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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023115283
(43)【公開日】2023-08-18
(54)【発明の名称】サポニンの新規な使用およびその分離のための方法
(51)【国際特許分類】
A61K 47/26 20060101AFI20230810BHJP
A61K 9/16 20060101ALI20230810BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20230810BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230810BHJP
【ＦＩ】
A61K47/26
A61K9/16
A61K31/7088
A61P43/00 105
【審査請求】有
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023106442
(22)【出願日】2023-06-28
(62)【分割の表示】P 2020501113の分割
【原出願日】2018-07-10
(31)【優先権主張番号】17180730.8
(32)【優先日】2017-07-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】18152304.4
(32)【優先日】2018-01-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(71)【出願人】
【識別番号】518294476
【氏名又は名称】フライエ ウニヴェルジテート ベルリン
(74)【代理人】
【識別番号】110002000
【氏名又は名称】弁理士法人栄光事務所
(72)【発明者】
【氏名】ヴェンク，アレクサンダー
(72)【発明者】
【氏名】メルツィヒ，マティアス エフ．
(72)【発明者】
【氏名】サマ，シムコ
(57)【要約】
【課題】本発明の目的は、ペプチドおよび核酸などの低分子化合物の細胞内送達に関して、サポニンＳＯ１８６１よりもさらに良好な特性を有する化合物を提供することである。
【解決手段】本発明は、その糖残基の１つにアセチル残基を含むサポニンの、新規な使用に関する。これらのサポニンは、既知のサポニンよりも、またさらにリポフェクタミンよりも、驚くべき高程度までトランスフェクション効率を増強することができる。
【選択図】図８
【解決手段】本発明は、その糖残基の１つにアセチル残基を含むサポニンの、新規な使用に関する。これらのサポニンは、既知のサポニンよりも、またさらにリポフェクタミンよりも、驚くべき高程度までトランスフェクション効率を増強することができる。
【選択図】図８
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞への核酸のインビトロ送達における、式（ＩＸ）のサポニンの使用。
［式中、Ｒ１はキシロース残基であるという条件付きである。］
【化1】
［式中、Ｒ１はキシロース残基であるという条件付きである。］
【請求項2】
前記細胞が真核細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項3】
前記サポニンが、リポソームベースのトランスフェクション試薬およびポリマーベースのトランスフェクション試薬からなる群より選択される少なくとも１つのトランスフェクション試薬と組合せて適用されることを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。
【請求項4】
リポソームベースのトランスフェクション試薬およびポリマーベースのトランスフェクション試薬からなる群より選択される、少なくとも１つのトランスフェクション試薬、ならびに、式（ＩＸ）のサポニンを含む、核酸のインビトロ送達における使用のためのトランスフェクション組成物。
［式中、Ｒ１はキシロース残基であるという条件付きである。］
【化2】
［式中、Ｒ１はキシロース残基であるという条件付きである。］
【請求項5】
式（ＩＸ）のサポニンの存在下に、細胞を核酸とインキュベートする工程を含む、インビトロのトランスフェクションのための方法。
［式中、Ｒ１はキシロース残基であるという条件付きである。］
【化3】
［式中、Ｒ１はキシロース残基であるという条件付きである。］
【請求項6】
前記細胞が真核細胞であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記核酸がナノ粒子の一部を形成することを特徴とする、請求項５または６に記載の方法。
【請求項8】
前記サポニンが、１μｇ／ｍＬから２５μｇ／ｍＬの範囲にある濃度において使用されることを特徴とする、請求項５から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記サポニンが、リポソームベースのトランスフェクション試薬およびポリマーベースのトランスフェクション試薬からなる群より選択される少なくとも１つのトランスフェクション試薬と組合せて適用されることを特徴とする、請求項５から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
