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特開2023-106912予後推定装置、情報取得方法、プログラム及び胆道癌の予後推定用キット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023106912
(43)【公開日】2023-08-02
(54)【発明の名称】予後推定装置、情報取得方法、プログラム及び胆道癌の予後推定用キット
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/68 20180101AFI20230726BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20230726BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/68 ZNA
C12M1/00 A
【審査請求】未請求
【請求項の数】13
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022007920
(22)【出願日】2022-01-21
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＥＮＳＯＲＦＬＯＷ
(71)【出願人】
【識別番号】504258527
【氏名又は名称】国立大学法人 鹿児島大学
(74)【代理人】
【識別番号】100095407
【弁理士】
【氏名又は名称】木村 満
(74)【代理人】
【識別番号】100168114
【弁理士】
【氏名又は名称】山中 生太
(74)【代理人】
【識別番号】100162259
【弁理士】
【氏名又は名称】末富 孝典
(74)【代理人】
【識別番号】100146916
【弁理士】
【氏名又は名称】廣石 雅紀
(72)【発明者】
【氏名】横山 勢也
(72)【発明者】
【氏名】谷本 昭英
(72)【発明者】
【氏名】東 美智代
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA23
4B029AA27
4B029BB11
4B029BB20
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QQ28
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR55
4B063QR62
4B063QR72
4B063QR77
4B063QS25
4B063QX01
(57)【要約】
【課題】胆道癌の予後を正確に推定できる予後推定装置、情報取得方法、プログラム及び胆道癌の予後推定用キットを提供する。
【解決手段】予後推定装置１は、予後が未知である胆道癌を有する対象由来の検体試料に含まれる遺伝子のメチル化の状況を示す情報に基づいて対象の予後を推定する推定部１０を備える。遺伝子は、ＭＵＣ１、ＭＵＣ４、ＴＭＥＦＦ２、ＥＣＡＤ、ＢＲＣＡ１、ＡＱＰ１、ＭＳＨ２、ＧＬＵＴ１、ＭＵＣ２、ＲＡＲｂ、ＳＬＣ５Ａ７、ＳＭＡＤ４及びＭＧＭＴからなる群から選択される少なくとも１種である。
【選択図】図１
【解決手段】予後推定装置１は、予後が未知である胆道癌を有する対象由来の検体試料に含まれる遺伝子のメチル化の状況を示す情報に基づいて対象の予後を推定する推定部１０を備える。遺伝子は、ＭＵＣ１、ＭＵＣ４、ＴＭＥＦＦ２、ＥＣＡＤ、ＢＲＣＡ１、ＡＱＰ１、ＭＳＨ２、ＧＬＵＴ１、ＭＵＣ２、ＲＡＲｂ、ＳＬＣ５Ａ７、ＳＭＡＤ４及びＭＧＭＴからなる群から選択される少なくとも１種である。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
予後が未知である胆道癌を有する第１の対象由来の検体試料に含まれる遺伝子のメチル化の状況を示す情報に基づいて前記第１の対象の予後を推定する推定部を備え、
前記遺伝子は、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＡＱＰ１、ＳＬＣ５Ａ７、ＧＬＵＴ１、ＥＣＡＤ、ＴＭＥＦＦ２、ＭＧＭＴ、ＲＡＲｂ、ＳＭＡＤ４、ＢＲＣＡ１及びＭＳＨ２からなる群から選択される少なくとも１種である、
予後推定装置。
前記遺伝子は、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＡＱＰ１、ＳＬＣ５Ａ７、ＧＬＵＴ１、ＥＣＡＤ、ＴＭＥＦＦ２、ＭＧＭＴ、ＲＡＲｂ、ＳＭＡＤ４、ＢＲＣＡ１及びＭＳＨ２からなる群から選択される少なくとも１種である、
予後推定装置。
【請求項2】
前記メチル化の状況を示す情報は、
前記遺伝子内に含まれるＣｐＧ部位がメチル化されていない程度を示す指標である、
請求項１に記載の予後推定装置。
前記遺伝子内に含まれるＣｐＧ部位がメチル化されていない程度を示す指標である、
請求項１に記載の予後推定装置。
【請求項3】
ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＳＬＣ５Ａ７、ＥＣＡＤ、ＭＧＭＴ、ＲＡＲｂ、ＳＭＡＤ４、ＢＲＣＡ１及びＭＳＨ２における前記ＣｐＧ部位は、
前記遺伝子のプロモーター配列の一部を含む領域におけるＣｐＧ部位である、
請求項２に記載の予後推定装置。
前記遺伝子のプロモーター配列の一部を含む領域におけるＣｐＧ部位である、
請求項２に記載の予後推定装置。
【請求項4】
ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＳＬＣ５Ａ７、ＥＣＡＤ、ＲＡＲｂ、ＳＭＡＤ４、ＢＲＣＡ１及びＭＳＨ２における前記領域は、
転写開始点を含む、
請求項３に記載の予後推定装置。
転写開始点を含む、
請求項３に記載の予後推定装置。
【請求項5】
前記遺伝子は、
ＡＱＰ１、ＳＬＣ５Ａ７、ＧＬＵＴ１及びＲＡＲｂである、
請求項１から４のいずれか一項に記載の予後推定装置。
ＡＱＰ１、ＳＬＣ５Ａ７、ＧＬＵＴ１及びＲＡＲｂである、
請求項１から４のいずれか一項に記載の予後推定装置。
【請求項6】
前記遺伝子は、
ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＧＬＵＴ１及びＢＲＣＡ１である、
請求項１から４のいずれか一項に記載の予後推定装置。
ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＧＬＵＴ１及びＢＲＣＡ１である、
請求項１から４のいずれか一項に記載の予後推定装置。
【請求項7】
前記推定部は、
前記第１の対象の予後として、胆道腫瘍組織の摘出後の前記第１の対象の生存期間を推定する、
請求項１から６のいずれか一項に記載の予後推定装置。
前記第１の対象の予後として、胆道腫瘍組織の摘出後の前記第１の対象の生存期間を推定する、
請求項１から６のいずれか一項に記載の予後推定装置。
【請求項8】
前記検体試料は、
胆道の非腫瘍組織を含む、
請求項１から７のいずれか一項に記載の予後推定装置。
胆道の非腫瘍組織を含む、
請求項１から７のいずれか一項に記載の予後推定装置。
【請求項9】
前記推定部は、
予後が判明している胆道癌を有する第２の対象由来の検体試料に含まれる遺伝子のメチル化の状況を示す情報と、判明している予後に関する情報との関係を示すサンプルデータに基づく教師あり学習で生成されたモデルによって、前記第１の対象の予後を推定する、
請求項１から８のいずれか一項に記載の予後推定装置。
予後が判明している胆道癌を有する第２の対象由来の検体試料に含まれる遺伝子のメチル化の状況を示す情報と、判明している予後に関する情報との関係を示すサンプルデータに基づく教師あり学習で生成されたモデルによって、前記第１の対象の予後を推定する、
請求項１から８のいずれか一項に記載の予後推定装置。
【請求項10】
前記推定部は、
前記サンプルデータを用いた教師あり学習を実行することにより、前記モデルを生成する、
請求項９に記載の予後推定装置。
前記サンプルデータを用いた教師あり学習を実行することにより、前記モデルを生成する、
請求項９に記載の予後推定装置。
【請求項11】
予後が未知である胆道癌を有する対象由来の検体試料に含まれる遺伝子のメチル化の状況を示す情報に基づいて前記対象の予後に関する情報を取得する取得ステップを含み、
