(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023113648
(43)【公開日】2023-08-16
(54)【発明の名称】ＥＤＢ標的化ＩＬ－１２組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20230808BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230808BHJP
C07K 14/54 20060101ALI20230808BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20230808BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230808BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20230808BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230808BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230808BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230808BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20230808BHJP
A61K 38/20 20060101ALI20230808BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230808BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C07K19/00 ZNA
C07K14/54
C07K14/47
C12N15/63 Z
C12P21/02 C
C12N5/10
A61P35/00
A61K39/395 T
A61K39/395 N
A61K47/68
A61K38/20
A61P37/04
【審査請求】有
【請求項の数】55
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023077703
(22)【出願日】2023-05-10
(62)【分割の表示】P 2020542822の分割
【原出願日】2019-02-08
(31)【優先権主張番号】18156141.6
(32)【優先日】2018-02-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】18179313.4
(32)【優先日】2018-06-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】518360689
【氏名又は名称】フィロジェン ソチエタ ペル アツィオーニ
(74)【代理人】
【識別番号】110000109
【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス
(72)【発明者】
【氏名】ヴィッラ アレッサンドラ
(72)【発明者】
【氏名】マタシ マッティア
(72)【発明者】
【氏名】オンガーロ ティツィアーノ
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ＥＤＢフィブロネクチンの発現に関連する様々な疾患および障害を効果的に治療するために使用することができる改良された組成物および方法を提供する。
【解決手段】ａ．第１のＩＬ－１２サブユニットおよび第２のＩＬ－１２タンパク質サブユニットを含むＩＬ－１２タンパク質；ｂ．ＥＤＢ結合ドメインを含むタンパク質；ならびにｃ．ＩＬ－１２タンパク質とＥＤＢ結合ドメインを含むタンパク質との間のリンカーを含む組成物を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】ａ．第１のＩＬ－１２サブユニットおよび第２のＩＬ－１２タンパク質サブユニットを含むＩＬ－１２タンパク質；ｂ．ＥＤＢ結合ドメインを含むタンパク質；ならびにｃ．ＩＬ－１２タンパク質とＥＤＢ結合ドメインを含むタンパク質との間のリンカーを含む組成物を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ．第１のＩＬ－１２サブユニットおよび第２のＩＬ－１２タンパク質サブユニットを含むＩＬ－１２タンパク質；
ｂ．ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質；ならびに
ｃ．ＩＬ－１２タンパク質とＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質との間のリンカーを含む組成物。
ｂ．ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質；ならびに
ｃ．ＩＬ－１２タンパク質とＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質との間のリンカーを含む組成物。
【請求項2】
ＩＬ－１２タンパク質とＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質との間のリンカーが、ＧＳＡＤＧＧＳＳＡＧＧＳＤＡＧ（配列番号４）を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質がｓｃＦｖを含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質がダイアボディである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項5】
ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質が一本鎖ダイアボディである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項6】
ＩＬ－１２タンパク質の第１のサブユニットがｐ４０であり、第２のサブユニットがｐ３５である、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
ＩＬ－１２タンパク質の第１のサブユニットが、配列番号１に記載のアミノ酸配列またはその断片と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むｐ４０であり、ここでＩＬ－１２タンパク質はＩＬ－１２受容体を活性化することができる、請求項１～６に記載の組成物。
【請求項8】
ＩＬ－１２タンパク質の第２のサブユニットが、配列番号３に記載のアミノ酸配列またはその断片と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むｐ３５であり、ここでＩＬ－１２タンパク質はＩＬ－１２受容体を活性化することができる、請求項１～７に記載の組成物。
【請求項9】
ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質が、単一特異性または二重特異性である、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項10】
ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質がフィブロネクチンのエクストラドメインＢ （ＥＤ－Ｂ）に結合する、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物
【請求項11】
ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質が、配列番号２８～３３に示されるアミノ酸配列の１つ以上と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項12】
ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質が、配列番号２８～３３のアミノ酸配列の各々を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項13】
ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質が、配列番号７および５に記載のアミノ酸配列の１つ以上と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項14】
ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質が、配列番号７および５に記載のアミノ酸配列の各々を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項15】
ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質が、
ａ）前記ドメインの少なくとも１つが配列番号７または配列番号５に対してそれぞれ≧８０％の配列同一性を有するという条件で請求項１４に記載の配列対、および／または
ｂ）前記ドメインの少なくとも１つがフィブロネクチンのエクストラドメインＢ （ＥＤ－Ｂ）に結合する能力を維持しながら、配列番号７または配列番号５に対してそれぞれ最大１０個のアミノ酸置換を有するという条件で請求項１４に記載の配列対の少なくとも１つを含む、請求項１４に記載の組成物。
ａ）前記ドメインの少なくとも１つが配列番号７または配列番号５に対してそれぞれ≧８０％の配列同一性を有するという条件で請求項１４に記載の配列対、および／または
ｂ）前記ドメインの少なくとも１つがフィブロネクチンのエクストラドメインＢ （ＥＤ－Ｂ）に結合する能力を維持しながら、配列番号７または配列番号５に対してそれぞれ最大１０個のアミノ酸置換を有するという条件で請求項１４に記載の配列対の少なくとも１つを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項16】
少なくとも１つのアミノ酸置換が保存的アミノ酸置換である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項17】
ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質が、
請求項１１～１６に記載のＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質の１つと比較して、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に対する≧５０％の標的結合親和性を有し、かつ／または
請求項１１～１６に記載のＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質の１つと、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）への結合について競合する、
請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物。
請求項１１～１６に記載のＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質の１つと比較して、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に対する≧５０％の標的結合親和性を有し、かつ／または
請求項１１～１６に記載のＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質の１つと、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）への結合について競合する、
請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項18】
ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質が、２つのＬ１９ ＶＨドメインおよび２つのＬ１９ ＶＬドメインを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項19】
２つのＬ１９ ＶＨドメインが同一のアミノ酸配列を有する、２つのＬ１９ ＶＨドメインが異なるアミノ酸配列を有する、２つのＬ１９ ＶＬドメインが同一のアミノ酸配列を有する、または２つのＬ１９ ＶＬドメインが異なるアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の組成物。
【請求項20】
ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質が、１つのＬ１９ ＶＨドメインおよび１つのＬ１９ ＶＬドメインを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項21】
前記組成物が、
第１のリンカーによりｐ３５ドメインに連結されたｐ４０ドメイン；
ＳＡＤリンカーによりｐ３５ドメインに連結された第１のＬ１９ ＶＨドメイン；
第３のリンカーにより第１のＬ１９ ＶＨドメインに連結された第１のＬ１９ ＶＬドメイン；
第４のリンカーにより第１のＬ１９ ＶＬドメインに連結された第２のＬ１９ ＶＨドメイン；
第５のリンカーにより第２のＬ１９ ＶＨドメインに連結された第２のＬ１９ ＶＬドメイン
を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物。
第１のリンカーによりｐ３５ドメインに連結されたｐ４０ドメイン；
ＳＡＤリンカーによりｐ３５ドメインに連結された第１のＬ１９ ＶＨドメイン；
第３のリンカーにより第１のＬ１９ ＶＨドメインに連結された第１のＬ１９ ＶＬドメイン；
第４のリンカーにより第１のＬ１９ ＶＬドメインに連結された第２のＬ１９ ＶＨドメイン；
第５のリンカーにより第２のＬ１９ ＶＨドメインに連結された第２のＬ１９ ＶＬドメイン
を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項22】
ｐ４０ドメインが、配列番号１に記載のアミノ酸配列またはその断片と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項23】
ｐ３５ドメインが、配列番号３に記載のアミノ酸配列またはその断片と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２１～２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項24】
第１のリンカーがＧＳリンカーである、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項25】
前記第１のリンカーが、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項26】
第１のＬ１９ ＶＨドメイン、第２のＬ１９ ＶＨドメイン、またはその両方が、配列番号２８～３０に示される少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項27】
第１のＬ１９ ＶＬドメイン、第２のＬ１９ ＶＬドメイン、またはその両方が、配列番号：３１～３３に記載の少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項28】
前記第１のＬ１９ ＶＨドメイン、前記第２のＬ１９ ＶＨドメイン、またはその両方が、配列番号７に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２１～２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項29】
前記第１のＬ１９ ＶＬドメイン、前記第２のＬ１９ ＶＬドメイン、またはその両方が、配列番号５に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２１～２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項30】
ＳＡＤリンカーが、配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２１～２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項31】
第３のリンカーがＧＳリンカーである、請求項２１～３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項32】
前記第３のリンカーが、配列番号６に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２１～３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項33】
第５のリンカーがＧＳリンカーである、請求項２１～３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項34】
前記第３のリンカーが、配列番号６に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２１～３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項35】
第３のリンカーおよび第５のリンカーが同一のアミノ酸配列を含む、請求項２１～３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項36】
第４のリンカーがＧＳリンカーである、請求項２１～３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項37】
前記第４のリンカーが、配列番号８に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２１～３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項38】
前記組成物が、配列番号１６に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項39】
組成物が、配列番号１６に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１～３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項40】
腫瘍性疾患と診断されているか、
腫瘍性疾患に罹患しているか、または
腫瘍性疾患を発症するリスクがある
ヒト又は動物対象の治療におけるか、またはそのような状態の予防のための、請求項１～３９のいずれか一項に記載の組成物の（医薬品の製造のための）使用。
腫瘍性疾患に罹患しているか、または
腫瘍性疾患を発症するリスクがある
ヒト又は動物対象の治療におけるか、またはそのような状態の予防のための、請求項１～３９のいずれか一項に記載の組成物の（医薬品の製造のための）使用。
【請求項41】
腫瘍性疾患が、悪性黒色腫、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、腎細胞がん、尿路上皮がん、頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）又はミスマッチ修復機構欠損（ｄＭＭＲ）を有する転移性結腸直腸がん、肝細胞がん、胃がん、皮膚の扁平上皮がん、子宮頸がん、およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）からなる群より選択される、請求項４０に記載の使用。
【請求項42】
ヒト又は動物の対象における血管新生の阻害のための、請求項１～３９のいずれか一項に記載の組成物の（医薬品の製造のための）使用。
【請求項43】
請求項１～３９のいずれか一項に記載の組成物、および任意に１種以上の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項44】
（ｉ）請求項１～３９のいずれか一項に記載の組成物または請求項４３に記載の医薬組成物および（ｉｉ）１つ以上の治療的活性化合物を含む組合せ。
【請求項45】
ＥＤ－Ｂフィブロネクチンの発現または過剰発現に関連する疾患または症状を治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１～３９のいずれか一項に記載の組成物、請求項４３に記載の医薬組成物、または請求項４４に記載の組合せの有効量を投与することを含む方法。
【請求項46】
ａ）請求項１～３９のいずれか一項に記載の組成物、請求項４３に記載の医薬組成物または請求項４４に記載の組合せ、
ｂ）組成物、組成物または組合せを投与するための装置、および
ｃ）使用説明書
を含むパーツの治療用キット。
ｂ）組成物、組成物または組合せを投与するための装置、および
ｃ）使用説明書
を含むパーツの治療用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、サイトカイン、抗原結合ドメイン、および改良されたリンカーを含む組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
ＩＬ－１２は、ｐ３５およびｐ４０という２つのジスルフィド結合サブユニットを含むヘテロ二量体サイトカインである。ＩＬ－１２はＴ細胞やナチュラルキラー細胞からのＩＦＮγの産生を刺激し、またＴｈ１ヘルパー細胞の分化を誘導する。ＩＬ－１２は、自然免疫および細胞性免疫の重要なメディエーターであり、抗がんおよび抗転移活性の可能性がある。
【0003】
しかし、他の多くのサイトカインと同様に、ＩＬ－１２の投与は重度の毒性と関連しており（Ｃａｒら、１９９９）、１日１μｇ／ｋｇという低用量でも、抗がん剤としての開発を妨げている。
【発明の概要】
【0004】
本発明は、とりわけ、ＥＤＢフィブロネクチンの発現に関連する様々な疾患および障害を効果的に治療するために使用することができる改良された組成物および方法を提供する。
【0005】
特に、本発明は、既知の組換えＩＬ－１２構築物よりも好ましい治療特性を有するＩＬ－１２結合ＥＤＢ結合ドメインを提供する。本明細書に記載された組成物は、驚くべきことに、ＥＤＢを標的とするように設計された以前から知られているＩＬ－１２構築物よりも優れており、疾患または障害、例えば、がんの標的治療のためにＩＬ－１２を安全かつ効果的に投与する長い間知られている問題を解決する。本明細書に記載される組成物および方法は、その体内分布プロファイル、その忍容性、その治療ウインドウ、および疾患部位に到達する際のその効力の１つまたは複数を増強することによって、ＩＬ－１２の改善された治療可能性を提供する。本明細書に記載される構築物はまた、驚くほど優れた製造可能性を示す。
【0006】
免疫サイトカイン治療薬の組織移行の向上は当技術分野において依然として必要とされている。また、これらは、産生が困難な高度に複雑なタンパク質であるため、免疫サイトカイン治療薬の改善された製造に対する要求が当技術分野では存在する。
【0007】
従って、改良版の免疫サイトカイン、例えば、ＩＬ－１２およびＥＤＢフィブロネクチン結合ドメインを含むタンパク質治療薬を提供することが本発明の目的である。本発明のさらなる目的は、より効率的な産生を示す免疫サイトカインを提供することである。本発明の別の目的は、ｉｎ ｖｉｖｏ性能、例えば標的結合または組織移行を改善した免疫サイトカインを提供することである。
【0008】
本発明は、抗原結合ドメインおよびそのような優れた特性を有するサイトカインを含む組成物を提供する。本発明および、適当なリンカーを含む、その特徴の一般的な利点について、以下に詳細に考察する。
【0009】
本発明の一態様によれば、組成物は、
ａ．第１のＩＬ－１２サブユニットおよび第２のＩＬ－１２タンパク質サブユニットを含むＩＬ－１２タンパク質；
ｂ．ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質；ならびに
ｃ．ＩＬ－１２タンパク質とＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質との間のリンカーを含む。
好適には、ＩＬ－１２の２つのサブユニットは、スキーム（Ｎ－＞Ｃ配向）：ｐ４０－リンカー１－ｐ３５のとおり、所与のリンカーによって互いに結合される。
ａ．第１のＩＬ－１２サブユニットおよび第２のＩＬ－１２タンパク質サブユニットを含むＩＬ－１２タンパク質；
ｂ．ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質；ならびに
ｃ．ＩＬ－１２タンパク質とＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質との間のリンカーを含む。
好適には、ＩＬ－１２の２つのサブユニットは、スキーム（Ｎ－＞Ｃ配向）：ｐ４０－リンカー１－ｐ３５のとおり、所与のリンカーによって互いに結合される。
【0010】
好適には、ＩＬ－１２はヒトＩＬ－１２である。本発明のいくつかの実施形態によれば、一本鎖ダイアボディはフィブロネクチンのスプライスアイソフォームに結合する。好ましくは、フィブロネクチンの前記エクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）は、ヒトフィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０２７５１）のエクストラドメインＢである。
【0011】
いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２タンパク質とＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質との間のリンカーは、ＧＳＡＤＧＧＳＳＡＧＧＳＤＡＧ（配列番号４）を含む。
【0012】
いくつかの実施形態において、ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質は、ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態において、ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質は、ダイアボディである。いくつかの実施形態において、ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質は、一本鎖ダイアボディである。
いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２タンパク質の第１のサブユニットはｐ４０であり、第２のサブユニットはｐ３５である。
いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２タンパク質の第１のサブユニットはｐ４０であり、第２のサブユニットはｐ３５である。
【0013】
いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２タンパク質の第１のサブユニットは、配列番号１に記載のアミノ酸配列またはその断片と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むｐ４０であり、ここでＩＬ－１２タンパク質はＩＬ－１２受容体を活性化することができる。
【0014】
いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２タンパク質の第２のサブユニットは、配列番号３に記載のアミノ酸配列またはその断片と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むｐ３５であり、ここでＩＬ－１２タンパク質はＩＬ－１２受容体を活性化することができる。
いくつかの実施形態において、ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質は、単一特異性または二重特異性である。
いくつかの実施形態において、ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質は、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する。
いくつかの実施形態において、ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質は、単一特異性または二重特異性である。
いくつかの実施形態において、ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質は、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する。
【0015】
いくつかの実施形態において、ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質は、配列番号２８～３３に記載のアミノ酸配列の１つ以上と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質は、配列番号２８～３３のアミノ酸配列の各々を含む。
いくつかの実施形態において、ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質は、配列番号２８～３３のアミノ酸配列の各々を含む。
【0016】
いくつかの実施形態において、ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質は、配列番号７および５に記載のアミノ酸配列の１つ以上と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質は、配列番号７および５に記載のアミノ酸配列の各々を含む。
いくつかの実施形態において、ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質は、配列番号７および５に記載のアミノ酸配列の各々を含む。
【0017】
いくつかの実施形態において、ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質は、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する能力を維持しながら、
ａ）ドメインの少なくとも１つは、それぞれ、配列番号７または配列番号５に対して≧８０％の配列同一性を有するという条件で、上記の配列対か、および／または
ｂ）ドメインの少なくとも１つは、それぞれ、配列番号７または配列番号５に対して最大１０個のアミノ酸置換を有するという条件で、上記の配列対の少なくとも一つを含む。
いくつかの実施形態において、ペプチドまたはタンパク質は、少なくとも１つのアミノ酸置換が保存的アミノ酸置換である少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
ａ）ドメインの少なくとも１つは、それぞれ、配列番号７または配列番号５に対して≧８０％の配列同一性を有するという条件で、上記の配列対か、および／または
ｂ）ドメインの少なくとも１つは、それぞれ、配列番号７または配列番号５に対して最大１０個のアミノ酸置換を有するという条件で、上記の配列対の少なくとも一つを含む。
いくつかの実施形態において、ペプチドまたはタンパク質は、少なくとも１つのアミノ酸置換が保存的アミノ酸置換である少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【0018】
いくつかの実施形態において、ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質は、
・上記の抗ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質の１つと比較して、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に対して≧５０％の標的結合親和性を有し、および／または
・上記のＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質の１つとフィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）への結合について競合する。
いくつかの実施形態において、ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質は、２つのＬ１９ ＶＨドメインおよび２つのＬ１９ ＶＬドメインを含む。
・上記の抗ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質の１つと比較して、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に対して≧５０％の標的結合親和性を有し、および／または
・上記のＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質の１つとフィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）への結合について競合する。
いくつかの実施形態において、ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質は、２つのＬ１９ ＶＨドメインおよび２つのＬ１９ ＶＬドメインを含む。
【0019】
いくつかの実施形態において、
・２つのＬ１９ ＶＨドメインは同じアミノ酸配列を有する；
・２つのＬ１９ ＶＨドメインは異なるアミノ酸配列を有する；
・２つのＬ１９ ＶＬドメインは同じアミノ酸配列を有する；または
・２つのＬ１９ ＶＬドメインは異なるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質は、１つのＬ１９ ＶＨドメインおよび１つのＬ１９ ＶＬドメインを含む。
・２つのＬ１９ ＶＨドメインは同じアミノ酸配列を有する；
・２つのＬ１９ ＶＨドメインは異なるアミノ酸配列を有する；
・２つのＬ１９ ＶＬドメインは同じアミノ酸配列を有する；または
・２つのＬ１９ ＶＬドメインは異なるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質は、１つのＬ１９ ＶＨドメインおよび１つのＬ１９ ＶＬドメインを含む。
【0020】
いくつかの実施形態において、組成物は、
・第１のリンカー（「リンカー１」とも呼ばれる）によりｐ３５ドメインに連結されたｐ４０ドメイン；
・ＳＡＤリンカーによりｐ３５ドメインに連結された第１のＬ１９ ＶＨドメイン；
・第３のリンカー（「リンカー３」とも呼ばれる）により第１のＬ１９ ＶＨドメインに連結された第１のＬ１９ ＶＬドメイン；
・第４のリンカー（「リンカー４」とも呼ばれる）により第１のＬ１９ ＶＬドメインに連結された第２のＬ１９ ＶＨドメイン；
・第５のリンカー（「リンカー５」とも呼ばれる）により第２のＬ１９ ＶＨドメインに連結された第２のＬ１９ ＶＬドメインを含む。
いくつかの実施形態において、第３のリンカーおよび第５のリンカーは、同じアミノ酸配列を含み、かつ／または互いに置き換えることができる。
・第１のリンカー（「リンカー１」とも呼ばれる）によりｐ３５ドメインに連結されたｐ４０ドメイン；
・ＳＡＤリンカーによりｐ３５ドメインに連結された第１のＬ１９ ＶＨドメイン；
・第３のリンカー（「リンカー３」とも呼ばれる）により第１のＬ１９ ＶＨドメインに連結された第１のＬ１９ ＶＬドメイン；
・第４のリンカー（「リンカー４」とも呼ばれる）により第１のＬ１９ ＶＬドメインに連結された第２のＬ１９ ＶＨドメイン；
・第５のリンカー（「リンカー５」とも呼ばれる）により第２のＬ１９ ＶＨドメインに連結された第２のＬ１９ ＶＬドメインを含む。
いくつかの実施形態において、第３のリンカーおよび第５のリンカーは、同じアミノ酸配列を含み、かつ／または互いに置き換えることができる。
【0021】
いくつかの実施形態において、ｐ４０ドメインは、配列番号１に記載のアミノ酸配列またはその断片と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0022】
いくつかの実施形態において、ｐ３５ドメインは、配列番号３に記載のアミノ酸配列またはその断片と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、第１のリンカー（「リンカー１」）は、ＧＳリンカーである。
いくつかの実施形態において、第１のリンカー（「リンカー１」）は、ＧＳリンカーである。
【0023】
いくつかの実施形態において、第１のリンカーは、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0024】
いくつかの実施形態において、第１のＬ１９ ＶＨドメイン、第２のＬ１９ ＶＨドメイン、またはその両方は、配列番号２８－３０に記載の少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0025】
いくつかの実施形態において、第１のＬ１９ ＶＬドメイン、第２のＬ１９ ＶＬドメイン、またはその両方は、配列番号３１－３３に記載の少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0026】
いくつかの実施形態において、第１のＬ１９ ＶＨドメイン、第２のＬ１９ ＶＨドメイン、またはその両方は、配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0027】
いくつかの実施形態において、第１のＬ１９ ＶＬドメイン、第２のＬ１９ ＶＬドメイン、またはその両方は、配列番号５に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0028】
いくつかの実施形態において、ＳＡＤリンカーは、配列番号４に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、第３のリンカー（「リンカー３」）は、ＧＳリンカーである。
いくつかの実施形態において、第３のリンカー（「リンカー３」）は、ＧＳリンカーである。
【0029】
いくつかの実施形態において、第３のリンカーは、配列番号６に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、第５のリンカー（「リンカー５」）は、ＧＳリンカーである。
いくつかの実施形態において、第５のリンカー（「リンカー５」）は、ＧＳリンカーである。
【0030】
いくつかの実施形態において、第５のリンカーは、配列番号６に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0031】
いくつかの実施形態において、第３のリンカー（「リンカー３」）および第５のリンカー（「リンカー５」）は、同一のアミノ酸配列を含み、かつ／または互いに交換することができる。
いくつかの実施形態において、第４のリンカー（「リンカー４」）は、ＧＳリンカーである。
いくつかの実施形態において、第４のリンカー（「リンカー４」）は、ＧＳリンカーである。
【0032】
いくつかの実施形態において、第４のリンカーは、配列番号８に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0033】
いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１６に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0034】
いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１６に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列からなる。
【0035】
本発明の別の態様によれば、上記請求項のいずれか１項に記載の組成物の（医薬品の製造のための）使用は、
・腫瘍性疾患と診断されているか、
・腫瘍性疾患に罹患しているか、または
・腫瘍性疾患を発症するリスクがある
ヒトまたは動物対象の治療、またはそのような状態の予防のために提供される。
・腫瘍性疾患と診断されているか、
・腫瘍性疾患に罹患しているか、または
・腫瘍性疾患を発症するリスクがある
ヒトまたは動物対象の治療、またはそのような状態の予防のために提供される。
【0036】
いくつかの実施形態において、腫瘍性疾患は、悪性黒色腫、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、腎細胞がん、尿路上皮がん、頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）又はミスマッチ修復機構欠損（ｄＭＭＲ）を有する転移性結腸直腸がん、肝細胞がん、胃がん、皮膚の扁平上皮がん、子宮頸がん、およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）からなる群から選択される。
本発明の別の態様によれば、ヒトまたは動物の対象における血管新生の抑制のための上記開示による組成物の（医薬品の製造のための）使用が提供される。
本発明の別の態様によれば、上記の少なくとも組成物、および任意に１種以上の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
本発明の別の態様によれば、（ｉ）上記の組成物または上記の医薬組成物、および（ｉｉ）１つ以上の治療的活性化合物を含む組合せが提供される。
本発明の別の態様によれば、ヒトまたは動物の対象における血管新生の抑制のための上記開示による組成物の（医薬品の製造のための）使用が提供される。
本発明の別の態様によれば、上記の少なくとも組成物、および任意に１種以上の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
本発明の別の態様によれば、（ｉ）上記の組成物または上記の医薬組成物、および（ｉｉ）１つ以上の治療的活性化合物を含む組合せが提供される。
【0037】
本発明の別の態様によれば、ＥＤ－Ｂフィブロネクチンの発現または過剰発現に関連する障害または状態を治療または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、上記の組成物、上記の医薬組成物、または上記の組合せの有効量を投与することを含む方法が提供される。
【0038】
本発明の別の態様によれば、パーツの治療用キットが提供され、
ａ）上記の組成物、上記の医薬組成物、または上記の組合せ、
ｂ）組成物、組成物または組合せを投与するための装置、および
ｃ）使用説明書を含む。
ａ）上記の組成物、上記の医薬組成物、または上記の組合せ、
ｂ）組成物、組成物または組合せを投与するための装置、および
ｃ）使用説明書を含む。
【図面の簡単な説明】
【0039】
【図1A】タンパク質発現実験の結果。材料および方法については下記を参照のこと。配列番号４のアミノ酸配列を有する１５－ｍｅｒリンカー（本明細書では「ＳＡＤ」とニックネームされる）は、全ての変異体（本明細書では「クローン」とも呼ばれる）のはるかに最良の産生収率を示す。２番目に良い変異体ＤＤＳよりも、収率はほぼ１００％良かった。ＡＫＫＡＳ株の２つの配列は配列番号９と１８であり、ＡＰ７株の２つの配列は配列番号１５と１９であり、ＤＤＳ株の２つの配列は配列番号１０と２０であり、ＡＰ６株の２つの配列は配列番号１４と２１であり、Ｇ４Ｓ株の２つの配列は配列番号１１と２２であり、ＳＥＳ株の２つの配列は配列番号１２と２３であり、Alpha３株の２つの配列は配列番号１３と２４であり、ＳＡＤ株の２つの配列は配列番号４と２５である。図１にはＮ末端残基とＣ末端残基（または５´－または３´－ヌクレオチド）があり、灰色で示してある。これらは、検索が必要な本出願の開示には属しない。それらは、それぞれのリンカーを埋め込むことができる枠組みを単純に示している。
【図1B】タンパク質発現実験の結果。材料および方法については下記を参照のこと。ＳＤＳ－ＰＡＧＥキャラクタリゼーションは、全ての変異体に対して約１２０ｋＤａの分子量を示した。
【図2】ＥＬＩＳＡ実験。全ての変異体は、１０μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌ濃度の両方で、ヒトフィブロネクチンのドメイン７Ｂ８９に結合する。
【図3】Ｂｉａｃｏｒｅの実験。すべての変異体はヒトフィブロネクチンのドメイン７Ｂ８９と同様の結合挙動を示す。
【図4】サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）。すべての変異体は、単量体免疫サイトカインに対応する１３ｍｌでの主要ピークと同等の凝集プロファイルを示し、凝集体に対応する１０ｍｌでのより小さいピークを示した。
【図5】免疫蛍光染色実験。全ての変異体は、陰性対照と比較して、凍結した同系Ｆ９奇形腫検体の血管構造を特異的に染色した。
【図6】ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍標的化。すべての変異体および陽性対照は、125Ｉで放射性ヨウ素化し、Ｆ９マウス奇形腫を皮下移植した免疫正常マウスに注射した（４～９μｇタンパク質／動物）。注射２４時間後に計測した放射能は、全ての変異体について腫瘍に蓄積を示した。しかしながら、「ＳＡＤ」変異体は、他の７つのクローンと比較して、腫瘍における優れた蓄積を示した（～２，９％ ＩＤ／ｇ（＝組織１ｇ当たりの注射量）対して、２番目に良いものは（Ｇ４Ｓ）3であり、～２，４％ ＩＤ／ｇを示す）。
【図7】ＩＬ－１２および抗フィブロネクチン抗体を用いた例示的免疫サイトカインフォーマット。
【図8】ＩＬ－１２および抗フィブロネクチン抗体を用いた例示的免疫サイトカインフォーマット。
【図9】異なる融合タンパク質のＳＥＣ分析。（Ａ）ｈｕＩＬ－１２Ｌ１９Ｌ１９「ＳＡＤ」バッチＡ、（Ｂ）ｈｕＩＬ－１２Ｌ１９Ｌ１９「ＳＡＤ」バッチＢ、（Ｃ）ｈｕＩＬ－１２Ｌ１９Ｌ１９「Ｏｌｄ」バッチＡ（Ｄ）ｈｕＩＬ－１２Ｌ１９Ｌ１９「Ｏｌｄ」バッチＢ。
【図10】Ｂｉａｃｏｒｅの実験。「ＳＡＤ」変異体は、フィブロネクチン７Ｂ８９ドメインに対する「Ｏｌｄ」リンカーを有する変異体と比較して、改善された見かけの親和性を有することを示した（３．８ｎＭ対６．７ｎＭ）。リンカーの変異はタンパク質の安定性に影響を及ぼすが、通常はその標的に対する親和性には影響しないので、この驚くべき結果は予想外である。
【図11】ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍標的化実験。「ＳＡＤ」変異体および「Ｏｌｄ」変異体は、125Ｉで放射性ヨウ素化され、Ｆ９マウス奇形腫を皮下移植した免疫適格マウスに注射（１０～１１μｇタンパク質／動物）された。「ＳＡＤ」変異体は、「ｏｌｄ」リンカー変異体と比較して、腫瘍標的化能が改善されることを示した。
【0040】
詳細な説明
＜定義＞
「抗体」とは、四量体構造単位を含む免疫グロブリンファミリーの分子を指し、各四量体は、２対の同一のポリペプチド鎖から構成され、各対は、１つの「軽鎖」（約２５ｋＤ）および１つの「重鎖」（約５０～７０ｋＤ）を有し、ジスルフィド結合を通して連結される。認識される免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はκまたはλのいずれかに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、εに分類され、そしてこれらは免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥをそれぞれ定義する。抗体は、任意のアイソタイプ／分類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ）、または任意のサブ分類（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）であり得る。
＜定義＞
「抗体」とは、四量体構造単位を含む免疫グロブリンファミリーの分子を指し、各四量体は、２対の同一のポリペプチド鎖から構成され、各対は、１つの「軽鎖」（約２５ｋＤ）および１つの「重鎖」（約５０～７０ｋＤ）を有し、ジスルフィド結合を通して連結される。認識される免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はκまたはλのいずれかに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、εに分類され、そしてこれらは免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥをそれぞれ定義する。抗体は、任意のアイソタイプ／分類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ）、または任意のサブ分類（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）であり得る。
【0041】
軽鎖及び重鎖はどちらも構造的相同性と機能的相同性の領域に分けられる。用語「定常」および「可変」は、構造的および機能的に使用される。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識を担う約１００～１１０以上のアミノ酸の可変（Ｖ）領域またはドメインを規定する。可変軽鎖（ＶL）と可変重鎖（ＶH）という用語は、それぞれ軽鎖と重鎖のこれらの領域を指す。ＶHとＶLの対合は一緒になって単一の抗原結合部位を形成する。Ｖ領域に加えて、Ｈ鎖およびＬ鎖の両方は定常（Ｃ）領域またはドメインを含む。免疫グロブリンＣ領域の分泌型は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、任意にＣＨ４（Ｃμ）、およびヒンジ領域の３つのＣドメインから形成される。免疫グロブリンＣ領域の膜結合型も膜ドメインと細胞内ドメインをもっている。それぞれの各軽鎖は、Ｎ－末端にＶLがあり、その反対側に定常領域（Ｃ）が続く。軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、経胎盤移動、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学的性質を与える。慣例により、定常領域ドメインの番号付けは、抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠位になるにつれて増加する。Ｎ末端は可変領域であり、Ｃ末端は定常領域である。ＣＨ３およびＣＬドメインは、それぞれ重鎖および軽鎖のカルボキシ末端ドメインを実際に構成する。ＶＬはＶＨと並んでおり、ＣＬは重鎖の第１の定常ドメインと並んでいる。本明細書中で使用される「抗体」は、従来の抗体構造および抗体の変異体を包含する。したがって、本概念の範囲内には、完全長抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、およびそれらの抗体断片がある。
【0042】
抗体は、完全免疫グロブリン鎖として、または種々のペプチダーゼで消化することによって産生される多くのよく特徴づけられた抗体断片として存在する。本明細書中で使用される用語「抗体断片」は、抗原のエピトープと特異的に相互作用する能力（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間的分布による）を保持する抗体の１つ以上の部分を指す。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域内のジスルフィド連結の下で抗体を消化し、それ自身がジスルフィド結合によってＶH－ＣH１に連結された軽鎖であるＦａｂ’の二量体であるＦ（ａｂ）’2を生成する。Ｆ（ａｂ）’2は、緩やかな条件下で還元されて、ヒンジ領域におけるジスルフィド連結が切断され、それによりＦ（ａｂ）’2二量体をＦａｂ’単量体に変換することができる。Ｆａｂ´単量体は、本質的にヒンジ領域の一部を有するＦａｂである。Paul, Fundamental Immunology 3d ed.(1993).種々の抗体断片は、インタクトな抗体の消化の観点から定義されるが、当業者は、このような断片が、化学的に、または組換えＤＮＡ方法論を使用することによって、新規に合成され得ることを認識するであろう。本明細書で使用される「抗体断片」とは、抗体全体の修飾によって産生されるか、または結合特異性および機能的活性を保持する組換えＤＮＡ方法論を用いて新規に合成される抗体の１つまたは複数の部分を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ断片、一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｄ（ＶｈおよびＣＨ１ドメイン）、ｄＡｂ（Ｖｈおよび単離されたＣＤＲ）；ダイアボディおよび一本鎖ダイアボディ；ならびに同じ結合特異性を有するこれらの断片の多量体型（例えば、Ｆ（ａｂ’）2,）が挙げられる。抗体断片はまた、本発明において提供される結合特異性および活性を達成するために、サイトカイン移植タンパク質に組み込まれ得る。
【0043】
本明細書で使用される「Ｆａｂ」ドメインは、重鎖可変ドメイン、定常領域ＣＨ１ドメイン、軽鎖可変ドメイン、および軽鎖定常領域ＣＬドメインを含む。ドメインの相互作用は、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインの間のジスルフィド結合によって安定化される。いくつかの実施形態において、Ｆａｂの重鎖ドメインは、Ｎ末端からＣ末端の順番で、ＶＨ－ＣＨであり、Ｆａｂの軽鎖ドメインは、Ｎ末端からＣ末端の順番で、ＶＬ－ＣＬである。いくつかの実施形態において、Ｆａｂの重鎖ドメインは、Ｎ末端からＣ末端の順番で、ＣＨ－ＶＨであり、Ｆａｂの軽鎖ドメインは順番に、ＣＬ－ＶＬである。Ｆａｂは歴史的にはインタクト免疫グロブリンのパパイン消化によって同定されたが、本開示の文脈では、「Ｆａｂ」は、典型的には、いずれの方法により組換えで産生される。それぞれのＦａｂ断片は、抗原結合に関して一価である。すなわち、それは単一の抗原結合部位を有する。
【0044】
