特開2023-110462ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害活性を有するペプチド及びその利用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023110462
(43)【公開日】2023-08-09
(54)【発明の名称】ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害活性を有するペプチド及びその利用
(51)【国際特許分類】
C07K 5/103 20060101AFI20230802BHJP
C07K 5/083 20060101ALI20230802BHJP
C12N 9/48 20060101ALI20230802BHJP
A23L 33/17 20160101ALI20230802BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230802BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20230802BHJP
A61K 38/06 20060101ALI20230802BHJP
A61K 38/07 20060101ALI20230802BHJP
A61K 36/736 20060101ALI20230802BHJP
【ＦＩ】
C07K5/103 ZNA
C07K5/083
C12N9/48
A23L33/17
A61P43/00 111
A61P3/10
A61K38/06
A61K38/07
A61K36/736
【審査請求】未請求
【請求項の数】14
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022011934
(22)【出願日】2022-01-28
(71)【出願人】
【識別番号】000000228
【氏名又は名称】江崎グリコ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100124431
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 順也
(74)【代理人】
【識別番号】100174160
【弁理士】
【氏名又は名称】水谷 馨也
(74)【代理人】
【識別番号】100175651
【弁理士】
【氏名又は名称】迫田 恭子
(72)【発明者】
【氏名】木村 雅和
(72)【発明者】
【氏名】木村 素子
(72)【発明者】
【氏名】中村 大地
(72)【発明者】
【氏名】若村 香菜子
【テーマコード（参考）】
4B018
4B050
4C084
4C088
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B018MD20
4B018ME03
4B050DD11
4B050LL01
4C084AA02
4C084AA03
4C084BA01
4C084BA15
4C084BA16
4C084MA52
4C084NA14
4C084ZC20
4C084ZC35
4C088AB51
4C088AC04
4C088BA16
4C088MA52
4C088NA14
4C088ZC20
4C088ZC35
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA12
4H045BA13
4H045DA56
4H045EA27
4H045FA16
4H045GA25
(57)【要約】
【課題】本発明の目的は、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害活性を有する新規な成分を見出し、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、及び抗糖尿病剤を提供することである。
【解決手段】アーモンド由来タンパク質の加水分解物に含まれるテトラペプチドＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及びトリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒは、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害活性があり、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、及び抗糖尿病剤として使用できる。
【選択図】なし
【解決手段】アーモンド由来タンパク質の加水分解物に含まれるテトラペプチドＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及びトリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒは、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害活性があり、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、及び抗糖尿病剤として使用できる。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙのアミノ酸配列を有するテトラペプチド。
【請求項2】
Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒのアミノ酸配列を有するトリペプチド。
【請求項3】
請求項１に記載のテトラペプチド及び／又は請求項２に記載のトリペプチドを含む、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害剤。
【請求項4】
請求項１に記載のテトラペプチド及び／又は請求項２に記載のトリペプチドとして、Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及び／又はトリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒを含むアーモンドタンパク質加水分解物を含む、請求項３に記載のジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害剤。
【請求項5】
請求項３又は４に記載のジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害剤を含む、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害用の飲食品。
【請求項6】
請求項３又は４に記載のジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害剤を含む、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害用の医薬品。
【請求項7】
請求項１に記載のテトラペプチド及び／又は請求項２に記載のトリペプチドを含む、血糖値上昇抑制剤。
【請求項8】
請求項１に記載のテトラペプチド及び／又は請求項２に記載のトリペプチドとして、Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及び／又はトリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒを含むアーモンドタンパク質加水分解物を含む、請求項７に記載の血糖値上昇抑制剤。
【請求項9】
請求項７又は８に記載の血糖値上昇抑制剤を含む、血糖値上昇抑制用の飲食品。
【請求項10】
請求項７又は８に記載の血糖値上昇抑制剤を含む、血糖値上昇抑制用の医薬品。
【請求項11】
請求項１に記載のテトラペプチド及び／又は請求項２に記載のトリペプチドを含む、抗糖尿病剤。
【請求項12】
請求項１に記載のテトラペプチド及び／又は請求項２に記載のトリペプチドとして、Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及び／又はトリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒを含むアーモンドタンパク質加水分解物を含む、請求項１１に記載の抗糖尿病剤。
【請求項13】
請求項１１又は１２に記載の抗糖尿病剤を含む、抗糖尿病用の飲食品。
【請求項14】
請求項１１又は１２に記載の抗糖尿病剤を含む、抗糖尿病用の医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害活性を有するペプチドに関する。また、本発明は、当該ペプチドを利用したジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、及び抗糖尿病剤等に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、２型糖尿病の治療においては、インクレチンと呼ばれる消化管ホルモンが脚光を浴びている。インクレチンは食事の摂取に伴い消化管から分泌され、膵β細胞に作用してインスリン分泌を促進するホルモンであり、血糖値を上昇させるグルカゴンの分泌抑制作用や、膵β細胞の保護及び増殖作用等も有している。このようにインクレチンは血糖値降下に重要な役割を担っているが、血中でジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ（ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ－ＩＶ；以下、「ＤＰＰ－ＩＶ」と表記することもある）により速やかに分解されて不活化するという問題があるため、２型糖尿病の治療戦略の1つとして、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤の利用が期待されている。そこで、従来、ＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を有する成分について種々見出されている。
