特開 2023-10659 Ｌ－グルタミン酸酸化酵素を含む組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023010659

(43)【公開日】2023-01-20

(54)【発明の名称】Ｌ－グルタミン酸酸化酵素を含む組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/06 20060101AFI20230113BHJP

   C12N 9/96 20060101ALI20230113BHJP

   C12Q 1/26 20060101ALI20230113BHJP

【ＦＩ】

C12N9/06 B

C12N9/96

C12Q1/26

【審査請求】未請求

【請求項の数】8

【出願形態】書面

(21)【出願番号】P 2022109333

(22)【出願日】2022-06-20

(31)【優先権主張番号】P 2021133019

(32)【優先日】2021-07-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(71)【出願人】

【識別番号】000210067

【氏名又は名称】池田食研株式会社

(72)【発明者】

【氏名】宅見 高史

(72)【発明者】

【氏名】宮本 浩士

【テーマコード（参考）】

4B050

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B050CC03

4B050CC05

4B050DD02

4B050EE10

4B050FF11E

4B050HH02

4B050HH04

4B050LL03

4B063QA01

4B063QQ16

4B063QQ23

4B063QQ80

4B063QR03

4B063QR49

4B063QS02

4B063QX01

(57)【要約】

【課題】 プロテアーゼ処理及び再精製を行うことなく、Ｌ－グルタミン酸酸化酵素を安定化する方法を提供し、安定性に優れたＬ－グルタミン酸酸化酵素を含む組成物、該組成物を用いたＬ－グルタミン酸の測定方法及び測定キットを提供するものである。
【解決手段】
Ｌ－グルタミン酸酸化酵素とカルシウム塩及び／又はナトリウム塩とを共存させることで、該酵素を安定化できることを見出し、本発明を完成した。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｌ－グルタミン酸酸化酵素を含む組成物において、カルシウム塩及び／又はナトリウム塩を共存させる工程を含む、Ｌ－グルタミン酸酸化酵素の安定性を向上させる方法。

【請求項2】

Ｌ－グルタミン酸酸化酵素を含む組成物において、カルシウム塩及び／又はナトリウム塩を共存させる工程を含む、ｐＨ３．０～９．０におけるＬ－グルタミン酸酸化酵素の安定性を向上させる方法。

【請求項3】

さらに酢酸塩を共存させる工程を含む、請求項１又は２に記載のＬ－グルタミン酸酸化酵素の安定性を向上させる方法。

【請求項4】

Ｌ－グルタミン酸酸化酵素、並びにカルシウム塩及び／又はナトリウム塩を含む、組成物。

【請求項5】

Ｌ－グルタミン酸酸化酵素１Ｕあたりのカルシウム塩濃度が０．０００１μｍｏｌ以上及び／又はナトリウム塩濃度が０．０１μｍｏｌ以上である、請求項４記載の組成物。

【請求項6】

さらに酢酸塩を含む、請求項４又は５に記載の組成物。

【請求項7】

請求項４又は５に記載の組成物を用いる、Ｌ－グルタミン酸の測定方法。

【請求項8】

請求項４又は５に記載の組成物を含む、Ｌ－グルタミン酸測定用キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｌ－グルタミン酸酸化酵素の安定化方法、該酵素を含む組成物、該酵素を用いたＬ－グルタミン酸の測定方法及び測定用キット等に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｌ－グルタミン酸は、様々な食品に含まれており、また旨味の主要物質であることから、食品の製造や開発の分野において簡便な測定が望まれている。一般的にはＬ－グルタミン酸は液体クロマトグラフィーにより測定されるが、Ｌ－グルタミン酸酸化酵素やＬ－グルタミン酸脱水素酵素を使用した測定キットもそれぞれ販売されており、特に酸性～弱酸性である場合が多い食品の分析においては、Ｌ－グルタミン酸酸化酵素を使用して測定する方法が簡便とされている。

