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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023113686
(43)【公開日】2023-08-16
(54)【発明の名称】ｐＨ依存的抗体の調製方法
(51)【国際特許分類】
C12P 21/08 20060101AFI20230808BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20230808BHJP
【ＦＩ】
C12P21/08
C07K16/00
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023080909
(22)【出願日】2023-05-16
(62)【分割の表示】P 2019561746の分割
【原出願日】2018-05-10
(31)【優先権主張番号】1707484.0
(32)【優先日】2017-05-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(71)【出願人】
【識別番号】517303085
【氏名又は名称】アルジェニクス ビーブイ
(74)【代理人】
【識別番号】100097456
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 徹
(72)【発明者】
【氏名】クリストプヘ ブランチェトト
(72)【発明者】
【氏名】エリク ホフマン
(72)【発明者】
【氏名】ヨハネス デ ハアルド
(72)【発明者】
【氏名】ジャコブス コーネリス ラッセル
(57)【要約】 （修正有）
【課題】pH依存的抗原結合の改善を示す操作された抗体を調製するための方法を提供する。
【解決手段】方法は、抗体CDR中の規定されたアミノ酸位置の部分集合での、ヒスチジン残基の導入に基づく。ヒスチジン置換のために選択されるアミノ酸位置の集合は、天然抗体レパートリーからの機能的抗体のCDR中でのヒスチジン出現率のヒートマップから導き出す。該方法は、pH依存的抗体バリアントを同定するためのより簡便で時間のかからないアプローチを提供する。
【選択図】図１
【解決手段】方法は、抗体CDR中の規定されたアミノ酸位置の部分集合での、ヒスチジン残基の導入に基づく。ヒスチジン置換のために選択されるアミノ酸位置の集合は、天然抗体レパートリーからの機能的抗体のCDR中でのヒスチジン出現率のヒートマップから導き出す。該方法は、pH依存的抗体バリアントを同定するためのより簡便で時間のかからないアプローチを提供する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
その抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を調製する方法であって：
親抗体の少なくとも1つのアミノ酸残基をヒスチジン残基で置換することにより、該操
作された抗体を調製することを含み、以下のホットスポットリスト：
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されており、かつ以下
のコールドスポットリスト：
からの少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されておらず、該操作された抗
体がその抗原とのpH依存的結合を示す、前記方法。
親抗体の少なくとも1つのアミノ酸残基をヒスチジン残基で置換することにより、該操
作された抗体を調製することを含み、以下のホットスポットリスト：
【表1】
のコールドスポットリスト：
【表2】
体がその抗原とのpH依存的結合を示す、前記方法。
【請求項2】
前記操作された抗体が、中性pHにおけるよりも酸性pHでその抗原との親和性が低い、請
求項1記載の方法。
求項1記載の方法。
【請求項3】
酸性pHでの前記操作された抗体-抗原相互作用の解離速度定数（kd）が、中性pHでの該
操作された抗体-抗原相互作用の該解離速度定数（kd）よりも高い、請求項1記載の方法。
操作された抗体-抗原相互作用の該解離速度定数（kd）よりも高い、請求項1記載の方法。
【請求項4】
酸性pHでの前記操作された抗体-抗原相互作用の前記解離速度定数（kd）が、酸性pHで
の親抗体-抗原相互作用の該解離速度定数（kd）よりも高い、請求項1記載の方法。
の親抗体-抗原相互作用の該解離速度定数（kd）よりも高い、請求項1記載の方法。
【請求項5】
酸性pHでの前記操作された抗体-抗原相互作用の平衡解離定数（KD）が、中性pHでの該
操作された抗体-抗原相互作用の該平衡解離定数（KD）よりも高い、請求項1又は2記載の
方法。
操作された抗体-抗原相互作用の該平衡解離定数（KD）よりも高い、請求項1又は2記載の
方法。
【請求項6】
前記ホットスポットリストから選択される少なくとも2つのアミノ酸残基をヒスチジン
で置換する、請求項1～5のいずれか1項記載の方法。
で置換する、請求項1～5のいずれか1項記載の方法。
【請求項7】
前記ホットスポットリストから選択される少なくとも3つのアミノ酸残基をヒスチジン
で置換する、請求項1～5のいずれか1項記載の方法。
で置換する、請求項1～5のいずれか1項記載の方法。
【請求項8】
前記ホットスポットリストから選択される少なくとも4つのアミノ酸残基をヒスチジン
で置換する、請求項1～5のいずれか1項記載の方法。
で置換する、請求項1～5のいずれか1項記載の方法。
【請求項9】
以下の残基：H100g、H100k、H100m、H100n、L95、L95d、L95e、L95f、L97の1以上もヒ
スチジンで置換する、請求項1～8のいずれか1項記載の方法。
スチジンで置換する、請求項1～8のいずれか1項記載の方法。
【請求項10】
前記コールドスポットリストから選択される少なくとも2つのアミノ酸残基をヒスチジ
ンで置換しない、請求項1～9のいずれか1項記載の方法。
ンで置換しない、請求項1～9のいずれか1項記載の方法。
【請求項11】
前記コールドスポットリストから選択される少なくとも3つのアミノ酸残基をヒスチジ
ンで置換しない、請求項1～9のいずれか1項記載の方法。
ンで置換しない、請求項1～9のいずれか1項記載の方法。
【請求項12】
VHCDR1、VHCDR2、VLCDR1、及びVLCDR2の前記コールドスポットリストから選択されるア
ミノ酸残基のいずれもヒスチジンで置換しない、請求項1～9のいずれか1項記載の方法。
ミノ酸残基のいずれもヒスチジンで置換しない、請求項1～9のいずれか1項記載の方法。
【請求項13】
前記親抗体又はそのCDRがラクダ科動物種に由来する、請求項1～12のいずれか1項記載
の方法。
の方法。
【請求項14】
その抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を調製する方法であって：
(a) 抗原と結合する親抗体を提供する工程；
(b) 該親抗体の操作されたバリアントのパネルを調製する工程であって、該パネル中の
該操作されたバリアントの各々が少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジン残基で置換
されていることによって該親抗体と異なり、以下のホットスポットリスト：
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されており、かつ以下
のコールドスポットリスト：
からの少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されていない、前記工程；
(c) 該操作されたバリアントのパネルを該抗原とのpH依存的結合についてスクリーニン
グし、それによって該抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を同定する工程、を含
む、前記方法。
(a) 抗原と結合する親抗体を提供する工程；
(b) 該親抗体の操作されたバリアントのパネルを調製する工程であって、該パネル中の
該操作されたバリアントの各々が少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジン残基で置換
されていることによって該親抗体と異なり、以下のホットスポットリスト：
【表3】
のコールドスポットリスト：
【表4】
(c) 該操作されたバリアントのパネルを該抗原とのpH依存的結合についてスクリーニン
グし、それによって該抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を同定する工程、を含
む、前記方法。
【請求項15】
パート(c)で同定した前記操作された抗体が、中性pHにおけるよりも酸性pHでその抗原
との親和性が低い、請求項14記載の方法。
との親和性が低い、請求項14記載の方法。
【請求項16】
パート(c)で同定した前記操作された抗体が、酸性pHでの該操作された抗体-抗原相互作
用の前記解離速度定数（kd）が、中性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の該解離速
度定数（kd）よりも高いことを特徴とする、請求項14記載の方法。
用の前記解離速度定数（kd）が、中性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の該解離速
度定数（kd）よりも高いことを特徴とする、請求項14記載の方法。
【請求項17】
パート(c)で同定した前記操作された抗体が、酸性pHでの該操作された抗体-抗原相互作
用の前記解離速度定数（kd）が、酸性pHでの前記親抗体-抗原相互作用の該解離速度定数
（kd）よりも高いことを特徴とする、請求項14記載の方法。
用の前記解離速度定数（kd）が、酸性pHでの前記親抗体-抗原相互作用の該解離速度定数
（kd）よりも高いことを特徴とする、請求項14記載の方法。
【請求項18】
パート(c)で同定した前記操作された抗体が、酸性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用
の前記平衡解離定数（KD）が、中性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の該平衡解離
定数（KD）よりも高いことを特徴とする、請求項14又は15記載の方法。
の前記平衡解離定数（KD）が、中性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の該平衡解離
定数（KD）よりも高いことを特徴とする、請求項14又は15記載の方法。
【請求項19】
工程(b)が、前記親抗体の操作されたバリアントのパネルを調製する工程を含み、該パ
ネル中の該操作されたバリアントの各々が、VHドメイン中の少なくとも1つのアミノ酸残
基がヒスチジン残基で置換されていることによって該親抗体と異なり、以下のホットスポ
ットリスト：
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されており、かつ以下
のコールドスポットリスト：
からの少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されていない、請求項14～18の
いずれか1項記載の方法。
ネル中の該操作されたバリアントの各々が、VHドメイン中の少なくとも1つのアミノ酸残
基がヒスチジン残基で置換されていることによって該親抗体と異なり、以下のホットスポ
ットリスト：
【表5】
のコールドスポットリスト：
【表6】
いずれか1項記載の方法。
【請求項20】
工程(b)が、前記親抗体の操作されたバリアントのパネルを調製する工程を含み、該パ
ネル中の該操作されたバリアントの各々が、VLドメイン中の少なくとも1つのアミノ酸残
基がヒスチジン残基で置換されていることによって該親抗体と異なり、以下のホットスポ
ットリスト：
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されており、かつ以下
のコールドスポットリスト：
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されていない、請求項1
4～18のいずれか1項記載の方法。
ネル中の該操作されたバリアントの各々が、VLドメイン中の少なくとも1つのアミノ酸残
基がヒスチジン残基で置換されていることによって該親抗体と異なり、以下のホットスポ
ットリスト：
【表7】
のコールドスポットリスト：
【表8】
4～18のいずれか1項記載の方法。
【請求項21】
前記親抗体の前記VLドメインがλクラスに属し、かつ以下のホットスポットリスト：
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されており、かつ以下
のコールドスポットリスト：
からの少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されていない、請求項20記載の
方法。
【表9】
のコールドスポットリスト：
【表10】
方法。
【請求項22】
前記親抗体の前記VLドメインがκクラスに属し、かつ以下のホットスポットリスト：
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されており、かつ以下
のコールドスポットリスト：
からの少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されていない、請求項20記載の
方法。
【表11】
のコールドスポットリスト：
【表12】
方法。
【請求項23】
その抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を調製する方法であって：
(a) 抗原と結合する親抗体を同定する工程；
(b) 該親抗体の操作されたバリアントのパネルを調製する工程であって、該パネル中の
該操作されたバリアントの各々が少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジン残基で置換
されていることによって該親抗体と異なり、以下のホットスポットリスト：
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されており、かつ以下
のコールドスポットリスト：
からの少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されていない、前記工程；
(c) 該操作されたバリアントのパネルを該標的抗原とのpH依存的結合についてスクリー
ニングし、それによってヒスチジンの存在により該抗原とのpH依存的結合が付与される選
択されたアミノ酸位置を同定する工程；
(d) 該親抗体の1以上のさらに操作されたバリアントを調製する工程であって、該バリ
アントの各々が工程(c)で同定された2以上の選択されたアミノ酸位置にヒスチジンを含む
、前記工程；及び
(e) 該さらに操作されたバリアントを該抗原とのpH依存的結合についてスクリーニング
し；それによって該抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を同定する工程、を含む
、前記方法。
(a) 抗原と結合する親抗体を同定する工程；
(b) 該親抗体の操作されたバリアントのパネルを調製する工程であって、該パネル中の
該操作されたバリアントの各々が少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジン残基で置換
されていることによって該親抗体と異なり、以下のホットスポットリスト：
【表13】
のコールドスポットリスト：
【表14】
(c) 該操作されたバリアントのパネルを該標的抗原とのpH依存的結合についてスクリー
ニングし、それによってヒスチジンの存在により該抗原とのpH依存的結合が付与される選
択されたアミノ酸位置を同定する工程；
(d) 該親抗体の1以上のさらに操作されたバリアントを調製する工程であって、該バリ
アントの各々が工程(c)で同定された2以上の選択されたアミノ酸位置にヒスチジンを含む
、前記工程；及び
(e) 該さらに操作されたバリアントを該抗原とのpH依存的結合についてスクリーニング
し；それによって該抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を同定する工程、を含む
、前記方法。
【請求項24】
パート(e)で同定した前記操作された抗体が、中性pHにおけるよりも酸性pHでその抗原
との親和性が低い、請求項23記載の方法。
との親和性が低い、請求項23記載の方法。
【請求項25】
パート(e)で同定した前記操作された抗体が、酸性pHでの該操作された抗体-抗原相互作
用の前記解離速度定数（kd）が、中性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の該解離速
度定数（kd）よりも高いことを特徴とする、請求項23記載の方法。
用の前記解離速度定数（kd）が、中性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の該解離速
度定数（kd）よりも高いことを特徴とする、請求項23記載の方法。
【請求項26】
パート(e)で同定した前記操作された抗体が、酸性pHでの該操作された抗体-抗原相互作
用の前記解離速度定数（kd）が、酸性pHでの前記親抗体-抗原相互作用の該解離速度定数
（kd）よりも高いことを特徴とする、請求項23記載の方法。
用の前記解離速度定数（kd）が、酸性pHでの前記親抗体-抗原相互作用の該解離速度定数
（kd）よりも高いことを特徴とする、請求項23記載の方法。
【請求項27】
パート(e)で同定した前記操作された抗体が、酸性pHでの該操作された抗体-抗原相互作
用の前記平衡解離定数（KD）が、中性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の該平衡解
離定数（KD）よりも高いことを特徴とする、請求項23又は24記載の方法。
用の前記平衡解離定数（KD）が、中性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の該平衡解
離定数（KD）よりも高いことを特徴とする、請求項23又は24記載の方法。
【請求項28】
工程(b)の前記パネル中の前記操作されたバリアントの各々が、前記ホットスポットリ
ストから選択されたアミノ酸位置での単一のヒスチジン置換を含む、請求項23～27のいず
れか1項記載の方法。
ストから選択されたアミノ酸位置での単一のヒスチジン置換を含む、請求項23～27のいず
れか1項記載の方法。
【請求項29】
工程(d)の前記さらに操作されたバリアントが、工程(c)で同定された3以上の前記選択
されたアミノ酸位置にヒスチジン残基を含む、請求項23～28のいずれか1項記載の方法。
されたアミノ酸位置にヒスチジン残基を含む、請求項23～28のいずれか1項記載の方法。
【請求項30】
工程(d)の前記さらに操作されたバリアントが、工程(c)で同定された4以上の前記選択
されたアミノ酸位置にヒスチジン残基を含む、請求項23～28のいずれか1項記載の方法。
されたアミノ酸位置にヒスチジン残基を含む、請求項23～28のいずれか1項記載の方法。
【請求項31】
工程(d)の前記さらに操作されたバリアントが、以下のアミノ酸位置：H100g、H100k、H
100m、H100n、L95、L95d、L95e、L95f、L97の1以上にヒスチジン残基をさらに含む、請求
項23～28のいずれか1項記載の方法。
100m、H100n、L95、L95d、L95e、L95f、L97の1以上にヒスチジン残基をさらに含む、請求
項23～28のいずれか1項記載の方法。
【請求項32】
その抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を調製する方法であって：
(a) 抗原と結合する親抗体を同定する工程；
(b) 該親抗体の操作されたバリアントの第1のパネルを調製する工程であって、該パネ
ル中の該操作されたバリアントの各々が、VHドメイン中の少なくとも1つのアミノ酸残基
がヒスチジン残基で置換されていることによって該親抗体と異なり、以下のホットスポッ
トリスト：
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されており、かつ以下
のコールドスポットリスト：
からの少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されていない、前記工程；
(c) 該操作されたバリアントの第1のパネルを該抗原とのpH依存的結合についてスクリ
ーニングし；それによってヒスチジンの存在によりpH依存的結合が付与されるVHドメイン
中の1以上の選択されたアミノ酸位置を同定する工程；
(d) 該親抗体の操作されたバリアントの第2のパネルを調製する工程であって、該パネ
ル中の該操作されたバリアントの各々がVLドメイン中の少なくとも1つのアミノ酸残基が
ヒスチジン残基で置換されていることによって該親抗体と異なり、以下のホットスポット
リスト：
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されており、かつ以下
のコールドスポットリスト：
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されていない、前記工
程；
(e) 該操作されたバリアントの第2のパネルを該抗原とのpH依存的結合についてスクリ
ーニングし；それによってヒスチジンの存在によりpH依存的結合が付与されるVLドメイン
中の1以上の選択されたアミノ酸位置を同定する工程；
(f) 該親抗体の1以上のさらに操作されたバリアントを調製する工程であって、該バリ
アントの各々が、工程(c)で同定されたVHドメイン中の1以上の選択されたアミノ酸位置の
アミノ酸がヒスチジンで置換されていることによって該親抗体と異なり、かつ工程(e)で
同定されたVLドメイン中の1以上の選択されたアミノ酸位置のアミノ酸がヒスチジンで置
換されていることによって該親抗体と異なる、前記工程；
(g) 該さらに操作されたバリアントを該抗原とのpH依存的結合についてスクリーニング
し；それによって該抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を同定する工程、を含む
、前記方法。
(a) 抗原と結合する親抗体を同定する工程；
(b) 該親抗体の操作されたバリアントの第1のパネルを調製する工程であって、該パネ
ル中の該操作されたバリアントの各々が、VHドメイン中の少なくとも1つのアミノ酸残基
がヒスチジン残基で置換されていることによって該親抗体と異なり、以下のホットスポッ
トリスト：
【表15】
のコールドスポットリスト：
【表16】
(c) 該操作されたバリアントの第1のパネルを該抗原とのpH依存的結合についてスクリ
ーニングし；それによってヒスチジンの存在によりpH依存的結合が付与されるVHドメイン
中の1以上の選択されたアミノ酸位置を同定する工程；
(d) 該親抗体の操作されたバリアントの第2のパネルを調製する工程であって、該パネ
ル中の該操作されたバリアントの各々がVLドメイン中の少なくとも1つのアミノ酸残基が
ヒスチジン残基で置換されていることによって該親抗体と異なり、以下のホットスポット
リスト：
【表17】
のコールドスポットリスト：
【表18】
程；
(e) 該操作されたバリアントの第2のパネルを該抗原とのpH依存的結合についてスクリ
ーニングし；それによってヒスチジンの存在によりpH依存的結合が付与されるVLドメイン
中の1以上の選択されたアミノ酸位置を同定する工程；
(f) 該親抗体の1以上のさらに操作されたバリアントを調製する工程であって、該バリ
アントの各々が、工程(c)で同定されたVHドメイン中の1以上の選択されたアミノ酸位置の
アミノ酸がヒスチジンで置換されていることによって該親抗体と異なり、かつ工程(e)で
同定されたVLドメイン中の1以上の選択されたアミノ酸位置のアミノ酸がヒスチジンで置
換されていることによって該親抗体と異なる、前記工程；
(g) 該さらに操作されたバリアントを該抗原とのpH依存的結合についてスクリーニング
し；それによって該抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を同定する工程、を含む
、前記方法。
【請求項33】
前記親抗体の前記VLドメインがλクラスに属し、かつ以下のホットスポットリスト：
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されており、かつ以下
のコールドスポットリスト：
からの少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されていない、請求項32記載の
方法。
【表19】
のコールドスポットリスト：
【表20】
方法。
【請求項34】
前記親抗体の前記VLドメインがκクラスに属し、かつ以下のホットスポットリスト：
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されており、かつ以下
のコールドスポットリスト：
からの少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されていない、請求項32記載の
方法。
【表21】
のコールドスポットリスト：
【表22】
方法。
【請求項35】
パート(g)で同定した前記操作された抗体が、中性pHにおけるよりも酸性pHでその抗原
との親和性が低い、請求項32～34のいずれか1項記載の方法。
との親和性が低い、請求項32～34のいずれか1項記載の方法。
【請求項36】
パート(g)で同定した前記操作された抗体が、酸性pHでの該操作された抗体-抗原相互作
用の前記解離速度定数（kd）が、中性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の該解離速
度定数（kd）よりも高いことを特徴とする、請求項32～34のいずれか1項記載の方法。
用の前記解離速度定数（kd）が、中性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の該解離速
度定数（kd）よりも高いことを特徴とする、請求項32～34のいずれか1項記載の方法。
【請求項37】
パート(g)で同定した前記操作された抗体が、酸性pHでの該操作された抗体-抗原相互作
用の前記解離速度定数（kd）が、酸性pHでの前記親抗体-抗原相互作用の該解離速度定数
（kd）よりも高いことを特徴とする、請求項32～34のいずれか1項記載の方法。
用の前記解離速度定数（kd）が、酸性pHでの前記親抗体-抗原相互作用の該解離速度定数
（kd）よりも高いことを特徴とする、請求項32～34のいずれか1項記載の方法。
【請求項38】
パート(g)で同定した前記操作された抗体が、酸性pHでの該操作された抗体-抗原相互作
用の前記平衡解離定数（KD）が、中性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の該平衡解
離定数（KD）よりも高いことを特徴とする、請求項32～37のいずれか1項記載の方法。
用の前記平衡解離定数（KD）が、中性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の該平衡解
離定数（KD）よりも高いことを特徴とする、請求項32～37のいずれか1項記載の方法。
【請求項39】
工程(f)の前記さらに操作されたバリアントが、工程(c)及び(e)で同定された全部で3以
上の前記選択されたアミノ酸位置にヒスチジンを含む、請求項32～38のいずれか1項記載
の方法。
上の前記選択されたアミノ酸位置にヒスチジンを含む、請求項32～38のいずれか1項記載
の方法。
【請求項40】
工程(f)の前記さらに操作されたバリアントが、工程(c)及び(e)で同定された全部で4以
上の前記選択されたアミノ酸位置にヒスチジンを含む、請求項32～38のいずれか1項記載
の方法。
上の前記選択されたアミノ酸位置にヒスチジンを含む、請求項32～38のいずれか1項記載
の方法。
【請求項41】
工程(f)の前記さらに操作されたバリアントが、以下のアミノ酸位置：H100g、H100k、H10
0m、H100n、L95、L95d、L95e、L95f、L97の1以上にヒスチジン残基をさらに含む、請求項
32～38のいずれか1項記載の方法。
0m、H100n、L95、L95d、L95e、L95f、L97の1以上にヒスチジン残基をさらに含む、請求項
32～38のいずれか1項記載の方法。
【請求項42】
前記親抗体又はそのCDRがラクダ科動物種に由来する、請求項14～41のいずれか1項記載
の方法。
の方法。
【請求項43】
その抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体であって、該操作された抗体のCDR中
の少なくとも1つのアミノ酸がヒスチジン残基であり、以下のホットスポットリスト：
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジン残基であり、かつ以下のコー
ルドスポットリスト：
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジン残基でないことを特徴とする
、前記操作された抗体。
の少なくとも1つのアミノ酸がヒスチジン残基であり、以下のホットスポットリスト：
【表23】
ルドスポットリスト：
【表24】
、前記操作された抗体。
【請求項44】
前記操作された抗体が、中性pHにおけるよりも酸性pHでその抗原との親和性が低い、請
求項43記載の操作された抗体。
求項43記載の操作された抗体。
【請求項45】
酸性pHでの前記操作された抗体-抗原相互作用の前記解離速度定数（kd）が、中性pHで
の該操作された抗体-抗原相互作用の該解離速度定数（kd）よりも高い、請求項43記載の
操作された抗体。
の該操作された抗体-抗原相互作用の該解離速度定数（kd）よりも高い、請求項43記載の
操作された抗体。
【請求項46】
酸性pHでの前記操作された抗体-抗原相互作用の前記平衡解離定数（KD）が、中性pHで
の該操作された抗体-抗原相互作用の該平衡解離定数（KD）よりも高い、請求項43又は44
記載の操作された抗体。
の該操作された抗体-抗原相互作用の該平衡解離定数（KD）よりも高い、請求項43又は44
記載の操作された抗体。
【請求項47】
前記ホットスポットリストから選択される少なくとも2つのアミノ酸残基がヒスチジン
である、請求項43～46のいずれか1項記載の操作された抗体。
である、請求項43～46のいずれか1項記載の操作された抗体。
【請求項48】
前記ホットスポットリストから選択される少なくとも3つのアミノ酸残基がヒスチジン
である、請求項43～46のいずれか1項記載の操作された抗体。
である、請求項43～46のいずれか1項記載の操作された抗体。
【請求項49】
前記ホットスポットリストから選択される少なくとも4つのアミノ酸残基がヒスチジン
である、請求項43～46のいずれか1項記載の操作された抗体。
である、請求項43～46のいずれか1項記載の操作された抗体。
【請求項50】
以下のアミノ酸位置：H100g、H100k、H100m、H100n、L95、L95d、L95e、L95f、L97の1
以上にヒスチジン残基をさらに含む、請求項43～49のいずれか1項記載の操作された抗体
。
以上にヒスチジン残基をさらに含む、請求項43～49のいずれか1項記載の操作された抗体
。
【請求項51】
表Bに列記される位置の少なくとも2つのアミノ酸残基がヒスチジンではない、請求項43
～50のいずれか1項記載の操作された抗体。
～50のいずれか1項記載の操作された抗体。
【請求項52】
前記コールドスポットリストから選択される位置の少なくとも3つのアミノ酸残基がヒ
スチジンではない、請求項43～50のいずれか1項記載の操作された抗体。
スチジンではない、請求項43～50のいずれか1項記載の操作された抗体。
【請求項53】
以下のアミノ酸位置：H100g、H100k、H100m、H100n、L95、L95d、L95e、L95f、L97の1
以上にヒスチジンを含み得ることを条件として、前記コールドスポットリストに記載の位
置のいずれのアミノ酸残基もヒスチジンではない、請求項43～50のいずれか1項記載の操
作された抗体。
以上にヒスチジンを含み得ることを条件として、前記コールドスポットリストに記載の位
置のいずれのアミノ酸残基もヒスチジンではない、請求項43～50のいずれか1項記載の操
作された抗体。
【請求項54】
ラクダ科動物抗体の操作されたバリアントである、請求項43～53のいずれか1項記載の
操作された抗体。
操作された抗体。
【請求項55】
Fc領域を含み、新生児Fc受容体（FcRn）と結合する、請求項43～54のいずれか1項記載
の操作された抗体。
の操作された抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（発明の分野）
本開示は、抗体工学の分野、特に標的抗原とのpH依存的結合を示す抗体バリアントを操
作するための方法、並びに該方法によって調製された抗体に関する。
本開示は、抗体工学の分野、特に標的抗原とのpH依存的結合を示す抗体バリアントを操
作するための方法、並びに該方法によって調製された抗体に関する。
【背景技術】
【0002】
（背景）
標的抗原とのpH依存的結合を示す抗体を操作することへの関心は、ますます高まってい
る。特に、酸性pHでの抗原結合が中性pHにおけるものと比較して低下を示す抗体を同定す
ることに関心が集まっている。
標的抗原とのpH依存的結合を示す抗体を操作することへの関心は、ますます高まってい
る。特に、酸性pHでの抗原結合が中性pHにおけるものと比較して低下を示す抗体を同定す
ることに関心が集まっている。
【0003】
pH感受性抗原結合を取り入れることにより、操作された抗体のインビボでの機能を改善
することができる。抗体を操作すると、中性pH（例えば、pH 7.4）で高親和性抗原結合を
保持し、かつ酸性pH（例えば、pH 4.5～6.0）で結合の低下を示す場合がある。エンドソ
ーム経路に入ると、pH依存的抗原結合により、酸性化エンドソーム（約pH 6.0）における
抗体-抗原複合体の解離及びFcRnによって仲介される遊離抗体のリサイクリングが可能と
なり、ひいては抗体の低頻度化又は抗体用量の減少を可能にし得る抗原クリアランスの強
化が促進される。
することができる。抗体を操作すると、中性pH（例えば、pH 7.4）で高親和性抗原結合を
保持し、かつ酸性pH（例えば、pH 4.5～6.0）で結合の低下を示す場合がある。エンドソ
ーム経路に入ると、pH依存的抗原結合により、酸性化エンドソーム（約pH 6.0）における
抗体-抗原複合体の解離及びFcRnによって仲介される遊離抗体のリサイクリングが可能と
なり、ひいては抗体の低頻度化又は抗体用量の減少を可能にし得る抗原クリアランスの強
化が促進される。
【0004】
典型的に、pH依存的抗体-抗原結合は、相互作用する抗体の結合又はフォールディング
の構造的変化を仲介する、イオン性ヒスチジン残基の存在に依存している。低pH値でのヒ
スチジンプロトン化に際し誘導される静電相互作用の変化により、結合親和性が減少し得
る。
の構造的変化を仲介する、イオン性ヒスチジン残基の存在に依存している。低pH値でのヒ
スチジンプロトン化に際し誘導される静電相互作用の変化により、結合親和性が減少し得
る。
【0005】
ヒスチジンを置換する様々な戦略を使用することにより、タンパク質にpH感受性を取り
入れることを目指す様々なタンパク質工学アプローチが記載されている。例えば、顆粒球
コロニー刺激因子（GCSF）の受容体相互作用部位の構造モデリングによりガイドされた合
理的設計により、ヒスチジンで置換した際にpH感受性バリアントをもたらす突然変異部位
を同定することが可能となった（Sarkarらの文献、Nat Biotechnol, Vol. 20, pp908-13,
2002）。しかしながら、タンパク質中のpH感受性を仲介し得る個別のヒスチジン置換位
置の評価は、時間がかかり、かつ予測不能である。
入れることを目指す様々なタンパク質工学アプローチが記載されている。例えば、顆粒球
コロニー刺激因子（GCSF）の受容体相互作用部位の構造モデリングによりガイドされた合
理的設計により、ヒスチジンで置換した際にpH感受性バリアントをもたらす突然変異部位
を同定することが可能となった（Sarkarらの文献、Nat Biotechnol, Vol. 20, pp908-13,
2002）。しかしながら、タンパク質中のpH感受性を仲介し得る個別のヒスチジン置換位
置の評価は、時間がかかり、かつ予測不能である。
【0006】
代替のアプローチとして、好適なハイスループット技術、例えば酵母表面ディスプレイ
（YSD）又はファージディスプレイを用いたコンビナトリアルライブラリのスクリーニン
グが、様々な異なるタンパク質スキャフォールド中でのpH感受性結合の操作に応用されて
いる。Schroterらの文献、mAbs, vol. 7(1), 138-151, 2015には、可逆的pH感受性抗原結
合のために抗体重鎖及び軽鎖可変ドメインを操作する一般的戦略が記載されている。この
アプローチは、重鎖及び軽鎖のコンビナトリアルヒスチジン置換ライブラリの作製及びス
クリーニングに依存している。このアプローチでは、ヒスチジン突然変異をVH及びVL領域
の相補性決定領域（CDR）にランダムに導入する。ヒスチジン突然変異は、VHドメイン及
びVLドメインのCDR中の任意のアミノ酸位置に導入することができる。ヒスチジン突然変
異の割合は、ライブラリのバリアント当たり平均して3つのランダム突然変異を達成する
ように調整する。従って、完全なライブラリは理論上、CDR中の3つのランダムなヒスチジ
ン置換の全ての考え得る組合わせを含むバリアントを包含する。
（YSD）又はファージディスプレイを用いたコンビナトリアルライブラリのスクリーニン
グが、様々な異なるタンパク質スキャフォールド中でのpH感受性結合の操作に応用されて
いる。Schroterらの文献、mAbs, vol. 7(1), 138-151, 2015には、可逆的pH感受性抗原結
合のために抗体重鎖及び軽鎖可変ドメインを操作する一般的戦略が記載されている。この
アプローチは、重鎖及び軽鎖のコンビナトリアルヒスチジン置換ライブラリの作製及びス
クリーニングに依存している。このアプローチでは、ヒスチジン突然変異をVH及びVL領域
の相補性決定領域（CDR）にランダムに導入する。ヒスチジン突然変異は、VHドメイン及
びVLドメインのCDR中の任意のアミノ酸位置に導入することができる。ヒスチジン突然変
異の割合は、ライブラリのバリアント当たり平均して3つのランダム突然変異を達成する
ように調整する。従って、完全なライブラリは理論上、CDR中の3つのランダムなヒスチジ
ン置換の全ての考え得る組合わせを含むバリアントを包含する。
【0007】
このコンビナトリアルライブラリアプローチは、実にTNFとのpH依存的結合を示すアダ
リムマブの操作されたバリアントの同定の成功を可能にした。しかしながら、この戦略は
、考え得るヒスチジン置換のために、VHドメイン及びVLドメインのCDR中の全てのアミノ
酸位置をサンプリングするのに要求されるライブラリのサイズが大きいことが原因で、比
較的時間がかかる。さらに、この戦略では、ヒスチジン残基を不利な位置に導入すること
による全体の抗体構造及び安定性は考慮されない。
リムマブの操作されたバリアントの同定の成功を可能にした。しかしながら、この戦略は
、考え得るヒスチジン置換のために、VHドメイン及びVLドメインのCDR中の全てのアミノ
酸位置をサンプリングするのに要求されるライブラリのサイズが大きいことが原因で、比
較的時間がかかる。さらに、この戦略では、ヒスチジン残基を不利な位置に導入すること
による全体の抗体構造及び安定性は考慮されない。
【発明の概要】
【0008】
（発明の概要）
標的抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体バリアントを調製するための代替方法
であって、従来技術の方法より実施が簡便かつ時間のかからない、前記方法が要望されて
いる。さらにまた、pH依存的抗原結合を示し、中性pHでの抗原結合能に過度の影響を及ぼ
さない、操作された抗体の同定を可能にする方法が、要望されている。
標的抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体バリアントを調製するための代替方法
であって、従来技術の方法より実施が簡便かつ時間のかからない、前記方法が要望されて
いる。さらにまた、pH依存的抗原結合を示し、中性pHでの抗原結合能に過度の影響を及ぼ
さない、操作された抗体の同定を可能にする方法が、要望されている。
【0009】
これらの要望に対処するため、本件出願人は機能的（すなわち、抗原結合性の）抗体可
変ドメインの大きなレパートリーの相補性決定領域（CDR）中のヒスチジン残基の天然出
現率の体系的解析を実施した。この解析の結果、本件出願人はネイティブ抗体中での天然
ヒスチジン出現率の「ヒートマップ」を導き出すことができた。この「ヒートマップ」は
、抗体レパートリー中にヒスチジンが天然に出現し得るCDR中の「ホットスポット」アミ
ノ酸残基のリスト、及びまた、典型的にヒスチジンが天然には出現しないCDR中の「コー
ルドスポット」アミノ酸残基のリストの両方を提供する。これら「ホットスポット」及び
「コールドスポット」リストは、例えば合理的設計又はコンビナトリアルアプローチにお
けるpH依存的抗体バリアントの操作に応用することができる。
変ドメインの大きなレパートリーの相補性決定領域（CDR）中のヒスチジン残基の天然出
現率の体系的解析を実施した。この解析の結果、本件出願人はネイティブ抗体中での天然
ヒスチジン出現率の「ヒートマップ」を導き出すことができた。この「ヒートマップ」は
、抗体レパートリー中にヒスチジンが天然に出現し得るCDR中の「ホットスポット」アミ
ノ酸残基のリスト、及びまた、典型的にヒスチジンが天然には出現しないCDR中の「コー
ルドスポット」アミノ酸残基のリストの両方を提供する。これら「ホットスポット」及び
「コールドスポット」リストは、例えば合理的設計又はコンビナトリアルアプローチにお
けるpH依存的抗体バリアントの操作に応用することができる。
【0010】
第1の態様において、本発明は、その抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を調
製する方法であって：親抗体の少なくとも1つのアミノ酸残基をヒスチジン残基で置換す
ることにより、該操作された抗体を調製することを含み、以下のホットスポットリスト：
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基をヒスチジンで置換し、かつ以下のコール
ドスポットリスト：
からの少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されておらず、該操作された抗
体がその抗原とのpH依存的結合を示す、前記方法を提供する。
製する方法であって：親抗体の少なくとも1つのアミノ酸残基をヒスチジン残基で置換す
ることにより、該操作された抗体を調製することを含み、以下のホットスポットリスト：
【表1】
ドスポットリスト：
【表2】
体がその抗原とのpH依存的結合を示す、前記方法を提供する。
【0011】
該操作された抗体は、該ヒスチジンによる置換の結果として、該親抗体と比較して、pH
依存的結合の改善（すなわち、より高いpH依存性）を示す。
依存的結合の改善（すなわち、より高いpH依存性）を示す。
【0012】
本発明は、その抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を調製する方法であって：
(a) 抗原と結合する親抗体を提供する工程；
(b) 該親抗体の操作されたバリアントのパネルを調製する工程であって、該パネル中の
該操作されたバリアントの各々が少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジン残基で置換
されていることによって該親抗体と異なり、以下のホットスポットリスト：
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されており、かつ以下
のコールドスポットリスト：
からの少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されていない、前記工程；
(c) 該操作されたバリアントのパネルを該抗原とのpH依存的結合についてスクリーニン
グし、それによって該抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を同定する工程、を含
む、前記方法をさらに提供する。
(a) 抗原と結合する親抗体を提供する工程；
(b) 該親抗体の操作されたバリアントのパネルを調製する工程であって、該パネル中の
該操作されたバリアントの各々が少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジン残基で置換
されていることによって該親抗体と異なり、以下のホットスポットリスト：
【表3】
のコールドスポットリスト：
【表4】
(c) 該操作されたバリアントのパネルを該抗原とのpH依存的結合についてスクリーニン
グし、それによって該抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を同定する工程、を含
む、前記方法をさらに提供する。
【0013】
工程(c)で同定された該操作された抗体は、該ヒスチジンによる置換の結果として、該
親抗体と比較して、pH依存的結合の改善（すなわち、より高いpH依存性）を示す。
親抗体と比較して、pH依存的結合の改善（すなわち、より高いpH依存性）を示す。
【0014】
本発明は、その抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を調製する方法であって：
(a) 抗原と結合する親抗体を同定する工程；
(b) 該親抗体の操作されたバリアントのパネルを調製する工程であって、該パネル中の
該操作されたバリアントの各々が少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジン残基で置換
されていることによって該親抗体と異なり、以下のホットスポットリスト：
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されており、かつ以下
のコールドスポットリスト：
からの少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されていない、前記工程；
(c) 該操作されたバリアントのパネルを該標的抗原とのpH依存的結合についてスクリー
ニングし、それによってヒスチジンの存在により該抗原とのpH依存的結合が付与される選
択されたアミノ酸位置を同定する工程；
(d) 該親抗体の1以上のさらに操作されたバリアントを調製する工程であって、該バリ
アントの各々が工程(c)で同定された2以上の選択されたアミノ酸位置にヒスチジンを含む
、前記工程；及び
(e) 該さらに操作されたバリアントを該抗原とのpH依存的結合についてスクリーニング
し；それによって該抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を同定する工程、を含む
、前記方法をさらに提供する。
(a) 抗原と結合する親抗体を同定する工程；
(b) 該親抗体の操作されたバリアントのパネルを調製する工程であって、該パネル中の
該操作されたバリアントの各々が少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジン残基で置換
されていることによって該親抗体と異なり、以下のホットスポットリスト：
【表5】
のコールドスポットリスト：
【表6】
(c) 該操作されたバリアントのパネルを該標的抗原とのpH依存的結合についてスクリー
ニングし、それによってヒスチジンの存在により該抗原とのpH依存的結合が付与される選
択されたアミノ酸位置を同定する工程；
(d) 該親抗体の1以上のさらに操作されたバリアントを調製する工程であって、該バリ
アントの各々が工程(c)で同定された2以上の選択されたアミノ酸位置にヒスチジンを含む
、前記工程；及び
(e) 該さらに操作されたバリアントを該抗原とのpH依存的結合についてスクリーニング
し；それによって該抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を同定する工程、を含む
、前記方法をさらに提供する。
【0015】
工程(e)で同定された該操作された抗体は、該ヒスチジンによる置換の結果として、該
親抗体と比較して、pH依存的結合の改善（すなわち、より高いpH依存性）を示す。
親抗体と比較して、pH依存的結合の改善（すなわち、より高いpH依存性）を示す。
【0016】
第2の態様において、本発明は、その抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体であ
って、該操作された抗体のCDR中の少なくとも1つのアミノ酸がヒスチジン残基であり、以
下のホットスポットリスト：
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジン残基であり、かつ以下のコー
ルドスポットリスト：
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジン残基でないことを特徴とする
、前記操作された抗体を提供する。
って、該操作された抗体のCDR中の少なくとも1つのアミノ酸がヒスチジン残基であり、以
下のホットスポットリスト：
【表7】
ルドスポットリスト：
【表8】
、前記操作された抗体を提供する。
【発明を実施するための形態】
【0017】
（詳細な説明）
本開示は、標的抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を調製する方法であって、
親抗体の可変ドメイン中の（及び優先的にはそのCDR中の）選択されたアミノ酸をヒスチ
ジン残基で置換することに基づく、前記方法を提供する。イオン性ヒスチジン残基を抗体
分子のVH及び/又はVLドメインに導入すると、抗原結合のpH依存性が変化し得ることは、
当該技術分野において一般に公知である。しかしながら、今日に至るまで利用可能なpH依
存的抗原結合を操作するための方法は、CDR中の全てのアミノ酸残基を考え得るヒスチジ
ンによる置換のためにサンプリングするランダムなコンビナトリアルライブラリのスクリ
ーニングに大いに依存してきた。
本開示は、標的抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を調製する方法であって、
親抗体の可変ドメイン中の（及び優先的にはそのCDR中の）選択されたアミノ酸をヒスチ
ジン残基で置換することに基づく、前記方法を提供する。イオン性ヒスチジン残基を抗体
分子のVH及び/又はVLドメインに導入すると、抗原結合のpH依存性が変化し得ることは、
当該技術分野において一般に公知である。しかしながら、今日に至るまで利用可能なpH依
存的抗原結合を操作するための方法は、CDR中の全てのアミノ酸残基を考え得るヒスチジ
ンによる置換のためにサンプリングするランダムなコンビナトリアルライブラリのスクリ
ーニングに大いに依存してきた。
【0018】
本方法は、ヒスチジンで置換する特定のアミノ酸残基の選択を、機能的抗体分子のVH及
びVLドメイン中の、より詳細にはそのCDR中の特定のアミノ酸位置でのヒスチジン残基の
天然出現率により、また、CDR中の他のアミノ酸位置でのヒスチジン残基の天然不存在率
により、ガイドする点で従来技術の方法と異なる。従って、本明細書で開示する方法は、
可変ドメイン（及び特にCDR）中のアミノ酸位置の予め選択された部分集合から選択され
るアミノ酸位置でのヒスチジン置換に基づく一方、CDR中の他の残基は好ましくはヒスチ
ジンで置換されないものとして予め選択される。
びVLドメイン中の、より詳細にはそのCDR中の特定のアミノ酸位置でのヒスチジン残基の
天然出現率により、また、CDR中の他のアミノ酸位置でのヒスチジン残基の天然不存在率
により、ガイドする点で従来技術の方法と異なる。従って、本明細書で開示する方法は、
可変ドメイン（及び特にCDR）中のアミノ酸位置の予め選択された部分集合から選択され
るアミノ酸位置でのヒスチジン置換に基づく一方、CDR中の他の残基は好ましくはヒスチ
ジンで置換されないものとして予め選択される。
【0019】
ヒスチジンで置換する候補として予め選択するアミノ酸残基を、本明細書では「ホット
スポット」残基と呼ぶ（表A）。これらはCDR中のアミノ酸位置又はCDR近傍のフレームワ
ーク位置であり、これらの位置ではヒスチジンが機能的抗体レパートリー中に天然に出現
することが観察される。
スポット」残基と呼ぶ（表A）。これらはCDR中のアミノ酸位置又はCDR近傍のフレームワ
ーク位置であり、これらの位置ではヒスチジンが機能的抗体レパートリー中に天然に出現
することが観察される。
【0020】
表A（ホットスポット残基位置）
【表9】
【0021】
好ましくはヒスチジンで置換しないものとして予め選択するアミノ酸残基を、本明細書
では「コールドスポット」残基と呼ぶ（表B）。これらはCDR中のアミノ酸位置又はCDR近
傍のフレームワーク位置であり、これらの位置ではヒスチジンが機能的抗体レパートリー
中に観察されない。
では「コールドスポット」残基と呼ぶ（表B）。これらはCDR中のアミノ酸位置又はCDR近
傍のフレームワーク位置であり、これらの位置ではヒスチジンが機能的抗体レパートリー
中に観察されない。
【0022】
表B（コールドスポット残基位置）
【表10】
【0023】
本開示は、その抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を調製する方法であって、
親抗体の少なくとも1つのアミノ酸残基をヒスチジン残基（本明細書ではHISと略し得る）
で置換することにより、該操作された抗体を調製することを含む、前記方法を提供する。
該操作された抗体は、該ヒスチジンによる置換の結果として、該親抗体と比較して、pH依
存的結合の改善（すなわち、より高いpH依存性）を示す。「親抗体」とは、対象となる抗
原と結合することができる任意の抗体とし得る。親抗体は、典型的には従来型の四鎖免疫
グロブリンであり、これらにおいては、抗原結合特異性が対となったVH及びVLドメインに
よって付与される 。しかしながらまた、この方法は他の親抗体、並びに抗原結合断片、
例えばFab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv、scFv、ダイアボディ、トリアボディ、ミニボディな
ど、及び対となったVH及びVLドメインによって提供される抗原結合部位を含む任意の他の
改変免疫グロブリン構成における、pH依存的結合の操作に応用可能である。ある実施態様
において、親抗体又はその可変ドメイン若しくはCDRは、これらに限定されないが、ラマ
、ラクダ、ヒトコブラクダ、アルパカ、ビクーナ、又はグアナコを含むラクダ科動物種に
由来し得る。ラクダ科動物モノクローナル抗体の調製は、その内容が参照により本明細書
に組み込まれているWO2010/001251に詳細に記載されている。親抗体及びそれに由来する
操作された抗体の他の好ましい特徴は、本明細書の別所に記載する。親抗体が結合する抗
原の性質は、特に制限されない。
親抗体の少なくとも1つのアミノ酸残基をヒスチジン残基（本明細書ではHISと略し得る）
で置換することにより、該操作された抗体を調製することを含む、前記方法を提供する。
該操作された抗体は、該ヒスチジンによる置換の結果として、該親抗体と比較して、pH依
存的結合の改善（すなわち、より高いpH依存性）を示す。「親抗体」とは、対象となる抗
原と結合することができる任意の抗体とし得る。親抗体は、典型的には従来型の四鎖免疫
グロブリンであり、これらにおいては、抗原結合特異性が対となったVH及びVLドメインに
よって付与される 。しかしながらまた、この方法は他の親抗体、並びに抗原結合断片、
例えばFab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv、scFv、ダイアボディ、トリアボディ、ミニボディな
ど、及び対となったVH及びVLドメインによって提供される抗原結合部位を含む任意の他の
改変免疫グロブリン構成における、pH依存的結合の操作に応用可能である。ある実施態様
において、親抗体又はその可変ドメイン若しくはCDRは、これらに限定されないが、ラマ
、ラクダ、ヒトコブラクダ、アルパカ、ビクーナ、又はグアナコを含むラクダ科動物種に
由来し得る。ラクダ科動物モノクローナル抗体の調製は、その内容が参照により本明細書
に組み込まれているWO2010/001251に詳細に記載されている。親抗体及びそれに由来する
操作された抗体の他の好ましい特徴は、本明細書の別所に記載する。親抗体が結合する抗
原の性質は、特に制限されない。
【0024】
操作された抗体は、親抗体の1以上の選択されたアミノ酸残基をヒスチジンで置換する
ことによって調製する。操作された抗体は、親抗体と比較して全部で1、2、3、4、5、又
はそれ以上のヒスチジンによる置換を含み得る。ヒスチジンで置換された選択されたアミ