【0003】
例えば、特許文献１には、特定構造のフルオロピロリドン誘導体が、ＤＰＰ－ＩＶ等のセリンプロテアーゼをＤＰＰ－ＩＶ阻害剤として使用し得ることが記載されている。また、特許文献２には、特定構造のプロリン誘導体をＤＰＰ－ＩＶ阻害剤として使用し得ることが記載されている。しかしながら、特許文献１及び２で報告されているＤＰＰ－ＩＶ阻害剤は、食経験がない化学合成品であり、食品等として日常的に利用することができないという欠点がある。
【0004】
一方、天然由来成分を利用したＤＰＰ－ＩＶ阻害剤についても、従来、幾つか報告されている。例えば、特許文献３には、カゼイン加水分解物に含まれるトリペプチドＭｅｔ－Ｌｙｓ－ＰｒｏがＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を有していることが記載されている。特許文献４には、チーズの水溶性画分に含まれる特定のペプチドがＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を有していることが記載されている。特許文献５には、グルテンをショウガ根茎由来酵素で分解することにより得られるトリペプチドＸ－Ｐｒｏ－ＧｌｎがＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を有していることが記載されている。特許文献６には、茶葉タンパク質分解物がＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を有していることが記載されている。このように、天然由来成分を利用したＤＰＰ－ＩＶ阻害剤についても幾つか報告されているが、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤として利用される成分のバリエーション増加等の観点から、天然由来成分を利用した新たなＤＰＰ－ＩＶ阻害剤の開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開２００７－６３２８６号公報
【特許文献2】特表２００７－５３７２３１号公報
【特許文献3】特開２０１６－１３６９６６号公報
【特許文献4】特開２０１４－１２２３号公報
【特許文献5】特開２０１７－２１４３３４号公報
【特許文献6】特開２０１７－４３６１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の目的は、ＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を有する新規な成分を見出し、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、及び抗糖尿病剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者等は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、アーモンド由来タンパク質の加水分解物に含まれるテトラペプチドＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及びトリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒは、ＤＰＰ－ＩＶ阻害活性があることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。
【0008】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙのアミノ酸配列を有するテトラペプチド。
項２． Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒのアミノ酸配列を有するトリペプチド。
項３． 項１に記載のテトラペプチド及び／又は項２に記載のトリペプチドを含む、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤。
項４． 項１に記載のテトラペプチド及び／又は項２に記載のトリペプチドとして、Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及び／又はトリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒを含むアーモンドタンパク質加水分解物を含む、項３に記載のＤＰＰ－ＩＶ阻害剤。
項５． 項３又は４に記載のＤＰＰ－ＩＶ阻害剤を含む、ＤＰＰ－ＩＶ阻害用の飲食品。
項６． 項３又は４に記載のＤＰＰ－ＩＶ阻害剤を含む、ＤＰＰ－ＩＶ阻害用の医薬品。
項７． 項１に記載のテトラペプチド及び／又は項２に記載のトリペプチドを含む、血糖値上昇抑制剤。
項８． 項１に記載のテトラペプチド及び／又は項２に記載のトリペプチドとして、Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及び／又はトリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒを含むアーモンドタンパク質加水分解物を含む、項７に記載の血糖値上昇抑制剤。
項９． 項７又は８に記載の血糖値上昇抑制剤を含む、血糖値上昇抑制用の飲食品。
項１０． 項７又は８に記載の血糖値上昇抑制剤を含む、血糖値上昇抑制用の医薬品。
項１１． 項１に記載のテトラペプチド及び／又は項２に記載のトリペプチドを含む、抗糖尿病剤。
項１２． 項１に記載のテトラペプチド及び／又は項２に記載のトリペプチドとして、Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及び／又はトリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒを含むアーモンドタンパク質加水分解物を含む、項１１に記載の抗糖尿病剤。
項１３． 項１１又は１２に記載の抗糖尿病剤を含む、抗糖尿病用の飲食品。
項１４． 項１１又は１２に記載の抗糖尿病剤を含む、抗糖尿病用の医薬品。
項１． Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙのアミノ酸配列を有するテトラペプチド。
項２． Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒのアミノ酸配列を有するトリペプチド。
項３． 項１に記載のテトラペプチド及び／又は項２に記載のトリペプチドを含む、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤。
項４． 項１に記載のテトラペプチド及び／又は項２に記載のトリペプチドとして、Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及び／又はトリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒを含むアーモンドタンパク質加水分解物を含む、項３に記載のＤＰＰ－ＩＶ阻害剤。
項５． 項３又は４に記載のＤＰＰ－ＩＶ阻害剤を含む、ＤＰＰ－ＩＶ阻害用の飲食品。
項６． 項３又は４に記載のＤＰＰ－ＩＶ阻害剤を含む、ＤＰＰ－ＩＶ阻害用の医薬品。
項７． 項１に記載のテトラペプチド及び／又は項２に記載のトリペプチドを含む、血糖値上昇抑制剤。
項８． 項１に記載のテトラペプチド及び／又は項２に記載のトリペプチドとして、Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及び／又はトリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒを含むアーモンドタンパク質加水分解物を含む、項７に記載の血糖値上昇抑制剤。
項９． 項７又は８に記載の血糖値上昇抑制剤を含む、血糖値上昇抑制用の飲食品。
項１０． 項７又は８に記載の血糖値上昇抑制剤を含む、血糖値上昇抑制用の医薬品。
項１１． 項１に記載のテトラペプチド及び／又は項２に記載のトリペプチドを含む、抗糖尿病剤。
項１２． 項１に記載のテトラペプチド及び／又は項２に記載のトリペプチドとして、Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及び／又はトリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒを含むアーモンドタンパク質加水分解物を含む、項１１に記載の抗糖尿病剤。
項１３． 項１１又は１２に記載の抗糖尿病剤を含む、抗糖尿病用の飲食品。
項１４． 項１１又は１２に記載の抗糖尿病剤を含む、抗糖尿病用の医薬品。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、天然物であるアーモンド由来のペプチドを利用してＤＰＰ－ＩＶを阻害するので、安全性が高く、飲食品等として日常的に摂取可能なＤＰＰ－ＩＶ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、及び抗糖尿病剤の提供が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】アーモンド由来タンパク質の加水分解物を精製処理して得られた画分について、ＨＰＬＣ分析によってＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及びＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒの存在を確認した結果を示す図である。上に示すクロマトグラフは精製処理して得られた画分、下に示すクロマトグラフ標準品である。