前記遺伝子は、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＡＱＰ１、ＳＬＣ５Ａ７、ＧＬＵＴ１、ＥＣＡＤ、ＴＭＥＦＦ２、ＭＧＭＴ、ＲＡＲｂ、ＳＭＡＤ４、ＢＲＣＡ１及びＭＳＨ２からなる群から選択される少なくとも１種である、
情報取得方法。
前記遺伝子は、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＡＱＰ１、ＳＬＣ５Ａ７、ＧＬＵＴ１、ＥＣＡＤ、ＴＭＥＦＦ２、ＭＧＭＴ、ＲＡＲｂ、ＳＭＡＤ４、ＢＲＣＡ１及びＭＳＨ２からなる群から選択される少なくとも１種である、
情報取得方法。
【請求項12】
コンピュータを、
予後が未知である胆道癌を有する対象由来の検体試料に含まれる遺伝子のメチル化の状況を示す情報に基づいて前記対象の予後を推定する推定部として機能させ、
前記遺伝子は、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＡＱＰ１、ＳＬＣ５Ａ７、ＧＬＵＴ１、ＥＣＡＤ、ＴＭＥＦＦ２、ＭＧＭＴ、ＲＡＲｂ、ＳＭＡＤ４、ＢＲＣＡ１及びＭＳＨ２からなる群から選択される少なくとも１種である、
プログラム。
予後が未知である胆道癌を有する対象由来の検体試料に含まれる遺伝子のメチル化の状況を示す情報に基づいて前記対象の予後を推定する推定部として機能させ、
前記遺伝子は、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＡＱＰ１、ＳＬＣ５Ａ７、ＧＬＵＴ１、ＥＣＡＤ、ＴＭＥＦＦ２、ＭＧＭＴ、ＲＡＲｂ、ＳＭＡＤ４、ＢＲＣＡ１及びＭＳＨ２からなる群から選択される少なくとも１種である、
プログラム。
【請求項13】
胆道癌を有する対象由来の検体試料に含まれる遺伝子のメチル化の状況を検出する試薬を備え、
前記遺伝子は、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＡＱＰ１、ＳＬＣ５Ａ７、ＧＬＵＴ１、ＥＣＡＤ、ＴＭＥＦＦ２、ＭＧＭＴ、ＲＡＲｂ、ＳＭＡＤ４、ＢＲＣＡ１及びＭＳＨ２からなる群から選択される少なくとも１種である、
胆道癌の予後推定用キット。
前記遺伝子は、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＡＱＰ１、ＳＬＣ５Ａ７、ＧＬＵＴ１、ＥＣＡＤ、ＴＭＥＦＦ２、ＭＧＭＴ、ＲＡＲｂ、ＳＭＡＤ４、ＢＲＣＡ１及びＭＳＨ２からなる群から選択される少なくとも１種である、
胆道癌の予後推定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、予後推定装置、情報取得方法、プログラム及び胆道癌の予後推定用キットに関する。
【背景技術】
【0002】
日本における癌死は死因の第１位であり、年間３７万人を超えている。がん全体における胆道癌の割合は約２％であるが、胆道癌の罹患数はがん全体では１３位で、胆道癌による死亡数は６位である。胆道癌の５年相対生存率は約２７％と極めて低く、胆道癌は難治性癌の代表とも言える。
【0003】
胆道癌は外科的に取り除くことが唯一の根治的治療法となっている。癌の拡がりのわずかな違いにより手術の方法が大きく異なるため精密な診断を要するが、胆道腫瘍の拡がりを画像情報だけで判断することは困難である。
【0004】
胆道癌の予後とアポタンパク質に糖鎖が結合した糖タンパク質であるムチンとの関連が示唆されている。例えば、非特許文献１では、肝内胆管癌（ＩＣＣ）組織におけるＭＵＣ１の発現が高い患者の予後は発現の低い患者より不良で、逆に、ＭＵＣ２の発現が高い患者の予後は発現の低い患者よりも良好であることが報告されている。
【0005】
非特許文献２では、腫瘤形成型のＩＣＣ組織におけるＭＵＣ４の発現が高い患者の予後は発現の低い患者よりも不良であることが報告されている。非特許文献３には、肝外胆管癌において、ＭＵＣ１及びＭＵＣ４の発現が予後の増悪因子であることが報告されている。
【0006】
胆道癌の予後に関して、ムチン以外のマーカーも報告されている。例えば、非特許文献４には、ＩＣＣにおいて、アクアポリン１（ＡＱＰ１）の発現が低い患者の予後が発現の高い患者よりも不良であることが報告されている。
【0007】
特許文献１には、機械学習の手法を応用して、生体試料から抽出される特徴量の統計的な差異に基づいて結腸癌、肺癌、黒色腫、乳癌、肝臓癌及び膵臓癌等の癌の患者の予後を推定する技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】特表２０２１－５２１５３６号公報
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Michiyo Higashi，外６名，“Expression of MUC1 and MUC2 Mucin Antigens in Intrahepatic Bile Duct Tumors: Its Relationship With a New Morphological Classification of Cholangiocarcinoma”，HEPATOLOGY，1999，30，1347-1355
【非特許文献2】Hiroaki Shibahara，外７名，“MUC4 Is a Novel Prognostic Factor of Intrahepatic Cholangiocarcinoma-Mass Forming Type”，HEPATOLOGY，2004，39，220-229
【非特許文献3】Shugo Tamada，外６名，“MUC4 Is a Novel Prognostic Factor of Extrahepatic Bile Duct Carcinoma”，Clin Cancer Res，2006，12，4257-4264
【非特許文献4】Shinichi Aishima，外７名，“Down-regulation of aquaporin-1 in intrahepatic cholangiocarcinoma is related to tumor progression and mucin expression”，Human Pathology，2007，38 (12)，1819-1825
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
上記特許文献１では、胆道癌については検討されていない。胆道癌の患者は胆道腫瘍を切除しても予後不良である症例が比較的多いため、予後の予測、特には外科的治療の適応性を予測できれば臨床的に極めて有用である。
【0011】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、胆道癌の予後を正確に推定できる予後推定装置、情報取得方法、プログラム及び胆道癌の予後推定用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明の第１の観点に係る予後推定装置は、
予後が未知である胆道癌を有する第１の対象由来の検体試料に含まれる遺伝子のメチル化の状況を示す情報に基づいて前記第１の対象の予後を推定する推定部を備え、
前記遺伝子は、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＡＱＰ１、ＳＬＣ５Ａ７、ＧＬＵＴ１、ＥＣＡＤ、ＴＭＥＦＦ２、ＭＧＭＴ、ＲＡＲｂ、ＳＭＡＤ４、ＢＲＣＡ１及びＭＳＨ２からなる群から選択される少なくとも１種である。
予後が未知である胆道癌を有する第１の対象由来の検体試料に含まれる遺伝子のメチル化の状況を示す情報に基づいて前記第１の対象の予後を推定する推定部を備え、
前記遺伝子は、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＡＱＰ１、ＳＬＣ５Ａ７、ＧＬＵＴ１、ＥＣＡＤ、ＴＭＥＦＦ２、ＭＧＭＴ、ＲＡＲｂ、ＳＭＡＤ４、ＢＲＣＡ１及びＭＳＨ２からなる群から選択される少なくとも１種である。
【0013】
前記メチル化の状況を示す情報は、
前記遺伝子内に含まれるＣｐＧ部位がメチル化されていない程度を示す指標である、
