特開 2023-102995 慢性腎臓病の治療剤及びそのスクリーニング方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023102995

(43)【公開日】2023-07-26

(54)【発明の名称】慢性腎臓病の治療剤及びそのスクリーニング方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/00 20060101AFI20230719BHJP

   C12Q 1/06 20060101ALI20230719BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20230719BHJP

   A61K 31/404 20060101ALI20230719BHJP

   A61K 31/40 20060101ALI20230719BHJP

   A61K 31/366 20060101ALI20230719BHJP

   A61K 31/4418 20060101ALI20230719BHJP

   A61K 31/47 20060101ALI20230719BHJP

   A61K 31/22 20060101ALI20230719BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20230719BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20230719BHJP

【ＦＩ】

A61K45/00

C12Q1/06

A61P13/12

A61K31/404

A61K31/40

A61K31/366

A61K31/4418

A61K31/47

A61K31/22

G01N33/50 Z

G01N33/15 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022003795

(22)【出願日】2022-01-13

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】505155528

【氏名又は名称】公立大学法人横浜市立大学

(74)【代理人】

【識別番号】100165179

【弁理士】

【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡

(74)【代理人】

【識別番号】100175824

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100152272

【弁理士】

【氏名又は名称】川越 雄一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100181722

【弁理士】

【氏名又は名称】春田 洋孝

(72)【発明者】

【氏名】石上 友章

(72)【発明者】

【氏名】中島 理恵

(72)【発明者】

【氏名】杉山 美智子

(72)【発明者】

【氏名】桑江 明子

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

4C084

4C086

4C206

【Ｆターム（参考）】

2G045AA40

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ79

4B063QR77

4B063QS33

4B063QX01

4C084AA17

4C084NA14

4C084ZA81

4C086AA01

4C086AA02

4C086BA17

4C086BC05

4C086BC13

4C086BC17

4C086BC28

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA81

4C206AA01

4C206AA02

4C206DB03

4C206DB56

4C206KA04

4C206MA01

4C206MA04

4C206MA13

4C206MA17

4C206NA14

4C206ZA81

(57)【要約】

【課題】慢性腎臓病の治療剤及びそのスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】スタチンを有効成分とする慢性腎臓病の治療剤、及び、被験物質の存在下でヒト不死化近位尿細管細胞株を培養する工程と、前記細胞株が培地中に分泌したアンジオテンシノーゲンを測定する工程と、を含み、前記被験物質の存在下におけるアンジオテンシノーゲンの分泌量が、前記被験物質の非存在下における分泌量と比較して低下することが、前記被験物質が慢性腎臓病の治療剤であることを示す、慢性腎臓病の治療剤のスクリーニング方法。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

スタチンを有効成分とする慢性腎臓病の治療剤。

【請求項2】

前記スタチンが、フルバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、セリバスタチン、ピタバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン及びメバスタチンからなる群より選択される少なくとも１種の化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和物である、請求項１に記載の慢性腎臓病の治療剤。

【請求項3】

前記スタチンが、フルバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、セリバスタチン、ピタバスタチンからなる群より選択される少なくとも１種の化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和物である、請求項１又は２に記載の慢性腎臓病の治療剤。

【請求項4】

慢性腎臓病の治療剤のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下でヒト不死化近位尿細管細胞株を培養する工程と、
前記細胞株が培地中に分泌したアンジオテンシノーゲンを測定する工程と、を含み、
前記被験物質の存在下におけるアンジオテンシノーゲンの分泌量が、前記被験物質の非存在下における分泌量と比較して低下することが、前記被験物質が慢性腎臓病の治療剤であることを示す、スクリーニング方法。

【請求項5】

アンジオテンシノーゲンを測定する前記工程をホモジニアスアッセイにより行う、請求項４に記載のスクリーニング方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、慢性腎臓病の治療剤及びそのスクリーニング方法に関する。