【図2】Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及びＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒを含むアーモンド由来タンパク質の加水分解物を摂取させた後に、糖負荷（ブドウ糖水溶液の摂取）を行い、経時的に血糖値を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0011】
１．ペプチド
本発明のペプチドは、ＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を有するペプチドであり、具体的には、Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙのアミノ酸配列（配列番号１）を有するテトラペプチド、及びＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒのアミノ酸配列を有するトリペプチドである。
本発明のペプチドは、ＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を有するペプチドであり、具体的には、Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙのアミノ酸配列（配列番号１）を有するテトラペプチド、及びＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒのアミノ酸配列を有するトリペプチドである。
【0012】
本発明において、アミノ酸は三文字表記を使用して表記しており、Ｉｌｅはイソロイシン、Ｐｒｏはプロリン、Ａｌａはアラニン、Ｇｌｙはグリシン、Ｖａｌはバリン、Ｔｙｒはチロシンを示している。また、本発明において、テトラペプチド及びトリペプチドの表記は、左端がＮ末端、右端がＣ末端に位置していることを示している。具体的には、Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙであれば、Ｎ末端からＣ末端に向けて、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、及びＧｌｙがこの順に配されており、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒであれば、Ｎ末端からＣ末端に向けて、Ｖａｌ、Ａｌａ、及びＴｙｒがこの順に配されていることを示している。
【0013】
本発明のペプチドの製造方法については、前記アミノ酸配列のテトラペプチド及び／又はトリペプチドが得られることを限度として、特に制限されないが、例えば、アーモンド由来タンパク質を加水分解する方法、生物工学的法、化学合成法等が挙げられる。これらの中でも、安全性等の観点から、好ましくは、アーモンド由来タンパク質を加水分解する方法が挙げられる。
【0014】
以下、アーモンド由来タンパク質を加水分解することにより本発明のペプチドを製造する方法について説明する。
【0015】
アーモンドとは、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）のアーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ ａｍｙｇｄａｌｕｓ Ｂａｔｓｃｈ）の種子（甘扁桃）である。アーモンド由来タンパク質は、アーモンドから抽出処理することにより得ることができる。アーモンド由来タンパク質の原料として使用されるアーモンドは、生のもの、焙煎したもの、アーモンドオイルの製造工程で生じる脱脂アーモンド（例えば、焙煎したアーモンドの脱脂物）等のいずれであってもよいが、製造コストの抑制、未利用資源の有効活用等の観点から、好ましくは脱脂アーモンドが挙げられる。
【0016】
アーモンドからタンパク質を抽出するには、常法に従って行うことができるが、例えば、アーモンドを必要に応じて粉砕又は粉末化した後に、アルカリ性水溶液に浸漬させればよい。アルカリ性水溶液のｐＨとしては、例えば、７～１４、好ましくは７．５～１２、より好ましくは８～１０が挙げられる。アルカリ性水溶液は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ剤を添加して調製される。抽出温度としては、例えば、４０～１００℃、好ましくは５０～９０℃、より好ましくは６０～８０℃が挙げられる。また、抽出時間としては、例えば、０．５時間以上、好ましくは１～２４時間、より好ましくは２～１２時間が挙げられる。
【0017】
斯くして得られたアーモンド由来タンパク質を含む抽出液は、必要に応じて固液分離、濃縮等を行った後に加水分解処理に供してもよいが、そのまま加水分解処理に供してもよい。
【0018】
アーモンド由来タンパク質を加水分解する方法については、Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及び／又はＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒが生成することを限度として特に制限されず、プロテアーゼ処理、酸処理、アルカリ処理等のいずれの方法であってもよいが、好ましくはプロテアーゼ処理が挙げられる。
【0019】
プロテアーゼ処理に使用されるプロテアーゼの種類については、Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及び／又はＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒを生成可能であることを限度として特に制限されないが、具体的には、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ、これらの組み合わせが挙げられる。また、プロテアーゼの由来についても、特に制限されず、例えば、パパイン、ブロメリン、フィシン等の植物由来プロテアーゼ；各種微生物由来のプロテアーゼ；ペプシン、（キモ）トリプシン、カテプシン等の動物由来プロテアーゼ等が挙げられる。プロテアーゼは市販品を使用することができる。プロテアーゼの市販品としては、例えば、パパインＷ－４０、サモアーゼＰＣ１０Ｆ、ニューラーゼＦ３Ｇ、パンクレアチンＦ、プロチンＳＤ－ＡＹ１０、プロチンＳＤ－ＮＹ１０、プロテアーゼＡ「アマノ」ＳＤ、プロテアーゼＭ「アマノ」ＳＤ、プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤ、ブロメラインＦ、プロテアックス（以上、天野エンザイム社製）；オリエンターゼＡＹ、オリエンターゼ１０ＮＬ、オリエンターゼ９０Ｎ、オリエンターゼＯＰ、ヌクレイシン、オリエンターゼ２２ＢＦ、ビオプラーゼＳＰ－２０ＦＧ、ビオプラーゼＯＰ（以上、エイチビィアイ社製）；スミチームＬＰ－Ｇ、スミチームＦＬ－Ｇ、スミチームＣＰ、スミチームＦＰ－Ｇ、スミチームＭＰ、スミチームＢＲ、スミチームＢＮＰ（以上、新日本化学工業社製）；アロアーゼＡＰ－１０、アロアーゼＸＡ－１０、アロアーゼＮＰ－１０（以上、ヤクルト薬品工業社製）；デナチームＣＰＯ ＰＥＰＲＩＣＨ（ナガセケムテックス社製）；マキシプロＰＳＰ（ＤＳＭ社製）；精製パパイン（三菱化学フーズ社製）；ＦｏｒｍｅａＴＬ、ＦｏｒｍｅａＣＴＬ（以上、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）等が挙げられる。
【0020】
プロテアーゼの中でも、アーモンド由来タンパク質からＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及びＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒを効率的に生成させるという観点から、好ましくはパパイン、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のプロテアーゼ、及びキモトリプシン、より好ましくはパパインＷ－４０（パパイン、天野エンザイム社製）、サモアーゼＰＣ１０Ｆ（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のプロテアーゼ、天野エンザイム社製）、及びＦｏｒｍｅａＣＴＬ（キモトリプシン、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）が挙げられる。
【0021】
これらのプロテアーゼは、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。とりわけ、パパインとＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のプロテアーゼとを併用、或はパパインとキモトリプシンとを併用することによって、アーモンド由来タンパク質からテトラペプチドＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及びトリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒを効率的に生成させることが可能になる。
【0022】
プロテアーゼ処理は、プロテアーゼとアーモンド由来タンパク質とを、プロテアーゼ反応が可能な溶媒中で共存させればよく、例えば、プロテアーゼとアーモンド由来タンパク質とを任意の順で溶媒に添加してもよいが、製造コストの抑制の観点から、前述するアーモンド由来タンパク質を含む抽出液、その濃縮液、又はその希釈液に、プロテアーゼを添加することが好ましい。
【0023】
プロテアーゼ処理において、基質となるアーモンド由来タンパク質の添加量については、特に制限されないが、１０～３００ｇ／Ｌ、好ましくは２５～２００ｇ／Ｌ、より好ましくは５０～１００ｇ／Ｌが挙げられる。プロテアーゼの添加量については、使用する酵素の種類に応じて適宜設定すればよいが、例えば、アーモンド由来タンパク質１００質量部当たり、プロテアーゼが総量で０．０１～２０質量部、好ましくは０．１～１０質量部、より好ましくは１～５質量部が挙げられる。
【0024】
