特開 2023-105440 キノコ栽培廃菌床の加圧熱水抽出物の製造方法、及びラジカル消去剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023105440

(43)【公開日】2023-07-31

(54)【発明の名称】キノコ栽培廃菌床の加圧熱水抽出物の製造方法、及びラジカル消去剤

(51)【国際特許分類】

   C12P 1/02 20060101AFI20230724BHJP

   B01D 11/02 20060101ALI20230724BHJP

   C12N 1/14 20060101ALI20230724BHJP

   C08B 37/00 20060101ALN20230724BHJP

【ＦＩ】

C12P1/02 Z

B01D11/02 A

C12N1/14 F

C08B37/00 Q

C08B37/00 C

【審査請求】未請求

【請求項の数】9

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022006266

(22)【出願日】2022-01-19

(71)【出願人】

【識別番号】313009877

【氏名又は名称】環境エネルギー株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000040

【氏名又は名称】弁理士法人池内アンドパートナーズ

(72)【発明者】

【氏名】樫村 幸嗣

(72)【発明者】

【氏名】野田 修嗣

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C090

4D056

【Ｆターム（参考）】

4B064AH19

4B064CA07

4B064CC15

4B064CC30

4B064CE08

4B064DA16

4B065AA71X

4B065AC14

4B065BD08

4B065BD16

4B065BD50

4B065CA55

4B065CA56

4C090AA04

4C090AA08

4C090BA21

4C090BA24

4C090BA81

4C090BC08

4C090CA04

4C090CA05

4C090CA10

4C090DA09

4D056AB14

4D056AC22

4D056BA16

4D056CA21

4D056CA22

4D056CA33

4D056CA39

4D056DA01

4D056DA02

(57)【要約】      （修正有）

【課題】キノコ栽培廃菌床の新たな利用として、高いラジカル消去活性を有する加圧熱水抽出物を得ることができるキノコ栽培廃菌床の加圧熱水抽出物の製造方法、及びラジカル消去剤を提供する。
【解決手段】本発明は、加圧熱水抽出物の製造方法であって、キノコ菌床栽培後の廃菌床を、飽和水蒸気圧以上の圧力下で、４０℃を超える温度の加圧熱水と接触させて加圧熱水抽出物を抽出する工程Ａを含み、前記キノコ菌床栽培後の廃菌床は、キノコの上面栽培後の廃菌床であり、前記加圧熱水抽出物は、ラジカル消去活性を有する、加圧熱水抽出物の製造方法に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

キノコ菌床栽培後の廃菌床の加圧熱水抽出物の製造方法であって、
キノコ菌床栽培後の廃菌床を、飽和水蒸気圧以上の圧力下で、４０℃を超える温度の加圧熱水と接触させて加圧熱水抽出物を抽出する工程Ａを含み、
前記キノコ菌床栽培後の廃菌床は、キノコの上面栽培後の廃菌床であり、
前記加圧熱水抽出物は、ラジカル消去活性を有する、加圧熱水抽出物の製造方法。

【請求項2】

前記工程Ａにおいて、加圧熱水の圧力は０．１～２．５ＭＰａである、請求項１に記載の加圧熱水抽出物の製造方法。

【請求項3】

前記工程Ａは、加圧熱水の温度が６４℃超、かつ１１３℃以下の範囲である工程Ａ１、加圧熱水の温度が１１７℃超、かつ１６９．７℃以下の範囲である工程Ａ２、及び加圧熱水の温度が１６９．７℃超、かつ２３３℃以下の範囲である工程Ａ３からなる群から選ばれる一つ以上の工程を含む、請求項１又は２に記載の加圧熱水抽出物の製造方法。

【請求項4】

前記工程Ａで得られた加圧熱水抽出物を乾燥する工程Ｂをさらに含む、請求項１～３のいずれかに記載の加圧熱水抽出物の製造方法。

【請求項5】

前記キノコは、シイタケである、請求項１～４のいずれかに記載の加圧熱水抽出物の製造方法。

【請求項6】

ラジカル消去活性を有するラジカル消去剤であって、
前記ラジカル消去剤は、キノコ菌床栽培後の廃菌床の加圧熱水抽出物を含み、
前記加圧熱水抽出物は、キノコ菌床栽培後の廃菌床を飽和水蒸気圧以上の圧力下で、４０℃を超える温度の加圧熱水と接触させて抽出したものであり、
前記キノコ菌床栽培後の廃菌床は、キノコの上面栽培後の廃菌床である、ラジカル消去剤。

