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特開2023-113903臓器の虚血再灌流傷害を予防する方法における使用のためのＩＬ－３３のアンタゴニスト
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023113903
(43)【公開日】2023-08-16
(54)【発明の名称】臓器の虚血再灌流傷害を予防する方法における使用のためのＩＬ－３３のアンタゴニスト
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20230808BHJP
A61L 27/36 20060101ALI20230808BHJP
A61L 27/54 20060101ALI20230808BHJP
A61L 27/22 20060101ALI20230808BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230808BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20230808BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20230808BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20230808BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20230808BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
A61L27/36 100
A61L27/36 410
A61L27/54
A61L27/22
A61K39/395 D
A61K39/395 U
A61K31/7088
A61K31/713
A61P13/12
A61P9/00
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023095440
(22)【出願日】2023-06-09
(62)【分割の表示】P 2020540401の分割
【原出願日】2019-01-24
(31)【優先権主張番号】18305054.1
(32)【優先日】2018-01-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
３．ＮＯＮＩＤＥＴ
４．ＳＰＡＮ
(71)【出願人】
【識別番号】591100596
【氏名又は名称】アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル
(71)【出願人】
【識別番号】506155266
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・ドゥ・ポワティエ
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＰＯＩＴＩＥＲＳ
(71)【出願人】
【識別番号】518154594
【氏名又は名称】サントル オスピタリエ ユニヴェルシテル ドゥ ポワティエ
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＨＯＳＰＩＴＡＬＩＥＲ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＩＲＥ ＤＥ ＰＯＩＴＩＥＲＳ
(71)【出願人】
【識別番号】595040744
【氏名又は名称】サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】エルブラン，アンドレ
(72)【発明者】
【氏名】ゴンベール，ジャン－マルク
(72)【発明者】
【氏名】フェルハト，マルア
(72)【発明者】
【氏名】ティエリー，アントワーヌ
(72)【発明者】
【氏名】ジラール，ジャン－フィリップ
(57)【要約】 （修正有）
【課題】臓器の虚血再灌流傷害を予防する方法を提供する。
【解決手段】臓器における虚血再灌流傷害を予防するか、重症度を低減するか、又はそのリスクを低減する方法であって、治療有効量のＩＬ－３３アンタゴニストを臓器に投与することを含む方法とする。
【選択図】なし
【解決手段】臓器における虚血再灌流傷害を予防するか、重症度を低減するか、又はそのリスクを低減する方法であって、治療有効量のＩＬ－３３アンタゴニストを臓器に投与することを含む方法とする。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
臓器における虚血再灌流傷害を予防するか、重症度を低減するか、又はそのリスクを低減する方法であって、治療有効量のＩＬ－３３アンタゴニストを臓器に投与することを含む方法。
【請求項2】
臓器が、レシピエントに移植されることになっている、請求項１記載の方法。
【請求項3】
臓器が、有効量のＩＬ－３３アンタゴニストで灌流される、請求項２記載の方法。
【請求項4】
臓器が、温虚血及び／又は冷虚血の対象である、請求項２記載の方法。
【請求項5】
外科的処置であって、肝臓切除術；血栓溶解療法、ステント留置術、又は外科的修復などによる心筋梗塞後の血行再建術；血栓溶解療法又は外科的修復などによる脳卒中後の血行再建術；あるいは、虚血傷害後の四肢の修復若しくは再接合術又は動脈瘤の外科的修復を含む、血管損傷後の血行再建術のような外科的処置中に実行される、請求項１記載の方法。
【請求項6】
外科的処置が、臓器への血液供給のクランプ固定を必要とする、請求項５記載の方法。
【請求項7】
外科的処置が、２つの血管の連結、例えば、冠動脈バイパス、末梢バイパス、血液透析アクセス（瘻孔の造設）、及び遊離皮弁手術（乳房及び顔面再建術）を伴う、請求項５記載の方法。
【請求項8】
心筋組織、血管組織及び神経組織（特に脳組織）のような組織において起こり得る、任意の虚血性発作又は虚血性イベントに適用される、請求項１記載の方法。
【請求項9】
急性腎傷害（ＡＫＩ）後の慢性腎疾患（ＣＫＤ）への進行を防止するための、請求項１記載の方法。
【請求項10】
ＩＬ－３３アンタゴニストが、ＩＬ－３３に対して結合親和性を有する抗体である、請求項１記載の方法。
【請求項11】
ＩＬ－３３アンタゴニストが、ＳＴ２の細胞外ドメインに対する抗体である、請求項１記載の方法。
【請求項12】
ＩＬ－３３アンタゴニストが、場合によりＦｃ領域のような免疫グロブリン定常ドメインに融合された、ＩＬ－３３を捕捉することができる可溶性受容体を形成するように、ＳＴ２の細胞外ドメインの全部又は一部を含むポリペプチドである、請求項１記載の方法。
【請求項13】
ＩＬ－３３アンタゴニストが、ｓｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのような、ＩＬ－３３又はＳＴ２発現のインヒビターである、請求項１記載の方法。
【請求項14】
ＩＬ－３３アンタゴニストが、注入、ポンプ装置及び／又は任意の機械（例えば、バイパス機械）を使用して、対象又は単離された臓器に直接投与される、請求項１記載の方法。
【請求項15】
有効量のＩＬ－３３アンタゴニストを含む保存溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、臓器の虚血再灌流傷害を予防する方法における使用のためのＩＬ－３３のアンタゴニストに関する。
【背景技術】
【0002】
腎移植時の虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）は、ミトコンドリア機能障害、活性酸素種の放出、細胞壊死、アポトーシス及び組織損傷を伴う、複雑な病態生理を経て移植片損傷（１）の一因となる。その結果、臓器機能が損なわれ（２）、線維症につながる（３）。
【0003】
ＩＲＩモデルでの研究は、自然免疫系が介在する炎症反応が腎損傷を引き起こすことを実証している（２～６）。ただし、免疫細胞の初期活性化及び虚血後の腎臓への動員の機序はなお不明であり、非感染性炎症反応を開始できる宿主生体分子である炎症性の損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）の関与の可能性の問題が浮かび上がる（７～８）。ＤＡＭＰは通常細胞内にあり、細胞膜によって免疫系から保護されており（９～１０）、組織損傷に続くそれらの放出は細胞損傷を伝達し、自然免疫系を活性化する（９～１２）。アラーミン（alarmin）と呼ばれるＤＡＭＰのサブセットは、組織由来の核タンパク質であり、上皮バリア組織及び内皮バリアにおいて高レベルで構成的に発現している。ディフェンシン、カテリシジン、好酸球由来神経毒、高移動度群ボックスタンパク質（ＨＭＧＢ）１、及びインターロイキン（ＩＬ）－１αを含む、これらの強力な免疫刺激剤は、Toll様受容体（ＴＬＲ）又はサイトカイン受容体を活性化する能力を持ち、そして隣接細胞／組織に警告を出し、自然免疫系及び適応免疫系を動員するための早期警戒信号として機能を果たす（１３）。
【0004】
重要な炎症性機能はまた、従来のサイトカイン及びアラーミンの両方として、ＩＬ－３３に起因するとされてきた（１４～１９）。ＩＬ－３３は、当初ＮＦ－ＨＥＶ（「高内皮細静脈の核因子（Nuclear Factor of High-Endothelial Venules）」）と呼ばれる核因子として同定され（２０）、ＩＬ－１－β及びＩＬ－１８も含むサイトカインのＩＬ－１受容体スーパーファミリーの最新のメンバーである。それは、内皮細胞及び上皮細胞及び／又は線維芽細胞の核において、腎臓を含む様々な組織によって構成的に発現される（１４～１９、２１）。感染又は外傷に起因する組織ストレス状態で、ＩＬ－３３は、アラーミンとして壊死細胞によって放出され、非免疫細胞及び自然免疫細胞の両方を急速に標的とし、それにより炎症性サイトカイン分泌を増加させる（１８、１９、２２）。それの具体的な受容体のＳＴ２及び共受容体のＩＬ－１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ－１ＲＡｃＰ）（１４、１５）に結合すると、ＩＬ－３３はＭｙＤ８８（骨髄分化一次応答遺伝子８８）依存性炎症経路を開始させる。ＩＬ－３３は、ＩＬ－３３のデコイ受容体として作用するｓＳＴ２（可溶性ＳＴ２）によって負に調節され得る（１９）。
【0005】
ＩＬ－３３は、腎毒性及び閉塞性ＡＫＩにおいて有害な効果を持つ強力な炎症性メディエーターとして説明されている（２１、２３）。ただし、２つのモデルでは、ＩＬ－３３は従来のサイトカイン同様に、ＡＫＩ誘導後２～４日以内に合成されるらしいため、ＩＬ－３３の初期のアラーミン様放出は報告されていない。一方、２型自然リンパ球（２４）及びＴｒｅｇ（２５）のようなＳＴ２を発現する逆調節免疫細胞の活性化を介する外因性ＩＬ－３３の保護効果は、幾つかの実験的ＡＫＩ設定において報告されている。
【0006】
ヒトでは、ＩＬ－３３は慢性腎疾患に関与している（２６、２７）。腎臓移植に関して、我々の最近の発見は、腎臓ＩＲＩの間に、ＩＬ－３３が再灌流後に血清及び尿中に即座に放出されるアラーミンとして作用することを示唆している（２８）。この臨床状況では、ＩＬ－３３レベルとＩＲＩ期間が相関しており、腎細胞損傷とＩＬ－３３放出の間の密接な関係を支持している（２８）。それにもかかわらず、実験的な腎臓ＩＲＩへのＩＬ－３３の関与の直接的な証拠はこれまで提供されていない。
【発明の概要】
【0007】
本発明は、臓器の虚血再灌流傷害を予防する方法における使用のためのＩＬ－３３のアンタゴニストに関する。特に、本発明は、特許請求の範囲によって規定される。
【0008】
発明の詳細な説明
炎症は、白血球浸潤及び尿細管傷害を特徴とする虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）の顕著な特徴である。ただし、これらのイベントを開始させる信号はよく理解されていないままである。本研究は、組織損傷の開始因子として、またマウスの実験的腎虚血再灌流によって引き起こされる自然免疫反応の主要な増幅因子として、核内アラーミンのインターロイキン（ＩＬ）－３３を同定している。ＩＬ－３３は、主に微小血管内皮細胞によって、尿細管周囲腔及び糸球体周囲腔に腎臓全体で構成的に発現されており、ＩＲＩの際にはここから直ちに放出される。ＩＬ－３３を欠くマウス（ＩＬ－３３Ｇｔ／Ｇｔ）では、早期の尿細管細胞傷害の減少、及びその後のＩＦＮ－γ／ＩＬ－１７Ａ産生好中球の浸潤の減少及び腎機能の維持によって証明されるとおり、ＩＲＩは減少する。この保護は、骨髄ＤＣ、ＮＫ及びｉＮＫＴ細胞の減少に関連しており、これらは、ＩＲＩでの潜在的に有害な役割で知られている。主要なＩＬ－３３共作用物質である循環ＩＬ－１２の増加、及びｉＮＫＴ細胞の表面ＩＬ－３３特異的受容体過剰発現は、好中球細胞浸潤のＩＬ－３３及びｉＮＫＴ細胞依存期に先行する。この知見によって、ＩＬ－３３がＩＦＮ－γとＩＬ－１７Ａの両方を誘導することによりｉＮＫＴ細胞を標的にするというインビトロの観察とともに、内因性ＩＬ－３３がｉＮＫＴ細胞動員及びサイトカイン産生を促進することにより腎臓ＩＲＩの一因となり、結果として傷害部位での好中球の浸潤及び活性化が生じることを本発明者らは提案するに至る。まとめると、発明者らの知見は、腎虚血再灌流によって誘導される自然免疫細胞の動員の一因となる新規な分子メディエーターを明らかにしており、腎移植に伴う急性腎傷害への新しい治療的洞察を提供し得る。
炎症は、白血球浸潤及び尿細管傷害を特徴とする虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）の顕著な特徴である。ただし、これらのイベントを開始させる信号はよく理解されていないままである。本研究は、組織損傷の開始因子として、またマウスの実験的腎虚血再灌流によって引き起こされる自然免疫反応の主要な増幅因子として、核内アラーミンのインターロイキン（ＩＬ）－３３を同定している。ＩＬ－３３は、主に微小血管内皮細胞によって、尿細管周囲腔及び糸球体周囲腔に腎臓全体で構成的に発現されており、ＩＲＩの際にはここから直ちに放出される。ＩＬ－３３を欠くマウス（ＩＬ－３３Ｇｔ／Ｇｔ）では、早期の尿細管細胞傷害の減少、及びその後のＩＦＮ－γ／ＩＬ－１７Ａ産生好中球の浸潤の減少及び腎機能の維持によって証明されるとおり、ＩＲＩは減少する。この保護は、骨髄ＤＣ、ＮＫ及びｉＮＫＴ細胞の減少に関連しており、これらは、ＩＲＩでの潜在的に有害な役割で知られている。主要なＩＬ－３３共作用物質である循環ＩＬ－１２の増加、及びｉＮＫＴ細胞の表面ＩＬ－３３特異的受容体過剰発現は、好中球細胞浸潤のＩＬ－３３及びｉＮＫＴ細胞依存期に先行する。この知見によって、ＩＬ－３３がＩＦＮ－γとＩＬ－１７Ａの両方を誘導することによりｉＮＫＴ細胞を標的にするというインビトロの観察とともに、内因性ＩＬ－３３がｉＮＫＴ細胞動員及びサイトカイン産生を促進することにより腎臓ＩＲＩの一因となり、結果として傷害部位での好中球の浸潤及び活性化が生じることを本発明者らは提案するに至る。まとめると、発明者らの知見は、腎虚血再灌流によって誘導される自然免疫細胞の動員の一因となる新規な分子メディエーターを明らかにしており、腎移植に伴う急性腎傷害への新しい治療的洞察を提供し得る。
【0009】
したがって、本発明の第１の目的は、治療有効量のＩＬ－３３アンタゴニストを臓器に投与することを含む、臓器における虚血再灌流傷害を予防するか、重症度を低減するか、又はリスクを低減する方法に関する。
【0010】
本明細書に使用されるとき、「虚血」という用語は、結果として臓器の損傷又は機能不全を生じる血液供給の制限のことをいう。虚血は、低酸素症（酸素の不足を表す、より一般的な用語であり、通常は呼吸している空気中の酸素の不足の結果である）というよりは、臓器への血液供給の絶対的又は相対的な不足、即ち、酸素、グルコース及び他の血液由来成分の不足である。相対的な不足とは、血液供給（酸素／燃料供給）と組織の適切な代謝のための血液要求との不一致を意味する。虚血はまた、血液を供給する血管の収縮又は閉塞によって引き起こされる、身体の一部への不十分な血流として説明され得る。これは、限定されるわけではないが、低血糖症（通常の血糖値よりも低い）；頻脈（異常に速い心臓の鼓動）；アテローム動脈硬化（動脈管腔を閉塞する脂質を含むプラーク）；低血圧（例えば、敗血症性ショック、心不全での低血圧）；血栓塞栓症（血栓）；血管の外部圧迫、例えば、圧力、血管の切断、移植臓器の植え込み、手術によるか、腫瘍によるなどの機械的に圧迫；塞栓症（循環中の異物、例えば、羊水塞栓症）；鎌状赤血球症（異常形状の赤血球）；アクロバット及び軍用飛行におけるように、血流を制限し、血液を身体の四肢に押し流す誘導重力；並びに凍傷、氷、又は不適切な低温圧迫療法によるような、局所的な極寒が原因である可能性がある。
