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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023105705
(43)【公開日】2023-07-31
(54)【発明の名称】抗菌性ポリペプチド、抗菌性組成物および医薬組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 15/31 20060101AFI20230724BHJP
C07K 14/195 20060101ALI20230724BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230724BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230724BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20230724BHJP
A61P 17/10 20060101ALI20230724BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20230724BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20230724BHJP
A61K 8/64 20060101ALI20230724BHJP
【ＦＩ】
C12N15/31
C07K14/195 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/21
C12P21/02 C
A61P17/10
A61K38/16
A61Q19/00
A61K8/64
【審査請求】有
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022006699
(22)【出願日】2022-01-19
(11)【特許番号】
(45)【特許公報発行日】2023-05-02
(71)【出願人】
【識別番号】592068200
【氏名又は名称】学校法人東京薬科大学
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(72)【発明者】
【氏名】中瀬 恵亮
(72)【発明者】
【氏名】小泉 珠理
(72)【発明者】
【氏名】中南 秀将
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C083
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG30
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA02
4B064DA20
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA34
4B065CA44
4B065CA50
4C083AD411
4C083AD412
4C083CC02
4C083EE14
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA07
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA20
4C084BA23
4C084CA04
4C084DA41
4C084MA63
4C084NA14
4C084ZA891
4C084ZA892
4H045AA10
4H045AA20
4H045CA11
4H045DA83
4H045EA15
4H045EA29
4H045FA74
(57)【要約】 （修正有）
【課題】抗菌性ポリペプチド、および、当該ポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【解決手段】（ａ）グラム陽性菌の増殖を抑制する活性を有し、かつ、（ｂ）以下のいずれかであるポリペプチドに関する：（ｉ）特定のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、（ｉｉ）特定のアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、（ｉｉｉ）特定の塩基配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、（ｉｖ）特定の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされる、（ｖ）特定の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる、および（ｖｉ）特定の塩基配列の縮重異性体からなるＤＮＡによってコードされる。
【選択図】なし
【解決手段】（ａ）グラム陽性菌の増殖を抑制する活性を有し、かつ、（ｂ）以下のいずれかであるポリペプチドに関する：（ｉ）特定のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、（ｉｉ）特定のアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、（ｉｉｉ）特定の塩基配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、（ｉｖ）特定の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされる、（ｖ）特定の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる、および（ｖｉ）特定の塩基配列の縮重異性体からなるＤＮＡによってコードされる。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）グラム陽性菌の増殖を抑制する活性を有し、かつ、
（ｂ）以下：
（ｉ）配列番号１または２のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、
（ｉｉ）配列番号１または２のアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
（ｉｉｉ）配列番号３または４の塩基配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
（ｉｖ）配列番号３または４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡによってコードされる、
（ｖ）配列番号３または４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる、および
（ｖｉ）配列番号３または４の塩基配列の縮重異性体からなるＤＮＡによってコードされる
のいずれかである、ポリペプチド。
（ｂ）以下：
（ｉ）配列番号１または２のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、
（ｉｉ）配列番号１または２のアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
（ｉｉｉ）配列番号３または４の塩基配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
（ｉｖ）配列番号３または４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡによってコードされる、
（ｖ）配列番号３または４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる、および
（ｖｉ）配列番号３または４の塩基配列の縮重異性体からなるＤＮＡによってコードされる
のいずれかである、ポリペプチド。
【請求項2】
前記グラム陽性菌が、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｉｒｕｍ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｒｏｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからなる群より選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項3】
Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｄｕｍに由来する、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項4】
前記グラム陽性菌が薬剤耐性を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項6】
請求項５に記載のＤＮＡを含む、プラスミド。
【請求項7】
請求項５に記載のＤＮＡを含む、微生物。
【請求項8】
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属である、請求項７に記載の微生物。
【請求項9】
請求項１～４のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項７もしくは８に記載の微生物を含む、抗菌性組成物。
【請求項10】
請求項１～４のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項７もしくは８に記載の微生物を含む、医薬組成物。
【請求項11】
皮膚疾患の治療および／または予防用である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項12】
前記皮膚疾患が、尋常性ざ瘡（ニキビ）であり、
前記グラム陽性菌が、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓである、請求項１１に記載の医薬組成物。
前記グラム陽性菌が、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓである、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項13】
請求項１～４のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項７もしくは８に記載の微生物を含む、化粧料組成物。
【請求項14】
請求項７または８に記載の微生物を培養することを含む、ポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗菌性ポリペプチド、ならびに、当該ポリペプチドを含む抗菌性組成物および医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
ざ瘡は、多くの人が経験する炎症性の皮膚疾患である。ざ瘡の増悪には、皮脂産生など宿主の内分泌要因に加えて、皮膚常在菌であるＣｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ（Ｃ．ａｃｎｅｓ）（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓとしても既知）の異常増殖が関連している。ざ瘡の治療には、レチノイン酸誘導体および過酸化ベンゾイルなどの面皰改善薬、ならびに、Ｃ．ａｃｎｅｓの除菌を目的とした抗菌薬が使用されている（非特許文献１）。
【0003】
一方で、抗菌薬の多用により薬剤耐性Ｃ．ａｃｎｅｓの増加が世界中で認められている（非特許文献２）。抗菌薬の使用は、Ｃ．ａｃｎｅｓだけでなくＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓなどの他の皮膚常在菌も耐性化させるリスクを有する（非特許文献３）。また、皮膚細菌叢の破綻を引き起こし、他の皮膚疾患を誘発する可能性がある（非特許文献４）。
【0004】
したがって、皮膚疾患、特にざ瘡の治療において、さらなる選択肢が必要とされていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｎ. Ｈａｙａｓｈｉ, Ｈ. Ａｋａｍａｔｓｕ, Ｋ. Ｉｗａｔｓｕｋｉ, Ｒ. Ｓｈｉｍａｄａ－Ｏｍｏｒｉ, Ｃ. Ｋａｍｉｎａｋａ, Ｉ. Ｋｕｒｏｋａｗａ, ｅｔ ａｌ. Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ： Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｃｎｅ ｖｕｌｇａｒｉｓ ２０１７. Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ４５ （２０１８） ８９８－９３５.
【非特許文献2】Ｋ. Ｎａｋａｓｅ, Ｎ. Ｈａｙａｓｈｉ, Ｙ. Ａｋｉｙａｍａ, Ｓ. Ａｏｋｉ, Ｎ. Ｎｏｇｕｃｈｉ. Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａｃｎｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｎ Ｊａｐａｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ２０１３ ａｎｄ ２０１５. Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ４４ （２０１７） １２４８－５４.
【非特許文献3】Ｋ. Ｎａｋａｓｅ, Ａ. Ｙｏｓｈｉｄａ, Ｈ. Ｓａｉｔａ, Ｎ. Ｈａｙａｓｈｉ, Ｓ. Ｎｉｓｈｉｊｉｍａ, Ｈ. Ｎａｋａｍｉｎａｍｉ, ｅｔ ａｌ. ８ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｑｕｉｎｏｌｏｎｅ ｕｓｅ ａｎｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｎｅ ｖｕｌｇａｒｉｓ. Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ４６ （２０１９） ７８２－６.
