特開 2023-105838 ハイブリッド顕微鏡装置及び顕微鏡システム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023105838

(43)【公開日】2023-08-01

(54)【発明の名称】ハイブリッド顕微鏡装置及び顕微鏡システム

(51)【国際特許分類】

   G02B 21/00 20060101AFI20230725BHJP

   H01J 37/28 20060101ALI20230725BHJP

   H01J 37/22 20060101ALI20230725BHJP

   G01N 23/2251 20180101ALI20230725BHJP

【ＦＩ】

G02B21/00

H01J37/28 B

H01J37/22 502L

H01J37/22 502A

G01N23/2251

【審査請求】未請求

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022006812

(22)【出願日】2022-01-20

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】520374612

【氏名又は名称】ＮａｎｏＳｕｉｔ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100190067

【弁理士】

【氏名又は名称】續 成朗

(72)【発明者】

【氏名】針山 孝彦

(72)【発明者】

【氏名】松田 直人

(72)【発明者】

【氏名】大野 輝昭

【テーマコード（参考）】

2G001

2H052

5C101

【Ｆターム（参考）】

2G001AA03

2G001AA07

2G001BA05

2G001BA07

2G001BA15

2G001CA01

2G001CA03

2G001DA05

2G001JA14

2G001LA01

2G001PA07

2G001QA01

2H052AC05

2H052AC09

2H052AC31

2H052AC33

2H052AD03

2H052AF10

2H052AF14

2H052AF25

5C101AA03

5C101KK01

(57)【要約】

【課題】別個の顕微鏡を用いることなく、単一の顕微鏡装置において、同一試料の同一箇所を、透過光による光学顕微鏡観察と走査型電子顕微鏡観察することができる装置を提供する。
【解決手段】本発明の一実施形態に係るハイブリッド顕微鏡装置１００は、観察対象試料に対して電子線照射するのと同じ側に光学顕微鏡観察のための光源１２２を備え、観察対象試料の透過光像を取得する光学像ディテクター１２１が観察対象試料に対して電子線照射側と反対側に配置されていることを特徴とする。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

観察対象試料に対して電子線照射するのと同じ側に光学顕微鏡観察のための光源を備え、観察対象試料の透過光像を取得する光学像ディテクターが観察対象試料に対して電子線照射側と反対側に配置されていることを特徴とする、光学顕微鏡と走査型電子顕微鏡のハイブリッド顕微鏡装置。

【請求項2】

光学像ディテクターがＣＣＤ及びＣＭＯＳから選ばれるディテクターであり、当該ディテクターが実質的に観察対象試料を載せる試料台の機能を有することを特徴とする、請求項１に記載のハイブリッド顕微鏡装置。

【請求項3】

光学像ディテクターの受光面積が、観察対象試料の面積よりも大きく、光学像ディテクターと観察対象試料との間に光学像ディテクターを構成する光学部品とは別個の集光型の光学系を有さない、請求項１または２に記載のハイブリッド顕微鏡装置。

【請求項4】

光学像ディテクターを構成する各画素の受光素子全体に対する座標情報を走査型電子顕微鏡による観察対象試料の拡大観察に際しての位置合わせのために利用可能に構成されている、請求項１から３のいずれか一項に記載のハイブリッド顕微鏡装置。

【請求項5】

請求項１から４のいずれか一項に記載のハイブリッド顕微鏡装置と、分析装置を備え、
当該分析装置は、
ハイブリッド顕微鏡装置の動作を制御する制御部と、
ハイブリッド顕微鏡装置により得られた走査型電子顕微鏡像及び光学顕微鏡像に関する画像情報を取得する画像取得部と、
制御部及び画像取得部からのデータを処理するデータ処理部と、
データ処理部での処理結果を出力する出力部を備え、
ハイブリッド顕微鏡装置の試料室内に配置された試料を走査型電子顕微鏡観察及び光学顕微鏡観察する、
ハイブリッド顕微鏡システム。

【請求項6】

分析装置は、ハイブリッド顕微鏡装置の光学像ディテクターを構成する各画素の受光素子全体に対する座標情報を取得し、当該座標情報を利用して走査型電子顕微鏡による観察対象試料の拡大観察に際しての位置合わせのためにハイブリッド顕微鏡装置の動作を制御可能に構成されている、請求項５に記載のハイブリッド顕微鏡システム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ハイブリッド顕微鏡装置及び顕微鏡システムに関し、特に、光学顕微鏡の機能と走査型電子顕微鏡の機能を備えた、多目的型の顕微鏡装置及び顕微鏡システムに関する。