【0011】
本明細書に使用されるとき、「再灌流」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、虚血後の組織への血流の回復のことをいう。
【0012】
したがって、「虚血再灌流」という用語は、虚血のエピソードの後に再灌流のエピソードが続くイベントを包含することが意図され、「虚血再灌流傷害」という用語は、虚血再灌流イベントによって引き起こされる組織損傷のことをいう。虚血期間の血液からの酸素及び栄養素の欠如は、循環の回復が、正常な機能の回復というよりは（又はそれとともに）酸化ストレスの誘導を通じて炎症及び酸化的損傷をもたらす状態を作り出す。
【0013】
本発明の方法は、線維症及び臓器機能不全を予防するのに特に適している。本明細書に使用されるとき、「線維症」という用語は、臓器又は組織の正常な構成要素としてではなく、修復又は反応過程としての線維組織の形成のことをいう。線維症は、任意の特定の組織における筋線維芽細胞の集積と、正常な沈着量を超えるコラーゲン沈着とを特徴とする。本明細書に使用されるとき、「臓器機能不全」という用語は、臓器の物理的構造又は機能の低下又は障害を意味しかつ含む。
【0014】
幾つかの実施態様において、本発明の方法の使用は、単離された（移植された）臓器に有効量のＩＬ－３３アンタゴニストを投与することによって臓器移植を改善することができる。したがって、幾つかの実施態様において、臓器はレシピエントに移植されることになっている。よって本方法は、単離された臓器にエクスビボで実行される。
【0015】
幾つかの実施態様において、移植された臓器は死体臓器であり、臓器が死体ドナーから得られるそれらの例では、ＩＬ－３３アンタゴニストを死体又は摘出された臓器のいずれかに投与することができる。幾つかの実施態様において、移植された臓器は生体臓器提供であり、それらの例では、ＩＬ－３３アンタゴニストを摘出された臓器に投与することができる。
【0016】
幾つかの実施態様において、臓器は単離され、有効量のＩＬ－３３アンタゴニストで灌流される。
【0017】
幾つかの実施態様において、移植臓器は、温虚血及び／又は冷虚血の対象である。
【0018】
本明細書に使用されるとき、「温虚血」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、正常温度条件下での細胞及び組織の虚血を説明するために使用される。
【0019】
本明細書に使用されるとき、「冷虚血」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、血液灌流の減少中又は血液供給がない場合の臓器冷却のことをいう。幾つかの実施態様において、有効量のＩＬ－３３アンタゴニストは、冷虚血時間に投与される。本明細書に使用されるとき、「冷虚血時間」又は「ＣＩＴ」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、回収された臓器の低温保存の開始から移植後の温循環の回復までの時間のことをいう。受け入れ外科医／施設によって、及びドナーとレシピエントの特性によって変動する。直感的には、ＣＩＴは短いほど良い。腎臓移植の場合、ＣＩＴは２４時間を下回るはずであり；膵臓移植の場合、ＣＩＴは１８時間を下回り、そして肝臓移植の場合、ＣＩＴは８時間を下回るはずである（Bernat JL, D'Alessandro AM, Port FK, Bleck TP, Heard SO, Medina J, et al. Report of a National Conference on Donation after cardiac death. Am J Transplant. 2006;6:281-91）。
【0020】
幾つかの実施態様において、本発明の方法の使用は、臓器への血液供給の停止とそれに続く再灌流を必要とする、臓器保護の外科的処置を改善することができる。虚血再灌流傷害のリスクをもたらす外科的処置の例は、肝臓切除術；血栓溶解療法、ステント留置術、又は外科的修復などによる心筋梗塞後の血行再建術；血栓溶解療法又は外科的修復などによる脳卒中後の血行再建術；あるいは、虚血傷害後の四肢の修復若しくは再接合術又は動脈瘤の外科的修復を含む、血管損傷後の血行再建術を含む。その他の例としては、腹腔鏡手術を含む上部又は下部胃腸管の手術、人工心肺装置を使用するか又は使用しない開心術、鼻咽喉手術、血管手術、神経学的（脳）手術、移植（肝臓、心臓、肺、腎臓、腸）、肝臓手術及び帝王切開がある。幾つかの実施態様において、外科的処置は、狭心症を緩和し、冠動脈疾患による死亡のリスクを低減するために行われる外科的処置である、冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）術又は心臓バイパス又は単にバイパス術としても知られる冠動脈バイパス術（Coronary Artery Bypass Surgery）である。患者の身体の他の部分からの動脈又は静脈が冠動脈に移植され、アテローム動脈硬化の狭窄部を迂回し、心筋（myocardium）（心筋（heart muscle））に供給する冠循環への血液供給を改善する。この手術は通常、心臓が停止した状態で行われるため、心肺バイパス法を使用する必要がある；拍動している心臓でのＣＡＢＧ、いわゆる「オフポンプ」術を実行するための手法が利用できる。幾つかの実施態様において、本発明の方法は、臓器への血液供給のクランプ固定を必要とする任意の外科的処置において使用することができる。特に、本発明の本方法は、２つの血管の連結、例えば、冠動脈バイパス、末梢バイパス、血液透析アクセス（瘻孔の造設）、及び遊離皮弁手術（乳房及び顔面再建術）を伴う全ての外科的処置に適用される。更に具体的には、本発明の方法は、吻合を必要とする任意の外科的処置に適用され得る。本明細書に使用されるとき「吻合」という用語は、血管のような管状構造間の外科的接続のことをいう。典型的には、有効量のＩＬ－３３アンタゴニストは、外科的処置の前、最中又は後に患者に投与され得る。特に、有効量のＩＬ－３３アンタゴニストは、臓器の再灌流中に患者に投与される。
【0021】
本発明の方法は、任意の虚血性発作又は虚血性イベントに適用され得る。虚血性イベントに特に影響を受けやすい組織は、心筋組織、血管組織及び神経組織（特に脳組織）を含む。虚血の影響を受けやすい他の組織は、腸、肝臓、腎臓及び眼からの組織を含む。外傷又は心停止の期間中の不安定狭心症のような特定の生理障害に起因して、心臓保護の必要が生じる場合がある。更に、脳卒中、一過性虚血発作又は切迫卒中（一過性黒内障（amarosis fugax））のような障害は、本発明の方法を使用する治療の候補症状である。二次性脳卒中のリスクを引き起こす脳卒中が発生した場合、又は数時間若しくは数日以内に脳卒中のリスクを引き起こす別の症状が発生した場合、本方法を適用してそのようなリスクを下げることができる。当業者は、他の虚血性組織損傷のリスクの増加に関連する状況を認識するであろう。そのような病状は、腸間膜動脈不全、腎動脈狭窄、肝静脈血栓症、末梢血管不全、多発性外傷、敗血症及び多臓器系不全を含む。他の虚血性イベントは、部分的冠動脈閉塞の血管造影の証拠、心筋損傷の心エコー検査の証拠、又は将来又は追加の虚血性イベントのリスクのその他の証拠（例えば、心筋梗塞（ＭＩ）のような心筋虚血性イベント、又は脳血管発作（ＣＶＡ）のような神経血管虚血）を含む。虚血／再灌流は、心筋以外の組織を損傷する可能性がある。提供される方法は、脳、肝臓、腸（gut）、腎臓、腸（bowel）の組織、又はその他の組織における虚血再灌流傷害の減少に役立つ可能性がある。追加の用途は、銃創、刺創に起因する腹部への貫通創から、あるいは減速外傷及び／又は自動車事故に続発する貫通創又は鈍的腹部外傷から生じるものを含む、内臓への血流の中断をもたらす鈍的又は貫通性外傷を含む。他の好ましい用途は、失血による出血性ショック、心筋梗塞若しくは心不全による心原性ショック、神経性ショック又はアナフィラキシーを含む、内臓への血流を中断させるか又は減少させるかの全身性低血圧をもたらす疾患又は処置を含む。
【0022】
幾つかの実施態様において、本発明の方法は、急性腎傷害（ＡＫＩ）後の慢性腎疾患（ＣＫＤ）への進行を防止するのに特に適している。本明細書に使用されるとき、「慢性腎疾患」（ＣＫＤ）という用語は、数ヶ月又は数年の期間にわたる腎機能の進行性の消失のことをいう。ＣＫＤは、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、腎臓に影響を与える多数の症状である、腎実質の破壊及び機能性ネフロン又は糸球体の消失を分類するために使用される。更に注目すべきは、ＣＫＤは様々な原因で発生する可能性があるが、最終的な経路は腎線維症のままである点である。「急性腎傷害」又は「急性腎不全」という用語は、典型的には体内の窒素老廃物の蓄積につながるのに十分な腎機能の急速な悪化によって特定される（例えば、Anderson and Schrier (1994), in Harrison's Principles of Internal Medicine, 13th edition, Isselbacher et al, eds., McGraw Hill Text, New Yorkを参照のこと）。少なくとも４～８mmol/L/日（１０～２０mg/dL/日）のＢＵＮの増加率、及び少なくとも４０～８０μmol/L/日（０．５～１．０mg/dL/日）の血清クレアチニンの増加率は、急性腎不全において典型的である。尿試料はまた、急性腎傷害を患っている患者の尿細管傷害残渣を含む場合がある。異化（又は異化亢進）である対象では、ＢＵＮの増加率は１００mg/dL/日を超える場合がある。ＢＵＮ又は血清クレアチニンの増加率は、連続血液検査によって決定され得、そして好ましくは、少なくとも２回の血液検査が、６時間と７２時間の間、又はより好ましくは、１２時間と２４時間の間の期間にわたって行われる。「急性」腎不全（数日間にわたる悪化）と「急速に進行する」腎不全（数週間にわたる悪化）とは区別されることがある。しかしながら、本明細書に使用されるとき、「急性腎傷害」という語句は、両方の症候群を包含することが意図されている。上記のとおり、急性腎傷害は臨床医によって定期的に特定されている。ＡＫＩは、血管収縮疾患（例えば、悪性高血圧症、強皮症、溶血性尿毒症症候群、血栓性血小板減少性紫斑病）及び血管炎（例えば、結節性多発動脈炎、過敏性血管炎、血清病、ウェゲナー肉芽腫症、巨細胞性動脈炎、混合性クリオグロブリン血症、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、全身性エリテマトーデス）のような血管系の異常に起因する場合がある。ＡＫＩはまた、感染後の異常（例えば、連鎖球菌、肺炎球菌、淋菌、ブドウ球菌、腸球菌、ウイルス［例えば、Ｂ型及びＣ型肝炎、おたふく風邪、麻疹、エプスタイン・バー］、マラリアの感染後、又はブルセラ症、レジオネラ、リステリア、シャント腎炎、ハンセン病、レプトスピラ症、若しくは内臓膿瘍に関連する）及び非感染性の異常（例えば、急速に進行する糸球体腎炎、膜増殖性糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、全身性エリテマトーデス、ウェゲナー肉芽腫症）のような糸球体の異常に起因する場合もある。幾つかの実施態様において、ＡＫＩは、薬物関連の原因（例えば、ペニシリン、スルホンアミド、カルベニシリン、セファロスポリン、エリスロマイシン、ナフシリン、オキサシリン、非ステロイド性抗炎症剤、利尿薬（フロセミド、エタクリン酸、チアジド、スピロノラクトン、水銀剤）、フェニトイン、フェノバルビタール、プロベネシド、アロプリノール、シメチジン）、感染に関連する原因（例えば、急性腎盂腎炎、連鎖球菌、ブドウ球菌、レプトスピラ症、マラリア、サルモネラ症）、乳頭壊死（例えば、糖尿病、鎌状赤血球症、鎮痛剤乱用、アルコール依存症に関連）、及び他の雑多な原因（例えば、サルコイドーシス、白血病、リンパ腫）に起因する急性間質性腎炎に起因する場合がある。幾つかの実施態様において、ＡＫＩは、結晶沈着（例えば、尿酸、シュウ酸塩、メトトレキサート）又は多発性骨髄腫及び軽鎖疾患による尿細管内閉塞に起因する場合がある。幾つかの実施態様において、ＡＫＩは、腎毒素（例えば、アミノグリコシド、テトラサイクリン、アンホテリシン、ポリミキシン、セファロスポリンのような抗菌剤）、重金属（例えば、水銀、鉛、ヒ素、金塩、バリウム）、及び他の雑多な化学物質（例えば、シスプラチン、ドキソルビシン、ストレプトゾシン、メトキシフルラン、ハロタン、エチレングリコール、四塩化炭素）、又は虚血（例えば、出血、低血圧、敗血症、火傷、腎梗塞、腎動脈解離、横紋筋融解症、外傷）、又は他の雑多な原因（例えば、造影剤、輸血反応、ミオグロビン血症、熱中症、ヘビ及びクモの咬傷）に起因する急性尿細管壊死に起因する場合がある。
【0023】
本明細書に使用されるとき、「ＩＬ－３３」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＮＣＢＩアクセッション番号NP_254274.1（ヒトアイソフォーム１）、NP_001186569.1（ヒトアイソフォーム２）、又はNP_001186570.1（ヒトアイソフォーム３）に明記されるアミノ酸配列を有するヒトＩＬ－３３タンパク質のことをいう。本明細書のタンパク質、ポリペプチド及びタンパク質断片への全ての言及は、非ヒト種（例えば、「マウスＩＬ－３３」、「サルＩＬ－３３」など）に由来するものとして明示的に指定されていない限り、それぞれのタンパク質、ポリペプチド又はタンパク質断片のヒト版を指すことが意図されている。
【0024】
本明細書に使用されるとき、「ＳＴ２」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＮＣＢＩアクセッション番号NP_057316.3に明記されるアミノ酸配列を有するＩＬ－３３の受容体のことをいう。
【0025】
本明細書に使用されるとき、「ＩＬ－３３アンタゴニスト」という用語は、ＩＬ－３３の活性又は発現を阻害する化合物のことをいう。特に、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＩＬ－３３又はその受容体（ＳＴ２）に結合し、ＩＬ－３３シグナル伝達及び／又はＩＬ－３３と細胞表面受容体（即ち、ＳＴ２）の間の相互作用を遮断、減衰又はそうではなく妨害することができる任意の化合物のことをいう。典型的には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、有機低分子、ポリペプチド、アプタマー、抗体、イントラアンチボディ、オリゴヌクレオチド又はリボザイムである。
【0026】
幾つかの実施態様において、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＩＬ－３３に対して結合親和性を有する抗体である。幾つかの実施態様において、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＳＴ２の細胞外ドメインに対する抗体である。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、ＳＴ２へのＩＬ－３３の結合を阻害することができる。幾つかの実施態様において、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＳＴ２に結合するＩＬ－３３の領域に対して結合親和性を有する抗体である。幾つかの実施態様において、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＩＬ－３３に結合するＳＴ２のドメインに対して結合親和性を有する抗体である。
【0027】