【背景技術】

【0002】

慢性腎臓病は、成人の８人に１人が罹患する疾患である。しかしながら、末期腎不全に至るまでの病態を改善する有効な薬物に乏しいのが現状である。慢性腎臓病としては、糖尿病性腎症、多発性嚢胞腎、糸球体腎炎、腎硬化症、ネフローゼ症候群が含まれる。

【0003】

慢性腎臓病の治療では、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬や、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬等のレニン・アンジオテンシン系阻害薬が用いられている。レニン・アンジオテンシン系は、体液・電解質の恒常性を維持する生理的なシステムである。レニン・アンジオテンシン系には、全身性レニン・アンジオテンシン系と、尿細管レニン・アンジオテンシン系が存在する（例えば、非特許文献１を参照）。近位尿細管細胞もアンジオテンシノーゲンを発現しており、結合尿細管／皮質集合管も尿細管特異的なレニンを発現しており、尿細管レニン・アンジオテンシン系として、生体のナトリウム代謝の恒常性を維持している（例えば、非特許文献１を参照）。

【0004】

現在、慢性腎臓病の治療に用いられている、既存のレニン・アンジオテンシン系阻害薬では、腎糸球体血行動態に対する作用と、尿細管に対する作用とを分離することができない。このため、既存のレニン・アンジオテンシン系阻害薬の投与には、腎機能の恒常性の維持を破綻してしまうリスクがある。そもそも尿細管中には、レニン・アンジオテンシン系の構成要素が、血中より高濃度に認められることから、既存薬の効果は尿細管レニン・アンジオテンシン系に対しては期待できない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ishigami T., et al., Identification of Bona Fide Alternative Renin Transcripts Expressed Along Cortical Tubules and Potential Roles in Promoting Insulin Resistance In Vivo Without Significant Plasma Renin Activity Elevation, Hypertension, 64, 125-133, 2014.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、慢性腎臓病の治療剤を提供することを目的とする。本発明はまた、慢性腎臓病の治療剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は以下の態様を含む。
［１］スタチンを有効成分とする慢性腎臓病の治療剤。
［２］前記スタチンが、フルバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、セリバスタチン、ピタバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン及びメバスタチンからなる群より選択される少なくとも１種の化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和物である、［１］に記載の慢性腎臓病の治療剤。
［３］前記スタチンが、フルバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、セリバスタチン、ピタバスタチンからなる群より選択される少なくとも１種の化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和物である、［１］又は［２］に記載の慢性腎臓病の治療剤。
［４］慢性腎臓病の治療剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下でヒト不死化近位尿細管細胞株を培養する工程と、前記細胞株が培地中に分泌したアンジオテンシノーゲンを測定する工程と、を含み、前記被験物質の存在下におけるアンジオテンシノーゲンの分泌量が、前記被験物質の非存在下における分泌量と比較して低下することが、前記被験物質が慢性腎臓病の治療剤であることを示す、スクリーニング方法。
［５］アンジオテンシノーゲンを測定する前記工程をホモジニアスアッセイにより行う、［４］に記載のスクリーニング方法。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、慢性腎臓病の治療剤を提供することができる。また、慢性腎臓病の治療剤のスクリーニング方法を提供することができる。本発明により、尿細管レニン・アンジオテンシン系を選択的に抑制・制御する化合物を特定することが可能になる。選択的に尿細管レニン・アンジオテンシン系を抑制する化合物は、腎糸球体血行動態に影響を与えることなく、腎内レニン・アンジオテンシン系を制御することができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】図１は、実験例１で樹立したヒト不死化近位尿細管細胞株の顕微鏡写真である。

【図2】図２（ａ）は、ヒト不死化近位尿細管細胞株から培地中に経時的に分泌されるアンジオテンシノーゲンをウエスタンブロッティングにより検出した結果を示す写真である。図２（ｂ）は、図２（ａ）と同一の試料中のアンジオテンシノーゲンを、実験例２で確立したアンジオテンシノーゲン測定系（近接ホモジニアスアッセイ）により検出した結果を示すグラフである。

