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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023104408
(43)【公開日】2023-07-28
(54)【発明の名称】コレラ毒素の検出方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/569 20060101AFI20230721BHJP
C07K 16/12 20060101ALI20230721BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20230721BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20230721BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20230721BHJP
【ＦＩ】
G01N33/569 F
C07K16/12 ZNA
C12M1/34 F
G01N33/53 D
G01N33/543 521
【審査請求】未請求
【請求項の数】21
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022005375
(22)【出願日】2022-01-17
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和３年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、新興・再興感染症に対する革新的医薬品等開発推進研究事業 「抗体ライブラリーを用いたワクチン・創薬展開と病原性・機能解析」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】505314022
【氏名又は名称】国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所
(71)【出願人】
【識別番号】000173692
【氏名又は名称】一般財団法人阪大微生物病研究会
(74)【代理人】
【識別番号】100212255
【弁理士】
【氏名又は名称】中川 将之
(72)【発明者】
【氏名】國澤 純
(72)【発明者】
【氏名】細見 晃司
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 孝一朗
(72)【発明者】
【氏名】朴 貞玉
【テーマコード（参考）】
4B029
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029BB02
4B029BB15
4B029CC01
4B029FA12
4B029FA15
4B029GA08
4B029HA05
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045DA76
4H045EA50
4H045FA72
4H045FA74
4H045GA10
4H045GA26
(57)【要約】
【課題】 本発明が解決しようとする課題は、コレラ毒素（ＣＴｘ）の検出を、簡便、迅速、高感度に行うことである。
【解決手段】コレラ毒素Ｂサブユニット遺伝子組換えタンパク質（ＣＴｘＢ）とアジュバントを含む抗原液を、ＢＡＬＢ／ｃマウスに接種した。接種後、マウスの脾細胞またはリンパ節細胞とＰ３Ｕ１とを融合させてハイブリドーマを作製し、その中から、ＣＴｘに対して高い反応性を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選抜し、ＣＴｘに対して優れた反応性を示す抗体を産生する４つのハイブリドーマを取得することに成功した。次いで、これらのモノクローナル抗体を用いて、イムノクロマトグラフィーによりＣＴｘの検出を行ったところ、高感度でＣＴｘを検出し得る結果を得た。
【選択図】図１
【解決手段】コレラ毒素Ｂサブユニット遺伝子組換えタンパク質（ＣＴｘＢ）とアジュバントを含む抗原液を、ＢＡＬＢ／ｃマウスに接種した。接種後、マウスの脾細胞またはリンパ節細胞とＰ３Ｕ１とを融合させてハイブリドーマを作製し、その中から、ＣＴｘに対して高い反応性を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選抜し、ＣＴｘに対して優れた反応性を示す抗体を産生する４つのハイブリドーマを取得することに成功した。次いで、これらのモノクローナル抗体を用いて、イムノクロマトグラフィーによりＣＴｘの検出を行ったところ、高感度でＣＴｘを検出し得る結果を得た。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
イムノクロマト法による検体中のコレラ毒素の検出方法であって、下記群から選択される同一または異なる２種の抗体を各々標識抗体および捕捉抗体として用いることを特徴とする、方法：
１）少なくともＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号９のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号１２のアミノ酸配列を有する、抗体；
２）少なくともＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号１９のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号２２のアミノ酸配列を有する、抗体；
３）少なくともＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号２９のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号３２のアミノ酸配列を有する、抗体；
４）少なくともＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号３９のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号４２のアミノ酸配列を有する、抗体；
５）上記１）～４）の抗体の各ＶＨ ＣＤＲ３領域および／またはＶＬ ＣＤＲ３領域において１または２個のアミノ酸変異を有する、抗体。
１）少なくともＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号９のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号１２のアミノ酸配列を有する、抗体；
２）少なくともＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号１９のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号２２のアミノ酸配列を有する、抗体；
３）少なくともＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号２９のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号３２のアミノ酸配列を有する、抗体；
４）少なくともＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号３９のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号４２のアミノ酸配列を有する、抗体；
５）上記１）～４）の抗体の各ＶＨ ＣＤＲ３領域および／またはＶＬ ＣＤＲ３領域において１または２個のアミノ酸変異を有する、抗体。
【請求項2】
上記抗体が、単離された抗体である、請求項１の方法。
【請求項3】
上記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１または２の方法。
【請求項4】
上記抗体が、コレラ毒素に対して５．０ｘ１０－９M以下の平衡解離定数ＫＤを有することを特徴とする、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
【請求項5】
上記抗体が、コレラ毒素に対して５．０ｘ１０－１０M以下の平衡解離定数ＫＤを有することを特徴とする、請求項４の方法。
【請求項6】
上記５）の抗体において、アミノ酸変異が、置換であることを特徴とする、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
上記置換が保存的アミノ酸置換であることを特徴とする、請求項６の方法。
【請求項8】
上記抗体が、さらに下記特徴を有することを特徴とする、請求項１～７のいずれかに記載の方法：
１）少なくともＶＨ ＣＤＲ１領域として配列番号７のアミノ酸配列、ＶH ＣＤＲ２領域として配列番号８のアミノ酸配列、ＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号９のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ１領域として配列番号１０のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ２領域として配列番号１１のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号１２のアミノ酸配列を有する、抗体；
２）少なくともＶＨ ＣＤＲ１領域として配列番号１７のアミノ酸配列、ＶH ＣＤＲ２領域として配列番号１８のアミノ酸配列、ＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号１９のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ１領域として配列番号２０のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ２領域として配列番号２１のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号２２のアミノ酸配列を有する、抗体；
３）少なくともＶＨ ＣＤＲ１領域として配列番号２７のアミノ酸配列、ＶH ＣＤＲ２領域として配列番号２８のアミノ酸配列、ＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号２９のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ１領域として配列番号３０のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ２領域として配列番号３１のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号３２のアミノ酸配列を有する、抗体；
４）少なくともＶＨ ＣＤＲ１領域として配列番号３７のアミノ酸配列、ＶH ＣＤＲ２領域として配列番号３８のアミノ酸配列、ＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号３９のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ１領域として配列番号４０のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ２領域として配列番号４１のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号４２のアミノ酸配列を有する、抗体；
５）上記１）～４）の抗体の各ＶＨ ＣＤＲ１領域、ＶＨ ＣＤＲ２領域、ＶＨＣＤＲ３領域、ＶＬ ＣＤＲ１領域、ＶＬ ＣＤＲ２領域および／またはＶＬ ＣＤＲ３領域において１または２個のアミノ酸変異を有する、抗体。
１）少なくともＶＨ ＣＤＲ１領域として配列番号７のアミノ酸配列、ＶH ＣＤＲ２領域として配列番号８のアミノ酸配列、ＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号９のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ１領域として配列番号１０のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ２領域として配列番号１１のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号１２のアミノ酸配列を有する、抗体；
２）少なくともＶＨ ＣＤＲ１領域として配列番号１７のアミノ酸配列、ＶH ＣＤＲ２領域として配列番号１８のアミノ酸配列、ＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号１９のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ１領域として配列番号２０のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ２領域として配列番号２１のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号２２のアミノ酸配列を有する、抗体；
３）少なくともＶＨ ＣＤＲ１領域として配列番号２７のアミノ酸配列、ＶH ＣＤＲ２領域として配列番号２８のアミノ酸配列、ＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号２９のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ１領域として配列番号３０のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ２領域として配列番号３１のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号３２のアミノ酸配列を有する、抗体；
４）少なくともＶＨ ＣＤＲ１領域として配列番号３７のアミノ酸配列、ＶH ＣＤＲ２領域として配列番号３８のアミノ酸配列、ＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号３９のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ１領域として配列番号４０のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ２領域として配列番号４１のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号４２のアミノ酸配列を有する、抗体；
５）上記１）～４）の抗体の各ＶＨ ＣＤＲ１領域、ＶＨ ＣＤＲ２領域、ＶＨＣＤＲ３領域、ＶＬ ＣＤＲ１領域、ＶＬ ＣＤＲ２領域および／またはＶＬ ＣＤＲ３領域において１または２個のアミノ酸変異を有する、抗体。
【請求項9】
上記抗体が、さらに下記特徴を有することを特徴とする、請求項１～８のいずれかに記載の方法：
１）ＶＨ領域として配列番号３のアミノ酸配列およびＶＬ領域として配列番号５のアミノ酸配列を有する、抗体；
２）ＶＨ領域として配列番号１３のアミノ酸配列およびＶＬ領域として配列番号１５のアミノ酸配列を有する、抗体；
３）ＶＨ領域として配列番号２３のアミノ酸配列およびＶＬ領域として配列番号２５のアミノ酸配列を有する、抗体；
４）ＶＨ領域として配列番号３３のアミノ酸配列およびＶＬ領域として配列番号３５のアミノ酸配列を有する、抗体；
５）上記１）～４）の抗体と８０％以上の配列同一性を有する、抗体。
１）ＶＨ領域として配列番号３のアミノ酸配列およびＶＬ領域として配列番号５のアミノ酸配列を有する、抗体；
２）ＶＨ領域として配列番号１３のアミノ酸配列およびＶＬ領域として配列番号１５のアミノ酸配列を有する、抗体；
３）ＶＨ領域として配列番号２３のアミノ酸配列およびＶＬ領域として配列番号２５のアミノ酸配列を有する、抗体；
４）ＶＨ領域として配列番号３３のアミノ酸配列およびＶＬ領域として配列番号３５のアミノ酸配列を有する、抗体；
５）上記１）～４）の抗体と８０％以上の配列同一性を有する、抗体。
【請求項10】
上記抗体が、４）の抗体または５）の抗体のうち４）の抗体に由来する抗体どうしの組合せであることを特徴とする、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
【請求項11】
コレラ毒素の検出用抗体であって、
１）少なくともＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号９のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号１２のアミノ酸配列を有する、抗体；
２）少なくともＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号１９のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号２２のアミノ酸配列を有する、抗体；
３）少なくともＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号２９のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号３２のアミノ酸配列を有する、抗体；
４）少なくともＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号３９のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号４２のアミノ酸配列を有する、抗体；および
５）上記１）～４）の抗体の各ＶＨ ＣＤＲ３領域および／またはＶＬ ＣＤＲ３領域において１または２個のアミノ酸変異を有する、抗体
からなる群から選択される１種の抗体または同一または異なる２種以上の抗体の組合せ。
１）少なくともＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号９のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号１２のアミノ酸配列を有する、抗体；
２）少なくともＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号１９のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号２２のアミノ酸配列を有する、抗体；
３）少なくともＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号２９のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号３２のアミノ酸配列を有する、抗体；
４）少なくともＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号３９のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号４２のアミノ酸配列を有する、抗体；および
５）上記１）～４）の抗体の各ＶＨ ＣＤＲ３領域および／またはＶＬ ＣＤＲ３領域において１または２個のアミノ酸変異を有する、抗体
からなる群から選択される１種の抗体または同一または異なる２種以上の抗体の組合せ。
【請求項12】
上記抗体が、単離された抗体である、請求項１１の抗体または抗体の組合せ。
【請求項13】
