特開 2023-107748 合成ＲＮＡ断片及びＲＮＡ依存性増幅のためのその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023107748

(43)【公開日】2023-08-03

(54)【発明の名称】合成ＲＮＡ断片及びＲＮＡ依存性増幅のためのその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20230727BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20230727BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230727BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20230727BHJP

   C12N 15/33 20060101ALI20230727BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z ZNA

C12Q1/6844 Z

C12N15/12

C12N15/31

C12N15/33

【審査請求】有

【請求項の数】21

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023006926

(22)【出願日】2023-01-20

(31)【優先権主張番号】63/302163

(32)【優先日】2022-01-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/338881

(32)【優先日】2022-05-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】508324396

【氏名又は名称】美洛生物科技股▲ふん▼有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】100167689

【弁理士】

【氏名又は名称】松本 征二

(72)【発明者】

【氏名】リン， シー・ラング

(72)【発明者】

【氏名】リン， サム

(72)【発明者】

【氏名】ウー， デービッド ティーエス

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA20

4B063QQ28

4B063QQ52

4B063QQ62

4B063QR08

4B063QR35

4B063QR42

4B063QR62

4B063QR80

4B063QS05

4B063QS24

4B063QS34

4B063QS36

4B063QS38

4B063QS39

(57)【要約】      （修正有）

【課題】ＲＮＡテンプレートと組み合わせ、ＰＣＲのためのプロモーターとして作用し、それによりｉｎ ｖｉｔｒｏでのｓａＲＮＡの増幅を実現することを可能とするＲｄＲｐ結合部位を提供する。
【解決手段】ここに開示されるものは、５’－末端リボ核酸（ＲＮＡ）依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）結合部位１１及び３’－末端ＲｄＲｐ結合部位１２の少なくとも一方によって隣接されるＲＮＡテンプレート１５を含み、したがってＲＮＡ依存性ＲＮＡサイクリング反応（ＲＣＲ）を介してｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅され得る合成ＲＮＡ断片に向けられる。本合成ＲＮＡ断片の使用による増幅ＲＮＡ産物を生成する方法も、ここに開示される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

合成リボ核酸（ＲＮＡ）断片であって、
５’－末端ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）結合部位及び３’－末端ＲｄＲｐ結合部位によって隣接されるＲＮＡテンプレートを備え、
前記５’－末端及び３’－末端結合部位の各々は、個々に、５’－ＵＳＵＳＣＹＷ－３’及び５’－ＵＡＧＳＲＶＲ－３’からなる群から選択されるポリリボヌクレオチド配列を備える、合成ＲＮＡ断片。

【請求項2】

前記５’－末端ＲｄＲｐ結合部位は、５’－ＵＣＵＣＣＵＡ－３’、５’－ＵＧＵＧＣＵＡ－３’又は５’－ＵＣＵＣＣＣＵ－３’のポリリボヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の合成ＲＮＡ断片。

【請求項3】

前記３’－末端ＲｄＲｐ結合部位は、５’－ＵＡＧＧＡＧＡ－３’、５’－ＵＡＧＣＡＣＡ－３’又は５’－ＵＡＧＧＧＡＧＡ－３’のポリリボヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の合成ＲＮＡ断片。

【請求項4】

前記ＲＮＡテンプレートは、ポリリボヌクレオチド配列、又はポリリボヌクレオチド及びポリデオキシリボヌクレオチド配列のハイブリッドを備え、前記ポリリボヌクレオチド配列はコーディングＲＮＡ又はノンコーディングＲＮＡである、請求項１に記載の合成ＲＮＡ断片。

【請求項5】

前記コーディングＲＮＡは、抗原をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項４に記載の合成ＲＮＡ断片。

【請求項6】

前記抗原は、癌抗原、腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、寄生虫抗原又はそれらの組合せである、請求項５に記載の合成ＲＮＡ断片。

【請求項7】

前記腫瘍抗原は、ネオアンチゲン、腫瘍由来溶解物、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチンタンパク質、上皮性腫瘍抗原（ＥＴＡ）、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、ＲＡＳタンパク質及び腫瘍抑制因子タンパク質からなる群から選択される、請求項６に記載の合成ＲＮＡ断片。

【請求項8】

前記細菌抗原は、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ及びＹｅｒｓｉｎｉａからなる群から選択される細菌種に由来する、請求項６に記載の合成ＲＮＡ断片。

【請求項9】

前記ウイルス抗原は、アデノウイルス、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、サイトメガロウイルス、デルタインフルエンザウイルス、デルタコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、ヘパシウイルス、ヘパトウイルス、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、インフルエンザＣウイルス、インフルエンザＤウイルス、レンチウイルス、レトウイルス、リンホクリプトウイルス、オルソニューモウイルス、オルソヘパドナウイルス、オルソポックスウイルス、パピローマウイルス、クアランジャウイルス、ロタウイルス、シンプレックスウイルス及びバリセロウイルスからなる群から選択されるウイルス種に由来する、請求項６に記載の合成ＲＮＡ断片。

【請求項10】

前記ウイルス抗原は、ベータコロナウイルスのスパイクタンパク質に由来する、請求項９に記載の合成ＲＮＡ断片。

【請求項11】

前記真菌抗原は、アスペルギルス症、分芽菌症、カンジダ症、黒色分芽菌症、クリプトコッカス症、ヒストプラスマ症、マイセトーマ、パラコクシジオイデス症、白癬及び癜風からなる群から選択される真菌感染症を引き起こす真菌種に由来する、請求項６に記載の合成ＲＮＡ断片。

【請求項12】

前記寄生虫抗原は、アフリカトリパノソーマ症、アメーバ症、シャーガス病、エキノコックス症、肝蛭症、鉤虫症、ヒメノレピス条虫症、リーシュマニア症、神経嚢虫症、オンコセルカ症、プラスモディウム感染症、パラゴニム症、ニューモシスチス肺炎（ＰＣＰ）、住血吸虫症、トリコモナス症、条虫症及び鞭虫症からなる群から選択される寄生虫感染症を引き起こす寄生虫種に由来する、請求項６に記載の合成ＲＮＡ断片。

