特開 2023-114958 ＣＡＭＫ２Ｇ発現を抑制する製剤及びその製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用する応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023114958

(43)【公開日】2023-08-18

(54)【発明の名称】ＣＡＭＫ２Ｇ発現を抑制する製剤及びその製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用する応用

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/00 20060101AFI20230810BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20230810BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20230810BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230810BHJP

   A61P 25/02 20060101ALI20230810BHJP

   A61K 31/137 20060101ALI20230810BHJP

   A61K 31/138 20060101ALI20230810BHJP

【ＦＩ】

A61K45/00

A61P17/06

A61P29/00

A61P43/00 111

A61P43/00 105

A61P25/02 105

A61K31/137

A61K31/138

【審査請求】有

【請求項の数】9

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022059742

(22)【出願日】2022-03-31

(31)【優先権主張番号】202210116648.X

(32)【優先日】2022-02-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(71)【出願人】

【識別番号】521557687

【氏名又は名称】孫 良丹

【氏名又は名称原語表記】ＳＵＮ Ｌｉａｎｇｄａｎ

【住所又は居所原語表記】２１８ Ｊｉｘｉ Ｒｏａｄ， Ｓｈｕｓｈａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｈｅｆｅｉ Ｃｉｔｙ， Ａｎｈｕｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ２３００２２， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】100205936

【弁理士】

【氏名又は名称】崔 海龍

(74)【代理人】

【識別番号】100132805

【弁理士】

【氏名又は名称】河合 貴之

(72)【発明者】

【氏名】孫 良丹

(72)【発明者】

【氏名】兪 亜芬

(72)【発明者】

【氏名】雍 亮

(72)【発明者】

【氏名】甄 ▲き▼

(72)【発明者】

【氏名】李 報

【テーマコード（参考）】

4C084

4C206

【Ｆターム（参考）】

4C084AA17

4C084MA16

4C084MA17

4C084MA63

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA261

4C084ZA262

4C084ZA891

4C084ZA892

4C084ZB211

4C084ZB212

4C084ZC021

4C084ZC022

4C084ZC201

4C084ZC202

4C206AA01

4C206AA02

4C206FA12

4C206FA18

4C206KA01

4C206MA01

4C206MA04

4C206MA36

4C206MA37

4C206MA83

4C206MA86

4C206NA14

4C206ZA26

4C206ZA89

4C206ZC02

(57)【要約】

【課題】本発明は、乾癬病の治療薬品の技術分野に属し、具体的に、ＣＡＭＫ２Ｇエクスプレッションを抑制する製剤及びその製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用する応用に関するものである。
【解決手段】本発明の製剤は皮膚の交感神経内のＣＡＭＫ２Ｇの異常活性化によりγδＴ 細胞ＩＬ－１７の分泌を刺激することを有効に抑制し、それにより乾癬病皮膚の部位ＩＬ－１７の調節による免疫反応を減少させ、乾癬病を治療する効果を獲得することができる。また、循環システムの好中球ＮＥＴｓの形成を低減し、病状が厳しくなることを抑制し、免疫不全症を治療する効果を獲得することができる。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＡＭＫ２Ｇエクスプレッションを抑制する製剤を獲得した後、その製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用することを特徴とするＣＡＭＫ２Ｇエクスプレッションを抑制する製剤及びその製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用する応用。

【請求項2】

前記ＣＡＭＫ２ＧエクスプレッションはＣＡＭＫ２Ｇトランスクリプションと／或いはＣＡＭＫ２Ｇトランスクリプションが実施された後のｍＲＮＡ変換を含むことを特徴とする請求項１に記載の応用。

【請求項3】

ＣａＭＫ２γの蛋白質活性を抑制する製剤を獲得し後、その製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用することを特徴とするＣａＭＫ２γの蛋白質活性を抑制する製剤及びその製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用する応用。

【請求項4】

γδＴ細胞を除去する製剤またはγδＴ細胞の成長を抑制する製剤を獲得し後、その製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用することを特徴とするγδＴ細胞を除去する製剤またはγδＴ細胞の成長を抑制する製剤及びその製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用する応用。

【請求項5】

前記γδＴ細胞は皮下γδＴ細胞であることを特徴とする請求項４に記載の応用。

【請求項6】

皮膚組織の交感神経の活性を除去または抑制する製剤を獲得し後、その製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用することを特徴とする皮膚組織の交感神経の活性を除去または抑制する製剤及びその製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用する応用。

【請求項7】

前記皮膚組織の交感神経の活性を除去または抑制する製剤は６－ＯＨＤＡであることを特徴とする請求項６に記載の応用。

【請求項8】

皮膚中の交感神経がノルエピネフリンを分泌することを抑制する製剤を獲得した後、その製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用することを特徴とする皮膚中の交感神経がノルエピネフリンを分泌することを抑制する製剤及びその製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用する応用。

【請求項9】

皮膚中のチロシンヒドロキシラーゼの成長または増加を抑制する製剤を獲得した後、その製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用することを特徴とする皮膚中のチロシンヒドロキシラーゼの成長または増加を抑制する製剤及びその製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用する応用。

【請求項10】

ＡＤＲＢ２抑制剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用することを特徴とするＡＤＲＢ２抑制剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用する応用。

【請求項11】

前記ＡＤＲＢ２抑制剤はＩＣＩ １１８５５１であることを特徴とする請求項１０に記載の応用。

【請求項12】

ｐ３８リン酸化を抑制する製剤を獲得した後、その製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用することを特徴とするｐ３８リン酸化を抑制する製剤及びその製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用する応用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、乾癬病の治療薬品の技術分野に属し、具体的に、ＣＡＭＫ２Ｇエクスプレッションを抑制する製剤及びその製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用する応用に関するものである。

【背景技術】

【0002】

乾癬病（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）は、慢性炎症性皮膚病であり、免疫細胞浸潤、表皮過形成（Ｅｐｉｄｅｒｍｉｃ Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）及びケラチン細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）の分化が異常であるという特徴を有している。以前の研究によると、ケラチン細胞と免疫細部の相互作用によりサイトカインネットワーク（ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｎｅｔｗｏｒｋ）が形成される。特に、ＩＬ－１７と後続の信号カスケード（ｓｉｇｎａｌ ｃａｓｃａｄｅ）により乾癬病の発展が促進される。乾癬病の多遺伝子遺伝性（Ｐｏｌｙｇｅｎｉｃ ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ）は、その病気の病因が炎症、細胞の増殖及びアポトーシス、神経心理学的要因（Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ）等のいろいろな要因に係っていることを反映する。遺伝的感受性（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）はどうして乾癬病の発展に影響を与えるか、特にどの細胞の種類が乾癬病の特異性遺伝子の変異に係っているかはまだ把握していない。従来のゲノム全体関連研究（ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ、ＧＷＡＳ）とｍｅｔａ分析方法により乾癬病のいろいろな感受性遺伝子（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｇｅｎｅ）を見つけた。その乾癬病の感受性遺伝子の変異の研究において、乾癬病の感受性遺伝子と疾病表現、リスク、メカニズムに関する事項を複数回言及することがある。例えば、遺伝子型表現型（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）に関する研究によると、ｒｓ１０８５２９３６が早期発病型乾癬病（発病年齢＜４０歳）に係っており、ｒｓ７２４７４２２４（ＧＪＢ２）は平常の乾癬病の臨床特性に係っており、ｒｓ１０２０７６０（ＮＦＫＢ１）は家族成員が陽性である乾癬病に係っていることが分かった。遺伝子と遺伝子の相互作用（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）、例えばＭＨＣ－ＬＣＥインタラクティブ（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ）、ＭＨＣ－ＩＬ１２Ｂインタラクティブは乾癬病の発病のリスクを増加させるおそれがある。感受性遺伝子はいろいろな乾癬病共存（ｃｏｍｏｒｂｉｄｉｔｙ）または他の免疫性疾病に係っている。例えば、乾癬病とＳＬＥの共通感受性部位（Ｃｏｍｍｏｎ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｓｉｔｅ）を研究することにより、ＮＦＫＢＩＡとＩＬ２８ＲＡは２つの疾病においてゲノム全体関連性（Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）の顕著レベル（ｃｏｎｓｐｉｃｕｏｕｓｎｅｓｓ ｌｅｖｅｌ）に達することが分かることができる。機能性研究によると、多数の感受性遺伝子は、特定性、適応性及び先天性免疫経路（Ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｐａｔｈｗａｙ）に係っている遺伝子の付近に位置していることが分かることができる。その遺伝子は、抗原プレゼンテーション（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ、ＨＬＡ－Ｃ、ＥＲＡＰ１）、ＩＬ－１７／２３軸方向活性化（Ａｘｉａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＴＲＡＦ３ＩＰ２）、先天性抗ウイルス免疫（Ｉｎｎａｔｅ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）／Ｉ型インターフェロン信号（Ｔｙｐｅ Ｉ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｓｉｇｎａｌ）の伝動（ＲＮＦ１１４、ＩＦＩＨ１）及び肌バリア機能（Ｓｋｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ、ＬＣＥ３Ｂ／３Ｄ）等を含む。

【0003】

乾癬病は、複雑な疾病であり、１つの要因により形成されるものでない。疾病の固有の病因及び調節メカニズム（ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）と、いろいろな要因が各疾病において占めているウエート（ｗｅｉｇｈｔ）とを見つけることは、疾病の病因を有効に検出する基礎と先決条件である。ゲノム変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）は、疾病を研究する前提であり、疾病の病因を研究する重要な源流である。しかしながら、現在、いろいろな感受性遺伝子のダウンストリームメカニズム（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）を検出する方法は依然として少ない。遺伝子の関連分析により疾病の特徴に関する提示性情報を獲得することができるが、その提示性情報は遺伝子の機能方面の初歩的な判断にしか過ぎないものであり、タンパク、細胞動物モデル（Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ）のレベル及び組織サンプルレベル（Ｔｉｓｓｕｅ ｓａｍｐｌｅ ｌｅｖｅｌ）により乾癬病中の感受性遺伝子の作用メカニズムを更に解析することにより獲得するものでない。したがって、乾癬病の発病メカニズムをはんだんすることができず、乾癬病に効く薬剤を提供することができない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明は、遺伝学（ｇｅｎｅｔｉｃｓ）に基づいて乾癬病に多く係っている感受性部位を見つけ、多機能性技術を採用することにより、タンパク、細胞動物モデル及び組織サンプルレベルにより、乾癬病中の感受性遺伝子ＣＡＭＫ２Ｇの作用メカニズムを更に解析する。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明の目的は、ＣＡＭＫ２Ｇエクスプレッションを抑制する製剤及び、その製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用する応用を提供することにある。

【0006】

前記ＣＡＭＫ２ＧエクスプレッションはＣＡＭＫ２Ｇトランスクリプションと／或いはＣＡＭＫ２Ｇトランスクリプションが実施された後のｍＲＮＡ変換（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）を含む。

【0007】

本発明の実施例において、乾癬病患者の末梢血中のＣＡＭＫ２Ｇトランスクリプションレベルは健康対照物より随分高く、乾癬病ネズミの末梢血中のＣＡＭＫ２Ｇトランスクリプションレベルも健康対照物より高く、かつ乾癬病患者の末梢血中のＣＡＭＫ２Ｇ＋細胞比例は健康対照物より随分高い。

【0008】

本発明の目的は、ＣａＭＫ２γの蛋白質活性（Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を抑制する製剤及び、その製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用する応用を更に提供することにある。

【0009】

本発明の具体的な実施例において、乾癬病ネズミの皮膚中のＣａＭＫ２γ総蛋白質のレベルとリン酸化活性蛋白質のレベルはいずれも、健康対照物より高い。すなわち、乾癬病患者のＣａＭＫ２γ総蛋白質のレベルとリン酸化の活性状態はいずれも、健康対照物より高い。

【0010】

本発明の目的は、好中球がＮＥＴｓを放出することを抑制する製剤及び、その製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用する応用を更に提供することにある。

【0011】

本発明の実施例において、乾癬病患者の好中球のＣａＭＫ２γ平均蛍光強度（ＭＦＩ）は健康対照物より随分高いが、単核細胞（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ、ＣＤ１４＋）と複数個のＴ細胞亜集団（ｃｅｌｌ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）はほぼ変わっていない。循環システムにおいてＣａＭＫ２γをオーバーエクスプレッションする細胞は主として、好中球である。乾癬病患者の好中球のＣａＭＫ２γ平均蛍光強度（ＭＦＩ）は健康対照物より随分高いが、単核細胞（ＣＤ１４＋）と複数個のＴ細胞亜集団はほぼ変わっていない。乾癬病患者の血液の好中球中のＣＡＭＫ２Ｇのトランスクリプションレベルは健康対照物より随分高い。

【0012】

本発明の目的は、γδＴ細胞を除去する製剤またはγδＴ細胞の成長を抑制する製剤及び、その製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用する応用を更に提供することにある。

【0013】

前記γδＴ細胞は皮下γδＴ細胞である。

【0014】

本発明の具体的な実施例において、ＩＭＱに処理されたＷＴネズミの背中の皮膚において、ＩＬ－１７Ａは主として、皮下γδＴ細胞により形成され、ＩＬ－１７Ａは表皮γδＴ細胞とαβＴ細胞においてエクスプレッションをほぼしない。ＩＭＱに処理されたＣａｍｋ２ｇ^－／－ネズミにおいて、ＩＬ－１７Ａ＋皮下γδＴ細胞はＩＭＱに処理されたＷＴネズミよりずいぶん少ないが、ＩＬ－１７Ａ＋表皮γδＴ細胞とＩＬ－１７Ａ＋ αβＴ細胞は変わっていない。

【0015】

本発明の具体的な実施例において、γδＴ細胞の欠陥があるネズミ（Ｔｃｒｄ^－／－）の皮下にＳＡＬを注射する。γδＴ細胞がないことにより、ＳＡＬが乾癬病表現と炎症浸潤（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を促進する作用は相殺される。

【0016】

本発明の目的は、皮膚組織の交感神経の活性を除去または抑制する製剤及び、その製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用する応用を更に提供することにある。

【0017】

前記皮膚組織の交感神経の活性を除去または抑制する製剤は６－ＯＨＤＡである。

【0018】

本発明の実施例において、皮膚組織のＣａＭＫ２γは主として、交感神経線維においてエクスプレッションをし、乾癬病患者の皮膚中のＣａＭＫ２γ＋交感神経は健康の皮膚の交感神経より多い。皮膚の交感神経はＩＭＱに誘導されたネズミ乾癬病サンプルの表現を除去するか或いは減少させる。交感神経が除去された交感神経の皮膚中のＩＬ－１７Ａ＋ γδＴ細胞は減少し、それは交感神経がγδＴ細胞を調節するとともにＩＬ－１７を形成することにより乾癬病サンプルの炎症に影響を与えることを反映する。

【0019】

本発明の具体的な実施例において、６－ＯＨＤＡに誘導されたＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞が破損されることにより細胞内のＴＨトランスクリプションレベルは低下し、ＣＡＭＫ２Ｇ遺伝子がノックアウトされることによってもＴＨトランスクリプションレベルは低下するおそれがある。６－ＯＨＤＡに誘導されたＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞が破損されることによりＣＡＭＫ２Ｇエクスプレッションに顕著な影響を与えない。

【0020】

本発明の目的は、皮膚中の交感神経がノルエピネフリン（Ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）を分泌することを抑制する製剤及び、その製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用する応用を更に提供することにある。