よって本明細書に使用されるとき、「抗体」という用語は、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子を指すために使用され、そしてこの用語は、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、ＴａｎｄＡｂダイマー、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、Ｆｄ、直鎖状抗体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片、バイボディ、トリボディ（ｓｃＦｖ－Ｆａｂ融合物、それぞれ二重特異性又は三重特異性）；ｓｃ－ダイアボディ；カッパ（ラムダ）ボディ（ｓｃＦｖ－ＣＬ融合物）；ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（Bispecific T-cell Engager）、ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖタンデムでＴ細胞を誘引する）；ＤＶＤ－Ｉｇ（二重可変ドメイン抗体、二重特異性フォーマット）；ＳＩＰ（小免疫タンパク質（small immunoprotein）、一種のミニボディ）；ＳＭＩＰ（「小モジュラー免疫薬（small modular immunopharmaceutical）」ｓｃＦｖ－Ｆｃダイマー）；ＤＡＲＴ（ｄｓ安定化ダイアボディ「二重親和性再標的化試薬（Dual Affinity ReTargeting）」）；１つ以上のＣＤＲを含む小抗体模倣物などのような抗原結合ドメインを含む抗体断片を含む。種々の抗体ベースのコンストラクト及び断片を調製及び使用するための手法は、当技術分野において周知である（Kabat et al., 1991を参照のこと、引用によって本明細書に具体的に取り込まれる）。ダイアボディは、特に、EP 404,097及びWO 93/11161に更に記載されている；一方、直鎖状抗体は、Zapata et al. (1995)に更に記載されている。従来の手法を用いて抗体を断片化できる。例えば、抗体をペプシンで処理することによってＦ（ａｂ’）２断片を作り出すことができる。得られるＦ（ａｂ’）２断片を、ジスルフィド架橋を還元することで処理しＦａｂ’断片を生成することができる。パパイン消化により、Ｆａｂ断片が形成され得る。Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ＴａｎｄＡｂ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、ダイマー、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片及び他の断片も組換え技術によって合成することができるか、又は化学的に合成することができる。抗体断片を製造するための技術は当技術分野において周知であり報告されている。例えば、Beckman et al., 2006; Holliger & Hudson, 2005; Le Gall et al., 2004; Reff & Heard, 2001; Reiter et al., 1996; 及びYoung et al., 1995のそれぞれは、有効な抗体断片の製造を更に説明して可能にしている。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、一本鎖抗体である。本明細書に使用されるとき、「単一ドメイン抗体」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、天然に軽鎖を欠くラクダ科の哺乳動物に見られるタイプの抗体の単一重鎖可変ドメインのことをいう。このような単一ドメイン抗体はまた、「ナノボディ（登録商標）」である。（単一）ドメイン抗体の一般的な説明については、上で引用された先行技術、更にはEP 0 368 684、Ward et al. (Nature 1989 Oct 12; 341 (6242): 544-6)、Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490; 及びWO 06/030220、WO 06/003388も参照される。
【0028】
幾つかの実施態様において、抗体はヒト化抗体である。本明細書に使用されるとき、「ヒト化」とは、ＣＤＲ領域外の幾つか、ほとんど又は全てのアミノ酸が、ヒト免疫グロブリン分子に由来する対応するアミノ酸で置き換えられている抗体を表す。ヒト化の方法は、米国特許第4,816,567号、5,225,539号、5,585,089号、5,693,761号、5,693,762号及び5,859,205号に記載されているものを含むが、これらに限定されず、そしてこれらは、引用によって本明細書に取り込まれる。
【0029】
幾つかの実施態様において、抗体は完全ヒト抗体である。完全ヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座の大部分の遺伝子導入マウスを免疫することによって調製され得る。例えば、米国特許第5,591,669号、5,598,369号、5,545,806号、5,545,807号、6,150,584号、及びそれらに引用された参考文献を参照のこと（これらの内容は引用によって本明細書に取り込まれる）。
【0030】
幾つかの実施態様において、本発明の抗体は一本鎖抗体である。本明細書に使用されるとき、「単一ドメイン抗体」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、天然に軽鎖を欠くラクダ科の哺乳動物に見られるタイプの抗体の単一重鎖可変ドメインのことをいう。このような単一ドメイン抗体はまた、「ナノボディ（登録商標）」である。
【0031】
幾つかの実施態様において、抗体は、ヒト重鎖定常領域配列を含むが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導しない。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、ＦｃｇＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）ポリペプチドに実質的に結合することができるＦｃドメインを含まない。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、Ｆｃドメインを欠く（例えば、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを欠く）か、又はＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４アイソタイプのＦｃドメインを含む。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ、一本鎖抗体断片、又は複数の異なる抗体断片を含む多重特異性抗体からなるか、又はこれらを含む。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、毒性部分に連結されていない。幾つかの実施態様において、アミノ酸残基から選択される１つ以上のアミノ酸は、抗体がＣ２ｑ結合を変化させるか、及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を減少若しくは消失させるように、異なるアミノ酸残基で置き換えられ得る。このアプローチは、ldusogieらによる米国特許第6,194,551号に更に詳細に記載されている。
【0032】
幾つかの実施態様において、ＩＬ－３３アンタゴニストは、ＳＴ２の機能的同等物を含むポリペプチドである。本明細書に使用されるとき、「ＳＴ２の機能的同等物」は、ＩＬ－３３に結合することができ、それによりＳＴ２とのＩＬ－３３の相互作用を妨げることができるポリペプチドである。「機能的同等物」という用語は、ＳＴ２の断片、変異体、及び突然変異タンパク質を含む。よって「機能的に同等」という用語は、タンパク質類似体がＳＴ２に結合する能力を保持するように、例えば、１つ以上のアミノ酸の欠失、置換又は付加によって、アミノ酸配列を変更することにより得られるＳＴ２の任意の同等物を含む。アミノ酸置換は、例えば、アミノ酸配列をコードするＤＮＡの点突然変異によって行われ得る。機能的同等物は、ＩＬ－３３に結合し、そしてＩＬ－３３を捕捉することができる可溶性受容体を形成するようにＳＴ２の細胞外ドメインの全部又は一部を含む分子を含む。よって機能的同等物には、ＳＴ２の可溶型が含まれる。これらのタンパク質の適切な可溶型、又はその機能的同等物は、例えば、膜貫通ドメインが化学的、タンパク質分解的又は組換え方法により除去されたタンパク質の切断型を含み得る。典型的には、機能的同等物は、対応するタンパク質と少なくとも８０％相同である。幾つかの実施態様において、機能的同等物は、任意の従来の分析アルゴリズムによって評価されるとき、少なくとも９０％相同である。本明細書に使用されるとき「機能的に同等の断片」という用語はまた、ＩＬ－３３に結合するＳＴ２の任意の断片又は断片の集合体を意味し得る。したがって本発明は、ＩＬ－３３へのＳＴ２の結合を阻害することができるポリペプチドを提供するが、このポリペプチドは、ＳＴ２の細胞外ドメインの少なくとも一部の配列に対応する配列を有する連続したアミノ酸を含み、その部分はＩＬ－３３に結合する。幾つかの実施態様において、ポリペプチドは、ＳＴ２の細胞外ドメインを含む。
【0033】
幾つかの実施態様において、ポリペプチドは、免疫グロブリン定常ドメイン（Ｆｃ領域）に融合されてイムノアドヘシンを形成するＳＴ２の機能的同等物を含む。イムノアドヘシンは、ヒト抗体の有用な化学的及び生物学的特性の多くを備え得る。イムノアドヘシンは、適切なヒト免疫グロブリンヒンジ及び定常ドメイン（Ｆｃ）配列に連結された所望の特異性を持つヒトタンパク質配列から作成できるため、全体にヒト成分を使用して目的の結合特異性を達成できる。免疫グロブリン配列は、典型的には、免疫グロブリン定常ドメインであるが、必ずしもそうではない。本発明のキメラの免疫グロブリン部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭから得ることができるが、典型的にはＩｇＧ１又はＩｇＧ３である。幾つかの実施態様において、ＰＤ－１又はＩＬ－３３の機能的同等物及びイムノアドヘシンの免疫グロブリン配列部分は、最小のリンカーによって連結される。本明細書に使用されるとき、「リンカー」という用語は、本発明のポリペプチドと免疫グロブリン配列部分とを連結する少なくとも１個のアミノ酸の配列のことをいう。そのようなリンカーは、立体障害を防止するのに役立つ可能性がある。幾つかの実施態様において、リンカーは、４個；５個；６個；７個；８個；９個；１０個；１１個；１２個；１３個；１４個；１５個；１６個；１７個；１８個；１９個；２０個；２１個；２２個；２３個；２４個；２５個；２６個；２７個；２８個；２９個；３０個のアミノ酸残基を有する。リンカー配列の１つの有用な群は、WO 96/34103及びWO 94/04678に記載されている重鎖抗体のヒンジ領域に由来するリンカーである。他の例は、ポリアラニンリンカー配列である。
【0034】
幾つかの実施態様において、ＩＬ－３３アンタゴニストは、それぞれＩＬ－３３又はＳＴ２発現のインヒビターである。「発現のインヒビター」とは、遺伝子の発現を阻害する生物学的効果を有する天然又は合成の化合物のことをいう。本発明の好ましい実施態様において、遺伝子発現の前記インヒビターは、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はリボザイムである。例えば、アンチセンスＲＮＡ分子及びアンチセンスＤＮＡ分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＩＬ－３３又はＳＴ２ ｍＲＮＡに結合することによってこれらのｍＲＮＡの翻訳を直接遮断してタンパク質翻訳を妨げるか、あるいはｍＲＮＡの分解を増加させて細胞におけるＩＬ－３３又はＳＴ２のレベル、ひいては活性を減少させるように作用するだろう。例えば、少なくとも約１５塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ＩＬ－３３又はＳＴ２をコードするｍＲＮＡ転写物配列の独特の領域に相補的であるものは、例えば、従来のホスホジエステル法により合成することができる。配列が既知である遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するためのアンチセンス技術を使用する方法は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第6,566,135号、6,566,131号、6,365,354号、6,410,323号、6,107,091号、6,046,321号、及び5,981,732号を参照のこと）。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もまた、本発明における使用のための発現のインヒビターとして機能することができる。ＩＬ－３３又はＳＴ２遺伝子発現が特異的に阻害されるように、患者又は細胞を低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）と、又は低分子二本鎖ＲＮＡの産生を引き起こすベクター若しくはコンストラクトと接触させることにより、ＩＬ－３３又はＳＴ２遺伝子発現を減少させることができる（即ち、ＲＮＡ干渉又はＲＮＡｉ）。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びリボザイムは、インビボで単独で、又はベクターと共同して送達され得る。その最も広い意味で、「ベクター」は、細胞、そして典型的にはＩＬ－３３又はＳＴ２を発現する細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はリボザイム核酸の移行を促進することができる任意のビヒクルである。典型的には、ベクターは核酸を細胞に輸送するが、ベクターが存在しない場合の分解の程度と比較して分解は低減されている。一般に、本発明において有用なベクターは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はリボザイム核酸配列の挿入又は組み込みによって操作された、プラスミド、ファージミド、ウイルス、他のビヒクル（ウイルス又は細菌源に由来する）を含むが、これらに限定されない。ウイルスベクターは好ましいタイプのベクターであり、以下のウイルスからの核酸配列を含むが、これらに限定されない：レトロウイルス（モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、及びラウス肉腫ウイルスなど）；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０タイプのウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタインバーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；及びレトロウイルスなどのＲＮＡウイルス。命名されていないが当技術分野で知られている他のベクターも容易に使用することができる。幾つかの実施態様において、発現のインヒビターはエンドヌクレアーゼである。「エンドヌクレアーゼ」という用語は、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する酵素のことをいう。デオキシリボヌクレアーゼＩなどの幾つかの酵素は、比較的非特異的に（配列に関係なく）ＤＮＡを切断するが、多くは、典型的には制限エンドヌクレアーゼ又は制限酵素と呼ばれ、非常に特異的なヌクレオチド配列でのみ切断する。エンドヌクレアーゼに基づくゲノム不活性化の背後にある機序は、通常、ＤＮＡ一本鎖又は二本鎖切断の最初の段階を必要とするが、これにより、ＤＮＡ修復のための２つの異なる細胞機序を始動させることができ、そしてこれは、ＤＮＡ不活化に利用できる：誤りがちな非相同末端結合（non-homologous end joining）（ＮＨＥＪ）及び高忠実度の相同組換え修復（ＨＤＲ）。特定の実施態様において、エンドヌクレアーゼはCRISPR-casである。本明細書に使用されるとき、「CRISPR-cas」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、そして塩基配列の短い反復を含む原核生物ＤＮＡのセグメントである、関連するクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）のことをいう。幾つかの実施態様において、エンドヌクレアーゼは、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）に由来するCRISPR-cas9である。CRISPR/Cas9システムは、US 8697359 B1及びUS 2014/0068797に記載されている。幾つかの実施態様において、エンドヌクレアーゼは、Zetscheら（“Cpf1 is a Single RNA-guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System (2015); Cell; 163, 1-13）における更に最近になって特性決定されたプレボテラ属とフランシセラ属１由来のCRISPR（CRISPR from Provotella and Francisella 1）（Cpf1）であるCRISPR-Cpf1である。
