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特開2023-115006がんを診断する方法およびＮＫ細胞活性の測定を使用した診断キット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023115006
(43)【公開日】2023-08-18
(54)【発明の名称】がんを診断する方法およびＮＫ細胞活性の測定を使用した診断キット
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20230808BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20230808BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20230808BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20230808BHJP
C07K 14/54 20060101ALN20230808BHJP
C12N 15/24 20060101ALN20230808BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20230808BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 P ZNA
G01N33/574 A
C12Q1/06
C07K19/00
C07K14/54
C12N15/24
C12N15/62 Z
【審査請求】有
【請求項の数】19
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023076634
(22)【出願日】2023-05-08
(62)【分割の表示】P 2021197948の分割
【原出願日】2012-02-10
(31)【優先権主張番号】10-2011-0012983
(32)【優先日】2011-02-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】513205259
【氏名又は名称】エヌケーマックス カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＮＫＭＡＸ ＣＯ．， Ｌｔｄ．
(74)【代理人】
【識別番号】100102842
【弁理士】
【氏名又は名称】葛和 清司
(72)【発明者】
【氏名】イ，ジェ ミョン
(72)【発明者】
【氏名】ユン，ジュ チョン
(72)【発明者】
【氏名】パク，サン ウ
(72)【発明者】
【氏名】キム，ジョン ソン
(57)【要約】
【課題】様々なタイプのがんを診断するための新しい方法に対する必要性が引き続き存在している。そのため、がんの診断および評価に使用できる方法、ならびに、かかる方法において有用なキットおよび試薬を提供することが本発明の目的である。
【解決手段】がんを診断するための方法、診断キットおよびＮＫ細胞活性の測定に有用な組成物が提供される。がんの罹患は、血液中のＮＫ細胞活性の測定を介したin vivo免疫系の変化をモニタリングすることにより診断され得る。したがって、がんの罹患は、本明細書に記載されるように、対象からの血液試料を用いて容易に予測することができる。
【選択図】図６
【解決手段】がんを診断するための方法、診断キットおよびＮＫ細胞活性の測定に有用な組成物が提供される。がんの罹患は、血液中のＮＫ細胞活性の測定を介したin vivo免疫系の変化をモニタリングすることにより診断され得る。したがって、がんの罹患は、本明細書に記載されるように、対象からの血液試料を用いて容易に予測することができる。
【選択図】図６
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＮＫ細胞活性を測定する方法であって、
血液試料中のＮＫ細胞を刺激し、それによって人為的にＮＫ細胞を活性化してＮＫ細胞分泌サイトカインを生成させること、および、
血液試料中のＮＫ細胞分泌サイトカインの量を測定すること、
を含む、前記方法。
血液試料中のＮＫ細胞を刺激し、それによって人為的にＮＫ細胞を活性化してＮＫ細胞分泌サイトカインを生成させること、および、
血液試料中のＮＫ細胞分泌サイトカインの量を測定すること、
を含む、前記方法。
【請求項2】
血液試料が、全血、末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）またはＮＫ細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ＮＫ細胞の刺激が、血液試料を、インターロイキン２、インターロイキン１２、インターロイキン１５およびインターロイキン１８からなる群から選択される、少なくとも１つの刺激性サイトカインと共にインキュベートすることによって、または、血液試料を、リポ多糖（ＬＰＳｓ）または、ポリイノシン・ポリシチジン酸（ポリＩ：Ｃ）と共にインキュベートすることによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
ＮＫ細胞の刺激が、血液試料を、インターロイキン２と共にインキュベートすることによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
ＮＫ細胞の刺激が、血液試料を、インターロイキン２およびインターロイキン１２と共にインキュベートすることによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
ＮＫ細胞の刺激が、血液試料を、インターロイキン１２およびインターロイキン１５と共にインキュベートすることによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
ＮＫ細胞の刺激が、血液試料を、インターロイキン１２およびインターロイキン１８と共にインキュベートすることによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
ＮＫ細胞分泌サイトカインが、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）およびマクロファージ炎症性タンパク質－１β（ＭＩＰ－１β）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
ＮＫ細胞分泌サイトカインがインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
ＮＫ細胞分泌サイトカインが腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）である、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
マクロファージ炎症性タンパク質－１β（ＭＩＰ－１β）が、ＮＫ細胞の活性化を正常者のものと比較するための対照群として使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
ＮＫ細胞分泌サイトカインの量の測定が、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
少なくとも１つの刺激性サイトカインが、安定化ペプチドとの融合タンパク質の形態である、請求項３に記載の方法。
【請求項14】
安定化ペプチドが、シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
安定化ペプチドが、α－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基１０３～１１５（配列番号２２）、アミノ酸残基１１４～１２６（配列番号２３）、アミノ酸残基１１９～１４０（配列番号２４）およびアミノ酸残基１３０～１４０（配列番号２５）、β－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基８５～１３４（配列番号２７）、γ－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基９６～１２７（配列番号２９）およびシノレチンのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基９６～１２７（配列番号２９）を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
血液試料中のＮＫ細胞を刺激し、それによって人為的にＮＫ細胞を活性化してＮＫ細胞分泌サイトカインを生成させるステップが、担体タンパク質を含有する培地において行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
がんの罹患または再発を検出するためのものである、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
対象におけるＮＫ細胞分泌サイトカインの量の、正常個体におけるレベルと比較した減少が、がんの罹患または再発の指標である、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
血液試料中のＮＫ細胞を刺激し、それによって人為的にＮＫ細胞を活性化してＮＫ細胞分泌サイトカインを生成させる作用物質を含む、
ＮＫ細胞活性を測定するためのキット。
ＮＫ細胞活性を測定するためのキット。
【請求項20】
ＮＫ細胞分泌サイトカインがインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）である、請求項１９に記載のキット。
【請求項21】
ＮＫ細胞分泌サイトカインが腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）である、請求項１９に記載のキット。
【請求項22】
血液試料中のＮＫ細胞を刺激し、人為的にＮＫ細胞を活性化してＮＫ細胞分泌サイトカインを生成させる作用物質が、少なくとも１つ刺激性サイトカイン、ＬＰＳまたはポリＩ：Ｃであり、前記少なくとも１つの刺激性サイトカインが、インターロイキン２、インターロイキン１２、インターロイキン１５およびインターロイキン１８からなる群から選択される、請求項１９に記載のキット。
【請求項23】
抗ＩＮＦ－γ抗体、抗ＴＮＦ－α抗体および抗ＭＩＰ－１β抗体の群から選択される少なくとも１つの抗体をさらに含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項24】
がんの罹患または再発を検出するためのものである、請求項１９～２３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項25】
さらに、対象におけるＮＫ細胞分泌サイトカインの量を正常個体におけるレベルと比較するための指示を含み、ここで、対象におけるＮＫ細胞分泌サイトカインのレベルの低減は、がんの罹患または再発の指標である、請求項２４に記載のキット。
【請求項26】
シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドに結合したサイトカインを含む融合タンパク質であって、前記サイトカインが、インターロイキン２、インターロイキン１２、インターロイキン１５およびインターロイキン１８からなる群から選択される、前記融合タンパク質。
【請求項27】
サイトカインがインターロイキン２である、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項28】
サイトカインがインターロイキン１２である、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項29】
サイトカインがインターロイキン１５である、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項30】
サイトカインがインターロイキン１８である、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項31】
シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドが、α－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基１０３～１１５（配列番号２２）、アミノ酸残基１１４～１２６（配列番号２３）、アミノ酸残基１１９～１４０（配列番号２４）およびアミノ酸残基１３０～１４０（配列番号２５）、β－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基８５～１３４（配列番号２７）、γ－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基９６～１２７（配列番号２９）、および、シノレチンのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基９６～１２７（配列番号２９）から選択される、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項32】
シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドに結合したインターロイキン２、
シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドに結合したインターロイキン１２、
シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドに結合したインターロイキン１５、および、
シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドに結合したインターロイキン１８
からなる群から選択される少なくとも１つの融合タンパク質を含む、ＮＫ細胞を活性化するための組成物。
シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドに結合したインターロイキン１２、
シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドに結合したインターロイキン１５、および、
シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドに結合したインターロイキン１８
からなる群から選択される少なくとも１つの融合タンパク質を含む、ＮＫ細胞を活性化するための組成物。
【請求項33】
シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドが、α－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基１０３～１１５（配列番号２２）、アミノ酸残基１１４～１２６（配列番号２３）、アミノ酸残基１１９～１４０（配列番号２４）およびアミノ酸残基１３０～１４０（配列番号２５）、β－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基８５～１３４（配列番号２７）、γ－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基９６～１２７（配列番号２９）、および、シノレチンのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基９６～１２７（配列番号２９）から選択される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項34】
シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドに結合したインターロイキン２、
シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドに結合したインターロイキン１２、
シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドに結合したインターロイキン１５、および、
シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドに結合したインターロイキン１８
からなる群から選択される少なくとも１つの融合タンパク質を含む、がん診断キット。
シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドに結合したインターロイキン１２、
シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドに結合したインターロイキン１５、および、
シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドに結合したインターロイキン１８
からなる群から選択される少なくとも１つの融合タンパク質を含む、がん診断キット。
【請求項35】
シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドが、α－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基１０３～１１５（配列番号２２）、アミノ酸残基１１４～１２６（配列番号２３）、アミノ酸残基１１９～１４０（配列番号２４）およびアミノ酸残基１３０～１４０（配列番号２５）、β－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基８５～１３４（配列番号２７）、γ－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基９６～１２７（配列番号２９）、および、シノレチンのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基９６～１２７（配列番号２９）から選択される、請求項３４に記載のがん診断キット。
【請求項36】
抗ＩＮＦ－γ抗体、抗ＴＮＦ－α抗体および抗ＭＩＰ－１β抗体の群から選択される少なくとも１つの抗体をさらに含む、請求項３４に記載のがん診断キット。
【請求項37】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項38】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項３７に記載のポリペプチド。
【請求項39】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項３７に記載のポリペプチド。
【請求項40】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または、配列番号１０のアミノ酸配列からなる、請求項３７に記載のポリペプチド。
【請求項41】
請求項３７～４０のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチド。
【請求項42】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号９の核酸配列、または、それらの相補鎖と少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項43】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号９の核酸配列、または、それらの相補鎖と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項４２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項44】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号９の核酸配列、または、それらの相補鎖と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項４２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項45】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号９の核酸配列、または、それらの相補鎖からなる請求項４２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項46】
請求項４１～４５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項47】
請求項４６に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は２０１１年２月１４日に出願された韓国特許出願第2011-0012983号に対する優先権および同出願の利益を主張するものであり、当該出願の開示はその全体が参照により本明細書に援用される。
本出願は２０１１年２月１４日に出願された韓国特許出願第2011-0012983号に対する優先権および同出願の利益を主張するものであり、当該出願の開示はその全体が参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【0002】
１．発明の技術分野
本発明はがんを診断するための方法および、ＮＫ細胞活性の測定を利用する診断キットに関する。
本発明はがんを診断するための方法および、ＮＫ細胞活性の測定を利用する診断キットに関する。
【0003】
２．関連技術の考察
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、病原体およびがん細胞を排除する自然免疫に関与し、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）、マクロファージ炎症性タンパク質－１β（ＭＩＰ－１β）、および、適応免疫を調節する他の分子を分泌することが知られている。ＮＫ細胞が他の細胞に遭遇すると、ＮＫ細胞は、がん細胞のようにＭＨＣクラス１が存在しない場合、または、ウイルス感染した細胞のようにＭＨＣクラスの形状が異常な場合に、これらの異常な細胞をそれらの分子作用を通じて攻撃するよう、それらの主要組織適合性複合体（ＭＨＣｓ）が、ＮＫ細胞内にシグナルを送る機構を有する。しかしながら、ＮＫ細胞は様々な種類のがんにおいて、機能および分化能に障害を有すると報告されていることから、ＮＫ細胞活性はがん細胞の生存と密接に関連している。それゆえに、がんの免疫療法のためにＮＫ細胞の数または活性を増大させる広範な研究が行われている。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、病原体およびがん細胞を排除する自然免疫に関与し、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）、マクロファージ炎症性タンパク質－１β（ＭＩＰ－１β）、および、適応免疫を調節する他の分子を分泌することが知られている。ＮＫ細胞が他の細胞に遭遇すると、ＮＫ細胞は、がん細胞のようにＭＨＣクラス１が存在しない場合、または、ウイルス感染した細胞のようにＭＨＣクラスの形状が異常な場合に、これらの異常な細胞をそれらの分子作用を通じて攻撃するよう、それらの主要組織適合性複合体（ＭＨＣｓ）が、ＮＫ細胞内にシグナルを送る機構を有する。しかしながら、ＮＫ細胞は様々な種類のがんにおいて、機能および分化能に障害を有すると報告されていることから、ＮＫ細胞活性はがん細胞の生存と密接に関連している。それゆえに、がんの免疫療法のためにＮＫ細胞の数または活性を増大させる広範な研究が行われている。
【0004】
一方、がんを診断する方法は主に、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）またはＸ線を使用して得られたグラフィック画像から、がんの存在を発見することを含んでいる。しかしながら、これらの検査は通常、患者が痛みや不都合が原因で検査を受ける強い必要性があるときにのみ、そして特定の組織においてのみ行われるため、がんの存在が見落とされる可能性がある。血液検査を使用したがんのリスクを決定する方法は開発されているが、がんを診断する方法としてのその利用は限られている。これは、その方法が、例えば前立腺がん、結腸がん、卵巣がん、膵がんまたは肝がんに対する血液腫瘍マーカーを使用して行われるため、患者が、がんよりもむしろ対応する臓器に病因因子がある場合に、がんが陽性であるように見えることがあるためである。抗体を使用してがんを診断する試みもあるが、そのような試みは特定のタイプのがんに限られている。
【0005】
したがって、様々なタイプのがんを診断するための新しい方法に対する必要性が引き続き存在している。
【発明の概要】
【0006】
そのため、がんの診断および評価に使用できる方法、ならびに、かかる方法において有用なキットおよび試薬を提供することが本発明の目的である。
【0007】
本発明の一側面として、ＮＫ細胞活性を測定する方法であって、該方法が、血液試料中のＮＫ細胞を刺激し、それによって人為的にＮＫ細胞を活性化してＮＫ細胞分泌サイトカインを生成させること、および、血液試料中のＮＫ細胞分泌サイトカインの量を測定することを含む方法が提供される。
【0008】
特定の非限定的な態様において、血液試料は全血試料、末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）または、ＮＫ細胞であってもよい。
【0009】
