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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023111535
(43)【公開日】2023-08-10
(54)【発明の名称】セマフォリン３Ａ発現促進剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/4184 20060101AFI20230803BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230803BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20230803BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230803BHJP
A61P 11/02 20060101ALI20230803BHJP
A61P 19/10 20060101ALI20230803BHJP
C07K 14/475 20060101ALN20230803BHJP
【ＦＩ】
A61K31/4184
A61P43/00 107
A61P37/08
A61P17/00
A61P11/02
A61P19/10
C07K14/475 ZNA
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022013425
(22)【出願日】2022-01-31
(71)【出願人】
【識別番号】502285457
【氏名又は名称】学校法人順天堂
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】鎌田 弥生
(72)【発明者】
【氏名】藤田 未麗
(72)【発明者】
【氏名】冨永 光俊
(72)【発明者】
【氏名】▲高▼森 建二
【テーマコード（参考）】
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC39
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA34
4C086ZA89
4C086ZA97
4C086ZB13
4C086ZB22
4H045CA40
4H045EA50
(57)【要約】
【課題】セマフォリン３Ａの発現を促進させる新たな技術を提供すること。
【解決手段】下記式（１）で表される化合物を有効成分とする、セマフォリン３Ａ発現促進剤。
〔式（１）中、
Ｒ1は、炭素数６～１４の芳香族炭化水素基又は炭素数１～１２の脂肪族炭化水素基を示し、
Ｒ2は、水素原子又は脂肪族炭化水素基を示し、
Ｘは、単結合、酸素原子又は硫黄原子を示す。〕
【選択図】なし
【解決手段】下記式（１）で表される化合物を有効成分とする、セマフォリン３Ａ発現促進剤。
Ｒ1は、炭素数６～１４の芳香族炭化水素基又は炭素数１～１２の脂肪族炭化水素基を示し、
Ｒ2は、水素原子又は脂肪族炭化水素基を示し、
Ｘは、単結合、酸素原子又は硫黄原子を示す。〕
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記式（１）で表される化合物を有効成分とする、セマフォリン３Ａ発現促進剤。
〔式（１）中、
Ｒ1は、炭素数６～１４の芳香族炭化水素基又は炭素数１～１２の脂肪族炭化水素基を示し、
Ｒ2は、水素原子又は脂肪族炭化水素基を示し、
Ｘは、単結合、酸素原子又は硫黄原子を示す。〕
【化1】
Ｒ1は、炭素数６～１４の芳香族炭化水素基又は炭素数１～１２の脂肪族炭化水素基を示し、
Ｒ2は、水素原子又は脂肪族炭化水素基を示し、
Ｘは、単結合、酸素原子又は硫黄原子を示す。〕
【請求項2】
下記式（１）で表される化合物を有効成分とする、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤。
〔式（１）中、
Ｒ1は、炭素数６～１４の芳香族炭化水素基又は炭素数１～１２の脂肪族炭化水素基を示し、
Ｒ2は、水素原子又は脂肪族炭化水素基を示し、
Ｘは、単結合、酸素原子又は硫黄原子を示す。〕
【化2】
Ｒ1は、炭素数６～１４の芳香族炭化水素基又は炭素数１～１２の脂肪族炭化水素基を示し、
Ｒ2は、水素原子又は脂肪族炭化水素基を示し、
Ｘは、単結合、酸素原子又は硫黄原子を示す。〕
【請求項3】
下記式（１）で表される化合物を有効成分とする、乾皮症予防及び／又は治療剤。
〔式（１）中、
Ｒ1は、炭素数６～１４の芳香族炭化水素基又は炭素数１～１２の脂肪族炭化水素基を示し、
Ｒ2は、水素原子又は脂肪族炭化水素基を示し、
Ｘは、単結合、酸素原子又は硫黄原子を示す。〕
【化3】
Ｒ1は、炭素数６～１４の芳香族炭化水素基又は炭素数１～１２の脂肪族炭化水素基を示し、
Ｒ2は、水素原子又は脂肪族炭化水素基を示し、
Ｘは、単結合、酸素原子又は硫黄原子を示す。〕
【請求項4】
下記式（１）で表される化合物を有効成分とする、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤。
〔式（１）中、
Ｒ1は、炭素数６～１４の芳香族炭化水素基又は炭素数１～１２の脂肪族炭化水素基を示し、
Ｒ2は、水素原子又は脂肪族炭化水素基を示し、
Ｘは、単結合、酸素原子又は硫黄原子を示す。〕
【化4】
Ｒ1は、炭素数６～１４の芳香族炭化水素基又は炭素数１～１２の脂肪族炭化水素基を示し、
Ｒ2は、水素原子又は脂肪族炭化水素基を示し、
Ｘは、単結合、酸素原子又は硫黄原子を示す。〕
【請求項5】
下記式（１）で表される化合物を有効成分とする、骨粗鬆症予防及び／又は治療剤。
〔式（１）中、
Ｒ1は、炭素数６～１４の芳香族炭化水素基又は炭素数１～１２の脂肪族炭化水素基を示し、
Ｒ2は、水素原子又は脂肪族炭化水素基を示し、
Ｘは、単結合、酸素原子又は硫黄原子を示す。〕
【化5】
Ｒ1は、炭素数６～１４の芳香族炭化水素基又は炭素数１～１２の脂肪族炭化水素基を示し、
Ｒ2は、水素原子又は脂肪族炭化水素基を示し、
Ｘは、単結合、酸素原子又は硫黄原子を示す。〕
【請求項6】
式（１）で表される化合物が、パーベンダゾール、フェンベンダゾール及びアルベンダゾールから選ばれる１種又は２種以上である、請求項１～５のいずれか１項に記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はセマフォリン３Ａ発現促進剤に関する。より詳細には、セマフォリン３Ａ発現促進剤、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤、乾皮症予防及び／又は治療剤、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤、並びに骨粗鬆症予防及び／又は治療剤に関する。
【背景技術】
【0002】
アトピー性皮膚炎や乾皮症の病変部位では表皮内に神経線維が多数増生し、これがかゆみ過敏の原因になる。
また、セマフォリンは、免疫応答や骨代謝の制御、がんの進展など様々な病態に関与することが知られるたんぱく質群である。正常皮膚（表皮）ではセマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ、神経反発因子）がＮＧＦ（神経伸張因子）より優位になっているが、アトピー性皮膚炎や乾皮症の病変部位では、セマフォリン３Ａの発現が低下してＮＧＦの発現が亢進する。その結果、ＮＧＦ優位となり、神経線維の表皮内侵入が惹起されるため、表皮内神経線維の増生は表皮角化細胞が産生するセマフォリン３Ａの発現減少が一因と考えられており、セマフォリン３Ａをアトピー性皮膚炎病変部に塗布又は皮下注射した場合にかゆみや皮膚炎の改善が認められたという報告がある（非特許文献１、２）。