【請求項7】

前記加圧熱水の圧力は０．１～２．５ＭＰａである、請求項６に記載のラジカル消去剤。

【請求項8】

前記加圧熱水の温度は、６４℃超、かつ１１３℃以下の範囲である条件１、１１７℃超、かつ１６９．７℃以下の範囲である条件２、及び１６９．７℃超、かつ２３３℃以下である条件３からなる群から選ばれる一つ以上の条件を満たす、請求項６又は７に記載のラジカル消去剤。

【請求項9】

２，２－ジフェニル－１－ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）ラジカル消去活性ＩＣ５０が１００ｍｇ／Ｌ以下である、請求項６～８のいずれかに記載のラジカル消去剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ラジカル消去活性を有する加圧熱水抽出物を得ることができるキノコ栽培廃菌床の加圧熱水抽出物の製造方法、及びラジカル消去剤に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、シイタケなどのキノコの菌床栽培後の廃菌床を再利用することが行われている。例えば、特許文献１には、キノコ栽培廃菌床からキノコ成分を抽出する加圧熱水処理方法を利用して堆肥物を製造することが記載されている。
非特許文献１には、廃菌床を堆肥、他のキノコ形成菌の基質、動物飼料、プラスチック代替包装材や建築材料、バイオ燃料、酵素源等として活用することが記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開２００６－１７６７６５号公報

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Mushroom cultivation in the circular economy, Daniel Grimm et al., Applied Microbiology and Biotechnology, 2018, Vol.102,7795-7803

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明の発明者らは、従来とは異なる、キノコ栽培廃菌床の新たな利用について検討した。

【0006】

本発明は、キノコ栽培廃菌床の新たな利用として、高いラジカル消去活性を有する加圧熱水抽出物を得ることができるキノコ栽培廃菌床の加圧熱水抽出物の製造方法、及びラジカル消去剤を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、加圧熱水抽出物の製造方法であって、キノコ菌床栽培後の廃菌床を、飽和水蒸気圧以上の圧力下で、４０℃を超える温度の加圧熱水と接触させて加圧熱水抽出物を抽出する工程Ａを含み、前記キノコ菌床栽培後の廃菌床は、キノコの上面栽培後の廃菌床であり、前記加圧熱水抽出物は、ラジカル消去活性を有する、加圧熱水抽出物の製造方法に関する。

【0008】

本発明は、ラジカル消去活性を有するラジカル消去剤であって、前記ラジカル消去剤は、キノコ菌床栽培後の廃菌床の加圧熱水抽出物を含み、前記加圧熱水抽出物は、キノコ菌床栽培後の廃菌床を飽和水蒸気圧以上の圧力下で、４０℃を超える温度の加圧熱水と接触させて抽出したものであり、前記キノコ菌床栽培後の廃菌床は、キノコの上面栽培後の廃菌床である、ラジカル消去剤に関する。

【発明の効果】

【0009】

本発明の加圧熱水抽出物の製造方法によれば、高いラジカル消去活性を有する、加圧熱水抽出物を得ることができる。
本発明によれば、高いラジカル消去活性を有するラジカル消去剤を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】一例の加圧熱水処理装置の模式的断面図である。

【図2】実施例１～１３、比較例１～１７の加圧熱水抽出物の２，２－ジフェニル－１－ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）ラジカル消去活性ＩＣ５０の結果を示すグラフである。

【図3】実施例１４～２６の加圧熱水抽出物のＤＰＰＨラジカル消去活性ＩＣ５０の結果を示すグラフである。

【図4】実施例５、１５及び２１の加圧熱水抽出物のフーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）で測定したＩＲスペクトルである。

【図5】実施例１４～２６の加圧熱水抽出物の三次元蛍光（ＥＥＭ）測定－ＰＡＲＡＦＡＣ解析結果を示すグラフである。

【図6】実験例１及び２におけるステンレス製反応器内部の温度推移を示すグラフである。

【図7】実験例３におけるステンレス製反応器内部の温度推移を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0011】

キノコは、通常、全面栽培又は上面栽培で栽培されているが、本発明の発明者らは、驚くことに、キノコの上面栽培後の廃菌床を用いることで、キノコの全面栽培後の廃菌床に比べて、ラジカル消去活性が高い加圧熱水抽出物が得られることを見出し、本発明に至った。
上面栽培は、袋詰めした後に滅菌した菌床にキノコ菌を接種して１次培養後、菌床の上面のみを露出させ、袋と菌床をゴムバンドで固定して袋の内側を一定の水で常に満たした状態に保ち、菌床の上面のみにキノコを発生させる。一方、全面栽培は、袋詰めした後に滅菌した菌床にキノコ菌を接種して１次培養後、脱袋した菌床を浸水槽中にて浸漬して菌床表面に被膜を形成し、その後菌床を浸水槽から取り出し、適宜、散水処理を行い、菌床全面にキノコを発生させる。
キノコの上面栽培後の廃菌床と、キノコの全面栽培後の廃菌床は、外観が明らかに異なるとともに、含水率も異なる。
以下において、特に指摘がない場合は、廃菌床は、キノコの上面栽培後の廃菌床を意味する。

