特開 2023-104905 吸収が調整可能な水溶性π共役蛍光１，１’－ビナフチル系ポリマー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023104905

(43)【公開日】2023-07-28

(54)【発明の名称】吸収が調整可能な水溶性π共役蛍光１，１’－ビナフチル系ポリマー

(51)【国際特許分類】

   C08G 61/10 20060101AFI20230721BHJP

   C08G 61/12 20060101ALI20230721BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20230721BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20230721BHJP

   G01N 33/533 20060101ALI20230721BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20230721BHJP

   C09K 11/06 20060101ALI20230721BHJP

【ＦＩ】

C08G61/10

C08G61/12

G01N21/64 F

G01N21/64 E

G01N33/53 D

G01N33/53 M

G01N33/533

G01N33/543 597

C09K11/06

C09K11/06 680

【審査請求】未請求

【請求項の数】12

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023004317

(22)【出願日】2023-01-16

(31)【優先権主張番号】22151720

(32)【優先日】2022-01-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(71)【出願人】

【識別番号】520094891

【氏名又は名称】ミルテニー バイオテック ベー．フェー． ウント コー． カー・ゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｂ．Ｖ． ＆ Ｃｏ． ＫＧ

【住所又は居所原語表記】Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ－Ｅｂｅｒｔ－Ｓｔｒａｓｓｅ ６８， ５１４２９ Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ

(74)【代理人】

【識別番号】100114890

【弁理士】

【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト

(74)【代理人】

【識別番号】100098501

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 拓

(74)【代理人】

【識別番号】100116403

【弁理士】

【氏名又は名称】前川 純一

(74)【代理人】

【識別番号】100134315

【弁理士】

【氏名又は名称】永島 秀郎

(74)【代理人】

【識別番号】100162880

【弁理士】

【氏名又は名称】上島 類

(72)【発明者】

【氏名】クリスティアン ドーゼ

(72)【発明者】

【氏名】ディアク マイネケ

(72)【発明者】

【氏名】ダニエル ベアント

(72)【発明者】

【氏名】トラヴィス ジェニングズ

【テーマコード（参考）】

2G043

4J032

【Ｆターム（参考）】

2G043AA01

2G043BA16

2G043CA04

2G043CA05

2G043CA09

2G043DA02

2G043EA01

2G043FA01

2G043FA02

2G043FA06

2G043KA02

2G043KA03

2G043KA09

2G043LA01

2G043LA03

4J032BA05

4J032BA21

4J032BA25

4J032BB06

4J032BB09

4J032BC02

4J032BC03

4J032BC12

4J032BD07

4J032CA03

4J032CA04

4J032CA14

4J032CB01

4J032CB04

4J032CB12

4J032CC01

4J032CD01

4J032CD02

4J032CE03

4J032CE22

4J032CE24

4J032CF05

4J032CG03

(57)【要約】      （修正有）

【課題】生体試料中の標的部位を検出するためのコンジュゲートおよび検出する方法を提供する。
【解決手段】一般式（Ｉ）

［式中、ＡＲおよびＭＵは、ポリマーの繰り返し単位であり、ＭＵは、ポリマー主鎖に沿って均一にまたはランダムに分布しているポリマー変性単位またはバンドギャップ変更単位であり、Ｇ１およびＧ２は、Ｇ１またはＧ２のうちの少なくとも１つが抗原認識部位であることを条件として、水素、ハロゲン、または抗原認識部位を表し、ａは１０～１００ｍｏｌ％であり、ｂは０～９０ｍｏｌ％であるが、ａ＋ｂ＝１００ｍｏｌ％であることを条件とし、ｃは１～１００００である］
を有するコンジュゲートを分析に適用する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

一般式（Ｉ）：

【化1】

［式中、ＡＲおよびＭＵは、ポリマーの繰り返し単位であり、
ＭＵは、ポリマー主鎖に沿って均一にまたはランダムに分布しているバンドギャップ変更単位であり、
Ｇ１およびＧ２は、Ｇ１またはＧ２のうちの少なくとも１つが抗原認識部位であることを条件として、水素、ハロゲン、または抗原認識部位を表し、
ａは１０～１００ｍｏｌ％であり、
ｂは０～９０ｍｏｌ％であるが、
ａ＋ｂ＝１００ｍｏｌ％であることを条件とし、
ｃは１～１００００である］
を有するコンジュゲートにおいて、
ＡＲが、一般式（ＩＩ）：

【化2】

［式中、残りの位置２，２’；３，３’；４，４’；５，５’；６，６’；７，７’および８，８’は、Ｈ、ＳＯ_２ＣＦ_３、ＳＯ_２Ｒ_ａ、ＣＦ_３、ＣＣｌ_３、ＣＮ、ＳＯ_３Ｈ、ＮＯ_２、ＮＲ_ａＲ_ｂＲ_ｃ ^＋、ＣＨＯ、ＣＯＲａ、ＣＯ_２Ｒａ、ＣＯＣｌ、ＣＯＮＲａＲｂ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｒ_ａ、ＯＲ_ａ、ＳＲ_ａ、ＯＣＯＲ_ａ、ＮＲ_ａＲ_ｂ、ＮＨＣＯＲ_ａ、ＣＣＲ_ａ、アリール－、ヘテロアリール－、Ｃ_６Ｈ_４ＯＲ_ａまたはＣ_６Ｈ_４ＮＲａＲｂからなる群から選択される同じまたは異なる残基で置換されており、Ｒａ～ｃは、独立して、水素、アルキル－、アルケニル－、アルキニル－、ヘテロアルキル－、アリール－、ヘテロアリール－、シクロアルキル－、アルキルシクロアルキル－、ヘテロアルキルシクロアルキル－、ヘテロシクロアルキル－、アラルキル－、もしくはヘテロアラルキル残基、または（ＣＨ_２）_ｘ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙＯ（ＣＨ_２）_ｚＣＨ_３であり、ｘは０～２０の整数であり、ｙは０～５０の整数であり、ｚは０～２０の整数である］
による２，２’または３，３’または５，５’または６，６’または７，７’または８，８’位を介してポリマー鎖に結合していることを特徴とする、コンジュゲート。