以下の工程：
・Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ ｅｌｅｇａｎｓ Ｍ．Ｂｉｅｂの根を切断すること、
・切断された前記根を凍結乾燥および粉砕して、根粉末を得ること、
・前記根粉末を、５０％（ｖ／ｖ）を超える濃度のメタノールを溶媒として用いて抽出して、根抽出物を得ること、
・前記根抽出物から前記メタノールを除去して、乾燥抽出物を得ること、
・前記乾燥抽出物を、溶媒である５０％（ｖ／ｖ）未満の濃度のメタノール中に溶解して、抽出物溶液を得ること、
・前記抽出物溶液を、少なくとも１つのクロマトグラフ分離工程に供して、精製されたサポニン溶液を得ること、および
・前記精製されたサポニン溶液から、いかなる溶媒も除去して、精製されたサポニン粉末を得ること、
を含む、式（ＩＸ）のサポニンを、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ ｅｌｅｇａｎｓ Ｍ．Ｂｉｅｂから単離するための方法。
［式中、Ｒ１はキシロース残基であるという条件付きである。］
・Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ ｅｌｅｇａｎｓ Ｍ．Ｂｉｅｂの根を切断すること、
・切断された前記根を凍結乾燥および粉砕して、根粉末を得ること、
・前記根粉末を、５０％（ｖ／ｖ）を超える濃度のメタノールを溶媒として用いて抽出して、根抽出物を得ること、
・前記根抽出物から前記メタノールを除去して、乾燥抽出物を得ること、
・前記乾燥抽出物を、溶媒である５０％（ｖ／ｖ）未満の濃度のメタノール中に溶解して、抽出物溶液を得ること、
・前記抽出物溶液を、少なくとも１つのクロマトグラフ分離工程に供して、精製されたサポニン溶液を得ること、および
・前記精製されたサポニン溶液から、いかなる溶媒も除去して、精製されたサポニン粉末を得ること、
を含む、式（ＩＸ）のサポニンを、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ ｅｌｅｇａｎｓ Ｍ．Ｂｉｅｂから単離するための方法。
【化4】
［式中、Ｒ１はキシロース残基であるという条件付きである。］
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、請求項１の前文によるサポニンのインビトロの使用と、請求項３の前文によるかかるサポニンのインビボの使用と、請求項７の前文によるトランスフェクション組成物と、請求項１０の前文によるインビトロのトランスフェクションのための方法と、および請求項１５の前文による、かかるサポニンを単離するための方法とに関する。
【背景技術】
【0002】
多くのサポニンが過去において記載されてきた。代表的には、［非特許文献１］；［非特許文献２］；［非特許文献３］；および［非特許文献４］が参照される。
【0003】
さらなるサポニンは、以下の刊行物に記載されている：［非特許文献５］；［非特許文献６］；［非特許文献７］；［非特許文献８］；［非特許文献９］；［非特許文献１０］。
【0004】
特定のサポニン（ＳＯ１８６１）が、ペプチドおよび脂質ナノ粒子の改善された細胞内送達を媒介し得ることも記載されている［非特許文献１１］。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｗｅｎｇ Ａｌｅｘａｎｄｅｒら著、Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｏｘｉｎｓ ａｎｄ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ（腫瘍療法における標的化トキシンおよびサポニンの併用用途のための、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａサポニンの単離のための簡単な方法），「Ｐｌａｎｔａ ｍｅｄｉｃａ」、２００９年、第７５巻、第１３号、Ｐ．１４２１－１４２２．
【非特許文献2】Ｗｅｎｇ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒら著、Ａ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓａｐｏｎｉｎ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｕｍｏｕｒ ｔｈｅｒａｐｙ（腫瘍療法におけるサポニン単離のための便利な方法）、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ」、２０１０年、第８７８巻、第７号、Ｐ．７１３－７１８．