「相補性決定ドメイン」または「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）は同義的に、ＶLおよびＶHの超可変領域を指す。ＣＤＲは、このような標的タンパク質に対する特異性を有する抗体鎖の標的タンパク質結合部位である。それぞれのヒトのＶLやＶHには３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１－３、Ｎ－末端から順番に番号付けされている）があり、可変領域の約１５～２０％を構成している。ＣＤＲは標的タンパク質のエピトープと構造的に相補的であるため、結合特異性に直接関与している。ＶLまたはＶHの残りの領域、いわゆるフレームワーク領域（ＦＲ）は、アミノ酸配列の変動が少ない(Kuby, Immunology, 4th ed., Chapter 4. W.H. Freeman & Co., New York, 2000)。
【0045】
ＣＤＲおよびフレームワーク領域の位置は、当技術分野における様々な周知の定義、例えば、Kabat, Chothia, international ImMunoGeneTics database (IMGT) 及びＡｂＭを用いて決定することができる（例えば Johnson et al., Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature, 342:877-883 (1989); Chothia et al., J. Mol. Biol., 227:799-817 (1992); Al-Lazikani et al., J.Mol.Biol., 273:927-748 (1997)を参照）。抗原結合部位の定義については、以下の文献にも記載されている：Ruiz et al., Nucleic Acids Res., 28:219-221 (2000); 及び Lefranc, M.P., Nucleic Acids Res., 29:207-209 (2001); MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996); 及び Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989); Martin et al., Methods Enzymol., 203:121-153 (1991); 及び Rees et al., In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141-172 (1996)。
【0046】
Ｋａｂａｔでは、ＶHのＣＤＲアミノ酸残基は３１－３５（ＨＣＤＲ１）、５０－６５（ＨＣＤＲ２）、９５－１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けされ、ＶLのＣＤＲアミノ酸残基は２４－３４（ＬＣＤＲ１）、５０－５６（ＬＣＤＲ２）、８９－９７（ＬＣＤＲ３）と番号付けされている。Ｃｈｏｔｈｉａでは、ＶH中のＣＤＲアミノ酸は２６－３２（ＨＣＤＲ１）、５２－５６（ＨＣＤＲ２）、９５－１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けされ、ＶL中のアミノ酸残基は２６－３２（ＬＣＤＲ１）、５０－５２（ＬＣＤＲ２）、９１－９６（ＬＣＤＲ３）と番号付けされている。ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの両方のＣＤＲ定義を組み合わせることにより、ＣＤＲは、ヒトＶＨにおけるアミノ酸残基２６～３５（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）、および９５～１０２（ＨＣＤＲ３）と、ヒトＶＬにおけるアミノ酸残基２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）、および８９～９７（ＬＣＤＲ３）からなる。
【0047】
本明細書中で使用される「抗体可変軽鎖」または「抗体可変重鎖」は、それぞれＶLまたはＶHを含むポリペプチドを指す。内因性ＶLは遺伝子セグメントＶ（可変）とＪ（接合）により、内因性ＶHはＶ，Ｄ（多様性），およびＪによりコードされている。ＶLまたはＶHのそれぞれには、フレームワーク領域（ＦＲ）だけでなく、ＣＤＲも含まれる。用語「可変領域」または「Ｖ領域」は同義的に、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を含む重鎖または軽鎖を意味する。Ｖ領域は、天然に存在するか、組換えまたは合成され得る。本出願において、抗体軽鎖および／または抗体重鎖は、時々、「抗体鎖」と総称され得る。本明細書に提供され、さらに記載されるように、「抗体可変軽鎖」または「抗体可変重鎖」および／または「可変領域」および／または「抗体鎖」は、任意にＣＤＲに挿入されたサイトカインポリペプチド配列を含む。
【0048】
例えばＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む、本明細書で開示される免疫グロブリン重鎖のＣ末端部分は、「Ｆｃ」ドメインである。本明細書で使用される「Ｆｃ領域」は、第１の定常領域（ＣＨ１）免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を指す。Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、およびＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、およびこれらのドメインに対する柔軟なヒンジＮ末端を指す。ＩｇＡおよびＩｇＭ Ｆｃについては、Ｊ鎖を含むことができる。ＩｇＧについては、Ｆｃは免疫グロブリンドメインＣγ２およびＣγ３、ならびにＣγ１とＣγのヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、そのカルボキシル末端に対する残基Ｃ２２６またはＰ２３０を含むと定義され、番号付けは、Ｋａｂａｔら（1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va.）におけるようにＥＵインデックスに従うと理解される。「Ｆｃ領域」は、抗体または抗体断片との関連において、単離されたこの領域またはこの領域を指すことができる。「Ｆｃ領域」は、例えば、エフェクター機能を調節する修飾を含む、ＣＨ２およびＣＨ３領域における、Ｆｃ領域の天然に存在する対立遺伝子変異体を含む。Ｆｃ領域には、生物学的機能に変化をもたらさない変異体も含まれる。例えば、１つ以上のアミノ酸は、生物学的機能の実質的な喪失なしに、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端から欠失される。たとえば、特定の実施形態ではＣ末端のリジンが修飾されたり除去されたりする。特定の実施形態では、Ｆｃ領域の１つまたは複数のＣ末端残基が改変または除去される。特定の実施形態では、Ｆｃの１つ以上のＣ末端残基（例えば、末端リシン）が欠失している。特定の他の実施形態では、Ｆｃ中の１以上のＣ末端残基は、別のアミノ酸で置換される（例えば、末端リジンが置換される）。このような変異体は、活性に対して最小限の影響を有するように、当技術分野で公知の一般的規則に従って選択される（例えば、Bowie, et al., Science 247:306-1310,1990を参照）。Ｆｃドメインは、ＦｃＲなどの細胞受容体によって認識され、補体活性化タンパク質であるＣ１ ｑが結合する免疫グロブリン（Ｉｇ）の部分である。ＣＨ２エキソンの５´部分にコードされているヒンジ下部領域は、ＦｃＲ受容体に結合するための抗体内の柔軟性を提供する。
【0049】
「キメラ抗体」とは、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が、異なるもしくは改変されたクラス、エフェクター機能および／または種の定常領域、またはキメラ抗体に新たな特性を付与する全く異なる分子（例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、および薬物）に連結されるように、定常領域またはその部分が改変され、置換され、または交換された抗体分子であるか；または（ｂ）可変領域またはその部分が、異なるもしくは改変された抗原特異性を有する可変領域で改変され、置換され、または交換された抗体分子である。
【0050】
「ヒト化」抗体は、ヒトにおいて免疫原性が低い一方で、非ヒト抗体の反応性（例えば、結合特異性、活性）を保持する抗体である。これは、例えば、ヒト以外のＣＤＲ領域を保持し、抗体の残りの部分をヒト対応物と置換することによって達成することができる。例えば、以下を参照することができる：Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)。
【0051】
「ヒト抗体」は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト由来の配列に由来する可変領域を有する抗体を含む。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域は、ヒト配列、例えば、ヒト生殖細胞系列配列、またはヒト生殖細胞系列配列の突然変異型、またはヒトフレームワーク配列分析に由来するコンセンサスフレームワーク配列を含むまたは抗体（例えば、Ｋｎａｐｐｉｋら（J. Mol. Biol. 296:57-86, 2000）に記載されている）に由来する。ヒト抗体は、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのランダムまたは部位特異的突然変異誘発またはｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞突然変異によって導入された突然変異、または安定性もしくは製造を促進するための保存的置換）を含み得る。
【0052】
「単離された」という用語は、核酸またはタンパク質に適用された場合、核酸またはタンパク質が、それが自然状態で関連する他の細胞成分を本質的に含まないことを意味する。それは、均一な状態にあることが望ましい。それは、乾燥溶液または水溶液のいずれかであり得る。純度および均質性は、典型的には、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高性能液体クロマトグラフィーを使用して決定される。調製物中に存在する優勢な種であるタンパク質を実質的に精製する。特に、単離された遺伝子は、遺伝子に隣接し、目的の遺伝子以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離される。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲル中で本質的に１つのバンドを生じることを意味する。特に、それは、核酸またはタンパク質が少なくとも８５％純粋であり、より好ましくは少なくとも９５％純粋であり、最も好ましくは少なくとも９９％純粋であることを意味する。
【0053】
用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）およびそのポリマーの一本鎖または二本鎖形態のいずれかを指す。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの公知のアナログを含有する核酸を包含する。特に明記しない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に修飾された変異体（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オーソログ、ＳＮＰ、および相補的配列、ならびに明示的に示された配列も潜在的に包含する。具体的には、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの３番目の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換される配列を生成することによって、縮重コドン置換を達成することができる（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); 及び Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。
【0054】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書中、アミノ酸残基のポリマーを意味するために同義的に使用される。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび非天然に存在するアミノ酸ポリマーの人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書中で使用されるように、「ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質」という用語は、全体として、またはその部分／断片によって、ＥＤＢに結合するペプチドまたはタンパク質、すなわち、フィブロネクチンを含むエクストラドメインＢに関連する。
【0055】
一般的に、ペプチドは、例えば、≧３アミノ酸残基および≦５０アミノ酸残基（したがって、オリゴまたはポリペプチド）の長さを有する単量体分子であってよく、一方、タンパク質は、例えば、≧５０アミノ酸残基の長さを有する各鎖１つ以上のタンパク質を有する単量体または二量体または高分子であってよい。
【0056】
用語「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタミン酸、およびＯ－ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を有する化合物、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合するα－炭素、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の全般的な化学構造とは異なっているが、天然に存在するアミノ酸と類似の様式で機能する構造を有する化合物を指す。
【0057】
「保存的に改変された変異体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用する。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードするか、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列をコードする核酸を意味する。遺伝暗号の縮重のために、機能的に同一な多数の核酸は、任意のタンパク質をコードする。たとえば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべてアミノ酸であるアラニンをコードしている。従って、コドンによりアラニンが指定される全ての位置で、コドンは、コードされたポリペプチドを改変することなく、対応する記載のコドンのいずれかに改変することができる。このような核酸変異は「サイレント変異」であり、これは保存的に修飾された変異の１種である。ポリペプチドをコードする本明細書中の全ての核酸配列は、核酸の全ての可能性のあるサイレント変異をさらに記載する。当業者は、機能的に同一の分子を取得するために、核酸中の各コドン（通常、メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常、トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾することができることは認識されよう。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載される配列の各々に内在している。
【0058】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされた配列中の単一のアミノ酸または少数の割合のアミノ酸を変化させ、付加または欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加が、化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす「保存的に修飾された変異体」であることを認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野でよく知られている。このような保存的に改変された変異体は、多型変異体、種間ホモログ、および対立遺伝子に加えられ、それらを除外しない。以下の８つの群は、各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照のこと）。
【0059】
この文脈において、本明細書中で使用される「保存的アミノ酸置換」は、非保存的置換よりも抗体機能に対するより小さな効果を有する。アミノ酸の分類にはいろいろな方法があるが、それらの構造とＲ基の全般的な化学的性質に基づいて、しばしば６つの主要な群に分類される。
【0060】
いくつかの実施形態において、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。例えば、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、
・塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、
・酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、
・非電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、
・非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、
・β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および
・芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。
・塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、
・酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、
・非電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、
・非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、
・β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および
・芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。
【0061】
他の保存されたアミノ酸置換は、ペプチドの電荷を修飾するためにアスパラギンをアスパラギン酸に置換する場合のように、アミノ酸側鎖ファミリーを横切って起こることもできる。保存的変化には、さらに、化学的に相同な非天然アミノ酸（すなわち、ロイシンの代わりに合成非天然疎水性アミノ酸、トリプトファンの代わりに合成非天然芳香族アミノ酸）の置換を含むことができる。
【0062】
「配列同一性のパーセンテージ」は、比較窓上で２つの最適に並べられた配列を比較することによって決定され、ここで、比較窓におけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのために、付加または欠失を含まない参照配列（例えば、ポリペプチド）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、両配列において同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定して一致位置の数を得、一致位置の数を比較窓における位置の総数で除し、結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
【0063】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列との関連において、「同一」またはパーセント「同一性」という用語は、同一配列である２つ以上の配列または部分配列を指す。比較窓、または次の配列比較アルゴリズムの１つを使用して、または手動の位置合わせと目視検査で測定された指定領域で最大の対応を比較して位置合わせした場合、２つの配列が同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドの指定されたパーセンテージを持つ場合（つまり、指定された領域全体、または指定されていない場合は、参照配列の配列全体にわたって、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性）、２つの配列は「実質的に同一」である。開示は、本明細書に例示される、それぞれポリペプチドまたはポリヌクレオチドと実質的に同一であるポリペプチドまたはポリヌクレオチドを提供する。任意に、同一性は、長さが少なくとも約１５、２５または５０ヌクレオチドである領域にわたって、またはより好ましくは長さが１００～５００または１０００またはそれ以上のヌクレオチドである領域にわたって、または参照配列の完全長にわたって存在する。アミノ酸配列に関して、同一性または実質的同一性は、長さが少なくとも５、１０、１５または２０アミノ酸、場合によっては長さが少なくとも約２５、３０、３５、４０、５０、７５または１００アミノ酸、場合によっては長さが少なくとも約１５０、２００または２５０アミノ酸、または参照配列の全長にわたる領域にわたって存在することができる。より短いアミノ酸配列、例えば２０以下のアミノ酸配列に関しては、本明細書で定義される保存的置換に従って、１または２個のアミノ酸残基が保存的に置換された場合、実質的な同一性が存在する。
【0064】
用語「対象」、「患者」および「個体」は同義的に、哺乳動物、例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類哺乳動物を意味する。哺乳動物は、実験哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスターでもよい。いくつかの実施態様において、哺乳動物は、畜産哺乳動物（例えば、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ラクダ科動物）又は家畜哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ）であり得る。
【0065】
本明細書中、用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、疾病または障害について、いくつかの実施形態において、疾病又は障害を改善すること（すなわち、疾患の発症またはその臨床症状の少なくとも１つを鈍化させるか、停止させるか、減少させる）を指す。別の実施形態において、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、患者によって識別できない可能性のあるものを含む少なくとも１つの身体的パラメータを緩和させるか、または改善することを指す。さらに別の実施形態において、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、疾病または障害を身体的に（例えば、識別可能な症状の安定化）、生理学的に（例えば、身体的パラメータの安定化）、またはその両方のいずれかで調節することを指す。さらに別の実施形態において、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「予防的治療（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」は、疾病または障害の発症の発症または進行または増悪を予防すること、または遅延させることを指す。
【0066】
「併用投与する」という用語は、個体中に２つの（またはそれ以上の）活性剤が同時に存在することを意味する。併用投与される活性剤は、同時または連続的に送達することができる。
【0067】
本発明の種々の態様は、以下のセクションで詳細に記載される。セクションの使用は、本発明を制限することを意図したものではない。各セクションは、本発明の任意の態様に適用することができる。本発明は、記載された組成物の特定の構成要素部分または記載された方法のプロセスステップに限定されず、組成物および方法は変化し得る。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載する目的のためであり、限定することを意図したものではないことも理解されたい。
【0068】
本明細書及び付属の請求項において用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「Ｔｈｅ」には、文脈が明確に他のことを規定していない限り、単数及び／又は複数の指示対象を含んでいる。本出願においては、特に断りがない限り、「又は」の使用は、「及び／又は」を意味する。さらに、数値によって区切られるパラメータ範囲が与えられる場合、その範囲は、これらの限界値を含むものとみなされることを理解されたい。本明細書に引用される全ての技術の開示は、その全体が参照により援用される。
【0069】
本明細書中で使用される用語「ＧＳリンカー」は、主に、または排他的に、グリシンおよびセリン残基からなるペプチドリンカーに関する（「Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカー」とも呼ばれる）。異なる実施形態において、ＧＳリンカーは、配列番号２、６または８のいずれかにおいて本明細書に記載されたリンカーである。
【0070】
本明細書中で使用される「保存的アミノ酸置換」は、非保存的置換よりも抗体機能に及ぼす効果が小さい。アミノ酸の分類にはいろいろな方法があるが、それらの構造とＲ基の全般的な化学的性質に基づいて、しばしば６つの主要な群に分類される。
【0071】
本明細書中で使用される用語「標的結合親和性」は、本発明による結合分子の標的に対する親和性を指し、「ＫＤ」値を用いて数値的に表される。一般に、より高い「ＫＤ」値がより弱い結合に相当する。いつくかの実施態様において「ＫＤ」は、放射性標識抗原結合アッセイ（ＭＡ）または、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）－２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）－３０００を用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイによって測定される。特定の実施形態において、「ｏｎ－ｒａｔｅ」または「ｒａｔｅ ｏｆ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ」または「ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ」または「ｋｏｎ」および「ｏｆｆ－ｒａｔｅ」または「ｒａｔｅ ｏｆ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ」または「ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ」または「ｋｏｆｆ」も、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法によって測定される。追加の実施形態では、「ＫＤ」、「ｋｏｎ」および「ｋｏｆｆ」がＯｃｔｅｔ（登録商標）システムを使用して測定される。
