特開 2023-104906 水溶性π共役蛍光１，１’－ビナフチル系タンデムポリマー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023104906

(43)【公開日】2023-07-28

(54)【発明の名称】水溶性π共役蛍光１，１’－ビナフチル系タンデムポリマー

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/533 20060101AFI20230721BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20230721BHJP

   C08G 61/02 20060101ALI20230721BHJP

   C09K 11/06 20060101ALI20230721BHJP

【ＦＩ】

G01N33/533

G01N21/64 F

G01N21/64 E

C08G61/02

C09K11/06

【審査請求】未請求

【請求項の数】11

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023004318

(22)【出願日】2023-01-16

(31)【優先権主張番号】22151897

(32)【優先日】2022-01-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(71)【出願人】

【識別番号】520094891

【氏名又は名称】ミルテニー バイオテック ベー．フェー． ウント コー． カー・ゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｂ．Ｖ． ＆ Ｃｏ． ＫＧ

【住所又は居所原語表記】Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ－Ｅｂｅｒｔ－Ｓｔｒａｓｓｅ ６８， ５１４２９ Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ

(74)【代理人】

【識別番号】100114890

【弁理士】

【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト

(74)【代理人】

【識別番号】100098501

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 拓

(74)【代理人】

【識別番号】100116403

【弁理士】

【氏名又は名称】前川 純一

(74)【代理人】

【識別番号】100134315

【弁理士】

【氏名又は名称】永島 秀郎

(74)【代理人】

【識別番号】100162880

【弁理士】

【氏名又は名称】上島 類

(72)【発明者】

【氏名】クリスティアン ドーゼ

(72)【発明者】

【氏名】ディアク マイネケ

(72)【発明者】

【氏名】トラヴィス ジェニングズ

(72)【発明者】

【氏名】ダニエル ベアント

【テーマコード（参考）】

2G043

4J032

【Ｆターム（参考）】

2G043AA01

2G043BA16

2G043BA17

2G043DA02

2G043EA01

2G043FA01

2G043FA02

2G043FA06

2G043LA01

2G043LA03

2G043LA07

4J032CA04

4J032CA12

4J032CA14

4J032CB05

4J032CC01

4J032CD02

4J032CE03

4J032CF03

4J032CG03

(57)【要約】      （修正有）

【課題】変性単位（ＭＵ）を選択することにより、所望の励起エネルギーに調整できる色素を提供する。
【解決手段】一般式（Ｉ）を有するコンジュゲート。

［式中、ＡＲ、ＭＵ、およびＭＵ^＊は、ポリマーの繰り返し単位であり、ＭＵおよびＭＵ^＊は、ポリマー主鎖に沿って均一にまたはランダムに分布しているポリマー変性単位またはバンドギャップ変更単位であり、Ｇ１およびＧ２は、Ｇ１またはＧ２のうちの少なくとも１つが抗原認識部位であることを条件として、水素、ハロゲン、または抗原認識部位を表す。］
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

一般式（Ｉ）

【化1】

［式中、ＡＲ、ＭＵ、およびＭＵ^＊は、ポリマーの繰り返し単位であり、
ＭＵおよびＭＵ^＊は、ポリマー主鎖に沿って均一にまたはランダムに分布しているポリマー変性単位またはバンドギャップ変更単位であり、
Ｇ１およびＧ２は、Ｇ１またはＧ２のうちの少なくとも１つが抗原認識部位であることを条件として、水素、ハロゲン、または抗原認識部位を表し、
ａは１０～１００ｍｏｌ％であり、
ｂは０～９０ｍｏｌ％であり、
ｃは０．１～９０ｍｏｌ％であるが、
ａ＋ｂ＋ｃ＝１００ｍｏｌ％であることを条件とし、
ｄは１～１００００である］
を有するコンジュゲートにおいて、
ＡＲが、一般式（ＩＩ）による２，２’または３，３’または４，４’または５，５’または６，６’または７，７’または８，８’位を介してポリマー鎖に結合していることを特徴とする、コンジュゲート。

【化2】

［式中、残りの位置２，２’；３，３’；４，４’；５，５’；６，６’；７，７’および８，８’は、Ｈ、ＳＯ_２ＣＦ_３、ＳＯ_２Ｒ_ａ、ＣＦ_３、ＣＣｌ_３、ＣＮ、ＳＯ_３Ｈ、ＮＯ_２、ＮＲ_ａＲ_ｂＲ_ｃ ^＋、ＣＨＯ、ＣＯＲ_ａ、ＣＯ_２Ｒ_ａ、ＣＯＣｌ、ＣＯＮＲ_ａＲ_ｂ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｒ_ａ、ＯＲ_ａ、ＳＲ_ａ、ＯＣＯＲ_ａ、ＮＲ_ａＲ_ｂ、ＮＨＣＯＲ_ａ、ＣＣＲ_ａ、アリール－、ヘテロアリール－、Ｃ_６Ｈ_４ＯＲ_ａまたはＣ_６Ｈ_４ＮＲ_ａＲ_ｂからなる群から選択される同じまたは異なる残基で置換されており、Ｒ_ａ～ｃは、独立して、水素、アルキル－、アルケニル－、アルキニル－、ヘテロアルキル－、アリール－、ヘテロアリール－、シクロアルキル－、アルキルシクロアルキル－、ヘテロアルキルシクロアルキル－、ヘテロシクロアルキル－、アラルキル－、もしくはヘテロアラルキル残基、または（ＣＨ_２）_ｘ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙＯ（ＣＨ_２）_ｚＣＨ_３であり、ｘは０～２０の整数であり、ｙは０～５０の整数であり、ｚは０～２０の整数である］

【請求項2】

主にＲ－またはＳ－立体異性体として提供されるＡＲで主たるキラリティーを有することを特徴とする、請求項１記載のコンジュゲート。

【請求項3】

前記抗原認識部位が、抗体、断片化抗体、断片化抗体誘導体、ペプチド／ＭＨＣ複合体、細胞接着もしくは共刺激分子の受容体、受容体リガンド、抗原、ハプテン結合剤、アビジン、ストレプトアビジン、アプタマー、プライマーおよびリガーゼ基質、ＴＣＲ分子を標的とするペプチド／ＭＨＣ複合体、細胞接着受容体分子、共刺激分子の受容体、または人工的に設計された結合分子からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１または２記載のコンジュゲート。