プロテアーゼ処理時のｐＨについては、使用するプロテアーゼが作用できる範囲であればよい。例えば、パパイン及び／又はＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のプロテアーゼを使用する場合であれば、ｐＨとして７～１４、好ましくは７．５～１２、より好ましくは８～１０が挙げられる。また、例えば、パパイン及び／又はキモトリプシンを使用する場合であれば、ｐＨとして、７～１４、好ましくは７．５～１２、より好ましくは８～１０が挙げられる。
【0025】
プロテアーゼ処理時の温度条件については、使用するプロテアーゼが作用できる範囲であればよい。例えば、パパイン及び／又はＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のプロテアーゼを使用する場合であれば、３０～７０℃、好ましくは４０～６０℃、より好ましくは４５～５５℃が挙げられる。また、例えば、パパイン及び／又はキモトリプシンを使用する場合であれば、３０～７０℃、好ましくは４０～６０℃、より好ましくは４５～５５℃が挙げられる。
【0026】
プロテアーゼ処理における処理時間については、使用するアーモンド由来タンパク質の量、酵素の種類や量、プロテアーゼ処理時のｐＨや温度等を勘案した上で、Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及びＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒの生成に必要な時間を適宜設定すればよいが、例えば、５～２４時間、好ましくは１０～２２時間、より好ましくは１５～２０時間が挙げられる。
【0027】
プロテアーゼ処理後には、必要に応じてプロテアーゼの失活、固液分離による残渣の除去、濃縮、乾燥等を行ってもよい。
【0028】
斯くして得られたアーモンドタンパク質の加水分解物は、Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及び／又はＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒが含まれており、本発明のペプチド含有物としてそのまま使用してもよい。また、得られたアーモンドタンパク質加水分解物を、必要に応じて、限外濾過、吸着樹脂処理、クロマトグラフィー等の精製処理に供して、テトラペプチドＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及び／又はトリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒの純度を高めたり、テトラペプチドＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及び／又はトリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒの精製品にしたりして、本発明のペプチド含有物として使用してもよい。
【0029】
本発明のペプチドの用途については、特に制限されないが、本発明のペプチドは、ＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を有しているので、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、抗糖尿病剤等として好適に使用することができる。これらの用途については、「２．ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、及び抗糖尿病剤」の欄にて詳述する。
【0030】
２．ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、及び抗糖尿病剤
テトラペプチドＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及び／又はトリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒは、ＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を有しているので、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤の有効成分として使用することができる。
テトラペプチドＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及び／又はトリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒは、ＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を有しているので、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤の有効成分として使用することができる。
【0031】
また、インクレチンは、インスリンの分泌促進作用や血糖値を上昇させるグルカゴンの分泌抑制作用を有しており、ＤＰＰ－ＩＶ阻害によってインクレチンの分解を抑制できるので、テトラペプチドＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及び／又はトリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒは、血糖値上昇抑制剤又は抗糖尿病剤の有効成分として使用することもできる。ここで、抗糖尿病剤は、２型糖尿病の予防又は治療の目的で使用されるものである。
【0032】
本発明のＤＰＰ－ＩＶ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、又は抗糖尿病剤では、有効成分として、テトラペプチドＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及びトリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒの内、いずれか少なくとも一方が含まれていればよいが、これらの双方が含まれている場合には、より一層優れたＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を発揮できるので、好適である。
【0033】
本発明のＤＰＰ－ＩＶ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、又は抗糖尿病剤において、有効成分として使用されるテトラペプチドＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及び／又はトリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒは、精製又は未精製のいずれの状態であってもよい。例えば、テトラペプチドＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及び／又はトリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒを含むアーモンドタンパク質加水分解物を、未精製の状態又はこれらのペプチドの純度を高めた状態で使用することもできる。
【0034】
本発明のＤＰＰ－ＩＶ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、又は抗糖尿病剤は、経口摂取又は経口投与によって使用される。本発明のＤＰＰ－ＩＶ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、又は抗糖尿病剤の摂取又は投与量については、生体内でＤＰＰ－ＩＶを阻害するのに有効量であれば得、使用される製品形態等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、成人１日当たりの摂取又は投与量が、前記テトラペプチドＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及び／又は前記トリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒの総量で、１ｍｇ～５００ｍｇ、好ましくは５～２５０ｍｇ、より好ましくは１０～１００ｍｇが挙げられる。
【0035】
本発明のＤＰＰ－ＩＶ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、又は抗糖尿病剤は、ＤＰＰ－ＩＶ阻害作用、血糖値上昇抑制作用、又は抗糖尿病作用の付与が求められる製品に配合して使用される。本発明のＤＰＰ－ＩＶ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、又は抗糖尿病剤を配合可能な製品については、経口摂取又は経口投与されるものであることを限度として特に制限されないが、例えば、飲食品、医薬品等が挙げられる。
【0036】
本発明のＤＰＰ－ＩＶ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、又は抗糖尿病剤が配合される製品の剤型は、固形状、半固形状、液状等のいずれであってもよく、当該製品の種類や用途に応じて適宜設定される。本発明のＤＰＰ－ＩＶ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、又は抗糖尿病剤が配合される製品には、その種類や剤型等に応じて、本発明の効果を損なわない範囲内で、食品素材、食品添加物、栄養成分、薬学的に許容される基材、薬学的に許容される添加剤、薬理成分等が含まれていてもよい。
【0037】