【0021】

本発明の具体的な実施例において、皮下（ｈｙｐｏｄｅｒｍｉｃ）にＮＥを注射することによりＩＭＱに誘導された乾癬病サンプルの表現を増加させ、ネズミ皮膚中のＩＬ－１７Ａ＋ γδＴ細胞の比例を増加させる。ＮＥを注射することはＣＡＭＫ２ＧがないことによりＩＬ－１７Ａ＋ γδＴ細胞が減少することを相殺する。ＮＥを注射した後、ＩＭＱに誘導されたＷＴとＣａｍｋ２ｇ^－／－ネズミの皮膚厚さの不均等が消える。

【0022】

本発明の目的は、皮膚中のチロシンヒドロキシラーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ、ＴＨ）の成長または増加を抑制する製剤及び、その製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用する応用を更に提供することにある。

【0023】

本発明の具体的な実施例において、ＴＨとｐＴＨは大幅に低下することは皮膚の局部の交感神経が不活性状態（ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）になることを反映する。

【0024】

本発明の目的はＡＤＲＢ２抑制剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用する応用を更に提供することにある。

【0025】

前記ＡＤＲＢ２抑制剤はＩＣＩ １１８５５１である。

【0026】

本発明の具体的な実施例において、ＩＣＩを注射することによりネズミの乾癬病表現（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）は低下し、ＩＭＱに誘導されたネズミの皮膚にＩＣＩを注射することにより皮膚のγδＴ－１７細胞の比例を低減する。

【0027】

本発明の目的は、ｐ３８リン酸化を抑制する製剤及び、その製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用する応用を更に提供することにある。

【0028】

本発明の具体的な実施例において、ＳＡＬ処理によりＩＭＱに誘導された皮膚中のｐ３８の活性化を増強し、ＩＣＩ処理の抑制作用が証明される。Ｃａｍｋ２ｇ^－／－ネズミの皮膚中のｐ３８リン酸化が抑制され、ＮＥを注射することによりｐ３８リン酸化を増加させるとともに回復させる。

【発明の効果】

【0029】

本発明の実施例において、本発明の製剤は皮膚の交感神経内のＣＡＭＫ２Ｇの異常活性化によりγδＴ 細胞ＩＬ－１７の分泌を刺激することを有効に抑制し、それにより乾癬病皮膚の部位ＩＬ－１７の調節による免疫反応を減少させ、乾癬病を治療する効果を獲得することができる。また、循環システムの好中球ＮＥＴｓの形成を低減し、病状が厳しくなることを抑制し、免疫不全症（Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｄｉｓｅａｓｅ）を治療する効果を獲得することができる。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1】本発明の実施例に係る設計を示す流れ図である。

【図2A】乾癬病患者の末梢血中のＣＡＭＫ２Ｇトランスクリプションレベルを示す図である。

【図2B】乾癬病患者の末梢血中のＣＡＭＫ２Ｇ＋細胞比例を示す図である。

【図2C】乾癬病ネズミの末梢血中のＣａｍｋ２ｇトランスクリプションレベルを示す図である。

【図2D】乾癬病ネズミの皮膚中のＣａＭＫ２γの総蛋白質のレベルとリン酸化活性蛋白質のレベルを示す図である。

【図3A】ＣａＭＫ２γが皮膚神経においてエクスプレッションをすることを示す図である。

【図3B】乾癬病患者の皮膚中のＣａＭＫ２γ＋交感神経の状況を示す図である。

【図4A】循環システムにおいてＣａＭＫ２γをオーバーエクスプレッションする細胞の状況を示す図である。

【図4B】乾癬病患者の好中球のＣａＭＫ２γの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す図である。

【図4C】乾癬病患者の血液の好中球のＣＡＭＫ２Ｇのトランスクリプションレベルを示す図である。

【図4D】乾癬病患者の血液の好中球のＣａＭＫ２γ総蛋白質のレベルとリン酸化の活性状態を示す図である。

【図5A】Ｃａｍｋ２ｇ^－／－ネズミの皮膚セクションのＨ＆Ｅ染色を示す図である。

【図5B】Ｃａｍｋ２ｇ^－／－ネズミのＰＡＳＩ評価結果を示す図である。

【図5C】乾癬病皮膚病変中の炎症浸潤細胞のフロー分類方法を示す図である。

【図5D】ＩＭＱに誘導されたＣａｍｋ２ｇ^－／－ネズミの背中の皮膚の炎症浸潤細胞の状況を示す図である。

【図5E】Ｃａｍｋ２ｇ^－／－ネズミの皮膚のマーカー炎症因子遺伝子のエクスプレッション状況を示す図である。

【図6A】フロー検査によりＩＭＱ処理後のＷＴネズミの背中の皮膚においてＩＬ－１７Ａが細胞をエクスプレッションすることを測定することを示す図である。

【図6B】フローサイトメトリーによりいろいろなネズミモデルの細胞状況を分析することを示す図である。

【図6C】ＩＭＱに処理されるＣａｍｋ２ｇ^－／－ネズミのＩＬ－１７Ａ＋皮下γδＴ細胞の状況を示す図である。

【図6D】ＩＭＱに処理されるＣａｍｋ２ｇ^－／－ネズミのＩＬ－１７Ａ＋皮下γδＴ細胞の状況を示す図である。

【図6E】ＩＭＱに処理されるＣａｍｋ２ｇ^－／－ネズミのＩＬ－１７Ａ＋ αβＴ細胞の状況を示す図である。

【図7A】ＩＭＱ処理が実施されるＣａｍｋ２ｇ^－／－ネズミの皮膚のＴＨリン酸化の状況を示す図である。

【図7B】ＩＭＱ処理後のＣａｍｋ２ｇ^－／－ネズミの皮膚中のノルアドレナリン（ＮＥ）のレベルを示す図である。

【図7C】ＩＭＱ処理後のＣａｍｋ２ｇ^－／－ネズミの皮膚中のドーパミンのレベルを示す図である。

【図7D】皮下にＮＥを注射することとＩＭＱでネズミ乾癬病サンプルの表現を誘導する実験を示す流れ図である。

【図7E】皮下にＮＥを注射したネズミ皮膚中のＩＬ－１７Ａ＋ γδＴ細胞の比例を示す流れ図である。

【図7F】皮下にＮＥを注射したネズミと、ＣＡＭＫ２ＧがないことによりＩＬ－１７Ａ＋ γδＴ細胞の変化状況を示す図である。

【図7G】皮下にＮＥを注射した後、ＩＭＱの誘導によりＷＴネズミとＣａｍｋ２ｇ^－／－ネズミの皮膚の厚さが厚くなることを示す図である。

【図8A】ＩＭＱ処理前にネズミの皮下に６－ＯＨＤＡを注射することを示す図である。

【図8B】免疫蛍光方法により皮下に６－ＯＨＤＡを注射したネズミの皮膚組織の交感神経の分布を獲得した後、その分布を示す図である。

【図8C】ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ測定方法により皮下に６－ＯＨＤＡを注射したネズミのＴＨとｐＴＨエクスプレッション状況を獲得した後、その状況を示す図である。

【図8D】皮下に６－ＯＨＤＡを注射するネズミの皮膚の表現を示す図である。

【図8E】皮下に６－ＯＨＤＡを注射したネズミの乾癬病サンプルの表現を示す図である。

【図8F】皮下に６－ＯＨＤＡを注射したネズミの皮膚中のＩＬ－１７Ａ＋ γδＴ細胞の状況を示す図である。

【図8G】皮下に６－ＯＨＤＡを注射したネズミの皮膚中のＮＥ状況を示す図である。

【図9A】６－ＯＨＤＡに誘導されるＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の破損と細胞内のＴＨトランスクリプションレベルを示す図である。

【図9B】６－ＯＨＤＡに誘導されたＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の破損によりＣＡＭＫ２Ｇエクスプレッションに影響を与えることを示す図である。

【図9C】６－ＯＨＤＡに誘導されるＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の破損によりＣＡＭＫ２Ｇの総蛋白質とリン酸化レベルに影響を与えることを示す図である。

【図10A】ＩＭＱに誘導される乾癬病ネズミの皮膚組織のＲＮＡ測定の状況を示す図である。

【図10B】乾癬病患者の皮膚病変と健康対照物の皮膚に対して免疫組織化学分析を実施してえた結果を示す図である。

【図10C】ＩＬ－１７をエクスプレッションする細胞がβ２－ＡＲをエクスプレッションすることを示す図である。

【図10D】ＩＭＱ処理によりネズミ皮膚中のβ２－ＡＲ＋ Ｔ細胞の比例が変化することを示す図である。

【図11A】ＩＭＱに誘導されるネズミの皮下にＳＡＬを注射することを示す図である。

【図11B】ＳＡＬを注射しかつＩＭＱに誘導されるネズミの皮膚の状況を示す図である。

【図11C】ＳＡＬを注射しかつＩＭＱに誘導されるネズミの背中の皮膚の厚さ、紅斑及びスケールを示す図である。

【図11D】ＳＡＬを注射しかつＩＭＱに誘導されるネズミのＩＬ－１７Ａの形成を示す図である。

【図12A】ＩＣＩを注射しかつＩＭＱに誘導されるネズミに対して実験をすることを示す流れ図である。

【図12B】ＩＣＩを注射しかつＩＭＱに誘導されるネズミの皮膚の状況を示す図である。

【図12C】ＩＣＩを注射しかつＩＭＱに誘導されるネズミの背中の皮膚の厚さ、紅斑及びスケールを示す図である。

【図12D】ＩＣＩを注射しかつＩＭＱに誘導されるネズミのγδＴ－１７細胞の比例を示す図である。

【図13A】γδＴ細胞の欠陥があるネズミ（Ｔｃｒｄ^－／－）の皮下にＳＡＬを注射した後の皮膚の表現を示す図である。

【図13B】γδＴ細胞の欠陥があるネズミ（Ｔｃｒｄ^－／－）の皮下にＳＡＬを注射した後、好中球性顆粒球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉｃ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ）の比例を示す図である。

【図13C】γδＴ細胞の欠陥があるネズミ（Ｔｃｒｄ^－／－）の皮下にＳＡＬを注射した後、単核細胞の比例を示す図である。

【図13D】γδＴ細胞の欠陥があるネズミ（Ｔｃｒｄ^－／－）の皮下にＳＡＬを注射した後、αβＴ細胞がＩＬ－１７Ａを形成することを示す図である。

【図14A】ＰＭＡとイオノマイシン（Ｉｏｎ）が一緒に刺激することによりＴ細胞の炎症前サイトカインが形成される状況を示す図である。

【図14B】ＩＣＩの刺激することによりＴ細胞の炎症前サイトカインが形成される状況を示す図である。

【図15A】ＰＭＡ／イオノにより活性化されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞において、ｐ３８、ＥＲＫ及びＪＮＫの活性化状況を示す図である。

【図15B】ＳＡＬ処理を実施した後、ＩＭＱに誘導される皮膚中のｐ３８の活性化状況を示す図である。

【図15C】ＳＡＬ処理を実施した後、ＩＭＱに誘導される皮膚中のｐ３８の活性化状況を示す図である。

【図15D】ＩＭＱ処理が実施されるＷＴネズミのｐ３８の活性化状況を示す図である。

【図16A】ＰＭＡに活性化されるＨＬ－６０細胞において、ＣａＭＫＩＩ－ＩＮ１とＫＮ９３がＭＰＯ、エラスターゼ及びＰＡＤ４のエクスプレッションを抑制することを示す図である。

【図16B】ＣａＭＫ２γの活性と細胞内のＲＯＳが抑制される状況を示す図である。

【図16C】ＣａＭＫ２γの活性とＮＣＦ１、ＮＣＦ２及びＮＯＸ２のｍＲＮＡレベルが抑制されることを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0031】

以下、本発明の実施例により本発明の技術的事項を詳細に説明するが、下記実施例は本発明の例示にしか過ぎないものであるため、本発明は下記実施例の構成にのみ限定されない。この技術分野の技術者は本発明の要旨を逸脱しない範囲内において設計の改良、変更等をすることができ、それらがあっても本発明に含まれることは勿論である。

【0032】

本発明の実施例において、図１に示される流れ図により実験を実施する。

【0033】

本発明の実施例において、ＩＭＱはイミキモド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）を指し、ＩＭＱはＴｏｌｌライクレセプター（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＬＲ）７、８のアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）である。

【0034】

本発明の実施例において、「アゴニスト」という用語は、ある生物活性物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）のレセプターと結合され、その活性物質の作用を示す物質または薬品を指す。

【0035】

本発明の実施例において、「拮抗質（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）」という用語は、レセプターと結合されたが、固有活性（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を具備しないクラスＩ物質（Ｃｌａｓｓ Ｉ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）である。拮抗質は競争拮抗質（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）と非競争拮抗質（ｎｏｎｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）に分けられる。

【0036】

本発明の実施例において、「ＰＭＡ」と「イオノマイシン（Ｉｏｎ）」はジャーカット細胞（Ｊｕｒｋａｔ ｃｅｌｌ）の活性化に用いられ、活性化されるジャーカット細胞のみが炎症因子（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）をオーバーエクスプレッション（ｏｖｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）することができる。

【0037】

本発明の実施例において、「ＣａＭＫ２γ」はＣＡＭＫ２Ｇ遺伝子がエクスプレッション（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）する蛋白質プロダクツ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の一種である。

【0038】

本発明の実施例において、「ＣＡＭＫ２Ｇ＋細胞」はＣＡＭＫ２Ｇ蛋白質をエクスプレッションする細胞である。

【0039】

本発明の実施例において、「ＩＭＱがＣａｍｋ２ｇ^－／－乾癬病ネズミモデルを誘導（ｉｎｄｕｃｅ）する」ということはＩＭＱに誘導されるＣＡＭＫ２Ｇ遺伝子がネズミをノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）することを指す。「ＩＭＱが誘導した野生ネズミモデル」ということはＩＭＱに誘導される野生ネズミを指す。

【0040】

実施例１
感受性遺伝子ＣＡＭＫ２Ｇの乾癬病中のエクスプレッションを検出

【0041】

本発明の実施例において、感受性遺伝子（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｇｅｎｅ）ＣＡＭＫ２Ｇと乾癬病のエクスプレッションの関連性を検出するため、乾癬病患者と乾癬病ネズミの血液と皮膚組織においてＣＡＭＫ２Ｇのエクスプレッション状況をそれぞれ検出する。ＲＴ－ｑＰＣＲとフロー検査（Ｆｌｏｗ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）の結果によると、乾癬病患者の末梢血（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ）中のＣＡＭＫ２Ｇトランスクリプションレベル（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌ）は健康対照物より随分高く（図２Ａ）、乾癬病患者の末梢血中のＣＡＭＫ２Ｇ＋細胞比例は健康対照物より随分高く（図２Ｂ）、かつ乾癬病ネズミの末梢血中のＣＡＭＫ２Ｇトランスクリプションレベルも健康対照物より高い（図２Ｃ）ことがわかることができる。

【0042】

従来の技術文献によると、ＣＡＭＫＩＩγは多いＣａ２＋が調節する信号経路（ｓｉｇｎａｌ ｐａｔｈｗａｙ）において第二クーリエ（ｃｏｕｒｉｅｒ）の役割をする。細胞内のＣａ２＋が平常のレベルになっているとき、自身の抑制作用により休眠状態を維持し、細胞内のＣａ２＋のレベルが増加するとき、自身のリン酸化により抑制状態を解除する。Ｔｈｒ２８７部位のリン酸化はＣａＭＫ２γの活性化形式である。