【0003】

Ｌ－グルタミン酸酸化酵素は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属の菌株をふすま培地で固体培養後、緩衝液にて抽出し、精製することで取得していたが、大変煩雑な方法だった（特許文献１及び非特許文献１）。そのため、組換え大腸菌による製造法が開発されたが、得られる酵素が比活性や熱安定性の低い酵素だったため、現在では組換え大腸菌で発現させた後にプロテアーゼ処理し、再度精製を行うことで、組換えＬ－グルタミン酸酸化酵素において、ふすま培養液由来の酵素と同程度の比活性や熱安定性を有する酵素が得られることが知られている（特許文献２及び非特許文献２～５）。その他、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する微生物由来の多くのＬ－グルタミン酸酸化酵素が知られており、その配列も開示されている（特許文献３、４及び非特許文献６、７）。

【0004】

一方、組換え体大腸菌由来の酵素をプロテアーゼ処理して再精製する製造方法は煩雑な上、高コストな製造法であり、また、使用したプロテアーゼが夾雑物として残存するリスクを完全に排除できないという問題点があった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特公昭６１－２６３５７号公報

【特許文献2】特許第４００２７６５号公報

【特許文献3】中国特許公開第１０４７２６４７１号公報

【特許文献4】中国特許公開第１０４７２６４７２号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４７（６），１３２３－１３２８，１９８３

【非特許文献2】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１．Ｌｅｔｔ．，３９，９１３－９１９，２０１７

【非特許文献3】Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３４，８０５－８１２，２００２

【非特許文献4】日本農芸化学会２０２０年度中四国支部大会（第５７回講演会）講演要旨集、Ｐ２０

【非特許文献5】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１．Ｌｅｔｔ．，３９，５２３－５２８，２０１７

【非特許文献6】Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４７，２６９－２７５，２００１

【非特許文献7】Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ １２９，１０８－１１４，２０１７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、プロテアーゼ処理及び再精製を行うことなく、Ｌ－グルタミン酸酸化酵素を安定化する方法を提供し、安定性に優れたＬ－グルタミン酸酸化酵素を含む組成物、該組成物を用いたＬ－グルタミン酸の測定方法及び測定キットを提供するものである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明では、Ｌ－グルタミン酸酸化酵素とカルシウム塩及び／又はナトリウム塩とを共存させることで、該酵素を安定化できることを見出し、本発明を完成した。

【0009】

すなわち、本発明は、以下の［１］～［８］の態様に関する。
［１］Ｌ－グルタミン酸酸化酵素を含む組成物において、カルシウム塩及び／又はナトリウム塩を共存させる工程を含む、Ｌ－グルタミン酸酸化酵素の安定性を向上させる方法。
［２］Ｌ－グルタミン酸酸化酵素を含む組成物において、カルシウム塩及び／又はナトリウム塩を共存させる工程を含む、ｐＨ３．０～９．０におけるＬ－グルタミン酸酸化酵素の安定性を向上させる方法。
［３］さらに酢酸塩を共存させる工程を含む、［１］又は［２］に記載のＬ－グルタミン酸酸化酵素の安定性を向上させる方法。
［４］Ｌ－グルタミン酸酸化酵素、並びにカルシウム塩及び／又はナトリウム塩を含む、組成物。
［５］Ｌ－グルタミン酸酸化酵素１Ｕあたりのカルシウム塩濃度が０．０００１μｍｏｌ以上及び／又はナトリウム塩濃度が０．０１μｍｏｌ以上である、［４］記載の組成物。
［６］さらに酢酸塩を含む、［４］又は［５］に記載の組成物。
［７］［４］～［６］の何れかに記載の組成物を用いる、Ｌ－グルタミン酸の測定方法。
［８］［４］～［６］の何れかに記載の組成物を含む、Ｌ－グルタミン酸測定用キット。

【発明の効果】

【0010】

本発明により、プロテアーゼ処理及び再精製を行うことなく、より簡便にＬ－グルタミン酸酸化酵素を安定化することができ、安定性に優れたＬ－グルタミン酸酸化酵素を含む組成物、該酵素を用いたＬ－グルタミン酸の測定方法及び測定キットを提供することが可能となった。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】Ｌ－グルタミン酸酸化酵素の各温度におけるＣａＣｌ_２又はＮａＣｌによる安定化効果を示した図である。