【請求項4】

ＭＵおよび／またはＭＵ^＊が、共役π系を提供する少なくとも１つのベンゼン環またはチオフェン環を有する同じまたは異なる芳香族系を含むことを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項記載のコンジュゲート。

【請求項5】

ＭＵおよび／またはＭＵ^＊が、独立して、以下の残基

【化3-1】

【化3-2】

のうちの１つ以上から選択されることを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項記載のコンジュゲート。

【請求項6】

Ｌが、前記ポリマー主鎖の末端に位置するアリールまたはヘテロアリール基であり、ｉ）アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラジン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、および分子もしくは生体分子へのコンジュゲートのためのそれらの保護された基から選択される官能基、またはｉｉ）エネルギー移動系のエネルギー受容体として結合した有機蛍光色素、またはｉｉｉ）生体分子、で終端している１つ以上のペンダント鎖で置換されていてよいことを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項記載のコンジュゲート。

【請求項7】

Ｌが、以下の残基

【化4-1】

【化4-2】

のうちの１つ以上から選択されることを特徴とする、請求項６記載のコンジュゲート。

【請求項8】

少なくとも２つの位置２，２’；３，３’；４，４’；５，５’；６，６’；７，７’および８，８’が、一般式（ＩＩＩ）

【化5】

［式中、ｎ＝５～１５である］
に従う残基で置換されていることを特徴とする、請求項１から７までのいずれか１項記載のコンジュゲート。

【請求項9】

ＦＬが、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、ローダミン、テトラメチルローダミン、ケイ素－ローダミン（ＳｉＲ）、クマリン、レゾルフィン、ピレン、アントラセン、フェニレン、フタロシアニン、シアニン、キサンテン、アミドピリリウムフルオロフォア、オキサジン、クアドレイン（Quadrain）色素、カルボピロニン、７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール（ＮＢＤ）フルオロフォア、ＢＯＤＩＰＹ（商標）フルオロフォア（Molecular Probes, Inc.）、ＡＬＥＸＡ（商標）フルオロフォア（Molecular Probes, Inc.）、ＤＹ（商標）フルオロフォア（Dyomics GmbH）、ベンゾピリリウムフルオロフォア、ベンゾピリリウム－ポリメチンフルオロフォア、ランタニドキレート、メタロポルフィリン、ロドール色素、カルボロドール色素、ナフタルイミド、およびポルフィリンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１から８までのいずれか１項記載のコンジュゲート。

【請求項10】

請求項１から９までのいずれか１項記載の少なくとも１つのコンジュゲートを用いて生体試料のサンプル中の標的部位を検出する方法であって、
ｄ）前記生体試料のサンプルを少なくとも１つのコンジュゲートと接触させ、それによって、抗原認識部位によって認識される前記標的部位を前記コンジュゲートで標識するステップ、
ｅ）標識された前記標的部位を、前記コンジュゲートの吸光度スペクトル内の波長を有する光で励起するステップ、
ｆ）前記コンジュゲートによって放出される蛍光放射を検出することによって、標識された前記標的部位を検出するステップ、
を含むことを特徴とする、方法。

【請求項11】

蛍光顕微鏡法、フローサイトメーター、蛍光分光法、細胞分離、病理学、または組織学における、請求項１から９までのいずれか１項記載のコンジュゲートの使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、水溶性蛍光ポリマー系色素、ならびに細胞の検出および分析のための抗体とのコンジュゲートにおけるそれらの使用に関する。

【0002】

発明の背景
免疫蛍光標識は、研究と臨床応用の両方において、生体試料からの標的細胞を詳しく分析し、特異的に分離するために重要である。これらの方法のワークフローでは、一般に、標的分子に結合した蛍光タグが使用され、これはその後生体サンプル中の目的の分析対象を同定するために使用される。分析対象の検出に対する感度と、多くの分析対象を同時にマルチプレックス化する能力の両方が、細胞分析ワークフローで非常に求められている特徴である。分析の感度は、蛍光タグの輝度に大きく依存する一方で、多くの分析対象の検出を同時にマルチプレックス化する能力は、異なる蛍光タグ間を光学的に識別することに依存する。水溶性π共役ポリマーは、感度とマルチプレックス化分析の両方への解決手段を提供する可能性を有している。

【0003】

蛍光プローブとしてのπ共役ポリマーは、生物学的に関連する分析対象の蛍光検出のツールボックスの主力となっている。その強い相互作用と光を吸収する能力のため、蛍光ポリマーは、その明るい蛍光強度と相まって、以前の技術よりも分析対象の検出感度を高める能力が強化されている。生体分析対象の検出における現在の傾向では、個々の蛍光色を使用してマルチプレックス化された分析対象の検出を可能にできるように、色調整可能な特性を持つ蛍光系に対する需要が高まっている。したがって、生体分析対象を検出する用途に有用であるためには、蛍光系は、吸収と発光の両方が望まれる励起と発光の両方に別々に調整できるように、制御可能な設計を有していなくてはならない。同じ系内で、高度に調整可能な励起エネルギーおよび別個に高度に調整可能な発光エネルギーを組み合わせて、生体分子の分析対象の高感度マルチプレックス検出を可能にすることができる蛍光系は、存在しない。

