特開 2023-104815 ワクチンの組み合わせ及びその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023104815

(43)【公開日】2023-07-28

(54)【発明の名称】ワクチンの組み合わせ及びその使用方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/00 20060101AFI20230721BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20230721BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20230721BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230721BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230721BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20230721BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20230721BHJP

   C12N 15/34 20060101ALN20230721BHJP

【ＦＩ】

A61K39/00 H ZNA

A61K39/12

A61K45/00

A61P43/00 121

A61K39/395 U

A61P31/12

C12N15/62 Z

C12N15/34

【審査請求】有

【請求項の数】16

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2022006035

(22)【出願日】2022-01-18

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 掲載アドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｊｏｕｒｎａｌｓ．ａｓｍ．ｏｒｇ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｍｂｉｏ、及び、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２８／ｍＢｉｏ．０３２２４－２０ 掲載年月日：２０２１年１月１９日 ［刊行物等］刊行物：ｍＢＩＯ第１２巻第１号の「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＤＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｅ６ ａｎｄ Ｅ７ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆＨｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ １６ （ＨＰＶ１６） ａｎｄ ＨＰＶ１８ ｆｏｒＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｂｏｏｓｔ ａｎｄ ＰＤ－１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ」 Ａｍｅｒｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ 発行日：２０２１年１月１９日

(71)【出願人】

【識別番号】522024481

【氏名又は名称】パピヴァックス バイオテック インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110001519

【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ユン－ニエン チャン

【テーマコード（参考）】

4C084

4C085

【Ｆターム（参考）】

4C084AA22

4C084MA02

4C084NA05

4C084ZB33

4C084ZC75

4C085AA03

4C085AA04

4C085AA14

4C085EE03

(57)【要約】      （修正有）

【課題】ワクチンの組み合わせ、特に、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連疾患のためのワクチンの組み合わせ、および医薬の製造におけるワクチンの組み合わせの使用を提供する。
【解決手段】第１のワクチンは、特定のポリヌクレオチドを含み、プライミングワクチンとして対象に投与されるものであり、第２のワクチンは、ＴＡ－ＨＰＶを含み、ブーストワクチンとして前記対象に投与されるものである、ワクチンの組み合わせの使用である。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１の融合タンパク質又は前記第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のワクチンであって、ここで、前記第１の融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の順に、
（ｉ）ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ－１６）のＥ７タンパク質又はその機能的バリアント、ここで、前記ＨＰＶ－１６のＥ７タンパク質又はその機能的バリアントは、前記タンパク質の先頭に配列番号１、及び前記タンパク質の末尾に配列番号２を含む、
（ｉｉ）ヒトパピローマウイルス１８型（ＨＰＶ－１８）のＥ７タンパク質又はその機能的バリアント、ここで、前記ＨＰＶ－１８のＥ７タンパク質又はその機能的バリアントは、前記タンパク質の先頭に配列番号３、及び前記タンパク質の末尾に配列番号４を含む、
（ｉｉｉ）ＨＰＶ－１６のＥ６タンパク質又はその機能的バリアント、ここで、前記ＨＰＶ－１６のＥ６タンパク質又はその機能的バリアントは、前記タンパク質の先頭に配列番号５、及び前記タンパク質の末尾に配列番号６を含む、
（ｉｖ）ＨＰＶ－１８のＥ６タンパク質又はその機能的バリアント、ここで、前記ＨＰＶ－１８のＥ６タンパク質又はその機能的バリアントは、前記タンパク質の先頭に配列番号７、及び前記タンパク質の末尾に配列番号８を含む、及び
（ｖ）熱ショックタンパク質又はその機能的バリアント
を含む前記第１のワクチン、並びに
第２の融合タンパク質及び第３の融合タンパク質、又は前記第２の融合タンパク質と前記第３の融合タンパク質とをコードする第２のポリヌクレオチドを含む、第２のワクチンであって、ここで、
前記第２の融合タンパク質は、
ＨＰＶ－１６のＥ６タンパク質又はその機能的バリアント、及び
ＨＰＶ－１６のＥ７タンパク質又はその機能的バリアントを含み、
前記第３の融合タンパク質は、
ＨＰＶ－１８のＥ６タンパク質又はその機能的バリアント、及び
ＨＰＶ－１８のＥ７タンパク質又はその機能的バリアントを含む、
前記第２のワクチンを含み、
前記第１の融合タンパク質における連結領域のアミノ酸配列は、前記第２の融合タンパク質及び前記第３の融合タンパク質における連結領域のアミノ酸配列と異なっている、
ワクチンの組み合わせ。

【請求項2】

前記ＨＰＶ－１６のＥ７タンパク質は配列番号９を含み、
前記ＨＰＶ－１８のＥ７タンパク質は配列番号１０を含み、
前記ＨＰＶ－１６のＥ６タンパク質は配列番号１１を含み、
前記ＨＰＶ－１８のＥ６タンパク質は配列番号１２を含む、
請求項１に記載のワクチンの組み合わせ。

【請求項3】

前記ＨＰＶ－１６のＥ７タンパク質は配列番号１３によりコードされ、
前記ＨＰＶ－１８のＥ７タンパク質は配列番号１４によりコードされ、
前記ＨＰＶ－１６のＥ６タンパク質は配列番号１５によりコードされ、
前記ＨＰＶ－１８のＥ６タンパク質は配列番号１６によりコードされる、
請求項１に記載のワクチンの組み合わせ。

【請求項4】

前記第１のポリヌクレオチドは配列番号１７を含む、請求項１に記載のワクチンの組み合わせ。

【請求項5】

前記第１のポリヌクレオチドは配列番号１８を含む、請求項１に記載のワクチンの組み合わせ。

【請求項6】

前記第２のポリヌクレオチドは組換えウイルス内に含まれている、請求項１に記載のワクチンの組み合わせ。

【請求項7】

前記組換えウイルスはＴＡ－ＨＰＶである、請求項６に記載のワクチンの組み合わせ。

【請求項8】

処置を必要とする対象におけるＨＰＶ関連疾患を処置するための医薬の製造における、請求項１～７のいずれか一項に記載のワクチンの組み合わせの使用であって、前記使用は、
請求項１に記載のワクチンの組み合わせを対象に投与することを含み、
前記第１のワクチンはプライミングワクチンとして前記対象に投与されるものであり、前記第２のワクチンはブーストワクチンとして前記対象に投与されるものである、
ワクチンの組み合わせの使用。

【請求項9】

前記ワクチンの組み合わせの投与が、
プライミングワクチンとしての前記第１のワクチンの投与後であってブーストワクチンとしての前記第２のワクチンの投与前に、ブーストワクチンとして前記第１のワクチンを前記対象に投与することをさらに含む、
請求項８に記載の使用。

【請求項10】

前記第１のワクチンは前記第１のポリヌクレオチドを含み、
前記第１のワクチンは対象当たり１０ミリグラム～対象当たり２０ミリグラムの用量で投与される、
請求項８に記載の使用。

【請求項11】

前記第２のワクチンはＴＡ－ＨＰＶを含み、
前記第２のワクチンは、１×１０^４プラーク形成単位（ｐｆｕ）～２×１０^９ｐｆｕの用量で投与される、
請求項８に記載の使用。