【背景技術】

【0002】

近年、病理組織の研究や診断などのために、光－電子相関顕微鏡法（Correlative Light and Electron Microscopy：ＣＬＥＭ）が使用されるようになってきている。

【0003】

例えば、特許文献１には、光学顕微鏡で観察するのに使用したスライドグラスを用いて走査電子顕微鏡観察を実行可能な走査電子顕微鏡が開示されている。
また、光学顕微鏡と走査電子顕微鏡による同一箇所の観察を容易にするＣＬＥＭ用システムとして、電界放出形走査電子顕微鏡（ＦＥ－ＳＥＭ）を用いたＣＬＥＭ解析を支援するシステムが開発され、市販されている（株式会社日立ハイテク、ＭｉｒｒｏｒＣＬＥＭ）。

【0004】

また、特許文献２及び非特許文献１には、走査型電子顕微鏡の観察試料上方からの蛍光顕微鏡観察が可能なような反射型光学系を配したハイブリッド顕微鏡が提案されている。

【0005】

しかしながら、一般的にスライドグラス上の病理組織標本を光学顕微鏡観察する場合は透過光による観察であることが多く、透過光による光学顕微鏡観察と走査型電子顕微鏡観察を組み合わせるＣＬＥＭに際しては別々な顕微鏡を使用せざるを得ず、観察操作が煩雑であるとの課題が残っていた。

【0006】

特許文献２には、発明が解決しようとする課題の項において、透視像観察等を行うことも可能な顕微鏡を提供することを目的とすることが記載されているが、発明の詳細な説明には、透視像観察を行うための機構は記載されていない。

【0007】

透過光による光学顕微鏡観察と走査型電子顕微鏡観察を組み合わせたものとしては特許文献３に例示があるが、この装置は大気圧ＳＥＭという特殊用途の顕微鏡である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】特開２０１２－１０９１７１号公報

【特許文献2】特開２０１４－２１１４４８号公報

【特許文献3】特開２０１８―２６１９７号公報

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】金丸孝昭 ほか，「光子・電子ハイブリッド顕微鏡開発－「ＦＬ－ＳＥＭ」による観察－」，顕微鏡 Ｖｏｌ．４６，Ｎｏ．１（２０１１），ｐ．６６－７０

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

このように、病理研究等のためにスライドグラス上の標本を簡易にＣＬＥＭ観察するニーズは存在するものの、現在までに提供される光学顕微鏡と走査型電子顕微鏡の併用、またはこれまでに提案されたハイブリッド顕微鏡においては、未だ実用上の課題は解決されていなかった。

【0011】

これに対して本発明者らは、簡易な構造でＣＬＥＭ観察を可能にする新たなハイブリッド顕微鏡の機構を着想した。

【0012】

本発明の目的は、別個の顕微鏡を用いることなく、単一の顕微鏡装置において、同一試料の同一箇所を、透過光による光学顕微鏡観察と走査型電子顕微鏡観察することができる装置、及び、当該装置を備えるシステムを提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明者らが鋭意検討した結果、上記課題は、以下の態様を有するハイブリッド顕微鏡装置及び顕微鏡システムにより解決可能となった。

【0014】

［１］ 観察対象試料に対して電子線照射するのと同じ側に光学顕微鏡観察のための光源を備え、観察対象試料の透過光像を取得する光学像ディテクターが観察対象試料に対して電子線照射側と反対側に配置されていることを特徴とする、光学顕微鏡と走査型電子顕微鏡のハイブリッド顕微鏡装置。
［２］ 光学像ディテクターがＣＣＤ及びＣＭＯＳから選ばれるディテクターであり、当該ディテクターが実質的に観察対象試料を載せる試料台の機能を有することを特徴とする、［１］のハイブリッド顕微鏡装置。
［３］ 光学像ディテクターの受光面積が、観察対象試料の面積よりも大きく、光学像ディテクターと観察対象試料との間に光学像ディテクターを構成する光学部品とは別個の集光型の光学系を有さない、［１］または［２］のハイブリッド顕微鏡装置。
［４］ 光学像ディテクターを構成する各画素の受光素子全体に対する座標情報を走査型電子顕微鏡による観察対象試料の拡大観察に際しての位置合わせのために利用可能に構成されている、［１］から［３］のいずれかのハイブリッド顕微鏡装置。
［５］ ［１］から［４］のいずれかのハイブリッド顕微鏡装置と、分析装置を備え、当該分析装置は、ハイブリッド顕微鏡装置の動作を制御する制御部と、ハイブリッド顕微鏡装置により得られた走査型電子顕微鏡像及び光学顕微鏡像に関する画像情報を取得する画像取得部と、制御部及び画像取得部からのデータを処理するデータ処理部と、データ処理部での処理結果を出力する出力部を備え、ハイブリッド顕微鏡装置の試料室内に配置された試料を走査型電子顕微鏡観察及び光学顕微鏡観察する、ハイブリッド顕微鏡システム。
［６］ 分析装置は、ハイブリッド顕微鏡装置の光学像ディテクターを構成する各画素の受光素子全体に対する座標情報を取得し、当該座標情報を利用して走査型電子顕微鏡による観察対象試料の拡大観察に際しての位置合わせのためにハイブリッド顕微鏡装置の動作を制御可能に構成されている、［５］のハイブリッド顕微鏡システム。