【0035】
本明細書に使用されるとき、「有効量」という用語は、所望の治療結果（即ち、虚血再灌流傷害の予防）を達成するために必要な用量及び期間でのＩＬ－３３アンタゴニストの有効量のことをいう。ＩＬ－３３アンタゴニストの治療有効量は、個体の病状、年齢、性別、及び体重、並びに個体において所望の応答を誘導するＩＬ－３３アンタゴニストの能力などの要因によって変化し得る。治療有効量はまた、治療上有益な効果が抗体又は抗体部分の任意の毒性又は有害な効果を上回る量でもある。ＩＬ－３３アンタゴニストの効率的な投薬量及び投薬計画は、処置されるべき疾患又は症状に依存し、そして当業者により決定され得る。当技術分野において通常の技能を有する医師は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定及び処方することができよう。例えば、医師は、医薬組成物に使用されるＩＬ－３３アンタゴニストの用量を、所望の治療効果を達成するのに必要なレベルよりも低いレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることができる。一般に、本発明の組成物の適切な用量は、特定の投薬計画により治療効果を生み出すのに有効な最低用量である、化合物の量であろう。そのような有効量は一般に上記の要因に依存するであろう。
【0036】
典型的には、本発明のＩＬ－３３アンタゴニストは、注入、ポンプ装置及び／又は任意の機械（例えば、バイパス機械）を使用して、対象又は単離された臓器に直接投与される。
【0037】
典型的には、ＩＬ－３３アンタゴニストは、薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物の形態で患者に投与される。これらの組成物に使用され得る薬学的に許容し得る担体は、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩のような緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩又は電解質（硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩など）、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ロウ、ポリエチレン－ポリオキシプロピレン－ブロックポリマー、ポリエチレングリコール及び羊毛脂を含むが、これらに限定されない。患者への投与における使用のために、組成物は患者への投与のために処方される。本発明の組成物は、経口、非経口、吸入スプレーにより、局所、直腸内、鼻内、口腔内、膣内、又は移植リザーバーを介して投与され得る。本明細書で使用されるものは、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、くも膜下、肝内、病巣内及び頭蓋内注射又は注入手法を含む。本発明の組成物の無菌注射剤形は、水性又は油性の懸濁液であってよい。これらの懸濁液は、適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を使用して、当技術分野で公知の手法によって処方され得る。無菌注射剤形はまた、例えば、１，３－ブタンジオール中の溶液として、非毒性の非経口的に許容し得る希釈剤又は溶媒中の無菌の注射可能な溶液又は懸濁液であってよい。使用可能な許容し得るビヒクル及び溶媒には、水、リンゲル液及び等張塩化ナトリウム溶液がある。更に、無菌の不揮発性油は、溶媒又は懸濁媒体として従来から使用されている。この目的のために、合成モノグリセリド又はジグリセリドを含む任意の無刺激性の不揮発性油が使用され得る。オレイン酸及びそのグリセリド誘導体のような脂肪酸は、特にポリオキシエチル化バージョンのオリーブ油又はヒマシ油のような薬学的に許容し得る天然油と同様に、注射剤の調製に有用である。これらの油性溶液又は懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈剤又は分散剤、例えば、乳剤及び懸濁液を含む薬学的に許容し得る剤形の製剤に一般的に使用されるカルボキシメチルセルロース又は類似の分散剤を含んでもよい。薬学的に許容し得る固体、液体、又は他の剤形の製造に一般的に使用される、Tween、Span及び他の乳化剤若しくは生物学的利用能増強剤のような、他の一般に使用される界面活性剤も、製剤目的で使用され得る。本発明の組成物は、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤又は液剤を含むがこれらに限定されない任意の経口投与可能な剤形で経口投与され得る。経口使用のための錠剤の場合、一般的に使用される担体は、乳糖及びコーンスターチを含む。ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤も典型的には添加される。カプセル剤形での経口投与に、有用な希釈剤は、例えば、乳糖を含む。水性懸濁剤が経口使用に必要な場合、ＩＬ－３３アンタゴニストは乳化剤及び懸濁剤と合わせられる。必要に応じて、特定の甘味剤、香味剤、又は着色剤も添加され得る。あるいは、本発明の組成物は、直腸内投与のための坐剤の剤形で投与され得る。これらは、室温で固体であるが直腸温度で液体であり、したがって直腸内で融解して薬物を放出する、適切な非刺激性賦形剤と薬剤を混合することによって調製することができる。そのような材料は、カカオバター、蜜蝋、及びポリエチレングリコールを含む。本発明の組成物はまた、特に処置の標的が、眼、皮膚、又は下部腸管の疾患を含む、局所適用により容易に到達可能な領域又は臓器を含む場合、局所投与され得る。適切な局所製剤は、これらの領域又は臓器のそれぞれに対して容易に調製される。局所適用のために、組成物は、１種以上の担体に懸濁又は溶解された活性成分を含む適切な軟膏剤に処方されてもよい。本発明の化合物の局所投与のための担体は、鉱油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ロウ及び水を含むが、これらに限定されない。あるいは、本組成物は、１種以上の薬学的に許容し得る担体に懸濁又は溶解された活性成分を含む適切なローション剤又はクリーム剤に処方され得る。適切な担体は、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２－オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水を含むが、これらに限定されない。下部腸管への局所適用は、直腸坐剤製剤（上記参照）又は適切な浣腸製剤で行うことができる。貼付剤も使用できる。本発明の組成物はまた、鼻内エアゾール又は吸入により投与されてもよい。そのような組成物は、医薬製剤の技術分野で周知の手法により調製され、ベンジルアルコール又は他の適切な保存料、生物学的利用能を高めるための吸収促進剤、フルオロカーボン、及び／又は他の従来の可溶化剤若しくは分散剤を使用して、生理食塩水中の溶液として調製され得る。
【0038】
幾つかの実施態様において、移植に適した単離された臓器は、有効量のＩＬ－３３アンタゴニストを含む保存溶液で灌流される。本明細書に使用されるとき、「保存溶液」又は「臓器保存液」という用語は、塩、好ましくは塩化物、硫酸塩、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びカリウム；糖、好ましくはマンニトール、ラフィノース、ショ糖、グルコース、フルクトース、ラクトビオン酸塩（耐水性である）、又はグルコン酸塩；抗酸化剤、例えば、グルタチオン；活性剤、例えば、アロプリノールなどのキサンチンオキシダーゼインヒビター、乳酸塩、ヒスチジン、グルタミン酸（又はグルタミン酸塩）、トリプトファンなどのアミノ酸；及び場合により、ヒドロキシエチルデンプン、ポリエチレングリコール又はデキストランなどのコロイドを含む、ｐＨ６．５～７．５を有する水溶液のことをいう。本発明の幾つかの実施態様において、臓器保存液は、以下から選択される：
－浸透圧 ３２０mOsmol/kg及びｐＨ７．４を有するUniversity of Wisconsinの溶液（UW又はViaSpan（登録商標））で、水中に１リットルでは以下の処方の溶液：ラクトビオン酸カリウム：１００mM、ＫＯＨ：１００mM、ＮａＯＨ：２７mM、ＫＨ２ＰＯ４：２５mM、ＭｇＳＯ４：５mM、ラフィノース：３０mM、アデノシン：５mM、グルタチオン：３mM、アロプリノール：１mM、ヒドロキシエチルデンプン：５０g/L、
－浸透圧 ３２０mOsm/kg及びｐＨ７．４を有するIGL-1（登録商標）で、水中に１リットルあたり以下の処方の溶液：ＮａＣＬ：１２５mM、ＫＨ２ＰＯ４：２５mM、ＭｇＳＯ４：５mM、ラフィノース：３０mM、ラクトビオン酸カリウム：１００mM、グルタチオン：３mM、アロプリノール：１mM、アデノシン：５mM、ポリエチレングリコール（分子量：３５kDa）：１g/L、
－浸透圧 ３２０mOsm/kg及びｐＨ７．３を有するCelsior（登録商標）で、水中に１リットルあたり以下の処方の溶液：グルタチオン：３mM、マンニトール：６０mM、ラクトビオン酸：８０mM、グルタミン酸：２０mM、ＮａＯＨ：１００mM、塩化カルシウム二水和物：０．２５mM、ＭｇＳＯ４：１．２mM、ＫＣｌ：１５mM、塩化マグネシウム六水和物：１３mM、ヒスチジン３０mM、
－BMPS Belzer（登録商標）又はBelzer機灌流溶液又はKPS1、特に１００mEq/L ナトリウム、２５mEq/L カリウムを含み、周囲温度でｐＨ７．４、浸透圧 ３００mOsm/Lを有する溶液、
－室温でｐＨ７．２０、及び浸透圧 ３１０mOsm/kgを有する、水中に１リットルあたり以下の処方を有するCustodiol（登録商標）HTK溶液：ＮａＣｌ：１８．０mM、ＫＣｌ：１５．０mM、ＫＨ２ＰＯ４：９mM、２－ケトグルタル酸水素カリウム：１．０mM、塩化マグネシウム六水和物：４．０mM；ヒスチジン、ＨＣｌ、Ｈ２Ｏ：１８．０mM、ヒスチジン：１９８．０mM、トリプトファン：２．０mM、マンニトール：３０．０mM、塩化カルシウム二水和物：０．０１５mM、
－浸透圧 ４８６mOsm/kg及びｐＨ７．１を有するSoltran（登録商標）で、水中に１リットルあたり以下の処方を有する溶液：ナトリウム：８４mM、カリウム：８０mM、マグネシウム：４１mM、硫酸塩：４１mM、マンニトール３３．８g/l、クエン酸塩：５４mM、グルコース：１９４mM、
－浸透圧 ２９５mOsmol/L及び水中に以下の処方を有するPerfadex（登録商標）：５０g/L デキストラン４０（分子量：４０，０００）、Ｎａ＋ １３８mM、Ｋ＋６mM、Ｍｇ２＋：０．８mM、Ｃｌ－１４２mM、ＳＯ４２－ ０．８mM、（＋Ｈ２ＰＯ４－、ＨＰＯ４２－）：０．８mM、グルコース ５mM、
－周囲温度でｐＨ６．０～７．５であり、浸透圧 ２７６．８mOsmol/Lを有する乳酸リンゲル液（登録商標）で、水中に以下の処方の溶液：：Ｎａ＋ １３０mM、Ｋ＋ ５．４mM、Ｃａ２＋：１．８mM、Ｃｌ－：１１１mM、乳酸：２７．７mM、
－水中に以下の処方のPlegisol（登録商標）：ＫＣｌ：１．１９３g/l、ＭｇＣｌ２、Ｈ２Ｏ：３．２５３g/L、ＮａＣｌ：６．４３g/L、ＣａＣｌ２：０．１７６g/l、
－周囲温度でｐＨ７．４であり、浸透圧 ３２０mOsmol/Lを有するSolution Hospital Edouard Henriotで、水中に以下の処方の溶液：ＫＯＨ：２５mM、ＮａＯＨ：１２５mM、ＫＨ２ＰＯ４：２５mM、ＭｇＣｌ２：５mM、ＭｇＳＯ４：５mM、ラフィノース：３０mM、ラクトビオン酸：１００mM、グルタチオン：３mM、アロプリノール：１mM、アデノシン：５mM、ヒドロキシエチルデンプン ５０g/L、並びに
－ヒト血清アルブミン、デキストラン、及び低濃度のカリウムを含む細胞外電解質を含むSteen（登録商標）溶液。
－浸透圧 ３２０mOsmol/kg及びｐＨ７．４を有するUniversity of Wisconsinの溶液（UW又はViaSpan（登録商標））で、水中に１リットルでは以下の処方の溶液：ラクトビオン酸カリウム：１００mM、ＫＯＨ：１００mM、ＮａＯＨ：２７mM、ＫＨ２ＰＯ４：２５mM、ＭｇＳＯ４：５mM、ラフィノース：３０mM、アデノシン：５mM、グルタチオン：３mM、アロプリノール：１mM、ヒドロキシエチルデンプン：５０g/L、
－浸透圧 ３２０mOsm/kg及びｐＨ７．４を有するIGL-1（登録商標）で、水中に１リットルあたり以下の処方の溶液：ＮａＣＬ：１２５mM、ＫＨ２ＰＯ４：２５mM、ＭｇＳＯ４：５mM、ラフィノース：３０mM、ラクトビオン酸カリウム：１００mM、グルタチオン：３mM、アロプリノール：１mM、アデノシン：５mM、ポリエチレングリコール（分子量：３５kDa）：１g/L、
－浸透圧 ３２０mOsm/kg及びｐＨ７．３を有するCelsior（登録商標）で、水中に１リットルあたり以下の処方の溶液：グルタチオン：３mM、マンニトール：６０mM、ラクトビオン酸：８０mM、グルタミン酸：２０mM、ＮａＯＨ：１００mM、塩化カルシウム二水和物：０．２５mM、ＭｇＳＯ４：１．２mM、ＫＣｌ：１５mM、塩化マグネシウム六水和物：１３mM、ヒスチジン３０mM、
－BMPS Belzer（登録商標）又はBelzer機灌流溶液又はKPS1、特に１００mEq/L ナトリウム、２５mEq/L カリウムを含み、周囲温度でｐＨ７．４、浸透圧 ３００mOsm/Lを有する溶液、
－室温でｐＨ７．２０、及び浸透圧 ３１０mOsm/kgを有する、水中に１リットルあたり以下の処方を有するCustodiol（登録商標）HTK溶液：ＮａＣｌ：１８．０mM、ＫＣｌ：１５．０mM、ＫＨ２ＰＯ４：９mM、２－ケトグルタル酸水素カリウム：１．０mM、塩化マグネシウム六水和物：４．０mM；ヒスチジン、ＨＣｌ、Ｈ２Ｏ：１８．０mM、ヒスチジン：１９８．０mM、トリプトファン：２．０mM、マンニトール：３０．０mM、塩化カルシウム二水和物：０．０１５mM、
－浸透圧 ４８６mOsm/kg及びｐＨ７．１を有するSoltran（登録商標）で、水中に１リットルあたり以下の処方を有する溶液：ナトリウム：８４mM、カリウム：８０mM、マグネシウム：４１mM、硫酸塩：４１mM、マンニトール３３．８g/l、クエン酸塩：５４mM、グルコース：１９４mM、
－浸透圧 ２９５mOsmol/L及び水中に以下の処方を有するPerfadex（登録商標）：５０g/L デキストラン４０（分子量：４０，０００）、Ｎａ＋ １３８mM、Ｋ＋６mM、Ｍｇ２＋：０．８mM、Ｃｌ－１４２mM、ＳＯ４２－ ０．８mM、（＋Ｈ２ＰＯ４－、ＨＰＯ４２－）：０．８mM、グルコース ５mM、
－周囲温度でｐＨ６．０～７．５であり、浸透圧 ２７６．８mOsmol/Lを有する乳酸リンゲル液（登録商標）で、水中に以下の処方の溶液：：Ｎａ＋ １３０mM、Ｋ＋ ５．４mM、Ｃａ２＋：１．８mM、Ｃｌ－：１１１mM、乳酸：２７．７mM、
－水中に以下の処方のPlegisol（登録商標）：ＫＣｌ：１．１９３g/l、ＭｇＣｌ２、Ｈ２Ｏ：３．２５３g/L、ＮａＣｌ：６．４３g/L、ＣａＣｌ２：０．１７６g/l、
－周囲温度でｐＨ７．４であり、浸透圧 ３２０mOsmol/Lを有するSolution Hospital Edouard Henriotで、水中に以下の処方の溶液：ＫＯＨ：２５mM、ＮａＯＨ：１２５mM、ＫＨ２ＰＯ４：２５mM、ＭｇＣｌ２：５mM、ＭｇＳＯ４：５mM、ラフィノース：３０mM、ラクトビオン酸：１００mM、グルタチオン：３mM、アロプリノール：１mM、アデノシン：５mM、ヒドロキシエチルデンプン ５０g/L、並びに
－ヒト血清アルブミン、デキストラン、及び低濃度のカリウムを含む細胞外電解質を含むSteen（登録商標）溶液。
【0039】
これらの臓器保存液はすべて市販品である。典型的には、臓器を保存するためのデバイスであって、前記デバイスは、保存溶液を充填した臓器容器を含み、１種以上の化合物（例えば、ＩＬ－３３アンタゴニスト）を臓器容器に注入するための１つ以上の手段を更に含むことを特徴とする、デバイスが使用される。
【0040】