【0004】

この課題に適した理想的なπ共役ポリマーは、本来、紫外線（ＵＶ）光による励起を可能にする高エネルギーバンドギャップを有する。それと同時に、バンドギャップ変更単位を使用することにより、可視スペクトル全体で励起エネルギーを赤色シフトさせることが容易に可能になるはずである。さらに、このようなポリマーの蛍光発光エネルギーは、蛍光エネルギー受容体色素を組み込むことにより別々に調整可能になるはずである。これらの受容体色素は、ポリマー骨格からエネルギーを流し、色調整可能な形式で検出するための固有の波長で蛍光を生成するために使用することができる。この形式では、π共役ポリマーは、一般的なレーザーの励起（例えば３５５ｎｍ、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５６１ｎｍ、または６４０ｎｍのラインのレーザー）と重なるように励起波長を個別に制御する一方で、それと同時に蛍光発光の波長を別々に調整する能力を有するであろう。この色調整可能なπ共役ポリマー系は、生体分子のマルチプレックス化された分析対象の検出の課題に対して非常に有用であろう。

【0005】

そのような水溶性π共役系ポリマーは、例えば、“Synthesis of Binaphthyl-Oligothiophene Copolymers with Emissions of Different Colors: Systematically Tuning the Photoluminescence of Conjugated Polymers” by K. Y. Musick, Q.-S. Hu, L. Pu, Macromolecules 1998, 31, 2933-2942に記載されている。

【0006】

さらに、米国特許出願公開第２０１８０００９９９０号明細書および米国特許第１０６０４６５７号明細書には、２，２’位においてＰＥＧで置換された４，４’－重合ビナフチルが記載されている。これは、ｓｐ^３混成軌道を利用するポリパラエチニリン（ＰＰＥ）結合を介して隣接するモノマーに４，４’結合が結合しているビナフチルに基づくポリマーについて言及している。本発明で開示されるビナフチルに基づくポリマーは、エチニリン結合なしで隣接するコモノマーに直接結合しており、その結果ｓｐ^２混成結合および完全芳香族共役系が得られる。水溶媒和ポリマー系色素およびポリマー系タンデム色素が提供される。ポリマー系色素には、共有結合、ビニレン基、またはエチニレン基を介して連結されたアリールまたはヘテロアリールコモノマーの共役セグメントを有する水溶媒和集光性多重発色団が含まれる。ポリマータンデム色素は、そのエネルギーを受容する近接位にある多重発色団に共有結合したシグナル伝達発色団をさらに含む。

【0007】

米国特許第１０４８１１６１号明細書には、２，２’位の置換基で置換された４，４’－重合ビナフチルが開示されている。水溶媒和ポリマー系色素およびポリマー系タンデム色素が提供される。ポリマー系色素には、共有結合、ビニレン基、またはエチニレン基を介して連結されたアリールまたはヘテロアリールコモノマーの共役セグメントを有する水溶媒和集光性多重発色団が含まれる。ポリマータンデム色素は、そのエネルギーを受容する近接位にある多重発色団に共有結合したシグナル伝達発色団をさらに含む。

【0008】

本発明の目的は、変性単位（ＭＵ）を選択することにより、所望の励起エネルギーに調整することができる色素を提供することであった。

【0009】

発明の概要
図１は、ポリビナフチルコモノマータンデム系を使用して、変性単位（ＭＵ）の選択によって励起エネルギーを、受容体色素の選択によって発光エネルギーを別々に調整する方法を示すスキームを示す。この方法では、本発明は、励起および発光が別々に制御され得る、物質の色の調整可能な状態を形成するために使用することができる。黒いボックスは、不可能な組み合わせを表す。ｂ）生体部位（Ｇ２）に結合したコポリマービナフチルタンデム系の図式的な表示であり、コモノマー（ｘ）の選択によりポリマーの励起エネルギーを調整することができ、タンデム色素（ｙ）の選択により系の発光エネルギーを調整することができ、モノマー間の結合が異なるビナフチルモノマー（ｚ）の選択によりポリマー骨格から受容体色素へのエネルギー移動の効率を調整することができる。

【0010】

したがって、本発明の目的は、一般式（Ｉ）

【化1】

［式中、ＡＲ（Ａｒ）、ＭＵ、およびＭＵ^＊は、ポリマーの繰り返し単位であり、
ＭＵおよびＭＵ^＊は、ポリマー主鎖に沿って均一にまたはランダムに分布しているポリマー変性単位またはバンドギャップ変更単位であり、
Ｇ１およびＧ２は、Ｇ１またはＧ２のうちの少なくとも１つが抗原認識部位であることを条件として、水素、ハロゲン、または抗原認識部位を表し、
ａは１０～１００ｍｏｌ％であり、
ｂは０～９０ｍｏｌ％であり、
ｃは０．１～９０ｍｏｌ％、好ましくは１～８０ｍｏｌ％、より好ましくは５～７０ｍｏｌ％、最も好ましくは１０～６０ｍｏｌ％であるが、
ａ＋ｂ＋ｃ＝１００ｍｏｌ％であることを条件とし、
ｄは１～１００００である。］
を有するコンジュゲートにおいて、
ＡＲが、一般式（ＩＩ）による２，２’または３，３’または５，５’または６，６’または７，７’または８，８’位を介してポリマー鎖に結合していることを特徴とする、コンジュゲートである。

【化2】

［式中、残りの位置２，２’；３，３’；４，４’；５，５’；６，６’；７，７’および８，８’は、Ｈ、ＳＯ_２ＣＦ_３、ＳＯ_２Ｒ_ａ、ＣＦ_３、ＣＣｌ_３、ＣＮ、ＳＯ_３Ｈ、ＮＯ_２、ＮＲ_ａＲ_ｂＲ_ｃ ^＋、ＣＨＯ、ＣＯＲ_ａ、ＣＯ_２Ｒ_ａ、ＣＯＣｌ、ＣＯＮＲ_ａＲ_ｂ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｒ_ａ、ＯＲ_ａ、ＳＲ_ａ、ＯＣＯＲ_ａ、ＮＲ_ａＲ_ｂ、ＮＨＣＯＲ_ａ、ＣＣＲ_ａ、アリール－、ヘテロアリール－、Ｃ_６Ｈ_４ＯＲ_ａまたはＣ_６Ｈ_４ＮＲ_ａＲ_ｂからなる群から選択される同じまたは異なる残基で置換されており、Ｒ_ａ～ｃは、独立して、水素、アルキル－、アルケニル－、アルキニル－、ヘテロアルキル－、アリール－、ヘテロアリール－、シクロアルキル－、アルキルシクロアルキル－、ヘテロアルキルシクロアルキル－、ヘテロシクロアルキル－、アラルキル－、もしくはヘテロアラルキル残基、または（ＣＨ_２）_ｘ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙＯ（ＣＨ_２）_ｚＣＨ_３であり、ｘは０～２０の整数であり、ｙは０～５０の整数であり、ｚは０～２０の整数である。］

