特開 2023-113514 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を検出するオリゴヌクレオチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023113514

(43)【公開日】2023-08-16

(54)【発明の名称】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を検出するオリゴヌクレオチド

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6888 20180101AFI20230808BHJP

   C12Q 1/70 20060101ALI20230808BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20230808BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20230808BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6888 Z

C12Q1/70 ZNA

C12N15/09 Z

C12Q1/686 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】14

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022015949

(22)【出願日】2022-02-03

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＴＲＩＴＯＮ

３．ノニデット

４．ＢＲＩＪ

(71)【出願人】

【識別番号】000003160

【氏名又は名称】東洋紡株式会社

(72)【発明者】

【氏名】日比野 麻紀

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA13

4B063QA18

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QQ10

4B063QQ52

4B063QR35

4B063QR39

4B063QR56

4B063QR62

4B063QR72

4B063QR79

4B063QS25

4B063QS36

4B063QX02

(57)【要約】      （修正有）

【課題】夾雑物を含みうる試料から事前に核酸の単離精製作業を実施することなくＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロン株を検出する方法を提供する。
【解決手段】以下の工程を包含する方法：
（１）核酸の単離処理を行っていない試料と、（ａ）ある特定の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む少なくとも一つのプライマー及び（ｂ）前記プライマーの核酸伸長生成物に対して相補的な塩基配列を含むように設計された少なくとも一つのプライマーを含むプライマーセットと、ＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合する工程；及び
（２）前記混合液を用いてＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

核酸の単離処理をせずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を検出する方法であって、以下の工程を包含する方法：
（１）核酸の単離処理を行っていない試料と、（ａ）配列番号５に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む少なくとも一つのプライマー及び（ｂ）前記プライマーの核酸伸長生成物に対して相補的な塩基配列を含むように設計された少なくとも一つのプライマーを含むプライマーセットと、ＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合する工程；及び
（２）前記混合液を用いてＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。

【請求項2】

前記工程（１）において、（ｃ）配列番号３若しくは４に記載の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む蛍光プローブを更に混合する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記（ｂ）プライマーが、配列番号７に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプライマーである、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記プライマーセットが、配列番号６に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプライマーを更に含む、請求項１～３のいずれかに記載の方法。

【請求項5】

前記工程（１）において、配列番号２に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む蛍光プローブを更に混合する、請求項１～４のいずれかに記載の方法。

【請求項6】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のデルタ株と判別して検出する、請求項４又は５に記載の方法。

【請求項7】

前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１～６のいずれかに記載の方法。

【請求項8】

核酸の単離処理をせずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロン株を検出するためのキットであって、以下の特徴を有するキット：
（１）（ａ）配列番号５に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む少なくとも一つのプライマー及び（ｂ）前記プライマーの核酸伸長生成物に対して相補的な塩基配列を含むように設計された少なくとも一つのプライマーを含む；並びに
（２）核酸の単離処理を行っていない試料からＲＴ－ＰＣＲ反応が可能な反応試薬を含む。

【請求項9】

（ｃ）配列番号３若しくは４に記載の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む蛍光プローブを更に含む、請求項８に記載のキット。

【請求項10】

前記（ｂ）プライマーが、配列番号７に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプライマーである、請求項８又は９に記載のキット。

【請求項11】

配列番号６に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプライマーを更に含む、請求項８～１０のいずれかに記載のキット。

【請求項12】

配列番号２に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む蛍光プローブを更に含む、請求項８～１１のいずれかに記載のキット。

【請求項13】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のデルタ株と判別して検出するために用いられる、請求項１１又は１２に記載のキット。

【請求項14】

前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項８～１３のいずれかに記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、核酸増幅によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を検出できるオリゴヌクレオチド、並びにこれを利用した検出方法及び検出キット等に関する。本発明により、例えば、咽頭および鼻腔ぬぐい液、喀痰、唾液等の生体試料から核酸精製せずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を高感度で検出することが可能である。本発明は、生命科学研究、臨床診断や食品衛生検査、環境検査等にも利用できる。

【背景技術】

【0002】

核酸増幅法は数コピーの標的核酸を可視化可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術であり、生命科学研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床検査といった医療分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられている。代表的な核酸増幅法は、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。ＰＣＲは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。アニーリングと伸長を同温度で、２ステップで行う場合もある。

【0003】

ＲＮＡを分析する場合、このＰＣＲの前段として、鋳型ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する逆転写（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ；ＲＴ）を実施する。これをＲＴ－ＰＣＲという。このＲＴ－ＰＣＲは、（１）ＲＴ、ＰＣＲを非連続に実施する２ステップＲＴ－ＰＣＲ、（２）ＲＴ、ＰＣＲを、単一酵素を利用して連続して実施する一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ、（３）逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼの２種類の酵素を利用して、ＲＴ、ＰＣＲを連続的に実施する二酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲの３つに大別される。

【0004】

ＰＣＲおよびＲＴ－ＰＣＲは、遺伝子検査やウイルス検査にも広く用いられている。このような検査の対象となるＲＮＡウイルスの代表例としては、コロナウイルスやインフルエンザウイルスなどの病原性ＲＮＡウイルスが挙げられる。
コロナウイルスは、風邪を含む呼吸器感染症引き起こす原因ウイルスであり、風邪の流行期において約１０～３５％程度はコロナウイルスが原因と言われている。変異型ウイルスが発生することも知られており、稀にＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）コロナウイルスやＭＥＲＳ（中東呼吸器症候群）コロナウイルス、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ｎＣＯＶ－２、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などと呼ばれる）など致死性の重篤な呼吸器疾患を齎すものが発生することが知られている。

【0005】

このＳＡＲ－ＣｏＶ－２は、２０１９年に中国武漢で発生して以来、世界各国で感染が広がり、パンデミックとなっている。感染が続く中で、より感染性が高い変異株や重症化しやすい変異株も発生している。感染拡大防止の観点や診断用途において、このように感染・伝播性の増加や抗原性の変化が懸念される変異株（ＶＯＣ；Ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ Ｃｏｎｃｅｒｎ）を簡便、迅速、高感度に検出および特定することが重要であることは言うまでもない。ＶＯＣに関連するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株としてはこれまでにアルファ株、ベータ株、ガンマ株、デルタ株など様々な変異株が発見されており、感染力の非常に強いオミクロン株が現在大きな問題となっている。従って、感染拡大防止の観点から、オミクロン株を早期に簡便、迅速、高感度に特定することが求められている。