さらなる態様において、ＮＫ細胞の刺激は、インターロイキン２、インターロイキン１２、インターロイキン１５、インターロイキン１８またはそれらの組み合わせを含む、少なくとも１つの刺激性サイトカインと共に血液試料をインキュベートすること、または、リポ多糖（ＬＰＳｓ）または、ポリイノシン・ポリシチジン酸（ポリＩ：Ｃ）と共に血液試料をインキュベートすることによって行ってもよい。
【0010】
特定の態様において、ＮＫ細胞分泌サイトカインは、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）またはマクロファージ炎症性タンパク質－１β（ＭＩＰ－１β）を含み得る。
【0011】
本方法のさらなる非限定的な態様において、マクロファージ炎症性タンパク質－１β（ＭＩＰ－１β）は、ＮＫ細胞の活性化を正常者のものと比較するためのコントロール群として使用できる。
【0012】
また、特定の態様において、本方法は、安定化ペプチドと融合した少なくとも１つの刺激性サイトカインを使用して実行してもよい。例えば、限定することを望まないが、安定化ペプチドはシヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドであってもよい。かかる態様において、安定化ペプチドは、α－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基１０３～１１５（配列番号２２）、アミノ酸残基１１４～１２６（配列番号２３）、アミノ酸残基１１９～１４０（配列番号２４）またはアミノ酸残基１３０～１４０（配列番号２５）、β－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基８５～１３４（配列番号２７）、γ－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基９６～１２７（配列番号２９）、または、シノレチン（配列番号２９）のＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基９６～１２７を含み得る。
【0013】
さらなる態様において、血液試料中のＮＫ細胞を刺激し、それによって人為的にＮＫ細胞を活性化してＮＫ細胞分泌サイトカインを生成させるステップは、担体タンパク質、例えば血清アルブミンタンパク質を含有する培地において行われる。
【0014】
前記方法は、がんの罹患または再発を検出するのに特に有用である。かかる態様において、対象におけるＮＫ細胞分泌サイトカインの量の、正常個体におけるレベルと比較した低減は、がんの罹患または再発の指標である。
【0015】
本発明のさらなる側面として、ＮＫ細胞活性を測定するためのキットが提供される。当該キットは、血液試料中のＮＫ細胞を刺激し、それによって人為的にＮＫ細胞を活性化してＮＫ細胞分泌サイトカインを生成させるための作用物質を含む。また、当該キットは、がんの罹患または再発を検出するためのものを含む、上記の方法を実行するために有用たり得る。
【0016】
当該キットのさらなる非限定的な態様において、ＮＫ細胞分泌サイトカインはインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）または、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）であってもよい。
【0017】
さらなる態様において、血液試料中のＮＫ細胞を刺激し、人為的にＮＫ細胞を活性化してＮＫ細胞分泌サイトカインを生成させるための作用物質は、少なくとも１つの刺激性サイトカイン、ＬＰＳまたはポリＩ：Ｃを含み得、前記少なくとも１つの刺激性サイトカインは、インターロイキン２、インターロイキン１２、インターロイキン１５、インターロイキン１８の１または２以上を含む。
【0018】
記載されたキットは、特定の態様において、以下の１または２以上をも含み得る：抗ＩＮＦ－γ抗体、抗ＴＮＦ－α抗体および抗ＭＩＰ－１β抗体。いかようにも限定的であることを望まないが、当該キットは、対象におけるＮＫ細胞分泌サイトカインの量を正常個体におけるレベルと比較するための指示をさらに含んでもよく、ここで、対象におけるＮＫ細胞分泌サイトカインのレベルの低減は、がんの罹患または再発の指標である。
【0019】
本発明のさらなる側面として、シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドに結合したサイトカインを含む融合タンパク質が提供され、当該サイトカインは、インターロイキン２、インターロイキン１２、インターロイキン１５またはインターロイキン１８のいずれかである。
【0020】
記載された融合タンパク質の特定の非限定的態様において、シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドは、α－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基１０３～１１５（配列番号２２）、アミノ酸残基１１４～１２６（配列番号２３）、アミノ酸残基１１９～１４０（配列番号２４）または、アミノ酸残基１３０～１４０（配列番号２５）、β－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基８５～１３４（配列番号２７）、γ－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基９６～１２７（配列番号２９）、または、シノレチンのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基９６～１２７（配列番号２９）を含んでもよい。
【0021】
上記融合タンパク質を含む組成物もまた提供される。
【0022】
また、上記融合タンパク質または上記組成物のいずれかを含むがん診断キットもまた、ここで提供される。
【0023】
上記がん診断キットは、特定の非限定的な態様において、以下のうちの少なくとも１つの抗体をも含み得る：抗ＩＮＦ－γ抗体、抗ＴＮＦ－α抗体および抗ＭＩＰ－１β抗体。
【0024】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８または、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドもまたここで提供される。限定的であることは望まないが、ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８および、配列番号１０の配列と、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を含む、より高いパーセントの同一性を有してもよい。
【0025】
上記融合タンパク質およびポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチドもまた提供される。例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号９の核酸配列、または、それらの相補鎖と少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含むオリゴヌクレオチドが提供される。かかるオリゴヌクレオチドは、限定なしに、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号９の配列または、それらの相補配列と、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を含む、より高いパーセントの同一性を有してもよい。
【0026】
上記のオリゴヌクレオチドを含むベクターもまた提供され、かかるベクターまたはオリゴヌクレオチドを含む宿主細胞も同様に提供される。
【図面の簡単な説明】
【0027】
本発明の上記および他の目的、特徴および利点は、それらの例示的な態様を、図面を参照して詳細に記載することにより、当業者にとってより明らかになる。
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
【0032】
【0033】
【0034】
【0035】
【0036】
【0037】
【0038】
【0039】
【発明を実施するための形態】
【0040】
発明の詳細な説明
本発明は、がんとＮＫ細胞の相互作用を利用した、がん罹患を診断するための方法、キットおよび試薬に関する。
本発明は、がんとＮＫ細胞の相互作用を利用した、がん罹患を診断するための方法、キットおよび試薬に関する。
【0041】
本目的のために、ＮＫ細胞活性の測定方法であって、血液試料中のＮＫ細胞を刺激し、それにより人為的にＮＫ細胞を活性化してＮＫ細胞分泌サイトカインを生成させること、および、血液試料中のＮＫ細胞分泌サイトカインの量を測定することを含む方法が提供される。
【0042】
本発明者らは、がん患者においてＮＫ細胞活性が減少するという観察に基づいて、ＮＫ細胞活性を測定することにより、がんの罹患を一次スクリーニングし得ることを見出した。本明細書に記載される方法は、ＮＫ細胞に対して人為的な刺激を与えることによりＮＫ細胞が正常に機能するかどうかについて決定すること、および、血液試料中に存在するＮＫ細胞分泌サイトカインの量の変化を検出することによりＮＫ細胞の活性化レベルを測定することが可能であり、これは、単に元々血液試料中に存在しているＮＫ細胞の数やサイトカインの量を測定する他の方法とは異なる。例えば、ＮＫ細胞の活性化レベルを測定する従来の方法においては、５１Ｃｒ放出アッセイが標的特異的細胞毒性の測定方法として使用されている。しかしながら、ＮＫ細胞活性をこのやり方で測定する場合には、放射性同位体を使用する必要があり、測定および分析が難しく、複雑で費用がかかる。そのため、当該アッセイは、がんの罹患を簡単に診断できるがんの一次スクリーニング／検査方法への使用には適しない。一方で、本発明によると、ＮＫ細胞を刺激し、ＮＫ細胞分泌サイトカインを生成させ、生成されたＮＫ細胞分泌サイトカインを定量化することによってＮＫ細胞活性を測定することができるため、ＮＫ細胞活性が減少した対象を、がんを患っている、または、がんを患うリスクのある対象として、有利にスクリーニングすることができる。
【0043】
本発明によると、血液試料は、限定されずに、対象から採取された全血、末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）および、ＮＫ細胞を含んでよい。ＰＢＭＣｓまたはＮＫ細胞は、全血の代わりに無処置（intact）で使用され得るが、特定の態様においては、手順がより簡単であり、低コストであるため、全血の使用が有利な場合がある。
【0044】
なお、本発明において、用語「対象（subject）」はがんを患っている疑い、もしくは、がんの再発を有する疑いがある、または、がんの罹患または再発を決定することを望む哺乳動物をいう。
【0045】
血液試料中に存在するＮＫ細胞は一般的に不活性状態で存在する。本発明によると、少なくとも１つのサイトカイン、リポ多糖（ＬＰＳ）またはポリイノシン：ポリシチジン酸（ポリＩ：Ｃ）を、血液試料中の当該ＮＫ細胞を刺激し、人為的にＮＫ細胞を活性化してＮＫ細胞分泌サイトカインを生成させる役目をする作用物質（本明細書中では、アゴニストまたはアクチベーターとも呼ばれる）として使用することができる。ここで、ＮＫ細胞を活性化するために使用されるサイトカインは、インターロイキン２、インターロイキン１２、インターロイキン１５およびインターロイキン１８、または、それらの組み合わせであってよい。インターロイキン２、インターロイキン１２、インターロイキン１５、インターロイキン１８、ＬＰＳまたはポリＩ：Ｃは、ＮＫ細胞分泌サイトカインを生成するために刺激されることが当該技術分野において広く知られている。そのため、本発明の１つの例示的な態様によると、ＮＫ細胞の刺激は、血液試料を、インターロイキン２、インターロイキン１２、インターロイキン１５および／またはインターロイキン１８を含む、少なくとも１つのサイトカインと共にインキュベートすることにより、または、血液試料をＬＰＳまたはポリＩ：Ｃと共にインキュベートすることにより行われてもよい。
【0046】
１つの非限定的な態様において、ＮＫ細胞の刺激は血液試料をインターロイキン２と共にインキュベートすることによって行われてもよい。インターロイキン２はＴ細胞によって分泌されるサイトカインの１つであり、in vivoの適応免疫応答におけるＴ細胞によるＮＫ細胞の活性化に関連することが知られている。また、インターロイキン２はin vitroでＮＫ細胞を活性化するために一般的に広く使用されるサイトカインである。そのため、ＮＫ細胞の刺激は、血液試料をインターロイキン２と共にインキュベートすることによって行われてもよい。
【0047】