【0043】

現在、リン酸化ＣａＭＫ２γ特異性を有している抗体が少ないが、ネズミ皮膚ＲＮＡ－ｓｅｑ結果によると、ＣａＭＫ２γは皮膚組織においてＣＡＭＫＩＩ家族のエクスプレッションレベル（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ）が最も高い成員である。したがって、本発明の実施例において、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＣａＭＫＩＩ （Ｔｈｒ２８７）抗体により皮膚組織の活性ＣａＭＫ２γレベルを測定する。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ測定によると、乾癬病ネズミの皮膚中のＣａＭＫ２γの総蛋白質（Ｔｏｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ）のレベルとリン酸化活性蛋白質（Ａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）のレベルがいずれも健康対照物より高い（図２Ｄ）ことがわかることができる。

【0044】

実施例２
皮膚組織中のＣａＭＫ２γのエクスプレッションを確定

【0045】

本発明の実施例において、ＣＡＭＫ２Ｇが皮膚組織の神経細胞（ｎｅｒｖｅ ｃｅｌｌ）においてオーバーエクスプレッションをするかを検証するため、健康対照物と乾癬病患者の皮膚サンプルに対してＣａＭＫ２γ（赤色）とパンニューロンマーカー（ｐａｎ－ｎｅｕｒｏｎａｌ ｍａｒｋｅｒ）β３－ｔｕｂｕｌｉｎ（緑色）のＣＯ染色（ＣＯ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を実施する。免疫蛍光の結果によると、ＣａＭＫ２γは皮膚神経においてエクスプレッションをするが、神経細胞はいずれもＣａＭＫ２γ陽性であるものでない（図３Ａ）。すなわち、ＣａＭＫＩＩ家族成員は神経細胞においてオーバーエクスプレッションをし、皮膚神経は交感神経（Ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ）と多種の知覚神経線維（Ｓｅｎｓｏｒｙ ｎｅｒｖｅ ｆｉｂｅｒｓ）で構成される。

【0046】

本発明の実施例において、交感神経線維（Ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ ｆｉｂｅｒ）のチロシンヒドロキシラーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ、ＴＨ）（緑色）とＣａＭＫ２γ（赤色）を識別することにより免疫蛍光ＣＯ染色（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ＣＯ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を実施する。その結果により、皮膚組織のＣａＭＫ２γは主として、交感神経線維内にエクスプレッションされており、乾癬病患者の皮膚中のＣａＭＫ２γ＋交感神経（Ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ ｎｅｒｖｅｓ）は健康の皮膚より多いことがわかる（図３Ｂ）。

【0047】

実施例３
循環システム中のＣａＭＫ２γのエクスプレッションを確定

【0048】

本発明の実施例において、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）により患者の末梢血ＣＤ１６＋ＣＤ６６ｂ＋好中球（ｎｅｕｔｒｏｃｙｔｅ）と非好中球（Ｎｏｎ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）ＣＤ１６＋ＣＤ６６ｂ－細胞、ＣＤ１６－ＣＤ６６ｂ－細胞中のＣａＭＫ２γの平均蛍光強度（ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、ＭＦＩ）を比較する。その結果によると、循環システムにおいてＣａＭＫ２γをオーバーエクスプレッションする細胞は主として、好中球である（図４Ａ）。

【0049】

本発明の実施例において、ＣａＭＫ２γが乾癬病患者の末梢血中の複数の常用の免疫細胞（ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ）において変化することを更に測定するため、患者と健康対照物の末梢血のいろいろな免疫細胞亜集団に対してフローサイトメトリー分析をする。その結果によると、乾癬病患者の好中球のＣａＭＫ２γの平均蛍光強度（ＭＦＩ）は健康対照物よりずいぶん高いが、単核細胞（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ、ＣＤ１４＋）と複数個のＴ細胞亜集団（ｃｅｌｌ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）はほぼ変わっていない（図４Ｂ）。

【0050】

本発明の実施例において、乾癬病患者の循環システムにおいて好中球内のＣＡＭＫ２Ｇエクスプレッションが変化することを更に測定するため、磁気ビーズ選別（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄ ｓｏｒｔｉｎｇ）方法により、乾癬病患者と健康対照物の血液において高純度の好中球をそれぞれ選別する。ＲＴ－ｑＰＣＲ測定によると、乾癬病患者の血液の好中球のＣＡＭＫ２Ｇのトランスクリプションレベルは健康対照物より随分高い（Ｐ＝０．００７９）（図４Ｃ）。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ測定によると、乾癬病患者のＣａＭＫ２γ総蛋白質のレベルとリン酸化の活性状態はいずれも、健康対照物より高いことが分かることができる（図４Ｄ）。

【0051】

実施例４
ＩＭＱに誘導されたＣａｍｋ２ｇ^－／－乾癬病ネズミモデルを形成する

【0052】

本発明の実施例において、乾癬病中のＣＡＭＫ２Ｇの作用メカニズムを更に研究するため、ＩＭＱに誘導されたＣａｍｋ２ｇ^－／－乾癬病ネズミモデルを形成する。

【0053】

本発明の実施例において、ＩＭＱに誘導されたＣａｍｋ２ｇ^－／－乾癬病ネズミモデルを形成するステップは、７歳のＷＴ（ｎ＝５）またはＣａｍｋ２ｇ^－／－ネズミ（ｎ＝５）の背中の毛を剃ることにより、サイズが２ｃｍ×２ｃｍである背中の皮膚を露出させるステップを含む。６２．５ｍｇのＩＭＱ乳化性ペースト（ｅｍｕｌｓｉｆｉａｂｌｅ ｐａｓｔｅ）または対照品（ｐｌａｃｅｂｏ）ＶＡＳをネズミの露出皮膚に均等に塗布し、それを４日間続けるとともに毎日ＰＡＳＩ評価を実施する。５日目はネズミに対してユーサネイジア（ｅｕｔｈａｎａｓｉａ）を実施した後、ネズミの皮膚、脾臓及び血液を取って測定する。

【0054】

本発明の実施例において、皮膚組織は、１０％のフォルマリン（Ｆｏｒｍａｌｉｎ）で固定させ、パラフィン包埋（ｐａｒａｆｆｉｎ ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）を実施し、４μｍのセクション（ｓｅｃｔｉｏｎ）を獲得した後、Ｈ＆Ｅ染色を実施する。

【0055】

本発明の実施例において、Ｈ＆Ｅ染色の画像はバーチカル顕微鏡（ｖｅｒｔｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５３）により１０倍に拡大して獲得するものである。

【0056】

本発明の実施例において、ネズミモデルの炎症を評価する方法は臨床ＰＡＳＩ評価方法により発明した客観的評価システムである。紅斑（ｅｒｙｔｈｅｍａ）、スケール及び厚さの増加を０～４で評価することができる。０は病症がないことを反映し、１は病症が軽いことを反映し、２は病症が中度であることを反映し、３は病症が明確であることを反映し、４は病症が厳しいことを反映する。紅斑の強度を表示するスコアカード（ｓｃｏｒｅｃａｒｄ）により紅斑の程度を評価することができる。総合的な評価（紅斑＋スケール＋厚さの増加）を、炎症の程度を表す数値にすることができる（０～１２で評価する）。

【0057】

皮膚セクションのＨ＆Ｅ染色とＰＡＳＩ評価結果により、ＩＭＱに誘導されたＣａｍｋ２ｇ^－／－ネズミモデルとＩＭＱに誘導された野生ネズミを比較してみると、Ｃａｍｋ２ｇ^－／－ネズミの乾癬病サンプルの表現が大幅に低下することが分かることができる。それは、ネズミの背中の皮膚厚さが減少し、紅斑とスケールが減少することを反映する（図５Ａ、図５Ｂ）。

【0058】

本発明の実施例において、特定の標識抗体（Ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）により分離後のネズミの免疫細胞を分類する。単核細胞と好中球は乾癬病皮膚病変（ｓｋｉｎ ｌｅｓｉｏｎｓ）中の炎症浸潤細胞（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）である（図５Ｃ）。フロー検査の結果によると、ＩＭＱに誘導されたＣａｍｋ２ｇ^－／－ネズミの背中の皮膚の炎症浸潤が大幅に減少することが分かることができる（図５Ｄ）。

【0059】

本発明の実施例において、皮膚免疫細胞を分離することは、皮膚を充分にカットするステップと、消化酵素（ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ）において３７℃の温度と２２５ｒｐｍの回転速度により消化を１．５ｈ実施するステップと、消化を３０分更に実施する。消化酵素は、１．２ｇのＢＳＡ（Ｂｉｏｆｏｘｘ、４２４０ＧＲ１００）、０．１２ｇの１型コラゲナーゼ（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｔｙｐｅ １）（Ｓｉｇｍａ、Ｃ０１３０－５Ｇ）、０．０６ｇの４型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、ＬＳ００４１８９）及び０．０６ｇのヒアルロニダーゼ（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ）（Ｓｉｇｍａ、Ｈ３５０６－５Ｇ）を３０ｍｌのＤＭＥＭ（ＨｙＣｌｏｎｅ、ＳＨ３００２２．０１）に溶解させた後、１ｍｇ／ｍｌであるＤＮａｓｅ（Ｙｕａｎｙｅ、Ｓ１００７３）を１５０μｌ添加することにより獲得することができる。消化が終わると、細胞懸濁液（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）を７０－μｍのフィルターで濾過する。細胞懸濁液を温度が４℃でありかつ回転速度が２０００ｒｐｍである遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）装置に送入して８ｍｉｎの遠心分離を実施した後、スーパーネイト（ｓｕｐｅｒｎａｔｅ）を除去することにより細胞粒子を収集する。細胞は容量が６ｍｌでありかつ濃度が４０％であるリンパ細胞（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）分離液体（５．４ｍｌのＰｅｒｃｏｌｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７－０８９１－０９）＋５２０μｌ Ｈａｎｋ‘ｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ、Ｃ０２１９）＋４４μｌ ２×Ｈｅｐｅｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、Ｈ１０８０－１００）＋８．９４６ｍｌ ＰＢＳ）に浮かんでいる。つぎに、容量が６ｍｌでありかつ濃度が８０％であるリンパ細胞分離液体（５．４ｍｌ Ｐｅｒｃｏｌｌ＋５２０μｌ Ｈａｎｋ‘ｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ＋４４μｌ ２×Ｈｅｐｅｓ Ｂｕｆｆｅｒ＋１．４９１ｍｌ ＰＢＳ）を容器の内壁に沿って容器にゆっくり注ぐことにより液体を二層に分離させる。分離液体を温度が４℃でありかつ回転速度が２０００ｒｐｍである遠心分離装置に送入して２０ｍｉｎの遠心分離を実施し、遠心揚力（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｌｉｆｔｉｎｇ ｆｏｒｃｅ）を最小にする。遠心分離後の液体は４層に分離され、上から下への順に沿う各層はそれぞれ、４０％のリンパ細胞分離液体、リンパ細胞、８０％のリンパ細胞分離液体及び細胞フラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）である。リンパ細胞を新しい遠心管（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｔｕｂｅ）にゆっくり転移させた後、１０ｍｌのＰＢＳでリンパ細胞をよく洗浄する。溶液を温度が４℃でありかつ回転速度が２０００ｒｐｍである遠心分離装置により８ｍｉｎの遠心分離を実施した後、スーパーネイトを除去することにより細胞粒子を収集する。つぎに、各細胞膜（ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ）の表面抗体（Ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を１μｌを取って５０μｌのＰＢＳに送入することにより細胞と混合させ、室内の暗室においてインキュベーションを３０ｍｉｎ実施する。３ｍｌのＰＢＳで細胞を洗浄する。温度が４℃でありかつ回転速度が２０００ｒｐｍである遠心分離装置により５ｍｉｎの遠心分離を実施した後、スーパーネイトを除去することにより細胞粒子を収集する。測定をする前、細胞の体積により細胞を３００～６００μｌのＰＢＳに浮かべる。細胞内抗体（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を染色させる必要がある場合、細胞沈殿物に１ｍｌの細胞透過剤（Ｃｅｌｌ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｒ）（固定／浸透用高濃度液体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、００－５１２３－４３）：ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍ希釈剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、００－５２２３－５６）＝１：３）を直接に添加し、室内の暗室においてインキュベーションを６０ｍｉｎ実施する。５０μｌのＰＢＳに適量の細胞内抗体を添加することによりそれと細胞を混合させ、室内の暗室に４０ｍｉｎ保存する。３ｍｌのＰＢＳで細胞を洗浄する。温度が４℃でありかつ回転速度が２０００ｒｐｍである遠心分離装置により５ｍｉｎの遠心分離を実施した後、スーパーネイトを除去することにより細胞粒子を収集する。測定をする前、細胞の体積により細胞を３００～６００μｌのＰＢＳに浮かべる。

【0060】

本発明の実施例において用いる表面抗体（Ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、ＣＤ４５－ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＲＥＦ１１－０４５１－８２）、ＣＤ１１ｂ ＰＥ－Ｃｙ７（ＢＤ、５５２８５０）、ＬＹ－６Ｇ－ＢＶ６０５（ＢＤ、５６３００５）、Ｌｙ－６Ｃ ＰＥ（ＢＤ、５６０５９２）、ＣＤ１１Ｃ ＰＥ－ＣＦ５９４（ＢＤ、５６２４５４）がある。

【0061】

本発明の実施例において、乾癬病と関係が密接でありかつ乾癬病皮膚病変においてエクスプレッションが高い既知の抗炎症遺伝子（ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｇｅｎｅｓ）に対して定量のＰＣＲを実施する。すなわち、Ｉｌ１７ａ、Ｉｌ１７ｆ、Ｉｌ６、Ｉｌ２２、ＩＬ１ｂ及びＴｎｆａを実施する。その結果によると、Ｃａｍｋ２ｇ^－／－ネズミの皮膚のマーカー遺伝子（ｍａｒｋｅｒ ｇｅｎｅ）のエクスプレッションが大幅に低下することが分かることができる（図５Ｅ）。

【0062】

実施例５
ＣａＭＫ２γで乾癬病ネズミ皮膚中のγδＴ－１７細胞を制御する

【0063】

好中球と単核細胞を乾癬病病変部位に集めることは乾癬病病因の特徴である。従来の技術文献によると、好中球と単核細胞は臨界効果（ｃｒｉｔｉｃａｌ ｅｆｆｅｃｔ）のサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）ＩＬ－１７に駆動されうものである。ＩＬ－１７はいろいろな細胞種類、例えばＴｈ１７細胞、Ｔｃ１７細胞、γδ Ｔ－１７細胞、ＩＬＣ３等により放出されることができる。

【0064】

本発明の実施例において、ＩＭＱ処理後のＷＴネズミの背中の皮膚に対してフロー検査をする。フロー検査の結果によると、ＩＭＱ処理が実施されたＷＴネズミの背中の皮膚において、ＩＬ－１７Ａは主として皮下γδＴ細胞により形成され、ＩＬ－１７Ａは表皮γδＴ細胞とαβＴ細胞においてエクスプレッションをほぼしないことが分かることができる（図６Ａ）。

【0065】

本発明の実施例において、ＣａＭＫ２γがＩＭＱ処理後のネズミの皮膚中のＩＬ－１７の形成に影響を与えるかを判断するため、フローサイトメトリー分析によりＩＬ－１７＋細胞がいろいろな皮膚のＴ細胞亜集団中の比例を分析する。その結果は図６Ｂに示すとおりである。ＩＭＱに処理されるＣａｍｋ２ｇ^－／－ネズミのＩＬ－１７Ａ＋皮下γδＴ細胞はＩＭＱに処理されるＷＴネズミよりずいぶん少なく（図６Ｃ）、ＩＬ－１７Ａ＋皮下γδＴ細胞とＩＬ－１７Ａ＋ αβＴは変わっていない（図６Ｄ、図６Ｅ）。