【0006】

ウイルスの変異の特定方法としては、一般的なＳＮＰ解析方法が通常用いられる。例えば変異を含む領域を挟むように増幅できるＰＣＲプライマーと、異なる蛍光で標識された野生株と変異株それぞれに相補的なＴａｑＭａｎプローブを用い、これらのプライマーとＴａｑＭａｎプローブとウイルスＲＮＡとを混合し、ＲＴ－ＰＣＲを行うことで、野生株、変異株を区別することができる。その他にも、変異株のみを増幅できるようなプライマーを設計し、増幅の有無で変異株の特定を行う手法（ＡＳＰ）、増幅産物に蛍光プローブを反応させ融解曲線解析で変異の有無を判定する手法、ＳＹＢＲなどのインタカーレター色素を用い、増幅産物の融解曲線解析で変異の有無を判定する手法など、様々な手法が知られている（非特許文献１）。これらの方法は組み合わせることも可能であり、複数の箇所の変異を同時に検出するマルチプレックスの手法も開発されている。

【0007】

しかしながら、ＴａｑＭａｎプローブとＲＴ－ＰＣＲ反応を用いて変異株を特定する場合、野生株と変異株で異なるシグナルを得る必要があり、反応条件の最適化が非常に重要となる。すなわち、上記のように野生株と変異株で異なるＴａｑＭａｎプローブを用いて特定する場合は、わずか１塩基又は数塩基の違いで蛍光シグナルを変化させる必要があり、プローブの長さや配列の選定等の条件設定が重要となる。また同様に、変異株のみを増幅できるようなプライマーを用いる場合も、わずか１塩基又は数塩基しか違わない野生型では増幅しないようにプライマーの長さや配列等を調整する必要があり容易でない。

【0008】

また、呼吸器感染症の遺伝子検査では、咽頭および鼻腔ぬぐい液、喀痰、唾液等の生体試料をサンプルとしＲＴ－ＰＣＲによる遺伝子検査が行われる。生体試料は、ＲＴ－ＰＣＲ反応を阻害する夾雑物や、非特異的な増幅を引き起こすウイルス由来以外の核酸を多く含んでいる。従って、核酸の単離処理をせずに、このような生体試料を夾雑物を含む状態でそのまま用いてＲＴ－ＰＣＲ反応を行う場合、反応が阻害されて増幅不良で検出不能となったり、反応系が複雑となることで非特異反応が生じ、検出感度が低下することなどが懸念される。このような検出感度の低下は、わずか１塩基の違いで蛍光シグナルを変化させて野生株と変異株を判定する必要があるような場合に、それらの識別を困難にするので特に問題となり得る。

【0009】

現在、感染拡大防止の観点から、迅速かつ簡便にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を判定する方法が強く求められている。特に咽頭および鼻腔ぬぐい液や唾液、糞便試料、ふき取り環境試料等より、核酸の単離処理を行わずにそのままＲＴ－ＰＣＲ反応を行い判定できる有用な方法の開発が望まれていた。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】ＹＡＫＵＧＡＫＵ ＺＡＳＳＨＩ １２２（７） ４５１―４６３（２００２）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明は上記従来技術に鑑みてなされたものであり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を簡便且つ高感度に特定・検出できる方法を提供することを目的とする。また本発明は、検査をより迅速・簡便化するため、核酸の単離処理をせずに、例えば、唾液、咽頭および鼻腔ぬぐい液等の生体試料に由来する夾雑物を含む状態の試料から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を特定・検出できる方法を提供することを更なる目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明者は、上記事情に鑑み、鋭意研究を行った結果、数多の候補配列の中から特定配列を含むプライマーを用いることで、オミクロン株を高感度に野生株等から区別して特定・検出できることを見出した。また、このプライマーと共に、野生株やデルタ株等の他の変異株を増幅し得るプライマーを含むプライマーセットで核酸増幅を行うことにより、夾雑物を含みうる唾液等の生体試料から事前に核酸の単離精製作業を実施することなくＲＴ－ＰＣＲ反応を行う場合であっても、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を野生株やデルタ株等の変異株と区別して特定・検出が可能であることを見出し、本発明に到達した。

【0013】

代表的な本願発明は、以下の通りである。
［項１］ 核酸の単離処理をせずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を検出する方法であって、以下の工程を包含する方法：
（１）核酸の単離処理を行っていない試料と、（ａ）配列番号５に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む少なくとも一つのプライマー及び（ｂ）前記プライマーの核酸伸長生成物に対して相補的な塩基配列を含むように設計された少なくとも一つのプライマーを含むプライマーセットと、ＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合する工程；及び
（２）前記混合液を用いてＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。
［項２］ 前記工程（１）において、（ｃ）配列番号３若しくは４に記載の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む蛍光プローブを更に混合する、項１に記載の方法。
［項３］ 前記（ｂ）プライマーが、配列番号７に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプライマーである、項１又は２に記載の方法。
［項４］ 前記プライマーセットが、配列番号６に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプライマーを更に含む、項１～３のいずれかに記載の方法。
［項５］ 前記工程（１）において、配列番号２に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む蛍光プローブを更に混合する、項１～４のいずれかに記載の方法。
［項６］ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のデルタ株と判別して検出する、項４又は５に記載の方法。
［項７］ 前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、項１～６のいずれかに記載の方法。
［項８］ 核酸の単離処理をせずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロン株を検出するためのキットであって、以下の特徴を有するキット：
（１）（ａ）配列番号５に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む少なくとも一つのプライマー及び（ｂ）前記プライマーの核酸伸長生成物に対して相補的な塩基配列を含むように設計された少なくとも一つのプライマーを含む；並びに
（２）核酸の単離処理を行っていない試料からＲＴ－ＰＣＲ反応が可能な反応試薬を含む。
［項９］ （ｃ）配列番号３若しくは４に記載の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む蛍光プローブを更に含む、項８に記載のキット。
［項１０］ 前記（ｂ）プライマーが、配列番号７に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプライマーである、項８又は９に記載のキット。
［項１１］ 配列番号６に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプライマーを更に含む、項８～１０のいずれかに記載のキット。
［項１２］ 配列番号２に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む蛍光プローブを更に含む、項８～１１のいずれかに記載のキット。
［項１３］ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のデルタ株と判別して検出するために用いられる、項１１又は１２に記載のキット。
［項１４］ 前記試料が、唾液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、及び糞便検体からなる群より選択される少なくとも一種である、項８～１３のいずれかに記載のキット。

【発明の効果】

【0014】

本発明によって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を迅速・簡便に特定・検出することができる。とりわけ、本発明によれば、唾液等の生体試料を特定配列のプライマーを含むプライマーセットと共にＲＴ－ＰＣＲ反応液に添加後、ＲＴ－ＰＣＲ反応を実施するだけで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株の検出ができるため、事前に生体試料から核酸単離処理を行う必要がなく、よって、核酸の単離処理時のコンタミネーションリスクの減少や検査時間の短縮に貢献できる。このような検査業務の効率化は、患者に対して正確な治療を行えるまでの時間が短縮できるとともに、感染防止の迅速な対応につながり感染症予防にも大いに寄与し得る。