【0011】

式ＩＩから分かるように、ＡＲをポリマー鎖に結合するためには、２，２’；３，３’；４，４’；５，５’；６，６’；７，７’および８，８’からの２つの位置が必要である。したがって、「残りの位置」という用語は、ポリマー鎖中のＡＲの結合に使用されない、開示された残基との置換に利用できるＡＲの１２個の位置を指す。図５に可能な置換パターンが示されている。置換に使用される残基は、各位置で同じであっても異なっていてもよい（例えば２位と２’位は、同じまたは異なる残基を有していてもよい）。

【0012】

任意選択的には、残りの位置にある２つの残基は、共通のシクロアルキル環系またはヘテロシクロアルキル環系を形成し得る。

【0013】

「ＡＲは、２，２’または３，３’または５，５’または６，６’または７，７’または８，８’位を介してポリマー鎖に結合している」という用語は、ＡＲの位置のそれぞれのＣ原子と、他のＡＲ単位、Ｇ１単位、またはＬ単位のＣ原子との間のＣ－Ｃ結合を指す。

【0014】

本発明のさらなる目的は、本明細書に開示の少なくとも１つのコンジュゲートを用いて生体試料のサンプル中の標的部位を検出する方法であって、
ａ）生体試料のサンプルを少なくとも１つのコンジュゲートと接触させ、それによって、抗原認識部位によって認識される標的部位をコンジュゲートで標識するステップ、
ｂ）標識された標的部位を、コンジュゲートの吸光度スペクトル内の波長を有する光で励起するステップ、
ｃ）コンジュゲートによって放出される蛍光放射を検出することによって、標識された標的部位を検出するステップ、
を含むことを特徴とする、方法である。

【0015】

本発明のさらに別の目的は、蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、蛍光分光法、細胞分離、病理学、または組織学における方法の使用である。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】ポリビナフチルコモノマータンデム系を使用して、変性単位（ＭＵ）の選択によって励起エネルギーを別々に調整することができる方法を示すスキームを示す図である。

【図2】標的部位に結合したタンデムビナフチルコモノマーポリマー系の例を示す図である。ビナフチルモノマー間の選択された結合に応じて、ポリマーは、主に直鎖構造から主にらせん構造に移行することができ、これによりポリマー系供与体から受容体色素へのエネルギー移動効率が調整可能にされる。

【図3】マルチプレックス化された分析対象検出のために生体試料と組み合わされた、異なる標的部位にコンジュゲートした複数の異なる色のビナフチルタンデム色素系の使用例を示す図である。

【図4a】本発明の実施例によるこれらの化合物からの蛍光共鳴エネルギー移動を示す図である。

【図4b】本発明の実施例によるこれらの化合物からの蛍光共鳴エネルギー移動を示す図である。

【図4c】本発明の実施例によるこれらの化合物からの蛍光共鳴エネルギー移動を示す図である。

【図4d】本発明の実施例によるこれらの化合物からの蛍光共鳴エネルギー移動を示す図である。

【図4e】本発明の実施例によるこれらの化合物からの蛍光共鳴エネルギー移動を示す図である。

【図4f】本発明の実施例によるこれらの化合物からの蛍光共鳴エネルギー移動を示す図である。

【図5】３５５ｎｍで励起した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のフローサイトメトリー分析における、本発明によるポリマー系色素モノクローナル抗体（抗ＣＤ１９）コンジュゲートの性能を示す図である。

【0017】

詳細な説明
調整可能な吸収帯と調整可能な発光波長の両方を有する式（Ｉ）に示されるビナフチル（ＢＮＰ）系水溶性蛍光π共役ポリマー色素の一般構造。ＭＵは、吸収帯を調整するための変更単位である。Ａｒは１，１’ビナフチルに基づくアリール単位である。Ｌは任意選択的なリンカーであり、Ｇ１とＧ２は共に末端部位である。ＦＬは、色調整可能な発光のための蛍光色素である。ＭＵ^＊は、色調整可能な発光のための蛍光色素を選択的に付加するために使用することができる化学選択的官能基を持つ変性単位である。

【0018】

本発明の変形形態では、少なくとも２つの位置２，２’；３，３’；４，４’；５，５’；６，６’；７，７’および８，８’は、一般式（ＩＶ）

【化3】

［式中、ｎ＝５～１５である］
に従う残基で置換されている。

【0019】

本発明のコンジュゲートは、好ましくは水溶性である。

【0020】

バンドギャップ変更単位としてのＭＵおよびＭＵ^＊
ＭＵおよびＭＵ^＊は、コンジュゲートの吸収帯をシフトさせるバンドギャップ変更単位である。

【0021】

ＭＵ^＊は、ＭＵと類似または同一のバンドギャップ変更単位であるが、重合に使用されない任意の修飾可能な原子を介して化学選択的部位に結合することができる。化学選択的部位としては、限定するものではないが、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラジン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、チオシアネート、ならびに蛍光色素へのコンジュゲートのためおよび蛍光発光の可変性のためのそれらの保護された基が挙げられる。

【0022】

コンジュゲートの吸収帯をシフトさせるために、ＭＵおよびＭＵ^＊は、任意選択的に電子吸引性残基、電子供与性残基、立体障害基、および／または水溶性を高める残基で置換された、共役π系を提供する少なくとも１つのベンゼン環またはチオフェン環を有する同じまたは異なる芳香族系をそれぞれ含む。

【0023】

より好ましくは、ＭＵおよびＭＵ^＊は、任意選択的に電子吸引性残基、電子供与性残基、立体障害基、および／または水溶性を高める残基で置換された、共役π系を提供する少なくとも２つの縮合した、環化した、または共役したベンゼン環またはチオフェン環を有する同じまたは異なる芳香族系をそれぞれ含む。