【図2】Ｌ－グルタミン酸酸化酵素の各ｐＨにおけるＣａＣｌ_２による安定化効果を示した図である。

【図3】１ｍＭ塩化カルシウム及び５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を含むＬ－グルタミン酸酸化酵素組成物を用いて、Ｌ－グルタミン酸を測定した図である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

Ｌ－グルタミン酸酸化酵素は、以下の反応を触媒する酵素である。
Ｌ－グルタミン酸＋Ｏ_２＋Ｈ_２Ｏ→α－ケトグルタル酸＋Ｈ_２Ｏ_２＋ＮＨ_３
Ｌ－グルタミン酸を酸化して、α－ケトグルタル酸を生成する反応を触媒する酵素であれば特に限定されず、公知のＬ－グルタミン酸酸化酵素を用いることができる。例えば、前記の特許文献又は非特許文献に記載のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する微生物由来のＬ－グルタミン酸酸化酵素が例示でき、非特許文献２、６若しくは７又は特許文献２～４に記載の公知配列を利用して組換え製造したＬ－グルタミン酸酸化酵素を使用することができる。

【0013】

また、本発明に適用することができるＬ－グルタミン酸酸化酵素は、Ｌ－グルタミン酸を酸化する活性を有する限り、上記に例示した配列のアミノ酸残基の一部が欠失、置換又は付加されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。

【0014】

Ｌ－グルタミン酸酸化酵素は公知の方法で取得でき、例えば、Ｌ－グルタミン酸酸化酵素を産生する公知のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する微生物、Ｓ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｖｉｒｉｄｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓ．ａｆｇｈａｎｉｅｎｓｉ等から該酵素の構造遺伝子を取得し、又は公知のアミノ酸配列を基に宿主に最適化した遺伝子配列を合成し、発現用ベクターに挿入後、該ベクターを用いて適切な宿主を形質転換して得られた形質転換体を培養し、遠心分離等で菌体又は培養上清を回収した後、菌体破砕等により抽出した粗酵素液を精製して得られる。

【0015】

宿主は、例えば大腸菌、枯草菌、放線菌等の原核細胞や、真菌（酵母、アスペルギルス属等の子嚢菌、担子菌等）、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用できるが、大腸菌が好ましい。

【0016】

本発明で使用されるＬ－グルタミン酸酸化酵素生産菌の培養には、通常の微生物培養用培地が使用できる。例えば、炭素源、窒素源、ビタミン類、無機物、その他使用する微生物が必要とする微量栄養素を程よく含有するものであれば、合成培地、天然培地の何れでも使用可能である。炭素源としては、グルコース、スクロース、デキストリン、澱粉、グリセリン、糖蜜等が使用できる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機塩類、ＤＬ－アラニン、Ｌ－グルタミン酸等のアミノ酸類、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー等の窒素含有天然物が使用できる。無機物としては、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第二鉄等が使用でき、ビタミン類を使用してもよい。さらに、タンパク質の発現の調整に必要な化合物を適宜添加しても良い。

【0017】

本発明のＬ－グルタミン酸酸化酵素を得るための培養は、通常、振盪培養や通気攪拌等の方法により好気的条件下で行うのが良い。Ｌ－グルタミン酸酸化酵素生産菌の特性を踏まえて、Ｌ－グルタミン酸酸化酵素の生産に適した培養条件に設定すれば良い。例えば、培養温度は１５℃から４５℃、好ましくは２０℃～４０℃、ｐＨは４．０～８．５、好ましくは５．０～８．０の範囲で行うのが好ましく、生産性を考慮して培養中にｐＨ調整をしても良い。培養期間は０．５日から１０日の範囲が好ましいが、流加培養や連続培養による生産量増大を行うのであれば、生産性が最適と判断される範囲で期間を延ばすことができる。この様な方法で培養することにより、培養物中にＬ－グルタミン酸酸化酵素を生成蓄積することができる。