本発明のＤＰＰ－ＩＶ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、又は抗糖尿病剤を飲食品分野で使用する場合、テトラペプチドＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及び／又はトリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒを、そのまま又は他の食品素材や添加成分と組み合わせて所望の形態に調製して、ＤＰＰ－ＩＶ阻害用飲食品、血糖値上昇抑制用飲食品、又は抗糖尿病用飲食品として提供すればよい。このような飲食品としては、一般の飲食品の他、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品、サプリメント等を含む）、病者用食品等の食品等が挙げられる。病者用食品は、ＤＰＰ－ＩＶ阻害、血糖値上昇抑制、或は糖尿病の予防又は治療が必要とされる患者用として提供することができる。これらの飲食品の形態として、特に制限されないが、具体的には、チョコレート、クッキー、ビスケット、スナック、クラッカー、チューイングガム、キャンディー、キャラメル類、口中清涼菓子、米菓子等の菓子類；饅頭、どら焼き等の和菓子類；ドライフルーツ、ナッツ、食物繊維等が練り込まれたエネルギーバー又はバランス栄養食品；アイスクリーム、アイスミルク、ラクトアイス、氷菓等の冷菓類；ヨーグルト、プリン、ゼリー等のデザート類；パン、クッキー、ビスケット、ピザ生地、パイ生地、アイスクリームのコーンカップ、モナカの皮、シュークリームの皮等のベーカリー類；スポンジケーキ、シフォンケーキ、カステラ、マドレーヌ、フィナンシェ、パウンドケーキ、ロールケーキ、ホットケーキ等の洋菓子；パスタ、うどん、ソバ、冷麦、そうめん、中華そば、マカロニ、ビーフン、はるさめ等の麺類；イチゴジャム、リンゴジャム、ブルーベリージャム、マーマレード等のジャム類；カレー、ハヤシ、シチュー、ミートソース、ホワイトソース等のソースの素；中華丼、牛丼、親子丼等のどんぶりの素；チャーハンの素、マーボー豆腐の素、釜飯の素等の調味料材料；味噌汁、スープ等のフリーズドライ食品；フルーツソース、中華あん、蒲焼きのたれ、みたらし団子のたれ、ホワイトソース、ドレッシング、ウスターソース、ミートソース、サウザンアイランドドレッシング等のたれ・ソース類；ハム、ソーセージ、焼き豚等の畜肉加工品；魚肉ソーセージ、魚肉ハム、魚肉すり身、蒲鉾、竹輪、はんぺん、薩摩揚げ等の水産練り製品；シリアル（穀物加工品）；カプセル剤（ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤）、錠剤、顆粒剤、粉剤、ゼリー剤、リポソーム製剤等のサプリメント；清涼飲料、乳飲料、乳酸菌飲料、炭酸飲料、果汁飲料、野菜飲料、野菜・果実飲料、粉末飲料、ゼリー飲料、コーヒー飲料、カカオ飲料、紅茶飲料、緑茶飲料、スポーツ飲料、栄養飲料、粉末飲料、エナジードリンク、ノンアルコール飲料、アルコール飲料等の飲料類等が挙げられる。
【0038】
また、本発明のＤＰＰ－ＩＶ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、又は抗糖尿病剤を飲食品分野で使用する場合、本発明のＤＰＰ－ＩＶ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、又は抗糖尿病剤を単独で又は他の成分と組み合わせて、ＤＰＰ－ＩＶ阻害用の食品添加物、血糖値上昇抑制用の食品添加物、又は抗糖尿病用の食品添加物として提供することもできる。
【0039】
本発明のＤＰＰ－ＩＶ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、又は抗糖尿病剤を飲食品に使用する場合、飲食品における当該ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、又は抗糖尿病剤の配合量については、飲食品の種類や形態等に応じて、前述する摂取量を充足できる範囲で適宜設定すればよいが、飲食品中でテトラペプチドＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及び／又はトリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒが総量で、０．０００１～９０質量％、好ましくは０．０００５～７５質量％、更に好ましくは０．００１～５０質量％となる範囲が挙げられる。
【0040】
また、本発明のＤＰＰ－ＩＶ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、又は抗糖尿病剤を医薬品分野で使用する場合、テトラペプチドＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及び／又はトリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒを単独で、又は他の薬理成分、薬学的に許容される基剤や添加剤等と組み合わせて所望の剤型に調製して、ＤＰＰ－ＩＶ阻害用医薬品、血糖値上昇抑制用医薬品、又は抗糖尿病用医薬品として提供すればよい。このような医薬品の形態としては、特に制限されないが、具体的には、ドリンク剤、錠剤、丸剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤（ハードカプセル及びソフトカプセルを含む）、トローチ剤、チュアブル剤、エキス剤（軟エキス剤、乾燥エキス剤等を含む）、ゼリー剤、シロップ剤、酒精剤等の内服用医薬品が挙げられる。
【0041】
本発明のＤＰＰ－ＩＶ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、又は抗糖尿病剤を医薬品に使用する場合、医薬品における当該ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤、血糖値上昇抑制剤、又は抗糖尿病剤の配合量については、医薬品の種類や剤型等に応じて、前述する投与量を充足できる範囲で適宜設定すればよいが、例えば、医薬品中でテトラペプチドＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙ及び／又はトリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒが総量で、０．０００１～９０質量％、好ましくは０．０００５～７５質量％、更に好ましくは０．００１～５０質量％となる範囲が挙げられる。
【実施例0042】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0043】
実施例１：アーモンドタンパク質の加水分解物の調製
脱脂したローストアーモンドの乾燥粉末４００ｇに水３６００ｇを加え、よく分散させ、濃度１０質量％のアーモンド含有液を調製した。このアーモンド含有液に、水酸化ナトリウムを添加して溶液のｐＨを９．０に調整し、７０℃で９時間加熱撹拌することにより、アーモンドタンパク質の抽出液を得た。
脱脂したローストアーモンドの乾燥粉末４００ｇに水３６００ｇを加え、よく分散させ、濃度１０質量％のアーモンド含有液を調製した。このアーモンド含有液に、水酸化ナトリウムを添加して溶液のｐＨを９．０に調整し、７０℃で９時間加熱撹拌することにより、アーモンドタンパク質の抽出液を得た。
【0044】
次いで、前記で得られたアーモンドタンパク質の抽出液を５０℃に冷却し、水酸化ナトリウムを添加してｐＨ９．０に再調整した後、パパインＷ－４０（天野エンザイム社製）及びサモアーゼＰＣ１０Ｆ（天野エンザイム社製）を、各々４ｇ（アーモンド含有液に対して０．１質量％）添加して、５０℃で１８時間加熱撹拌することにより加水分解反応を行った。その後、８０℃で３０分間加熱することにより酵素を失活させ加水分解反応を停止し、室温になるまで冷却した。この加水分解液を遠心分離（１５０００×ｇ、４℃、１０分間）して、上清を回収し、次いで、回収した上清を吸引濾過し残渣を除去した。濾過後の水溶液を凍結乾燥し、加水分解物（凍結乾燥品）約２００ｇを得た。
【0045】
実施例２：ＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を有するペプチドの同定
１．ＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を有するペプチドの分離
前記実施例１で得られた加水分解物（凍結乾燥品）を５質量％となるように超純水に溶解させ、加水分解物含有水溶液を調製した。この加水分解物含有水溶液５００μＬを固相抽出カートリッジ（Ｓｅｐ－Ｐａｋ Ｐｌｕｓ Ｓｈｏｒｔ Ｃ１８ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ、Ｗａｔｅｒｓ社製）に注入した後、シリンジを用いて超純水３ｍＬを注入し、押し出した溶液は回収せず廃棄した。次いで、１０容量%メタノール水溶液１ｍＬを固相抽出カートリッジに注入し、同じく押し出した溶液は回収せず廃棄した。最後に、１０容量%メタノール水溶液２ｍＬを固相抽出カートリッジに注入し、押し出した溶液を回収した。
１．ＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を有するペプチドの分離
前記実施例１で得られた加水分解物（凍結乾燥品）を５質量％となるように超純水に溶解させ、加水分解物含有水溶液を調製した。この加水分解物含有水溶液５００μＬを固相抽出カートリッジ（Ｓｅｐ－Ｐａｋ Ｐｌｕｓ Ｓｈｏｒｔ Ｃ１８ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ、Ｗａｔｅｒｓ社製）に注入した後、シリンジを用いて超純水３ｍＬを注入し、押し出した溶液は回収せず廃棄した。次いで、１０容量%メタノール水溶液１ｍＬを固相抽出カートリッジに注入し、同じく押し出した溶液は回収せず廃棄した。最後に、１０容量%メタノール水溶液２ｍＬを固相抽出カートリッジに注入し、押し出した溶液を回収した。
【0046】
回収した溶液を濃縮して乾燥した後、超純水２００μＬに溶解し、０．４５μｍ遠心フィルター（５，０００ｒｐｍ／ｍｉｎ）を通過後の溶液をサンプルとして、逆相ＨＰＬＣを用いて下記分離条件１及び２にてペプチドの分離を行った。