他の非限定的な態様において、ＮＫ細胞の刺激は、血液試料をインターロイキン２およびインターロイキン１２と共にインキュベートすることによって行われてもよい。早期のがん患者の場合、ＮＫ細胞の活性が低くてもＴ細胞の活性が高いことがある。それに対して、末期のがん患者の場合、ＮＫ細胞だけでなく、Ｔ細胞の活性も低いことがある。インターロイキン１２はＮＫ細胞だけでなく、Ｔ細胞の活性化にも関与する。それゆえ、もしインターロイキン２と共にインターロイキン１２で処置する場合、ＮＫ細胞から分泌されるサイトカインに、Ｔ細胞の刺激によって分泌されるサイトカインが加わる。そのため、ＮＫ細胞の抗がん免疫だけでなく、免疫の総合的なレベルを評価し、そして、このレベルをがんの進行の程度またはがん治療の予後を表すマーカーとして使用することが可能である。インターロイキン１５およびインターロイキン１８は、活性化した樹状細胞およびマクロファージにより分泌されるサイトカインであり、in vitroでの自然免疫応答の最中にＮＫ細胞の活性化および増殖を誘導する。特に、インターロイキン１２がインターロイキン１５またはインターロイキン１８と組み合わされた場合、比較的少量のインターロイキン１２を、ＮＫ細胞におけるＮＫ細胞分泌サイトカインの分泌を刺激するために使用することができる。そのため、ＮＫ細胞の刺激は、血液試料をインターロイキン１２およびインターロイキン１５、または、インターロイキン１２およびインターロイキン１８と共にインキュベートすることによって効果的に行うことができる。
【0048】
本発明によると、ＮＫ細胞分泌サイトカインの数値はＮＫ細胞活性を評価する尺度として使用される。本発明において、「ＮＫ細胞分泌サイトカイン」はＮＫ細胞から分泌されるサイトカイン、特に、人為的な刺激による活性化ＮＫ細胞からのサイトカインをいう。１つの態様において、ＮＫ細胞分泌サイトカインは、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）、マクロファージ炎症性タンパク質－１β（ＭＩＰ－１β）の群から選択される少なくとも１つのサイトカインである。インターフェロン－γはＮＫ細胞、樹状細胞、Ｔｃ細胞、Ｔｈ１細胞等から分泌され、がんの制御のための自然免疫および適応免疫において、重要な役割を果たすサイトカインとして知られる。また、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）はがん細胞を殺滅し、さらには、細菌などの外部侵入物の殺滅、Ｔ細胞の活性化の誘導に関与し、Ｂ細胞からの抗体生産のための補助的な因子としての役割を果たす。そのため、例えば、インターフェロン－γまたは腫瘍壊死因子－アルファの数値が正常者からのインターフェロン－γまたは腫瘍壊死因子－アルファの数値より小さい場合、このことは、がんの制御のためのＮＫ細胞活性に問題があることを示す。そのため、人為的に活性化されたＮＫ細胞から分泌されるインターフェロン－γまたは腫瘍壊死因子－アルファの量を、正常者からのインターフェロン－γまたは腫瘍壊死因子－アルファの量と比較することによって、ＮＫ細胞活性を決定することが可能である。
【0049】
一方、マクロファージ炎症性タンパク質－１β（ＭＩＰ－１β）は、ＮＫ細胞の活性化を比較するための対照群として使用できる。以下の例において示すとおり、マクロファージ炎症性タンパク質－１β（ＭＩＰ－１β）の数値は正常者およびがん患者の双方において同様に高い。それゆえ、マクロファージ炎症性タンパク質－１β（ＭＩＰ－１β）は、正常者およびがん患者におけるＮＫ細胞活性を分析するために使用でき、または、がん診断キットを用いた分析のための対照群として使用できる。
【0050】
ＮＫ細胞分泌サイトカインの定量化は、当該技術分野において知られるいかなる方法によって行われてもよいが、本発明はこれに限定されるものではない。例えば、インターフェロン－γの定量化は、インターフェロン－γ酵素結合免疫吸着アッセイ（インターフェロン－γ ＥＬＩＳＡ）を使用して行われてもよい。
【0051】
また、血液試料中のＮＫ細胞を刺激し、人為的にＮＫ細胞を活性化してＮＫ細胞分泌サイトカインを生成させる役目をする作用物質として使用される、インターロイキン２、インターロイキン１２、インターロイキン１５またはインターロイキン１８を含む少なくとも１つのサイトカインは、安定化ペプチドとの融合タンパク質の形態であってよい。
【0052】
安定化ペプチドとの融合タンパク質の形態のインターロイキン２、インターロイキン１２、インターロイキン１５またはインターロイキン１８は、野生型インターロイキン２、インターロイキン１２、インターロイキン１５またはインターロイキン１８の生物学的活性および保存安定性と比較して、同様の生物学的活性および高い保存安定性を提供することができる。例えば、サイトカインが当該安定化ペプチドと結合されると、当該サイトカインは、本来の活性を有する一方、凍結乾燥など環境の変化にも関わらず安定性を維持する。
【0053】
安定化ペプチドは、インターロイキン２、インターロイキン１２、インターロイキン１５またはインターロイキン１８のＮまたはＣ末端に結合していてもよく、当該融合タンパク質の調製は、融合タンパク質を調製する既知の方法を用いて行ってもよい。
【0054】
１つの例示的な態様によると、シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テール（アルファ－シヌクレインの酸性テールアミノ酸配列、ＡＴＳ）ドメインペプチドを、インターロイキン２、インターロイキン１２、インターロイキン１５またはインターロイキン１８に結合できる安定化ペプチドとして使用することができるが、本発明はこれに限定されるものではない。韓国特許第10-0506766号は、ＡＴＳペプチドが環境ストレスに対する抵抗性を融合パートナータンパク質に与えることを開示している。
【0055】
１つの例示的な態様によると、ここで使用され得る安定化ペプチドは、α－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基１０３～１１５、アミノ酸残基１１４～１２６、アミノ酸残基１１９～１４０および、アミノ酸残基１３０～１４０、β－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基８５～１３４、γ－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基９６～１２７および、シノレチンのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基９６～１２７から選択される安定化ペプチドを含む。本発明において、ＡＴＳペプチドのアミノ酸配列、ＡＴＳペプチドおよび同ペプチドを含む融合タンパク質の調製方法は、韓国特許第10-0506766号に開示される方法を使用して行うことができる。以下の例を参照すると、ＡＴＳペプチドと融合されたインターロイキン２、インターロイキン１２、インターロイキン１５またはインターロイキン１８は安定性が高く、サイトカインがＴリンパ球により活性化された場合に野生型のものと同様の活性を表すことが示される。
【0056】
１つの態様において、血液試料中のＮＫ細胞を刺激し、それによって人為的にＮＫ細胞を活性化してＮＫ細胞分泌サイトカインを生成させるステップは、担体タンパク質を含有する培地中で行うことができる。担体タンパク質は、血液試料中のＮＫ細胞を刺激し、人為的にＮＫ細胞を活性化してＮＫ細胞分泌サイトカインを生成させ、それによってＮＫ細胞がより多くのＮＫ細胞分泌サイトカインを生産するのを誘導するための作用物質として使用される、インターロイキン２、インターロイキン１２、インターロイキン１５またはインターロイキン１８などのサイトカインを安定化させるための役割を果たす。特定の態様において、担体タンパク質はウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンであってよいが、これらに限定されるものではない。
【0057】
また、ＮＫ細胞活性を測定する方法は、がんの罹患または再発をスクリーニングすることに使用することができる。
【0058】
ＮＫ細胞活性は、人為的に活性化されたＮＫ細胞から分泌されるＮＫ細胞分泌サイトカインの量を、正常者からのＮＫ細胞分泌サイトカインの量と比較することによって測定することができる。この場合、ＮＫ細胞分泌サイトカインの量が正常者からのＮＫ細胞分泌サイトカインのものより小さい場合に、ＮＫ細胞活性は減少したとみなされる。そのため、がんのリスクまたはがんの再発を判定することが可能である。ＮＫ細胞活性が正常者と比較して減少した場合、対象は、がんを患っている疑いのある患者、あるいは、がんの再発を有する患者として一次的に分類され得る。また、がんの罹患または再発は、通常行われるがん診断のための、ＣＴ、ＭＲＩまたはポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）などのさらなる診断方法を介して、または、最終的な組織検査を介して診断され得る。本発明による方法はがんを最終的に診断する方法ではないが、当該方法は、血液を使用してがんの罹患または再発を一次スクリーニングできるという優れた利点がある。
【0059】
また、本発明は、血液試料中のＮＫ細胞を刺激し、人為的にＮＫ細胞を活性化してＮＫ細胞分泌サイトカインを生成させる役目をするアゴニストまたはアクチベーターなどの作用物質を含む、ＮＫ細胞活性を測定するためのキットを提供する。ＮＫ細胞活性を測定するための当該キットは、上記ＮＫ細胞活性を測定する方法を容易に行うために使用することができる。
【0060】
ＮＫ細胞活性を測定するためのキットにおいて、ＮＫ細胞を刺激し、人為的にＮＫ細胞を活性化してＮＫ細胞分泌サイトカインを生成させる役目をする作用物質は、少なくとも１つのサイトカイン、ＬＰＳまたはポリＩ：Ｃであり得、当該サイトカインは、インターロイキン２、インターロイキン１２、インターロイキン１５およびインターロイキン１８からなる群から選択され得る。
ＮＫ細胞を刺激し、人為的にＮＫ細胞を活性化して、インターフェロン－γなどのＮＫ細胞分泌サイトカインを生成させる役目をする作用物質に加えて、当該がん診断キットは、ＮＫ細胞活性測定のためのさらなる構成要素、例えば、ＮＫ細胞分泌サイトカインを定量化するための抗体および基材を含んでもよい。１つの態様において、本発明のキットは、抗ＩＮＦ－γ抗体、抗ＴＮＦ－α抗体および抗ＭＩＰ－１β抗体の群から選択される少なくとも１つの抗体をさらに含む。
ＮＫ細胞を刺激し、人為的にＮＫ細胞を活性化して、インターフェロン－γなどのＮＫ細胞分泌サイトカインを生成させる役目をする作用物質に加えて、当該がん診断キットは、ＮＫ細胞活性測定のためのさらなる構成要素、例えば、ＮＫ細胞分泌サイトカインを定量化するための抗体および基材を含んでもよい。１つの態様において、本発明のキットは、抗ＩＮＦ－γ抗体、抗ＴＮＦ－α抗体および抗ＭＩＰ－１β抗体の群から選択される少なくとも１つの抗体をさらに含む。
【0061】
本発明によるキットにおける抗体は、固体基材上に固定されていてもよい。抗体は、文献（Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow & Lane; Cold Spring Harbor, 1988）中に記載される様々な方法を使用して固定することができる。適した固体基材は、細胞培養プレート、ＥＬＩＳＡプレート、チューブおよび高分子フィルムを含み得る。さらに、固体基材は、棒、合成ガラス、アガロースビーズ、カップ、平面パック、または、固体支持体によって支持された、または固体支持体に付着した、他のフィルムまたはコーティングを含む。
【0062】
また、本発明によるキットは、インターフェロン－γなどの、ＮＫ細胞分泌サイトカインを選択的に認識する抗体を用いた免疫学的分析のために使用される試薬を含み得る。免疫学的分析は、本発明による抗体への抗原の結合を測定できるすべての方法を含み得る。かかる方法は当該技術分野において知られており、例えば、免疫細胞化学および免疫組織化学、放射性免疫測定法、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット、Ｆａｒｒアッセイ、沈降素反応、比濁法、免疫拡散法、向流電気泳動法、一元放射免疫拡散法および、免疫蛍光法を含む。
【0063】
免疫学的分析のために使用される試薬は、適した担体、検出可能なシグナルを生成する能力のある標識、溶解剤、界面活性剤を含む。また、標識材料が酵素の場合、試薬は酵素活性を測定できる基質、および、反応停止剤を含み得る。
適した担体は、限定されずに、可溶性担体、例えば、当該技術分野において知られる、生理学的に利用可能なバッファー（例えば、ＰＢＳ）の１つ、または、不溶性担体、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋性デキストラン、多糖およびラテックスの表面を金属で覆うことによって得られる磁性粒子などの高分子、および、他の紙、ガラス、金属、アガロースおよびそれらの組み合わせを含み得る。