【請求項12】

前記ワクチンの組み合わせの投与が、
前記ワクチンの組み合わせの投与と組み合わせて、化学療法、放射線療法、放射線化学療法、寒冷療法、温熱療法、標的化療法、細胞療法、遺伝子療法、又は免疫療法を行うことをさらに含む、
請求項８に記載の使用。

【請求項13】

前記化学療法、放射線療法、放射線化学療法、寒冷療法、温熱療法、標的化療法、細胞療法、遺伝子療法、又は免疫療法は、前記第１のワクチンの投与の前に、及び／又は前記第１のワクチンの投与と同時に行われる、
請求項１２に記載の使用。

【請求項14】

前記免疫療法は、免疫チェックポイント阻害剤を前記対象に投与することを含む、請求項１２に記載の使用。

【請求項15】

前記免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイント阻害剤は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）、誘導性共刺激分子（ＩＣＯＳ）、Ｔ細胞免疫グロブリン－ムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、又はＴ細胞免疫グロブリン－免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）ドメイン（ＴＩＧＩＴ）を標的にする免疫調節剤である、請求項１４に記載の使用。

【請求項16】

前記免疫チェックポイント阻害剤は抗ＰＤ－１抗体である、請求項１４に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

配列表の参照
本願の添付物は、２０２１年１２月７日に作成され、１８，２５３バイトのサイズである、「２１１２２３－ＵＳ８６６７９－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ－ｖ１Ｆ．ｔｘｔ」という名称のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｃｏｄｅ ｆｏｒ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＡＳＣＩＩ）テキストファイルの配列表である。前記配列表は、参照により本明細書に完全に取り込まれる。

【0002】

発明者による先開示の記載（３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．７７（ｂ）（６））
先開示である２０２１年１月１９日公開の「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＤＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｅ６ ａｎｄ Ｅ７ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ １６ （ＨＰＶ１６） ａｎｄ ＨＰＶ１８ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｂｏｏｓｔ ａｎｄ ＰＤ－１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ」，ｍＢｉｏ，Ｊａｎｕａｒｙ／Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０２１，Ｖｏｌｕｍｅ １２，Ｉｓｓｕｅ １，ｐａｇｅｓ １－１９は、本願の権利請求される主題に関する研究について論じるものである。本願の発明者であるＹｕｎｇ－Ｎｉｅｎ Ｃｈａｎｇは、自身が先開示において論じられる主題の唯一の発明者であり、先開示に関する実験を実施するための主要な材料を提供したことを明確に述べる。発明者はまた、先開示の共著者でもある。先開示の残りの共著者は、本発明者の指示の元、実験の種々の態様を実施及び記録したので、その能力内で先行開示に貢献した。先開示のコピーは、本願と同時に提出される情報開示陳述書に関連して提供される。

【0003】

技術分野
本開示は概して、ワクチンの組み合わせ、特に、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連疾患のためのワクチンの組み合わせに関し、より具体的には、プライミングワクチン及びブースターワクチンの特定の設計によるワクチンの組み合わせの改善に関する。

【背景技術】

【0004】

ＨＰＶは、子宮頸がん、肛門がん、陰茎がん、外陰がん、膣がん、及び頭頚部がんを含む様々なヒトのがんにおける共通の病原因子である。Ｇａｒｄａｓｉｌ（登録商標）及びＣｅｒｖａｒｉｘ（登録商標）など、ＨＰＶに対する現在のワクチンは、ＨＰＶ感染の予防において臨床的有効性を示してきたが、既存のＨＰＶ感染又はＨＰＶ関連がんを有する患者の治療においては効果がない。そのため、ＨＰＶに感染した患者又はＨＰＶ関連疾患を患っている患者のための治療的ワクチンの開発に対する需要が高い。

【0005】

デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ワクチン接種は、１又は複数の抗原をコードするＤＮＡ配列を含む遺伝子改変されたプラスミドを注射することによる、感染の予防又は疾患の治療のための技術である。ＤＮＡワクチンは、製造の安全性、スピード、及び予測性、温度安定性、設計の柔軟性、並びに広範囲な種類の免疫応答を誘発する能力を含む、従来のワクチンに対する理論的利点を有する。

【0006】

有効なワクチンは、通常、プライムブーストの方式での２回以上の免疫化を必要とする。従来、同種ブースト（homologous boost）として同じワクチンが複数回投与される。いくつかの知見により、プライムブーストは同じ抗原を含む異なる種類のワクチンを用いて行い得ることが提案されている。多くの場合、そのような異種プライムブーストは、同種プライムブーストよりも免疫原性が高いことがある（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９ Ｊｕｎ；２１（３）：３４６－３５１）。異種プライムブーストは、同じ又は重複する抗原性挿入断片を発現する２種類の異なるベクター又は送達系の投与を含んでいてもよい。特定のベクターの組み合わせを用いることで抗体及びＴ細胞免疫の両方が増大し得ることが知られている。しかしながら、共に複数の抗原の融合タンパク質又はそれをコードするベクターのいずれかであり得るプライミングワクチン及びブーストワクチンは、融合タンパク質において同じ抗原配置を有していてもよく、プライムブースト投与計画により引き起こされた増強された免疫はまた、複数の抗原の融合タンパク質における連結に関連したエピトープに対する免疫応答のブーストも含むことがあり、標的病原因子に対する免疫応答阻害又はその他の好ましくない効果を引き起こすことがある。

【0007】

さらに、新たに開発されたＤＮＡワクチンをクリニックに提供する前に、新規配列のワクチン接種による自己免疫の誘発の可能性は対処すべき大きな懸念である。ワクチンに対するそのような有害反応は、ワクチン接種された対象の感受性と種々のワクチン構成成分の間の相互作用の結果と見なされることがある。ワクチンに含まれるある種の病原因子と特定のヒトタンパク質の間の重要な類似性は、免疫交差反応性をもたらすことがあり、病原性抗原に対する免疫系の反応により類似ヒトタンパク質（自己抗原）を害することがあり、本質的に自己免疫疾患を引き起こす（Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８ Ｊｕｎ；１５（６）：５８６－５９４）。したがって、ワクチンの免疫原性を高めることに加えて、ワクチンを開発する際に交差反応性による自己免疫の誘発の可能性を回避することも同様に重要である。

【0008】

上述の理由を考慮して、ワクチンにより発現される又はワクチンに含まれる融合タンパク質に潜在的に存在する、連結に関連したエピトープに対する免疫応答を生じるリスク及び自己抗原に対する交差反応性を誘発するリスクの低減に反映されるとおり、免疫原性が増強され、安全性が改善された、ＨＰＶ関連疾患を処置するためのワクチンの提供に対する満たされていない要求が存在する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