【0015】

更に、特定配列のプライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲ反応を行う本発明の方法では、野生型のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用に設計された蛍光標識をそのまま用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を野生株等から識別できる。従って、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を検出する際に、オミクロン株検出用及び野生株検出用など蛍光標識プローブを複数設計する必要がないという点でも利点がある。

【発明を実施するための形態】

【0016】

以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。

【0017】

本発明は、核酸の単離処理をせずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を検出する方法、および該方法を実施するためのキット等に関する。オミクロン株は、これまでに知られているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の他の変異株と異なり、野生型のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム配列（配列番号１）において非常に多数の変異を含むことが知られている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株における変異は、特にスパイクタンパク質（Ｓタンパク質ともいう）をコードする塩基配列に多数含まれることが知られており、例えば、Ｇ１４２Ｄ、Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｋ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ｐ６８１Ｈをコードする塩基配列において変異を有することが分かっている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２等のウイルスは変異しやすく、オミクロン株も今後変異を繰り返していくと推定される。本明細書において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株とは、Ａｉｎｅ Ｏ’Ｔｏｏｌｅ等の文献（Ｖｉｒｕｓ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，２０２１，７（２），１－９（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる））に記載のＰａｎｇｏｌｉｎ ｔｏｏｌ（Ｐａｎｇｏｌｉｎ：Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ Ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｎａｍｅｄ Ｇｌｏｂａｌ Ｏｕｔｂｒｅａｋ Ｌｉｎｅａｇｅｓ）を使用し、Ｂ．１．１．５２９に分類されるＳＡＲＳ-ＣｏＶ-２の変異株（例えば、ＢＡ．２株等を含む）を指し、また、現在判明しているオミクロン株（Ｂ．１．１．５２９系統）と同等の塩基配列（例えば、当該オミクロン株のＳタンパク質をコードする領域において９９％以上の同一性を有する塩基配列）を有するオミクロン株の派生株を含む。このようなオミクロン株の派生株としては、例えば、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａをコードする塩基配列をゲノムＲＮＡに含むオミクロン株の派生株を含むが、これらに限定されない。

【0018】

本発明では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を検出するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパクにおけるＬ４５２位の周辺領域、具体的には、配列番号１において２２８７５～２２８９８番目に示される塩基配列に対応する領域を標的として設計したプライマーを用いることで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を特異的に検出することを一つの特徴としている。この本発明で用いるプライマーは、配列番号１で示される野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の塩基配列において、２２８８２番目の塩基がＴがＧに、また２２８９８番目の塩基のＧがＡに置換されている。本発明では、このようなプライマーを含むプライマーセットを用いてＲＴ－ＰＣＲ反応を行うことで、上記のようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を、野生株等と区別して検出することができる。

【0019】

一つの実施形態において、本発明は、核酸の単離処理をせずにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を検出する方法であって、少なくとも以下の（１）及び（２）の工程を含む方法を提供する：
（１）核酸の単離処理を行っていない試料と、（ａ）配列番号５に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む少なくとも一つのプライマー及び（ｂ）前記プライマーの核酸伸長生成物に対して相補的な塩基配列を含むように設計された少なくとも一つのプライマーを含むプライマーセットと、ＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合する工程；並びに
（２）前記混合液を用いてＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。
本発明は、前記工程（１）において、特定の塩基配列から構成されるプライマーを含むプライマーセットを用いることにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を高度に識別して検出でき、また例えば、唾液、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液等の夾雑物質を含む生体試料をそのまま用いる場合であっても、これらの生体試料中に含まれ得るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロン株を高感度に検出できることを見出したことに基づく。

【0020】

上記の実施態様において、本発明の方法は、核酸の単離処理を行っていない試料を使用することを一つの特徴とする。例えば、本発明は、各種試料から市販の核酸精製キットで核酸を単離したり、あるいはウイルスのゲノム核酸をキャプシド構造などから露出させるための事前の熱処理等をしていない未処理試料を用いることができる。手間のかかる精製等の前処理が不要となるため簡便であるという観点から、これらの未処理試料を用いることが好ましい。また、夾雑物質を除去するような分離精製を伴わない核酸抽出を行った試料であってもよい。ここで、分離精製を伴わない核酸抽出を行った試料とは、試料中で核酸を露出させた状態にすることを意味し、例えば、試料中で細胞膜やカプシド、エンベロープ等を破壊し、これらに内包されていた核酸を抽出して露出させること（但し、破壊後に残存する細胞膜やカプシド、エンベロープの断片等は除去しないこと）をいう。本発明では、このような単離精製の手間を省いて用意した試料であっても良好に核酸増幅でき、安定してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を検出ことが可能である。このような分離精製を伴わない核酸抽出処理は、前記工程（１）に先立って行うことができる。

【0021】

本発明において用いられる試料は、核酸の単離処理を行っていないものであれば特に限定されない。本発明に用いる試料が、唾液、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液等の夾雑物質および不溶性物質を含みうる試料である場合、当該試料は事前に水または緩衝液等にて懸濁した懸濁液であってよく、唾液試料等であればそのまま使用してもよく、糞便試料等の固形試料をＰＣＲ反応液に直接添加してもよい。例えば咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、鼻咽頭ぬぐい液、喀痰、嘔吐物、唾液、うがい液、涙液、糞便（排泄便、直腸便）などが挙げられるが、特に限定されるものではなく、生体に由来するもの全般に用いることが可能である。特には、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、鼻咽頭ぬぐい液、喀痰、肺吸引物、脳脊髄液、うがい液、唾液、涙液、糞便、培養細胞、培養上清からの検出に有用であり、なかでも唾液試料、喀痰試料、うがい液、涙液、咽頭ぬぐい液試料、鼻咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液試料、糞便試料の検出に有用である。本発明によれば、これら試料から市販のＲＮＡ精製キット等を用いてＲＮＡを単離してＲＴ－ＰＣＲ反応に供する必要がないという利点がある。前記試料は直接検出に供してもよいし、夾雑物の反応への影響を低減し、より安定した検査結果を得るために、水、生理食塩水または緩衝液に前記試料を懸濁した試料であってもよい。前記緩衝液としては、特に限定されるものではないが、ハンクス緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリシン緩衝液などが挙げられる。また、粘性の強い生体試料（例えば、粘性の強い喀痰を含む試料）の場合は、特に限定されないが、スプタザイム酵素液で処理した試料であってもよい。