【0047】
＜分離条件１＞
カラム：ＩｎｅｒｔｓｉＬ ＯＤＳ－３（ジーエルサイエンス社製）
検出：ＵＶ ２１０ｎｍ
流速：３ｍＬ／ｍｉｎ
溶離液Ａ：超純水
溶離液Ｂ：５０％アセトニトリル水溶液
グラジェント：溶離液Ａの割合１００％から、１３３分後に溶離液Ｂの割合が５０％になるような直線グラジエント条件に設定した。
カラム：ＩｎｅｒｔｓｉＬ ＯＤＳ－３（ジーエルサイエンス社製）
検出：ＵＶ ２１０ｎｍ
流速：３ｍＬ／ｍｉｎ
溶離液Ａ：超純水
溶離液Ｂ：５０％アセトニトリル水溶液
グラジェント：溶離液Ａの割合１００％から、１３３分後に溶離液Ｂの割合が５０％になるような直線グラジエント条件に設定した。
【0048】
＜分離条件２＞
カラム：ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ １００ ＲＰ－１８（ＭＥＲＣＫ社製）
検出：ＵＶ ２１０ｎｍ
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
溶離液Ａ：超純水
溶離液Ｂ：５０％アセトニトリル水溶液
グラジェント：溶離液Ａの割合１００％から、２０分後に溶離液Ｂの割合が１００%になるような直線グラジエント条件に設定した。
カラム：ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ １００ ＲＰ－１８（ＭＥＲＣＫ社製）
検出：ＵＶ ２１０ｎｍ
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
溶離液Ａ：超純水
溶離液Ｂ：５０％アセトニトリル水溶液
グラジェント：溶離液Ａの割合１００％から、２０分後に溶離液Ｂの割合が１００%になるような直線グラジエント条件に設定した。
【0049】
分離条件１で得られた溶出画分について、ＤＰＰＩＶ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｋｉｔ（ＢＭＬ－ＡＫ４９９，Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を測定したところ、リテンションタイム８０分の溶出画分にＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を持つペプチドが存在していた。この条件により分離したペプチドを「ペプチドＡ」とした。
【0050】
また、分離条件２で得られた溶出画分について、ＤＰＰＩＶ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｋｉｔ（ＢＭＬ－ＡＫ４９９，Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を測定したところ、リテンションタイム１２分の溶出画分にＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を持つペプチドが存在していた。この条件により分離したペプチドを「ペプチドＢ」とした。
【0051】
２．ペプチドＡ及びＢのアミノ酸配列の同定
ＤＰＰ－ＩＶ阻害活性が認められたペプチドＡ及びＢのアミノ酸配列を、プロテインシーケンサ（ＰＰＳＱ－５３Ａ、島津製作所社）により同定した。その結果、ペプチドＡはＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒからなるトリペプチドであり、ペプチドＢはＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙからなるテトラペプチドであることが分かった。
ＤＰＰ－ＩＶ阻害活性が認められたペプチドＡ及びＢのアミノ酸配列を、プロテインシーケンサ（ＰＰＳＱ－５３Ａ、島津製作所社）により同定した。その結果、ペプチドＡはＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒからなるトリペプチドであり、ペプチドＢはＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙからなるテトラペプチドであることが分かった。
【0052】
３．トリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒ及びテトラペプチドＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－ＧｌｙのＤＰＰ－ＩＶ阻害活性の確認
３－１．試験方法
トリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒ及びテトラペプチドＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙを合成して、これらのＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を測定した。ＤＰＰ－ＩＶ阻害活性は、ＤＰＰＩＶ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｋｉｔ（ＢＭＬ－ＡＫ４９９，Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用して行った。具体的な測定条件は、以下の通りである。
３－１．試験方法
トリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒ及びテトラペプチドＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙを合成して、これらのＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を測定した。ＤＰＰ－ＩＶ阻害活性は、ＤＰＰＩＶ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｋｉｔ（ＢＭＬ－ＡＫ４９９，Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用して行った。具体的な測定条件は、以下の通りである。
【0053】
＜材料＞
緩衝液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）
基質液：Ｈ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－ｐＮＡ（１０ｍＭ ｉｎ ＤＭＳＯ） キット付属の基質液を、前記緩衝液を用いて５０倍に希釈したものを用いた。
酵素液：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６ キット付属の酵素液４０μＬを、前記緩衝液を用いて全量１０１１．５μＬとなるよう希釈した。この希釈溶液を、前記緩衝液を用いて更に２倍に希釈したものを用いた。
試料液：合成したＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒ及びＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙを超純水で適宜段階希釈したものを用いた。
緩衝液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）
基質液：Ｈ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－ｐＮＡ（１０ｍＭ ｉｎ ＤＭＳＯ） キット付属の基質液を、前記緩衝液を用いて５０倍に希釈したものを用いた。
酵素液：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６ キット付属の酵素液４０μＬを、前記緩衝液を用いて全量１０１１．５μＬとなるよう希釈した。この希釈溶液を、前記緩衝液を用いて更に２倍に希釈したものを用いた。
試料液：合成したＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒ及びＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙを超純水で適宜段階希釈したものを用いた。
【0054】
＜手法＞
緩衝液、基質液、及び試料液のそれぞれを、表１に従い１ウェル中に全量１００μＬとなるよう９６ウェルプレートに添加した。次いで、この９６ウェルプレートをマイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００ＰＲＯ，ＴＥＣＡＮ社製）へ挿入し、３７℃で１０分間、プレインキュベートした。プレインキュベート後、表１に従い酵素液を、マイクロプレートリーダーに添加した。その後、３７℃で６０分間反応させながら、ＤＰＰ－ＩＶによる基質からのｐ－ニトロアニリン（ｐＮＡ）の切断により増加する吸光度を４０５ｎｍにて５分間隔で測定した。
緩衝液、基質液、及び試料液のそれぞれを、表１に従い１ウェル中に全量１００μＬとなるよう９６ウェルプレートに添加した。次いで、この９６ウェルプレートをマイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００ＰＲＯ，ＴＥＣＡＮ社製）へ挿入し、３７℃で１０分間、プレインキュベートした。プレインキュベート後、表１に従い酵素液を、マイクロプレートリーダーに添加した。その後、３７℃で６０分間反応させながら、ＤＰＰ－ＩＶによる基質からのｐ－ニトロアニリン（ｐＮＡ）の切断により増加する吸光度を４０５ｎｍにて５分間隔で測定した。
【0055】
【表1】
【0056】
以下の式に従って、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒ及びＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙの各濃度におけるＤＰＰ－ＩＶ阻害率を算出し、ＩＣ50（ＤＰＰ－ＩＶ活性を５０％阻害する濃度）を求めた。