【図3】図３は、実験例２で確立したアンジオテンシノーゲン測定系により作成した標準曲線である。

【図4】図４（ａ）及び（ｂ）は、実験例３における代表的なスクリーニング結果を示す図である。

【図5】図５は、実験例４の結果を示すグラフである。

【図6】図６は、実験例５の結果を示すグラフである。

【図7】図７は、実験例５の結果を示すグラフである。

【図8】図８は、実験例５の結果を示すグラフである。

【図9】図９は、実験例５の結果を示すグラフである。

【図10】図１０は、実験例５の結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0010】

［慢性腎臓病の治療剤］
１実施形態において、本発明は、スタチンを有効成分とする慢性腎臓病の治療剤を提供する。

【0011】

実施例において後述するように、発明者らは、不死化した近位尿細管細胞の培地にスタチンを添加することにより、近位尿細管細胞によるアンジオテンシノーゲンの分泌が抑制されることを明らかにした。

【0012】

この結果は、スタチンが、腎糸球体血行動態に対する作用と、尿細管に対する作用とを分離し、尿細管レニン・アンジオテンシン系を特異的に抑制する、新たなクラスの慢性腎臓病の治療剤であることを意味する。

【0013】

したがって、スタチンは新たな慢性腎臓病の治療剤として有用である。スタチンは、近位尿細管細胞によるアンジオテンシノーゲンの分泌抑制剤であるということもできる。

【0014】

スタチンは、ＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素を阻害することにより、血液中のコレステロール値を低下させる、ＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素阻害薬の総称である。スタチンとしては、フルバスタチン（ＣＡＳ番号：９３９５７－５４－１）、アトルバスタチン（ＣＡＳ番号：１３４５２３－００－５）、シンバスタチン（ＣＡＳ番号：７９９０２－６３－９）、セリバスタチン（ＣＡＳ番号：１４５５９９－８６－６）、ピタバスタチン（ＣＡＳ番号：１４７５１１－６９－１）、ロバスタチン（ＣＡＳ番号：２８７７１４－４１－４）、プラバスタチン（ＣＡＳ番号：８１０９３－３７－０）、ロスバスタチン（ＣＡＳ番号：２８７７１４－４１－４）及びメバスタチン（ＣＡＳ番号：７３５７３－８８－３）からなる群より選択される少なくとも１種の化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和物が挙げられる。

【0015】

スタチンとしては、なかでも、フルバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、セリバスタチン、ピタバスタチンからなる群より選択される少なくとも１種の化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和物が好ましい。

【0016】

薬学的に許容される塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。

【0017】

また、スタチン又はスタチンの塩の溶媒和物としては、薬学的に許容される溶媒和物であれば特に制限されず、例えば、水和物、有機溶媒和物等が挙げられる。

【0018】

より具体的なスタチンの塩又はその溶媒和物としては、フルバスタチン・ナトリウム、アトロバスタチン・カルシウム、アトルバスタチンカルシウム水和物、ピタバスタチン・カルシウム、ピタバスタチン・カルシウム水和物、フルバスタチン・ナトリウム、セリバスタチン・ナトリウム、プラバスタチン・ナトリウム等が挙げられる。

【0019】

慢性腎臓病の治療剤は、医薬組成物として製剤化されていることが好ましい。慢性腎臓病の治療剤は、例えば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等の形態で経口的に、あるいは、注射剤等の形態で非経口的に投与することができる。

【0020】

薬学的に許容される担体としては、通常医薬組成物の製剤に用いられるものを特に制限なく用いることができる。より具体的には、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤；デンプン、結晶性セルロース等の賦形剤；アルギン酸等の膨化剤；水、エタノール、グリセリン等の注射剤用溶剤等が挙げられる。

【0021】

医薬組成物は添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン、マルチトール等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノール等の安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤等が挙げられる。