適した担体は、限定されずに、可溶性担体、例えば、当該技術分野において知られる、生理学的に利用可能なバッファー（例えば、ＰＢＳ）の１つ、または、不溶性担体、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋性デキストラン、多糖およびラテックスの表面を金属で覆うことによって得られる磁性粒子などの高分子、および、他の紙、ガラス、金属、アガロースおよびそれらの組み合わせを含み得る。
【0064】
検出可能なシグナルを生成できる標識として、酵素、蛍光物質、発光物質および放射性物質が使用され得る。酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、ブドウ糖酸化酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ、インベルターゼ等を使用することができ、フルオレセインイソチオシアネートまたはフィコビリタンパク質は、蛍光物質として使用することができ、イソルミノールまたはルシゲニンは、発光物質として使用することができ、Ｉ１３１、Ｃ１４または、Ｈ３は、放射性物質として使用することができる。しかしながら、例示的な材料に加えて、免疫学的分析のために使用できる任意の物質をここで使用することができる。
【0065】
さらに本発明は、シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドに結合したサイトカインを含む融合タンパク質を提供する。ここで、サイトカインは、インターロイキン２、インターロイキン１２、インターロイキン１５またはインターロイキン１８であってもよい。上述のとおり、当該融合タンパク質は、ＮＫ細胞を刺激し、人為的にＮＫ細胞を活性化してＮＫ細胞分泌サイトカインを生成させる役目をする作用物質として使用することができ、凍結乾燥または長期保存などの環境の変化にも関わらず、野生型インターロイキン２、インターロイキン１２、インターロイキン１５またはインターロイキン１８と比較して高い安定性を提供する。
【0066】
１つの例示的な態様によると、融合タンパク質は、インターロイキン２がシヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドに結合した融合タンパク質であってもよい。
【0067】
別の例示的な態様によると、融合タンパク質は、インターロイキン１２がシヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドに結合した融合タンパク質であってもよい。
【0068】
さらに別の例示的な態様によると、融合タンパク質は、インターロイキン１５がシヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドに結合した融合タンパク質であってもよい。
【0069】
さらにまた別の例示的な態様によると、融合タンパク質は、インターロイキン１８がシヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドに結合した融合タンパク質であってもよい。
【0070】
融合タンパク質において、シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドはまた、α－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基１０３～１１５、アミノ酸残基１１４～１２６、アミノ酸残基１１９～１４０およびアミノ酸残基１３０～１４０、β－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基８５～１３４、γ－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基９６～１２７および、シノレチンのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基９６～１２７から選択され得る。
【0071】
また、本発明はＮＫ細胞を活性化するための融合タンパク質の使用を提供する。上述のように、当該融合タンパク質は、血液中のＮＫ細胞を活性化し、ＮＫ細胞分泌サイトカインの分泌を促進するために使用することができる。
【0072】
したがって、本発明はＮＫ細胞を活性化するための組成物を提供する。ここで、組成物は、シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドに結合したインターロイキン２、シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドに結合したインターロイキン１２、シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドに結合したインターロイキン１５およびシヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドに結合したインターロイキン１８からなる群から選択される、少なくとも１つの融合タンパク質を含む。
【0073】
１つの例示的な態様によると、シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドは、α－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基１０３～１１５、アミノ酸残基１１４～１２６、アミノ酸残基１１９～１４０およびアミノ酸残基１３０～１４０、β－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基８５～１３４、γ－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基９６～１２７および、シノレチンのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基９６～１２７から選択され得る。
【0074】
また、ＮＫ細胞を活性化するための組成物は、安定化ペプチドと融合したサイトカインに加えて、融合タンパク質を維持および保存することが可能なバッファーを含み得る。
【0075】
さらに、本発明は、シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドに結合したインターロイキン２、シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドに結合したインターロイキン１２、シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドに結合したインターロイキン１５および、シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドに結合したインターロイキン１８からなる群から選択される、少なくとも１つの融合タンパク質を含む、がん診断キットを提供する。上述のとおり、対象から採取された血液試料を融合タンパク質と共にインキュベートすると、血液試料中のＮＫ細胞が活性化される。そのため、対象におけるＮＫ細胞活性は、ＮＫ細胞の活性化により生成されたインターフェロン－γを定量化することにより測定することができ、それによって、正常者のＮＫ細胞活性より低いＮＫ細胞活性を有する対象を、がんを患っている、または、がんの再発を有するリスクのある患者として分類することにより、がんを一次診断することができる。
【0076】
１つの例示的な態様によると、シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドは、α－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基１０３～１１５、アミノ酸残基１１４～１２６、アミノ酸残基１１９～１４０およびアミノ酸残基１３０～１４０、β－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基８５～１３４、γ－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基９６～１２７および、シノレチンのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基９６～１２７から選択され得る。
【0077】
融合タンパク質に加えて、当該がん診断キットは、本発明による診断方法を行うために使用されるさらなる構成要素、例えばＮＫ細胞分泌サイトカインを定量化するための抗体および基材を含み得る。これらの構成要素は、ＮＫ細胞活性を測定するためのキットに関連して上述されている。上述の方法におけるこれらの構成要素を使用するための説明書もまた、キットに含まれ得る。
【0078】
本発明の好ましい態様のこれらおよび他の特徴、側面および利点が、以下の例において、より十分に記載されることは明らかである。これらの例が、説明の目的のためだけに提供され、発明の範囲を限定することを意図しないこともまた理解されるべきである。当業者は、特許請求の範囲に記載された発明の範囲から逸脱することなく、他の均等物の作製および改良を行うことができることを理解する。
【実施例0079】
例
調製例１：安定化ペプチド－ＩＬ融合タンパク質を有する発現ベクターの構築
安定化ペプチドと融合したＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５またはＩＬ－１８を調製するために、発現ベクターを構築した。α－シヌクレインのアミノ酸残基１１９～１４０を含有するペプチド（配列番号２３、以下「ＳＰ」と称する）を安定化ペプチドとして使用した。ＩＬ２、ＩＬ１２ｐ３５、ＩＬ１２ｐ４０、ＩＬ１５およびＩＬ－１８のｃＤＮＡを、全ＲＮＡ抽出キット（Invitron Biotechnology）を使用してヒトリンパ球から全ＲＮＡを単離し、逆転写酵素（Invitrogen）を使用して全ＲＮＡ逆転写することによって得た。得られたｃＤＮＡを鋳型として使用し、各ｃＤＮＡ遺伝子に特異的な以下のプライマーを使用して、ＰＣＲで増幅した。
調製例１：安定化ペプチド－ＩＬ融合タンパク質を有する発現ベクターの構築
安定化ペプチドと融合したＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５またはＩＬ－１８を調製するために、発現ベクターを構築した。α－シヌクレインのアミノ酸残基１１９～１４０を含有するペプチド（配列番号２３、以下「ＳＰ」と称する）を安定化ペプチドとして使用した。ＩＬ２、ＩＬ１２ｐ３５、ＩＬ１２ｐ４０、ＩＬ１５およびＩＬ－１８のｃＤＮＡを、全ＲＮＡ抽出キット（Invitron Biotechnology）を使用してヒトリンパ球から全ＲＮＡを単離し、逆転写酵素（Invitrogen）を使用して全ＲＮＡ逆転写することによって得た。得られたｃＤＮＡを鋳型として使用し、各ｃＤＮＡ遺伝子に特異的な以下のプライマーを使用して、ＰＣＲで増幅した。
【数1】
【0080】
図１は、ＩＬ２、ＩＬ１２ｐ３５、ＩＬ１２ｐ４０、ＩＬ１５およびＩＬ－１８を含む、上記サイトカインとＳＰとの融合産物のコンストラクトを示す概略図である。同図に図解するとおり、ＳＰ－ｈＩＬ２融合産物は、ＰＣＲ増幅したｈＩＬ２およびα－シヌクレインのアミノ酸残基１１９～１４０をコードする遺伝子を、ｐＲＳＥＴＡ発現ベクターに順次サブクローニングすることによって構築した。ＳＰ－ｈＩＬ１２ｐ４０融合産物は、ＰＣＲ増幅したｈＩＬ１２ｐ４０およびα－シヌクレインのアミノ酸残基１１９～１４０をコードする遺伝子を、ｐＶＬ１３９３発現ベクターに順次サブクローニングすることによって構築した。ＳＰ－ｈＩＬ１２ｐ３５融合産物は、ＰＣＲ増幅したＳＰ－ｈＩＬ１２ｐ３５およびα－シヌクレインのアミノ酸残基１１９～１４０をコードする遺伝子を、ｐＶＬ１３９３発現ベクターに順次サブクローニングすることによって構築した。ｈＩＬ１５－ＳＰ融合産物は、ＰＣＲ増幅したｈＩＬ１５およびα－シヌクレインのアミノ酸残基１１９～１４０をコードする遺伝子を、ｐＲＳＥＴＡ発現ベクターに順次サブクローニングすることによって構築した。ＳＰ－ｈＩＬ１８融合産物は、ＰＣＲ増幅したｈＩＬ１８およびα－シヌクレインのアミノ酸残基１１９～１４０をコードする遺伝子を、ｐＲＳＥＴＡ発現ベクターに順次サブクローニングすることによって構築した。すべてのコンストラクトの配列はＤＮＡシークエンシングによって確認した。
【0081】
ＳＰ－ｈＩＬ２融合産物の核酸およびアミノ酸配列は、配列番号１および２にそれぞれ記載されている。ＳＰ－ｈＩＬ１２ｐ４０融合産物の核酸およびアミノ酸配列は、配列番号３および４にそれぞれ記載されている。ＳＰ－ｈＩＬ１２ｐ３５融合産物の核酸およびアミノ酸配列は、配列番号５および６にそれぞれ記載されている。図１に示すように、６×Ｈｉｓ－ｔａｇ配列が、ウィルスによって発現されるＳＰ－ｈＩＬ１２ｐ４０融合産物およびＳＰ－ｈＩＬ１２ｐ３５融合産物の単離および精製の目的のために、各ベクターに含有される。ｈＩＬ１５－ＳＰ融合産物の核酸およびアミノ酸配列は、配列番号７および８にそれぞれ記載されている。また、ＳＰ－ｈＩＬ１８融合産物の核酸およびアミノ酸配列は、配列番号９および１０にそれぞれ記載されている。