【請求項2】

前記コンジュゲートの末端に位置する前記ＭＵ単位が、以下の式（ＩＩＩ）

【化3】

［式中、Ｇ１、ＡＲ、ＭＵ、Ｇ２、ａ、ｂ、およびｃは、式（Ｉ）と同じ意味を有し、Ｌは、アルキル、アリール、またはヘテロアリール基を含む分子を表す］
に従ってリンカー基Ｌを介して結合していることを特徴とする、請求項１記載のコンジュゲート。

【請求項3】

主にＲ－またはＳ－立体異性体として提供されるＡＲで主たるキラリティーを有することを特徴とする、請求項１記載のコンジュゲート。

【請求項4】

ＭＵが、共役π系を提供する少なくとも１つのベンゼン環またはチオフェン環を有する芳香族系を含むことを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項記載のコンジュゲート。

【請求項5】

ＭＵが、以下の残基

【化4-1】

【化4-2】

のうちの１つ以上から選択されることを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項記載のコンジュゲート。

【請求項6】

Ｌが、前記ポリマー主鎖の末端に位置するアリールまたはヘテロアリール基であり、ｉ）アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラジン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、および分子もしくは生体分子へのコンジュゲートのためのそれらの保護された基から選択される官能基、またはｉｉ）エネルギー移動系のエネルギー受容体として結合した有機蛍光色素、またはｉｉｉ）生体分子、で終端している１つ以上のペンダント鎖で置換されていてよいことを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項記載のコンジュゲート。

【請求項7】

Ｌが、以下の残基

【化5-1】

【化5-2】

のうちの１つ以上から選択されることを特徴とする、請求項６記載のコンジュゲート。

【請求項8】

少なくとも２つの位置２，２’；３，３’；４，４’；５，５’；６，６’；７，７’および８，８’が、一般式（ＩＩＩ）

【化6】

［式中、ｎ＝５～１５である］
に従う残基で置換されていることを特徴とする、請求項１から７までのいずれか１項記載のコンジュゲート。

【請求項9】

Ｇ１およびＧ２が、独立して、水素、ハロゲン、または抗原認識部位であることを特徴とする、請求項１から８までのいずれか１項記載のコンジュゲート。

【請求項10】

前記抗原認識部位が、抗体、断片化抗体、断片化抗体誘導体、ペプチド／ＭＨＣ複合体、細胞接着もしくは共刺激分子の受容体、受容体リガンド、抗原、ハプテン結合剤、アビジン、ストレプトアビジン、アプタマー、プライマーおよびリガーゼ基質、ＴＣＲ分子を標的とするペプチド／ＭＨＣ複合体、細胞接着受容体分子、共刺激分子の受容体、または人工的に設計された結合分子からなる群から選択されることを特徴とする、請求項９記載のコンジュゲート。

【請求項11】

請求項１から１０までのいずれか１項記載の少なくとも１つのコンジュゲートを用いて生体試料のサンプル中の標的部位を検出する方法であって、
ｄ）前記生体試料のサンプルを少なくとも１つのコンジュゲートと接触させ、それによって、抗原認識部位によって認識される前記標的部位を前記コンジュゲートで標識するステップ、
ｅ）標識された前記標的部位を、前記コンジュゲートの吸光度スペクトル内の波長を有する光で励起するステップ、
ｆ）前記コンジュゲートによって放出される蛍光放射を検出することによって、標識された前記標的部位を検出するステップ、
を含むことを特徴とする、方法。

【請求項12】

蛍光顕微鏡法、フローサイトメーター、蛍光分光法、細胞分離、病理学、または組織学における、請求項１から１０までのいずれか１項記載のコンジュゲートの使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、水溶性蛍光ポリマー系色素、ならびに細胞の検出および分析のための抗体とのコンジュゲートにおけるそれらの使用に関する。

【0002】

発明の背景
免疫蛍光標識は、研究と臨床応用の両方において、生体試料からの標的細胞を詳しく分析し、特異的に分離するために重要である。分析の感度は、主にフルオロフォアの輝度に依存する。水溶性π共役系ポリマーは、輝度の高いフルオロフォアとして使用されており、また生物学的用途で利用されている。

【0003】

そのような水溶性π共役系ポリマーは、例えば、“Synthesis of Binaphthyl-Oligothiophene Copolymers with Emissions of Different Colors: Systematically Tuning the Photoluminescence of Conjugated Polymers” by K. Y. Musick, Q.-S. Hu, L. Pu, Macromolecules 1998, 31, 2933-2942に記載されている。