【0018】

培養物中からＬ－グルタミン酸酸化酵素を得る方法は、通常のタンパク質の製造方法が利用できる。例えば、最初にＬ－グルタミン酸酸化酵素生産菌を培養後、遠心分離により培養上清液を得る。又は培養菌体を得、適当な方法で該培養微生物を破砕し、破砕液から遠心分離等によって上清液を得る。次に、これらの上清液中に含まれるＬ－グルタミン酸酸化酵素を、通常のタンパク質の精製方法で精製し、精製酵素を得ることができる。例えば、限外ろ過、塩析、溶媒沈殿、熱処理、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー等を適宜組み合わせることによって精製できる。

【0019】

本発明では、Ｌ－グルタミン酸酸化酵素を、カルシウム塩及び／又はナトリウム塩と共存させることで、カルシウム塩及び／又はナトリウム塩非存在下に比べて、Ｌ－グルタミン酸酸化酵素の安定性を向上することができる。Ｌ－グルタミン酸酸化酵素の安定性を向上することで、Ｌ－グルタミン酸酸化酵素が失活するのを抑え、タンパク当たりの活性（比活性）を保持することができる。詳細には、Ｌ－グルタミン酸酸化酵素をカルシウム塩及び／又はナトリウム塩を含む酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で、４０℃、１時間処理した場合、処理前の好ましくは４５％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上の活性又は比活性を保持することができる。また、好ましくはｐＨ２．５～ｐＨ９．５、より好ましくはｐＨ３．０～ｐＨ９．０の範囲において、カルシウム塩及び／又はナトリウム塩非存在下と比べてＬ－グルタミン酸酸化酵素の安定性を向上することができ、特にｐＨ７．０以上の範囲において、２５℃、２３時間処理で完全に失活する酵素をカルシウム塩及び／又はナトリウム塩と共存させることで、処理前の好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは４５％以上の活性又は比活性を保持することができる。また、緩衝液によるＬ－グルタミン酸酸化酵素の安定化効果も期待でき、活性を低下させない緩衝液であれば特に限定されないが、キレート作用のない有機酸塩を含む緩衝液が好ましく、例えば、酢酸塩、スルホン酸塩等を含む緩衝液が例示でき、酢酸カリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、ＭＥＳ―ＮａＯＨ緩衝液、ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ緩衝液、トリス塩酸緩衝液等が好ましい。カルシウムイオンとキレートし易い、リン酸緩衝液は使用しないのが好ましく、クエン酸緩衝液は、好ましくはｐＨ４．０以下及びｐＨ６．０以上では使用しないのが好ましく、ＥＤＴＡ等のキレート剤も酵素活性に支障をきたす可能性のある銅イオン等を低減する場合を除き、使用しないのが好ましい。

【0020】

前記抽出及び精製時に、カルシウム塩を含む緩衝液又はカルシウム塩とナトリウム塩とを含む緩衝液を使用するのが好ましく、ｐＨ４．０～９．０の緩衝液が好ましく、ｐＨ４．５～８．５がより好ましい。