【0024】

電子吸引性残基、電子供与性残基、立体障害基、および／または水溶性を高める残基としては、アルキルもしくはエーテル（グリコール）残基のような１つ以上の残基またはハロゲン原子またはハロゲン化アルキル基を使用することができる。

【0025】

ＭＵおよびＭＵ^＊繰り返し単位は、本発明のコンジュゲートにおいて均一にまたはランダムに分布し得る。その限りにおいて、ＭＵおよびＭＵ^＊は、バンドギャップ変更単位としての機能だけでなく、ポリマー変性単位としての機能も有する。

【0026】

ＭＵおよびＭＵ^＊の好ましい残基（任意選択的には開示の通りに置換）は以下の通りである：

【化4-1】

【化4-2】

【化4-3】

【0027】

末端基Ｇ１およびＧ２
Ｇ１およびＧ２は、共に、水素、ハロゲン、または抗原認識部位の群から独立して選択される。抗原認識部位は、抗体、断片化抗体、断片化抗体誘導体、ペプチド／ＭＨＣ複合体、細胞接着もしくは共刺激分子の受容体、受容体リガンド、抗原、ハプテン結合剤、アビジン、ストレプトアビジン、アプタマー、プライマーおよびリガーゼ基質、ＴＣＲ分子を標的とするペプチド／ＭＨＣ複合体、細胞接着受容体分子、共刺激分子の受容体、または人工的に設計された結合分子から選択することができる。

【0028】

蛍光部位ＦＬ
適切な蛍光部位ＦＬは、例えばフローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡法などの免疫蛍光技術の分野で知られているものである。本発明の方法では、コンジュゲートで標識された標的部位は、ポリマー骨格または蛍光部位ＦＬまたはその両方を励起し、ＦＬまたはポリマーから得られる発光（フォトルミネッセンス）を検出することによって検出される。

【0029】

有用な蛍光部位ＦＬは、タンパク質系、例えばフィコビリタンパク質、低分子有機分子色素、例えばフルオレセインのようなキサンテン、またはローダミン、シアニン、オキサジン、クマリン、アクリジン、オキサジアゾール、ピレン、ピロメテン、ピリジロキサゾール、または有機金属錯体、例えばＲｕ、Ｅｕ、Ｐｔ錯体であってよい。単一の分子体に加えて、蛍光タンパク質または小有機分子色素のクラスター、ならびに量子ドット、アップコンバーティングナノ粒子、金ナノ粒子、色素ポリマーナノ粒子などのナノ粒子も蛍光部位として使用することができる。

【0030】

本発明の変形形態では、フルオロフォアＦＬは、スルホネート、ホスホネート、ホスフェート、ポリエーテル、スルホンアミド、およびカーボネートからなる群から選択される１つ以上の水溶性付与置換基で置換されている。スルホネート置換基を有する蛍光部位、例えばThermo Fisher Scientific Inc.から供給されているＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒファミリーの色素を使用することが特に有利である。フルオロフォア当たりのスルホネート置換度は、２以上であってよい。すなわちローダミン系色素またはシアニン系色素の場合である。

【0031】

適切な市販の蛍光部位は、Miltenyi Biotec BV & Co. KGの製品ライン「Ｖｉｏ」、またはThermofisherのＦＩＴＣもしくはＰｒｏｍｏｆｌｕｏｒもしくはＡｌｅｘａ色素および／もしくはＢｏｄｉｐｙ色素、またはLumiprobeのシアニン、またはDyomics GmbHのＤＹ（商標）フルオロフォア、またはAberior GmbHのＳｔａｒ色素から購入することができる。

【0032】

リンカー基Ｌ
Ｌは、ポリマー主鎖の末端に位置するアリールまたはヘテロアリール基から構成されるリンカーであり、ｉ）アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラジン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、および分子もしくは生体分子へのコンジュゲートのためのそれらの保護された基から選択される官能基、またはｉｉ）受容体色素としてコンジュゲートした有機色素、またはｉｉｉ）生体分子、で終端している１つ以上のペンダント鎖で置換されている。

【0033】

好ましくは、Ｌは、以下の残基：

【化5-1】

【化5-2】

のうちの１つ以上から選択される。

【0034】

抗原認識部位
「抗原認識部位」という用語は、細胞の細胞内または細胞外で発現される抗原のような、生体試料で発現される標的部位に対して向けられる、任意の種類の抗体、断片化抗体、または断片化抗体誘導体を指す。この用語は、完全インタクト抗体、断片化抗体、または断片化抗体誘導体、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ、ナノボディに関する。そのような断片化された抗体誘導体は、これらの種類の分子を含む共有結合および非共有結合コンジュゲートを含む組み換え手順によって合成することができる。抗原認識部位のさらなる例は、ＴＣＲ分子を標的とするペプチド／ＭＨＣ－複合体、細胞接着受容体分子、共刺激分子の受容体、人工的に操作された結合分子、例えば細胞表面分子を標的とする例えばペプチドまたはアプタマーである。

【0035】

本発明の方法で使用されるコンジュゲートは、最大１００個、好ましくは１～２０個の抗原認識部位Ｙを含み得る。抗原認識部位と標的抗原との相互作用は、高親和性であっても低親和性であってもよい。単一の低親和性抗原認識部位の結合相互作用は小さすぎて、抗原との安定した結合が得られない。低親和性抗原認識部位は、酵素分解性スペーサーへのコンジュゲートによって多量体化することで、高い結合活性を得ることができる。スペーサーが酵素分解されると、低親和性抗原認識部位が単量体化し、蛍光マーカーが完全に除去される。