また、セマフォリンは、免疫応答や骨代謝の制御、がんの進展など様々な病態に関与することが知られるたんぱく質群である。正常皮膚（表皮）ではセマフォリン３Ａ（Ｓｅｍａ３Ａ、神経反発因子）がＮＧＦ（神経伸張因子）より優位になっているが、アトピー性皮膚炎や乾皮症の病変部位では、セマフォリン３Ａの発現が低下してＮＧＦの発現が亢進する。その結果、ＮＧＦ優位となり、神経線維の表皮内侵入が惹起されるため、表皮内神経線維の増生は表皮角化細胞が産生するセマフォリン３Ａの発現減少が一因と考えられており、セマフォリン３Ａをアトピー性皮膚炎病変部に塗布又は皮下注射した場合にかゆみや皮膚炎の改善が認められたという報告がある（非特許文献１、２）。
【0003】
また、セマフォリン３Ａの発現減少はアレルギー性鼻炎の鼻粘膜上皮でも見られ、セマフォリン３Ａの鼻腔内投与により鼻炎が軽減されるという報告もある（非特許文献３）。また、セマフォリン３Ａは、破骨細胞の分化抑制と分化促進を同時に行うことで骨量を増加させる作用をもつことが知られている（非特許文献４）。
【0004】
このようなセマフォリン３Ａの発現を促進するものとして、植物由来スフィンゴ糖脂質や緑茶抽出物がこれまでに報告されている（特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開２０１７－１９７５０１号公報
【特許文献2】特開２０２１－１３０６４１号公報
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｎｅｇｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ ＤｅｒｍａｔｏｌＳｃｉ，２０１２，６６：３７－４３．
【非特許文献2】Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１２８（１２），２８４２－９，２００８
【非特許文献3】Ｓａｗａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ ＰｈａｒｍａｃｏｌＳｃｉ １１７，３４－４４，２０１１
【非特許文献4】林ら，実験医学，Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．４，２０１３年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
一方、パーベンダゾールやフェンベンダゾール、アルベンダゾールに代表されるベンズイミダゾール誘導体は、駆虫に有効ということが知られているが、セマフォリン３Ａ発現促進効果やアトピー性皮膚炎予防及び／又は治療効果、乾皮症予防及び／又は治療効果、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療効果、骨粗鬆症予防及び／又は治療効果があるか否かを検討したという報告はない。
本発明の課題は、セマフォリン３Ａの発現を促進させる新たな技術を提供することにある。
本発明の課題は、セマフォリン３Ａの発現を促進させる新たな技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは鋭意検討した結果、パーベンダゾールやフェンベンダゾール、アルベンダゾールに代表される特定のベンズイミダゾール誘導体が優れたセマフォリン３Ａ発現促進効果を有することを見出し、本発明を完成した。
【0009】
すなわち、本発明は、以下の＜１＞～＜７＞を提供するものである。
＜１＞ 下記式（１）で表される化合物（以下、化合物（１）ともいう）を有効成分とする、セマフォリン３Ａ発現促進剤（以下、本発明のセマフォリン３Ａ発現促進剤ともいう）。
＜１＞ 下記式（１）で表される化合物（以下、化合物（１）ともいう）を有効成分とする、セマフォリン３Ａ発現促進剤（以下、本発明のセマフォリン３Ａ発現促進剤ともいう）。
【0010】
【化1】
【0011】
〔式（１）中、
Ｒ1は、炭素数６～１４の芳香族炭化水素基又は炭素数１～１２の脂肪族炭化水素基を示し、
Ｒ2は、水素原子又は脂肪族炭化水素基を示し、
Ｘは、単結合、酸素原子又は硫黄原子を示す。〕
Ｒ1は、炭素数６～１４の芳香族炭化水素基又は炭素数１～１２の脂肪族炭化水素基を示し、
Ｒ2は、水素原子又は脂肪族炭化水素基を示し、
Ｘは、単結合、酸素原子又は硫黄原子を示す。〕
【0012】
＜２＞ 化合物（１）を有効成分とする、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤（以下、本発明のアトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤ともいう）。
＜３＞ 化合物（１）を有効成分とする、乾皮症予防及び／又は治療剤（以下、本発明の乾皮症予防及び／又は治療剤ともいう）。
＜４＞ 化合物（１）を有効成分とする、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤（以下、本発明のアレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤ともいう）。
＜３＞ 化合物（１）を有効成分とする、乾皮症予防及び／又は治療剤（以下、本発明の乾皮症予防及び／又は治療剤ともいう）。
＜４＞ 化合物（１）を有効成分とする、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤（以下、本発明のアレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤ともいう）。
【0013】
＜５＞ 化合物（１）を有効成分とする、骨粗鬆症予防及び／又は治療剤（以下、本発明の骨粗鬆症予防及び／又は治療剤ともいう）。
＜６＞ 化合物（１）を有効成分とする、ＮＧＦ発現抑制剤（以下、本発明のＮＧＦ発現抑制剤ともいう）。
＜６＞ 化合物（１）を有効成分とする、ＮＧＦ発現抑制剤（以下、本発明のＮＧＦ発現抑制剤ともいう）。
【0014】
＜７＞ 式（１）で表される化合物が、パーベンダゾール、フェンベンダゾール及びアルベンダゾールから選ばれる１種又は２種以上である、＜１＞～＜６＞のいずれかに記載の剤。
【発明の効果】
【0015】
本発明のセマフォリン３Ａ発現促進剤は、優れたセマフォリン３Ａ発現促進効果を有する。また、本発明のＮＧＦ発現抑制剤は、優れたＮＧＦ発現抑制効果を有する。
本発明のアトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤は、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療効果に優れる。
本発明の乾皮症予防及び／又は治療剤は、乾皮症予防及び／又は治療効果に優れる。
本発明のアレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤は、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療効果に優れる。
本発明の骨粗鬆症予防及び／又は治療剤は、骨粗鬆症予防及び／又は治療効果に優れる。
本発明のアトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤は、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療効果に優れる。
本発明の乾皮症予防及び／又は治療剤は、乾皮症予防及び／又は治療効果に優れる。
本発明のアレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤は、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療効果に優れる。