上記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１１または１２の抗体または抗体の組合せ。
【請求項14】
上記抗体が、コレラ毒素に対して５．０ｘ１０－９M以下の平衡解離定数ＫＤを有することを特徴とする、請求項１１～１３のいずれかに記載の抗体または抗体の組合せ。
【請求項15】
上記抗体が、コレラ毒素に対して５．０ｘ１０－１０M以下の平衡解離定数ＫＤを有することを特徴とする、請求項１４の抗体または抗体の組合せ。
【請求項16】
上記５）の抗体において、アミノ酸変異が、置換であることを特徴とする、請求項１１～１５のいずれかに記載の抗体または抗体の組合せ。
【請求項17】
上記置換が保存的アミノ酸置換であることを特徴とする、請求項１６の抗体または抗体の組合せ。
【請求項18】
上記抗体が、さらに下記特徴を有することを特徴とする、請求項１１～１７のいずれかに記載の抗体または抗体の組合せ：
１）少なくともＶＨ ＣＤＲ１領域として配列番号７のアミノ酸配列、ＶH ＣＤＲ２領域として配列番号８のアミノ酸配列、ＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号９のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ１領域として配列番号１０のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ２領域として配列番号１１のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号１２のアミノ酸配列を有する、抗体；
２）少なくともＶＨ ＣＤＲ１領域として配列番号１７のアミノ酸配列、ＶH ＣＤＲ２領域として配列番号１８のアミノ酸配列、ＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号１９のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ１領域として配列番号２０のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ２領域として配列番号２１のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号２２のアミノ酸配列を有する、抗体；
３）少なくともＶＨ ＣＤＲ１領域として配列番号２７のアミノ酸配列、ＶH ＣＤＲ２領域として配列番号２８のアミノ酸配列、ＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号２９のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ１領域として配列番号３０のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ２領域として配列番号３１のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号３２のアミノ酸配列を有する、抗体；
４）少なくともＶＨ ＣＤＲ１領域として配列番号３７のアミノ酸配列、ＶH ＣＤＲ２領域として配列番号３８のアミノ酸配列、ＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号３９のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ１領域として配列番号４０のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ２領域として配列番号４１のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号４２のアミノ酸配列を有する、抗体；
５）上記１）～４）の抗体の各ＶＨ ＣＤＲ１領域、ＶＨ ＣＤＲ２領域、ＶＨＣＤＲ３領域、ＶＬ ＣＤＲ１領域、ＶＬ ＣＤＲ２領域および／またはＶＬ ＣＤＲ３領域において１または２個のアミノ酸変異を有する、抗体。
１）少なくともＶＨ ＣＤＲ１領域として配列番号７のアミノ酸配列、ＶH ＣＤＲ２領域として配列番号８のアミノ酸配列、ＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号９のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ１領域として配列番号１０のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ２領域として配列番号１１のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号１２のアミノ酸配列を有する、抗体；
２）少なくともＶＨ ＣＤＲ１領域として配列番号１７のアミノ酸配列、ＶH ＣＤＲ２領域として配列番号１８のアミノ酸配列、ＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号１９のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ１領域として配列番号２０のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ２領域として配列番号２１のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号２２のアミノ酸配列を有する、抗体；
３）少なくともＶＨ ＣＤＲ１領域として配列番号２７のアミノ酸配列、ＶH ＣＤＲ２領域として配列番号２８のアミノ酸配列、ＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号２９のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ１領域として配列番号３０のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ２領域として配列番号３１のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号３２のアミノ酸配列を有する、抗体；
４）少なくともＶＨ ＣＤＲ１領域として配列番号３７のアミノ酸配列、ＶH ＣＤＲ２領域として配列番号３８のアミノ酸配列、ＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号３９のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ１領域として配列番号４０のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ２領域として配列番号４１のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号４２のアミノ酸配列を有する、抗体；
５）上記１）～４）の抗体の各ＶＨ ＣＤＲ１領域、ＶＨ ＣＤＲ２領域、ＶＨＣＤＲ３領域、ＶＬ ＣＤＲ１領域、ＶＬ ＣＤＲ２領域および／またはＶＬ ＣＤＲ３領域において１または２個のアミノ酸変異を有する、抗体。
【請求項19】
上記抗体が、さらに下記特徴を有することを特徴とする、請求項１１～１８のいずれかに記載の抗体または抗体の組合せ：
１）ＶＨ領域として配列番号３のアミノ酸配列およびＶＬ領域として配列番号５のアミノ酸配列を有する、抗体；
２）ＶＨ領域として配列番号１３のアミノ酸配列およびＶＬ領域として配列番号１５のアミノ酸配列を有する、抗体；
３）ＶＨ領域として配列番号２３のアミノ酸配列およびＶＬ領域として配列番号２５のアミノ酸配列を有する、抗体；
４）ＶＨ領域として配列番号３３のアミノ酸配列およびＶＬ領域として配列番号３５のアミノ酸配列を有する、抗体；
５）上記１）～４）の抗体と８０％以上の配列同一性を有する、抗体。
１）ＶＨ領域として配列番号３のアミノ酸配列およびＶＬ領域として配列番号５のアミノ酸配列を有する、抗体；
２）ＶＨ領域として配列番号１３のアミノ酸配列およびＶＬ領域として配列番号１５のアミノ酸配列を有する、抗体；
３）ＶＨ領域として配列番号２３のアミノ酸配列およびＶＬ領域として配列番号２５のアミノ酸配列を有する、抗体；
４）ＶＨ領域として配列番号３３のアミノ酸配列およびＶＬ領域として配列番号３５のアミノ酸配列を有する、抗体；
５）上記１）～４）の抗体と８０％以上の配列同一性を有する、抗体。
【請求項20】
請求項１１～１９のいずれかに記載の抗体または抗体の組合せを含むことを特徴とする、コレラ毒素検出用イムノクロマトキット。
【請求項21】
上記抗体の組合せが、４）の抗体どうしの組合せであって、４）の抗体が金コロイドと感作して標識抗体をなしており、４）の抗体が固層上に線状に固定されて捕捉抗体をなしていることを特徴とする、請求項２０のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、コレラ毒素の検出方法、当該方法に使用する抗体および当該方法に使用するためのキットに関するものである。
【背景技術】
【0002】
コレラ菌（Vibrio cholerae）は、ビブリオ科ビブリオ属のグラム陰性桿菌である。表面抗原（Ｏ抗原）により多くの血清型に分類されるが、そのうち「Ｏ１」か「Ｏ１３９」の血清型のいずれかを示し、さらにコレラ毒素を産生する菌のみが、コレラと診断されている。コレラは、患者や保菌者の便中のコレラ菌に汚染された食物や水による経口感染によって感染する。血清型Ｏ１のコレラは、１８１７年以降７回の世界的な大流行を繰り返してきている。その多くは、インド、東南アジア、その他の流行国への渡航者による輸入感染症として発症している。しかし、衛生環境が改善してきた地域での発生は減少している。先進国の患者発生報告の大部分は、今もコレラの流行がある途上国への渡航者、あるいは途上国から持ち込まれた飲食物を介しての感染となっている。日本におけるコレラの報告数は年々減少してきており、２０００年代前半は年間５０～１００人程度の発生があったが、近年は年間１０人以下となることが多くなっている。
【0003】
コレラ毒素（コレラトキシン、CTとも）は、分子量約８４ｋＤａのオリゴマータンパク質で、分子量約２７ｋＤａのＡサブユニット１分子と分子量約１１．６ｋＤａのＢサブユニット５分子からなる。コレラ毒素のアミノ酸配列や作用機序等の詳細は、既に研究されている（特許文献１、非特許文献１）。
【0004】
コレラの確定診断のためには、便培養によってコレラ菌を分離して、その血清型がＯ１かＯ１３９であることを確認したうえ、さらに、毒素産生か毒素遺伝子を証明することが必要である。コレラ菌の検出のためのキットとしては、例えばデンカ株式会社製のコレラ菌AD「生研」が市販されている。また、コレラ菌の検出方法として、分離培養検査、ＰＣＲ検査といった一般的な菌体検出方法のほか、抗コレラ菌モノクローナル抗体（特許文献２～４）やコレラ菌検出用のオリゴヌクレオチド（特許文献５および６）を用いた方法がある。しかし、分離培養検査には、特殊な検査室が必要であり、手法が煩雑で、培養や外部委託に時間がかかるといった問題がある。さらに、PCR法は、特殊な機器が必要であるため手法が煩雑で外部委託に時間がかかるといった問題がある。
【0005】
コレラ毒素の検出のためのキットとしては、例えばデンカ株式会社製のＶＥＴ－ＲＰＬＡ「生研」が市販されている。コレラ毒素の検出のための方法としては、上記ＶＥＴ－ＲＰＬＡ「生研」も利用している毒素産生性試験（Reversed Passive Latex Agglutination Test :ＲＰＬＡ法)が一般的であるが、培養菌からのコレラ毒素を検出するため、試験時間に１日を要し、最小検出感度は１～２ｎｇ/ｍＬであるといった問題がある。また、上記ＶＥＴ－ＲＰＬＡ「生研」の添付文書でも述べられているが、コレラ毒素の相同因子である大腸菌易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）も同感度で検出されるという問題もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開昭５８－２２２０３３号公報
【特許文献2】特開昭６２－２６５９９３号公報
【特許文献3】特開昭６２－２６５９９４号公報
【特許文献4】特開昭６２－２６５９９８号公報
【特許文献5】特開平５－２７６９９６号公報
【特許文献6】特開平７－８２７９号公報
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】R.-G. Zhang, D. L. Scott, M. L. Westbrook, S. Nance, B. D. Spangler, G. G. Shipley and E. M. Westbrook. 1995 The three-dimensional crystal structure of cholera toxin. Journal of Molecular Biology 251563-573
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明が解決しようとする課題は、医療現場、食品汚染現場、検査室内など様々な場面で必要とされるコレラ毒素（ＣＴ）の検出を、簡便、迅速、高感度に行うことである。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を行った。まず、コレラ毒素のBサブユニット（ＣＴｘＢ）とアジュバントを含む抗原液を、ＢＡＬＢ／ｃマウスに接種した。接種後、マウスの脾細胞またはリンパ節細胞とＰ３Ｕ１とを融合させてハイブリドーマを作製し、その中から、ＣＴｘＢに対して高い反応性を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選抜し、ＣＴｘＢに対して優れた反応性を示す抗体を産生する４つのハイブリドーマを取得することに成功した。
【0010】
次いで、これらのモノクローナル抗体を用いて、イムノクロマトグラフィーによりＣＴｘＢおよび全長コレラ毒素（ＣＴｘ）の検出をそれぞれ行ったところ、高感度でＣＴｘＢおよびＣＴｘを検出し得る結果を得た。
【0011】
そこで、第一の態様において、本発明は、イムノクロマト法による検体中のコレラ毒素の検出方法（以下、本発明の検出方法と略す）であって、下記群（以下、本発明の抗体群と略す）から選択される同一または異なる２種の抗体を各々標識抗体および捕捉抗体として用いることを特徴とする、方法を提供する：
１）少なくともＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号９のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号１２のアミノ酸配列を有する、２Ｇ６抗体；
２）少なくともＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号１９のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号２２のアミノ酸配列を有する、３Ｆ７抗体；
３）少なくともＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号２９のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号３２のアミノ酸配列を有する、４Ｅ６抗体；
４）少なくともＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号３９のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号４２のアミノ酸配列を有する、８Ａ５抗体；および
５）上記１）～４）の抗体の各ＶＨ ＣＤＲ３領域および／またはＶＬ ＣＤＲ３領域において１または２個のアミノ酸変異を有する、抗体。
１）少なくともＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号９のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号１２のアミノ酸配列を有する、２Ｇ６抗体；
２）少なくともＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号１９のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号２２のアミノ酸配列を有する、３Ｆ７抗体；
３）少なくともＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号２９のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号３２のアミノ酸配列を有する、４Ｅ６抗体；
４）少なくともＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号３９のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号４２のアミノ酸配列を有する、８Ａ５抗体；および
５）上記１）～４）の抗体の各ＶＨ ＣＤＲ３領域および／またはＶＬ ＣＤＲ３領域において１または２個のアミノ酸変異を有する、抗体。
【0012】
本発明の抗体群に属する抗体は、好ましくは、単離された抗体である。本発明の抗体群に属する抗体は、いずれもポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、非特異的反応による誤検出を防止する観点から好ましくはモノクローナル抗体である。
【0013】
より好ましくは、本発明の抗体群に属する抗体は、コレラ毒素に対して５．０ｘ１０－９M以下、より好ましくは１．０ｘ１０－９M以下、さらに好ましくは５．０ｘ１０－１０M以下の平衡解離定数ＫＤを有する。
【0014】
上記５）の抗体において、アミノ酸変異は、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入のいずれであってもよいが、好ましくは置換、免疫学的特異性維持の観点からとりわけ好ましくは保存的アミノ酸置換である。
【0015】
さらに好ましい態様において、本発明の抗体群は、下記特徴を有する：
１）少なくともＶＨ ＣＤＲ１領域として配列番号７のアミノ酸配列、ＶH ＣＤＲ２領域として配列番号８のアミノ酸配列、ＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号９のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ１領域として配列番号１０のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ２領域として配列番号１１のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号１２のアミノ酸配列を有する、２Ｇ６抗体；
２）少なくともＶＨ ＣＤＲ１領域として配列番号１７のアミノ酸配列、ＶH ＣＤＲ２領域として配列番号１８のアミノ酸配列、ＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号１９のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ１領域として配列番号２０のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ２領域として配列番号２１のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号２２のアミノ酸配列を有する、３Ｆ７抗体；