【0012】

本発明において、加圧熱水抽出物の製造方法は、キノコの上面栽培後の廃菌床を、飽和水蒸気圧以上の圧力下で、４０℃を超える温度の加圧熱水と接触させて加圧熱水抽出物を抽出する工程Ａを含む。ここで、「キノコの上面栽培後の廃菌床を、飽和水蒸気圧以上の圧力下で、４０℃を超える温度の加圧熱水と接触させて加圧熱水抽出物を抽出する工程Ａ」とは、連続的に昇温した場合や段階的に昇温した場合のいずれの場合においても、工程Ａで抽出した加圧熱水抽出物は、キノコの上面栽培後の廃菌床を飽和水蒸気圧以上の圧力下で、温度が４０℃以下の加圧熱水と接触させることで抽出した加圧熱水抽出物を含まないことを意味する。

【0013】

廃菌床は、キノコの上面栽培後の廃菌床であればよく、キノコの種類は特に限定されない。キノコは、白色腐朽菌でもよく、褐色腐朽菌でもよいが、加圧熱水抽出物のラジカル消去活性がより高まる観点から、白色腐朽菌の上面栽培後の廃菌床であることが好ましい。白色腐朽菌としては、特に限定されず、例えば、シイタケ、ナメコ、マイタケ、エリンギ、ヒラタケ、ブナシメジ等が挙げられ、加圧熱水抽出物のラジカル消去活性がより高まる観点から、シイタケ栽培後の廃菌床であることがより好ましい。

【0014】

廃菌床において、キノコの栽培回数（発生回数）は特に限定されず、例えば、１～８回でもよい。菌床の培地基材は、特に限定されず、例えば、木質チップの原料としてナラ、ブナ、シイ、スギ、栄養体としてフスマ、デンプン、米糠、コーンスターチ、炭酸カルシウム、貝化石、貝殻粉末等のいずれでもよい。

【0015】

工程Ａにおいて、キノコの上面栽培後の廃菌床を、飽和水蒸気圧以上の圧力下で、温度の４０℃より高い加圧熱水と接触させる。このような条件の加圧熱水で廃菌床を処理することで、ラジカル消去活性を有する成分を多く含む加圧熱水抽出物が得られる。加圧熱水の上限は特に限定されないが、例えば、エネルギーコスト低減の観点から、２５０℃以下であることが好ましい。

【0016】

加圧熱水と接触させる前に、例えば、加圧熱水抽出物の抽出効果を高める観点から、廃菌床を所定のサイズに切断又は粉砕してもよい。切断又は粉砕後の廃菌床の大きさは特に限定されないが、好ましくは可能な限りエネルギーを消費しないものが望ましい。例えば、数ｃｍ以下で、１００μｍ程度以下の粉末が望ましく、具体的には５０～１００メッシュ程度に分級したものを用いてもよい。なお、廃菌床は、切断又は粉砕する前に乾燥してもよい。

【0017】

工程Ａは、ラジカル消去活性が高い加圧熱水抽出物を得やすい観点から、加圧熱水の温度が６４℃超、かつ１１３℃以下の範囲である工程Ａ１、加圧熱水の温度が１１７℃超、かつ１６９．７℃以下の範囲である工程Ａ２、及び加圧熱水の温度が１６９．７℃超、かつ２３３℃以下の範囲である工程Ａ３からなる群から選ばれる一つ以上の工程を含むことが好ましく、加圧熱水の温度が６４℃超、かつ１１３℃以下の範囲である工程Ａ１を含むことがより好ましい。