【請求項13】

前記ノンコーディングＲＮＡは、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又はアプタマーである、請求項４に記載の合成ＲＮＡ断片。

【請求項14】

前記ｍｉＲＮＡは、前駆体ｍｉＲＮＡ又は成熟ｍｉＲＮＡである、請求項１３に記載の合成ＲＮＡ断片。

【請求項15】

前記ノンコーディングＲＮＡは、前駆体ｍｉＲＮＡ－３０２に由来する、請求項１４に記載の合成ＲＮＡ断片。

【請求項16】

前記ＲＮＡテンプレートは、非構造タンパク質の転写産物をコードするポリリボヌクレオチド配列を備える、請求項１に記載の合成ＲＮＡ断片。

【請求項17】

前記非構造タンパク質は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）である、請求項１６に記載の合成ＲＮＡ断片。

【請求項18】

増幅ＲＮＡ産物をｉｎ ｖｉｔｒｏで生成する方法であって、ＲＮＡサイクリング反応（ＲＣＲ）を介して請求項１に記載の合成ＲＮＡ断片を増幅し、それにより請求項１に記載の合成ＲＮＡ断片の前記ＲＮＡテンプレートから転写された前記増幅ＲＮＡ産物を生成するステップを備える方法。

【請求項19】

前記合成ＲＮＡ断片の前記ＲＮＡテンプレートは、ポリリボヌクレオチド配列、又はポリリボヌクレオチド及びポリデオキシリボヌクレオチド配列のハイブリッドを備え、前記ポリリボヌクレオチド配列は非構造タンパク質の転写産物をコードする、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

５－プライムキャップ（５’キャップ）及びポリ（Ａ）テールを、前記増幅ＲＮＡ産物に付加するステップをさらに備える請求項１８に記載の方法。

【請求項21】

前記増幅ＲＮＡ産物は、自己増幅ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）である、請求項１８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２２年１月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／３０２，１６３号及び２０２２年５月５日に出願された第６３／３３８，８８１号の優先権及び利益を主張し、その全体が参照によりここに取り込まれる。

【0002】

本開示は、核酸増幅技術の分野に関する。より具体的には、開示された発明は、新規合成リボ核酸（ＲＮＡ）断片及びＲＮＡ依存性ＲＮＡサイクリング反応（ＲＣＲ）におけるその使用に関する。

【背景技術】

【0003】

最初にアルファウイルスゲノムに由来して以来、自己増幅リボ核酸（ｓａＲＮＡ又はｓａｍＲＡＮ）は、数十年にわたって癌及び感染性疾患に対するワクチンを開発するのに研究され、用いられてきた。初期のｓａＲＮＡ設計は、ゲノム発現のための自己複製可能な組換えｍＲＮＡプラットフォームを再構築するバックボーンとしてウイルスゲノムの部分を用いるウイルスレプリコンに基づいている。結果として、ｓａＲＮＡ構築物は、キャップ、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ペプチド／タンパク質コード配列、３’ＵＴＲ及び可変長ポリ（Ａ）テールを含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の基本要素を含むだけでなく、ウイルスの１９ヌクレオチド（ｎｔ）保存配列要素（３’ＣＳＥ）及び３’ＣＳＥ配列を認識することによってｉｎ ｓｉｔｕでのＲＮＡ転写産物の自己転写及び増幅を可能とするＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）複合体をコードするアルファウイルスレプリカーゼ遺伝子も備える。それらの自己複製活性の結果として、ｓａＲＮＡは、低濃度で送達されて、同等の抗原発現を実現し得る。そのため、ｓａＲＮＡは、重要なＲＮＡワクチン候補として浮上している。

【0004】

所望のＲＮＡ配列の増幅ＲＮＡ産物をｉｎ ｖｉｔｒｏで生成する現在の方法体系は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）を組み合わせる方法に依存する。具体的には、方法は、主に以下の、逆転写２本鎖ｃＤＮＡテンプレートを所望のＲＮＡ配列から調製するステップ、ＲＮＡテンプレートを逆転写２本鎖ｃＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を介して合成するステップ、合成ＲＮＡテンプレートを逆転写してＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを形成するステップ、ＰＣＲを反復することによってＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドをプロモーター結合２本鎖ｃＤＮＡに増幅するステップ、ＲＮＡをプロモーター結合２本鎖ｃＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を介して合成するステップ、及び増幅ハイブリッドＲＮＡ－ｃＤＮＡ産物のデオキシリボヌクレオチドをエンドヌクレアーゼによって消化し、それにより増幅ＲＮＡ産物を生成するステップを備える。

【0005】

しかし、上記方法では、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｓａＲＮＡの増幅に制限がある。前述のＲｄＲｐは、ＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを生成するステップを省くように開発され、ＲＮＡ介在性増幅に関与され得るが、ＲｄＲｐ結合部位として作用する３’ＣＳＥは、一般的なＰＣＲ又は逆転写ＰＣＲにおける潜在的なプライマーとして用いるには、未だに長すぎる。また、３’ＣＳＥは、ステムループを容易に形成する高次構造配列であるため、ＲＮＡ転写が従来の原核生物のＲＮＡポリメラーゼを用いることを阻害し、従来のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）方法の実行の失敗をもたらす。

【0006】

前述を鑑み、関連技術において、ＲＮＡテンプレートと組み合わせ、ＰＣＲのためのプロモーターとして作用し、それによりｉｎ ｖｉｔｒｏでのｓａＲＮＡの増幅を実現することを可能とするＲｄＲｐ結合部位を開発するニーズが存在する。

【発明の概要】

【0007】

以下に、基本的な理解を読者に与えるために本開示の簡略化した概要を提示する。この概要は、本開示の網羅的な概観ではなく、本発明の鍵となる／重要な要素を特定するものでも本発明の範囲を記するものでもない。その専らの目的は、ここに開示される幾つかの概念を、後述のさらに詳細な説明の序章としての簡略な形態で提示することである。