【非特許文献4】Ｎ.Ｎ. Ｓｃｈｏｍｍｅｒ, Ｒ.Ｌ. Ｇａｌｌｏ. Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ. Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２１ （２０１３） ６６０－８.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、抗菌性ポリペプチド、および、当該ポリペプチドを含む医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
皮膚常在菌は、様々な菌種から構成されており、その一部は、代謝物およびバクテリオシンなどの抗菌性ペプチドを産生することによって、病原性細菌の定着を阻害し、皮膚細菌叢を維持している（参考文献５および６）。例えば、皮膚に存在するコアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ｃｏａｇｕｌａｓｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ；ＣｏＮＳ）として、Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳ．ｈｏｍｉｎｉｓが挙げられるが、これらは、病原性細菌Ｓ．ａｕｒｅｕｓの増殖抑制作用を有するバクテリオシンであるｇａｌｌｉｄｅｒｍｉｎ、ｅｐｉｄｅｒｍｉｎおよびｈｏｍｉｎｉｃｉｎをそれぞれ産生し、皮膚の健康に維持に関与している可能性が示されている（参考文献７および８）。しかしながら、抗菌活性および抗菌物質の産生について明らかになっていない皮膚常在菌も存在する。そこで、本発明者らはＣ．ａｃｎｅｓの増殖を抑制する皮膚細菌について探索を行った。
【0008】
本発明者らは、鋭意研究の結果、健常者の皮膚およびざ瘡膿疱から分離した皮膚細菌のうち、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｄｕｍ（Ｃ．ａｖｉｄｕｍ）がＣ．ａｃｎｅｓの増殖を抑制すること、および、Ｃ．ａｖｉｄｕｍは、Ｃ．ａｃｎｅｓの薬剤耐性菌に対しても増殖抑制を示すことを見出した。また、Ｃ．ａｖｉｄｕｍは、Ｃ．ａｃｎｅｓ以外の、数種のグラム陽性細菌に対しても特異的に増殖抑制を示すことが示された。さらに、本発明者らは、グラム陽性細菌の増殖を阻害するＣ．ａｖｉｄｕｍ株のゲノムを解析した結果、非阻害株には認められない新規のポリペプチドをコードする遺伝子クラスターを見出した。本発明は、これらの知見に基づき成されたものである。
【0009】
即ち、本発明は以下のとおりである：
［１］（ａ）グラム陽性菌の増殖を抑制する活性を有し、かつ、
（ｂ）以下：
（ｉ）配列番号１または２のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、
（ｉｉ）配列番号１または２のアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
（ｉｉｉ）配列番号３または４の塩基配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
（ｉｖ）配列番号３または４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡによってコードされる、
（ｖ）配列番号３または４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる、および
（ｖｉ）配列番号３または４の塩基配列の縮重異性体からなるＤＮＡによってコードされる
のいずれかである、ポリペプチド；
［２］前記グラム陽性菌が、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｉｒｕｍ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｒｏｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからなる群より選択される、［１］に記載のポリペプチド；
［３］Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｄｕｍに由来する、［１］または［２］に記載のポリペプチド；
［４］前記グラム陽性菌が薬剤耐性を有する、［１］～［３］のいずれか１項に記載のポリペプチド；
［５］［１］～［４］のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ；
［６］［５］に記載のＤＮＡを含む、プラスミド；
［７］［５］に記載のＤＮＡを含む、微生物；
［８］Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属である、［７］に記載の微生物；
［９］［１］～［４］のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは［７］もしくは［８］に記載の微生物を含む、抗菌性組成物；
［１０］［１］～［４］のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは［７］もしくは［８］に記載の微生物を含む、医薬組成物；
［１１］皮膚疾患の治療および／または予防用である、［１０］に記載の医薬組成物；
［１２］前記皮膚疾患が、尋常性ざ瘡（ニキビ）であり、
前記グラム陽性菌が、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓである、［１１］に記載の医薬組成物；
［１３］［１］～［４］のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項７もしくは８に記載の微生物を含む、化粧料組成物；
［１４］［７］または［８］に記載の微生物を培養することを含む、ポリペプチドの製造方法。
［１］（ａ）グラム陽性菌の増殖を抑制する活性を有し、かつ、
（ｂ）以下：
（ｉ）配列番号１または２のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、
（ｉｉ）配列番号１または２のアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
（ｉｉｉ）配列番号３または４の塩基配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
（ｉｖ）配列番号３または４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡによってコードされる、
（ｖ）配列番号３または４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる、および
（ｖｉ）配列番号３または４の塩基配列の縮重異性体からなるＤＮＡによってコードされる
のいずれかである、ポリペプチド；
［２］前記グラム陽性菌が、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｉｒｕｍ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｒｏｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからなる群より選択される、［１］に記載のポリペプチド；
［３］Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｄｕｍに由来する、［１］または［２］に記載のポリペプチド；
［４］前記グラム陽性菌が薬剤耐性を有する、［１］～［３］のいずれか１項に記載のポリペプチド；
［５］［１］～［４］のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ；
［６］［５］に記載のＤＮＡを含む、プラスミド；
［７］［５］に記載のＤＮＡを含む、微生物；
［８］Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属である、［７］に記載の微生物；
［９］［１］～［４］のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは［７］もしくは［８］に記載の微生物を含む、抗菌性組成物；
［１０］［１］～［４］のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは［７］もしくは［８］に記載の微生物を含む、医薬組成物；
［１１］皮膚疾患の治療および／または予防用である、［１０］に記載の医薬組成物；
［１２］前記皮膚疾患が、尋常性ざ瘡（ニキビ）であり、
前記グラム陽性菌が、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓである、［１１］に記載の医薬組成物；
［１３］［１］～［４］のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項７もしくは８に記載の微生物を含む、化粧料組成物；
［１４］［７］または［８］に記載の微生物を培養することを含む、ポリペプチドの製造方法。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、抗菌性ポリペプチド、および、当該ポリペプチドを含む医薬組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】Ｃ．ａｖｉｄｕｍによるＣ．ａｃｎｅｓ ＡＴＣＣ６９１９に対する増殖抑制作用を示す図である。（ａ）にはＣ．ａｖｉｄｕｍ ＡＴＣＣ２５５７７を、（ｂ）にはＣ．ａｖｉｄｕｍ ＴＰ－ＣＶ４を、（ｃ）にはＣ．ａｖｉｄｕｍ ＴＰ－ＣＶ１４を添加した。
【図2】Ｃ．ａｖｉｄｕｍ ＡＴＣＣ２５５７７によるＣ．ａｃｎｅｓ臨床分離株に対する増殖抑制作用を示す図である。５０ｃ、１３８ａ、１３２ｃおよび２０ｂはマクロライド－クリンダマイシン耐性株、４４ｂはキノロン耐性株であり、２５ｃはテトラサイクリン耐性株、１０１ｂおよび１０２ａは薬剤感受性株である。
【図3】静置培養において、異なる菌量のＣ．ａｖｉｄｕｍと混合したＣ．ａｃｎｅｓの増殖曲線を示す。菌量比は、Ｃ．ａｖｉｄｕｍ：Ｃ．ａｃｎｅｓを示す。
【図4】本発明にかかるポリペプチドの遺伝子オペロンを示す図である。
【図5】本発明にかかるポリペプチド（アビダマイシン）と他の環状バクテリオシンとのアミノ酸配列を比較した図である。
【図6】本発明にかかるポリペプチドのアミノ酸配列および当該アミノ酸配列をコードする塩基配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、本発明を実施するための形態について具体的に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【0013】