【発明の効果】

【0015】

本発明によれば、スライドグラス上の病理組織標本等の観察対象試料を簡易にＣＬＥＭ観察できるハイブリッド顕微鏡装置が提供される。
また、本発明によれば、上記ハイブリッド顕微鏡装置を備えるハイブリッド顕微鏡システムが提供される。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】本発明の一実施形態に係るハイブリッド顕微鏡装置の構成を示す模式図。

【図2】本発明の別の実施形態に係るハイブリッド顕微鏡装置の構成を示す模式図。

【図3】本発明の別の実施形態に係るハイブリッド顕微鏡装置の構成を示す模式図。

【図4】本発明の別の実施形態に係るハイブリッド顕微鏡装置の構成を示す模式図。

【図5】本発明の一実施形態に係るハイブリッド顕微鏡システムの構成を示すブロック図。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下、本発明の実施の形態について添付の図面を参照して説明する。

【0018】

［ハイブリッド顕微鏡装置の構成及び機能］
本発明のハイブリッド顕微鏡装置は、光学顕微鏡の機能と走査型電子顕微鏡の機能を備え、単一の顕微鏡装置により、透過光による光学顕微鏡観察と走査型電子顕微鏡観察の両方を実行可能な、顕微鏡装置である。即ち、本発明の顕微鏡装置は、光学顕微鏡と走査型電子顕微鏡のハイブリッド顕微鏡装置である。

【0019】

本発明のハイブリッド顕微鏡装置は、観察対象試料に対して電子線照射するのと同じ側に光学顕微鏡観察のための光源を備え、観察対象試料の透過光像を取得する光学像ディテクターが観察対象試料に対して電子線照射側と反対側に配置されていることを特徴とする。

【0020】

＜実施の形態１＞
図１は、本発明の一実施形態に係るハイブリッド顕微鏡装置の構成を示す模式図である。

【0021】

図１に示すように、本実施形態のハイブリッド顕微鏡装置１００（以下、単に顕微鏡装置１００とも称する。）は、走査型電子顕微鏡部１１０と、光学顕微鏡部１２０と、試料室１３０と、試料室底部材１４０と、真空排気手段１５０ａ、１５０ｂを備える。これにより、本実施形態の顕微鏡装置１００は、走査型電子顕微鏡機能と、光学顕微鏡機能を具備する。

【0022】

走査型電子顕微鏡部１１０は、鏡筒１１１と、対物レンズ１１２と、電子線ディテクター１１３を備える。

【0023】

鏡筒１１１の内部には、電子銃（電子線発生部）が配置されている。電子銃が電子線を発生する原理はいかなるものでも良く、典型的には、熱電子放出型、フィールドエミッション型、ショットキー型が挙げられる。このうち、熱電子放出型を用いることが、装置全体の小型化の点で好ましい。なお、鏡筒１１１の内部に配置される電子銃及び電子光学部品の構成については、従来の走査型電子顕微鏡と同様の構成を採用することができるので、本明細書では詳細な説明は省略する。

【0024】

対物レンズ１１２は、鏡筒１１１の下部末端に配置されている。鏡筒１１１内の電子銃から放出される電子線は、対物レンズ１１２によってビーム幅がコントロールされて観察対象試料に照射される。

【0025】

なお、図１には示していないが、観察対象試料は、後述する光学像ディテクターの上部に載置された状態で、試料室１３０の底部側から試料室１３０の内部に導入される。言い換えると、図１に示す顕微鏡装置１００では、観察対象試料は、装置外部の大気圧条件下から試料室１３０の内部に導入されるように構成されている。但し、試料室１３０内に観察対象試料を導入する様式はこれに限定されない。