【0008】

ここで実現され、広義に記載されるように、本開示の一態様は、合成リボ核酸（ＲＮＡ）断片に向けられ、それは、５’－末端ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）結合部位、３’－末端ＲｄＲｐ結合部位又はそれらの組合せによって隣接されるＲＮＡテンプレートを備え、５’－末端及び３’－末端ＲｄＲｐ結合部位の各々は、個々に、５’－ＵＳＵＳＣＹＷ－３’及び５’－ＵＡＧＳＲＶＲ－３’からなる群から選択されるポリリボヌクレオチド配列を備える。

【0009】

本開示のいくつかの実施形態によると、５’－末端ＲｄＲｐ結合部位は、５’－ＵＣＵＣＣＵＡ－３’、５’－ＵＧＵＧＣＵＡ－３’又は５’－ＵＣＵＣＣＣＵ－３’のポリリボヌクレオチド配列を有する。

【0010】

本開示のいくつかの実施形態によると、３’－末端ＲｄＲｐ結合部位は、５’－ＵＡＧＧＡＧＡ－３’、５’－ＵＡＧＣＡＣＡ－３’又は５’－ＵＡＧＧＧＡＧＡ－３’のポリリボヌクレオチド配列を有する。

【0011】

本開示のいくつかの実施形態によると、ＲＮＡテンプレートは、ポリリボヌクレオチド配列、又はポリリボヌクレオチド及びポリデオキシリボヌクレオチド配列のハイブリッドを備え、ポリリボヌクレオチド配列は、コーディングＲＮＡ又はノンコーディングＲＮＡである。

【0012】

本開示の一実施形態によると、コーディングＲＮＡは、抗原をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり得る。具体的には、抗原は、癌抗原、腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、寄生虫抗原又はそれらの組合せであり得る。

【0013】

腫瘍抗原の例は、これらに限定されないが、ネオアンチゲン、腫瘍由来溶解物、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチンタンパク質、上皮性腫瘍抗原（ＥＴＡ）、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、ＲＡＳタンパク質及び腫瘍抑制因子タンパク質を含む。

【0014】

例示の細菌抗原は、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ及びＹｅｒｓｉｎｉａを含む細菌種に由来し得るが、これらに限定されない。

【0015】

例示のウイルス抗原は、これらに限定されないが、アデノウイルス、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、サイトメガロウイルス、デルタインフルエンザウイルス、デルタコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、ヘパシウイルス、ヘパトウイルス、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、インフルエンザＣウイルス、インフルエンザＤウイルス、レンチウイルス、レトウイルス、リンホクリプトウイルス、オルソニューモウイルス、オルソポックスウイルス、パピローマウイルス、クアランジャウイルス、ロタウイルス、シンプレックスウイルス及びバリセロウイルスを含むウイルス種に由来し得る。

【0016】

本開示の好適な一実施形態によると、ウイルス抗原は、ベータコロナウイルスのスパイクタンパク質に由来する。

【0017】

例示の真菌抗原は真菌感染症を引き起こす真菌種に由来し得るものであり、真菌感染症はアスペルギルス症、ブラストミセス症、カンジダ症、黒色分芽菌症、クリプトコッカス症、ヒストプラスマ症、マイセトーマ、パラコクシジオイデス症、白癬及び癜風を含むが、これらに限定されない。

【0018】

例示の寄生虫抗原は、これらに限定されないが、アフリカトリパノソーマ症、アメーバ症、シャーガス病、エキノコックス症、肝蛭症、鉤虫症、ヒメノレピス条虫症、リーシュマニア症、神経嚢虫症、オンコセルカ症、プラスモディウム感染症、パラゴニム症、ニューモシスチス肺炎（ＰＣＰ）、住血吸虫症、トリコモナス症、条虫症及び鞭虫症を含む寄生虫感染症を引き起こす寄生虫種に由来し得る。

【0019】

本開示のいくつかの実施形態によると、ノンコーディングＲＮＡは、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又はアプタマーである。

【0020】

本開示のある実施形態では、ｍｉＲＮＡは前駆体ｍｉＲＮＡであり、他の実施形態では、ｍｉＲＮＡは成熟ｍｉＲＮＡである。

【0021】

本開示の効果的な一実施例によると、ノンコーディングＲＮＡは、前駆体ｍｉＲＮＡ－３０２に由来する。

【0022】

本開示のいくつかの実施形態によると、ＲＮＡテンプレートは、非構造タンパク質の転写産物をコードするポリリボヌクレオチド配列を備え、好適な一実施形態では、非構造タンパク質はＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）である。

【0023】

本開示の他の態様は、ＲＮＡサイクリング反応（ＲＣＲ）を介して前述の合成ＲＮＡ断片を増幅し、それにより上記合成ＲＮＡ断片のＲＮＡテンプレートから転写された増幅ＲＮＡ産物を生成するステップを備える、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅ＲＮＡ産物を生成する方法に向けられる。

【0024】

本開示のいくつかの実施形態によると、合成ＲＮＡ断片のＲＮＡテンプレートは、ポリリボヌクレオチド配列、又はポリリボヌクレオチド及びポリデオキシリボヌクレオチド配列のハイブリッドを備え、ポリリボヌクレオチド配列は非構造タンパク質の転写産物をコードする。本開示の好適な一実施形態によると、非構造タンパク質はＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）である。

【0025】

本開示のいくつかの実施形態によると、本方法は、５－プライムキャップ（５’キャップ）及びポリ（Ａ）テールを増幅ＲＮＡ産物に付加するステップをさらに備える。

【0026】

本開示のいくつかの好適な実施形態では、増幅ＲＮＡ産物は、自己増幅ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）である。

【0027】

本開示の付随する特徴及び効果の多くは、添付図面との関連で検討される以下の詳細な説明を参照してより深く理解されることになる。

【0028】

本説明は、添付図面に照らして読まれる以下の詳細な説明から、より深く理解される。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】図は、本開示の一実施形態に係る例示の合成ＲＮＡ断片１の概略図である。