本開示の第１の態様では、ワクチンの組み合わせをが提供されてもよい。前記ワクチンの組み合わせは、第１のワクチン及び第２のワクチンを含む。第１のワクチンは、第１の融合タンパク質、又は前記第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドを含んでいてもよい。第１の融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の順に、（ｉ）ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ－１６）のＥ７タンパク質又はその機能的バリアント、（ｉｉ）ヒトパピローマウイルス１８型（ＨＰＶ－１８）のＥ７タンパク質又はその機能的バリアント、（ｉｉｉ）ＨＰＶ－１６のＥ６タンパク質又はその機能的バリアント、（ｉｖ）ＨＰＶ－１８のＥ６タンパク質又はその機能的バリアント、及び（ｖ）熱ショックタンパク質又はその機能的バリアントを含んでいてもよい。ＨＰＶ－１６のＥ７タンパク質又はその機能的バリアントは、前記タンパク質の先頭に配列番号１、及び前記タンパク質の末尾に配列番号２を含んでいてもよい。ＨＰＶ－１８のＥ７タンパク質又はその機能的バリアントは、前記タンパク質の先頭に配列番号３、及び前記タンパク質の末尾に配列番号４を含んでいてもよい。ＨＰＶ－１６のＥ６タンパク質は又はその機能的バリアントは、前記タンパク質の先頭に配列番号５、及び前記タンパク質の末尾に配列番号６を含んでいてもよい。ＨＰＶ－１８のＥ６タンパク質又はその機能的バリアントは、前記タンパク質の先頭に配列番号７、及び前記タンパク質の末尾に配列番号８を含んでいてもよい。第２のワクチンは、第２の融合タンパク質及び第３の融合タンパク質、又は前記第２の融合タンパク質と前記第３の融合タンパク質とをコードする第２のポリヌクレオチドを含んでいてもよい。第２の融合タンパク質は、ＨＰＶ－１６のＥ６タンパク質又はその機能的バリアント、及びＨＰＶ－１６のＥ７タンパク質又はその機能的バリアントを含んでいてもよい。第３の融合タンパク質は、ＨＰＶ－１８のＥ６タンパク質又はその機能的バリアント、及びＨＰＶ－１８のＥ７タンパク質又はその機能的バリアントを含んでいてもよい。第１の融合タンパク質における連結領域のアミノ酸配列は、第２の融合タンパク質及び第３の融合タンパク質における連結領域のアミノ酸配列と異なっていてもよい。

【0010】

いくつかの実施形態では、ＨＰＶ－１６のＥ７タンパク質は配列番号９を含んでいてもよく、ＨＰＶ－１８のＥ７タンパク質は配列番号１０を含んでいてもよく、ＨＰＶ－１６のＥ６タンパク質は配列番号１１を含んでいてもよく、ＨＰＶ－１８のＥ６タンパク質は配列番号１２を含んでいてもよい。

【0011】

いくつかの実施形態では、ＨＰＶ－１６のＥ７タンパク質は配列番号１３によりコードされていてもよく、ＨＰＶ－１８のＥ７タンパク質は配列番号１４によりコードされていてもよく、ＨＰＶ－１６のＥ６タンパク質は配列番号１５によりコードされていてもよく、ＨＰＶ－１８のＥ６タンパク質は配列番号１６によりコードされていてもよい。

【0012】

いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは配列番号１７を含んでいてもよい。

【0013】

いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは配列番号１８を含んでいてもよい。

【0014】

いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは組換えウイルス内に含まれていてもよい。

【0015】

いくつかの実施形態では、前記組換えウイルスはＴＡ－ＨＰＶであってもよい。

【0016】

本開示の第２の態様では、処置を必要とする対象においてＨＰＶ関連疾患を処置する方法が提供されてもよい。前記方法は、前述のワクチンの組み合わせを対象に投与することを含んでいてもよい。第１のワクチンがプライミングワクチンとして投与されてもよく、第２のワクチンがブーストワクチンとして投与されてもよい。

【0017】

いくつかの実施形態では、前記方法は、プライミングワクチンとしての第１のワクチンの投与後であってブーストワクチンとしての第２のワクチンの投与前に、ブーストワクチンとして第１のワクチンを対象に投与することをさらに含んでいてもよい。

【0018】

いくつかの実施形態では、第１のワクチンは第１のポリヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、第１のワクチンは対象当たり１０ミリグラム～対象当たり２０ミリグラムの用量で投与されてもよい。

【0019】

いくつかの実施形態では、第２のワクチンはＴＡ－ＨＰＶを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、第２のワクチンは、１×１０^４プラーク形成単位（ｐｆｕ）～２×１０^９ｐｆｕの用量で投与されてもよい。

【0020】

いくつかの実施形態では、前記方法は、ワクチンの組み合わせの投与と組み合わせて、化学療法、放射線療法、放射線化学療法、寒冷療法、温熱療法、標的化療法、細胞療法、遺伝子療法、又は免疫療法を行うことをさらに含んでいてもよい。

【0021】

いくつかの実施形態では、化学療法、放射線療法、放射線化学療法、寒冷療法、温熱療法、標的化療法、細胞療法、遺伝子療法、又は免疫療法は、第１のワクチンの投与の前に、及び／又は第１のワクチンの投与と同時に行ってもよい。

【0022】

いくつかの実施形態では、免疫療法は、免疫チェックポイント阻害剤を対象に投与することを含んでいてもよい。

【0023】

いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）、誘導性共刺激分子（ＩＣＯＳ）、Ｔ細胞免疫グロブリン－ムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、又はＴ細胞免疫グロブリン－免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）ドメイン（ＴＩＧＩＴ）を標的にする免疫調節剤であってもよい。

【0024】

いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体であってもよい。

【0025】

上記に記載された本開示の特徴を詳細に理解できるように、ふぉｒ上記に簡潔に概説された本開示のより具体的な記載は、そのいくつかは添付の図面において説明される実施形態が参照されてもよい。しかしながら、本開示はその他の等しく効果的な実施形態を認め得るので、添付の図面は本開示の典型的な実施形態を説明するのみであり、したがって、その範囲を限定するものであるとは見なされないことに留意すべきである。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1A】本開示の一実施形態のワクチンの組み合わせの第１のワクチンの第１の融合タンパク質をコードするＤＮＡコンストラクトを示す略図である。

【図1B】本開示の一実施形態のワクチンの組み合わせのワクシニアウイルスのゲノム中に挿入されたＨＰＶ－１６ Ｅ６－Ｅ７融合タンパク質及びＨＰＶ－１８ Ｅ６－Ｅ７融合タンパク質の発現カセットを示す略図である。

【図2A】本開示の一実施形態による、プライムブースト戦略で本開示のワクチンの組み合わせ（ＤＮＡの２回用量及び組換えウイルスの１回用量、ＤＤＶ投与計画）又はプライムブースト戦略でＤＮＡワクチンのみ（ＤＮＡの３回用量、ＤＤＤ投与計画）をワクチン接種されたマウスにおけるＨＰＶ抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞媒介性免疫応答の特徴付けのための実験計画の略図である。

【図2B】本開示の一実施形態による、ＨＰＶ－１６ Ｅ７（アミノ酸４９～５７）ペプチド結合四量体染色を用い、両側スチューデントｔ検定を用いた、無感作のマウス又は本開示のワクチンの組み合わせ（ＤＤＶ投与計画）若しくはＤＮＡワクチンのみ（ＤＤＤ投与計画）で処置されたマウスから採取された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における全ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対するＨＰＶ－１６ Ｅ７特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合を示す棒グラフである。