【0022】

更に、本発明において用いられる試料は、キャプシドや細胞壁などの堅牢な構造からＲＮＡまたはＤＮＡを抽出しやすくするために、前記試料を緩衝液や、酸またはアルカリ性溶液、有機溶媒などを含む溶液と混合した試料であってもよい。前記溶液に含まれるものとして、酸性溶液としては、酸性の溶液であれば特に限定されない。酸性溶液としては、例えば、ギ酸水溶液、酢酸水溶液、酪酸水溶液、塩酸水溶液、硝酸水溶液、硫酸水溶液、クエン酸水溶液、乳酸水溶液、リン酸水溶液、安息香酸水溶液、シュウ酸水溶液、酒石酸水溶液、アスコルビン酸水溶液、スルホン酸水溶液などが挙げられ、１種単独又は２種以上組み合わせて使用できる。アルカリ性溶液においても、アルカリ性の溶液であれば特に限定されない。アルカリ性溶液としては、例えば水酸化カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化リチウム水溶液、水酸化マグネシウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液、水酸化バリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸マグネシウム水溶液、炭酸カルシウム水溶液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液（ＴＡＰＳＯ，ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ）などが挙げられ、１種単独又は２種以上組み合わせて使用できる。有機溶媒として、具体的にはエタノール、メタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、トリエチルアミン、ジメチルホルムアミド、ヘキサメチルホスホリックトリアミド、ジメチルスルホキシド、アセトン、アセトニトリル、エタノール、メタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、ピリジン等が挙げられるがこれに限られるものではない。さらには、本発明に用いられる試料は、前記溶液と混合後熱処理に供されたものであっても良い。熱処理の条件は、特に限定されないが、６０℃以上、好ましくは７０℃以上、より好ましくは８０℃以上、更により好ましくは９０℃以上で、１秒以上処理されたものであってよい。

【0023】

本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を検出する方法は、オミクロン株のスパイクタンパク質をコードするゲノムＲＮＡ領域の一部を増幅するために特定配列のプライマーを含むプライマーセットを用いる。本発明において使用するプライマーセットは、（ａ）配列番号５に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む少なくとも一つのプライマーと、（ｂ）前記（ａ）プライマーの核酸伸長生成物に対して相補的な塩基配列を含むように設計された少なくとも一つのプライマーを含み、ＲＴ－ＰＣＲ反応において核酸を増幅し得るように設計されたプライマーセットであれば特に限定されない。好ましい一つの実施形態では、本発明に使用するプライマーセットは、５０～５００ｂｐ程度を増幅し得るように設計されたプライマーセットであり、５０～３００ｂｐ程度を増幅し得るように設計されたプライマーセットであることがより好ましく、５０～１５０ｂｐ程度を増幅し得るように設計されたプライマーセットであることが更に好ましい。なお、本明細書において、特定の配列番号で示される塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプライマーとは、前記塩基配列の５’末端及び／又は３’末端に１又は数個（例えば１～３個、好ましくは１～２個、より好ましくは１個）の塩基が付加されたものであってもよい。このような塩基の付加は標的配列に応じて当業者により適宜設計され得る。また、本発明に用いるプライマーセットは、（ａ）プライマー及び（ｂ）プライマーを各々一つずつ含むものであってもよいし、（ａ）プライマーを二つ以上及び／又は（ｂ）プライマーを二つ以上含んでいてもよい。

【0024】

本発明に用いる前記プライマーセットにおいて、（ａ）配列番号５に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む少なくとも一つのプライマーは、フォワードプライマー（Ｆｗｄプライマーとも略記する）であってもよく、リバースプライマー（Ｒｅｖプライマーとも略記する）であってもよい。好ましくは、前記（ａ）プライマーはフォワードプライマーであって、前記（ｂ）プライマーはリバースプライマーとして設計されるプライマーである。好ましくは、リバースプライマーとして設計される前記（ｂ）プライマーは、配列番号７に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプライマーである。なかでも、前記（ａ）プライマーとして配列番号５に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるプライマー及び（ｂ）プライマーとして配列番号７に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるプライマーとを含むプライマーセットであることが好ましく、前記（ａ）プライマーとして配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマー及び（ｂ）プライマーとして配列番号７に記載の塩基配列からなるプライマーとを含むプライマーセットであることがより好ましい。このようなプライマーセットを用いてＲＴ－ＰＣＲ反応を行うことで、核酸の単離処理を行っていない試料を用いて夾雑物を含み得る反応液でＲＴ－ＰＣＲ反応を行う場合であっても、高感度にオミクロン株を増幅し検出することができる。

【0025】

本発明に用いる上記プライマーセットは、前記（ａ）プライマー及び前記（ｂ）プライマー以外のプライマーを含むものであってもよい。このようなプライマーとしては、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生株又はデルタ株等の他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株のゲノムＲＮＡを増幅し得るように設計されたプライマーであり得る。前記（ａ）プライマー及び前記（ｂ）プライマーに加えて、このようなプライマーも組み合わせて含むプライマーセットを用いることで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株だけでなく、野生株又はデルタ株等の他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を同時検出することも可能となり、生体試料中に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が、オミクロン株とそれ以外の株のいずれであるか（例えば、オミクロン株であるか、デルタ株であるか、野生株のいずれであるか等）を識別できるという利点がある。このような更なるプライマーとしては、好ましくは、前記（ｂ）プライマーと一緒になってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株以外の変異株のゲノムＲＮＡを増幅し得るプライマーであり、より好ましくは、前記（ｂ）プライマーと一緒になってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のデルタ株のゲノムＲＮＡを増幅し得るプライマーであり、更に好ましくは、配列番号６に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプライマーであり、更により好ましくは配列番号６に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるプライマーであり、特に好ましくは配列番号６に記載の塩基配列からなるプライマーである。このようなプライマーを組み合わせて用いることで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株とデルタ株とを、同じＲＴ－ＰＣＲ反応液を用いて区別して良好に判別できることが後述の試験例の結果に示されている。

【0026】

一つの実施形態において、本発明では、前記プライマーセットで増幅した核酸増幅産物にハイブリダイズし得るように設計された蛍光標識核酸プローブ（以下，（ｃ）プローブともいう）を用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を検出する。このような蛍光標識プローブとしては、目的の核酸増幅産物があるときに強いシグナルを発生するプローブであれば特に限定されないが、例えば、ＴａｑＭａｎプローブ（米国特許第５，２１０，０１５号公報、米国特許第５，５３８，８４８号公報、米国特許第５，４８７，９７２号公報、米国特許第５，８０４，３７５号公報）、モレキュラービーコン（米国特許第５，１１８，８０１号公報）、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ（国際公開第９７／４６７０７号パンフレット，国際公開第９７／４６７１２号パンフレット，国際公開第９７／４６７１４号パンフレット）などが挙げられる。好ましくは、ＴａｑＭａｎプローブである。