本明細書において、「～」を用いて示される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。本明細書に段階的に記載されている数値範囲において、ある段階の数値範囲の上限値又は下限値は、他の段階の数値範囲の上限値又は下限値と任意に組み合わせることができる。
【0014】
本明細書に記述されているＤＮＡの取得、ベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ２０１２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、遺伝子工学実験ノート （羊土社 田村隆明）等に記載されている当該分野で既知の方法により行なうことができる。本明細書において特に断りのない限りヌクレオチド配列は５’から３’方向に向けて記載される。本明細書において、「ポリペプチド」および「タンパク質」の語は、互換可能に使用される。
【0015】
本明細書において、参照アミノ酸配列に対する比較アミノ酸配列の「配列同一性」の割合（％）は、これら２つの配列間の同一性が最大となるように配列を整列させ、必要であれば２つの配列の一方または双方にギャップが導入されたときの、参照配列中のアミノ酸残基と同一である、比較配列中のアミノ酸残基の百分率として定義される。このとき、保存的置換は配列同一性の一部として考慮しない。配列同一性は、公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することによって決定することができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）等のアライメントサーチツールを用いて決定することができる。当業者は、アラインメントにおいて、比較配列の最大のアラインメントを得るために適切なパラメーターを決定することができる。塩基配列の「配列同一性」についても、同様の方法によって決定することができる。
【0016】
本明細書において、「内因」または「内因性」の用語は、遺伝子組換えによる改変がなされていない宿主微生物が、言及された遺伝子またはそれによりコードされるタンパク質を、当該宿主細胞内で優位な生化学的反応を進行させ得る程度に機能的に発現しているかどうかに関わらず、宿主微生物が有していることを意味するために用いられる。「内因性」および「内在性」の用語は、本明細書において互換可能に用いられる。また、本明細書において、「外来」または「外来性」の用語は、遺伝子組換えによる改変がなされていない宿主微生物が、言及された遺伝子を有していない場合、またはその遺伝子によりコードされるタンパク質を実質的に発現しない場合、または異なる遺伝子により当該タンパク質のアミノ酸配列をコードしているが、形質転換後に匹敵する内因性タンパク質の活性を発現しない場合において、本発明に基づく遺伝子配列を宿主微生物に導入することを意味するために用いられる。「外来性」および「外因性」の用語は、本明細書において互換可能に用いられる。
【0017】
本発明者らは、健常者の皮膚およびざ瘡膿疱から分離した１２２株の皮膚細菌のうち、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｄｕｍ（Ｃ．ａｖｉｄｕｍ）が、薬剤耐性株を含むＣ．ａｃｎｅｓの増殖を抑制した。加えて、いくつかのグラム陽性菌の増殖を抑制することを見出した。グラム陽性菌の増殖を阻害するＣ．ａｖｉｄｕｍ株をゲノム解析した結果、増殖を阻害しない非阻害株には認められない新規の抗菌性ポリペプチド（以下、アビダマイシン（ａｖｉｄａｍｉｃｉｎ）とも称する。）をコードする遺伝子クラスターが存在することを見出した。
【0018】
したがって、本発明の第１の側面は、抗菌性ポリペプチドに関する。本発明にかかるポリペプチドは、グラム陽性菌の増殖を抑制する活性を有する。グラム陽性菌の増殖を抑制する活性とは、本発明にかかるポチペプチドをグラム陽性菌に添加しない場合と比較して、グラム陽性菌の増殖を低下させる活性をいう。グラム陽性菌に関し、「増殖を抑制する活性」の語は、「増殖抑制活性」または「増殖阻害活性」とも称され、これらの語は互換可能に用いられる。
【0019】
本発明にかかるポリペプチドによって増殖が抑制されるグラム陽性菌は、具体的には、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する。
【0020】
一態様において、グラム陽性菌は、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｉｒｕｍ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｒｏｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからなる群より選択される。
【0021】
例えば、グラム陽性菌がＣｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ（Ｃ．ａｃｎｅｓ）である場合、Ｃ．ａｃｎｅｓ増殖抑制活性は、試験プレート上に播種したＣ．ａｃｎｅｓに対し、本発明にかかるＣ．ａｖｉｄｕｍ株もしくはポリペプチドを添加し、一定の培養時間の後（例えば、３５℃、嫌気条件下で４８時間培養後）にＣ．ａｃｎｅｓに対して増殖阻止円が形成される場合、Ｃ．ａｃｎｅｓ増殖抑制活性があると判断することができる。あるいは、液体培地で混合培養した時に、増殖したＣ．ａｃｎｅｓの菌量を非添加群と比較することで決定することができる。上記方法は、以下で説明する本発明にかかる微生物によるＣ．ａｃｎｅｓ増殖抑制活性についても同様に適用することができる。ここで示した増殖抑制の確認方法は、Ｃ．ａｃｎｅｓ以外のグラム陽性菌の増殖抑制の確認にも用いることができる。
【0022】
ざ瘡患者から分離されるＣ．ａｃｎｅｓ株は薬剤耐性を有するものも多く認められる。本発明にかかるポリペプチドは、薬剤耐性を有するグラム陽性菌、特に、薬剤耐性を有するＣ．ａｃｎｅｓに対しても増殖抑制活性を有する。薬剤耐性とは、抗生物質による抗菌作用に抵抗性を示すことをいい、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（ＡＭＲ）とも称される。抗生物質としては、例えば、マクロライド系、リンコマイシン系、キノロン系、テトラサイクリン系、β－ラクタム系およびアミノグリコシド系の抗生物質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。薬剤耐性は、複数の抗生物質に耐性を有する、多剤耐性であってもよい。
【0023】
配列に関し、本発明にかかるポリペプチドは、以下のいずれかである：
（ｉ）配列番号１または２のアミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、
（ｉｉ）配列番号１または２のアミノ酸配列に対して１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～７個、１～５個または１～３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
（ｉｉｉ）配列番号３または４の塩基配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～７個、１～５個または１～３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
（ｉｖ）配列番号３または４の塩基配列と８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡによってコードされる、
（ｖ）配列番号３または４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる、および
（ｖｉ）配列番号３または４の塩基配列の縮重異性体からなるＤＮＡによってコードされる。
（ｉ）配列番号１または２のアミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、
（ｉｉ）配列番号１または２のアミノ酸配列に対して１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～７個、１～５個または１～３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
（ｉｉｉ）配列番号３または４の塩基配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～７個、１～５個または１～３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
（ｉｖ）配列番号３または４の塩基配列と８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡによってコードされる、
（ｖ）配列番号３または４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる、および
（ｖｉ）配列番号３または４の塩基配列の縮重異性体からなるＤＮＡによってコードされる。
【0024】
ここで、配列番号１は、配列番号３の塩基配列から翻訳されるアミノ酸配列であり、配列番号２は、配列番号３の１～１０５番目の塩基から翻訳されるアミノ酸を含まないアミノ酸配列である（図６）。配列番号１からなるポリペプチドおよび配列番号２からなるポリペプチドのいずれも抗菌活性を有すると予想され、特にＮ末端の１９アミノ酸が活性に大きく関連すると推測される。
【0025】
配列に関し、本発明にかかるポリペプチドは、好ましくは、以下のいずれかである：
（ｉ）配列番号１または２のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、
（ｉｉ）配列番号１または２のアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
（ｉｉｉ）配列番号３または４の塩基配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
（ｉｖ）配列番号３または４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡによってコードされる、
（ｖ）配列番号３または４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる、および
（ｖｉ）配列番号３または４の塩基配列の縮重異性体からなるＤＮＡによってコードされる。
（ｉ）配列番号１または２のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、