【図2C】本開示の一実施形態による、ＨＰＶ－１６ Ｅ６（アミノ酸５０～５７）ペプチド、ＨＰＶ－１６ Ｅ７（アミノ酸４９～５７）ペプチド、又はＨＰＶ－１８ Ｅ６（アミノ酸６７～７５）ペプチドのいずれかで刺激した後の、本開示のワクチンの組み合わせ（ＤＤＶ投与計画）若しくはＤＮＡワクチンのみ（ＤＤＤ投与計画）をワクチン接種されたマウスからの３×１０^５個の脾臓細胞当たりのＨＰＶ－１６ Ｅ７特異的ＩＦＮ－γ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の数を示す棒グラフである。

【図3A】本開示の一実施形態による、抗ＰＤ－１抗体を用いて又は用いずに、プライムブースト戦略で本開示のワクチンの組み合わせで処置されたＴＣ－１腫瘍担持マウスにおけるＨＰＶ抗原特異的免疫応答及び抗腫瘍効果を特徴付けるための実験計画の略図である。

【図3B】本開示の一実施形態による、ＨＰＶ－１６ Ｅ７（アミノ酸４９～５７）ペプチド結合四量体染色を用い、両側スチューデントｔ検定を用いた、未処置のマウス、抗ＰＤ－１抗体のみで処置されたマウス、本開示のワクチンの組み合わせ（ＤＤＶ）で処置されたマウス、又は抗ＰＤ－１抗体と組み合わせた本開示のワクチンの組み合わせ（抗ＰＤ－１＋ＤＤＶ）で処置されたマウスから調製された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における全ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対するＨＰＶ－１６ Ｅ７特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合を示す棒グラフである。

【図3C】本開示の一実施形態による、未処置のマウス、抗ＰＤ－１抗体のみで処置されたマウス、本開示のワクチンの組み合わせ（ＤＤＶ）で処置されたマウス、又は抗ＰＤ－１抗体と組み合わせた本開示のワクチンの組み合わせ（抗ＰＤ－１＋ＤＤＶ）で処置されたマウスにおけるＴＣ－１腫瘍容積を示す曲線グラフである。

【図3D】本開示の一実施形態による、未処置のマウス、抗ＰＤ－１抗体のみで処置されたマウス、本開示のワクチンの組み合わせ（ＤＤＶ）で処置されたマウス、又は抗ＰＤ－１抗体と組み合わせた本開示のワクチンの組み合わせ（抗ＰＤ－１＋ＤＤＶ）で処置されたマウスにおける生存率を示すカプラン・マイヤー生存曲線である。

【発明を実施するための形態】

【0027】

一般的な方法にしたがって、記載される種々の特徴は縮尺どおりの図ではなく、本開示に関する特徴を強調するために図示されている。図及び本文を通して、同様の参照文字は同様の要素を示す。

【0028】

本開示の例示的実施形態が示される添付の図面を参照して、以下に本開示をより十分に記載する。しかしながら、この開示は多くの異なる形式で実施されてもよく、本明細書に記載される例示的実施形態に限定するものと見なされるべきではない。むしろ、これらの例示的実施形態は、本開示を詳細かつ完全とし、本開示の範囲を当業者十分に伝えるように提供されるものである。全体を通して、同様の参照文字は同様の要素を示す。

【0029】

本明細書で用いられる専門用語は、特定の例示的実施形態のみを記載することを目的とするものであり、本開示を限定することを意図していない。本明細書で用いられる場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈で別段の明示がない限り、複数形も同様に含むことを意図している。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び／又は「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、又は「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び／又は「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、又は「有する（ｈａｓ）」及び／又は「有している（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、本明細書で用いられる場合、提示されている特徴、領域、整数、ステップ、操作、要素、及び／又は構成要素の存在を特定するが、１又は複数のその他の特徴、領域、整数、ステップ、操作、要素、構成要素、及び／又はそれらのグループの存在又は追加を排除するものではないこともさらに理解されるだろう。

【0030】

本明細書で用いられる場合、「機能的バリアント」という用語は、（ｉ）アミノ酸配列において野生型タンパク質と少なくとも、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の同一性を有し、且つ、（ｉｉ）野生型タンパク質の免疫原性（例えば、タンパク質特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞を誘発する能力）を保持しているタンパク質を指す。

【0031】

本明細書で用いられる場合、「～と組み合わせた」との用語は、同一患者の同一疾患を処置する過程において、別段の指示がない限り、２種類以上のワクチン又は治療剤の同時投与又は不特定の制限時間内の任意の順序での連続的投与を含む。

【0032】

別段の定義がない限り、本明細書で用いられる全ての用語（技術用語及び科学用語を含む）は、本開示が属する当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。一般に使用される辞書において定義されるような用語は、関連技術及び本開示の文脈におけるそれらの意味と一致する意味を有していると解釈されるべきであり、本明細書で明確にそのように定義されていない限り、理想化された意味又は過度に形式張った意味で解釈されないこともさらに理解されるだろう。

【0033】

本開示のワクチンの組み合わせは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連疾患を有する対象に提供される。ＨＰＶ関連疾患を有する対象は、これらに限定されないが、疣贅、乳頭腫、上皮内腫瘍、陰茎がん、膣がん、外陰がん、肛門がん、中咽頭がん、非黒色腫皮膚がん、結膜がん、又は子宮頸がんを患う哺乳類（例えば、ヒト、マウスなど）であってもよい

【0034】

ワクチンの組み合わせは、第１のワクチン及び第２のワクチンを含んでいてもよい。第１のワクチンは、第１の融合タンパク質、又は前記第１の融合タンパク質をコードするよう設計されている第１のポリヌクレオチドを含む。第１の融合タンパク質は、特定の配置を有する複数のＨＰＶ抗原及び熱ショックタンパク質を含み、したがって、複数のＨＰＶ抗原の間及びＨＰＶ抗原と熱ショックタンパク質との間に特定の連結領域を含む。第２のワクチンは、第２の融合タンパク質及び第３の融合タンパク質、又は前記第２の融合タンパク質と前記第３の融合タンパク質とをコードする第２のポリヌクレオチドを含む。第２の融合タンパク質は、特定の配置を有する２つのＨＰＶ抗原を含み、したがって、複数のＨＰＶ抗原の間に特定の連結領域を含む。第３の融合タンパク質も、特定の配置を有する２つのＨＰＶ抗原を含み、したがって、複数のＨＰＶ抗原の間に特定の連結領域を含む。第１の融合タンパク質における連結領域のアミノ酸配列は、第２の融合タンパク質及び第３の融合タンパク質における連結領域のアミノ酸配列と異なっている。