こととしてもよい。
前記遺伝子内に含まれるＣｐＧ部位がメチル化されていない程度を示す指標である、
こととしてもよい。
【0014】
ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＳＬＣ５Ａ７、ＥＣＡＤ、ＭＧＭＴ、ＲＡＲｂ、ＳＭＡＤ４、ＢＲＣＡ１及びＭＳＨ２における前記ＣｐＧ部位は、
前記遺伝子のプロモーター配列の一部を含む領域におけるＣｐＧ部位である、
こととしてもよい。
前記遺伝子のプロモーター配列の一部を含む領域におけるＣｐＧ部位である、
こととしてもよい。
【0015】
ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＳＬＣ５Ａ７、ＥＣＡＤ、ＲＡＲｂ、ＳＭＡＤ４、ＢＲＣＡ１及びＭＳＨ２における前記領域は、
転写開始点を含む、
こととしてもよい。
転写開始点を含む、
こととしてもよい。
【0016】
前記遺伝子は、
ＡＱＰ１、ＳＬＣ５Ａ７、ＧＬＵＴ１及びＲＡＲｂである、
こととしてもよい。
ＡＱＰ１、ＳＬＣ５Ａ７、ＧＬＵＴ１及びＲＡＲｂである、
こととしてもよい。
【0017】
前記遺伝子は、
ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＧＬＵＴ１及びＢＲＣＡ１である、
こととしてもよい。
ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＧＬＵＴ１及びＢＲＣＡ１である、
こととしてもよい。
【0018】
前記推定部は、
前記第１の対象の予後として、胆道腫瘍組織の摘出後の前記第１の対象の生存期間を推定する、
こととしてもよい。
前記第１の対象の予後として、胆道腫瘍組織の摘出後の前記第１の対象の生存期間を推定する、
こととしてもよい。
【0019】
前記検体試料は、
胆道の非腫瘍組織を含む、
こととしてもよい。
胆道の非腫瘍組織を含む、
こととしてもよい。
【0020】
前記推定部は、
予後が判明している胆道癌を有する第２の対象由来の検体試料に含まれる遺伝子のメチル化の状況を示す情報と、判明している予後に関する情報との関係を示すサンプルデータに基づく教師あり学習で生成されたモデルによって、前記第１の対象の予後を推定する、
こととしてもよい。
予後が判明している胆道癌を有する第２の対象由来の検体試料に含まれる遺伝子のメチル化の状況を示す情報と、判明している予後に関する情報との関係を示すサンプルデータに基づく教師あり学習で生成されたモデルによって、前記第１の対象の予後を推定する、
こととしてもよい。
【0021】
前記推定部は、
前記サンプルデータを用いた教師あり学習を実行することにより、前記モデルを生成する、
こととしてもよい。
前記サンプルデータを用いた教師あり学習を実行することにより、前記モデルを生成する、
こととしてもよい。
【0022】
本発明の第２の観点に係る情報取得方法は、
予後が未知である胆道癌を有する対象由来の検体試料に含まれる遺伝子のメチル化の状況を示す情報に基づいて前記対象の予後に関する情報を取得する取得ステップを含み、
前記遺伝子は、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＡＱＰ１、ＳＬＣ５Ａ７、ＧＬＵＴ１、ＥＣＡＤ、ＴＭＥＦＦ２、ＭＧＭＴ、ＲＡＲｂ、ＳＭＡＤ４、ＢＲＣＡ１及びＭＳＨ２からなる群から選択される少なくとも１種である。
予後が未知である胆道癌を有する対象由来の検体試料に含まれる遺伝子のメチル化の状況を示す情報に基づいて前記対象の予後に関する情報を取得する取得ステップを含み、
前記遺伝子は、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＡＱＰ１、ＳＬＣ５Ａ７、ＧＬＵＴ１、ＥＣＡＤ、ＴＭＥＦＦ２、ＭＧＭＴ、ＲＡＲｂ、ＳＭＡＤ４、ＢＲＣＡ１及びＭＳＨ２からなる群から選択される少なくとも１種である。
【0023】
本発明の第３の観点に係るプログラムは、
コンピュータを、
予後が未知である胆道癌を有する対象由来の検体試料に含まれる遺伝子のメチル化の状況を示す情報に基づいて前記対象の予後を推定する推定部として機能させ、
前記遺伝子は、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＡＱＰ１、ＳＬＣ５Ａ７、ＧＬＵＴ１、ＥＣＡＤ、ＴＭＥＦＦ２、ＭＧＭＴ、ＲＡＲｂ、ＳＭＡＤ４、ＢＲＣＡ１及びＭＳＨ２からなる群から選択される少なくとも１種である。
コンピュータを、
予後が未知である胆道癌を有する対象由来の検体試料に含まれる遺伝子のメチル化の状況を示す情報に基づいて前記対象の予後を推定する推定部として機能させ、
前記遺伝子は、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＡＱＰ１、ＳＬＣ５Ａ７、ＧＬＵＴ１、ＥＣＡＤ、ＴＭＥＦＦ２、ＭＧＭＴ、ＲＡＲｂ、ＳＭＡＤ４、ＢＲＣＡ１及びＭＳＨ２からなる群から選択される少なくとも１種である。
【0024】
本発明の第４の観点に係る胆道癌の予後推定用キットは、
胆道癌を有する対象由来の検体試料に含まれる遺伝子のメチル化の状況を検出する試薬を備え、
前記遺伝子は、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＡＱＰ１、ＳＬＣ５Ａ７、ＧＬＵＴ１、ＥＣＡＤ、ＴＭＥＦＦ２、ＭＧＭＴ、ＲＡＲｂ、ＳＭＡＤ４、ＢＲＣＡ１及びＭＳＨ２からなる群から選択される少なくとも１種である。
胆道癌を有する対象由来の検体試料に含まれる遺伝子のメチル化の状況を検出する試薬を備え、
前記遺伝子は、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＡＱＰ１、ＳＬＣ５Ａ７、ＧＬＵＴ１、ＥＣＡＤ、ＴＭＥＦＦ２、ＭＧＭＴ、ＲＡＲｂ、ＳＭＡＤ４、ＢＲＣＡ１及びＭＳＨ２からなる群から選択される少なくとも１種である。
【発明の効果】
【0025】
本発明によれば、胆道癌の予後を正確に推定できる。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1】本発明の実施の形態に係る予後推定装置の構成を示すブロック図である。
【図2】本実施の形態に係る各遺伝子におけるメチル化の程度を取得する塩基配列、メチル化部位、及び当該塩基配列に含まれるプロモーター配列を示す図である。
【図3】本実施の形態に係る各遺伝子におけるメチル化の程度を取得する塩基配列、及びメチル化部位を示す図である。
【図7】ＭＵＣ１についてメチル化されているメチル化部位の個数それぞれの割合の分布を示す図である。
【図8】ＭＵＣ１のメチル化部位がメチル化されていない程度を示す指標（脱メチル化指数）で分けられる２群それぞれの生存曲線を示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ非腫瘍部及び腫瘍部の検体試料を解析した結果である。
【図9】ＭＵＣ２についてメチル化されているメチル化部位の個数それぞれの割合の分布を示す図である。
【図10】ＭＵＣ２の脱メチル化指数で分けられる２群それぞれの生存曲線を示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ非腫瘍部及び腫瘍部の検体試料を解析した結果である。
【図11】ＭＵＣ４についてメチル化されているメチル化部位の個数それぞれの割合の分布を示す図である。
【図12】ＭＵＣ４の脱メチル化指数で分けられる２群それぞれの生存曲線を示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ非腫瘍部及び腫瘍部の検体試料を解析した結果である。
【図13】ＡＱＰ１についてメチル化されているメチル化部位の個数それぞれの割合の分布を示す図である。
【図14】ＡＱＰ１の脱メチル化指数で分けられる２群それぞれの生存曲線を示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ非腫瘍部及び腫瘍部の検体試料を解析した結果である。
【図15】ＳＬＣ５Ａ７についてメチル化されているメチル化部位の個数それぞれの割合の分布を示す図である。