【数1】
【0057】
３－２．試験結果
結果を表２に示す。この結果、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒ及びＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－ＧｌｙにはＤＰＰ－ＩＶ阻害活性があり、Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－ＧｌｙはＤＰＰ－ＩＶ阻害活性が格段に高いことが確認された。
結果を表２に示す。この結果、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒ及びＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－ＧｌｙにはＤＰＰ－ＩＶ阻害活性があり、Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－ＧｌｙはＤＰＰ－ＩＶ阻害活性が格段に高いことが確認された。
【0058】
【表2】
【0059】
実施例３：トリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒ及びテトラペプチドＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙの精製物の調製
前記実施例１で得られた加水分解物を、樹脂を用いた精製処理に供し、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒ及びＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙの純度を高めた精製物を調製した。具体的には、前記実施例1で得られた加水分解物を超純水に添加して混合し、水溶液を調製した。この水溶液ｍＬを、樹脂（ＰｒｅｐＣ１８，日本ウォーターズ社製）を充填したカラム（内径５０ｍｍ×長さ２００ｍｍ，ＢＩＯＲＡＤ社製）にロードした。次いで、濃度が異なる２種のエタノール水溶液をカラムに滴下することによりペプチドの溶出を行い、溶出液を分画した。得られた各画分について、合成したＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒ及びＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙを標準品として用いて、以下の条件でＨＰＬＣ分析を行った。
前記実施例１で得られた加水分解物を、樹脂を用いた精製処理に供し、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒ及びＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙの純度を高めた精製物を調製した。具体的には、前記実施例1で得られた加水分解物を超純水に添加して混合し、水溶液を調製した。この水溶液ｍＬを、樹脂（ＰｒｅｐＣ１８，日本ウォーターズ社製）を充填したカラム（内径５０ｍｍ×長さ２００ｍｍ，ＢＩＯＲＡＤ社製）にロードした。次いで、濃度が異なる２種のエタノール水溶液をカラムに滴下することによりペプチドの溶出を行い、溶出液を分画した。得られた各画分について、合成したＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒ及びＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙを標準品として用いて、以下の条件でＨＰＬＣ分析を行った。
【0060】
＜ＨＰＬＣの条件＞
ＨＰＬＣシステム：ＬＣ－２０１０ ＣＨＴ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ）
カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｘｔｅｒｒａ Ｃ１８(４．６×１５０ｍｍ、５μｍ)
検出：ＵＶ ２１０ｎｍ
流速：８００μＬ／ｍｉｎ
溶離液Ａ：０．１％酢酸水溶液
溶離液Ｂ：０．１％酢酸含有５０％エタノール水溶液
グラジェント：
時間（ｍｉｎ） Ａ液（％） Ｂ液（％）
０～４ ９６ ４
４～２０ ６０ ４０
カラム温度：４０℃
注入量：５μＬ
ＨＰＬＣシステム：ＬＣ－２０１０ ＣＨＴ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ）
カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｘｔｅｒｒａ Ｃ１８(４．６×１５０ｍｍ、５μｍ)
検出：ＵＶ ２１０ｎｍ
流速：８００μＬ／ｍｉｎ
溶離液Ａ：０．１％酢酸水溶液
溶離液Ｂ：０．１％酢酸含有５０％エタノール水溶液
グラジェント：
時間（ｍｉｎ） Ａ液（％） Ｂ液（％）
０～４ ９６ ４
４～２０ ６０ ４０
カラム温度：４０℃
注入量：５μＬ
【0061】
その結果、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒ及びＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙの双方が含まれている画分が検出された。当該画分をＨＰＬＣ分析した結果を図１に示す。また、当該画分を濃縮して凍結乾燥し、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒ及びＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙを含む精製物を調製し、後述する実施例４で使用した。
【0062】
実施例４：ＤＰＰ－ＩＶ阻害活性の確認
実施例１で得られた加水分解物（Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒを１．６０ｍｇ／ｇ及びＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙを１．３３ｍｇ／ｇ含有）、及び実施例４で得られた精製物（Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒを５．１０ｍｇ／ｇ及びＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙを４．３０ｍｇ／ｇ含有）について、ＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を測定した。ＤＰＰ－ＩＶ阻害活性は、ＤＰＰＩＶ－ＧｌｏTM Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｓｓａｙ（Ｇ８３５０，Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使用して行った。具体的な測定条件は、以下の通りである。
実施例１で得られた加水分解物（Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒを１．６０ｍｇ／ｇ及びＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙを１．３３ｍｇ／ｇ含有）、及び実施例４で得られた精製物（Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒを５．１０ｍｇ／ｇ及びＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙを４．３０ｍｇ／ｇ含有）について、ＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を測定した。ＤＰＰ－ＩＶ阻害活性は、ＤＰＰＩＶ－ＧｌｏTM Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｓｓａｙ（Ｇ８３５０，Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使用して行った。具体的な測定条件は、以下の通りである。
【0063】
＜材料＞
緩衝液：１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０、ニッポンジーン社製）を、超純水を用いて１００倍希釈した１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を使用した。
基質液：キット付属のＤＰＰＩＶ－ＧｌｏTM Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ粉末に超純水２５μＬを加えた１０ｍＭの基質液を使用した。
ルシフェリン検出試薬：キット付属のＬｕｃｉｆｅｒｉｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ粉末にＤＰＰＩＶ－ＧｌｏTM Ｂｕｆｆｅｒ １０ｍＬを全量加え、混合したものを使用した。
測定試薬：前記ルシフェリン検出試薬１０ｍＬに前記基質液２０μＬを加え十分混合し、基質濃度を２０μＭに調整したものを使用した。
酵素液：０．５ｍｇ/ｍＬのＤｉｐｅｐｔｉｄｙｌｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＩＶ， ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎt（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社製）溶液を、前記緩衝液を用いて１６０００倍希釈したものを使用した。
試料液（サンプル）：実施例１で得られた加水分解物又は実施例４で得られた精製物を、超純水を用いて濃度１５０ｍｇ／ｍＬに調製した。次に、この水溶液と、超純水を用いて１０ｖｏｌ％に調製したジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、富士フィルム和光純薬製）水溶液を、３対１の割合で(ＤＭＳＯ濃度が２．５ｖｏｌ％となるように)混合したものを使用した。