３）少なくともＶＨ ＣＤＲ１領域として配列番号２７のアミノ酸配列、ＶH ＣＤＲ２領域として配列番号２８のアミノ酸配列、ＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号２９のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ１領域として配列番号３０のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ２領域として配列番号３１のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号３２のアミノ酸配列を有する、４Ｅ６抗体；
４）少なくともＶＨ ＣＤＲ１領域として配列番号３７のアミノ酸配列、ＶH ＣＤＲ２領域として配列番号３８のアミノ酸配列、ＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号３９のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ１領域として配列番号４０のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ２領域として配列番号４１のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号４２のアミノ酸配列を有する、８Ａ５抗体；および
５）上記１）～４）の抗体の各ＶＨ ＣＤＲ１領域、ＶＨ ＣＤＲ２領域、ＶＨＣＤＲ３領域、ＶＬ ＣＤＲ１領域、ＶＬ ＣＤＲ２領域および／またはＶＬ ＣＤＲ３領域において１または２個のアミノ酸変異を有する、抗体。
１）少なくともＶＨ ＣＤＲ１領域として配列番号７のアミノ酸配列、ＶH ＣＤＲ２領域として配列番号８のアミノ酸配列、ＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号９のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ１領域として配列番号１０のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ２領域として配列番号１１のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号１２のアミノ酸配列を有する、２Ｇ６抗体；
２）少なくともＶＨ ＣＤＲ１領域として配列番号１７のアミノ酸配列、ＶH ＣＤＲ２領域として配列番号１８のアミノ酸配列、ＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号１９のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ１領域として配列番号２０のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ２領域として配列番号２１のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号２２のアミノ酸配列を有する、３Ｆ７抗体；
３）少なくともＶＨ ＣＤＲ１領域として配列番号２７のアミノ酸配列、ＶH ＣＤＲ２領域として配列番号２８のアミノ酸配列、ＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号２９のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ１領域として配列番号３０のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ２領域として配列番号３１のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号３２のアミノ酸配列を有する、４Ｅ６抗体；
４）少なくともＶＨ ＣＤＲ１領域として配列番号３７のアミノ酸配列、ＶH ＣＤＲ２領域として配列番号３８のアミノ酸配列、ＶＨ ＣＤＲ３領域として配列番号３９のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ１領域として配列番号４０のアミノ酸配列、ＶＬ ＣＤＲ２領域として配列番号４１のアミノ酸配列およびＶＬ ＣＤＲ３領域として配列番号４２のアミノ酸配列を有する、８Ａ５抗体；および
５）上記１）～４）の抗体の各ＶＨ ＣＤＲ１領域、ＶＨ ＣＤＲ２領域、ＶＨＣＤＲ３領域、ＶＬ ＣＤＲ１領域、ＶＬ ＣＤＲ２領域および／またはＶＬ ＣＤＲ３領域において１または２個のアミノ酸変異を有する、抗体。
【0016】
より好ましい態様において、本発明の抗体群は、下記特徴を有する：
１）ＶＨ領域として配列番号３のアミノ酸配列およびＶＬ領域として配列番号５のアミノ酸配列を有する、２Ｇ６抗体；
２）ＶＨ領域として配列番号１３のアミノ酸配列およびＶＬ領域として配列番号１５のアミノ酸配列を有する、３Ｆ７抗体；
３）ＶＨ領域として配列番号２３のアミノ酸配列およびＶＬ領域として配列番号２５のアミノ酸配列を有する、４Ｅ６抗体；
４）ＶＨ領域として配列番号３３のアミノ酸配列およびＶＬ領域として配列番号３５のアミノ酸配列を有する、８Ａ５抗体；および
５）上記１）～４）の抗体と８０％以上の配列同一性を有する、抗体。
１）ＶＨ領域として配列番号３のアミノ酸配列およびＶＬ領域として配列番号５のアミノ酸配列を有する、２Ｇ６抗体；
２）ＶＨ領域として配列番号１３のアミノ酸配列およびＶＬ領域として配列番号１５のアミノ酸配列を有する、３Ｆ７抗体；
３）ＶＨ領域として配列番号２３のアミノ酸配列およびＶＬ領域として配列番号２５のアミノ酸配列を有する、４Ｅ６抗体；
４）ＶＨ領域として配列番号３３のアミノ酸配列およびＶＬ領域として配列番号３５のアミノ酸配列を有する、８Ａ５抗体；および
５）上記１）～４）の抗体と８０％以上の配列同一性を有する、抗体。
【0017】
第二の態様において、本発明は、コレラ毒素の検出用抗体であって、上記本発明の抗体群から選択されるいずれか1種の抗体または同一または異なる２種以上の抗体の組合せを提供する。当該抗体の組合せは、例えば、イムノクロマト法によるコレラ毒素の検出用抗体としての同一または異なる２種の抗体の組合せである。より好ましくは、上記４）の８Ａ５抗体または５）の抗体のうち４）の８Ａ５抗体に由来する抗体の同一の抗体の組合せ、最も好ましくは上記４）の８Ａ５抗体の同一の抗体の組合せである。
【0018】
第三の態様において、本発明は、上記本発明の抗体群から選択されるいずれかの抗体または抗体の組合せを含むことを特徴とする、コレラ毒素検出用イムノクロマトキットを提供する。当該キットは、例えば、４）の８Ａ５抗体を含んでおり、かつ、４）の８Ａ５抗体が金コロイドと感作して標識抗体をなしており、４）の８Ａ５抗体が固層上に線状に固定されて捕捉抗体をなしている。
【発明の効果】
【0019】
本発明を用いることで、医療現場でも食中毒原因コレラ毒素を簡便（例えばキット化することで特別な検査室を必要としない）、迅速（試験時間：1時間未満、好ましくは30分未満、例えば１５分）、そして高感度（検出感度：～１ｎｇ／ｍＬ、好ましくは～０．２５ｎｇ／ｍＬ）に検出できる。さらに、本発明の抗体群に属する抗体は、コレラ毒素の相同因子である大腸菌易熱性エンテロトキシンのＢサブユニット（ＬＴＢ）については１００ｎｇ／ｍＬの高濃度条件でのみ検出することから、コレラ毒素検出の特異度は高いと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】本発明の抗体群を得るためのハイブリドーマ作成法のスキームを示す。
【図2】候補抗体１０種のＣＴｘＢ反応性を示す。左の棒が抗原であるＣＴｘＢ、右の棒がネガティブコントロールである腸内細菌死菌体のＥＬＩＳＡでのＯＤ４５０を示す。
【図3】精製済みの候補抗体６種のＣＴｘＢに対する反応性を示す。左の棒が抗原であるＣＴｘＢの濃度１．０μｇ／ｍＬ、右の棒が０．１μｇ／ｍＬのＥＬＩＳＡでのＯＤ４５０を示す。
【図4】精製済みの候補抗体６種のＣＴｘに対する反応性を示す。左の棒が抗原であるＣＴｘの濃度１．０μｇ／ｍＬ、右の棒が０．１μｇ／ｍＬのＥＬＩＳＡでのＯＤ４５０を示す。
【図5】表面プラズモン共鳴法による精製済みの候補抗体６種のＣＴｘＢに対するアフィニティを示す。
【図6】金コロイド感作させた候補抗体とテストラインに用いる候補抗体の各組合せで、水、ＰＢＳのみあるいはＣＴｘＢ ０．１、１、１０および１００ｎｇ/ｍＬのイムノクロマトグラフを示す。
【図7】金コロイド感作させた候補抗体とテストラインに用いる候補抗体の各組合せで、１％ＰＢＳのみ、ＣＴｘＢ １０ｎｇ/ｍＬおよびＬＴＢ １０ｎｇ/ｍＬのイムノクロマトグラフを示す。
【図8】ＣＴｘ（０、０．２５、０．５、１．０または１０ｎｇ/ｍＬ）、ＣＴｘＢ（０、０．２５、０．５、１．０または１０ｎｇ/ｍＬ）またはＬＴＢ（０、０．２５、０．５、１．０、１０または１００ｎｇ/ｍＬ）を展開液１％ＮＰ４０－ＰＢＳに調製懸濁させ、金コロイド感作：８Ａ５、テストライン：８Ａ５のイムノクロマト試薬に展開したイムノクロマトグラフを示す。
【図9】ＣＴｘ（０、１．０または１０ｎｇ/ｍＬ）、ＣＴｘＢ（０、１．０または１０ｎｇ/ｍＬ）またはＬＴＢ（０、１．０、１０または１００ｎｇ/ｍＬ）を健常人便に懸濁した展開液１％ＮＰ４０－ＰＢＳに調製懸濁させ、金コロイド感作：８Ａ５、テストライン：８Ａ５のイムノクロマト試薬に展開したイムノクロマトグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【0021】
以下に本発明の詳細な説明をするが、本明細書において用いられる用語は、微生物学、生化学、分子生物学、医学及び薬学分野における一般的な定義に従って理解される。ただし、本明細書において特に説明または定義されている用語については、本明細書における説明または定義が優先する。また、本明細書中に引用されている文献については、参照により本明細書の一部とする。
【0022】
第一の態様において、本発明は、上記の通り、イムノクロマト法による検体中のコレラ毒素の検出方法を提供する。イムノクロマト法は、標識抗体と捕捉抗体を用いて抗原を検出する免疫測定法として理解されている。典型的には、イムノクロマト法の工程は、検体と標識抗体とを接触させ、固層の検体適用部分に検体を適用し、検体中の標識抗体―抗原結合体を展開させ、判定部分に固着させた捕捉抗体によって標識抗体－抗原結合体を捕捉して、標識抗体－抗原－捕捉抗体結合体を形成させてこれを目視ないし適切な測定装置によって判定するという工程である。したがって、本発明の検出方法は、典型的には、１）検体と標識抗体とを接触させる工程、２）標識抗体と接触させた検体を、捕捉抗体を固着させた判定部分を有する固層上で展開させる工程、３）判定部分を確認する工程を含む。
【0023】
本発明の検出方法において、検体は、糞便、汚水、飲料品、食品等の食中毒検査に用いられるどのような検体であってもよく、水や緩衝液等で希釈または懸濁した検体であってもよい。また、検体なる表現には、検体または検体の希釈液もしくは懸濁液だけでなく、それらと標識抗体の混合物も含意される。
【0024】
本発明の検出方法において、標識抗体は、本発明の抗体群から選択されるいずれかの抗体を標識化したものである。標識化の手段は、当該技術分野において通常用いられるどのような手段であってもよく、典型的には、抗体に金属コロイド、蛍光色素、磁性ラテックスビーズ等を結合させる手段、例えば抗体に金属コロイドとして金コロイド粒子を感作させることが含まれるが、これらに限定されない。
【0025】
本発明の検出方法において、捕捉抗体は、標識抗体と同一の抗原、すなわちコレラ毒素に結合する抗体である。典型的には捕捉抗体は検体を展開する固層上に固着して使用する。かかる捕捉抗体によって、標識抗体と結合した抗原、すなわち標識抗体結合コレラ毒素を固層上に捕捉する。典型的には、捕捉抗体は、固層の一部に、例えば泳動方向と直交する線状に固着されて判定部分を形成する。
【0026】
本発明の検出方法において、固層は、イムノクロマトアッセイにおいて通常用いられるどのような固層であってもよく、例えばガラス繊維、ナイロン、ニトロセルロース、ポリビニリデンジフルオライド、セルロースアセテートなどの微多孔質物質からなる固層を用いることができるが、これらに限定されない。さらに、当該固層は、機能的に説明すれば、検体適用部分、泳動部分および判定部分を含む。
【0027】
本発明の検出方法において、検体の展開方法は、固層に応じて適宜選択される。例えば展開は、固層の毛細管現象によるものであっても、電気などの外力を加えた泳動であってもよい。必要な装置が少なくすむという簡便さのため、固層の毛細管現象を利用した泳動が好ましい。
【0028】
本発明の検出方法において、判定ないし判定部分の確認は、標識抗体に応じて適宜選択される。例えばかかる判定ないし判定部分の確認には、目視のほか、蛍光測定装置などを利用した測定が含まれる。必要な装置が少なくすむという簡便さのため目視が好ましいが、蛍光測定を用いる場合には蛍光強度による定量的測定が可能という利点もある。
【0029】
本発明の検出方法の検出対象であるコレラ毒素は、配列番号１で表わされるアミノ酸からなるＡサブユニットと、５個の配列番号２で表わされるアミノ酸からなるＢサブユニットとが、組み合わさって成る。コレラ毒素の詳細な構造は、公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋなど）に登録されている。コレラ毒素のＡサブユニットとＢサブユニットのアミノ酸配列を以下に具体的に示す。コレラ毒素はＣＴと略され、単にコレラ毒素と記述する場合にはその全長と断片、例えばサブユニットの両方を含意する。特にコレラ毒素の全長をＣＴｘ、ＡサブユニットをＣＴｘＡ、ＢサブユニットをＣＴｘＢと称する。なお、すべてのアミノ酸配列において、1文字表記と3文字表記が相互に一義的に変換可能であることは当然に理解される。
【0030】
ＣＴｘＡのアミノ酸配列（配列番号１）：
ＭＶＫＩＩＦＶＦＦＩＦＬＳＳＦＳＹＡＮＤＤＫＬＹＲＡＤＳＲＰＰＤＥＩＫＱＳＧＧＬＭＰＲＧＱＳＥＹＦＤＲＧＴＱＭＮＩＮＬＹＤＨＡＲＧＴＱＴＧＦＶＲＨＤＤＧＹＶＳＴＳＩＳＬＲＳＡＨＬＶＧＱＴＩＬＳＧＨＳＴＹＹＩＹＶＩＡＴＡＰＮＭＦＮＶＮＤＶＬＧＡＹＳＰＨＰＤＥＱＥＶＳＡＬＧＧＩＰＹＳＱＩＹＧＷＹＲＶＨＦＧＶＬＤＥＱＬＨＲＮＲＧＹＲＤＲＹＹＳＮＬＤＩＡＰＡＡＤＧＹＧＬＡＧＦＰＰＥＨＲＡＷＲＥＥＰＷＩＨＨＡＰＰＧＣＧＮＡＰＲＳＳＭＳＮＴＣＤＥＫＴＱＳＬＧＶＫＦＬＤＥＹＱＳＫＶＫＲＱＩＦＳＧＹＱＳＤＩＤＴＨＮＲＩＫＤＥＬ
ＭＶＫＩＩＦＶＦＦＩＦＬＳＳＦＳＹＡＮＤＤＫＬＹＲＡＤＳＲＰＰＤＥＩＫＱＳＧＧＬＭＰＲＧＱＳＥＹＦＤＲＧＴＱＭＮＩＮＬＹＤＨＡＲＧＴＱＴＧＦＶＲＨＤＤＧＹＶＳＴＳＩＳＬＲＳＡＨＬＶＧＱＴＩＬＳＧＨＳＴＹＹＩＹＶＩＡＴＡＰＮＭＦＮＶＮＤＶＬＧＡＹＳＰＨＰＤＥＱＥＶＳＡＬＧＧＩＰＹＳＱＩＹＧＷＹＲＶＨＦＧＶＬＤＥＱＬＨＲＮＲＧＹＲＤＲＹＹＳＮＬＤＩＡＰＡＡＤＧＹＧＬＡＧＦＰＰＥＨＲＡＷＲＥＥＰＷＩＨＨＡＰＰＧＣＧＮＡＰＲＳＳＭＳＮＴＣＤＥＫＴＱＳＬＧＶＫＦＬＤＥＹＱＳＫＶＫＲＱＩＦＳＧＹＱＳＤＩＤＴＨＮＲＩＫＤＥＬ
【0031】
ＣＴｘＢのアミノ酸配列（配列番号２）：
ＭＩＫＬＫＦＧＶＦＦＴＶＬＬＳＳＡＹＡＨＧＴＰＱＮＩＴＤＬＣＡＥＹＨＮＴＱＩＹＴＬＮＤＫＩＦＳＹＴＥＳＬＡＧＫＲＥＭＡＩＩＴＦＫＮＧＡＩＦＱＶＥＶＰＧＳＱＨＩＤＳＱＫＫＡＩＥＲＭＫＤＴＬＲＩＡＹＬＴＥＡＫＶＥＫＬＣＶＷＮＮＫＴＰＨＡＩＡＡＩＳＭＡＮ
ＭＩＫＬＫＦＧＶＦＦＴＶＬＬＳＳＡＹＡＨＧＴＰＱＮＩＴＤＬＣＡＥＹＨＮＴＱＩＹＴＬＮＤＫＩＦＳＹＴＥＳＬＡＧＫＲＥＭＡＩＩＴＦＫＮＧＡＩＦＱＶＥＶＰＧＳＱＨＩＤＳＱＫＫＡＩＥＲＭＫＤＴＬＲＩＡＹＬＴＥＡＫＶＥＫＬＣＶＷＮＮＫＴＰＨＡＩＡＡＩＳＭＡＮ
【0032】
本発明において、抗体は、いわゆる完全な抗体の他に、様々な構造、例えば、抗体断片、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体融合物、及びそれぞれの断片などであってよいが、これらに限定されない。
【0033】
抗体は、典型的には軽鎖と重鎖のペア2つからなる４量体であり、各鎖のアミノ末端部分には、抗原認識に主に関与する可変領域が含まれる。可変領域では３つのループが重鎖及び軽鎖の各Ｖドメイン（重鎖についてVH、軽鎖についてVLとも称する）について集合しており、抗原結合部位を形成する。各ループは、相補性決定領域とも称され（以下、「ＣＤＲ」とも称する）、この部分におけるアミノ酸配列の変異が最も顕著である。「可変」とは、可変領域の特定のセグメントが、抗体の配列において広範囲に異なるという事実を意味する。可変領域内の可変性は、均一に分布していない。代わりに、Ｖドメインは、それぞれ９～１５アミノ酸長以上の「超可変領域」と称される極度に可変性の短い領域により区分される１５～３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と称される比較的不変の構造からなる。各ＶＨ及びＶＬは、３つの超可変領域（「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」とも）と４つのＦＲからなり、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へ配置される。ＣＤＲの中でもとりわけＣＤＲ３が相補性の決定に重要なセグメントであり、次いで他のＣＤＲが相補性の決定に寄与する。ＦＲは、相補性の決定において、ほとんどまたは全く寄与しない。このため、抗原との結合特異性という観点において抗体を特定する場合には、抗体の全アミノ酸配列を特定するのではなく、ＣＤＲ配列、例えばＣＤＲ２のアミノ酸配列のみ、あるいはＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を特定することによって、十分に抗体を特定できる。
【0034】
一実施態様において、抗体は抗体断片である。具体的な抗体断片としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）単一の可変領域からなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６、参照により全体を援用する）；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）２つの結合したＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）であって、ＶＨドメイン及びＶＬドメインが、２つのドメインが会合して抗原結合部位を形成することができるペプチドリンカーにより結合されているもの（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５８７９－５８８３、参照によりその全体が援用される）；（ｖｉｉｉ）二重特異性単鎖Ｆｖ（ＷＯ０３／１１１６１、参照により本明細書に援用される）；及び（ｉｘ）遺伝子融合により構築された多価または多重特異性（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）断片である「ダイアボディ」または「トリアボディ」（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ． ａｌ．，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６：４６１－４７９；ＷＯ９４／１３８０４；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４－６４４８、参照により全て、その全体が援用される）。