【0022】

医薬組成物は、上述した、スタチン、スタチンの塩又はこれらの溶媒和物と、上述した薬学的に許容される担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。

【0023】

医薬組成物の投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、例えば、成人１日あたり１～４０ｍｇ程度の有効成分を１日１回又は２～４回程度に分けて投与すればよい。

【0024】

［慢性腎臓病の治療剤のスクリーニング方法］
１実施形態において、本発明は、慢性腎臓病の治療剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下でヒト不死化近位尿細管細胞株を培養する工程と、前記細胞株が培地中に分泌したアンジオテンシノーゲンを測定する工程と、を含み、前記被験物質の存在下におけるアンジオテンシノーゲンの分泌量が、前記被験物質の非存在下における分泌量と比較して低下することが、前記被験物質が慢性腎臓病の治療剤であることを示す、スクリーニング方法を提供する。

【0025】

発明者らは、ヒト不死化近位尿細管細胞株がアンジオテンシノーゲンを分泌することを見出し、本実施形態のスクリーニング方法を完成させた。ヒト不死化近位尿細管細胞株がアンジオテンシノーゲンを分泌することは従来知られていなかった。

【0026】

実施例において後述するように、本実施形態のスクリーニング方法により、慢性腎臓病の治療剤をスクリーニングすることができる。本実施形態のスクリーニング方法によりスクリーニングすることができる治療剤は、尿細管レニン・アンジオテンシン系を抑制・制御する作用を持つものである。

【0027】

被験物質としては、特に限定されず、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリ等が挙げられる。

【0028】

本実施形態のスクリーニング方法において、アンジオテンシノーゲンを測定する工程をホモジニアスアッセイにより行うことが好ましい。従来、アンジオテンシノーゲンの測定は、いわゆる不均一ＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏ－ａｓｓａｙ、酵素免疫アッセイ）で行われていた。不均一ＥＩＡでは、Ｂ／Ｆ分離を必要とする。ここで、「Ｂ」はｂｏｎｄ（結合）、「Ｆ」はｆｒｅｅ（遊離）の意味である。つまり、抗体と結合している抗原と抗体と結合していない抗原を分離するということである。

【0029】

マイクロプレート上に抗体を固相化した従来法のＥＬＩＳＡは、複数の操作が必要であり、なかでも洗浄の工程は、確実に残余血清、残余反応液を除去する上で欠かせなかった。しかしながら洗浄の工程は、測定時間の上昇をもたらすとともに、自動化によりスループット性を向上する上で強い障害になっていた。

【0030】

これに対し、ホモジニアスアッセイはＢ／Ｆ分離を必要としないため、不均一ＥＩＡによるスループット性の低下を解消するとともに、高感度な測定を実現することができる。この結果、慢性腎臓病の治療剤のハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）が可能となる。

【0031】

ホモジニアスアッセイは、特に限定されないが、近接ホモジニアスアッセイであることが好ましく、例えば、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（パーキンエルマー社）等の市販のキットを使用して行うことができる。

【0032】

［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、スタチンの有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、慢性腎臓病の治療方法を提供する。

【0033】

１実施形態において、本発明は、慢性腎臓病の治療のためのスタチンを提供する。

【0034】

１実施形態において、本発明は、慢性腎臓病の治療剤を製造するためのスタチンの使用を提供する。

【0035】

これらの実施形態において、スタチンについては上述したものと同様である。すなわち、スタチンは、フルバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、セリバスタチン、ピタバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン及びメバスタチンからなる群より選択される少なくとも１種の化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和物であってよい。

【実施例0036】

次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0037】

［実験例１］
（ヒト近位尿細管細胞の不死化）
ｐＬｅｎｔｉ６＿Ｖ５／ＤＥＳＴ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）のＮｏｔＩ部位に、ＣＤＫＮ２Ａ（ｐ１６）遺伝子（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿００００７７．５）の第４１９～４３７番目の塩基配列を標的とした、Ｕ６プロモーター作動型ｓｈＲＮＡ発現カセットを導入したベクター（ｐＬｅｎｔｉ６＿Ｖ５／ＤＥＳＴ＿ｓｈ－ｐ１６）を作製した。