【0004】

さらに、米国特許出願公開第２０１８０００９９９０号明細書および米国特許第１０６０４６５７号明細書には、２，２’位においてＰＥＧで置換された４，４’－重合ビナフチルが記載されている。これは、ｓｐ^３混成軌道を利用するポリパラエチニリン（ＰＰＥ）結合を介して隣接するモノマーに４，４’結合が結合しているビナフチルに基づくポリマーについて言及している。本発明で開示されるビナフチルに基づくポリマーは、エチニリン結合なしで隣接するコモノマーに直接結合しており、その結果ｓｐ^２混成結合および完全芳香族共役系が得られる。水溶媒和ポリマー系色素およびポリマー系タンデム色素が提供される。ポリマー系色素には、共有結合、ビニレン基、またはエチニレン基を介して連結されたアリールまたはヘテロアリールコモノマーの共役セグメントを有する水溶媒和集光性多重発色団が含まれる。ポリマータンデム色素は、そのエネルギーを受容する近接位にある多重発色団に共有結合したシグナル伝達発色団をさらに含む。

【0005】

このように開示されたポリマー系色素は製造コストが高く、特に４，４’官能化ビナフチルモノマーの合成は面倒かつ高コストである。さらに、これらのポリマー系色素を紫外励起光を用いて使用するためには特殊なコモノマーが必要であり、得られるポリマー系色素は非常に複雑である。したがって、本発明の目的は、吸収特性および発光特性をスペクトルのＵＶ領域に向けて調整することにおける柔軟性が高められ、かつ製造がより容易で、より低コストでもある単純な系を提供することである。

【0006】

発明の概要
ビナフチルモノマーに基づくπ共役ポリマーは、非常に広い範囲にわたって吸収波長を調整することを可能にする。この系のエネルギーは、２つのねじれたナフチル単位からなるビナフチルモノマーのユニークな構造のため非常に高い。先行技術のポリフルオレンおよびポリフェナントレンに基づくポリマーとは対照的に、この構造的特徴のため、深紫外領域に吸収を持つポリマーを設計することができる。

【0007】

系のエネルギーは、ビナフチルモノマーと適切なコモノマーとの共重合によって厳密に制御することができる。コモノマーを戦略的に選択することで、ポリマーの吸収帯の端をスペクトルの深紫外から可視範囲に調整する能力が得られる。

【0008】

ユニークなモノマーを使用し、これらを特定のコモノマーと組み合わせることによって、望まれる励起レーザーに正確に一致させるようにスペクトルの吸収帯の位置が制御され、その結果、技術的課題の解決手段が提供される。

【0009】

π共役ポリマーを蛍光プローブとして使用することは、蛍光検出のツールボックスの主力となっている。有用なポリマーの吸収帯は、光源の波長、例えば３５５ｎｍ、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５６１ｎｍ、または６４０ｎｍの波長のレーザーと一致する必要がある。しかしながら、現行のポリマーは、その光吸収帯域が紫色の狭い領域に限定されており、そのためその有用性が限られている。調整可能な吸収帯を有する新規なπ共役ポリマーにより、分析対象の検出を含む生物学的用途向けの水溶性ポリマー系色素の収蔵庫の拡大が可能になるであろう。

【0010】

発明の簡単な説明
したがって、本発明の目的は、一般式（Ｉ）：

【化1】

［式中、ＡＲおよびＭＵは、ポリマーの繰り返し単位であり、
ＭＵは、ポリマー主鎖に沿って均一にまたはランダムに分布しているバンドギャップ変更単位であり、
Ｇ１およびＧ２は、Ｇ１またはＧ２のうちの少なくとも１つが抗原認識部位であることを条件として、水素、ハロゲン、または抗原認識部位を表し、
ａは１０～１００ｍｏｌ％であり、
ｂは０～９０ｍｏｌ％であるが、
ａ＋ｂ＝１００ｍｏｌ％であることを条件とし、
ｃは１～１００００である］
を有するコンジュゲートにおいて、
ＡＲが、一般式（ＩＩ）：

【化2】

［式中、残りの位置２，２’；３，３’；４，４’；５，５’；６，６’；７，７’および８，８’は、Ｈ、ＳＯ_２ＣＦ_３、ＳＯ_２Ｒ_ａ、ＣＦ_３、ＣＣｌ_３、ＣＮ、ＳＯ_３Ｈ、ＮＯ_２、ＮＲ_ａＲ_ｂＲ_ｃ ^＋、ＣＨＯ、ＣＯＲａ、ＣＯ_２Ｒａ、ＣＯＣｌ、ＣＯＮＲａＲｂ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｒ_ａ、ＯＲ_ａ、ＳＲ_ａ、ＯＣＯＲ_ａ、ＮＲ_ａＲ_ｂ、ＮＨＣＯＲ_ａ、ＣＣＲ_ａ、アリール－、ヘテロアリール－、Ｃ_６Ｈ_４ＯＲ_ａまたはＣ_６Ｈ_４ＮＲａＲｂからなる群から選択される同じまたは異なる残基で置換されており、Ｒａ～ｃは、独立して、水素、アルキル－、アルケニル－、アルキニル－、ヘテロアルキル－、アリール－、ヘテロアリール－、シクロアルキル－、アルキルシクロアルキル－、ヘテロアルキルシクロアルキル－、ヘテロシクロアルキル－、アラルキル－、もしくはヘテロアラルキル残基、または（ＣＨ_２）_ｘ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙＯ（ＣＨ_２）_ｚＣＨ_３であり、ｘは０～２０の整数であり、ｙは０～５０の整数であり、ｚは０～２０の整数である］
による２，２’または３，３’または５，５’または６，６’または７，７’または８，８’位を介してポリマー鎖に結合していることを特徴とする、コンジュゲートである。