ノ酸残基は、典型的に抗体可変ドメインのCDR中又はCDR近傍のフレームワーク位置に位置
する。対となったVH及びVLドメインを含む抗体分子の場合、ヒスチジンによる置換のため
に選択する残基は、VHドメインのCDR若しくはVLドメインのCDR、又はVHドメイン及びVLド
メインの両方のCDR中に位置し得る。
ことによって調製する。操作された抗体は、親抗体と比較して全部で1、2、3、4、5、又
はそれ以上のヒスチジンによる置換を含み得る。ヒスチジンで置換された選択されたアミ
ノ酸残基は、典型的に抗体可変ドメインのCDR中又はCDR近傍のフレームワーク位置に位置
する。対となったVH及びVLドメインを含む抗体分子の場合、ヒスチジンによる置換のため
に選択する残基は、VHドメインのCDR若しくはVLドメインのCDR、又はVHドメイン及びVLド
メインの両方のCDR中に位置し得る。
【0025】
本明細書に記載するように、ヒスチジンで置換する少なくとも1つのアミノ酸位置は、
「ホットスポット」リストから選択しなくてはならない（表A）。ある実施態様において
、ヒスチジンで置換する少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、又は少なくと
も5つのアミノ酸位置を、「ホットスポット」リストから選択する。ある実施態様におい
て、操作された抗体中の全てのヒスチジン置換を、ホットスポットリスト（表A）から選
択されるアミノ酸位置に施す。すなわち、ホットスポットリスト中の残基のみをヒスチジ
ンによる置換のために選択し得る。しかしながら、他の実施態様において、少なくとも1
つのヒスチジン置換をホットスポットリスト（表A）から選択される位置に施すことを条
件として、ヒスチジン置換をホットスポットリストにない1以上の位置に含めることがで
きる。例として、以下に論ずるように、ある実施態様において1以上のヒスチジン置換をV
H CDR3及び/又はVL CDR3中の「コールドスポット」位置に含めることができる。
「ホットスポット」リストから選択しなくてはならない（表A）。ある実施態様において
、ヒスチジンで置換する少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、又は少なくと
も5つのアミノ酸位置を、「ホットスポット」リストから選択する。ある実施態様におい
て、操作された抗体中の全てのヒスチジン置換を、ホットスポットリスト（表A）から選
択されるアミノ酸位置に施す。すなわち、ホットスポットリスト中の残基のみをヒスチジ
ンによる置換のために選択し得る。しかしながら、他の実施態様において、少なくとも1
つのヒスチジン置換をホットスポットリスト（表A）から選択される位置に施すことを条
件として、ヒスチジン置換をホットスポットリストにない1以上の位置に含めることがで
きる。例として、以下に論ずるように、ある実施態様において1以上のヒスチジン置換をV
H CDR3及び/又はVL CDR3中の「コールドスポット」位置に含めることができる。
【0026】
本明細書に記載するように、親抗体には好ましくはヒスチジンによる置換のために選択
されない特定のアミノ酸位置がある。これらのアミノ酸位置は、「コールドスポット」リ
スト（表B)に示されているアミノ酸位置である。本明細書に記載の方法に従って調製する
操作された抗体は、コールドスポットリスト（表B）にあるヒスチジンで置換されない少
なくとも1つのアミノ酸位置を含まなくてはならない。ある実施態様において、コールド
スポットリスト（表B）にある少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、又は少な
くとも5つのアミノ酸位置は、ヒスチジンで置換しない。さらなる実施態様において、コ
ールドスポットリスト（表B）にあるアミノ酸位置のいずれもヒスチジンで置換しない。
されない特定のアミノ酸位置がある。これらのアミノ酸位置は、「コールドスポット」リ
スト（表B)に示されているアミノ酸位置である。本明細書に記載の方法に従って調製する
操作された抗体は、コールドスポットリスト（表B）にあるヒスチジンで置換されない少
なくとも1つのアミノ酸位置を含まなくてはならない。ある実施態様において、コールド
スポットリスト（表B）にある少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、又は少な
くとも5つのアミノ酸位置は、ヒスチジンで置換しない。さらなる実施態様において、コ
ールドスポットリスト（表B）にあるアミノ酸位置のいずれもヒスチジンで置換しない。
【0027】
VH CDR3及びVL CDR3の場合、表Bに列記される1以上のコールドスポットアミノ酸残基位
置にもヒスチジン残基を導入し、かつ結果として得る抗体バリアント（複数可）をpH依存
的結合について試験することは、差支えない（かつある実施態様では有益となり得る）。
VH CDR3及びVL CDR3の性質が高度に変化することを考慮すると、（ホットスポット位置に
加え、又はこれらに代えて）これらのCDR中のコールドスポット位置にヒスチジン残基を
導入することは、CDR1及びCDR2中のコールドスポット位置に導入した場合よりも抗体構造
中でより許容されやすく、かつpH依存的抗原結合への重要な寄与をなし得る。従って、VH
CDR3及びVL CDR3中の列記されたコールドスポット位置でのヒスチジンの置換は、本発明
の全ての態様で許容される。
置にもヒスチジン残基を導入し、かつ結果として得る抗体バリアント（複数可）をpH依存
的結合について試験することは、差支えない（かつある実施態様では有益となり得る）。
VH CDR3及びVL CDR3の性質が高度に変化することを考慮すると、（ホットスポット位置に
加え、又はこれらに代えて）これらのCDR中のコールドスポット位置にヒスチジン残基を
導入することは、CDR1及びCDR2中のコールドスポット位置に導入した場合よりも抗体構造
中でより許容されやすく、かつpH依存的抗原結合への重要な寄与をなし得る。従って、VH
CDR3及びVL CDR3中の列記されたコールドスポット位置でのヒスチジンの置換は、本発明
の全ての態様で許容される。
【0028】
具体的な一実施態様において、ヒスチジンで置換された全てのアミノ酸残基を、ホット
スポットリスト（表A）から選択するが、ここで1以上の以下の残基：H100g、H100k、H100
m、H100n、L95、L95d、L95e、L95f、L97をさらにヒスチジンで置換し得ることを条件とす
る。
スポットリスト（表A）から選択するが、ここで1以上の以下の残基：H100g、H100k、H100
m、H100n、L95、L95d、L95e、L95f、L97をさらにヒスチジンで置換し得ることを条件とす
る。
【0029】
（pH依存的結合）
本明細書に記載の方法に従って1以上のヒスチジン置換が導入された操作された抗体は
、標的抗原とのpH依存的結合を示し得る。
本明細書に記載の方法に従って1以上のヒスチジン置換が導入された操作された抗体は
、標的抗原とのpH依存的結合を示し得る。
【0030】
抗体-抗原結合相互作用との関連で本明細書で使用する用語「pH依存的結合」とは、酸
性pHでの抗体の抗原結合活性が、中性pHでの抗体の抗原結合活性と異なることを意味する
。
性pHでの抗体の抗原結合活性が、中性pHでの抗体の抗原結合活性と異なることを意味する
。
【0031】
抗原結合活性の様々な尺度を、酸性pHでの抗原結合活性の中性pHでの抗原結合活性に対
する差の指標として使用することができる。
する差の指標として使用することができる。
【0032】
一実施態様において、その抗原に対する抗体の「親和性」は、抗原結合活性の指標とし
て使用することができる。好ましい実施態様において、操作された抗体の酸性pHでのその
抗原に対する親和性が、操作された抗体の中性pHでのその抗原に対する親和性よりも低い
場合、操作された抗体は「pH依存的結合」を示す。
て使用することができる。好ましい実施態様において、操作された抗体の酸性pHでのその
抗原に対する親和性が、操作された抗体の中性pHでのその抗原に対する親和性よりも低い
場合、操作された抗体は「pH依存的結合」を示す。
【0033】
一実施態様において、抗体-抗原相互作用の解離速度定数（kd）（抗体のオフ速度koff
とも呼ぶ）を抗原結合活性の指標として使用することができる。好ましい実施態様におい
て、酸性pHでの操作された抗体-抗原相互作用の解離速度定数（kd）が、中性pHでの操作
された抗体-抗原相互作用の解離速度定数（kd）よりも高い場合、操作された抗体は、「p
H依存的結合」を示す。
とも呼ぶ）を抗原結合活性の指標として使用することができる。好ましい実施態様におい
て、酸性pHでの操作された抗体-抗原相互作用の解離速度定数（kd）が、中性pHでの操作
された抗体-抗原相互作用の解離速度定数（kd）よりも高い場合、操作された抗体は、「p
H依存的結合」を示す。
【0034】
解離速度定数（kd）をpH依存的結合の指標として使用する実施態様において、酸性pHで
の操作された抗体-抗原相互作用の解離速度定数（kd）の、中性pHでの操作された抗体-抗
原相互作用の解離速度定数（kd）に対する比は、少なくとも1.5、又は少なくとも2、又は
少なくとも5、又は少なくとも10となり得る。
の操作された抗体-抗原相互作用の解離速度定数（kd）の、中性pHでの操作された抗体-抗
原相互作用の解離速度定数（kd）に対する比は、少なくとも1.5、又は少なくとも2、又は
少なくとも5、又は少なくとも10となり得る。
【0035】
他の実施態様において、酸性pH（例えば、pH 5.5）での操作された抗体の解離速度定数
（kd）は、同じ酸性pHでの親抗体の解離速度定数（kd）よりも高い。そのような実施態様
において、酸性pH（例えば、pH 5.5）でのkdは、ヒスチジン置換の結果として親抗体と比
較して高い。ある実施態様において、酸性pHでの操作された抗体-抗原相互作用の解離速
度定数（kd）の、同じ酸性pHでの親抗体-抗原相互作用の解離速度定数（kd）に対する比
は、少なくとも1.5、又は少なくとも2、又は少なくとも5、又は少なくとも10となり得る
。インビボでの抗体リサイクリング経路を鑑みるに、酸性pH（例えば、pH 5.5）での解離
速度（kd）は、pH依存的結合の特に妥当な尺度である。酸性pH（pH 5.5～6.0）での抗原-
抗体複合体の解離がより速くなれば、酸性化エンドソーム中での抗原の放出が可能となる
。
（kd）は、同じ酸性pHでの親抗体の解離速度定数（kd）よりも高い。そのような実施態様
において、酸性pH（例えば、pH 5.5）でのkdは、ヒスチジン置換の結果として親抗体と比
較して高い。ある実施態様において、酸性pHでの操作された抗体-抗原相互作用の解離速
度定数（kd）の、同じ酸性pHでの親抗体-抗原相互作用の解離速度定数（kd）に対する比
は、少なくとも1.5、又は少なくとも2、又は少なくとも5、又は少なくとも10となり得る
。インビボでの抗体リサイクリング経路を鑑みるに、酸性pH（例えば、pH 5.5）での解離
速度（kd）は、pH依存的結合の特に妥当な尺度である。酸性pH（pH 5.5～6.0）での抗原-
抗体複合体の解離がより速くなれば、酸性化エンドソーム中での抗原の放出が可能となる
。
【0036】
一実施態様において、平衡解離定数（KD）は、抗原結合活性の指標として使用すること
ができる。好ましい実施態様において、酸性pHでの操作された抗体-抗原相互作用の平衡
解離定数（KD）が、中性pHでの操作された抗体-抗原相互作用の平衡解離定数（KD）より
も高い場合、操作された抗体は、「pH依存的結合」を示す。
ができる。好ましい実施態様において、酸性pHでの操作された抗体-抗原相互作用の平衡
解離定数（KD）が、中性pHでの操作された抗体-抗原相互作用の平衡解離定数（KD）より
も高い場合、操作された抗体は、「pH依存的結合」を示す。
【0037】
平衡解離定数（KD）をpH依存的結合の指標として使用する実施態様において、酸性pHで
の操作された抗体-抗原相互作用の平衡解離定数（KD）の、中性pHでの操作された抗体-抗
原相互作用の平衡解離定数（KD）に対する比は、1.5超、又は2超、又は5超、又は10超と
なり得る。特に好ましい実施態様において、操作された抗体は酸性pHでの抗原結合に対し
て中性pHで20～40倍強い抗原結合を示し得る。
の操作された抗体-抗原相互作用の平衡解離定数（KD）の、中性pHでの操作された抗体-抗
原相互作用の平衡解離定数（KD）に対する比は、1.5超、又は2超、又は5超、又は10超と
なり得る。特に好ましい実施態様において、操作された抗体は酸性pHでの抗原結合に対し
て中性pHで20～40倍強い抗原結合を示し得る。
【0038】
平衡解離定数（KD）を抗原結合活性の指標として使用する非限定的な実施態様において
、操作された抗体は、酸性pH（例えば、pH 5.5）で10～20 nMの範囲のその抗原に対する
平衡解離定数（KD）を示し得る；それに対し、操作された抗体の中性pH（例えば、pH 7.4
）でのその抗原に対するKDは、およそ0.5 nM以下となり得る。
、操作された抗体は、酸性pH（例えば、pH 5.5）で10～20 nMの範囲のその抗原に対する
平衡解離定数（KD）を示し得る；それに対し、操作された抗体の中性pH（例えば、pH 7.4
）でのその抗原に対するKDは、およそ0.5 nM以下となり得る。
【0039】
pH依存的結合を示すために使用できる他の抗原結合活性の尺度には、親和性定数又は会
合速度定数（ka）又はオン速度（kon）があり得る。
合速度定数（ka）又はオン速度（kon）があり得る。
【0040】
アンタゴニスト抗体について、抗原結合活性の尺度は遮断能、すなわち好適なアッセイ
におけるIC50とし得る。
におけるIC50とし得る。
【0041】
好ましい実施態様において、1以上のヒスチジン置換を含む操作された抗体は、親抗体
と比較して高いその抗原との結合のpH依存性を示す。「より高い結合のpH依存性」とは、
酸性pHでの抗原結合活性及び中性pHでの抗原結合活性の差が、操作された抗体に対して、
その由来となる親抗体に対するよりも有意に大きいことを意味する。
と比較して高いその抗原との結合のpH依存性を示す。「より高い結合のpH依存性」とは、
酸性pHでの抗原結合活性及び中性pHでの抗原結合活性の差が、操作された抗体に対して、
その由来となる親抗体に対するよりも有意に大きいことを意味する。
【0042】
いくつかの実施態様において、親抗体はその標的抗原との結合の顕著なpH依存性を示し
得ず、pH依存性は1以上のヒスチジン置換の結果として操作されたバリアントに導入され
得る。他の実施態様において、親抗体は測定可能なpH依存性を示す場合があり、このpH依
存性は1以上のヒスチジン置換の結果として操作されたバリアントにおいて有意に高くな
る。
得ず、pH依存性は1以上のヒスチジン置換の結果として操作されたバリアントに導入され
得る。他の実施態様において、親抗体は測定可能なpH依存性を示す場合があり、このpH依
存性は1以上のヒスチジン置換の結果として操作されたバリアントにおいて有意に高くな
る。
【0043】
ある実施態様において、中性pHでの抗原-抗体結合力を著しく損なうことなく、操作さ
れた抗体にpH依存性を導入することが可能な場合がある。そのような実施態様において、
操作された抗体は、その由来となる親抗体と比較して有意に低い酸性pHでの抗原結合活性
を示し得るのに対し、中性pHでの操作された抗体の抗原結合活性は、中性pHでのその由来
となる親抗体の抗原結合活性と同等となり得る（すなわち、有意に異ならない）。
れた抗体にpH依存性を導入することが可能な場合がある。そのような実施態様において、
操作された抗体は、その由来となる親抗体と比較して有意に低い酸性pHでの抗原結合活性
を示し得るのに対し、中性pHでの操作された抗体の抗原結合活性は、中性pHでのその由来
となる親抗体の抗原結合活性と同等となり得る（すなわち、有意に異ならない）。
【0044】
本明細書に記載する、ヒスチジン置換の候補となるアミノ酸を機能的抗体レパートリー
中でのヒスチジンの天然出現率の「ヒートマップ」に従って選択する方法の1つの利点は
、ヒスチジン残基が典型的に抗体レパートリー中にそれが天然に出現し得る「ホットスポ
ット」アミノ酸位置にのみ導入され、従って抗体構造中で許容されることである。ホット
スポット位置でのヒスチジン置換により中性pHでの抗原結合活性の強度に顕著な影響を及
ぼすことなく抗原結合のpH依存性を付与することができることが認められている。
中でのヒスチジンの天然出現率の「ヒートマップ」に従って選択する方法の1つの利点は
、ヒスチジン残基が典型的に抗体レパートリー中にそれが天然に出現し得る「ホットスポ
ット」アミノ酸位置にのみ導入され、従って抗体構造中で許容されることである。ホット
スポット位置でのヒスチジン置換により中性pHでの抗原結合活性の強度に顕著な影響を及
ぼすことなく抗原結合のpH依存性を付与することができることが認められている。
【0045】
一実施態様において、操作された抗体は親抗体と比較して高いその抗原との結合のpH依
存性を示す一方で、中性pHでの親抗体の抗原結合活性を少なくとも80%保持する。さらな
る実施態様において、操作された抗体は、中性pHでの親抗体の抗原結合活性を少なくとも
80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は100%保持し得る一方で、依然
としてpH依存的結合を示す。
存性を示す一方で、中性pHでの親抗体の抗原結合活性を少なくとも80%保持する。さらな
る実施態様において、操作された抗体は、中性pHでの親抗体の抗原結合活性を少なくとも
80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は100%保持し得る一方で、依然
としてpH依存的結合を示す。
【0046】
好ましい実施態様において、操作された抗体は親抗体と比較して高いその抗原との結合
のpH依存性を示す一方で、中性pHでの親抗体の該抗原に対する親和性を少なくとも80%、
少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は100%保持する。
のpH依存性を示す一方で、中性pHでの親抗体の該抗原に対する親和性を少なくとも80%、
少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は100%保持する。
【0047】
平衡解離定数（KD）を抗原結合活性の指標として使用する実施態様において、操作され
た抗体は中性pHでの標的抗原に対する親抗体のKDよりも20%以下、又は15%以下、又は10%
以下、又は5%以下大きい中性pHでの標的抗原に対する平衡解離定数（KD）を示し得る。他
の実施態様において、操作された抗体は、中性pHでの標的抗原に対する親抗体のKDと実質
的に等しい中性pHでの標的抗原に対する平衡解離定数（KD）を示し得る。
た抗体は中性pHでの標的抗原に対する親抗体のKDよりも20%以下、又は15%以下、又は10%
以下、又は5%以下大きい中性pHでの標的抗原に対する平衡解離定数（KD）を示し得る。他
の実施態様において、操作された抗体は、中性pHでの標的抗原に対する親抗体のKDと実質
的に等しい中性pHでの標的抗原に対する平衡解離定数（KD）を示し得る。
【0048】
他の実施態様において、pH依存性を導入すると、中性pHでのその抗原に対する操作され
た抗体の親和性が低下する場合がある。しかしながら、所望の結合のpH依存性が達成され
ることを条件として、標的抗原の性質、抗体の意図された用途、及びまた親抗体の特性に
よっては中性pHでの親和性の低下は許容し得る場合がある。例えば、親抗体が中性pHでそ
の抗原に対する特に高い親和性を示すならば、このことにpH依存性の顕著な向上が付随す
る場合（すなわち中性pHでの結合及び酸性pHでの結合の間に所望の「倍数差」が達成され
ることを条件として）中性pHでのその抗原に対する操作された抗体の親和性の低下は許容
され得る。ある実施態様において、所望の結合のpH依存性もまた達成されることを条件と
して、中性pHでのその標的抗原に対する操作された抗体の親和性は、中性pHでのその抗原
に対する親抗体の親和性よりも最大10倍低く、又は20倍低くさえなり得る。
た抗体の親和性が低下する場合がある。しかしながら、所望の結合のpH依存性が達成され
ることを条件として、標的抗原の性質、抗体の意図された用途、及びまた親抗体の特性に
よっては中性pHでの親和性の低下は許容し得る場合がある。例えば、親抗体が中性pHでそ
の抗原に対する特に高い親和性を示すならば、このことにpH依存性の顕著な向上が付随す
る場合（すなわち中性pHでの結合及び酸性pHでの結合の間に所望の「倍数差」が達成され
ることを条件として）中性pHでのその抗原に対する操作された抗体の親和性の低下は許容
され得る。ある実施態様において、所望の結合のpH依存性もまた達成されることを条件と
して、中性pHでのその標的抗原に対する操作された抗体の親和性は、中性pHでのその抗原
に対する親抗体の親和性よりも最大10倍低く、又は20倍低くさえなり得る。
【0049】
上記実施態様の各々において、「酸性pH」とは、pH 4.0～pH 6.5、好ましくはpH 4.5～
pH 6.0、より好ましくはpH 5.5～pH 6.0、及びより好ましくはpH 5.5～pH 5.8の範囲のpH
を指す。
pH 6.0、より好ましくはpH 5.5～pH 6.0、及びより好ましくはpH 5.5～pH 5.8の範囲のpH
を指す。
【0050】
上記実施態様の各々において、「中性pH」とは、pH 6.7～pH 10.0、好ましくはpH 7.0
～pH 8.0、より好ましくはpH 7.4の範囲のpHを指す。
～pH 8.0、より好ましくはpH 7.4の範囲のpHを指す。
【0051】
特定の実施態様において、pH依存的結合は、酸性pH 5.5での抗体の抗原結合活性を中性
pH 7.4での同抗体の抗原結合活性と比較することによって評価することができる。
pH 7.4での同抗体の抗原結合活性と比較することによって評価することができる。
【0052】
他の実施態様において、pH依存的結合は、酸性pH 6.0での抗体の抗原結合活性を中性pH
7.4での同抗体の抗原結合活性と比較することによって評価することができる。
7.4での同抗体の抗原結合活性と比較することによって評価することができる。
【0053】
規定されたpHでの抗体の抗原結合活性を決定するための適切な方法及び条件は、一般に
当該技術分野において公知である。例として、規定されたpHでの抗体の抗原結合活性は、
添付する実験実施例に記載の通りBiacore（登録商標）（GE Healthcare）により、ELISA
により、又はMSDプラットフォームを使用して測定することができる。
当該技術分野において公知である。例として、規定されたpHでの抗体の抗原結合活性は、
添付する実験実施例に記載の通りBiacore（登録商標）（GE Healthcare）により、ELISA
により、又はMSDプラットフォームを使用して測定することができる。
【0054】
（ヒスチジン出現率のヒートマップ）
本明細書に記載の親抗体のアミノ酸残基は、天然抗体レパートリー中の機能的抗体のCD
R中の特定のアミノ酸位置でのヒスチジン残基の出現率の「ヒートマップ」に基づいて、
ヒスチジンによる置換のために選択し、又はヒスチジンにより置換しないものとし得る。
この「ヒートマップ」は、抗体レパートリー中にヒスチジンが天然に出現し得るCDR中の
「ホットスポット」アミノ酸残基位置及びCDR近傍のフレームワーク位置のリスト、並び
にまた、典型的にヒスチジンが天然には出現しないCDR中の「コールドスポット」アミノ
酸残基位置及びCDR近傍のフレームワーク位置のリストの両方を提供する。
本明細書に記載の親抗体のアミノ酸残基は、天然抗体レパートリー中の機能的抗体のCD
R中の特定のアミノ酸位置でのヒスチジン残基の出現率の「ヒートマップ」に基づいて、
ヒスチジンによる置換のために選択し、又はヒスチジンにより置換しないものとし得る。
この「ヒートマップ」は、抗体レパートリー中にヒスチジンが天然に出現し得るCDR中の
「ホットスポット」アミノ酸残基位置及びCDR近傍のフレームワーク位置のリスト、並び
にまた、典型的にヒスチジンが天然には出現しないCDR中の「コールドスポット」アミノ
酸残基位置及びCDR近傍のフレームワーク位置のリストの両方を提供する。
【0055】
「抗体レパートリー」とは、抗原結合活性を示す抗体集団を意味する。「天然抗体レパ
ートリー」は、典型的に標的抗原を用いた宿主の免疫化によって生産された抗体集団であ
る。これらレパートリーは、2以上の標的抗原に対する抗体を含み得る。本開示において
、ヒスチジン出現率の「ヒートマップ」は、それ自体複数の異なる標的抗原を用いた宿主
動物の免疫化により誘導された、多様なラマ抗体のレパートリーに由来している。また、
これらの免疫化から単離された抗体を特異的ファージディスプレイ選択によってスクリー
ニングし、これによりpH依存的抗原結合を示す抗体の富化が可能となった。
ートリー」は、典型的に標的抗原を用いた宿主の免疫化によって生産された抗体集団であ
る。これらレパートリーは、2以上の標的抗原に対する抗体を含み得る。本開示において
、ヒスチジン出現率の「ヒートマップ」は、それ自体複数の異なる標的抗原を用いた宿主
動物の免疫化により誘導された、多様なラマ抗体のレパートリーに由来している。また、
これらの免疫化から単離された抗体を特異的ファージディスプレイ選択によってスクリー
ニングし、これによりpH依存的抗原結合を示す抗体の富化が可能となった。
【0056】
（置換する残基の選択）
任意の所与の親抗体について、ヒスチジンによる置換の候補アミノ酸残基の選択を、ヒ
スチジン出現率のヒートマップによりガイドする。
任意の所与の親抗体について、ヒスチジンによる置換の候補アミノ酸残基の選択を、ヒ
スチジン出現率のヒートマップによりガイドする。
【0057】
アミノ酸残基の「置換（substitution）」又は「置換（replacement）」という用語は
、本明細書で互換的に使用する。親抗体の操作されたバリアントである操作された抗体の
文脈において、「置換」には親抗体の規定されたアミノ酸位置でのアミノ酸残基が異なる
アミノ酸残基、すなわち親抗体のその位置には天然に出現しないヒスチジン残基で置換さ
れることが要求される。
、本明細書で互換的に使用する。親抗体の操作されたバリアントである操作された抗体の
文脈において、「置換」には親抗体の規定されたアミノ酸位置でのアミノ酸残基が異なる
アミノ酸残基、すなわち親抗体のその位置には天然に出現しないヒスチジン残基で置換さ
れることが要求される。
【0058】
本明細書に記載のヒスチジン出現率の「ヒートマップ」は、ヒスチジンが天然に出現す
ることが観察されるホットスポットアミノ酸位置のリストを提供する。操作された抗体の
由来となる対象とする親抗体は、ホットスポットリストにある1以上のアミノ酸位置にヒ
スチジン残基を天然に含み得る。これらの状況にあって、天然のヒスチジン残基はpH依存
的抗原結合に寄与し得るため、一般に操作された抗体中に保持されるであろう。しかしな
がら、本明細書に記載の方法においては、この天然に出現するヒスチジンはヒスチジン置
換として数に入れない。従って、本明細書に記載の方法には、操作された抗体が、その由
来となる親抗体と比較して、1以上のホットスポットアミノ酸位置に少なくとも1つの追加
のヒスチジン残基を含まなくてはならないことが要求される。操作された抗体への1以上
の追加のヒスチジン残基の導入により、既にホットスポットヒスチジン残基を含んでいる
親抗体についてさえ、操作された抗体のpH依存的結合が改善され得る（すなわち、より高
い標的抗原との結合のpH依存性をもたらす）。
ることが観察されるホットスポットアミノ酸位置のリストを提供する。操作された抗体の
由来となる対象とする親抗体は、ホットスポットリストにある1以上のアミノ酸位置にヒ
スチジン残基を天然に含み得る。これらの状況にあって、天然のヒスチジン残基はpH依存
的抗原結合に寄与し得るため、一般に操作された抗体中に保持されるであろう。しかしな
がら、本明細書に記載の方法においては、この天然に出現するヒスチジンはヒスチジン置
換として数に入れない。従って、本明細書に記載の方法には、操作された抗体が、その由
来となる親抗体と比較して、1以上のホットスポットアミノ酸位置に少なくとも1つの追加
のヒスチジン残基を含まなくてはならないことが要求される。操作された抗体への1以上
の追加のヒスチジン残基の導入により、既にホットスポットヒスチジン残基を含んでいる
親抗体についてさえ、操作された抗体のpH依存的結合が改善され得る（すなわち、より高
い標的抗原との結合のpH依存性をもたらす）。
【0059】
ヒスチジンで置換する候補アミノ酸残基は、VH及びVLドメインのCDR中のアミノ酸位置