【発明を実施するための形態】

【0030】

一般的な慣行により、種々の説明される特徴／要素は縮尺通りに図示されないが、代わりに、本発明に関連する特定の特徴／要素を最も良く示すように図示される。また、種々の図面における同様の参照番号及び指定は、同様の要素／部分を示すように用いられる。

【0031】

添付図面との関連で以下に与えられる詳細な説明は、本実施例の説明としてのものであり、本実施例が構成又は利用され得る形態のみを示すものではない。その説明は、実施例の機能及び実施例を構成して動作させるためのステップの配列を説明する。ただし、同一又は同等の機能及び配列が、異なる実施例によっても実現され得る。

【0032】

１．定義
便宜上、明細書、実施例及び添付の特許請求の範囲で採用される特定の用語をここにまとめる。特に断りのない限り、ここに用いられるすべての技術的及び科学的用語は、この発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同様の意味を有する。

【0033】

単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、そうでないことを文脈が明示しない限り、複数の参照を含むものとして用いられる。

【0034】

発明の広い範囲を説明する数値範囲及びパラメータは概数であるものの、特定の実施例で説明される数値は可能な限り正確に報告される。ただし、いずれの数値も、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的にもたらされる所定の誤差を本来的に含む。

【0035】

ここに用いられるように、用語「ＲＮＡテンプレート」は、所望のポリリボヌクレオチド配列が増幅され得るＲＮＡ介在性ＲＮＡサイクリング反応（ＲＣＲ）においてコピーの合成のためのテンプレートとして作用する所望のポリリボヌクレオチド配列を含むことを意図する。したがって、ＲＮＡテンプレートは、実用的なニーズに応じて、コーディングＲＮＡ若しくはノンコーディングＲＮＡのポリリボヌクレオチド配列又はコーディングＲＮＡ若しくはノンコーディングＲＮＡに由来するポリリボヌクレオチド配列を備え得る。例えば、ＲＮＡテンプレートは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のスパイクタンパク質をコードするポリリボヌクレオチド配列を備え得る。あるいは、ＲＮＡテンプレートは、テンプレートにポリリボヌクレオチドが存在する場合、ポリリボヌクレオチド及びポリデオキシリボヌクレオチド配列のハイブリッドも備え得る。

【0036】

ここに互換可能に用いられる用語「所望のＲＮＡ」又は「所望のポリリボヌクレオチド配列」は、標的としてみなされ、特定の目的のために増幅されることが予想されるそれらのＲＮＡ断片又はポリリボヌクレオチド配列をいう。本開示では、所望のＲＮＡは、前駆体ｍｉＲＮＡの断片又はウイルス非構造タンパク質の転写産物であり得る。

【0037】

ここに用いられるように、用語「ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）結合部位」は、ＲｄＲｐ酵素によって認識及び結合され得る短鎖ＲＮＡ配列（例えば、１０ｎｔ未満）をいう。通常、ＲｄＲｐ結合部位は、ＤＮＡ又はＲＮＡのポリヌクレオチドの末端に隣接されて、増幅方法体系、例えばＲＮＡサイクリング反応（ＲＣＲ）において有用なＤＮＡ／ＲＮＡテンプレートを形成し得る。本開示によると、ＲｄＲｐ結合部位は、５’－ＵＳＵＳＣＹＷ－３’又は５’－ＵＡＧＳＲＶＲ－３’のポリリボヌクレオチド配列を備える。

【0038】

ここに互換可能に用いられる用語「「ＲＮＡ依存性」又は「ＲＮＡ介在性」ＲＮＡサイクリング反応（ＲＣＲ）」は、増幅ＲＮＡを生成するために、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）を用いてテンプレートとしてのポリリボヌクレオチド配列及び反応材料としてのリボヌクレオシド三リン酸（ｒＮＴＰ）を用いる、反復されるサイクリング反応をいう。

【0039】

ここに用いられる用語「非構造タンパク質」は、ウイルスによってコードされるがウイルス粒子の一部ではないタンパク質をいう。非構造タンパク質（ｎｓＰ又はＮＳＰ）は、通常、ウイルスプロテアーゼ、ＲＮＡレプリカーゼ及び／又はＲＮＡテンプレート指向性ポリメラーゼなどの、ウイルスが自己を複製するのに用いる種々の酵素及び転写因子を含む。

【0040】

ここに用いられる用語「マイクロＲＮＡ」又は「ｍｉＲＮＡ」は、遺伝子発現の制御において役割を果たすノンコーディングＲＮＡの部類をいう。大部分のｍｉＲＮＡは、ＤＮＡ配列から１次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）に転写され、前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）及び最終的に成熟ｍｉＲＮＡにプロセッシングされる。したがって、ここに用いられる用語ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡプロセッシング及び成熟に関与されるすべてのノンコーディングＲＮＡをいい、好ましくは、前駆体ｍｉＲＮＡ及び成熟ｍｉＲＮＡを含む。

【0041】

ここに用いられる用語「感染性疾患」は、通常、発熱、炎症、上部気道症状、下痢等などの急性症状引き起こす細菌、ウイルス、真菌又は寄生虫などの病原体によって引き起こされる障害をいう。

【0042】

２．好適な実施形態の詳細な説明
本開示は、リボ核酸（ＲＮＡ）テンプレートの２つの末端に隣接され、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）によって認識されてｉｎ ｓｉｔｕ転写を開始し得る短鎖リボヌクレオチド（１０ｎｔ未満）の開発に、少なくともある程度基づく。したがって、本開示は、ＲｄＲｐに認識可能な新規短鎖リボヌクレオチドによって隣接されるＲＮＡテンプレートを備え、したがってＲＮＡ依存性ＲＮＡサイクリング反応（ＲＣＲ）を介してｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅され得る合成ＲＮＡ断片を提供する。また、本合成ＲＮＡ断片の使用による増幅ＲＮＡ産物を生成する方法も、ここに提供される。