【0035】

具体的には、第１の融合タンパク質、第２の融合タンパク質、及び第３の融合タンパク質における複数のＨＰＶ抗原の特定の配置は、以下に記載されるものである。

【0036】

第１の融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の順に、（ｉ）ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ－１６）のＥ７タンパク質又はその機能的バリアント、ここで、前記ＨＰＶ－１６のＥ７タンパク質又はその機能的バリアントは、前記タンパク質の先頭に配列番号１、及び前記タンパク質の末尾に配列番号２を含む、（ｉｉ）ヒトパピローマウイルス１８型（ＨＰＶ－１８）のＥ７タンパク質又はその機能的バリアント、ここで、前記ＨＰＶ－１８のＥ７タンパク質又はその機能的バリアントは、前記タンパク質の先頭に配列番号３、及び前記タンパク質の末尾に配列番号４を含む、（ｉｉｉ）ＨＰＶ－１６のＥ６タンパク質又はその機能的バリアント、ここで、前記ＨＰＶ－１６のＥ６タンパク質は又はその機能的バリアントは、前記タンパク質の先頭に配列番号５、及び前記タンパク質の末尾に配列番号６を含む、（ｉｖ）ＨＰＶ－１８のＥ６タンパク質又はその機能的バリアント、ここで、前記ＨＰＶ－１８のＥ６タンパク質又はその機能的バリアントは、前記タンパク質の先頭に配列番号７、及び前記タンパク質の末尾に配列番号８を含む、並びに（ｖ）熱ショックタンパク質又はその機能的バリアントを含んでいてもよい。したがって、第１の融合タンパク質において、連結は、隣接する複数のＨＰＶ抗原（例えば、ＨＰＶ－１６のＥ７タンパク質とＨＰＶ－１８のＥ７タンパク質、ＨＰＶ－１８のＥ７タンパク質とＨＰＶ－１６のＥ６タンパク質、ＨＰＶ－１６のＥ６タンパク質とＨＰＶ－１８のＥ６タンパク質）の間、及びＨＰＶ－１８のＥ６タンパク質と熱ショックタンパク質との間に形成される。

【0037】

第２の融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の順に、ＨＰＶ－１６のＥ６タンパク質又はその機能的バリアント、及びＨＰＶ－１６のＥ７タンパク質又はその機能的バリアントを含んでいてもよい。第３の融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端の順に、ＨＰＶ－１８のＥ６タンパク質又はその機能的バリアント、及びＨＰＶ－１８のＥ７タンパク質又はその機能的バリアントを含んでいてもよい。したがって、第２の融合タンパク質又は第３の融合タンパク質において、連結は、隣接する複数のＨＰＶ抗原（例えば、ＨＰＶ－１６のＥ６タンパク質とＨＰＶ－１６のＥ７タンパク質、又はＨＰＶ－１８のＥ６タンパク質とＨＰＶ－１８のＥ７タンパク質）の間に形成される。

【0038】

第１の融合タンパク質、第２の融合タンパク質、及び第３の融合タンパク質の前述の配置により、第１の融合タンパク質における連結領域のアミノ酸配列は、第２の融合タンパク質及び第３の融合タンパク質における連結領域のアミノ酸配列と異なっている。

【0039】

ワクチンの組み合わせによる第１のワクチンの第１のポリヌクレオチド及び第２のワクチンの第２のポリヌクレオチドは、図１Ａ及び図１Ｂにそれぞれ示される。

【0040】

図１Ａは、第１の融合タンパク質をコードする例示的な第１のポリヌクレオチド（ＰＢＩ－１１と示す）を示す。第１のポリヌクレオチドは、Ｎ末端からＣ末端の順に、シグナルペプチド（「Ｓ」と示す）、ＨＰＶ－１６のＥ７タンパク質（Ｅ７_（１６）と示す）、ＨＰＶ－１８のＥ７タンパク質（Ｅ７_（１８）と示す）、ＨＰＶ－１６のＥ６タンパク質（Ｅ６_（１６）と示す）、ＨＰＶ－１８のＥ６タンパク質（Ｅ６_（１８）と示す）、及び７０キロダルトンの熱ショックタンパク質（ＨＳＰ７０）を含む第１の融合タンパク質をコードする融合遺伝子を含む。

【0041】

したがって、第１の融合タンパク質は、隣接する複数のＨＰＶ抗原（例えば、ＨＰＶ－１６のＥ７タンパク質とＨＰＶ－１８のＥ７タンパク質、ＨＰＶ－１８のＥ７タンパク質とＨＰＶ－１６のＥ６タンパク質、ＨＰＶ－１６のＥ６タンパク質とＨＰＶ－１８のＥ６タンパク質）の間に形成された連結領域を有する。

【0042】

いくつかの実施形態では、ＨＰＶ－１６のＥ７タンパク質は配列番号９を含んでいてもよく、ＨＰＶ－１８のＥ７タンパク質は配列番号１０を含んでいてもよく、ＨＰＶ－１６のＥ６タンパク質は配列番号１１を含んでいてもよく、ＨＰＶ－１８のＥ６タンパク質は配列番号１２を含んでいてもよい。

【0043】

いくつかの実施形態では、ＨＰＶ－１６のＥ７タンパク質は配列番号１３によりコードされていてもよく、ＨＰＶ－１８のＥ７タンパク質は配列番号１４によりコードされていてもよく、ＨＰＶ－１６のＥ６タンパク質は配列番号１５によりコードされていてもよく、ＨＰＶ－１８のＥ６タンパク質は配列番号１６によりコードされていてもよい。

【0044】

いくつかの実施形態では、ｐＢＩ－１１は、本願のワクチンの組み合わせの第１のワクチンとして用いられてもよい。配列番号１７に記載されるヌクレオチド配列を有するｐＢＩ－１１は、シグナルぺプチドをコードする部分配列、配列番号９に記載されるＨＰＶ－１６のＥ７タンパク質、配列番号１０に記載されるＨＰＶ－１８のＥ７タンパク質、配列番号１１に記載されるＨＰＶ－１６のＥ６タンパク質、配列番号１２に記載されるＨＰＶ－１８のＥ６タンパク質をコードする最適化ＨＰＶ部分配列（図１Ａ、断片１０１）、並びにＨＳＰ７０をコードする部分配列を含む融合遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトである。

【0045】

いくつかの実施形態では、代替的に及び／又は追加的に、ｐＢＩ－１２が本願のワクチンの組み合わせの第１のワクチンとして用いられてもよい。配列番号１８に記載されるヌクレオチド配列を有するｐＢＩ－１２は、シグナルぺプチドをコードする最適化シグナル配列、配列番号９に記載されるＨＰＶ－１６のＥ７タンパク質、配列番号１０に記載されるＨＰＶ－１８のＥ７タンパク質、配列番号１１に記載されるＨＰＶ－１６のＥ６タンパク質、配列番号１２に記載されるＨＰＶ－１８のＥ６タンパク質をコードする最適化ＨＰＶ部分配列、並びにＨＳＰ７０をコードする部分配列を含む融合遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトである。

【0046】

いくつかの実施形態では、第１のワクチンは第１のポリヌクレオチドを含んでいてもよく、第１のワクチンは対象当たり１０ミリグラム～対象当たり２０ミリグラムの用量で投与されてもよい。

【0047】

図１Ｂは、第２の融合タンパク質と第３の融合タンパク質とをコードする例示的な第２のポリヌクレオチドを示す。図１Ｂに示すように、第２の融合タンパク質及び第３の融合タンパク質の発現カセットは、ワクシニアウイルスのゲノム内に含まれている（ＴＡ－ＨＰＶと示す）。第２のポリヌクレオチドは、ＨＰＶ－１６のＥ６タンパク質及びＥ７タンパク質をコードする第１の翻訳領域（図１ＢにおいてＨＰＶ１６ Ｅ６７と示す）、及びＨＰＶ－１８のＥ６タンパク質及びＥ７タンパク質をコードする第２の翻訳領域（図１ＢにおいてＨＰＶ１８ Ｅ６７と示す）を含む。