及びCDR近傍のフレームワーク位置がKABAT付番体系（Kabatらの文献、「免疫学の対象と
なるタンパク質の配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」、第5版
、Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）に
従って同定された「ホットスポット」リスト（表A）から選択する。操作された抗体は、
表Aから選択されるアミノ酸位置に少なくとも1つのヒスチジン置換を含まなくてはならな
い。
及びCDR近傍のフレームワーク位置がKABAT付番体系（Kabatらの文献、「免疫学の対象と
なるタンパク質の配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」、第5版
、Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）に
従って同定された「ホットスポット」リスト（表A）から選択する。操作された抗体は、
表Aから選択されるアミノ酸位置に少なくとも1つのヒスチジン置換を含まなくてはならな
い。
【0060】
様々なアプローチを使用して、対象とする親抗体にpH依存的抗原結合を付与するための
最も適切なヒスチジン置換を選択することができる。その標的抗原との親抗体の結合相互
作用についての構造的情報が利用可能である場合、ヒスチジン置換のためのホットスポッ
トリストから候補アミノ酸を選択するために「合理的設計」アプローチを利用することは
、適切であり得る。抗原-抗体結合相互作用に直接関与し、又は親抗体の抗原結合接触面
の全体的構造に影響を及ぼす可能性が高いホットスポット残基を、そのような構造的情報
に基づいて選択することができる。続いて1以上の選択されたホットスポット残基又はそ
れらの異なる組合わせがヒスチジンで置換された親抗体の操作されたバリアントを合成し
、例えば本明細書に記載のスクリーニング方法を使用してpH依存的抗原結合についてスク
リーニングすることができる。
最も適切なヒスチジン置換を選択することができる。その標的抗原との親抗体の結合相互
作用についての構造的情報が利用可能である場合、ヒスチジン置換のためのホットスポッ
トリストから候補アミノ酸を選択するために「合理的設計」アプローチを利用することは
、適切であり得る。抗原-抗体結合相互作用に直接関与し、又は親抗体の抗原結合接触面
の全体的構造に影響を及ぼす可能性が高いホットスポット残基を、そのような構造的情報
に基づいて選択することができる。続いて1以上の選択されたホットスポット残基又はそ
れらの異なる組合わせがヒスチジンで置換された親抗体の操作されたバリアントを合成し
、例えば本明細書に記載のスクリーニング方法を使用してpH依存的抗原結合についてスク
リーニングすることができる。
【0061】
また、ヒスチジンによる置換の候補残基は、親抗体の可変ドメインのファミリー又はサ
ブタイプに基づいて選択することができる。本明細書では、同様に抗体レパートリー中の
ヒスチジン出現率のヒートマップに由来する、様々なサブタイプに特異的なホットスポッ
ト残基のリストを記載する。ある実施態様において、親抗体のVH及び/又はVLドメインの
可変ドメインのファミリー又はサブタイプが公知であり、ヒスチジンによる置換の候補残
基は以下のサブタイプ特異的又はファミリー特異的なホットスポットリストから選択する
ことができる。これらのリストは限定することを意図するものではなく、単に特定の可変
ドメインのファミリー又はサブタイプについてのヒスチジンによる置換に最も適切であり
得るアミノ酸位置の模範を提供するものである。任意の所与の可変ドメインについて、考
え得るヒスチジンで置換するアミノ酸位置は、可変ドメインのファミリー又はサブタイプ
にかかわらず、完全ホットスポットリスト（表A）から選択することができる。
ブタイプに基づいて選択することができる。本明細書では、同様に抗体レパートリー中の
ヒスチジン出現率のヒートマップに由来する、様々なサブタイプに特異的なホットスポッ
ト残基のリストを記載する。ある実施態様において、親抗体のVH及び/又はVLドメインの
可変ドメインのファミリー又はサブタイプが公知であり、ヒスチジンによる置換の候補残
基は以下のサブタイプ特異的又はファミリー特異的なホットスポットリストから選択する
ことができる。これらのリストは限定することを意図するものではなく、単に特定の可変
ドメインのファミリー又はサブタイプについてのヒスチジンによる置換に最も適切であり
得るアミノ酸位置の模範を提供するものである。任意の所与の可変ドメインについて、考
え得るヒスチジンで置換するアミノ酸位置は、可変ドメインのファミリー又はサブタイプ
にかかわらず、完全ホットスポットリスト（表A）から選択することができる。
【0062】
VH3ファミリーの重鎖可変ドメインについて：
表VH3A（VH3ファミリーのホットスポット残基）
表VH3B（VH3ファミリーのコールドスポット残基）
表VH3A（VH3ファミリーのホットスポット残基）
【表11】
【表12】
【0063】
VH1ファミリーの重鎖可変ドメインについて：
表VH1A（VH1ファミリーのホットスポット残基）
表VH1B（VH1ファミリーのコールドスポット残基）
表VH1A（VH1ファミリーのホットスポット残基）
【表13】
【表14】
【0064】
VH4ファミリーの重鎖可変ドメインについて：
表VH4A（VH4ファミリーのホットスポット残基）
表VH4B（VH4ファミリーのコールドスポット残基）
表VH4A（VH4ファミリーのホットスポット残基）
【表15】
【表16】
【0065】
λタイプの軽鎖可変ドメインについて：
表VλA（Vλのホットスポット残基）
表VλB（Vλのコールドスポット残基）
表VλA（Vλのホットスポット残基）
【表17】
【表18】
【0066】
Vλ1ファミリーの軽鎖可変ドメインについて：
表Vλ1A（Vλ1ファミリーのホットスポット残基）
表Vλ1B（Vλ1ファミリーのコールドスポット残基）
表Vλ1A（Vλ1ファミリーのホットスポット残基）
【表19】
【表20】
【0067】
Vλ2ファミリーの軽鎖可変ドメインについて：
表Vλ2A（Vλ2ファミリーのホットスポット残基）
表Vλ2B（Vλ2ファミリーのコールドスポット残基）
表Vλ2A（Vλ2ファミリーのホットスポット残基）
【表21】
【表22】
【0068】
Vλ3ファミリーの軽鎖可変ドメインについて：
表Vλ3A（Vλ3ファミリーのホットスポット残基）
表Vλ3B（Vλ3ファミリーのコールドスポット残基）
表Vλ3A（Vλ3ファミリーのホットスポット残基）
【表23】
【表24】
【0069】
Vλ5ファミリーの軽鎖可変ドメインについて：
表Vλ5A（Vλ5ファミリーのホットスポット残基）
表Vλ5B（Vλ5ファミリーのコールドスポット残基）
表Vλ5A（Vλ5ファミリーのホットスポット残基）
【表25】
【表26】
【0070】
Vλ8ファミリーの軽鎖可変ドメインについて：
表Vλ8A（Vλ8ファミリーのホットスポット残基）
表Vλ8B（Vλ8ファミリーのコールドスポット残基）
表Vλ8A（Vλ8ファミリーのホットスポット残基）
【表27】
【表28】
【0071】
κタイプの軽鎖可変ドメインについて：
表VΚA（VΚのホットスポット残基）
表VΚB（VΚのコールドスポット残基）
表VΚA（VΚのホットスポット残基）
【表29】
【表30】
【0072】
VΚ1ファミリーの軽鎖可変ドメインについて：
表VΚ1A（VΚ1ファミリーのホットスポット残基）
表VΚ1B（VΚ1ファミリーのコールドスポット残基）
表VΚ1A（VΚ1ファミリーのホットスポット残基）
【表31】
【表32】
【0073】
VΚ2ファミリーの軽鎖可変ドメインについて：
表VΚ2A（VΚ2ファミリーのホットスポット残基）
表VΚ2B（VΚ2ファミリーのコールドスポット残基）
表VΚ2A（VΚ2ファミリーのホットスポット残基）
【表33】
【表34】
【0074】
VΚ4ファミリーの軽鎖可変ドメインについて：
表VΚ4A（VΚ4ファミリーのホットスポット残基）
表VΚ4B（VΚ4ファミリーのコールドスポット残基）
表VΚ4A（VΚ4ファミリーのホットスポット残基）
【表35】
【表36】
【0075】
（バリアントのパネルのスクリーニング）
本発明の方法の特定の実施態様は、親抗体の操作されたバリアントのパネルの構築と、
それに続き所望のpH依存的結合を示す1以上の操作されたバリアントを同定するために該
パネルをスクリーニングすることに基づくことができる。バリアントのパネルを構築すれ
ば、ヒートマップに規定されるアミノ酸位置での多数の考え得るヒスチジン置換を、体系
的に突然変異解析することが可能となる。この方法は、バリアントのパネルの構築をヒス
チジン出現率のヒートマップによってガイドし、従ってヒスチジンによる置換の候補とし
てCDR中の全ての考え得るアミノ酸位置及びそれらの組合わせをサンプリングすることを
必要とせず、又はそのようにすることを妥当でないものとする点で、従来技術におけるコ
ンビナトリアル方法と異なる。
本発明の方法の特定の実施態様は、親抗体の操作されたバリアントのパネルの構築と、
それに続き所望のpH依存的結合を示す1以上の操作されたバリアントを同定するために該
パネルをスクリーニングすることに基づくことができる。バリアントのパネルを構築すれ
ば、ヒートマップに規定されるアミノ酸位置での多数の考え得るヒスチジン置換を、体系
的に突然変異解析することが可能となる。この方法は、バリアントのパネルの構築をヒス
チジン出現率のヒートマップによってガイドし、従ってヒスチジンによる置換の候補とし
てCDR中の全ての考え得るアミノ酸位置及びそれらの組合わせをサンプリングすることを
必要とせず、又はそのようにすることを妥当でないものとする点で、従来技術におけるコ
ンビナトリアル方法と異なる。
【0076】
本明細書に記載の体系的突然変異解析方法は一般に：
(a) 抗原と結合する親抗体を提供する工程；
(b) 該親抗体の操作されたバリアントのパネルを調製する工程であって、該パネル中の
該操作されたバリアントの各々が少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジン残基で置換
されていることによって該親抗体と異なり、ホットスポットリスト（表A）から選択され
る少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されており、かつコールドスポット
リスト（表B）から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されてい
ない、前記工程；
(c) 該操作されたバリアントのパネルを該抗原とのpH依存的結合についてスクリーニン
グし、それによって該抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を同定する工程、を含
む。
(a) 抗原と結合する親抗体を提供する工程；
(b) 該親抗体の操作されたバリアントのパネルを調製する工程であって、該パネル中の
該操作されたバリアントの各々が少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジン残基で置換
されていることによって該親抗体と異なり、ホットスポットリスト（表A）から選択され
る少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されており、かつコールドスポット
リスト（表B）から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されてい
ない、前記工程；
(c) 該操作されたバリアントのパネルを該抗原とのpH依存的結合についてスクリーニン
グし、それによって該抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を同定する工程、を含
む。
【0077】
この方法には、対象とする親抗体の操作されたバリアントのパネルを調製することが要
求され、パネル中の操作されたバリアントの各々は、少なくとも1つのアミノ酸がヒスチ
ジンにより置換されていることによって親抗体と異なる。また、ヒスチジンで置換するア
ミノ酸位置の選択は、ヒスチジン出現率のヒートマップに基づく。パネル中の操作された
バリアントの各々は、ホットスポットリスト（表A）から選択されるアミノ酸位置での少
なくとも1つのヒスチジンによる置換を含まなくてはならない一方、コールドスポットリ
スト（表B）から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基は、ヒスチジンで置換されてい
ない。好ましくは、パネル中の操作されたバリアントの各々には、異なるパターンのヒス
チジン置換を含める。そうすれば、異なるヒスチジン置換によるpH依存的抗原結合への効
果を並行して解析することが可能となる。
求され、パネル中の操作されたバリアントの各々は、少なくとも1つのアミノ酸がヒスチ
ジンにより置換されていることによって親抗体と異なる。また、ヒスチジンで置換するア
ミノ酸位置の選択は、ヒスチジン出現率のヒートマップに基づく。パネル中の操作された
バリアントの各々は、ホットスポットリスト（表A）から選択されるアミノ酸位置での少
なくとも1つのヒスチジンによる置換を含まなくてはならない一方、コールドスポットリ
スト（表B）から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基は、ヒスチジンで置換されてい
ない。好ましくは、パネル中の操作されたバリアントの各々には、異なるパターンのヒス
チジン置換を含める。そうすれば、異なるヒスチジン置換によるpH依存的抗原結合への効
果を並行して解析することが可能となる。
【0078】
方法の一実施態様において、パネル中の操作されたバリアントの各々は、列記されたホ
ットスポットアミノ酸位置（表A）の1つに単一のヒスチジン置換を含み得る。好ましくは
、パネル中の操作されたバリアントの各々は、列記されたホットスポットアミノ酸位置（
表A）の1つに異なるヒスチジン置換を含む。そのようなパネルにより、個別のホットスポ
ットアミノ酸位置でのヒスチジン置換によるpH依存的結合への効果を解析することが可能
となる。操作されたバリアントのパネルはホットスポットリストの全体を代表し得る。す
なわち、表Aに列記されたアミノ酸位置の各々に単一のヒスチジン置換を有するバリアン
トを含むことができ、又はホットスポットリストの選択された部分集合、例えば1以上の
具体的な可変ドメインのファミリー若しくはサブタイプと関連する置換の部分集合などを
代表し得る。さらにまた、パネルはVH CDR3又はVL CDR3中の1以上の「コールドスポット
」位置にヒスチジン置換を含むバリアントを含み得る。
ットスポットアミノ酸位置（表A）の1つに単一のヒスチジン置換を含み得る。好ましくは
、パネル中の操作されたバリアントの各々は、列記されたホットスポットアミノ酸位置（
表A）の1つに異なるヒスチジン置換を含む。そのようなパネルにより、個別のホットスポ
ットアミノ酸位置でのヒスチジン置換によるpH依存的結合への効果を解析することが可能
となる。操作されたバリアントのパネルはホットスポットリストの全体を代表し得る。す
なわち、表Aに列記されたアミノ酸位置の各々に単一のヒスチジン置換を有するバリアン
トを含むことができ、又はホットスポットリストの選択された部分集合、例えば1以上の
具体的な可変ドメインのファミリー若しくはサブタイプと関連する置換の部分集合などを
代表し得る。さらにまた、パネルはVH CDR3又はVL CDR3中の1以上の「コールドスポット
」位置にヒスチジン置換を含むバリアントを含み得る。
【0079】
他の実施態様において、工程(b)で調製したパネルは、2以上、3以上、4以上、又は5以
上のヒスチジン置換の様々な組合わせを含む操作されたバリアントを含み得るが、これに
は少なくとも1つの該置換が表Aから選択されるホットスポットアミノ酸位置になくてはな
らない一方、表Bからの少なくとも1つのアミノ酸は、ヒスチジンで置換されていないこと
を条件とする。好ましくは、該ヒスチジン置換の全てを表Aから選択されるホットスポッ
トアミノ酸位置で行う。このパネルにより、pH依存的結合を付与するヒスチジン残基の組
合わせ（及び特にホットスポットヒスチジン置換の組合わせ）をスクリーニングすること
が可能となる。さらにまた、パネルはVH CDR3又はVL CDR3中の1以上の「コールドスポッ
ト」位置でのヒスチジン置換を、任意に1以上のホットスポットアミノ酸位置でのヒスチ
ジン置換と組合わせて含むバリアントを含み得る。
上のヒスチジン置換の様々な組合わせを含む操作されたバリアントを含み得るが、これに
は少なくとも1つの該置換が表Aから選択されるホットスポットアミノ酸位置になくてはな
らない一方、表Bからの少なくとも1つのアミノ酸は、ヒスチジンで置換されていないこと
を条件とする。好ましくは、該ヒスチジン置換の全てを表Aから選択されるホットスポッ
トアミノ酸位置で行う。このパネルにより、pH依存的結合を付与するヒスチジン残基の組
合わせ（及び特にホットスポットヒスチジン置換の組合わせ）をスクリーニングすること
が可能となる。さらにまた、パネルはVH CDR3又はVL CDR3中の1以上の「コールドスポッ
ト」位置でのヒスチジン置換を、任意に1以上のホットスポットアミノ酸位置でのヒスチ
ジン置換と組合わせて含むバリアントを含み得る。
【0080】
ある実施態様において、ヒスチジンで置換することによりpH依存的結合を付与すること
ができる単一のアミノ酸位置を同定するために、初期スクリーニングを先に記載の通り単
一ヒスチジン置換を含む操作されたバリアントのパネルに対して実施することができる。
この初期スクリーニングの結果に基づいて、既にpH依存的結合を付与するものとして同定
されたヒスチジン置換を組合わせた1以上のさらに操作されたバリアントを構築すること
ができる。そのような方法は：
(a) 抗原と結合する親抗体を同定する工程；
(b) 該親抗体の操作されたバリアントのパネルを調製する工程であって、該パネル中の
該操作されたバリアントの各々が少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジン残基で置換
されていることによって該親抗体と異なり、ホットスポットリスト（表A）から選択され
る少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されており、かつコールドスポット
リスト（表B）から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されてい
ない、前記工程（ここで、好ましくは該操作されたバリアントの各々は、異なるパターン
のヒスチジン置換を含む）；
(c) 該操作されたバリアントのパネルを該標的抗原とのpH依存的結合についてスクリー
ニングし、それによってヒスチジンの存在により該抗原とのpH依存的結合が付与される選
択されたアミノ酸位置を同定する工程；
(d) 該親抗体の1以上のさらに操作されたバリアントを調製する工程であって、該バリ
アントの各々が工程(c)で同定された2以上の選択されたアミノ酸位置にヒスチジンを含む
、前記工程；及び
(e) 該さらに操作されたバリアントを該抗原とのpH依存的結合についてスクリーニング
し；それによって該抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を同定する工程、を含み
得る。
ができる単一のアミノ酸位置を同定するために、初期スクリーニングを先に記載の通り単
一ヒスチジン置換を含む操作されたバリアントのパネルに対して実施することができる。
この初期スクリーニングの結果に基づいて、既にpH依存的結合を付与するものとして同定
されたヒスチジン置換を組合わせた1以上のさらに操作されたバリアントを構築すること
ができる。そのような方法は：
(a) 抗原と結合する親抗体を同定する工程；
(b) 該親抗体の操作されたバリアントのパネルを調製する工程であって、該パネル中の
該操作されたバリアントの各々が少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジン残基で置換
されていることによって該親抗体と異なり、ホットスポットリスト（表A）から選択され
る少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されており、かつコールドスポット
リスト（表B）から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されてい
ない、前記工程（ここで、好ましくは該操作されたバリアントの各々は、異なるパターン
のヒスチジン置換を含む）；
(c) 該操作されたバリアントのパネルを該標的抗原とのpH依存的結合についてスクリー
ニングし、それによってヒスチジンの存在により該抗原とのpH依存的結合が付与される選
択されたアミノ酸位置を同定する工程；
(d) 該親抗体の1以上のさらに操作されたバリアントを調製する工程であって、該バリ
アントの各々が工程(c)で同定された2以上の選択されたアミノ酸位置にヒスチジンを含む
、前記工程；及び
(e) 該さらに操作されたバリアントを該抗原とのpH依存的結合についてスクリーニング
し；それによって該抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を同定する工程、を含み
得る。
【0081】
方法の特定の実施態様において、VHドメイン及びVLドメイン中のヒスチジン置換は、そ
れらのpH依存的結合に対する効果を個別に解析することができる。従って、一実施態様に
おいて、工程(b)は、該親抗体の操作されたバリアントのパネルを調製する工程であって
、該パネル中の該操作されたバリアントの各々がVHドメイン中の少なくとも1つのアミノ
酸残基がヒスチジン残基で置換されていることによって該親抗体と異なり、重鎖ホットス
ポットリスト（表HA）から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換
されており、かつ重鎖コールドスポットリスト（表HB）から選択される少なくとも1つの
アミノ酸残基がヒスチジンで置換されていない、前記工程を含む。さらにまた、パネルは
VH CDR3中の「コールドスポット」位置にヒスチジン置換を含むバリアントを含み得る。
れらのpH依存的結合に対する効果を個別に解析することができる。従って、一実施態様に
おいて、工程(b)は、該親抗体の操作されたバリアントのパネルを調製する工程であって
、該パネル中の該操作されたバリアントの各々がVHドメイン中の少なくとも1つのアミノ
酸残基がヒスチジン残基で置換されていることによって該親抗体と異なり、重鎖ホットス
ポットリスト（表HA）から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換
されており、かつ重鎖コールドスポットリスト（表HB）から選択される少なくとも1つの
アミノ酸残基がヒスチジンで置換されていない、前記工程を含む。さらにまた、パネルは
VH CDR3中の「コールドスポット」位置にヒスチジン置換を含むバリアントを含み得る。
【0082】
典型的に、操作されたバリアントは、親抗体のVLドメインと対をなす、1以上のヒスチ
ジン置換を含む突然変異体VHドメインを含む。そのようなライブラリを用いると、VHドメ
イン中のpH依存的結合を付与するヒスチジン置換をスクリーニングすることが可能となる
。
ジン置換を含む突然変異体VHドメインを含む。そのようなライブラリを用いると、VHドメ
イン中のpH依存的結合を付与するヒスチジン置換をスクリーニングすることが可能となる
。
【0083】
表HA（VHホットスポット残基位置）
表HB（VHコールドスポット残基位置）
【表37】
【表38】
【0084】
さらなる実施態様において、工程(b)は、該親抗体の操作されたバリアントのパネルを
調製する工程であって、該パネル中の該操作されたバリアントの各々がVLドメイン中の少
なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジン残基で置換されていることによって該親抗体と
異なり、軽鎖ホットスポットリスト（表LA）から選択される少なくともアミノ酸残基がヒ
スチジンで置換されており、かつ軽鎖ホットスポットリスト（表LB）から選択される少な
くとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されていない、前記工程を含む。さらにま
た、パネルはVL CDR3中の「コールドスポット」位置にヒスチジン置換を含むバリアント
を含み得る。
調製する工程であって、該パネル中の該操作されたバリアントの各々がVLドメイン中の少
なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジン残基で置換されていることによって該親抗体と
異なり、軽鎖ホットスポットリスト（表LA）から選択される少なくともアミノ酸残基がヒ
スチジンで置換されており、かつ軽鎖ホットスポットリスト（表LB）から選択される少な
くとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されていない、前記工程を含む。さらにま
た、パネルはVL CDR3中の「コールドスポット」位置にヒスチジン置換を含むバリアント
を含み得る。
【0085】
典型的に、操作されたバリアントは、親抗体のVHドメインと対をなす、1以上のヒスチ
ジン置換を含む突然変異体VLドメインを含む。そのようなライブラリを用いると、VLドメ
イン中のpH依存的結合を付与するヒスチジン置換をスクリーニングすることが可能となる
。
ジン置換を含む突然変異体VLドメインを含む。そのようなライブラリを用いると、VLドメ
イン中のpH依存的結合を付与するヒスチジン置換をスクリーニングすることが可能となる
。
【0086】
表LA（VLホットスポット残基位置）
表LB（VLコールドスポット残基位置）
【表39】
【表40】
【0087】
λクラスの軽鎖バリアントについて、「ホットスポット」及び「コールドスポット」残
基位置は以下のリストから選択することができる：
表VλA（Vλホットスポット残基）
表VλB（Vλコールドスポット残基）
基位置は以下のリストから選択することができる：
表VλA（Vλホットスポット残基）
【表41】
【表42】
【0088】
κクラスの軽鎖バリアントについて、「ホットスポット」及び「コールドスポット」残
基位置は以下のリストから選択することができる：
表VΚA（VΚホットスポット残基位置）
表VΚB（VΚコールドスポット残基位置）
基位置は以下のリストから選択することができる：
表VΚA（VΚホットスポット残基位置）
【表43】
【表44】
【0089】
ある実施態様において、個別の初期VH及びVLドメインスクリーニングによって同定され
たVH及びVLドメインのヒスチジン置換を、単一の操作されたバリアント中で組合わせるこ
とができる。続いて、さらなるスクリーニングを実施して、pH依存的結合を示すVH及びVL
の組合わせを同定することができる。そのような方法は：
(a) 抗原と結合する親抗体を同定する工程；
(b) 該親抗体の操作されたバリアントの第1のパネルを調製する工程であって、該パネ
ル中の該操作されたバリアントの各々がVHドメイン中の少なくとも1つのアミノ酸残基が
ヒスチジン残基で置換されていることによって該親抗体と異なり、重鎖ホットスポットリ
スト（表HA）から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されてお
り、かつ重鎖コールドスポットリスト（表HB）から選択される少なくとも1つのアミノ酸
残基がヒスチジンで置換されていない、前記工程；
(c) 該操作されたバリアントの第1のパネルを該抗原とのpH依存的結合についてスクリ
ーニングし；それによってヒスチジンの存在によりpH依存的結合が付与されるVHドメイン
中の1以上の選択されたアミノ酸位置を同定する工程；
(d) 該親抗体の操作されたバリアントの第2のパネルを調製する工程であって、該パネ
ル中の該操作されたバリアントの各々がVLドメイン中の少なくとも1つのアミノ酸残基が
ヒスチジン残基で置換されていることによって該親抗体と異なり、軽鎖ホットスポットリ
スト（表LA）から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されてお
り、かつ軽鎖ホットスポットリスト（表LB）から選択される少なくとも1つのアミノ酸残
基がヒスチジンで置換されていない、前記工程；
(e) 該操作されたバリアントの第2のパネルを該抗原とのpH依存的結合についてスクリ
ーニングし；それによってヒスチジンの存在によりpH依存的結合が付与されるVLドメイン
中の1以上の選択されたアミノ酸位置を同定する工程；