本発明の更なる目的は、臓器を保存するためのデバイスであって、前記デバイスは、保存溶液を充填した臓器容器を含み、ＩＬ－３３アンタゴニストを臓器容器に注入するための１つ以上の手段を更に含むことを特徴とする、デバイスに関する。幾つかの実施態様において、本発明のデバイスは、注入手段によるＩＬ－３３アンタゴニストの投与時間の通知を医療従事者に与えるアラームを含む。幾つかの実施態様において、本発明のデバイスは、必要なときに／プログラムされたときに、注入手段によりＩＬ－３３アンタゴニストを自動投与するためにプログラム可能である。幾つかの実施態様において、本発明のデバイスは、臓器容器、コンピューティングシステム、及び本発明のＩＬ－３３アンタゴニストを注入するための手段を含む。臓器容器は、臓器用の無菌の入れ物（receptacle）である。臓器容器には保存溶液を充填する。コンピューティングシステム、又は同様の電子計算デバイスは、コンピューティングシステムのレジスタ及び／又はメモリ内の電子などの物理量として表されるデータを、コンピューティングシステムのメモリ、レジスタ、又は他のそのような情報ストレージ、通信装置若しくは表示デバイス内の物理量として同様に表される他のデータへと操作及び／又は変換するように構成される。コンピューティングシステムは、データ提示及びデータ入力のためのディスプレイユニットを含む。ＩＬ－３３アンタゴニストを注入するための手段は、アンタゴニストを含有する容器、及び臓器チャンバーへの化合物の注入を可能にするデバイスを含む。例えば、手段はシリンジである。幾つかの実施態様において、デバイスはソフトウェアを含む。ソフトウェアは、本発明の方法の実現を可能にし、注入されるＩＬ－３３アンタゴニストの注入時間の調整の役割を果たす。幾つかの実施態様において、臓器容器は、流体及び圧力に対して密封されている。幾つかの実施態様において、本発明のデバイスは、以下を更に含む：１種又は数種の循環システム、１種又は数種の冷却手段、１種又は数種の酸素供給器、１種又は数種のポンプ、１種又は数種のフィルター、１種又は数種のプローブ又はセンサー（例えば、温度、圧力又は任意の化合物濃度を検出する）、及び／又は１種又は数種のソフトウェア。
【0041】
本発明は、以下の図面及び実施例により更に説明される。しかしながら、これらの実施例及び図面は、決して本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【0042】
【図1A】ＩＬ－３３欠損マウスはＩＲＩから保護されている。野生型（ＷＴ）及びＩＬ－３３Ｇｔ／Ｇｔ（ＩＬ－３３欠損）マウスを、偽手術（Ｓｈａｍ）に付したか、又は対側腎摘出術（Ｃｔｒ）後に３２分の片側虚血（ＩＲＩ）に付した。２４時間（Ｔ２４）の再灌流後、腎臓及び末梢血が得られた（１群あたり５～８匹）。（Ａ－Ｃ）急性腎傷害の変化は、ＩＬ－３３欠損マウスでは軽減されている。ＩＬ－３３欠損マウスは、血中クレアチニン（Ａ）及び尿素窒素（ＢＵＮ）（Ｂ）レベルの低下を示した。（Ｃ）尿細管傷害スコア（１群あたり５～８匹のマウス）。二群比較には両側マンホイットニーＵ検定を使用し、三群以上の比較には一元配置分散分析に続くTukey事後検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｄ）ＩＲＩ誘導酸化ストレス生成は、ＩＬ－３３欠損マウスでは軽減されている。ＷＴ及びＩＬ－３３欠損マウスの腎組織におけるＲＯＳ産生は、CellROX（登録商標）グリーンと呼ばれる蛍光プローブを使用して測定された。CellROX蛍光強度の定量（１群あたり３匹）。ＡＵ：任意の単位。二群比較には両側マンホイットニーＵ検定を使用し、三群以上の比較には一元配置分散分析に続くTukey事後検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。ここで留意すべきは、Ｓｈａｍ値とＣｔｒ値の間に差は見られなかったことであり（データは示さない）、これは、全ての検定パラメーターに有意なＳｈａｍ効果がないことを示している。
【図1B】ＩＬ－３３欠損マウスはＩＲＩから保護されている。野生型（ＷＴ）及びＩＬ－３３Ｇｔ／Ｇｔ（ＩＬ－３３欠損）マウスを、偽手術（Ｓｈａｍ）に付したか、又は対側腎摘出術（Ｃｔｒ）後に３２分の片側虚血（ＩＲＩ）に付した。２４時間（Ｔ２４）の再灌流後、腎臓及び末梢血が得られた（１群あたり５～８匹）。（Ａ－Ｃ）急性腎傷害の変化は、ＩＬ－３３欠損マウスでは軽減されている。ＩＬ－３３欠損マウスは、血中クレアチニン（Ａ）及び尿素窒素（ＢＵＮ）（Ｂ）レベルの低下を示した。（Ｃ）尿細管傷害スコア（１群あたり５～８匹のマウス）。二群比較には両側マンホイットニーＵ検定を使用し、三群以上の比較には一元配置分散分析に続くTukey事後検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｄ）ＩＲＩ誘導酸化ストレス生成は、ＩＬ－３３欠損マウスでは軽減されている。ＷＴ及びＩＬ－３３欠損マウスの腎組織におけるＲＯＳ産生は、CellROX（登録商標）グリーンと呼ばれる蛍光プローブを使用して測定された。CellROX蛍光強度の定量（１群あたり３匹）。ＡＵ：任意の単位。二群比較には両側マンホイットニーＵ検定を使用し、三群以上の比較には一元配置分散分析に続くTukey事後検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。ここで留意すべきは、Ｓｈａｍ値とＣｔｒ値の間に差は見られなかったことであり（データは示さない）、これは、全ての検定パラメーターに有意なＳｈａｍ効果がないことを示している。
【図1C】ＩＬ－３３欠損マウスはＩＲＩから保護されている。野生型（ＷＴ）及びＩＬ－３３Ｇｔ／Ｇｔ（ＩＬ－３３欠損）マウスを、偽手術（Ｓｈａｍ）に付したか、又は対側腎摘出術（Ｃｔｒ）後に３２分の片側虚血（ＩＲＩ）に付した。２４時間（Ｔ２４）の再灌流後、腎臓及び末梢血が得られた（１群あたり５～８匹）。（Ａ－Ｃ）急性腎傷害の変化は、ＩＬ－３３欠損マウスでは軽減されている。ＩＬ－３３欠損マウスは、血中クレアチニン（Ａ）及び尿素窒素（ＢＵＮ）（Ｂ）レベルの低下を示した。（Ｃ）尿細管傷害スコア（１群あたり５～８匹のマウス）。二群比較には両側マンホイットニーＵ検定を使用し、三群以上の比較には一元配置分散分析に続くTukey事後検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｄ）ＩＲＩ誘導酸化ストレス生成は、ＩＬ－３３欠損マウスでは軽減されている。ＷＴ及びＩＬ－３３欠損マウスの腎組織におけるＲＯＳ産生は、CellROX（登録商標）グリーンと呼ばれる蛍光プローブを使用して測定された。CellROX蛍光強度の定量（１群あたり３匹）。ＡＵ：任意の単位。二群比較には両側マンホイットニーＵ検定を使用し、三群以上の比較には一元配置分散分析に続くTukey事後検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。ここで留意すべきは、Ｓｈａｍ値とＣｔｒ値の間に差は見られなかったことであり（データは示さない）、これは、全ての検定パラメーターに有意なＳｈａｍ効果がないことを示している。
【図1D】ＩＬ－３３欠損マウスはＩＲＩから保護されている。野生型（ＷＴ）及びＩＬ－３３Ｇｔ／Ｇｔ（ＩＬ－３３欠損）マウスを、偽手術（Ｓｈａｍ）に付したか、又は対側腎摘出術（Ｃｔｒ）後に３２分の片側虚血（ＩＲＩ）に付した。２４時間（Ｔ２４）の再灌流後、腎臓及び末梢血が得られた（１群あたり５～８匹）。（Ａ－Ｃ）急性腎傷害の変化は、ＩＬ－３３欠損マウスでは軽減されている。ＩＬ－３３欠損マウスは、血中クレアチニン（Ａ）及び尿素窒素（ＢＵＮ）（Ｂ）レベルの低下を示した。（Ｃ）尿細管傷害スコア（１群あたり５～８匹のマウス）。二群比較には両側マンホイットニーＵ検定を使用し、三群以上の比較には一元配置分散分析に続くTukey事後検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｄ）ＩＲＩ誘導酸化ストレス生成は、ＩＬ－３３欠損マウスでは軽減されている。ＷＴ及びＩＬ－３３欠損マウスの腎組織におけるＲＯＳ産生は、CellROX（登録商標）グリーンと呼ばれる蛍光プローブを使用して測定された。CellROX蛍光強度の定量（１群あたり３匹）。ＡＵ：任意の単位。二群比較には両側マンホイットニーＵ検定を使用し、三群以上の比較には一元配置分散分析に続くTukey事後検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。ここで留意すべきは、Ｓｈａｍ値とＣｔｒ値の間に差は見られなかったことであり（データは示さない）、これは、全ての検定パラメーターに有意なＳｈａｍ効果がないことを示している。
【図2】図２：ＩＬ－３３欠損マウスでは死亡率が低下している。野生型（ＷＴ）及びＩＬ－３３Ｇｔ／Ｇｔ（ＩＬ－３３欠損）マウスを、偽手術（Ｓｈａｍ；１群あたり３匹）に付したか、又は対側腎摘出術後に３２分の片側虚血（ＩＲＩ；１群あたり６匹）に付した。偽手術及びＩＲＩのＷＴ及びＩＬ－３３欠損マウスのカプラン・マイヤー生存曲線。ＩＲＩ誘導の３０日後、ＩＬ－３３欠損マウスでは１００％の生存率が観察されたのに対し、ＷＴマウスの５０％は最初の３～４日以内に死亡した。ＷＴ ＩＲＩ群の生存分布は、他の全てのマウス群とは有意に異なっていた。（マンテル－コックス、＊Ｐ＜０．０５）。虚血再灌流誘導ＷＴマウスの大部分は、ＩＲＩの２～３日後になお無尿であったため、ＩＲＩが恐らく死因である。
【図3A】図３：ＳＴ２欠損マウスはＩＲＩから保護されている。野生型（ＷＴ）及びＳＴ２ＫＯ（ＳＴ２欠損）マウスを、偽手術（Ｓｈａｍ）に付したか、又は対側腎摘出術（Ｃｔｒ）後に３２分の片側虚血（ＩＲＩ）に付した。２４時間（Ｔ２４）の再灌流後、腎臓が得られた（１群あたり４～６匹）。ＩＲＩ後のＴ２４では、ＳＴ２欠損マウスは、その対応するＷＴと比較して、血中クレアチニンレベルはあまり上昇せず（Ａ）、尿細管間質の損傷の軽減を示した（Ｂ）。対照血漿（Ｔ０）は未処置動物から得られた。尿細管傷害は、過ヨウ素酸シッフ（periodic acid-Shiff）（ＰＡＳ）染色で評価された。ＷＴ及びＳＴ２欠損マウスの両方からのＳｈａｍ及び健常Ｃｔｒ腎臓は、正常な尿細管構造を示した。データは平均値±ＳＥＭとして表される。三群以上の比較には一元配置分散分析に続くTukey事後検定を使用した。＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図3B】図３：ＳＴ２欠損マウスはＩＲＩから保護されている。野生型（ＷＴ）及びＳＴ２ＫＯ（ＳＴ２欠損）マウスを、偽手術（Ｓｈａｍ）に付したか、又は対側腎摘出術（Ｃｔｒ）後に３２分の片側虚血（ＩＲＩ）に付した。２４時間（Ｔ２４）の再灌流後、腎臓が得られた（１群あたり４～６匹）。ＩＲＩ後のＴ２４では、ＳＴ２欠損マウスは、その対応するＷＴと比較して、血中クレアチニンレベルはあまり上昇せず（Ａ）、尿細管間質の損傷の軽減を示した（Ｂ）。対照血漿（Ｔ０）は未処置動物から得られた。尿細管傷害は、過ヨウ素酸シッフ（periodic acid-Shiff）（ＰＡＳ）染色で評価された。ＷＴ及びＳＴ２欠損マウスの両方からのＳｈａｍ及び健常Ｃｔｒ腎臓は、正常な尿細管構造を示した。データは平均値±ＳＥＭとして表される。三群以上の比較には一元配置分散分析に続くTukey事後検定を使用した。＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図4】図４：ＩＲＩ後のコラーゲン沈着はＩＬ－３３欠損マウスで減少している。野生型（ＷＴ）及びＩＬ－３３Ｇｔ／Ｇｔ（ＩＬ－３３欠損）マウスを、偽手術（Ｓｈａｍ；ｎ＝３）に付したか、又は対側腎摘出術（Ｃｔｒ）後に３２分の片側虚血（ＩＲＩ；ｎ＝６）に付した。再灌流後３０日目（Ｄ３０）に、生存マウスから腎臓が得られた。線維症は、シリウスレッド染色を使用して測定された。腎臓での有意なコラーゲン沈着は、それらの対応する健常Ｃｔｒ（ｎ＝３）又はＳｈａｍ（ｎ＝３）と比較して、ＷＴ（ｎ＝３）の腎臓のＩＲＩ後Ｄ３０で見つかったが、ＩＬ－３３欠損（ｎ＝６）マウスでは見られなかった。ＩＬ－３３欠損マウスで線維症への進行が少ないのは、ＩＬ－３３の消失というよりは初期ＡＫＩが少ないためと考えられた。データは平均値±ＳＥＭとして表される。二群比較には両側マンホイットニーＵ検定を使用し、三群以上の比較には一元配置分散分析に続くTukey事後検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【実施例0043】
材料と方法
動物
野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスをJanvier Labs（Le Genest-Saint-Isle, France）から購入した。Ｌａｃ－ｚ遺伝子トラップ（Ｇｔ）レポーターを備えたＩＬ－３３欠損Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＩＬ－３３Ｇｔ／Ｇｔ）は、Piceryら（５２）に報告されたとおり作成された。Ｊα１８ＫＯ Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｉＮＫＴ細胞を欠く）及びＳＴ２ＫＯ Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、それぞれM Taniguchi（５３）及びA McKenzie（５４）から提供された。全てのマウスは、特定の無菌条件下で我々の動物施設で維持された。体重２５～３０ｇの１０～１２週齢のオスマウスを全ての実験に使用した。動物の世話及び実験の操作は、フランス農林省（French Agriculture and Forestry Ministry）（法令87849）及び欧州共同体理事会指令（European Communities Council Directive）（86/609/EEC）のガイドラインに従って行われ、地域の倫理委員会（COMETHEA:CE2012-06）に承認された。
動物
野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスをJanvier Labs（Le Genest-Saint-Isle, France）から購入した。Ｌａｃ－ｚ遺伝子トラップ（Ｇｔ）レポーターを備えたＩＬ－３３欠損Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＩＬ－３３Ｇｔ／Ｇｔ）は、Piceryら（５２）に報告されたとおり作成された。Ｊα１８ＫＯ Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｉＮＫＴ細胞を欠く）及びＳＴ２ＫＯ Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、それぞれM Taniguchi（５３）及びA McKenzie（５４）から提供された。全てのマウスは、特定の無菌条件下で我々の動物施設で維持された。体重２５～３０ｇの１０～１２週齢のオスマウスを全ての実験に使用した。動物の世話及び実験の操作は、フランス農林省（French Agriculture and Forestry Ministry）（法令87849）及び欧州共同体理事会指令（European Communities Council Directive）（86/609/EEC）のガイドラインに従って行われ、地域の倫理委員会（COMETHEA:CE2012-06）に承認された。
【0044】
虚血再灌流腎傷害のマウスモデル
片側腎虚血再灌流の確立されたマウスモデルが使用された。簡単に述べると、マウスをイソフルラン（誘導には２％、維持には１．５％）で麻酔した。側腹部切開後、まっすぐなSchwartzマイクロクリップ（Fine Science Tools, Heidelberg, Germany）を使用して右腎茎を３２分間クランプ固定し、その後解放した。この虚血の期間は、高い死亡率なしに顕著な重症度の腎傷害を誘導するために選択され、機能回復後の線維症プロセスの評価を可能にした。左の対側腎臓（Ｃｔｒ）を結紮し、ＩＲＩ誘導前に摘出し、ＩＲＩ及びＳｈａｍ腎臓との比較のための健常な内部対照として使用した。偽手術マウスは、腎茎のクランプ固定を除く同一の外科的処置を受け、ＩＲＩマウスの対照として機能した。体温は、処置全体を通じて制御された。次に、食餌と水を自由に摂取させて、動物を回復させた。イソフルラン麻酔したマウスの後眼窩洞から血液を採取し、１、３、６、又は２４時間再灌流して右腎臓を摘出した。