【0018】

工程Ａ１において、加圧熱水の温度が６４℃超、かつ１１３℃以下の範囲であることにより、ラジカル消去活性がより高い加圧熱水抽出物を得やすくなる。これは、工程Ａ１において、加圧熱水の温度が６４℃超、かつ１１３℃以下の範囲であることにより、ヘミセルロース分解産物、セルロース分解産物及び菌糸体由来のβ-グルカン分解産物の溶出が少ないリグニン分解物溶出画分が得られやすいためであると推測される。工程Ａ１で得られた加圧熱水抽出物は、ラジカル消去活性が高く、ヘミセルロース分解産物、セルロース分解産物及び菌糸体由来のβ-グルカン分解産物の溶出が少ないことから、バニリン酸、シリンガ酸などの低分子水溶性リグニン分解物の豊富な抗酸化作用を有する機能性素材として好適に用いることができる。工程Ａ１において、加圧熱水抽出物のラジカル消去活性をより高める観点から、加圧熱水の温度は、７６℃超、かつ１０３℃以下であることがより好ましい。

【0019】

工程Ａ２において、加圧熱水の温度が１１７℃超、かつ１６９．７℃以下の範囲であることにより、ヘミセルロース分解産物が豊富なリグニン分解物溶出画分が得られやすいと推測される。工程Ａ２で得られた加圧熱水抽出物は、工程Ａ１で得られた加圧熱水抽出物に比べて、ＤＰＰＨラジカル消去活性は劣るが、これは、工程Ａ２で得られた加圧熱水抽出物がオリゴ糖を主体とするヘミセルロース分解産物を豊富に含むことに起因すると推測される。工程Ａ１で得られた加圧熱水抽出物に比べて、ＤＰＰＨラジカル消去活性は劣るものの、適度なラジカル消去活性が求められる、オリゴ糖の豊富な機能性素材として好適に用いることができる。工程Ａ２において、加圧熱水抽出物のラジカル消去活性をより高める観点から、加圧熱水の温度は１４５～１５０℃であることがより好ましい。

【0020】

工程Ａ３において、加圧熱水の温度が１６９．７℃超、かつ２３３℃以下の範囲であることにより、セルロース分解産物及び菌糸体由来のβ-グルカン分解産物が豊富なリグニン分解物溶出画分溶出画分が得られやすいと推測される。工程Ａ３で得られた加圧熱水抽出物は、工程Ａ１で得られた加圧熱水抽出物に比べて、ＤＰＰＨラジカル消去活性は劣るが、これは、工程Ａ３で得られた加圧熱水抽出物がオリゴ糖を主体とするセルロース分解産物及び菌糸体由来のβ-グルカン分解産物を豊富に含むことに起因すると推測される。工程Ａ３で得られた加圧熱水抽出物は、工程Ａ１で得られた加圧熱水抽出物に比べて、ＤＰＰＨラジカル消去活性は劣るものの、適度なラジカル消去活性が求められる、β－グルカン分解物の豊富な機能性素材として好適に用いることができる。工程Ａ３において、加圧熱水抽出物のラジカル消去活性をより高める観点から、加圧熱水の温度は２１５～２２６℃であることがより好ましい。

【0021】

加圧熱水の圧力は、飽和水蒸気圧以上の圧力であればよく、特に限定されないが、例えば、０．１～２．５ＭＰａであってもよい。

【0022】

工程Ａは、密閉耐圧性容器中で、上述した温度及び圧力下で廃菌床を加圧熱水と接触させることで行うことができる。工程Ａにおいて、水の使用量は特に限定されないが、例えば、廃菌床の重量に対し、１０～１００倍重量の加圧熱水を接触させて行うことができる。

【0023】

工程Ａで用いる装置は、特に限定されないが、例えば、流通式加圧熱水装置を用いることができる。流通式加圧熱水装置としては、公知の加圧熱水処理装置を用いることができ、例えば、図１に示す加圧熱水処理装置等が挙げられる。加圧熱水処理装置１は、窒素ボンベ２、高圧ポンプ３、反応器４、冷却器５、保圧弁６、バルブ７、熱電対８及びこれらを接続する配管９、オイルバス１０、保温用外部ヒーター（図示なし）、計器類（図示なし）、処理液受け１３からなる。１１は加熱コイルであり、１２は水である。反応器の上下端は、例えば、多孔質フィルターで閉じることができる。多孔質フィルターは、特に限定されないが、例えば、２～１００μｍの範囲の貫通した孔の開いたものであってもよい。多孔質フィルターの材質は、ステンレスなどの金属でもよく、セラミックでもよい。切断又は粉砕後の廃菌床の大きさ等を考慮して最も適した孔の開いたものを選択すればよい。例えば、粉砕、乾燥後の廃菌床が５０～１００メッシュ程度に分級したものである場合は、平均孔径５μｍのガスケットフィルターを用いてもよい。