【0072】
本明細書中で使用される「結合について競合する」という用語は、上記の配列によって定義される抗体の１つに関して使用され、これは、実際の抗体が、前記配列によって定義された抗体と同様に、同じ標的、または標的エピトープまたはドメインもしくはサブドメインに結合する活性であることを意味し、後者の変異体である。結合の効率（例えば、動力学または熱力学）は、後者の効率と同じか、またはそれより大きいか、またはそれより小さいことができる。例えば、基質への結合のための平衡結合定数は、２つの抗体について異なり得る。
【0073】
本明細書中で使用される用語「所定の標的に結合する能力を維持する」とは、例えば、それぞれの変異体が非修飾ペプチドのそれと比較して≧５０％の標的結合親和性を有することを意味する。
ＥＤＢフィブロネクチン
ＥＤＢフィブロネクチン
【0074】
フィブロネクチン（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０２７５１）は、インテグリンと呼ばれる膜貫通受容体タンパク質に結合する細胞外マトリックスの高分子量（～４４０ｋＤａ）糖タンパク質である。インテグリンと同様に、フィブロネクチンはコラーゲン、フィブリン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（シンデカンなど）などの細胞外マトリックス成分と結合する。
【0075】
フィブロネクチンはがん発生に関与している。肺がんでは、特に非小細胞肺がんでフィブロネクチン発現が増加している。肺がん細胞のフィブロネクチンへの接着は、腫瘍形成性を増強し、アポトーシス誘導化学療法剤に対する耐性を付与する。フィブロネクチンは、肺腫瘍の増殖／生存および治療に対する抵抗性を促進する可能性があり、新しい抗がん剤の開発のための新規標的となることが議論されている。
【0076】
フィブロネクチンはタンパク質二量体として存在し、二つのほぼ同一の単量体が一対のジスルフィド結合で連結されている。フィブロネクチンタンパク質は単一の遺伝子から産生されるが、その前駆体ｍＲＮＡの選択的スプライシングは、１コピーのフィブロネクチン遺伝子から産生され、ＥＤＡ、ＥＤＢおよびＩＩＩＣＳドメインをコードする３つの部位で起こり、複数のアイソフォームが作られる。
【0077】
ＥＤＡまたはＥＤＢドメインを含むフィブロネクチンアイソフォームは、胚発生におけるそれらの重要性および正常成体組織におけるそれらの制限された存在のために、腫瘍胎児型として知られる。これらのアイソフォームはまた、血管新生の重要なマーカーとして認識されており、これは発生における重要な生理学的過程であり、がんの進行において腫瘍細胞によって必要とされる。ＥＤ－Ｂフィブロネクチンは、腫瘍組織、特に乳がん、脳腫瘍、リンパ腫細胞、および前立腺がんにおいて発現される。その組織特異的発現プロファイルのため、ＥＤ－Ｂフィブロネクチンは、治療標的化のために利用する魅力的な腫瘍抗原である。
【0078】
ＩＬ－１２
インターロイキン－１２は、免疫系に対して複数の生物学的効果を有するヘテロ二量体サイトカインである。ｐ３５とｐ４０の２つのサブユニットからなり、いずれもＩＬ－１２の活性型であるｐ７０の分泌に必要である。インターロイキン‐１２は樹状細胞（ＤＣ）に作用し、成熟と抗原提示の増加を導き、これは腫瘍特異的抗原に対するＴ細胞応答の開始を可能にすることができる。また、ＤＣによるＩＬ－１２の分泌を促し、応答を増幅するポジティブフィードバック機構を作り出す。いったん応答が開始されると、ＩＬ－１２は免疫系をＴｈ１サイトカインプロファイルに向かわせ、ＣＤ４＋Ｔ細胞にインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）を分泌させ、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞応答を導くという基本的な役割を果たす。
インターロイキン－１２は、免疫系に対して複数の生物学的効果を有するヘテロ二量体サイトカインである。ｐ３５とｐ４０の２つのサブユニットからなり、いずれもＩＬ－１２の活性型であるｐ７０の分泌に必要である。インターロイキン‐１２は樹状細胞（ＤＣ）に作用し、成熟と抗原提示の増加を導き、これは腫瘍特異的抗原に対するＴ細胞応答の開始を可能にすることができる。また、ＤＣによるＩＬ－１２の分泌を促し、応答を増幅するポジティブフィードバック機構を作り出す。いったん応答が開始されると、ＩＬ－１２は免疫系をＴｈ１サイトカインプロファイルに向かわせ、ＣＤ４＋Ｔ細胞にインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）を分泌させ、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞応答を導くという基本的な役割を果たす。
【0079】
ＩＬ－１２はまた、ＩＦＮ－γと結合する腫瘍壊死因子－Alpha（ＴＮＦ－α）を含む他のサイトカインの分泌を導く強力な炎症誘発性サイトカインであり、ＣＤ４＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の発生の前提条件である。さらに、ＩＬ－１２は、ＩＦＮ－γおよび他のサイトカインの誘導を介して、マクロファージおよび好酸球などの自然免疫細胞の活性化を促進することができる。その後、この活性化は、これらの細胞によるＩＬ－１２分泌を導き、自然応答および獲得応答の両方のさらなる増幅を導く。しかしながら、高レベルのＩＬ－１２、ひいてはＩＦＮ－γもまた、ＩＬ－１０のようなアンタゴニスト分子の誘導およびＳＴＡＴ４のようなＩＬ－１２の下流のシグナル伝達分子の枯渇と関連している。
【0080】
ＩＬ－１２を治療薬として利用する以前の試みは、ＩＬ－１２が、しばしば、許容できない毒性副作用、例えば、発熱、疲労、血液学的変化、高血糖、および／または臓器機能不全を伴う、せいぜい控えめなの抗腫瘍効果を示し、不成功であった。
【0081】
本明細書中で使用される「ｐ３５」は、以下に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％（８０％）の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する：
ＲＮＬＰＶＡＴＰＤＰＧＭＦＰＣＬＨＨＳＱＮＬＬＲＡＶＳＮＭＬＱＫＡＲＱＴＬＥＦＹＰＣＴＳＥＥＩＤＨＥＤＩＴＫＤＫＴＳＴＶＥＡＣＬＰＬＥＬＴＫＮＥＳＣＬＮＳＲＥＴＳＦＩＴＮＧＳＣＬＡＳＲＫＴＳＦＭＭＡＬＣＬＳＳＩＹＥＤＬＫＭＹＱＶＥＦＫＴＭＮＡＫＬＬＭＤＰＫＲＱＩＦＬＤＱＮＭＬＡＶＩＤＥＬＭＱＡＬＮＦＮＳＥＴＶＰＱＫＳＳＬＥＥＰＤＦＹＫＴＫＩＫＬＣＩＬＬＨＡＦＲＩＲＡＶＴＩＤＲＶＭＳＹＬＮＡＳ（配列番号３）．
ＲＮＬＰＶＡＴＰＤＰＧＭＦＰＣＬＨＨＳＱＮＬＬＲＡＶＳＮＭＬＱＫＡＲＱＴＬＥＦＹＰＣＴＳＥＥＩＤＨＥＤＩＴＫＤＫＴＳＴＶＥＡＣＬＰＬＥＬＴＫＮＥＳＣＬＮＳＲＥＴＳＦＩＴＮＧＳＣＬＡＳＲＫＴＳＦＭＭＡＬＣＬＳＳＩＹＥＤＬＫＭＹＱＶＥＦＫＴＭＮＡＫＬＬＭＤＰＫＲＱＩＦＬＤＱＮＭＬＡＶＩＤＥＬＭＱＡＬＮＦＮＳＥＴＶＰＱＫＳＳＬＥＥＰＤＦＹＫＴＫＩＫＬＣＩＬＬＨＡＦＲＩＲＡＶＴＩＤＲＶＭＳＹＬＮＡＳ（配列番号３）．
【0082】
本明細書中で使用される「ｐ４０」は、以下に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％（８０％）の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する：
ＩＷＥＬＫＫＤＶＹＶＶＥＬＤＷＹＰＤＡＰＧＥＭＶＶＬＴＣＤＴＰＥＥＤＧＩＴＷＴＬＤＱＳＳＥＶＬＧＳＧＫＴＬＴＩＱＶＫＥＦＧＤＡＧＱＹＴＣＨＫＧＧＥＶＬＳＨＳＬＬＬＬＨＫＫＥＤＧＩＷＳＴＤＩＬＫＤＱＫＥＰＫＮＫＴＦＬＲＣＥＡＫＮＹＳＧＲＦＴＣＷＷＬＴＴＩＳＴＤＬＴＦＳＶＫＳＳＲＧＳＳＤＰＱＧＶＴＣＧＡＡＴＬＳＡＥＲＶＲＧＤＮＫＥＹＥＹＳＶＥＣＱＥＤＳＡＣＰＡＡＥＥＳＬＰＩＥＶＭＶＤＡＶＨＫＬＫＹＥＮＹＴＳＳＦＦＩＲＤＩＩＫＰＤＰＰＫＮＬＱＬＫＰＬＫＮＳＲＱＶＥＶＳＷＥＹＰＤＴＷＳＴＰＨＳＹＦＳＬＴＦＣＶＱＶＱＧＫＳＫＲＥＫＫＤＲＶＦＴＤＫＴＳＡＴＶＩＣＲＫＮＡＳＩＳＶＲＡＱＤＲＹＹＳＳＳＷＳＥＷＡＳＶＰＣＳ（配列番号１）．
ＩＷＥＬＫＫＤＶＹＶＶＥＬＤＷＹＰＤＡＰＧＥＭＶＶＬＴＣＤＴＰＥＥＤＧＩＴＷＴＬＤＱＳＳＥＶＬＧＳＧＫＴＬＴＩＱＶＫＥＦＧＤＡＧＱＹＴＣＨＫＧＧＥＶＬＳＨＳＬＬＬＬＨＫＫＥＤＧＩＷＳＴＤＩＬＫＤＱＫＥＰＫＮＫＴＦＬＲＣＥＡＫＮＹＳＧＲＦＴＣＷＷＬＴＴＩＳＴＤＬＴＦＳＶＫＳＳＲＧＳＳＤＰＱＧＶＴＣＧＡＡＴＬＳＡＥＲＶＲＧＤＮＫＥＹＥＹＳＶＥＣＱＥＤＳＡＣＰＡＡＥＥＳＬＰＩＥＶＭＶＤＡＶＨＫＬＫＹＥＮＹＴＳＳＦＦＩＲＤＩＩＫＰＤＰＰＫＮＬＱＬＫＰＬＫＮＳＲＱＶＥＶＳＷＥＹＰＤＴＷＳＴＰＨＳＹＦＳＬＴＦＣＶＱＶＱＧＫＳＫＲＥＫＫＤＲＶＦＴＤＫＴＳＡＴＶＩＣＲＫＮＡＳＩＳＶＲＡＱＤＲＹＹＳＳＳＷＳＥＷＡＳＶＰＣＳ（配列番号１）．
【0083】
本明細書中で使用される「ＩＬ－１２」は、（ｉ）下記（ａ）および（ｂ）の両方を含むポリペプチドを意味し、
並びに（ｉｉ）ＩＬ－１２受容体を活性化することができる：
（ａ）ｐ３５、またはその断片であって、ｐ３５が、下記に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％（８０％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む：
ＲＮＬＰＶＡＴＰＤＰＧＭＦＰＣＬＨＨＳＱＮＬＬＲＡＶＳＮＭＬＱＫＡＲＱＴＬＥＦＹＰＣＴＳＥＥＩＤＨＥＤＩＴＫＤＫＴＳＴＶＥＡＣＬＰＬＥＬＴＫＮＥＳＣＬＮＳＲＥＴＳＦＩＴＮＧＳＣＬＡＳＲＫＴＳＦＭＭＡＬＣＬＳＳＩＹＥＤＬＫＭＹＱＶＥＦＫＴＭＮＡＫＬＬＭＤＰＫＲＱＩＦＬＤＱＮＭＬＡＶＩＤＥＬＭＱＡＬＮＦＮＳＥＴＶＰＱＫＳＳＬＥＥＰＤＦＹＫＴＫＩＫＬＣＩＬＬＨＡＦＲＩＲＡＶＴＩＤＲＶＭＳＹＬＮＡＳ（配列番号３）
および
（ｂ）ｐ４０、またはその断片であって、ｐ４０が、下記に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％（８０％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む：
ＩＷＥＬＫＫＤＶＹＶＶＥＬＤＷＹＰＤＡＰＧＥＭＶＶＬＴＣＤＴＰＥＥＤＧＩＴＷＴＬＤＱＳＳＥＶＬＧＳＧＫＴＬＴＩＱＶＫＥＦＧＤＡＧＱＹＴＣＨＫＧＧＥＶＬＳＨＳＬＬＬＬＨＫＫＥＤＧＩＷＳＴＤＩＬＫＤＱＫＥＰＫＮＫＴＦＬＲＣＥＡＫＮＹＳＧＲＦＴＣＷＷＬＴＴＩＳＴＤＬＴＦＳＶＫＳＳＲＧＳＳＤＰＱＧＶＴＣＧＡＡＴＬＳＡＥＲＶＲＧＤＮＫＥＹＥＹＳＶＥＣＱＥＤＳＡＣＰＡＡＥＥＳＬＰＩＥＶＭＶＤＡＶＨＫＬＫＹＥＮＹＴＳＳＦＦＩＲＤＩＩＫＰＤＰＰＫＮＬＱＬＫＰＬＫＮＳＲＱＶＥＶＳＷＥＹＰＤＴＷＳＴＰＨＳＹＦＳＬＴＦＣＶＱＶＱＧＫＳＫＲＥＫＫＤＲＶＦＴＤＫＴＳＡＴＶＩＣＲＫＮＡＳＩＳＶＲＡＱＤＲＹＹＳＳＳＷＳＥＷＡＳＶＰＣＳ（配列番号１）。
並びに（ｉｉ）ＩＬ－１２受容体を活性化することができる：
（ａ）ｐ３５、またはその断片であって、ｐ３５が、下記に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％（８０％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む：
ＲＮＬＰＶＡＴＰＤＰＧＭＦＰＣＬＨＨＳＱＮＬＬＲＡＶＳＮＭＬＱＫＡＲＱＴＬＥＦＹＰＣＴＳＥＥＩＤＨＥＤＩＴＫＤＫＴＳＴＶＥＡＣＬＰＬＥＬＴＫＮＥＳＣＬＮＳＲＥＴＳＦＩＴＮＧＳＣＬＡＳＲＫＴＳＦＭＭＡＬＣＬＳＳＩＹＥＤＬＫＭＹＱＶＥＦＫＴＭＮＡＫＬＬＭＤＰＫＲＱＩＦＬＤＱＮＭＬＡＶＩＤＥＬＭＱＡＬＮＦＮＳＥＴＶＰＱＫＳＳＬＥＥＰＤＦＹＫＴＫＩＫＬＣＩＬＬＨＡＦＲＩＲＡＶＴＩＤＲＶＭＳＹＬＮＡＳ（配列番号３）
および
（ｂ）ｐ４０、またはその断片であって、ｐ４０が、下記に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％（８０％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む：
ＩＷＥＬＫＫＤＶＹＶＶＥＬＤＷＹＰＤＡＰＧＥＭＶＶＬＴＣＤＴＰＥＥＤＧＩＴＷＴＬＤＱＳＳＥＶＬＧＳＧＫＴＬＴＩＱＶＫＥＦＧＤＡＧＱＹＴＣＨＫＧＧＥＶＬＳＨＳＬＬＬＬＨＫＫＥＤＧＩＷＳＴＤＩＬＫＤＱＫＥＰＫＮＫＴＦＬＲＣＥＡＫＮＹＳＧＲＦＴＣＷＷＬＴＴＩＳＴＤＬＴＦＳＶＫＳＳＲＧＳＳＤＰＱＧＶＴＣＧＡＡＴＬＳＡＥＲＶＲＧＤＮＫＥＹＥＹＳＶＥＣＱＥＤＳＡＣＰＡＡＥＥＳＬＰＩＥＶＭＶＤＡＶＨＫＬＫＹＥＮＹＴＳＳＦＦＩＲＤＩＩＫＰＤＰＰＫＮＬＱＬＫＰＬＫＮＳＲＱＶＥＶＳＷＥＹＰＤＴＷＳＴＰＨＳＹＦＳＬＴＦＣＶＱＶＱＧＫＳＫＲＥＫＫＤＲＶＦＴＤＫＴＳＡＴＶＩＣＲＫＮＡＳＩＳＶＲＡＱＤＲＹＹＳＳＳＷＳＥＷＡＳＶＰＣＳ（配列番号１）。
【0084】
リンカー
特定の実施形態において、１つ以上のペプチドリンカーは、（Ｇｌｙn－Ｓｅｒ）m配列、（Ｇｌｙn－Ａｌａ）m配列、または（Ｇｌｙn－Ｓｅｒ）m／（Ｇｌｙn－Ａｌａ）m配列の任意の組合せから独立に選択される。ここで、それぞれのｎは、１から５までの整数であり、それぞれのｍは、０から１０までの整数である。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは（Ｇｌｙ4－Ｓｅｒ）mであり、ここで、ｍは０から１０までの整数である。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは（Ｇｌｙ4－Ａｌａ）mであり、ここで、ｍは０～１０の整数である。リンカーの例としては、限定されるわけではないが、特定の実施形態には、Ｇ4Ｓ反復、例えば、Ｇｌｙ－ＳｅｒリンカーＧＧＧＧＳ（配列番号３４）、またはｍが１以上の正の整数である（ＧＧＧＧＳ）mが含まれる。たとえば、ｍ＝１、ｍ＝２、ｍ＝３、ｍ＝４、ｍ＝５およびｍ＝６、ｍ＝７、ｍ＝８、ｍ＝９およびｍ＝１０である。いくつかの実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）3又は（ＧＧＧＳ）4を含むがこれに限定されない、ＧＧＧＧＳ（配列番号３４）の複数の反復を含む。いくつかの実施形態において、Ｓｅｒは、Ａｌａに置換することができる。例えば、（ＧＧＧＧＡ）のようなリンカーＧ／Ａ（配列番号３５）、または（ＧＧＧＧＡ）mで、ここでｍは１以上の正の整数である。いくつかの実施形態において、リンカーは、ＧＧＧＧＡ（配列番号３５）の複数の反復を含む。他の実施形態では、リンカーは、組合せおよび複数のＧＧＧＧＳ（配列番号３４）、およびＧＧＧＧＡ（配列番号３５）を含む。
特定の実施形態において、１つ以上のペプチドリンカーは、（Ｇｌｙn－Ｓｅｒ）m配列、（Ｇｌｙn－Ａｌａ）m配列、または（Ｇｌｙn－Ｓｅｒ）m／（Ｇｌｙn－Ａｌａ）m配列の任意の組合せから独立に選択される。ここで、それぞれのｎは、１から５までの整数であり、それぞれのｍは、０から１０までの整数である。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは（Ｇｌｙ4－Ｓｅｒ）mであり、ここで、ｍは０から１０までの整数である。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは（Ｇｌｙ4－Ａｌａ）mであり、ここで、ｍは０～１０の整数である。リンカーの例としては、限定されるわけではないが、特定の実施形態には、Ｇ4Ｓ反復、例えば、Ｇｌｙ－ＳｅｒリンカーＧＧＧＧＳ（配列番号３４）、またはｍが１以上の正の整数である（ＧＧＧＧＳ）mが含まれる。たとえば、ｍ＝１、ｍ＝２、ｍ＝３、ｍ＝４、ｍ＝５およびｍ＝６、ｍ＝７、ｍ＝８、ｍ＝９およびｍ＝１０である。いくつかの実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）3又は（ＧＧＧＳ）4を含むがこれに限定されない、ＧＧＧＧＳ（配列番号３４）の複数の反復を含む。いくつかの実施形態において、Ｓｅｒは、Ａｌａに置換することができる。例えば、（ＧＧＧＧＡ）のようなリンカーＧ／Ａ（配列番号３５）、または（ＧＧＧＧＡ）mで、ここでｍは１以上の正の整数である。いくつかの実施形態において、リンカーは、ＧＧＧＧＡ（配列番号３５）の複数の反復を含む。他の実施形態では、リンカーは、組合せおよび複数のＧＧＧＧＳ（配列番号３４）、およびＧＧＧＧＡ（配列番号３５）を含む。
【0085】
いくつかの実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２）を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列ＧＳＡＤＧＧＳＳＡＧＧＳＤＡＧ（配列番号４）を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列ＧＳＳＧＧ（配列番号６）を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列ＳＳＳＳＧＳＳＳＳＧＳＳＳＳＧ（配列番号８）を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＡＫＧＧＧＧＫＡＧＧＧＳ（配列番号９）を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＤＧＧＧＧＤＧＧＧＧＳ（配列番号１０）を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１）を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号１２）を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号１３）を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列ＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰ（配列番号１４）を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列ＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰ（配列番号１５）を含む。
【0086】
抗ＥＤＢ結合ＩＬ－１２
本発明は、とりわけ、がんを含むＥＤＢ－フィブロネクチンの発現に関連する疾患または障害を治療するための方法および組成物を提供する。本明細書に記載されるのは、ＩＬ－１２のがん指向性送達を達成するための標的としてフィブロネクチンを利用する新しい組成物および方法である。このアプローチは、全身毒性を減少させ、ＩＬ－１２の治療域を増加させる一方で、ＩＬ－１２の治療可能性を十分に利用することを約束する。
ＩＬ－１２およびＥＤＢフィブロネクチン標的化ドメインを含む他の構築物は以前に記載されているが、現在開示されている組成物は驚くほど優れている。
本発明は、とりわけ、がんを含むＥＤＢ－フィブロネクチンの発現に関連する疾患または障害を治療するための方法および組成物を提供する。本明細書に記載されるのは、ＩＬ－１２のがん指向性送達を達成するための標的としてフィブロネクチンを利用する新しい組成物および方法である。このアプローチは、全身毒性を減少させ、ＩＬ－１２の治療域を増加させる一方で、ＩＬ－１２の治療可能性を十分に利用することを約束する。
ＩＬ－１２およびＥＤＢフィブロネクチン標的化ドメインを含む他の構築物は以前に記載されているが、現在開示されている組成物は驚くほど優れている。
【0087】
ＷＯ２００６／１１９８９７は、その内容が本明細書に参照により援用されており、「Ｌ１９」と名付けられたＥＤＢフィブロネクチン標的化抗体と結合したＩＬ－１２の３つの異なった分子フォーマットを開示している。
【0088】
１つのフォーマットは、図７Ａに示されるように、ｓｃ（ＩＬ－１２）－ｓｃＦｖ（Ｌ１９）であった。このフォーマットは、２つのサブユニットがペプチドリンカーを介して連結され、次いで、ＩＬ－１２が、第２のペプチドリンカーを介して（したがって、「一本鎖」ＩＬ－１２、またはｓｃ（ＩＬ－１２））、一本鎖ＦｖフォーマットにもあるＬ１９抗体に連結されるＩＬ－１２ヘテロ二量体からなる（したがって、ｓｃＦｖ（Ｌ１９））。このフォーマットは、従来技術の知見と一致して、控えめな腫瘍標的化能を示した。
別のフォーマットは、図７Ｂに示されるように、ｓｃ（ＩＬ－１２）－ＳＩＰ（Ｌ１９）のホモ二量体であった。ＳＩＰフォーマット（「小免疫タンパク質」）は、出願人によりＷＯ２００３／０７６４６９において開発されており、「ミニ抗体」ともニックネームが付けられている。ＳＩＰは、ＣＨ４ドメインに結合したｓｃＦｖを含む２つのサブユニットからなるホモ二量体である。二つのＣＨ４ドメインはジスルフィド架橋によって互いに結合している。Ｌ１９の腫瘍標的化特性がＳＩＰフォーマットを用いて改善され得るという先行技術の指摘にもかかわらず、このコンジュゲートの腫瘍取り込みの増加は観察されなかった。
別のフォーマットは、図７Ｂに示されるように、ｓｃ（ＩＬ－１２）－ＳＩＰ（Ｌ１９）のホモ二量体であった。ＳＩＰフォーマット（「小免疫タンパク質」）は、出願人によりＷＯ２００３／０７６４６９において開発されており、「ミニ抗体」ともニックネームが付けられている。ＳＩＰは、ＣＨ４ドメインに結合したｓｃＦｖを含む２つのサブユニットからなるホモ二量体である。二つのＣＨ４ドメインはジスルフィド架橋によって互いに結合している。Ｌ１９の腫瘍標的化特性がＳＩＰフォーマットを用いて改善され得るという先行技術の指摘にもかかわらず、このコンジュゲートの腫瘍取り込みの増加は観察されなかった。
【0089】
別のフォーマットは、ジスルフィド架橋によって互いに結合したＩＬ－１２ｐ４０およびｐ３５サブユニットのヘテロ二量体であり、それぞれのサブユニットがｓｃＦｖ（Ｌ１９）に融合し、図７Ｃに示されるように、ｓｃＦｖ（Ｌ１９）－ｐ３５／ｐ４０－ｓｃＦｖ（Ｌ１９）ヘテロ二量体を形成した。このヘテロ二量体フォーマットにより、腫瘍への取り込みの著明な改善が得られた。
【0090】
その内容が本明細書に参照により援用されるＷＯ２０１３／０１４１４９において、出願人は、「Ｆ８」と名付けられた抗体と名付けられた抗ＥＤＡフィブロネクチン腫瘍標的化抗体に結合したＩＬ－１２の２つの新たな代替分子フォーマットを開示している。
【0091】
その中で、ＩＬ－１２免疫コンジュゲートのもう一つのフォーマットは、「一本鎖ダイアボディ」を含む。本質的には、短い－５アミノ酸－リンカーをもつ２つのｓｃＦｖ抗体（したがって「ダイアボディ」を形成する）が、より長い－１５アミノ酸－ペプチドリンカーによって互いに結合したものからなる。
【0092】
単一特異性Ｆ８一本鎖ダイアボディ（図８Ｂ参照）に融合したＩＬ－１２を特徴とする分子フォーマットは、腫瘍標的化の点で、（ｉ）ｓｃＦｖ（Ｆ８）－ｐ３５／ｐ４０－ｓｃＦｖ（Ｆ８）ヘテロ二量体（図８Ａ）このヘテロ二量体（そのＬ１９変異体において、ＷＯ２００６／１１９８９７に開示された最良のフォーマットであることが証明された）、または（ｉｉ）ダイアボディに結合した２つのＩＬ－１２分子（図８Ｃ）のいずれよりも優れていることが示された。
【0093】
Ｌ１９
本明細書で使用する「Ｌ１９抗体」とは、ＥＤＢフィブロネクチンまたはその任意の部分に結合し、以下のアミノ酸配列の１つ以上と少なくとも７５％（７５％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む任意の抗体を意味する：
Ｌ１９ ＶＨ （配列番号７）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
Ｌ１９ ＶＬ （配列番号５）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＹＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＴＧＲＩＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＣＤＲ１ ＶＨ （配列番号２８）
ＳＦＳＭＳ
ＣＤＲ２ ＶＨ （配列番号２９）
ＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧ
ＣＤＲ３ ＶＨ （配列番号３０）
ＰＦＰＹＦＤＹ
ＣＤＲ１ ＶＬ （配列番号３１）
ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＦＬＡ
ＣＤＲ２ ＶＬ （配列番号３２）
ＹＡＳＳＲＡＴ
ＣＤＲ３ ＶＬ （配列番号３３）
ＱＱＴＧＲＩＰＰＴ
Ｌ１９ ダイアボディ（配列番号３６）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＳＳＧＧＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＹＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＴＧＲＩＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
本明細書で使用する「Ｌ１９抗体」とは、ＥＤＢフィブロネクチンまたはその任意の部分に結合し、以下のアミノ酸配列の１つ以上と少なくとも７５％（７５％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む任意の抗体を意味する：
Ｌ１９ ＶＨ （配列番号７）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
Ｌ１９ ＶＬ （配列番号５）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＹＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＴＧＲＩＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＣＤＲ１ ＶＨ （配列番号２８）
ＳＦＳＭＳ
ＣＤＲ２ ＶＨ （配列番号２９）
ＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧ
ＣＤＲ３ ＶＨ （配列番号３０）
ＰＦＰＹＦＤＹ
ＣＤＲ１ ＶＬ （配列番号３１）
ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＦＬＡ
ＣＤＲ２ ＶＬ （配列番号３２）
ＹＡＳＳＲＡＴ
ＣＤＲ３ ＶＬ （配列番号３３）
ＱＱＴＧＲＩＰＰＴ
Ｌ１９ ダイアボディ（配列番号３６）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＳＳＧＧＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＹＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＴＧＲＩＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