【0036】

好ましくは、「抗原認識部位」という用語は、ＩＬ２、ＦｏｘＰ３、ＣＤ１５４のような細胞内、またはＣＤ１９、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ４、ＣＤ、ＣＤ２５、ＣＤ３４、ＣＤ５６、およびＣＤ１３３のような細胞外の生体試料（標的細胞）により発現する抗原に対する抗体を指す。抗原認識部位Ｇ１、Ｇ２、特に抗体は、側鎖アミノまたはスルフヒドリル基を介してＣＰに結合することができる。場合によっては、抗体のグリコシド側鎖が過ヨウ素酸によって酸化されて、アルデヒド官能基が生じることがある。

【0037】

抗原認識部位は、共有結合的にまたは非共有結合的に結合することができる。共有結合または非共有結合によるコンジュゲートの方法は当業者に知られており、蛍光マーカーのコンジュゲートについて述べた方法と同じである。

【0038】

本発明の方法は、複雑な混合物からの特定の細胞タイプの検出および／または単離に特に有用であり、ステップａ）～ｃ）の複数の連続した手順を含み得る。この方法は、コンジュゲートの様々な組み合わせを使用することができる。例えば、コンジュゲートは、２つの異なる抗ＣＤ３４抗体のように、２つの異なるエピトープに特異的な抗体を含み得る。例えば２つの異なるＴ細胞集団間の分化のための抗ＣＤ４と抗ＣＤ８、または制御性Ｔ細胞のような異なる細胞亜集団の決定のための抗ＣＤ４と抗ＣＤ２５など、異なる抗原は、異なる抗体を含む異なるコンジュゲートで対処され得る。

【0039】

細胞検出方法
コンジュゲートで標識された標的は、蛍光部位ＦＬまたは骨格ＣＰのいずれかを励起し、得られた蛍光シグナルを分析することによって検出される。励起波長は、通常、蛍光部位ＦＬまたはＣＰの吸収極大に従って選択され、当該技術分野で公知のＬＡＳＥＲまたはＬＥＤ源によって提供される。複数の異なる検出部位ＦＬが複数の色／パラメータ検出に使用される場合、吸収スペクトルが重ならない、少なくとも吸収極大が重ならない蛍光部位を選択するように注意すべきである。蛍光部位の場合、標的は、例えば蛍光顕微鏡、フローサイトメーター、スペクトロフルオロメーター、または蛍光スキャナーで検出することができる。化学発光によって放出される光は、励起を省略した同様の装置によって検出することができる。

【0040】

標的部位
本発明の方法で検出される標的部位は、組織切片、細胞凝集体、懸濁細胞、または接着細胞などの任意の生体試料上にあってよい。細胞は、生きていても死んでいてもよい。好まくは、標的部位は、無脊椎動物（例えば線虫（Caenorhabditis elegans）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster））、脊椎動物（例えばゼブラフィッシュ（Danio rerio）、アフリカツメガエル（Xenopus laevis））、および哺乳類（例えばハツカネズミ（Mus musculus）、ヒト（Homo Sapiens））の動物全体、臓器、組織切片、細胞凝集体、または単一細胞などの生体試料の細胞内または細胞外で発現した抗原である。

【0041】

方法の使用
本発明の方法は、蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、蛍光分光法、細胞分離、病理学、または組織学におけるような、研究、診断、および細胞治療における様々な用途で使用することができる。

【0042】

本発明の第１の変形形態では、細胞のような生体試料は、計数の目的、すなわちコンジュゲートの抗原認識部位によって認識される抗原の特定のセットを有するサンプルからの細胞の量を確定するために検出される。別の変形形態では、ステップｃ）でコンジュゲートによって検出された生体試料は、光学的手段、静電力、圧電力、機械的分離、または音響的手段によってサンプルから分離される。

【0043】

本発明の別の変形形態では、コンジュゲートの抗原認識部位によって認識される生体試料上の抗原のような標的部位の位置が決定される。そのような技術は、「マルチエピトープリガンドカートグラフィー（Multi Epitope Ligand Cartography）」、「チップベースサイトメトリー（Chip-based Cytometry）」または「Multiomyx」として知られており、例えば欧州特許第０８１０４２８号明細書、欧州特許第１１８１５２５号明細書、欧州特許第１１３６８２２号明細書、または欧州特許第１２２４４７２号明細書に記載されている。この技術では、細胞は固定化され、蛍光部位に結合した抗体と接触する。抗体は、生体試料（例えば細胞表面）上のそれぞれの抗原によって認識され、結合していないマーカーが除去されて蛍光部位が励起された後、蛍光部位の蛍光発光によって抗原の位置が検出される。特定の変形形態では、蛍光部位に結合した抗体の代わりに、ＭＡＬＤＩ－ＩｍａｇｉｎｇまたはＣｙＴＯＦで検出可能な部位に結合した抗体を使用することができる。当業者は、蛍光部位に基づく技術を、これらの検出部位を扱うために修正する方法を認識している。

【0044】

標的部位の位置付けは、蛍光放射の波長に対して十分な解像度および感度を有するデジタル撮像装置によって達成され、デジタル撮像装置は、例えば蛍光顕微鏡を用いて、光学的拡大の有無にかかわらず使用され得る。得られる画像は、ＲＡＷ、ＴＩＦ、ＪＰＥＧ、またはＨＤＦ５形式などで、ハードドライブなどの適切な保存デバイスに保存される。

【0045】

異なる抗原を検出するために、同じまたは異なる蛍光部位または抗原認識部位を有する異なる抗体コンジュゲートを提供することができる。異なる波長の蛍光発光の並行検出は限られるため、抗体－蛍光色素コンジュゲートは、別々に、または小さいグループ（２～１０）で順々に利用される。

【0046】

本発明による方法のさらに別の変形形態では、生体試料、特にサンプルの懸濁細胞は、マイクロキャビティ内に捕捉することによって、または付着によって固定化される。

【0047】

通常、本発明の方法は、複数の変形形態で行うことができる。例えば、コンジュゲートで標識された標的部位が検出される前に、例えば緩衝液で洗浄することにより、標的部位によって認識されないコンジュゲートを除去することができる。

【0048】

本発明の変形形態では、少なくとも２つのコンジュゲートが同時にまたはその後の染色シーケンスで提供され、各抗原認識部位は異なる抗原を認識する。別の変形形態では、少なくとも２つのコンジュゲートがサンプルに同時に、または後続の染色シーケンスで提供され得る。いずれの場合も、標識された標的部位を同時にまたは逐次的に検出することができる。