【0043】

２．１ 本開示の合成ＲＮＡ断片
本発明の一態様は、リボ核酸（ＲＮＡ）依存性ＲＮＡ増幅工程に用いられるのに適した合成ＲＮＡ断片に向けられる。合成ＲＮＡ断片は、５’－末端ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）結合部位、３’－末端ＲｄＲｐ結合部位又はそれらの組合せによって隣接されるＲＮＡテンプレートを備え、５’－末端及び３’－末端ＲｄＲｐ結合部位の各々は、個々に、５’－ＵＳＵＳＣＹＷ－３’及び５’－ＵＡＧＳＲＶＲ－３’からなる群から選択されるポリリボヌクレオチド配列を備える。

【0044】

本開示の一実施形態に係る本合成ＲＮＡ断片１の例示の構造を示す図をより具体的に参照する。ＲＮＡテンプレート１５は、５’－末端ＲｄＲｐ結合部位１１若しくは３’－末端ＲｄＲｐ結合部位１２又は双方によっていずれか隣接され得ることが留意されるべきである。好ましくは、図に示す概略構造のように、ＲＮＡテンプレート１５は、５’－末端及び３’－末端ＲｄＲｐ結合部位（１１、１２）の双方によって隣接される。

【0045】

本開示の合成ＲＮＡ断片は、１本鎖又は２本鎖のいずれかのＤＮＡ又はｃＤＮＡテンプレートからｉｎ ｖｉｔｒｏで直接的に転写するステップを含む、当技術分野で周知の手順及び／又はツールを介して生成され得る。本開示のいくつかの実施形態によると、合成ＲＮＡ断片は、米国特許出願公開第２０２２／０３９６７９８号及び国際公開第２０２２／２６０７１８号並びにＬｉ及びＪｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２２１，２００３年によって発表された研究論文に記載されるように、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）又は一般のＰＣＲ手順及びｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）手順を組み合わせた方法によって生成される。具体的には、標的遺伝子又は配列断片の２本鎖ｃＤＮＡテンプレート（以下、ｃＤＮＡテンプレート）は、（ＰＣＲのためのフォワード及びリバースプライマーを含む）プライマー対の添加を伴う従来のＲＴ－ＰＣＲを介して、単離された１本鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド又は２本鎖ＤＮＡから生成される。本開示によると、プライマー対は、ＲｄＲｐ結合部位の配列を相補するように設計及び合成され、したがって、本ＲｄＲｐ結合部位の相補的ＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡテンプレートの５’－及び３’－末端に埋め込まれ、取り込まれる。なお、本ＲｄＲｐ結合部位は、ＲｄＲｐ活性を開始させるためのプロモーター様モチーフとして作用する。結果として生成されたｃＤＮＡテンプレートは、ＩＶＴ手順を受けて、合成ＲＮＡ断片を作成する。本開示によると、ＩＶＴ手順を行うために、もたらされたｃＤＮＡテンプレートは、当技術分野で周知の手順及び／又はツールを介してプラスミド又はウイルスベクターにクローニングされてもよく、それにより、５’－末端及び３’－末端ＲｄＲｐ結合部位によって隣接されるＲＮＡテンプレートのＲＮＡ配列を備える本合成ＲＮＡ断片を生成する。代替的な実施形態では、ＲｄＲｐ結合部位のプライマーを取り込み結果として生成されたｃＤＮＡテンプレートは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡサイクリング反応（ＲＣＲ）の出発材料として作用することができ、それにより、本合成ＲＮＡ断片を直接的に生成する。

【0046】

本開示のいくつかの好適な実施形態によると、５’－末端ＲｄＲｐ結合部位は、５’－ＵＣＵＣＣＵＡ－３’、５’－ＵＧＵＧＣＵＡ－３’又は５’－ＵＣＵＣＣＣＵ－３’のポリリボヌクレオチド配列を有する。本開示の他の好適な実施形態によると、３’－末端ＲｄＲｐ結合部位は、５’－ＵＡＧＧＡＧＡ－３’、５’－ＵＡＧＣＡＣＡ－３’又は５’－ＵＡＧＧＧＡＧＡ－３’のポリリボヌクレオチド配列を有する。効果的な一実施例では、ＲＮＡテンプレートは、５’－ＵＣＵＣＣＵＡ－３’及び５’－ＵＡＧＧＡＧＡ－３’によって隣接される。他の効果的な実施例では、ＲＮＡテンプレートは、５’－ＵＧＵＧＣＵＡ－３’及び５’－ＵＡＧＣＡＣＡ－３’によって隣接される。さらなる効果的な実施例では、ＲＮＡテンプレートは、５’－ＵＣＵＣＣＣＵ－３’及び５’－ＵＡＧＧＧＡＧＡ－３’によって隣接される。

【0047】

代替的に又は任意選択的に、本開示の５’－末端及び３’－末端ＲｄＲｐ結合部位の各々は、個々に、５’－ＵＡＧＳＲＶＲＡ－３’及び５’－ＵＹＢＹＨＣＵＡ－３’からなる群から選択されるポリリボヌクレオチド配列を備える。

【0048】

上述されるように、本開示のＲＮＡテンプレートは、ＲＮＡコピーを生成するのに有用な合成ＲＮＡ断片を形成するように２つのＲｄＲｐ結合部位によって隣接されている限り、コーディングＲＮＡ又はノンコーディングＲＮＡの所望のポリリボヌクレオチド配列のいずれかであってもよく、いずれかを含んでいてもよい。

【0049】

本開示のいくつかの実施形態によると、コーディングＲＮＡは、抗原をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。具体的に、コーディングＲＮＡは、癌抗原、腫瘍抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、細菌抗原、ウイルス抗原又はそれらの組合せをコードするｍＲＮＡであり得る。