本発明の骨粗鬆症予防及び／又は治療剤は、骨粗鬆症予防及び／又は治療効果に優れる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】パーベンダゾール添加による分泌Ｓｅｍａ３Ａタンパク質量の増大を示す図。
【図2】パーベンダゾールのＳｅｍａ３Ａ ｍＲＮＡ発現促進効果を示す図。
【図3】パーベンダゾールのＮＧＦ ｍＲＮＡ発現抑制効果を示す図。
【図4】パーベンダゾールの低毒性を示す図。
【図5-1】フェンベンダゾールのＳｅｍａ３Ａ ｍＲＮＡ発現促進効果を示す図。
【図5-2】アルベンダゾールのＳｅｍａ３Ａ ｍＲＮＡ発現促進効果を示す図。
【図6-1】フェンベンダゾールのＮＧＦ ｍＲＮＡ発現抑制効果を示す図。
【図6-2】アルベンダゾールのＮＧＦ ｍＲＮＡ発現抑制効果を示す図。
【図7-1】三次元表皮モデル角層表面にパーベンダゾールを添加した場合のセマフォリン３Ａ発現促進効果を示す図。
【図7-2】三次元表皮モデル培地にパーベンダゾールを添加した場合のセマフォリン３Ａ発現促進効果を示す図。
【図8-1】三次元表皮モデル角層表面にパーベンダゾールを添加した場合の低毒性を示す図。
【図8-2】三次元表皮モデル培地にパーベンダゾールを添加した場合の低毒性を示す図。
【図9】パーベンダゾールによるセマフォリン３Ａ発現促進効果と転写因子（Ｃ－ＪＵＮ、Ｃ－ＦＯＳ）との関連を示す図。
【図10】ＡＰ－１阻害剤存在下におけるパーベンダゾールによるセマフォリン３Ａ発現促進効果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【0017】
本発明のセマフォリン３Ａ発現促進剤、ＮＧＦ発現抑制剤、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤、乾皮症予防及び／又は治療剤、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤、並びに骨粗鬆症予防及び／又は治療剤は、下記式（１）で表される化合物を有効成分とする。
まず、化合物（１）について詳細に説明する。
まず、化合物（１）について詳細に説明する。
【0018】
【化2】
【0019】
〔式（１）中、
Ｒ1は、炭素数６～１４の芳香族炭化水素基又は炭素数１～１２の脂肪族炭化水素基を示し、
Ｒ2は、水素原子又は脂肪族炭化水素基を示し、
Ｘは、単結合、酸素原子又は硫黄原子を示す。〕
Ｒ1は、炭素数６～１４の芳香族炭化水素基又は炭素数１～１２の脂肪族炭化水素基を示し、
Ｒ2は、水素原子又は脂肪族炭化水素基を示し、
Ｘは、単結合、酸素原子又は硫黄原子を示す。〕
【0020】
化合物（１）としては、下記式（１Ｂ）で表される化合物が好ましい。
【0021】
【化3】
【0022】
〔式（１Ｂ）中、Ｒ1、Ｒ2及びＸは、前記と同義である。〕
【0023】
式（１）及び（１Ｂ）中、Ｘは、単結合、酸素原子又は硫黄原子を示すが、セマフォリン３Ａ発現促進効果、ＮＧＦ発現抑制効果、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療効果、乾皮症予防及び／又は治療効果、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療効果、骨粗鬆症予防及び／又は治療効果並びに低毒性の観点から、単結合又は硫黄原子が好ましく、単結合が特に好ましい。
【0024】
Ｒ1で示される芳香族炭化水素基の炭素数は６～１４であるが、好ましくは６～１２であり、より好ましくは６～８である。また、芳香族炭化水素基としては、具体的には、フェニル基、トリル基、キシリル基、ナフチル基等のアリール基が挙げられる。これらの中では、セマフォリン３Ａ発現促進効果、ＮＧＦ発現抑制効果、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療効果、乾皮症予防及び／又は治療効果、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療効果、骨粗鬆症予防及び／又は治療効果並びに低毒性の観点から、フェニル基が好ましい。
【0025】
Ｒ1で示される脂肪族炭化水素基の炭素数は１～１２であるが、セマフォリン３Ａ発現促進効果、ＮＧＦ発現抑制効果、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療効果、乾皮症予防及び／又は治療効果、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療効果、骨粗鬆症予防及び／又は治療効果並びに低毒性の観点から、好ましくは１～１０であり、より好ましくは２～６であり、特に好ましくは３～４である。
また、Ｒ2は、水素原子又は脂肪族炭化水素基を示すが、好ましくは脂肪族炭化水素基である。Ｒ2で示される脂肪族炭化水素基の炭素数は、セマフォリン３Ａ発現促進効果、ＮＧＦ発現抑制効果、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療効果、乾皮症予防及び／又は治療効果、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療効果、骨粗鬆症予防及び／又は治療効果並びに低毒性の観点から、好ましくは１～１０であり、より好ましくは１～６であり、更に好ましくは１～４であり、特に好ましくは１～２である。
Ｒ1、Ｒ2で示される脂肪族炭化水素基は直鎖状でも分岐状でもよい。また、脂肪族炭化水素基としては、アルキル基が好ましい。アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ドデシル基等が挙げられる。
Ｒ1で示されるアルキル基の中では、セマフォリン３Ａ発現促進効果、ＮＧＦ発現抑制効果、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療効果、乾皮症予防及び／又は治療効果、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療効果、骨粗鬆症予防及び／又は治療効果並びに低毒性の観点から、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基が好ましい。また、Ｒ2で示されるアルキル基の中では、セマフォリン３Ａ発現促進効果、ＮＧＦ発現抑制効果、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療効果、乾皮症予防及び／又は治療効果、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療効果、骨粗鬆症予防及び／又は治療効果並びに低毒性の観点から、メチル基、エチル基が好ましい。
また、Ｒ2は、水素原子又は脂肪族炭化水素基を示すが、好ましくは脂肪族炭化水素基である。Ｒ2で示される脂肪族炭化水素基の炭素数は、セマフォリン３Ａ発現促進効果、ＮＧＦ発現抑制効果、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療効果、乾皮症予防及び／又は治療効果、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療効果、骨粗鬆症予防及び／又は治療効果並びに低毒性の観点から、好ましくは１～１０であり、より好ましくは１～６であり、更に好ましくは１～４であり、特に好ましくは１～２である。
Ｒ1、Ｒ2で示される脂肪族炭化水素基は直鎖状でも分岐状でもよい。また、脂肪族炭化水素基としては、アルキル基が好ましい。アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ドデシル基等が挙げられる。