【0038】

続いて、ｐＥＮＴＲ－Ａ＿ＴＥＲＴを用いて、Ｇａｔｅｗａｙクローニング・システムにより、ｐＬｅｎｔｉ６＿Ｖ５／ＤＥＳＴ＿ｓｈ－ｐ１６にＴＥＲＴ遺伝子を導入し、レンチウイルスベクター（ｐＬｅｎｔｉ６＿ＴＥＲＴ＿ｓｈ－ｐ１６）を作製した。

【0039】

続いて、ｐＬｅｎｔｉ６＿ＴＥＲＴ＿ｓｈ－ｐ１６及びＶｉｒａＰｏｗｅｒ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｍｉｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を２９３ＦＴ細胞（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に導入し、ウイルス粒子を作製した。

【0040】

続いて、正常ヒト近位尿細管細胞（ロンザ社）にウイルス粒子を感染させて、ヒトＴＥＲＴ遺伝子、及び、ｐ１６遺伝子を不活化するｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を導入して不死化し、ヒト不死化近位尿細管細胞株（ｈＲＰＴＥＣ）を得た。続いて、得られたヒト不死化近位尿細管細胞株の培地をＤＭＥＭに馴化し、以下の実験に用いた。図１は、樹立したヒト不死化近位尿細管細胞株の顕微鏡写真である。倍率は２０倍である。

【0041】

［実験例２］
（アンジオテンシノーゲン測定系の確立）
市販のキット（製品名「ＡｌｐｈａＬＩＳＡ」、パーキンエルマー社）を使用した近接ホモジニアスアッセイにより、アンジオテンシノーゲン（以下、「ＡＧＴ」という場合がある。）を測定する測定系を確立した。

【0042】

《ビオチン化抗ＡＧＴ抗体の調製》
抗ＡＧＴ抗体（Ａｂｎｏｖａ社）にＮＨＳ－ＣｈｒｏｍａＬｉｎｋビオチン溶液（ＳｏｌｕＬｉｎｋ社）を添加し、室温で２時間インキュベーションした。続いて、Ｚｅｂａ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で余分なビオチン化試薬を除去した。続いて、下記式（１）に示す算出式に基づいて、２８０ｎｍの吸光度（Ａ_２８０）及び３５４ｎｍの吸光度（Ａ_３５４）からビオチン化抗体の濃度を測定した。
ビオチン化抗体の濃度（μＭ）＝（（Ａ_２８０－（Ａ_３５４×０．２３））／１．３４）／１６０，０００×１０^６ …（１）

【0043】

《アクセプタービーズへの抗体結合》
非標識ＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズ（パーキンエルマー社）に、抗ＡＧＴ抗体（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）、及び、１０％Ｔｗｅｅｎ－２０、４００ｍＭ ＮａＢＨ_３ＣＮを添加し、３７℃で４８時間インキュベートした。

【0044】

続いて、０．８ＭのＮａＯＨで溶解した６５ｍｇ／ｍＬ濃度のカルボキシメチルアミンヘミ塩酸塩（ＣＭＯ）溶液を、上記のビーズ・抗体溶液に添加し、未反応基をブロックした。

【0045】

続いて、４℃で１６，０００ｇ、１５分間遠心し、上清を除去した。続いて、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬで洗浄し、０．０５％Ｐｒｏｃｌｉｎ－３００を添加したＰＢＳに懸濁した。