【0066】

実施例７
皮膚のＣａＭＫ２γ＋交感神経でγδＴ－１７細胞を制御する

【0067】

従来の技術文献によると、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）は、カテコールアミン（ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅ、ドーパミン（ｄｏｐａｍｉｎｅ、ＤＡ）、ノルアドレナリン（Ｎｏｒａｄｒｅｎａｌｉｎｅ、ＮＥ）及びアドレナリン（ａｄｒｅｎａｌｉｎｅ））の生合成（ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）中の速度制限酵素（ｒａｔｅ－ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）であり、皮膚中の交感神経を鑑別することに用いられる。ＣａＭＫＩＩ家族成員はニューロン集団（Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）においてＴＨリン酸化を刺激することによりカテコールアミンの生合成の制御に制御する。

【0068】

本発明の実施例において、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ測定によると、ＩＭＱ処理によりネズミの皮膚のＴＨリン酸化が大幅に増加するが、ＣＡＭＫ２ＧがないことによりＴＨリン酸化の増加が抑制されることがわかることができる（図７Ａ）。

【0069】

本発明の実施例において、ＥＬＩＳＡによりネズミの皮膚中のカテコールアミンの神経伝達物質（ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ）の分泌を測定する。その結果によると、ＩＭＱ処理後のＣａｍｋ２ｇ^－／－ネズミの皮膚中のＮＥレベルはＷＴネズミより低いが、皮膚中のドーパミンが変わっていないことが分かることができる（図７Ｂ、図７Ｃ）。

【0070】

本発明の実施例において、皮下にＮＥを注射することによりＩＭＱに誘導された乾癬病サンプルの表現を増加させ、ネズミ皮膚中のＩＬ－１７Ａ＋ γδＴ細胞の比例を増加させる。ＮＥを注射することはＣＡＭＫ２ＧがないことによりＩＬ－１７Ａ＋ γδＴ細胞が減少することを相殺し（図７Ｄ、図７Ｅ／図７Ｆ）、交感神経は皮膚中のＮＥの重要な出所であることを反映する。

【0071】

本発明の実施例において、ＮＥを注射した後、ＩＭＱに誘導されたＷＴとＣａｍｋ２ｇ^－／－ネズミの皮膚厚さの不均等が消える（図７Ｇ）。それは、ＣａＭＫ２γでＩＭＱに誘導された皮膚炎症を制御することは皮膚の交換神経がＮＥを分泌することに係っており、皮膚中のＣａＭＫ２γ＋交換神経はＮＥを分泌することにより一部分のγδＴ細胞ＩＬ－１７Ａの形成を調節することを反映する。

【0072】

実施例８
皮膚の交感神経の除去がネズミモデルの乾癬病表現に与える影響

【0073】

従来の技術文献によると、６－ヒドロキシドパミン（６－ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ、６－ＯＨＤＡ）は、カテコールアミン作動性ニューロン（ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ）の選択的神経毒（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ）であり、交感神経の除去に用いられる。腹腔（ａｂｄｏｍｉｎａｌ ｃａｖｉｔｙ）に６－ＯＨＤＡを注射することにより、ＩＭＱに誘導される耳浮腫（ｅａｒ ｅｄｅｍａ）を減少させることができるが、ＩＬ－１７Ａの形成に影響を与えない。その原因は心血管効果（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｆｆｅｃｔｓ）と／或いは全身性交感神経の除去により生ずる全身性免疫障害（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）にある。

【0074】

本発明の実施例において、皮膚の局部の交感神経を切除することにより乾癬病ネズミに与える影響を観察するため、ＩＭＱ処理前にネズミの皮下に６－ＯＨＤＡを注射する（図８Ａ）。免疫蛍光とｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ測定の結果によると、ＴＨとｐＴＨ（副甲状腺ホルモン、ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ）が大幅に低下することが分かることができ、それは皮膚の局部の交感神経不活性状態になることを反映する（図８Ｂ、図８Ｃ）。後続の研究によると、皮膚の局部の交感神経が除去されることによりＩＭＱに誘導されたネズミの乾癬病サンプルの表現が減少することが分かることができる（図８Ｄ、図８Ｅ）。交感神経が除去される皮膚中のＩＬ－１７Ａ＋ γδＴ細胞が減少することは、皮膚の交感神経がγδＴ細胞を調節することによりＩＬ－１７の形成を調節しかつ乾癬病サンプルの皮膚の炎症に影響を与えることを反映する（図８Ｆ）。交感神経が除去される皮膚中のＮＥが減少することは、交感神経がＮＥを分泌することによりγδＴ細胞ＩＬ－１７の形成を調節することを反映する（図８Ｇ）。

【0075】

実施例９
ＣＡＭＫ２Ｇ遺伝子がノックアウトされることにより６－ＯＨＤＡが破損されたＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞に与える影響

【0076】

本発明の実施例において、ＣａＭＫ２γが交感神経内のＴＨのエクスプレッションに直接に影響を与えるかを更に測定するため、ＲＮＡｉ方法によりヒト神経芽細胞（ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ）内のＣＡＭＫ２Ｇをノックダウン（ｋｎｏｃｋ－ｄｏｗｎ）する。ＳＨ－ＳＹ５Ｙは分化程度が低い腫瘤細胞であり、ＳＨ－ＳＹ５Ｙとドーパミン作動性ニューロン（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ）の形状、生理及び生化学的機能（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）は類似しており、ＳＨ－ＳＹ５Ｙとドーパミン作動性ニューロンはエクスプレッションＴＨを構成することができる。ｑＰＣＲ測定の結果によると、６－ＯＨＤＡに誘導されるＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の破損により細胞内のＴＨトランスクリプションレベルが低下し、ＣＡＭＫ２Ｇ遺伝子がノックアウトされることによってもＴＨトランスクリプションレベルが低下することが分かることができる（図９Ａ）。６－ＯＨＤＡに誘導されたＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の破損によりＣＡＭＫ２Ｇエクスプレッションに顕著な影響を与えない（図９Ｂ）。本発明の実施例において、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ測定によると、ＣＡＭＫ２Ｇ遺伝子をノックアウトすることによりＣａＭＫ２γの総蛋白質のレベルとｐＴＨレベルを大幅に低減し、６－ＯＨＤＡに誘導されるＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の破損によってもＣａＭＫ２γの総蛋白質のレベルとｐＴＨレベルを低減することができる。また、６－ＯＨＤＡに誘導されるＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の破損によりＣａＭＫＩＩ家族の他の成員のリン酸化レベルも増加することができる（図９Ｃ）。

【0077】

実施例１０
ＮＥレセプターの皮膚内のエクスプレッションモデル

【0078】

本発明の実施例において、ＩＭＱに誘導される乾癬病ネズミの皮膚組織に対してＲＮＡ測定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）を実施する。その結果によると、ＡＤＲＢ２ （β２－ＡＲ）は皮膚中の重要なＮＥレセプターエクスプレッションであることが分かることができる（図１０Ａ）。

【0079】

本発明の実施例において、乾癬病患者の皮膚病変と健康対照物の皮膚に対して免疫組織化学分析（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施する。その結果によると、β２－ＡＲが皮下部位に浸潤している免疫細胞上においてエクスプレッションをすることが分かることができる（図１０Ｂ）。

【0080】

本発明の実施例において、免疫蛍光とフローサイトメトリー分析によると、ＩＬ－１７をエクスプレッションする大部分の細胞はβ２－ＡＲをエクスプレッションし（図１０Ｃ）、ＩＭＱ処理によりネズミ皮膚中のβ２－ＡＲ＋ Ｔ細胞の比例が増加することが分かることができる（図１０Ｄ）。

【0081】

実施例１１
β２－ＡＲ活性剤（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）でネズミモデルの乾癬病表現を調節

【0082】

本発明の実施例において、ＮＥがβ２－ＡＲによりγδＴ－１７細胞に直接に影響を与えるかを更に測定するため、ＩＭＱに誘導されるネズミの皮下にサルメテロールキナフォーテ（Ｓａｌｍｅｔｅｒｏｌ ｘｉｎａｆｏａｔｅ、ＳＡＬ、それは選択的ＡＤＲＢ２アゴニストである）を注射する。健康対照物と比較してみると、ＳＡＬを注射することによりネズミの乾癬病表現は増加する。すなわち、背中の皮膚の厚さは厚くなり、紅斑とスケールは増加する（図１１Ｂ、図１１Ｃ）。ＩＭＱに誘導されたネズミの皮膚にＳＡＬを注射することによりγδＴ細胞がＩＬ－１７Ａを形成することを促進させることができる（図１１Ｄ）。

【0083】

実施例１２
β２－ＡＲ拮抗質によりネズミモデルの乾癬病表現を調節

【0084】

本発明の実施例において、ＩＭＱに誘導されるネズミの皮下にＩＣＩ １１８，５５１（ＩＣＩ、それは選択的ＡＤＲＢ２拮抗質である）を注射する。健康対照物と比較してみると、ＩＣＩが注射されることによりネズミの乾癬病表現は低下し（図１２Ｂ、図１２Ｃ）、ＩＭＱに誘導されたネズミの皮膚にＩＣＩを注射することにより皮膚のγδＴ－１７細胞の比例を低減する（図１２Ｄ）。

【0085】

実施例１３
ＮＥ－ＡＤＲＢ２信号経路でγδＴ ｃｅｌｌｓ分泌ＩＬ－１７を調節

【0086】

本発明の実施例において、γδＴ細胞の欠陥があるネズミ（Ｔｃｒｄ^－／－）の皮下にＳＡＬを注射する。γδＴ細胞がないことにより、ＳＡＬが乾癬病表現と炎症浸潤を促進する作用は相殺される（図１３Ａ、図１３Ｂ、図１３Ｃ）。ＳＡＬはαβＴ細胞がＩＬ－１７Ａを形成することに影響を与えない（図１３Ｄ）。以上のとおり、皮膚中のＮＥは主として皮膚交感神経により形成され、ＮＥ－ ＡＤＲＢ２信号経路によりγδＴ細胞がＩＬ－１７を形成するように調節する。すなわちαβＴ細胞がＩＬ－１７を形成するように調節しない。

【0087】

実施例１４
細胞モデルにおいてβ２－ＡＲの免疫調節作用（ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ）を検証

【0088】

本発明の実施例において、ＡＤＲＢ２がγδＴ細胞の炎症反応を調節することを測定するため、サルメテロールキナフォーテ（Ｓａｌｍｅｔｅｒｏｌ ｘｉｎａｆｏａｔｅ）と拮抗質 ＩＣＩ １１８５５１でＪｕｒｋａｔ細胞（永生する人のＴリンパ細胞）を刺激する。ＰＭＡとイオノマイシン（Ｉｏｎ）が一緒に刺激する場合、高濃度のＳＡＬによりＴ細胞の炎症前サイトカイン（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）ＩＬ－１７Ａ、ＴＮＦ－α及びＩＬ－２２の形成を増加させる（図１４Ａ）。逆に、ＩＣＩはサイトカインの形成を低減する（図１４Ｂ）。

【0089】

実施例１５
ＮＥ－ＡＤＲＢ２－ｐ３８信号経路の検証

【0090】

本発明の実施例において、ＰＭＡ／イオノマイシンで２ｈの活性化をしたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞において、ＳＡＬで４ｈの刺激をすることによりｐ３８リン酸化を大幅に増加させることができるが、ＩＣＩで４ｈ処理することによりｐ３８リン酸化を抑制する。しかしながら、それらはＭＡＰＫ家族の２つの成員であるＥＲＫとＪＮＫの活性化に影響を与えない。ＡＤＲＢ２でＴ細胞の活性化を調節するとき、ｐ３８リン酸化に依頼するが、ＥＲＫとＪＮＫに依頼しない。それは、従来の技術文献に記載されている、ｐ３８リン酸化は自己免疫型関節炎（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ａｒｔｈｒｉｔｉ）中のＴｈ１７細胞の増殖を促進することと一致する。ｐ３８ ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路（Ｋｉｎａｓｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ）は末梢血免疫システム中のＴ細胞の活性化と分化に影響を与える。

【0091】

本発明の実施例において、ＰＭＡ／イオノにより活性化されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞のネズミ皮膚中のｐ３８のレベルを更に測定した。その結果によると、ｐ３８リン酸化はＩＭＱにより活性化される。ＳＡＬ処理によりＩＭＱに誘導された皮膚中のｐ３８の活性化を増強することができるが、ＩＣＩ処理はそれを抑制する（図１５Ｂ、図１５Ｃ）。

【0092】

本発明の実施例において、ＰＭＡ／イオノにより活性化されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞とＩＭＱ処理が実施されたＷＴネズミを比較してみると、Ｃａｍｋ２ｇ^－／－ネズミの皮膚のｐ３８リン酸化が抑制されることが分かることができる。ＮＥを注射することによりｐ３８リン酸化を増加させるとともに回復させる（図１５Ｄ）。

【0093】

その結果によると、ＣａＭＫ２γはＮＥ－ＡＤＲＢ２－ｐ３８経路を活性化することによりＴ細胞がＩＬ－１７を形成することを促進する。

【0094】

実施例１６
ＣａＭＫ２γはＮＡＰＤＨオキシダーゼ・コンプレック・スサブユニット蛋白質（Ｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ Ｓｕｂｕｎｉｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）の合成を促進することにより好中球内のＲＯＳの形成を刺激し、それによりＮＥＴｓの形成を調節する。

【0095】

従来の技術文献によると、ＩＬ－１７を形成するＴ細胞は乾癬病免疫学を研究する主流になっているが、好中球は、最初の免疫システムにおいて数量が最も多い細胞であるので、乾癬病の発病と発展において注目を集めている。活性化の好中球により増強の呼吸が形成されるとともに活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＯＳ）の形成が伴い、最後にＮＥＴｏｓｉｓが形成される。ＮＥＴｏｓｉｓは細胞のアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）及び壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）と異なっている好中球の死亡形式である。ＮＥＴｏｓｉｓに伴ってＮＥＴｓが形成される。ＮＥＴｓは、ミエロペルオキシダーゼ（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＭＰＯ）、好中球エラスターゼ（ｅｌａｓｔａｓｅ、ＮＥ）及びペプチジルアルギニンダイミナーゼ（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｄｅｉｍｉｎａｓｅ）４ （ＰＡＤ４）等のプロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）を放出する。そのプロテアーゼは炎症性メディエーター（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍｅｄｉａｔｏｒ）の加水分解活性化（Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）と自己抗原（ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ）のＮＥＴｓの形成に参与する。ＨＬ６０は、骨髄腫細胞株（Ｍｙｅｌｏｍａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ）であり、ＤＢＳＯの刺激により好中球に分化される潜在力を具備している。ＣａＭＫ２γはＣＡＭＫ家族のＨＬ－６０細胞においてエクスプレッションレベルと活性が最も高い成員である。

【0096】

本発明の実施例において、ＣａＭＫ２γが好中球内のＮＥＴｓの形成に参与するかを測定するため、２種のＣａＭＫＩＩ抑制剤であるＣａＭＫＩＩ－ ＩＮ１とＫＮ９３を用いる。その結果によると、ＰＭＡに活性化されるＨＬ－６０細胞において、ＣａＭＫＩＩ－ＩＮ１とＫＮ９３はいずれも、ＭＰＯ、エラスターゼ及びＰＡＤ４の放出を抑制することが分かることができる。それは好中球内のＣａＭＫ２γ活性はＮＥＴｓの形成を減少させることを反映する（図１６Ａ）。