（ｉｉ）配列番号１または２のアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
（ｉｉｉ）配列番号３または４の塩基配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなる、
（ｉｖ）配列番号３または４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡによってコードされる、
（ｖ）配列番号３または４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってコードされる、および
（ｖｉ）配列番号３または４の塩基配列の縮重異性体からなるＤＮＡによってコードされる。
【0026】
本明細書において、「緊縮条件」とは、例えば、「１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６８℃」程度の条件である。
【0027】
配列に関し、本発明にかかるポリペプチドは、より好ましくは、以下のいずれかである：
（ｘｉ）配列番号１または２のアミノ酸配列からなる、および
（ｘｉｖ）配列番号３または４の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされる。
（ｘｉ）配列番号１または２のアミノ酸配列からなる、および
（ｘｉｖ）配列番号３または４の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされる。
【0028】
本発明にかかるポリペプチドは、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物、具体的には、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｄｕｍに由来する。本発明にかかるポリペプチドは、より好ましくは、Ｃ．ａｖｉｄｕｍ ＡＴＣＣ２５５７７株およびＣ．ａｖｉｄｕｍ ＴＰ－ＣＶ１４株に由来する。本明細書において、「由来する」とは、遺伝子またはそれによりコードされるポリペプチドが、言及する特定の生物種が内因的に有しているものであることを意味する。
【0029】
本発明にかかるポリペプチドは、一態様において、環状構造を有していてもよい。例えば、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド、および、配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるポリペプチドは、環状構造を有する。
【0030】
本発明の第２の側面は、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡに関する。また本発明の別の側面は、当該ＤＮＡを含むプラスミド、および、当該ＤＮＡを含む微生物に関する。
【0031】
プラスミドは、前記ＤＮＡを導入した遺伝子組換えプラスミドであってよく、また、微生物は、前記ＤＮＡを宿主微生物（例えば受容菌株）に導入した遺伝子組換え微生物であってもよい。すなわち、上記のポリペプチドの外来性遺伝子を導入した遺伝子組換えプラスミドおよび遺伝子組換え微生物も、本発明の範囲に包含される。ここで、「遺伝子組換えプラスミド」および「遺伝子組換え微生物」は、それぞれ、単に「組換えプラスミド」および「組換え微生物」とも称される。
【0032】
本明細書において、「宿主微生物」および「宿主」の用語は、本明細書で互換可能に用いられる。一例において、「宿主微生物」の語は、プラスミドが形質転換によって導入される、受容菌株を示す。本発明の宿主微生物は、既に単離保存されているもの、新たに天然から分離したもの、および、遺伝子改変を行ったもの、いずれをも任意に選択することができる。
【0033】
例えば、宿主微生物は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物が使用される。したがって、本発明にかかる組換え微生物は、例えば、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する。宿主微生物の具体例としては、例えばＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓが挙げられる。
【0034】
一態様において、本発明にかかる組換えプラスミドまたは組換え微生物は、以下：
（ｉｖ）配列番号３または４の塩基配列と８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｖ）配列番号３または４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、および
（ｖｉ）配列番号３または４の塩基配列の縮重異性体からなるＤＮＡ
のいずれかを含む。
（ｉｖ）配列番号３または４の塩基配列と８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｖ）配列番号３または４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、および
（ｖｉ）配列番号３または４の塩基配列の縮重異性体からなるＤＮＡ
のいずれかを含む。
【0035】
好ましい態様において、本発明にかかる組換えプラスミドまたは組換え微生物は、以下：
（ｉｖ）配列番号３または４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｖ）配列番号３または４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、および、
（ｖｉ）配列番号３または４の塩基配列の縮重異性体からなるＤＮＡ
のいずれかを含む。
（ｉｖ）配列番号３または４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｖ）配列番号３または４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡと緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、および、
（ｖｉ）配列番号３または４の塩基配列の縮重異性体からなるＤＮＡ
のいずれかを含む。
【0036】
より好ましい態様において、本発明にかかる組換えプラスミドまたは組換え微生物は、
（ｘｉｖ）配列番号３または４の塩基配列からなるＤＮＡ
を含む。
（ｘｉｖ）配列番号３または４の塩基配列からなるＤＮＡ
を含む。
【0037】
本発明の第３の側面は、先述の微生物を培養することを含む、ポリペプチドの製造方法に関する。具体的には、当該製造方法は、先述の微生物を培養して、当該改変微生物の培養物および／または培養物の抽出物を得る培養工程を含む。当該製造方法は、前記培養物および／または前記培養物の抽出物から、抗菌性ポリペプチドを回収する回収工程をさらに含んでもよい。
【0038】
培養工程に関し、培地組成および培養条件は、目的のポリペプチドの生産、ならびに、微生物の生育および維持の観点から、当業者が適宜選択および設定することができる。
【0039】
回収工程は、分離および／または精製を目的とした任意の手法により行われる。例えば、遠心分離、膜ろ過、膜分離、晶析、抽出、蒸留、吸着、相分離、イオン交換、および、各種のクロマトグラフィーといった手法が挙げられるが、これらに限定されない。分離および／または精製は、一つの手法を選択してもよく、あるいは、複数の手法を組み合わせて行ってもよい。
【0040】
本発明にかかる微生物およびその培養物は、例えば、皮膚常在菌、特にＣ．ａｃｎｅｓの異常増殖を抑制することができるため、皮膚疾患の予防に有利に使用できることが期待される。
【0041】
本発明の第４の側面は、先述のポリペプチドまたは先述の微生物を含む組成物に関する。組成物は、薬理学的に許容可能な担体をさらに含んでもよい。組成物中、ポリペプチドは塩の形態で存在してもよい。当該組成物は、例えば、抗菌性組成物である。
【0042】
本発明にかかる組成物は、化粧料組成物または医薬組成物として使用することもできる。
【0043】
一態様において、本発明にかかる化粧料組成物は、先述のポリペプチドまたは先述の微生物を含み、化粧料として許容される担体をさらに含んでもよい。かかる化粧料組成物は、皮膚常在菌、特にＣ．ａｃｎｅｓの異常増殖を抑制し、皮膚の美観を維持および／または向上させることができる。
【0044】
別の一態様において、本発明にかかる医薬組成物は、先述のポリペプチドまたは先述の微生物を含み、薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい。
【0045】
別の好ましい態様において、本発明にかかる医薬組成物は、皮膚疾患の治療および／または予防用の医薬組成物である。皮膚疾患としては、例えば、ざ瘡、毛包炎および酒さが挙げられるが、これらに限定されず、グラム陽性菌、特にＣ．ａｃｎｅｓの異常増殖が関与する皮膚疾患を指す。皮膚疾患は、特には尋常性ざ瘡（ニキビ）である。
【0046】
本明細書において皮膚疾患に関し、「予防」の語には「抑制」も包含される。「抑制」および「予防」の語は共に、皮膚疾患の悪化または進行を予防すること、遅らせることおよび軽減することを意味するものとする。皮膚疾患の「悪化」および「進行」は、疾患部分の数および範囲の増加または拡大が含まれるが、これらに限定されない。
【0047】
皮膚疾患の「予防」および「抑制」は、当該分野で公知の方法に従って評価することができる。例えば、疾患部分の数および範囲、疾患に関与する微生物の生存数、ならびに、疾患に関与する遺伝子の発現などを指標として評価することができる。疾患に関与する微生物の生存数は、例えば、カップ法、ディスク法およびＴｉｍｅ ｋｉｌｌ法を用いて評価することができる。また、遺伝子の発現は、例えば、免疫蛍光染色法、および、ＲＴ－ＰＣＲ法によって確認することができる。
【0048】
以上説明したとおり、本発明によれば、新規な抗菌性ポリペプチドおよび当該ポリペプチドを生産することのできる微生物が提供される。本発明にかかる抗菌性ポリペプチドまたは微生物によれば、皮膚常在菌、特にＣ．ａｃｎｅｓの異常増殖が関与する皮膚疾患の治療用の新規な医薬組成物を提供することができる。本発明にかかる抗菌性ポリペプチドまたは微生物は、ＡＭＲを獲得した皮膚常在菌に対しても増殖抑制効果を示すため、既存の抗生物質による治療が難しい皮膚疾患に対しても代替の治療選択肢を提供することができる。また、本発明にかかるポリペプチドおよび微生物は、特定の皮膚常在菌にのみ作用するため、耐性化および細菌叢の破綻を起こす危険性が低く、この点で医薬組成物の活性成分として有用であると考えられる。さらに、上記ポリペプチドまたは上記微生物を用いることにより、皮膚疾患を事前に予防できる可能性がある。また、皮膚の美観を向上または維持することのできる化粧料も提供することができる。