【0035】
いくつかの実施態様において、抗体は異なる種由来の混合物であってよく、例えば、キメラ抗体及び／またはヒト化抗体などであってよい。すなわち、本発明において、ＣＤＲセットは、本明細書において配列により具体的に記載されるもの以外のフレームワーク及び定常領域とともに使用されてよい。
【0036】
一般に、「キメラ抗体」及び「ヒト化抗体」はともに、２以上の種由来の領域を組み合わせた抗体を意味する。例えば、「キメラ抗体」は、従来、マウス（またはいくつかの場合ではラット）由来の可変領域（１つ以上）とヒト由来の定常領域（１つ以上）とを含む。「ヒト化抗体」は、通常、ヒト抗体で見られる配列と交換された可変ドメインフレームワーク領域を有している非ヒト抗体を意味する。一般に、ヒト化抗体においては、ＣＤＲを除く抗体全体は、ヒト起源のポリヌクレオチドによりコードされるか、またはそのＣＤＲ内を除いてそのような抗体と同一である。ＣＤＲは、そのいくつかまたは全てが非ヒト生物由来の核酸によりコードされ、ヒト抗体可変領域のβシートフレームワークへとグラフトされて抗体を作っており、その特異性はグラフトされたＣＤＲにより決定される。このような抗体の作製は、例えば、ＷＯ９２／１１０１８、Ｊｏｎｅｓ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－１５３６などに記載されており、これらは全て、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【0037】
一実施態様において、抗体はミニボディである。ミニボディは、ＣＨ３ドメインと連結されたｓｃＦｖを含む最小化抗体様タンパク質である（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３０５５－３０６１、参照によりその全体が援用される）。いくつかの場合において、ｓｃＦｖはＦｃ領域と連結されてよく、ヒンジ領域のいくつかまたは全体を含んでよい。
【0038】
本発明の抗体は、通常、単離されるか、または組換えられる。「単離される」とは、本明細書で開示する様々なポリペプチドを記載するために使用する場合、ポリペプチドが発現される細胞または細胞培養物から同定され且つ分離され、且つ／または回収されたポリペプチドを意味する。通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程により調製される。「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を意味する。例えば、コレラ毒素と特異的に結合する単離された抗体は、コレラ毒素以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない。
【0039】
複数の単離されたモノクローナル抗体は、本発明の検出方法において、組み合わせて、例えばイムノクロマト法による場合には、一方を標識化することで標識抗体をなし他方を固層に固着させることで捕捉抗体をなして、使用することができる。
【0040】
本発明の抗体群から選択される抗体は、コレラ毒素と特異的に結合する。「特異的結合」または「特異的に結合する」、または特定の抗原若しくは抗原断片に「特異的」であるとは、非特異的相互作用と測定可能な程度に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、コントロール分子の結合と比較して、分子の結合を決定することにより測定でき、コントロール分子は、通常、結合活性を有さない類似構造の分子である。例えば、特異的結合は、標的と類似するコントロール分子との競合により決定され得る。
【0041】
特定の抗原または抗原断片に対する特異的結合は、例えば、少なくとも約１．０ｘ１０－１、少なくとも約５．０ｘ１０－２または好ましくは少なくとも約１．０ｘ１０－２の抗原または抗原断片に対するＫｄ（１／ｓ）を有する抗体により示される。ここで、Ｋｄとは、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度定数を意味する。典型的には、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原または抗原断片に対するコントロール分子について２０～、５０～、１００～、５００～、１０００～、５，０００～倍以上のＫｄを有する。
【0042】
さらに、特定の抗原または抗原断片に対する特異的結合は、例えば、コントロールに対する抗原または抗原断片について少なくとも２０～、５０～、１００～、５００～、１０００～、５，０００～倍以上の抗原または抗原断片に対する結合速度定数Ｋａ（１／Ｍｓ）を有する抗体により示され、ここで、Ｋａは、特定の抗体－抗原相互作用の結合速度を意味する。
【0043】
さらに、特定の抗体と当該抗体と特異的に結合する抗原または抗原断片との結合特性は、平衡解離定数ＫＤ（Ｍ）として、Ｋｄ／Ｋｓにより求められる。平衡解離定数はあるいはアフィニティとも呼ばれる。高い結合特性は、低いKD値として表現され、例えば本発明の検出方法において使用される抗体は、コレラ毒素に対して２５℃で５．０ｘ１０－９M以下、より好ましくは１．０ｘ１０－９M以下、さらに好ましくは５．０ｘ１０－１０M以下のＫＤを有し、３７℃で１．０ｘ１０－９Ｍ以下、より好ましくは５．０ｘ１０－１０Ｍ以下、さらに好ましくは１．０ｘ１０－１０Ｍ以下のＫＤを有する。
【0044】
抗体と抗原との結合速度定数、解離速度定数および平行解離定数は、いずれも、当該技術分野において既知の手法によって容易に求めることができる。かかる手法としては、例えば、抗原架橋法、抗体架橋法およびキャプチャー法等を含むいわゆる表面プラズモン共鳴法がしばしば用いられるが、これらに限定されない。
【0045】
本発明の第２の態様において、本発明は、コレラ毒素と特異的に結合する抗体群を提供する。本発明の抗体群に含まれる抗体は、単独で、または2種以上の組合せで使用することができる。また、本発明の抗体群から選択されるいずれか1種の抗体と、本発明の抗体群の他の抗体、例えばコレラ毒素と結合する他の抗体とを、組合せて使用することもできる。
【0046】
最も好ましい態様において、本発明の抗体１）２Ｇ６は、そのＶＨが配列番号３で表わされるアミノ酸配列を有し、そのＶＬが配列番号５で表わされるアミノ酸配列を有する。また、抗体１）のＶＨをコードする遺伝子は配列番号４で表わされる塩基配列を有し、抗体１）のＶＬをコードする遺伝子は配列番号６で表わされる。抗体１）のアミノ酸配列及びこれをコードする遺伝子の塩基配列を以下に具体的に示す。
【0047】
抗体１）のＶＨのアミノ酸配列（配列番号３）：
ＥＧＱＬＱＥＳＧＡＥＬＡＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＦＩＮＰＹＴＧＦＴＥＹＳＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＩＱＬＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＳＲＲＦＮＹＧＳＡＹＦＤＦＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
ＥＧＱＬＱＥＳＧＡＥＬＡＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＦＩＮＰＹＴＧＦＴＥＹＳＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＩＱＬＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＳＲＲＦＮＹＧＳＡＹＦＤＦＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
【0048】
抗体１）のＶＨをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号４）：
ｇａｇｇｇｇｃａｇｃ ｔｔｃａｇｇａｇｔｃ ｔｇｇｇｇｃｔｇａａ ｃｔｇｇｃａａａａｃ ｃｔｇｇｇｇｃｃｔｃ ａｇｔｇａａｇａｔｇ ｔｃｃｔｇｃａａｇｇ ｃｔｔｃｔｇｇｃｔａ ｃａｃｃｔｔｔａｃｔ ａｇｃｔａｃｔｇｇａ ｔｇｃａｃｔｇｇｇｔ ａａａａｃａｇａｇｇ ｃｃｔｇｇａｃａｇｇ ｇｔｃｔｇｇａａｔｇ ｇａｔｔｇｇａｔｔｃ ａｔｔａａｔｃｃｔｔ ａｃａｃｔｇｇｔｔｔ ｔａｃｔｇａｇｔａｃ ａｇｔｃａｇａａｇｔ ｔｃａａｇｇａｃａａ ｇｇｃｃａｃａｔｔｇ ａｃｔｇｃａｇａｃａ ａａｔｃｃｔｃｃａｇ ｔａｃａｇｃｃｔａｃ ａｔａｃａａｃｔｇａ ａｃａｇｃｃｔｇａｃ ａｔｃｔｇａｇｇａｃ ｔｃｔｇｃａｇｔｃｔ ａｔｔａｃｔｇｔｔｃ ａａｇａａｇｇｔｔｔ ａａｃｔａｃｇｇｔａ ｇｔｇｃｃｔａｃｔｔ ｔｇａｃｔｔｃｔｇｇ ｇｇｃｃａａｇｇｃａ ｃｃａｃｔｃｔｃａｃ ａｇｔｃｔｃｃｔｃａ
ｇａｇｇｇｇｃａｇｃ ｔｔｃａｇｇａｇｔｃ ｔｇｇｇｇｃｔｇａａ ｃｔｇｇｃａａａａｃ ｃｔｇｇｇｇｃｃｔｃ ａｇｔｇａａｇａｔｇ ｔｃｃｔｇｃａａｇｇ ｃｔｔｃｔｇｇｃｔａ ｃａｃｃｔｔｔａｃｔ ａｇｃｔａｃｔｇｇａ ｔｇｃａｃｔｇｇｇｔ ａａａａｃａｇａｇｇ ｃｃｔｇｇａｃａｇｇ ｇｔｃｔｇｇａａｔｇ ｇａｔｔｇｇａｔｔｃ ａｔｔａａｔｃｃｔｔ ａｃａｃｔｇｇｔｔｔ ｔａｃｔｇａｇｔａｃ ａｇｔｃａｇａａｇｔ ｔｃａａｇｇａｃａａ ｇｇｃｃａｃａｔｔｇ ａｃｔｇｃａｇａｃａ ａａｔｃｃｔｃｃａｇ ｔａｃａｇｃｃｔａｃ ａｔａｃａａｃｔｇａ ａｃａｇｃｃｔｇａｃ ａｔｃｔｇａｇｇａｃ ｔｃｔｇｃａｇｔｃｔ ａｔｔａｃｔｇｔｔｃ ａａｇａａｇｇｔｔｔ ａａｃｔａｃｇｇｔａ ｇｔｇｃｃｔａｃｔｔ ｔｇａｃｔｔｃｔｇｇ ｇｇｃｃａａｇｇｃａ ｃｃａｃｔｃｔｃａｃ ａｇｔｃｔｃｃｔｃａ
【0049】
抗体１）のＶＬのアミノ酸配列（配列番号５）：
ＤＩＬＬＴＱＳＰＡＬＭＡＡＳＰＧＥＫＶＴＩＴＣＳＶＳＳＳＩＳＳＳＮＬＨＷＹＱＱＫＳＥＴＳＰＫＰＷＩＹＧＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＶＫ
ＤＩＬＬＴＱＳＰＡＬＭＡＡＳＰＧＥＫＶＴＩＴＣＳＶＳＳＳＩＳＳＳＮＬＨＷＹＱＱＫＳＥＴＳＰＫＰＷＩＹＧＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＶＫ
【0050】
抗体１）のＶＬをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号６）：
ｇａｃａｔｔｔｔｇｃ ｔｃａｃｔｃａｇｔｃ ｔｃｃａｇｃａｃｔｃ ａｔｇｇｃｔｇｃａｔ ｃｔｃｃａｇｇｇｇａ ｇａａｇｇｔｃａｃｃ ａｔｃａｃｃｔｇｔａ ｇｔｇｔｃａｇｃｔｃ ａａｇｔａｔａａｇｔ ｔｃｃａｇｃａａｃｔ ｔｇｃａｃｔｇｇｔａ ｃｃａｇｃａｇａａｇ ｔｃａｇａａａｃｃｔ ｃｃｃｃｃａａａｃｃ ｃｔｇｇａｔｔｔａｔ ｇｇｃａｃａｔｃｃａ ａｃｃｔｇｇｃｔｔｃ ｔｇｇａｇｔｃｃｃｔ ｇｔｔｃｇｃｔｔｃａ ｇｔｇｇｃａｇｔｇｇ ａｔｃｔｇｇｇａｃｃ ｔｃｔｔａｔｔｃｔｃ ｔｃａｃａａｔｃａｇ ｃａｇｃａｔｇｇａｇ ｇｃｔｇａａｇａｔｇ ｃｔｇｃｃａｃｔｔａ ｔｔａｃｔｇｔｃａａ ｃａｇｔｇｇａｇｔａ ａｔｔａｃｃｃａｃｔ ｃａｃｇｔｔｃｇｇａ ｇｇｇｇｇｇａｃｃａ ａｇｃｔｇｇａｇｇｔ ａａａａ
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【0051】
さらに抗体１）を詳細に分析して、ＶＨおよびＶＬのＣＤＲ１～３を各々特定した。本発明の抗体１）は、そのＶＨ ＣＤＲ１が配列番号７で、ＶＨ ＣＤＲ２が配列番号８で、ＶＨ ＣＤＲ３が配列番号９で表わされるアミノ酸配列を有し、そのＶＬ ＣＤＲ１が配列番号１０で、ＶＬ ＣＤＲ２が配列番号１１で、ＶＬ ＣＤＲ３が配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有する。ＶＨおよびＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を以下に具体的に示す。
【0052】
抗体１）のＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号７）：
ＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨ
抗体１）のＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号８）：
ＦＩＮＰＹＴＧＦＴＥＹＳＱＫＦＫＤ
抗体１）のＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号９）：
ＲＦＮＹＧＳＡＹＦＤＦ
抗体１）のＶＬ ＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号１０）：
ＳＶＳＳＳＩＳＳＳＮＬＨ
抗体１）のＶＬ ＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号１１）：
ＧＴＳＮＬＡＳ
抗体１）のＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号１２）：
ＱＱＷＳＮＹＰＬＴ
ＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨ
抗体１）のＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号８）：
ＦＩＮＰＹＴＧＦＴＥＹＳＱＫＦＫＤ
抗体１）のＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号９）：
ＲＦＮＹＧＳＡＹＦＤＦ
抗体１）のＶＬ ＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号１０）：
ＳＶＳＳＳＩＳＳＳＮＬＨ
抗体１）のＶＬ ＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号１１）：
ＧＴＳＮＬＡＳ
抗体１）のＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号１２）：
ＱＱＷＳＮＹＰＬＴ
【0053】
最も好ましい態様において、本発明の抗体２）３Ｆ７は、そのＶＨが配列番号１３で表わされるアミノ酸配列を有し、そのＶＬが配列番号１５で表わされるアミノ酸配列を有する。また、抗体２）のＶＨをコードする遺伝子は配列番号１４で表わされる塩基配列を有し、抗体２）のＶＬをコードする遺伝子は配列番号１６で表わされる。抗体２）のアミノ酸配列及びこれをコードする遺伝子の塩基配列を以下に具体的に示す。
【0054】
抗体２）のＶＨのアミノ酸配列（配列番号１３）：
ＱＡＹＬＱＱＳＧＰＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＳＹＹＭＨＷＶＲＱＲＨＧＫＳＬＥＷＩＧＹＩＤＰＦＮＧＤＴＲＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＨＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＨＹＣＡＲＷＡＹＹＤＳＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
ＱＡＹＬＱＱＳＧＰＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＳＹＹＭＨＷＶＲＱＲＨＧＫＳＬＥＷＩＧＹＩＤＰＦＮＧＤＴＲＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＨＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＨＹＣＡＲＷＡＹＹＤＳＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
【0055】
抗体２）のＶＨをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号１４）：
ｃａｇｇｃｔｔａｔｃ ｔｇｃａｇｃａｇｔｃ ｔｇｇａｃｃｔｇａｇ ｃｔｇａｔｇａａｇｃ ｃｔｇｇｇｇｃｔｔｃ ａｇｔｇａａｇａｔａ ｔｃｃｔｇｃａａｇｇ ｃｔｔｃｃｇｇｔｔａ ｃｔｃｔｔｔｃａｃｔ ａｇｃｔａｃｔａｃａ ｔｇｃａｃｔｇｇｇｔ ｇａｇｇｃａｇａｇａ ｃａｔｇｇａａａｇａ ｇｃｃｔｔｇａｇｔｇ ｇａｔｔｇｇａｔａｔ ａｔｔｇａｔｃｃｔｔ ｔｃａａｔｇｇｔｇａ ｔａｃｔａｇｇｔａｃ ａａｃｃａｇａａａｔ ｔｃａａｇｇｇｃａａ ｇｇｃｃａｃａｔｔｇ ａｃｔｇｔａｇａｃａ ａａｔｃｔｔｃｃａｇ ｃａｃａｇｃｃｔａｃ ａｔｇｃａｔｃｔｃａ ｇｃａｇｃｃｔｇａｃ ａｔｃｔｇａｇｇａｃ ｔｃｔｇｃａｇｔｃｃ ａｔｔａｃｔｇｔｇｃ ａａｇａｔｇｇｇｃｔ ｔａｃｔａｃｇａｔａ ｇｔｔａｔｔａｔｔｔ ｔｇａｃｔａｃｔｇｇ ｇｇｃｃａａｇｇｃａ ｃｃａｃｔｃｔｃａｃ ａｇｔｃｔｃｃｔｃａ
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【0056】
抗体２）のＶＬのアミノ酸配列（配列番号１５）：
ＤＶＶＶＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＥＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＧＦＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＬＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
ＤＶＶＶＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＥＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＧＦＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＬＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
【0057】
抗体２）のＶＬをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号１６）：
ｇａｔｇｔｔｇｔｇｇ ｔｇａｃｃｃａａａｃ ｔｃｃａｃｔｃｔｃｃ ｃｔｇｃｃｔｇｔｃａ ｇｔｃｔｔｇｇａｇａ ｇｃａａｇｃｃｔｃｃ ａｔｃｔｃｔｔｇｃａ ｇａｔｃｔａｇｔｃａ ｇｇｇｃｔｔｔｇｔａ ｃａｔａｇｔａａｔｇ ｇａａａｃａｃｃｔａ ｔｔｔａｇａａｔｇｇ ｔａｃｃｔｇｃａｇａ ａａｃｃａｇｇｃｃａ ｇｔｃｔｃｃａａａｇ ｃｔｃｃｔｇａｔｃｔ ａｃａａａｇｔｔｔｃ ｃａａｃｃｇａｔｔｔ ｔｃｔｇｇｇｇｔｃｃ ｃａｇａｃａｇｇｔｔ ｃａｇｔｇｇｃａｇｔ ｇｇａｔｃａｇｇｇａ ｃａｇａｔｔｔｃａｃ ａｃｔｃａａｇａｔｃ ａｇｃａｇａｇｔｇｇ ａｇｇｃｔｇａｇｇａ ｔｃｔｇｇｇａｇｔｔ ｔａｔｔａｃｔｇｔｃ ｔｔｃａａｇｇｔｔｃ ａｃａｔｇｔｔｃｃｇ ｃｔｃａｃｇｔｔｃｇ ｇｔｇｃｔｇｇｇａｃ ｃａａｇｃｔｇｇａｇ ｃｔｇａａａ
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【0058】
さらに抗体２）を詳細に分析して、ＶＨおよびＶＬのＣＤＲ１～３を各々特定した。本発明の抗体２）は、そのＶＨ ＣＤＲ１が配列番号１７で、ＶＨ ＣＤＲ２が配列番号１８で、ＶＨ ＣＤＲ３が配列番号１９で表わされるアミノ酸配列を有し、そのＶＬ ＣＤＲ１が配列番号２０で、ＶＬ ＣＤＲ２が配列番号２１で、ＶＬ ＣＤＲ３が配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を有する。ＶＨおよびＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を以下に具体的に示す。