(f) 該親抗体の1以上のさらに操作されたバリアントを調製する工程であって、該バリ
アントの各々が、工程(c)で同定されたVHドメイン中の1以上の選択されたアミノ酸位置の
アミノ酸がヒスチジンで置換されていることによって該親抗体と異なり、かつ工程(e)で
同定されたVLドメイン中の1以上の選択されたアミノ酸位置のアミノ酸がヒスチジンで置
換されていることによって該親抗体と異なる、前記工程；及び
(g) 該さらに操作されたバリアントを該抗原とのpH依存的結合についてスクリーニング
し；それによって該抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を同定する工程、を含み
得る。
たVH及びVLドメインのヒスチジン置換を、単一の操作されたバリアント中で組合わせるこ
とができる。続いて、さらなるスクリーニングを実施して、pH依存的結合を示すVH及びVL
の組合わせを同定することができる。そのような方法は：
(a) 抗原と結合する親抗体を同定する工程；
(b) 該親抗体の操作されたバリアントの第1のパネルを調製する工程であって、該パネ
ル中の該操作されたバリアントの各々がVHドメイン中の少なくとも1つのアミノ酸残基が
ヒスチジン残基で置換されていることによって該親抗体と異なり、重鎖ホットスポットリ
スト（表HA）から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されてお
り、かつ重鎖コールドスポットリスト（表HB）から選択される少なくとも1つのアミノ酸
残基がヒスチジンで置換されていない、前記工程；
(c) 該操作されたバリアントの第1のパネルを該抗原とのpH依存的結合についてスクリ
ーニングし；それによってヒスチジンの存在によりpH依存的結合が付与されるVHドメイン
中の1以上の選択されたアミノ酸位置を同定する工程；
(d) 該親抗体の操作されたバリアントの第2のパネルを調製する工程であって、該パネ
ル中の該操作されたバリアントの各々がVLドメイン中の少なくとも1つのアミノ酸残基が
ヒスチジン残基で置換されていることによって該親抗体と異なり、軽鎖ホットスポットリ
スト（表LA）から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されてお
り、かつ軽鎖ホットスポットリスト（表LB）から選択される少なくとも1つのアミノ酸残
基がヒスチジンで置換されていない、前記工程；
(e) 該操作されたバリアントの第2のパネルを該抗原とのpH依存的結合についてスクリ
ーニングし；それによってヒスチジンの存在によりpH依存的結合が付与されるVLドメイン
中の1以上の選択されたアミノ酸位置を同定する工程；
(f) 該親抗体の1以上のさらに操作されたバリアントを調製する工程であって、該バリ
アントの各々が、工程(c)で同定されたVHドメイン中の1以上の選択されたアミノ酸位置の
アミノ酸がヒスチジンで置換されていることによって該親抗体と異なり、かつ工程(e)で
同定されたVLドメイン中の1以上の選択されたアミノ酸位置のアミノ酸がヒスチジンで置
換されていることによって該親抗体と異なる、前記工程；及び
(g) 該さらに操作されたバリアントを該抗原とのpH依存的結合についてスクリーニング
し；それによって該抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を同定する工程、を含み
得る。
【0090】
このアプローチにより、初期（個別）のVH及びVLドメインのスクリーニングにおいて同
定されたヒスチジン突然変異間の相乗効果を同定することが可能である。例えば、VH及び
VLドメインの突然変異の異なる組合わせの間の相乗作用効果を同定するために、最も性能
の高いVH突然変異（すなわち、最も大きなpH依存性を付与する突然変異）を多数の異なる
VL突然変異と組合わせ、又は最も性能の高いVL突然変異を異なるVH突然変異と組合わせる
ことができる。この実施態様において、VH CDR3又はVL CDR3及びこれらの組合わせ中の「
コールドスポット」位置にもヒスチジン置換を含むことは、差支えない。
定されたヒスチジン突然変異間の相乗効果を同定することが可能である。例えば、VH及び
VLドメインの突然変異の異なる組合わせの間の相乗作用効果を同定するために、最も性能
の高いVH突然変異（すなわち、最も大きなpH依存性を付与する突然変異）を多数の異なる
VL突然変異と組合わせ、又は最も性能の高いVL突然変異を異なるVH突然変異と組合わせる
ことができる。この実施態様において、VH CDR3又はVL CDR3及びこれらの組合わせ中の「
コールドスポット」位置にもヒスチジン置換を含むことは、差支えない。
【0091】
（スクリーニング方法）
様々なスクリーニング方法を使用して、標的抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗
体を同定することができる。そのようなスクリーニング方法は：
(a) 酸性pHでの操作された抗体の抗原結合活性を決定する工程；
(b) 中性pHでの操作された抗体の抗原結合活性を決定する工程；
(c) その酸性pHでの抗原結合活性が中性pHでの抗原結合活性と異なる操作された抗体を
選択する工程、を含む。
様々なスクリーニング方法を使用して、標的抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗
体を同定することができる。そのようなスクリーニング方法は：
(a) 酸性pHでの操作された抗体の抗原結合活性を決定する工程；
(b) 中性pHでの操作された抗体の抗原結合活性を決定する工程；
(c) その酸性pHでの抗原結合活性が中性pHでの抗原結合活性と異なる操作された抗体を
選択する工程、を含む。
【0092】
規定されたpHでの抗原結合活性を決定するための適切な方法及び条件は、一般に当該技
術分野において公知である。例として、規定されたpHでの抗体の抗原結合活性は、添付す
る実験実施例に記載の通りBiacore（登録商標）（GE Healthcare）により、決定すること
ができる。他の好適な技術には、ELISA又はMSDがあり、これらを使用して、異なるpH条件
下（例えば、pH 7.4及びpH 5.5）、特定の抗体濃度（例えば、EC50）での抗原結合を決定
することができる。
術分野において公知である。例として、規定されたpHでの抗体の抗原結合活性は、添付す
る実験実施例に記載の通りBiacore（登録商標）（GE Healthcare）により、決定すること
ができる。他の好適な技術には、ELISA又はMSDがあり、これらを使用して、異なるpH条件
下（例えば、pH 7.4及びpH 5.5）、特定の抗体濃度（例えば、EC50）での抗原結合を決定
することができる。
【0093】
本明細書に記載の方法は、中性pH及び酸性pHでの操作された抗体の抗原結合活性を測定
する工程、並びに操作された抗体がpH依存的結合を示すかどうかを決定するために中性pH
及び/又は酸性pHでの結合の1以上のパラメータを比較する工程、を含み得る。
する工程、並びに操作された抗体がpH依存的結合を示すかどうかを決定するために中性pH
及び/又は酸性pHでの結合の1以上のパラメータを比較する工程、を含み得る。
【0094】
ある実施態様において、操作された抗体の抗原結合活性は、添付する実施例に記載の通
り2点pH ELISA（dual pH ELISA）によって測定することができる。この設定において、抗
体の抗原との最初の結合を中性pH（例えば、pH 7.4）で評価し、それに続き酸性pH（例え
ば、pH 5.5）で洗浄工程を行う。これにより、抗体の会合、解離、又はそれら両方に対す
るpHの効果を識別することが可能となり、抗体の標的抗原との結合が中性pHで起こり、か
つ抗原の放出が酸性のエンドソーム内pHで起こるインビボでの状況をより適切に代表し得
る。
り2点pH ELISA（dual pH ELISA）によって測定することができる。この設定において、抗
体の抗原との最初の結合を中性pH（例えば、pH 7.4）で評価し、それに続き酸性pH（例え
ば、pH 5.5）で洗浄工程を行う。これにより、抗体の会合、解離、又はそれら両方に対す
るpHの効果を識別することが可能となり、抗体の標的抗原との結合が中性pHで起こり、か
つ抗原の放出が酸性のエンドソーム内pHで起こるインビボでの状況をより適切に代表し得
る。
【0095】
典型的に、選択された操作された抗体は、酸性pHで中性pHにおけるよりも低いその抗原
に対する親和性を示す。初期スクリーニングにおいて、酸性pHでの親和性の中性pHでの親
和性に対する有意な差が少しでも認められれば、pH依存的結合を示すことができる。
に対する親和性を示す。初期スクリーニングにおいて、酸性pHでの親和性の中性pHでの親
和性に対する有意な差が少しでも認められれば、pH依存的結合を示すことができる。
【0096】
酸性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の解離速度定数（kd）、すなわちオフ速度
が、中性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の該解離速度定数（kd）よりも高い場合
がある。初期スクリーニングにおいて、酸性pHでの（kd）の中性pHでの（kd）に対する有
意な差が少しでも認められれば、pH依存的結合を示すことができる。他の実施態様におい
て、酸性pHでの操作された抗体-抗原相互作用の解離速度定数（kd）の、中性pHでの操作
された抗体-抗原相互作用の解離速度定数（kd）に対する比は、少なくとも1.5、又は少な
くとも2、又は少なくとも5、又は少なくとも10となり得る。複数のヒスチジン突然変異を
組合わせると、全体のpH依存性の度合いが増加し得る。
が、中性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の該解離速度定数（kd）よりも高い場合
がある。初期スクリーニングにおいて、酸性pHでの（kd）の中性pHでの（kd）に対する有
意な差が少しでも認められれば、pH依存的結合を示すことができる。他の実施態様におい
て、酸性pHでの操作された抗体-抗原相互作用の解離速度定数（kd）の、中性pHでの操作
された抗体-抗原相互作用の解離速度定数（kd）に対する比は、少なくとも1.5、又は少な
くとも2、又は少なくとも5、又は少なくとも10となり得る。複数のヒスチジン突然変異を
組合わせると、全体のpH依存性の度合いが増加し得る。
【0097】
酸性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の平衡解離定数（KD）が、中性pHでの該操
作された抗体-抗原相互作用の該平衡解離定数（KD）よりも高い場合がある。初期スクリ
ーニングにおいて、酸性pHでのKDの中性pHでのKDに対する有意な差が少しでも認められれ
ば、pH依存的結合を示すことができる。酸性pHでの操作された抗体-抗原相互作用の平衡
解離定数（KD）の、中性pHでの操作された抗体-抗原相互作用の平衡解離定数（KD）に対
する比は、1.5超、又は2超、又は5超、又は10超となり得る。
作された抗体-抗原相互作用の該平衡解離定数（KD）よりも高い場合がある。初期スクリ
ーニングにおいて、酸性pHでのKDの中性pHでのKDに対する有意な差が少しでも認められれ
ば、pH依存的結合を示すことができる。酸性pHでの操作された抗体-抗原相互作用の平衡
解離定数（KD）の、中性pHでの操作された抗体-抗原相互作用の平衡解離定数（KD）に対
する比は、1.5超、又は2超、又は5超、又は10超となり得る。
【0098】
複数のヒスチジン突然変異を組合わせると、全体のpH依存性の度合いが増加し得る。特
に好ましい実施態様において、ヒスチジン突然変異を組合わせることにより、酸性pHでの
抗原結合に対して中性pHでおよそ20～40倍強い抗原結合を達成し得る。
に好ましい実施態様において、ヒスチジン突然変異を組合わせることにより、酸性pHでの
抗原結合に対して中性pHでおよそ20～40倍強い抗原結合を達成し得る。
【0099】
本明細書の別所に記載の通り、pH依存的結合の改善は、中性pHでの標的抗原に対する親
和性への顕著な影響の有無にかかわらず、達成することができる。
和性への顕著な影響の有無にかかわらず、達成することができる。
【0100】
平衡解離定数（KD）を抗原結合活性の指標として使用する非限定的な実施態様において
、操作された抗体は、酸性pH（例えば、pH 5.5）で10～20 nMの範囲のその抗原に対する
平衡解離定数（KD）を示し得る；それに対し、操作された抗体の中性pH（例えば、7.4）
でのその抗原に対するKDは、およそ0.5 nM以下となり得る。
、操作された抗体は、酸性pH（例えば、pH 5.5）で10～20 nMの範囲のその抗原に対する
平衡解離定数（KD）を示し得る；それに対し、操作された抗体の中性pH（例えば、7.4）
でのその抗原に対するKDは、およそ0.5 nM以下となり得る。
【0101】
上記実施態様の各々において、「酸性pH」とは、pH 4.0～pH 6.5、好ましくはpH 4.5～
pH 6.0、より好ましくはpH 5.5～pH 6.0、及びより好ましくはpH 5.5～pH 5.8の範囲のpH
を指す。
pH 6.0、より好ましくはpH 5.5～pH 6.0、及びより好ましくはpH 5.5～pH 5.8の範囲のpH
を指す。
【0102】
上記実施態様の各々において、「中性pH」とは、pH 6.7～pH 10.0、好ましくはpH 7.0
～pH 8.0、より好ましくはpH 7.4の範囲のpHを指す。
～pH 8.0、より好ましくはpH 7.4の範囲のpHを指す。
【0103】
特定の実施態様において、pH依存的結合は、酸性pH 5.5での抗体の抗原結合活性を中性
pH 7.4での同抗体の抗原結合活性と比較することによって評価することができる。
pH 7.4での同抗体の抗原結合活性と比較することによって評価することができる。
【0104】
他の実施態様において、pH依存的結合は、酸性pH 6.0での抗体の抗原結合活性を中性pH
7.4での同抗体の抗原結合活性と比較することによって評価することができる。
7.4での同抗体の抗原結合活性と比較することによって評価することができる。
【0105】
本明細書に記載の方法は、さらに又は代替として、酸性pH及び/又は中性pHでの親抗体
の抗原結合活性を測定する工程、並びにこの結合相互作用のパラメータを操作された抗体
-抗原相互作用の対応する結合パラメータと比較する工程、を含み得る。
の抗原結合活性を測定する工程、並びにこの結合相互作用のパラメータを操作された抗体
-抗原相互作用の対応する結合パラメータと比較する工程、を含み得る。
【0106】
酸性pH（例えば、pH 5.5）での操作された抗体の解離速度定数（kd）は、同じ酸性pHで
の親抗体の解離速度定数（kd）よりも高くなり得る。そのような実施態様において、酸性
pH（例えば、pH 5.5）でのkdは、ヒスチジン置換の結果として親抗体と比較して高い。
酸性pHでの操作された抗体-抗原相互作用の解離速度定数（kd）の、同じ酸性pHでの親抗
体-抗原相互作用の解離速度定数（kd）に対する比は、少なくとも1.5、又は少なくとも2
、又は少なくとも5、又は少なくとも10となり得る。
の親抗体の解離速度定数（kd）よりも高くなり得る。そのような実施態様において、酸性
pH（例えば、pH 5.5）でのkdは、ヒスチジン置換の結果として親抗体と比較して高い。
酸性pHでの操作された抗体-抗原相互作用の解離速度定数（kd）の、同じ酸性pHでの親抗
体-抗原相互作用の解離速度定数（kd）に対する比は、少なくとも1.5、又は少なくとも2
、又は少なくとも5、又は少なくとも10となり得る。
【0107】
（操作された抗体）
また、本明細書では、その抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体であって、該操
作された抗体のCDR中の少なくとも1つのアミノ酸がヒスチジン残基であり、ホットスポッ
トリスト（表A）から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジン残基であり、
かつコールドスポットリスト（表B）からの少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジン残
基ではないことを特徴とする、前記操作された抗体を提供する。
また、本明細書では、その抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体であって、該操
作された抗体のCDR中の少なくとも1つのアミノ酸がヒスチジン残基であり、ホットスポッ
トリスト（表A）から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジン残基であり、
かつコールドスポットリスト（表B）からの少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジン残
基ではないことを特徴とする、前記操作された抗体を提供する。
【0108】
「操作された抗体」とは、そのアミノ酸配列がインビトロで意図的に変更された、又は
突然変異を加えられた抗体を意味する。本開示において、「操作された抗体」とは、抗体
のCDRのアミノ酸配列が1以上の追加のヒスチジン残基を導入するために意図的に変更され
た、又は突然変異を加えられた抗体バリアントである。
突然変異を加えられた抗体を意味する。本開示において、「操作された抗体」とは、抗体
のCDRのアミノ酸配列が1以上の追加のヒスチジン残基を導入するために意図的に変更され
た、又は突然変異を加えられた抗体バリアントである。
【0109】
抗体VL及びVHドメインのCDRは典型的に、以下のアミノ酸を含むものとして定義するこ
とができる：軽鎖可変ドメイン中の残基24～34 （CDRL1）、50～56 （CDRL2）、及び89～
97 （CDRL3）、並びに重鎖可変ドメイン中の残基31～35又は31～35c （CDRH1）, 50～65
（CDRH2）、及び95～102 （CDRH3）（Kabatらの文献、「免疫学の対象となるタンパク質
の配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」, 第5版、Public Healt
h Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）。
とができる：軽鎖可変ドメイン中の残基24～34 （CDRL1）、50～56 （CDRL2）、及び89～
97 （CDRL3）、並びに重鎖可変ドメイン中の残基31～35又は31～35c （CDRH1）, 50～65
（CDRH2）、及び95～102 （CDRH3）（Kabatらの文献、「免疫学の対象となるタンパク質
の配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」, 第5版、Public Healt
h Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）。
【0110】
操作された抗体は、VHドメイン、又はVLドメイン、又はVHドメイン及びVLドメインの両
方のCDR中に全部で1、2、3、4、5、又はそれより多くのヒスチジン残基を含み得る。
方のCDR中に全部で1、2、3、4、5、又はそれより多くのヒスチジン残基を含み得る。
【0111】
操作された抗体のCDR中の少なくとも1つのヒスチジン残基は、「ホットスポット」リス
ト（表A）から選択されるアミノ酸位置に出現しなくてはならない。ある実施態様におい
て、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、又は少なくとも5つのヒスチジン残
基は、ホットスポットリストから選択されるアミノ酸位置に出現しなくてはならない。あ
る実施態様において、操作された抗体中の全てのヒスチジン残基はホットスポットリスト
（表A）から選択されるアミノ酸位置に出現する。本明細書に記載するように、操作され
た抗体のCDR中には、好ましくはヒスチジン残基によって占有されない特定のアミノ酸位
置が存在する。これらのアミノ酸位置は、「コールドスポット」リスト（表B）に示され
ているアミノ酸位置である。操作された抗体は、コールドスポットリスト（表B）にある
ヒスチジン残基によって占有されない少なくとも1つのアミノ酸位置を含まなくてはなら
ない。ある実施態様において、コールドスポットリスト（表B）にある少なくとも2つ、少
なくとも3つ、少なくとも4つ、又は少なくとも5つのアミノ酸位置は、ヒスチジンではな
い。さらなる実施態様において、コールドスポットリスト（表B）にあるアミノ酸位置の
いずれもヒスチジンではない。この例外として、ある実施態様において、VH CDR3又はVL
CDR3及びこれらの組合わせ中の「コールドスポット」位置にもヒスチジン置換を含むこと
は、差支えない。
ト（表A）から選択されるアミノ酸位置に出現しなくてはならない。ある実施態様におい
て、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、又は少なくとも5つのヒスチジン残
基は、ホットスポットリストから選択されるアミノ酸位置に出現しなくてはならない。あ
る実施態様において、操作された抗体中の全てのヒスチジン残基はホットスポットリスト
（表A）から選択されるアミノ酸位置に出現する。本明細書に記載するように、操作され
た抗体のCDR中には、好ましくはヒスチジン残基によって占有されない特定のアミノ酸位
置が存在する。これらのアミノ酸位置は、「コールドスポット」リスト（表B）に示され
ているアミノ酸位置である。操作された抗体は、コールドスポットリスト（表B）にある
ヒスチジン残基によって占有されない少なくとも1つのアミノ酸位置を含まなくてはなら
ない。ある実施態様において、コールドスポットリスト（表B）にある少なくとも2つ、少
なくとも3つ、少なくとも4つ、又は少なくとも5つのアミノ酸位置は、ヒスチジンではな
い。さらなる実施態様において、コールドスポットリスト（表B）にあるアミノ酸位置の
いずれもヒスチジンではない。この例外として、ある実施態様において、VH CDR3又はVL
CDR3及びこれらの組合わせ中の「コールドスポット」位置にもヒスチジン置換を含むこと
は、差支えない。
【0112】
操作された抗体は、その抗原とのpH依存的結合を示す。これは、酸性pHでの抗体の抗原
結合活性が、中性pHでの抗体の抗原結合活性と異なることを意味する。
結合活性が、中性pHでの抗体の抗原結合活性と異なることを意味する。
【0113】
一実施態様において、該操作された抗体は、中性pHにおけるよりも酸性pHでその抗原と
の親和性が低い。
の親和性が低い。
【0114】
一実施態様において、酸性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の解離速度定数（kd
）は、中性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の該解離速度定数（kd）よりも高い。
）は、中性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の該解離速度定数（kd）よりも高い。
【0115】
一実施態様において、酸性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の平衡解離定数（KD
）は、中性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の該平衡解離定数（KD）よりも高い。
）は、中性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の該平衡解離定数（KD）よりも高い。
【0116】
特に好ましい実施態様において、操作された抗体は酸性pHでの抗原結合に対して中性pH
で20～40倍強い抗原結合を示し得る。
で20～40倍強い抗原結合を示し得る。
【0117】
平衡解離定数（KD）を抗原結合活性の指標として使用する非限定的な実施態様において
、操作された抗体は、酸性pH（例えば、pH 5.5）で10～20 nMの範囲のその抗原に対する
平衡解離定数（KD）を示し得る；それに対し、操作された抗体の中性pH（例えば、7.4）
でのその抗原に対するKDは、およそ0.5 nM以下となり得る。
、操作された抗体は、酸性pH（例えば、pH 5.5）で10～20 nMの範囲のその抗原に対する
平衡解離定数（KD）を示し得る；それに対し、操作された抗体の中性pH（例えば、7.4）
でのその抗原に対するKDは、およそ0.5 nM以下となり得る。
【0118】
（操作された抗体の構造）
本明細書に記載の操作された抗体は典型的に、抗原結合特異性が対をなし、6つのCDRが
抗原結合部位に寄与するVH及びVLドメインによって提供される従来型の四鎖免疫グロブリ
ンである。しかしながらまた、用語「操作された抗体」は、これらに限定はされないが、
Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv、scFv、ダイアボディ、トリアボディ、ミニボディなどを含
む従来の免疫グロブリンの抗原結合断片及び操作された抗原結合コンストラクト、及び対
となったVH及びVLドメインによって提供される抗原結合部位を含む任意の他の改変免疫グ
ロブリン構成を包含する。
本明細書に記載の操作された抗体は典型的に、抗原結合特異性が対をなし、6つのCDRが
抗原結合部位に寄与するVH及びVLドメインによって提供される従来型の四鎖免疫グロブリ
ンである。しかしながらまた、用語「操作された抗体」は、これらに限定はされないが、
Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv、scFv、ダイアボディ、トリアボディ、ミニボディなどを含
む従来の免疫グロブリンの抗原結合断片及び操作された抗原結合コンストラクト、及び対
となったVH及びVLドメインによって提供される抗原結合部位を含む任意の他の改変免疫グ
ロブリン構成を包含する。
【0119】
操作された抗体は、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、及びCH3ドメインの1以上
又は全てを含む定常領域を含み得る。特に、操作された抗体は、1以上の抗体エフェクタ
ー機能を付与し得るFc領域（CH2及びCH3ドメインから構成される）を含むことができる。
操作された抗体のFc領域はそれ自体有用な機能特性を付与するために操作され、又は改変
され得る。
又は全てを含む定常領域を含み得る。特に、操作された抗体は、1以上の抗体エフェクタ
ー機能を付与し得るFc領域（CH2及びCH3ドメインから構成される）を含むことができる。
操作された抗体のFc領域はそれ自体有用な機能特性を付与するために操作され、又は改変
され得る。
【0120】
操作された抗体は：IgA、IgD、IgE、IgG、又はIgMを含む任意の抗体クラスのものとす
ることができる。好ましい実施態様において、操作された抗体は、IgGである。操作され
た抗体は：IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4を含む任意のサブクラス（アイソタイプ）のIgG
とし得る。
ることができる。好ましい実施態様において、操作された抗体は、IgGである。操作され
た抗体は：IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4を含む任意のサブクラス（アイソタイプ）のIgG
とし得る。
【0121】
好ましい実施態様において、操作された抗体は新生児Fc受容体（FcRn）と結合すること
ができるFc領域を含み得る。特に、Fc領域が中性pHでFcRnに対する強い結合親和性を示す
ことが、望ましい場合がある。操作された抗体のFc領域は、新生児Fc受容体、FcRnとの結
合を強化するために、改変することができる。FcRnとの高められた結合を付与するFc改変
の例には、Fc領域のCH2及び/又はCH3ドメイン中の1以上のアミノ酸位置でのアミノ酸置換
がある。
ができるFc領域を含み得る。特に、Fc領域が中性pHでFcRnに対する強い結合親和性を示す
ことが、望ましい場合がある。操作された抗体のFc領域は、新生児Fc受容体、FcRnとの結
合を強化するために、改変することができる。FcRnとの高められた結合を付与するFc改変
の例には、Fc領域のCH2及び/又はCH3ドメイン中の1以上のアミノ酸位置でのアミノ酸置換
がある。
【0122】
好適なFc突然変異には、Vaccaroらの文献、Nature Biotechnology, Vol. 23, 1283-128
8 (2005).に記載されたAbdeg（商標）突然変異がある。Abdeg（商標）突然変異体はヒトI