Ｒ1で示されるアルキル基の中では、セマフォリン３Ａ発現促進効果、ＮＧＦ発現抑制効果、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療効果、乾皮症予防及び／又は治療効果、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療効果、骨粗鬆症予防及び／又は治療効果並びに低毒性の観点から、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基が好ましい。また、Ｒ2で示されるアルキル基の中では、セマフォリン３Ａ発現促進効果、ＮＧＦ発現抑制効果、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療効果、乾皮症予防及び／又は治療効果、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療効果、骨粗鬆症予防及び／又は治療効果並びに低毒性の観点から、メチル基、エチル基が好ましい。
【0026】
Ｒ1で示される芳香族炭化水素基は、置換芳香族炭化水素基でも非置換芳香族炭化水素基でもよく、Ｒ1、Ｒ2で示される脂肪族炭化水素基は、置換脂肪族炭化水素基でも非置換脂肪族炭化水素基でもよい。
Ｒ1、Ｒ2における置換基としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子が挙げられる。
Ｒ1、Ｒ2における置換基としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子が挙げられる。
【0027】
化合物（１）としては、セマフォリン３Ａ発現促進効果、ＮＧＦ発現抑制効果、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療効果、乾皮症予防及び／又は治療効果、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療効果、骨粗鬆症予防及び／又は治療効果並びに低毒性の観点から、パーベンダゾール、フェンベンダゾール及びアルベンダゾールから選ばれる１種又は２種以上が好ましく、パーベンダゾールが特に好ましい。
化合物（１）は市販品を用いても常法に従って合成して得たものを用いてもよい。
化合物（１）は市販品を用いても常法に従って合成して得たものを用いてもよい。
【0028】
そして、後記実施例に示すように、化合物（１）は、セマフォリン３Ａ発現促進効果、ＮＧＦ発現抑制効果、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療効果、乾皮症予防及び／又は治療効果、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療効果、骨粗鬆症予防及び／又は治療効果に優れる。また、細胞毒性が低い。
したがって、化合物（１）は、細胞のセマフォリン３Ａの発現を促進することができ、また、細胞のＮＧＦの発現を抑制することができるところ、セマフォリン３Ａ発現促進剤、ＮＧＦ発現抑制剤、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤、乾皮症予防及び／又は治療剤、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤、骨粗鬆症予防及び／又は治療剤として有用である。
ここで、本明細書において「セマフォリン３Ａ発現促進」とは、細胞のセマフォリン３Ａの発現を促進することをいい、また、本明細書において「ＮＧＦ発現抑制」とは、細胞のＮＧＦの発現を抑制することをいう。上記細胞としては、好ましくは皮膚細胞であり、表皮角化細胞、線維芽細胞、及びメラノサイトから選ばれる１種又は２種以上が挙げられる。
また、本明細書において「アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療」とは、アトピー性皮膚炎を予防及び／又は治療することをいい、具体的には、アトピー性皮膚炎の炎症やかゆみを抑制することをいう。
また、本明細書において「乾皮症予防及び／又は治療」とは、乾皮症を予防及び／又は治療することをいい、具体的には、乾皮症の炎症やかゆみを抑制することをいう。
また、本明細書において「アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療」とは、アレルギー性鼻炎を予防及び／又は治療することをいい、具体的には、鼻みず、鼻づまり、くしゃみ等の鼻のアレルギー症状を緩和することをいう。
また、本明細書において「骨粗鬆症予防及び／又は治療」とは、骨粗鬆症を予防及び／又は治療することをいう。
したがって、化合物（１）は、細胞のセマフォリン３Ａの発現を促進することができ、また、細胞のＮＧＦの発現を抑制することができるところ、セマフォリン３Ａ発現促進剤、ＮＧＦ発現抑制剤、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤、乾皮症予防及び／又は治療剤、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤、骨粗鬆症予防及び／又は治療剤として有用である。
ここで、本明細書において「セマフォリン３Ａ発現促進」とは、細胞のセマフォリン３Ａの発現を促進することをいい、また、本明細書において「ＮＧＦ発現抑制」とは、細胞のＮＧＦの発現を抑制することをいう。上記細胞としては、好ましくは皮膚細胞であり、表皮角化細胞、線維芽細胞、及びメラノサイトから選ばれる１種又は２種以上が挙げられる。
また、本明細書において「アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療」とは、アトピー性皮膚炎を予防及び／又は治療することをいい、具体的には、アトピー性皮膚炎の炎症やかゆみを抑制することをいう。
また、本明細書において「乾皮症予防及び／又は治療」とは、乾皮症を予防及び／又は治療することをいい、具体的には、乾皮症の炎症やかゆみを抑制することをいう。
また、本明細書において「アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療」とは、アレルギー性鼻炎を予防及び／又は治療することをいい、具体的には、鼻みず、鼻づまり、くしゃみ等の鼻のアレルギー症状を緩和することをいう。
また、本明細書において「骨粗鬆症予防及び／又は治療」とは、骨粗鬆症を予防及び／又は治療することをいう。
【0029】
また、化合物（１）は、セマフォリン３Ａ発現促進剤、ＮＧＦ発現抑制剤、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤、乾皮症予防及び／又は治療剤、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤、骨粗鬆症予防及び／又は治療剤となり得、セマフォリン３Ａ発現促進、ＮＧＦ発現抑制、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療、乾皮症予防及び／又は治療、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療、骨粗鬆症予防及び／又は治療のために使用することができ、また、セマフォリン３Ａ発現促進剤、ＮＧＦ発現抑制剤、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤、乾皮症予防及び／又は治療剤、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤、骨粗鬆症予防及び／又は治療剤を製造するために使用できる。