【0059】
抗体２）のＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号１７）：
ＧＹＳＦＴＳＹＹＭＨ
抗体２）のＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号１８）：
ＹＩＤＰＦＮＧＤＴＲＹＮＱＫＦＫＧ
抗体２）のＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号１９）：
ＷＡＹＹＤＳＹＹＦＤＹ
抗体２）のＶＬ ＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号２０）：
ＲＳＳＱＧＦＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ
抗体２）のＶＬ ＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号２１）：
ＫＶＳＮＲＦＳ
抗体２）のＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号２２）：
ＬＱＧＳＨＶＰＬＴ
ＧＹＳＦＴＳＹＹＭＨ
抗体２）のＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号１８）：
ＹＩＤＰＦＮＧＤＴＲＹＮＱＫＦＫＧ
抗体２）のＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号１９）：
ＷＡＹＹＤＳＹＹＦＤＹ
抗体２）のＶＬ ＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号２０）：
ＲＳＳＱＧＦＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ
抗体２）のＶＬ ＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号２１）：
ＫＶＳＮＲＦＳ
抗体２）のＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号２２）：
ＬＱＧＳＨＶＰＬＴ
【0060】
最も好ましい態様において、本発明の抗体３）４Ｅ６は、そのＶＨが配列番号２３で表わされるアミノ酸配列を有し、そのＶＬが配列番号２５で表わされるアミノ酸配列を有する。また、抗体３）のＶＨをコードする遺伝子は配列番号２４で表わされる塩基配列を有し、抗体３）のＶＬをコードする遺伝子は配列番号２６で表わされる。抗体３）のアミノ酸配列及びこれをコードする遺伝子の塩基配列を以下に具体的に示す。
【0061】
抗体３）のＶＨのアミノ酸配列（配列番号２３）：
ＥＶＲＬＱＱＳＧＰＥＬＶＲＰＧＡＳＭＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＮＬＤＷＩＧＬＩＨＰＹＮＧＲＴＴＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＬＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＫＥＹＤＷＹＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＥＶＲＬＱＱＳＧＰＥＬＶＲＰＧＡＳＭＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＮＬＤＷＩＧＬＩＨＰＹＮＧＲＴＴＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＬＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＫＥＹＤＷＹＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳ
【0062】
抗体３）のＶＨをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号２４）：
ｇａｇｇｔｔｃｇｇｃ ｔｇｃａａｃａｇｔｃ ｔｇｇａｃｃｔｇａｇ ｃｔｇｇｔｇａｇｇｃ ｃｔｇｇａｇｃｔｔｃ ａａｔｇａａｇａｔａ ｔｃｃｔｇｃａａｇｇ ｃｔｔｃｔｇｇｔｔａ ｃｔｃａｔｔｃａｃｔ ｇｇｃｔａｃａｃｃａ ｔｇａａｃｔｇｇｇｔ ｇａａａｃａｇａｇｃ ｃａｔｇｇａａａｇａ ａｃｃｔｔｇａｃｔｇ ｇａｔｔｇｇａｃｔｔ ａｔｔｃａｔｃｃｔｔ ａｃａａｔｇｇｔｃｇ ｔａｃｔａｃｃｔａｃ ａａｃｃａｇａａｇｔ ｔｃａａｇｇｇｃａａ ｇｇｃｃａｃａｔｔａ ａｃｔｇｔａｇａｃａ ａｇｔｃａｔｃｃａｇ ｃａｃａｇｃｃｔａｃ ａｔｇｇａｇｃｔｃｃ ｔｃａｇｔｃｔｇａｃ ａｔｃｔｇａｇｇａｃ ｔｃｔｇｃａｇｔｃｔ ａｔｔａｃｔｇｔｇｃ ａａａａｇａｇｔａｃ ｇａｃｔｇｇｔａｃｔ ｔｃｇａｔｇｔｃｔｇ ｇｇｇｃｇｃａｇｇｇ ａｃｃａｃｇｇｔｃａ ｃｃｇｔｃｔｃｃｔｃ ａ
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【0063】
抗体３）のＶＬのアミノ酸配列（配列番号２５）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＬＧＤＴＩＴＩＴＣＨＡＳＱＮＩＮＩＷＬＳＷＹＱＱＫＰＧＮＩＰＫＬＬＩＹＱＡＳＮＬＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＧＦＫＬＴＩＲＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＱＳＹＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
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【0064】
抗体３）のＶＬをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号２６）：
ｇａｃａｔｃｃａｇａ ｔｇａｃａｃａｇｔｃ ｔｃｃａｔｃｃａｇｔ ｃｔｇｔｃｔｇｃａｔ ｃｃｃｔｔｇｇａｇａ ｃａｃａａｔｔａｃｃ ａｔｃａｃｔｔｇｃｃ ａｔｇｃｃａｇｔｃａ ｇａａｃａｔｔａａｔ ａｔｔｔｇｇｔｔａａ ｇｃｔｇｇｔａｃｃａ ｇｃａｇａａａｃｃａ ｇｇａａａｔａｔｔｃ ｃｔａａａｃｔａｔｔ ｇａｔｃｔａｔｃａｇ ｇｃｔｔｃｃａａｃｔ ｔｇｃａｃａｃａｇｇ ｃｇｔｃｃｃａｔｃａ ａｇｇｔｔｔａｇｔｇ ｇｃａｇｔｇｇａｔｃ ｔｇｇａａｃａｇｇｔ ｔｔｃａａａｔｔａａ ｃｃａｔｃｃｇｃａｇ ｃｃｔｇｃａｇｃｃｔ ｇａａｇａｃａｔｔｇ ｃｃａｃｔｔａｃｔａ ｃｔｇｔｃａａｃａｇ ｇｇｔｃａａａｇｔｔ ａｔｃｃｔｃｇｇａｃ ｇｔｔｃｇｇｔｇｇａ ｇｇｃａｃｃａａｇｃ ｔｇｇａａａｔｃａａ ａ
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【0065】
さらに抗体３）を詳細に分析して、ＶＨおよびＶＬのＣＤＲ１～３を各々特定した。本発明の抗体３）は、そのＶＨ ＣＤＲ１が配列番号２７で、ＶＨ ＣＤＲ２が配列番号２８で、ＶＨ ＣＤＲ３が配列番号２９で表わされるアミノ酸配列を有し、そのＶＬ ＣＤＲ１が配列番号３０で、ＶＬ ＣＤＲ２が配列番号３１で、ＶＬ ＣＤＲ３が配列番号３２で表わされるアミノ酸配列を有する。ＶＨおよびＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を以下に具体的に示す。
【0066】
抗体３）のＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号２７）：
ＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮ
抗体３）のＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号２８）：
ＬＩＨＰＹＮＧＲＴＴＹＮＱＫＦ
抗体３）のＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号２９）：
ＥＹＤＷＹＦＤＶ
抗体３）のＶＬ ＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号３０）：
ＨＡＳＱＮＩＮＩＷＬＳ
抗体３）のＶＬ ＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号３１）：
ＱＡＳＮＬＨＴ
抗体３）のＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号３２）：
ＱＱＧＱＳＹＰＲＴ
ＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮ
抗体３）のＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号２８）：
ＬＩＨＰＹＮＧＲＴＴＹＮＱＫＦ
抗体３）のＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号２９）：
ＥＹＤＷＹＦＤＶ
抗体３）のＶＬ ＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号３０）：
ＨＡＳＱＮＩＮＩＷＬＳ
抗体３）のＶＬ ＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号３１）：
ＱＡＳＮＬＨＴ
抗体３）のＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号３２）：
ＱＱＧＱＳＹＰＲＴ
【0067】
最も好ましい態様において、本発明の抗体４）８Ａ５は、そのＶＨが配列番号３３で表わされるアミノ酸配列を有し、そのＶＬが配列番号３５で表わされるアミノ酸配列を有する。また、抗体４）のＶＨをコードする遺伝子は配列番号３４で表わされる塩基配列を有し、抗体４）のＶＬをコードする遺伝子は配列番号３６で表わされる。抗体４）のアミノ酸配列及びこれをコードする遺伝子の塩基配列を以下に具体的に示す。
【0068】
抗体４）のＶＨのアミノ酸配列（配列番号３３）：
ＱＶＱＬＱＱＳＡＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＦＴＦＴＳＹＴＬＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＲＧＹＴＥＹＨＱＫＦＫＤＫＴＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＩＱＬＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＤＧＦＦＬＹＡＬＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
ＱＶＱＬＱＱＳＡＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＦＴＦＴＳＹＴＬＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＲＧＹＴＥＹＨＱＫＦＫＤＫＴＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＩＱＬＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＤＧＦＦＬＹＡＬＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
【0069】
抗体４）のＶＨをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号３４）：
ｃａｇｇｔｃｃａａｃ ｔｇｃａｇｃａｇｔｃ ｔｇｃａｇｃｔｇａａ ｃｔｇｇｃａａｇａｃ ｃｔｇｇｇｇｃｃｔｃ ａｇｔｇａａｇａｔｇ ｔｃｃｔｇｃａａｇｇ ｃｔｔｃｔｇｇｃｔｔ ｃａｃｃｔｔｔａｃｔ ａｇｃｔａｃａｃｇｔ ｔａｃａｃｔｇｇｇｔ ａａａａｃａｇａｇｇ ｃｃｔｇｇａｃａｇｇ ｇｔｃｔｇｇａａｔｇ ｇａｔｔｇｇａｔａｃ ａｔｔａａｔｃｃｃｃ ｇｔｇｇａｔａｔａｃ ｔｇａｇｔａｃｃａｔ ｃａｇａａｇｔｔｃａ ａｇｇａｃａａｇａｃ ｃａｃａｔｔｇａｃｔ ｇｃａｇａｃａａａｔ ｃｃｔｃｃａｇｃａｃ ａｇｃｃｔａｃａｔａ ｃａａｃｔｇａａｃａ ｇｃｃｔｇａｃａｔｃ ｔｇａｇｇａｃｔｃｔ ｇｃｇｇｔｃｔａｔｔ ａｃｔｇｔｇｃａａｇ ａｔａｔｇａｔｇｇｔ ｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔ ａｔｇｃｔｔｔｇｇａ ｃｔａｔｔｇｇｇｇｔ ｃａａｇｇａａｃｃｔ ｃａｇｔｃａｃｃｇｔ ｃｔｃｃｔｃａ
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【0070】
抗体４）のＶＬのアミノ酸配列（配列番号３５）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＭＹＡＳＬＧＥＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＳＮＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＹＲＡＳＲＬＶＨＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＳＬＴＩＳＳＬＥＹＥＤＭＧＩＹＳＣＬＱＹＤＥＦＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＭＹＡＳＬＧＥＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＳＮＬＳＷＦＱＱＫＰＧＫＳＰＫＴＬＩＹＲＡＳＲＬＶＨＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＱＤＹＳＬＴＩＳＳＬＥＹＥＤＭＧＩＹＳＣＬＱＹＤＥＦＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
【0071】
抗体４）のＶＬをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号３６）：
ｇａｃａｔｃｃａｇａ ｔｇａｃａｃａｇｔｃ ｔｃｃａｔｃｔｔｃｃ ａｔｇｔａｔｇｃａｔ ｃｔｃｔａｇｇａｇａ ｇａｇａｇｔｃａｃｔ ａｔｃａｃｔｔｇｃａ ａｇｇｃｇａｇｔｃａ ｇｇａｃａｔｔａａｔ ａｇｃａａｔｔｔａａ ｇｃｔｇｇｔｔｃｃａ ｇｃａｇａａａｃｃａ ｇｇｇａａａｔｃｔｃ ｃｔａａｇａｃｃｃｔ ｇａｔｃｔａｔｃｇｔ ｇｃａａｇｃａｇａｔ ｔｇｇｔａｃａｔｇｇ ｇｇｔｃｃｃａｔｃａ ａｇｇｔｔｃａｇｔｇ ｇｃａｇｔｇｇａｔｃ ｔｇｇｇｃａａｇａｔ ｔａｔｔｃｔｃｔｃａ ｃｃａｔｃａｇｃａｇ ｃｃｔｇｇａｇｔａｔ ｇａａｇａｔａｔｇｇ ｇａａｔｔｔａｔｔｃ ｔｔｇｔｃｔａｃａｇ ｔａｔｇａｔｇａｇｔ ｔｔｃｃｇｔａｃａｃ ｇｔｔｃｇｇａｇｇｇ ｇｇｇａｃｃａａｇｃ ｔｇｇａａａｔａａａ ａ
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【0072】
さらに抗体４）を詳細に分析して、ＶＨおよびＶＬのＣＤＲ１～３を各々特定した。本発明の抗体４）は、そのＶＨ ＣＤＲ１が配列番号３７で、ＶＨ ＣＤＲ２が配列番号３８で、ＶＨ ＣＤＲ３が配列番号３９で表わされるアミノ酸配列を有し、そのＶＬ ＣＤＲ１が配列番号４０で、ＶＬ ＣＤＲ２が配列番号４１で、ＶＬ ＣＤＲ３が配列番号４２で表わされるアミノ酸配列を有する。ＶＨおよびＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を以下に具体的に示す。
【0073】
抗体４）のＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号３７）：
ＧＦＴＦＴＳＹＴＬＨ
抗体４）のＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号３８）：
ＹＩＮＰＲＧＹＴＥＹＨＱＫＦＫＤ
抗体４）のＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号３９）：
ＹＤＧＦＦＬＹＡＬＤＹ
抗体４）のＶＬ ＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号４０）：
ＫＡＳＱＤＩＮＳＮＬＳ
抗体４）のＶＬ ＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号４１）：
ＲＡＳＲＬＶＨ
抗体４）のＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号４２）：
ＬＱＹＤＥＦＰＹＴ
ＧＦＴＦＴＳＹＴＬＨ
抗体４）のＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号３８）：
ＹＩＮＰＲＧＹＴＥＹＨＱＫＦＫＤ
抗体４）のＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号３９）：
ＹＤＧＦＦＬＹＡＬＤＹ
抗体４）のＶＬ ＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号４０）：
ＫＡＳＱＤＩＮＳＮＬＳ
抗体４）のＶＬ ＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号４１）：
ＲＡＳＲＬＶＨ
抗体４）のＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号４２）：
ＬＱＹＤＥＦＰＹＴ
【0074】
本発明は、さらに変異抗体も提供する。すなわち、本発明の抗体は多数の修飾がなされてよく、これには、ＣＤＲにおけるアミノ酸修飾（親和性成熟）、Ｆｃ領域におけるアミノ酸修飾、グリコシル化変異体、他のタイプの共有結合修飾などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0075】
本明細書において「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって親ポリペプチドのものと異なるポリペプチド配列を意味する。アミノ酸修飾には、置換、挿入および欠失が含まれてよく、多くの場合、置換、とりわけ保存的置換が好ましい。
【0076】
一般に、本明細書に記載するとおり、抗体の機能が依然として存在する限り、変異体には任意数の修飾が含まれてよい。すなわち、本発明の抗体群のいずれかのＣＤＲで作製されたアミノ酸変異体の場合、例えば、抗体は、ＣＴｘに依然として、特異的に結合すべきである。
【0077】
しかしながら、一般に、多くの場合、そのゴールは最小数の修飾で機能を変更することであるので、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換が通常利用される。いくつかの場合において、１～５個修飾が存在し、多くの実施態様においては、１～２、１～３、及び１～４個の修飾の使用も認められる。
【0078】