片側腎虚血再灌流の確立されたマウスモデルが使用された。簡単に述べると、マウスをイソフルラン（誘導には２％、維持には１．５％）で麻酔した。側腹部切開後、まっすぐなSchwartzマイクロクリップ（Fine Science Tools, Heidelberg, Germany）を使用して右腎茎を３２分間クランプ固定し、その後解放した。この虚血の期間は、高い死亡率なしに顕著な重症度の腎傷害を誘導するために選択され、機能回復後の線維症プロセスの評価を可能にした。左の対側腎臓（Ｃｔｒ）を結紮し、ＩＲＩ誘導前に摘出し、ＩＲＩ及びＳｈａｍ腎臓との比較のための健常な内部対照として使用した。偽手術マウスは、腎茎のクランプ固定を除く同一の外科的処置を受け、ＩＲＩマウスの対照として機能した。体温は、処置全体を通じて制御された。次に、食餌と水を自由に摂取させて、動物を回復させた。イソフルラン麻酔したマウスの後眼窩洞から血液を採取し、１、３、６、又は２４時間再灌流して右腎臓を摘出した。
【0045】
腎機能
血漿クレアチニン及び血中尿素窒素（ＢＵＮ）は、報告されている高性能液体クロマトグラフィー（５５）及びCobas C701自動分析装置（Roche Diagnostic）をそれぞれ使用して、再灌流の１、３、６、又は２４時間後に測定されて腎機能が評価された。
血漿クレアチニン及び血中尿素窒素（ＢＵＮ）は、報告されている高性能液体クロマトグラフィー（５５）及びCobas C701自動分析装置（Roche Diagnostic）をそれぞれ使用して、再灌流の１、３、６、又は２４時間後に測定されて腎機能が評価された。
【0046】
サイトカイン及びケモカインの測定
製造業者の取扱説明書に従い、マウスＩＬ－３３及びＭＣＰ－１（Quantikineキット）並びにマウスＩＬ－１７Ａ及びヒトＩＬ－８（Duotest）をサンドイッチＥＬＩＳＡ（R&D Systems）によって血漿中で定量した。以前に報告されているとおり（２９）、マウスＩＦＮ－γを標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡによって定量した。製造業者の取扱説明書に従い、Luminex法を使用して、血漿中のマウスＩＬ－１２ｐ７０、ＭＩＰ－２、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ及びＣＸＣＬ１０を測定した（R&D Systems）。
製造業者の取扱説明書に従い、マウスＩＬ－３３及びＭＣＰ－１（Quantikineキット）並びにマウスＩＬ－１７Ａ及びヒトＩＬ－８（Duotest）をサンドイッチＥＬＩＳＡ（R&D Systems）によって血漿中で定量した。以前に報告されているとおり（２９）、マウスＩＦＮ－γを標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡによって定量した。製造業者の取扱説明書に従い、Luminex法を使用して、血漿中のマウスＩＬ－１２ｐ７０、ＭＩＰ－２、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ及びＣＸＣＬ１０を測定した（R&D Systems）。
【0047】
腎組織病理
腎臓を４％ホルモルで固定し、パラフィンワックスに包埋し、３．５μmで薄切した。過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色を使用して、尿細管傷害を評価した。組織学的変化は、示された尿細管の評価によって評価された：拡張、細胞壊死及び円柱形成、間質性浮腫及び間質性炎症に加えて刷子縁の消失。全ての組織学的検査は、以下のとおり半定量的スケールを使用して盲検法で腎病理学者（ＪＭＧ）によって実行された。０（損傷なし）；１（腎臓切片全体の２５％未満に影響を与える損傷）、２（腎臓切片の２５～５０％に影響を与える損傷）、３（腎臓切片全体の５０％以上に影響を与える損傷）。
腎臓を４％ホルモルで固定し、パラフィンワックスに包埋し、３．５μmで薄切した。過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色を使用して、尿細管傷害を評価した。組織学的変化は、示された尿細管の評価によって評価された：拡張、細胞壊死及び円柱形成、間質性浮腫及び間質性炎症に加えて刷子縁の消失。全ての組織学的検査は、以下のとおり半定量的スケールを使用して盲検法で腎病理学者（ＪＭＧ）によって実行された。０（損傷なし）；１（腎臓切片全体の２５％未満に影響を与える損傷）、２（腎臓切片の２５～５０％に影響を与える損傷）、３（腎臓切片全体の５０％以上に影響を与える損傷）。
【0048】
免疫染色及びイムノブロッティング
免疫染色及びウエスタンブロット分析には、マウスの全長（３４～３７kD）及び切断ＩＬ－３３（１９～２２kD）を認識するポリクローナルヤギ抗マウスＩＬ－３３抗体（R&D Systems、クローンAF3626）を使用した。
免疫染色及びウエスタンブロット分析には、マウスの全長（３４～３７kD）及び切断ＩＬ－３３（１９～２２kD）を認識するポリクローナルヤギ抗マウスＩＬ－３３抗体（R&D Systems、クローンAF3626）を使用した。
【0049】
免疫蛍光試験では、５μmの凍結切片を４％ パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で４℃で１時間固定した。切片をブロックにして、３％ ＢＳＡ、０．３％ Triton-X100で透過処理した後、以下のとおり一次抗体で４℃で一晩染色した：ヤギ抗マウスＩＬ－３３（１：５００）、ラット抗マウスＣＤ３１（１：５００、BD Biosciences、クローンMEC13.3）、及びＡＰＣ結合抗ＣＤ４５（１：２００、BD Biosciences、クローン30-F11）。スライドを以下のとおり二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした：Alexa Fluor 488ロバ抗ラットＩｇＧ（１：２５０；Life Technologies、A21208）、Alexa Fluor 568ロバ抗ヤギＩｇＧ（１：５００；Life Technologies、A11057）を二次抗体として使用した。核染色は、ＤＡＰＩ（４，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）（SouthernBiotech）で実行された。
【0050】
免疫組織化学によるＩＬ－３３検出では、５μmの凍結切片をアセトンで固定し、ペルオキシダーゼブロック溶液（Dako）に浸漬して内因性ペルオキシダーゼ活性を排除した。切片を１％ ＦＢＳと、次にヤギ抗マウスＩＬ－３３抗体（１：２００）と室温で４時間インキュベートした。ＨＲＰ結合ウサギ抗ヤギＩｇＧ二次抗体（１：２００、Invitrogen）とのインキュベーション後、ＤＡＢ基質（Dako）を使用して免疫複合体を可視化した。画像は、全ての写真で同じレーザー出力及び利得強度を使用して、蛍光顕微鏡（Olympus BX41）又は共焦点顕微鏡（Olympus FV1000）によって得られた。ＩＬ－３３発現は、Visilog7.1（登録商標）ソフトウェアを使用してデジタル的に定量された。動物毎に、５視野を分析した。
【0051】
イムノブロッティングでは、腎臓ホモジネートをＲＩＰＡ溶解緩衝液（ホスファターゼ及びプロテアーゼインヒビターカクテル（Santa Cruz）を補足した、２０mM トリス－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１５０mM ＮａＣｌ、１mM Ｎａ２ＥＤＴＡ、１mM ＥＧＴＡ、１％ Nonidet P-40、１％ デオキシコール酸ナトリウム）で溶解した。４℃で１０分間１４０００ｇで遠心分離後、上清を回収した。腎臓溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜を脱脂粉乳でブロッキングし、ヤギ抗マウスＩＬ－３３抗体（１：５００）と、次にＨＲＰ結合ウサギ抗ヤギポリクローナル抗体（１：２０００、Invitrogen）と４℃で一晩インキュベートした。ChemiDoc（商標）MPイメージングシステム（Bio-Rad）を使用して、免疫反応性タンパク質をECL Primeウエスタンブロッティング検出試薬（Amersham）で可視化した。相対タンパク質レベルをローディングコントロールとしてのＧＡＰＤＨに対して正規化した（１：２０００、Cell Signaling）。
【0052】
線維症の定量評価
凍結保存された腎臓切片（５μm）を冷アセトンで１０分間固定し、次に室温で３０分間シリウスレッド（Diapath）で染色した。切片を酸性水、エタノール（９５％、次に１００％）で洗浄し、光学顕微鏡分析用にマウントした。分析された表面積全体で正規化されたコラーゲン沈着量（赤い面積）は、Visilog7.1ソフトウェアを使用してデジタル的に定量された。
凍結保存された腎臓切片（５μm）を冷アセトンで１０分間固定し、次に室温で３０分間シリウスレッド（Diapath）で染色した。切片を酸性水、エタノール（９５％、次に１００％）で洗浄し、光学顕微鏡分析用にマウントした。分析された表面積全体で正規化されたコラーゲン沈着量（赤い面積）は、Visilog7.1ソフトウェアを使用してデジタル的に定量された。
【0053】
ＲＮＡ抽出及びリアルタイム定量的逆転写（ＲＴｑＰＣＲ）
製造業者の取扱説明書（Macherey-Nagel）に従い、Nucleospin ＲＮＡ抽出キットを使用して、マウスの腎組織から総ＲＮＡを抽出した。各試料からの総ＲＮＡ（１μg）は、qScript cDNA Supermix（Quanta Biosciences）を使用して、ｃＤＮＡに逆転写された。2X Perfecta SYBER Green Mix（Quanta Biosciences）及び５００nM マウスＩｌ－３３特異的プライマーを使用して、Rotor-Gene Q Lightcycler（Qiagen）で定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行した。結果は次にNono ｍＲＮＡ含有量で正規化された。
製造業者の取扱説明書（Macherey-Nagel）に従い、Nucleospin ＲＮＡ抽出キットを使用して、マウスの腎組織から総ＲＮＡを抽出した。各試料からの総ＲＮＡ（１μg）は、qScript cDNA Supermix（Quanta Biosciences）を使用して、ｃＤＮＡに逆転写された。2X Perfecta SYBER Green Mix（Quanta Biosciences）及び５００nM マウスＩｌ－３３特異的プライマーを使用して、Rotor-Gene Q Lightcycler（Qiagen）で定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行した。結果は次にNono ｍＲＮＡ含有量で正規化された。
【0054】
腎臓白血球の単離及びフローサイトメトリー分析
新鮮な腎臓を細かく切り刻み、７０μm こし器（BD Falcon）に通し、完全RPMI 1640（Life Technologies）中で３００ｇで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを３６％ パーコール溶液（GE Healthcare）に再懸濁し、次に７２％ パーコール溶液の層にロードした後、５００ｇで２０分間、室温で遠心分離した。白血球をパーコールの界面層から回収し、ＰＢＳ１Ｘで洗浄した。腎白血球の表現型分析は、以下のｍＡｂを使用したフローサイトメトリーによって実行された：CD45-BV510（クローン30-F11；Biolegend）、CD11b-PE（クローン：M1/70；Biolegend）、F4/80-FITC（クローン：BM8；Biolegend）、GR-1-BV421（クローン：RB6-8C5；Biolegend）、NK1.1-APC（クローン：PK136；Biolegend）、NK1.1-PerCpCy5.5（クローン：PK136；BD Biosciences）、CD3-PerCpCy5.5（クローン：17A2；Biolegend）及びST2-APC（クローン：245707；R&D systems）。ｉＮＫＴ細胞を特定するために、α－ガラクトシルセラミド類似体PBS57を負荷したBV421に結合したマウスＣＤ１ｄテトラマー（ＴＴ）で、又はその負荷していないテトラマーを対照として使用し、試料を染色した。
新鮮な腎臓を細かく切り刻み、７０μm こし器（BD Falcon）に通し、完全RPMI 1640（Life Technologies）中で３００ｇで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを３６％ パーコール溶液（GE Healthcare）に再懸濁し、次に７２％ パーコール溶液の層にロードした後、５００ｇで２０分間、室温で遠心分離した。白血球をパーコールの界面層から回収し、ＰＢＳ１Ｘで洗浄した。腎白血球の表現型分析は、以下のｍＡｂを使用したフローサイトメトリーによって実行された：CD45-BV510（クローン30-F11；Biolegend）、CD11b-PE（クローン：M1/70；Biolegend）、F4/80-FITC（クローン：BM8；Biolegend）、GR-1-BV421（クローン：RB6-8C5；Biolegend）、NK1.1-APC（クローン：PK136；Biolegend）、NK1.1-PerCpCy5.5（クローン：PK136；BD Biosciences）、CD3-PerCpCy5.5（クローン：17A2；Biolegend）及びST2-APC（クローン：245707；R&D systems）。ｉＮＫＴ細胞を特定するために、α－ガラクトシルセラミド類似体PBS57を負荷したBV421に結合したマウスＣＤ１ｄテトラマー（ＴＴ）で、又はその負荷していないテトラマーを対照として使用し、試料を染色した。
【0055】
細胞内サイトカイン染色では、細胞を単離して、Brefeldin A（Golgistop、BD Biosciences）の存在下で４～６時間インキュベートした。表面マーカー抗体で染色した後、細胞をFix/Perm緩衝液（BD Biosciences）で透過処理して、抗マウスＩＦＮ－γ－ＰＥ－Ｃｙ７（クローン：XMG102；BD Biosciences）及び抗マウスＩＬ－１７Ａ－ＰＥ（クローン：TC11-18H10；BD Biosciences）抗体とインキュベートした。細胞は、BD FACS Verse（商標）サイトメーター（BD Biosciences）及びFlowJo v7ソフトウェア（TreeStar, Inc）を使用して分析された。
【0056】
死細胞は、Live/Dead Fixable Near-IR Dead Cell Stainキット（Life Technologies）を使用して除外された。
【0057】
ｉＮＫＴ細胞の精製及び培養
ｉＮＫＴ（PBS57負荷ＴＴ（＋）ＣＤ５（＋））細胞は、前述のように（２９）、ＦＡＣＳによってソートされた。ソーティングの前に、製造業者の取扱説明書に従い、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６２Ｌ、及びＣＤ１９細胞を磁気的に枯渇（Invitrogen Life Technology）させて、新たに単離された脾細胞からｉＮＫＴ細胞を濃縮した。ソートされた細胞は、日常的に純度９７％であった。コートされた抗ＣＤ３ ｍＡｂ（１μg/mL、BD Pharmingen）を含むか含まない２００μg/mL 完全ＲＰＭＩで、マウスＩＬ－３３（１０ng/mL、R&D Systems）及び／又はマウスＩＬ－１２（２０ng/mL、R&D Systems)の存在下又は非存在下で、３７℃及び５％ ＣＯ２で丸底９６ウェルプレート中、合計２．５×１０４個のソート済みｉＮＫＴを４８時間培養した。ＩＦＮ－γ及びＩＬ－１７Ａは、ＥＬＩＳＡにより上清中で測定された。
ｉＮＫＴ（PBS57負荷ＴＴ（＋）ＣＤ５（＋））細胞は、前述のように（２９）、ＦＡＣＳによってソートされた。ソーティングの前に、製造業者の取扱説明書に従い、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６２Ｌ、及びＣＤ１９細胞を磁気的に枯渇（Invitrogen Life Technology）させて、新たに単離された脾細胞からｉＮＫＴ細胞を濃縮した。ソートされた細胞は、日常的に純度９７％であった。コートされた抗ＣＤ３ ｍＡｂ（１μg/mL、BD Pharmingen）を含むか含まない２００μg/mL 完全ＲＰＭＩで、マウスＩＬ－３３（１０ng/mL、R&D Systems）及び／又はマウスＩＬ－１２（２０ng/mL、R&D Systems)の存在下又は非存在下で、３７℃及び５％ ＣＯ２で丸底９６ウェルプレート中、合計２．５×１０４個のソート済みｉＮＫＴを４８時間培養した。ＩＦＮ－γ及びＩＬ－１７Ａは、ＥＬＩＳＡにより上清中で測定された。