ここで、上記「使用」は、ヒト若しくは非ヒト動物への投与又は摂取であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。なお、「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には、医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。
ここで、上記「使用」は、ヒト若しくは非ヒト動物への投与又は摂取であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。なお、「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には、医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。
【0030】
本発明のセマフォリン３Ａ発現促進剤、ＮＧＦ発現抑制剤、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤、乾皮症予防及び／又は治療剤、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤、骨粗鬆症予防及び／又は治療剤は、セマフォリン３Ａ発現促進やＮＧＦ発現抑制、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療、乾皮症予防及び／又は治療、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療、骨粗鬆症予防及び／又は治療に有効な医薬品、医薬部外品、化粧品若しくは食品として、又は医薬品、医薬部外品、化粧品若しくは食品に配合する素材として使用可能である。
なお、食品は、セマフォリン３Ａ発現促進やＮＧＦ発現抑制、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療、乾皮症予防及び／又は治療、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療、骨粗鬆症予防及び／又は治療をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した保健機能食品（例えば機能性表示食品、特定保健用食品、栄養機能食品等）とすることが可能である。
なお、食品は、セマフォリン３Ａ発現促進やＮＧＦ発現抑制、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療、乾皮症予防及び／又は治療、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療、骨粗鬆症予防及び／又は治療をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した保健機能食品（例えば機能性表示食品、特定保健用食品、栄養機能食品等）とすることが可能である。
【0031】
本発明のセマフォリン３Ａ発現促進剤、ＮＧＦ発現抑制剤、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤、乾皮症予防及び／又は治療剤、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤、骨粗鬆症予防及び／又は治療剤の適用手段は、経口、注射、皮膚外用等のいずれでもよいが、皮膚外用又は注射が好ましく、皮膚外用がより好ましい。なお、このような皮膚を適用部位とする形態としては、例えば、皮膚外用剤、入浴剤、注射用製剤が挙げられる。なお、「皮膚」は、顔や身体、手足の皮膚、及び頭皮を包含する概念である。
【0032】
本発明のセマフォリン３Ａ発現促進剤、ＮＧＦ発現抑制剤、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤、乾皮症予防及び／又は治療剤、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤、骨粗鬆症予防及び／又は治療剤を経口投与する場合、その剤形としては、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、丸剤、カプセル剤、ドライシロップ剤等の固形製剤；半固形製剤；懸濁剤、シロップ剤等の液状製剤等が挙げられる。医薬品、医薬部外品、食品のいずれの場合においても、これらの剤形にしてよい。また、経口投与用組成物とする場合には、上記の有効成分に加えて、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤等の添加剤を含有せしめることができる。
また、上記食品の具体的な形態としては、錠剤等の上記剤形の保健機能食品やサプリメントの他、ウエハース、ビスケット、ガム等の各種食品が挙げられる。
また、上記食品の具体的な形態としては、錠剤等の上記剤形の保健機能食品やサプリメントの他、ウエハース、ビスケット、ガム等の各種食品が挙げられる。
【0033】
本発明のセマフォリン３Ａ発現促進剤、ＮＧＦ発現抑制剤、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤、乾皮症予防及び／又は治療剤、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤、骨粗鬆症予防及び／又は治療剤を経皮用（皮膚外用剤）とする場合、その剤形としては、軟膏剤、クリーム剤、乳液、ゲル剤、ペースト剤、ローション、スプレー剤、貼付剤等が挙げられる。また、皮膚外用剤は、例えば、化粧水、美容液、パック、乳液、クリーム、サンスクリーン、サンオイル等の形態にしてもよい。
皮膚を適用部位とする形態とする場合には、上記の有効成分に加えて、通常の外用剤や入浴剤において基材や添加剤として用いられる各種成分を含有せしめることができる。
皮膚を適用部位とする形態とする場合には、上記の有効成分に加えて、通常の外用剤や入浴剤において基材や添加剤として用いられる各種成分を含有せしめることができる。
【0034】
化合物（１）の含有量としては、本発明のセマフォリン３Ａ発現促進剤、ＮＧＦ発現抑制剤、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤、乾皮症予防及び／又は治療剤、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤、骨粗鬆症予防及び／又は治療剤中、０．００１質量％以上８０質量％以下が好ましく、本発明のセマフォリン３Ａ発現促進剤、ＮＧＦ発現抑制剤、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤、乾皮症予防及び／又は治療剤、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤、骨粗鬆症予防及び／又は治療剤が医薬品である場合は、０．０１質量％以上４０質量％以下がより好ましい。一方、本発明のセマフォリン３Ａ発現促進剤、ＮＧＦ発現抑制剤、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤、乾皮症予防及び／又は治療剤、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤、骨粗鬆症予防及び／又は治療剤が、医薬部外品、化粧品又は食品である場合、化合物（１）の含有量としては、医薬部外品、化粧品又は食品中に０．００１質量％以上１０質量％以下がより好ましい。
【0035】
本発明のセマフォリン３Ａ発現促進剤、ＮＧＦ発現抑制剤、アトピー性皮膚炎予防及び／又は治療剤、乾皮症予防及び／又は治療剤、アレルギー性鼻炎予防及び／又は治療剤、骨粗鬆症予防及び／又は治療剤は、化合物（１）として、成人一日あたり、０．００１～５ｍｇを摂取又は塗布することが好ましい。