【図16】ＳＬＣ５Ａ７の脱メチル化指数で分けられる２群それぞれの生存曲線を示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ非腫瘍部及び腫瘍部の検体試料を解析した結果である。
【図17】ＧＬＵＴ１についてメチル化されているメチル化部位の個数それぞれの割合の分布を示す図である。
【図18】ＧＬＵＴ１の脱メチル化指数で分けられる２群それぞれの生存曲線を示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ非腫瘍部及び腫瘍部の検体試料を解析した結果である。
【図19】ＥＣＡＤについてメチル化されているメチル化部位の個数それぞれの割合の分布を示す図である。
【図20】ＥＣＡＤの脱メチル化指数で分けられる２群それぞれの生存曲線を示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ非腫瘍部及び腫瘍部の検体試料を解析した結果である。
【図21】ＴＭＥＦＦ２についてメチル化されているメチル化部位の個数それぞれの割合の分布を示す図である。
【図22】ＴＭＥＦＦ２の脱メチル化指数で分けられる２群それぞれの生存曲線を示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ非腫瘍部及び腫瘍部の検体試料を解析した結果である。
【図23】ＭＧＭＴについてメチル化されているメチル化部位の個数それぞれの割合の分布を示す図である。
【図24】ＭＧＭＴの脱メチル化指数で分けられる２群それぞれの生存曲線を示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ非腫瘍部及び腫瘍部の検体試料を解析した結果である。
【図25】ＲＡＲｂについてメチル化されているメチル化部位の個数それぞれの割合の分布を示す図である。
【図26】ＲＡＲｂの脱メチル化指数で分けられる２群それぞれの生存曲線を示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ非腫瘍部及び腫瘍部の検体試料を解析した結果である。
【図27】ＳＭＡＤ４についてメチル化されているメチル化部位の個数それぞれの割合の分布を示す図である。
【図28】ＳＭＡＤ４の脱メチル化指数で分けられる２群それぞれの生存曲線を示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ非腫瘍部及び腫瘍部の検体試料を解析した結果である。
【図29】ＢＲＣＡ１についてメチル化されているメチル化部位の個数それぞれの割合の分布を示す図である。
【図30】ＢＲＣＡ１の脱メチル化指数で分けられる２群それぞれの生存曲線を示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ非腫瘍部及び腫瘍部の検体試料を解析した結果である。
【図31】ＭＳＨ２についてメチル化されているメチル化部位の個数それぞれの割合の分布を示す図である。
【図32】ＭＳＨ２の脱メチル化指数で分けられる２群それぞれの生存曲線を示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ非腫瘍部及び腫瘍部の検体試料を解析した結果である。
【図33】ＡＱＰ１、ＳＬＣ５Ａ７、ＧＬＵＴ１及びＲＡＲｂの脱メチル化指数を組み合わせたモデルで分けられる２群それぞれの生存曲線を示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ非腫瘍部及び腫瘍部の検体試料を解析した結果である。
【図34】ＡＱＰ１、ＳＬＣ５Ａ７、ＧＬＵＴ１及びＲＡＲｂの脱メチル化指数を組み合わせたモデルの４分割交差検定の結果を示す図である。
【図35】ＡＱＰ１、ＳＬＣ５Ａ７、ＧＬＵＴ１及びＲＡＲｂの脱メチル化指数を組み合わせたモデルの２分割交差検定の結果を示す図である。
【図36】ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＧＬＵＴ１及びＢＲＣＡ１の脱メチル化指数を組み合わせたモデルで分けられる２群それぞれの生存曲線を示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ非腫瘍部及び腫瘍部の検体試料を解析した結果である。
【図37】ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＧＬＵＴ１及びＢＲＣＡ１の脱メチル化指数を組み合わせたモデルの４分割交差検定の結果を示す図である。
【図38】ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＧＬＵＴ１及びＢＲＣＡ１の脱メチル化指数を組み合わせたモデルの２分割交差検定の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0027】
以下、本発明に係る実施の形態について図面を参照して詳細に説明する。各図面においては、同一又は同等の部分には同一の符号が付される。
【0028】
本実施の形態に係る予後推定装置は、予後が未知である胆道癌を有する対象の予後、特には術後予後を推定するための装置である。対象とは、胆道を有する動物であれば特に限定されず、イヌ、ネコ、ブタ及びサル等が挙げられ、好ましくはヒトである。
【0029】
予後推定装置は、コンピュータ上に構築される。すなわち、予後推定装置は、ソフトウエアによる情報処理が、ハードウエア資源を用いて具体的に実現される情報処理装置である。
【0030】
図１に示すように、予後推定装置１は、遺伝子のメチル化の状況を示す情報（メチル化データ）２を入力する。遺伝子は、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＡＱＰ１、ＳＬＣ５Ａ７、ＧＬＵＴ１、ＥＣＡＤ、ＴＭＥＦＦ２、ＭＧＭＴ、ＲＡＲｂ、ＳＭＡＤ４、ＢＲＣＡ１及びＭＳＨ２の少なくとも１種である。ここでの“遺伝子”とは、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）よりも上流のプロモーター及びエンハンサー等の当該遺伝子の発現を制御する転写調節領域、５’ＵＴＲ、開始コドンから終止コドンまでのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、並びに３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含むものとする。ＤＮＡのメチル化は、主にシトシンに生じるメチル基による修飾をいう。メチル化の状況を示す情報は、塩基配列における５’－ＣＧ－３’の部位（以下、“ＣｐＧ部位”ともいう）のシトシンのメチル化又は脱メチル化の程度を示す値である。
【0031】
メチル化データは、対象由来の検体試料から公知の方法で取得される。検体試料は、例えば、胆道癌を有する対象から摘出術によって採取された組織検体の腫瘍組織及び非腫瘍組織、細胞診検体、術中迅速診断の凍結組織検体の他、膵液及び末梢血等の体液検体である。メチル化データは、遺伝子に関して、ＣｐＧ部位がメチル化した塩基配列とメチル化していない塩基配列とを識別できる公知の方法によって解析することで取得できる。
【0032】
例えば、検体試料から抽出した遺伝子をバイサルファイトで処理することで、メチル化されていないシトシンは、ウラシルに変換され、メチル化されているシトシンを含む塩基配列と異なる塩基配列となる。さらに、メチル化されたシトシンを含む塩基配列とメチル化されていないシトシンを含む塩基配列とをそれぞれ増幅可能なプライマーを用いて、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行うことで増幅させたＤＮＡの塩基配列を、次世代シーケンサー等を使用して決定すればよい。ＰＣＲの結果、増幅産物ではバイサルファイト処理で変換されたウラシルはチミンとして増幅される。結果的に検体試料中の遺伝子の塩基配列がメチル化されていないシトシンであればチミンとして読まれ、メチル化されたシトシンであればシトシンとして読まれ、メチル化データを取得できる。