【実施例0049】

例として、以下の化合物を、異なる受容体色素ＦＬを用いて以下の一般的な方法で合成し、抗原認識部分にコンジュゲートさせた。

【化6】

【表1】

【0050】

表は、様々なポリマー－受容体色素タンデム系の物理データを示している。上に示したポリ（ビナフチル－ｃｏ－フェニレン－ＮＨ２）ポリマーを、様々な受容体色素ＦＬに結合させ、蛍光発光特性を測定して、発光波長（ｌｅｍ）、蛍光量子収率（ＱＹ）、およびエネルギー移動効率（Ｉ_{ｄｏｎｏｒ}／Ｉ_{ａｃｃｅｐｔｏｒ}）を決定した。全ての測定は、３２５ｎｍでビナフチルポリマーを励起することによって行った。

【0051】

使用した受容体色素は、公知のスルホシアニンおよびＳｔａｒ Ｒｅｄ色素である。図４ａ～ｆは、これらの化合物からの蛍光共鳴エネルギー移動を示している。ビナフチル残基供与体の発光は、各プロットにおいて約４００ｎｍを中心としている。受容体色素を介したエネルギー移動による蛍光発光は、ａ）フルオレセイン（約５３０ｎｍ）、ｂ）Ｓｕｌｆｏ－Ｃｙ３（約５７６ｎｍ）、ｃ）Ｓｕｌｆｏ－Ｃｙ３．５（約６０５ｎｍ）、ｄ）Ｓｕｌｆｏ－Ｃｙ５．５（約７０６ｎｍ）、ｅ）Ｓｕｌｆｏ－Ｃｙ７（約７８８ｎｍ）、およびｆ）Ｓｔａｒ Ｒｅｄ（約６６２ｎｍ）である。グラフｃ、ｄ、ｅ、およびｆの６５０ｎｍ付近を中心とする鋭い発光の特徴は、発光測定のアーティファクトであり、タンデムポリマーの蛍光の実際の特徴ではない。

【0052】

３５５ｎｍで励起した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のフローサイトメトリー分析におけるポリマー色素モノクローナル抗体（抗ＣＤ１９）コンジュゲートの性能試験を図５に示す。明確化のため単球を除外するためにＣＤ１４陰性細胞のみが示されている。Ａ）５８５／４２ｎｍ発光フィルターで検出されたＢＮＰ－ｓＣｙ３コンジュゲート；Ｂ）６１０／２０ｎｍ発光フィルターで検出されたＢＮＰ－ｓＣｙ３．３コンジュゲート；Ｃ）６７０／３０ｎｍ発光フィルターで検出されたＢＮＰ－Ｓｔａｒ Ｒｅｄコンジュゲート；Ｄ）７１０／３０ｎｍ発光フィルターで検出されたＢＮＰ－ｓＣｙ５．５コンジュゲート；Ｅ）７８０／６０ｎｍ発光フィルターで検出されたＢＮＰ－ｓＣｙ７コンジュゲート。

【0053】

［一般的合成］
［ビルディングブロックＭ１の合成］

【化7】

【0054】

アセトン（４２ｍＬ）中の６，６’－ジブロモ－［１，１’－ビナフタレン］－２，２’－ジオール（３．００ｇ、６ｍｍｏｌ）の撹拌されている溶液に、３４－ヨード－２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２－ウンデカオキサテトラトリアコンタン（１２．６ｇ、２０ｍｍｏｌ）、続いてＫ_２ＣＯ_３（２．８２ｇ、２０ｍｏｌ）を入れ、得られた反応混合物を７０℃で１６時間撹拌した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して乾燥させた。得られた粗製物質を水（２０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３×３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相をブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮した。得られた粗製残留物を、メタノール／ジクロロメタン（５：９５）で溶出するシリカカラムクロマトグラフィーにより精製して、淡黄色の液体を得た。この化合物を、アセトニトリル／水（５０：５０）で溶出する逆相クロマトグラフィーによりさらに精製した。化合物を凍結乾燥することで、純粋な化合物Ｍ１（１．７ｇ、１７．６％）を淡黄色の液体として得た。

【0055】

［ビルディングブロックＭ２の合成］

【化8】

【0056】

炭酸カリウム（２．７４ｇ、１９．９ｍｍｏｌ）を、ジメチルホルムアミド（４０ｍＬ）中の２，５－ジブロモフェノール（１．００ｇ、３．９７ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。４－（Ｎ－Ｂｏｃ－アミノ）ブチルブロミド（１．２ｇ、４．８ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加し、溶液を８０℃で７２時間加熱した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をジクロロメタン（５０ｍＬ）に懸濁させ、水（３×５０ｍＬ）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下で除去することで白色固体（１．４９ｇ）を得た。粗生成物を、ｎ－ヘキサン中で０体積％から５０体積％の酢酸エチルの勾配を用いるシリカフラッシュカラムクロマトグラフィー、およびそれに続く水中で０体積％から１００体積％のアセトニトリルの勾配を用いる逆相フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製した。生成物を白色固体として得た（１．４６ｇ、８７％）。

【0057】

［ｔｅｒｔ－ブチル４－（４－ブロモフェニル）ブタノエート（Ｍ３）の合成］

【化9】

【0058】

１，１’カルボニルジイミダゾール（６６７ｍｇ、４．１１ｍｍｏｌ）を、ジメチルホルムアミド（４．１ｍＬ）中の４－（４－ブロモフェニル）ブタン酸（１．００ｇ、４．１１ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、混合物を４０℃で１時間撹拌した。ｔ－ブチルアルコール（６１０ｍｇ、７７２μＬ、８．２３ｍｍｏｌ）と１，８ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク－７エン（６２６ｍｇ、６１４μＬ、４．１１ｍｏｌ）を添加し、混合物を４０℃で２４時間撹拌した。ジエチルエーテル（５０ｍＬ）を添加し、溶液を１０％塩酸（１０ｍＬ）、水（１０ｍＬ）、および１０％炭酸ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗生成物を、ｎ－ヘキサン中で０体積％から１０体積％の酢酸エチルの勾配で溶離するシリカフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製することで、生成物を無色オイルとして得た（２３４ｍｇ、１７％）。