【非特許文献3】Ｗｅｎｇ Ａｌｅｘａｎｄｅｒら著、Ｔｈｅ ｔｏｘｉｎ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｔｏｘｉｎｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｔｈｅｉｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｂｙ ｓａｐｏｎｉｎｓ（標的化抗腫瘍トキシンの毒素成分は、サポニンによるその効能増強を決定する）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｏｎｃｏｌｏｇｙ」、２０１２年、第６巻、第３号、Ｐ．３２３－３３２．
【非特許文献4】Ｗｅｎｇ Ａｌｅｘａｎｄｅｒら著、Ｓａｐｏｎｉｎｓ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏｘｉｎｓ（サポニンはタンパク質トキシンの細胞内トラフィッキングを調節する）、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ」、２０１２年、第１６４巻、第１号、Ｐ．７４－８６．
【非特許文献5】Ｔｈａｋｕｒ，Ｍａｙａｎｋら著、Ｈｉｇｈ－ｓｐｅｅｄ ｃｏｕｎｔｅｒｃｕｒｒｅｎｔ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｏｆｆ－ｌｉｎｅ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｏｒｍｅｔｒｙ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｂｉｓｄｅｓｍｏｄｉｃ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ ｐｏｓｓｅｓｓｉｎｇ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｎ ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｔｏｘｉｎｓ（標的化抗腫瘍トキシンに対し相乗的な毒性増強特性を有する、サポナリア・オフィキナリス由来のビスデスモディックサポニンの、高速向流クロマトグラフィー回収率およびオフラインエレクトロスプレーイオン化質量分析プロファイリング）、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ」、２０１４年、第９５５巻、Ｐ．１－９．
【非特許文献6】Ｊｉａ，Ｚｈｏｎｇｈｕａ，Ｋａｚｕｏ Ｋｏｉｋｅ，およびＴａｍｏｔｓｕ Ｎｉｋａｉｄｏ著、Ｍａｊｏｒ ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ（サポナリア・オフィキナリス由来の主要なトリテルペノイドサポニン）、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ」、１９９８年、第６１巻、第１１号、Ｐ．１３６８－１３７３．
【非特許文献7】Ｈａｄｄａｄ，Ｍｏｈａｍｅｄら著、Ｎｅｗ ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ Ａｃａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｕｍ ｐａｃｈｙｓｔｅｇｉｕｍ（アカントフィルム・パキステギウム由来の新規トリテルペンサポニン）、「Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ ｃｈｉｍｉｃａ ａｃｔａ」、２００４年、第８７巻、第１号、Ｐ．７３－８１．
【非特許文献8】Ｆｕ，Ｈｏｎｇｚｈｅｎｇら著、Ｓｉｌｅｎｏｒｕｂｉｃｏｓｉｄｅｓ Ａ－Ｄ，Ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄ Ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｓｉｌｅｎｅ ｒｕｂｉｃｕｎｄａ（シレネ・ルビクンダ由来のトリテルペノイドサポニン、シレノルビコシドＡ－Ｄ）、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ」、２００５年、第６８巻、第５号、Ｐ．７５４－７５８．
【非特許文献9】Ｍｏｎｉｕｓｚｋｏ－Ｓｚａｊｗａｊ，Ｂａｒｂａｒａら著、Ｈｉｇｈｌｙ Ｐｏｌａｒ Ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄ Ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｒｏｏｔｓ ｏｆ Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｌ（サポナリア・オフィキナリスＬ．の根由来の高極性トリテルペノイドサポニン）、「Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ」、２０１６年、第９９巻、第５号、Ｐ．３４７－３５４．