【0097】

本発明の実施例において、ＣａＭＫ２γの活性を抑制することにより細胞内のＲＯＳの形成（図１６Ｂ）とＮＣＦ１、ＮＣＦ２及びＮＯＸ２のｍＲＮＡレベルを低減する（図１６Ｃ）ことを更に発見した。前記ｍＲＮＡはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＮＡＰＤＨ）オキシダーゼ・コンプレックの蛋白質サブユニット（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔ）を形成することできる。研究によると、ＮＡＰＤＨオキシダーゼ・コンプレックは細胞内のＲＯＳの重要な出所であることを反映する。

【0098】

本発明の実施例の結果によると、活性化のＣａＭＫ２γはＮＡＰＤＨオキシダーゼ・コンプレック・スサブユニット蛋白質の合成を促進することにより好中球内のＲＯＳの形成を刺激し、それによりＮＥＴｓの形成を調節する。それは循環システム中のＣＡＭＫ２γが乾癬病の発展に参与することを反映する。

【0099】

以上、本発明の好適な実施例を説明してきたが、前記実施例は、本発明の例示にしか過ぎないものであり、本発明は前記実施例の構成にのみ限定されるものでない。この技術分野の技術者は本発明の要旨を逸脱しない範囲内において設計の変更、改良等をすることができ、それらがあっても本発明の特許請求の範囲が定めた範囲に含まれることは勿論である。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図7F】

【図7G】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図8G】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【手続補正書】

【提出日】2023-07-05

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＡＭＫ２Ｇ発現を抑制する製剤を獲得した後、その製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用し、前記ＣＡＭＫ２Ｇ発現は、ＣＡＭＫ２Ｇ転写及び／又はＣＡＭＫ２Ｇ転写が実施された後のｍＲＮＡ翻訳を含み、前記ＣＡＭＫ２Ｇ発現を抑制する製剤によって、γδＴ細胞ＩＬ－１７の分泌が抑制されることを特徴とするＣＡＭＫ２Ｇ発現を抑制する製剤が乾癬病の治療薬品の製造における使用。

【請求項2】

前記ＣＡＭＫ２Ｇ発現を抑制する製剤は、ＣａＭＫ２γの蛋白質活性を抑制することによって、皮膚組織の交感神経の活性を除去または抑制することを特徴とする請求項１に記載のＣＡＭＫ２Ｇ発現を抑制する製剤が乾癬病の治療薬品の製造における使用。

【請求項3】

前記γδＴ細胞は、皮下γδＴ細胞であることを特徴とする請求項１に記載のＣＡＭＫ２Ｇ発現を抑制する製剤が乾癬病の治療薬品の製造における使用。

【請求項4】

皮膚組織の交感神経の活性を除去または抑制するための製剤は、６－ＯＨＤＡであることを特徴とする請求項２に記載のＣＡＭＫ２Ｇ発現を抑制する製剤が乾癬病の治療薬品の製造における使用。

【請求項5】

前記皮膚組織の交感神経の活性を除去または抑制することは、皮膚中の交感神経がノルエピネフリンを分泌することを抑制することによって実現されることを特徴とする請求項２に記載のＣＡＭＫ２Ｇ発現を抑制する製剤が乾癬病の治療薬品の製造における使用。

【請求項6】

前記皮膚組織の交感神経の活性を除去または抑制することは、皮膚中のチロシンヒドロキシラーゼの成長または増加を抑制することを含むことを特徴とする請求項２に記載のＣＡＭＫ２Ｇ発現を抑制する製剤が乾癬病の治療薬品の製造における使用。

【請求項7】

前記ＣＡＭＫ２Ｇ発現を抑制する製剤は、ＡＤＲＢ２を抑制できることを特徴とする請求項１に記載のＣＡＭＫ２Ｇ発現を抑制する製剤が乾癬病の治療薬品の製造における使用。

【請求項8】

前記ＡＤＲＢ２抑制剤は、ＩＣＩ １１８５５１であることを特徴とする請求項７に記載のＣＡＭＫ２Ｇ発現を抑制する製剤が乾癬病の治療薬品の製造における使用。

【請求項9】

前記ＣＡＭＫ２Ｇ発現を抑制する製剤は、皮膚におけるｐ３８リン酸化を抑制できることを特徴とする請求項１に記載のＣＡＭＫ２Ｇ発現を抑制する製剤が乾癬病の治療薬品の製造における使用。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、乾癬病の治療薬品の技術分野に属し、具体的に、ＣＡＭＫ２Ｇ発現を抑制する製剤及びその製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用する応用に関するものである。

【背景技術】

【0002】

乾癬病（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）は、慢性炎症性皮膚病であり、免疫細胞浸潤、表皮過形成（Ｅｐｉｄｅｒｍｉｃ Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）及びケラチン細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）の分化が異常であるという特徴を有している。以前の研究によると、ケラチン細胞と免疫細部の相互作用によりサイトカインネットワーク（ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｎｅｔｗｏｒｋ）が形成される。特に、ＩＬ－１７と後続の信号カスケード（ｓｉｇｎａｌ ｃａｓｃａｄｅ）により乾癬病の発展が促進される。乾癬病の多遺伝子遺伝性（Ｐｏｌｙｇｅｎｉｃ ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ）は、その病気の病因が炎症、細胞の増殖及びアポトーシス、神経心理学的要因（Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ）等のいろいろな要因に係っていることを反映する。遺伝的感受性（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）はどうして乾癬病の発展に影響を与えるか、特にどの細胞の種類が乾癬病の特異性遺伝子の変異に係っているかはまだ把握していない。従来のゲノム全体関連研究（ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ、ＧＷＡＳ）とｍｅｔａ分析方法により乾癬病のいろいろな感受性遺伝子（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｇｅｎｅ）を見つけた。その乾癬病の感受性遺伝子の変異の研究において、乾癬病の感受性遺伝子と疾病表現、リスク、メカニズムに関する事項を複数回言及することがある。例えば、遺伝子型表現型（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）に関する研究によると、ｒｓ１０８５２９３６が早期発病型乾癬病（発病年齢＜４０歳）に係っており、ｒｓ７２４７４２２４（ＧＪＢ２）は平常の乾癬病の臨床特性に係っており、ｒｓ１０２０７６０（ＮＦＫＢ１）は家族成員が陽性である乾癬病に係っていることが分かった。遺伝子と遺伝子の相互作用（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）、例えばＭＨＣ－ＬＣＥインタラクティブ（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ）、ＭＨＣ－ＩＬ１２Ｂインタラクティブは乾癬病の発病のリスクを増加させるおそれがある。感受性遺伝子はいろいろな乾癬病共存（ｃｏｍｏｒｂｉｄｉｔｙ）または他の免疫性疾病に係っている。例えば、乾癬病とＳＬＥの共通感受性部位（Ｃｏｍｍｏｎ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｓｉｔｅ）を研究することにより、ＮＦＫＢＩＡとＩＬ２８ＲＡは２つの疾病においてゲノム全体関連性（Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）の顕著レベル（ｃｏｎｓｐｉｃｕｏｕｓｎｅｓｓ ｌｅｖｅｌ）に達することが分かることができる。機能性研究によると、多数の感受性遺伝子は、特定性、適応性及び先天性免疫経路（Ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｐａｔｈｗａｙ）に係っている遺伝子の付近に位置していることが分かることができる。その遺伝子は、抗原プレゼンテーション（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ、ＨＬＡ－Ｃ、ＥＲＡＰ１）、ＩＬ－１７／２３軸方向活性化（Ａｘｉａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＴＲＡＦ３ＩＰ２）、先天性抗ウイルス免疫（Ｉｎｎａｔｅ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）／Ｉ型インターフェロン信号（Ｔｙｐｅ Ｉ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｓｉｇｎａｌ）の伝動（ＲＮＦ１１４、ＩＦＩＨ１）及び肌バリア機能（Ｓｋｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ、ＬＣＥ３Ｂ／３Ｄ）等を含む。

【0003】

乾癬病は、複雑な疾病であり、１つの要因により形成されるものでない。疾病の固有の病因及び調節メカニズム（ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）と、いろいろな要因が各疾病において占めているウエート（ｗｅｉｇｈｔ）とを見つけることは、疾病の病因を有効に検出する基礎と先決条件である。ゲノム変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）は、疾病を研究する前提であり、疾病の病因を研究する重要な源流である。しかしながら、現在、いろいろな感受性遺伝子のダウンストリームメカニズム（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）を検出する方法は依然として少ない。遺伝子の関連分析により疾病の特徴に関する提示性情報を獲得することができるが、その提示性情報は遺伝子の機能方面の初歩的な判断にしか過ぎないものであり、タンパク、細胞動物モデル（Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ）のレベル及び組織サンプルレベル（Ｔｉｓｓｕｅ ｓａｍｐｌｅ ｌｅｖｅｌ）により乾癬病中の感受性遺伝子の作用メカニズムを更に解析することにより獲得するものでない。したがって、乾癬病の発病メカニズムをはんだんすることができず、乾癬病に効く薬剤を提供することができない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明は、遺伝学（ｇｅｎｅｔｉｃｓ）に基づいて乾癬病に多く係っている感受性部位を見つけ、多機能性技術を採用することにより、タンパク、細胞動物モデル及び組織サンプルレベルにより、乾癬病中の感受性遺伝子ＣＡＭＫ２Ｇの作用メカニズムを更に解析する。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明の目的は、ＣＡＭＫ２Ｇ発現を抑制する製剤及び、その製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用する応用を提供することにある。

【0006】

前記ＣＡＭＫ２Ｇ発現はＣＡＭＫ２Ｇ転写と／或いはＣＡＭＫ２Ｇ転写が実施された後のｍＲＮＡ翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）を含む。

【0007】

本発明の実施例において、乾癬病患者の末梢血中のＣＡＭＫ２Ｇ転写レベルは健康対照物より随分高く、乾癬病ネズミの末梢血中のＣＡＭＫ２Ｇ転写レベルも健康対照物より高く、かつ乾癬病患者の末梢血中のＣＡＭＫ２Ｇ＋細胞比例は健康対照物より随分高い。

【0008】

本発明の目的は、ＣａＭＫ２γの蛋白質活性（Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を抑制する製剤及び、その製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用する応用を更に提供することにある。

【0009】

本発明の具体的な実施例において、乾癬病ネズミの皮膚中のＣａＭＫ２γ総蛋白質のレベルとリン酸化活性蛋白質のレベルはいずれも、健康対照物より高い。すなわち、乾癬病患者のＣａＭＫ２γ総蛋白質のレベルとリン酸化の活性状態はいずれも、健康対照物より高い。

【0010】

本発明の目的は、好中球がＮＥＴｓを放出することを抑制する製剤及び、その製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用する応用を更に提供することにある。

【0011】

本発明の実施例において、乾癬病患者の好中球のＣａＭＫ２γ平均蛍光強度（ＭＦＩ）は健康対照物より随分高いが、単核細胞（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ、ＣＤ１４＋）と複数個のＴ細胞亜集団（ｃｅｌｌ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）はほぼ変わっていない。循環システムにおいてＣａＭＫ２γをオーバー発現する細胞は主として、好中球である。乾癬病患者の好中球のＣａＭＫ２γ平均蛍光強度（ＭＦＩ）は健康対照物より随分高いが、単核細胞（ＣＤ１４＋）と複数個のＴ細胞亜集団はほぼ変わっていない。乾癬病患者の血液の好中球中のＣＡＭＫ２Ｇの転写レベルは健康対照物より随分高い。

【0012】

本発明の目的は、γδＴ細胞を除去する製剤またはγδＴ細胞の成長を抑制する製剤及び、その製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用する応用を更に提供することにある。

【0013】

前記γδＴ細胞は皮下γδＴ細胞である。

【0014】

本発明の具体的な実施例において、ＩＭＱに処理されたＷＴネズミの背中の皮膚において、ＩＬ－１７Ａは主として、皮下γδＴ細胞により形成され、ＩＬ－１７Ａは表皮γδＴ細胞とαβＴ細胞において発現をほぼしない。ＩＭＱに処理されたＣａｍｋ２ｇ^－／－ネズミにおいて、ＩＬ－１７Ａ＋皮下γδＴ細胞はＩＭＱに処理されたＷＴネズミよりずいぶん少ないが、ＩＬ－１７Ａ＋表皮γδＴ細胞とＩＬ－１７Ａ＋ αβＴ細胞は変わっていない。

【0015】

本発明の具体的な実施例において、γδＴ細胞の欠陥があるネズミ（Ｔｃｒｄ^－／－）の皮下にＳＡＬを注射する。γδＴ細胞がないことにより、ＳＡＬが乾癬病表現と炎症浸潤（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を促進する作用は相殺される。

【0016】

本発明の目的は、皮膚組織の交感神経の活性を除去または抑制する製剤及び、その製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用する応用を更に提供することにある。

【0017】

前記皮膚組織の交感神経の活性を除去または抑制する製剤は６－ＯＨＤＡである。

【0018】

本発明の実施例において、皮膚組織のＣａＭＫ２γは主として、交感神経線維において発現をし、乾癬病患者の皮膚中のＣａＭＫ２γ＋交感神経は健康の皮膚の交感神経より多い。皮膚の交感神経はＩＭＱに誘導されたネズミ乾癬病サンプルの表現を除去するか或いは減少させる。交感神経が除去された交感神経の皮膚中のＩＬ－１７Ａ＋ γδＴ細胞は減少し、それは交感神経がγδＴ細胞を調節するとともにＩＬ－１７を形成することにより乾癬病サンプルの炎症に影響を与えることを反映する。

【0019】

本発明の具体的な実施例において、６－ＯＨＤＡに誘導されたＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞が破損されることにより細胞内のＴＨ転写レベルは低下し、ＣＡＭＫ２Ｇ遺伝子がノックアウトされることによってもＴＨ転写レベルは低下するおそれがある。６－ＯＨＤＡに誘導されたＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞が破損されることによりＣＡＭＫ２Ｇ発現に顕著な影響を与えない。

【0020】

本発明の目的は、皮膚中の交感神経がノルエピネフリン（Ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）を分泌することを抑制する製剤及び、その製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用する応用を更に提供することにある。

【0021】

本発明の具体的な実施例において、皮下（ｈｙｐｏｄｅｒｍｉｃ）にＮＥを注射することによりＩＭＱに誘導された乾癬病サンプルの表現を増加させ、ネズミ皮膚中のＩＬ－１７Ａ＋ γδＴ細胞の比例を増加させる。ＮＥを注射することはＣＡＭＫ２ＧがないことによりＩＬ－１７Ａ＋ γδＴ細胞が減少することを相殺する。ＮＥを注射した後、ＩＭＱに誘導されたＷＴとＣａｍｋ２ｇ^－／－ネズミの皮膚厚さの不均等が消える。

【0022】

本発明の目的は、皮膚中のチロシンヒドロキシラーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ、ＴＨ）の成長または増加を抑制する製剤及び、その製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用する応用を更に提供することにある。

【0023】

本発明の具体的な実施例において、ＴＨとｐＴＨは大幅に低下することは皮膚の局部の交感神経が不活性状態（ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）になることを反映する。

【0024】

本発明の目的はＡＤＲＢ２抑制剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用する応用を更に提供することにある。