【0024】

乾燥状態の廃菌床を所定量反応器に充填した後、反応器を配管に接続し、次に、反応器及び周囲配管に保温用外部ヒーターを取り付けた後、系内に窒素ガスを充填し、保安弁で系内圧を所定圧（例えば、０．１～２．５ＭＰａ）になるように調整する。次に、高圧ポンプで系内に通水し、オイルバスに浸る位置まで系内水を到達させ、一旦通水を停止する。次に、オイルバスで系内の温度を制御する。温度は、連続的に昇温させてもよく、段階的に昇温させてもよい。昇温時間は、特に限定されないが、目的とする画分の収量を目安に調整することができる。水は水道水でも使用できるが、イオン交換水、蒸留水、フィルター濾過した限外濾過水等のように十分に精製した水を用いることが望ましい。反応器を通過した後の処理液を室温まで冷却したのち、一定時間間隔（例えば、約５分ごと）に加圧熱水の温度が４０℃を超える温度帯の処理液（水溶液又は水分散液状態の加圧熱水抽出物）を回収することで、加圧熱水抽出物を得ることができる。工程Ａ１の場合は、６４℃超、かつ１１３℃以下の温度帯の処理液を一定時間間隔（例えば、約５分ごと）で回収し、工程Ａ２の場合は、１１７℃超、かつ１６９．７℃以下の温度帯の処理液を一定時間間隔（例えば、約５分ごと）で回収し、工程Ａ３の場合は、１６９．７℃超、かつ２３３℃以下の温度帯の処理液を一定時間間隔（例えば、約５分ごと）で回収してもよい。所定の温度で回収した処理液は、単独で加圧熱水抽出物として用いてもよく、２つ以上を混合して加圧熱水抽出物として用いてもよい。

【0025】

加圧熱水抽出物は、コスト及び取扱い性の観点から、水の温度及び圧力を所定範囲に調整したバッチ式装置を用いて行うこともできる。

【0026】

工程Ａで得られた水溶液又は水分散液状態の加圧熱水抽出物は、工程Ｂにおいて、乾燥することで粉末状態にしてもよい。乾燥方法は、特に限定されず、例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥等の公知の方法で行うことができる。粉末状態にすることで、保存性が向上し、輸送コストも低減できる。

【0027】

加圧熱水抽出物のラジカル消去活性は、ＤＰＰＨラジカル消去活性ＩＣ５０を測定することで確認することができる。加圧熱水抽出物のＤＰＰＨラジカル消去活性ＩＣ５０は、ラジカル消去効果の観点から、２５０ｍｇ／Ｌ以下であることが好ましく、２４０ｍｇ／Ｌ以下であることがより好ましく、２３０ｍｇ／Ｌ以下であることがさらに好ましく、２００ｍｇ／Ｌ以下であることがさらにより好ましく、１８０ｍｇ／Ｌ以下であることがさらにより好ましく、１６０ｍｇ／Ｌ以下であることがさらにより好ましく、１４０ｍｇ／Ｌ以下であることがさらにより好ましく、１２０ｍｇ／Ｌ以下であることがさらにより好ましく、１００ｍｇ／Ｌ以下であることが特に好ましい。

【0028】

上記のように得られたキノコの上面栽培後の廃菌床の加圧熱水抽出物は、ラジカル消去剤として用いることができる。当該加圧熱水抽出物は、菌床成分分解物由来成分やキノコ菌糸体由来成分等の数多くの成分を含む混合物であり、元素分析、ＦＴ-ＩＲ、¹³Ｃ ＣＰ／ＰＡＳＳ ＮＭＲ、ＨＰ-ＳＥＣ（分子サイズ分布）、及びＴＨＭ-ＧＣ/ＭＳ等の様々な分析方法を用いても、加圧熱水抽出物の成分を特定することは実際的ではない。

【0029】

ラジカル消去剤は、抗酸化作用（活性酸素種の発生やその働きの抑制、あるいは活性酸素そのものを取り除く作用のこと）のうちラジカル性の活性酸素種を消去する能力を有しており、例えば、加圧熱水抽出物とラジカルを接触させることで、ラジカル消去剤として機能させることができる。対象となるラジカルとしては、特に限定されず、発生したラジカルのいずれでもよいが、例えば、ヒドロキシラジカル、アルコキシラジカル、ペルオキシラジカル、ヒドロペルオキシラジカル、一酸化窒素、二酸化窒素、スーパーオキシドアニオン等が挙げられる。