【0048】

いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、組換えウイルス中に含まれていてもよい。

【0049】

いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドを含む組換えウイルスは、これに限定されないが、ＴＡ－ＨＰＶであってもよい。ＴＡ－ＨＰＶは、１×１０^４ｐｆｕ～２×１０^９ｐｆｕの用量で投与されてもよい。ＴＡ－ＨＰＶは、好ましくは、２×１０^４ｐｆｕ～５×１０^７ｐｆｕの用量で投与されてもよい。

【0050】

いくつかの実施形態では、本開示のワクチンの組み合わせは、ＨＰＶ関連疾患の処置のための対象に投与されてもよい。

【0051】

いくつかの実施形態では、ＨＰＶに対する対象の免疫応答を増強するための異種プライムブースト投与計画において用いられる併用療法を提供するために、ワクチンの組み合わせの第１のワクチンはプライミングワクチンとして投与されてもよく、ワクチンの組み合わせの第２のワクチンはブーストワクチンとして続いて投与されてもよい。例えば、第１のワクチンは、第１のポリヌクレオチドを含んでいてもよく、対象当たり１０ミリグラム～対象当たり２０ミリグラムの用量で投与されてもよく、第２のワクチンは、ＴＡ－ＨＰＶを含んでいてもよく、１×１０^４ｐｆｕ～２×１０^９ｐｆｕの用量で投与されてもよい。

【0052】

いくつかの実施形態では、ＨＰＶに対する対象の免疫応答を増強するための異種プライムブースト投与計画において用いられる併用療法を提供するために、ワクチンの組み合わせの第１のワクチンは、プライミングワクチンとして投与されてもよく、ブーストワクチンとして続いて投与されてもよく、ブーストワクチンとしての第１のワクチンの投与後にワクチンの組み合わせの第２のワクチンもブーストワクチンとして続いて投与されてもよい。

【0053】

いくつかの実施形態では、ワクチンの組み合わせは、免疫チェックポイント阻害剤をさらに含んでいてもよい。免疫チェックポイント阻害剤は、第１のワクチン及び／又は第２のワクチンと、同時に又は任意の順序で連続的に投与されてもよい。例えば、免疫チェックポイント阻害剤は、第１のワクチンの投与の前及び／又は第１のワクチンの投与と同時に投与されてもよい。

【0054】

いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）、誘導性共刺激分子（ＩＣＯＳ）、Ｔ細胞免疫グロブリン－ムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、又はＴ細胞免疫グロブリン－免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）ドメイン（ＴＩＧＩＴ）を標的にする免疫調節剤であってもよい。例えば、免疫チェックポイントは、ＰＤ－１を標的にする抗体（「抗ＰＤ－１抗体」ともいう）であってもよい。

【0055】

いくつかの実施形態では、ワクチンの組み合わせの第１のワクチン及び第２のワクチンは、ワクチン接種を受けた対象においてより強い免疫応答を引き起こすための、免疫賦活剤などの成分をさらに含んでいてもよい。

【実施例0056】

実施例１：ワクチンの組み合わせの設計及び合成
ｐＢＩ－１ ＤＮＡコンストラクトは、ｐＮＧＶＬ４ａ－ＳｉｇＥ７（ｄｅｔｏｘ）ＨＳＰ７０（Ｃ．Ｔｒｉｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ ２００３，２１：４０３６－４０４２）として以前に記載されている。一つの例においては、ｐＢＩ－１１ ＤＮＡコンストラクトは、シグナルペプチド、ＨＰＶ－１６のＥ７タンパク質、ＨＰＶ－１８のＥ７タンパク質、ＨＰＶ－１６のＥ６タンパク質、ＨＰＶ－１８のＥ６タンパク質、及びＨＳＰ７０の５’部分（Ｔｔｈ１１１Ｉ部位まで）の融合タンパク質をコードし、５’がＥｃｏＲＩ部位とＫｏｚａｋ部位に挟まれ、３’にＴｔｈ１１１Ｉ部位を有する合成ＤＮＡ断片のギブソンアセンブリによって得られた。前記合成ＤＮＡ断片をｐＢＩ－１中にクローニングして、ＥｃｏＲＩとＴｔｈ１１１Ｉの間の断片をインフレームでＨＳＰ７０と置換した。ｐＢＩ－１中のＨＰＶ－１６のＥ７タンパク質、ＨＰＶ－１８のＥ７タンパク質、ＨＰＶ－１６のＥ６タンパク質、及びＨＰＶ－１８のＥ６タンパク質のための発現遺伝子は、コドン最適化されており、それぞれ配列番号１～４によりコードされる。別の例では、ｐＢＩ－１２ ＤＮＡコンストラクトはまた、シグナルペプチド、ＨＰＶ－１６のＥ７タンパク質、ＨＰＶ－１８のＥ７タンパク質、ＨＰＶ－１６のＥ６タンパク質、ＨＰＶ－１８のＥ６タンパク質、及びＨＳＰ７０の融合タンパク質をコードする合成ＤＮＡ断片を含んでいた。ｐＢＩ－１２中のシグナルペプチド、ＨＰＶ－１６ Ｅ７、ＨＰＶ－１８ Ｅ７、ＨＰＶ－１６ Ｅ６、及びＨＰＶ－１８ Ｅ６のための発現遺伝子は、コドン最適化されていた。ｐＢＩ－１２の合成ＤＮＡ断片をｐＢＩ－１２中にクローニングして、ＥｃｏＲＩとＴｔｈ１１１Ｉの間の断片をインフレームでＨＳＰ７０と置換した。

【0057】

各ＤＮＡコンストラクトの合成ＤＮＡ断片中の、遺伝子発現のために最適化された遺伝子（図１Ａ、断片１０１）又は天然のパピローマウイルス配列に基づいた遺伝子（図１Ａ、断片１０３）は、図１Ａに示される。

【0058】

ＴＡ－ＨＰＶは、ＨＰＶ１６型及びＨＰＶ１８型のがん遺伝子Ｅ６及びＥ７を発現する組換えワクシニアウイルスワクチンである。ＨＰＶ－１６及びＨＰＶ－１８のがん遺伝子Ｅ６及びＥ７は、ワクシニアウイルスＷｙｅｔｈ株ゲノム中の中性部位（Ｌ．Ｋ．Ｂｏｒｙｓｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ．，１９９６ Ｊｕｎ １；３４７（９０１４）：１５２３－７）に、ｐ７．５プロモーター及びＨ６プロモーター（図１Ｂにおいて、それぞれｐ７．５及びＨ６と示す）の制御下で先頭部分が向かい合う（head-to-head）方向で挿入されてもよい。ＨＰＶ－１６遺伝子及びＨＰＶ－１８遺伝子の両方について、Ｅ６終止コドンは、Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質の翻訳領域、及びＥ７中のＲｂ結合部位を不活性化するよう導入された特定の変異を生じるように改変されてもよい。