【0026】

電子線ディテクター１１３は、観察対象試料に電子線が照射されることで発生する反射電子、二次電子を検知し、観察対象試料の走査型電子顕微鏡観察像を与える。ここで、電子線ディテクター１１３は、蛍光Ｘ線を検知する機能を有するものであっても良い。

【0027】

即ち、本実施形態の顕微鏡装置１００において、観察対象試料を走査型電子顕微鏡観察する様式はいかなるものでも良く、電子顕微鏡観察における一般的な様式である反射電子モード、二次電子モード、または蛍光Ｘ線を検出する様式であっても良い。このうち、本発明においては、反射電子モードまたは二次電子モードによる検出様式が好ましい。

【0028】

光学顕微鏡部１２０は、光学像ディテクター１２１と、光源１２２を備える。

【0029】

光学像ディテクター１２１は、観察対象試料の透過光像を取得するためのものであり、観察対象試料に対して電子線照射側と反対側に配置されている。

【0030】

光学像ディテクター１２１としては、ＣＭＯＳ及びＣＣＤが一般的であり、本発明にはいずれも好ましく使用できる。ここで、本実施形態の顕微鏡装置１００では、光学像ディテクター１２１が実質的に観察対象試料を載せる試料台の機能を有することが好ましい。例えば、図１において、光学像ディテクター１２１は、試料室底部材１４０の一部分を構成しており、試料室底部材１４０は、光学像ディテクター１２１が位置する部分の上部に、観察対象試料を載置可能に構成されている。

【0031】

また、本実施形態の顕微鏡装置１００では、光学像ディテクター１２１の受光面積が、観察対象試料の面積よりも大きいことが好ましい。例えば、観察対象試料が一般的な病理組織標本である態様では、光学像ディテクター１２１の受光面積（縦×横のサイズ）は、縦３．５ｍｍ×横４．５ｍｍ以上が好ましく、より好ましくは縦４．５ｍｍ×横５．５ｍｍ以上であり、さらに好ましくは縦５．５ｍｍ×横７ｍｍ以上である。

【0032】

さらに、図１に示す顕微鏡装置１００において、観察対象試料は、光学像ディテクター１２１上に直接載置することができる。このように、本実施形態の顕微鏡装置１００では、光学像ディテクター１２１と観察対象試料との間に光学像ディテクター１２１を構成する光学部品とは別個の集光型の光学系を有さないことが好ましい。かかる光学像ディテクターの構成としては、例えば、特開２０１８－４２２８３号公報に記載のものを採用することができる。

【0033】

光源１２２は、光学像ディテクター１２１による観察対象試料の光学顕微鏡観察を行うためのものであり、観察対象試料に対して電子線照射するのと同じ側に配置されている。具体的には、図１に示す顕微鏡装置１００では、光源１２２は、対物レンズ１１２の下部末端に配置されている。

【0034】

光源１２２としてはいかなるものを使用しても良く、例えば、ＬＥＤ（ライト・エミッティング・ダイオード）、水銀ランプ、キセノンランプ等を使用することができるが、ＬＥＤが好ましい光源として挙げられる。この場合、ＬＥＤは青色光と黄色光を混合した白色ＬＥＤ、または、青色光と緑色光と赤色光を混合した３色混合型白色ＬＥＤが好ましく、より好ましくは３色混合型である。また、光源は白色光としてだけでなく、青色光、緑色光、赤色光をそれぞれ単独で照射できる構成であることが好ましい。また、ＬＥＤとは別に、紫外線を照射するＵＶ－ＬＥＤを光源１２２として備える構成も好ましい。

【0035】

図１では、光源１２２が対物レンズ１１２の下部両側に配置される例を示しているが、上述したＬＥＤは導光板を介していかなる形状の光源とすることも可能であることは周知であるので、光源１２２の形状としては、対物レンズ１１２を囲むようにドーナツ状の形状を有している方が、観察対象試料の光学顕微鏡観察像の取得に際しての光の不均一性を低減する観点で好ましい。

【0036】

鏡筒１１１及び試料室１３０には、それぞれ、真空排気手段１５０ａ、１５０ｂが取り付けられており、観察対象試料の走査型電子顕微鏡観察に際して矢印方向への排気によって鏡筒１１１内及び試料室１３０内を所定の真空度に調整可能とされている。真空排気手段１５０ａ、１５０ｂは、真空ポンプで構成されている。