【0046】

《至適ビオチン化抗体濃度の決定》
５００ｎｇ／ｍＬ濃度のヒトＡＧＴタンパク質（シグマアルドリッチ社）溶液をアナライトとし、至適ビオチン化抗体濃度を検討した。

【0047】

上記のビオチン化抗ＡＧＴ抗体を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ（パーキンエルマー社）を用いて、１５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭに希釈し、５μＬのアナライト、５０μｇ／ｍＬのアクセプタービーズ溶液をそれぞれ１／２ Ａｒｅａ Ｐｌａｔｅ ９６（パーキンエルマー社）にアプライし、室温で１時間インキュベーションした。その後、８０μｇ／ｍＬのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎストレプトアビジンドナービーズ（パーキンエルマー社）を２５μＬ加え、３０分インキュベートした後、ＥｎＳｐｉｒｅ Ａｌｐｈａ（パーキンエルマー社）でシグナルを計測した。

【0048】

標準曲線の作成には、ヒトＡＧＴタンパク質（シグマアルドリッチ社）をＤＭＥＭで１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、１，０００ｎｇ／ｍＬ、５，０００ｎｇ／ｍＬ、１０，０００ｎｇ／ｍＬ、５０，０００ｎｇ／ｍＬに希釈したものを使用した。

【0049】

図２（ａ）及び（ｂ）は、確立したアンジオテンシノーゲン測定系による代表的なアッセイの結果である。図２（ａ）は、ヒト不死化近位尿細管細胞株（ｈＲＰＴＥＣ）から培地中に経時的に分泌されるアンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）をウエスタンブロッティングにより検出した結果を示す写真である。

【0050】

図２（ｂ）は、図２（ａ）と同一の試料中のアンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）を、本実験例で確立したアンジオテンシノーゲン測定系（近接ホモジニアスアッセイ）により検出した結果を示すグラフである。図２（ｂ）中、縦軸は蛍光強度（相対値）を示し、横軸は時間（時間）を示す。

【0051】

図３は、本実験例で確立したアンジオテンシノーゲン測定系により作成した標準曲線である。

【0052】

［実験例３］
（ＨＴＳスクリーニング）
東京大学創薬機構より提供された、Ｖａｌｉｄａｔｅｄ Ｌｉｂｒａｒｙ（既知の薬効のある低分子化合物、３３９９化合物、２ｍＭ、５μＬ）を使って、慢性腎臓病の治療剤をスクリーニングした。実験例１で樹立した不死化ｈＲＰＴＥＣの培地に、上記ライブラリに含まれる各低分子化合物を、終濃度１μＭで添加し、４８～７２時間、５％ＣＯ_２、３７℃でインキュベートした。その後、培地を回収し、培地中のＡＧＴ濃度を測定した。培地中のＡＧＴ濃度の測定は実験例２で確立した近接ホモジニアスアッセイにより行った。

【0053】

具体的には、まず、不死化ｈＲＰＴＥＣを、１０ｍｍディッシュ８～９枚用意した。続いて、古い培地を吸引除去し、Ｄ－ＰＢＳ（－）２ｍＬで２回洗浄した。続いて、０．０５％トリプシンＥＤＴＡ １ｍＬを添加し、５％ＣＯ_２、３７℃のインキュベーター内に数分間静置した。その後、細胞が剥がれていることを確認し、１ｍＬの１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭを加えた。続いて、細胞数をカウントして、２．７５×１０^５／ｍＬに細胞密度を調整し、９６ウェルプレートに２００μＬ／ウェル（５．５×１０^４個／ウェル）ずつ播種して、５％ＣＯ_２、３７℃のインキュベーター内で４８時間インキュベートした。続いて、不死化ｈＲＰＴＥＣが播種された９６ウェルプレートの培地を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加した、ＦＢＳ不含ＤＭＥＭ３８μＬ／ウェルに変更した。

【0054】

続いて、東京大学創薬機構より提供された低分子化合物プレートを室温に戻した。続いて、１μＬの低分子化合物（２ｍＭ）に９９μＬのＦＢＳ不含ＤＭＥＭを加えて、１００倍希釈（２０μＭ）した。続いて、希釈した低分子化合物２μＬを、不死化ｈＲＰＴＥＣが播種された９６ウェルプレートに分注した。各低分子化合物の最終濃度は１μＭであった。その後、５％ＣＯ_２、３７℃のインキュベーター内で７２時間インキュベートした。