gGの操作されたバリアントであり、これらに限定はされないが、Met252、Ser254、Thr256
、His 433、及びAsn434を、Tyr252、Thr254、Glu256、Lys433、及びPhe434（EU付番）に
する突然変異を含むヒトIgG1を含む。Abdeg（商標）突然変異を有する操作された抗体（
例えば、操作されたヒトIgG1）は、その野生型対応物と比較して強化されたFcRnとの結合
親和性を示し、細胞表面でのエクソサイトーシス事象の間にFcRnとより安定に結合する。
本明細書で規定する好ましい操作された抗体は、可変ドメインのCDR中の1以上のヒスチジ
ン置換をFc領域中のAbdeg突然変異と組合わせる。
8 (2005).に記載されたAbdeg（商標）突然変異がある。Abdeg（商標）突然変異体はヒトI
gGの操作されたバリアントであり、これらに限定はされないが、Met252、Ser254、Thr256
、His 433、及びAsn434を、Tyr252、Thr254、Glu256、Lys433、及びPhe434（EU付番）に
する突然変異を含むヒトIgG1を含む。Abdeg（商標）突然変異を有する操作された抗体（
例えば、操作されたヒトIgG1）は、その野生型対応物と比較して強化されたFcRnとの結合
親和性を示し、細胞表面でのエクソサイトーシス事象の間にFcRnとより安定に結合する。
本明細書で規定する好ましい操作された抗体は、可変ドメインのCDR中の1以上のヒスチジ
ン置換をFc領域中のAbdeg突然変異と組合わせる。
【0123】
さらに好適なFc突然変異は、US 8,163,881に記載のNHance（商標）突然変異を含む。NH
ance（商標）突然変異体はヒトIgGの操作されたバリアントであり、これらに限定はされ
ないが、His 433及びAsn434をLys433及びPhe434（EU付番）にする突然変異を含むヒトIgG
1を含む。NHance（商標）突然変異を有する操作された抗体（例えば、操作されたヒトIgG
1）は、その野生型対応物と比較して強化されたFcRnとの結合親和性を示す。本明細書で
規定する好ましい操作された抗体は、可変ドメインのCDR中の1以上のヒスチジン置換をFc
領域中のNHance（商標）突然変異と組合わせる。
ance（商標）突然変異体はヒトIgGの操作されたバリアントであり、これらに限定はされ
ないが、His 433及びAsn434をLys433及びPhe434（EU付番）にする突然変異を含むヒトIgG
1を含む。NHance（商標）突然変異を有する操作された抗体（例えば、操作されたヒトIgG
1）は、その野生型対応物と比較して強化されたFcRnとの結合親和性を示す。本明細書で
規定する好ましい操作された抗体は、可変ドメインのCDR中の1以上のヒスチジン置換をFc
領域中のNHance（商標）突然変異と組合わせる。
【0124】
好ましい実施態様において、操作された抗体は、CDR中に1以上のヒスチジン置換を含む
ラクダ科動物由来抗体（例えば、ラマ抗体）の可変ドメインの操作されたバリアントであ
る可変ドメイン（VH及びVL）、並びにAbdeg（商標）突然変異Tyr252、Thr254、Glu256、L
ys433、及びPhe434（EU付番）を含むヒトIgG（例えば、ヒトIgG1）のFc領域を含み得る。
ラクダ科動物由来抗体（例えば、ラマ抗体）の可変ドメインの操作されたバリアントであ
る可変ドメイン（VH及びVL）、並びにAbdeg（商標）突然変異Tyr252、Thr254、Glu256、L
ys433、及びPhe434（EU付番）を含むヒトIgG（例えば、ヒトIgG1）のFc領域を含み得る。
【0125】
さらに好ましい実施態様において、操作された抗体は、CDR中に1以上のヒスチジン置換
を含むラクダ科動物由来抗体（例えば、ラマ抗体）の可変ドメインの操作されたバリアン
トである可変ドメイン（VH及びVL）、並びにNHance（商標）突然変異Lys433及びPhe434（
EU付番）を含むヒトIgG（例えば、ヒトIgG1）のFc領域を含み得る。
を含むラクダ科動物由来抗体（例えば、ラマ抗体）の可変ドメインの操作されたバリアン
トである可変ドメイン（VH及びVL）、並びにNHance（商標）突然変異Lys433及びPhe434（
EU付番）を含むヒトIgG（例えば、ヒトIgG1）のFc領域を含み得る。
【0126】
pH依存的抗原結合に加え、高められたFcRnとの結合親和性という2つの特性を示す操作
された抗体は、活性抗原除去効果を発揮することができ、インビボで血漿から可溶性抗原
を排除するのに有用である。「活性抗原除去」という概念は、操作された抗体を利用して
、細胞表面エンドサイトーシス受容体の活動を模倣するものであり、これにより血漿から
標的抗原を選択的に排除することが可能となる。簡潔に説明すると、操作された抗体は血
漿中（中性pH）に存在する対応する抗原と結合して、抗原-抗体複合体を形成する。この
複合体は、エンドソーム中へとランダムに吸収され（通常飲作用により）、そこでpHが酸
性になると、抗体Fc部分はFcRnと結合する。操作された抗体のpH依存的抗原結合特性のた
めに、結合した抗原は酸性エンドソーム内に放出され、リソソーム経路により分解へと向
かう。遊離抗体（依然としてFcRnと結合するが、もはやその抗原とは結合しない）は続い
てリサイクルされて細胞表面に戻り、そこでさらなるラウンドの抗原結合及び内部移行に
参加することができる。pH 7.4での結合に実質的に影響を及ぼすことなく酸性pHでのFcRn
との結合を促進するFc突然変異により、この「活性抗原除去」プロセスを強化することが
できる。
された抗体は、活性抗原除去効果を発揮することができ、インビボで血漿から可溶性抗原
を排除するのに有用である。「活性抗原除去」という概念は、操作された抗体を利用して
、細胞表面エンドサイトーシス受容体の活動を模倣するものであり、これにより血漿から
標的抗原を選択的に排除することが可能となる。簡潔に説明すると、操作された抗体は血
漿中（中性pH）に存在する対応する抗原と結合して、抗原-抗体複合体を形成する。この
複合体は、エンドソーム中へとランダムに吸収され（通常飲作用により）、そこでpHが酸
性になると、抗体Fc部分はFcRnと結合する。操作された抗体のpH依存的抗原結合特性のた
めに、結合した抗原は酸性エンドソーム内に放出され、リソソーム経路により分解へと向
かう。遊離抗体（依然としてFcRnと結合するが、もはやその抗原とは結合しない）は続い
てリサイクルされて細胞表面に戻り、そこでさらなるラウンドの抗原結合及び内部移行に
参加することができる。pH 7.4での結合に実質的に影響を及ぼすことなく酸性pHでのFcRn
との結合を促進するFc突然変異により、この「活性抗原除去」プロセスを強化することが
できる。
【0127】
また、先に列記した具体的なFc突然変異に加え、操作された抗体は、抗体のエンドソー
ムへの取り込みを改善する、例えばpIの変化、電荷の変化、pH 7.4及び/又はpH6.0でのFc
Rn 親和性の変化を含む任意の他の突然変異又は改変；任意の他の「高効率リサイクリン
グ（high recycling）」Fc受容体、例えばFcγ受容体、特にFcγRIIbなどとの結合の増加
を促進する任意の突然変異又は改変；免疫複合体形成を増加させる任意の突然変異（例え
ば、補体結合部位）を含み得る。
ムへの取り込みを改善する、例えばpIの変化、電荷の変化、pH 7.4及び/又はpH6.0でのFc
Rn 親和性の変化を含む任意の他の突然変異又は改変；任意の他の「高効率リサイクリン
グ（high recycling）」Fc受容体、例えばFcγ受容体、特にFcγRIIbなどとの結合の増加
を促進する任意の突然変異又は改変；免疫複合体形成を増加させる任意の突然変異（例え
ば、補体結合部位）を含み得る。
【0128】
操作された抗体は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ラクダ科動物、又は他の哺乳動物
種からの親抗体の操作されたバリアント又はキメラ抗体とし得る。特定の実施態様におい
て、操作された抗体は、ラクダ科動物種、例えばラマ、ラクダ、ヒトコブラクダ、グアナ
コ、ビクーナなどから単離したラクダ科動物抗体の操作されたバリアント、又は可変ドメ
イン（若しくはそのCDR）がラクダ科動物種（例えば、ラマ）に由来し、定常ドメインが
ヒトに由来するラクダ科動物-ヒトキメラ抗体（例えば、ラマ-ヒトキメラ）の操作された
バリアントとすることができる。ラクダ科動物抗体及びラクダ科動物-ヒトキメラ抗体を
生産する技術は、その内容が参照により本明細書に組み込まれているWO 2010/001251に記
載されている。
種からの親抗体の操作されたバリアント又はキメラ抗体とし得る。特定の実施態様におい
て、操作された抗体は、ラクダ科動物種、例えばラマ、ラクダ、ヒトコブラクダ、グアナ
コ、ビクーナなどから単離したラクダ科動物抗体の操作されたバリアント、又は可変ドメ
イン（若しくはそのCDR）がラクダ科動物種（例えば、ラマ）に由来し、定常ドメインが
ヒトに由来するラクダ科動物-ヒトキメラ抗体（例えば、ラマ-ヒトキメラ）の操作された
バリアントとすることができる。ラクダ科動物抗体及びラクダ科動物-ヒトキメラ抗体を
生産する技術は、その内容が参照により本明細書に組み込まれているWO 2010/001251に記
載されている。
【0129】
操作された抗体の抗原結合特異性、すなわちそれが結合する標的抗原の性質は、特に制
限されない。本件出願人は、本明細書で提供する方法論が抗原結合特性の異なる多数の様
々な親抗体のpH依存的バリアントの操作に応用可能であることを実証した。従って、pH依
存的抗原結合を操作するための記載された技術は、一般応用性の原理となり、1つの具体
的な標的抗原と結合する抗体に限定されない。
限されない。本件出願人は、本明細書で提供する方法論が抗原結合特性の異なる多数の様
々な親抗体のpH依存的バリアントの操作に応用可能であることを実証した。従って、pH依
存的抗原結合を操作するための記載された技術は、一般応用性の原理となり、1つの具体
的な標的抗原と結合する抗体に限定されない。
【0130】
（例証）
本発明は、以下の実施例によってさらに例証されるが、さらに限定するものとして解釈
するべきではない。本件出願の全体にわたって引用されている全ての参考文献、特許及び
公開特許出願の内容は、明白に参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、以下の実施例によってさらに例証されるが、さらに限定するものとして解釈
するべきではない。本件出願の全体にわたって引用されている全ての参考文献、特許及び
公開特許出願の内容は、明白に参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【0131】
（図面の簡単な説明）
【図1】機能的アッセイを使用して測定した、親抗体18E2の操作されたバリアントにおけるpH依存的抗原結合を例証する。リガンド：受容体相互作用の阻害のIC50を、pH 7.4及びpH5.5の両方で、親抗体18E2及び1又は2つの規定されたヒスチジン突然変異を含む18E2の操作されたバリアントについて測定した。
【図2】MSD技術を使用して測定した、親抗体5D1のヒスチジン突然変異体のpH依存的結合を例証する。
【図3】MSD技術を使用して測定した、親抗体5D1のヒスチジン突然変異体のpH依存的結合を例証する。
【図4】MSD技術を使用して測定した、親抗体5D1のヒスチジン突然変異体のpH依存的結合を例証する。
【実施例0132】
（実施例1：ヒートマップの構築）
大きな抗体レパートリー中でヒスチジン残基が天然に許容されるVドメイン中のアミノ
酸残基位置を同定するため、いくつかの標的抗原プロジェクトから得た多数の機能的（抗
原結合性）抗体のVH、Vλ、及びVκドメイン又は対応するFab断片の配列をプールし、解
析した。
大きな抗体レパートリー中でヒスチジン残基が天然に許容されるVドメイン中のアミノ
酸残基位置を同定するため、いくつかの標的抗原プロジェクトから得た多数の機能的（抗
原結合性）抗体のVH、Vλ、及びVκドメイン又は対応するFab断片の配列をプールし、解
析した。
【0133】
各標的抗原プロジェクトには、精製抗原又は標的を発現するDNA（DNAワクチン接種）に
よる活動的ラマの免疫化、Fab又はscFvファージディスプレイライブラリ構築、並びにフ
ァージディスプレイによる特異的結合因子の選択及びスクリーニングが含まれていた。フ
ァージディスプレイは、通常溶出剤としてトリプシンを使用して最高3ラウンドの選択を
行い、続いてペリプラズム抽出物中でFab（又はscFv）を発現させ、ELISA、MSD、又はSPR
（Biacore）によりFab（又はscFv）結合因子を同定する、標準的手順に従って実施した。
トリプシンによる溶出に加え、pH依存的結合を有する抗体をさらに富化させるため、続い
て並行ファージディスプレイプロセスを行った。このプロセスでは、TBS（50mMトリス pH
5.5、及び150mM NaCl）中のpH 5.5の溶出液を使用して、最高3ラウンドの選択を行った
。続いて全ての配列をプールし、タイプ（VH、Vλ、又はVκ）及びサブファミリー（例え
ば、VH1、VH2、及びVH3）に細分した。任意の厳密な重複配列を除去し、特有の配列のみ
を使用してVドメインの各位置でのヒスチジン残基の数を数えた。これにより、免疫化し
たラマ由来の抗体のVドメイン中のどのアミノ酸位置でヒスチジンが受け入れられるかを
示す「ヒートマップ」が作成された。さらに、このデータセットは免疫化したラマからの
RNAを使用したハイスループット配列決定法により同定される配列を使用して、さらに完
全なものとすることができる。
よる活動的ラマの免疫化、Fab又はscFvファージディスプレイライブラリ構築、並びにフ
ァージディスプレイによる特異的結合因子の選択及びスクリーニングが含まれていた。フ
ァージディスプレイは、通常溶出剤としてトリプシンを使用して最高3ラウンドの選択を
行い、続いてペリプラズム抽出物中でFab（又はscFv）を発現させ、ELISA、MSD、又はSPR
（Biacore）によりFab（又はscFv）結合因子を同定する、標準的手順に従って実施した。
トリプシンによる溶出に加え、pH依存的結合を有する抗体をさらに富化させるため、続い
て並行ファージディスプレイプロセスを行った。このプロセスでは、TBS（50mMトリス pH
5.5、及び150mM NaCl）中のpH 5.5の溶出液を使用して、最高3ラウンドの選択を行った
。続いて全ての配列をプールし、タイプ（VH、Vλ、又はVκ）及びサブファミリー（例え
ば、VH1、VH2、及びVH3）に細分した。任意の厳密な重複配列を除去し、特有の配列のみ
を使用してVドメインの各位置でのヒスチジン残基の数を数えた。これにより、免疫化し
たラマ由来の抗体のVドメイン中のどのアミノ酸位置でヒスチジンが受け入れられるかを
示す「ヒートマップ」が作成された。さらに、このデータセットは免疫化したラマからの
RNAを使用したハイスループット配列決定法により同定される配列を使用して、さらに完
全なものとすることができる。
【0134】
（実施例2：pH依存性を高めるためのヒートマップの使用）
高い親和性、機能性（例えば、リガンド：受容体相互作用の遮断）、及び好ましくは多
少のpH依存性の観点から要求される特徴を有する親抗体又はFab断片を、ヒートマップを
使用したヒスチジン工学のために選択した。
高い親和性、機能性（例えば、リガンド：受容体相互作用の遮断）、及び好ましくは多
少のpH依存性の観点から要求される特徴を有する親抗体又はFab断片を、ヒートマップを
使用したヒスチジン工学のために選択した。
【0135】
最初に少数のヒスチジン突然変異を単一の親抗体について試験した。抗体18E2のVHドメ
イン中の位置H35及びVLドメイン中の位置L34に突然変異を加えた。この抗体の標的抗原は
コンフォメーションエピトープの存在のためにBiacore（登録商標）では対応できないこ
とから、pH依存性の効果は抗体のリガンド：受容体相互作用を遮断する能力を測定した。
全てのタンパク質をpH 7.4又はpH 5.5でインキュベートする場合、IC50を測定した。結果
を表1及び図1に示す。データから、単一の突然変異を導入すると、この抗体のpH依存性が
4倍増加することが観察されたことが示唆される。興味深いことに、突然変異したVHを突
然変異したVλと組合わせることにより、pH 7.4での過剰な効果を伴うことなくpH依存性
がさらに改善された。
イン中の位置H35及びVLドメイン中の位置L34に突然変異を加えた。この抗体の標的抗原は
コンフォメーションエピトープの存在のためにBiacore（登録商標）では対応できないこ
とから、pH依存性の効果は抗体のリガンド：受容体相互作用を遮断する能力を測定した。
全てのタンパク質をpH 7.4又はpH 5.5でインキュベートする場合、IC50を測定した。結果
を表1及び図1に示す。データから、単一の突然変異を導入すると、この抗体のpH依存性が
4倍増加することが観察されたことが示唆される。興味深いことに、突然変異したVHを突
然変異したVλと組合わせることにより、pH 7.4での過剰な効果を伴うことなくpH依存性
がさらに改善された。
【0136】
表：1
【表45】
【0137】
これらのデータから、ヒートマップにより規定された位置でのヒスチジンによるアミノ
酸の置換が機能していること、すなわちpH依存性を強化することができることが確認され
た。他の位置でのヒスチジン突然変異により、より優れた（又はより劣った）効果がもた
らされ得るものと予想することができるため、体系的な突然変異解析を実施した。
酸の置換が機能していること、すなわちpH依存性を強化することができることが確認され
た。他の位置でのヒスチジン突然変異により、より優れた（又はより劣った）効果がもた
らされ得るものと予想することができるため、体系的な突然変異解析を実施した。
【0138】
（実施例3：pH依存性を高めるためのヒートマップを使用した完全突然変異解析）
第2の抗原標的に対し方向づけられた抗体5D1のpH依存性をヒートマップを使用して導入
した。ヒートマップによれば、5D1のVH中の18個の位置はヒスチジン置換の影響を受けや
すく、5D1のVλ中の12個の位置はヒスチジン置換の影響を受けやすかった（表2を参照さ
れたい）。ヒスチジン残基はVLの位置55及び91に天然に存在し、その結果試験することと
なる突然変異体の数がさらに減少したことに留意されたい。VLの最も近い生殖細胞系列は
VL8であるため、初期スクリーニングにおいてFR2中の位置L49はヒスチジンに突然変異さ
せなかった。しかしながら、CDR2ループの構造的保存に基づいて、この位置も同様にヒー
トマップに従って突然変異させることができたはずであった。
第2の抗原標的に対し方向づけられた抗体5D1のpH依存性をヒートマップを使用して導入
した。ヒートマップによれば、5D1のVH中の18個の位置はヒスチジン置換の影響を受けや
すく、5D1のVλ中の12個の位置はヒスチジン置換の影響を受けやすかった（表2を参照さ
れたい）。ヒスチジン残基はVLの位置55及び91に天然に存在し、その結果試験することと
なる突然変異体の数がさらに減少したことに留意されたい。VLの最も近い生殖細胞系列は
VL8であるため、初期スクリーニングにおいてFR2中の位置L49はヒスチジンに突然変異さ
せなかった。しかしながら、CDR2ループの構造的保存に基づいて、この位置も同様にヒー
トマップに従って突然変異させることができたはずであった。
【0139】
表2
【表46】
【0140】
各々の突然変異について、合成遺伝子を発注した（Geneart, Thermo Scientific）。凍
結乾燥させたDNAをH2Oで希釈し、標準的なDNA再クローニング方法（制限酵素及びT4リガ
ーゼ）を使用して、ヒト定常ドメイン（VHに対してはCH1-CH2-CH3、又はVλに対してはC
λ、又はVκに対してはCκ）を含む哺乳動物発現ベクターに再クローニングした。作製し
たコンストラクトは配列を確認して10 mlの浮遊させたHEK293細胞に一過的にトランスフ
ェクションするために使用し、各々単一のHIS置換を含む操作されたバリアント抗体のパ
ネルを作製した。
結乾燥させたDNAをH2Oで希釈し、標準的なDNA再クローニング方法（制限酵素及びT4リガ
ーゼ）を使用して、ヒト定常ドメイン（VHに対してはCH1-CH2-CH3、又はVλに対してはC
λ、又はVκに対してはCκ）を含む哺乳動物発現ベクターに再クローニングした。作製し
たコンストラクトは配列を確認して10 mlの浮遊させたHEK293細胞に一過的にトランスフ
ェクションするために使用し、各々単一のHIS置換を含む操作されたバリアント抗体のパ
ネルを作製した。
【0141】
各単一のVH 5D1突然変異体に野生型軽鎖を個別にトランスフェクションし、一方各単一
のVL 5D1突然変異体に野生型重鎖を個別にトランスフェクションした。HEK293細胞をFree
style 293発現培地（Gibco）中37℃、5% CO2で増殖させ、最適密度0.5～0.8×106細胞/mL
の下トランスフェクションを実施した。トランスフェクション混合物には、HEK293培養物
1 mL当たり40 μLのOPTI-MEM（Gibco）、1.5 μgのポリエチレンイミン（PEI）（Polysci
ences）、及び0.5 μg DNAを含めた。重鎖及び軽鎖に適用する比は、1～3とした。
のVL 5D1突然変異体に野生型重鎖を個別にトランスフェクションした。HEK293細胞をFree
style 293発現培地（Gibco）中37℃、5% CO2で増殖させ、最適密度0.5～0.8×106細胞/mL
の下トランスフェクションを実施した。トランスフェクション混合物には、HEK293培養物
1 mL当たり40 μLのOPTI-MEM（Gibco）、1.5 μgのポリエチレンイミン（PEI）（Polysci
ences）、及び0.5 μg DNAを含めた。重鎖及び軽鎖に適用する比は、1～3とした。
【0142】
細胞へのトランスフェクションの4時間後、全培養物体積の10%となる9 % Primatone HS
/ UF（Kerry BioScience/ Sheffield）を加えた。培養物を100 rpmで振盪しながら6日間
インキュベートし、その後1,000×gで10分間遠心分離することにより収集した。1×PBS中
のプロテインA-セファロースビーズ（GE Healthcare）の50%スラリーを細胞培養物上清1
mL当たり10 μL加えた。ビーズを含む上清を、ローター上4℃、25 rpmで少なくとも2時間
インキュベートした。ビーズを低い減速速度で610×g、2分間遠心分離することによりペ
レット化した。機能的mABと結合したビーズを96ウェル0.45 μmフィルタープレート（PAL
L）に移し、かつ引き続き1×PBS、0.5 M NaCl（ChemLab）を含む1×PBS、及び0.15 M NaC
l（ChemLab）を含む0.5×PBSで洗浄した。各回では、洗浄工程間で真空を適用した。結合
したmABを0.3 M NaCl (ChemLab) を含むpH 3の50 mMクエン酸ナトリウム（Sigma-Aldrich
）を使用して溶出した。溶出した画分をpH 8の1M KHPO4/KH2PO4（VWR）によって中和し、
タンパク質濃度をNanoDrop 2000（Thermo Scientific）で測定した。Biacoreにより、又
はMSDプラットフォームを使用して、スクリーニングを行った。
/ UF（Kerry BioScience/ Sheffield）を加えた。培養物を100 rpmで振盪しながら6日間
インキュベートし、その後1,000×gで10分間遠心分離することにより収集した。1×PBS中
のプロテインA-セファロースビーズ（GE Healthcare）の50%スラリーを細胞培養物上清1
mL当たり10 μL加えた。ビーズを含む上清を、ローター上4℃、25 rpmで少なくとも2時間
インキュベートした。ビーズを低い減速速度で610×g、2分間遠心分離することによりペ
レット化した。機能的mABと結合したビーズを96ウェル0.45 μmフィルタープレート（PAL
L）に移し、かつ引き続き1×PBS、0.5 M NaCl（ChemLab）を含む1×PBS、及び0.15 M NaC
l（ChemLab）を含む0.5×PBSで洗浄した。各回では、洗浄工程間で真空を適用した。結合
したmABを0.3 M NaCl (ChemLab) を含むpH 3の50 mMクエン酸ナトリウム（Sigma-Aldrich
）を使用して溶出した。溶出した画分をpH 8の1M KHPO4/KH2PO4（VWR）によって中和し、
タンパク質濃度をNanoDrop 2000（Thermo Scientific）で測定した。Biacoreにより、又
はMSDプラットフォームを使用して、スクリーニングを行った。
【0143】
Biacoreによるスクリーニングでは、いくつかの設定を使用することができる。「直接
的」設定においては、CM5チップ（GE Healthcare）上にコーティングされた抗原と精製抗
体の結合は、製造業者の説明書に従い、pH 7.4のHBSEP緩衝液 (0.01 M 4-(2-ヒドロキシ
エチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）pH 7.4、0.15 M NaCl（ChemLab）、3 m
M EDTA, 0.005%（v/ v）Surfactant P20)中25℃で、pH 7.4若しくはpH 5.5として、又は
同じ緩衝液を使用するが1 M HClを加えることによりpH 5.5に調整して測定した。異なる
「捕捉」設定において、突然変異型抗体は全てのチャネルにおいてポリクローナル抗ヒト
IgGでコーティングされたチップ上に捕捉される。mABをHBSEPに注入してRUを150～300に
到達させ、続いてpH 7.4の、又はpHを5.5に調整したHBSEP緩衝液中様々な濃度のリガンド
（検体）を注入した。各サイクルの後、pH 1.5の10 mMグリシンを10秒間注入することに
より、チップ表面の再生を行った。全ての速度論的解析は、GE Healthcareによって提供
される適切なソフトウェアを使用して実施した。
的」設定においては、CM5チップ（GE Healthcare）上にコーティングされた抗原と精製抗
体の結合は、製造業者の説明書に従い、pH 7.4のHBSEP緩衝液 (0.01 M 4-(2-ヒドロキシ
エチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）pH 7.4、0.15 M NaCl（ChemLab）、3 m
M EDTA, 0.005%（v/ v）Surfactant P20)中25℃で、pH 7.4若しくはpH 5.5として、又は
同じ緩衝液を使用するが1 M HClを加えることによりpH 5.5に調整して測定した。異なる
「捕捉」設定において、突然変異型抗体は全てのチャネルにおいてポリクローナル抗ヒト
IgGでコーティングされたチップ上に捕捉される。mABをHBSEPに注入してRUを150～300に
到達させ、続いてpH 7.4の、又はpHを5.5に調整したHBSEP緩衝液中様々な濃度のリガンド
（検体）を注入した。各サイクルの後、pH 1.5の10 mMグリシンを10秒間注入することに
より、チップ表面の再生を行った。全ての速度論的解析は、GE Healthcareによって提供
される適切なソフトウェアを使用して実施した。
【0144】
MSDプラットフォームを使用した抗体の試験について、プレート（MSD）を1×PBS中4℃
で標的により一晩コーティングした。続いてプレートを600 rpmで振盪しながら200 μLの
1×PBSで3回洗浄し、150 μL の 1%（m/ v）カゼイン（Sigma-Aldrich）を含む1×PBSを
用いて室温で1～2時間ブロッキングした。続いてプレートを200 μLの0.05%（m/ v）Twee
n（Merck）（pH 7.4）を含む1×PBS又は0.05%（m/ v）Tween（Merck）（pH 5.5）を含む
クエン酸緩衝液（0.05 Mクエン酸（Sigma-Aldrich）、0.14 Mクエン酸ナトリウム（Sigma
-Aldrich）、0.15 M NaCl（ChemLab））で3回洗浄した。用量反応曲線を計算するため、p
H 7.4又はpH 5.5とする1×PBST（0.05%（m/ v）Tweenを含むPBS）（pH 7.4）又は0.05%（
m/ v）Tween（Merck）を含むクエン酸緩衝液（pH 5.5）中に様々な濃度で加えたmABの25
μLを、ウェルに加えた。600 rpmで振盪しながら室温で1時間インキュベートした後、ウ
ェルをpH 7.4又はpH 5.5の1×PBSTで4回洗浄した。最後の洗浄工程について、PBST pH 7.