【0094】
医薬組成物
本発明のさらなる態様は、本発明の少なくとも１つのコンジュゲートおよび任意に薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。
本発明の医薬組成物は、典型的には、治療的有効量の本発明のコンジュゲートと、任意に、薬学的に許容される賦形剤などの添加物質とを含む。前記医薬組成物は、医薬当業者で周知の方法で調製される。担体または賦形剤は、活性成分のビヒクルまたは媒体として機能し得る液状物質であってもよい。適当な担体または賦形剤は当技術分野で周知であり、例えば、安定剤、抗酸化剤、ｐＨ調節物質、放出制御賦形剤を含む。
本発明のさらなる態様は、本発明の少なくとも１つのコンジュゲートおよび任意に薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。
本発明の医薬組成物は、典型的には、治療的有効量の本発明のコンジュゲートと、任意に、薬学的に許容される賦形剤などの添加物質とを含む。前記医薬組成物は、医薬当業者で周知の方法で調製される。担体または賦形剤は、活性成分のビヒクルまたは媒体として機能し得る液状物質であってもよい。適当な担体または賦形剤は当技術分野で周知であり、例えば、安定剤、抗酸化剤、ｐＨ調節物質、放出制御賦形剤を含む。
【0095】
本発明の薬学的調製物は、例えば、非経口的使用に適合され得、溶液などの形態で患者に投与され得る。本発明の組成物を含む組成物を患者に投与することができる。投与は、好ましくは「治療的有効量」であり、これは、患児に利益を示すのに充分である。このような利益は、少なくとも１つの症状の改善であり得る。実際に投与される量、および投与の割合およびタイムコースは、治療されるものの性質および重症度に依存するであろう。治療の処方、例えば用量に関する決定などは、総合診療医や他の医師の責務の範囲内である。治療は、医師の判断で、毎日、週２回、週１回、または月１回の間隔で繰り返すことができる。
【0096】
経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、粉末剤または液体剤形であってもよい。錠剤は、ゼラチンまたは補助剤のような固体担体を含むことができる。液体医薬組成物は、一般に、水、鉱油、動物油または植物油、鉱油または合成油のような液体担体を含む。生理食塩液、デキストロース又は他の糖類溶液又はグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールを含むことができる。
【0097】
静脈内注射または罹患部位への注射の場合、活性成分は、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する、非経口的に許容可能な水溶液の形成である。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液のような等張ビヒクルを用いて適当な溶液を調製することができる。必要に応じて、防腐剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤および／または他の添加剤を含めてもよい。
【0098】
さらに、本明細書に開示される実施形態は、互いに関連しない個々の実施形態として理解されることを意味しないことを理解されたい。特有の実施形態で議論される特徴は、本明細書に示される他の実施形態に関連するとしても開示されることを意味する。ある事例では、特定の特徴が、一実施形態では開示されていないが、別の実施形態で開示されている場合は、当業者は、前記特徴が前記他の実施形態で開示されるものではないことを必ずしも意味しないことを理解されよう。当業者であれば、他の実施形態についても前記特徴を開示することが本出願の主旨であるが、単に明瞭にするため、及び本明細書を管理可能な量に維持するために、これが行われていないことを理解されよう。
【0099】
さらに、本明細書で参照する文献の内容を参照により援用する。これは、特に、標準的または通常方法を開示する先行技術文献を指す。その場合、参照による援用は、主に十分な開示を可能にし、長い反復を避ける目的がある。
【0100】
一般に、本発明の組成物は、標的構造がＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質の特異性によって規定される、細胞、組織、臓器または患者における特異的標的構造に結合することができる。
【0101】
標的に到達すると、ＩＬ－１２はＴ細胞やナチュラルキラー細胞からのＩＦＮγの産生を刺激し、Ｔｈ１ヘルパー細胞の分化も誘導する。ＩＬ－１２は、自然免疫および細胞性免疫の重要なメディエーターである。構築物中のＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質が、標的構造、例えば、腫瘍、血液疾患、またはがんに変化する過程にある細胞を特徴付けるレセプターまたは細胞外マトリックスタンパク質に特異的である場合、組成物の結合は、ＩＬ－１２媒介の強力な抗がん剤および抗転移活性を誘発する。
【0102】
本出願人らは、ＧＳＡＤＧＧＳＳＡＧＧＳＤＡＧを含むアミノ酸モチーフを含むリンカーを用いて、ＩＬ－１２をＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質（すなわち、ＷＯ２０１３／０１４１４９に開示されているようなダイアボディ）に結合させると、より優れた腫瘍標的性能ならびに優れた産生収率が達成され得ることを驚くべきことに発見した。同時に、この変異体の結合挙動は、より短いＧＳＡＤＧＧリンカーの結合挙動よりも優れており、本願明細書中「Ｏｌｄ」とニックネームされ、ＷＯ２０１３／０１４１４９に開示されている。
【0103】
本出願人らは、サイトカインとＬ１９一本鎖ダイアボディ間の異なったポリペプチドリンカーを有する一本鎖ダイアボディフォーマット（ｈｕＩＬ－１２Ｌ１９Ｌ１９）において、Ｌ１９抗体に結合したヒトＩＬ－１２の８つのクローンを最初に評価し、特徴付けた。
【0104】
（ｉ）「ＡＫＫＡＳ」（ｉｉ）「ＤＤＳ」（ｉｉｉ）「（Ｇ４Ｓ）3」（ｉｖ）「ＳＡＤ」および（ｖ）「ＳＥＳ」とニックネームをつけた５つのクローンは、免疫サイトカインの組換え抗体への接合のためのリンカーを含み、それらの異なった電荷特性（中性、正電荷、負電荷）のために選択されている。
（ｖｉ）Alpha３（ｖｉｉ）ＡＰ６および（ｖｉｉｉ）ＡＰ７とニックネームをつけた３つの追加クローンを開発した。これら３つのクローンに関しては、Ｃｈｅｎら（２０１３）で報告されている原理を考慮し、実施した。このレビューは、堅いリンカーがより良好な安定性を有し、サイトカインと抗体の間の正しい距離を維持し、従って治療効果を増加する可能性を示唆する。
リンカー（ｉ）～（ｖｉｉｉ）のいずれも、この特異的免疫サイトカインにおいて以前に試験されていなかった。
（ｖｉ）Alpha３（ｖｉｉ）ＡＰ６および（ｖｉｉｉ）ＡＰ７とニックネームをつけた３つの追加クローンを開発した。これら３つのクローンに関しては、Ｃｈｅｎら（２０１３）で報告されている原理を考慮し、実施した。このレビューは、堅いリンカーがより良好な安定性を有し、サイトカインと抗体の間の正しい距離を維持し、従って治療効果を増加する可能性を示唆する。
リンカー（ｉ）～（ｖｉｉｉ）のいずれも、この特異的免疫サイトカインにおいて以前に試験されていなかった。
【0105】
「ＳＡＤ」リンカーは、（ｉｉｉ）他のクローンと比較してＥＤ－Ｂに対する結合挙動を損ないことなしに、（ｉ）腫瘍標的化性能および（ｉｉ）ＥＤＢ結合ドメインを含むペプチドまたはタンパク質に結合したＩＬ－１２の産生収率を他のクローンと比較して大きく増強することが、驚くべきことに見出された。これは、Ｃｈｅｎによって報告された原理の考察にもかかわらず、ＳＡＤリンカーのみが、「Ｏｌｄ」クローン（以下により詳細に記載）および本明細書に記載される他の新規変異体の両方と比較した場合、多くの優れた特性を有する組成物をもたらしたことは、全く驚くべきことである。
【0106】
最後に、ＷＯ２０１３／０１４１４９に開示されたリンカーを含む「Ｏｌｄ」とニックネームを付けられた９番目のクローンを「ＳＡＤ」リンカーと比較したところ、配列の最初の部分を「Ｏｌｄ」リンカーと共有しているにもかかわらず、「ＳＡＤ」リンカーがＥＤ－Ｂに対して優れた結合親和性を有することが驚くべきことに見出された。
【0107】
さらに、サイズ排除クロマトグラフィー後、「ＳＡＤ」リンカーは、「Ｏｌｄ」リンカーと比較してより高い単量体部分を示し、これは、全体コンジュゲートの集合がより効率的であることを意味し、「ＳＡＤ」リンカーによって与えられるより高い単量体部分は、全体製造収率を増加させると予想される。
【0108】
本明細書中で使用される用語「一本鎖ダイアボディ」は、以下のスキーム（Ｎ－＞Ｃ配向）：Ｌ１９ＶＨ－リンカー３－Ｌ１９ＶＬ－リンカー４－Ｌ１９ＶＨ－リンカー３－Ｌ１９ＶＬに従って、短いリンカー、好ましくは３～１０アミノ酸長、より好ましくは５アミノ酸長を有する２つの一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体（「ダイアボディ」としても知られる）が、より長いリンカー、好ましくは５～２０アミノ酸長、より好ましくは１５アミノ酸長によって互いに連結された構築物に関する。
【0109】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ヘテロ二量体ＩＬ－１２タンパク質の第１のサブユニットはｐ４０であり、第２のサブユニットはｐ３５である。前述したように、ＥＤＡまたはＥＤＢドメインを含むフィブロネクチンアイソフォームは、正常の成体組織における限定された存在とは対照的に、それらの発生上の重要性および腫瘍におけるそれらの再発現のために、腫瘍胎児型として知られている。
【0110】
これらのアイソフォームはまた、血管新生の重要なマーカーとして認識されており、これは発生における重要な生理学的過程であり、がんの進行において腫瘍細胞によって必要とされる。
【0111】
したがって、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）は、本明細書で考察するような免疫サイトカインの使用を含む、抗がん治療のための魅力的な標的である。
【0112】
本発明のいくつかの実施形態によれば、一本鎖ダイアボディは、相補性決定領域（ＣＤＲ）、または目的の抗原に特異的に結合することが可能な抗体のＶＨおよび／またはＶＬドメイン、例えばフィブロネクチンのエクストラドメインＢの抗原に特異的に結合することが可能な抗体の１つ以上のＣＤＲまたはＶＨおよび／またはＶＬドメインを有する抗原結合部位を含み得る。
【0113】
抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列によって提供され得る。ＣＤＲまたはＣＤＲのセットを運ぶ構造は、一般に、ＣＤＲまたはＣＤＲのセットが、再配列された免疫グロブリン遺伝子によってコードされる天然に存在するＶＨおよびＶＬ抗体可変ドメインのＣＤＲまたはＣＤＲのセットに対応する位置に位置する抗体重鎖または軽鎖配列またはその実質的部分である。免疫グロブリン可変ドメインの構造および位置は、Kabatら(1987) (Sequences of Proteins of Immunological Interest.4 th Edition.US Department of Health and Human Services.)およびその最新情報を参考にして決定することができる。最新情報は、現在インターネット上で入手可能である（ａｔ ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ又は任意の検索エンジンを使用して「Ｋａｂａｔ」を検索）。
【0114】
ＣＤＲ領域またはＣＤＲにより、Kabatら（１９８７）「Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4thEdition, US Department of Health and Human Services」 Kabat et al., (1991a)「Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5thEdition, US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington, and later editions」により定義された免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の超可変領域を指すことが意図される。抗体は、典型的には、３つの重鎖ＣＤＲおよび３つの軽鎖ＣＤＲを含む。ここで、ＣＤＲまたはＣＤＲｓという用語は、当該抗原またはそれが認識するエピトープに対する抗体の親和性によって結合にかかわっているアミノ酸残基の大部分を含むこれらの領域の１つ、または全体を、ケースに応じて示すために使用される。
【0115】
したがって、一本鎖ダイアボディは、１、２、３、４、５または６個のＣＤＲ、または抗体Ｌ１９のＶＨおよび／またはＶＬドメインを有する抗原結合部位を含み得る。
【0116】
本発明のいくつかの実施形態によれば、一本鎖ダイアボディは、配列番号２８～３３に記載の抗体Ｌ１９の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗原結合部位を含み得る。抗原結合部位は、それぞれ、配列番号７および５に記載された抗体Ｌ１９のＶＨおよび／またはＶＬドメインを含むことができる。
【0117】
抗原結合部位は、抗体Ｌ１９の１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含み得る。Ｌ１９のＣＤＲのアミノ酸配列は、
配列番号２８（ＶＨ ＣＤＲ１）；
配列番号２９（ＶＨ ＣＤＲ２）；
配列番号３０（ＶＨ ＣＤＲ３）；
配列番号３１（ＶＬ ＣＤＲ１）；
配列番号３２（ＶＬ ＣＤＲ２）および／または
配列番号３３（ＶＬ ＣＤＲ３）である。
配列番号２８（ＶＨ ＣＤＲ１）；
配列番号２９（ＶＨ ＣＤＲ２）；
配列番号３０（ＶＨ ＣＤＲ３）；
配列番号３１（ＶＬ ＣＤＲ１）；
配列番号３２（ＶＬ ＣＤＲ２）および／または
配列番号３３（ＶＬ ＣＤＲ３）である。
【0118】
配列番号２８～３０は、ヒトモノクローナル抗体Ｌ１９のＶＨ ＣＤＲ領域（それぞれ１～３）のアミノ酸配列である。配列番号３１～３３は、ヒトモノクローナル抗体Ｌ１９のＶＬ ＣＤＲ領域（それぞれ１～３）のアミノ酸である。抗体Ｌ１９のＶＨおよびＶＬドメインのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号７および５に対応する。
【0119】
本発明のいくつかの実施形態によれば、一本鎖ダイヤボディは、
ａ）本明細書中で配列番号２８－３０として定義される３つの重鎖ＣＤＲおよび本明細書中で配列番号３１－３３として定義される３つの軽鎖ＣＤＲを含むセット、
ｂ）本明細書中で配列番号７として定義されるＶＨ中の３つの重鎖ＣＤＲおよび本明細書中で配列番号５として定義されるＶＬ中の３つの軽鎖ＣＤＲのセット、
ｃ）フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する能力を維持しながら、ＣＤＲの少なくとも１つがａ）またはｂ）で指定されたそれぞれのＣＤＲに対して最大３つのアミノ酸置換を持っているという条件付きの、ａ）またはｂ）の重鎖ＣＤＲ／軽鎖ＣＤＲの組合せ、
ｄ）フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する能力を維持しながら、ＣＤＲの少なくとも１つが、ａ）またはｂ）で指定されたそれぞれのＣＤＲに対して６６％以上の配列同一性を持っているという条件付きの、ａ）またはｂ）の重鎖ＣＤＲ／軽鎖ＣＤＲの組合せ、の少なくとも一つを含み、
ここで、ＣＤＲはフィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合することができるように、適切なタンパク質フレームワークに埋め込まれている。
ａ）本明細書中で配列番号２８－３０として定義される３つの重鎖ＣＤＲおよび本明細書中で配列番号３１－３３として定義される３つの軽鎖ＣＤＲを含むセット、
ｂ）本明細書中で配列番号７として定義されるＶＨ中の３つの重鎖ＣＤＲおよび本明細書中で配列番号５として定義されるＶＬ中の３つの軽鎖ＣＤＲのセット、
ｃ）フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する能力を維持しながら、ＣＤＲの少なくとも１つがａ）またはｂ）で指定されたそれぞれのＣＤＲに対して最大３つのアミノ酸置換を持っているという条件付きの、ａ）またはｂ）の重鎖ＣＤＲ／軽鎖ＣＤＲの組合せ、
ｄ）フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する能力を維持しながら、ＣＤＲの少なくとも１つが、ａ）またはｂ）で指定されたそれぞれのＣＤＲに対して６６％以上の配列同一性を持っているという条件付きの、ａ）またはｂ）の重鎖ＣＤＲ／軽鎖ＣＤＲの組合せ、の少なくとも一つを含み、
ここで、ＣＤＲはフィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合することができるように、適切なタンパク質フレームワークに埋め込まれている。
【0120】
いくつかの実施形態では、ＣＤＲの少なくとも１つは、それぞれのＣＤＲに対して、≧６７、好ましくは≧６８、より好ましくは≧６９、≧７０、≧７１、≧７２、≧７３、≧７４、≧７５、≧７６、≧７７、≧７８、≧７９、≧８０、≧８１、≧８２、≧８３、≧８４、≧８５、≧８６、≧８７、≧８８、≧８９、≧９０、≧９１、≧９２、≧９３、≧９４、≧９５、≧９６、≧９７、≧９８または最も好ましくは≧９９％の配列同一性を有する。
別の実施形態では、ＣＤＲの少なくとも１つは、親和性成熟または他の修飾によって修飾されており、上に開示された配列と比較して配列改変をもたらしている。
別の実施形態では、ＣＤＲの少なくとも１つは、親和性成熟または他の修飾によって修飾されており、上に開示された配列と比較して配列改変をもたらしている。
【0121】
いくつかの実施形態において、ＣＤＲの少なくとも１つは、ａ）またはｂ）に明記されるように、それぞれのＣＤＲに対して最大２、好ましくは１アミノ酸置換を有する。
【0122】
本発明のいくつかの実施形態によれば、一本鎖ダイアボディは、
ａ）配列番号７および５に記載の抗体Ｌ１９のＶＨおよびＶＬドメイン、
ｂ）ドメインの少なくとも１つがそれぞれ、配列番号７または配列番号５に対して≧８０％の配列同一性を有するという条件付きの、ａ）の重鎖／軽鎖可変ドメイン配列対、および／または
ｃ）ａ）の重鎖／軽鎖可変ドメイン配列対、および／またはｃ）ドメインがそれぞれ配列番号７または配列番号５に対して、１０までのアミノ酸置換を有するという条件付きの、ａ）の重鎖／軽鎖可変ドメイン配列対、のうちの少なくとも１つを含み、前記ドメインの少なくとも１つは、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する能力を維持する。
ａ）配列番号７および５に記載の抗体Ｌ１９のＶＨおよびＶＬドメイン、
ｂ）ドメインの少なくとも１つがそれぞれ、配列番号７または配列番号５に対して≧８０％の配列同一性を有するという条件付きの、ａ）の重鎖／軽鎖可変ドメイン配列対、および／または
ｃ）ａ）の重鎖／軽鎖可変ドメイン配列対、および／またはｃ）ドメインがそれぞれ配列番号７または配列番号５に対して、１０までのアミノ酸置換を有するという条件付きの、ａ）の重鎖／軽鎖可変ドメイン配列対、のうちの少なくとも１つを含み、前記ドメインの少なくとも１つは、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する能力を維持する。
【0123】
いくつかの実施形態において、ドメインの少なくとも１つは、それぞれ、≧８１、好ましくは≧８２、より好ましくは≧８３、≧８４、≧８５、≧８６、≧８７、≧８８、≧８９、≧９０、≧９１、≧９２、≧９３、≧９４、≧９５、≧９６、≧９７、≧９８または最も好ましくは≧９９％の配列同一性を、配列番号７または配列番号５に対して有する。
【0124】
いくつかの実施形態において、ドメインの少なくとも１つは、それぞれ、最大９個、好ましくは最大８個、より好ましくは最大７個、６個、５個、４個、３個または２個、および最も好ましくは最大１個のアミノ酸置換を、配列番号７または配列番号５に対して有する。
本発明のいくつかの実施形態によれば、一本鎖ダイアボディにおける少なくとも１つのアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、一本鎖ダイアボディにおける少なくとも１つのアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。
【0125】
さらなる一実施形態によれば、前記組成物は、全長構造「［ｐ４０］－［リンカー１］－［ｐ３５］－［ＳＡＤリンカー］－［Ｌ１９ＶＨ］－［リンカー３］－［Ｌ１９ＶＬ］－［リンカー４］－［Ｌ１９ＶＨ］－［リンカー３］－［Ｌ１９ＶＬ］」を有する。
１つのさらなる実施形態によれば、組成物は、配列番号１６による全長配列を有する。
１つのさらなる実施形態によれば、組成物は、配列番号１６による全長配列を有する。
【0126】
疾患
本発明のさらなる態様によれば、
・腫瘍性疾患と診断されているか、
・腫瘍性疾患に罹患してるか、または
・腫瘍性疾患を発症するリスクがある
ヒトまたは動物の対象の治療における、またはそのような状態の予防のための上記の組成物の（医薬品の製造のための）使用が提供される。
本発明のさらなる態様によれば、ヒトまたは動物の対象における血管新生の抑制における前記請求項のいずれかに記載の組成物の（医薬品の製造のための）使用。
本発明のさらなる態様によれば、
・腫瘍性疾患と診断されているか、
・腫瘍性疾患に罹患してるか、または
・腫瘍性疾患を発症するリスクがある
ヒトまたは動物の対象の治療における、またはそのような状態の予防のための上記の組成物の（医薬品の製造のための）使用が提供される。
本発明のさらなる態様によれば、ヒトまたは動物の対象における血管新生の抑制における前記請求項のいずれかに記載の組成物の（医薬品の製造のための）使用。
【0127】
したがって、本明細書に記載されるコンジュゲートは、ｉｎ ｖｉｖｏでＩＬ－１２を新生血管系に標的化することによって、腫瘍性疾患を治療するか、または血管新生を阻害する方法において使用され得る。
「腫瘍性疾患」という用語は、腫瘍および血液疾患を含む、悪性変質およびがんを包含する。
「腫瘍性疾患」という用語は、腫瘍および血液疾患を含む、悪性変質およびがんを包含する。
【0128】
また、薬剤、特に治療剤、例えばＩＬ－１２を患者の新生血管系に標的化することによって、がんを治療する方法、または血管新生を阻害する方法も考えられ、この方法は、本明細書に記載されるコンジュゲートの治療的有効量を患者に投与することを含む。本明細書に記載される組成物を用いて治療可能な状態には、がん、他の腫瘍および新生物状態が含まれる。該組成物は、血管新生を阻害し、それによってリウマチ関節炎、糖尿病性網膜症、加齢性筋肉変性、血管腫、腫瘍およびがんを治療するために使用され得る。治療には予防的治療が含まれる。前記組成物はまた、診断方法、例えば、上記条件のいずれかと関連し得る血管新生の標的化および診断において投与され得る。組成物に含まれるタンパク質治療薬または診断薬の性質、および標的化部分の特異性に応じて、他の疾患および状態を診断し、治療することもできる。
【0129】
本明細書に記載されるような治療に適したがんは、固形または非固形がんまたは悪性リンパ腫のいずれかの型を含み、特に肝がん、リンパ腫、白血病（例えば、急性骨髄性白血病）、肉腫、皮膚がん、膀胱がん、乳がん、子宮がん、卵巣がん、前立腺がん、肺がん、大腸がん、子宮頸がん、頭頸部がん、食道がん、膵臓がん、腎臓がん、胃がんおよび脳がんを含む。がんは家族性のことも散発性のこともある。がんは転移性のことも非転移性のこともある。
好ましくは、がんは、腎臓がん、乳がん、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、肉腫（例えば、消化管間質腫瘍）、皮膚がん（例えば、メラノーマ）、結腸直腸がん、および神経内分泌腫瘍の群から選択されるがんである。
いくつかの実施形態において、腫瘍性疾患は、ＥＤ－Ｂフィブロネクチンの発現または過剰発現によって特徴付けられる。
好ましくは、がんは、腎臓がん、乳がん、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、肉腫（例えば、消化管間質腫瘍）、皮膚がん（例えば、メラノーマ）、結腸直腸がん、および神経内分泌腫瘍の群から選択されるがんである。
いくつかの実施形態において、腫瘍性疾患は、ＥＤ－Ｂフィブロネクチンの発現または過剰発現によって特徴付けられる。
【0130】
本発明の組成物は、任意の適切な経路を介して、通常、血流中への注射および／または処理される部位、例えば、腫瘍または腫瘍血管系への直接的な注射によって、処理を必要とする患者に投与され得る。正確な投与量とその投与回数は、多くの因子、処理経路、処理対象となる領域（例えば、腫瘍）の大きさと位置に依存するであろう。
【0131】
反応性に関して、対象は、対象内のがんのパラメータ（例えば、血液がん、例えば、がん細胞の増殖、増殖および／または生存）が、任意の適切な測定によって、例えば質量、細胞数または体積によって決定されるとき、検出可能な量、例えば、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上遅延または減少される場合に、治療に反応する。１つの実施例では、対象が、治療が行われない場合に予測される平均余命を約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％以上延長した平均余命を経験した場合に、治療に反応する。別の実施例では、対象が無病生存率、全生存率または増悪までの期間が増加している場合、対象は治療に反応する。例えば、ＮＣＣＮ腫瘍診療ガイドライン（ＮＣＣＮガイドライン（登録商標））によって提供された基準を含む、患者が治療に反応するかどうかを決定するために、いくつかの方法を用いることができる。
【0132】
組合せ療法
組成物は、単独で、または他の治療と組合せて、同時に、または連続的に、治療される状態に依存して投与され得る。他の治療には、非ステロイド性抗炎症薬（例えば、アスピリン、イブプロフェンまたはケトプロフェン）のような適切な用量の疼痛緩和薬、またはモルヒネのようなオピエート、または制吐薬の投与が含まれ得る。
本発明のさらなる態様によれば、上記記載の組成物または医薬組成物と、１つ以上の治療的活性化合物との組合せが提供される。
組成物は、単独で、または他の治療と組合せて、同時に、または連続的に、治療される状態に依存して投与され得る。他の治療には、非ステロイド性抗炎症薬（例えば、アスピリン、イブプロフェンまたはケトプロフェン）のような適切な用量の疼痛緩和薬、またはモルヒネのようなオピエート、または制吐薬の投与が含まれ得る。