【0021】

本発明のＬ－グルタミン酸酸化酵素を含む組成物は、Ｌ－グルタミン酸酸化酵素、並びにカルシウム塩及び／又はナトリウム塩を含む組成物であればよく、Ｌ－グルタミン酸酸化酵素を安定化できれば特に限定されないが、Ｌ－グルタミン酸酸化酵素１Ｕあたり、カルシウム塩濃度は０．０００１μｍｏｌ以上が好ましく、０．００１μｍｏｌ以上がより好ましく、０．１μｍｏｌ以上がさらに好ましく、０．５μｍｏｌ以上が特に好ましく、５０μｍｏｌ以下が好ましく、２０μｍｏｌ以下がより好ましく、１０μｍｏｌ以下がさらに好ましく、ナトリウム塩濃度は０．０１μｍｏｌ以上が好ましく、０．１μｍｏｌ以上がより好ましく、１又は２μｍｏｌ以上がさらに好ましく、５μｍｏｌ以上が特に好ましく、１ｍｍｏｌ以下が好ましく、５００μｍｏｌ以下がより好ましく、２００μｍｏｌ以下がより好ましい。また、Ｌ－グルタミン酸酸化酵素１ｍｇあたり、カルシウム塩濃度は０．０２μｍｏｌ以上が好ましく、０．２μｍｏｌ以上がより好ましく、２０μｍｏｌ以上がさらに好ましく、１００μｍｏｌ以上が特に好ましく、１０ｍｍｏｌ以下が好ましく、５ｍｍｏｌ以下がより好ましく、２ｍｍｏｌ以下がさらに好ましく、ナトリウム塩濃度は１μｍｏｌ以上が好ましく、１０μｍｏｌ以上がより好ましく、１００又は４００μｍｏｌ以上がさらに好ましく、１ｍｍｏｌ以上が特に好ましく、２００ｍｍｏｌ以下が好ましく、１００ｍｍｏｌ以下がより好ましく、５０ｍｍｏｌ以下がより好ましい。また、緩衝液成分を含むのが好ましく、キレート作用のない有機酸塩を含むのが好ましく、例えば、酢酸塩、スルホン酸塩等を含む緩衝液成分が例示でき、酢酸カリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、ＭＥＳ―ＮａＯＨ緩衝液、ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ緩衝液、トリス塩酸緩衝液等の成分が好ましい。本発明のＬ－グルタミン酸酸化酵素を含む組成物は、カルシウム塩及び／又はナトリウム塩非存在下と比べて安定性が向上しており、失活を防ぐことで高い比活性を保持することができ、組成物中の該酵素の比活性は、好ましくは２０Ｕ／ｍｇ以上、より好ましくは５０Ｕ／ｍｇ以上、さらに好ましくは８０Ｕ／ｍｇ以上、特に好ましくは１００Ｕ／ｍｇ以上である。

【0022】

また、本酵素液を濃縮した場合、例えば０．１ｍｇ／ｍＬ以上、０．２ｍｇ／ｍＬ以上又は０．５ｍｇ／ｍＬ以上の場合、ナトリウム塩濃度が低いと、活性を有したまま不溶化する場合がある。不溶化は、タンパク質濃度や緩衝液の種類、ｐＨ等によっても変わるが、ｐＨ８．０より６．０の方がナトリウム塩濃度の影響を受けやすく、不溶化した酵素は、遠心により沈殿を回収できる。酵素濃縮液での不溶化を防ぐためには、［００２１］に記載している量と同量のナトリウム塩を共存させるのが好ましい。

【0023】

ナトリウム塩やカルシウム塩の種類としては、Ｌ－グルタミン酸酸化酵素を安定化できれば特に限定されないが、例えば、塩化物塩（塩化カルシウムや塩化ナトリウム）、硫酸塩（硫酸カルシウムや硫酸ナトリウム）、酢酸塩（酢酸カルシウムや酢酸ナトリウム）、炭酸塩（炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム）等の無機酸塩や有機酸塩を使用可能である。

【0024】

Ｌ－グルタミン酸酸化酵素を含む組成物については、さらに、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン、糖類（例えば、トレハロース等）、糖アルコール類等から成る群より選ばれる１以上の成分を混合して使用することができる。本組成物は、液体でもよく、又は凍結乾燥等により乾燥組成物としてもよい。

【0025】

本発明のＬ－グルタミン酸酸化酵素を含む組成物を用いて、Ｌ－グルタミン酸を測定することができる。具体的には、Ｌ－グルタミン酸を含む被検試料と本発明のＬ－グルタミン酸酸化酵素組成物を、混合や接触させる工程により、被検試料中のＬ－グルタミン酸を定量できる。本発明のＬ－グルタミン酸酸化酵素組成物の酵素の量は、１試料当り０．０５から５０Ｕ程度が好ましく、測定時の終濃度で０．０１～１０Ｕ／ｍＬの範囲が好ましく、０．０５～５Ｕ／ｍＬがより好ましく、０．５～１Ｕ／ｍＬがさらに好ましい。測定時のｐＨは、好ましくはｐＨ２．５～９．０、より好ましくはｐＨ３．０～ｐＨ９．０に設定でき、酸性域からアルカリ性域まで、広い範囲で測定可能である。