【0037】

本実施形態の顕微鏡装置１００の好ましい一態様では、走査型電子顕微鏡観察は、特許文献３に記載されるような大気圧下で行われるのではなく、鏡筒１１１内及び試料室１３０内が所定の真空度に調整された真空条件で行われる。その真空度は１００パスカル以下が好ましく、１０パスカル以下がより好ましく、１０^－２パスカル以下が最も好ましい。ここで、真空条件での走査型電子顕微鏡観察をより短時間で効率的に実行する観点から、鏡筒１１１内の電子銃が予め所定の真空度に調整された真空管内に配置されている構成を採用しても良い。

【0038】

また、本実施形態の顕微鏡装置１００の好ましい一態様では、光学像ディテクター１２１を構成する各画素の受光素子全体に対する座標情報を走査型電子顕微鏡による観察対象試料の拡大観察に際しての位置合わせのために利用可能に構成されていることが好ましい。これにより、例えばスライドグラス上の病理組織標本を光学顕微鏡観察し、目的の観察部位もしくは観察領域が発見された際に、走査型電子顕微鏡観察するにあたっての拡大操作の精度が向上し、より短時間で効率的に観察することができる。また、各病理組織標本について取得した座標情報を記録しておくことで、一旦試料を装置外部に取り出した後に再び観察に供する場合にも、当該記録された座標情報を基に、目的の観察部位もしくは観察領域に位置合わせすることができるので、観察操作がより簡略化される。

【0039】

＜実施の形態２＞
図２は、本発明の別の実施形態に係るハイブリッド顕微鏡装置の構成を示す模式図である。なお、図２において、図１に示す顕微鏡装置１００と同様の構成には同一の符号を付し、以下ではその詳細な説明は省略する。

【0040】

図２に示すように、本実施形態のハイブリッド顕微鏡装置２００（以下、単に顕微鏡装置２００とも称する。）では、図１に示す顕微鏡装置１００における電子線ディテクター１１３と光源１２２の配置が入れ替わっている。即ち、図２に示す顕微鏡装置２００では、電子ディテクター１１３は、対物レンズ１１２の下部末端に配置されている。

【0041】

ここで、図２では、光源１２２が電子線ディテクター１１３の下部側方に配置される例を示しているが、上述したＬＥＤは導光板を介していかなる形状の光源とすることも可能であることは周知であるので、光源１２２の形状としては、電子線ディテクター１１３を囲むようにドーナツ状の形状を有している方が、観察対象試料の光学顕微鏡観察像の取得に際しての光の不均一性を低減する観点で好ましい。

【0042】

＜実施の形態３＞
図３は、本発明の別の実施形態に係るハイブリッド顕微鏡装置の構成を示す模式図である。なお、図３において、図１に示す顕微鏡装置１００または図２に示す顕微鏡装置２００と同様の構成には同一の符号を付し、以下ではその詳細な説明は省略する。

【0043】

図３に示すように、本実施形態のハイブリッド顕微鏡装置３００（以下、単に顕微鏡装置３００とも称する。）では、光学顕微鏡部１２０は、光学像ディテクター１２１と、光源１２２と、可動式ミラー１２３を備える。

【0044】

本実施形態の顕微鏡装置３００では、光源１２２は、鏡筒１１１の内部に配置されている。また、鏡筒１１１の内部には、光源１２２から光が発せられる方向に可動式のミラー１２３が配置されており、光源１２２から発せられた光は、可動式ミラー１２３により鏡筒１１１の下部方向に反射され、対物レンズ１１２を通過して観察対象試料に照射される。

【0045】

可動式ミラー１２３としては、上述した機能が発揮される限りにおいてその材質や大きさ等は特に制限されない。また、可動式ミラー１２３は、顕微鏡装置３００による走査型電子顕微鏡観察の際に鏡筒１１１内の電子銃から放出される電子線の進路を妨げない位置に退避可能とされており、そのための移動機構については、従来公知の構成を採用することができる。

【0046】

＜実施の形態４＞
図４は、本発明の別の実施形態に係るハイブリッド顕微鏡装置の構成を示す模式図である。なお、図４において、図１に示す顕微鏡装置１００と同様の構成には同一の符号を付し、以下ではその詳細な説明は省略する。

【0047】

図４に示すように、本実施形態のハイブリッド顕微鏡装置４００（以下、単に顕微鏡装置４００とも称する。）では、光学顕微鏡部１２０は、光学像ディテクター１２１と、光源１２２と、光透過性の試料台１２４と、光学レンズ１２５を備える。