【0033】
プライマーの長さは、特に限定されないが、例えば２０～４５塩基の長さとして、メチル化部位を含む８０～５００塩基、好ましくは１００～４００塩基、さらに好ましくは１２０～３５０塩基の長さの増幅産物を得るようにすればよい。
【0034】
例えば、メチル化データは、遺伝子内に含まれるＣｐＧ部位がメチル化されていない程度を示す指標である。具体的には、遺伝子内の所定の領域の塩基配列（以下、“標的配列”ともいう）中のＣｐＧ部位のうちメチル化されているＣｐＧ部位の個数が少ない増幅産物の、当該遺伝子の全増幅産物に対する割合である。メチル化されているＣｐＧ部位の個数が少ないとみなす条件は、例えば、ｍＲＮＡの発現量と一致する傾向を示す閾値、腫瘍組織と非腫瘍組織との間で有意差を示す閾値、ＴＮＭスコア及び予後等の臨床情報間で有意差を示す閾値等に基づいて設定される。少ないとみなされる、メチル化されているＣｐＧ部位の個数の上限は、標的配列中のＣｐＧ部位の個数に応じて増減させてもよく、適宜設定されるが、例えば、標的配列中にＣｐＧ部位が８個ある場合、メチル化されているＣｐＧ部位が０個、１個、２個又は３個である増幅産物の全増幅産物に対する割合である。
【0035】
好ましくは、遺伝子がＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＳＬＣ５Ａ７、ＥＣＡＤ、ＭＧＭＴ、ＲＡＲｂ、ＳＭＡＤ４、ＢＲＣＡ１及びＭＳＨ２の場合、ＣｐＧ部位は、遺伝子のプロモーター配列の一部を含む領域である標的配列におけるＣｐＧ部位である。図２には、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＳＬＣ５Ａ７、ＥＣＡＤ、ＭＧＭＴ、ＲＡＲｂ、ＳＭＡＤ４、ＢＲＣＡ１及びＭＳＨ２の塩基配列の一部である標的配列がそれぞれ示されている。図２において直線で囲まれている塩基配列はプロモーター配列であって、標的配列中のＣｐＧ部位が二重下線で示されている。ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＳＬＣ５Ａ７、ＥＣＡＤ、ＭＧＭＴ、ＲＡＲｂ、ＳＭＡＤ４、ＢＲＣＡ１及びＭＳＨ２の場合、プロモーター配列の一部を含む標的配列におけるＣｐＧ部位についてのメチル化データを使用するのが好ましい。
【0036】
図２において、プロモーター配列の３’末端付近には転写開始点がある。よって、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＳＬＣ５Ａ７、ＥＣＡＤ、ＲＡＲｂ、ＳＭＡＤ４、ＢＲＣＡ１及びＭＳＨ２における標的配列は転写開始点を含んでもよい。
【0037】
【0038】
予後推定装置１は、メチル化データ２に対して演算を行って、予後に関する情報（予後情報）３を出力する。予後情報３としては、術後の生存期間の他に、胆道腫瘍組織の摘出術の適応、腫瘍の転移の有無及び摘出術後の再発の有無又は再発までの期間等を示す情報が挙げられる。
【0039】
予後推定装置１の構成についてより詳細に説明する。以下では、予後が未知である対象を対象Ａ（第１の対象）とし、予後が判明している対象を対象Ｂ（第２の対象）とする。予後推定装置１は、図１に示すように、推定部１０を備える。推定部１０は、胆道癌を有する対象Ａ由来の検体試料に含まれる遺伝子のメチル化データに基づいて対象Ａの予後を推定する。詳細には、推定部１０は、胆道癌を有する対象Ｂ由来の検体試料に含まれる遺伝子のメチル化データと、判明している予後情報との関係を示すサンプルデータに基づく教師あり学習で生成されたモデルによって、対象Ａについての予後情報を出力する。
【0040】
教師あり学習とは、説明変数とそれに付随する目的変数との組み合わせの集合を学習用データとして、学習用データに対するフィッティングを行うことにより学習を行う機械学習の一手法である。フィッティングは、学習用データに含まれる説明変数の特徴量を抽出して目的変数ごとの特徴量を選んだり、その目的変数に属するデータの特徴を抽出したり、目的変数を識別する判断基準を生成したりすることで行う。フィッティングによって、入力された説明変数からその説明変数に対応するべき目的変数を出力するモデルが生成される。モデルによって、学習用データに含まれない新たな説明変数に対応する目的変数を出力することができる。
【0041】
サンプルデータは、学習用データに相当し、説明変数は予後が判明している対象Ｂ由来の検体試料に含まれる遺伝子のメチル化データであって、目的変数は対象Ｂの予後情報である。推定部１０が用いるモデルは、学習用である複数の対象Ｂ由来の検体試料から取得されるメチル化データと、各対象Ｂの予後を示す情報との組み合わせの集合をサンプルデータとして生成されたモデルである。
【0042】
例えば、サンプルデータは、遺伝子Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３・・・Ｇｎそれぞれのメチル化データをｖ１、ｖ２、ｖ３・・・ｖｎとして、ｖ１～ｖｎが説明変数である。目的変数は、予後情報としての胆道腫瘍組織の摘出後の当該対象の生存期間である。
【0043】
推定部１０は、対象Ａ由来の検体試料から取得されたメチル化データを、あらかじめ生成されたモデルに入力することで、対象Ａの胆道腫瘍組織の摘出後の生存期間を出力として得る。これにより、推定部１０は、対象Ａの予後を推定できる。
【0044】
教師あり学習で生成するモデルには、公知の任意のモデルを採用すればよい。教師あり学習のモデルとしては、例えば、線形回帰、線形分類、ロジスティック回帰、サポートベクターマシーン、ランダムフォレスト、決定木、ニューラルネットワーク、畳み込みニューラルネットワーク、パーセプトロン、ディープラーニング及びｋ近傍法等が挙げられる。教師あり学習には、Ｒ、Ｊｕｂａｔｕｓ、Ｔｈｅａｎｏ及びＴｅｎｓｏｒＦｌｏｗ等、種々のフレームワークを利用できる。
【0045】
好ましくは、上記モデルは、線形回帰モデル又は線形分類モデルである。線形回帰モデル及び線形分類モデルは、説明変数とそれに対応するべき目的変数とを写像する関数である。線形回帰モデルの場合、目的変数として連続値を予測することができる。線形分類モデルでは、目的変数としてラベル（カテゴリ）を判定することができる。目的変数がラベルの場合、例えば、生存期間が５年未満を予後不良、５年以上を予後良好とした２つのラベルとすることができる。
【0046】
説明変数として用いる遺伝子の数は１つであってもよいが、複数種の遺伝子を組み合わせて用いることで、推定の精度の向上が期待できる。組み合わせられる遺伝子の種類は、２～１０種類、２～８種類、２～６種類又は２～５種類である。推定に使用される遺伝子は、例えば、ＡＱＰ１、ＳＬＣ５Ａ７、ＧＬＵＴ１及びＲＡＲｂであってもよいし、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＧＬＵＴ１及びＢＲＣＡ１であってもよい。
【0047】
推定部１０は、サンプルデータを用いた教師あり学習を実行することにより、モデルを生成する。実際には、サンプルデータは複数の対象Ｂから取得される。予後不良、すなわち生存期間が短い対象Ｂ、及び予後良好、すなわち生存期間が長い対象Ｂ由来の検体試料から取得されたサンプルデータを多数使用することで推定の精度を向上させることができる。
【0048】
図１に示す予後推定装置１は、例えば、図４に示すハードウエア構成を有するコンピュータがソフトウエアプログラムを実現することにより実現される。具体的には、予後推定装置１は、装置全体の制御を司るＣＰＵ（Central Processing Unit）２１と、ＣＰＵ２１の作業領域等として動作する主記憶部２２と、ＣＰＵ２１の動作プログラム等を記憶する外部記憶部２３と、操作部２４と、表示部２５と、通信インターフェイス２６と、これらを接続する内部バス２７から構成される。
【0049】
主記憶部２２は、ＲＡＭ（Random Access Memory）等から構成されている。主記憶部２２には、ＣＰＵ２１の推定プログラム２８と、機械学習プログラム２９と、サンプルデータ３０と、メチル化データ２とが外部記憶部２３からロードされる。また、主記憶部２２は、ＣＰＵ２１の作業領域（データの一時記憶領域）としても用いられる。