【0055】

続いて、実験例２で確立したアンジオテンシノーゲン測定系（近接ホモジニアスアッセイ）により、各ウェルの培地中に分泌されたアンジオテンシノーゲンを測定した。

【0056】

具体的には、まず、１０×ＡｌｐｈａＬＩＳＡ Ｈｉｂｌｏｃｋ Ｂｕｆｆｅｒ（パーキンエルマー社）３００μＬに、蒸留水２７００μＬを加え、溶液（１）とした。続いて、上記溶液（１）５７６μＬにビオチン化抗ＡＧＴ抗体溶液６４μＬを加え、７５μＬずつ８ウェルに分注した。続いて、上記溶液（１）６３３．６μＬにアクセプタービーズ６．４μＬを加え、７５μＬずつ８ウェルに分注した。続いて、遮光下で上記溶液（１）１４７６μＬにＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎストレプトアビジンドナービーズ（パーキンエルマー社）を２４μＬ加え、１８０μＬずつ８ウェルに分注した。続いて、各低分子化合物の存在下で培養した不死化ｈＲＰＴＥＣの培地を１０μＬずつアプライした。

【0057】

同様に、ポジティブコントロール（化合物無添加培地で不死化ｈＲＰＴＥＣを培養した培地）、ネガティブコントロール（細胞培養に使用していない培地）も１０μＬずつアプライした。

【0058】

続いて、希釈したビオチン化抗体・アクセプタービーズ溶液を５μＬずつアプライし、シーリングの後、ボルテックスにより撹拌し軽く遠心した後、室温で３時間インキュベートした。その後、希釈したドナービーズを１２．５μＬずつアプライし、ボルテックス及び遠心した後、室温で３０分間インキュベートしてＥｎＳｐｉｒｅ Ａｌｐｈａ（パーキンエルマー社）でシグナルを計測した。

【0059】

図４（ａ）及び（ｂ）は、代表的なスクリーニング結果を示す図であり、９６ウェルプレート１枚分の結果を示す。図４（ａ）は測定値を示し、図４（ｂ）は測定値から算出した、アンジオテンシノーゲンの分泌の阻害率（％）を示す。図４（ａ）及び（ｂ）中、「１」の列はポジティブコントロールの結果であり、「１２」の列はネガティブコントロールの結果である。アンジオテンシノーゲンの分泌の阻害率は、下記式（２）により算出した。
阻害率（％）＝（１－（測定値－ネガティブコントロールの測定値の平均値）／（ポジティブコントロールの測定値の平均値－ネガティブコントロールの測定値の平均値））×１００ …（２）

【0060】

スクリーニングの結果、近位尿細管細胞によるアンジオテンシノーゲンの分泌を抑制する化合物として、フルバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、セリバスタチン、ピタバスタチンが同定された。

【0061】

下記表１に、フルバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、セリバスタチン、ピタバスタチンによるアンジオテンシノーゲンの分泌の阻害率を示す。アンジオテンシノーゲンの分泌の阻害率は、上記式（２）により算出した。

【0062】

【表1】

【0063】

［実験例４］
（スタチン及びＮａ－Ｋ ＡＴＰａｓｅ阻害剤の比較）
不死化ｈＲＰＴＥＣを用いて、スタチン及びＮａ－Ｋ ＡＴＰａｓｅ阻害剤によるアンジオテンシノーゲンの分泌の阻害率を比較した。

【0064】

図５は、不死化ｈＲＰＴＥＣを用いて測定した、スタチンによるアンジオテンシノーゲンの分泌の阻害率と、正常対照と考えられる尿細管Ｎａ－Ｋ ＡＴＰａｓｅ阻害剤によるアンジオテンシノーゲンの分泌の阻害率を、実験例２で確立したアンジオテンシノーゲン測定系（近接ホモジニアスアッセイ）により測定した結果を示すグラフである。アンジオテンシノーゲンの分泌の阻害率は、上記式（２）により算出した。