【0026】

本発明のＬ－グルタミン酸酸化酵素を含む組成物を用いて、Ｌ－グルタミン酸測定用キットを製造することができる。特に、本発明の安定化させた酵素は比活性や熱安定性が高い事から、目的の測定キットを簡便に製造することが可能となった。

【0027】

本発明のＬ－グルタミン酸測定用キットは少なくとも下記の反応液Ａ及びＢを含むのが好ましい。
（反応液Ａ）
トリンダー試薬若しくは新トリンダー試薬、アスコルビン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、並びに防腐剤を含む試薬組成物。
（反応液Ｂ）
Ｌ－グルタミン酸酸化酵素、カプラー化合物、安定化剤及び防腐剤を含む試薬組成物。

【0028】

測定対象となるＬ－グルタミン酸を含む試料としては特に限定されないが、例えば野菜、果物、種実類、魚介類、畜肉類等の食品、特に、ジュース、スープ、出汁等が例示でき、組織、細胞又は微生物培養で使用される培養液、培養物の抽出物等、血液、血清、尿等の生体試料等も例示できる。

【0029】

前記アスコルビン酸オキシダーゼは特に限定されないが、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ属に由来する酵素が例示でき、詳細にはキュウリ、カボチャ由来のアスコルビン酸オキシダーゼを使用することができる。ペルオキシダーゼについては特に限定されないが、一般的に試薬として販売されている西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼ等を使用することができる。また、本発明に使用するＬ－グルタミン酸酸化酵素の濃度は終濃度として０．０１～５０Ｕ／ｍＬの範囲が好ましく、より好ましくは０．０５～２０Ｕ／ｍＬ、さらに好ましくは０．１～１０Ｕ／ｍＬ、特に好ましくは０．５～５Ｕ／ｍＬの範囲が好ましい。カルシウム塩濃度は終濃度として０．０１～１００ｍＭの範囲が好ましく、より好ましくは０．０５～５０ｍＭ、さらに好ましくは０．１～２０ｍＭの範囲が好ましく、ナトリウム塩濃度は終濃度として１～２，０００ｍＭの範囲が好ましく、より好ましくは５～１，０００ｍＭ、さらに好ましくは１０～５００ｍＭ、特に好ましくは２０～２００ｍＭの範囲が好ましい。アスコルビン酸オキシダーゼは終濃度として０．１～１００Ｕ／ｍＬの範囲が好ましく、より好ましくは０．５～５０Ｕ／ｍＬの範囲が好ましく、さらに好ましくは２～２０Ｕ／ｍＬの範囲が好ましい。ペルオキシダーゼは終濃度として０．１～１００Ｕ／ｍＬの範囲が好ましく、より好ましくは０．５～５０Ｕ／ｍＬの範囲が好ましく、さらに好ましくは２～２０Ｕ／ｍＬの範囲が好しい。

【0030】

前記トリンダー試薬は例えばフェノールが例示でき、新トリンダー試薬としては例えばＮ－エチル－Ｎ－スルホプロピル－３－メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピルアニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピル－３－メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン（ＡＤＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン（ＴＯＯＳ）等の公知の発色試薬が例示できる。これらの発色試薬は一種又は二種以上を混合して用いてもよいが、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン（ＴＯＯＳ）を使用することが好ましい。

【0031】

前記カプラー化合物はトリンダー試薬、又は新トリンダー試薬との組み合わせで発色する任意の化合物を使用することができ、例えば４－アミノアンチピリン（４－ＡＡ）、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）、アミノジフェニルアミン、１－（４－スルホフェニル）－２，３－ジメチル－４－アミノ－５－ピラゾロン（ＣＰ２－４）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－ｍ－トルイジン又はその誘導体等を用いることができる。これらのカプラー化合物は一種、又は二種以上組わせて使用することができるが、特に４－アミノアンチピリンを使用することが好ましい。