【0025】

前記ＡＤＲＢ２抑制剤はＩＣＩ １１８５５１である。

【0026】

本発明の具体的な実施例において、ＩＣＩを注射することによりネズミの乾癬病表現（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）は低下し、ＩＭＱに誘導されたネズミの皮膚にＩＣＩを注射することにより皮膚のγδＴ－１７細胞の比例を低減する。

【0027】

本発明の目的は、ｐ３８リン酸化を抑制する製剤及び、その製剤を乾癬病の治療薬品の製造に使用する応用を更に提供することにある。

【0028】

本発明の具体的な実施例において、ＳＡＬ処理によりＩＭＱに誘導された皮膚中のｐ３８の活性化を増強し、ＩＣＩ処理の抑制作用が証明される。Ｃａｍｋ２ｇ^－／－ネズミの皮膚中のｐ３８リン酸化が抑制され、ＮＥを注射することによりｐ３８リン酸化を増加させるとともに回復させる。

【発明の効果】

【0029】

本発明の実施例において、本発明の製剤は皮膚の交感神経内のＣＡＭＫ２Ｇの異常活性化によりγδＴ 細胞ＩＬ－１７の分泌を刺激することを有効に抑制し、それにより乾癬病皮膚の部位ＩＬ－１７の調節による免疫反応を減少させ、乾癬病を治療する効果を獲得することができる。また、循環システムの好中球ＮＥＴｓの形成を低減し、病状が厳しくなることを抑制し、免疫不全症（Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｄｉｓｅａｓｅ）を治療する効果を獲得することができる。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1】本発明の実施例に係る設計を示す流れ図である。

【図2A】乾癬病患者の末梢血中のＣＡＭＫ２Ｇ転写レベルを示す図である。

【図2B】乾癬病患者の末梢血中のＣＡＭＫ２Ｇ＋細胞比例を示す図である。

【図2C】乾癬病ネズミの末梢血中のＣａｍｋ２ｇ転写レベルを示す図である。

【図2D】乾癬病ネズミの皮膚中のＣａＭＫ２γの総蛋白質のレベルとリン酸化活性蛋白質のレベルを示す図である。

【図3A】ＣａＭＫ２γが皮膚神経において発現をすることを示す図である。

【図3B】乾癬病患者の皮膚中のＣａＭＫ２γ＋交感神経の状況を示す図である。

【図4A】循環システムにおいてＣａＭＫ２γをオーバー発現する細胞の状況を示す図である。

【図4B】乾癬病患者の好中球のＣａＭＫ２γの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す図である。

【図4C】乾癬病患者の血液の好中球のＣＡＭＫ２Ｇの転写レベルを示す図である。

【図4D】乾癬病患者の血液の好中球のＣａＭＫ２γ総蛋白質のレベルとリン酸化の活性状態を示す図である。

【図5A】Ｃａｍｋ２ｇ^－／－ネズミの皮膚セクションのＨ＆Ｅ染色を示す図である。

【図5B】Ｃａｍｋ２ｇ^－／－ネズミのＰＡＳＩ評価結果を示す図である。

【図5C】乾癬病皮膚病変中の炎症浸潤細胞のフロー分類方法を示す図である。

【図5D】ＩＭＱに誘導されたＣａｍｋ２ｇ^－／－ネズミの背中の皮膚の炎症浸潤細胞の状況を示す図である。

【図5E】Ｃａｍｋ２ｇ^－／－ネズミの皮膚のマーカー炎症因子遺伝子のエクスプレッション発現状況を示す図である。

【図6A】フロー検査によりＩＭＱ処理後のＷＴネズミの背中の皮膚においてＩＬ－１７Ａが細胞をエクスプレッション発現することを測定することを示す図である。

【図6B】フローサイトメトリーによりいろいろなネズミモデルの細胞状況を分析することを示す図である。

【図6C】ＩＭＱに処理されるＣａｍｋ２ｇ^－／－ネズミのＩＬ－１７Ａ＋皮下γδＴ細胞の状況を示す図である。

【図6D】ＩＭＱに処理されるＣａｍｋ２ｇ^－／－ネズミのＩＬ－１７Ａ＋皮下γδＴ細胞の状況を示す図である。

【図6E】ＩＭＱに処理されるＣａｍｋ２ｇ^－／－ネズミのＩＬ－１７Ａ＋ αβＴ細胞の状況を示す図である。

【図7A】ＩＭＱ処理が実施されるＣａｍｋ２ｇ^－／－ネズミの皮膚のＴＨリン酸化の状況を示す図である。

【図7B】ＩＭＱ処理後のＣａｍｋ２ｇ^－／－ネズミの皮膚中のノルアドレナリン（ＮＥ）のレベルを示す図である。

【図7C】ＩＭＱ処理後のＣａｍｋ２ｇ^－／－ネズミの皮膚中のドーパミンのレベルを示す図である。

【図7D】皮下にＮＥを注射することとＩＭＱでネズミ乾癬病サンプルの表現を誘導する実験を示す流れ図である。

【図7E】皮下にＮＥを注射したネズミ皮膚中のＩＬ－１７Ａ＋ γδＴ細胞の比例を示す流れ図である。

【図7F】皮下にＮＥを注射したネズミと、ＣＡＭＫ２ＧがないことによりＩＬ－１７Ａ＋ γδＴ細胞の変化状況を示す図である。

【図7G】皮下にＮＥを注射した後、ＩＭＱの誘導によりＷＴネズミとＣａｍｋ２ｇ^－／－ネズミの皮膚の厚さが厚くなることを示す図である。

【図8A】ＩＭＱ処理前にネズミの皮下に６－ＯＨＤＡを注射することを示す図である。

【図8B】免疫蛍光方法により皮下に６－ＯＨＤＡを注射したネズミの皮膚組織の交感神経の分布を獲得した後、その分布を示す図である。

【図8C】ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ測定方法により皮下に６－ＯＨＤＡを注射したネズミのＴＨとｐＴＨ発現状況を獲得した後、その状況を示す図である。

【図8D】皮下に６－ＯＨＤＡを注射するネズミの皮膚の表現を示す図である。

【図8E】皮下に６－ＯＨＤＡを注射したネズミの乾癬病サンプルの表現を示す図である。

【図8F】皮下に６－ＯＨＤＡを注射したネズミの皮膚中のＩＬ－１７Ａ＋ γδＴ細胞の状況を示す図である。

【図8G】皮下に６－ＯＨＤＡを注射したネズミの皮膚中のＮＥ状況を示す図である。

【図9A】６－ＯＨＤＡに誘導されるＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の破損と細胞内のＴＨ転写レベルを示す図である。

【図9B】６－ＯＨＤＡに誘導されたＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の破損によりＣＡＭＫ２Ｇ発現に影響を与えることを示す図である。

【図9C】６－ＯＨＤＡに誘導されるＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の破損によりＣＡＭＫ２Ｇの総蛋白質とリン酸化レベルに影響を与えることを示す図である。

【図10A】ＩＭＱに誘導される乾癬病ネズミの皮膚組織のＲＮＡ測定の状況を示す図である。

【図10B】乾癬病患者の皮膚病変と健康対照物の皮膚に対して免疫組織化学分析を実施してえた結果を示す図である。

【図10C】ＩＬ－１７を発現する細胞がβ２－ＡＲを発現することを示す図である。

【図10D】ＩＭＱ処理によりネズミ皮膚中のβ２－ＡＲ＋ Ｔ細胞の比例が変化することを示す図である。

【図11A】ＩＭＱに誘導されるネズミの皮下にＳＡＬを注射することを示す図である。

【図11B】ＳＡＬを注射しかつＩＭＱに誘導されるネズミの皮膚の状況を示す図である。

【図11C】ＳＡＬを注射しかつＩＭＱに誘導されるネズミの背中の皮膚の厚さ、紅斑及びスケールを示す図である。

【図11D】ＳＡＬを注射しかつＩＭＱに誘導されるネズミのＩＬ－１７Ａの形成を示す図である。

【図12A】ＩＣＩを注射しかつＩＭＱに誘導されるネズミに対して実験をすることを示す流れ図である。

【図12B】ＩＣＩを注射しかつＩＭＱに誘導されるネズミの皮膚の状況を示す図である。

【図12C】ＩＣＩを注射しかつＩＭＱに誘導されるネズミの背中の皮膚の厚さ、紅斑及びスケールを示す図である。

【図12D】ＩＣＩを注射しかつＩＭＱに誘導されるネズミのγδＴ－１７細胞の比例を示す図である。

【図13A】γδＴ細胞の欠陥があるネズミ（Ｔｃｒｄ^－／－）の皮下にＳＡＬを注射した後の皮膚の表現を示す図である。

【図13B】γδＴ細胞の欠陥があるネズミ（Ｔｃｒｄ^－／－）の皮下にＳＡＬを注射した後、好中球性顆粒球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉｃ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ）の比例を示す図である。

【図13C】γδＴ細胞の欠陥があるネズミ（Ｔｃｒｄ^－／－）の皮下にＳＡＬを注射した後、単核細胞の比例を示す図である。

【図13D】γδＴ細胞の欠陥があるネズミ（Ｔｃｒｄ^－／－）の皮下にＳＡＬを注射した後、αβＴ細胞がＩＬ－１７Ａを形成することを示す図である。

【図14A】ＰＭＡとイオノマイシン（Ｉｏｎ）が一緒に刺激することによりＴ細胞の炎症前サイトカインが形成される状況を示す図である。

【図14B】ＩＣＩの刺激することによりＴ細胞の炎症前サイトカインが形成される状況を示す図である。

【図15A】ＰＭＡ／イオノにより活性化されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞において、ｐ３８、ＥＲＫ及びＪＮＫの活性化状況を示す図である。

【図15B】ＳＡＬ処理を実施した後、ＩＭＱに誘導される皮膚中のｐ３８の活性化状況を示す図である。

【図15C】ＳＡＬ処理を実施した後、ＩＭＱに誘導される皮膚中のｐ３８の活性化状況を示す図である。

【図15D】ＩＭＱ処理が実施されるＷＴネズミのｐ３８の活性化状況を示す図である。

【図16A】ＰＭＡに活性化されるＨＬ－６０細胞において、ＣａＭＫＩＩ－ＩＮ１とＫＮ９３がＭＰＯ、エラスターゼ及びＰＡＤ４の発現を抑制することを示す図である。

【図16B】ＣａＭＫ２γの活性と細胞内のＲＯＳが抑制される状況を示す図である。

【図16C】ＣａＭＫ２γの活性とＮＣＦ１、ＮＣＦ２及びＮＯＸ２のｍＲＮＡレベルが抑制されることを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0031】

以下、本発明の実施例により本発明の技術的事項を詳細に説明するが、下記実施例は本発明の例示にしか過ぎないものであるため、本発明は下記実施例の構成にのみ限定されない。この技術分野の技術者は本発明の要旨を逸脱しない範囲内において設計の改良、変更等をすることができ、それらがあっても本発明に含まれることは勿論である。

【0032】

本発明の実施例において、図１に示される流れ図により実験を実施する。

【0033】

本発明の実施例において、ＩＭＱはイミキモド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）を指し、ＩＭＱはＴｏｌｌライクレセプター（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＬＲ）７、８のアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）である。

【0034】

本発明の実施例において、「アゴニスト」という用語は、ある生物活性物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）のレセプターと結合され、その活性物質の作用を示す物質または薬品を指す。

【0035】

本発明の実施例において、「拮抗質（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）」という用語は、レセプターと結合されたが、固有活性（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を具備しないクラスＩ物質（Ｃｌａｓｓ Ｉ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）である。拮抗質は競争拮抗質（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）と非競争拮抗質（ｎｏｎｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）に分けられる。

【0036】

本発明の実施例において、「ＰＭＡ」と「イオノマイシン（Ｉｏｎ）」はジャーカット細胞（Ｊｕｒｋａｔ ｃｅｌｌ）の活性化に用いられ、活性化されるジャーカット細胞のみが炎症因子（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）をオーバー発現（ｏｖｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）することができる。

【0037】

本発明の実施例において、「ＣａＭＫ２γ」はＣＡＭＫ２Ｇ遺伝子が発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）する蛋白質プロダクツ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の一種である。

【0038】

本発明の実施例において、「ＣＡＭＫ２Ｇ＋細胞」はＣＡＭＫ２Ｇ蛋白質を発現する細胞である。

【0039】

本発明の実施例において、「ＩＭＱがＣａｍｋ２ｇ^－／－乾癬病ネズミモデルを誘導（ｉｎｄｕｃｅ）する」ということはＩＭＱに誘導されるＣＡＭＫ２Ｇ遺伝子がネズミをノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）することを指す。「ＩＭＱが誘導した野生ネズミモデル」ということはＩＭＱに誘導される野生ネズミを指す。

【0040】

実施例１
感受性遺伝子ＣＡＭＫ２Ｇの乾癬病中の発現を検出

【0041】

本発明の実施例において、感受性遺伝子（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｇｅｎｅ）ＣＡＭＫ２Ｇと乾癬病の発現の関連性を検出するため、乾癬病患者と乾癬病ネズミの血液と皮膚組織においてＣＡＭＫ２Ｇの発現状況をそれぞれ検出する。ＲＴ－ｑＰＣＲとフロー検査（Ｆｌｏｗ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）の結果によると、乾癬病患者の末梢血（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ）中のＣＡＭＫ２Ｇ転写レベル（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌ）は健康対照物より随分高く（図２Ａ）、乾癬病患者の末梢血中のＣＡＭＫ２Ｇ＋細胞比例は健康対照物より随分高く（図２Ｂ）、かつ乾癬病ネズミの末梢血中のＣＡＭＫ２Ｇ転写レベルも健康対照物より高い（図２Ｃ）ことがわかることができる。

【0042】

従来の技術文献によると、ＣＡＭＫＩＩγは多いＣａ２＋が調節する信号経路（ｓｉｇｎａｌ ｐａｔｈｗａｙ）において第二クーリエ（ｃｏｕｒｉｅｒ）の役割をする。細胞内のＣａ２＋が平常のレベルになっているとき、自身の抑制作用により休眠状態を維持し、細胞内のＣａ２＋のレベルが増加するとき、自身のリン酸化により抑制状態を解除する。Ｔｈｒ２８７部位のリン酸化はＣａＭＫ２γの活性化形式である。

【0043】

現在、リン酸化ＣａＭＫ２γ特異性を有している抗体が少ないが、ネズミ皮膚ＲＮＡ－ｓｅｑ結果によると、ＣａＭＫ２γは皮膚組織においてＣＡＭＫＩＩ家族の発現レベル（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ）が最も高い成員である。したがって、本発明の実施例において、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＣａＭＫＩＩ （Ｔｈｒ２８７）抗体により皮膚組織の活性ＣａＭＫ２γレベルを測定する。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ測定によると、乾癬病ネズミの皮膚中のＣａＭＫ２γの総蛋白質（Ｔｏｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ）のレベルとリン酸化活性蛋白質（Ａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）のレベルがいずれも健康対照物より高い（図２Ｄ）ことがわかることができる。