4又はクエン酸緩衝液pH 5.5により、600 rpmで振盪しながら室温で5～10分間余分にイン
キュベーションを実施した。全てのウェルを1×PBS（pH 7.4）で最後に洗浄し、0.1%カゼ
イン（Sigma-Aldrich）-1×PBS（pH 7.4）中の1:2000ヤギ抗ヒトFc Sulfo （MSD）の25
μLを加え、600 rpmで振盪しながら室温で1時間置いた。洗浄工程後、200 μLの1×PBST
（pH 7.4）、150 μLのMSD読取緩衝液（MSD）を各ウェルに加え、プレートをQuickPlex S
Q 120装置（MSD）において読み取った。
で標的により一晩コーティングした。続いてプレートを600 rpmで振盪しながら200 μLの
1×PBSで3回洗浄し、150 μL の 1%（m/ v）カゼイン（Sigma-Aldrich）を含む1×PBSを
用いて室温で1～2時間ブロッキングした。続いてプレートを200 μLの0.05%（m/ v）Twee
n（Merck）（pH 7.4）を含む1×PBS又は0.05%（m/ v）Tween（Merck）（pH 5.5）を含む
クエン酸緩衝液（0.05 Mクエン酸（Sigma-Aldrich）、0.14 Mクエン酸ナトリウム（Sigma
-Aldrich）、0.15 M NaCl（ChemLab））で3回洗浄した。用量反応曲線を計算するため、p
H 7.4又はpH 5.5とする1×PBST（0.05%（m/ v）Tweenを含むPBS）（pH 7.4）又は0.05%（
m/ v）Tween（Merck）を含むクエン酸緩衝液（pH 5.5）中に様々な濃度で加えたmABの25
μLを、ウェルに加えた。600 rpmで振盪しながら室温で1時間インキュベートした後、ウ
ェルをpH 7.4又はpH 5.5の1×PBSTで4回洗浄した。最後の洗浄工程について、PBST pH 7.
4又はクエン酸緩衝液pH 5.5により、600 rpmで振盪しながら室温で5～10分間余分にイン
キュベーションを実施した。全てのウェルを1×PBS（pH 7.4）で最後に洗浄し、0.1%カゼ
イン（Sigma-Aldrich）-1×PBS（pH 7.4）中の1:2000ヤギ抗ヒトFc Sulfo （MSD）の25
μLを加え、600 rpmで振盪しながら室温で1時間置いた。洗浄工程後、200 μLの1×PBST
（pH 7.4）、150 μLのMSD読取緩衝液（MSD）を各ウェルに加え、プレートをQuickPlex S
Q 120装置（MSD）において読み取った。
【0145】
単一のpH設定に加え（抗体結合及び洗浄を同じ7.4又は5.5のpHで行う）、本発明者らは
抗体結合をpH 7.4で行うが、洗浄をpH 5.5のクエン酸緩衝液中で行う、2点pH ELISAも試
験した。この設定により、会合又は解離又はそれら両方に対するpHの効果を識別すること
が可能となり、結合がpH 7.4で起こり、かつ抗原の放出がpH 5.5-6.0のエンドソーム中で
起こるに違いないインビボの状況がより適切に代表される。
抗体結合をpH 7.4で行うが、洗浄をpH 5.5のクエン酸緩衝液中で行う、2点pH ELISAも試
験した。この設定により、会合又は解離又はそれら両方に対するpHの効果を識別すること
が可能となり、結合がpH 7.4で起こり、かつ抗原の放出がpH 5.5-6.0のエンドソーム中で
起こるに違いないインビボの状況がより適切に代表される。
【0146】
表2に示した全ての単一突然変異体をスクリーニングした後、いくつかの単一突然変異
体はpH依存的結合に対する効果を有するようであった（表3）。例えば、5D1VLm3、5D1VHm
6、5D1VHm14は5D1wtと比較して顕著なpH依存的結合を有していた。さらに、5D1VHm13は有
利な速度論を伴うpH依存性の幾分の改善を有していた。
体はpH依存的結合に対する効果を有するようであった（表3）。例えば、5D1VLm3、5D1VHm
6、5D1VHm14は5D1wtと比較して顕著なpH依存的結合を有していた。さらに、5D1VHm13は有
利な速度論を伴うpH依存性の幾分の改善を有していた。
【0147】
表：3
【表47】
【表48】
【0148】
また、pH依存性は図2及び3、並びに表4に示すように、MSD技術を使用して観察した。こ
れらの突然変異体の効果は図2に示す曲線により可視化されている。図2では、洗浄の間pH
5.5が適用され（最大の結合が減少する）、並びに結合及び洗浄の両方の間にpH 5.5が適
用される（突然変異体5D1VLm3及び5D1VHm6について最大の結合が失われる）。これに対し
、pH 7.4で測定したEC50は、野生型親抗体と同程度のままであった。
れらの突然変異体の効果は図2に示す曲線により可視化されている。図2では、洗浄の間pH
5.5が適用され（最大の結合が減少する）、並びに結合及び洗浄の両方の間にpH 5.5が適
用される（突然変異体5D1VLm3及び5D1VHm6について最大の結合が失われる）。これに対し
、pH 7.4で測定したEC50は、野生型親抗体と同程度のままであった。
【0149】
表：4
【表49】
【0150】
これらのデータはpH依存性が導入されても、その効果は解離段階よりも会合段階に対し
て顕著であることを示唆している。従って、pH依存性を強化するために、さらにヒスチジ
ン突然変異を導入することは、有益となり得る。
て顕著であることを示唆している。従って、pH依存性を強化するために、さらにヒスチジ
ン突然変異を導入することは、有益となり得る。
【0151】
（実施例：4 pH依存性をさらに増加させるヒスチジン突然変異の組合わせ）
VLm3、VHm6、及びVHm13は全てpH依存性に対する効果を有するため、これらの突然変異
を同じ抗体中で組合わせた。二重HIS突然変異体VLm3/VHm6及びVLm3/VHm13は、HEK293細胞
のトランスフェクションの間単純に各々の鎖をコードするプラスミドを一緒に組合わせる
ことにより、作製した。得られた抗体のpH依存性は、MSDで試験した（図4を参照されたい
）。
VLm3、VHm6、及びVHm13は全てpH依存性に対する効果を有するため、これらの突然変異
を同じ抗体中で組合わせた。二重HIS突然変異体VLm3/VHm6及びVLm3/VHm13は、HEK293細胞
のトランスフェクションの間単純に各々の鎖をコードするプラスミドを一緒に組合わせる
ことにより、作製した。得られた抗体のpH依存性は、MSDで試験した（図4を参照されたい
）。
【0152】
突然変異の組合わせは、表5に示すように、pH依存性に対する非常に肯定的な効果を有
していた。二重変異体がpH 5.5で示す結合は、非常に乏しかった（pH5.5-pH5.5設定）。
対照的に、大部分のpH 7.4での抗体結合は、pH 5.5での洗浄の間に放出された（pH7.4-pH
5.5設定）。
していた。二重変異体がpH 5.5で示す結合は、非常に乏しかった（pH5.5-pH5.5設定）。
対照的に、大部分のpH 7.4での抗体結合は、pH 5.5での洗浄の間に放出された（pH7.4-pH
5.5設定）。
【0153】
表：5
nd：低い結合のためにEC50が測定可能でない
【表50】
【0154】
（実施例5：抗体3D6のpH依存性を高めるためのヒートマップを使用した完全突然変異解析
）
第2の抗原標的に対し方向づけられた抗体3D6のpH依存性をヒートマップを使用して導入
した。ヒートマップ及びCDR長によれば、3D6のVH中の25個の位置はヒスチジン置換の影響
を受けやすく、3D6のVκ中の16個の位置はヒスチジン置換の影響を受けやすかった（表6
を参照されたい）。これら25個の位置のうち21個を初期スクリーニングにおいて試験した
。
）
第2の抗原標的に対し方向づけられた抗体3D6のpH依存性をヒートマップを使用して導入
した。ヒートマップ及びCDR長によれば、3D6のVH中の25個の位置はヒスチジン置換の影響
を受けやすく、3D6のVκ中の16個の位置はヒスチジン置換の影響を受けやすかった（表6
を参照されたい）。これら25個の位置のうち21個を初期スクリーニングにおいて試験した
。
【0155】
表：6
【表51】
【0156】
各突然変異について、合成遺伝子を注文し（Geneart, Thermo Scientific）、適切な発
現ベクターにクローニングし、抗体を実施例3に示すように作製した。抗体のpH依存性を
、Biacore T200チップを高量の抗ヒトFc抗体（8000 RU）でコーティングした捕捉設定で
試験した。続いて、pH 7.4のHBS-EP中の3D6抗体の野生型又は突然変異体（2 μg/ml）を
注入して、好ましくは100～200 RUに到達させた。シグナルを安定化させた後、標的を2.5
又は10 nMで注入し、pH 7.4又は5.5のHBS-EP緩衝液を使用して洗浄した。pH 7.4での平衡
解離定数KD（M）は、 T200ソフトウェアを使用して測定した。会合をpH 7.4で行ったため
、解離定数（kd 1/s）のみをpH 5.5でのフィッティングから抽出した。結果を表7及び8に
提示する。
現ベクターにクローニングし、抗体を実施例3に示すように作製した。抗体のpH依存性を
、Biacore T200チップを高量の抗ヒトFc抗体（8000 RU）でコーティングした捕捉設定で
試験した。続いて、pH 7.4のHBS-EP中の3D6抗体の野生型又は突然変異体（2 μg/ml）を
注入して、好ましくは100～200 RUに到達させた。シグナルを安定化させた後、標的を2.5
又は10 nMで注入し、pH 7.4又は5.5のHBS-EP緩衝液を使用して洗浄した。pH 7.4での平衡
解離定数KD（M）は、 T200ソフトウェアを使用して測定した。会合をpH 7.4で行ったため
、解離定数（kd 1/s）のみをpH 5.5でのフィッティングから抽出した。結果を表7及び8に
提示する。
【0157】
表：7
【表52】
【0158】
表：8
【表53】
【0159】
これらのデータは、pH 7.4での結合の損失を最小限にしながらpH依存性が3D6に導入さ
れたことを示す。pH依存性を強化するために、単一ヒスチジン突然変異を組合わせること
は、有益となり得る。
れたことを示す。pH依存性を強化するために、単一ヒスチジン突然変異を組合わせること
は、有益となり得る。
【0160】
（実施例：6 抗体3D6においてpH依存性をさらに増加させるヒスチジン突然変異の組合わ
せ）
表7又は8における結果に基づいて、顕著なpH依存性を導入し、かつ/又はpH 7.4での結
合を改善する突然変異を同じドメイン中で組合わせて、新たな突然変異体VHm23、VHm24、
VHm25、VHm26、VKm16、VKm17、VKm18、及びVKm19（表9）を作製した。例えば、3D6VHm23
は突然変異VHm9及びVHm13を有し、3D6VHm24は、突然変異VHm0及びVHm16を有するなどであ
る。
せ）
表7又は8における結果に基づいて、顕著なpH依存性を導入し、かつ/又はpH 7.4での結
合を改善する突然変異を同じドメイン中で組合わせて、新たな突然変異体VHm23、VHm24、
VHm25、VHm26、VKm16、VKm17、VKm18、及びVKm19（表9）を作製した。例えば、3D6VHm23
は突然変異VHm9及びVHm13を有し、3D6VHm24は、突然変異VHm0及びVHm16を有するなどであ
る。
【0161】
表：9
【表54】
【0162】
新たなVH及びVK突然変異体は、HEK293細胞のトランスフェクションの間単純に各々の鎖
をコードするプラスミドを互いに一緒に組合わせることにより、さらに組合わせた。例え
ば、抗体3D6VHm23/VKm11は、VHm23突然変異体DNAを突然変異体VKm11 DNAと共トランスフ
ェクションすることにより組合わせた。精製後、結果として得た抗体のpH依存性を実施例
5に記載の通りBiacore（登録商標）を使用して試験した。優れたpH依存性及びpH 7.4での
優れた親和性を有する抗体は、加える標的の濃度が高い（0.04 nM; 0.1 nM; 0.37 nM; 1.
1 nM; 3.3 nM、及び10 nM）ことを唯一の相違点としてさらに特性評価した。pH 7.4でのK
D（M）は、 T200ソフトウェアを使用して測定した。解離定数（kd s-1）のみをpH 5.5で
のフィッティングから抽出した。上位5つの抗体を表10に示す。
をコードするプラスミドを互いに一緒に組合わせることにより、さらに組合わせた。例え
ば、抗体3D6VHm23/VKm11は、VHm23突然変異体DNAを突然変異体VKm11 DNAと共トランスフ
ェクションすることにより組合わせた。精製後、結果として得た抗体のpH依存性を実施例
5に記載の通りBiacore（登録商標）を使用して試験した。優れたpH依存性及びpH 7.4での
優れた親和性を有する抗体は、加える標的の濃度が高い（0.04 nM; 0.1 nM; 0.37 nM; 1.