【0048】

光透過性試料台１２４及び光学レンズ１２５は、試料室１３０内に配置されている。本実施形態の顕微鏡装置４００では、観察対象試料は、光透過性試料台１２４の上部に載置される。言い換えると、本実施形態の顕微鏡装置４００では、光源１２２は、観察対象試料に対して電子線照射側と同じ側に配置されており、光透過性試料台１２４、光学レンズ１２５、及び光学像ディテクター１２１は、観察対象試料に対して電子線照射側と反対側に配置されている。そして、光学レンズ１２５は、光源１２２から発せられて観察対象試料及び光透過性試料台１２４を透過した光を集光し、その下側に配置された光学像ディテクター１２１が受光する。

【0049】

このように、本発明のハイブリッド顕微鏡装置においては、光学像ディテクター１２１と観察対象試料との間に光学像ディテクター１２１を構成する光学部品とは別個の集光型の光学系を有する構成としても良い。

【0050】

なお、光透過性試料台１２４及び光学レンズ１２５としては、上述した機能が発揮される限りにおいてその材質や大きさ等は特に制限されず、従来公知の構成を採用することができる。

【0051】

また、光透過性試料台１２４に観察対象試料を載置する様式としては、例えば、試料室１３０の側壁部を構成する部材の一部分を開放可能な構成とし、試料室１３０の側部から観察対象試料を試料室１３０の内部に導入するとともに、光透過性試料台１２４の上部に載置する構成とすることができる。このような構成は、従来の走査型電子顕微鏡においても採用されている。但し、本実施形態の顕微鏡装置４００において、試料室１３０内に観察対象試料を導入する様式及び光透過性試料台１２４に観察対象試料を載置する様式はこれに限定されない。

【0052】

［ハイブリッド顕微鏡装置を用いた試料の観察方法］
次に、本発明のハイブリッド顕微鏡装置を用いた試料の観察方法の好適な一実施形態として、観察対象試料がスライドグラス上の病理組織標本である態様について説明する。

【0053】

従来、病理診断及び病理診断法の研究においては、採取した病理組織標本を染色剤（ヘマトキシン・エオジン染色（ＨＥ染色））や他の免疫染色法（特定の抗体を用いて所望の抗原を染色する方法）で染色して光学顕微鏡観察することは良く行われている。この際、病理組織標本はスライドグラス上にパラフィン包埋剤を用いて固定されることが多い。近年、そうしたパラフィン固定染色病理組織標本について、光学顕微鏡観察に加えて走査型電子顕微鏡を組み合わせて観察して、特定の位置を拡大し、組織学的な形状観察する方法論が取られる。しかしながら、従来の走査型電子顕微鏡観察技術においてかかる病理組織標本を観察する場合は、試料への静電気チャージアップを避けるために予め金属蒸着を施すことが必要であった。そして、一旦金属蒸着を施した病理組織標本は、再度光学顕微鏡観察で染色像を観察することは不可能になる。

【0054】

しかしながら、例えば国際公開第２０１３／０３５８６６号に記載の技術（ＮａｎｏＳｕｉｔ（登録商標）技術）によれば、上述した金属蒸着を行って試料の光透過性を損なうことなく病理組織標本の走査型電子顕微鏡観察が可能になった。この技術を用いれば、観察対象の病理組織標本を一旦走査型電子顕微鏡観察に供したのちに再び光学顕微鏡観察することに何ら障害は無い。しかるに光学顕微鏡と走査型電子顕微鏡が別個体であるため、目的の観察位置を精密に一致させてのＣＬＥＭ観察は未だ煩雑な操作を要していた。

【0055】

即ち、本発明のハイブリッド顕微鏡装置は、ＮａｎｏＳｕｉｔ技術との併用によるスライドグラス上の病理組織標本の観察において、使用者に大きな利便性を与えるものである。

【0056】

本発明のハイブリッド顕微鏡装置を用いるＣＬＥＭ観察には、国際公開第２０１３／０３５８６６号に記載されるような観察補助液（以下、ＮａｎｏＳｕｉｔ溶液という。）を用いることが好ましい。

【0057】

ＮａｎｏＳｕｉｔ溶液は、本発明のハイブリッド顕微鏡装置の走査型電子顕微鏡機能による観察において、観察像の鮮明性を改善する。ＮａｎｏＳｕｉｔ溶液は、必須成分として、グリセリン及びグリセリン代替物；ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０、ポリソルベート８５などのポリソルベート類、及び、ポリソルベート類代替物から選ばれる少なくとも１種の界面活性性化合物を含み、任意成分として、単糖類、二糖類、塩類、及び、緩衝液から選ばれる少なくとも１種の化合物を含んでなる。