【実施例0036】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【0037】
〔試験例〕
（１） 材料と試薬
Ｔ－５２２４はＡｄｏｏＱ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社の製品を使用した。ｃ－Ｊｕｎ、ｃ－Ｆｏｓ、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡは、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社から購入したものを用いた。ベンズイミダゾール系駆虫薬のパーベンダゾール、フェンベンダゾール、アルベンダゾールは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社の製品を購入し、いずれもジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解後、実験に用いた。
（１） 材料と試薬
Ｔ－５２２４はＡｄｏｏＱ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社の製品を使用した。ｃ－Ｊｕｎ、ｃ－Ｆｏｓ、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡは、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社から購入したものを用いた。ベンズイミダゾール系駆虫薬のパーベンダゾール、フェンベンダゾール、アルベンダゾールは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社の製品を購入し、いずれもジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解後、実験に用いた。
【0038】
（２） ＮＨＥＫｓの培養
正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）は、Ｌｏｎｚａ社のプロトコールに従い培養した。ＮＨＥＫｓを６ウェル組織培養用プレート内で培養し、細胞密度が５０～８０％の増殖期の細胞にパーベンダゾール（０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ）、フェンベンダゾール（１μＭ、１０μＭ）またはアルベンダゾール（１μＭ、１０μＭ）を添加した。駆虫薬添加から４８時間後に細胞の培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡによりＳｅｍａ３Ａタンパク質発現量の解析を行った。また、全ＲＮＡを抽出し、定量リアルタイムＰＣＲによりｍＲＮＡの発現解析を行った。
正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）は、Ｌｏｎｚａ社のプロトコールに従い培養した。ＮＨＥＫｓを６ウェル組織培養用プレート内で培養し、細胞密度が５０～８０％の増殖期の細胞にパーベンダゾール（０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ）、フェンベンダゾール（１μＭ、１０μＭ）またはアルベンダゾール（１μＭ、１０μＭ）を添加した。駆虫薬添加から４８時間後に細胞の培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡによりＳｅｍａ３Ａタンパク質発現量の解析を行った。また、全ＲＮＡを抽出し、定量リアルタイムＰＣＲによりｍＲＮＡの発現解析を行った。
【0039】
（３） ｓｉＲＮＡによるノックダウン解析
転写因子ＡＰ－１の構成成分であるｃ－Ｊｕｎとｃ－ＦｏｓがパーベンダゾールによるＳｅｍａ３Ａの発現促進作用に関与していることを証明するために、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用して、ｃ－Ｊｕｎとｃ－Ｆｏｓの発現を抑制後、細胞をパーベンダゾールで刺激し、Ｓｅｍａ３ＡのｍＲＮＡ発現量を解析した。
ＮＨＥＫｓにｃ－Ｊｕｎ及びｃ－Ｆｏｓに対するｓｉＲＮＡまたはＣｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（終濃度４０ｎＭ）をそれぞれＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉ ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、トランスフェクションした。細胞は抗菌剤を含まない培地で培養し、４８時間後に１μＭパーベンダゾールを添加した培地に交換し、細胞を刺激した。更に２４時間後に細胞から全ＲＮＡを抽出し、定量リアルタイムＰＣＲにより、各転写因子及びＳｅｍａ３ＡのｍＲＮＡの発現解析を行った。使用したｓｉＲＮＡの配列（４種類の異なる配列のｓｉＲＮＡの混合物（配列番号１～１２））を表１に示す。
転写因子ＡＰ－１の構成成分であるｃ－Ｊｕｎとｃ－ＦｏｓがパーベンダゾールによるＳｅｍａ３Ａの発現促進作用に関与していることを証明するために、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用して、ｃ－Ｊｕｎとｃ－Ｆｏｓの発現を抑制後、細胞をパーベンダゾールで刺激し、Ｓｅｍａ３ＡのｍＲＮＡ発現量を解析した。
ＮＨＥＫｓにｃ－Ｊｕｎ及びｃ－Ｆｏｓに対するｓｉＲＮＡまたはＣｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（終濃度４０ｎＭ）をそれぞれＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉ ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、トランスフェクションした。細胞は抗菌剤を含まない培地で培養し、４８時間後に１μＭパーベンダゾールを添加した培地に交換し、細胞を刺激した。更に２４時間後に細胞から全ＲＮＡを抽出し、定量リアルタイムＰＣＲにより、各転写因子及びＳｅｍａ３ＡのｍＲＮＡの発現解析を行った。使用したｓｉＲＮＡの配列（４種類の異なる配列のｓｉＲＮＡの混合物（配列番号１～１２））を表１に示す。
【0040】
【表1】
【0041】
（４） 阻害剤による解析
転写因子ＡＰ－１がパーベンダゾールによるＳｅｍａ３Ａの発現促進作用に関与していることを証明するために、ＮＨＥＫｓにＡＰ－１阻害剤Ｔ－５２２４（終濃度１０μＭ）を添加して、ＡＰ－１のＤＮＡへの結合を阻害後、細胞を１μＭパーベンダゾールで刺激し、Ｓｅｍａ３Ａの発現量を解析した。
転写因子ＡＰ－１がパーベンダゾールによるＳｅｍａ３Ａの発現促進作用に関与していることを証明するために、ＮＨＥＫｓにＡＰ－１阻害剤Ｔ－５２２４（終濃度１０μＭ）を添加して、ＡＰ－１のＤＮＡへの結合を阻害後、細胞を１μＭパーベンダゾールで刺激し、Ｓｅｍａ３Ａの発現量を解析した。
【0042】
（５） 各遺伝子のｍＲＮＡ発現の解析
各遺伝子の転写レベルを定量リアルタイムＰＣＲにより解析した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、取扱説明書に従って培養細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。定量リアルタイムＰＣＲは取扱説明書に従い、ＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により実施した。使用したプライマーに関する情報を表２に示す（配列番号１３～２２）。リボソームタンパク質Ｓ１８（ＲＰＳ１８）を標準遺伝子として使用した。各ｍＲＮＡの量はＲＰＳ１８の量に対して標準化し、最終的に対照（溶媒添加）群のｍＲＮＡに対する比として示した。