本発明のさらなる態様によれば、上記記載の組成物または医薬組成物と、１つ以上の治療的活性化合物との組合せが提供される。
【0133】
本発明のさらなる態様によれば、ＥＤ－Ｂフィブロネクチンの発現または過剰発現に関連する障害または状態を治療または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、組成物、医薬組成物または上記記載に従った組合せの有効量を投与することを含む方法が提供される。
【0134】
キット
本発明のさらなる態様によれば、
ａ）上記による組成物、医薬組成物または組合せ、
ｂ）組成物、組成物または組合せを投与するための装置、および
ｃ）使用説明書を含むパーツのキットが提供される。
本発明のさらなる態様によれば、
ａ）上記による組成物、医薬組成物または組合せ、
ｂ）組成物、組成物または組合せを投与するための装置、および
ｃ）使用説明書を含むパーツのキットが提供される。
【0135】
いくつかの実施形態において、このようなパーツのキットは、適切な患者用パンフレットを備えた薬剤充填済みシリンジを含む。別の実施形態では、このようなパーツのキットは、適当な使用者指示のある輸液ボトルを含む。
【0136】
キットの構成要素は、滅菌され、密封されたバイアルまたは他の容器中にあることが望ましい。
キットは、本明細書に記載される方法における成分の使用説明書をさらに含むことができる。キットの構成要素は、容器、例えばバッグ、箱、ジャー、缶またはブリスターパックに含まれていてもよく、包装されていてもよい。
キットは、本明細書に記載される方法における成分の使用説明書をさらに含むことができる。キットの構成要素は、容器、例えばバッグ、箱、ジャー、缶またはブリスターパックに含まれていてもよく、包装されていてもよい。
【実施例0137】
本発明は図面および前記の説明において詳細に図示および説明されてきたが、そのような図示および説明は例示または例示的であり、限定的ではないと考えられるべきであり、本発明は開示された実施形態に限定されない。開示される実施形態に対する他の変形形態は、図面、開示、及び添付の特許請求の範囲の研究から、請求される発明を実施する際に当業者によって理解され、実施され得る。特許請求の範囲において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、他の要素又はステップを排除するものではなく、不定冠詞「ａ（１つの）」又は「ａｎ（１つの）」は複数形を除外するものではない。特定の手段が相互に異なる従属請求項に列挙されているという単なる事実は、これらの手段の組合せを使用して利益を得ることができないことを示すものではない。特許請求の範囲のどの引用符号も、範囲を限定すると解釈するべきではない。
本明細書に開示される全てのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端まで示される；本明細書に開示される全ての核酸配列は、５´－＞３´で示される。
本明細書に開示される全てのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端まで示される；本明細書に開示される全ての核酸配列は、５´－＞３´で示される。
【0138】
実施例１
出願人らは驚くべきことに、特定のリンカーを用いてＩＬ－１２を一本鎖ダイアボディ（すなわち、ＷＯ２０１３／０１４１４９に開示された優れたフォーマット）に結合させると、より優れた腫瘍標的化性能ならびに優れた産生収率が達成され得ることを発見した。
出願人らは驚くべきことに、特定のリンカーを用いてＩＬ－１２を一本鎖ダイアボディ（すなわち、ＷＯ２０１３／０１４１４９に開示された優れたフォーマット）に結合させると、より優れた腫瘍標的化性能ならびに優れた産生収率が達成され得ることを発見した。
【0139】
出願人は、サイトカインとＬ１９一本鎖ダイアボディの間に異なったポリペプチドリンカーを有する一本鎖ダイアボディフォーマット（ｈｕＩＬ－１２Ｌ１９Ｌ１９）において、Ｌ１９抗体に結合したヒトＩＬ－１２の８つのクローンを評価し、特徴付けした。
【0140】
（ｉ）「ＡＫＫＡＳ」（ｉｉ）「ＤＤＳ」（ｉｉｉ）「（Ｇ４Ｓ）3」（ｉｖ）「ＳＡＤ」および（ｖ）「ＳＥＳ」とニックネームを付けられた５つのクローンは、免疫サイトカインを組換え抗体に接合させるためのリンカーを含み、それらの異なった電荷特性（中性、正電荷、負電荷）のために選択されている。
（ｖｉ）Alpha３（ｖｉｉ）ＡＰ６および（ｖｉｉｉ）ＡＰ７とニックネームを付けられた３つの追加クローンを開発した。これら３つのクローンに関して、Ｃｈｅｎら（２０１３）に報告された教示を検討し、実施した。このレビューは、堅い（ｒｉｇｉｄ）リンカーがより良好な安定性を有し、サイトカインと抗体の間の正しい距離を維持し、従って治療効果を増加する可能性を示唆する。
リンカー（ｉ）～（ｖｉｉｉ）のいずれも、この特異的免疫サイトカインにおいて以前に試験されていなかった。
（ｖｉ）Alpha３（ｖｉｉ）ＡＰ６および（ｖｉｉｉ）ＡＰ７とニックネームを付けられた３つの追加クローンを開発した。これら３つのクローンに関して、Ｃｈｅｎら（２０１３）に報告された教示を検討し、実施した。このレビューは、堅い（ｒｉｇｉｄ）リンカーがより良好な安定性を有し、サイトカインと抗体の間の正しい距離を維持し、従って治療効果を増加する可能性を示唆する。
リンカー（ｉ）～（ｖｉｉｉ）のいずれも、この特異的免疫サイトカインにおいて以前に試験されていなかった。
【0141】
驚くべきことに、「ＳＡＤ」リンカーは、他のクローンと比較してＥＤ－Ｂに等しく結合する能力がある一方で、一本鎖ダイアボディに結合したＩＬ－１２の腫瘍標的化性能および産生収率を大幅に増強することが見出された。
材料および方法
実施例で試験された変異体は、以下の一般的な構造を有する：
材料および方法
実施例で試験された変異体は、以下の一般的な構造を有する：
【表1】
【0142】
配列番号 異なる変異体（本明細書では「クローン」とも呼ばれる）は、表２に詳述されているように、リンカー２の配列が互いに異なる：
【表2】
【0143】
様々なリンカーをもつ８つの融合タンパク質のクローニング
ｈｕＩＬ－１２Ｌ１９Ｌ１９をコードする配列は、Ｌ１９抗体およびＩＬ１２ペイロードという異なったＰＣＲ断片を組み立てることによって作製された。Ｌ１９遺伝子を、適切なプライマーを用いて、あらかじめ生成された融合タンパク質Ｌ１９－ＩＬ２鋳型からＰＣＲ増幅した。第２のＬ１９遺伝子を適当なプライマーでＰＣＲ増幅した。
ｈｕＩＬ－１２Ｌ１９Ｌ１９をコードする配列は、Ｌ１９抗体およびＩＬ１２ペイロードという異なったＰＣＲ断片を組み立てることによって作製された。Ｌ１９遺伝子を、適切なプライマーを用いて、あらかじめ生成された融合タンパク質Ｌ１９－ＩＬ２鋳型からＰＣＲ増幅した。第２のＬ１９遺伝子を適当なプライマーでＰＣＲ増幅した。
【0144】
同時に、ＩＬ－１２のｐ３５ドメインの遺伝子の一部を、適切なプライマーを用いて、以前に生成されたＩＬ１２ベースの免疫サイトカインからＰＣＲ増幅した。２つの中間体断片をＰＣＲで（Ｐ３５－Ｌ１９断片を生成するため）組み立て、ＢａｍＨＩ／ＢｓｐＥＩで二重消化し、ｐ３５を含む二重消化ベクターにクローン化した。新たに作製したｐ３５－Ｌ１９ベクターをその後ＢｓｐＥＩ／ＮｏｔＩ－ＨＦで二重消化し、第２のＬ１９ダイアボディ断片遺伝子と連結した。断片ｐ３５－Ｌ１９Ｌ１９をＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ－ＨＦにより消化し、ｐ４０サブユニット遺伝子を有する前もって二重消化した哺乳動物細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）にクローン化し、完全長ＩＬ１２－Ｌ１９Ｌ１９を得た。
【0145】
断片「Ａ」（リンカーを有するｐ３５の一部をコード）、断片「Ｂ」（リンカーと抗体の一部をコード）のＰＣＲアッセンブリーにより、ＩＬ１２と一本鎖ダイアボディＬ１９断片の間に様々なリンカー挿入した。異なる断片「Ａ」と断片「Ｂ」は、適当なプライマーを用いて、鋳型としてＩＬ１２－Ｌ１９Ｌ１９から増幅した。
【0146】
クローンＡＰ７のためにデザインされたクローニング戦略は、突然変異体クローン（ＡＰ６と命名）の作製につながった。すべてのＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ－ＨＦおよびＢｓｐＥＩ制限酵素で二重消化し、Ｐ３５－Ｌ１９Ｌ１９ ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドに連結した。得られたプラスミドを増幅し、ＮｏｔＩ－ＨＦおよびＢａｍＨＩ－ＨＦ制限酵素で二重消化し、挿入断片をＩＬ１２を含むｐｃＤＮＡ３．１プラスミドにサブクローニングした。得られたＤＮＡプラスミドを増幅し、細胞トランスフェクションに用いた。
【0147】
様々なリンカー８つの融合タンパク質の発現精製
種々のヒトＩＬ－１２融合体の産生には、懸濁液中のＣＨＯ－Ｓ細胞を用いた。ｈｕＩＬ‐１２Ｌ１９Ｌ１９変異体は一過性遺伝子発現を用いて発現した。製造用４×１０6のＣＨＯ－Ｓ細胞を懸濁液中で１ｍｌ遠心分離し、ＣＨＯ－Ｓに適した培地１ｍＬに再懸濁した。次に、１００万細胞当たり、プラスミドＤＮＡの０．６２５μｇに続いて、２．５μｇのポリエチレンイミン（ＰＥＩ；ｐＨ７．０の１ｍｇ／ｍＬ水溶液）を細胞に加え、穏やかに混合した。トランスフェクトした培養物を、３１℃の振盪インキュベーターで６日間インキュベートした。
種々のヒトＩＬ－１２融合体の産生には、懸濁液中のＣＨＯ－Ｓ細胞を用いた。ｈｕＩＬ‐１２Ｌ１９Ｌ１９変異体は一過性遺伝子発現を用いて発現した。製造用４×１０6のＣＨＯ－Ｓ細胞を懸濁液中で１ｍｌ遠心分離し、ＣＨＯ－Ｓに適した培地１ｍＬに再懸濁した。次に、１００万細胞当たり、プラスミドＤＮＡの０．６２５μｇに続いて、２．５μｇのポリエチレンイミン（ＰＥＩ；ｐＨ７．０の１ｍｇ／ｍＬ水溶液）を細胞に加え、穏やかに混合した。トランスフェクトした培養物を、３１℃の振盪インキュベーターで６日間インキュベートした。
【0148】
最後に、一過性遺伝子発現により産生された融合タンパク質をタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーにより細胞培養培地から精製し、次いでＰＢＳに対して透析した。
【0149】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
融合タンパク質の正しい分子量を、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ１０％およびＳＤＳ‐ＰＡＧＥ１２％により還元および非還元条件下で分析した。
融合タンパク質の正しい分子量を、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ１０％およびＳＤＳ‐ＰＡＧＥ１２％により還元および非還元条件下で分析した。
【0150】
ＥＬＩＳＡ
種々のＩＬ－１２融合物の正しい結合を確認するために、Ｅｌｉｓａプレートを５０ｕｇ／ｍｌのフィブロネクチンドメイン７Ｂ８９で一晩コーティングした（参照、ＷＯ２００１／０６２８００Ａ１、その内容は参照により本明細書に援用される）。免疫サイトカインを１０ｕｇ／ｍｌおよび１ｕｇ／ｍｌで試験した。二次試薬として、タンパク質Ａ西洋ワサビペルオキシダーゼを用いた。このアッセイはＢＭＢｌｕｅ ＰＯＤ可溶性基質を用いて発色させた。３３３ｍＭのＨ2ＳＯ4を加えて比色反応を停止し、マイクロタイタープレートリーダーを用いて波長４５０ｎｍと６５０ｎｍで吸光度を測定した。
種々のＩＬ－１２融合物の正しい結合を確認するために、Ｅｌｉｓａプレートを５０ｕｇ／ｍｌのフィブロネクチンドメイン７Ｂ８９で一晩コーティングした（参照、ＷＯ２００１／０６２８００Ａ１、その内容は参照により本明細書に援用される）。免疫サイトカインを１０ｕｇ／ｍｌおよび１ｕｇ／ｍｌで試験した。二次試薬として、タンパク質Ａ西洋ワサビペルオキシダーゼを用いた。このアッセイはＢＭＢｌｕｅ ＰＯＤ可溶性基質を用いて発色させた。３３３ｍＭのＨ2ＳＯ4を加えて比色反応を停止し、マイクロタイタープレートリーダーを用いて波長４５０ｎｍと６５０ｎｍで吸光度を測定した。
【0151】
サイズ排除クロマトグラフィーとＢｉａｃｏｒｅ
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００増加カラムを用いたＡＫＴＡ ＦＰＬＣシステムでサイズ排除クロマトグラフィーを行った。表面プラズモン共鳴実験親和性測定を、フィブロネクチン７Ｂ８９ドメインコーティングＣＭ５チップ上、精製ｈｕＩＬ‐１２Ｌ１９Ｌ１９クローンで、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００装置により行った。試料は連続希釈として注入され、濃度範囲は１μＭから２５０ｎＭであった。
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００増加カラムを用いたＡＫＴＡ ＦＰＬＣシステムでサイズ排除クロマトグラフィーを行った。表面プラズモン共鳴実験親和性測定を、フィブロネクチン７Ｂ８９ドメインコーティングＣＭ５チップ上、精製ｈｕＩＬ‐１２Ｌ１９Ｌ１９クローンで、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００装置により行った。試料は連続希釈として注入され、濃度範囲は１μＭから２５０ｎＭであった。
【0152】
免疫蛍光
様々なｈｕＩＬ－１２融合体のがん細胞への結合能を確認するため、凍結同系Ｆ９奇形腫検体の凍結切片（８ｕｍ）上に免疫蛍光法を実施した。腫瘍切片は氷冷アセトン（５分）で固定した。固定後、カバースリップを洗浄し、ＰＢＳ中の２０％ウシ胎児血清で４５分間ブロッキングした。濃度５μｇ／ｍｌのＨｕＩＬ‐１２Ｌ１９Ｌ１９クローンを室温で１時間２％ ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液中に添加した。次に、カバースリップを、ＰＢＳで２回洗浄し、最終希釈１：１０００の二次抗体マウス抗ヒトインターロイキン－１２を２％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液中に室温で１時間添加した。その後、カバースリップを再度ＰＢＳで２回洗浄し、最終希釈１：５００の三次抗体ヤギ抗マウスを添加した。ＤＡＰＩを用いて核を対比染色した。
様々なｈｕＩＬ－１２融合体のがん細胞への結合能を確認するため、凍結同系Ｆ９奇形腫検体の凍結切片（８ｕｍ）上に免疫蛍光法を実施した。腫瘍切片は氷冷アセトン（５分）で固定した。固定後、カバースリップを洗浄し、ＰＢＳ中の２０％ウシ胎児血清で４５分間ブロッキングした。濃度５μｇ／ｍｌのＨｕＩＬ‐１２Ｌ１９Ｌ１９クローンを室温で１時間２％ ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液中に添加した。次に、カバースリップを、ＰＢＳで２回洗浄し、最終希釈１：１０００の二次抗体マウス抗ヒトインターロイキン－１２を２％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液中に室温で１時間添加した。その後、カバースリップを再度ＰＢＳで２回洗浄し、最終希釈１：５００の三次抗体ヤギ抗マウスを添加した。ＤＡＰＩを用いて核を対比染色した。
【0153】
放射性標識およびｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍標的化
種々のＩＬ－１２融合体のｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍への結合能を確認するために、それらの標的化能を生体内分布分析により評価した。１００μｇの各ＩＬ－１２Ｌ１９Ｌ１９クローンを125ＩおよびクロラミンＴ水和物で放射性ヨウ素化し、ＰＤ１０カラムで精製した。放射性標識したタンパク質をＦ９マウス奇形腫を皮下移植した免疫適格マウスの側尾静脈に注射した。マウス１匹あたりの注射用量は４～９μｇであった。注射２４時間後にマウスを屠殺した。臓器の重量を測定し、Ｐａｃｋａｒｄ Ｃｏｂｒａ γカウンターを用いて放射能を計数した。代表臓器の放射能含有量は、組織１ｇ当たりの注入量に対する割合（％ＩＤ／ｇ ±標準誤差）で表した。
種々のＩＬ－１２融合体のｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍への結合能を確認するために、それらの標的化能を生体内分布分析により評価した。１００μｇの各ＩＬ－１２Ｌ１９Ｌ１９クローンを125ＩおよびクロラミンＴ水和物で放射性ヨウ素化し、ＰＤ１０カラムで精製した。放射性標識したタンパク質をＦ９マウス奇形腫を皮下移植した免疫適格マウスの側尾静脈に注射した。マウス１匹あたりの注射用量は４～９μｇであった。注射２４時間後にマウスを屠殺した。臓器の重量を測定し、Ｐａｃｋａｒｄ Ｃｏｂｒａ γカウンターを用いて放射能を計数した。代表臓器の放射能含有量は、組織１ｇ当たりの注入量に対する割合（％ＩＤ／ｇ ±標準誤差）で表した。
【0154】
結果
クローニング、発現およびＳＤＳ－ＰＡＧＥ
ｈｕＩＬ‐１２Ｌ１９Ｌ１９融合タンパク質の８つの変異体は、サイトカインとＬ１９一本鎖ダイアボディの間の各々異なるポリペプチドリンカーでクローニングに成功した。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥキャラクタリゼーションは、全ての変異体について約１２０ｋＤａの分子量を示し、これは予想されるタンパク質サイズ（約１０９ｋＤａ、非グリコシル化）を確認した。（ＣＨＯ－Ｓ細胞における一過性遺伝子発現による）発現は、すべての変異体について、３．５～５ｍｇ／Ｌの範囲であった。驚くべきことに、「ＳＡＤ」とニックネームを付けられたクローンは、９ｍｇ／Ｌの収量を示し、これは、他の７つのクローンの収量よりも著しく高い。結果を図１に示す。
クローニング、発現およびＳＤＳ－ＰＡＧＥ
ｈｕＩＬ‐１２Ｌ１９Ｌ１９融合タンパク質の８つの変異体は、サイトカインとＬ１９一本鎖ダイアボディの間の各々異なるポリペプチドリンカーでクローニングに成功した。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥキャラクタリゼーションは、全ての変異体について約１２０ｋＤａの分子量を示し、これは予想されるタンパク質サイズ（約１０９ｋＤａ、非グリコシル化）を確認した。（ＣＨＯ－Ｓ細胞における一過性遺伝子発現による）発現は、すべての変異体について、３．５～５ｍｇ／Ｌの範囲であった。驚くべきことに、「ＳＡＤ」とニックネームを付けられたクローンは、９ｍｇ／Ｌの収量を示し、これは、他の７つのクローンの収量よりも著しく高い。結果を図１に示す。
【0155】
ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡでは、８つのクローン、Alpha３、ＡＰ６、ＡＰ７、ＤＤＳ、ＳＥＳ、ＡＫＫＡＳ、（Ｇ４Ｓ）3およびＳＡＤはすべてについて、ヒトフィブロネクチンのドメイン７Ｂ８９に対する結合（１０μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌ濃度の両方）を確認した。結果を図２に示す。
ＥＬＩＳＡでは、８つのクローン、Alpha３、ＡＰ６、ＡＰ７、ＤＤＳ、ＳＥＳ、ＡＫＫＡＳ、（Ｇ４Ｓ）3およびＳＡＤはすべてについて、ヒトフィブロネクチンのドメイン７Ｂ８９に対する結合（１０μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌ濃度の両方）を確認した。結果を図２に示す。
【0156】
ＢｉａＣｏｒｅ
ヒトフィブロネクチンのドメイン７Ｂ８９で被覆したチップについて、Ｂｉａｃｏｒｅ分析により、より正確な親和定数の決定を行った（図３）。試料は連続希釈として注入し、濃度は１０００ｎＭ、７５０ｎＭ、５００ｎＭおよび２５０ｎＭに等しかった（図３）。見かけのＫＤはＢｉａｃｏｒｅ Ｘ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅにより推定した。
ヒトフィブロネクチンのドメイン７Ｂ８９で被覆したチップについて、Ｂｉａｃｏｒｅ分析により、より正確な親和定数の決定を行った（図３）。試料は連続希釈として注入し、濃度は１０００ｎＭ、７５０ｎＭ、５００ｎＭおよび２５０ｎＭに等しかった（図３）。見かけのＫＤはＢｉａｃｏｒｅ Ｘ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅにより推定した。
【0157】
サイズ排除クロマトグラフィー
８つのクローン、Alpha３、ＡＰ６、ＡＰ７、ＤＤＳ、ＳＥＳ、ＡＫＫＡＳ、（Ｇ４Ｓ）3およびＳＡＤを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ-２００ｉｎｃｒｅａｓｅ）で特徴付けしたところ、全てのクローンは、単量体免疫サイトカインに対応する主要ピークと同等のプロファイルを示した（図４）。
８つのクローン、Alpha３、ＡＰ６、ＡＰ７、ＤＤＳ、ＳＥＳ、ＡＫＫＡＳ、（Ｇ４Ｓ）3およびＳＡＤを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ-２００ｉｎｃｒｅａｓｅ）で特徴付けしたところ、全てのクローンは、単量体免疫サイトカインに対応する主要ピークと同等のプロファイルを示した（図４）。
【0158】
免疫蛍光
凍結同系Ｆ９奇形腫検体凍結切片（８ｕｍ）上にクローンのAlpha３，ＡＰ６，ＡＰ７，ＤＤＳ，ＳＥＳ，ＡＫＫＡＳ，（Ｇ４Ｓ）3およびＳＡＤを用いて免疫蛍光法を行った。すべてのクローンは、陰性対照と比較して、血管系に特異的な結合を示した（図５）。
凍結同系Ｆ９奇形腫検体凍結切片（８ｕｍ）上にクローンのAlpha３，ＡＰ６，ＡＰ７，ＤＤＳ，ＳＥＳ，ＡＫＫＡＳ，（Ｇ４Ｓ）3およびＳＡＤを用いて免疫蛍光法を行った。すべてのクローンは、陰性対照と比較して、血管系に特異的な結合を示した（図５）。
【0159】
ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍標的化
ｉｎ ｖｉｖｏ標的化は生体内分布解析により評価した。Alpha３、ＡＰ６、ＡＰ７、ＤＤＳ、ＳＥＳ、ＡＫＫＡＳ、（Ｇ４Ｓ）3およびＳＡＤ、ならびに陽性対照（マウスＩＬ－１２に結合したＬ１９一本鎖ダイアボディ）の８クローンを、125Ｉで放射性ヨード化し、皮下移植したＦ９マウス奇形腫を有する免疫応答性マウスに注射した（４～９μｇタンパク質／動物）。注射２４時間後に計数した放射能は、すべてのクローンで腫瘍に集積を示したが、「ＳＡＤ」クローンは他の７クローンと比較して腫瘍に優れた集積を示した。（図６）
ｉｎ ｖｉｖｏ標的化は生体内分布解析により評価した。Alpha３、ＡＰ６、ＡＰ７、ＤＤＳ、ＳＥＳ、ＡＫＫＡＳ、（Ｇ４Ｓ）3およびＳＡＤ、ならびに陽性対照（マウスＩＬ－１２に結合したＬ１９一本鎖ダイアボディ）の８クローンを、125Ｉで放射性ヨード化し、皮下移植したＦ９マウス奇形腫を有する免疫応答性マウスに注射した（４～９μｇタンパク質／動物）。注射２４時間後に計数した放射能は、すべてのクローンで腫瘍に集積を示したが、「ＳＡＤ」クローンは他の７クローンと比較して腫瘍に優れた集積を示した。（図６）
【0160】
実施例２
さらなる一連の比較実験において、「ＳＡＤ」リンカーもまた、結合能、単量体プロファイルおよび腫瘍標的化能に関して、ＷＯ２０１３／０１４１４９に開示された古い（およびより短い）ＧＳＡＤＧＧリンカー（配列番号２６）よりも優れていることが驚くべきことに見出された。
材料および方法
この実施例で検証された変異体は、以下の一般的な構造を有する：
配列番号 異なる変異体（本明細書では「クローン」とも呼ばれる）は、リンカー２の配列が互いに異なる：
さらなる一連の比較実験において、「ＳＡＤ」リンカーもまた、結合能、単量体プロファイルおよび腫瘍標的化能に関して、ＷＯ２０１３／０１４１４９に開示された古い（およびより短い）ＧＳＡＤＧＧリンカー（配列番号２６）よりも優れていることが驚くべきことに見出された。
材料および方法
この実施例で検証された変異体は、以下の一般的な構造を有する：
【表3】
【表4】
【0161】
融合タンパク質のクローニング
一本鎖ダイアボディフォーマット中のＬ１９抗体（すなわち、それぞれｈｕＩＬ－１２Ｌ１９Ｌ１９「Ｏｌｄ」およびｈｕＩＬ－１２Ｌ１９Ｌ１９「ＳＡＤ」変異体）に６または１５アミノ酸リンカーを介して融合されたｈｕＩＬ－１２を含む融合タンパク質を、上記の株に沿ってクローン化した。
一本鎖ダイアボディフォーマット中のＬ１９抗体（すなわち、それぞれｈｕＩＬ－１２Ｌ１９Ｌ１９「Ｏｌｄ」およびｈｕＩＬ－１２Ｌ１９Ｌ１９「ＳＡＤ」変異体）に６または１５アミノ酸リンカーを介して融合されたｈｕＩＬ－１２を含む融合タンパク質を、上記の株に沿ってクローン化した。
【0162】
融合タンパク質の発現
一本鎖ダイアボディフォーマットにおけるＬ１９抗体（すなわち、それぞれｈｕＩＬ－１２Ｌ１９Ｌ１９「Ｏｌｄ」およびｈｕＩＬ－１２Ｌ１９Ｌ１９「ＳＡＤ」変異体）に６または１５アミノ酸リンカーを介して融合されたｈｕＩＬ－１２を含む融合タンパク質を、懸濁液適応ＣＨＯ細胞培養における一過性遺伝子発現によって産生した。トランスフェクション後、細胞を、ＰｒｏＣＨＯ－４培地（４ｍＭ超グルタミンを添加）中で、振盪条件下で３１℃で６日間維持し、その後、培養上清を遠心分離によって回収し、さらに処理して、融合タンパク質を精製した。
一本鎖ダイアボディフォーマットにおけるＬ１９抗体（すなわち、それぞれｈｕＩＬ－１２Ｌ１９Ｌ１９「Ｏｌｄ」およびｈｕＩＬ－１２Ｌ１９Ｌ１９「ＳＡＤ」変異体）に６または１５アミノ酸リンカーを介して融合されたｈｕＩＬ－１２を含む融合タンパク質を、懸濁液適応ＣＨＯ細胞培養における一過性遺伝子発現によって産生した。トランスフェクション後、細胞を、ＰｒｏＣＨＯ－４培地（４ｍＭ超グルタミンを添加）中で、振盪条件下で３１℃で６日間維持し、その後、培養上清を遠心分離によって回収し、さらに処理して、融合タンパク質を精製した。
【0163】
プロテインＡ樹脂を用いた融合タンパク質の精製
トランスフェクトされたＣＨＯ細胞懸濁培養物を、４℃で５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上清は０．４５ｕｍフィルターを用いた濾過によりさらに精製にした。タンパク質Ａ樹脂を濾過した上清に添加し、混合物を振盪条件下で約１時間インキュベートした。次に樹脂を液体クロマトグラフィーカラムに回収し、「緩衝液Ａ」（１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０ ｉｎ ＰＢＳ ｐＨ ７．４）で洗浄した後、「緩衝液Ｂ」（５００ｍＭ ＮａＣｌ ０．５ｍＭ ＥＤＴＡ ｉｎ ＰＢＳ ｐＨ ７．４）で２回目の洗浄を行った。ｈｕＩＬ‐１２を含む融合タンパク質を１００ｍＭ ＴＥＡを用いて重力流によって溶出した。アリコートを採取し、融合タンパク質を含む画分をＵＶスペクトロメトリーによって確認して、プールし、ＰＢＳに対して一晩透析した。