【0032】

本発明のＬ－グルタミン酸測定キットでは反応液の腐敗、変質を防止する為、各種の防腐剤を使用することができる。防腐剤としてはアンピシリン、クロラムフェニコール、プロクリン（登録商標）等公知のものを使用することができ、特にクロラムフェニコール、プロクリンを使用することが好ましい。

【0033】

（酵素活性測定法）
本発明のＬ－グルタミン酸酸化酵素の酵素活性は、次の方法で測定できる。
酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）が終濃度１００ｍＭ、４－アミノアンチピリンが終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ、ＴＯＯＳが終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ、西洋わさびペルオキシダーゼが終濃度２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、Ｌ－グルタミン酸ナトリウムが終濃度１００ｍＭになるよう石英セル（光路長１ｃｍ）に入れ、恒温セルホルダー付き分光光度計にセットして３７℃で１０分間インキュベートした後、酵素溶液０．０５ｍｌを加えて撹拌し（総液量３．０ｍｌ）、５５５ｎｍにおける５分間の吸光度（Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）変化（△ＡＢＳ／ｍｉｎ）を測定する。そして、次の式により酵素活性を算出する。１分間に１μｍｏｌのＬ－グルタミン酸が分解される酵素活性を１ｕｎｉｔ（Ｕ）と定義する。なお、酵素希釈液においては、カルシウム塩等を含んだ緩衝液に、さらに終濃度０．１％になるように牛血清アルブミンを添加しておくのが望ましい。

【0034】

【数1】

【実施例0035】

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。

【実施例0036】

（Ｌ－グルタミン酸酸化酵素組成物の製造方法）
非特許文献２に記載のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ由来Ｌ－グルタミン酸酸化酵素のアミノ酸配列（配列番号１）をコードし、大腸菌発現用に最適化した合成ポリヌクレオチドを、ｐＥＴ２１（ａ）＋ベクターに挿入し、該ベクターを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換することで、Ｌ－グルタミン酸酸化酵素を産生する組換え大腸菌を取得した。なお、Ｃ末にはＨｉｓ－ｔａｇ配列を付与したタンパク質として発現するように酵素本来の終止コドンを削除し、ｐＥＴ２１（ａ）＋ベクターに由来する終止コドンを使用した。

【0037】

前記組換え大腸菌をＬＢ液体培地で培養して得られた菌体を１ｍＭ塩化カルシウムを含む１０ｍＭ酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に懸濁し、超音波破砕により菌体を破砕後、遠心して回収した無細胞抽出液を、イオン交換クロマトグラフィーとしてＣｅｌｌｕｆｉｎｅ ＤＥＡＥ Ａ－５００ｍカラムに吸着させた後、１ｍＭ塩化カルシウムを含む１０ｍＭ酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で洗浄し、該緩衝液から、同緩衝液にさらに１，０００ｍＭ塩化ナトリウムを加えた緩衝液へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させ、活性画分を回収した。回収した酵素を、１ｍＭ塩化カルシウム及び１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で置換することで、Ｌ－グルタミン酸酸化酵素組成物を取得した。

【0038】

Ｌ－グルタミン酸酸化酵素活性は前述の酵素活性測定法で、またタンパク質濃度はＢＳＡを標準物質としたＢｒａｄｆｏｒｄ法で測定した結果、タンパク質あたりのＬ－グルタミン酸酸化酵素活性（比活性）は、２３０Ｕ／ｍｇであった。

【0039】

尚、基質として各１０ｍＭのＬ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アスパラギン酸又はＤ－グルタミン酸を使用して、Ｌ－グルタミン酸酸化酵素の作用性をそれぞれ確認したところ、Ｌ－グルタミン酸に対する活性を１００％とした場合、Ｌ－グルタミン０．１％、Ｌ－アスパラギン酸０％、Ｄ－グルタミン酸０％となり、優れた基質特異性を有するＬ－グルタミン酸酸化酵素であることが確認できた。