【0082】
調製例２：組換えＳＰ融合タンパク質の発現および精製
組換えＳＰ－ｈＩＬ２タンパク質を発現するために構築した発現ベクターは、Escherichia coli BL21(DE3)RIPL（Invitrogen）に形質転換し、次いでインキュベートした。培養液を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、細胞ペレットを得た。細胞ペレットはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に再懸濁し、その後、超音波処理によってホモジナイズした。E. coliにおいて不溶性の形態で発現されたＳＰ融合タンパク質をリフォールディングの手順に供し、その後、イオン－交換樹脂を使用して精製した。
組換えＳＰ－ｈＩＬ２タンパク質を発現するために構築した発現ベクターは、Escherichia coli BL21(DE3)RIPL（Invitrogen）に形質転換し、次いでインキュベートした。培養液を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、細胞ペレットを得た。細胞ペレットはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に再懸濁し、その後、超音波処理によってホモジナイズした。E. coliにおいて不溶性の形態で発現されたＳＰ融合タンパク質をリフォールディングの手順に供し、その後、イオン－交換樹脂を使用して精製した。
【0083】
組換えＳＰ－ｈＩＬ１２タンパク質を発現するために構築した２つの発現ベクターは、昆虫細胞系であるｓｆ２１細胞にそれぞれトランスフェクトし、ウィルス培養液を製造した。得られた２つのウィルス培養液は、ＩＬ１２ｐ４０がＩＬ１２ｐ３５に結合したヘテロ二量体ＩＬ１２ｐ７０タンパク質を生産するために、同時に昆虫ｓｆ２１細胞系にトランスフェクトし、これをその後、精製した。
【0084】
組換えｈＩＬ１５－ＳＰタンパク質を発現するために構築した発現ベクターは、E. coli BL21(DE3)RIPL（Invitrogen）に形質転換し、次いでインキュベートした。培養液を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、細胞ペレットを得た。細胞ペレットはＰＢＳ（ｐＨ７．４）に再懸濁し、その後、超音波処理によってホモジナイズした。E. coliにおいて可溶性の形態で発現されたＳＰ融合タンパク質を、イオン－交換樹脂を使用して精製した。
【0085】
組換えＳＰ－ｈＩＬ１８タンパク質を発現するために構築した発現ベクターは、E. coli BL21(DE3)RIPL（Invitrogen）に形質転換し、次いでインキュベートした。培養液を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、細胞ペレットを得た。細胞ペレットはＰＢＳ（ｐＨ７．４）に再懸濁し、その後、超音波処理によってホモジナイズした。E. coliにおいて可溶性の形態で発現されたＳＰ融合タンパク質を、イオン－交換樹脂を使用して精製した。
【0086】
精製したＳＰ融合タンパク質（３μｇ）は、最終精製タンパク質を確認するために１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ使用して電気泳動した（図２：（ａ）ＳＰ－ｈＩＬ２タンパク質（ATGen, Cat# ATGK04）、（ｂ）ＩＬ１５－ＳＰタンパク質（ATGen, Cat# ATGK06）および（ｃ）ＳＰ－ＩＬ１８タンパク質（ATGen, Cat# ATGK07））。
【0087】
実験例１：全血においてＮＫ細胞を活性化できるサイトカインの種類の確認
正常者からの全血１ｍｌとＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌとを２４ウェル細胞培養プレートに入れ、１０ｎｇ／ｍｌの各組換えヒトインターロイキンＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５およびＩＬ－１８と混合し、その後２４時間培養した。２４時間の培養後、上清を採取し、上清中のインターフェロン－γの量をサンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用して測定した（図３Ａ）。結果として、正常者の血液試料中のＮＫ細胞によって分泌されたサイトカインは、微量であったため、検出されなかったが、血液試料をＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５およびＩＬ－１８の少なくとも１つで処理すると、血液試料中のＮＫ細胞から分泌されるサイトカインのレベルは上昇した。血液試料をＮＫ細胞スティミュレーターのみで処理すると、血液試料中のインターフェロン－γのレベルが、特にＩＬ－２で処理した群およびＩＬ－１２で処理した群において上昇することが分かった（図３Ａ）。
正常者からの全血１ｍｌとＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌとを２４ウェル細胞培養プレートに入れ、１０ｎｇ／ｍｌの各組換えヒトインターロイキンＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５およびＩＬ－１８と混合し、その後２４時間培養した。２４時間の培養後、上清を採取し、上清中のインターフェロン－γの量をサンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用して測定した（図３Ａ）。結果として、正常者の血液試料中のＮＫ細胞によって分泌されたサイトカインは、微量であったため、検出されなかったが、血液試料をＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５およびＩＬ－１８の少なくとも１つで処理すると、血液試料中のＮＫ細胞から分泌されるサイトカインのレベルは上昇した。血液試料をＮＫ細胞スティミュレーターのみで処理すると、血液試料中のインターフェロン－γのレベルが、特にＩＬ－２で処理した群およびＩＬ－１２で処理した群において上昇することが分かった（図３Ａ）。
【0088】
また、正常者からの全血１ｍｌとＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌとを２４ウェル細胞培養プレートに入れ、図３Ｂ（各１０ｎｇ／ｍｌ）に示すように、組換えヒトインターロイキンの様々な組み合わせにより処理し、２４時間培養した。２４時間の培養後、上清を採取し、インターフェロン－γのレベルを上記と同じ方法で測定した。全血をＮＫ細胞スティミュレーターの様々な組み合わせで処理すると、インターフェロン－γのレベルが、特にＩＬ－２＋ＩＬ－１２の存在下において上昇することが分かった（図３Ｂ）。
【0089】
さらに、ＩＬ－１２およびＩＬ－１５の組み合わせでの処理の後のインターフェロン－γのレベルを測定するために、全血を図３Ｃに示す濃度のＮＫ細胞スティミュレーターで処理し、２４時間培養した。２４時間の培養後、上清を採取し、インターフェロン－γのレベルを上記と同じ方法で測定した。
【0090】
ＩＬ－１２およびＩＬ－１８の組み合わせの処理の後のインターフェロン－γのレベルを測定するために、全血を図３Ｄに示す濃度のＮＫ細胞スティミュレーターでも処理し、２４時間培養した。２４時間の培養後、上清を採取し、インターフェロン－γのレベルを上記と同じ方法で測定した。
【0091】
実験例２：ＩＬ－２で人為的に活性化させたＮＫ細胞から分泌されるサイトカインの種類の確認
全血試料を６１人の正常者および５０人のがん患者から取得した。全血１ｍｌとＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌとを２４ウェル細胞培養プレートに入れ、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトインターロイキンＳＰ ＩＬ－２で処理し、その後２４時間培養した。２４時間の培養後、上清を採取し、その後、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用して、インターフェロン－γ、ＴＮＦ－αおよびＭＩＰ－１βのレベルを測定した。結果として、図４に示すように、インターフェロン－γおよびＴＮＦ－αが、がん患者のよりも少ない量で正常者の全血から分泌されたが、ＭＩＰ－１βは、正常者およびがん患者の全血試料から分泌されたことが確認された。
全血試料を６１人の正常者および５０人のがん患者から取得した。全血１ｍｌとＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌとを２４ウェル細胞培養プレートに入れ、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトインターロイキンＳＰ ＩＬ－２で処理し、その後２４時間培養した。２４時間の培養後、上清を採取し、その後、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用して、インターフェロン－γ、ＴＮＦ－αおよびＭＩＰ－１βのレベルを測定した。結果として、図４に示すように、インターフェロン－γおよびＴＮＦ－αが、がん患者のよりも少ない量で正常者の全血から分泌されたが、ＭＩＰ－１βは、正常者およびがん患者の全血試料から分泌されたことが確認された。
【0092】
疾患検査に使用されるin vitro診断試薬の場合、様々な検証技術が使用されている。ここでは、一般的に、正常範囲とカットオフ分析を使用した。正常範囲は、各試料群の平均値および標準偏差を測定するために使用される参照範囲であり、カットオフ分析は、in vitro診断試薬の推定値を計算することによって臨床的感度および臨床的特異度を測定する方法である。臨床的感度は、患者が疾患を患っている場合に、診断検査の結果が陽性を示すことが実証される確率を意味し、臨床的特異度は、患者が疾患を患っていない場合に、診断検査の結果が陰性を示すことが実証される確率を意味する。
【0093】
カットオフ値が１０％超および１０％未満である場合、カットオフ値はそれぞれ、正および負の値に設定されていると仮定する。その場合、臨床的感度および臨床的特異度はカットオフ分析を使用して測定した。結果を表１に示す。
【表1】
【0094】
がん患者および正常者の群において、ＩＦＮ－γは９８．４％の感度および９８％の特異度を有することが測定された。ＴＮＦ－αは９０．９％の感度および６９％の特異度を有することが測定され、ＩＦＮ－γのものより低かったが、最新の開発されたがん診断キットは高くても２０～３０％の特異度を有する。それゆえ、約７０％またはそれを超える特異度を有するＴＮＦ－αもまた、ＮＫ細胞活性を測定するためのがん診断キット用のマーカーとして使用し得ることが予想される。
【0095】
実験例３：ＳＰ ＩＬ－２およびＩＬ－２の安定性の比較
ＳＰ ＩＬ－２およびＩＬ－２の安定性を比較するために、２人から全血試料を採取した。得られた全血試料のそれぞれ１ｍｌとＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌとを、２４ウェル細胞培養プレートに入れ、その後、ＳＰ ＩＬ－２およびＩＬ－２を加え、完全に混合し、その後２４時間培養した。２４時間の培養後、上清を採取し、上清中のインターフェロン－γのレベルをサンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用して測定した。ＩＬ－２およびＳＰ ＩＬ－２の活性分析の結果から、２つのタンパク質の活性に違いがないことが分かった（図５Ａ）。しかしながら、それぞれ全血培養条件下において、ＩＬ－２ではなくＳＰ ＩＬ－２で全血を処理した場合、ＮＫ細胞がＳＰ ＩＬ－２によって活性化され、それによってインターフェロン－γのレベルが上昇したことが確認できた（図５Ｂ）。このことは、２つのタンパク質の活性に違いはないが、ＳＰを適用することでＩＬ－２の安定性が増大することを示す。