各遺伝子の転写レベルを定量リアルタイムＰＣＲにより解析した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、取扱説明書に従って培養細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。定量リアルタイムＰＣＲは取扱説明書に従い、ＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により実施した。使用したプライマーに関する情報を表２に示す（配列番号１３～２２）。リボソームタンパク質Ｓ１８（ＲＰＳ１８）を標準遺伝子として使用した。各ｍＲＮＡの量はＲＰＳ１８の量に対して標準化し、最終的に対照（溶媒添加）群のｍＲＮＡに対する比として示した。
【0043】
【表2】
【0044】
（６） Ｓｅｍａ３Ａタンパク質発現解析
Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の発現レベルは、ＥＬＩＳＡにより解析した。培養上清中のＳｅｍａ３Ａ量を取扱説明書に従って、ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ Ｓｅｍａ３Ａ（Ｕｓｃｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。
Ｓｅｍａ３Ａタンパク質の発現レベルは、ＥＬＩＳＡにより解析した。培養上清中のＳｅｍａ３Ａ量を取扱説明書に従って、ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ Ｓｅｍａ３Ａ（Ｕｓｃｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。
【0045】
（７） パーベンダゾール添加後のＮＨＥＫｓの細胞生存率の解析
ＮＨＥＫｓの細胞生存率はＣｅｌｌ－ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ－８（同仁化学）により解析した。９６ウェル培養プレート内で細胞を培養し、細胞密度が５０～８０％の増殖期の細胞にパーベンダゾールを添加した。薬剤添加の４８時間後、取扱説明書に従いＣＣＫ－８溶液を各ウェルに添加後、プレートをＣＯ2インキュベーターに３時間静置し、呈色反応を行った。その後、ＡＲＶＯＸ４マルチラベルプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で４５０ｎｍの吸光度測定を行った。
ＮＨＥＫｓの細胞生存率はＣｅｌｌ－ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ－８（同仁化学）により解析した。９６ウェル培養プレート内で細胞を培養し、細胞密度が５０～８０％の増殖期の細胞にパーベンダゾールを添加した。薬剤添加の４８時間後、取扱説明書に従いＣＣＫ－８溶液を各ウェルに添加後、プレートをＣＯ2インキュベーターに３時間静置し、呈色反応を行った。その後、ＡＲＶＯＸ４マルチラベルプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で４５０ｎｍの吸光度測定を行った。
【0046】
（８） 三次元培養ヒト表皮モデルの培養
三次元培養ヒト表皮モデルＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ－ＭＯＤＥＬ（Ｊ－ＴＥＣ）は、Ｊ－ＴＥＣ社の取扱説明書に従い、キット付属のアッセイ培地で培養した。
試験の前日、２４ウェル組織培養用プレート内で一晩、前培養した。その翌日、アッセイ培地で希釈したパーベンダゾール（１μＭ，１０μＭ）を表皮モデル角層表面に５０μＬ滴下して細胞を刺激、またはパーベンダゾール（１μＭ，１０μＭ）を含む培地で表皮モデルを培養し基底層側から細胞を刺激した。２４時間培養後、表皮を回収し、バイオマッシャーで細胞を破砕後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、定量リアルタイムＰＣＲによりｍＲＮＡの発現解析を行った。また、培養カップの外側にＭＴＴ（３－（４，５－ｄｉ－ｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２，５－ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）試薬（同仁化学）をアッセイ培地で希釈した溶液（終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）を加えて、ＣＯ2インキュベーターで３時間反応後、表皮を回収し、イソプロパノール３００μＬに浸漬して色素を抽出した。室温暗所で一晩静置後、抽出液はＡＲＶＯＸ４マルチラベルプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で４５０ｎｍの吸光度測定を行った。
三次元培養ヒト表皮モデルＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ－ＭＯＤＥＬ（Ｊ－ＴＥＣ）は、Ｊ－ＴＥＣ社の取扱説明書に従い、キット付属のアッセイ培地で培養した。
試験の前日、２４ウェル組織培養用プレート内で一晩、前培養した。その翌日、アッセイ培地で希釈したパーベンダゾール（１μＭ，１０μＭ）を表皮モデル角層表面に５０μＬ滴下して細胞を刺激、またはパーベンダゾール（１μＭ，１０μＭ）を含む培地で表皮モデルを培養し基底層側から細胞を刺激した。２４時間培養後、表皮を回収し、バイオマッシャーで細胞を破砕後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、定量リアルタイムＰＣＲによりｍＲＮＡの発現解析を行った。また、培養カップの外側にＭＴＴ（３－（４，５－ｄｉ－ｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２，５－ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）試薬（同仁化学）をアッセイ培地で希釈した溶液（終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）を加えて、ＣＯ2インキュベーターで３時間反応後、表皮を回収し、イソプロパノール３００μＬに浸漬して色素を抽出した。室温暗所で一晩静置後、抽出液はＡＲＶＯＸ４マルチラベルプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で４５０ｎｍの吸光度測定を行った。
【0047】
（９） 統計処理
統計処理ソフトＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ９（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定、Ｔｕｋｅｙ検定またはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により有意差を求めた。*Ｐ ＜ ０．０５を統計学的に有意差ありとした。
統計処理ソフトＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ９（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定、Ｔｕｋｅｙ検定またはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により有意差を求めた。*Ｐ ＜ ０．０５を統計学的に有意差ありとした。
【0048】
（試験結果）