【0058】
腎近位尿細管上皮細胞培養
不死化マウス腎臓の近位尿細管上皮（ＴＫＰＴＳ）細胞は、Elsa Bello-Reuss教授（Texas）から提供され、Dr Rafia Al-Lamki（Dr Bradley's laboratory所属, Cambridge, UK）から送付された。正常な腎臓に由来するヒト腎近位尿細管上皮細胞株ＨＲＰＴＥＣ及びＨＫ－２は、それぞれＡＴＣＣから購入され、Pr. Tauc（Sofia-Antipolis University, Nice, France）から提供された。細胞は、３７℃で５％ ＣＯ２の加湿雰囲気内で、４％（ＨＲＰＴＥＣ）、５％（ＴＫＰＴＳ）又は１０％（ＨＫ－２）のＦＢＳを補足したフェノールレッドを含まないダルベッコ改変イーグル培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２で培養された。細胞コンフルエンスが７０～８０％に達するまで培地を２日毎にリフレッシュして、適切なマウス又はヒト組換えＩＬ－３３（R&D Systems、１０～２０ng/mL）の存在下又は非存在下で２４時間又は４８時間更にインキュベートした。ＩＬ－８及びＭＣＰ－１は、ＥＬＩＳＡにより上清中で測定された。
不死化マウス腎臓の近位尿細管上皮（ＴＫＰＴＳ）細胞は、Elsa Bello-Reuss教授（Texas）から提供され、Dr Rafia Al-Lamki（Dr Bradley's laboratory所属, Cambridge, UK）から送付された。正常な腎臓に由来するヒト腎近位尿細管上皮細胞株ＨＲＰＴＥＣ及びＨＫ－２は、それぞれＡＴＣＣから購入され、Pr. Tauc（Sofia-Antipolis University, Nice, France）から提供された。細胞は、３７℃で５％ ＣＯ２の加湿雰囲気内で、４％（ＨＲＰＴＥＣ）、５％（ＴＫＰＴＳ）又は１０％（ＨＫ－２）のＦＢＳを補足したフェノールレッドを含まないダルベッコ改変イーグル培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２で培養された。細胞コンフルエンスが７０～８０％に達するまで培地を２日毎にリフレッシュして、適切なマウス又はヒト組換えＩＬ－３３（R&D Systems、１０～２０ng/mL）の存在下又は非存在下で２４時間又は４８時間更にインキュベートした。ＩＬ－８及びＭＣＰ－１は、ＥＬＩＳＡにより上清中で測定された。
【0059】
酸化ストレス測定
CellROX（登録商標）グリーン試薬（ThermoFisher Scientific）を使用して、酸化ストレスを反映する腎臓のスーパーオキシド産生を評価した。腎臓の凍結保存切片（５μm）を５μMのCellROXグリーン試薬と一緒に暗所で３７℃で３０分間インキュベートした。次に試料をＰＢＳ１Ｘで洗浄し、ＤＡＰＩ（SouthernBiotech）を含む培地でマウントして、Olympus BX41蛍光顕微鏡システムを使用して観察した。Image Jを使用して酸化ストレスを求めて算出した。データは任意の単位（AU）で陽性染色細胞のΣ平均（グリーン信号）／核のΣ平均（ブルー信号）の割合として表された。動物毎に、５～７視野を分析した。
CellROX（登録商標）グリーン試薬（ThermoFisher Scientific）を使用して、酸化ストレスを反映する腎臓のスーパーオキシド産生を評価した。腎臓の凍結保存切片（５μm）を５μMのCellROXグリーン試薬と一緒に暗所で３７℃で３０分間インキュベートした。次に試料をＰＢＳ１Ｘで洗浄し、ＤＡＰＩ（SouthernBiotech）を含む培地でマウントして、Olympus BX41蛍光顕微鏡システムを使用して観察した。Image Jを使用して酸化ストレスを求めて算出した。データは任意の単位（AU）で陽性染色細胞のΣ平均（グリーン信号）／核のΣ平均（ブルー信号）の割合として表された。動物毎に、５～７視野を分析した。
【0060】
統計分析
GraphPad Prismソフトウェア、バージョン５．０を使用して統計分析を実行した。全ての実験群は、ノンパラメトリックのマンホイットニーＵ検定を使用して二群のＰ値を計算し、そして三群以上には一元配置分散分析に続くTukey事後検定を使用して比較した。生存分析には、ログランク検定と共にカプラン・マイヤープロットを使用した。Ｐ＜０．０５は統計的に有意であると見なされた。データは平均値±ＳＥＭとして示されている。
GraphPad Prismソフトウェア、バージョン５．０を使用して統計分析を実行した。全ての実験群は、ノンパラメトリックのマンホイットニーＵ検定を使用して二群のＰ値を計算し、そして三群以上には一元配置分散分析に続くTukey事後検定を使用して比較した。生存分析には、ログランク検定と共にカプラン・マイヤープロットを使用した。Ｐ＜０．０５は統計的に有意であると見なされた。データは平均値±ＳＥＭとして示されている。
【0061】
結果
ＩＬ－３３は、微小血管内皮細胞の核で構成的に発現している。
最初に、野生型（ＷＴ）マウスの健常腎臓におけるＩＬ－３３の発現及びその局在を調べた。Akcayら（２１）の観察のとおり、ＩＬ－３３は免疫組織化学により、糸球体周囲及び尿細管周囲に明確に検出された（データは示さない）。免疫染色の特異性は、ＩＬ－３３欠損マウスの腎臓に免疫反応がないことで検証された。ＩＬ－３３は、尿細管周囲細胞及び糸球体周囲細胞の両方で、大部分核で、構成的に発現していた（データは示さない）。ＩＬ－３３欠損マウスでは免疫蛍光は検出されなかった（データは示さない）。ＩＬ－３３と、非常に特異的な内皮細胞マーカーであるＣＤ３１との共染色により、間質細胞の過半数（約６０～７０％）が両分子を共発現していることが明らかになった（データは示さない）。２０～３０％ ＣＤ３１（－）ＩＬ－３３（＋）細胞は、一般的な白血球マーカーＣＤ４５との共染色によって評価されたとおり、常在免疫細胞ではなかった。実際、白血球として同定されたＣＤ４５強陽性細胞はＩＬ－３３を発現しなかった（データは示さない）。
ＩＬ－３３は、微小血管内皮細胞の核で構成的に発現している。
最初に、野生型（ＷＴ）マウスの健常腎臓におけるＩＬ－３３の発現及びその局在を調べた。Akcayら（２１）の観察のとおり、ＩＬ－３３は免疫組織化学により、糸球体周囲及び尿細管周囲に明確に検出された（データは示さない）。免疫染色の特異性は、ＩＬ－３３欠損マウスの腎臓に免疫反応がないことで検証された。ＩＬ－３３は、尿細管周囲細胞及び糸球体周囲細胞の両方で、大部分核で、構成的に発現していた（データは示さない）。ＩＬ－３３欠損マウスでは免疫蛍光は検出されなかった（データは示さない）。ＩＬ－３３と、非常に特異的な内皮細胞マーカーであるＣＤ３１との共染色により、間質細胞の過半数（約６０～７０％）が両分子を共発現していることが明らかになった（データは示さない）。２０～３０％ ＣＤ３１（－）ＩＬ－３３（＋）細胞は、一般的な白血球マーカーＣＤ４５との共染色によって評価されたとおり、常在免疫細胞ではなかった。実際、白血球として同定されたＣＤ４５強陽性細胞はＩＬ－３３を発現しなかった（データは示さない）。
【0062】
尿細管周囲及び糸球体周囲の内皮細胞からのＩＲＩ誘導ＩＬ－３３放出は、転写を必要としない。
腎虚血再灌流後の組織損傷は、内皮細胞壊死につながる血流の急激な減少によって開始する。我々は、虚血再灌流直後にＩＬ－３３が壊死性内皮細胞から放出される可能性があると推測した。この仮定を検証するには、対側腎摘出後３２分間腎茎の片側クランプ固定によってＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウスでＩＲＩを誘導した。ＩＬ－３３免疫蛍光染色は、内部（定常状態）対照として使用される対応する健常な対側（Ｃｔｒ）（データは示さない）と比較して、損傷した腎臓の再灌流の１時間後には、糸球体周囲及び尿細管周囲の内皮細胞（ＣＤ３１（＋））の両方で明らかに減少した（データは示さない）。アラーミン放出と一致して、細胞内ＩＬ－３３は、クランプ固定なしの偽手術（Ｓｈａｍ）マウスでは減少しなかった（データは示さない）。虚血性腎臓からのＩＬ－３３のこの部分的な早期消失は、ウエスタンブロット分析によって確認された（データは示さない）。これは、循環ＩＬ－３３の上昇と同時であったが、ＩＲＩ（Ｔ０）の前には事実上検出できず、クランプ固定後１時間で血漿中で増加した。この時点では、切開のみに起因して、Ｓｈａｍマウスに部分的で一時的であるがわずかな増加が見られた（データは示さない）。血漿ＩＬ－３３レベルの上昇は最大６時間持続し、再灌流後２４時間以内にベースラインに戻った（データは示さない）。再灌流の１時間後のＩＬ－３３の放出は、ＲＴｑＰＣＲ分析によって証明されたとおり、転写を必要としなかったが、これは、対照腎臓（Ｃｔｒ）（１．０±０．０３５、平均値±ＳＥＭ、ｎ＝７）と虚血後１時間の腎臓（０．９５±０．０８、平均値±ＳＥＭ、ｎ＝５；ｐ＝０．６７、ｔ検定）の間のＩｌ－３３遺伝子発現に差がないことを明らかにした。これらのデータは、ＩＬ－３３が虚血マウスでアラーミンとして作用するという見解のとおり、損傷直後のデノボ合成というよりは内因性タンパク質の放出を支持している。
腎虚血再灌流後の組織損傷は、内皮細胞壊死につながる血流の急激な減少によって開始する。我々は、虚血再灌流直後にＩＬ－３３が壊死性内皮細胞から放出される可能性があると推測した。この仮定を検証するには、対側腎摘出後３２分間腎茎の片側クランプ固定によってＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウスでＩＲＩを誘導した。ＩＬ－３３免疫蛍光染色は、内部（定常状態）対照として使用される対応する健常な対側（Ｃｔｒ）（データは示さない）と比較して、損傷した腎臓の再灌流の１時間後には、糸球体周囲及び尿細管周囲の内皮細胞（ＣＤ３１（＋））の両方で明らかに減少した（データは示さない）。アラーミン放出と一致して、細胞内ＩＬ－３３は、クランプ固定なしの偽手術（Ｓｈａｍ）マウスでは減少しなかった（データは示さない）。虚血性腎臓からのＩＬ－３３のこの部分的な早期消失は、ウエスタンブロット分析によって確認された（データは示さない）。これは、循環ＩＬ－３３の上昇と同時であったが、ＩＲＩ（Ｔ０）の前には事実上検出できず、クランプ固定後１時間で血漿中で増加した。この時点では、切開のみに起因して、Ｓｈａｍマウスに部分的で一時的であるがわずかな増加が見られた（データは示さない）。血漿ＩＬ－３３レベルの上昇は最大６時間持続し、再灌流後２４時間以内にベースラインに戻った（データは示さない）。再灌流の１時間後のＩＬ－３３の放出は、ＲＴｑＰＣＲ分析によって証明されたとおり、転写を必要としなかったが、これは、対照腎臓（Ｃｔｒ）（１．０±０．０３５、平均値±ＳＥＭ、ｎ＝７）と虚血後１時間の腎臓（０．９５±０．０８、平均値±ＳＥＭ、ｎ＝５；ｐ＝０．６７、ｔ検定）の間のＩｌ－３３遺伝子発現に差がないことを明らかにした。これらのデータは、ＩＬ－３３が虚血マウスでアラーミンとして作用するという見解のとおり、損傷直後のデノボ合成というよりは内因性タンパク質の放出を支持している。
【0063】
ＩＬ－３３又はその特異的受容体ＳＴ２を欠くマウスは、ＩＲＩから保護されている。
クランプ固定２４時間後のＷＴ及びＩＬ－３３欠損マウスにおいて、血中クレアチニン（図１Ａ）及び尿素窒素（ＢＵＮ）（図１Ｂ）を測定することにより、腎機能に対するＩＬ－３３の影響を評価した。対応するそのＳｈａｍと比較して、ＩＬ－３３を欠くマウスではこれらの基準により腎機能障害がないことが明らかになった。この結果は、重症の腎不全の結果として、ＷＴマウスの５０％ 生存とは対照的に、手術後の最初の３～４日以内のこれらの１００％ 生存率によって確認された（図２）。皮髄境界部での刷子縁の消失、円柱形成、尿細管拡張及び炎症性浸潤によって評価された急性尿細管壊死（ＡＴＮ）は、ＩＬ－３３欠損腎臓ではその対応するＷＴに対して減少し（データは示さない）、ＡＴＮスコアは大幅に低下した（図１Ｃ）。ＳＴ２欠損マウスの腎臓も同様に中程度のＡＴＮスコアを示し（図３Ａ及びＢ）、ＩＬ－３３がその特異的ＳＴ２受容体を介して腎臓ＩＲＩを誘導することを証明している。
クランプ固定２４時間後のＷＴ及びＩＬ－３３欠損マウスにおいて、血中クレアチニン（図１Ａ）及び尿素窒素（ＢＵＮ）（図１Ｂ）を測定することにより、腎機能に対するＩＬ－３３の影響を評価した。対応するそのＳｈａｍと比較して、ＩＬ－３３を欠くマウスではこれらの基準により腎機能障害がないことが明らかになった。この結果は、重症の腎不全の結果として、ＷＴマウスの５０％ 生存とは対照的に、手術後の最初の３～４日以内のこれらの１００％ 生存率によって確認された（図２）。皮髄境界部での刷子縁の消失、円柱形成、尿細管拡張及び炎症性浸潤によって評価された急性尿細管壊死（ＡＴＮ）は、ＩＬ－３３欠損腎臓ではその対応するＷＴに対して減少し（データは示さない）、ＡＴＮスコアは大幅に低下した（図１Ｃ）。ＳＴ２欠損マウスの腎臓も同様に中程度のＡＴＮスコアを示し（図３Ａ及びＢ）、ＩＬ－３３がその特異的ＳＴ２受容体を介して腎臓ＩＲＩを誘導することを証明している。
【0064】
虚血腎臓では、再灌流時の活性酸素種（ＲＯＳ）の生成が有害な細胞応答のカスケードを開始させ、炎症、細胞死、及び急性腎不全を引き起こす（３３、３４）。我々の腎ＩＲＩモデルでCellROX染色によって、ＲＯＳ産生に対するＩＬ－３３欠損の影響を評価した（図１Ｄ）。ＷＴ及びＩＬ－３３欠損マウスの両方のＳｈａｍ腎臓で示されているとおり、基本条件では、蛍光染色は弱かった。虚血及びその後の２４時間再灌流の後に、ＲＯＳ産生はＷＴマウスで増加したが、対応するそのＩＬ－３３欠損マウスでは増加せず、ＩＲＩ重症度はＩＬ－３３に依存するという仮説を支持した。この結論は、虚血腎臓におけるコラーゲン沈着（これもＩＲＩ重症度に依存することが知られている（３５、３６））を検討するにあたって確認された（図４）。
【0065】
ＩＬ－３３欠損は、骨髄細胞のＩＲＩ後輸送及び炎症性サイトカイン発現の両方を変化させる。
虚血／再灌流後に、好中球、単球／マクロファージ、及び骨髄樹状細胞（ＤＣ）が腎臓に動員され、ＩＲＩに介在する（６）。ＩＲＩの２４時間後のＷＴ及びＩＬ－３３欠損マウスにおいて、ＣＤ４５（＋）細胞として識別された総腎白血球の出現率を比較することにより、このプロセスに対するＩＬ－３３の寄与を評価した。総ＣＤ４５（＋）細胞数は、ＷＴマウスでＩＲＩを受けている腎臓では、未処置マウス及びＳｈａｍマウスよりも有意に高く（データは示さない）、顕著な浸潤を示していた。特に、ＣＤ４５（＋）細胞動員は、ＩＬ－３３を欠くマウスで少なくとも２倍減少した。これらの細胞を更に試験すると、単球／マクロファージ（ＣＤ１１ｂｈｉｇｈＦ４／８０ｌｏｗ）（データは示さない）、骨髄ＤＣ（ＣＤ１１ｂｌｏｗＦ４／８０ｈｉｇｈ）（データは示さない）、及び好中球（ＧＲ－１ｈｉｇｈＣＤ１１ｂｈｉｇｈ）（データは示さない）の数が全て、骨髄の細胞輸送の減少を反映して減少したことが分かった。
虚血／再灌流後に、好中球、単球／マクロファージ、及び骨髄樹状細胞（ＤＣ）が腎臓に動員され、ＩＲＩに介在する（６）。ＩＲＩの２４時間後のＷＴ及びＩＬ－３３欠損マウスにおいて、ＣＤ４５（＋）細胞として識別された総腎白血球の出現率を比較することにより、このプロセスに対するＩＬ－３３の寄与を評価した。総ＣＤ４５（＋）細胞数は、ＷＴマウスでＩＲＩを受けている腎臓では、未処置マウス及びＳｈａｍマウスよりも有意に高く（データは示さない）、顕著な浸潤を示していた。特に、ＣＤ４５（＋）細胞動員は、ＩＬ－３３を欠くマウスで少なくとも２倍減少した。これらの細胞を更に試験すると、単球／マクロファージ（ＣＤ１１ｂｈｉｇｈＦ４／８０ｌｏｗ）（データは示さない）、骨髄ＤＣ（ＣＤ１１ｂｌｏｗＦ４／８０ｈｉｇｈ）（データは示さない）、及び好中球（ＧＲ－１ｈｉｇｈＣＤ１１ｂｈｉｇｈ）（データは示さない）の数が全て、骨髄の細胞輸送の減少を反映して減少したことが分かった。
【0066】
以前の研究は、急性腎ＩＲＩにおけるＩＦＮ－γ及びＩＬ－１７Ａ産生好中球の潜在的な役割を証明している（３１、３２）。ＩＲＩの２４時間後のＷＴ及びＩＬ－３３欠損腎臓からの好中球で細胞内フローサイトメトリーを使用して、これら２種のサイトカインの発現を分析した。ＷＴ腎臓では大部分の浸潤性好中球がＩＦＮ－γ及びＩＬ－１７Ａを共発現したが、このサブセットはＩＬ－３３欠損マウスでは明らかに減少していた。したがって、ＩＦＮ－γ（－）／ＩＬ－１７Ａ（－）好中球の頻度は、対応するＷＴマウスに対してＩＬ－３３欠損マウスからの腎臓では増加した。