【0050】
外部記憶部２３は、フラッシュメモリ、ハードディスク等の不揮発性メモリから構成される。外部記憶部２３には、ＣＰＵ２１に実行させるための推定プログラム２８と、機械学習プログラム２９と、があらかじめ記憶されている。また、外部記憶部２３には、さらに、サンプルデータ３０と、対象Ａ由来の検体試料から取得されたメチル化データ２とが記憶される。
【0051】
操作部２４は、キーボード及びマウス等のデバイスと、これらのデバイスを内部バス２７に接続するインターフェイス装置から構成されている。
【0052】
表示部２５は、ＣＲＴ（Cathode Ray Tube）、液晶モニタ等の表示用デバイスから構成される。
【0053】
通信インターフェイス２６は、外部機器とのデータ送受信を行うインターフェイスである。通信インターフェイス２６を介して、サンプルデータ３０又はメチル化データ２が送受信される。
【0054】
次に、本実施の形態に係る予後推定装置１の動作によって実現される情報取得方法、すなわち予後推定装置１によって実行される処理について説明する。予後推定装置１によって実行される処理は、図５に示す学習段階の処理と、図６に示す推定段階の処理とに分かれている。
【0055】
まず、学習段階の処理について説明する。学習段階では、機械学習プログラム２９が外部記憶部２３から主記憶部２２に読み込まれ、ＣＰＵ２１が、機械学習プログラム２９を実行することにより、処理が実行される。
【0056】
図６に示すように、まず、予後推定装置１は、サンプルデータ３０の読み込みを行う（ステップＳ１）。ここでは、サンプルデータ３０が外部記憶部２３から主記憶部２２に読み込まれる。
【0057】
続いて、推定部１０は、サンプルデータ３０を用いて教師あり学習を行う（ステップＳ２）。教師あり学習により、教師あり学習で生成されたモデルは、後述される推定プログラム２８で用いられるため、主記憶部２２及び外部記憶部２３に記憶される。ステップＳ２が完了すると、予後推定装置１は、学習段階の処理を終了する。
【0058】
次に、推定段階の処理について説明する。推定段階では、推定プログラム２８が外部記憶部２３から主記憶部２２に読み込まれ、ＣＰＵ２１が、推定プログラム２８を実行することにより、処理が実行される。
【0059】
図６に示すように、まず、予後推定装置１は、メチル化データ２の読み込みを行う（ステップＳ１１）。ここでは、メチル化データ２が外部記憶部２３から主記憶部２２に読み込まれる。続いて、推定部１０は、教師あり学習で生成されたモデルに従ってメチル化データ２から対象Ａの予後が推定され、予後情報が出力される（ステップＳ１２）。ステップＳ１２が完了すると、予後推定装置１は、推定段階の処理を終了する。
【0060】
本実施の形態に係る予後推定装置１は、下記実施例に示すように、胆道癌を有する対象Ｂの予後に相関する遺伝子に係るメチル化データに基づく教師あり学習で生成されたモデルによって対象Ａの胆道癌の予後、例えば胆道腫瘍組織の摘出後の対象Ａの生存期間を推定する。このため、対象Ａの胆道癌の予後を正確に推定することができる。本実施の形態では、遺伝子の発現抑制に関与するＣｐＧ部位がメチル化されていない程度を示す指標を用いてもよいこととした。遺伝子の発現量としてｍＲＮＡを定量する場合、ｍＲＮＡはＤＮＡより不安定であるとともに、ＤＮＡに逆転写する必要があり、検体試料の調整が煩雑となりやすい。この点、メチル化データは抽出したＤＮＡを処理すればよいので、精度よく予後を推定できる。
【0061】
ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＳＬＣ５Ａ７、ＥＣＡＤ、ＭＧＭＴ、ＲＡＲｂ、ＳＭＡＤ４、ＢＲＣＡ１及びＭＳＨ２については、ＣｐＧ部位をプロモーター配列の一部を含む標的配列におけるＣｐＧ部位であってもよいこととした。プロモーター配列の塩基のメチル化は、当該プロモーター配列によって発現が制御される遺伝子の発現への影響が大きいため、これら遺伝子の発現をより反映したモデルによって、予後を正確に推定することができる。
【0062】
本実施の形態では、複数の遺伝子として、ＡＱＰ１、ＳＬＣ５Ａ７、ＧＬＵＴ１及びＲＡＲｂの組み合わせ、又はＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＧＬＵＴ１及びＢＲＣＡ１の組み合わせで生成されたモデルを用いて予後を推定してもよいこととした。これら遺伝子の組み合わせのメチル化データによれば、下記実施例に示すように、良好な精度で予後を推定できる。
【0063】
本実施の形態では、検体試料は胆道の腫瘍組織を含んでもよいこととした。下記実施例に示すように、上記の遺伝子は腫瘍組織の検体試料から取得したメチル化データが予後に相関するため、予後を正確に推定できる。また、検体試料は胆道の非腫瘍組織を含んでもよいこととした。特に、下記実施例に示すように、上記のその他の遺伝子はもちろんのこと、ＥＣＡＤ及びＴＭＥＦＦ２については、非腫瘍組織の検体試料から取得したメチル化データが予後により相関するため、非腫瘍組織から取得されるＥＣＡＤ及びＴＭＥＦＦ２のメチル化データの使用は、予後の正確な推定に寄与する。
【0064】
なお、本実施の形態に係る予後推定装置１は、推定部１０でモデルを生成するようにしたが、推定部１０は、生成したモデルではなく、予後推定装置１の外部で生成され、外部記憶部２３にあらかじめ記憶されたモデルにより予後を推定してもよい。
【0065】
上述の予後推定装置１のハードウエア構成やソフトウエア構成は一例であり、任意に変更および修正が可能である。
【0066】
ＣＰＵ３１、主記憶部３２、外部記憶部３３、操作部３４、表示部３５、通信インターフェイス３６及び内部バス３８などから構成される予後推定装置１の処理を行う中心となる部分は、専用のシステムによらず、通常のコンピュータシステムを用いて実現可能である。例えば、上記の動作を実行するためのコンピュータプログラムを、コンピュータが読み取り可能な記録媒体（フレキシブルディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ－ＲＯＭ等）に格納して配布し、当該コンピュータプログラムをコンピュータにインストールすることにより、上記の処理を実行する予後推定装置１を構成してもよい。また、インターネット等の通信ネットワーク上のサーバ装置が有する記憶装置に当該コンピュータプログラムを格納しておき、通常のコンピュータシステムがダウンロード等することで予後推定装置１を構成してもよい。
【0067】
予後推定装置１の機能を、ＯＳ（オペレーティングシステム）とアプリケーションプログラムの分担、またはＯＳとアプリケーションプログラムとの協働により実現する場合などには、アプリケーションプログラム部分のみを記録媒体や記憶装置に格納してもよい。
【0068】
搬送波にコンピュータプログラムを重畳し、通信ネットワークを介して配信することも可能である。たとえば、通信ネットワーク上の掲示板（BBS, Bulletin Board System）にコンピュータプログラムを掲示し、ネットワークを介してコンピュータプログラムを配信してもよい。そして、このコンピュータプログラムを起動し、ＯＳの制御下で、他のアプリケーションプログラムと同様に実行することにより、前記の処理を実行できるように構成してもよい。
【0069】
なお、別の実施の形態では、胆道癌の予後推定用キットが提供される。予後推定用キットは、胆道癌を有する対象由来の検体試料に含まれる上記の遺伝子のメチル化の状況を検出する試薬を備える。試薬としては、バイサルファイト処理されたゲノムＤＮＡに含まれる上記遺伝子について、メチル化されたシトシンを含む塩基配列とメチル化されていないシトシンを含む塩基配列とをＰＣＲでそれぞれ増幅可能なプライマーが挙げられる。好ましくは、プライマーは、各遺伝子の上記標的配列をＰＣＲ産物の塩基配列中に含むように設計されたものである。予後推定用キットは、検体試料に含まれるゲノムＤＮＡにおけるメチル化されていないシトシンをウラシルに変換する試薬、例えばバイサルファイト（亜硫酸水素塩）を試薬として備えてもよい。予後推定用キットは、各種緩衝液、ＰＣＲによる増幅産物の塩基配列の決定に使用するその他の試薬等を備えてもよい。