ＳＰ ＩＬ－２およびＩＬ－２の安定性を比較するために、２人から全血試料を採取した。得られた全血試料のそれぞれ１ｍｌとＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌとを、２４ウェル細胞培養プレートに入れ、その後、ＳＰ ＩＬ－２およびＩＬ－２を加え、完全に混合し、その後２４時間培養した。２４時間の培養後、上清を採取し、上清中のインターフェロン－γのレベルをサンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用して測定した。ＩＬ－２およびＳＰ ＩＬ－２の活性分析の結果から、２つのタンパク質の活性に違いがないことが分かった（図５Ａ）。しかしながら、それぞれ全血培養条件下において、ＩＬ－２ではなくＳＰ ＩＬ－２で全血を処理した場合、ＮＫ細胞がＳＰ ＩＬ－２によって活性化され、それによってインターフェロン－γのレベルが上昇したことが確認できた（図５Ｂ）。このことは、２つのタンパク質の活性に違いはないが、ＳＰを適用することでＩＬ－２の安定性が増大することを示す。
【0096】
実験例４：ＮＫ細胞を刺激するための条件に応じた、正常者およびがん患者からのＮＫ細胞活性の比較
２０人の正常者および４８人の末期（３～４段階）がん患者から採取した全血試料のそれぞれ１ｍｌと、ＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌとを、２４ウェル細胞培養プレートに入れ、各試料を２つのサブグループに分け、サブグループをそれぞれ、ＳＰ ＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍｌ）（条件Ａ）およびＳＰ ＩＬ－２（５ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ－１２（５ｎｇ／ｍｌ）（条件Ｂ）で処理し、その後２４時間培養した。培養の後、上清を採取し、インターフェロン－γのレベルをサンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用して測定した。
２０人の正常者および４８人の末期（３～４段階）がん患者から採取した全血試料のそれぞれ１ｍｌと、ＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌとを、２４ウェル細胞培養プレートに入れ、各試料を２つのサブグループに分け、サブグループをそれぞれ、ＳＰ ＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍｌ）（条件Ａ）およびＳＰ ＩＬ－２（５ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ－１２（５ｎｇ／ｍｌ）（条件Ｂ）で処理し、その後２４時間培養した。培養の後、上清を採取し、インターフェロン－γのレベルをサンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用して測定した。
【0097】
結果として、条件Ａの場合において、図６に示すように、正常者の約９０％が高いインターフェロン－γレベルを有したが、がん患者の大半は低いインターフェロン－γレベルを有したことが分かった。条件Ｂの場合においても、正常者は高いインターフェロン－γレベルを有したが、がん患者の大半は低いインターフェロン－γのレベルを有したことが分かった。しかしながら、条件Ａの場合と比較して、条件Ｂの場合における、高いインターフェロン－γレベルはがん患者においてより高かった。ＳＰ ＩＬ－２のみで全血試料を処理する場合、ＮＫ細胞のみが特異的に活性化される（以下の実験例５および図７参照）が、全血試料がＳＰ ＩＬ－２およびＩＬ－１２の組み合わせで処理する場合、ＮＫ細胞はＴ細胞と共に活性化されるようである。それゆえ、インターフェロン－γのレベルがＴ細胞の活性化により上昇するようである。そのため、Ｔ細胞活性が残っているがん患者の一部において、高いインターフェロン－γレベルが観察される可能性があると考えられる。条件Ｂで処理された場合であっても、がん患者が低いインターフェロン－γレベルを有する場合、ＮＫ細胞の抗がん免疫および全般的な全身性免疫ががん患者において減少したと推定できる。これを、がんの進行と予後を決定するための重要なマーカーとして使用することが考えられる。
【0098】
実験例５：血液試料の種類に応じた、正常者およびがん患者のＮＫ細胞活性の比較
正常者からの血液試料の種類に応じた、ＩＬ２によるインターフェロン－γ分泌能力の違いを決定するために、以下の実験を行った。（ａ）Ｔ細胞からのＩＬ２ １ｎｇ／ｍｌに対するＮＫ細胞のインターフェロン－γ分泌能力、（ｂ）ＮＫ細胞からのＩＬ２ １ｎｇ／ｍｌに対するＮＫ細胞のインターフェロン－γ分泌能力、（ｃ）全血からのＩＬ２ １ｎｇ／ｍｌに対するＮＫ細胞のインターフェロン－γ分泌能力、および（ｄ）ＰＢＭＣからのＩＬ２濃度に応じたＮＫ細胞のインターフェロン－γ分泌能力を測定した。結果を図７に示す。インターフェロン－γは上記と同じ方法で測定した。結果として、Ｔ細胞におけるＩＬ２の活性化によって分泌されたインターフェロン－γの量は変化したが、未処理群のインターフェロン－γのものと大きく違わなかったため、Ｔ細胞は血液試料として使用するには適さなかった。全血、ＰＢＭＣｓおよびＮＫ細胞において、未処理群のインターフェロン－γの量と比較して、インターフェロン－γの量に有意な差があった。そのため、全血、ＰＢＭＣｓおよびＮＫ細胞は、本発明による方法およびキットに適用するための好適な血液試料であると評価された。
正常者からの血液試料の種類に応じた、ＩＬ２によるインターフェロン－γ分泌能力の違いを決定するために、以下の実験を行った。（ａ）Ｔ細胞からのＩＬ２ １ｎｇ／ｍｌに対するＮＫ細胞のインターフェロン－γ分泌能力、（ｂ）ＮＫ細胞からのＩＬ２ １ｎｇ／ｍｌに対するＮＫ細胞のインターフェロン－γ分泌能力、（ｃ）全血からのＩＬ２ １ｎｇ／ｍｌに対するＮＫ細胞のインターフェロン－γ分泌能力、および（ｄ）ＰＢＭＣからのＩＬ２濃度に応じたＮＫ細胞のインターフェロン－γ分泌能力を測定した。結果を図７に示す。インターフェロン－γは上記と同じ方法で測定した。結果として、Ｔ細胞におけるＩＬ２の活性化によって分泌されたインターフェロン－γの量は変化したが、未処理群のインターフェロン－γのものと大きく違わなかったため、Ｔ細胞は血液試料として使用するには適さなかった。全血、ＰＢＭＣｓおよびＮＫ細胞において、未処理群のインターフェロン－γの量と比較して、インターフェロン－γの量に有意な差があった。そのため、全血、ＰＢＭＣｓおよびＮＫ細胞は、本発明による方法およびキットに適用するための好適な血液試料であると評価された。
【0099】
実験例６：ＬＰＳによる、正常者から提供されたＮＫ細胞活性の比較
血液試料中のＮＫ細胞を刺激し、人為的にＮＫ細胞を活性化してインターフェロン－γを生成させる役目をする作用物質の他の例として、ＬＰＳを、ヒト全血からのインターフェロン－γの量を測定するために使用した。図８に示すように、インターフェロン－γの分泌が５０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳによって誘導されたことが明らかとなり、これはＮＫ細胞がＬＰＳなどの非特異的アゴニストで刺激される場合であっても、ＮＫ細胞が人為的に活性化し、インターフェロン－γを生成し得ることを示すものである。
血液試料中のＮＫ細胞を刺激し、人為的にＮＫ細胞を活性化してインターフェロン－γを生成させる役目をする作用物質の他の例として、ＬＰＳを、ヒト全血からのインターフェロン－γの量を測定するために使用した。図８に示すように、インターフェロン－γの分泌が５０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳによって誘導されたことが明らかとなり、これはＮＫ細胞がＬＰＳなどの非特異的アゴニストで刺激される場合であっても、ＮＫ細胞が人為的に活性化し、インターフェロン－γを生成し得ることを示すものである。
【0100】
実験例７：安定化ペプチドと融合したｈＩＬ１２およびｈＩＬ１５によるＮＫ細胞の刺激
ＮＫ細胞をインキュベートするチューブとして、抗凝固剤であるヘパリンナトリウムを含有するチューブ（BD）を購入し、血液の凝固を防ぐために使用した。５ｍｌの全血を採取し、抗凝固剤（ヘパリンナトリウム）を含有するチューブの中に入れた。得られた全血の１ｍｌをＲＰＭＩ１６４０培地と混合し、ＮＫ細胞アクチベーターであるＳＰ－ｈＩＬ２／ｈＩＬ１２をそれに加えた。得られた混合物を３７℃で１６～２４時間インキュベートした。安定化ペプチドが融合したＳＰｈＩＬ２およびｈＩＬ１２による、全血におけるＮＫ細胞の刺激は、上記実験例において記載された方法に従ってインキュベートした血液中のインターフェロン－γの量を測定することにより決定した。
ＮＫ細胞をインキュベートするチューブとして、抗凝固剤であるヘパリンナトリウムを含有するチューブ（BD）を購入し、血液の凝固を防ぐために使用した。５ｍｌの全血を採取し、抗凝固剤（ヘパリンナトリウム）を含有するチューブの中に入れた。得られた全血の１ｍｌをＲＰＭＩ１６４０培地と混合し、ＮＫ細胞アクチベーターであるＳＰ－ｈＩＬ２／ｈＩＬ１２をそれに加えた。得られた混合物を３７℃で１６～２４時間インキュベートした。安定化ペプチドが融合したＳＰｈＩＬ２およびｈＩＬ１２による、全血におけるＮＫ細胞の刺激は、上記実験例において記載された方法に従ってインキュベートした血液中のインターフェロン－γの量を測定することにより決定した。
【0101】
また、全血の培養条件に応じて分泌されるインターフェロン－γの量を測定した。図９に示すように、ＮＫ細胞を、ウシ血清アルブミンなどの担体タンパク質が添加されたＰＢＳ中でインキュベートした場合、ＮＫ細胞をＰＢＳ中でインキュベートした場合と比較して、ＮＫ細胞のインターフェロン－γ分泌能力が上昇したことが明らかとなった。
【0102】
実験例８：がんの進行段階に応じたインターフェロン－γ分泌の違い
がんの進行段階応じた分泌インターフェロン－γの量を決定するために、がん患者１（乳癌から完全に回復した患者）、がん患者２（脳腫瘍を患っている疑いのある患者）および正常者からの全血を、ＩＬ１２ １００ｎｇ／ｍｌおよびＩＬ１５ １０００ｎｇ／ｍｌが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地中で２４時間インキュベートし、分泌されたインターフェロン－γの量を上記のとおりに測定した。全血はフローサイトメトリーにも供した。
がんの進行段階応じた分泌インターフェロン－γの量を決定するために、がん患者１（乳癌から完全に回復した患者）、がん患者２（脳腫瘍を患っている疑いのある患者）および正常者からの全血を、ＩＬ１２ １００ｎｇ／ｍｌおよびＩＬ１５ １０００ｎｇ／ｍｌが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地中で２４時間インキュベートし、分泌されたインターフェロン－γの量を上記のとおりに測定した。全血はフローサイトメトリーにも供した。
【0103】
結果として、図１０に示すように、インターフェロン－γの分泌能力が、正常者、がん患者１およびがん患者２の順に確認された。そのため、分泌されるインターフェロン－γの量は、がんの進行段階に応じて異なることが確認された。これらの事実から、本発明による方法が、血液試料中のＮＫ細胞によって分泌されるインターフェロン－γの量を測定し、それによって、がんの罹患および進行段階の予測、または、がんの再発を予測するために使用できることが分かった。
【0104】
実験例９：ＮＫ細胞の刺激により生成されるインターフェロン－γの定量化
ＮＫ細胞をインキュベートするチューブとして、抗凝固剤であるヘパリンナトリウムを含有するチューブ（BD）を購入し、血液の凝固を防ぐために使用した。５ｍｌの全血を８人の正常者から採取し、抗凝固剤（ヘパリンナトリウム）を含有するチューブの中に入れた。得られた全血の１ｍｌをＲＰＭＩ１６４０培地と混合し、安定化ペプチドと結合したＳＰ－ｈＩＬ１２／ｈＩＬ１５－ＳＰをそれに加えた。得られた混合物を３７℃で１６～２４時間インキュベートした。
ＮＫ細胞をインキュベートするチューブとして、抗凝固剤であるヘパリンナトリウムを含有するチューブ（BD）を購入し、血液の凝固を防ぐために使用した。５ｍｌの全血を８人の正常者から採取し、抗凝固剤（ヘパリンナトリウム）を含有するチューブの中に入れた。得られた全血の１ｍｌをＲＰＭＩ１６４０培地と混合し、安定化ペプチドと結合したＳＰ－ｈＩＬ１２／ｈＩＬ１５－ＳＰをそれに加えた。得られた混合物を３７℃で１６～２４時間インキュベートした。
【0105】