【0011】

式ＩＩから分かるように、ＡＲをポリマー鎖に結合するためには、２，２’；３，３’；４，４’；５，５’；６，６’；７，７’および８，８’からの２つの位置が必要である。したがって、「残りの位置」という用語は、ポリマー鎖中のＡＲの結合に使用されない、開示された残基との置換に利用できるＡＲの１２個の位置を指す。図５に可能な置換パターンが示されている。置換に使用される残基は、各位置で同じであっても異なっていてもよい（例えば２位と２’位は、同じまたは異なる残基を有していてもよい）。

【0012】

任意選択的には、残りの位置にある２つの残基は、共通のシクロアルキル環系またはヘテロシクロアルキル環系を形成し得る。

【0013】

本発明の変形形態では、少なくとも２つの位置２，２’；３，３’；４，４’；５，５’；６，６’；７，７’および８，８’は、一般式（ＩＶ）

【化3】

［式中、ｎ＝５～１５である］
に従う残基で置換されている。

【0014】

本発明のコンジュゲートは、好ましくは水溶性である。

【0015】

「ＡＲは、２，２’または３，３’または５，５’または６，６’または７，７’または８，８’位を介してポリマー鎖に結合している」という用語は、ＡＲの位置のそれぞれのＣ原子と、他のＡＲ単位、Ｇ１単位、またはＬ単位のＣ原子との間のＣ－Ｃ結合を指す。

【0016】

本発明のさらなる目的は、本明細書に開示の少なくとも１つのコンジュゲートを用いて生体試料のサンプル中の標的部位を検出する方法であって、
ａ）生体試料のサンプルを少なくとも１つのコンジュゲートと接触させ、それによって、抗原認識部位によって認識される標的部位をコンジュゲートで標識するステップ、
ｂ）標識された標的部位を、コンジュゲートの吸光度スペクトル内の波長を有する光で励起するステップ、
ｃ）コンジュゲートによって放出される蛍光放射を検出することによって、標識された標的部位を検出するステップ、
を含むことを特徴とする、方法である。

【0017】

本発明のさらに別の目的は、蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、蛍光分光法、細胞分離、病理学、または組織学における方法の使用である。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】水溶性ポリ（ビナフチル）ホモポリマー１の吸収（実線）および発光（破線）スペクトルを示す図である。

【図2】水溶性のビナフチルに基づくフェニレンコポリマー２の吸収（実線）および発光（破線）スペクトルを示す図である。

【図3】水溶性のビナフチルに基づくビチオフェンコポリマー３の吸収（実線）および発光（破線）スペクトルを示す図である。

【図4】市販のフローサイトメーターでコポリマー２の抗ＣＤ４および抗ＣＤ１９抗体コンジュゲートで染色したときのヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のフローサイトメトリー分析を示す図である。

【図5】ＡＲの置換パターンを示す図である。

【図6】ポリマー部分と抗原認識部位とを含む本発明のコンジュゲートを示す図である。

【0019】

バンドギャップ変更単位としてのＭＵ
ＭＵは、コンジュゲートの吸収帯のシフトを引き起こすバンドギャップ変更単位である。この目的のために、ＭＵは、任意選択的に電子吸引性残基、電子供与性残基、立体障害基、および／または水溶性を高める残基で置換された、共役π系を提供する少なくとも１つのベンゼン環またはチオフェン環を有する芳香族系を含む。

【0020】

より好ましくは、ＭＵは、任意選択的に電子吸引性残基、電子供与性残基、立体障害基、および／または水溶性を高める残基で置換された、共役π系を提供する少なくとも２つの縮合した、環化した、または共役したベンゼン環またはチオフェン環を有する芳香族系を含む。

【0021】

電子吸引性残基、電子供与性残基、立体障害基、および／または水溶性を高める残基としては、アルキルもしくはエーテル（グリコール）残基のような１つ以上の残基またはハロゲン原子またはハロゲン化アルキル基を使用することができる。

【0022】

ＭＵ繰り返し単位は、本発明のコンジュゲートにおいて均一にまたはランダムに分布し得る。その限りにおいて、ＭＵはバンドギャップ変更単位としての機能だけでなく、ポリマー変性単位としても機能する。

【0023】

ＭＵの好ましい残基は以下の通り：

【化4-1】

【化4-2】

である。

【0024】

末端基Ｇ１およびＧ２
Ｇ１およびＧ２は、共に、水素、ハロゲン、または抗原認識部位の群から独立して選択される。抗原認識部位は、抗体、断片化抗体、断片化抗体誘導体、ペプチド／ＭＨＣ複合体、細胞接着もしくは共刺激分子の受容体、受容体リガンド、抗原、ハプテン結合剤、アビジン、ストレプトアビジン、アプタマー、プライマーおよびリガーゼ基質、ＴＣＲ分子を標的とするペプチド／ＭＨＣ複合体、細胞接着受容体分子、共刺激分子の受容体、または人工的に設計された結合分子から選択することができる。