【0027】

プローブに用いられ得る蛍光化合物は、当該分野で公知の任意のものを使用することができ、例えば、使用したいｑＰＣＲ機器に合わせて選択することができる。蛍光化合物の具体例としては、例えば、ローダミン（ＲＯＸ）若しくはその誘導体（例えば、５－カルボキシ－Ｘ－ローダミン、６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン、５－カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ））、又はそれらの塩などのローダミン系化合物；フルオロセイン又はその誘導体（例えば、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ２’，７’－ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５’－ヘキサクロロ－フルオレセイン－ＣＥホスホロアミダイト））、ＶＩＣ（登録商標）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）シリーズ、ローダミン又はその誘導体（例えば、５－カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）やテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ））、Ｃｙ（登録商標）色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５）、若しくはそれらの誘導体、又はそれらの塩等の非ローダミン系化合物等があげられるが、これらに限定されない。蛍光化合物は、必要に応じて、使用する蛍光物質にあった消光物質を使用することができる。上記のような蛍光物質に対応した消光物質としては、例えば、ＴＡＭＲＡ（テトラメチル－ローダミン）、ＤＡＢＣＹＬ（４－（４－ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸）、ＢＨＱ１（ＢＨＱ：Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標））、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0028】

前記のようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を検出し得る蛍光プローブは、前記プライマーセットで増幅した核酸増幅産物の二本鎖のいずれか一方の鎖の塩基配列の一部にハイブリダイズし得るように設計されたプローブであれば、特に限定されず、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株のゲノム塩基配列に特有の変異塩基を含むように設計されたものでなくてもよく、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型のゲノム塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプローブであってもよい。このように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株と野生株との間で共通する塩基配列（好ましくは、２０～３０ｂｐ程度の連続して共通する塩基配列、より好ましくは２２～２６ｂｐ程度の連続して共通する塩基配列）を標的とするように蛍光プローブを設計することで、オミクロン株と野生株との識別のためにそれぞれに対応する複数の蛍光標識プローブを設計する必要がなく、低コストでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を検出できるという利点がある。このような蛍光プローブとしては、例えば、配列番号３若しくは４に記載の塩基配列又はそれらの塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む蛍光プローブ、好ましくは配列番号３に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む蛍光プローブ、より好ましくは配列番号３に記載の塩基配列からなる蛍光プローブが挙げられるが、これらに限定されない。なお、本明細書において、特定の配列番号で示される塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプローブとは、前記塩基配列の５’末端及び／又は３’末端に１又は数個（例えば１～３個、好ましくは１～２個、より好ましくは１個）の塩基が付加されたものであってもよい。このような塩基の付加は標的配列に応じて当業者により適宜設計され得る。本発明では、上記のような蛍光プローブを一つ使用してもよいし、二つ以上を組み合わせて使用してもよい。

【0029】

本発明に用いる上記プライマーセットは、前記（ｃ）プローブ以外の蛍光プローブを含むものであってもよい。このような蛍光プローブとしては、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のデルタ株等の他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株のゲノムＲＮＡからの核酸増幅産物を検出し得るように設計された蛍光プローブであり得る。前記（ｃ）プローブに加えて、このような蛍光プローブも組み合わせて用いることで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株だけでなく、デルタ株等の他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株を判別しながら同時検出することも可能となるという利点がある。このような更なる蛍光プローブとしては、好ましくは、オミクロン株と同様に感染力の強さから問題となっているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のデルタ株のゲノムＲＮＡからの核酸増幅産物を検出し得る蛍光プローブであり、より好ましくは、配列番号２に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む蛍光プローブであり、さらに好ましくは配列番号２に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる蛍光プローブであり、特に好ましくは配列番号２に記載の塩基配列からなる蛍光プローブである。このような蛍光プローブを組み合わせて用いることで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株とデルタ株とを、同じＲＴ－ＰＣＲ反応液を用いて区別して良好に判別できる。

【0030】

本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を検出する方法では、核酸の単離処理を行っておらず夾雑物質が含まれる試料からであっても、夾雑物質の阻害を受けることなくＲＴ－ＰＣＲ反応が実施され得るＲＴ－ＰＣＲ反応液（ＲＴ－ＰＣＲ試薬）を用いてＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する。このようなＲＴ－ＰＣＴ反応液は、例えば、夾雑物質に対して耐性を示すことが公知のＤＮＡポリメラーゼ等を含むものが好ましいが、特に限定されない。

【0031】

前記ＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれるＤＮＡポリメラーゼとしては、当該分野で公知の任意のＤＮＡポリメラーゼを用いることができる。好ましくは、夾雑物耐性を持つことが当該分野で公知の任意のＤＮＡポリメラーゼを用いることができる。夾雑物耐性とは、ＲＴ－ＰＣＲ阻害物質の存在下においても、核酸増幅反応に十分なＤＮＡポリメラーゼの高い酵素活性を有する性質を指す。夾雑物耐性を持つＤＮＡポリメラーゼとして、特に限定されるものではないが、Ｔｔｈ，Ｂｓｔ，ＫＯＤ，Ｐｆｕ，Ｐｗｏ、Ｔｂｒ，Ｔｆｉ，Ｔｆｌ，Ｔｍａ，Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ，ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ、ＨａｗｋＺ０５やこれらの変異体が挙げられるが、特に限定されない。好ましくは、ＴｔｈおよびＨａｗｋＺ０５又はこれらの変異体の使用である。特に好ましくはＴｔｈ又はその変異体の使用である。通常夾雑耐性を有しないＴａｑなどのＤＮＡポリメラーゼにおいても、アミノ酸変異により夾雑耐性を有する変異体である場合は使用することが可能である。前記ＰＣＲ反応液に含まれる前記夾雑物耐性を有するＤＮＡポリメラーゼの総量は、一例として、少なくとも４．２ｎｇ／μＬ以上あればよく、５．０ｎｇ／μＬ以上であることが好ましく、５．８ｎｇ／μＬ以上であることがより好ましい。なかでも好ましくは、８．３ｎｇ／μＬ以上である。前記夾雑物耐性を有するＤＮＡポリメラーゼの総量の上限は特に限定されないが、一例として、２０ｎｇ／μＬ以下とすることができ、１６．７ｎｇ／μＬ以下であっても十分に本発明の効果を得ることができる。ポリメラーゼの量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法もしくはＮａｎｏｄｒｏｐ（サーモフィッシャー社）により定量した値であり、安全データシート（ＳＤＳ）から概算してもよい。ＢＳＡなどのタンパク質を含む場合は、後者の方法で算出することが望ましい。非特異的反応抑制の効果を高めるため、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体との併用、あるいは化学修飾により熱不安定ブロック基のＤＮＡポリメラーゼへ導入することで、ＰＣＲ反応開始までのＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を抑制し、ホットスタートＲＴ－ＰＣＲへの適用ができることが好ましい。