【非特許文献10】Ｆｕｃｈｓ，Ｈｅｎｄｒｉｋら著、Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ Ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ ａｓ Ｅｎｄｏｓｏｍａｌ Ｅｓｃａｐｅ Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ ｉｎ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｕｍｏｒ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ（標的化腫瘍療法におけるエンドソーム脱出促進剤としてのグリコシル化トリテルペノイド）、「Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ」、２０１７年、第５巻、第２号、Ｐ．１４．
【非特許文献11】Ｗｅｎｇ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒら著、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ－ ａｎｄ ｌｉｐｉｄ－ｎａｎｏｐｌｅｘｅｓ ｂｙ ｎａｔｕｒａｌ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ（天然グリコシドによる、ペプチド－および脂質－ナノプレックスの改良された細胞内送達）、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ」、２０１５年、第２０６巻、Ｐ．７５－９０．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の目的は、ペプチドおよび核酸などの低分子化合物の細胞内送達に関して、サポニンＳＯ１８６１よりもさらに良好な特性を有する化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
驚いたことに、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ ｅｌｅｇａｎｓ Ｍ．Ｂｉｅｂ（カスミソウ）から単離可能なサポニンは、細胞への低分子の送達、特に核酸の送達に関し、優れた効果を有する。かかるサポニンは、式（Ｉ）に対応する：
【0008】
【化1】
【0009】
これによれば、Ｒ１は、そのＣ１原子によって、式（Ｉ）の対応するキシロース残基に結合された、キシロース残基またはアラビノース残基であり；かつＲ２は、同じ分子内の他のＲ２残基とは独立して、Ｈまたはアセチル残基であるが、但し、少なくとも２つのアセチル残基がサポニン中に存在するという条件付きである。
【0010】
このサポニンは、共通したサポニンコア構造をもち、何ら異常な結合を含まない。むしろそれは、その糖残基および／またはそのアセチル残基のみにおいて、他のサポニンと異なっている。
【0011】
式（Ｉ）における個々の糖残基のよりよい同定のため、それらは上記の式（Ｉ）の描写において対応する略号で示される。それによれば、略号は以下の意味を有する：
【0012】
【表1】
【0013】
アラビノース（Ａｒａ）の構造は、式（ＩＩ）に対応する：
【0014】
【化2】
【0015】
式（Ｉ）による化合物は、ＳＯ１８６１のトランスフェクション効率のおよそ２倍高いトランスフェクション効率を示した。ＳＯ１８６１についてはトランスフェクション効率のわずかな上昇しか予想されなかったことから、このことは完全に予想外であり、驚くべき結果である。既存のサポニンの数が多いことから、本発明者らは、その使用が本明細書にクレームされている化合物が、たとえそれらの化合物がそれ自体公知である場合でも、かかる高いトランスフェクション効率を示すことは予想できなかった。サポニンは合成することができず、また一般的に化学薬品の供給元から簡単に購入することはできない。むしろ、それらは植物または植物の部分から単離される必要がある。このことは、サポニンの特性を研究することを特に難しくする。
【0016】
本発明者らは、驚くべきことに、一般式（Ｉ）によるサポニンがＧｙｐｓｏｐｈｉｌａ ｅｌｅｇａｎｓ Ｍ．Ｂｉｅｂから単離可能であること、それが予想外の高いトランスフェクション効率を示すことを見出した。かかるサポニンがＧｙｐｓｏｐｈｉｌａ ｅｌｅｇａｎｓ Ｍ．Ｂｉｅｂから抽出可能であることは、以前には記載されていなかった。むしろ、一般式（Ｉ）に該当するサポニンが全く別の植物（Ａｃｈａｔｈｏｐｈｙｌｌｕｍ ｐａｃｈｙｓｔｅｇｉｕｍ（アカントフィルム・パキステギウム））から単離されたことがＨａｄｄａｄら（詳細は上記参照）によって記載され、しかしながらこのサポニンがトランスフェクション効率を上昇させ得たことを指示するものは何ら示していない。
【0017】