試料液（陰性コントロール）：超純水にＤＭＳＯ（富士フィルム和光純薬製）を２．５ｖｏｌ％となるように添加したものを使用した。
試料液（陽性コントロール）：Ｐ３２／９８（ＢＭＬ－ＰＩ１４２－００１０、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を、２．５ｖｏｌ％ＤＭＳＯを用いて濃度１９．２μＭとなるように添加したものを使用した。
緩衝液：１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０、ニッポンジーン社製）を、超純水を用いて１００倍希釈した１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を使用した。
基質液：キット付属のＤＰＰＩＶ－ＧｌｏTM Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ粉末に超純水２５μＬを加えた１０ｍＭの基質液を使用した。
ルシフェリン検出試薬：キット付属のＬｕｃｉｆｅｒｉｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ粉末にＤＰＰＩＶ－ＧｌｏTM Ｂｕｆｆｅｒ １０ｍＬを全量加え、混合したものを使用した。
測定試薬：前記ルシフェリン検出試薬１０ｍＬに前記基質液２０μＬを加え十分混合し、基質濃度を２０μＭに調整したものを使用した。
酵素液：０．５ｍｇ/ｍＬのＤｉｐｅｐｔｉｄｙｌｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＩＶ， ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎt（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社製）溶液を、前記緩衝液を用いて１６０００倍希釈したものを使用した。
試料液（サンプル）：実施例１で得られた加水分解物又は実施例４で得られた精製物を、超純水を用いて濃度１５０ｍｇ／ｍＬに調製した。次に、この水溶液と、超純水を用いて１０ｖｏｌ％に調製したジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、富士フィルム和光純薬製）水溶液を、３対１の割合で(ＤＭＳＯ濃度が２．５ｖｏｌ％となるように)混合したものを使用した。
試料液（陰性コントロール）：超純水にＤＭＳＯ（富士フィルム和光純薬製）を２．５ｖｏｌ％となるように添加したものを使用した。
試料液（陽性コントロール）：Ｐ３２／９８（ＢＭＬ－ＰＩ１４２－００１０、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を、２．５ｖｏｌ％ＤＭＳＯを用いて濃度１９．２μＭとなるように添加したものを使用した。
【0064】
＜手法＞
測定試薬５μＬ、試料液１μＬ、及び酵素液４μＬを、３８４ウェルプレートの各ウェル中に添加し、室温で３０分間インキュベートした。次いで３８４ウェルプレートをマイクロプレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１０５、パーキンエルマー社製）へ挿入し、発光強度の測定を行った。医学統計解析ソフトＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ９（エムデーエフ社製）を用いて、試料液（陰性コントロール）の場合の発光強度を１００％、試料液（陽性コントロール）の場合の発光強度を０％に設定し、実施例１で得られた加水分解物及び実施例４で得られた精製物のＩＣ50（ＤＰＰ－ＩＶ活性を５０％阻害する濃度）を求めた。
測定試薬５μＬ、試料液１μＬ、及び酵素液４μＬを、３８４ウェルプレートの各ウェル中に添加し、室温で３０分間インキュベートした。次いで３８４ウェルプレートをマイクロプレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１０５、パーキンエルマー社製）へ挿入し、発光強度の測定を行った。医学統計解析ソフトＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ９（エムデーエフ社製）を用いて、試料液（陰性コントロール）の場合の発光強度を１００％、試料液（陽性コントロール）の場合の発光強度を０％に設定し、実施例１で得られた加水分解物及び実施例４で得られた精製物のＩＣ50（ＤＰＰ－ＩＶ活性を５０％阻害する濃度）を求めた。
【0065】
結果を表３に示す。実施例４で得られた精製物のＩＣ50が、実施例１で得られた加水分解物に比べて０．６倍であった。即ち、樹脂を用いた精製により、ＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を持つＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒ及びＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙが濃縮され、より高いＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を示すことが確認された。
【0066】
【表3】
【0067】
実施例５：食後血糖上昇抑制効果の確認試験
前記の通り、トリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒ及びテトラペプチドＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙには、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＤＰＰ－ＩＶ阻害活性が認められた。そこで、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒ及びＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙを含む組成物（実施例１で得られた加水分解物；Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒを１．６０ｍｇ／ｇ及びＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙを１．３３ｍｇ／ｇ含有）が、ヒト体内で食後血糖上昇抑制効果を奏するか否かを確認するために、ヒトでの試験を行った。
前記の通り、トリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒ及びテトラペプチドＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙには、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＤＰＰ－ＩＶ阻害活性が認められた。そこで、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒ及びＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙを含む組成物（実施例１で得られた加水分解物；Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒを１．６０ｍｇ／ｇ及びＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙを１．３３ｍｇ／ｇ含有）が、ヒト体内で食後血糖上昇抑制効果を奏するか否かを確認するために、ヒトでの試験を行った。
【0068】
ヘルシンキ宣言に則り、本試験の目的、方法、得られる結果等についての十分な説明を行なった後、同意が得られた健常成人(男性３名、女性３名；平均年齢３５歳)を被験者とした。試験は２日間に分けて行った。また、本試験の実施に際し空腹時の血糖値を測定する必要性から、試験前日２２時から試験当日開始までは絶食、試験開始1時間半前までは飲水のみを可能とし、その後試験開始までは絶水とした。なお、試験前日の食事内容は指定しなかった。試験中は、血糖値に影響を及ぼす運動や活動を制限し、安静な状態を保つようにした。
【0069】
実施例１で得られた加水分解物（凍結乾燥物）を摂取量が５ｇとなるように水１００ｍＬに懸濁した飲料を試験食とした。また、実施例１で得られた加水分解物の原料として使用した脱脂ローストアーモンドの乾燥粉末を、タンパク質としての摂取量が５ｇとなるように水１００ｍＬに懸濁した飲料をプラセボ食とした。また、糖質負荷のための基準食として、グルコース（Ｄ（＋）－グルコース，富士フイルム和光純薬社製）を、糖質としての摂取量が５０ｇとなるように水３００ｍＬに溶解した飲料を使用した。
【0070】
本試験では、被験者に試験食又はプラセボ食を摂食させ、その３０分後に基準食を摂取させた。試験食又はプラセボ食の摂取直前（－３０分）、基準食の摂取直前（０分）、基準食摂取後３０分、６０分、９０分、及び１２０分の時点で採血を行った。採血は留置針を用い、医師または看護師により行った。採血した血液サンプルについて血糖値を測定した。測定には、ラボアッセイTMグルコース（富士フイルム和光純薬社製）を使用した。
【0071】
図２に、試験食又はプラセボ食の摂取直前から基準食摂取後１２０分までの被験者6名の血糖値の平均値の経時変化を示す。この結果、実施例１で得られた加水分解物を摂取することにより、糖負荷直後から血糖値の上昇抑制効果が認められた。即ち、トリペプチドＶａｌ－Ａｌａ－Ｔｙｒ及びテトラペプチドＩｌｅ－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｙは、ヒト体内で食後血糖上昇抑制効果を奏することが明らかとなった。
【図1】
【図2】
【配列表】