【0025】

リンカー基Ｌ
本発明の第１の実施形態では、コンジュゲートの末端に位置するＭＵ単位は、以下の式（ＩＩＩ）

【化5】

［式中、Ｇ１、ＡＲ、ＭＵ、Ｇ２、ａ、ｂ、およびｃは、式（Ｉ）と同じ意味を有し、Ｌは、ポリマーをＧ２に連結するアルキル、アリール、またはヘテロアリール基を含む分子を表す］
に示されるように、リンカー基Ｌを介して結合している。

【0026】

Ｌは、ポリマー主鎖の末端に位置するアリールまたはヘテロアリール基であり、ｉ）アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラジン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、および分子もしくは生体分子へのコンジュゲートのためのそれらの保護された基から選択される官能基、またはｉｉ）エネルギー移動系のエネルギー受容体として結合した有機蛍光色素、またはｉｉｉ）生体分子、で終端している１つ以上のペンダント鎖で置換されていてよい。

【0027】

好ましくは、Ｌは、以下の残基：

【化6-1】

【化6-2】

のうちの１つ以上から選択される。

【0028】

抗原認識部位
「抗原認識部位」という用語は、細胞の細胞内または細胞外で発現される抗原のような、生体試料で発現される標的部位に対して向けられる、任意の種類の抗体、断片化抗体、または断片化抗体誘導体を指す。この用語は、完全インタクト抗体、断片化抗体、または断片化抗体誘導体、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ、ナノボディに関する。そのような断片化された抗体誘導体は、これらの種類の分子を含む共有結合および非共有結合コンジュゲートを含む組み換え手順によって合成することができる。抗原認識部位のさらなる例は、ＴＣＲ分子を標的とするペプチド／ＭＨＣ－複合体、細胞接着受容体分子、共刺激分子の受容体、人工的に操作された結合分子、例えば細胞表面分子を標的とする例えばペプチドまたはアプタマーである。

【0029】

本発明の方法で使用されるコンジュゲートは、最大１００個、好ましくは１～２０個の抗原認識部位Ｙを含み得る。抗原認識部位と標的抗原との相互作用は、高親和性であっても低親和性であってもよい。単一の低親和性抗原認識部位の結合相互作用は小さすぎて、抗原との安定した結合が得られない。低親和性抗原認識部位は、酵素分解性スペーサーへのコンジュゲートによって多量体化することで、高い結合活性を得ることができる。スペーサーが酵素分解されると、低親和性抗原認識部位が単量体化し、蛍光マーカーが完全に除去される。

【0030】

好ましくは、「抗原認識部位」という用語は、ＩＬ２、ＦｏｘＰ３、ＣＤ１５４のような細胞内、またはＣＤ１９、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ４、ＣＤ、ＣＤ２５、ＣＤ３４、ＣＤ５６、およびＣＤ１３３のような細胞外の生体試料（標的細胞）により発現する抗原に対する抗体を指す。抗原認識部位Ｇ１、Ｇ２、特に抗体は、側鎖アミノまたはスルフヒドリル基を介してＣＰに結合することができる。場合によっては、抗体のグリコシド側鎖が過ヨウ素酸によって酸化されて、アルデヒド官能基が生じることがある。

【0031】

抗原認識部位は、共有結合的にまたは非共有結合的に結合することができる。共有結合または非共有結合によるコンジュゲートの方法は当業者に知られており、蛍光マーカーのコンジュゲートについて述べた方法と同じである。

【0032】

本発明の方法は、複雑な混合物からの特定の細胞タイプの検出および／または単離に特に有用であり、ステップａ）～ｃ）の複数の連続した手順を含み得る。この方法は、コンジュゲートの様々な組み合わせを使用することができる。例えば、コンジュゲートは、２つの異なる抗ＣＤ３４抗体のように、２つの異なるエピトープに特異的な抗体を含み得る。例えば２つの異なるＴ細胞集団間の分化のための抗ＣＤ４と抗ＣＤ８、または制御性Ｔ細胞のような異なる細胞亜集団の決定のための抗ＣＤ４と抗ＣＤ２５など、異なる抗原は、異なる抗体を含む異なるコンジュゲートで対処され得る。

【0033】

細胞検出方法
コンジュゲートで標識された標的は、蛍光部位ＦＬまたは骨格ＣＰのいずれかを励起し、得られた蛍光シグナルを分析することによって検出される。励起波長は、通常、蛍光部位ＦＬまたはＣＰの吸収極大に従って選択され、当該技術分野で公知のＬＡＳＥＲまたはＬＥＤ源によって提供される。複数の異なる検出部位ＦＬが複数の色／パラメータ検出に使用される場合、吸収スペクトルが重ならない、少なくとも吸収極大が重ならない蛍光部位を選択するように注意すべきである。蛍光部位の場合、標的は、例えば蛍光顕微鏡、フローサイトメーター、スペクトロフルオロメーター、または蛍光スキャナーで検出することができる。化学発光によって放出される光は、励起を省略した同様の装置によって検出することができる。

【0034】

標的部位
本発明の方法で検出される標的部位は、組織切片、細胞凝集体、懸濁細胞、または接着細胞などの任意の生体試料上にあってよい。細胞は、生きていても死んでいてもよい。好ましくは、標的部位は、無脊椎動物（例えば線虫（Caenorhabditis elegans）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster））、脊椎動物（例えばゼブラフィッシュ（Danio rerio）、アフリカツメガエル（Xenopus laevis））、および哺乳類（例えばハツカネズミ（Mus musculus）、ヒト（Homo Sapiens））の動物全体、臓器、組織切片、細胞凝集体、または単一細胞などの生体試料の細胞内または細胞外で発現した抗原である。