したがって、本発明は、細胞への核酸、脂質、ペプチド、および／またはタンパク質のインビトロ送達における、一般式（Ｉ）によるサポニンの使用に関する。それによれば、核酸のインビトロ送達は、サポニンの特に適切な用途である。送達されるべき適切な核酸は、ＤＮＡ、例えばプラスミドＤＮＡまたはミニサークルＤＮＡ、およびＲＮＡ、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。送達されるべき核酸または他の分子は、ナノプレックスの形態で存在していていもよい。ナノプレックスは典型的には、送達されるべき低分子を結合することができるペプチドまたは脂質により生成される。したがって、核酸送達性ナノプレックスは、核酸がそれに結合される脂質または非脂質担体を含む。ナノプレックスはまたナノ粒子とも称され得る。一実施形態においては、送達されるべき核酸は、ミニサークルＤＮＡである。一実施形態では、送達されるべき分子は、ペプチドミニサークルＤＮＡ粒子である。
【0018】
一実施形態においては、核酸、脂質、ペプチド、および／またはタンパク質が送達されるべき細胞は、真核細胞である。ヒト細胞、動物細胞（例えばげっ歯類細胞）、または植物細胞が、細胞として使用されるために特に適切である。酵母細胞もまた使用可能である。
【0019】
一態様においては、本発明は、治療または診断における一般式（Ｉ）のサポニンの使用に関する。それによれば、サポニンはヒトまたは動物への核酸、脂質、ペプチド、および／またはタンパク質のインビボ送達に使用される。
【0020】
一実施形態においては、動物は哺乳類、特にげっ歯類である。
【0021】
一態様においては、少なくとも２つのサポニン、とりわけ、ちょうど２つのサポニンの混合物が使用され、これにおいて前記Ｒ１は、第１のサポニンではキシロースを、そして第２のサポニンではアラビノースを示す。
【0022】
一実施形態においては、全ての糖はそのＤ立体異性型で存在する。
【0023】
一実施形態においては、Ｒ１は、キシロース残基である。それ故、サポニンは以下の式（ＩＩＩ）に対応する：
【0024】
【化3】
【0025】
一実施形態においては、Ｒ１は、アラビノース残基である。それ故、サポニンは以下の式（ＩＶ）に対応する：
【0026】
【化4】
【0027】
一実施形態においては、サポニンは、一般式（Ｖ）の立体異性体型で存在する。同様に、一実施形態では、キシロース残基およびアラビノース残基が、式（ＶＩ）または（ＶＩＩ）の立体異性型で存在する：
【0028】
【化5】
【0029】
一実施形態においては、サポニンは、ちょうど２つのアセチル基をもち、すなわち、Ｒ２残基のうち２つはアセチル残基であり、残りのＲ２残基は水素である。
【0030】
一実施形態においては、アセチル基は対応するキノボース残基のＣ３およびＣ４位の酸素原子に結合されており、結果として式（ＶＩＩＩ）のサポニンを生じる：
【0031】
【化6】
【0032】
一実施形態においては、３つのＲ２残基全てがアセチル残基であり、結果として式（ＩＸ）のサポニンを生じる：
【0033】
【化7】
【0034】
本発明者らは驚くべきことに、一般式（Ｉ）のサポニンが、単独で用いた場合にトランスフェクション効率を上昇させるばかりでなく、古典的なトランスフェクション試薬のトランスフェクション効率を増強するためにも特に適することも見出した。したがってそれは、かかるトランスフェクション試薬のブースターとして使用可能である。上記記載の使用は、古典的なトランスフェクション試薬のためのブースターとしての、かかるサポニンの使用を包含する。一実施形態においては、サポニンは、リポソームベースのトランスフェクション試薬およびポリマーベースのトランスフェクション試薬からなる群より選択される少なくとも１つのトランスフェクション試薬と組合せて、インビボまたはインビトロにおいて使用される。かかるトランスフェクション試薬の例は、以下に列記される。
【0035】
独立した請求項間での全体的な発明の概念は、一般式（Ｉ）によるサポニンのトランスフェクション効率の有意な増強において確かめられるべきであり、そのことは本発明者らにより初めて明らかにされた。
【0036】
一態様においては、本発明は、古典的なトランスフェクション試薬と式（Ｉ）による少なくとも１つのサポニンとを含むトランスフェクション組成物であって、これにおいて、残基Ｒ１およびＲ２が上記記載の意味をもつ、該トランスフェクション組成物に関する。古典的なトランスフェクション試薬は、２つのサブグループ、すなわちリポソームベースのトランスフェクション試薬およびポリマーベースのトランスフェクション試薬に分けることができる。リポソームベースのトランスフェクション試薬は、トリメチルアンモニウムプロパンなどの極性頭部基に結合した疎水性脂肪酸鎖をもつ、ほとんどがカチオン性に帯電した脂質からなる。ポリマーベースのトランスフェクション試薬は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などの帯電した頭部基を含有する有機ポリマーからなる。
【0037】
市販の古典的なリポソームベースのトランスフェクション試薬の例は、ＭＥＴＡＦＥＣＴＥＮＥ；ＴｒａｎｓＦａｓｔ；Ｓｔｅｍｆｅｃｔ；およびＴｒａｎｓＦｅｃｔｉｎである。