【0044】

実施例２
皮膚組織中のＣａＭＫ２γの発現を確定

【0045】

本発明の実施例において、ＣＡＭＫ２Ｇが皮膚組織の神経細胞（ｎｅｒｖｅ ｃｅｌｌ）においてオーバー発現をするかを検証するため、健康対照物と乾癬病患者の皮膚サンプルに対してＣａＭＫ２γ（赤色）とパンニューロンマーカー（ｐａｎ－ｎｅｕｒｏｎａｌ ｍａｒｋｅｒ）β３－ｔｕｂｕｌｉｎ（緑色）のＣＯ染色（ＣＯ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を実施する。免疫蛍光の結果によると、ＣａＭＫ２γは皮膚神経において発現をするが、神経細胞はいずれもＣａＭＫ２γ陽性であるものでない（図３Ａ）。すなわち、ＣａＭＫＩＩ家族成員は神経細胞においてオーバー発現をし、皮膚神経は交感神経（Ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ）と多種の知覚神経線維（Ｓｅｎｓｏｒｙ ｎｅｒｖｅ ｆｉｂｅｒｓ）で構成される。

【0046】

本発明の実施例において、交感神経線維（Ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ ｆｉｂｅｒ）のチロシンヒドロキシラーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ、ＴＨ）（緑色）とＣａＭＫ２γ（赤色）を識別することにより免疫蛍光ＣＯ染色（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ＣＯ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を実施する。その結果により、皮膚組織のＣａＭＫ２γは主として、交感神経線維内に発現されており、乾癬病患者の皮膚中のＣａＭＫ２γ＋交感神経（Ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ ｎｅｒｖｅｓ）は健康の皮膚より多いことがわかる（図３Ｂ）。

【0047】

実施例３
循環システム中のＣａＭＫ２γの発現を確定

【0048】

本発明の実施例において、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）により患者の末梢血ＣＤ１６＋ＣＤ６６ｂ＋好中球（ｎｅｕｔｒｏｃｙｔｅ）と非好中球（Ｎｏｎ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）ＣＤ１６＋ＣＤ６６ｂ－細胞、ＣＤ１６－ＣＤ６６ｂ－細胞中のＣａＭＫ２γの平均蛍光強度（ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、ＭＦＩ）を比較する。その結果によると、循環システムにおいてＣａＭＫ２γをオーバー発現する細胞は主として、好中球である（図４Ａ）。

【0049】

本発明の実施例において、ＣａＭＫ２γが乾癬病患者の末梢血中の複数の常用の免疫細胞（ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ）において変化することを更に測定するため、患者と健康対照物の末梢血のいろいろな免疫細胞亜集団に対してフローサイトメトリー分析をする。その結果によると、乾癬病患者の好中球のＣａＭＫ２γの平均蛍光強度（ＭＦＩ）は健康対照物よりずいぶん高いが、単核細胞（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ、ＣＤ１４＋）と複数個のＴ細胞亜集団（ｃｅｌｌ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）はほぼ変わっていない（図４Ｂ）。

【0050】

本発明の実施例において、乾癬病患者の循環システムにおいて好中球内のＣＡＭＫ２Ｇ発現が変化することを更に測定するため、磁気ビーズ選別（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄ ｓｏｒｔｉｎｇ）方法により、乾癬病患者と健康対照物の血液において高純度の好中球をそれぞれ選別する。ＲＴ－ｑＰＣＲ測定によると、乾癬病患者の血液の好中球のＣＡＭＫ２Ｇの転写レベルは健康対照物より随分高い（Ｐ＝０．００７９）（図４Ｃ）。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ測定によると、乾癬病患者のＣａＭＫ２γ総蛋白質のレベルとリン酸化の活性状態はいずれも、健康対照物より高いことが分かることができる（図４Ｄ）。

【0051】

実施例４
ＩＭＱに誘導されたＣａｍｋ２ｇ^－／－乾癬病ネズミモデルを形成する

【0052】

本発明の実施例において、乾癬病中のＣＡＭＫ２Ｇの作用メカニズムを更に研究するため、ＩＭＱに誘導されたＣａｍｋ２ｇ^－／－乾癬病ネズミモデルを形成する。

【0053】

本発明の実施例において、ＩＭＱに誘導されたＣａｍｋ２ｇ^－／－乾癬病ネズミモデルを形成するステップは、７歳のＷＴ（ｎ＝５）またはＣａｍｋ２ｇ^－／－ネズミ（ｎ＝５）の背中の毛を剃ることにより、サイズが２ｃｍ×２ｃｍである背中の皮膚を露出させるステップを含む。６２．５ｍｇのＩＭＱ乳化性ペースト（ｅｍｕｌｓｉｆｉａｂｌｅ ｐａｓｔｅ）または対照品（ｐｌａｃｅｂｏ）ＶＡＳをネズミの露出皮膚に均等に塗布し、それを４日間続けるとともに毎日ＰＡＳＩ評価を実施する。５日目はネズミに対してユーサネイジア（ｅｕｔｈａｎａｓｉａ）を実施した後、ネズミの皮膚、脾臓及び血液を取って測定する。

【0054】

本発明の実施例において、皮膚組織は、１０％のフォルマリン（Ｆｏｒｍａｌｉｎ）で固定させ、パラフィン包埋（ｐａｒａｆｆｉｎ ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）を実施し、４μｍのセクション（ｓｅｃｔｉｏｎ）を獲得した後、Ｈ＆Ｅ染色を実施する。

【0055】

本発明の実施例において、Ｈ＆Ｅ染色の画像はバーチカル顕微鏡（ｖｅｒｔｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５３）により１０倍に拡大して獲得するものである。

【0056】

本発明の実施例において、ネズミモデルの炎症を評価する方法は臨床ＰＡＳＩ評価方法により発明した客観的評価システムである。紅斑（ｅｒｙｔｈｅｍａ）、スケール及び厚さの増加を０～４で評価することができる。０は病症がないことを反映し、１は病症が軽いことを反映し、２は病症が中度であることを反映し、３は病症が明確であることを反映し、４は病症が厳しいことを反映する。紅斑の強度を表示するスコアカード（ｓｃｏｒｅｃａｒｄ）により紅斑の程度を評価することができる。総合的な評価（紅斑＋スケール＋厚さの増加）を、炎症の程度を表す数値にすることができる（０～１２で評価する）。

【0057】

皮膚セクションのＨ＆Ｅ染色とＰＡＳＩ評価結果により、ＩＭＱに誘導されたＣａｍｋ２ｇ^－／－ネズミモデルとＩＭＱに誘導された野生ネズミを比較してみると、Ｃａｍｋ２ｇ^－／－ネズミの乾癬病サンプルの表現が大幅に低下することが分かることができる。それは、ネズミの背中の皮膚厚さが減少し、紅斑とスケールが減少することを反映する（図５Ａ、図５Ｂ）。

【0058】

本発明の実施例において、特定の標識抗体（Ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）により分離後のネズミの免疫細胞を分類する。単核細胞と好中球は乾癬病皮膚病変（ｓｋｉｎ ｌｅｓｉｏｎｓ）中の炎症浸潤細胞（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）である（図５Ｃ）。フロー検査の結果によると、ＩＭＱに誘導されたＣａｍｋ２ｇ^－／－ネズミの背中の皮膚の炎症浸潤が大幅に減少することが分かることができる（図５Ｄ）。

【0059】

本発明の実施例において、皮膚免疫細胞を分離することは、皮膚を充分にカットするステップと、消化酵素（ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ）において３７℃の温度と２２５ｒｐｍの回転速度により消化を１．５ｈ実施するステップと、消化を３０分更に実施する。消化酵素は、１．２ｇのＢＳＡ（Ｂｉｏｆｏｘｘ、４２４０ＧＲ１００）、０．１２ｇの１型コラゲナーゼ（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｔｙｐｅ １）（Ｓｉｇｍａ、Ｃ０１３０－５Ｇ）、０．０６ｇの４型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、ＬＳ００４１８９）及び０．０６ｇのヒアルロニダーゼ（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ）（Ｓｉｇｍａ、Ｈ３５０６－５Ｇ）を３０ｍｌのＤＭＥＭ（ＨｙＣｌｏｎｅ、ＳＨ３００２２．０１）に溶解させた後、１ｍｇ／ｍｌであるＤＮａｓｅ（Ｙｕａｎｙｅ、Ｓ１００７３）を１５０μｌ添加することにより獲得することができる。消化が終わると、細胞懸濁液（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）を７０－μｍのフィルターで濾過する。細胞懸濁液を温度が４℃でありかつ回転速度が２０００ｒｐｍである遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）装置に送入して８ｍｉｎの遠心分離を実施した後、スーパーネイト（ｓｕｐｅｒｎａｔｅ）を除去することにより細胞粒子を収集する。細胞は容量が６ｍｌでありかつ濃度が４０％であるリンパ細胞（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）分離液体（５．４ｍｌのＰｅｒｃｏｌｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７－０８９１－０９）＋５２０μｌ Ｈａｎｋ‘ｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ、Ｃ０２１９）＋４４μｌ ２×Ｈｅｐｅｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、Ｈ１０８０－１００）＋８．９４６ｍｌ ＰＢＳ）に浮かんでいる。つぎに、容量が６ｍｌでありかつ濃度が８０％であるリンパ細胞分離液体（５．４ｍｌ Ｐｅｒｃｏｌｌ＋５２０μｌ Ｈａｎｋ‘ｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ＋４４μｌ ２×Ｈｅｐｅｓ Ｂｕｆｆｅｒ＋１．４９１ｍｌ ＰＢＳ）を容器の内壁に沿って容器にゆっくり注ぐことにより液体を二層に分離させる。分離液体を温度が４℃でありかつ回転速度が２０００ｒｐｍである遠心分離装置に送入して２０ｍｉｎの遠心分離を実施し、遠心揚力（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｌｉｆｔｉｎｇ ｆｏｒｃｅ）を最小にする。遠心分離後の液体は４層に分離され、上から下への順に沿う各層はそれぞれ、４０％のリンパ細胞分離液体、リンパ細胞、８０％のリンパ細胞分離液体及び細胞フラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）である。リンパ細胞を新しい遠心管（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｔｕｂｅ）にゆっくり転移させた後、１０ｍｌのＰＢＳでリンパ細胞をよく洗浄する。溶液を温度が４℃でありかつ回転速度が２０００ｒｐｍである遠心分離装置により８ｍｉｎの遠心分離を実施した後、スーパーネイトを除去することにより細胞粒子を収集する。つぎに、各細胞膜（ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ）の表面抗体（Ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を１μｌを取って５０μｌのＰＢＳに送入することにより細胞と混合させ、室内の暗室においてインキュベーションを３０ｍｉｎ実施する。３ｍｌのＰＢＳで細胞を洗浄する。温度が４℃でありかつ回転速度が２０００ｒｐｍである遠心分離装置により５ｍｉｎの遠心分離を実施した後、スーパーネイトを除去することにより細胞粒子を収集する。測定をする前、細胞の体積により細胞を３００～６００μｌのＰＢＳに浮かべる。細胞内抗体（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を染色させる必要がある場合、細胞沈殿物に１ｍｌの細胞透過剤（Ｃｅｌｌ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｒ）（固定／浸透用高濃度液体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、００－５１２３－４３）：ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍ希釈剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、００－５２２３－５６）＝１：３）を直接に添加し、室内の暗室においてインキュベーションを６０ｍｉｎ実施する。５０μｌのＰＢＳに適量の細胞内抗体を添加することによりそれと細胞を混合させ、室内の暗室に４０ｍｉｎ保存する。３ｍｌのＰＢＳで細胞を洗浄する。温度が４℃でありかつ回転速度が２０００ｒｐｍである遠心分離装置により５ｍｉｎの遠心分離を実施した後、スーパーネイトを除去することにより細胞粒子を収集する。測定をする前、細胞の体積により細胞を３００～６００μｌのＰＢＳに浮かべる。

【0060】

本発明の実施例において用いる表面抗体（Ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、ＣＤ４５－ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＲＥＦ１１－０４５１－８２）、ＣＤ１１ｂ ＰＥ－Ｃｙ７（ＢＤ、５５２８５０）、ＬＹ－６Ｇ－ＢＶ６０５（ＢＤ、５６３００５）、Ｌｙ－６Ｃ ＰＥ（ＢＤ、５６０５９２）、ＣＤ１１Ｃ ＰＥ－ＣＦ５９４（ＢＤ、５６２４５４）がある。

【0061】

本発明の実施例において、乾癬病と関係が密接でありかつ乾癬病皮膚病変において発現が高い既知の抗炎症遺伝子（ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｇｅｎｅｓ）に対して定量のＰＣＲを実施する。すなわち、Ｉｌ１７ａ、Ｉｌ１７ｆ、Ｉｌ６、Ｉｌ２２、ＩＬ１ｂ及びＴｎｆａを実施する。その結果によると、Ｃａｍｋ２ｇ^－／－ネズミの皮膚のマーカー遺伝子（ｍａｒｋｅｒ ｇｅｎｅ）の発現が大幅に低下することが分かることができる（図５Ｅ）。

【0062】

実施例５
ＣａＭＫ２γで乾癬病ネズミ皮膚中のγδＴ－１７細胞を制御する

【0063】

好中球と単核細胞を乾癬病病変部位に集めることは乾癬病病因の特徴である。従来の技術文献によると、好中球と単核細胞は臨界効果（ｃｒｉｔｉｃａｌ ｅｆｆｅｃｔ）のサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）ＩＬ－１７に駆動されうものである。ＩＬ－１７はいろいろな細胞種類、例えばＴｈ１７細胞、Ｔｃ１７細胞、γδ Ｔ－１７細胞、ＩＬＣ３等により放出されることができる。

【0064】

本発明の実施例において、ＩＭＱ処理後のＷＴネズミの背中の皮膚に対してフロー検査をする。フロー検査の結果によると、ＩＭＱ処理が実施されたＷＴネズミの背中の皮膚において、ＩＬ－１７Ａは主として皮下γδＴ細胞により形成され、ＩＬ－１７Ａは表皮γδＴ細胞とαβＴ細胞において発現をほぼしないことが分かることができる（図６Ａ）。

【0065】

本発明の実施例において、ＣａＭＫ２γがＩＭＱ処理後のネズミの皮膚中のＩＬ－１７の形成に影響を与えるかを判断するため、フローサイトメトリー分析によりＩＬ－１７＋細胞がいろいろな皮膚のＴ細胞亜集団中の比例を分析する。その結果は図６Ｂに示すとおりである。ＩＭＱに処理されるＣａｍｋ２ｇ^－／－ネズミのＩＬ－１７Ａ＋皮下γδＴ細胞はＩＭＱに処理されるＷＴネズミよりずいぶん少なく（図６Ｃ）、ＩＬ－１７Ａ＋皮下γδＴ細胞とＩＬ－１７Ａ＋ αβＴは変わっていない（図６Ｄ、図６Ｅ）。

【0066】

実施例６
皮膚のＣａＭＫ２γ＋交感神経でγδＴ－１７細胞を制御する

【0067】

従来の技術文献によると、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）は、カテコールアミン（ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅ、ドーパミン（ｄｏｐａｍｉｎｅ、ＤＡ）、ノルアドレナリン（Ｎｏｒａｄｒｅｎａｌｉｎｅ、ＮＥ）及びアドレナリン（ａｄｒｅｎａｌｉｎｅ））の生合成（ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）中の速度制限酵素（ｒａｔｅ－ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）であり、皮膚中の交感神経を鑑別することに用いられる。ＣａＭＫＩＩ家族成員はニューロン集団（Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）においてＴＨリン酸化を刺激することによりカテコールアミンの生合成の制御に制御する。

【0068】

本発明の実施例において、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ測定によると、ＩＭＱ処理によりネズミの皮膚のＴＨリン酸化が大幅に増加するが、ＣＡＭＫ２ＧがないことによりＴＨリン酸化の増加が抑制されることがわかることができる（図７Ａ）。