【0035】

方法の使用
本発明の方法は、蛍光顕微鏡法、フローサイトメーター、蛍光分光法、細胞分離、病理学、または組織学におけるような、研究、診断、および細胞治療における様々な用途で使用することができる。

【0036】

本発明の第１の変形形態では、細胞のような生体試料は、計数の目的、すなわちコンジュゲートの抗原認識部位によって認識される抗原の特定のセットを有するサンプルからの細胞の量を確定するために検出される。別の変形形態では、ステップｃ）でコンジュゲートによって検出された生体試料は、光学的手段、静電力、圧電力、機械的分離、または音響的手段によってサンプルから分離される。

【0037】

本発明の別の変形形態では、コンジュゲートの抗原認識部位によって認識される生体試料上の抗原のような標的部位の位置が決定される。そのような技術は、「マルチエピトープリガンドカートグラフィー（Multi Epitope Ligand Cartography）」、「チップベースサイトメトリー（Chip-based Cytometry）」または「Multiomyx」として知られており、例えば欧州特許第０８１０４２８号明細書、欧州特許第１１８１５２５号明細書、欧州特許第１１３６８２２号明細書、または欧州特許第１２２４４７２号明細書に記載されている。この技術では、細胞は固定化され、蛍光部位に結合した抗体と接触する。抗体は、生体試料（例えば細胞表面）上のそれぞれの抗原によって認識され、結合していないマーカーが除去されて蛍光部位が励起された後、蛍光部位の蛍光発光によって抗原の位置が検出される。特定の変形形態では、蛍光部位に結合した抗体の代わりに、ＭＡＬＤＩ－ＩｍａｇｉｎｇまたはＣｙＴＯＦで検出可能な部位に結合した抗体を使用することができる。当業者は、蛍光部位に基づく技術を、これらの検出部位を扱うために修正する方法を認識している。

【0038】

標的部位の位置付けは、蛍光放射の波長に対して十分な解像度および感度を有するデジタル撮像装置によって達成され、デジタル撮像装置は、例えば蛍光顕微鏡を用いて、光学的拡大の有無にかかわらず使用され得る。得られる画像は、ＲＡＷ、ＴＩＦ、ＪＰＥＧ、またはＨＤＦ５形式などで、ハードドライブなどの適切な保存デバイスに保存される。

【0039】

異なる抗原を検出するために、同じまたは異なる蛍光部位または抗原認識部位を有する異なる抗体コンジュゲートを提供することができる。異なる波長の蛍光発光の並行検出は限られるため、抗体－蛍光色素コンジュゲートは、個別に、または小さいグループ（２～１０）で順々に利用される。

【0040】

本発明による方法のさらに別の変形形態では、生体試料、特にサンプルの懸濁細胞は、マイクロキャビティ内に捕捉することによって、または付着によって固定化される。

【0041】

通常、本発明の方法は、複数の変形形態で行うことができる。例えば、コンジュゲートで標識された標的部位が検出される前に、例えば緩衝液で洗浄することにより、標的部位によって認識されないコンジュゲートを除去することができる。

【0042】

本発明の変形形態では、少なくとも２つのコンジュゲートが同時にまたはその後の染色シーケンスで提供され、各抗原認識部位は異なる抗原を認識する。別の変形形態では、少なくとも２つのコンジュゲートがサンプルに同時に、または後続の染色シーケンスで提供され得る。いずれの場合も、標識された標的部位を同時にまたは逐次的に検出することができる。

【0043】

実施例
例として、以下の水溶性ビナフチルに基づくポリマー１～３

【化7】

【化8】

【化9】

を合成し、位置Ｇ１に抗原認識部位を持たせた。

【0044】

ビルディングブロックＭ１の合成

【化10】

【0045】

アセトン（４２ｍＬ）中の６，６’－ジブロモ－［１，１’－ビナフタレン］－２，２’－ジオール（３．００ｇ、６ｍｍｏｌ）の撹拌されている溶液に、３４－ヨード－２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２－ウンデカオキサテトラトリアコンタン（１２．６ｇ、２０ｍｍｏｌ）、続いてＫ_２ＣＯ_３（２．８２ｇ、２０ｍｏｌ）を入れ、得られた反応混合物を７０℃で１６時間撹拌した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して乾燥させた。得られた粗製物質を水（２０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３×３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相をブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮した。得られた粗製残留物を、メタノール／ジクロロメタン（５：９５）で溶出するシリカカラムクロマトグラフィーにより精製して、淡黄色の液体を得た。この化合物を、アセトニトリル／水（５０：５０）で溶出する逆相クロマトグラフィーによりさらに精製した。化合物を凍結乾燥することで、純粋な化合物Ｍ１（１．７ｇ、１７．６％）を淡黄色の液体として得た。