【実施例0049】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【0050】
＜１＞試料および培養条件
＜１－１＞菌株
皮膚細菌として、２０１４年に健常者の皮膚から得られたブドウ球菌属菌８５株と、２０１３～２０１５年にざ瘡患者検体から分離された嫌気性菌３７株を使用した（参考文献２）。具体的には、Ｃ．ａｃｎｅｓとしては、基準株であるＡＴＣＣ６９１９、および、ざ瘡患者から分離された８株を（参考文献２および１２）、グラム陽性菌としては、基準株であるＣ．ａｖｉｄｕｍ ＡＴＣＣ２５５７７、Ｃ．ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ ＡＴＣＣ２５５６４、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ ＡＴＣＣ１４９９０、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ２９２１３、Ｓ．ｃａｐｉｔｉｓ ＡＴＣＣ２７８４０、Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ ＡＴＣＣ２９９７０、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ ＡＴＣＣ６６３３、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ ＡＴＣＣ１９４３４、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ１９４３３、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ ＡＴＣＣ８０４１、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍＡＴＣＣ１４９１７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ ＡＴＣＣ６９４０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｒｏｓｉｓ ＡＴＣＣ３７３、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ１２３４４およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＡＴＣＣ ＢＡＡ－２５５を、グラム陰性菌としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ８７３９および多剤排出ポンプａｃｒＡＢ欠損株であるＫＡＭ３２を、真菌としては、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＡＴＣＣ１０２３１を使用した。
＜１－１＞菌株
皮膚細菌として、２０１４年に健常者の皮膚から得られたブドウ球菌属菌８５株と、２０１３～２０１５年にざ瘡患者検体から分離された嫌気性菌３７株を使用した（参考文献２）。具体的には、Ｃ．ａｃｎｅｓとしては、基準株であるＡＴＣＣ６９１９、および、ざ瘡患者から分離された８株を（参考文献２および１２）、グラム陽性菌としては、基準株であるＣ．ａｖｉｄｕｍ ＡＴＣＣ２５５７７、Ｃ．ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ ＡＴＣＣ２５５６４、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ ＡＴＣＣ１４９９０、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ２９２１３、Ｓ．ｃａｐｉｔｉｓ ＡＴＣＣ２７８４０、Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ ＡＴＣＣ２９９７０、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ ＡＴＣＣ６６３３、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ ＡＴＣＣ１９４３４、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ１９４３３、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ ＡＴＣＣ８０４１、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍＡＴＣＣ１４９１７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ ＡＴＣＣ６９４０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｒｏｓｉｓ ＡＴＣＣ３７３、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ１２３４４およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＡＴＣＣ ＢＡＡ－２５５を、グラム陰性菌としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ８７３９および多剤排出ポンプａｃｒＡＢ欠損株であるＫＡＭ３２を、真菌としては、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＡＴＣＣ１０２３１を使用した。
【0051】
＜１－２＞培養条件
嫌気性菌であるＣ．ａｃｎｅｓ、Ｃ．ａｖｉｄｕｍ、Ｃ．ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍは、ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＧＡＭ ａｇａｒ（ＮｉｓｓｕｉＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）またはｍｏｄｉｆｉｅｄ ＧＡＭ ｍｅｄｉｕｍ（Ｎｉｓｓｕｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）で３５℃、嫌気条件下で４８～７２時間培養した。
嫌気性菌であるＣ．ａｃｎｅｓ、Ｃ．ａｖｉｄｕｍ、Ｃ．ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍは、ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＧＡＭ ａｇａｒ（ＮｉｓｓｕｉＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）またはｍｏｄｉｆｉｅｄ ＧＡＭ ｍｅｄｉｕｍ（Ｎｉｓｓｕｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）で３５℃、嫌気条件下で４８～７２時間培養した。
【0052】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属菌およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属菌は、Ｂｌｏｏｄ ａｇａｒ［５％Ｄｅｆｉｂｒｉｎａｔｅｄ ｈｏｒｓｅｂｌｏｏｄ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｂｉｏ－Ｔｅｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｉｒｉｅｓ）ａｎｄ １．５％ ａｇａｒ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｏｘｏｉｄ）ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｂｒａｉｎ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ, Ｏｘｏｉｄ）］を用いて、好気条件下および微好気条件下で２４時間培養した。
【0053】
その他の菌種は、ｔｒｙｐｔｏｎｅ ｓｏｙａａｇａｒ ［１．５％ ａｇａｒ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｔｒｙｐｔｏｎｅ ｓｏｙａｂｒｏｔｈ （ＴＳＢ, Ｏｘｏｉｄ）］またはＴＳＢを用いて３５℃、好気条件下で２４時間培養した。
【0054】
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＭＧ１３６３は、Ｍ１７培地（ＢＤ, Ｓｐａｒｋｓ, ＭＤ）に０．５％ ｇｌｕｃｏｓｅを添加したＧＭ１７培地を用いて、好気条件下、３０℃で２４時間培養した。
【0055】
＜２＞試験方法および結果
＜２－１＞皮膚細菌のＣ．ａｃｎｅｓに対する増殖抑制活性
増殖抑制作用は、増殖阻止円形成の有無を判定することで評価した。試験プレートは、０．７５％ ａｇａｒ含有ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＧＡＭ ｍｅｄｉｕｍに、Ｃ．ａｃｎｅｓ ＡＴＣＣ６９１９を接種し、ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＧＡＭ ａｇａｒに重層することで作製した。直径８ｍｍの穴を試験プレートに空け、１５０μＬの各種培養菌液を滴下した。試験プレートは３５℃、嫌気条件下で４８時間培養後に判定した。Ｃ．ａｃｎｅｓに対して増殖阻止円を形成した菌株をＣ．ａｃｎｅｓ増殖阻害株と定義した（図１）。
＜２－１＞皮膚細菌のＣ．ａｃｎｅｓに対する増殖抑制活性
増殖抑制作用は、増殖阻止円形成の有無を判定することで評価した。試験プレートは、０．７５％ ａｇａｒ含有ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＧＡＭ ｍｅｄｉｕｍに、Ｃ．ａｃｎｅｓ ＡＴＣＣ６９１９を接種し、ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＧＡＭ ａｇａｒに重層することで作製した。直径８ｍｍの穴を試験プレートに空け、１５０μＬの各種培養菌液を滴下した。試験プレートは３５℃、嫌気条件下で４８時間培養後に判定した。Ｃ．ａｃｎｅｓに対して増殖阻止円を形成した菌株をＣ．ａｃｎｅｓ増殖阻害株と定義した（図１）。
【0056】
試験した１２２株の皮膚常在菌の中から、Ｃ．ａｃｎｅｓの増殖阻害株が２８株（２３．０％）得られた（図１）。特に、ほとんどのＣ．ａｖｉｄｕｍ（８９．７％，２６／２９）がＣ．ａｃｎｅｓＡＴＣＣ６９１９の増殖を抑制した。そこで、これ以降はそのほとんどがＣ．ａｃｎｅｓの増殖を抑制したＣ．ａｖｉｄｕｍの基準株ＡＴＣＣ２５５７７を用いて研究を行った。
【0057】