【0058】

グリセリンは３価のアルコール（いわゆる多価アルコール）であり、水酸基を分子内に有し、低蒸気圧物質である。また、グリセリンは粘性を有している。これらの特徴を有する物質は、グリセリンの代替成分としてＮａｎｏＳｕｉｔ溶液に含めることができる。具体的には、グリセリン代替物としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、トリグリセリド、ポリレゾルシノール、ポリフェノール、タンニン酸、ウルシオール、サポニンなどが挙げられる。グリセリン及びグリセリン代替物は、１種を単独で用いても良く、２種以上を併用しても良い。

【0059】

本明細書において、「ポリソルベート類」とは、ソルビタン脂肪酸エステル（非イオン性界面活性剤）にエチレンオキシドを反応させて作製されたものを意図する。現在一般に入手可能なポリソルベート類としては、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ ２０）、ポリソルベート４０（Ｔｗｅｅｎ ４０）、ポリソルベート６０（Ｔｗｅｅｎ ６０）、ポリソルベート６５（Ｔｗｅｅｎ ６５）、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ ８０）、ポリソルベート８５（Ｔｗｅｅｎ ８５）が挙げられるが、ＮａｎｏＳｕｉｔ溶液に含めることができるポリソルベート類はこれらに限定されない。また、ポリソルベート類と同様に非イオン性界面活性剤に分類される物質は、ポリソルベート類の代替成分としてＮａｎｏＳｕｉｔ溶液に含めることができる。具体的には、ポリソルベート類代替物としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、ポリオキシエチレンモノ脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、アルキルポリグリコシド、Ｎ－メチルアルキルグルカミドなどが挙げられる。ポリソルベート類及びポリソルベート類代替物は、１種を単独で用いても良く、２種以上を併用しても良い。

【0060】

単糖類としては、例えば、グルコース、フルクトースなどが挙げられる。
二糖類としては、例えば、スクロース、トレハロースなどが挙げられる。
塩類としては、例えば、例えば、イミダゾリウム塩類、ピリジニウム塩類、ピペリジニウム塩類、ピロリジニウム塩類、四級アンモニウム塩類などが挙げられる。
緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液（酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液）、リン酸緩衝液（リン酸・リン酸ナトリウム緩衝液）、クエン酸緩衝液（クエン酸・クエン酸ナトリウム緩衝液）、クエン酸リン酸緩衝液（クエン酸・リン酸ナトリウム緩衝液）、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液などが挙げられる。
これらの単糖類、二糖類、塩類、及び、緩衝液は、１種を単独で用いても良く、２種以上を併用しても良い。

【0061】

グリセリン、グリセリン代替物、ポリソルベート類、及び、ポリソルベート類代替物から選ばれる少なくとも１種の化合物からなる必須成分は、ＮａｎｏＳｕｉｔ溶液中に０．０１重量パーセントから１０重量パーセント含む態様が好ましく、０．１重量パーセントから２重量パーセント含む態様がより好ましい。

【0062】

ここで、本発明のハイブリッド顕微鏡装置を用いる、スライドグラス上の病理組織標本のＣＬＥＭ観察の手順について説明する。なお、本発明の具体的な態様は、以下に記載する手順に限られるものではない。

【0063】

（１）スライドグラス上にパラフィン固定された病理組織標本を予め脱パラフィン処理し、さらに親水化処理を行って、観察対象試料を準備する。
（２）（１）の観察対象試料にＮａｎｏＳｕｉｔ溶液を適用し、病理組織標本の表面にＮａｎｏＳｕｉｔ溶液からなる液膜を形成する。
（３）（２）の観察対象試料を本発明のハイブリッド顕微鏡装置の試料室に導入する。（例えば、図１に示す顕微鏡装置１００では、観察対象試料を、試料室底部材１４０の、光学像ディテクター１２１が位置する部分の上部に載置する。）
（４）顕微鏡装置の光学顕微鏡機能により、観察対象試料を光学顕微鏡観察し、光学顕微鏡像を取得する。
（５）（４）の光学顕微鏡観察ののち、走査型電子顕微鏡で高倍率観察を行う位置（範囲）を決定する。この際、顕微鏡装置は、光学像ディテクターを構成する各画素の受光素子全体に対する座標情報を利用して、当該高倍率観察を行う位置（範囲）を選択可能に構成されていることが好ましい。
（６）顕微鏡装置の真空排気手段（真空ポンプ）を作動させ、走査型電子顕微鏡観察が可能なように、鏡筒内及び試料室内を所定の真空度に調整する。
（７）顕微鏡装置の機能を走査型電子顕微鏡機能に切り替え、（５）で決定した位置（範囲）を所定の高倍率で走査型電子顕微鏡観察し、走査型電子顕微鏡観察像を取得する。
（８）走査型電子顕微鏡部の電子線ディテクターが蛍光Ｘ線を検知する機能を有する場合、必要に応じて、蛍光Ｘ線像を取得する。