【0046】

ビルディングブロックＭ２の合成

【化11】

【0047】

ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の４－（４－ブロモフェニル）ブタン酸（２．００ｇ、８．２２ｍｍｏｌ）の撹拌されている溶液を０℃に冷却し、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（４．４０ｍＬ、２４．７ｍｍｏｌ）を添加し、続いて、３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（２．３６ｇ、１２．３ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１０分間撹拌し、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（１．４２ｇ、１２．３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１６時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（５０ｍＬ）を添加した。懸濁液を濾過し、残留物を減圧乾燥することで、２．４ｇの粗生成物をオフホワイトの固体として得た。固体をエタノールで洗浄し、減圧乾燥することで、ＮＨＳエステルを白色固体として得た（１．２４ｇ）。ＮＨＳ－エステル（２．００ｇ、５．８９ｍｍｏｌ）を、Ｎ－Ｂｏｃ－エチレンジアミン塩酸塩（２．０６ｇ、６．４８ｍｍｏｌ）と共にテトラヒドロフラン（４０ｍＬ）と水（２０ｍＬ）との混合物に０℃で溶解し、炭酸水素ナトリウム（２．４７ｇ、２９．５ｍｍｏｌ）を添加した。反応温度を室温までゆっくり上げ、混合物を７時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮してテトラヒドロフランを除去し、次いで水（１００ｍＬ）を添加し、懸濁液を１５分間撹拌した。得られた固体を濾別し、減圧乾燥することで、生成物（２．０ｇ）をオフホワイトの固体として得た。固体をイソプロピルアルコール（２４ｍＬ）から再結晶することで、化合物Ｍ２を白色固体として得た（１．１５ｇ、３８％）。

【0048】

ビナフチルホモポリマーの合成１

【化12】

【0049】

アルゴン雰囲気下、ビス（１，５－シクロオクタジエニル）ニッケル（０）（１０５ｍｇ、３８２μｍｏｌ）、２，２’－ビピリジル（６０．０ｍｇ、３８２μｍｏｌ）、および１，５－シクロオクタジエン（４１．０ｍｇ、３８２μｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（８ｍＬ）に溶解し、７０℃で３０分間撹拌した。化合物Ｍ１（２５０ｍｇ、１７３μｍｏｌ）およびＭ２（１．３ｍｇ、３．４μｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（４ｍｌ）に溶解し、反応混合物に添加した。溶液を７０℃で３時間撹拌した。溶媒を留去し、ポリマーをジクロロメタン（３２ｍＬ）とピペリジン（８ｍＬ）との混合物に溶解した。揮発性物質を減圧下で除去し、残留物をエタノールに懸濁させた。遠心分離を行った後、上清みを凍結乾燥することで生成物を得た（１０１ｍｇ、４５％）。ＧＰＣ（２７０ｎｍ）：Ｍｎ：７．９ｋＤａ、Ｍｗ：９．７ｋＤａ、Ｄ＝１．２。

【0050】

ビナフチルビナフチルフェニレンコポリマーの合成２

【化13】

【0051】

アルゴン雰囲気下、ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）中の化合物Ｍ１（２５０ｍｇ、１７３μｍｏｌ）と１，４－ベンゼンジボロン酸ビス（ピナコール）エステル（５７．０ｍｇ、１７３μｍｏｌ）との混合物に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１０ｍｇ、８．６μｍｏｌ）を添加した。炭酸カリウム水溶液（２Ｍ、７５０μＬ）を添加し、混合物を８０℃で３時間撹拌した。化合物Ｍ２（５２．０ｍｇ、１００μｍｏｌ）を添加し、溶媒を留去した。残留物を２０体積％のエタノール水溶液に懸濁させた。遠心分離を行った後、上清みを凍結乾燥することで黄褐色のポリマーを得た。ポリマーをサイズ排除精製により精製しその後凍結乾燥した。ポリマーをジクロロメタン（３２ｍＬ）とピペリジン（８ｍＬ）との混合物に溶解した。溶媒を留去した後、ポリマーを２０体積％のエタノール水溶液に溶解し、サイズ排除精製によって脱塩することで、純粋な生成物（２８２ｍｇ、９４．４％）を得た。ＧＰＣ（２７０ｎｍ）：Ｍｎ＝２０．６ｋＤａ、Ｍｗ＝３４．２ｋＤａ、Ｄ＝１．７。

【0052】

ビナフチルビチオフェンコポリマーの合成３

【化14】

【0053】

ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）中の化合物Ｍ１（２５０ｍｇ、１７３μｍｏｌ）と２，２’ビチオフェン－５，５’－ジボロン酸ビス（ピナコール）エステル（６７．０ｍｇ、１７４μｍｏｌ）との混合物に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１０ｍｇ、８．６μｍｏｌ、０．０５０当量）を添加した。炭酸カリウム水溶液（２Ｍ、７５０μＬ）を添加した後、溶液をアルゴン下で８０℃で３時間撹拌した。溶媒を留去し、ポリマーをジクロロメタン（３２ｍＬ）とピペリジン（８ｍＬ）との混合物に溶解した。揮発性物質を減圧下で除去し、残留物を２０体積％のエタノール水溶液に懸濁させた。遠心分離を行った後、上清みを凍結乾燥することで黄褐色のポリマーを得た（１１４ｍｇ、４６％）。ＧＰＣ（２７０ｎｍ）：Ｍｎ：１０．７ｋＤａ；Ｍｗ：１９．１ｋＤａ；Ｄ＝１．８。