＜２－２＞Ｃ．ａｖｉｄｕｍおよびＣ．ａｃｎｅｓの共培養
ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＧＡＭ ｍｅｄｉｕｍで、４８時間振とう培養したＣ．ａｃｎｅｓ ＡＴＣＣ６９１９およびＣ．ａｖｉｄｕｍ ＡＴＣＣ２５５７７を、１：１、１：１０、１：１００および１：１０００の菌量比となるように混合した。
ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＧＡＭ ｍｅｄｉｕｍで、４８時間振とう培養したＣ．ａｃｎｅｓ ＡＴＣＣ６９１９およびＣ．ａｖｉｄｕｍ ＡＴＣＣ２５５７７を、１：１、１：１０、１：１００および１：１０００の菌量比となるように混合した。
【0058】
菌数測定を行うために、Ｃ．ａｖｉｄｕｍ ＡＴＣＣ２５５７７およびＣ．ａｃｎｅｓ ＡＴＣＣ６９１９に、それぞれｒｉｆａｍｐｉｃｉｎおよびｃｌａｒｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ耐性を付与した（参考文献１３および１４）。静置条件での共培養の後、残存Ｃ．ａｃｎｅｓの菌数を測定した。１μｇ/ｍＬ ｃｌａｒｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ（Ｔｏｋｙｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）含有ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＧＡＭ ａｇａｒおよび１０μｇ／ｍＬ ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ）含有ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＧＡＭ ａｇａｒに増殖したコロニーを、それぞれＣ．ａｃｎｅｓおよびＣ．ａｖｉｄｕｍとして測定した。結果は、３回の独立した実験の平均±標準偏差として図３に示した。
【0059】
Ｃ．ａｖｉｄｕｍ ＡＴＣＣ２５５７７のＣ．ａｃｎｅｓに対する増殖阻害作用を液体培地での共培養で検討した結果、菌量依存的な殺菌作用が認められた（図３）。特に、Ｃ．ａｃｎｅｓの１０倍以上の菌量のＣ．ａｖｉｄｕｍを混合すると、４８時間後にはＣ．ａｃｎｅｓは検出限界以下まで減少した。従って、Ｃ．ａｖｉｄｕｍのＣ．ａｃｎｅｓに対する増殖阻害作用は寒天培地上および液体培地での非振とう培養などの静置条件で発現することが示唆された。
【0060】
＜２－３＞Ｃ．ａｖｉｄｕｍの増殖抑制活性の菌種特異性
各種の細菌および真菌に対してＣ．ａｖｉｄｕｍ ＡＴＣＣ２５５７７の増殖阻害作用は、前述と同様に増殖阻止円形成の有無を判定することで評価した。結果は、３回の独立した実験の平均±標準偏差として示した。
各種の細菌および真菌に対してＣ．ａｖｉｄｕｍ ＡＴＣＣ２５５７７の増殖阻害作用は、前述と同様に増殖阻止円形成の有無を判定することで評価した。結果は、３回の独立した実験の平均±標準偏差として示した。
【0061】
Ｃ．ａｖｉｄｕｍ ＡＴＣＣ２５５７７は、薬剤耐性株を含む８株すべてのＣ．ａｃｎｅｓ臨床分離株の増殖を阻害した（図２）。加えて、菌種特異性を明らかにするために、種々の菌種に対するＣ．ａｖｉｄｕｍ ＡＴＣＣ２５５７７による増殖抑制作用を試験した（表１）。その結果、皮膚常在菌であるＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳ．ａｕｒｅｕｓの増殖阻害効果は認められなかった。一方、皮膚常在菌であるＣｕｔｉｂａｃｔｅｉｒｕｍ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍの増殖を抑制した。加えて、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ、Ｃ．ｘｅｒｏｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの増殖を阻害することが示された。
【0062】
【表1】
【0063】
＜２－４＞全ゲノム比較分析
Ｃ．ａｃｎｅｓ阻害Ｃ．ａｖｉｄｕｍ株ＴＰ－ＣＶ１４（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＰ０２４３０９)と非阻害Ｃ．ａｖｉｄｕｍ株ＴＰ－ＣＶ４（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＰ０２４３０８））のゲノムをＧｅｎｅｉｏｕｓ Ｐｒｉｍｅ ｖｅｒ. ２０１９．２.３（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ，Ａｕｃｋｌａｎｄ，Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）を用いて比較した。Ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）、アミノ酸配列は、Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）およびＰＤＢｓｕｍを用いて解析した。ＰＤＢｓｕｍで得られたタンパク質の配列と各ＯＲＦのタンパク質をＧＥＮＥＴＹＸ ｖｅｒ．１０．１．０のＬｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法を用いたホモロジー解析で比較し、遺伝子機能を推定した。また、アミノ酸配列はＧＥＮＥＴＹＸ ｖｅｒ．１０．１．０のｃｌｕｓｔａｌ Ｗ２を使用して比較した。
Ｃ．ａｃｎｅｓ阻害Ｃ．ａｖｉｄｕｍ株ＴＰ－ＣＶ１４（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＰ０２４３０９)と非阻害Ｃ．ａｖｉｄｕｍ株ＴＰ－ＣＶ４（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＰ０２４３０８））のゲノムをＧｅｎｅｉｏｕｓ Ｐｒｉｍｅ ｖｅｒ. ２０１９．２.３（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ，Ａｕｃｋｌａｎｄ，Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）を用いて比較した。Ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）、アミノ酸配列は、Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）およびＰＤＢｓｕｍを用いて解析した。ＰＤＢｓｕｍで得られたタンパク質の配列と各ＯＲＦのタンパク質をＧＥＮＥＴＹＸ ｖｅｒ．１０．１．０のＬｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法を用いたホモロジー解析で比較し、遺伝子機能を推定した。また、アミノ酸配列はＧＥＮＥＴＹＸ ｖｅｒ．１０．１．０のｃｌｕｓｔａｌ Ｗ２を使用して比較した。
【0064】
抗菌作用関連遺伝子を同定するために、Ｃ．ａｃｎｅｓ阻害Ｃ．ａｖｉｄｕｍ ＴＰ－ＣＶ１４株と非阻害Ｃ．ａｃｎｅｓ ＴＰ－ＣＶ４株のゲノムを比較し、抗菌作用に関与すると予想される遺伝子領域を特定した（図４）。遺伝子クラスター（４，８９９ ｂｐ）は、アミノ酸数９４の抗菌性タンパク質（ＭＷ：９，１２６.７）をコードするｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ （ＯＲＦ）を含む８個のＯＲＦで構成されており、それぞれのＯＲＦを、ａｖｄＡからａｖｄＨと名付けた。この抗菌性タンパク質をアビダマイシンと命名した。アビダマイシンをコードするａｖｄＡは、Ｃ．ａｃｎｅｓに対し増殖阻害作用を示したすべてのＣ．ａｖｉｄｕｍ株から検出された。そこで、アビダマイシン生合成遺伝子クラスターをＥ．ｃｏｌｉ－ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓのシャトルベクターであるｐＭＧ３６ｅにクローニングし、Ｌ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３に導入した結果、形質転換体Ｌ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３はＣ．ａｃｎｅｓの増殖を抑制した。従って、アビダマイシン生合成伝子クラスターがＣ．ａｃｎｅｓへの抗菌活性に関連することが示された。
【0065】
次いで、アビダマイシン生合成クラスターに含まれるＯＲＦの役割を推定するため、各ＯＲＦのタンパク質の配列相同性をＰＢＤｓｕｍで検索し、相同性および類似性を算出した（図４）。アビダマイシンをコードするａｖｄＡに加えて、他のバクテリオシンの遺伝子クラスターと同様に、膜タンパク質、ならびに、バクテリオシンの菌体外への排出および免疫に関連するトランスポーターが認められた。ＡｖｄＡのアミノ酸配列をＰＢＤｓｕｍで検索したところ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓが産生する環状バクテリオシンであるｅｎｔｅｒｏｃｉｎｓ ＮＫＲ－５－３ｂ （ＰＤＩ ｉｄ： ２ｍｐ８）およびｚ－ｓｃｏｒｅ １８２．１を示した（表２）。
【0066】
【表2】
【0067】
環状バクテリオシンはリーダーペプチドである頭部が切断されたのち、頭部と尾部が環化する（参考文献１６）。アビダマイシンのリーダーペプチドを推定するために、既知の環状バクテリオシンとの配列相同性を解析した（表２および図５）。その結果、アビダマイシンのリーダーペプチドは３５アミノ酸残基であることが推定された。推定領域におけるリーダーペプチド切断後のアビダマイシンは、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ＴＫ４１４０１が産生するｌｅｕｃｏｃｙｃｌｉｃｉｎ Ｑ（参考文献１７）と最も高い相同性を示した（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ７８．０ ％, ｉｄｅｎｔｉｔｙ ３７．３％）（表２）。
【0068】
ＴＰ－ＣＶ４とＣＰ－ＣＶ１４との比較により、Ａｎｔｉ－ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎをコードすると推定される遺伝子領域の特異的プライマー：
ABP-F: 5‘-CAGTTGTCGGCGTTATGCTG-3’ （配列番号５）
ABP-R: 5‘-CGACCTTCTCCCACTTC-3’ （配列番号６）
を作成した。Ａｎｔｉ－ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅはＧｏＴａｑ（登録商標） ３ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）［９５℃、１０ｓｅｃの熱変性、６０℃、３０ｓｅｃのアニーリング反応、７２℃、２０ｓｅｃの伸長反応を２５サイクル］で検出した。