【0050】

前述の腫瘍抗原の例は、限定されることなく、ネオアンチゲン、腫瘍由来溶解物、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチンタンパク質、上皮性腫瘍抗原（ＥＴＡ）、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、ＲＡＳタンパク質、腫瘍抑制因子タンパク質及びそれらの組合せを含む。

【0051】

前述の細菌抗原の例は、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ及びＹｅｒｓｉｎｉａ属を含む細菌種に由来するものを含むが、これらに限定されない。

【0052】

前述のウイルス抗原の例は、これらに限定されないが、アデノウイルス、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、サイトメガロウイルス、デルタインフルエンザウイルス、デルタコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、ヘパシウイルス、ヘパトウイルス、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、インフルエンザＣウイルス、インフルエンザＤウイルス、レンチウイルス、レトウイルス、リンホクリプトウイルス、オルソニューモウイルス、オルソポックスウイルス、パピローマウイルス、クアランジャウイルス、ロタウイルス、シンプレックスウイルス及びバリセロウイルスを含むウイルス種に由来するものを含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原は、ベータコロナウイルス属に由来し、好ましくは重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のスパイク（Ｓ）タンパク質又はヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質である。代替的な実施形態では、ウイルス抗原は、ヘパシウイルス属に由来し、好ましくはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のコア抗原である。

【0053】

真菌抗原の例は、これらに限定されないが、アスペルギルス症、分芽菌症、カンジダ症、黒色分芽菌症、クリプトコッカス症、ヒストプラスマ症、マイセトーマ、パラコクシジオイデス症、白癬、癜風及びそれらの組合せを含む真菌感染症を引き起こす真菌種に由来するものを含む。

【0054】

前述の寄生虫抗原の例は、これらに限定されないが、アフリカトリパノソーマ症、アメーバ症、シャーガス病、エキノコックス症、肝蛭症、鉤虫症、ヒメノレピス条虫症、リーシュマニア症、神経嚢虫症、オンコセルカ症、プラスモディウム感染症、パラゴニム症、ニューモシスチス肺炎（ＰＣＰ）、住血吸虫症、トリコモナス症、条虫症、鞭虫症及びそれらの組合せを含む寄生虫感染症を引き起こす寄生虫種に由来するものを含む。

【0055】

本開示の代替的な実施形態によると、ＲＮＡテンプレートは、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又はアプタマーなどのノンコーディングＲＮＡのポリリボヌクレオチド配列を含む。通常、ｍｉＲＮＡの例は、これらに限定されないが、前駆体ｍｉＲＮＡ又は成熟ｍｉＲＮＡを含む。効果的な一実施例によると、本ＲＮＡテンプレートは、ヒトの前駆体ｍｉＲＮＡ－３０２クラスターに由来するポリリボヌクレオチド配列を含む。

【0056】

いくつかの代替的な実施形態では、コーディング又はノンコーディングＲＮＡ配列に加えて、合成ＲＮＡ断片は、ウイルスに由来する非構造タンパク質（ｎｓＰ）をコードするポリリボヌクレオチド配列をさらに備える。通常、ポリリボヌクレオチド配列の転写産物は、ＲＮＡレプリカーゼ及び／又はＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）などの機能性タンパク質に翻訳されてＲＮＡ介在性複製を開始する。本合成ＲＮＡ断片における使用に適した非構造タンパク質の例は、これらに限定されないが、ロタウイルス、ベータコロナウイルス、インフルエンザウイルス、ヘパシウイルス、オルソヘパドナウイルス、フレボウイルス等を含むウイルス種又は属に由来するものであり得る。本開示の効果的な一実施形態では、転写産物は、アルファウイルスに由来し、翻訳後にＲｄＲｐタンパク質全体を形成すると予想される４つの非構造タンパク質（ｎｓＰ１～４）を有する。本開示の他の効果的な実施形態では、非構造タンパク質は、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に由来する。さらに他の効果的な実施形態では、非構造タンパク質は、ＮＳ５Ｂとして知られるようなＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲｄＲｐに由来する。

【0057】

２．２ 本合成ＲＮＡ断片の使用を介した増幅
本開示の他の態様は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅ＲＮＡ産物を生成する方法に向けられる。方法は、ＲＮＡサイクリング反応（ＲＣＲ）を介して本合成ＲＮＡ断片を増幅し、それにより本合成ＲＮＡ断片のＲＮＡテンプレートから転写された増幅ＲＮＡ産物を生成するステップを少なくとも備える。

【0058】

本開示によると、合成ＲＮＡ断片は、ＲＮＡレプリカーゼ（すなわち、ＲｄＲｐ酵素）によって認識され得る少なくとも１つのＲｄＲｐ結合部位を含み、したがって、ＲＮＡ依存性（又はＲＮＡ介在性）ＲＣＲに用いられ得る。ＲＮＡ依存性ＲＣＲの工程は、米国特許出願第１７／６４８，３３６号並びに米国仮特許出願第６３／３０２，１６３号及び第６３／３３８，８８１号に記載されている。簡潔には、合成ＲＮＡ断片及びＲＮＡレプリカーゼ（すなわち、ＲｄＲｐ酵素）は、ＲＮＡ合成に必要とされるリボヌクレオシド三リン酸分子（ｒＮＴＰ）を含む緩衝液条件で供給される。増幅が開始すると、ほとんどの場合にセンス鎖ＲＮＡ配列である合成ＲＮＡ断片は、テンプレートとして作用し、ＲｄＲｐ酵素をＲｄＲｐ結合部位に結合させ、複製を実行して、相補的アンチセンス鎖ＲＮＡ配列を生成し得る。アンチセンス鎖ＲＮＡ配列も、ＲＮＡテンプレート及びＲｄＲｐ結合部位を含み、したがって、アンチセンス鎖ＲＮＡ配列は、センス鎖ＲＮＡ配列を増幅する他のテンプレートとして作用することができ、センス鎖ＲＮＡ配列はアンチセンス鎖ＲＮＡ配列を再度増幅するテンプレートとしてさらに作用する。換言すると、センス鎖及びアンチセンス鎖ＲＮＡの双方は、相互についてのテンプレートとして作用して、ＲＮＡ依存性ＲＣＲを介した所望のＲＮＡ増幅を実施し得る。したがって、複数の増幅サイクルは、実用的なニーズによる温度及び時間を含む所定の条件下で行われてもよく、最終的に所望の配列を有する合成ＲＮＡ断片は、１０から１０００倍の増幅、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０又は１０００倍の増幅のように数倍に増幅され、それにより所望の増幅ＲＮＡ産物を取得する。効果的な一実施例では、もたらされる増幅ＲＮＡ産物は、最初の合成ＲＮＡ断片に対して１０倍の増加量である。他の効果的な実施例では、増幅ＲＮＡ産物は、合成ＲＮＡ断片に対して１００倍の増加量である。他の効果的な実施例では、増幅ＲＮＡ産物は、１０００倍の増加量を有する。