３７℃でインキュベートした８人の正常者からの全血を１５００～２０００ｇで遠心分離し、上清としての血清を得た。その後、血清の１５０～２００μｌを採取し、インターフェロン－γＥＬＩＳＡに供した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ一次抗体（抗ヒトインターフェロン－γモノクローナル抗体、ATGen、Cat# ATGK02）をコーティングバッファー（０．１炭酸ナトリウム、ｐＨ９．５）で１：１０００の比率に希釈した。希釈した一次抗体を、１００μｌ／ウェルの量で９６ウェルマイクロタイターＥＬＩＳＡプレート（Nunc Maxisorp、NUNC, Naperville, IL）に分け、１６～１８時間、４℃で維持した。その後、プレート内の溶液を除去し、プレートを４００μｌ／ウェルの量の洗浄溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で洗浄した。この場合、洗浄は３回行った。その後、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＰＢＳを３００μｌ／ウェルの量で分け、室温で１時間維持した。その後、プレート内の溶液を除去し、プレートを４００μｌ／ウェルの量のＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ溶液）で洗浄した。この場合、洗浄は３回行った。一次抗体でコーティングした９６ウェルマイクロタイターＥＬＩＳＡプレートをシールし、使用するために４℃で保管した。
【0106】
インターフェロン－γ標準溶液（組換えヒトインターフェロン－γ（ATGen, Cat# IFG4001）２００ｎｇおよび０．０５％Ｐｒｏｃｌｉｎ３００を含有するＰＢＳ）を希釈し、一次抗体でコーティングした９６ウェルマイクロタイターＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／ウェルの量で分け、実験段階で調製した患者の血清を１００μｌ／ウェルの量で分け、その後室温で２時間維持した。
【表2】
【0107】
２時間後、９６ウェルマイクロタイターＥＬＩＳＡプレート内の溶液を除去し、プレートを４００μｌ／ウェルの量の洗浄溶液で洗浄した。この場合、洗浄は３回行った。その後、２次抗体（ビオチン化抗ヒトインターフェロン－γモノクローナル抗体（ATGen Cat# ATGK03））を希釈溶液で１：５００の比率に希釈し、１００μｌ／ウェルの量で分け、その後室温で１時間維持した。その後、プレート内の溶液を除去し、プレートを４００μｌ／ウェルの量の洗浄溶液で３回洗浄した。ＨＲＰ結合ストレプトアビジン溶液（Thermo Scientific, Cat# 21130）を、希釈溶液で１：３０００の比率に希釈し、１００μｌ／ウェルの量で分け、その後室温で３０分維持した。その後、希釈したＨＲＰ結合ストレプトアビジン溶液をＥＬＩＳＡプレートに分け、１時間インキュベートした。１時間の培養の後、９６ウェルマイクロタイターＥＬＩＳＡプレート内の溶液を除去し、プレートを４００μｌ／ウェルの量の洗浄溶液で３回洗浄した。
【0108】
テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）１ｍｇを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１ｍｌに溶解し、得られた混合液を０．０５Ｍクエン酸リン酸塩バッファー９ｍｌで希釈して基質溶液を調製した。その後、基質溶液を１００μｌ／ウェルの量でプレートに分け、室温で３０分間維持した。
【0109】
反応停止溶液（２Ｎ希硫酸溶液）を１００μｌ／ウェルの量で分けて反応を停止させ、得られた反応液をＥＬＩＳＡリーダーを使用して４５０ｎｍで測定した。
【0110】
８人の正常者からの全血を使用して測定したＮＫ細胞のインターフェロン－γ分泌能力を図１１に示す。これらの結果は、全血がサイトカインによって刺激されると、血液中に存在する免疫細胞がインターフェロン－γの分泌を誘導するために効果的に活性化されることを示す。
【0111】
さらに、８人の正常者からの全血をサイトカインによって刺激した後、全血をフローサイトメトリーに供した。結果を図１２に示す。これらの結果から、ＮＫ細胞が全血の刺激によって活性化されたときに、ＮＫ細胞が細胞毒性を示したことが明らかとなった。ＣＤ５６はＮＫ細胞のマーカーであり、ＣＤ１０７ａはＮＫ細胞が細胞傷害性顆粒を分泌していることを示すマーカーである。図１１のインターフェロン－γ分泌結果が、図１２のＮＫ細胞による細胞傷害性の結果と顕著に相関することから、全血の刺激によるＮＫ細胞のインターフェロン－γ分泌能力は、間接的にＮＫ細胞の細胞傷害性を表すことが分かった。
【0112】
本発明によると、がんの罹患または再発は、例えば、がんを患っている、または、がんの疑いのある対象においてin vivo免疫システムにおける変化をモニタリングすること、および、血液中のＮＫ細胞活性を測定することによって診断することができる。そのため、本発明は、対象からの血液試料を使用して、がんの罹患または再発を予測することに有用たり得る。
【0113】
本明細書に例示的な態様を開示したが、他のバリエーションが可能であることを理解すべきである。そのようなバリエーションは、本発明の例示的な態様の範囲からの逸脱としてみなされるべきではなく、当業者にとって明らかであるようなすべてのそのような改変は以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【0114】
本明細書で引用されるすべての文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-06-06
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性を測定する方法であって、
全血試料を、インターロイキン１５またはインターロイキン１８から選択される、少なくとも１つの刺激性サイトカインを含む作用物質と共にインキュベートすることによって、全血試料中のＮＫ細胞を刺激し、それによって人為的にＮＫ細胞を活性化してＮＫ細胞分泌サイトカインを生成および分泌させること；ならびに
全血試料中に分泌されたＮＫ細胞分泌サイトカインの量を測定すること、および前記量をＮＫ細胞活性を評価する尺度として使用すること；
を含み、
ＮＫ細胞分泌サイトカインは、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）、またはその両方を含む、
前記方法。
全血試料を、インターロイキン１５またはインターロイキン１８から選択される、少なくとも１つの刺激性サイトカインを含む作用物質と共にインキュベートすることによって、全血試料中のＮＫ細胞を刺激し、それによって人為的にＮＫ細胞を活性化してＮＫ細胞分泌サイトカインを生成および分泌させること；ならびに
全血試料中に分泌されたＮＫ細胞分泌サイトカインの量を測定すること、および前記量をＮＫ細胞活性を評価する尺度として使用すること；
を含み、
ＮＫ細胞分泌サイトカインは、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）、またはその両方を含む、
前記方法。
【請求項2】
ＮＫ細胞の刺激が、全血試料を、インターロイキン１５と共にインキュベートすることによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ＮＫ細胞の刺激が、全血試料を、インターロイキン１５およびインターロイキン１２と共にインキュベートすることによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
ＮＫ細胞の刺激が、全血試料を、インターロイキン１８と共にインキュベートすることによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
ＮＫ細胞の刺激が、全血試料を、インターロイキン１８およびインターロイキン１２と共にインキュベートすることによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
ＮＫ細胞分泌サイトカインがインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
ＮＫ細胞分泌サイトカインの量の測定が、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）または他の免疫学的分析によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
少なくとも１つの刺激性サイトカインが、安定化ペプチドとの融合タンパク質の形態であり、
安定化ペプチドが、シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドであり、
安定化ペプチドが、α－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基１０３～１１５（配列番号２２）、アミノ酸残基１１４～１２６（配列番号２３）、アミノ酸残基１１９～１４０（配列番号２４）またはアミノ酸残基１３０～１４０（配列番号２５）、β－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基８５～１３４（配列番号２７）、γ－シヌクレインのアミノ酸残基１～１２７（配列番号２８）、またはγ－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基９６～１２７（配列番号２９）を含む、
請求項１に記載の方法。
安定化ペプチドが、シヌクレインファミリーのＣ末端酸性テールドメインペプチドであり、
安定化ペプチドが、α－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基１０３～１１５（配列番号２２）、アミノ酸残基１１４～１２６（配列番号２３）、アミノ酸残基１１９～１４０（配列番号２４）またはアミノ酸残基１３０～１４０（配列番号２５）、β－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基８５～１３４（配列番号２７）、γ－シヌクレインのアミノ酸残基１～１２７（配列番号２８）、またはγ－シヌクレインのＣ末端酸性テールドメインのアミノ酸残基９６～１２７（配列番号２９）を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項9】
全血試料中のＮＫ細胞を刺激し、それによって人為的にＮＫ細胞を活性化してＮＫ細胞分泌サイトカインを生成および分泌させるステップが、担体タンパク質を含有する溶液において行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
方法が、がんの罹患または再発の診断を補助するためのものであって、
対象におけるＮＫ細胞分泌サイトカインの量の、正常個体におけるレベルと比較した減少が、がんの罹患または再発の指標である、
請求項１に記載の方法。
対象におけるＮＫ細胞分泌サイトカインの量の、正常個体におけるレベルと比較した減少が、がんの罹患または再発の指標である、
請求項１に記載の方法。
【請求項11】
少なくとも１つの刺激性サイトカインが、安定化ペプチドとの融合タンパク質の形態であり、
融合タンパク質が、配列番号８または配列番号１０のアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載の方法。
融合タンパク質が、配列番号８または配列番号１０のアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項12】
ＮＫ細胞の刺激が、全血試料を、インターロイキン１８または安定化ペプチドとの融合タンパク質の形態であるインターロイキン１８と共にインキュベートすることによって行われる、請求項１または６に記載の方法。
【請求項13】
ＮＫ細胞の刺激が、全血試料を、インターロイキン１５または安定化ペプチドとの融合タンパク質の形態であるインターロイキン１５と共にインキュベートすることによって行われる、請求項１または６に記載の方法。
【請求項14】
ＮＫ細胞活性は、経時的なＮＫ細胞活性の上昇または減少についてモニタリングされる、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
ＮＫ細胞活性の測定が、対象からの全血試料中に分泌されたＮＫ細胞分泌サイトカインの測定量を、正常者の全血試料中に分泌されたＮＫ細胞分泌サイトカインの測定量と比較することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
作用物質がインターロイキン１８を含む場合に、前記作用物質はインターロイキン１２を含まずおよびリポ多糖（ＬＰＳ）を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法を用いて、がんの罹患または再発の診断を補助する方法。
【請求項18】
全血試料が、ヒト全血試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項19】
全血試料中のＮＫ細胞が、刺激のステップの前において、不活性化状態にある、請求項１に記載の方法。
【外国語明細書】