【実施例0030】

以下実施例により本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。

【0031】

（実験例１）
＜廃菌床＞
シイタケ（Ｌｅｔｉｎａ ｅｄｏｄｅｓ）菌床栽培（全面栽培方式；群馬県上野村きのこセンター、シイタケ菌種Ｈ６０７、栽培回数：１回、菌床培地基材組成：木質としてナラチップ、栄養体として特フスマ、ホミニフィード、貝化石を配合）に用いられ、シイタケを栽培し、子実体を収穫後に廃棄された菌床を用い、粉砕し、気流乾燥機で乾燥後、５０～１００メッシュ程度に分級した。
＜加圧水装置＞
加圧水処理には、図１に示した加圧水処理装置を用いた。加圧水処理装置１は、窒素ボンベ２、高圧ポンプ３、反応器４、冷却器５、保圧弁６、バルブ７、熱電対８、及びこれらを接続する配管９、オイルバス１０、処理液受け１３、保温用外部ヒーター（図示なし）、計器類（図示なし）からなる。１１は加熱コイルであり、１２は水である。反応器は、両端をガスケットフィルター（平均孔径：5μｍ）でキャップした流通式パーコレータ型反応器（SUS316、23.5 mm i.d. ×65 mm length, 28 ml）であった。
＜廃菌床の加圧熱水処理＞
上記の乾燥状態の廃菌床（乾燥廃菌床）９ｇを正確に秤量し、２８ｍＬ容のステンレス製反応器に充填した後、これを配管に接続した。次に、反応器及び周囲配管に保温用外部ヒーターを取り付けた後、系内に窒素ガスを充填し、保安弁で系内圧を２．５ＭＰａとした。さらに、オイルバスで系内の温度を制御し、蒸留水を１０ｍＬ／ｍｉｎの流速で反応器を通過させることで、廃菌床を加圧熱水と接触させた。温度は３０～１７０℃に設定し、７０分かけて連続的に昇温した。図６に、実験例１におけるステンレス製反応器内部の温度推移を示した。反応器を通過した後の処理液（抽出物）は冷却したのち５分ごとに回収し、試料番号１～１５の加圧熱水抽出物（水溶液又は水分散液）を得た。その後、凍結乾燥することで、試料番号１～１５の乾燥状態の加圧熱水抽出物を得た。下記表２に、試料番号１～１５に対応する加圧熱水の温度を示した。試料番号１～１５は、比較例に該当する。

【0032】

（実験例２）
シイタケ菌床栽培（上面栽培方式；農林業公社しんしろ菌床センター作手より入手、シイタケ菌種Ｈ６０７、栽培回数８回、菌床培地基材組成：木質としてナラチップ、栄養体としてフスマ、デンプン、米糠、コーンスターチ、炭酸カルシウムを配合）に用いられ、シイタケを栽培し、子実体を収穫後に廃棄された菌床を用いた以外は、実験例１と同様にして、試料番号１６～３０の加圧熱水抽出物を得た。図６に、実験例２におけるステンレス製反応器内部の温度推移を示した。下記表３に、試料番号１６～３０に対応する加圧熱水の温度を示した。試料番号１６～１７は、比較例に該当し、試料番号１８～３０は、実施例に該当する。

【0033】

（実験例３）
オイルバスで系内の温度を２段階で昇温させた以外は、実験例２と同様にして、試料番号３１～４３の加圧熱水抽出物を得た。昇温は、具体的には、３０℃から１０分かけて約１５０℃に昇温させた後、２０分間保持し、次いで、３５分かけて約２３０℃までに昇温させた後、３０個分間保持した。図７に、実験例３におけるステンレス製反応器内部の温度推移を示した。下記表４に、試料番号３１～４３に対応する加圧熱水の温度を示した。試料番号３１～４３は、実施例に該当する。

【0034】

試料番号１～４３の加圧熱水抽出物のＤＰＰＨラジカル消去活性を下記のとおりに測定評価し、その結果を下記表２～４、及び図２、３に示した。また、試料番号２２（実施例５）、試料番号３２（実施例１５）及び試料番号３８（実施例２１）の加圧熱水抽出物をＦＴＩＲにて分析し、その結果を図４に示した。また、試料番号３１～４３（実施例１４～２６）の加圧熱水抽出物に対して三次元蛍光（ＥＥＭ）測定－ＰＡＲＡＦＡＣ解析を行い、その結果を下記表５及び図５に示した。また、試料番号１～４３の加圧熱水抽出物の収率を下記のように算出し、その結果を下記表２～４に示した。凍結乾燥後（乾燥状態）の加圧熱水抽出物をメノウ乳鉢で均一に粉砕した後、ＤＰＰＨラジカル消去活性及びＦＴＩＲ分析に用いた。