【0059】

実施例２：ワクチンの組み合わせにおいてコードされる融合タンパク質中の複数のＨＰＶ抗原の配置は、自己抗原に対する交差反応性免疫を誘発し得る宿主タンパク質に共通する配列を有するペプチドを含まない
自己抗原に対する交差反応性を誘発するであろうワクチンエピトープを同定するため、ヒトタンパク質の配列に対する第１のワクチンにコードされる第１の融合タンパク質の配列を比較した。ペプチド抗原が、ＣＤ８ Ｔ細胞に対するＭＨＣクラスＩ上の８～１１アミノ酸、又はＣＤ４ Ｔ細胞に対するＭＨＣクラスＩＩ上の１２～２０アミノ酸のいずれかの断片として提示されることを考慮して、ｐＢＩ－１１にコードされた融合タンパク質中のＨＰＶ１６／１８ Ｅ６／Ｅ７ペプチド及び連結領域から作成された全ての８アミノ酸長について、ＵｎｉＰｒｏｔ（登録商標）（Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ（登録商標）データベース及びＴｒＥＭＢＬ（登録商標）データベースを含む）中のヒトタンパク質配列に対する検索を行った。

【0060】

具体的には、内在的なペプチドと同一であり得る新規ペプチド候補を検索するために、ｐＢＩ－１１のアミノ酸２４～５５０から、長さが５～８アミノ酸（５アミノ酸長～８アミノ酸長）の全ての直鎖状配列を作製した。この直鎖状配列は、シグナルペプチドの最後の７アミノ酸、ＨＰＶ－１６ Ｅ７、ＨＰＶ－１８ Ｅ７、ＨＰＶ－１８ Ｅ６、ＨＰＶ－１６ Ｅ６、及びＨＳＰ７０の最初の１１アミノ酸に及ぶ。全体で、５２０個の８アミノ酸長、５２１個の７アミノ酸長、５２２個の６アミノ酸長、及び５２３個の５アミノ酸長が作成された。

【0061】

さらに、配列は、ウエブサイトで提供されるＰｅｐｔｉｄｅ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌを用いて８０～１００配列ずつのグループでＵｎｉＰｒｏｔ（登録商標）タンパク質データベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）に提出され、ヒトタンパク質についてフィルターをかけられたＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ（登録商標）データベース及びＴｒＥＭＢＬ（登録商標）データベースに対する完全一致について検索された。結果は、ｐＢＩ－１１にコードされる融合タンパク質と、８アミノ酸以上の内在的なヒトペプチド配列との間に完全一致はないことを明らかにした。

【0062】

代替的な検索アプローチも実施した。ｐＢＩ－１１のタンパク質配列の同じ領域を用いて、Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／）を検索した。（２０２１年１１月２３日に出願された米国特許出願番号第１７／５３４，２５６号に開示される）ｐＢＩ－１０．１配列に対してマッピングされた任意のエピトープ配列を得るためのＬｉｎｅａｒ Ｅｐｉｔｏｐｅについての「部分列（substring）」が選択された。検索により、ｐＢＩ－１１中のＨＰＶ－１６ Ｅ７に由来するＢ細胞エピトープ同定された（以下の表１参照）。このエピトープは、ヒト対象における安全性が試験されているｐＢＩ－１中にも存在している。まとめると、これらの結果は、本願の第１のワクチン（ｐＢＩ－１１又はｐＢＩ－１２）にコードされる融合タンパク質の配置は自己抗原に対する交差反応性Ｔ細胞免疫を誘発し得るペプチドを生成する可能性が低いことを示唆する。

【0063】

【表1】

【0064】

さらに、ｐＢＩ－１１は、ＴＡ－ＨＰＶ（図１Ｂ参照）における順序と異なる順序で配置された、シグナルペプチド、ＨＰＶ－１６ Ｅ７、ＨＰＶ－１８ Ｅ７、ＨＰＶ－１６ Ｅ６、及びＨＰＶ－１８ Ｅ６（Ｅ７_（１６）／Ｅ７_（１８）／Ｅ６_（１６）／Ｅ６_（１８）、図１Ａ参照）の融合タンパク質をコードする。そのような配置は、ｐＢＩ－１１によりコードされる融合タンパク質内に潜在的に含まれる連結に関連したエピトープに対する免疫応答をブーストすることをさらに回避し得る。

【0065】

結果として、本願のワクチンの組み合わせは自己抗原に対する交差反応性の免疫応答を誘発するリスク、及びワクチン内に含まれる又はワクチンにコードされる融合タンパク質中の連結に関連したエピトープに対する免疫が引き起こされる可能性を低減し、したがって、安全性が改善される。

【0066】

実施例３：ｐＢＩ－１１ワクチンにより引き起こされたＨＰＶ抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞媒介性免疫応答は、ＴＡ－ＨＰＶワクシニアウイルスワクチンでのブーストによりさらに促進される
ｐＢＩ－１１のみ、又はＴＡ－ＨＰＶを組み合わせたｐＢＩ－１１のいずれかをワクチン接種されたマウスにおける免疫応答を比較するために、ｉｎ ｖｉｖｏ Ｔ細胞活性化アッセイが行われた。

【0067】

図２Ａは実験計画の略図である。Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ニューヨーク州、ジャーマンタウン）から入手した６週齢～８週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスにｐＢＩ－１１（マウス当たり２５ｍｇ／５０ｍｌ）を筋肉内（Ｉ．Ｍ．）注射によりワクチン接種した。マウスは、対照群（無感作群）、ＤＤＤ群、及びＤＤＶ群に分けられた。７日後に、各群における各マウスを同じ投与計画でブーストした。第２のワクチン接種の１週間後に、ＤＤＤ群のマウス（図２ＡでＤＤＤと示す）にｐＢＩ－１１（マウス当たり２５ｍｇ／５０ｍｌ）を筋肉内注射によりワクチン接種した。ＤＤＶ群のマウス（図２ＡでＤＤＶと示す）にＴＡ－ＨＰＶ（マウス当たり１０^６ｐｆｕ／５０ｍｌ）を筋肉内注射によりワクチン接種した。最後のワクチン接種の６日後、ＨＰＶ－１６ Ｅ７四量体染色のために、ワクチン接種したマウス又は無感作のマウスから末梢血を採取した。最後のワクチン接種の１４日後、ワクチン接種されたマウスから脾臓細胞を調製し、ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（登録商標）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カルフォルニア州、サンディエゴ）の存在下、ＨＰＶ－１６ Ｅ６（アミノ酸５０～５７）ペプチド、ＨＰＶ－１６ Ｅ７（アミノ酸４９～５７）ペプチド、又はＨＰＶ－１８ Ｅ６（アミノ酸６７～７５）ペプチドのいずれかで刺激した。エピトープＨＰＶ－１６ Ｅ６（アミノ酸５０～５７）の提示は、免疫優性エピトープであるＨＰＶ－１６ Ｅ７（アミノ酸４９～５７）により抑制されることが知れられている。抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞を検出するために細胞内ＩＦＮ－γサイトカイン染色アッセイを行った。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）フローサイトメーターを用いて細胞を獲得し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウェア（カルフォルニア州、マウンテンビュー、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてデータを解析した。

【0068】

図２Ｂに示されるように、ＤＤＶ投与計画でワクチン接種されたマウスは、ｐＢＩ－１１のみ（ＤＤＤ）をワクチン接種されたマウス又は無感作マウスよりも、Ｅ７特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合が顕著に高かった。