ABP-F: 5‘-CAGTTGTCGGCGTTATGCTG-3’ （配列番号５）
ABP-R: 5‘-CGACCTTCTCCCACTTC-3’ （配列番号６）
を作成した。Ａｎｔｉ－ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅはＧｏＴａｑ（登録商標） ３ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）［９５℃、１０ｓｅｃの熱変性、６０℃、３０ｓｅｃのアニーリング反応、７２℃、２０ｓｅｃの伸長反応を２５サイクル］で検出した。
【0069】
＜２－５＞Ｃ．ａｖｉｄｕｍの抗菌性タンパク質の遺伝子クラスターのクローニング
推定した抗菌性タンパク質の遺伝子クラスターをＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＭＧ１３６３に導入し、抗菌活性への関連を評価した。Ｃ．ａｖｉｄｕｍのＤＮＡ抽出はＡｏｋｉ ｅｔ ａｌ．の方法で行った（参考文献１５）。抽出したＤＮＡは、制限酵素切断部位を付与したプライマー：
ABP cloning F (XbaI): 5’-GGG TCT AGA GCC AGG ATG GGG CTA GAC-3’
（配列番号７）
ABP cloning R (HindIII): 5’-GGG AAG CTT GCT CCA CTG ACA CCT ACA GG-3’
（配列番号８）
を用いて、ＫＯＤ Ｏｎｅ（登録商標） ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （Ｔｏｙｏｂｏ, Ｏｓａｋａ, Ｊａｐａｎ）で増幅した。増幅産物およびＥ．ｃｏｌｉ－ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓのシャトルベクターであるｐＭＧ３６ｅは、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳ）で切断し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ.２（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いてＬｉｇａｔｉｏｎした。Ｌｉｇａｔｉｏｎ産物はＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに塩化カルシウム法で形質転換を行ったのち、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ＭＧ１３６３にエレクトロポレーション法で導入した。Ｅ．ｃｏｌｉおよびＬ．ｌａｃｔｉｓ形質転換体の選択には、１００ ｍｇ／ｍＬ ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎを含むＬＢ寒天培地およびＧＭ１７培地を使用した。形質転換体を、上記と同様にＣ．ａｃｎｅｓを封入した軟ＧＡＭ寒天培地に接種し、嫌気条件下で４８時間培養し、阻止円の有無を確認した。
推定した抗菌性タンパク質の遺伝子クラスターをＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＭＧ１３６３に導入し、抗菌活性への関連を評価した。Ｃ．ａｖｉｄｕｍのＤＮＡ抽出はＡｏｋｉ ｅｔ ａｌ．の方法で行った（参考文献１５）。抽出したＤＮＡは、制限酵素切断部位を付与したプライマー：
ABP cloning F (XbaI): 5’-GGG TCT AGA GCC AGG ATG GGG CTA GAC-3’
（配列番号７）
ABP cloning R (HindIII): 5’-GGG AAG CTT GCT CCA CTG ACA CCT ACA GG-3’
（配列番号８）
を用いて、ＫＯＤ Ｏｎｅ（登録商標） ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （Ｔｏｙｏｂｏ, Ｏｓａｋａ, Ｊａｐａｎ）で増幅した。増幅産物およびＥ．ｃｏｌｉ－ＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓのシャトルベクターであるｐＭＧ３６ｅは、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳ）で切断し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ.２（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いてＬｉｇａｔｉｏｎした。Ｌｉｇａｔｉｏｎ産物はＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに塩化カルシウム法で形質転換を行ったのち、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ＭＧ１３６３にエレクトロポレーション法で導入した。Ｅ．ｃｏｌｉおよびＬ．ｌａｃｔｉｓ形質転換体の選択には、１００ ｍｇ／ｍＬ ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎを含むＬＢ寒天培地およびＧＭ１７培地を使用した。形質転換体を、上記と同様にＣ．ａｃｎｅｓを封入した軟ＧＡＭ寒天培地に接種し、嫌気条件下で４８時間培養し、阻止円の有無を確認した。
【0070】
＜３＞考察
Ｃ．ａｃｎｅｓに対して増殖阻害作用を示す皮膚細菌を探索したところ、皮膚で最も多く認められるＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのすべての株はＣ．ａｃｎｅｓの増殖を抑制しなかった。また、健康なヒトの毛包内で多いとされるＣ．ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍもＣ．ａｃｎｅｓを阻害しなかった。Ｃ．ａｃｎｅｓの増殖を抑制した菌株は、皮膚における存在量の少ないＣ．ａｖｉｄｕｍであった。Ｃ．ａｖｉｄｕｍによる増殖阻害作用は、Ｃ．ａｃｎｅｓ ＡＴＣＣ６９１９だけでなく、薬剤耐性株を含む試験したすべてのＣ．ａｃｎｅｓ臨床分離株にも認められた。加えて、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属以外の、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属菌、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属菌およびＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅなどのグラム陽性菌に対しても増殖抑制作用を示した。バクテリオシンは抗菌薬などに比べて、狭い抗菌スペクトルを示すことが知られている。Ｃ．ａｖｉｄｕｍのアビダマイシンは特定の皮膚常在菌にのみ作用することが示唆され、耐性化および細菌叢の破綻を起こす危険性が低いと考えられる。
Ｃ．ａｃｎｅｓに対して増殖阻害作用を示す皮膚細菌を探索したところ、皮膚で最も多く認められるＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのすべての株はＣ．ａｃｎｅｓの増殖を抑制しなかった。また、健康なヒトの毛包内で多いとされるＣ．ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍもＣ．ａｃｎｅｓを阻害しなかった。Ｃ．ａｃｎｅｓの増殖を抑制した菌株は、皮膚における存在量の少ないＣ．ａｖｉｄｕｍであった。Ｃ．ａｖｉｄｕｍによる増殖阻害作用は、Ｃ．ａｃｎｅｓ ＡＴＣＣ６９１９だけでなく、薬剤耐性株を含む試験したすべてのＣ．ａｃｎｅｓ臨床分離株にも認められた。加えて、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属以外の、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属菌、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属菌およびＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅなどのグラム陽性菌に対しても増殖抑制作用を示した。バクテリオシンは抗菌薬などに比べて、狭い抗菌スペクトルを示すことが知られている。Ｃ．ａｖｉｄｕｍのアビダマイシンは特定の皮膚常在菌にのみ作用することが示唆され、耐性化および細菌叢の破綻を起こす危険性が低いと考えられる。
【0071】
Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ＭＧ１３６３の遺伝子導入株は、Ｃ．ａｃｎｅｓに対して増殖阻害作用を示した。本研究では、アビダマイシン生合成遺伝子クラスターがＣ．ａｃｎｅｓへの抗菌活性に関連することに加えて、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属菌の遺伝子発現が近縁のＬ．ｌａｃｔｉｓを用いることで可能であることを示した。
【0072】
アビダマイシンは、ｌｅｕｃｏｃｙｃｌｉｃｉｎ Ｑと高い相同性を示し、他の類似するバクテリオシンはすべてプレペプチドからリーダーペプチドが切断された後に環化するｈｅａｄ－ｔｏ－ｔａｉｌ型の環状バクテリオシンであった（参考文献１７）。そのため、アビダマイシンも環状バクテリオシンであると予想したが、アビダマイシンの生合成遺伝子クラスター中には、脱水酵素などの直接的に環化に関与する遺伝子（参考文献１６）は見出されなかった。一方で、ＡＳ－４８においてはＡＳ－４８Ｂ（膜タンパク質）、ｕｂｅｒｏｌｙｓｉｎにおいてはＵｌｂＢ（ＡＢＣトランスポーター）が環状化に関連していると報告されており（参考文献２１）、アビダマイシンにおいても膜タンパク質およびＡＢＣトランスポーターであるＡｖｄＢおよびＡｖｄＣ、ＡｖｄＥ、ＡｖｄＦが環状化に関連している可能性がある。リーダーペプチドの予測には、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより得られた分子量と理論分子量とのギャップにより推定されるが、上清中からアビダマイシンは検出できていない。他の環状バクテリオシンのアミノ酸配列と比較した時、既知の環状バクテリオシンの頭部（Ｎ末端）のアミノ酸は、イソロイシン、ロイシン、バリンまたはメチオニンであった。そのため、アビダマイシンもこのいずれかのアミノ酸の前で切断されると推定した。加えて、リーダーペプチドの長さは～５０アミノ酸であることを考慮すると３５番目のチロシンで切断されると予想した。