【0035】

（１）ＤＰＰＨラジカル消去活性の測定
ＤＰＰＨ（２，２－Ｄｉｐｈｅｎｙｌ－１－ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ）は、９９．５％エタノールに溶解した。試料は９９．５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。
９６穴マイクロプレートの各ウェルに試料溶液２０μＬ、Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒとして１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）８０μＬ、０．２０ｍＭのＤＰＰＨ溶液１００μＬを添加し、混和後、遮光下、２５℃で３０分間静置した。反応後、プレートリーダーで５１７ｎｍの吸光度を測定した。下記表１の組成のブランク１、ブランク２、及びブランク３についても、同時に吸光度を測定し、下記の数式１により試料のＤＰＰＨラジカル消去率（％）を算出した。
ＤＰＰＨラジカルを５０％消去する濃度（５０％阻害濃度：ＩＣ５０）を算出のため、まず、１，１０，１００，１０００μｇ／ｍＬの各試料溶液の消去率を測定し、消去率５０％を含む濃度域を決定した。次に、この濃度域において５０％消去率を含む３濃度と対応する消去率を直線回帰し、求めた回帰式から５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出した。

【表1】

【数1】

【0036】

（２）フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）分析
乾燥ＫＢｒ粉末で１５０倍に希釈した試料の赤外スペクトルを、フーリエ変換赤外分光光度計（ＦＴ／ＩＲ－４６００ ｔｙｐｅＡ、日本分光社製）を用いて、拡散反射フーリエ変換赤外分光（ｄｉｆｆｕｓｅ ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｆｏｕｒｉｅｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｓ）法によりＩＲスペクトルを測定した。測定は、４００～４０００ｃｍ^-1波数域で、２００スキャン（対照として測定したＫＢｒ粉末はスキャン回数を６４回に設定した）、解像度４ｃｍ^-1で行った。

【0037】

（３）三次元蛍光（ＥＥＭ）測定－ＰＡＲＡＦＡＣ解析
水溶液又は水分散状態の試料を０．４５μｍのセルロースエステル膜でろ過後、４℃で冷蔵保存した試料の溶存有機炭素（ＤＯＣ）濃度を全有機体炭素測定装置（ＴＯＣ－Ｖ、島津製作所製）で測定し、ＤＯＣが１ｍｇ／ＬになるようにＭｉｌｌｉ－Ｑ水で希釈し、三次元蛍光（ＥＥＭ）測定に供した。ＥＥＭ測定は蛍光分光光度計（Ｆ７０００、日立ハイテックサイエンス製）を使用し、１ｃｍキュベットを用いて５ｎｍの間隔で２２０－４５０ｎｍの励起波長と１ｎｍの間隔で２５０－５５０ｎｍの蛍光波長をスキャンした。励起及び蛍光スリットの幅はともに５ｎｍに設定した。光電子増倍管（ＰＭＴ）電圧は７００μＶ、スキャン速度は２４００ｎｍ／ｍｉｎとした。比較のためのＭｉｌｌｉ－Ｑ水のＥＥＭ測定は実験期間を通して毎回行った。ＰＡＲＡＦＡＣ解析は、多変量解析ソフトウェア「３Ｄ ＳｐｅｃｔＡｌｙｚｅR Ｖｅｒ．１．４（ダイナコム）」を用いて行った。

【0038】

（４）試料の収率
試料の収率は以下のように求めた。
試料の収率（％）＝（凍結乾燥後の加圧熱水抽出物の重量／乾燥廃菌床仕込み重量）×１００

【0039】

【表2】

【0040】

【表3】

【0041】

【表4】

【0042】

【表5】

【0043】

上記表２～３及び図２～３のデータから分かるように、キノコの上面栽培後の廃菌床を用いた実施例１～２６は、キノコの全面栽培後の廃菌床を用いた比較例１～１７に比べて、ＤＰＰＨラジカルを消去するＩＣ５０が半分以下となっており、ラジカル活性が高かった。特に、飽和水蒸気圧以上の圧力下で、加圧熱水と接触させて加圧熱水抽出物を抽出する工程Ａにおいて、加圧熱水の温度が６４℃超、かつ１１３℃以下の範囲である実施例３～７は、ＤＰＰＨラジカルを消去するＩＣ５０が１００ｍｇ／Ｌ以下であり、ラジカル活性が極めて高かった。