【0059】

いくつかの実施形態によると、増幅は、６．０～８．０の範囲のｐＨレベルで、２０℃～４５℃で、２０分から６時間にわたって実施される。

【0060】

本開示によると、結果として得られた増幅ＲＮＡ産物は、反応条件に応じて、１次、２次又は３次構造のいずれかとなり得る。いくつかの実施形態では、本増幅ＲＮＡ産物の構造は、１本鎖の２次構造のコンフォメーションである。他の実施形態では、本増幅ＲＮＡ産物は、主に２本鎖ＲＮＡ産物から構成される。

【0061】

上述のように、ＲＮＡ依存性ＲＣＲに用いられる合成ＲＮＡ断片は、ウイルスに由来する非構造タンパク質（ｎｓＰ）をコードするポリリボヌクレオチド配列をさらに備える。合成ＲＮＡ断片のＲＮＡテンプレートにおいて、上記ポリリボヌクレオチド配列は、好ましくは、所望のＲＮＡの上流に配置される。本開示のいくつかの実施形態では、転写産物は、アルファウイルスに由来し、翻訳後にＲｄＲｐタンパク質全体を形成すると予想される４つの非構造タンパク質（ｎｓＰ１～４）を有する。本開示の他の実施形態では、非構造タンパク質は、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に由来する。さらに他の効果的な実施形態では、非構造タンパク質は、ＮＳ５Ｂとして知られるようなＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲｄＲｐに由来する。

【0062】

したがって、合成ＲＮＡ断片の全長に基づいて生成する増幅ＲＮＡは、非構造タンパク質転写産物をコードするポリリボヌクレオチド配列も含む。本増幅ＲＮＡ産物は、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ、小核球（ｓｎｏ）ＲＮＡ及びおそらくｍＲＮＡを介したＲＮＡ誘導性ＲＮＡ修飾などの、当技術分野で周知の手段及びツールによって、これらに限定されないが、ＲＮＡスプライシング、ナンセンス変異依存分解（ｎｏｎｓｅｎｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｃａｙ）（ＮＭＤ）、ＲＮＡ編集、５’－キャップ形成、３’－ポリ（Ａ）テーリング及びそれらの組み合わせを含むＲＮＡプロセッシングをさらに受ける。好適な一実施形態では、５プライムキャップ（５’キャップ）及びポリ（Ａ）テールは、増幅ＲＮＡ産物に付加され、それにより成熟メッセンジャーＲＮＡを生成する。構造的に、結果として生成された増幅ＲＮＡ産物は、５’キャップ、５’ＵＴＲ、少なくとも１つの非構造タンパク質（ｎｓＰ）、翻訳開始部位（ＴＩＳ）、目的の所望の配列（コーディング又はノンコーディング配列のいずれか）、３’ＵＴＲ及び３’ポリ（Ａ）テールを少なくとも含む。したがって、結果として得られた増幅ＲＮＡ産物は、自己増幅特性を所持し、したがって自己増幅ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）として多彩な用途に作用し得る。

【0063】

まとめると、本合成ＲＮＡ断片は、ＲＣＲ介在性ＲＮＡ増幅に必要とされる５’－末端及び３’－末端ＲｄＲｐ結合部位並びに自己複製に必要とされる非構造タンパク質（すなわち、ＲｄＲｐポリメラーゼ）のポリリボヌクレオチド配列を構造的に含み、結果として、上述の本ＲＣＲ方法により上記合成ＲＮＡ断片を増幅することによって生成された増幅ＲＮＡ産物は、ｍＲＮＡワクチン開発に有益であるｓａＲＮＡの全長コンフォメーションを保持する。

【0064】

上記の特徴により、本開示は、ポリメラーゼによって認識され結合される新規の５’－末端及び３’－末端ＲｄＲｐ結合部位を備える新規合成ＲＮＡ断片を提供し、したがってｉｎ ｖｉｔｒｏ環境でのＲＮＡ依存性増幅及び複製を可能とする。さらに、本開示の５’－末端及び３’－末端ＲｄＲｐ結合部位は、ステムループ構造によって阻害されることなく、相補的対を形成してＲＮＡテンプレートに対するＲｄＲｐの結合を安定化してＲＮＡ合成を開始する。全体として、ｓａＲＮＡは、ＲＮＡ依存性ＲＣＲ工程において効果的及び迅速に合成されることができ、それによって結果として生成されたｓａＲＮＡが高収率、高構造完全性及び高純度の有利な効果並びに多彩な用途を保持する。

【実施例0065】

材料及び方法
プライマー
表１ 本出願において用いられたプライマー対

【表1】

【0066】

配列設計
本開示の５’－及び３’－末端ＲｄＲｐ結合部位のＲＮＡ配列は、コンピュータスクリーニングによって設計されＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＨＣＶウイルスに由来する。