【0032】

本発明に用いられるＲＴ－ＰＣＲ反応液は、ＤＮＡポリメラーゼおよび必要に応じて逆転写酵素を含む。前記ＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる逆転写酵素の由来としては、ＲＮＡをＤＮＡに変換できれば特に限定されないが、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）－ＲＴ、ＡＭＶ－ＲＴ（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）、ＨＩＶ－ＲＴ、ＲＡＶ２－ＲＴ、ＥＩＡＶ－ＲＴ、カルボキシドサーマス・ハイドロゲノフォルマン（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｍ）ＤＮＡポリメラーゼ）やその変異体が例示される。特に好ましい例としては、ＭＭＬＶ－ＲＴ、ＡＭＶ－ＲＴ、またはそれらの変異体が挙げられる。

【0033】

本発明において用いられるＲＴ－ＰＣＲ反応液は、逆転写酵素活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを含むものであっても良い。逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼとは、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する能力とＤＮＡを増幅する能力を兼ね備えたＤＮＡポリメラーゼである。逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、逆転写活性及び夾雑物耐性に加えて、耐熱性を有することが好ましい。耐熱性とは、７０℃で１分以上の熱処理を実施しても、酵素活性が半分以上低下しないことをいう。由来は特に限定されるものではないが、Ｔａｑ、Ｔｔｈ，Ｂｓｔ，Ｂｃａ，ＫＯＤ，Ｐｆｕ，Ｐｗｏ、Ｔｂｒ，Ｔｆｉ，Ｔｆｌ，Ｔｍａ，Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ，ＤＥＥＰＶＥＮＴやこれらの変異体が挙げられる。これまでに逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼとして、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ）やＴｈｅｒｍｕｓ ｓｐ Ｚ０５由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｚ０５）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｍａ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ）などが挙げられ、これらの逆転写活性と耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性が失われていない変異体であってもよい。また、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ）の変異体であって、逆転写活性を有するものが知られており（例えば、ＲＴＸ：ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｘｅｎｏｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、本発明にはこのような逆転写酵素活性を併せ持つ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼも使用できる。特に好ましくは、Ｔｔｈ、Ｚ０５及びこれらの変異体からなる群より選択される逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。

【0034】

本明細書において、夾雑物耐性を有するＤＮＡポリメラーゼの変異体とは、その由来である野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列に対して、例えば８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、なかでも好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、且つ、夾雑物質の存在下においても高いＤＮＡポリメラーゼ活性を有するものをいう。逆転写活性も兼ね備えたＤＮＡポリメラーゼである場合、夾雑物質の存在下においてもＲＮＡをｃＤＮＡに変換する活性及びＤＮＡを増幅する活性を有するものをいう。ここで、アミノ酸配列の同一性を算出する方法としては、当該分野で公知の任意の手段で行うことができる。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、一例として、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出することが可能である。また、本発明に用いられ得る変異体は、その由来である野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加（以下、これらを纏めて「変異」ともいう）したアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、且つ、野生型ＤＮＡポリメラーゼと同様にＲＮＡをｃＤＮＡに変換する活性及びＤＮＡを増幅する活性を有するものであってもよい。ここで１又は数個とは、例えば、１～８０個、好ましくは１～４０個、よりこのましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個であり得るが、特に限定されない。

【0035】

本発明に用いられるＲＴ－ＰＣＲ反応液には、ＤＮＡポリメラーゼの他、緩衝剤、適当な塩、マグネシウム塩又はマンガン塩、デオキシヌクレオチド三リン酸、さらに必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。

【0036】

本発明で使用される緩衝剤としては、特に限定されないが、トリス（Ｔｒｉｓ），トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ），ビスートリシン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ），ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）などが挙げられる。硫酸、塩酸、酢酸、リン酸などでｐＨを６～９、より好ましくはｐＨ７～９に調整されたものである。また、添加する緩衝剤の濃度としては、１０～２００ｍＭ，より好ましくは２０～１５０ｍＭで使用される。この際、反応に適当なイオン条件とするために、塩溶液が加えられる。塩溶液としては、塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウムなどが挙げられる。

【0037】

本発明で使用されるｄＮＴＰとしては、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰがそれぞれ０．１～０．５ｍＭ、最も一般的には０．２ｍＭ程度加えられる。ｄＴＴＰの代わり及び／又は一部としてｄＵＴＰを使用することによって、クロスコンタミネーションに対する予防処置をとってもよい。クロスコンタミネーションに対する予防処置を講じる場合、Ｕｒａｃｉｌ－Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＵＮＧ）を含むことが好ましい。

【0038】

更に、本発明では、ＲＴ－ＰＣＲ反応液に、２価陽イオンを含むことが好ましい。このように２価陽イオンを含むことで、より安定して高い夾雑耐性が得られ高感度な検出が可能となる。２価陽イオンとしては、特に限定されないが、マグネシウムイオン、マンガンイオン、カルシウムイオン、銅イオン、鉄イオン、ニッケルイオン、亜鉛イオン等を挙げることができる。好ましくは、２価陽イオンとして、マグネシウムイオン、マンガンイオンを含むことが好ましい。本発明において、ＰＣＲ反応液にマグネシウムイオンやマンガンイオン等を添加する場合は、マグネシウムやマンガンを添加してもよいし、これらの塩を添加してもよい。マグネシウム又はその塩としては、マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム等が例示され、マンガン又はその塩としては、マンガン、塩化マンガン、硫酸マンガン、酢酸マンガンなどが例示される。このようなマグネシウム、マンガン、又はこれらの塩は、ＲＴ－ＰＣＲ反応液中に１～１０ｍＭ程度加えられることが好ましい。本発明の検出方法において、一酵素系ＲＴ－ＰＣＲを実施する場合、安定的に高い感度が得られ易いという観点からは、マンガン又はその塩を含むことが好ましい。特定の実施態様では、ＲＴ－ＰＣＲ反応液において１ｍＭ以上のマンガン又はその塩を含むことが好ましく、１．５ｍＭ以上のマンガン又はその塩を含むことが好ましく、２．０ｍＭ以上のマンガン又はその塩を含むことがより好ましい。また、二酵素系ＲＴ－ＰＣＲを実施する場合、安定的に高い感度が得られ易いという観点からは、マグネシウム又はその塩を含むことが好ましい。特定の実施態様では、ＲＴ－ＰＣＲ反応液において１ｍＭ以上のマグネシウム又はその塩を含むことが好ましく、１．５ｍＭ以上のマグネシウム又はその塩を含むことが好ましく、２．０ｍＭ以上のマグネシウム又はその塩を含むことがより好ましい。