トランスフェクトされたＣＨＯ細胞懸濁培養物を、４℃で５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上清は０．４５ｕｍフィルターを用いた濾過によりさらに精製にした。タンパク質Ａ樹脂を濾過した上清に添加し、混合物を振盪条件下で約１時間インキュベートした。次に樹脂を液体クロマトグラフィーカラムに回収し、「緩衝液Ａ」（１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０ ｉｎ ＰＢＳ ｐＨ ７．４）で洗浄した後、「緩衝液Ｂ」（５００ｍＭ ＮａＣｌ ０．５ｍＭ ＥＤＴＡ ｉｎ ＰＢＳ ｐＨ ７．４）で２回目の洗浄を行った。ｈｕＩＬ‐１２を含む融合タンパク質を１００ｍＭ ＴＥＡを用いて重力流によって溶出した。アリコートを採取し、融合タンパク質を含む画分をＵＶスペクトロメトリーによって確認して、プールし、ＰＢＳに対して一晩透析した。
【0164】
融合タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー
融合タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーを、ＡＫＴＡ－ＦＰＬＣシステム上の泳動緩衝液としてＰＢＳを用いてＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００増加１０／３００ ＧＬカラムを用いて実施した。１００μｌのタンパク質溶液をループに注入し、カラムに自動的に注入した。２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を経時的に評価した。融合タンパク質のＳＥＣプロファイルをＵＮＩＣＯＲＮソフトウェアのピーク積分関数を用いて分析し、全％面積またはピーク％面積に対する単量体画分の割合を定量した。試料負荷によるピークアーチファクトまたは試料緩衝液中に存在する塩を除外するために、保持容量５～１７．５ｍＬの間隔のみを定量に考慮した。
融合タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーを、ＡＫＴＡ－ＦＰＬＣシステム上の泳動緩衝液としてＰＢＳを用いてＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００増加１０／３００ ＧＬカラムを用いて実施した。１００μｌのタンパク質溶液をループに注入し、カラムに自動的に注入した。２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を経時的に評価した。融合タンパク質のＳＥＣプロファイルをＵＮＩＣＯＲＮソフトウェアのピーク積分関数を用いて分析し、全％面積またはピーク％面積に対する単量体画分の割合を定量した。試料負荷によるピークアーチファクトまたは試料緩衝液中に存在する塩を除外するために、保持容量５～１７．５ｍＬの間隔のみを定量に考慮した。
【0165】
ＢＩＡＣｏｒｅ
表面プラズモン共鳴実験親和性測定を、フィブロネクチン７Ｂ８９ドメイン新鮮被覆ＣＭ５チップ上の精製「Ｏｌｄ」および「ＳＡＤ」クローンを有するＢｉａｃｏｒｅＸ１００装置により実施した。試料を、２５０ｎＭ、１２５ｎＭおよび６２．５ｍＭに等しい濃度の連続希釈として注入した（図１０）。見かけのＫＤはＢｉａｃｏｒｅ Ｘ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅにより推定した。
表面プラズモン共鳴実験親和性測定を、フィブロネクチン７Ｂ８９ドメイン新鮮被覆ＣＭ５チップ上の精製「Ｏｌｄ」および「ＳＡＤ」クローンを有するＢｉａｃｏｒｅＸ１００装置により実施した。試料を、２５０ｎＭ、１２５ｎＭおよび６２．５ｍＭに等しい濃度の連続希釈として注入した（図１０）。見かけのＫＤはＢｉａｃｏｒｅ Ｘ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅにより推定した。
【0166】
放射性標識およびｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍標的化
精製タンパク質サンプルｈｕＩＬ－１２Ｌ１９Ｌ１９「ＳＡＤ」（リンカーＧＳＡＤＧＧＳＳＡＧＧＳＤＡＧ、配列番号４）およびｈｕＩＬ－１２Ｌ１９Ｌ１９「Ｏｌｄ」（リンカーＧＳＡＤＧＧ、配列番号２６）（１００ｇ）を125ＩおよびクロラミンＴ水和物で放射性ヨウ素化し、ＰＤ１０カラムで精製した。タンパク質はタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー後に放射性ヨード化した。タンパク質を皮下移植したＦ９マウス奇形腫を有する免疫適格（１２９／Ｓｖ）マウスの外側尾静脈に注射した。マウス１匹あたりの注射用量は１０～１１ｇであった。注射２４時間後にマウスを屠殺した。臓器サンプルの重量を測定し、Ｐａｃｋａｒｄ Ｃｏｂｒａ γカウンターを用いて放射能を計数した。異なる臓器におけるタンパク質取り込みを計算し、組織１ｇ当たりの注射用量のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ ±標準誤差）で表した。腫瘍へのタンパク質取り込みはＴａｒｌｉら（１９９９）に従い腫瘍成長により調整した。
精製タンパク質サンプルｈｕＩＬ－１２Ｌ１９Ｌ１９「ＳＡＤ」（リンカーＧＳＡＤＧＧＳＳＡＧＧＳＤＡＧ、配列番号４）およびｈｕＩＬ－１２Ｌ１９Ｌ１９「Ｏｌｄ」（リンカーＧＳＡＤＧＧ、配列番号２６）（１００ｇ）を125ＩおよびクロラミンＴ水和物で放射性ヨウ素化し、ＰＤ１０カラムで精製した。タンパク質はタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー後に放射性ヨード化した。タンパク質を皮下移植したＦ９マウス奇形腫を有する免疫適格（１２９／Ｓｖ）マウスの外側尾静脈に注射した。マウス１匹あたりの注射用量は１０～１１ｇであった。注射２４時間後にマウスを屠殺した。臓器サンプルの重量を測定し、Ｐａｃｋａｒｄ Ｃｏｂｒａ γカウンターを用いて放射能を計数した。異なる臓器におけるタンパク質取り込みを計算し、組織１ｇ当たりの注射用量のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ ±標準誤差）で表した。腫瘍へのタンパク質取り込みはＴａｒｌｉら（１９９９）に従い腫瘍成長により調整した。
【0167】
結果
融合タンパク質の発現と精製、サイズ排除クロマトグラフィー
ｈｕＩＬ－１２Ｌ１９Ｌ１９「ＳＡＤ」とｈｕＩＬ－１２Ｌ１９「Ｏｌｄ」の２種類の変異体は、ＣＨＯ細胞での一過性遺伝子発現によって作製された。実験は２回行われ、２組の産生実験が異なる日に行われ、それぞれバッチＡおよびＢが生成された。タンパク質－Ａアフィニティークロマトグラフィーによる一段階精製、およびＰＢＳによる透析に続いて、タンパク質試料の均一性をサイズ排除クロマトグラフィーによって評価した（図９）。両タンパク質変異体は、初期保持容積で溶出する高分子量変異体の存在によって強調されるタンパク質凝集を示した。どちらの場合も、ｈｕＩＬ－１２Ｌ１９「ＳＡＤ」は、ＵＮＩＣＯＲＮソフトウエアのピーク積分機能を用いたタンパク質の単量体部分の定量によって確認されたように、より良好なプロファイルを示した。実際、ｈｕＩＬ－１２Ｌ１９「ＳＡＤ」変異体は、ｈｕＩＬ－１２Ｌ１９「Ｏｌｄ」と比較して、より低い凝集傾向を示した。これは、ベースラインより上の曲線下総面積のパーセンテージとして単量体のピーク面積を考慮するか（平均値：それぞれ５４．５７％対４６．６９％）、または統合されたすべてのピークの合計のパーセンテージとして単量体のピーク面積（平均値：それぞれ５８．８３％対５２．７４％）を考慮した（表１）。
融合タンパク質の発現と精製、サイズ排除クロマトグラフィー
ｈｕＩＬ－１２Ｌ１９Ｌ１９「ＳＡＤ」とｈｕＩＬ－１２Ｌ１９「Ｏｌｄ」の２種類の変異体は、ＣＨＯ細胞での一過性遺伝子発現によって作製された。実験は２回行われ、２組の産生実験が異なる日に行われ、それぞれバッチＡおよびＢが生成された。タンパク質－Ａアフィニティークロマトグラフィーによる一段階精製、およびＰＢＳによる透析に続いて、タンパク質試料の均一性をサイズ排除クロマトグラフィーによって評価した（図９）。両タンパク質変異体は、初期保持容積で溶出する高分子量変異体の存在によって強調されるタンパク質凝集を示した。どちらの場合も、ｈｕＩＬ－１２Ｌ１９「ＳＡＤ」は、ＵＮＩＣＯＲＮソフトウエアのピーク積分機能を用いたタンパク質の単量体部分の定量によって確認されたように、より良好なプロファイルを示した。実際、ｈｕＩＬ－１２Ｌ１９「ＳＡＤ」変異体は、ｈｕＩＬ－１２Ｌ１９「Ｏｌｄ」と比較して、より低い凝集傾向を示した。これは、ベースラインより上の曲線下総面積のパーセンテージとして単量体のピーク面積を考慮するか（平均値：それぞれ５４．５７％対４６．６９％）、または統合されたすべてのピークの合計のパーセンテージとして単量体のピーク面積（平均値：それぞれ５８．８３％対５２．７４％）を考慮した（表１）。
【表5】
【0168】
表１：ＵＮＩＣＯＲＮソフトウエアのピーク積分関数により評価した異なる融合タンパク質の単量体画分の定量。（＊）ベースラインより上の曲線下総面積に対するピーク面積の割合。（°）すべての積分ピークの合計に対するピーク面積の割合。
【0169】
Ｂｉａｃｏｒｅ
見かけのＫＤは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅにより、「Ｏｌｄ」クローン（ｈｕＩＬ－１２Ｌ１９Ｌ１９「Ｏｌｄ」とリンカーＧＳＡＤＧＧ）では６．７ｎＭ、「ＳＡＤ」クローン（ｈｕＩＬ－１２Ｌ１９Ｌ１９「ＳＡＤ」とリンカーＧＳＡＤＧＧＳＳＡＧＧＳＤＡＧ）では３．８ｎＭと推定された（図１０）。
ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍標的化
注射２４時間後に計数した放射能は、「ＳＡＤ」クローンが「Ｏｌｄ」クローンと比較して予想外に優れた腫瘍取り込みを有することを示した（図１１）。
見かけのＫＤは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅにより、「Ｏｌｄ」クローン（ｈｕＩＬ－１２Ｌ１９Ｌ１９「Ｏｌｄ」とリンカーＧＳＡＤＧＧ）では６．７ｎＭ、「ＳＡＤ」クローン（ｈｕＩＬ－１２Ｌ１９Ｌ１９「ＳＡＤ」とリンカーＧＳＡＤＧＧＳＳＡＧＧＳＤＡＧ）では３．８ｎＭと推定された（図１０）。
ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍標的化
注射２４時間後に計数した放射能は、「ＳＡＤ」クローンが「Ｏｌｄ」クローンと比較して予想外に優れた腫瘍取り込みを有することを示した（図１１）。
【0170】
実施例３
ｈｕＩＬ－１２Ｌ１９Ｌ１９「ＳＡＤ」変異体の有効性は、悪性黒色腫、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、腎細胞がん、尿路上皮がん、頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）又はミスマッチ修復機構欠損（ｄＭＭＲ）を有する転移性結腸直腸がん、肝細胞がん、胃がん、皮膚の扁平上皮がん、子宮頸がん、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を有するヒト患者において評価される。少なくとも１つの患者コホートでは、直前の治療として投与された免疫チェックポイント遮断療法をベースとしたレジメンで、疾患の進行が実証されている。
ｈｕＩＬ－１２Ｌ１９Ｌ１９「ＳＡＤ」変異体の有効性は、悪性黒色腫、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、腎細胞がん、尿路上皮がん、頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）又はミスマッチ修復機構欠損（ｄＭＭＲ）を有する転移性結腸直腸がん、肝細胞がん、胃がん、皮膚の扁平上皮がん、子宮頸がん、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を有するヒト患者において評価される。少なくとも１つの患者コホートでは、直前の治療として投与された免疫チェックポイント遮断療法をベースとしたレジメンで、疾患の進行が実証されている。
【0171】
患者にｈｕＩＬ－１２Ｌ１９Ｌ１９「ＳＡＤ」変異体を週１回８週間静脈内投与する。患者は４μｇ／ｋｇ、８μｇ／ｋｇ、１２μｇ／ｋｇ、１６μｇ／ｋｇまたは２０μｇ／ｋｇの投与を受ける。
治療開始から６ヵ月間、または同意の撤回または進行性疾患がみられるまで患者を追跡する。
治療開始から６ヵ月間、または同意の撤回または進行性疾患がみられるまで患者を追跡する。
【0172】
ＩＬ１２－Ｌ１９Ｌ１９Ｌ１９－Ｌ１２の薬物動態解析は、融合分子およびＩＬ１２部分のサンドイッチ捕捉を用いて評価する。ヒト抗融合タンパク質抗体（ＨＡＦＡ）は、表面プラズモン共鳴分析およびサンドイッチ捕捉により試験する。固形がんに対するＲＥＣＩＳＴ（ｖｅｒｓｉｏｎ １．１）又は悪性リンパ腫評価基準のＬＵＧＡＮＯ基準を用いて、８週目、１６週目及び２４週目に抗腫瘍活性、例えば有効性を評価する。
【0173】
更なる実施形態
実施形態の第１のセットによれば、以下が提供される：
１．ａ）第１および第２サブユニットを有するヘテロ二量体ＩＬ－１２タンパク質、
ｂ）一本鎖ダイアボディ、および
ｃ）ＩＬ－１２タンパク質と一本鎖ダイアボディとの間のリンカーを含むコンジュゲートであって、リンカーはＳＡＤを含むアミノ酸モチーフを含む、コンジュゲート。
２．上記ＳＡＤリンカーが、アミノ酸モチーフモチーフＧＳＡＤＧＧＳＳＡＧＧＳＤＡＧ（配列番号４）を含む点１に記載のコンジュゲート。
３．ヘテロ二量体ＩＬ－１２タンパク質の第１のサブユニットがｐ４０であり、第２のサブユニットがｐ３５である、点１～２のいずれかに記載のコンジュゲート。
４．一本鎖ダイアボディが単一特異性または二重特異性である、点１～３のいずれかに記載のコンジュゲート。
５．一本鎖ダイアボディがフィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する、点１～４のいずれかに記載のコンジュゲート。
６．一本鎖ダイアボディが２つのＬ１９ ＶＨドメインおよび２つのＬ１９ ＶＬドメインを含む、点１～５のいずれかに記載のコンジュゲート。
７．完全長構造［ｐ４０］－［リンカー１］－［ｐ３５］－［ＳＡＤリンカー］－［Ｌ１９ＶＨ］－［リンカー３］－［Ｌ１９ＶＬ］－［リンカー４］－［Ｌ１９ＶＨ］－［リンカー３］－［Ｌ１９ＶＬ］を有する点１～６のいずれかに記載のコンジュゲート。
８．配列番号１６による全長配列を有する点１～７のいずれかに記載のコンジュゲート。
９．・腫瘍性疾患と診断されているか、
・腫瘍性疾患に罹患しているか、または
・腫瘍性疾患を発症するリスクがある
ヒト又は動物対象の治療におけるか、またはそのような状態の予防のための、上記点のいずれかに記載のコンジュゲートの（医薬品の製造のための）使用。
１０．ヒトまたは動物の対象における血管新生の抑制における上記点のいずれかに記載のコンジュゲートの（医薬品の製造のための）使用。
１１．点１～８のいずれかに記載のコンジュゲートを少なくとも含み、および任意に１種以上の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
１２．（ｉ）点１～８のいずれか１つに記載のコンジュゲート、または点１１に記載の医薬組成物、および（ｉｉ）１つ以上の治療的活性化合物を含む組合せ。
１３．ＥＤ－Ｂフィブロネクチンの発現または過剰発現に関連する障害または状態を治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に、点１～８のいずれか１項に記載のコンジュゲートの有効量、点１１に記載の医薬組成物、または点１２に記載の組合せを投与することを含む、方法。
１４．ａ）点１～８のいずれか１つに記載のコンジュゲート、点１１に記載の医薬組成物または点１２に記載の組合せ、
ｂ）前記コンジュゲート、組成物または組合せを投与するための装置、および
ｃ）使用説明書を含むパーツの治療用キット。
実施形態の第１のセットによれば、以下が提供される：
１．ａ）第１および第２サブユニットを有するヘテロ二量体ＩＬ－１２タンパク質、
ｂ）一本鎖ダイアボディ、および
ｃ）ＩＬ－１２タンパク質と一本鎖ダイアボディとの間のリンカーを含むコンジュゲートであって、リンカーはＳＡＤを含むアミノ酸モチーフを含む、コンジュゲート。
２．上記ＳＡＤリンカーが、アミノ酸モチーフモチーフＧＳＡＤＧＧＳＳＡＧＧＳＤＡＧ（配列番号４）を含む点１に記載のコンジュゲート。
３．ヘテロ二量体ＩＬ－１２タンパク質の第１のサブユニットがｐ４０であり、第２のサブユニットがｐ３５である、点１～２のいずれかに記載のコンジュゲート。
４．一本鎖ダイアボディが単一特異性または二重特異性である、点１～３のいずれかに記載のコンジュゲート。
５．一本鎖ダイアボディがフィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する、点１～４のいずれかに記載のコンジュゲート。
６．一本鎖ダイアボディが２つのＬ１９ ＶＨドメインおよび２つのＬ１９ ＶＬドメインを含む、点１～５のいずれかに記載のコンジュゲート。
７．完全長構造［ｐ４０］－［リンカー１］－［ｐ３５］－［ＳＡＤリンカー］－［Ｌ１９ＶＨ］－［リンカー３］－［Ｌ１９ＶＬ］－［リンカー４］－［Ｌ１９ＶＨ］－［リンカー３］－［Ｌ１９ＶＬ］を有する点１～６のいずれかに記載のコンジュゲート。
８．配列番号１６による全長配列を有する点１～７のいずれかに記載のコンジュゲート。
９．・腫瘍性疾患と診断されているか、
・腫瘍性疾患に罹患しているか、または
・腫瘍性疾患を発症するリスクがある
ヒト又は動物対象の治療におけるか、またはそのような状態の予防のための、上記点のいずれかに記載のコンジュゲートの（医薬品の製造のための）使用。
１０．ヒトまたは動物の対象における血管新生の抑制における上記点のいずれかに記載のコンジュゲートの（医薬品の製造のための）使用。
１１．点１～８のいずれかに記載のコンジュゲートを少なくとも含み、および任意に１種以上の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
１２．（ｉ）点１～８のいずれか１つに記載のコンジュゲート、または点１１に記載の医薬組成物、および（ｉｉ）１つ以上の治療的活性化合物を含む組合せ。
１３．ＥＤ－Ｂフィブロネクチンの発現または過剰発現に関連する障害または状態を治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に、点１～８のいずれか１項に記載のコンジュゲートの有効量、点１１に記載の医薬組成物、または点１２に記載の組合せを投与することを含む、方法。
１４．ａ）点１～８のいずれか１つに記載のコンジュゲート、点１１に記載の医薬組成物または点１２に記載の組合せ、
ｂ）前記コンジュゲート、組成物または組合せを投与するための装置、および
ｃ）使用説明書を含むパーツの治療用キット。
【0174】
実施形態の第２のセットによれば、以下が提供される：
１．ａ）第１および第２サブユニットを有するヘテロ二量体ＩＬ－１２タンパク質、
ｂ）一本鎖ダイアボディ、および
ｃ）ＩＬ－１２タンパク質と一本鎖ダイアボディとの間のリンカーを含むコンジュゲートであって、このリンカーは、ＧＳＡＤＧＧＳＳＡＧＧＳＤＡＧ（配列番号４）を含むアミノ酸モチーフを含む、コンジュゲート。
２．ヘテロ二量体ＩＬ－１２タンパク質の第１のサブユニットがｐ４０であり、第２のサブユニットがｐ３５である、点１のいずれかに記載のコンジュゲート。３．一本鎖ダイアボディが単一特異性または二重特異性である、点１～２のいずれかに記載のコンジュゲート。
４．一本鎖ダイアボディがフィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する、点１～３のいずれかに記載のコンジュゲート。
５．一本鎖ダイアボディが２つのＬ１９ ＶＨドメインおよび２つのＬ１９ ＶＬドメインを含む、点１～４のいずれかに記載のコンジュゲート。
６．完全長構造［ｐ４０］－［リンカー１］－［ｐ３５］－［ＳＡＤリンカー］－［Ｌ１９ＶＨ］－［リンカー３］－［Ｌ１９ＶＬ］－［リンカー４］－［Ｌ１９ＶＨ］－［リンカー３］－［Ｌ１９ＶＬ］を有する点１～５のいずれかに記載のコンジュゲート。
７．配列番号１６による全長配列を有する点１～６のいずれかに記載のコンジュゲート。
８．・腫瘍性疾患と診断されているか、
・腫瘍性疾患に罹患しているか、または
・腫瘍性疾患を発症するリスクがある
ヒト又は動物対象の治療におけるか、またはそのような状態の予防のための、上記点のいずれかに記載のコンジュゲートの（医薬品の製造のための）使用。
９．ヒトまたは動物の対象における血管新生の抑制における上記点のいずれかに記載のコンジュゲートの（医薬品の製造のための）使用。
１０．少なくとも点１～７に記載のコンジュゲート、および任意に１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
１１．（ｉ）点１～７のいずれか１つに記載のコンジュゲート、または点１０に記載の医薬組成物、および（ｉｉ）１つ以上の治療的活性化合物を含む組合せ。
１２．ＥＤ－Ｂフィブロネクチンの発現または過剰発現に関連する障害または状態を治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に、点１～７のいずれか１項に記載のコンジュゲートの有効量、点１０に記載の医薬組成物、または点１１に記載の組合せを投与することを含む、方法。
１３．ａ）点１～点７のいずれかに記載のコンジュゲート、点１０に記載の医薬組成物又は点１１に記載の組合せ、
ｂ）コンジュゲート、組成物又は組合せを投与するための装置、および
ｃ）使用説明書を含むパーツの治療用キット。
１．ａ）第１および第２サブユニットを有するヘテロ二量体ＩＬ－１２タンパク質、
ｂ）一本鎖ダイアボディ、および
ｃ）ＩＬ－１２タンパク質と一本鎖ダイアボディとの間のリンカーを含むコンジュゲートであって、このリンカーは、ＧＳＡＤＧＧＳＳＡＧＧＳＤＡＧ（配列番号４）を含むアミノ酸モチーフを含む、コンジュゲート。
２．ヘテロ二量体ＩＬ－１２タンパク質の第１のサブユニットがｐ４０であり、第２のサブユニットがｐ３５である、点１のいずれかに記載のコンジュゲート。３．一本鎖ダイアボディが単一特異性または二重特異性である、点１～２のいずれかに記載のコンジュゲート。
４．一本鎖ダイアボディがフィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する、点１～３のいずれかに記載のコンジュゲート。
５．一本鎖ダイアボディが２つのＬ１９ ＶＨドメインおよび２つのＬ１９ ＶＬドメインを含む、点１～４のいずれかに記載のコンジュゲート。
６．完全長構造［ｐ４０］－［リンカー１］－［ｐ３５］－［ＳＡＤリンカー］－［Ｌ１９ＶＨ］－［リンカー３］－［Ｌ１９ＶＬ］－［リンカー４］－［Ｌ１９ＶＨ］－［リンカー３］－［Ｌ１９ＶＬ］を有する点１～５のいずれかに記載のコンジュゲート。
７．配列番号１６による全長配列を有する点１～６のいずれかに記載のコンジュゲート。
８．・腫瘍性疾患と診断されているか、
・腫瘍性疾患に罹患しているか、または
・腫瘍性疾患を発症するリスクがある
ヒト又は動物対象の治療におけるか、またはそのような状態の予防のための、上記点のいずれかに記載のコンジュゲートの（医薬品の製造のための）使用。
９．ヒトまたは動物の対象における血管新生の抑制における上記点のいずれかに記載のコンジュゲートの（医薬品の製造のための）使用。
１０．少なくとも点１～７に記載のコンジュゲート、および任意に１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
１１．（ｉ）点１～７のいずれか１つに記載のコンジュゲート、または点１０に記載の医薬組成物、および（ｉｉ）１つ以上の治療的活性化合物を含む組合せ。
１２．ＥＤ－Ｂフィブロネクチンの発現または過剰発現に関連する障害または状態を治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に、点１～７のいずれか１項に記載のコンジュゲートの有効量、点１０に記載の医薬組成物、または点１１に記載の組合せを投与することを含む、方法。
１３．ａ）点１～点７のいずれかに記載のコンジュゲート、点１０に記載の医薬組成物又は点１１に記載の組合せ、
ｂ）コンジュゲート、組成物又は組合せを投与するための装置、および
ｃ）使用説明書を含むパーツの治療用キット。
【0175】
実施形態の第三のセットによれば、以下が提供される：
１．ａ）第１および第２サブユニットを有するヘテロ二量体ＩＬ－１２タンパク質、
ｂ）一本鎖ダイアボディ、および
ｃ）ＩＬ－１２タンパク質と一本鎖ダイアボディとの間のリンカー
を含むコンジュゲートであって、このリンカーは、ＧＳＡＤＧＧＳＳＡＧＧＳＤＡＧ（配列番号４）を含むアミノ酸モチーフを含む、コンジュゲート。
２．ヘテロ二量体ＩＬ－１２タンパク質の第１のサブユニットがｐ４０であり、第２のサブユニットがｐ３５である、点１に記載のコンジュゲート。
３．一本鎖ダイアボディが単一特異性または二重特異性である、点１～２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
４．一本鎖ダイアボディがフィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する、点１～３のいずれか一項に記載のコンジュゲート
５．前記一本鎖ダイアボディが、配列番号２８～３３に記載の抗体Ｌ１９の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗原結合部位を含む、点１～４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
６．一本鎖ダイアボディが、配列番号７および５に記載の抗体Ｌ１９のＶＨおよびＶＬドメインを含む、点１～５に記載のコンジュゲート。
７．一本鎖ダイアボディが、ａ）点６の重鎖／軽鎖可変ドメイン配列対の少なくとも１つを含み、前記ドメインの少なくとも１つが、それぞれ、配列番号７または配列番号５に対して≧８０％の配列同一性を有する、および／またはｂ）点６の重鎖／軽鎖可変ドメイン配列対を有する、ただし、ドメインの少なくとも１つは、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する能力を維持しながら、それぞれ、配列番号７または配列番号５に対して≧１０のアミノ酸置換を有する、点１～６のいずれかに記載のコンジュゲート。
８．一本鎖ダイアボディにおける少なくとも１つのアミノ酸置換が保存的アミノ酸置換である、点１～７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
９．一本鎖ダイアボディが、点５、または点６の抗体の１つと比較して、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に対して≧５０％の標的結合親和性を有し、かつ／または点５、または点６の抗体の１つとフィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）への結合について競合する、点１～８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
１０．一本鎖ダイアボディが２つのＬ１９ ＶＨドメインおよび２つのＬ１９ ＶＬドメインを含む、点１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート
１１．完全長構造［ｐ４０］－［リンカー１］－［ｐ３５］－［ＳＡＤリンカー］－［Ｌ１９ＶＨ］－［リンカー３］－［Ｌ１９ＶＬ］－［リンカー４］－［Ｌ１９ＶＨ］－［リンカー３］－［Ｌ１９ＶＬ］を有する点１～１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
１２．配列番号１６による全長配列を有する点１～１１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
１３．・腫瘍性疾患と診断されているか、
・腫瘍性疾患に罹患しているか、または
・腫瘍性疾患を発症するリスクがある
ヒト又は動物対象の治療におけるか、またはそのような状態の予防のための、上記点のいずれか一に記載のコンジュゲートの（医薬品の製造のための）使用。
１４．ヒトまたは動物の対象における血管新生の抑制のための、前記点のいずれか１つに記載のコンジュゲートの（医薬品の製造のための）使用。
１５．点１～１２のいずれか１つ、および任意に１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を少なくとも含むコンジュゲートを含む薬学的組成物。
１６．（ｉ）点１～１２のいずれか１つに記載のコンジュゲート物、または点１５に記載の医薬組成物、および（ｉｉ）１つ以上の治療的活性化合物を含む組合せ。
１７．ＥＤ－Ｂフィブロネクチンの発現または過剰発現に関連する障害または状態を治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に、点１～１２のいずれか１つに記載のコンジュゲートの有効量、点１５に記載の医薬組成物、または点１６に記載の組合せを投与することを含む、方法。
１８．ａ）点１～１２のいずれか１つに記載のコンジュゲート、点１５に記載の医薬組成物または点１６に記載の組合せ、
ｂ）前記コンジュゲート、組成物または組合せを投与するための装置、および
ｃ）使用説明書を含むパーツの治療用キット。
１．ａ）第１および第２サブユニットを有するヘテロ二量体ＩＬ－１２タンパク質、
ｂ）一本鎖ダイアボディ、および
ｃ）ＩＬ－１２タンパク質と一本鎖ダイアボディとの間のリンカー
を含むコンジュゲートであって、このリンカーは、ＧＳＡＤＧＧＳＳＡＧＧＳＤＡＧ（配列番号４）を含むアミノ酸モチーフを含む、コンジュゲート。
２．ヘテロ二量体ＩＬ－１２タンパク質の第１のサブユニットがｐ４０であり、第２のサブユニットがｐ３５である、点１に記載のコンジュゲート。
３．一本鎖ダイアボディが単一特異性または二重特異性である、点１～２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
４．一本鎖ダイアボディがフィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する、点１～３のいずれか一項に記載のコンジュゲート
５．前記一本鎖ダイアボディが、配列番号２８～３３に記載の抗体Ｌ１９の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗原結合部位を含む、点１～４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
６．一本鎖ダイアボディが、配列番号７および５に記載の抗体Ｌ１９のＶＨおよびＶＬドメインを含む、点１～５に記載のコンジュゲート。
７．一本鎖ダイアボディが、ａ）点６の重鎖／軽鎖可変ドメイン配列対の少なくとも１つを含み、前記ドメインの少なくとも１つが、それぞれ、配列番号７または配列番号５に対して≧８０％の配列同一性を有する、および／またはｂ）点６の重鎖／軽鎖可変ドメイン配列対を有する、ただし、ドメインの少なくとも１つは、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する能力を維持しながら、それぞれ、配列番号７または配列番号５に対して≧１０のアミノ酸置換を有する、点１～６のいずれかに記載のコンジュゲート。
８．一本鎖ダイアボディにおける少なくとも１つのアミノ酸置換が保存的アミノ酸置換である、点１～７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
９．一本鎖ダイアボディが、点５、または点６の抗体の１つと比較して、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に対して≧５０％の標的結合親和性を有し、かつ／または点５、または点６の抗体の１つとフィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）への結合について競合する、点１～８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
１０．一本鎖ダイアボディが２つのＬ１９ ＶＨドメインおよび２つのＬ１９ ＶＬドメインを含む、点１～９のいずれか一項に記載のコンジュゲート
１１．完全長構造［ｐ４０］－［リンカー１］－［ｐ３５］－［ＳＡＤリンカー］－［Ｌ１９ＶＨ］－［リンカー３］－［Ｌ１９ＶＬ］－［リンカー４］－［Ｌ１９ＶＨ］－［リンカー３］－［Ｌ１９ＶＬ］を有する点１～１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
１２．配列番号１６による全長配列を有する点１～１１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
１３．・腫瘍性疾患と診断されているか、
・腫瘍性疾患に罹患しているか、または
・腫瘍性疾患を発症するリスクがある
ヒト又は動物対象の治療におけるか、またはそのような状態の予防のための、上記点のいずれか一に記載のコンジュゲートの（医薬品の製造のための）使用。
１４．ヒトまたは動物の対象における血管新生の抑制のための、前記点のいずれか１つに記載のコンジュゲートの（医薬品の製造のための）使用。
１５．点１～１２のいずれか１つ、および任意に１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を少なくとも含むコンジュゲートを含む薬学的組成物。
１６．（ｉ）点１～１２のいずれか１つに記載のコンジュゲート物、または点１５に記載の医薬組成物、および（ｉｉ）１つ以上の治療的活性化合物を含む組合せ。
１７．ＥＤ－Ｂフィブロネクチンの発現または過剰発現に関連する障害または状態を治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に、点１～１２のいずれか１つに記載のコンジュゲートの有効量、点１５に記載の医薬組成物、または点１６に記載の組合せを投与することを含む、方法。
１８．ａ）点１～１２のいずれか１つに記載のコンジュゲート、点１５に記載の医薬組成物または点１６に記載の組合せ、
ｂ）前記コンジュゲート、組成物または組合せを投与するための装置、および
ｃ）使用説明書を含むパーツの治療用キット。
【0176】
本発明のさらなる一実施形態によれば、ＳＡＤリンカーは、アミノ酸モチーフＧＳＡＤＧＧＳＳＡＧＧＳＤＡＧ（配列番号４）を含む。本明細書中で使用される用語「一本鎖ダイアボディ」は、スキーム（Ｎ－＞Ｃ配向）：Ｌ１９ＶＨ－リンカー3－Ｌ１９ＶＬ－リンカー４－Ｌ１９ＶＨ－リンカー３－Ｌ１９ＶＬのとおり、短いリンカー、好ましくは５アミノ酸長を有し、より長いリンカー、好ましくは１５アミノ酸長により互いに結合された２つの一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体の構築物に関する。
【0177】
本発明の一実施形態によれば、リンカー3は、ＧＳＳＧＧ（配列番号６）であり、リンカー4はＳＳＳＳＧＳＳＳＳＧＳＳＳＳＧ（配列番号８）である。本発明の１つの実施形態によれば、ヘテロ二量体ＩＬ－１２タンパク質の第１のサブユニットはｐ４０であり、第２のサブユニットはｐ３５である。好適には、２つのサブユニットは、スキーム（Ｎ－＞Ｃ配向）：ｐ４０－リンカー1－ｐ３５のとおり、所与のリンカーによって互いに結合される。
【0178】
好適には、ＩＬ－１２はヒトＩＬ－１２である。好ましい実施態様において、リンカー１は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２）である。本発明の一実施形態によれば、一本鎖ダイアボディは単一特異性または二重特異性である。本発明の１つの実施形態によれば、一本鎖ダイアボディはフィブロネクチンのスプライスアイソフォームに結合する。本発明の１つの実施形態によれば、一本鎖ダイアボディはフィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する。
【0179】
参考文献（その開示は、その全体が参照として本明細書に援用される）
Car et al., Toxicologic Pathology (1999), 27(1), 58-63
Chen et al., Adv Drug Deliv Rev. (2013), 65(10), 1357-1369
WO2013/014149
WO2006/119897
Tarli et al., Blood (1999), 94(1), 192-198.
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Chen et al., Adv Drug Deliv Rev. (2013), 65(10), 1357-1369
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WO2006/119897
Tarli et al., Blood (1999), 94(1), 192-198.
【0180】
配列
下記の配列は、本出願の開示の一部を形成する。ＷＩＰＯ ＳＴ ２５互換性のある電子化配列表もまた、この出願と共に提供される。疑義を避けるため、以下の表中の配列と電子化配列表中の配列との間に齟齬が存在する場合、この表中の配列は正しいものとみなされるものとする。
下記の配列は、本出願の開示の一部を形成する。ＷＩＰＯ ＳＴ ２５互換性のある電子化配列表もまた、この出願と共に提供される。疑義を避けるため、以下の表中の配列と電子化配列表中の配列との間に齟齬が存在する場合、この表中の配列は正しいものとみなされるものとする。
【表6】
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図7】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【図10】
【図11】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-06-08
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ．第１のＩＬ－１２サブユニットおよび第２のＩＬ－１２タンパク質サブユニットを含むＩＬ－１２タンパク質；
ｂ．ＥＤＢ結合ドメインを含むタンパク質；ならびに
ｃ．ＩＬ－１２タンパク質とＥＤＢ結合ドメインを含むタンパク質との間のリンカーを含む組成物。
ｂ．ＥＤＢ結合ドメインを含むタンパク質；ならびに
ｃ．ＩＬ－１２タンパク質とＥＤＢ結合ドメインを含むタンパク質との間のリンカーを含む組成物。
【請求項2】
ＩＬ－１２タンパク質とＥＤＢ結合ドメインを含むタンパク質との間のリンカーが、ＧＳＡＤＧＧＳＳＡＧＧＳＤＡＧ（配列番号４）を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
ＥＤＢ結合ドメインを含むタンパク質がｓｃＦｖを含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
ＥＤＢ結合ドメインを含むタンパク質がダイアボディである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項5】
ＥＤＢ結合ドメインを含むタンパク質が一本鎖ダイアボディである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項6】
ＩＬ－１２タンパク質の第１のサブユニットがｐ４０であり、第２のサブユニットがｐ３５である、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
ＩＬ－１２タンパク質の第１のサブユニットが、配列番号１またはその断片と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むｐ４０であり、ここでＩＬ－１２タンパク質はＩＬ－１２受容体を活性化することができる、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
ＩＬ－１２タンパク質の第２のサブユニットが、配列番号３またはその断片と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むｐ３５であり、ここでＩＬ－１２タンパク質はＩＬ－１２受容体を活性化することができる、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項9】
ＥＤＢ結合ドメインを含むタンパク質が、単一特異性または二重特異性である、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項10】
ＥＤＢ結合ドメインを含むタンパク質がフィブロネクチンのエクストラドメインＢ （ＥＤ－Ｂ）に結合する、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物
【請求項11】
ＥＤＢ結合ドメインを含むタンパク質が、配列番号２８から３３のいずれか１つと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項12】
ＥＤＢ結合ドメインを含むタンパク質が、配列番号２８～３３のアミノ酸配列の各々を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項13】
ＥＤＢ結合ドメインを含むタンパク質が、配列番号５または７に記載のアミノ酸配列の１つ以上と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項14】
ＥＤＢ結合ドメインを含むタンパク質が、配列番号５および７を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項15】
フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に結合する能力を維持しながら、
ＥＤＢ結合ドメインを含むタンパク質が、
ａ）前記ドメインの少なくとも１つが配列番号７または配列番号５に対してそれぞれ≧８０％の配列同一性を有するという条件で請求項１４に記載の配列対、および／または
ｂ）配列番号７または配列番号５に対してそれぞれ最大１０個のアミノ酸置換を有するという条件で請求項１４に記載の配列対
の少なくとも１つを含む、請求項１４に記載の組成物。
ＥＤＢ結合ドメインを含むタンパク質が、
ａ）前記ドメインの少なくとも１つが配列番号７または配列番号５に対してそれぞれ≧８０％の配列同一性を有するという条件で請求項１４に記載の配列対、および／または
ｂ）配列番号７または配列番号５に対してそれぞれ最大１０個のアミノ酸置換を有するという条件で請求項１４に記載の配列対
の少なくとも１つを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項16】
少なくとも１つのアミノ酸置換が保存的アミノ酸置換である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項17】
ＥＤＢ結合ドメインを含むタンパク質が、
ａ）請求項１１～１６のいずれか一項に記載のＥＤＢ結合ドメインを含むタンパク質の１つと比較して、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に対する≧５０％の標的結合親和性を有し、かつ／または
ｂ）請求項１１～１６のいずれか一項に記載のＥＤＢ結合ドメインを含むタンパク質の１つと、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）への結合について競合する、
請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物。
ａ）請求項１１～１６のいずれか一項に記載のＥＤＢ結合ドメインを含むタンパク質の１つと比較して、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）に対する≧５０％の標的結合親和性を有し、かつ／または
ｂ）請求項１１～１６のいずれか一項に記載のＥＤＢ結合ドメインを含むタンパク質の１つと、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）への結合について競合する、
請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項18】
ＥＤＢ結合ドメインを含むタンパク質が、２つのＬ１９ ＶＨドメインおよび２つのＬ１９ ＶＬドメインを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項19】
ａ）２つのＬ１９ ＶＨドメインが同一のアミノ酸配列を有する、
ｂ）２つのＬ１９ ＶＨドメインが異なるアミノ酸配列を有する、
ｃ）２つのＬ１９ ＶＬドメインが同一のアミノ酸配列を有する、または
ｄ）２つのＬ１９ ＶＬドメインが異なるアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の組成物。
ｂ）２つのＬ１９ ＶＨドメインが異なるアミノ酸配列を有する、
ｃ）２つのＬ１９ ＶＬドメインが同一のアミノ酸配列を有する、または
ｄ）２つのＬ１９ ＶＬドメインが異なるアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の組成物。
【請求項20】
ＥＤＢ結合ドメインを含むタンパク質が、１つのＬ１９ ＶＨドメインおよび１つのＬ１９ ＶＬドメインを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項21】
前記組成物が、
ａ）第１のリンカーによりｐ３５ドメインに連結されたｐ４０ドメイン；
ｂ）ＳＡＤリンカーによりｐ３５ドメインに連結された第１のＬ１９ ＶＨドメイン；
ｃ）第３のリンカーにより第１のＬ１９ ＶＨドメインに連結された第１のＬ１９ ＶＬドメイン；
ｄ）第４のリンカーにより第１のＬ１９ ＶＬドメインに連結された第２のＬ１９ ＶＨドメイン；または
ｅ）第５のリンカーにより第２のＬ１９ ＶＨドメインに連結された第２のＬ１９ ＶＬドメイン
を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物。
ａ）第１のリンカーによりｐ３５ドメインに連結されたｐ４０ドメイン；
ｂ）ＳＡＤリンカーによりｐ３５ドメインに連結された第１のＬ１９ ＶＨドメイン；
ｃ）第３のリンカーにより第１のＬ１９ ＶＨドメインに連結された第１のＬ１９ ＶＬドメイン；
ｄ）第４のリンカーにより第１のＬ１９ ＶＬドメインに連結された第２のＬ１９ ＶＨドメイン；または
ｅ）第５のリンカーにより第２のＬ１９ ＶＨドメインに連結された第２のＬ１９ ＶＬドメイン
を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項22】
ｐ４０ドメインが、配列番号１またはその断片と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項23】
ｐ３５ドメインが、配列番号３に記載のアミノ酸配列またはその断片と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２１～２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項24】
第１のリンカーがＧＳリンカーである、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項25】
前記第１のリンカーが、配列番号２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項26】
第１のＬ１９ ＶＨドメイン、第２のＬ１９ ＶＨドメイン、またはその両方が、配列番号２８～３０のいずれか一つと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項27】
第１のＬ１９ ＶＬドメイン、第２のＬ１９ ＶＬドメイン、またはその両方が、配列番号３１～３３のいずれか一項にと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項28】
前記第１のＬ１９ ＶＨドメイン、前記第２のＬ１９ ＶＨドメイン、またはその両方が、配列番号７と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２１～２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項29】
前記第１のＬ１９ ＶＬドメイン、前記第２のＬ１９ ＶＬドメイン、またはその両方が、配列番号５と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２１～２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項30】
ＳＡＤリンカーが、配列番号４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２１～２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項31】
第３のリンカーがＧＳリンカーである、請求項２１～３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項32】
前記第３のリンカーが、配列番号６と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２１～３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項33】
第５のリンカーがＧＳリンカーである、請求項２１～３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項34】
前記第５のリンカーが、配列番号６と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２１～３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項35】
第３のリンカーおよび第５のリンカーが同一のアミノ酸配列を含む、請求項２１～３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項36】
第４のリンカーがＧＳリンカーである、請求項２１～３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項37】
前記第４のリンカーが、配列番号８と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２１～３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項38】
前記組成物が、配列番号１６と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項39】
組成物が、配列番号１６と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１～３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項40】
請求項１～３９のいずれか１項に記載の組成物、および任意選択的に、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項41】
ａ）請求項１～３９のいずれか１項に記載の組成物または請求項４０に記載の医薬組成物；および
ｂ）１つ以上の治療的活性化合物
を含む、組合せ。
ｂ）１つ以上の治療的活性化合物
を含む、組合せ。
【請求項42】
ａ）およびｂ）が別々に投与されるのに適している、請求項４１に記載の組合せ。
【請求項43】
請求項１～３９のいずれか１項に記載の組成物、または請求項４１に記載の組合せを含む、対象における腫瘍性疾患の治療または予防のための治療薬。
【請求項44】
対象が腫瘍性疾患を発症するリスクがある、請求項４３に記載の治療薬。
【請求項45】
対象が腫瘍性疾患に罹患している、請求項４３に記載の治療薬。
【請求項46】
腫瘍性疾患が、悪性黒色腫、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、腎細胞がん、尿路上皮がん、頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）又はミスマッチ修復機構欠損（ｄＭＭＲ）を有する転移性結腸直腸がん、肝細胞がん、胃がん、皮膚の扁平上皮がん、子宮頸がん、およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）からなる群より選択される、請求項４３～３５のいずれか１項記載の腫瘍性疾患を治療するための治療薬。
【請求項47】
請求項１～３９のいずれか１項に記載の組成物、または請求項４１に記載の組合せを含む、対象における血管新生を抑制するための治療薬。
【請求項48】
対象におけるＥＤ－Ｂフィブロネクチンの発現または過剰発現に関連する疾患または症状の治療のための医薬であって、請求項１～３９のいずれか１項に記載の組成物、または請求項４１に記載の組合せを含む、治療薬。
【請求項49】
ａ）請求項１～３９のいずれか一項に記載の組成物、請求項４０に記載の医薬組成物または請求項４１に記載の組合せ、
ｂ）組成物、組成物または組合せを投与するための装置、および
ｃ）使用説明書
を含むパーツの治療用キット。
ｂ）組成物、組成物または組合せを投与するための装置、および
ｃ）使用説明書
を含むパーツの治療用キット。
【請求項50】
請求項１～３９のいずれか１項に記載の組成物をコードするポリヌクレオチド。
【請求項51】
プロモーターと、請求項５０に記載のポリヌクレオチドとを含むベクター。
【請求項52】
ａ）請求項１～３９のいずれか１項に記載の組成物をコードするポリヌクレオチドを細胞に接触させること；
ｂ）ａ）でコードされるポリペプチドを産生するのに十分な量でポリヌクレオチドを発現させること；および
ｃ）該ポリペプチドを回収すること
を含むポリペプチドの製造方法。
ｂ）ａ）でコードされるポリペプチドを産生するのに十分な量でポリヌクレオチドを発現させること；および
ｃ）該ポリペプチドを回収すること
を含むポリペプチドの製造方法。
【請求項53】
細胞がＣＨＯ細胞である、請求項５２に記載の方法。
【請求項54】
請求項１～３９のいずれか１項に記載の組成物をコードするポリヌクレオチドを含む細胞。
【請求項55】
細胞がＣＨＯ細胞である、請求項５４に記載の細胞。
【外国語明細書】