【0054】

ポリマー系色素の抗体へのバイオコンジュゲーション
抗体は、５ｍｇ／ｍＬの抗体濃度で３０分間、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）中のジチオトレイトール（５０ｍＭ）を使用して還元した。還元された抗体を、ゲル濾過オーブンであるＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５カラム（Cytiva Europe GmbH, Germany）で精製した。抗体含有画分をクーマシー染色によって特定し、２８０ｎｍにおける吸光度を測定することによりプールした画分の抗体濃度を決定した。

【0055】

ヘテロ二官能性架橋剤としてスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）を使用して、アミノ官能化ポリマーを還元した抗体にカップリングさせた。クロスカップリングは、市販のＳＭＣＣクロスカップリングキット（Thermo Fisher Scientific Inc., USA）を使用して行った。カップリングは、キットの使用説明書に従って行った。抗体－ポリマーコンジュゲートは、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。

【0056】

細胞染色
ＰＥＢ緩衝液を使用して１ｍＬ当たり１×１０^７個の細胞の濃度でボルテックスを行い、続いて３００ｇで５分間遠心分離することにより、細胞を洗浄した。１×１０^７個の細胞を２０μＬのＰＥＢバッファーに再懸濁し、細胞染色のために１ｍＬ当たり１×１０^７個の細胞の濃度に到達するように抗体－色素コンジュゲートおよびＰＥＢバッファーを添加した。細胞は、４℃で１０分間インキュベートすることにより染色した。その後、細胞を再度洗浄し、フローサイトメトリー分析のために１ｍＬのＰＥＢバッファーに再懸濁した。染色した細胞は、分析まで４℃で保管した。死細胞の識別のために、ヨウ化プロピジウム溶液（力価１：１０００）を測定の直前に装置によって添加した。

【0057】

フローサイトメトリー分析
染色した細胞は、５つのレーザー励起源（３５５ｎｍ、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５６１ｎｍ、６４０ｎｍ）を３７９／２８ｎｍのバンドパスフィルターと組み合わせたＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（Becton, Dickinson & Company Inc, USA）を用いたフローサイトメトリーによって分析した。フローサイトメトリーデータ分析は、ＦｌｏｗＪｏ（Becton, Dickinson & Company Inc, USA）フローサイトメトリー分析ソフトウェアを使用して行った。

【0058】

考察
図１は、ポリビナフチルホモポリマー１の吸収および発光スペクトルを示す。吸収および発光の極大は、それぞれ３１５ｎｍおよび４０８ｎｍである（表１）。

【0059】

図２に示されているように、ビナフチルモノマーとフェニレンモノマーとの共重合（コポリマー２）により、ホモポリマー１と比較して吸収極大が１５ｎｍ深色シフトした。ホモポリマー１とフェニレンコポリマー２の発光極大は非常に近い（それぞれ４０８ｎｍおよび４０６ｎｍ、表１を参照）。

【0060】

図３に示されているように、ビナフチルモノマーとビチオフェンモノマーとの共重合（コポリマー３）により、ホモポリマー１と比較して吸収極大が８５ｎｍ深色シフトした。ビチオフェンコポリマー３の発光極大は、ホモポリマー１と比較して１０３ｎｍ長波長側にシフトしている（表１）。

【0061】

【表1】

【0062】

表中、Ｆｌ．ＱＹは、合成されたポリマーの蛍光量子収率を表し、これは、ポリマーによる蛍光変換効率の単位測定値であり、１．００の値は、吸収された光子から放出された蛍光光子への１００％の変換効率を表し、０．００は０％の変換を表す。Ｍｎ（ｋＤａ）は数平均分子量を意味し、Ｍｗ（ｋＤａ）は質量平均分子量を意味する。

【0063】

化合物１、２、および３は、水溶性ビナフチルに基づくポリマーの吸収波長が、異なるコモノマーとの共重合によって調整できることを示している。本発明は、一般的に使用される励起レーザーの波長に一致するように吸収帯をシフトさせるために使用することができる。例えば、ポリマー１（純粋なビナフチルポリマー）は、２８０ｎｍの深紫外レーザーに最適になるように調整され；ポリマー２（フェニレンコモノマー）は３５５ｎｍのＵＶレーザーに最適であり、ポリマー３（ビスチオフェンコモノマー）はバイオレットレーザー（４０５ｎｍ）に最適である。

【0064】

本発明の有用性を示すために、ビナフチルフェニレンコポリマー２をヒト抗ＣＤ４およびヒト抗ＣＤ１９モノクローナル抗体にコンジュゲートさせた。このコンジュゲートは図６に示す構造を有していた。

【0065】

コポリマー２の抗ＣＤ４および抗ＣＤ１９抗体コンジュゲートを、励起源としてＵＶレーザー（３５５ｎｍ）を使用するヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のフローサイトメトリー分析に使用した。図４は、ＵＶレーザーを使用したフローサイトメトリー分析におけるフェニレンコポリマー２抗体コンジュゲートの性能を示している。他の励起波長に合わせるために、コモノマーの選択に応じて吸収波長を調整することができる。例えば、ビチオフェンコポリマー３は、バイオレットレーザー（４０５ｎｍ）を用いる用途に使用することができる。

【0066】

これらの実施例は、スペクトル中の吸収帯の位置を制御して望まれる励起レーザーに正確に一致させることを可能にし、それによって生物学的用途向けの水溶性蛍光ポリマー系色素の収蔵庫の拡大が可能になる本発明の有用性を示している。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5】

【図6】

【外国語明細書】