【0069】

さらに、図２Ｃは、プライムワクシニアブースト（ＤＤＶ）におけるマウスは、ｐＢＩ－１１のみを投与されたマウスと比較して、ＨＰＶ－１６ Ｅ７特異的Ｔ細胞の数が顕著に多く（Ｐ＝０．０４２８）、ＨＰＶ－１８ Ｅ６特異的Ｔ細胞の数が多い（Ｐ＝０．２１１６）ことを示す。実際、ＴＡ－ＨＰＶのみをワクチン接種されたマウスにおけるＨＰＶ－１６ Ｅ７特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞媒介性免疫応答は以前に特徴付けられている（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０１８ Ｄｅｃ；５２５：２０５－２１５）。ＴＡ－ＨＰＶのみをワクチン接種されたマウスは、認識できるＨＰＶ－１６ Ｅ７特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞媒介性免疫応答を引き起こさなかったことが分かっている（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０１８ Ｄｅｃ；５２５：２０５－２１５）。しかしながら、発明者らによる結果は、ＴＡ－ＨＰＶブースターワクチン接種が、ｐＢＩ－１１ ＤＮＡワクチンでのプライミング後に引き起こされるＨＰＶ－１６抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞免疫応答及びＨＰＶ－１８抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞免疫応答を同時に促進可能であることを示す。

【0070】

上記結果に基づくと、本開示のワクチンの組み合わせによる第２のワクチン（例えば、ＴＡ－ＨＰＶ）と組み合わせて第１のワクチン（例えば、ｐＢＩ－１１）を用いる異種プライムブーストワクチン接種は、第１のワクチン（例えば、ｐＢＩ－１１）のみの投与と比較して、増強されたＨＰＶ抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞介在性免疫応答を誘発する。

【0071】

実施例４．本開示のワクチンの組み合わせは、治療的抗腫瘍応答を改善するための抗ＰＤ－１免疫チェックポイント阻害と組み合わされ得る
ＨＰＶ関連疾患に対する治療的抗腫瘍効果を引き起こすための抗ＰＤ－１免疫チェックポイント阻害剤を組み合わせた本開示のワクチンの組み合わせの能力を、ＨＰＶ－１６ Ｅ６／Ｅ７^＋ＴＣ－１腫瘍モデルにおいて試験した。

【0072】

図３Ａは実験計画の略図である。６週齢～８週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスに２×１０^５個のＴＣ－１腫瘍細胞を０日目に皮下注射した。３日目に、マウスを４つの群（未処置群、抗ＰＤ－１群、ＤＤＶ群、及び抗ＰＤ－１＋ＤＤＶ群）に分けた。抗ＰＤ－１群のマウスに精製抗マウスＰＤ－１モノクローナル抗体（ＭＡｂ；クローン２９Ｆ．１Ａ１２、マウス当たり２００ｍｇ）を腹腔内注射により注入した。処置を一日おきに繰り返した。ＤＤＶ群のマウスにｐＢＩ－１１（マウス当たり２５ｍｇ／５０ｍｌ）を筋肉内注射でワクチン接種し、３日後にブーストし、３日後に皮膚乱切によりＴＡ－ＨＰＶワクシニアウイルスでさらにブーストした。抗ＰＤ－１＋ＤＤＶ群のマウスを抗マウスＰＤ－１ ＭＡｂ及びｐＢＩ－１１ ＤＮＡワクチンプライムの両方で処置した後、ＴＡ－ＨＰＶワクシニアウイルスブーストで処置した。２７日目に、ＨＰＶ－１６ Ｅ７ペプチド（アミノ酸４９～５７）結合四量体染色を用いてＨＰＶ－１６ Ｅ７特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞介在性免疫応答を特徴付けるため、ＰＢＭＣを採取した。

【0073】

ある例では、図３Ａにおける実験の略図は、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ－１抗体）が異種プライムブーストワクチン接種（例えば、ＤＤＶ）より前に投与されることを示す。しかしながら、その他の例では、追加的に及び／又は代替的に、免疫チェックポイント阻害剤は異種プライムブーストワクチン接種の過程において投与されてもよい。

【0074】

四量体染色のために、マウスＰＢＭＣを精製抗マウスＣＤ１６／３２で最初に染色し、次に、ＦＩＴＣ結合抗マウスＣＤ８ａ及びＰＥ結合ＨＰＶ－１６ Ｅ７（アミノ酸４９～５７）ペプチド結合Ｈ－２Ｄ^ｂ四量体で４℃で１時間染色した。洗浄後、細胞を７－ＡＡＳで染色した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）フローサイトメーターを用いて細胞を獲得し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウェア（カルフォルニア州、マウンテンビュー、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。四量体染色の結果は図３Ｂに示される。

【0075】

触診及びデジタルキャリパーにより２週間に１回、腫瘍の増殖を検査した。腫瘍容積は、式：［最大直径×（垂直直径）^２］×３．１４／６を用いて計算され、図３Ｃに示される。図３Ｄに示されるように、腫瘍担持マウスの生存率を記録し、自然死、及び死亡を引き起こす２ｃｍ以上の直径の腫瘍の両方を死亡と計数した。

【0076】

図３Ｂに示されるように、単独でのＤＤＶ投与又は抗ＰＤ－１抗体と共にＤＤＶ投与を受けたマウスは、ＨＰＶ－１６ Ｅ７特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞介在性免疫応答を示したが、抗ＰＤ－１抗体のワクチン接種が無い場合は、抗ＰＤ－１抗体の処置は検出可能なＨＰＶ－１６ Ｅ７特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を引き起こさなかった。

【0077】

さらに、図３Ｃは、ＤＤＶ投与計画に抗ＰＤ－１抗体処置を追加することにより、治療的抗腫瘍効果が顕著に促進されたことを実証した。このことは、ワクチン接種と抗ＰＤ－１抗体処置との相乗効果、及び抗ＰＤ－１抗体処置は事前の免疫応答が無い場合は効果的ではないことを示唆する。さらに、図３Ｄは、併用処置（抗ＰＤ－１＋ＤＤＶ）により、顕著に（ＤＤＶと比較した場合にＰ＝０．００７３、抗ＰＤ－１と比較した場合にＰ＝０．０００２）良好な腫瘍担持マウスの生存率となることを示す。

【0078】

結論として、ＨＰＶ抗原の図示された配置を有する第１の融合タンパク質を含む第１のワクチン、又は前記第１の融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド、並びに前記第１の融合タンパク質におけるＨＰＶ抗原の配置とは異なるＨＰＶ抗原の配置をいずれも有する第２の融合タンパク質及び第３の融合タンパク質を含む第２のワクチン、又は前記第２の融合タンパク質と前記第３の融合タンパク質とをコードする第２のポリヌクレオチドを含む本開示のワクチンの組み合わせは、自己抗原に対する交差反応性免疫の誘発のリスク、及びワクチンに含まれる又はワクチンによるコードされる融合タンパク質における連結に関連したエピトープに対する免疫応答のブーストのリスクを低減するだけではなく、顕著なＨＰＶ抗原特異的免疫応答を示す。さらに、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ－１抗体）と組み合わせた本開示のワクチンの組み合わせは、より強いＨＰＶ抗原特異的抗腫瘍応答をｉｎ ｖｉｖｏで引き起こし、より強力な抗腫瘍効果をさらにもたらす。

【0079】

当業者は、本開示の教示を保持した上で、装置及び方法の多数の変更及び改変がなされてもよいことに容易に気付くであろう。したがって、上記開示は添付の特許請求の範囲の境界のみにより限定されると解釈されるべきである。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【配列表】

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【外国語明細書】