【0044】

また、表２～３のデータから分かるように、６４℃超、かつ１１３℃以下の範囲の加圧熱水で抽出した試料番号２０～２４（実施例３～７）の加圧熱水抽出物（ヘミセルロース分解産物、セルロース分解産物及び菌糸体由来のβ-グルカン分解産物の溶出が少ないリグニン分解物溶出画分と推定される）の合計収率は６．６％であった。１１７℃超、かつ１６９．７℃以下の範囲の加圧熱水で抽出した試料番号３１～３６（実施例１４～１９）の加圧熱水抽出物（ヘミセルロース分解産物が豊富なリグニン分解物溶出画分と推定される）の合計収率は１３．３％であった。１６９．７℃超、かつ２３３℃以下の範囲の加圧熱水で抽出した試料番号３７～４３（実施例２０～２６）の加圧熱水抽出物（セルロース分解産物及び菌糸体由来のβ-グルカン分解産物が豊富なリグニン分解物溶出画分溶出画分と推定される）の合計収率は２３．９％であった。これらの結果は飽和蒸気圧以上の蒸気圧下で昇温処理により難溶性のリグニン、ヘミセルロース、グルカンが順次、効率よく抽出されていることを示唆している。

【0045】

図４のＩＲスペクトルにおいて、１７２０ｃｍ^-1付近のピークは、カルボキシ基のＣ＝Ｏ伸縮を伴うグアイアシル環（リグニンの構成単位のひとつ）振動を意味し、１５１０ｃｍ^-1付近のピークはベンゼン環振動を意味し、１２６０ｃｍ^-1付近のピークは、カルボキシ基のＣ－Ｏ伸縮、フェノールＣ－Ｏ－Ｈ変角、及びカルボキシ基のＣ＝Ｏ伸縮を伴うグアイアシル環振動を意味し、９００ｃｍ^-1付近のピークは、セルロースのＣ－Ｈ変角、糖単位のβ－構造（グリコシド結合のＣ－Ｏ－Ｃ伸縮）を意味する。
７０～１２０℃の範囲の加圧熱水で抽出した実施例５の加圧熱水抽出物で検出された１２６０ｃｍ^-1付近のピークは、Ｃ＝Ｏ伸縮を伴うグアイアシル環（リグニンの構成単位のひとつ）振動を意味する。
１４５～１７０℃の範囲の加圧熱水で抽出した実施例１５及び２０５～２３５℃の範囲の加圧熱水で抽出した実施例２１の加圧熱水抽出物で検出された１２６０ｃｍ^-1付近のピークは１７２０ｃｍ^-1付近のピークとの連動性もみられることから、Ｃ＝Ｏ伸縮を伴うグアイアシル環振動以外にヘミセルロース分解産物、セルロース分解産物およびβ－グルカン分解産物由来のＣＯＯＨの影響も示唆される。ピーク強度は、実施例１５の方が高い。
９００ｃｍ^-1付近のピークはβ－グルカン（木質由来セルロース、菌糸体由来β－グルカン）により生じるオリゴ糖のグリコシド結合のＣ－Ｏ－Ｃ伸縮に起因しており、リグニンに関係する１５１０ｃｍ^-1（ベンゼン環振動）付近のピーク強度と９００ｃｍ^-1のピーク強度との比（１５１０ｃｍ^-1付近のピーク強度／９００ｃｍ^-1のピーク強度）が、実施例５（１．２０）＞実施例１５（０．９３）＞実施例２１（０．７９）であったことから、この順に芳香族成分が減り、糖成分が増えたと推察される。実施例５、実施例１５、及び実施例２１の順にラジカル消去活性が減少していることから、糖成分が加圧熱水抽出物のラジカル消去活性を阻害すると推察される。

【0046】

上記表４から分かるように、実施例１４～２６の加圧熱水抽出物は、表４示す励起波長（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）および蛍光波長（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）を持つ５つの成分に分離される。図５に、実施例１４～２６の加圧熱水抽出物における成分Ｃ３のスコア（蛍光成分濃度に対応する量）を示した。成分Ｃ３はチロオシン、フェニルアラニンあるいは微生物によって生成された低分子の芳香化合物に帰属される蛍光特性を有する画分であることから、リグニン-炭水化物複合体（ＬＣＣ）に富んだ画分であると推察される。ＬＣＣの抗酸化活性はオリゴ糖の共存により阻害される（International Journal of Biological Macromolecules 2019, Vol139, 21-29）ことから、β－グルカン分解産物以外にＬＣＣとオリゴ糖に富んだ画分であることを示唆している。

【符号の説明】

【0047】

１ 加圧熱水処理装置１
２ 窒素ボンベ
３ 高圧ポンプ
４ 反応器
５ 冷却器
６ 保圧弁
７ バルブ
８ 熱電対
９ 配管
１０ オイルバス
１１ 加熱コイル
１２ 水
１３ 処理液受け

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】