【0067】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡトランスフェクション
ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）の単離されたメッセンジャーＲＮＡ、及び前駆体ｍｉＲＮＡ－３０２又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質を、２０：１～１：２０の範囲の比率で混合し、０．５ｍＬの細胞培養培地に溶解し、１～５０μＬのトランスフェクション試薬（ｉｎ ｖｉｖｏ－ｊｅｔＰＥＩ、Ｗｅｓｔｂｕｒｇ社、オランダ）を添加して混合物を形成した。そして、１０～３０分間のインキュベーション後、混合物を、５０％～６０％の培養密度の培養細胞を含む他の細胞培養培地に添加した。培地を、細胞の種類に応じて、１２～４８時間ごとにリフラッシュ（ｒｅｆｌａｓｈ）した。

【0068】

ｃＤＮＡテンプレートの調製
単離された所望のＲＮＡ（０．０１ｎｇ～１０μｇ）、逆転写（ＲＴ）プライマー（０．０１～２０ｎｍｏｌｅ）、ｄＮＴＰ及び逆転写酵素を、逆転写反応キット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ｃＤＮＡ ＲＴ ｋｉｔ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、アメリカ）の試薬（２０～５０μＬ）と混合して、製造元の指示に従って反応混合物を調製した。そして、反応混合物を、その相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）テンプレートを生成するように、所望のＲＮＡの長さ及び構造複雑性に応じて、３７～６５℃で１～３時間インキュベーションした。そして、ＲＴ由来のｃＤＮＡテンプレート（０．０１ｐｇ～１０μｇ）を、２０～５０μＬのＰＣＲ緩衝液（Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｋｉｔ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、アメリカ）と混合し、ＰＣＲ混合物を生成した。公開文献Ｌｉ及びＪｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２２１，２００３年並びに米国特許出願第１７／６４８，３３６号、米国仮特許出願第６３／３０２，１６３号及び第６３／３３８，８８１号に記載されるように、ＰＣＲ混合物は、熱変性（９４℃、１分間）、アニーリング（３０～５８℃、３０秒から１分間）及び伸長（７２℃で、１～３分間）で構成される反応サイクルを５～４０サイクルにわたって受け、それにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）を含む更なる検討のためのテンプレートとして作用する増幅ｃＤＮＡを生成した。

【0069】

表１に列挙されるように、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）のｃＤＮＡ配列を生成するのに用いられたＲＴプライマー対の配列は、配列番号１である。

【0070】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
合成及び増幅されたｃＤＮＡテンプレートは、配列番号１～４を含むＰＣＲに特異的なプライマー（以下、ＰＣＲ－ｒｅａｄｙプライマー）によって、本５’－末端及び３’－末端ＲｄＲｐ結合部位をｃＤＮＡテンプレート上に取り込まれた。具体的には、配列番号１及び２を、ＲｄＲｐ遺伝子を含むｃＤＮＡテンプレートとともに用い、配列番号３及び４を、ヒトｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２クラスター遺伝子（ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２）を含むｃＤＮＡテンプレートとともに用いた。増幅ｃＤＮＡテンプレート（０．０１ｎｇ～１０μｇ）、０．１～５０ＵのウイルスＲｄＲｐ及びヘリカーゼ（Ａｂｃａｍ社、マイアミ州、アメリカ／Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ社、ニューヨーク州）、ｒＮＴＰ並びにＴ７、Ｔ３、Ｍ１３及び／又はＳＰ６を含むＲＮＡポリメラーゼを、ＭｇＣｌ_２、ＮａＣｌ、スペルミジンを補足されたＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を含む、任意選択的にトリメチルグリシン（ＴＭＧ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及び／又は３［Ｎ－モルホリノ］プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）を各々０．００１～１０ｍＭで添加された１×転写緩衝液において混合して、混合物を形成した。混合物を、ＲＮＡ依存性増幅のための本合成ＲＮＡ断片を生成するように、３０～４０℃で１～６時間にわたって反応させた。

【0071】

ＲＮＡ依存性ＲＮＡサイクリング反応（ＲＣＲ）
単離された合成ＲＮＡ断片（０．０１ｎｇ～１０μｇ）、ウイルスＲｄＲｐ及びヘリカーゼの混合物（０．１～５０Ｕ）並びにｒＮＴＰを、ＭｇＣｌ_２、ＮａＣｌ、スペルミジン、ＴＭＧ、ＤＭＳＯ及び／又はＭＯＰＳ（０．００１～１０ｍＭ）を補足されたＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を含む１×転写緩衝液において混合し、それにより反応混合物を形成した。反応混合物は、２０～４５℃で１～６時間にわたってインキュベーションすることによってＲＮＡ依存性ＲＣＲを受け、それにより増幅ＲＮＡ産物を生成した。

【0072】

統計
すべてのデータを、平均及び標準偏差（ＳＤ）として示した。各試験群の平均値及びそのＳＤを、それぞれＭｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥｘｃｅｌのＡＶＥＲＡＧＥ及びＳＴＤＥＶによって計算した。データを、一元配置分散分析によって分析した。Ｔｕｋｅｙ及びＤｕｎｎｅｔｔのｔ事後検定を用いて、統計ソフトウェア（ＳＰＳＳ ｖ１２．０）を実施することによって、各群におけるデータ差の有意性を特定した。ｐ＜０．０５を有意であると見なした。

【実施例0073】

実施例１ ５’－末端及び３’－末端ＲｄＲｐ結合部位を含む本合成ＲＮＡ断片の生成
本５’－末端及び３’－末端ＲｄＲｐ結合部位は、「材料及び方法」の章に記載された方法によって設計及び合成された。結果として生成された５’－末端及び３’－末端ＲｄＲｐ結合部位並びにそれらのＲＮＡ配列を表２に列挙する。
表２ 本５’－末端及び３’－末端ＲｄＲｐ結合部位

【表2】

【0074】

さらに、ウイルスＲｄＲｐのｃＤＮＡテンプレート、並びに表２の５’－末端ＲｄＲｐ結合部位及び３’－末端ＲｄＲｐ結合部位の各々によって隣接されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質又は前駆体ｍｉＲＮＡ－３０２は「材料及び方法」の章に記載された手順により合成され、そして、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を受け、それにより本合成ＲＮＡ断片を生成した。