【実施例0070】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【0071】
試験例１
（ＤＮＡ抽出及びバイサルファイト処理）
胆管癌患者から摘出術によって取得した組織検体の腫瘍部より１ｍｍ辺組織を採取した。臨床フローで陰性が確定している組織断端部より非腫瘍部を同様に採取した。なお、検体を採取した胆管癌患者の術後の生存期間は判明している。ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、腫瘍部の組織及び非腫瘍部の組織それぞれからＤＮＡを抽出した。次いで、ＥｐｉＴｅｃｔ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用して、抽出したＤＮＡをバイサルファイト処理に供した。
（ＤＮＡ抽出及びバイサルファイト処理）
胆管癌患者から摘出術によって取得した組織検体の腫瘍部より１ｍｍ辺組織を採取した。臨床フローで陰性が確定している組織断端部より非腫瘍部を同様に採取した。なお、検体を採取した胆管癌患者の術後の生存期間は判明している。ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、腫瘍部の組織及び非腫瘍部の組織それぞれからＤＮＡを抽出した。次いで、ＥｐｉＴｅｃｔ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用して、抽出したＤＮＡをバイサルファイト処理に供した。
【0072】
（標的配列の増幅）
バイサルファイト処理したＤＮＡについて、ＫＯＤ－Ｍｕｌｔｉ＆Ｅｐｉ（商標）（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いてＰＣＲを行い、標的配列を増幅した。対象とした遺伝子はＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＡＱＰ１、ＳＬＣ５Ａ７（コリントランスポーター）、ＧＬＵＴ１、ＥＣＡＤ、ＴＭＥＦＦ２、ＭＧＭＴ、ＲＡＲｂ、ＳＭＡＤ４、ＢＲＣＡ１及びＭＳＨ２である。
バイサルファイト処理したＤＮＡについて、ＫＯＤ－Ｍｕｌｔｉ＆Ｅｐｉ（商標）（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いてＰＣＲを行い、標的配列を増幅した。対象とした遺伝子はＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＡＱＰ１、ＳＬＣ５Ａ７（コリントランスポーター）、ＧＬＵＴ１、ＥＣＡＤ、ＴＭＥＦＦ２、ＭＧＭＴ、ＲＡＲｂ、ＳＭＡＤ４、ＢＲＣＡ１及びＭＳＨ２である。
【0073】
ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＳＬＣ５Ａ７、ＥＣＡＤ、ＭＧＭＴ、ＲＡＲｂ、ＳＭＡＤ４、ＢＲＣＡ１及びＭＳＨ２の標的配列は図２に示される。ＡＱＰ１、ＧＬＵＴ１及びＴＭＥＦＦ２の標的配列は図３に示される。
【0074】
ＰＣＲの条件は、９４℃で２分間に続き、９８℃で１０秒間、Ｔｍ値の温度で３０秒間及び６８℃で３０秒間からなるサイクルを３０サイクルとした。ＭＵＣ１、ＭＵＣ４、ＴＭＥＦＦ２、ＥＣＡＤ、ＢＲＣＡ１、ＡＱＰ１、ＭＳＨ２及びＧＬＵＴ１のＴｍ値は５９、ＭＵＣ２、ＲＡＲｂ及びＳＬＣ５Ａ７のＴｍ値は５３、ＳＭＡＤ４及びＭＧＭＴのＴｍ値は５０である。ＡＭ ｐｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）を用いてＰＣＲの増幅産物を精製した。
【0075】
各遺伝子における標的配列を増幅するためのプライマーの塩基配列を表１に示す。
【0076】
【表1】
【0077】
なお、本明細書に係る塩基配列において、“Ｙ”は“Ｃ”又は“Ｔ”を意味し、“Ｒは“Ｇ”又は“Ａ”を意味する。
【0078】
（次世代シーケンサー用のライブラリーの構築及び配列決定）
次世代シーケンサーにアプライするライブラリー（サンプル）を、ＧｅｎＮｅｘｔ（商標） ＮＧＳ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて構築した。各検体の標識には、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製のｉｎｄｅｘを用いた。ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ３（６００－ｃｙｃｌｅ）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて、ライブラリーの塩基配列を決定した。
次世代シーケンサーにアプライするライブラリー（サンプル）を、ＧｅｎＮｅｘｔ（商標） ＮＧＳ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて構築した。各検体の標識には、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製のｉｎｄｅｘを用いた。ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ３（６００－ｃｙｃｌｅ）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて、ライブラリーの塩基配列を決定した。
【0079】
（メチル化データのマイニング）
バイサルファイトシーケンスアラインメント及びメチル化検出のためのソフトウエアであるアプリケーションｂｉｓｍａｒｋを用いて、塩基配列データについてマッピングを行った。ｍｅｔｈｐａｔ（Nicholas C. Wong, et al., BMC Bioinformatics，2016，17 (98)）を用いて、メチル化シークエンスデータを抽出した。メチル化シークエンスデータに基づいて、Ｒを用いて脱メチル化指数を次のように算出した。
バイサルファイトシーケンスアラインメント及びメチル化検出のためのソフトウエアであるアプリケーションｂｉｓｍａｒｋを用いて、塩基配列データについてマッピングを行った。ｍｅｔｈｐａｔ（Nicholas C. Wong, et al., BMC Bioinformatics，2016，17 (98)）を用いて、メチル化シークエンスデータを抽出した。メチル化シークエンスデータに基づいて、Ｒを用いて脱メチル化指数を次のように算出した。
【0080】
１検体から調製され、次世代シーケンサーで塩基配列が決定された全リードについて、各遺伝子の標的配列内に含まれる被メチル化部位であるＣｐＧ部位のうち、メチル化されているＣｐＧ部位の個数を計数した。続いて、全リードにおけるメチル化されているＣｐＧ部位の個数それぞれの割合を算出した。例えば、遺伝子Ａの標的配列内のＣｐＧ部位が８個であるところ、塩基配列が決定された２０００００リードにおいて、メチル化されているＣｐＧ部位の個数が０個（Ｘ０と表記する）、１個（Ｘ１と表記する）、２個（Ｘ２と表記する）、３個（Ｘ３と表記する）、４個（Ｘ４と表記する）、５個（Ｘ５と表記する）、６個（Ｘ６と表記する）、７個（Ｘ７と表記する）及び８個（Ｘ８と表記する）のリードがそれぞれ７４０００リード、４００００リード、２００００リード、１６０００リード、１４０００リード、１２０００リード、１００００リード、８０００リード及び６０００リードとする。Ｘ０、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７及びＸ８の割合は、それぞれで３７％（７４０００／２０００００）、２０％、１０％、８％、７％、６％、５％、４％及び３％となる。この場合、遺伝子Ａの脱メチル化指数を、Ｘ０～Ｘ４の割合を合計し、８２とする。
【0081】