アミノ酸修飾の数は、機能的ドメインの範囲内であってよいことに留意すべきである：例えば、野生型または改変タンパク質のＦｃ領域では１～５個の修飾、例えばＦｖ領域では１～５個の修飾を有することが望ましい場合がある。変異ポリペプチド配列は、親配列（例えば、本発明の抗体群から選択されるいずれかの抗体の可変領域、定常領域、並びに／または重鎖及び軽鎖配列など）と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％または最大で９８若しくは９９％の同一性を有することが好ましい。配列サイズにもよるが、同一性の割合は、アミノ酸の数によって決まることに留意すべきである。
【0079】
本明細書において「アミノ酸置換」または「置換」とは、親ポリペプチド配列の特定の位置のアミノ酸を別のアミノ酸と交換することを意味する。例えば、置換Ｓ１００Ａとは、１００位のセリンをアラニンと交換した変異ポリペプチドをいう。本明細書で使用する場合、「アミノ酸挿入」または「挿入」とは、親ポリペプチド配列の特定の位置のアミノ酸の付加を意味する。本明細書で使用する場合に、「アミノ酸欠失」または「欠失」とは、親ポリペプチド配列における特定の位置のアミノ酸の除去を意味する。
【0080】
本明細書で使用する場合、「親ポリペプチド」、「親タンパク質」、「前駆体ポリペプチド」または「前駆体タンパク質」とは、変異体を作製するためにその後修飾される、非修飾のポリペプチドを意味する。通常、本明細書における親ポリペプチドは本発明の抗体群から選択されるいずれかの抗体である。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列をいうこともある。従って、本明細書で使用する場合、「親Ｆｃポリペプチド」とは、変異体を作製するために修飾されるＦｃポリペプチドを意味し、本明細書で使用する場合、「親抗体」とは、変異抗体を作製するために修飾される抗体を意味する。
【0081】
本明細書において「野生型」または「ＷＴ」または「天然」とは、アレル変異を含む、天然で発見されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。ＷＴタンパク質、ポリペプチド、抗体、免疫グロブリン、ＩｇＧなどは、意図的に修飾されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
【0082】
本明細書において「変異Ｆｃ領域」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって、野生型Ｆｃ配列のものとは異なるＦｃ配列を意味する。Ｆｃ変異体は、Ｆｃポリペプチド自体、Ｆｃ変異体ポリペプチドを含む組成物、またはアミノ酸配列をいうこともある。
【0083】
いくつかの実施態様において、１つ以上のアミノ酸修飾が、抗体の１つ以上のＣＤＲにおいてなされる。一般に、１または２個のアミノ酸のみが、いずれかの単一のＣＤＲにおいて置換され、通常は３、４、５、６、７、８、９または１０個以上の変化はＣＤＲのセット内ではなされない。しかしながら、任意のＣＤＲにおいて、置換されないか、１個または２個、あるいは３個以上の置換のいずれかの組合せが、任意の他の置換と、独立して任意選択で組み合わされ得る。
【0084】
いくつかの場合において、ＣＤＲにおけるアミノ酸修飾は、「親和性成熟」と称される。「親和性成熟された」抗体は、１つ以上のＣＤＲにおいて１つ以上の変更を有するものであり、その結果、これらの変更を有さない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性が改善される。いくつかの場合において、稀ではあるが、その抗原に対する抗体の親和性を低下させることが望ましい場合があるが、通常、これは好ましくない。
【0085】
親和性成熟は、「親」抗体と比較して、少なくとも約１０％～５０～１００～１５０％以上、または１～５倍、抗原に対する抗体の結合親和性を増加させるためになされ得る。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル、またはさらにはピコモルオーダーの親和性を有する。親和性成熟抗体は、既知の手順により製造される。例えば、重鎖可変（ＶＨ）ドメイン及び軽鎖可変（ＶＬ）ドメインシャッフリングによる親和性成熟を記載したＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９－７８３を参照されたい。ＣＤＲ及び／またはフレームワーク残基のランダム変異導入法は、以下に記載される：例えば、Ｂａｒｂａｓ，ｅｔ ａｌ．１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ ９１：３８０９－３８１３；Ｓｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅ １６９：１４７－１５５；Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４－２００４；Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０－９；及びＨａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９－８９６など。
【0086】
あるいは、アミノ酸修飾は、「サイレント」、あるいは「保存的」である、例えば、抗原に対する抗体の親和性を有意に変更しない、本発明の抗体の１つ以上のＣＤＲでなされ得る。これらは、発現を最適化する（本発明の抗体をコードする核酸についてなし得る）ことを含む様々な理由でなされ得る。
【0087】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質。以下、「生物学的等価体」）を生じさせ得ることは当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。親水性指標もまた、生物学的等価体の作製において考慮される。米国特許第４、５５４、１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（－０．４）；プロリン（－０．５±１）；アラニン（－０．５）；ヒスチジン（－０．５）；システイン（－１．０）；メチオニン（－１．３）；バリン（－１．５）；ロイシン（－１．８）；イソロイシン（－１．８）；チロシン（－２．３）；フェニルアラニン（－２．５）；トリプトファン（－３．４）。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、±０．５以内であることがさらに好ましい。
【0088】
したがって、本発明において、ポリペプチドは変異導入や保存的置換をされていてもよい。かかる変異は、置換、挿入、欠失のいずれの変異であってもよい。かかる変異導入の方法は、当該技術分野において周知であり、特定の方法に縛られない。保存的置換とは、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数及び／又は疎水性指数が上記のように類似している置換をいい、サイレントな修飾の典型例である。かかる保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンとリジン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとスレオニン；グルタミンとアスパラギン；バリン、ロイシン、及びイソロイシン、などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0089】
従って、変異ＣＤＲ及び抗体は、本発明のＣＤＲ及び抗体の定義内に含まれる；すなわち、本発明の抗体は、１つ以上のＣＤＲにおいて、アミノ酸修飾を含み得る。さらに、以下で概説するとおり、アミノ酸修飾は、ＣＤＲ外の任意の領域（フレームワーク及び定常領域を含む）において、独立して任意選択でなされ得る。
【0090】
いくつかの実施態様において、ＣＴｘに対して特異的な変異抗体を記載する。この抗体は６つのＣＤＲからなり、ここで、この抗体の各ＣＤＲは、それぞれ独立して、上記の各アミノ酸配列と０、１または２個のアミノ酸置換により異なり得る。翻ってＦＲ領域においては、そのアミノ酸配列が比較的抗体の結合特異性に影響しないことから、より広範な変異、例えば親ＦＲ領域配列と約８０％、８５％あるいは９０％の同一性となる変異を導入することができる。
【0091】
上記で概説する修飾に加えて、他の修飾がなされ得る。例えば、分子は、ＶＨドメインとＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の組込みにより安定化され得る（Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１２３９－１２４５、参照によりその全体が援用される）。さらに、以下で概説するようになされ得る抗体の様々な共有結合修飾が存在する。
【0092】
抗体の共有結合修飾は、本発明の範囲内に含まれ、常にではないが通常は、翻訳後に行われる。例えば、選択された側鎖またはＮ末端若しくはＣ末端残基と反応可能な有機誘導体化剤を抗体の特定のアミノ酸残基と反応させることにより、複数のタイプの抗体共有結合修飾が分子に導入される。
【0093】
最も一般的には、システイニル残基が、クロロ酢酸またはクロロアセトアミドなどのα－ハロアセテート（及び対応するアミン）と反応して、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生成する。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α－ブロモ－β－（５－イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ－アルキルマレイミド、３－ニトロ－２－ピリジルジスルフィド、メチル ２－ピリジルジスルフィド、ｐ－クロロメルクリベンゾアート、２－クロロメルクリ－４－ニトロフェノール、またはクロロ－７－ニトロベンゾ－２－オキサ－１，３－ジアゾールなどとの反応により、誘導体化されてよい。
【0094】
ヒスチジル残基は、ジエチルピロカーボネートとｐＨ５．５～７．０で反応させることにより誘導体化される。なぜなら、この薬剤は、ヒスチジル側鎖に対して比較的特異的だからである。パラ－ブロモフェナシルブロミドも有用である；反応は、ｐＨ６．０の０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で実施されることが好ましい。
【0095】
リジニル（ｌｙｓｉｎｙｌ）及びアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応する。この薬剤を用いた誘導体化は、リジニル残基の電荷を逆転させる効果を有
する。α－アミノ含有残基を誘導体化するために適した他の薬剤は、メチルピコリンイミデートなどのイミドエステル；ピリドキサールホスフェート；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ－メチルイソウレア；２，４－ペンタンジオン；及びグリオキシル酸とのアミノ基転移酵素触媒反応が挙げられる。
する。α－アミノ含有残基を誘導体化するために適した他の薬剤は、メチルピコリンイミデートなどのイミドエステル；ピリドキサールホスフェート；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ－メチルイソウレア；２，４－ペンタンジオン；及びグリオキシル酸とのアミノ基転移酵素触媒反応が挙げられる。
【0096】
アルギニル残基は、１つまたは複数の従来の試薬との反応により修飾され、これらのなかには、フェニルグリオキサール、２，３－ブタンジオン、１，２－シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンがある。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫａにより、反応がアルカリ条件で実施されることを必要とする。さらに、これらの試薬は、リジンの基、及びアルギニンイプシロンアミノ基と反応してよい。
【0097】
チロシル残基の特定の修飾は、チロシル残基にスペクトル標識を導入することに特に関心がある場合には、芳香族ジオゾニウム化合物またはテトラニトロメタンと反応させることによりなされてよい。最も一般的には、Ｎ－アセチルイミドゾール及びテトラニトロメタンを用いて、それぞれ、Ｏ－アセチルチロシル種及び３－ニトロ誘導体を形成する。チロシル残基は、１２５Ｉまたは１３１Ｉを用いてヨウ素化して、ラジオイムノアッセイ、クロラミンＴ法（適しているとして上記に記載したもの）で使用するための標識されたタンパク質を調製する。
【0098】
カルボキシル側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’－Ｎ＝Ｃ＝Ｎ－Ｒ’）［式中、Ｒ及びＲ’は、任意選択で異なるアルキル基である］との反応により選択的に修飾され、例えば、１－シクロヘキシル－３－（２－モルホリニル－４－エチル）カルボジイミド、１－エチル－３－（４－アゾニア－４，４－ジメチルペンチル）カルボジイミドなどである。さらに、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニル及びグルタミニル残基に変換される。
【0099】
二官能性剤を用いた誘導体化は、以下に記載の方法に加えて様々な方法で使用するため、水不溶性のサポートマトリックスまたは表面への抗体の架橋に有用である。一般的に使用される架橋剤としては、例えば、１，１－ビス（ジアゾアセチル）－２－フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４－アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二官能性イミドエステル（３，３’－ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含む）及び二官能性マレイミド（ビス－Ｎ－マレイミド－１，８－オクタンなど）が挙げられる。メチル－３－［（ｐ－アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成できる光活性化可能（ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ）な中間体を生成する。あるいは、サイノモルガソジェン（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓｏｇｅｎ）ブロミド活性化炭水化物などの反応性水不溶性マトリックス及び反応性基質（Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．３，９６９，２８７；３，６９１，０１６；４，１９５，１２８；４，２４７，６４２；４，２２９，５３７；及び４，３３０，４４０（全て参照により援用される）に記載のもの）がタンパク質固定化に用いられる。
【0100】
グルタミニル及びアスパラギニル残基は、それぞれ、対応するグルタミル及びアスパルチル残基に頻繁に脱アミノ化される。あるいは、これらの残基は、中程度の酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も、本発明の範囲内に含まれる。
【0101】
他の修飾として、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα－アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９－８６［１９８３］、参照によりその全体が援用される）、Ｎ－末端アミンのアセチル化、及びＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【0102】
さらに、当業者に理解されるように、標識化（蛍光、酵素、磁気、放射性などを含む）は全て抗体（及び本発明の他の組成物）に追加され得る。
【0103】
本発明は、それぞれ特定のＣＤＲセット（上記で概説するように、いくつかのアミノ酸置換を含む）を有する多数の抗体を提供する。上記で概説するように、抗体は、６つのＣＤＲのセット、可変領域、または全長の重鎖及び軽鎖（定常領域を含む）により定義され得る。さらに、上記で概説するように、アミノ酸置換がなされてもよい。一般に、ＣＤＲ内の変化との関連で、アミノ酸修飾は、ＣＤＲの長さが比較的短いことに起因して、なされ得るアミノ酸修飾の数に関して通常記載される。これは、可変、定常または全長配列に導入され得るアミノ酸修飾の数の議論にも適用できる一方、変化の数に加えて、「％同一性」に関してこれらの変化を定義することも適切である。従って、本明細書に記載されるように、本発明内に含まれる抗体は、本明細書に列挙した配列番号に記載の配列と８０、８５、９０、９５、９８または９９％同一である。
【0104】
本発明は、本発明の抗体群から選択される任意の抗体の製造方法をさらに提供する。これらの方法は、本発明の抗体をコードする、１つ以上の単離された核酸を含む宿主細胞を培養する工程を含む。当業者に理解されるように、これは、抗体の特性に応じて、様々な方法で実施され得る。いくつかの実施態様において、本発明の抗体が全長の従来の抗体である場合、例えば、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域である場合には、例えば、抗体が製造され、単離可能な条件下で実施される。
【0105】
一般に、本発明の抗体をコードする核酸を提供する。このようなポリヌクレオチドは、重鎖及び軽鎖それぞれの可変領域及び定常領域の両方をコードするものであるが、本明細書に記載の組成物に従って、他の組合せも本発明により企図される。本発明は、開示するポリヌクレオチド由来のオリゴヌクレオチド断片、及びこれらのポリヌクレオチドと相補的な核酸配列も意図する。
【0106】
ポリヌクレオチドはＲＮＡの形態であってもＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、核酸アナログ及び合成ＤＮＡの形態であるポリヌクレオチドは、本発明の範囲内である。ＤＮＡは二本鎖であっても一本鎖であってもよく、一本鎖の場合には、コーディング（センス）鎖または非コーディング（アンチセンス）鎖であってよい。ポリペプチドをコードするコーディング配列は、本明細書で提供するコーディング配列と同一であってもよく、または異なるコーディング配列であって、遺伝コードの冗長性または縮重の結果として、本明細書で提供するＤＮＡと同一のポリペプチドをコードする配列であってもよい。
【0107】
いくつかの実施態様において、本発明の抗体をコードする１つ以上の核酸は、発現ベクターに組み込まれ、当該発現ベクターは、導入される宿主細胞の染色体外であるか、またはそのゲノム中にインテグレートされるよう設計され得る。発現ベクターは、任意数の適切な制御配列（転写及び翻訳調節配列、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、複製起点などが挙げられるが、これらに限定されない）または他の要素（選択遺伝子など）を含むことができ、これらは全て、当分野でよく知られるように操作可能に連結される。いくつかの場合、２つの核酸を用いて、それぞれを異なる発現ベクターに入れるか（例えば、第一の発現ベクターに重鎖、第二の発現ベクターに軽鎖）、あるいはそれらを同一の発現ベクターにいれることができる。制御配列の選択を含む、１つ以上の発現ベクターの設計は、宿主細胞の選択、所望するタンパク質の発現レベルなどの因子によって決まり得ることが当業者に理解されるだろう。
【0108】