1 nM; 3.3 nM、及び10 nM）ことを唯一の相違点としてさらに特性評価した。pH 7.4でのK
D（M）は、 T200ソフトウェアを使用して測定した。解離定数（kd s-1）のみをpH 5.5で
のフィッティングから抽出した。上位5つの抗体を表10に示す。
【0163】
表：10
【表55】
【0164】
Biacoreからの結果は、本明細書で提示する方法を用いると、pH 7.4での結合の損失を
最小限にして、高いpH依存性を有する抗体を迅速に同定することが可能となることを明確
に示している。
最小限にして、高いpH依存性を有する抗体を迅速に同定することが可能となることを明確
に示している。
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【手続補正書】
【提出日】2023-06-14
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
その抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を調製する方法であって：
親抗体の少なくとも1つのアミノ酸残基をヒスチジン残基で置換することにより、該操作された抗体を調製することを含み、以下のホットスポットリスト：
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されており、かつ以下のコールドスポットリスト：
からの少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されておらず、該操作された抗体がその抗原とのpH依存的結合を示す、前記方法。
親抗体の少なくとも1つのアミノ酸残基をヒスチジン残基で置換することにより、該操作された抗体を調製することを含み、以下のホットスポットリスト：
【表1】
【表2】
【手続補正書】
【提出日】2023-06-14
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0164】
Biacoreからの結果は、本明細書で提示する方法を用いると、pH 7.4での結合の損失を
最小限にして、高いpH依存性を有する抗体を迅速に同定することが可能となることを明確
に示している。
本件出願は、以下の態様の発明を提供する。
（態様１）
その抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を調製する方法であって：
親抗体の少なくとも1つのアミノ酸残基をヒスチジン残基で置換することにより、該操
作された抗体を調製することを含み、以下のホットスポットリスト：
（表１）
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されており、かつ以下
のコールドスポットリスト：
（表２）
からの少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されておらず、該操作された抗
体がその抗原とのpH依存的結合を示す、前記方法。
（態様2）
前記操作された抗体が、中性pHにおけるよりも酸性pHでその抗原との親和性が低い、態
様1記載の方法。
（態様3）
酸性pHでの前記操作された抗体-抗原相互作用の解離速度定数（k d ）が、中性pHでの該
操作された抗体-抗原相互作用の該解離速度定数（k d ）よりも高い、態様1記載の方法。
（態様4）
酸性pHでの前記操作された抗体-抗原相互作用の前記解離速度定数（k d ）が、酸性pHで
の親抗体-抗原相互作用の該解離速度定数（k d ）よりも高い、態様1記載の方法。
（態様5）
酸性pHでの前記操作された抗体-抗原相互作用の平衡解離定数（K D ）が、中性pHでの該
操作された抗体-抗原相互作用の該平衡解離定数（K D ）よりも高い、態様1又は2記載の方
法。
（態様6）
前記ホットスポットリストから選択される少なくとも2つのアミノ酸残基をヒスチジン
で置換する、態様1～5のいずれか1項記載の方法。
（態様7）
前記ホットスポットリストから選択される少なくとも3つのアミノ酸残基をヒスチジン
で置換する、態様1～5のいずれか1項記載の方法。
（態様8）
前記ホットスポットリストから選択される少なくとも4つのアミノ酸残基をヒスチジン
で置換する、態様1～5のいずれか1項記載の方法。
（態様9）
以下の残基：H100g、H100k、H100m、H100n、L95、L95d、L95e、L95f、L97の1以上もヒ
スチジンで置換する、態様1～8のいずれか1項記載の方法。
（態様10）
前記コールドスポットリストから選択される少なくとも2つのアミノ酸残基をヒスチジ
ンで置換しない、態様1～9のいずれか1項記載の方法。
（態様11）
前記コールドスポットリストから選択される少なくとも3つのアミノ酸残基をヒスチジ
ンで置換しない、態様1～9のいずれか1項記載の方法。
（態様12）
VHCDR1、VHCDR2、VLCDR1、及びVLCDR2の前記コールドスポットリストから選択されるア
ミノ酸残基のいずれもヒスチジンで置換しない、態様1～9のいずれか1項記載の方法。
（態様13）
前記親抗体又はそのCDRがラクダ科動物種に由来する、態様1～12のいずれか1項記載の
方法。
（態様14）
その抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を調製する方法であって：
(a) 抗原と結合する親抗体を提供する工程；
(b) 該親抗体の操作されたバリアントのパネルを調製する工程であって、該パネル中の
該操作されたバリアントの各々が少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジン残基で置換
されていることによって該親抗体と異なり、以下のホットスポットリスト：
（表３）
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されており、かつ以下
のコールドスポットリスト：
（表４）
からの少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されていない、前記工程；
(c) 該操作されたバリアントのパネルを該抗原とのpH依存的結合についてスクリーニン
グし、それによって該抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を同定する工程、を含
む、前記方法。
（態様15）
パート(c)で同定した前記操作された抗体が、中性pHにおけるよりも酸性pHでその抗原
との親和性が低い、態様14記載の方法。
（態様16）
パート(c)で同定した前記操作された抗体が、酸性pHでの該操作された抗体-抗原相互作
用の前記解離速度定数（k d ）が、中性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の該解離速
度定数（k d ）よりも高いことを特徴とする、態様14記載の方法。
（態様17）
パート(c)で同定した前記操作された抗体が、酸性pHでの該操作された抗体-抗原相互作
用の前記解離速度定数（k d ）が、酸性pHでの前記親抗体-抗原相互作用の該解離速度定数
（k d ）よりも高いことを特徴とする、態様14記載の方法。
（態様18）
パート(c)で同定した前記操作された抗体が、酸性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用
の前記平衡解離定数（K D ）が、中性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の該平衡解離
定数（K D ）よりも高いことを特徴とする、態様14又は15記載の方法。
（態様19）
工程(b)が、前記親抗体の操作されたバリアントのパネルを調製する工程を含み、該パ
ネル中の該操作されたバリアントの各々が、VHドメイン中の少なくとも1つのアミノ酸残
基がヒスチジン残基で置換されていることによって該親抗体と異なり、以下のホットスポ
ットリスト：
（表５）
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されており、かつ以下
のコールドスポットリスト：
（表６）
からの少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されていない、態様14～18のい
ずれか1項記載の方法。
（態様20）
工程(b)が、前記親抗体の操作されたバリアントのパネルを調製する工程を含み、該パ
ネル中の該操作されたバリアントの各々が、VLドメイン中の少なくとも1つのアミノ酸残
基がヒスチジン残基で置換されていることによって該親抗体と異なり、以下のホットスポ
ットリスト：
（表７）
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されており、かつ以下
のコールドスポットリスト：
（表８）
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されていない、態様14
～18のいずれか1項記載の方法。
（態様21）
前記親抗体の前記VLドメインがλクラスに属し、かつ以下のホットスポットリスト：
（表９）
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されており、かつ以下
のコールドスポットリスト：
（表１０）
からの少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されていない、態様20記載の方
法。
（態様22）
前記親抗体の前記VLドメインがκクラスに属し、かつ以下のホットスポットリスト：
（表１１）
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されており、かつ以下
のコールドスポットリスト：
（表１２）
からの少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されていない、態様20記載の方
法。
（態様23）
その抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を調製する方法であって：
(a) 抗原と結合する親抗体を同定する工程；
(b) 該親抗体の操作されたバリアントのパネルを調製する工程であって、該パネル中の
該操作されたバリアントの各々が少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジン残基で置換
されていることによって該親抗体と異なり、以下のホットスポットリスト：
（表１３）
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されており、かつ以下
のコールドスポットリスト：
（表１４）
からの少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されていない、前記工程；
(c) 該操作されたバリアントのパネルを該標的抗原とのpH依存的結合についてスクリー
ニングし、それによってヒスチジンの存在により該抗原とのpH依存的結合が付与される選
択されたアミノ酸位置を同定する工程；
(d) 該親抗体の1以上のさらに操作されたバリアントを調製する工程であって、該バリ
アントの各々が工程(c)で同定された2以上の選択されたアミノ酸位置にヒスチジンを含む
、前記工程；及び
(e) 該さらに操作されたバリアントを該抗原とのpH依存的結合についてスクリーニング
し；それによって該抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を同定する工程、を含む
、前記方法。
（態様24）
パート(e)で同定した前記操作された抗体が、中性pHにおけるよりも酸性pHでその抗原
との親和性が低い、態様23記載の方法。
（態様25）
パート(e)で同定した前記操作された抗体が、酸性pHでの該操作された抗体-抗原相互作
用の前記解離速度定数（k d ）が、中性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の該解離速
度定数（k d ）よりも高いことを特徴とする、態様23記載の方法。
（態様26）
パート(e)で同定した前記操作された抗体が、酸性pHでの該操作された抗体-抗原相互作
用の前記解離速度定数（k d ）が、酸性pHでの前記親抗体-抗原相互作用の該解離速度定数
（k d ）よりも高いことを特徴とする、態様23記載の方法。
（態様27）
パート(e)で同定した前記操作された抗体が、酸性pHでの該操作された抗体-抗原相互作
用の前記平衡解離定数（K D ）が、中性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の該平衡解
離定数（K D ）よりも高いことを特徴とする、態様23又は24記載の方法。
（態様28）
工程(b)の前記パネル中の前記操作されたバリアントの各々が、前記ホットスポットリ
ストから選択されたアミノ酸位置での単一のヒスチジン置換を含む、態様23～27のいずれ
か1項記載の方法。
（態様29）
工程(d)の前記さらに操作されたバリアントが、工程(c)で同定された3以上の前記選択
されたアミノ酸位置にヒスチジン残基を含む、態様23～28のいずれか1項記載の方法。
（態様30）
工程(d)の前記さらに操作されたバリアントが、工程(c)で同定された4以上の前記選択
されたアミノ酸位置にヒスチジン残基を含む、態様23～28のいずれか1項記載の方法。
（態様31）
工程(d)の前記さらに操作されたバリアントが、以下のアミノ酸位置：H100g、H100k、H
100m、H100n、L95、L95d、L95e、L95f、L97の1以上にヒスチジン残基をさらに含む、態様
23～28のいずれか1項記載の方法。
（態様32）
その抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を調製する方法であって：
(a) 抗原と結合する親抗体を同定する工程；
(b) 該親抗体の操作されたバリアントの第1のパネルを調製する工程であって、該パネ
ル中の該操作されたバリアントの各々が、VHドメイン中の少なくとも1つのアミノ酸残基
がヒスチジン残基で置換されていることによって該親抗体と異なり、以下のホットスポッ
トリスト：
（表１５）
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されており、かつ以下
のコールドスポットリスト：
（表１６）
からの少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されていない、前記工程；
(c) 該操作されたバリアントの第1のパネルを該抗原とのpH依存的結合についてスクリ
ーニングし；それによってヒスチジンの存在によりpH依存的結合が付与されるVHドメイン
中の1以上の選択されたアミノ酸位置を同定する工程；
(d) 該親抗体の操作されたバリアントの第2のパネルを調製する工程であって、該パネ
ル中の該操作されたバリアントの各々がVLドメイン中の少なくとも1つのアミノ酸残基が
ヒスチジン残基で置換されていることによって該親抗体と異なり、以下のホットスポット
リスト：
（表１７）
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されており、かつ以下
のコールドスポットリスト：
（表１８）
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されていない、前記工
程；
(e) 該操作されたバリアントの第2のパネルを該抗原とのpH依存的結合についてスクリ
ーニングし；それによってヒスチジンの存在によりpH依存的結合が付与されるVLドメイン
中の1以上の選択されたアミノ酸位置を同定する工程；
(f) 該親抗体の1以上のさらに操作されたバリアントを調製する工程であって、該バリ
アントの各々が、工程(c)で同定されたVHドメイン中の1以上の選択されたアミノ酸位置の
アミノ酸がヒスチジンで置換されていることによって該親抗体と異なり、かつ工程(e)で
同定されたVLドメイン中の1以上の選択されたアミノ酸位置のアミノ酸がヒスチジンで置
換されていることによって該親抗体と異なる、前記工程；
(g) 該さらに操作されたバリアントを該抗原とのpH依存的結合についてスクリーニング
し；それによって該抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を同定する工程、を含む
、前記方法。
（態様33）
前記親抗体の前記VLドメインがλクラスに属し、かつ以下のホットスポットリスト：
（表１９）
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されており、かつ以下
のコールドスポットリスト：
（表２０）
からの少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されていない、態様32記載の方
法。
（態様34）
前記親抗体の前記VLドメインがκクラスに属し、かつ以下のホットスポットリスト：
（表２１）
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されており、かつ以下
のコールドスポットリスト：
（表２２）
からの少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジンで置換されていない、態様32記載の方
法。
（態様35）
パート(g)で同定した前記操作された抗体が、中性pHにおけるよりも酸性pHでその抗原
との親和性が低い、態様32～34のいずれか1項記載の方法。
（態様36）
パート(g)で同定した前記操作された抗体が、酸性pHでの該操作された抗体-抗原相互作
用の前記解離速度定数（k d ）が、中性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の該解離速
度定数（k d ）よりも高いことを特徴とする、態様32～34のいずれか1項記載の方法。
（態様37）
パート(g)で同定した前記操作された抗体が、酸性pHでの該操作された抗体-抗原相互作
用の前記解離速度定数（k d ）が、酸性pHでの前記親抗体-抗原相互作用の該解離速度定数
（k d ）よりも高いことを特徴とする、態様32～34のいずれか1項記載の方法。
（態様38）
パート(g)で同定した前記操作された抗体が、酸性pHでの該操作された抗体-抗原相互作
用の前記平衡解離定数（K D ）が、中性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の該平衡解
離定数（K D ）よりも高いことを特徴とする、態様32～37のいずれか1項記載の方法。
（態様39）
工程(f)の前記さらに操作されたバリアントが、工程(c)及び(e)で同定された全部で3以
上の前記選択されたアミノ酸位置にヒスチジンを含む、態様32～38のいずれか1項記載の
方法。
（態様40）
工程(f)の前記さらに操作されたバリアントが、工程(c)及び(e)で同定された全部で4以
上の前記選択されたアミノ酸位置にヒスチジンを含む、態様32～38のいずれか1項記載の
方法。
（態様41）
工程(f)の前記さらに操作されたバリアントが、以下のアミノ酸位置：H100g、H100k、H10
0m、H100n、L95、L95d、L95e、L95f、L97の1以上にヒスチジン残基をさらに含む、態様32
～38のいずれか1項記載の方法。
（態様42）
前記親抗体又はそのCDRがラクダ科動物種に由来する、態様14～41のいずれか1項記載の
方法。
（態様43）
その抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体であって、該操作された抗体のCDR中
の少なくとも1つのアミノ酸がヒスチジン残基であり、以下のホットスポットリスト：
（表２３）
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジン残基であり、かつ以下のコー
ルドスポットリスト：
（表２４）
から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジン残基でないことを特徴とする
、前記操作された抗体。
（態様44）
前記操作された抗体が、中性pHにおけるよりも酸性pHでその抗原との親和性が低い、態
様43記載の操作された抗体。
（態様45）
酸性pHでの前記操作された抗体-抗原相互作用の前記解離速度定数（k d ）が、中性pHで
の該操作された抗体-抗原相互作用の該解離速度定数（k d ）よりも高い、態様43記載の操
作された抗体。
（態様46）
酸性pHでの前記操作された抗体-抗原相互作用の前記平衡解離定数（K D ）が、中性pHで
の該操作された抗体-抗原相互作用の該平衡解離定数（K D ）よりも高い、態様43又は44記
載の操作された抗体。
（態様47）
前記ホットスポットリストから選択される少なくとも2つのアミノ酸残基がヒスチジン
である、態様43～46のいずれか1項記載の操作された抗体。
（態様48）
前記ホットスポットリストから選択される少なくとも3つのアミノ酸残基がヒスチジン
である、態様43～46のいずれか1項記載の操作された抗体。
（態様49）
前記ホットスポットリストから選択される少なくとも4つのアミノ酸残基がヒスチジン
である、態様43～46のいずれか1項記載の操作された抗体。
（態様50）
以下のアミノ酸位置：H100g、H100k、H100m、H100n、L95、L95d、L95e、L95f、L97の1
以上にヒスチジン残基をさらに含む、態様43～49のいずれか1項記載の操作された抗体。
（態様51）
表Bに列記される位置の少なくとも2つのアミノ酸残基がヒスチジンではない、態様43～
50のいずれか1項記載の操作された抗体。
（態様52）
前記コールドスポットリストから選択される位置の少なくとも3つのアミノ酸残基がヒ
スチジンではない、態様43～50のいずれか1項記載の操作された抗体。
（態様53）
以下のアミノ酸位置：H100g、H100k、H100m、H100n、L95、L95d、L95e、L95f、L97の1
以上にヒスチジンを含み得ることを条件として、前記コールドスポットリストに記載の位
置のいずれのアミノ酸残基もヒスチジンではない、態様43～50のいずれか1項記載の操作
された抗体。
（態様54）
ラクダ科動物抗体の操作されたバリアントである、態様43～53のいずれか1項記載の操
作された抗体。
（態様55）
Fc領域を含み、新生児Fc受容体（FcRn）と結合する、態様43～54のいずれか1項記載の
操作された抗体。
最小限にして、高いpH依存性を有する抗体を迅速に同定することが可能となることを明確
に示している。
本件出願は、以下の態様の発明を提供する。
（態様１）
その抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を調製する方法であって：
親抗体の少なくとも1つのアミノ酸残基をヒスチジン残基で置換することにより、該操
作された抗体を調製することを含み、以下のホットスポットリスト：
（表１）
のコールドスポットリスト：
（表２）
体がその抗原とのpH依存的結合を示す、前記方法。
（態様2）
前記操作された抗体が、中性pHにおけるよりも酸性pHでその抗原との親和性が低い、態
様1記載の方法。
（態様3）
酸性pHでの前記操作された抗体-抗原相互作用の解離速度定数（k d ）が、中性pHでの該
操作された抗体-抗原相互作用の該解離速度定数（k d ）よりも高い、態様1記載の方法。
（態様4）
酸性pHでの前記操作された抗体-抗原相互作用の前記解離速度定数（k d ）が、酸性pHで
の親抗体-抗原相互作用の該解離速度定数（k d ）よりも高い、態様1記載の方法。
（態様5）
酸性pHでの前記操作された抗体-抗原相互作用の平衡解離定数（K D ）が、中性pHでの該
操作された抗体-抗原相互作用の該平衡解離定数（K D ）よりも高い、態様1又は2記載の方
法。
（態様6）
前記ホットスポットリストから選択される少なくとも2つのアミノ酸残基をヒスチジン
で置換する、態様1～5のいずれか1項記載の方法。
（態様7）
前記ホットスポットリストから選択される少なくとも3つのアミノ酸残基をヒスチジン
で置換する、態様1～5のいずれか1項記載の方法。
（態様8）
前記ホットスポットリストから選択される少なくとも4つのアミノ酸残基をヒスチジン
で置換する、態様1～5のいずれか1項記載の方法。
（態様9）
以下の残基：H100g、H100k、H100m、H100n、L95、L95d、L95e、L95f、L97の1以上もヒ
スチジンで置換する、態様1～8のいずれか1項記載の方法。
（態様10）
前記コールドスポットリストから選択される少なくとも2つのアミノ酸残基をヒスチジ
ンで置換しない、態様1～9のいずれか1項記載の方法。
（態様11）
前記コールドスポットリストから選択される少なくとも3つのアミノ酸残基をヒスチジ
ンで置換しない、態様1～9のいずれか1項記載の方法。
（態様12）
VHCDR1、VHCDR2、VLCDR1、及びVLCDR2の前記コールドスポットリストから選択されるア
ミノ酸残基のいずれもヒスチジンで置換しない、態様1～9のいずれか1項記載の方法。
（態様13）
前記親抗体又はそのCDRがラクダ科動物種に由来する、態様1～12のいずれか1項記載の
方法。
（態様14）
その抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を調製する方法であって：
(a) 抗原と結合する親抗体を提供する工程；
(b) 該親抗体の操作されたバリアントのパネルを調製する工程であって、該パネル中の
該操作されたバリアントの各々が少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジン残基で置換
されていることによって該親抗体と異なり、以下のホットスポットリスト：
（表３）
のコールドスポットリスト：
（表４）
(c) 該操作されたバリアントのパネルを該抗原とのpH依存的結合についてスクリーニン
グし、それによって該抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を同定する工程、を含
む、前記方法。
（態様15）
パート(c)で同定した前記操作された抗体が、中性pHにおけるよりも酸性pHでその抗原
との親和性が低い、態様14記載の方法。
（態様16）
パート(c)で同定した前記操作された抗体が、酸性pHでの該操作された抗体-抗原相互作
用の前記解離速度定数（k d ）が、中性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の該解離速
度定数（k d ）よりも高いことを特徴とする、態様14記載の方法。
（態様17）
パート(c)で同定した前記操作された抗体が、酸性pHでの該操作された抗体-抗原相互作
用の前記解離速度定数（k d ）が、酸性pHでの前記親抗体-抗原相互作用の該解離速度定数
（k d ）よりも高いことを特徴とする、態様14記載の方法。
（態様18）
パート(c)で同定した前記操作された抗体が、酸性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用
の前記平衡解離定数（K D ）が、中性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の該平衡解離
定数（K D ）よりも高いことを特徴とする、態様14又は15記載の方法。
（態様19）
工程(b)が、前記親抗体の操作されたバリアントのパネルを調製する工程を含み、該パ
ネル中の該操作されたバリアントの各々が、VHドメイン中の少なくとも1つのアミノ酸残
基がヒスチジン残基で置換されていることによって該親抗体と異なり、以下のホットスポ
ットリスト：
（表５）
のコールドスポットリスト：
（表６）
ずれか1項記載の方法。
（態様20）
工程(b)が、前記親抗体の操作されたバリアントのパネルを調製する工程を含み、該パ
ネル中の該操作されたバリアントの各々が、VLドメイン中の少なくとも1つのアミノ酸残
基がヒスチジン残基で置換されていることによって該親抗体と異なり、以下のホットスポ
ットリスト：
（表７）
のコールドスポットリスト：
（表８）
～18のいずれか1項記載の方法。
（態様21）
前記親抗体の前記VLドメインがλクラスに属し、かつ以下のホットスポットリスト：
（表９）
のコールドスポットリスト：
（表１０）
法。
（態様22）
前記親抗体の前記VLドメインがκクラスに属し、かつ以下のホットスポットリスト：
（表１１）
のコールドスポットリスト：
（表１２）
法。
（態様23）
その抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を調製する方法であって：
(a) 抗原と結合する親抗体を同定する工程；
(b) 該親抗体の操作されたバリアントのパネルを調製する工程であって、該パネル中の
該操作されたバリアントの各々が少なくとも1つのアミノ酸残基がヒスチジン残基で置換
されていることによって該親抗体と異なり、以下のホットスポットリスト：
（表１３）
のコールドスポットリスト：
（表１４）
(c) 該操作されたバリアントのパネルを該標的抗原とのpH依存的結合についてスクリー
ニングし、それによってヒスチジンの存在により該抗原とのpH依存的結合が付与される選
択されたアミノ酸位置を同定する工程；
(d) 該親抗体の1以上のさらに操作されたバリアントを調製する工程であって、該バリ
アントの各々が工程(c)で同定された2以上の選択されたアミノ酸位置にヒスチジンを含む
、前記工程；及び
(e) 該さらに操作されたバリアントを該抗原とのpH依存的結合についてスクリーニング
し；それによって該抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を同定する工程、を含む
、前記方法。
（態様24）
パート(e)で同定した前記操作された抗体が、中性pHにおけるよりも酸性pHでその抗原
との親和性が低い、態様23記載の方法。
（態様25）
パート(e)で同定した前記操作された抗体が、酸性pHでの該操作された抗体-抗原相互作
用の前記解離速度定数（k d ）が、中性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の該解離速
度定数（k d ）よりも高いことを特徴とする、態様23記載の方法。
（態様26）
パート(e)で同定した前記操作された抗体が、酸性pHでの該操作された抗体-抗原相互作
用の前記解離速度定数（k d ）が、酸性pHでの前記親抗体-抗原相互作用の該解離速度定数
（k d ）よりも高いことを特徴とする、態様23記載の方法。
（態様27）
パート(e)で同定した前記操作された抗体が、酸性pHでの該操作された抗体-抗原相互作
用の前記平衡解離定数（K D ）が、中性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の該平衡解
離定数（K D ）よりも高いことを特徴とする、態様23又は24記載の方法。
（態様28）
工程(b)の前記パネル中の前記操作されたバリアントの各々が、前記ホットスポットリ
ストから選択されたアミノ酸位置での単一のヒスチジン置換を含む、態様23～27のいずれ
か1項記載の方法。
（態様29）
工程(d)の前記さらに操作されたバリアントが、工程(c)で同定された3以上の前記選択
されたアミノ酸位置にヒスチジン残基を含む、態様23～28のいずれか1項記載の方法。
（態様30）
工程(d)の前記さらに操作されたバリアントが、工程(c)で同定された4以上の前記選択
されたアミノ酸位置にヒスチジン残基を含む、態様23～28のいずれか1項記載の方法。
（態様31）
工程(d)の前記さらに操作されたバリアントが、以下のアミノ酸位置：H100g、H100k、H
100m、H100n、L95、L95d、L95e、L95f、L97の1以上にヒスチジン残基をさらに含む、態様
23～28のいずれか1項記載の方法。
（態様32）
その抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を調製する方法であって：
(a) 抗原と結合する親抗体を同定する工程；
(b) 該親抗体の操作されたバリアントの第1のパネルを調製する工程であって、該パネ
ル中の該操作されたバリアントの各々が、VHドメイン中の少なくとも1つのアミノ酸残基
がヒスチジン残基で置換されていることによって該親抗体と異なり、以下のホットスポッ
トリスト：
（表１５）
のコールドスポットリスト：
（表１６）
(c) 該操作されたバリアントの第1のパネルを該抗原とのpH依存的結合についてスクリ
ーニングし；それによってヒスチジンの存在によりpH依存的結合が付与されるVHドメイン
中の1以上の選択されたアミノ酸位置を同定する工程；
(d) 該親抗体の操作されたバリアントの第2のパネルを調製する工程であって、該パネ
ル中の該操作されたバリアントの各々がVLドメイン中の少なくとも1つのアミノ酸残基が
ヒスチジン残基で置換されていることによって該親抗体と異なり、以下のホットスポット
リスト：
（表１７）
のコールドスポットリスト：
（表１８）
程；
(e) 該操作されたバリアントの第2のパネルを該抗原とのpH依存的結合についてスクリ
ーニングし；それによってヒスチジンの存在によりpH依存的結合が付与されるVLドメイン
中の1以上の選択されたアミノ酸位置を同定する工程；
(f) 該親抗体の1以上のさらに操作されたバリアントを調製する工程であって、該バリ
アントの各々が、工程(c)で同定されたVHドメイン中の1以上の選択されたアミノ酸位置の
アミノ酸がヒスチジンで置換されていることによって該親抗体と異なり、かつ工程(e)で
同定されたVLドメイン中の1以上の選択されたアミノ酸位置のアミノ酸がヒスチジンで置
換されていることによって該親抗体と異なる、前記工程；
(g) 該さらに操作されたバリアントを該抗原とのpH依存的結合についてスクリーニング
し；それによって該抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体を同定する工程、を含む
、前記方法。
（態様33）
前記親抗体の前記VLドメインがλクラスに属し、かつ以下のホットスポットリスト：
（表１９）
のコールドスポットリスト：
（表２０）
法。
（態様34）
前記親抗体の前記VLドメインがκクラスに属し、かつ以下のホットスポットリスト：
（表２１）
のコールドスポットリスト：
（表２２）
法。
（態様35）
パート(g)で同定した前記操作された抗体が、中性pHにおけるよりも酸性pHでその抗原
との親和性が低い、態様32～34のいずれか1項記載の方法。
（態様36）
パート(g)で同定した前記操作された抗体が、酸性pHでの該操作された抗体-抗原相互作
用の前記解離速度定数（k d ）が、中性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の該解離速
度定数（k d ）よりも高いことを特徴とする、態様32～34のいずれか1項記載の方法。
（態様37）
パート(g)で同定した前記操作された抗体が、酸性pHでの該操作された抗体-抗原相互作
用の前記解離速度定数（k d ）が、酸性pHでの前記親抗体-抗原相互作用の該解離速度定数
（k d ）よりも高いことを特徴とする、態様32～34のいずれか1項記載の方法。
（態様38）
パート(g)で同定した前記操作された抗体が、酸性pHでの該操作された抗体-抗原相互作
用の前記平衡解離定数（K D ）が、中性pHでの該操作された抗体-抗原相互作用の該平衡解
離定数（K D ）よりも高いことを特徴とする、態様32～37のいずれか1項記載の方法。
（態様39）
工程(f)の前記さらに操作されたバリアントが、工程(c)及び(e)で同定された全部で3以
上の前記選択されたアミノ酸位置にヒスチジンを含む、態様32～38のいずれか1項記載の
方法。
（態様40）
工程(f)の前記さらに操作されたバリアントが、工程(c)及び(e)で同定された全部で4以
上の前記選択されたアミノ酸位置にヒスチジンを含む、態様32～38のいずれか1項記載の
方法。
（態様41）
工程(f)の前記さらに操作されたバリアントが、以下のアミノ酸位置：H100g、H100k、H10
0m、H100n、L95、L95d、L95e、L95f、L97の1以上にヒスチジン残基をさらに含む、態様32
～38のいずれか1項記載の方法。
（態様42）
前記親抗体又はそのCDRがラクダ科動物種に由来する、態様14～41のいずれか1項記載の
方法。
（態様43）
その抗原とのpH依存的結合を示す操作された抗体であって、該操作された抗体のCDR中
の少なくとも1つのアミノ酸がヒスチジン残基であり、以下のホットスポットリスト：
（表２３）
ルドスポットリスト：
（表２４）
、前記操作された抗体。
（態様44）
前記操作された抗体が、中性pHにおけるよりも酸性pHでその抗原との親和性が低い、態
様43記載の操作された抗体。
（態様45）
酸性pHでの前記操作された抗体-抗原相互作用の前記解離速度定数（k d ）が、中性pHで
の該操作された抗体-抗原相互作用の該解離速度定数（k d ）よりも高い、態様43記載の操
作された抗体。
（態様46）
酸性pHでの前記操作された抗体-抗原相互作用の前記平衡解離定数（K D ）が、中性pHで
の該操作された抗体-抗原相互作用の該平衡解離定数（K D ）よりも高い、態様43又は44記
載の操作された抗体。
（態様47）
前記ホットスポットリストから選択される少なくとも2つのアミノ酸残基がヒスチジン
である、態様43～46のいずれか1項記載の操作された抗体。
（態様48）
前記ホットスポットリストから選択される少なくとも3つのアミノ酸残基がヒスチジン
である、態様43～46のいずれか1項記載の操作された抗体。
（態様49）
前記ホットスポットリストから選択される少なくとも4つのアミノ酸残基がヒスチジン
である、態様43～46のいずれか1項記載の操作された抗体。
（態様50）
以下のアミノ酸位置：H100g、H100k、H100m、H100n、L95、L95d、L95e、L95f、L97の1
以上にヒスチジン残基をさらに含む、態様43～49のいずれか1項記載の操作された抗体。
（態様51）
表Bに列記される位置の少なくとも2つのアミノ酸残基がヒスチジンではない、態様43～
50のいずれか1項記載の操作された抗体。
（態様52）
前記コールドスポットリストから選択される位置の少なくとも3つのアミノ酸残基がヒ
スチジンではない、態様43～50のいずれか1項記載の操作された抗体。
（態様53）
以下のアミノ酸位置：H100g、H100k、H100m、H100n、L95、L95d、L95e、L95f、L97の1
以上にヒスチジンを含み得ることを条件として、前記コールドスポットリストに記載の位
置のいずれのアミノ酸残基もヒスチジンではない、態様43～50のいずれか1項記載の操作
された抗体。
（態様54）
ラクダ科動物抗体の操作されたバリアントである、態様43～53のいずれか1項記載の操
作された抗体。
（態様55）
Fc領域を含み、新生児Fc受容体（FcRn）と結合する、態様43～54のいずれか1項記載の
操作された抗体。
【外国語明細書】