【0038】
市販の古典的なポリマーベースのトランスフェクション試薬の例は、ＧｅｎｅＣｅｌｌｉｎ；Ｘ－ｔｒｅｍｅＧｅｎｅトランスフェクション試薬、例えばＸ－ｔｒｅｍｅＧｅｎｅ ９ ＤＮＡトランスフェクション試薬、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧｅｎｅ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション試薬、およびＸ－ｔｒｅｍｅＧｅｎｅ ｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬；ＴｒａｎｓＩＴトランスフェクション試薬、例えばＴｒａｎｓＩＴ－Ｘ２ダイナミック・デリバリー・システム（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ）、ＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ１試薬、ＴｒａｎｓＩＴ－２０２０試薬、ＴｒａｎｓＩＴ－ＰＲＯ試薬、ＴｒａｎｓＩＴ－ＶｉｒｕｓＧＥＮ試薬、ＴｒａｎｓＩＴ－Ｌｅｎｔｉ試薬、ＴｒａｎｓＩＴ－Ｉｎｓｅｃｔ試薬、ＴｒａｎｓＩＴ－２９３試薬、ＴｒａｎｓＩＴ－ＢｒＣａ試薬、ＴｒａｎｓＩＴ－ＣＨＯトランスフェクション試薬、ＴｒａｎｓＩＴ－ＨｅＬａＭＯＮＳＴＥＲトランスフェクション試薬、ＴｒａｎｓＩＴ－Ｊｕｒｋａｔ試薬、ＴｒａｎｓＩＴ－Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ試薬、ＴｒａｎｓＩＴ－ｍＲＮＡトランスフェクション試薬、ＴｒａｎｓＩＴ－ＴＫＯ試薬、ＴｒａｎｓＩＴ－ｓｉＱＵＥＳＴ試薬、およびＴｒａｎｓＩＴ－Ｏｌｉｇｏ試薬；Ｖｉａｆｅｃｔ；ＦｕＧＥＮＥ；Ｘｆｅｃｔ；ＴｕｒｂｏＦｅｃｔ；およびＧｅｎＪｅｔである。
【0039】
一実施形態においては、トランスフェクション組成物中のサポニンのＲ１は、キシロース残基である。
【0040】
一実施形態では、トランスフェクション組成物中のサポニンは、ちょうど２つのアセチル基をもつ。
【0041】
一実施形態では、アセチル基は、対応するキノボース残基のＣ３およびＣ４位の酸素原子に結合される。
【0042】
一実施形態では、トランスフェクション試薬は、リポソームベースのトランスフェクション試薬である。
【0043】
一実施形態では、トランスフェクション試薬は、ポリマーベースのトランスフェクション試薬である。
【0044】
一実施形態では、トランスフェクション試薬は、ＴｒａｎｓＩＴトランスフェクション試薬、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧｅｎｅトランスフェクション試薬、およびＧｅｎｅＣｅｌｌｉｎからなる群より選択される。
【0045】
一実施形態では、トランスフェクション試薬は、ＧｅｎｅＣｅｌｌｉｎである。
【0046】
一態様においては、前述の説明によるサポニンまたは少なくとも２つのサポニンの混合物を使用することにより、核酸、脂質、ペプチド、および／またはタンパク質を、それを必要とするヒトまたは動物へ送達するための方法に関する。
【0047】
一態様においては、本発明は、細胞のインビトロのトランスフェクションのための方法に関する。この方法は、前述の説明によるサポニンまたは少なくとも２つのサポニンの混合物の存在下に、細胞を核酸とインキュベートする工程を含む。トランスフェクションは、一過性トランスフェクションまたは安定トランスフェクションであってよい。ＤＮＡおよびＲＮＡは適切な核酸であり、ここではＤＮＡが特に適している。一実施形態においては、送達されるべき核酸はミニサークルＤＮＡである。
【0048】
一実施形態においては、細胞は真核細胞である。ヒト細胞、動物細胞（げっ歯類細胞など）、または植物細胞が、細胞として使用されるのに特に適している。酵母細胞もまた使用可能である。
【0049】
一実施形態では、核酸はナノ粒子の一部を形成する。一例を挙げれば、ＤＮＡナノ粒子が使用され得る。ペプチドミニサークルＤＮＡ粒子、またはＤＮＡへ結合されたペプチドを含んでいる粒子は、さらに適切な例である。同様に、ＲＮＡナノ粒子は、トランスフェクションを実施するための適切な実体である。
【0050】
一実施形態においては、サポニンは、１μｇ／ｍＬと２５μｇ／ｍＬの間、特に１．５μｇ／ｍＬと２０μｇ／ｍＬの間、特に２μｇ／ｍＬと１５μｇ／ｍＬの間、特に２．５μｇ／ｍＬと１２．５μｇ／ｍＬの間、特に３μｇ／ｍＬと１０μｇ／ｍＬの間、特に４μｇ／ｍＬと９μｇ／ｍＬの間、特に５μｇ／ｍＬと８μｇ／ｍＬの間、特に６μｇ／ｍＬと７μｇ／ｍＬの間の範囲にある濃度で使用される。
【0051】
一実施形態では、サポニンは、クレームされた方法の範囲内で、リポソームベースのトランスフェクション試薬およびポリマーベースのトランスフェクション試薬からなる群より選択される少なくとも１つのトランスフェクション試薬と組合せて使用される。かかるトランスフェクション試薬の例は、上記に列記されている。
【0052】