【0059】

［ポリマー骨格の合成］

【化10】

ｃ＝０．１、ａ＝０．９、ｄ＝２７

【0060】

ビス（１，５－シクロオクタジエン）ニッケル（０）（１１７ｍｇ、４２４μｍｏｌ）、２，２’－ビピリジル（６６．０ｍｇ、４２４μｍｏｌ）、および１，５－シクロオクタジエン（４６．０ｍｇ、４２４μｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（８ｍｌ）に溶解し、アルゴン雰囲気下で７０℃で３０分間撹拌した。モノマーＭ１（２５０ｍｇ、１７３μｍｏｌ）、Ｍ２（８ｍｇ、１９μｍｏｌ）、およびＭ３（１．１ｍｇ、３．９μｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下でジメチルホルムアミド（８ｍＬ）に溶解し、Ｎｉ錯体含有溶液に添加した。混合物を７０℃で３時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残留物を２０体積％のエタノール水溶液に懸濁させた。遠心分離を行った後、上清みをサイズ排除濾過を使用して精製し、続いて凍結乾燥することでポリマーを黄色の泡状物として得た。ポリマーをジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（５ｍＬ）を添加した。溶液を室温で２時間撹拌した。揮発性物質を減圧下で除去し、残留物を２０体積％のエタノール水溶液（１００ｍＬ）に溶解し、サイズ排除濾過（カットオフ１０ｋＤａ）によって精製し、凍結乾燥することで、最終生成物（１２２ｍｇ、４４％）を得た。

【0061】

［ポリマータンデム色素の合成］

【化11】

ｃ＝１０％、ａ＝９０％、ｄ＝２７

【0062】

ＤＭＳＯ（０．３３μＬ）中のポリマー骨格（５．０ｍｇ）の溶液に、ＤＭＳＯ（０．１～０．７ｍＬ）中のＮＨＳ受容体色素（１．１２８μｍｏｌ）の溶液を添加した。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１０．８μＬ）を添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を２０体積％のＥｔＯＨ（４０ｍＬ）に注ぎ入れた。限外濾過により過剰の受容体色素を除去した。ポリマーを２０体積％のＥｔＯＨ（１５ｍＬ）に溶解して濾液が無色になるまで限外濾過によって濃縮する手順を繰り返すことにより精製した。

【0063】

［タンデム色素のアミノ化］

【化12】

【0064】

ポリマータンデム色素（５．０ｍｇ）を、２０体積％のエタノールを含有するＭＥＳバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ６）（０．５０ｍＬ）に溶解した。５０ｍＭのＭＥＳバッファー中のＮ－ヒドロキシスクシンイミド（２．３ｍｇ、２０μｍｏｌ）の溶液（１９２μＬ）と、５０ｍＭのＭＥＳバッファー中の１エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（３．８ｍｇ、２０μｍｏｌ）の溶液（１９０μＬ）を添加した。混合物を室温で２０分間撹拌した。エチレンジアミン（１．７３μＬ、１．５６ｍｇ、２６μｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で２時間撹拌した。混合物を５０ｍＭのＭＥＳバッファー（１０ｍＬ）で希釈し、限外濾過により濃縮した。ポリマーを２０体積％のＥｔＯＨ（１５ｍＬ）に溶解し、続いて限外濾過および凍結乾燥することによって精製した。

【0065】

［ポリマータンデム色素の抗体へのバイオコンジュゲーション］
抗体は、５ｍｇ／ｍＬの抗体濃度で３０分間、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）中のジチオトレイトール（５０ｍＭ）を使用して還元した。還元された抗体を、ゲル濾過オーブンであるＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５カラム（Cytiva Europe GmbH, Germany）で精製した。抗体含有画分をクーマシー染色によって特定し、２８０ｎｍにおける吸光度を測定することによりプールした画分の抗体濃度を決定した。

【0066】

ヘテロ二官能性架橋剤としてスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）を使用して、アミノ官能化ポリマーを還元した抗体にカップリングさせた。クロスカップリングは、市販のＳＭＣＣクロスカップリングキット（Thermo Fisher Scientific Inc., USA）を使用して行った。カップリングは、キットの使用説明書に従って行った。抗体－ポリマーコンジュゲートは、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。

【0067】

［細胞染色］
ＰＥＢ緩衝液を使用して１ｍＬ当たり１×１０^７個の細胞の濃度でボルテックスを行い、続いて３００ｇで５分間遠心分離することにより、細胞を洗浄した。１×１０^７個の細胞を２０μＬのＰＥＢバッファーに再懸濁し、細胞染色のために１ｍＬ当たり１×１０^７個の細胞の濃度に到達するように抗体－色素コンジュゲートおよびＰＥＢバッファーを添加した。細胞は、４℃で１０分間インキュベートすることにより染色した。その後、細胞を再度洗浄し、フローサイトメトリー分析のために１ｍＬのＰＥＢバッファーに再懸濁した。染色した細胞は、分析まで４℃で保管した。死細胞の識別のために、ヨウ化プロピジウム溶液（力価１：１０００）を測定の直前に装置によって添加した。

【0068】

［フローサイトメトリー分析］
染色した細胞は、５つのレーザー励起源（３５５ｎｍ、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５６１ｎｍ、６４０ｎｍ）を３７９／２８ｎｍのバンドパスフィルターと組み合わせたＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（Becton, Dickinson & Company Inc, USA）を用いたフローサイトメトリーによって分析した。フローサイトメトリーデータ分析は、ＦｌｏｗＪｏ（Becton, Dickinson & Company Inc, USA）フローサイトメトリー分析ソフトウェアを使用して行った。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4a】

【図4b】

【図4c】

【図4d】

【図4e】

【図4f】

【図5】

【外国語明細書】