【0064】

［ハイブリッド顕微鏡システム］
上述した、本発明のハイブリッド顕微鏡装置を用いる、スライドグラス上の病理組織標本のＣＬＥＭ観察に使用するのに好適な、本発明のハイブリッド顕微鏡システムは、ハイブリッド顕微鏡装置と、分析装置を備える。ここで、当該分析装置は、ハイブリッド顕微鏡装置の光学像ディテクターを構成する各画素の受光素子全体に対する座標情報を取得し、当該座標情報を利用して走査型電子顕微鏡による観察対象試料の拡大観察に際しての位置合わせのためにハイブリッド顕微鏡装置の動作を制御可能に構成されていることが好ましい。

【0065】

図５は、本発明の一実施形態に係るハイブリッド顕微鏡システムの構成を示すブロック図である。

【0066】

図５に示すように、本実施形態に係るハイブリッド顕微鏡システム７００（以下、単に顕微鏡システム７００とも称する。）は、ハイブリッド顕微鏡装置５００（以下、単に顕微鏡装置５００とも称する。）と、分析装置６００を備える。

【0067】

顕微鏡装置５００としては、図１～図４を参照して説明した実施の形態１～４に係る顕微鏡装置１００、２００、３００、４００を用いることができる。

【0068】

分析装置６００は、制御部６１０と、画像取得部６２０と、データ処理部６３０と、出力部６４０を備える。

【0069】

制御部６１０は、顕微鏡装置５００の動作を制御する。具体的には、制御部６１０は、顕微鏡装置５００の、少なくとも走査型電子顕微鏡部１１０、光学顕微鏡部１２０、試料室１３０、及び試料室底部材１４０の動作を制御可能に構成されている。制御部６１０による顕微鏡装置５００の制御に関する情報（データ）は、データ処理部６３０に送信可能とされている。

【0070】

画像取得部６２０は、顕微鏡装置５００により得られた走査型電子顕微鏡像及び光学顕微鏡像に関する画像情報を取得する。言い換えると、画像取得部６２０は、顕微鏡装置５００の走査型電子顕微鏡部１１０及び光学顕微鏡部１２０により得られた画像情報を取得する。画像取得部６２０によって取得された画像情報（画像データ）は、データ処理部６３０に送信可能とされている。

【0071】

データ処理部６３０は、制御部６１０及び画像取得部６２０からのデータを処理し、その処理結果を出力部６４０に送信可能とされている。

【0072】

出力部６４０は、データ処理部６３０での処理結果を出力する。出力部６４０としては、例えば、液晶表示装置、プリンタ等が用いられる。なお、出力部６４０には、データ処理部６３０での処理結果をＵＳＢメモリ等の記録媒体に記録する記録装置を用いても良い。

【0073】

このような構成を備える顕微鏡システム７００により、観察対象試料の走査型電子顕微鏡観察及び光学顕微鏡観察が行われる。ここで、画像取得部６２０には、上述したような、スライドグラス上の病理組織標本のＣＬＥＭ観察を実行するためのコンピュータプログラム（観察対象試料のＣＬＥＭ観察プログラム）が記憶されているとともに、プログラム実行中に格納及び参照される種々の分析データの記憶領域が確保されている。分析データには、顕微鏡装置５００の光学像ディテクター１２１を構成する各画素の受光素子全体に対する座標情報等が含まれる。

【0074】

このように、本実施形態の顕微鏡システム７００では、簡易な装置構成により、観察対象試料のＣＬＥＭ観察、即ち、走査型電子顕微鏡観察及び光学顕微鏡観察を容易に行うことができる。

【符号の説明】

【0075】

１００、２００、３００、４００、５００ ハイブリッド顕微鏡装置
１１０ 走査型電子顕微鏡部
１１１ 鏡筒
１１２ 対物レンズ
１１３ 電子線ディテクター
１２０ 光学顕微鏡部
１２１ 光学像ディテクター
１２２ 光源
１２３ 可動式ミラー
１２４ 光透過性試料台
１２５ 光学レンズ
１３０ 試料室
１４０ 試料室底部材
１５０ａ、１５０ｂ 真空排気手段
６００ 分析装置
６１０ 制御部
６２０ 画像取得部
６３０ データ処理部
６４０ 出力部
７００ ハイブリッド顕微鏡システム

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】