図７は、ＭＵＣ１を解析対象として、検体すべてについて、全リードにおけるメチル化されているＣｐＧ部位の個数それぞれの割合の分布を示す。ＭＵＣ１では脱メチル化指数（Hypomethylation Index）をＸ０～Ｘ４の割合の合計とした。非腫瘍部においてＭＵＣ１の脱メチル化指数が６５以上を陽性（positive）、６５未満を陰性（negative）とした場合の生存曲線を図８（Ａ）に示す。一方、腫瘍部においてＭＵＣ１の脱メチル化指数が６３．５以上を陽性、６３．５未満を陰性とした場合の生存曲線を図８（Ｂ）に示す。非腫瘍部及び腫瘍部のいずれでも陽性と陰性との間に生存曲線に有意な差があり、ＭＵＣ１の脱メチル化の程度が高いと、術後の生存期間が短い傾向があり、予後不良であった。
【0082】
図９は、ＭＵＣ２を解析対象として、検体すべてについて、全リードにおけるメチル化されているＣｐＧ部位の個数それぞれの割合の分布を示す。ＭＵＣ２では脱メチル化指数をＸ０～Ｘ７の割合の合計とした。非腫瘍部においてＭＵＣ２の脱メチル化指数が８５以上を陽性、８５未満を陰性とした場合の生存曲線を図１０（Ａ）に示す。一方、腫瘍部においてＭＵＣ２の脱メチル化指数が８９．９以上を陽性、８９．９未満を陰性とした場合の生存曲線を図１０（Ｂ）に示す。非腫瘍部及び腫瘍部のいずれでも陽性と陰性との間に生存曲線に有意な差があり、ＭＵＣ２の脱メチル化の程度が高いと、術後の生存期間が短い傾向があり、予後不良であった。
【0083】
同様に、ＭＵＣ４に関してＣｐＧ部位の各個数の割合の分布、非腫瘍部及び腫瘍部についての生存曲線を、図１１、図１２（Ａ）及び図１２（Ｂ）にそれぞれ示す。ＭＵＣ４については非腫瘍部及び腫瘍部のいずれでも陽性と陰性との間に生存曲線に有意な差があり、ＭＵＣ４の脱メチル化の程度が低いと、術後の生存期間が短い傾向があり、予後不良であった。
【0084】
ＡＱＰ１に関してＣｐＧ部位の各個数の割合の分布、非腫瘍部及び腫瘍部についての生存曲線を、図１３、図１４（Ａ）及び図１４（Ｂ）にそれぞれ示す。ＡＱＰ１については非腫瘍部及び腫瘍部のいずれでも陽性と陰性との間に生存曲線に有意な差があり、ＡＱＰ１の脱メチル化の程度が低いと、術後の生存期間が短い傾向があり、予後不良であった。
【0085】
ＳＬＣ５Ａ７に関してＣｐＧ部位の各個数の割合の分布、非腫瘍部及び腫瘍部についての生存曲線を、図１５、図１６（Ａ）及び図１６（Ｂ）にそれぞれ示す。ＳＬＣ５Ａ７については非腫瘍部及び腫瘍部のいずれでも陽性と陰性との間に生存曲線に有意な差があり、ＳＬＣ５Ａ７の脱メチル化の程度が低いと、術後の生存期間が短い傾向があり、予後不良であった。
【0086】
ＧＬＵＴ１に関してＣｐＧ部位の各個数の割合の分布、非腫瘍部及び腫瘍部についての生存曲線を、図１７、図１８（Ａ）及び図１８（Ｂ）にそれぞれ示す。ＧＬＵＴ１については非腫瘍部及び腫瘍部のいずれでも陽性と陰性との間に生存曲線に有意な差があり、ＧＬＵＴ１の脱メチル化の程度が高いと、術後の生存期間が短い傾向があり、予後不良であった。
【0087】
ＥＣＡＤに関してＣｐＧ部位の各個数の割合の分布、非腫瘍部及び腫瘍部についての生存曲線を、図１９、図２０（Ａ）及び図２０（Ｂ）にそれぞれ示す。ＥＣＡＤについては非腫瘍部において陽性と陰性との間に生存曲線に有意な差があり、ＥＣＡＤの脱メチル化の程度が低いと、術後の生存期間が短い傾向があり、予後不良であった。
【0088】
ＴＭＥＦＦ２に関してＣｐＧ部位の各個数の割合の分布、非腫瘍部及び腫瘍部についての生存曲線を、図２１、図２２（Ａ）及び図２２（Ｂ）にそれぞれ示す。ＴＭＥＦＦ２については非腫瘍部において陽性と陰性との間に生存曲線に有意な差があり、ＴＭＥＦＦ２の脱メチル化の程度が低いと、術後の生存期間が短い傾向があり、予後不良であった。
【0089】
ＭＧＭＴに関してＣｐＧ部位の各個数の割合の分布、非腫瘍部及び腫瘍部についての生存曲線を、図２３、図２４（Ａ）及び図２４（Ｂ）にそれぞれ示す。ＭＧＭＴについては非腫瘍部及び腫瘍部のいずれでも陽性と陰性との間に生存曲線に有意な差があり、ＭＧＭＴの脱メチル化の程度が低いと、術後の生存期間が短い傾向があり、予後不良であった。
【0090】
ＲＡＲｂに関してＣｐＧ部位の各個数の割合の分布、非腫瘍部及び腫瘍部についての生存曲線を、図２５、図２６（Ａ）及び図２６（Ｂ）にそれぞれ示す。ＲＡＲｂについては非腫瘍部及び腫瘍部のいずれでも陽性と陰性との間に生存曲線に有意な差があり、ＲＡＲｂの脱メチル化の程度が低いと、術後の生存期間が短い傾向があり、予後不良であった。
【0091】
ＳＭＡＤ４に関してＣｐＧ部位の各個数の割合の分布、非腫瘍部及び腫瘍部についての生存曲線を、図２７、図２８（Ａ）及び図２８（Ｂ）にそれぞれ示す。ＳＭＡＤ４については非腫瘍部及び腫瘍部のいずれでも陽性と陰性との間に生存曲線に有意な差があり、ＳＭＡＤ４の脱メチル化の程度が低いと、術後の生存期間が短い傾向があり、予後不良であった。
【0092】
ＢＲＣＡ１に関してＣｐＧ部位の各個数の割合の分布、非腫瘍部及び腫瘍部についての生存曲線を、図２９、図３０（Ａ）及び図３０（Ｂ）にそれぞれ示す。ＢＲＣＡ１については非腫瘍部及び腫瘍部のいずれでも陽性と陰性との間に生存曲線に有意な差があり、ＢＲＣＡ１の脱メチル化の程度が低いと、術後の生存期間が短い傾向があり、予後不良であった。
【0093】
ＭＳＨ２に関してＣｐＧ部位の各個数の割合の分布、非腫瘍部及び腫瘍部についての生存曲線を、図３１、図３２（Ａ）及び図３２（Ｂ）にそれぞれ示す。ＭＳＨ２については非腫瘍部において陽性と陰性との間に生存曲線に有意な差があり、ＭＳＨ２の脱メチル化の程度が低いと、術後の生存期間が短い傾向があり、予後不良であった。
【0094】
１７１個の検体の全生存期間と生存時間データオブジェクトを作成するＲの関数Ｓｕｒｖとを用いて算出したデータに線形回帰する関数を、線形モデルを作成するＲの関数ｌｍによって作成した。説明変数は、モデル１ではＡＱＰ１、ＳＬＣ５Ａ７、ＧＬＵＴ１及びＲＡＲｂの脱メチル化指数を用い、モデル２ではＭＵＣ２、ＭＵＣ４、ＧＬＵＴ１及びＢＲＣＡ１の脱メチル化指数を用いた。モデル１又はモデル２で得られる目的変数（Ｃａｌｕｃｕｌａｔｅｄ ｒｉｓｋ Ｉｎｄｅｘ）が０以上の検体をハイリスク群（positive）、目的変数が０未満の検体をnegativeとした。モデル１及びモデル２の性能を交差検定で検討した。
【0095】
図３３（Ａ）及び図３３（Ｂ）は、それぞれ１個抜き交差検定：Ｌｅａｖｅ Ｏｎｅ Ｏｕｔ Ｃｒｏｓｓ Ｖａｒｉｄａｔｉｏｎ（ＬＯＯＣＶ）法によるモデル１の非腫瘍部及び腫瘍部の生存曲線を示す。非腫瘍部及び腫瘍部で、ハイリスク群は有意に生存期間が長く、ハザードレシオはそれぞれ２．１９３及び２．００６であった。モデル１の４分割交差検定の結果を図３４に示す。非腫瘍部及び腫瘍部で、ハイリスク群を有意に判別でき、ハザードレシオはそれぞれ２．７０９及び２．４１２であった。モデル１の２分割交差検定の結果を図３５に示す。非腫瘍部及び腫瘍部で、ハイリスク群を有意に判別でき、ハザードレシオはそれぞれ２．７４５及び２．３６８であった。
【0096】
図３６（Ａ）及び図３６（Ｂ）は、それぞれＬＯＯＣＶ法によるモデル２の非腫瘍部及び腫瘍部の生存曲線を示す。非腫瘍部及び腫瘍部で、ハイリスク群は有意に生存期間が長く、ハザードレシオはそれぞれ２．５２８及び２．１９であった。モデル１の４分割交差検定の結果を図３７に示す。非腫瘍部及び腫瘍部で、ハイリスク群を有意に判別でき、ハザードレシオはそれぞれ２．４１２及び２．２９９であった。モデル１の２分割交差検定の結果を図３８に示す。非腫瘍部及び腫瘍部で、ハイリスク群を有意に判別でき、ハザードレシオはそれぞれ２．４４７及び２．４１８であった。
【0097】
この発明は、この発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、この発明を説明するためのものであり、この発明の範囲を限定するものではない。すなわち、この発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、この発明の範囲内とみなされる。
【符号の説明】
【0098】
１ 予後推定装置、２ メチル化データ、３ 予後情報、１０ 推定部、２１ ＣＰＵ、２２ 主記憶部、２３ 外部記憶部、２４ 操作部、２５ 表示部、２６ 通信インターフェイス、２７ 内部バス、２８ 推定プログラム、２９ 機械学習プログラム、３０ サンプルデータ
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【配列表】