【0073】
参考文献
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[21] R.E. Wirawan, K.M. Swanson, T. Kleffmann, R.W. Jack, J.R. Tagg. Uberolysin: a novel cyclic bacteriocin produced by Streptococcus uberis. Microbiology 153 (2007) 1619-30.
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-08-10
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）グラム陽性菌の増殖を抑制する活性を有し、かつ、
（ｂ）以下：
（ｉ）配列番号１または２のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、
（ｉｖ）配列番号３または４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡによってコードされる、および
（ｖｉ）配列番号３または４の塩基配列の縮重異性体からなるＤＮＡによってコードされる
のいずれかである、ポリペプチド。
（ｂ）以下：
（ｉ）配列番号１または２のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、
（ｉｖ）配列番号３または４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡによってコードされる、および
（ｖｉ）配列番号３または４の塩基配列の縮重異性体からなるＤＮＡによってコードされる
のいずれかである、ポリペプチド。
【請求項2】
前記グラム陽性菌が、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｉｒｕｍ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｒｏｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからなる群より選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項3】
Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｄｕｍに由来する、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項4】
前記グラム陽性菌が薬剤耐性を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項6】
請求項５に記載のＤＮＡを含む、プラスミド。
【請求項7】
請求項５に記載のＤＮＡを含む、微生物。
【請求項8】
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属である、請求項７に記載の微生物。
【請求項9】
請求項１～４のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項７もしくは８に記載の微生物を含む、抗菌性組成物。
【請求項10】
請求項１～４のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項７もしくは８に記載の微生物を含む、医薬組成物。
【請求項11】
皮膚疾患の治療および／または予防用である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項12】
前記皮膚疾患が、尋常性ざ瘡（ニキビ）であり、
前記グラム陽性菌が、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓである、請求項１１に記載の医薬組成物。
前記グラム陽性菌が、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓである、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項13】
請求項１～４のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項７もしくは８に記載の微生物を含む、化粧料組成物。
【請求項14】
請求項７または８に記載の微生物を培養することを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のポリペプチドの製造方法。
【手続補正書】
【提出日】2022-12-01
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）グラム陽性菌の増殖を抑制する活性を有し、かつ、
（ｂ）以下：
（ｉ）配列番号１または２のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、
（ｉｖ）配列番号３または４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡによってコードされる、および
（ｖｉ）配列番号３または４の塩基配列の縮重異性体からなるＤＮＡによってコードされる
のいずれかである、ポリペプチド
または
前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む微生物
を含む、抗菌性組成物。
（ｂ）以下：
（ｉ）配列番号１または２のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、
（ｉｖ）配列番号３または４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡによってコードされる、および
（ｖｉ）配列番号３または４の塩基配列の縮重異性体からなるＤＮＡによってコードされる
のいずれかである、ポリペプチド
または
前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む微生物
を含む、抗菌性組成物。
【請求項2】
（ａ）グラム陽性菌の増殖を抑制する活性を有し、かつ、
（ｂ）以下：
（ｉ）配列番号１または２のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、
（ｉｖ）配列番号３または４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡによってコードされる、および
（ｖｉ）配列番号３または４の塩基配列の縮重異性体からなるＤＮＡによってコードされる
のいずれかである、ポリペプチド
または
前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む微生物
を含む、医薬組成物。
（ｂ）以下：
（ｉ）配列番号１または２のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、
（ｉｖ）配列番号３または４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡによってコードされる、および
（ｖｉ）配列番号３または４の塩基配列の縮重異性体からなるＤＮＡによってコードされる
のいずれかである、ポリペプチド
または
前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む微生物
を含む、医薬組成物。
【請求項3】
皮膚疾患の治療および／または予防用である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記皮膚疾患が、尋常性ざ瘡（ニキビ）であり、
前記グラム陽性菌が、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓである、請求項３に記載の医薬組成物。
前記グラム陽性菌が、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓである、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項5】
（ａ）グラム陽性菌の増殖を抑制する活性を有し、かつ、
（ｂ）以下：
（ｉ）配列番号１または２のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、
（ｉｖ）配列番号３または４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡによってコードされる、および
（ｖｉ）配列番号３または４の塩基配列の縮重異性体からなるＤＮＡによってコードされる
のいずれかである、ポリペプチド
または
前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む微生物
を含む、化粧料組成物。
（ｂ）以下：
（ｉ）配列番号１または２のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、
（ｉｖ）配列番号３または４の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡによってコードされる、および
（ｖｉ）配列番号３または４の塩基配列の縮重異性体からなるＤＮＡによってコードされる
のいずれかである、ポリペプチド
または
前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む微生物
を含む、化粧料組成物。
【請求項6】
前記グラム陽性菌が、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｉｒｕｍ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｒｏｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからなる群より選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項7】
前記ポリペプチドが、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｄｕｍに由来する、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項8】
前記グラム陽性菌が薬剤耐性を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項9】
前記微生物が、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属である、請求項１～８のいずれか１項に記載の組成物。