【0067】
腎ｉＮＫＴ細胞の動員、活性化及びサイトカイン産生は、ＩＬ－３３欠損ＩＲＩ後マウスにおいて障害されている。
虚血再灌流によって誘導されるｉＮＫＴ細胞の活性化及び腎臓への動員は、腎傷害前の好中球浸潤及び炎症性サイトカイン産生にとって決定的に重要であると考えられている（６）。ＩＬ－３３がｉＮＫＴ細胞の活性化及び炎症組織への動員を推進することを知って（３７）、その欠損がＩＲＩ誘導２４時間後のこのサブセットにどのように影響するかを調べた。以前に報告されたように（３１、３２）、ｉＮＫＴ細胞（PBS57負荷ＣＤ１ｄ ＴＴ（＋）ＣＤ３（＋））は、未処置及びＳｈａｍ対照と比較して、ＩＲＩ後のＷＴ腎臓で、細胞数（データは示さない）及び頻度（データは示さない）の両方に関して顕著に増加した。更には、それらのＣＤ６９細胞表面発現は、ＩＲＩによる活性化を反映して上方制御された（データは示さない）。同じ条件で、ＩＬ－３３が欠損したマウスではいずれの増加もなかったが、このことは、ＩＲＩ誘導ｉＮＫＴ細胞輸送におけるＩＬ－３３の重要な役割を確立した。炎症部位でｉＮＫＴ細胞を動員する能力がよく認識されている３種のケモカインである（３８、３９）、ＩＰ－１０／ＣＸＣＬ１０、ＭＩＧ／ＣＸＣＬ９及びＲＡＮＴＥＳ／ＣＣＬ５の血漿レベルは、ＩＲＩ誘導後３時間以内に増加したが、これはＷＴ及びＩＬ－３３欠損マウスにおいて同様に起こっており、これらのケモカインがＩＲＩ中のその産生についてＩＬ－３３に依存しないことを示唆する発見である。
虚血再灌流によって誘導されるｉＮＫＴ細胞の活性化及び腎臓への動員は、腎傷害前の好中球浸潤及び炎症性サイトカイン産生にとって決定的に重要であると考えられている（６）。ＩＬ－３３がｉＮＫＴ細胞の活性化及び炎症組織への動員を推進することを知って（３７）、その欠損がＩＲＩ誘導２４時間後のこのサブセットにどのように影響するかを調べた。以前に報告されたように（３１、３２）、ｉＮＫＴ細胞（PBS57負荷ＣＤ１ｄ ＴＴ（＋）ＣＤ３（＋））は、未処置及びＳｈａｍ対照と比較して、ＩＲＩ後のＷＴ腎臓で、細胞数（データは示さない）及び頻度（データは示さない）の両方に関して顕著に増加した。更には、それらのＣＤ６９細胞表面発現は、ＩＲＩによる活性化を反映して上方制御された（データは示さない）。同じ条件で、ＩＬ－３３が欠損したマウスではいずれの増加もなかったが、このことは、ＩＲＩ誘導ｉＮＫＴ細胞輸送におけるＩＬ－３３の重要な役割を確立した。炎症部位でｉＮＫＴ細胞を動員する能力がよく認識されている３種のケモカインである（３８、３９）、ＩＰ－１０／ＣＸＣＬ１０、ＭＩＧ／ＣＸＣＬ９及びＲＡＮＴＥＳ／ＣＣＬ５の血漿レベルは、ＩＲＩ誘導後３時間以内に増加したが、これはＷＴ及びＩＬ－３３欠損マウスにおいて同様に起こっており、これらのケモカインがＩＲＩ中のその産生についてＩＬ－３３に依存しないことを示唆する発見である。
【0068】
ＩＲＩ中に、活性化ｉＮＫＴ細胞が、それらが生成するＩＦＮ－γ及びＩＬ－１７Ａを介して、動員及び好中球によるＩＦＮ－γ産生を促進することが提案されている。このプロセスにおける内因性ＩＬ－３３の潜在的な役割と一致して、ＩＦＮ－γ（＋）／ＩＬ－１７Ａ（＋）Ｔ細胞の頻度は、ＩＬ－３３欠損マウスでは減少する傾向があったが（データは示さない）、ｉＮＫＴ細胞におけるＩＦＮ－γ／ＩＬ－１７Ａ発現レベルは有意に低下した（データは示さない）。これは、ＩＬ－３３がｉＮＫＴ細胞を標的とし、インビトロでＩＦＮ－γ（２９、３０）及びＩＬ－１７Ａ両方の産生を誘導するという我々の発見を裏付けている（データは示さない）。
【0069】
ｉＮＫＴ細胞として、ＩＬ－３３の標的となり（２９、３０）、ＩＲＩ中に動員される（４０）ことも知られているＮＫ細胞は、ＩＲＩの２４時間後にＷＴマウスの腎臓における動員及びＩＦＮ－γ／ＩＬ－１７発現の増加を示したが、その対応するＩＬ－３３欠損マウスでは部分的に失われた現象であった（データは示さない）。
【0070】
ＩＬ－３３のＩＲＩ誘導放出は、ｉＮＫＴ細胞を欠くマウスにおいて腎傷害も好中球浸潤も促進しない。
腎ＩＲＩにおけるｉＮＫＴ細胞活性化及び動員に介在するＩＬ－３３の重要な役割は、ｉＮＫＴ細胞欠損Ｊα１８ＫＯマウス及びＩＬ－３３欠損マウスの同様の表現型、即ち、ＩＲＩに対する完全な保護（データは示さない）と共に好中球（データは示さない）及び単球／マクロファージ（データは示さない）浸潤の減少によって支持される。ここで留意すべきは、末梢血へのＩＬ－３３放出の血漿レベル及び時間経過は、ＩＲＩを受けているＪα１８ＫＯマウスのｉＮＫＴ細胞欠損の影響を受けなかったが（データは示さない）、これはＩＬ－３３活性のメディエーターとしてのｉＮＫＴ細胞の必要性を強調する発見である。
腎ＩＲＩにおけるｉＮＫＴ細胞活性化及び動員に介在するＩＬ－３３の重要な役割は、ｉＮＫＴ細胞欠損Ｊα１８ＫＯマウス及びＩＬ－３３欠損マウスの同様の表現型、即ち、ＩＲＩに対する完全な保護（データは示さない）と共に好中球（データは示さない）及び単球／マクロファージ（データは示さない）浸潤の減少によって支持される。ここで留意すべきは、末梢血へのＩＬ－３３放出の血漿レベル及び時間経過は、ＩＲＩを受けているＪα１８ＫＯマウスのｉＮＫＴ細胞欠損の影響を受けなかったが（データは示さない）、これはＩＬ－３３活性のメディエーターとしてのｉＮＫＴ細胞の必要性を強調する発見である。
【0071】
同時の骨髄細胞動員のない初期のＩＲＩ誘導腎病変は、ＩＬ－３３に依存する。
ＩＲＩ誘導２４時間後のＩＬ－３３依存性炎症反応のピークの前には、再灌流の最初の６時間を含む非常に早い段階があり、クレアチニン／ＢＵＮレベル及びＡＴＮスコアのわずかであるが有意な増加（データは示さない）、並びに骨髄細胞浸潤（データは示さない）を特徴とする。尿細管上皮壊死及び腎機能の変化の両方（しかし、骨髄細胞の動員（データは示さない）も炎症部位へのこれらの動員に関与する（４１）ケモカインのＭＣＰ－１／ＣＣＬ２及びＭＩＰ－２／ＣＸＣＬ２の増加（データは示さない）もこの限りでない）が、ＩＲＩ６時間後のＩＬ－３３欠損マウスでは消失したという事実は、ＩＬ－３３が免疫細胞に依存しないやり方で組織病変を開始させるという見解を支持する。この証拠は、ＩＬ－３３が腎上皮細胞を標的とするという我々のインビトロの発見を裏付けている（データは示さない）。更には、この初期の炎症エピソードは、ｉＮＫＴ細胞（データは示さない）、ＮＫ細胞及び骨髄ＤＣ（データは示さない）の動員に先行したが、これは、ＩＬ－３３／自然ＳＴ２発現細胞軸が、単球／マクロファージ及び好中球浸潤を開始させるというよりは増幅することを示している。
ＩＲＩ誘導２４時間後のＩＬ－３３依存性炎症反応のピークの前には、再灌流の最初の６時間を含む非常に早い段階があり、クレアチニン／ＢＵＮレベル及びＡＴＮスコアのわずかであるが有意な増加（データは示さない）、並びに骨髄細胞浸潤（データは示さない）を特徴とする。尿細管上皮壊死及び腎機能の変化の両方（しかし、骨髄細胞の動員（データは示さない）も炎症部位へのこれらの動員に関与する（４１）ケモカインのＭＣＰ－１／ＣＣＬ２及びＭＩＰ－２／ＣＸＣＬ２の増加（データは示さない）もこの限りでない）が、ＩＲＩ６時間後のＩＬ－３３欠損マウスでは消失したという事実は、ＩＬ－３３が免疫細胞に依存しないやり方で組織病変を開始させるという見解を支持する。この証拠は、ＩＬ－３３が腎上皮細胞を標的とするという我々のインビトロの発見を裏付けている（データは示さない）。更には、この初期の炎症エピソードは、ｉＮＫＴ細胞（データは示さない）、ＮＫ細胞及び骨髄ＤＣ（データは示さない）の動員に先行したが、これは、ＩＬ－３３／自然ＳＴ２発現細胞軸が、単球／マクロファージ及び好中球浸潤を開始させるというよりは増幅することを示している。
【0072】
ｉＮＫＴ細胞での循環ＩＬ－１２及び表面ＳＴ２過剰発現の増加は、自然免疫細胞浸潤のＩＬ－３３依存期に先行する
興味深いことに、ＩＬ－３３の放出はＩＲＩの１時間後すぐにピークに達したが、骨髄細胞の動員に対するその影響はＩＲＩ誘導の２４時間後にのみ発生した。恐らく、ＩＬ－３３は、独立した刺激というよりは、ＴＣＲ及び／又はＩＬ－１２刺激の補因子としてｉＮＫＴ細胞を標的としていると考えられる。実際、我々は血漿ＩＬ－１２の３倍の増加に注目したが、それはＩＲ後わずか６時間でそのピークに達した（データは示さない）。ＩＬ－１２の放出と同様に、ｉＮＫＴ細胞のＴＣＲ介在性活性化はＩＲＩの誘導後最初の数時間以内に起こらないが（３１）、ＩＬ－１２と組合せてＴＣＲで刺激されたｉＮＫＴ細胞によるＩＦＮ－ｇ産生を劇的に増強すると報告された（（２８～３０）及びデータは示さない）。これらのデータは、ｉＮＫＴ細胞の表面ＳＴ２レベルの最大の増加がクランプ固定後最初の数時間以内に達成されなかったという事実（データは示さない）と共に、免疫細胞に対するＩＬ－３３の増幅効果がＩＲＩの２４時間後にのみ現れた理由を説明するかもしれない。
興味深いことに、ＩＬ－３３の放出はＩＲＩの１時間後すぐにピークに達したが、骨髄細胞の動員に対するその影響はＩＲＩ誘導の２４時間後にのみ発生した。恐らく、ＩＬ－３３は、独立した刺激というよりは、ＴＣＲ及び／又はＩＬ－１２刺激の補因子としてｉＮＫＴ細胞を標的としていると考えられる。実際、我々は血漿ＩＬ－１２の３倍の増加に注目したが、それはＩＲ後わずか６時間でそのピークに達した（データは示さない）。ＩＬ－１２の放出と同様に、ｉＮＫＴ細胞のＴＣＲ介在性活性化はＩＲＩの誘導後最初の数時間以内に起こらないが（３１）、ＩＬ－１２と組合せてＴＣＲで刺激されたｉＮＫＴ細胞によるＩＦＮ－ｇ産生を劇的に増強すると報告された（（２８～３０）及びデータは示さない）。これらのデータは、ｉＮＫＴ細胞の表面ＳＴ２レベルの最大の増加がクランプ固定後最初の数時間以内に達成されなかったという事実（データは示さない）と共に、免疫細胞に対するＩＬ－３３の増幅効果がＩＲＩの２４時間後にのみ現れた理由を説明するかもしれない。
【0073】
考察：
内因性ＩＬ－３３は、組織損傷中に危険信号を媒介するアラーミンとして同定されている（１６）。この概念は最近、腎傷害が早期のＩＬ－３３放出に関連しているヒト腎移植に適用されている（２８）。また、ＩＲＩ後のインビボ条件を模倣する内皮細胞のインビトロ低酸素／再酸素化にも当てはまる（２８）。
内因性ＩＬ－３３は、組織損傷中に危険信号を媒介するアラーミンとして同定されている（１６）。この概念は最近、腎傷害が早期のＩＬ－３３放出に関連しているヒト腎移植に適用されている（２８）。また、ＩＲＩ後のインビボ条件を模倣する内皮細胞のインビトロ低酸素／再酸素化にも当てはまる（２８）。
【0074】
内皮細胞からアラーミンとして放出される内因性ＩＬ－３３が、免疫細胞と非免疫細胞の両方を標的とすることにより、ＩＲＩ誘導腎傷害の病因に寄与することを初めて証明する。ＩＬ－３３がないと、急性虚血性腎不全の臨床的及び組織学的特徴が弱められ、重症の尿細管間質性損傷が軽減され、腎機能が維持された。
【0075】
ＩＬ－３３は、主としてかつ構成的に上皮バリア組織及び内皮細胞の核において発現しているため、細胞傷害に反応して即座に放出され得る。腎臓におけるＩＬ－３３の細胞内局在に関する幾つかの研究では、ヒトの腎大血管及び小血管の内皮核における構成的発現（４２）、また同様の発現プロフィールを持つ（２１、２３）マウスの尿細管周囲血管内皮細胞における構成的発現が報告されている。これらのデータと一致して、健常なマウス腎臓では、ＩＬ－３３は主として尿細管周囲の毛細血管の（ＣＤ３１（＋）ＣＤ４５（－））内皮細胞により、及びＣＤ３１（－）ＣＤ４５（－）間質細胞（これらは、周皮細胞、内皮前駆細胞及び／又は線維芽細胞であってもよい）により発現されることを証明する。
【0076】
腎虚血再灌流後に組織損傷を引き起こす最初のイベントは、血流の急激な減少とそれに続く内皮細胞の壊死である。我々は、完全長の活性ＩＬ－３３が腎内皮細胞から消失し、再灌流からわずか１時間以内に循環中に増加し、Ｉｌ－３３ ｍＲＮＡ発現に変化がないことを発見した。この結果は、この状況においてＩＬ－３３が、瀕死の内皮細胞の核から放出されると、アラーミンとして損傷を伝達できることを証明している。
【0077】
即時の結果として、ＩＬ－３３は、恐らく尿細管上皮細胞を直接標的とすることによって、免疫細胞に依存しないやり方で腎病変を開始させる。これらのデータは、ＩＬ－３３が腎近位尿細管上皮細胞に対して細胞傷害活性を有するかどうか未だ決定されていないけれども、内皮損傷が腎ＩＲＩの最初のイベントであるというF Molitorisのグループの見解（４３）と一致している。
【0078】
更に、ＩＬ－３３は、特に、腎ＩＲＩ中の有害作用が広く認識されているｉＮＫＴリンパ球に対する影響を介して好中球に関連する組織損傷を更に増幅する。実際、虚血再灌流に続いて、好中球は腎臓に動員され、そこで主要なＩＲＩエフェクター細胞として作用する（４４～４６）。その動員及び活性化は、恐らくそのＩＦＮ－γ／ＩＬ－１７Ａ産生を介して、ｉＮＫＴ細胞に依存することが広く認められている（３１、３２）。我々は、ＩＬ－３３とｉＮＫＴ細胞とが直接相互作用して、虚血性腎臓における好中球浸潤を促進するという証拠を３項目提供する：（ｉ）ｉＮＫＴ細胞は、ＩＬ－３３受容体特異的ＳＴ２鎖を構成的に発現する（２９、３０）；（ii）ＩＬ－３３はｉＮＫＴ細胞の動員を推進し、虚血再灌流に応答してそのＩＦＮ－γ／ＩＬ－１７Ａ産生を誘導し、そして（iii）組換えＩＬ－３３はインビトロでｉＮＫＴ細胞を標的とし、ＩＲＩに介在する炎症性サイトカインを誘導するため、ＩＬ－３３、ｉＮＫＴ細胞、及びＩＦＮ－γ／ＩＬ－１７Ａ産生は相互に関連している。ｉＮＫＴ細胞と同様に、好中球はＳＴ２を発現するため、ＩＬ－３３に直接応答できた。ただし、ｉＮＫＴ細胞を欠くマウスにおいて好中球を動員できなかったことは、この仮定を支持していない。
【0079】
定常状態（２９）及び病態生理学的設定（３７）では、ＩＬ－３３は、ｉＮＫＴ細胞を標的とすることによる独立した刺激としてではなく、ＩＬ－１２及び／又はＴＣＲ刺激の補因子のように挙動するようである。ＩＲＩ中の同様のシナリオと一致して、我々は血漿ＩＬ－１２の増加に注目したが、Marquesら（４７）はＩＬ－１２欠損マウスの保護を報告した。更には、ＩＲＩ中のｉＮＫＴ細胞の動員／活性化はＣＤ１ｄとの相互作用を介して行われるが（３１、３２）、これは、恐らくＣＤ１ｄ分子と関連しており、インバリアントＴＣＲによって認識される自己糖脂質である、内因性Ａｇが関与していることを意味する（４８）。これらの項目の証拠は、ＩＲＩ中の骨髄ＤＣの動員がＩＬ－３３に依存するという我々の証明と共に、ＤＣ区画がＩＬ－１２を同時に放出し、ＩＲＩ中にｉＮＫＴ細胞リガンドを提示する可能性を高めている（ストレス条件に応答して報告されているとおり（４８～５１））。
【0080】
ＩＬ－３３がｉＮＫＴ細胞と直接相互作用して肺の非感染性炎症を調節するという我々の証拠（３７）と共に、現在の我々の研究は、ＩＬ－３３／ｉＮＫＴ細胞軸が、組織損傷に関連している「無菌性炎症」に関与する新しい一般的な生理病理学的機序を表すという見解を支持している。また、ＩＬ－３３の循環への即時放出が、ｉＮＫＴリンパ球の早期活性化の原因である可能性があることを示す、我々の最近の予備研究で示唆されているとおり、ヒト腎移植中に発生するＩＲＩにも適用される場合がある（２８）。この研究及び別の最近の研究（２７）は、血中に放出されたＩＬ－３３がヒトの早期のＡＫＩバイオマーカーになり得るかどうかという問題を提起している。
【0081】
我々の現在の研究は、腎臓ＩＲ中のアラーミンとしてのＩＬ－３３の役割、特に腎内皮細胞と上皮細胞の間の動態におけるＩＬ－３３の意義の基本的な機序の理解を向上させる。更には、アラーミンのシグナル伝達経路は、ＩＲＩ及びＡＫＩに関与する自然炎症カスケードを中和することができる、新しい治療標的として役立つ可能性がある。このアプローチは、移植における主要な課題である、長期的な移植片の生存に有益であろう。
【0082】
参考文献：
本出願の至るところで、種々の参考文献により、本発明が関係する最新技術を説明している。これらの参考文献の開示は、引用によって本開示に取り込まれる。
本出願の至るところで、種々の参考文献により、本発明が関係する最新技術を説明している。これらの参考文献の開示は、引用によって本開示に取り込まれる。
【0083】
【表1】
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【手続補正書】
【提出日】2023-07-05
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
本願明細書に記載の発明。
【外国語明細書】