一般に、選択される宿主細胞に適した任意の方法（例えば、トランスフォーメーション、トランスフェクション、エレクトロポレーション、インフェクションなど）を用いて、１つ以上の核酸が１つ以上の発現調節要素に操作可能に連結されるように（例えば、ベクターにおいて、細胞でのプロセスにより作出される構築物において、宿主細胞のゲノムにインテグレートされて）、核酸及び／または発現が適した宿主細胞に導入され、組換え宿主細胞が作出される。得られた組換え宿主細胞は、発現に適した条件下（例えば、インデューサーの存在下、適した非ヒト動物中、適した塩、増殖因子、抗生物質、栄養補助剤などを添加した培地など）で維持でき、それによりコードされた１つ以上のポリペプチドが製造される。いくつかの場合において、重鎖が１つの細胞で製造され、軽鎖が別の細胞で製造される。
【0109】
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当分野で既知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手可能な多くの不死化細胞株が含まれ、これには、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞ガン細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、及び多数の他の細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。細菌、酵母、昆虫及び植物を含む（これらに限定されない）非哺乳動物細胞を用いて、組換え抗体を発現させることもできる。いくつかの実施態様において、抗体は、ウシやニワトリなどのトランスジェニック動物において製造することができる。
【0110】
抗体分子生物学、発現、精製及びスクリーニングの一般的な方法は、例えば、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＆ Ｄｕｂｅｌにより編集されたＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，２００１ ａｎｄ ２０１０ Ｈａｙｈｕｒｓｔ ＆ Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，２００１，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ５：６８３－６８９；Ｍａｙｎａｒｄ ＆ Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，２０００，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ ２：３３９－７６；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２に記載される。
【0111】
さらに本発明は、本発明の抗体群から選択されるいずれか1種の抗体または抗体の組合せを含む、コレラ毒素検出用イムノクロマトキットを提供する。かかるキットの一態様について説明すると、ニトロセルロース膜のような多孔性素材からなるマトリックス上に、捕捉抗体を線状に固相化した検出部分と、その上流側に、標識した検出抗体（標識抗体）を担持した標識試薬ゾーンを含む。通常、標識試薬ゾーンは、標識した検出用抗体を担持した多孔性のパッドにより構成される。マトリックスの上流端には、展開液を貯蔵した展開液槽が設けられている。さらに、通常、上記検出ゾーンの下流に、標識抗体の展開を確認するために抗標識抗体をライン状に固相化した展開確認部分と、さらにその下流に、展開液を吸収するための多孔性の吸収パッドが設けられた展開液吸収部分が設けられている。さらに、標識が酵素標識である場合には、標識試薬ゾーンよりも上流に、標識酵素の基質を担持した基質ゾーンが設けられる。
【0112】
使用時には、検体を標識試薬ゾーンに添加し、押し込み部を加圧して突起部を移動させることにより、展開液パッドを展開液槽に挿入し、展開液パッドを通じて展開液をマトリックスに供給する。展開液が基質ゾーンを通過する際に基質が展開液中に溶出され、基質を含む展開液が流動する。展開液が標識試薬ゾーンを通過する際に、標識抗体と検体とが展開液中に溶出され、基質、標識抗体及び検体を含む展開液が流動する。検体中にＣＴＸが含まれる場合には、ＣＴＸと標識抗体とが、抗原抗体反応により結合し、これらが検出ゾーンに到達すると、検出ゾーンにおいて、固相化抗体とＣＴＸとが抗原抗体反応により結合する。その結果、ＣＴＸを介して標識抗体が検出ゾーンに固定される。こうして検出ゾーンにおける標識を測定することにより、ＣＴＸが検出されることになる。検体中にＣＴＸが含まれていない場合には、標識抗体は検出ゾーンに固定されず、さらに下流に移動するため、検出ゾーンにおいて標識は検出されない。なお、検出ゾーンの下流の展開液確認部には、抗標識抗体が固相化されているため、標識抗体は展開液確認部に固定されることになる。よって、展開液確認部に標識が検出された場合、展開液が正しく展開されたことを意味する。展開液は、最終的に、その下流の吸収パッドに吸収される。
【0113】
また、本発明は、上記本発明の方法に用いるためのキットを提供する。本発明のキットは、少なくとも本発明のモノクローナル抗体又はその組み合わせを含む。
【0114】
サンドイッチ法を検出原理とする方法を利用する場合には、固相化した抗原捕捉用抗体と検出用抗体の少なくとも一方、好ましくは両方の抗体が、本発明のモノクローナル抗体である。さらに、標準検体試薬（各濃度） 、対照試薬、試料の希釈液、希釈用カートリッジ、洗浄液などを組み合わせることができる。酵素標識を利用した場合には、標識の検出に必要な基質や反応停止液などを含めることができる。検出用抗体を標識しない場合には、例えば、当該検出用抗体に結合する物質を標識したものをキットに含めることができる。
【0115】
サンドイッチ法として、イムノクロマトグラフィーを採用する場合には、抗原捕捉用抗体が検出ゾーンに固定化された膜担体と標識された検出用抗体を担持しているパッドとを備えたデバイスをキットに含めることができる。当該デバイスは、展開液パッドや吸収パッドなど、イムノクロマトグラフィーに適したその他の構成要素を備えることができる。
【0116】
本発明のキットには、さらに、当該キットの使用説明書を含めることができる。
【実施例0117】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0118】
１．抗体の作製
下記培地を用いた：
ＦＢＳ（－）培地：ＤＭＥＭ（ナカライ）５００ ｍＬ、１００ｍＭ ピルビン酸ナトリウム ５ｍＬ、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（ＮＥＡＡ）（ナカライ） ５ｍＬ、２－メルカプトエタノール ０．５ｍＬ、ペニシリンストレプトマイシン混合溶液（ナカライ）５ｍＬ
ＦＢＳ（＋）培地：ＦＢＳ（－）培地に１０％ ＦＢＳ（Invitrogen）を添加；
ＨＡＴ培地：ＦＢＳ（＋）培地 ２５０ ｍＬ、ＨＡＴ（×５０ ｃｏｎｃ． ＭＰバイオ）５ ｍＬ、ＩＬ－６（PeproTech 組換えマウスＩＬ－６）１０ ｎｇ／ｍＬ；
ＨＴ Ｄ－ＭＥＭ培地：ＤＭＥＭ（ナカライ、高グルコース）５００ ｍＬ、１００ｍＭ ピルビン酸ナトリウム ５ｍＬ、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（ＮＥＡＡ）（ナカライ）５ ｍＬ、２－メルカプトエタノール０．５ ｍＬ、ＦＢＳ（Invitrogen）５０ ｍＬ、ＩＬ－６ もしくはＢＭ Ｃｏｎｄｉｍｅｄ Ｈ ５ ｍＬ、ＨＴ（×５０ ｃｏｎｃ． ＭＰバイオ）５ ｍＬ、ペニシリンストレプトマイシン混合溶液（ナカライ）５ ｍＬ
ＨｙＣｏｌｎｅ ＬＭ，ＡＤＣＦ Ｍａｂ：ＨｙＣｏｌｎｅ ＬＭ ＡＤＣＦ ＭＡｂ １０００ｍＬ、ペニシリンストレプトマイシン混合溶液（ナカライ）１０．１ｍＬ（１００×）
下記培地を用いた：
ＦＢＳ（－）培地：ＤＭＥＭ（ナカライ）５００ ｍＬ、１００ｍＭ ピルビン酸ナトリウム ５ｍＬ、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（ＮＥＡＡ）（ナカライ） ５ｍＬ、２－メルカプトエタノール ０．５ｍＬ、ペニシリンストレプトマイシン混合溶液（ナカライ）５ｍＬ
ＦＢＳ（＋）培地：ＦＢＳ（－）培地に１０％ ＦＢＳ（Invitrogen）を添加；
ＨＡＴ培地：ＦＢＳ（＋）培地 ２５０ ｍＬ、ＨＡＴ（×５０ ｃｏｎｃ． ＭＰバイオ）５ ｍＬ、ＩＬ－６（PeproTech 組換えマウスＩＬ－６）１０ ｎｇ／ｍＬ；
ＨＴ Ｄ－ＭＥＭ培地：ＤＭＥＭ（ナカライ、高グルコース）５００ ｍＬ、１００ｍＭ ピルビン酸ナトリウム ５ｍＬ、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（ＮＥＡＡ）（ナカライ）５ ｍＬ、２－メルカプトエタノール０．５ ｍＬ、ＦＢＳ（Invitrogen）５０ ｍＬ、ＩＬ－６ もしくはＢＭ Ｃｏｎｄｉｍｅｄ Ｈ ５ ｍＬ、ＨＴ（×５０ ｃｏｎｃ． ＭＰバイオ）５ ｍＬ、ペニシリンストレプトマイシン混合溶液（ナカライ）５ ｍＬ
ＨｙＣｏｌｎｅ ＬＭ，ＡＤＣＦ Ｍａｂ：ＨｙＣｏｌｎｅ ＬＭ ＡＤＣＦ ＭＡｂ １０００ｍＬ、ペニシリンストレプトマイシン混合溶液（ナカライ）１０．１ｍＬ（１００×）
【0119】
１－１．細胞融合
コレラトキシンBサブユニットＣＴｘＢをSigma Adjuvant systemと１：１の比率で混合した抗原液をＢＡＬＢ／ｃマウスの足蹠に２週間間隔で２回接種して、マウスを免疫した（図１）。ＦＢＳ（＋）培地にマウスから採取したリンパ節・脾臓を添加した。５ｍＬのＦＢＳ（＋）培地が入った５ｃｍ径のシャーレに組織を入れ、組織についている脂肪を除去した後、１００μｍセルストレイナーとディスポシリンジのピストンで脾細胞またはリンパ節を濾し出した。脾細胞またはリンパ節細胞とマウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｕ１を混合し、融合細胞をＨＡＴ培地に希釈し、９６ウェルプレートに２００μＬ／ウェルで播種した。１０％ ＣＯ２ ３７℃で培養し、２～３日おきにＨＡＴ培地を１００μＬずつ交換してコロニーが出現、増殖するまで培養して、ハイブリドーマ１０種を得た。１０種のハイブリドーマについて、２Ｇ６、３Ｃ３、３Ｆ３、３Ｆ７、４Ｅ６、５Ｆ２、８Ａ５、８Ｂ３、１０Ｂ８、１９Ｆ５と呼称し、それぞれのハイブリドーマ得られた抗体も同じ呼称を用いた。スキームを図１に示す。
コレラトキシンBサブユニットＣＴｘＢをSigma Adjuvant systemと１：１の比率で混合した抗原液をＢＡＬＢ／ｃマウスの足蹠に２週間間隔で２回接種して、マウスを免疫した（図１）。ＦＢＳ（＋）培地にマウスから採取したリンパ節・脾臓を添加した。５ｍＬのＦＢＳ（＋）培地が入った５ｃｍ径のシャーレに組織を入れ、組織についている脂肪を除去した後、１００μｍセルストレイナーとディスポシリンジのピストンで脾細胞またはリンパ節を濾し出した。脾細胞またはリンパ節細胞とマウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｕ１を混合し、融合細胞をＨＡＴ培地に希釈し、９６ウェルプレートに２００μＬ／ウェルで播種した。１０％ ＣＯ２ ３７℃で培養し、２～３日おきにＨＡＴ培地を１００μＬずつ交換してコロニーが出現、増殖するまで培養して、ハイブリドーマ１０種を得た。１０種のハイブリドーマについて、２Ｇ６、３Ｃ３、３Ｆ３、３Ｆ７、４Ｅ６、５Ｆ２、８Ａ５、８Ｂ３、１０Ｂ８、１９Ｆ５と呼称し、それぞれのハイブリドーマ得られた抗体も同じ呼称を用いた。スキームを図１に示す。
【0120】
１－２．一次スクリーニング（ＥＬＩＳＡ）
抗原であるＣＴｘＢをＰＢＳで濃度調製し、ネガティブコントロールである凍結乾燥したマウス腸内細菌を炭酸－重炭酸緩衝液で溶解した（マウス腸内細菌死菌体：１．０ｍｇ／ｍＬ、ＣＴｘＢ：５．０μｇ／ｍＬ）。抗原とマウス腸内細菌死菌体をそれぞれ９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルずつ添加し、４℃で一晩静置し、固層化した。これらに１％ＢＳＡ－ＰＢＳを１７０μＬ／ウェルずつ添加し、室温で2時間静置して、ブロッキングした後、２５０μＬ ＰＢＳ－Ｔで3回洗浄した。これらに、各ハイブリドーマ培養上清を５０μＬ／ウェルずつ添加し、室温で２時間静置した後、２５０μＬ ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。さらに、１％ＢＳＡ－ＰＢＳ－Ｔで希釈した抗マウスＩｇＧ （全分子）－ＨＲＰ(1031-05, Southern biotech)を１００μＬ／ウェルずつ添加し３７℃で１時間静置し、２５０μＬ ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。その後、ＴＭＢ（KPL 50-76-03 TMB Microwell Peroxidase Substrate System）を１００μＬ／ウェルずつ添加し、室温で正確に2分後に０．５Ｎ ＨＣｌを５０μＬ／ウェルで播種したものを、分光光度計を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図２に示す。各ハイブリドーマについて、左の棒がＣＴｘＢ、右の棒が腸内細菌死菌体の吸光度を示す。腸内細菌死菌体と比較して、ＣＴｘＢに対する極めて高い反応性を示した抗体は、２Ｇ６、３Ｆ７、４Ｅ６、５Ｆ２および８Ａ５の５種であり、１９Ｆ５を次点で陽性とした。
抗原であるＣＴｘＢをＰＢＳで濃度調製し、ネガティブコントロールである凍結乾燥したマウス腸内細菌を炭酸－重炭酸緩衝液で溶解した（マウス腸内細菌死菌体：１．０ｍｇ／ｍＬ、ＣＴｘＢ：５．０μｇ／ｍＬ）。抗原とマウス腸内細菌死菌体をそれぞれ９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルずつ添加し、４℃で一晩静置し、固層化した。これらに１％ＢＳＡ－ＰＢＳを１７０μＬ／ウェルずつ添加し、室温で2時間静置して、ブロッキングした後、２５０μＬ ＰＢＳ－Ｔで3回洗浄した。これらに、各ハイブリドーマ培養上清を５０μＬ／ウェルずつ添加し、室温で２時間静置した後、２５０μＬ ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。さらに、１％ＢＳＡ－ＰＢＳ－Ｔで希釈した抗マウスＩｇＧ （全分子）－ＨＲＰ(1031-05, Southern biotech)を１００μＬ／ウェルずつ添加し３７℃で１時間静置し、２５０μＬ ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。その後、ＴＭＢ（KPL 50-76-03 TMB Microwell Peroxidase Substrate System）を１００μＬ／ウェルずつ添加し、室温で正確に2分後に０．５Ｎ ＨＣｌを５０μＬ／ウェルで播種したものを、分光光度計を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図２に示す。各ハイブリドーマについて、左の棒がＣＴｘＢ、右の棒が腸内細菌死菌体の吸光度を示す。腸内細菌死菌体と比較して、ＣＴｘＢに対する極めて高い反応性を示した抗体は、２Ｇ６、３Ｆ７、４Ｅ６、５Ｆ２および８Ａ５の５種であり、１９Ｆ５を次点で陽性とした。
【0121】
１－３．クローニング（限界希釈法）
６種のハイブリドーマ株を限界希釈法でクローニングし、０．５、１、２細胞／２００μＬ／ウェルとなるようにＨＡＴ培地で希釈して９６ウェルプレートに播種した。上清（１００μＬ／ウェル）を利用してスクリーニング（ＥＬＩＳＡ）を行った。スクリーニング陽性のウェルがシングルコロニーだった場合は、ＨＴ培地でスケールアップして凍結ストックを作製し、必要に応じて培養上清もしくはマウス腹水で抗体を大量調製し、シングルコロニーでなかった場合はクローニングを繰り返した。
６種のハイブリドーマ株を限界希釈法でクローニングし、０．５、１、２細胞／２００μＬ／ウェルとなるようにＨＡＴ培地で希釈して９６ウェルプレートに播種した。上清（１００μＬ／ウェル）を利用してスクリーニング（ＥＬＩＳＡ）を行った。スクリーニング陽性のウェルがシングルコロニーだった場合は、ＨＴ培地でスケールアップして凍結ストックを作製し、必要に応じて培養上清もしくはマウス腹水で抗体を大量調製し、シングルコロニーでなかった場合はクローニングを繰り返した。
【0122】
１－４．モノクローナル抗体精製
ＨＴ Ｄ－ＭＥＭ培地を恒温槽で３７℃に温め、凍結したハイブリドーマを３７℃恒温槽で融解した。融解したハイブリドーマを１０ｍＬのＨＴ Ｄ－ＭＥＭ培地に添加した。遠心分離（1,200 rpm, ３分）をした後、上清を除去し、ペレットをほぐし、１０ｍＬのＨＴ Ｄ－ＭＥＭ培地にて懸濁した。１０ｃｍセルディッシュに細胞懸濁液を添加し、３７℃で培養した。ハイブリドーマの増殖を確認後、細胞を懸濁し、１０ｍＬのＨＴ Ｄ－ＭＥＭ培地が添加されているフラスコに細胞懸濁液を添加して、３７℃で培養した。ハイブリドーマの増殖を確認後、細胞を懸濁し、４０ｍＬのＨＴ Ｄ－ＭＥＭ培地が添加されているフラスコに細胞懸濁液を１０ｍＬ添加し、３７℃で培養した。ハイブリドーマの増殖を確認後、上清を除去し、１５ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した後、５０ｍＬのADCF MAbを添加し、３７℃で培養した。培養２日後の上清を回収し、５０ｍＬのADCF MAbを添加後、３７℃で培養した。回収した上清は４℃で保存した。
ＨＴ Ｄ－ＭＥＭ培地を恒温槽で３７℃に温め、凍結したハイブリドーマを３７℃恒温槽で融解した。融解したハイブリドーマを１０ｍＬのＨＴ Ｄ－ＭＥＭ培地に添加した。遠心分離（1,200 rpm, ３分）をした後、上清を除去し、ペレットをほぐし、１０ｍＬのＨＴ Ｄ－ＭＥＭ培地にて懸濁した。１０ｃｍセルディッシュに細胞懸濁液を添加し、３７℃で培養した。ハイブリドーマの増殖を確認後、細胞を懸濁し、１０ｍＬのＨＴ Ｄ－ＭＥＭ培地が添加されているフラスコに細胞懸濁液を添加して、３７℃で培養した。ハイブリドーマの増殖を確認後、細胞を懸濁し、４０ｍＬのＨＴ Ｄ－ＭＥＭ培地が添加されているフラスコに細胞懸濁液を１０ｍＬ添加し、３７℃で培養した。ハイブリドーマの増殖を確認後、上清を除去し、１５ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した後、５０ｍＬのADCF MAbを添加し、３７℃で培養した。培養２日後の上清を回収し、５０ｍＬのADCF MAbを添加後、３７℃で培養した。回収した上清は４℃で保存した。
【0123】
培養液を遠心（1,200 rpm, ５分）して上清を回収し、０．４５μｍフィルターを用いてろ過した。Protein G Sepharoseによるアフィニティークロマトグラフィにて抗体を精製して、単離した。精製抗体の溶出フラクション液の吸光度（Ａ２８０）を超微量分光光度計（NanoDrop（商標） Lite 、Thermo Fisher Scientific）で測定した。プールした回収フラクションをAmicon Ultra-15 30K（UFC903024, Merck）に添加し、ＰＢＳを４～５ｍＬ添加し濃縮遠心した後、吸光度（Ａ２８０）を同様に測定して、濃度を算出した。
【0124】
１－５．精製抗体の反応性確認試験（ＥＬＩＳＡ）