【0065】

スタチンとしては、フルバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、セリバスタチン、ピタバスタチンを使用した。また、尿細管Ｎａ－Ｋ ＡＴＰａｓｅ阻害剤としては、ジゴキシン、ウワバイン、ラナトシドＣを使用した。図５中、縦軸はアンジオテンシノーゲンの分泌の阻害率（％）を表す。また、「ＡＬＬ」はスタチンを除く全低分子化合物を表し、「ＤＲ」はスタチンを表す。

【0066】

その結果、スタチン類が、正常対照と考えられる尿細管Ｎａ－Ｋ ＡＴＰａｓｅ阻害剤（ジゴキシン類）と、同等のアンジオテンシノーゲンの分泌の阻害効果を示すことが確認された。

【0067】

［実験例５］
（同定した化合物の検証）
実験例１で樹立した不死化ｈＲＰＴＥＣの培地に、スタチンを様々な濃度で添加し、４８～７２時間、５％ＣＯ_２、３７℃でインキュベートした。スタチンとしては、フルバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、セリバスタチン及びピタバスタチンを使用した。その後、培地を回収し、培地中のアンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）濃度を測定した。培地中のＡＧＴ濃度の測定は実験例２で確立した近接ホモジニアスアッセイにより行った。

【0068】

具体的には、まず、不死化ｈＲＰＴＥＣを、１０ｍｍディッシュ８～９枚用意した。続いて、古い培地を吸引除去し、Ｄ－ＰＢＳ（－）２ｍＬで２回洗浄した。続いて、０．０５％トリプシンＥＤＴＡ １ｍＬを添加し、５％ＣＯ_２、３７℃のインキュベーター内に数分間静置した。その後、細胞が剥がれていることを確認し、１ｍＬの１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭを加えた。続いて、細胞数をカウントして、２．７５×１０^５／ｍＬに細胞密度を調整し、９６ウェルプレートに２００μＬ／ウェル（５．５×１０^４個／ウェル）ずつ播種して、５％ＣＯ_２、３７℃のインキュベーター内で４８時間インキュベートした。続いて、不死化ｈＲＰＴＥＣが播種された９６ウェルプレートの培地を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加した、ＦＢＳ不含ＤＭＥＭ３８μＬ／ウェルに変更した。

【0069】

続いて、段階希釈した各スタチン２μＬを、それぞれ、不死化ｈＲＰＴＥＣが播種された９６ウェルプレートに分注した。各スタチンの最終濃度は、それぞれ、１，０００ｎＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、０ｎＭであった。その後、５％ＣＯ_２、３７℃のインキュベーター内で７２時間インキュベートした。

【0070】

続いて、実験例２で確立したアンジオテンシノーゲン測定系（近接ホモジニアスアッセイ）により、各ウェルの培地中に分泌されたアンジオテンシノーゲンを測定した。また、ＭＴＴアッセイにより、細胞が生存していることを確認した。

【0071】

図６～１０は、各スタチンによるアンジオテンシノーゲンの分泌の阻害率（％）を示すグラフである。アンジオテンシノーゲンの分泌の阻害率は、上記式（２）により算出した。図６はフルバスタチンを添加した結果であり、図７はアトルバスタチンを添加した結果であり、図８はシンバスタチンを添加した結果であり、図９はセリバスタチンを添加した結果であり、図１０はピタバスタチンを添加した結果である。

【0072】

その結果、各スタチンの添加により、不死化ｈＲＰＴＥＣからのアンジオテンシノーゲンの分泌が抑制されたことが確認された。また、各スタチンの濃度依存性も明らかとなった。

【産業上の利用可能性】

【0073】

本発明によれば、慢性腎臓病の治療剤を提供することができる。また、慢性腎臓病の治療剤のスクリーニング方法を提供することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】