【0069】

本発明の実施例において、ＥＬＩＳＡによりネズミの皮膚中のカテコールアミンの神経伝達物質（ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ）の分泌を測定する。その結果によると、ＩＭＱ処理後のＣａｍｋ２ｇ^－／－ネズミの皮膚中のＮＥレベルはＷＴネズミより低いが、皮膚中のドーパミンが変わっていないことが分かることができる（図７Ｂ、図７Ｃ）。

【0070】

本発明の実施例において、皮下にＮＥを注射することによりＩＭＱに誘導された乾癬病サンプルの表現を増加させ、ネズミ皮膚中のＩＬ－１７Ａ＋ γδＴ細胞の比例を増加させる。ＮＥを注射することはＣＡＭＫ２ＧがないことによりＩＬ－１７Ａ＋ γδＴ細胞が減少することを相殺し（図７Ｄ、図７Ｅ／図７Ｆ）、交感神経は皮膚中のＮＥの重要な出所であることを反映する。

【0071】

本発明の実施例において、ＮＥを注射した後、ＩＭＱに誘導されたＷＴとＣａｍｋ２ｇ^－／－ネズミの皮膚厚さの不均等が消える（図７Ｇ）。それは、ＣａＭＫ２γでＩＭＱに誘導された皮膚炎症を制御することは皮膚の交換神経がＮＥを分泌することに係っており、皮膚中のＣａＭＫ２γ＋交換神経はＮＥを分泌することにより一部分のγδＴ細胞ＩＬ－１７Ａの形成を調節することを反映する。

【0072】

実施例７
皮膚の交感神経の除去がネズミモデルの乾癬病表現に与える影響

【0073】

従来の技術文献によると、６－ヒドロキシドパミン（６－ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ、６－ＯＨＤＡ）は、カテコールアミン作動性ニューロン（ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ）の選択的神経毒（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ）であり、交感神経の除去に用いられる。腹腔（ａｂｄｏｍｉｎａｌ ｃａｖｉｔｙ）に６－ＯＨＤＡを注射することにより、ＩＭＱに誘導される耳浮腫（ｅａｒ ｅｄｅｍａ）を減少させることができるが、ＩＬ－１７Ａの形成に影響を与えない。その原因は心血管効果（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｆｆｅｃｔｓ）と／或いは全身性交感神経の除去により生ずる全身性免疫障害（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）にある。

【0074】

本発明の実施例において、皮膚の局部の交感神経を切除することにより乾癬病ネズミに与える影響を観察するため、ＩＭＱ処理前にネズミの皮下に６－ＯＨＤＡを注射する（図８Ａ）。免疫蛍光とｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ測定の結果によると、ＴＨとｐＴＨ（副甲状腺ホルモン、ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ）が大幅に低下することが分かることができ、それは皮膚の局部の交感神経不活性状態になることを反映する（図８Ｂ、図８Ｃ）。後続の研究によると、皮膚の局部の交感神経が除去されることによりＩＭＱに誘導されたネズミの乾癬病サンプルの表現が減少することが分かることができる（図８Ｄ、図８Ｅ）。交感神経が除去される皮膚中のＩＬ－１７Ａ＋ γδＴ細胞が減少することは、皮膚の交感神経がγδＴ細胞を調節することによりＩＬ－１７の形成を調節しかつ乾癬病サンプルの皮膚の炎症に影響を与えることを反映する（図８Ｆ）。交感神経が除去される皮膚中のＮＥが減少することは、交感神経がＮＥを分泌することによりγδＴ細胞ＩＬ－１７の形成を調節することを反映する（図８Ｇ）。

【0075】

実施例８
ＣＡＭＫ２Ｇ遺伝子がノックアウトされることにより６－ＯＨＤＡが破損されたＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞に与える影響

【0076】

本発明の実施例において、ＣａＭＫ２γが交感神経内のＴＨの発現に直接に影響を与えるかを更に測定するため、ＲＮＡｉ方法によりヒト神経芽細胞（ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ）内のＣＡＭＫ２Ｇをノックダウン（ｋｎｏｃｋ－ｄｏｗｎ）する。ＳＨ－ＳＹ５Ｙは分化程度が低い腫瘤細胞であり、ＳＨ－ＳＹ５Ｙとドーパミン作動性ニューロン（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ）の形状、生理及び生化学的機能（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）は類似しており、ＳＨ－ＳＹ５Ｙとドーパミン作動性ニューロンは発現ＴＨを構成することができる。ｑＰＣＲ測定の結果によると、６－ＯＨＤＡに誘導されるＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の破損により細胞内のＴＨ転写レベルが低下し、ＣＡＭＫ２Ｇ遺伝子がノックアウトされることによってもＴＨ転写レベルが低下することが分かることができる（図９Ａ）。６－ＯＨＤＡに誘導されたＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の破損によりＣＡＭＫ２Ｇ発現に顕著な影響を与えない（図９Ｂ）。本発明の実施例において、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ測定によると、ＣＡＭＫ２Ｇ遺伝子をノックアウトすることによりＣａＭＫ２γの総蛋白質のレベルとｐＴＨレベルを大幅に低減し、６－ＯＨＤＡに誘導されるＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の破損によってもＣａＭＫ２γの総蛋白質のレベルとｐＴＨレベルを低減することができる。また、６－ＯＨＤＡに誘導されるＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の破損によりＣａＭＫＩＩ家族の他の成員のリン酸化レベルも増加することができる（図９Ｃ）。

【0077】

実施例９
ＮＥレセプターの皮膚内の発現モデル

【0078】

本発明の実施例において、ＩＭＱに誘導される乾癬病ネズミの皮膚組織に対してＲＮＡ測定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）を実施する。その結果によると、ＡＤＲＢ２ （β２－ＡＲ）は皮膚中の重要なＮＥレセプター発現であることが分かることができる（図１０Ａ）。

【0079】

本発明の実施例において、乾癬病患者の皮膚病変と健康対照物の皮膚に対して免疫組織化学分析（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施する。その結果によると、β２－ＡＲが皮下部位に浸潤している免疫細胞上において発現をすることが分かることができる（図１０Ｂ）。

【0080】

本発明の実施例において、免疫蛍光とフローサイトメトリー分析によると、ＩＬ－１７を発現する大部分の細胞はβ２－ＡＲを発現し（図１０Ｃ）、ＩＭＱ処理によりネズミ皮膚中のβ２－ＡＲ＋ Ｔ細胞の比例が増加することが分かることができる（図１０Ｄ）。

【0081】

実施例１０
β２－ＡＲ活性剤（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）でネズミモデルの乾癬病表現を調節

【0082】

本発明の実施例において、ＮＥがβ２－ＡＲによりγδＴ－１７細胞に直接に影響を与えるかを更に測定するため、ＩＭＱに誘導されるネズミの皮下にサルメテロールキナフォーテ（Ｓａｌｍｅｔｅｒｏｌ ｘｉｎａｆｏａｔｅ、ＳＡＬ、それは選択的ＡＤＲＢ２アゴニストである）を注射する。健康対照物と比較してみると、ＳＡＬを注射することによりネズミの乾癬病表現は増加する。すなわち、背中の皮膚の厚さは厚くなり、紅斑とスケールは増加する（図１１Ｂ、図１１Ｃ）。ＩＭＱに誘導されたネズミの皮膚にＳＡＬを注射することによりγδＴ細胞がＩＬ－１７Ａを形成することを促進させることができる（図１１Ｄ）。

【0083】

実施例１１
β２－ＡＲ拮抗質によりネズミモデルの乾癬病表現を調節

【0084】

本発明の実施例において、ＩＭＱに誘導されるネズミの皮下にＩＣＩ １１８，５５１（ＩＣＩ、それは選択的ＡＤＲＢ２拮抗質である）を注射する。健康対照物と比較してみると、ＩＣＩが注射されることによりネズミの乾癬病表現は低下し（図１２Ｂ、図１２Ｃ）、ＩＭＱに誘導されたネズミの皮膚にＩＣＩを注射することにより皮膚のγδＴ－１７細胞の比例を低減する（図１２Ｄ）。

【0085】

実施例１２
ＮＥ－ＡＤＲＢ２信号経路でγδＴ ｃｅｌｌｓ分泌ＩＬ－１７を調節

【0086】

本発明の実施例において、γδＴ細胞の欠陥があるネズミ（Ｔｃｒｄ^－／－）の皮下にＳＡＬを注射する。γδＴ細胞がないことにより、ＳＡＬが乾癬病表現と炎症浸潤を促進する作用は相殺される（図１３Ａ、図１３Ｂ、図１３Ｃ）。ＳＡＬはαβＴ細胞がＩＬ－１７Ａを形成することに影響を与えない（図１３Ｄ）。以上のとおり、皮膚中のＮＥは主として皮膚交感神経により形成され、ＮＥ－ ＡＤＲＢ２信号経路によりγδＴ細胞がＩＬ－１７を形成するように調節する。すなわちαβＴ細胞がＩＬ－１７を形成するように調節しない。

【0087】

実施例１３
細胞モデルにおいてβ２－ＡＲの免疫調節作用（ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ）を検証

【0088】

本発明の実施例において、ＡＤＲＢ２がγδＴ細胞の炎症反応を調節することを測定するため、サルメテロールキナフォーテ（Ｓａｌｍｅｔｅｒｏｌ ｘｉｎａｆｏａｔｅ）と拮抗質 ＩＣＩ １１８５５１でＪｕｒｋａｔ細胞（永生する人のＴリンパ細胞）を刺激する。ＰＭＡとイオノマイシン（Ｉｏｎ）が一緒に刺激する場合、高濃度のＳＡＬによりＴ細胞の炎症前サイトカイン（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）ＩＬ－１７Ａ、ＴＮＦ－α及びＩＬ－２２の形成を増加させる（図１４Ａ）。逆に、ＩＣＩはサイトカインの形成を低減する（図１４Ｂ）。

【0089】

実施例１４
ＮＥ－ＡＤＲＢ２－ｐ３８信号経路の検証

【0090】

本発明の実施例において、ＰＭＡ／イオノマイシンで２ｈの活性化をしたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞において、ＳＡＬで４ｈの刺激をすることによりｐ３８リン酸化を大幅に増加させることができるが、ＩＣＩで４ｈ処理することによりｐ３８リン酸化を抑制する。しかしながら、それらはＭＡＰＫ家族の２つの成員であるＥＲＫとＪＮＫの活性化に影響を与えない。ＡＤＲＢ２でＴ細胞の活性化を調節するとき、ｐ３８リン酸化に依頼するが、ＥＲＫとＪＮＫに依頼しない。それは、従来の技術文献に記載されている、ｐ３８リン酸化は自己免疫型関節炎（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ａｒｔｈｒｉｔｉ）中のＴｈ１７細胞の増殖を促進することと一致する。ｐ３８ ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路（Ｋｉｎａｓｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ）は末梢血免疫システム中のＴ細胞の活性化と分化に影響を与える。

【0091】

本発明の実施例において、ＰＭＡ／イオノにより活性化されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞のネズミ皮膚中のｐ３８のレベルを更に測定した。その結果によると、ｐ３８リン酸化はＩＭＱにより活性化される。ＳＡＬ処理によりＩＭＱに誘導された皮膚中のｐ３８の活性化を増強することができるが、ＩＣＩ処理はそれを抑制する（図１５Ｂ、図１５Ｃ）。

【0092】

本発明の実施例において、ＰＭＡ／イオノにより活性化されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞とＩＭＱ処理が実施されたＷＴネズミを比較してみると、Ｃａｍｋ２ｇ^－／－ネズミの皮膚のｐ３８リン酸化が抑制されることが分かることができる。ＮＥを注射することによりｐ３８リン酸化を増加させるとともに回復させる（図１５Ｄ）。

【0093】

その結果によると、ＣａＭＫ２γはＮＥ－ＡＤＲＢ２－ｐ３８経路を活性化することによりＴ細胞がＩＬ－１７を形成することを促進する。

【0094】

実施例１５
ＣａＭＫ２γはＮＡＰＤＨオキシダーゼ・コンプレック・スサブユニット蛋白質（Ｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ Ｓｕｂｕｎｉｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）の合成を促進することにより好中球内のＲＯＳの形成を刺激し、それによりＮＥＴｓの形成を調節する。

【0095】

従来の技術文献によると、ＩＬ－１７を形成するＴ細胞は乾癬病免疫学を研究する主流になっているが、好中球は、最初の免疫システムにおいて数量が最も多い細胞であるので、乾癬病の発病と発展において注目を集めている。活性化の好中球により増強の呼吸が形成されるとともに活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＯＳ）の形成が伴い、最後にＮＥＴｏｓｉｓが形成される。ＮＥＴｏｓｉｓは細胞のアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）及び壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）と異なっている好中球の死亡形式である。ＮＥＴｏｓｉｓに伴ってＮＥＴｓが形成される。ＮＥＴｓは、ミエロペルオキシダーゼ（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＭＰＯ）、好中球エラスターゼ（ｅｌａｓｔａｓｅ、ＮＥ）及びペプチジルアルギニンダイミナーゼ（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｄｅｉｍｉｎａｓｅ）４ （ＰＡＤ４）等のプロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）を放出する。そのプロテアーゼは炎症性メディエーター（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍｅｄｉａｔｏｒ）の加水分解活性化（Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）と自己抗原（ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ）のＮＥＴｓの形成に参与する。ＨＬ６０は、骨髄腫細胞株（Ｍｙｅｌｏｍａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ）であり、ＤＢＳＯの刺激により好中球に分化される潜在力を具備している。ＣａＭＫ２γはＣＡＭＫ家族のＨＬ－６０細胞において発現レベルと活性が最も高い成員である。

【0096】

本発明の実施例において、ＣａＭＫ２γが好中球内のＮＥＴｓの形成に参与するかを測定するため、２種のＣａＭＫＩＩ抑制剤であるＣａＭＫＩＩ－ ＩＮ１とＫＮ９３を用いる。その結果によると、ＰＭＡに活性化されるＨＬ－６０細胞において、ＣａＭＫＩＩ－ＩＮ１とＫＮ９３はいずれも、ＭＰＯ、エラスターゼ及びＰＡＤ４の放出を抑制することが分かることができる。それは好中球内のＣａＭＫ２γ活性はＮＥＴｓの形成を減少させることを反映する（図１６Ａ）。

【0097】

本発明の実施例において、ＣａＭＫ２γの活性を抑制することにより細胞内のＲＯＳの形成（図１６Ｂ）とＮＣＦ１、ＮＣＦ２及びＮＯＸ２のｍＲＮＡレベルを低減する（図１６Ｃ）ことを更に発見した。前記ｍＲＮＡはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＮＡＰＤＨ）オキシダーゼ・コンプレックの蛋白質サブユニット（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔ）を形成することできる。研究によると、ＮＡＰＤＨオキシダーゼ・コンプレックは細胞内のＲＯＳの重要な出所であることを反映する。

【0098】

本発明の実施例の結果によると、活性化のＣａＭＫ２γはＮＡＰＤＨオキシダーゼ・コンプレック・スサブユニット蛋白質の合成を促進することにより好中球内のＲＯＳの形成を刺激し、それによりＮＥＴｓの形成を調節する。それは循環システム中のＣＡＭＫ２γが乾癬病の発展に参与することを反映する。

【0099】

以上、本発明の好適な実施例を説明してきたが、前記実施例は、本発明の例示にしか過ぎないものであり、本発明は前記実施例の構成にのみ限定されるものでない。この技術分野の技術者は本発明の要旨を逸脱しない範囲内において設計の変更、改良等をすることができ、それらがあっても本発明の特許請求の範囲が定めた範囲に含まれることは勿論である。