抗原としてＣＴｘＢおよびＣＴｘを炭酸－重炭酸緩衝液で溶解し、濃度調製した（ＣＴｘＢ：０．１、１．０ μｇ／ｍＬ、ＣＴｘ：０．１、１．０ μｇ／ｍＬ）。抗原溶液をそれぞれ９６ウェルプレートに１００μL／ウェル添加し、4 ℃で一晩静置して固相化した。溶液を廃棄し、１％ＢＳＡ－ＰＢＳを９６ウェルプレートに１７０μＬ／ウェル添加し、室温で２時間静置し、ブロッキングした。ＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、ハイブリドーマ培養上清を５０μＬ／ウェル添加し、室温で２時間静置した後、ＰＢＳ－Ｔで洗浄した。１％ＢＳＡ－ＰＢＳ－Ｔで希釈した抗マウスＩｇＧ（全分子）-HRP（1031-05, Southern biotech）を１００μＬ／ウェル添加し３７℃で１時間静置し、ＰＢＳ－Ｔで洗浄した。ＴＭＢ（KPL 50-76-03 TMB Microwell Peroxidase Substrate System）を１００μＬ／ウェル添加し、室温で正確に２分後に０．５Ｎ ＨＣｌを５０μＬ／ウェルで播種し、分光光度計を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図３（ＣＴｘＢ）および図４（ＣＴｘ）に示す。各抗体について、左の棒が１．０μｇ／ｍＬ、右の棒が０．１μｇ／ｍＬの吸光度を示す。いずれの抗体もＣＴｘＢに対しては高濃度で高い反応性を示したが、低濃度では全体的に反応性が低下し、特に１９Ｆ５は低濃度でほとんどＣＴｘＢに対する反応性が認められなかった。また、ＣＴｘに対しては、とりわけ１９Ｆ５の反応性の低さが顕著であった。
抗原としてＣＴｘＢおよびＣＴｘを炭酸－重炭酸緩衝液で溶解し、濃度調製した（ＣＴｘＢ：０．１、１．０ μｇ／ｍＬ、ＣＴｘ：０．１、１．０ μｇ／ｍＬ）。抗原溶液をそれぞれ９６ウェルプレートに１００μL／ウェル添加し、4 ℃で一晩静置して固相化した。溶液を廃棄し、１％ＢＳＡ－ＰＢＳを９６ウェルプレートに１７０μＬ／ウェル添加し、室温で２時間静置し、ブロッキングした。ＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、ハイブリドーマ培養上清を５０μＬ／ウェル添加し、室温で２時間静置した後、ＰＢＳ－Ｔで洗浄した。１％ＢＳＡ－ＰＢＳ－Ｔで希釈した抗マウスＩｇＧ（全分子）-HRP（1031-05, Southern biotech）を１００μＬ／ウェル添加し３７℃で１時間静置し、ＰＢＳ－Ｔで洗浄した。ＴＭＢ（KPL 50-76-03 TMB Microwell Peroxidase Substrate System）を１００μＬ／ウェル添加し、室温で正確に２分後に０．５Ｎ ＨＣｌを５０μＬ／ウェルで播種し、分光光度計を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図３（ＣＴｘＢ）および図４（ＣＴｘ）に示す。各抗体について、左の棒が１．０μｇ／ｍＬ、右の棒が０．１μｇ／ｍＬの吸光度を示す。いずれの抗体もＣＴｘＢに対しては高濃度で高い反応性を示したが、低濃度では全体的に反応性が低下し、特に１９Ｆ５は低濃度でほとんどＣＴｘＢに対する反応性が認められなかった。また、ＣＴｘに対しては、とりわけ１９Ｆ５の反応性の低さが顕著であった。
【0125】
１－６．交差性試験（ＥＬＩＳＡ）
下記の各熱死菌体を作製し（６０℃、６０分）、凍結乾燥した。
C.jejuni, P.aeruginosa, S.liquefaciens, E.coli DH5α, S.Enteritidis, B.vulgatus, L.gasseri, P.mirabilis, C.freundii, E.freundii, K.pneumoniae, K.aerogenes, E.cloacae, E.faecalis
抗原ならびに凍結乾燥した各熱死菌体を炭酸－重炭酸緩衝液で溶解・濃度調製した（ＣＴｘＢ：１．０μｇ／ｍＬ、ＣＴｘ：１．０μｇ／ｍＬ、各種細菌死菌体：１．０ｍｇ/ｍＬ）。９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェル添加し、4 ℃で一晩静置して固相化した。溶液を廃棄し、１％ＢＳＡ－ＰＢＳを９６ウェルプレートに１７０μＬ／ウェル添加し、室温で２時間静置し、ブロッキングした。ＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、ハイブリドーマ培養上清を５０μＬ／ウェル添加し、室温で2時間静置した後、ＰＢＳ－Ｔで洗浄した。１％ＢＳＡ－ＰＢＳ－Ｔで希釈した抗マウスＩｇＧ（全分子）-HRP（1031-05, Southern biotech）を１００μＬ／ウェル添加し３７℃で１時間静置し、ＰＢＳ－Ｔで洗浄した。ＴＭＢ（KPL 50-76-03 TMB Microwell Peroxidase Substrate System）を１００μＬ／ウェル添加し、室温で正確に２分後に０．５Ｎ ＨＣｌを５０μＬ／ウェルで播種し、分光光度計を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。抗原であるＣＴｘＢおよびＣＴｘでは反応があったが、上記いずれの菌体でも反応性は認められなかった。
下記の各熱死菌体を作製し（６０℃、６０分）、凍結乾燥した。
C.jejuni, P.aeruginosa, S.liquefaciens, E.coli DH5α, S.Enteritidis, B.vulgatus, L.gasseri, P.mirabilis, C.freundii, E.freundii, K.pneumoniae, K.aerogenes, E.cloacae, E.faecalis
抗原ならびに凍結乾燥した各熱死菌体を炭酸－重炭酸緩衝液で溶解・濃度調製した（ＣＴｘＢ：１．０μｇ／ｍＬ、ＣＴｘ：１．０μｇ／ｍＬ、各種細菌死菌体：１．０ｍｇ/ｍＬ）。９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェル添加し、4 ℃で一晩静置して固相化した。溶液を廃棄し、１％ＢＳＡ－ＰＢＳを９６ウェルプレートに１７０μＬ／ウェル添加し、室温で２時間静置し、ブロッキングした。ＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、ハイブリドーマ培養上清を５０μＬ／ウェル添加し、室温で2時間静置した後、ＰＢＳ－Ｔで洗浄した。１％ＢＳＡ－ＰＢＳ－Ｔで希釈した抗マウスＩｇＧ（全分子）-HRP（1031-05, Southern biotech）を１００μＬ／ウェル添加し３７℃で１時間静置し、ＰＢＳ－Ｔで洗浄した。ＴＭＢ（KPL 50-76-03 TMB Microwell Peroxidase Substrate System）を１００μＬ／ウェル添加し、室温で正確に２分後に０．５Ｎ ＨＣｌを５０μＬ／ウェルで播種し、分光光度計を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。抗原であるＣＴｘＢおよびＣＴｘでは反応があったが、上記いずれの菌体でも反応性は認められなかった。
【0126】
１－７．サンドイッチＥＬＩＳＡ
上記１－４で得られた６種の陽性抗体（２Ｇ６、３Ｆ７、４Ｅ６、５Ｆ２、８Ａ５および１９Ｆ５）の様々な組み合わせを用いてＣＴｘＢを検出するサンドイッチＥＬＩＳＡ試験を行った。まず、抗体の標識化を行った。HRP Conjugation Kit（abcam AB102890-300）中のModifier溶液をモノクローナル抗体（＞１ｍｇ／ｍＬＦ）溶液に添加し混合した（１μＬ modifier／１０μＬ抗体）。前記Modifier溶液が添加されたモノクローナル抗体をＨＲＰミックスに添加し混合した。抗体－ＨＲＰミックス溶液を、遮光、２０～２５℃、３時間～一晩静置し、反応させた。Quencher溶液を添加し、遮光、２０～２５℃で、３０分反応させた（１μＬ quencher／１０μＬ抗体）。
上記１－４で得られた６種の陽性抗体（２Ｇ６、３Ｆ７、４Ｅ６、５Ｆ２、８Ａ５および１９Ｆ５）の様々な組み合わせを用いてＣＴｘＢを検出するサンドイッチＥＬＩＳＡ試験を行った。まず、抗体の標識化を行った。HRP Conjugation Kit（abcam AB102890-300）中のModifier溶液をモノクローナル抗体（＞１ｍｇ／ｍＬＦ）溶液に添加し混合した（１μＬ modifier／１０μＬ抗体）。前記Modifier溶液が添加されたモノクローナル抗体をＨＲＰミックスに添加し混合した。抗体－ＨＲＰミックス溶液を、遮光、２０～２５℃、３時間～一晩静置し、反応させた。Quencher溶液を添加し、遮光、２０～２５℃で、３０分反応させた（１μＬ quencher／１０μＬ抗体）。
【0127】
次いで、捕捉抗体の固層化し、標識抗体の反応を調べた。モノクローナル抗体を炭酸－重炭酸緩衝液で２．０μｇ／ｍＬ濃度になるように調製した。９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェル添加し、４℃で一晩静置した。３００μＬ ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、捕捉抗体溶液を取り除いた。１％ＢＳＡ－ＰＢＳを９６ウェルプレートに２００μＬ／ウェル添加し、室温で２時間、または４℃で一晩静置した。１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴで希釈調製した抗原ＣＴｘＢ（０．１μｇ／ｍＬ）溶液を１００μＬ／ウェル添加し、３７℃で９０分反応させた。液を取り除いた後、３００μＬ ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。１％ＢＳＡ－ＰＢＳＴで希釈調製した０．５μｇ／ｍＬのＨＲＰ標識の標識抗体溶液を１００ μＬ／ウェル添加し、室温で２時間静置し反応させた。液を取り除いた後、３００μＬ ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。ＴＭＢを１００μＬ／ウェル添加し、室温で正確に２分後に０．５Ｎ ＨＣｌを５０μＬ／ウェル添加し、分光光度計を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【0128】
標識抗体として５Ｆ２－ＨＲＰと１９Ｆ５－ＨＲＰを用いた場合には、固層化抗体が何であれ、抗原は検出できなかった。また、固層化抗体として５Ｆ２を用いた場合とネガティブコントロールでは、標識化抗体が何であれ、抗原は全く検出できなかった。固層化抗体として１９Ｆ５を用いた場合には、標識抗体として３Ｆ７－ＨＲＰまたは８Ａ５－ＨＲＰを用いた場合には抗原が検出できたが、その他の標識抗体では抗原が検出できなかった。２Ｇ６、３Ｆ７、４Ｅ６および８Ａ５の間では、標識抗体と固層化抗体とが同一抗体である場合も含め、すべての組合せで抗原を検出可能であった。
【0129】
２．抗体アフィニティ解析
Biacore T200（Cytiva）を用いて表面プラズモン共鳴法により抗体のアフィニティを測定した。Mouse Antibody Capture Kit（Cytiva）を用いてＣＭ５チップに抗マウスＩｇＧ抗体を固相化し、各種抗ＣＴｘモノクローナル抗体を捕捉した。ＣＴｘＢを含むランニング緩衝液（０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、１．５Ｍ ＮａＣｌ、 ３０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ｖ/ｖ Surfactant P 20）を３０μＬ／分の流速で添加し（アソシエーションフェーズ）、センサーチップにランニング緩衝液を流入した（ディソシエーションフェーズ）。結合速度定数（Ｋａ）、解離速度定数（Ｋｄ）、平行解離定数（ＫＤ）はBIAEvaluation 3.1により算出した。結果を図５に示す。２Ｇ６、３Ｆ７、４Ｅ６および８Ａ５の４種の抗体はいずれも極めて低いＫＤを示した。
Biacore T200（Cytiva）を用いて表面プラズモン共鳴法により抗体のアフィニティを測定した。Mouse Antibody Capture Kit（Cytiva）を用いてＣＭ５チップに抗マウスＩｇＧ抗体を固相化し、各種抗ＣＴｘモノクローナル抗体を捕捉した。ＣＴｘＢを含むランニング緩衝液（０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、１．５Ｍ ＮａＣｌ、 ３０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ｖ/ｖ Surfactant P 20）を３０μＬ／分の流速で添加し（アソシエーションフェーズ）、センサーチップにランニング緩衝液を流入した（ディソシエーションフェーズ）。結合速度定数（Ｋａ）、解離速度定数（Ｋｄ）、平行解離定数（ＫＤ）はBIAEvaluation 3.1により算出した。結果を図５に示す。２Ｇ６、３Ｆ７、４Ｅ６および８Ａ５の４種の抗体はいずれも極めて低いＫＤを示した。
【0130】
３．イムノクロマト
３－１．イムノクロマトキットの作成
２Ｇ６、３Ｆ７、４Ｅ６および８Ａ５の４種の抗体について、決定した被覆タンパク量の濃度に調製した。至適ｐHのＫＨ２ＰＯ４を分注し、直径４０ｎｍの金コロイド溶液（B.B.International）を加え撹拌し静置した。１％ ＰＥＧ２０，０００と１０％ ＢＳＡを加えた後、遠心分離して上清を取り除き、沈殿を超音波で分散させた。これに、金コロイド保存バッファーを添加し、遠心分離をする操作を繰り返し行い、抗体感作金コロイド溶液を得た。
３－１．イムノクロマトキットの作成
２Ｇ６、３Ｆ７、４Ｅ６および８Ａ５の４種の抗体について、決定した被覆タンパク量の濃度に調製した。至適ｐHのＫＨ２ＰＯ４を分注し、直径４０ｎｍの金コロイド溶液（B.B.International）を加え撹拌し静置した。１％ ＰＥＧ２０，０００と１０％ ＢＳＡを加えた後、遠心分離して上清を取り除き、沈殿を超音波で分散させた。これに、金コロイド保存バッファーを添加し、遠心分離をする操作を繰り返し行い、抗体感作金コロイド溶液を得た。
【0131】
テストラインに用いる抗体として２Ｇ６、３Ｆ７、４Ｅ６および８Ａ５の４種を調製し、それぞれニトロセルロースのメンブレン（150CNPH -N-SS40）へ塗布した。塗布後、５０℃で３０分間熱乾燥した。乾燥終了後、ブロッキング及び安定化処理を行い乾燥して、抗体固相化メンブレンを得た。次いで、抗体感作金コロイド溶液、DWおよび金コロイド塗布バッファーを１：１：２の割合で混合した。Glass Fiber Diagnostic Pad（MILLIPORE）に、混合液を均等に塗布し、デシケーターにて減圧乾燥を行って、コンジュゲートパッドを得た。
【0132】
試作品（フルストリップ）へ水のみあるいはＣＴｘＢ ０．１、１、１０および１００ｎｇ/ｍＬ水溶液を１００μＬずつ滴下して、約２０分後のライン発色を確認した。結果を図６に示す。いずれのフルストリップでも、１０～１００ｎｇ/ｍＬで明瞭な発色が確認でき、１ｎｇ/ｍＬでもわずかに発色が確認できた。
【0133】
３－２．ＣＴｘＢおよびＬＴＢを利用したイムノクロマトの検証
１％NP４０－ＰＢＳにＣＴｘＢおよび大腸菌易熱性エンテロトキシンＢサブユニット（ＬＴＢ）をそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬになるよう調製懸濁し、上記イムノクロマトキットの作成で得られたフルストリップへ１００μＬずつ滴下して、約２０分後のライン発色を確認した。結果を図７に示す。いずれのフルストリップでも、ＣＴｘＢは検出できたが、ＬＴＢは検出されなかった。
１％NP４０－ＰＢＳにＣＴｘＢおよび大腸菌易熱性エンテロトキシンＢサブユニット（ＬＴＢ）をそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬになるよう調製懸濁し、上記イムノクロマトキットの作成で得られたフルストリップへ１００μＬずつ滴下して、約２０分後のライン発色を確認した。結果を図７に示す。いずれのフルストリップでも、ＣＴｘＢは検出できたが、ＬＴＢは検出されなかった。
【0134】
３－３．展開液の検証
展開液１％ＮＰ４０－ＰＢＳにＣＴｘＢ、ＣＴｘおよびＬＴＢを各種濃度となるように調製懸濁し、イムノクロマト試薬（金コロイド：８Ａ５, テストライン：８Ａ５）にそれぞれ１００μＬ展開し、２０分後に判定を行った。結果を図８に示す。また、健常人便を１％ＮＰ４０－ＰＢＳに懸濁し、ＣＴｘＢ、ＣＴｘおよびＬＴＢを各種濃度となるように調製懸濁した疑似検体を利用して、イムノクロマト試薬（金コロイド：８Ａ５、テストライン：８Ａ５）に１００μＬ展開し、２０分後に判定を行った。結果を図９に示す。テストラインおよびコントロールのいずれにもバンドが確認できたので、問題なく展開が行われたと判断した。
展開液１％ＮＰ４０－ＰＢＳにＣＴｘＢ、ＣＴｘおよびＬＴＢを各種濃度となるように調製懸濁し、イムノクロマト試薬（金コロイド：８Ａ５, テストライン：８Ａ５）にそれぞれ１００μＬ展開し、２０分後に判定を行った。結果を図８に示す。また、健常人便を１％ＮＰ４０－ＰＢＳに懸濁し、ＣＴｘＢ、ＣＴｘおよびＬＴＢを各種濃度となるように調製懸濁した疑似検体を利用して、イムノクロマト試薬（金コロイド：８Ａ５、テストライン：８Ａ５）に１００μＬ展開し、２０分後に判定を行った。結果を図９に示す。テストラインおよびコントロールのいずれにもバンドが確認できたので、問題なく展開が行われたと判断した。
【0135】
３－３．イムノクロマト試薬交差性試験
下記菌について、１％ＮＰ４０－ＰＢＳにてMcFarland＝０．５（約１．０ｘ１０８ｃｆｕ／ｍＬ）に調製し、イムノクロマト試薬（金コロイド：８Ａ５、テストライン：８Ａ５）に１００μＬ展開し、２０分後に判定を行い、交差反応性を検証した。いずれの菌にも、イムノクロマト試薬（金コロイド：８Ａ５、テストライン：８Ａ５）は交差反応性を示さなかった。
C. jejuni, C. coli, S. typhimurium, C. difficile, P. mirabilis, P. aeruginosa B. cereus, C. freundii, S. aureus, K. pneumonia, K. aerogenes, S. liquefaciens, E. cloacae, E. faecalis, E hermannii, S. epidermidis, E coli O114, C tetani
下記菌について、１％ＮＰ４０－ＰＢＳにてMcFarland＝０．５（約１．０ｘ１０８ｃｆｕ／ｍＬ）に調製し、イムノクロマト試薬（金コロイド：８Ａ５、テストライン：８Ａ５）に１００μＬ展開し、２０分後に判定を行い、交差反応性を検証した。いずれの菌にも、イムノクロマト試薬（金コロイド：８Ａ５、テストライン：８Ａ５）は交差反応性を示さなかった。
C. jejuni, C. coli, S. typhimurium, C. difficile, P. mirabilis, P. aeruginosa B. cereus, C. freundii, S. aureus, K. pneumonia, K. aerogenes, S. liquefaciens, E. cloacae, E. faecalis, E hermannii, S. epidermidis, E coli O114, C tetani
【0136】
４．アミノ酸および遺伝子配列解析
各種ハイブリドーマ（１０６細胞）よりＲＮＡを抽出後、ｃＤＮＡの合成を行った。ｃＤＮＡを鋳型として縮重プライマーによるＶＨ、ＶＬの増幅・クローニングを実施し、ＶＨ、ＶＬの遺伝子配列解析を行った。結果は各配列表に示す通りである。
各種ハイブリドーマ（１０６細胞）よりＲＮＡを抽出後、ｃＤＮＡの合成を行った。ｃＤＮＡを鋳型として縮重プライマーによるＶＨ、ＶＬの増幅・クローニングを実施し、ＶＨ、ＶＬの遺伝子配列解析を行った。結果は各配列表に示す通りである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】