【0039】

さらにＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる添加剤として、アミノ酸におけるアミノ基に３個のメチル基を付加した構造を有する第４級アンモニウム塩（以下、「ベタイン様４級アンモニウム」という）、ポリペプチド（ウシ血清アルブミン、セリシン、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（以下ＢＰＦともいう）、ゼラチン）、グリセロール、グリコール及び界面活性剤よりなる群から選択された少なくとも１つを含んでいてもよい。

【0040】

本発明に用いられる前記ポリペプチドは、分子量が５～５００ｋＤａである限り、特に限定されないが、好ましくは、６～４００ｋＤａである。本明細書において、分子量を示すときは、他の意味であることが明らかでない限り、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて決定した値をいう。ＳＤＳ－ＰＡＧＥでの分子量の測定は、当該分野で一般的な手法及び装置を用い、市販される分子量マーカー等を用いて行うことができる。例えば、「分子量５０ｋＤａ」とは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分子量を測定した際に、当業者が、通常５０ｋＤａの位置にバンドがあると判断する範囲にあることをいう。また、本発明に用いられるポリペプチドは、上記分子量の範囲内のポリペプチドの混合物であってもよい。

【0041】

本発明に用いられる前記ポリペプチドは、本発明の効果を奏する限り特に限定されず、複数のアミノ酸がペプチド結合で連なって形成されたタンパク質をいう。また、本発明に用いられるポリペプチドは、アミノ酸が連結されたポリペプチド構造を有する限り、例えば、熱変性等により三次元構造が解かれたような熱変性ポリペプチド（例えば、ゼラチン）等であってもよい。具体的には、本発明に使用され得るポリペプチドとして、例えば、アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン、ラクトアルブミン、ヒト血清アルブミン、卵由来アルブミン）、ゼラチン（例えば、魚ゼラチン、豚ゼラチン）、セリシン、カゼイン、フィブロイン等の天然由来タンパク質（天然由来ポリペプチド）；Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（以下ＢＰＦともいう）、コラーゲン加水分解物、ポリペプトン、酵母エキス、ビーフエキストラクト等の合成・分解等により人為的に製造されたポリペプチド等を用いることができる。より一層優れた本発明の効果が奏されるという観点から、好ましくは、本発明に用いられるポリペプチドは、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（以下ＢＰＦ）、及び／又はセリシンである。少量でも高い効果が発揮され得るという観点から、より好ましくは、ウシ血清アルブミン、ゼラチン（なかでも魚ゼラチン）を用いるのが好適である。これらのポリペプチドは、１種類だけ使用してもよいし、２種類以上を組合わせて使用してもよい。また、これらのポリペプチドは、天然からの抽出や合成等の手段により調製してもよく、また市販品も好適に使用することができる。

【0042】

本発明において、前記ポリペプチドの使用量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、例えば、前記試料と一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合した混合液中において、終濃度０．０００１～２００ｍｇ／ｍＬとなるような量、好ましくは０．０１～１５０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．１～１３０ｍｇ／ｍＬ、更に好ましくは０．５～１００ｍｇ／ｍＬで使用することができる。より優れた効果を発揮させるために好ましい量は、使用するポリペプチドの種類や所望される効果の程度等によって変動し得るが、例えば、以下のような使用量を例示することができる。
・ウシ血清アルブミンを用いる場合：ＲＴ－ＰＣＲ反応液中終濃度として、例えば０．５ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは２ｍｇ／ｍＬ以上、更に好ましくは３ｍｇ／ｍＬ以上。上限値は特に限定されないが、例えば、１０ｍｇ／ｍＬ以下とすることができる。
・ゼラチンを用いる場合：ＲＴ－ＰＣＲ反応液中終濃度として、例えば０．１ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以上、更に好ましくは７．５ｍｇ／ｍＬ以上、さらにより好ましくは１５ｍｇ／ｍＬ以上。上限値は特に限定されないが、例えば、５０ｍｇ／ｍＬ以下とすることができる。
・セリシンを用いる場合：ＲＴ－ＰＣＲ反応液中終濃度として、例えば１ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ以上、更に好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ以上、更により好ましくは５０ｍｇ／ｍＬ以上。上限値は特に限定されないが、例えば、１００ｍｇ／ｍＬ以下とすることができる。
・ＢＰＦを用いる場合：ＲＴ－ＰＣＲ反応液中終濃度として、例えば１ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ以上、更に好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ以上、更により好ましくは３０ｍｇ／ｍＬ以上。上限値は特に限定されないが、例えば、５０ｍｇ／ｍＬ以下とすることができる。

【0043】

前記ＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる界面活性剤としては、トリトンＸ－１００（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）、トリトンＸ－１１４（ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４）、ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０），ノニデットＰ４０、Ｂｒｉｊｉ３５、Ｂｒｉｊｉ５８、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、Ｅｍｕｌｇｅｎ４２０などが挙げられるが、特に限定されない。ＲＴ－ＰＣＲ反応液中の前記界面活性剤の濃度も特に限定はされないが、好ましくは０．０００１％以上、より好ましくは０．００２％以上、さらに好ましくは０．００５％以上で、良好な検出が可能となる。上限は特に限定されないが、一例として、０．１％以下とすることができる。

【0044】

前記ＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれるベタイン様４級アンモニウムとしては、ベタイン（トリメチルグリシン）、カルニチンなどが挙げられるが、特に限定されるものではない。ベタイン構造は分子内に安定な正、負の両電荷を持つ化合物で、界面活性剤のような性質を示し、ウイルス構造の不安定化を引き起こすと考えられる。さらに、ＤＮＡポリメラーゼの核酸増幅を促進することが知られる。好ましい前記ベタイン様４級アンモニウム濃度は、０．１Ｍ～２Ｍ、より好ましくは０．２Ｍ～１．２Ｍである。

【0045】

さらには、当該技術分野でＰＣＲまたはＲＴ－ＰＣＲを促進することが知られる物質と組み合わせて使用することもできる。本発明において有用な促進物質とは、例えば、グリセロール、ポリオール、プロテアーゼインヒビター、シングルストランド結合タンパク質（ＳＳＢ）、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ｔＲＮＡ、硫黄または酢酸含有化合物類、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチレングリコール、ホルムアミド、アセトアミド、エクトイン、トレハロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）、酢酸テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＡ）、ポリエチレングリコールなどが挙げられるが、これらに限定されない。さらに反応阻害を低減するように、エチレングリコール－ビス（２－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＧＴＡ）、１，２－ビス（ｏ－アミノフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＢＡＰＴＡ）のようなキレート剤を含んでいてもよい。

【0046】

また、核酸の単離処理を行っておらず夾雑物質が含まれる試料からであっても、夾雑物質の阻害を受けることなくＲＴ－ＰＣＲ反応が実施され得るＲＴ－ＰＣＲ反応液（ＲＴ－ＰＣＲ試薬）としては、市販品も使用することができ、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（東洋紡）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｉｒｅｃｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＲＴ－ｑＰＣＲ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）、２０１９新型コロナウイルス検出試薬キット（島津）などを使用することができる。好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（東洋紡）を使用するのがよい。