図１に、パーベンダゾールを添加したＮＨＥＫｓの培養上清中に分泌されたＳｅｍａ３Ａタンパク質をＥＬＩＳＡで定量した結果を示す（パーベンダゾール無添加（０μＭ）群に対して、***Ｐ ＜ ０．００１、****Ｐ ＜ ０．０００１で有意差あり）。
図１に示すとおり、パーベンダゾールをＮＨＥＫｓに添加することによって、培養上清中へのＳｅｍａ３Ａタンパク質の分泌量が増加した。
図１に、パーベンダゾールを添加したＮＨＥＫｓの培養上清中に分泌されたＳｅｍａ３Ａタンパク質をＥＬＩＳＡで定量した結果を示す（パーベンダゾール無添加（０μＭ）群に対して、***Ｐ ＜ ０．００１、****Ｐ ＜ ０．０００１で有意差あり）。
図１に示すとおり、パーベンダゾールをＮＨＥＫｓに添加することによって、培養上清中へのＳｅｍａ３Ａタンパク質の分泌量が増加した。
【0049】
図２に、パーベンダゾールを添加したＮＨＥＫｓにおけるＳｅｍａ３ＡのｍＲＮＡ発現を定量リアルタイムＰＣＲで解析した結果を示す（パーベンダゾール無添加（０μＭ）群に対して、***Ｐ ＜ ０．００１、****Ｐ ＜ ０．０００１で有意差あり）。
図２に示すとおり、パーベンダゾールをＮＨＥＫｓに添加することによって、Ｓｅｍａ３Ａ ｍＲＮＡ発現量が増加した。
図２に示すとおり、パーベンダゾールをＮＨＥＫｓに添加することによって、Ｓｅｍａ３Ａ ｍＲＮＡ発現量が増加した。
【0050】
図３に、パーベンダゾールを添加したＮＨＥＫｓにおけるＮＧＦのｍＲＮＡ発現を定量リアルタイムＰＣＲで解析した結果を示す（パーベンダゾール無添加（０μＭ）群に対して、****Ｐ ＜ ０．０００１で有意差あり）。
図３に示すとおり、ＮＧＦ ｍＲＮＡの発現はパーベンダゾール添加により減少した。
図３に示すとおり、ＮＧＦ ｍＲＮＡの発現はパーベンダゾール添加により減少した。
【0051】
【0052】
図５－１に、フェンベンダゾールを添加したＮＨＥＫｓにおけるＳｅｍａ３ＡのｍＲＮＡ発現を定量リアルタイムＰＣＲで解析した結果を示す（フェンベンダゾール無添加（０μＭ）群に対して、****Ｐ ＜ ０．０００１で有意差あり）。
図５－１に示すとおり、フェンベンダゾールも、ＮＨＥＫｓに添加された場合にＳｅｍａ３Ａ ｍＲＮＡ発現を促進した。
図５－２に、アルベンダゾールを添加したＮＨＥＫｓにおけるＳｅｍａ３ＡのｍＲＮＡ発現を定量リアルタイムＰＣＲで解析した結果を示す（アルベンダゾール無添加（０μＭ）群に対して、****Ｐ ＜ ０．０００１で有意差あり）。
図５－２に示すとおり、アルベンダゾールも、ＮＨＥＫｓに添加された場合にＳｅｍａ３Ａ ｍＲＮＡ発現を促進した。
図５－１に示すとおり、フェンベンダゾールも、ＮＨＥＫｓに添加された場合にＳｅｍａ３Ａ ｍＲＮＡ発現を促進した。
図５－２に、アルベンダゾールを添加したＮＨＥＫｓにおけるＳｅｍａ３ＡのｍＲＮＡ発現を定量リアルタイムＰＣＲで解析した結果を示す（アルベンダゾール無添加（０μＭ）群に対して、****Ｐ ＜ ０．０００１で有意差あり）。
図５－２に示すとおり、アルベンダゾールも、ＮＨＥＫｓに添加された場合にＳｅｍａ３Ａ ｍＲＮＡ発現を促進した。
【0053】
図６－１に、フェンベンダゾールを添加したＮＨＥＫｓにおけるＮＧＦのｍＲＮＡ発現を定量リアルタイムＰＣＲで解析した結果を示す（フェンベンダゾール無添加（０μＭ）群に対して、****Ｐ ＜ ０．０００１で有意差あり）。
図６－１に示すとおり、フェンベンダゾールを添加したＮＨＥＫｓでも、ＮＧＦ ｍＲＮＡの発現が抑制された。
図６－２に、アルベンダゾールを添加したＮＨＥＫｓにおけるＮＧＦのｍＲＮＡ発現を定量リアルタイムＰＣＲで解析した結果を示す（アルベンダゾール無添加（０μＭ）群に対して、****Ｐ ＜ ０．０００１で有意差あり）。
図６－２に示すとおり、アルベンダゾールを添加したＮＨＥＫｓでも、ＮＧＦ ｍＲＮＡの発現が抑制された。
図６－１に示すとおり、フェンベンダゾールを添加したＮＨＥＫｓでも、ＮＧＦ ｍＲＮＡの発現が抑制された。
図６－２に、アルベンダゾールを添加したＮＨＥＫｓにおけるＮＧＦのｍＲＮＡ発現を定量リアルタイムＰＣＲで解析した結果を示す（アルベンダゾール無添加（０μＭ）群に対して、****Ｐ ＜ ０．０００１で有意差あり）。
図６－２に示すとおり、アルベンダゾールを添加したＮＨＥＫｓでも、ＮＧＦ ｍＲＮＡの発現が抑制された。
【0054】
図７－１に、三次元培養ヒト表皮モデルの角層表面にパーベンダゾールを添加し、角層側から細胞を刺激したときのＳｅｍａ３Ａ ｍＲＮＡ発現をリアルタイムＰＣＲで解析した結果を示す（パーベンダゾール無添加（０μＭ）群に対して、**Ｐ ＜ ０．０１、****Ｐ ＜ ０．０００１で有意差あり）。
図７－１に示すとおり、三次元培養ヒト表皮モデルの角層表面にパーベンダゾール溶液を塗布したところ、Ｓｅｍａ３Ａ ｍＲＮＡ発現が増加した。
図７－２に、三次元培養ヒト表皮モデルの培地にパーベンダゾールを添加し、基底層側から細胞を刺激したときのＳｅｍａ３Ａ ｍＲＮＡ発現をリアルタイムＰＣＲで解析した結果を示す（パーベンダゾール無添加（０μＭ）群に対して、*Ｐ ＜ ０．０５、**Ｐ ＜ ０．０１で有意差あり）。
図７－２に示すとおり、培地で希釈したパーベンダゾール溶液を用いて、基底層側から細胞を刺激したときにも、Ｓｅｍａ３Ａ ｍＲＮＡの発現が増加した。
図７－１に示すとおり、三次元培養ヒト表皮モデルの角層表面にパーベンダゾール溶液を塗布したところ、Ｓｅｍａ３Ａ ｍＲＮＡ発現が増加した。
図７－２に、三次元培養ヒト表皮モデルの培地にパーベンダゾールを添加し、基底層側から細胞を刺激したときのＳｅｍａ３Ａ ｍＲＮＡ発現をリアルタイムＰＣＲで解析した結果を示す（パーベンダゾール無添加（０μＭ）群に対して、*Ｐ ＜ ０．０５、**Ｐ ＜ ０．０１で有意差あり）。
図７－２に示すとおり、培地で希釈したパーベンダゾール溶液を用いて、基底層側から細胞を刺激したときにも、Ｓｅｍａ３Ａ ｍＲＮＡの発現が増加した。
【0055】
図８－１に、三次元培養ヒト表皮モデルの角層表面にパーベンダゾールを添加したときの細胞生存率の解析結果を、図８－２に、三次元培養ヒト表皮モデルの培地にパーベンダゾールを添加し、基底層側から刺激したときの細胞生存率をＭＴＴアッセイで解析した結果を、それぞれ示す。
図８－１、図８－２に示すとおり、三次元培養ヒト表皮モデルの角層側（図８－１）、基底層側（図８－２）からパーベンダゾールで細胞を刺激したとき、細胞生存率の有意な低下は見られなかった。
図８－１、図８－２に示すとおり、三次元培養ヒト表皮モデルの角層側（図８－１）、基底層側（図８－２）からパーベンダゾールで細胞を刺激したとき、細胞生存率の有意な低下は見られなかった。
【0056】
図９に、ＮＨＥＫｓにおける転写因子ｃ－Ｊｕｎとｃ－Ｆｏｓをノックダウン後、パーベンダゾールを添加したときのＳｅｍａ３Ａ ｍＲＮＡ発現をリアルタイムＰＣＲで解析した結果を示す（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌのパーベンダゾール無添加（０μＭ）群に対して、****Ｐ ＜ ０．０００１で有意差あり。ｓｉＣｏｎｔｒｏｌの１μＭパーベンダゾール添加群に対して、††††Ｐ ＜ ０．０００１で有意差あり）。
図９に示すとおり、パーベンダゾールによるＳｅｍａ３Ａの発現促進作用は、転写因子ＡＰ－１の構成成分であるｃ－Ｊｕｎとｃ－Ｆｏｓのノックダウンにより、有意に抑制された。
図９に示すとおり、パーベンダゾールによるＳｅｍａ３Ａの発現促進作用は、転写因子ＡＰ－１の構成成分であるｃ－Ｊｕｎとｃ－Ｆｏｓのノックダウンにより、有意に抑制された。
【0057】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【図7-1】
【図7-2】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10】
【配列表】