【0047】

前記工程（２）におけるＲＴ－ＰＣＲ反応のサイクルは、１．熱処理や２．逆転写反応のステップを含んでよい。また、各ステップの前後に、ホットスタート酵素を活性化させるための熱処理工程を含んでもよい。１の熱処理工程では、ウイルスを破砕してウイルス内の核酸を露出させる、及び／もしくは核酸増幅反応においてホットスタート酵素を活性化させる工程を含み得る。前記熱処理工程の温度及び時間は、６０℃以上であり、かつ１秒以上であればよく、好ましくは７０℃、３０秒以上、より好ましくは８０℃、３０秒以上、特に好ましくは８５℃、３０秒以上である。２の逆転写反応の温度は、使用する逆転写酵素の逆転写活性と、プライマー及びプローブのＴｍ値によって決定され、少なくとも２５℃以上であればよい。より好ましくは３７℃以上である。ＰＣＲでは、［１］熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、［２］鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、［３］ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、の３ステップを含んでいればよく、［２］と［３］を同一の温度で実施して、２ステップとしてもよい。迅速なＲＴ－ＰＣＲを実施するためには、前記ＲＴ－ＰＣＲ反応に使用するサーマルサイクラーは、前記［２］と［３］のステップの伸長時間を合わせて１５秒以下、より好ましくは１０秒以下の測定プログラムを設定することが望ましい。なお、本明細書において「ＰＣＲの伸長時間」とは、サーマルサイクラーでの設定時間を指す。

【0048】

本発明の別の一態様は、上記のような特定塩基配列のプライマーを含むことを特徴とする、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株検出キットである。具体的には、この本発明のキットは、（ａ）配列番号５に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む少なくとも一つのプライマーと、（ｂ）前記プライマーの核酸伸長生成物に対して相補的な塩基配列を含むように設計された少なくとも一つのプライマーとを含み、より好ましくは（ｂ）プライマーとして配列番号７に記載の塩基配列又はその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むプライマーを含むものであり得る。このキットは更に、核酸の単離処理を行っておらず夾雑物質が含まれる試料からであっても、夾雑物質の阻害を受けることなくＲＴ－ＰＣＲ反応が可能な反応試薬を含むことが好ましい。また、これらのキットは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を検出し得る前記（ｃ）蛍光プローブを含むことが好ましい。また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のデルタ株等の他の変異株のゲノムＲＮＡを増幅し得る他のプライマー及び／又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のデルタ株等の他の変異株のゲノムＲＮＡからの増幅産物を検出し得る他の蛍光標識プローブを含むことが更に好ましい。この本発明のキットに含み得るプライマー、蛍光プローブ、及びその他に含み得る成分は、上記の変異検出方法において詳述されたものと同様であり得る。本発明のキットにおいて、上記のようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を検出するためのプライマー（プライマーセット）及び蛍光プローブ、並びにＲＴ－ＰＣＲ反応が可能な反応試薬、更に必要に応じて含んでいてもよい、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株以外の他の変異株（例えば、デルタ株）等を検出するための蛍光プローブ、プライマー（プライマーセット）などは、１つの試薬としてキットに含まれてもよいし、別々の試薬としてキットに含まれ、使用前に混合して用事調製される態様で提供されてもよい。

【実施例0049】

以下、実施例をもって、本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

【0050】

試験例１．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株の分離検出
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ －Ｍｕｌｔｉ－（東洋紡）に添付の前処理液、反応液、酵素液を用いて、唾液存在下、特定の塩基配列を有するプライマーを用いることにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株を、オミクロン以外の株（野生株、デルタ株）と分離して検出できるか評価した。具体的には、上記キットの前処理液３μＬに陰性唾液検体８μＬを添加し、室温５分、９５℃５分反応後、反応液３０μL及び酵素液５μL、１０μＭの配列番号５に記載のＦｗｄプライマー１．２μＬ及び／又は１０μＭの配列番号６に記載のＦｗｄプライマー１．２μＬ、１０μＭの配列番号７に記載のＲｅｖプライマー１．２μＬ、１０μＭの配列番号３に記載のＦＡＭ－ＢＨＱ３標識プローブ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型の塩基配列に基づき設計された蛍光プローブ）又は１０μM配列番号２に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタ株検出Ｃｙ５―ＢＨＱ３標識プローブいずれかを０．３μＬ添加し、滅菌水で最終液量が４０μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。そこにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロン株ＲＮＡ、デルタ株ＲＮＡ、野生株ＲＮＡ１μＬ（それぞれ１００００、５０、２５、０コピー／μＬ）を添加し、ＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。なお、ここで用意されたＲＴ－ＰＣＲ反応液は唾液由来の夾雑物質を取り除く操作を行っていないため、核酸の単離処理を行っていない疑似試料とみなすことができる。ＲＴ―ＰＣＲは４２℃５分、９５℃１０秒の反応の後、９５℃５秒→６０℃３０秒の繰り返しを４５サイクルする条件で実施した。

【0051】

ＲＴ－ＰＣＲの結果得られたＣｔ値を表１に示す。Ｎ／Ａは増幅しなかったことを示す。配列番号６－７の組合せのプライマーセットでは野生株とデルタ株でのみシグナルが得られ、野生株とオミクロン株をうまく分離できていたものの、オミクロン株を検出できていない。配列番号５－７のプライマーの組合せでは、高コピー数の場合に野生株にも反応している結果となったが、Ｃｔを比較すると野生型の方はＣｔ値が大きく、オミクロン株の方が野生株より効率的に反応している結果となった。また、配列番号５－６－７の組合せでは、ＦＡＭで標識した野生型配列に基づき設計された蛍光プローブを用いた場合には野生株とオミクロン株を漏れなく検出し、更に、Ｃｙ５で標識されたデルタ株配列に基づき設計されたプローブも併用することによりデルタ株と野生株・オミクロン株との同時分離も可能であることが示された。

【0052】

この結果から、配列番号５－７のプライマーセットを用いることでオミクロン株のみを効率的に増幅して検出することが出来ることが分かる。また、配列番号６－７のプライマーセット及び／又は配列番号５－６－７のプライマーセットを利用したＲＴ－ＰＣＲ反応での検出を同時に行えば、オミクロン株を検出できるだけでなく、野生株及び／又はデルタ株とオミクロン株を分離して検出することが出来ることが明らかとなった。

【表1】

【産業上の利用可能性】

【0053】

本発明は、臨床検査、感染症拡大防止などを目的とした検査の他、分子生物学研究等においても好適に利用できる。

【配列表】

2023113514000001.app