一態様においては、本発明は、前述の説明によるサポニンまたは少なくとも２つのサポニンの混合物を、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ ｅｌｅｇａｎｓ Ｍ．Ｂｉｅｂから単離するための方法に関する。この方法は、以下に説明される工程を含む。それによれば、工程は必ずしも示された順序で実施される必要はない。むしろ、任意の他の賢明な方法工程の順序もまた適用可能である。
【0053】
第１の工程においては、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ ｅｌｅｇａｎｓ Ｍ．Ｂｉｅｂの根が切断される。任意で、切断された根は洗浄される。続いて、切断された根は凍結乾燥され、そして粉砕される。そのようにして、根粉末が得られる。
【0054】
根粉末は、高濃度の有機溶媒を用いて抽出され、根抽出物が得られる。用語「高濃度の有機溶媒」は、５０％（ｖ／ｖ）を超える濃度をもつ有機溶媒に関係する。メタノールまたは任意の他の短鎖有機アルコールは、適した有機溶媒である。例を示せば、７０から１００％、特に７５から９５％、特に８０から９０％の溶媒濃度が、適切な高濃度である。有機溶媒が水と混和性である場合、水が共溶媒として使用され得る。
【0055】
その後、高濃度の有機溶媒が根抽出物から除去され、乾燥抽出物が得られる。この除去は、例えば減圧蒸留により実施可能である。
【0056】
乾燥抽出物は次に、低濃度の有機溶媒中に溶解されて、抽出物溶液が得られる。用語「低濃度の有機溶媒」は、５０％（ｖ／ｖ）未満の濃度をもつ有機溶媒に関係する。例を示せば、１０％から５０％、特に１５％から４５％、特に２０％から４０％、とりわけ２５％から３０％の濃度が、低濃度の有機溶媒のための適切な濃度範囲である。再度、メタノールまたは任意の他の短鎖有機アルコールが、適した有機溶媒である。同様に、低濃度の有機溶媒が水と混和性である場合、水が共溶媒として使用され得る。
【0057】
抽出物溶液は次に、少なくとも１つのクロマトグラフ分離工程に供される。それにより、精製されたサポニン溶液が得られる。クロマトグラフ分離は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により実現される。典型的には、精製されたサポニン溶液の純度を高める目的で、１つ超のクロマトグラフ分離を実施することが望ましい。したがって、第１のクロマトグラフ分離工程後に得られた精製されたサポニン溶液を、それに続く少なくとも１つのクロマトグラフ分離工程に供することが可能である。それによれば、様々なカラムが個々のクロマトグラフ分離工程において使用可能である。
【0058】
個々のクロマトグラフ分離工程は（１つ超のクロマトグラフ分離工程が実施される場合に）、様々な固定相および／または移動相において実施することが可能である。したがって、個々のクロマトグラフ分離工程において使用される溶媒を、これらの工程間で変えることが可能である。
【0059】
最後に、溶媒は、少なくとも１つのクロマトグラフ分離工程の後に、精製されたサポニン溶液から除去される。これは、例えば、減圧蒸留によるか、または凍結乾燥によって行われ得る。結果として、精製されたサポニン粉末を生じる。
【0060】
本明細書に開示された全ての実施形態は、任意の所望の方法で組合わされてもよい。さらに、説明された使用および方法の実施形態は、任意の所望の方法で、記載された別の方法および使用へ転用されてもよい。記載されたトランスフェクション組成物はまた、任意の記載された実施形態を利用することも可能である。
【0061】
本発明の態様のさらなる詳細は、代表的な実施例および添付の図面について説明されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0062】
【図1】Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ ｅｌｅｇａｎｓ Ｍ．Ｂｉｅｂの根からの乾燥された原抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図3】単離されたサポニンＧＥ１７４１のＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳクロマトグラムを示す図である。
【図4】単離されたサポニンＧＥ１７４１のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。
【図5】フローサイトメトリー法の結果を示す図である。
【図6】Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞における、ナノプレックス±トリテルペンサポニンのトランスフェクション効率を示す図である。
【図7】質量分析およびＮＭＲ分光法により解明された、ＧＥ１７４１の化学構造を示す図である。
【図8】種々のトランスフェクションエンハンサーのトランスフェクション効率のプロットを示す図である。
【図9】様々な市販のトランスフェクション法のトランスフェクション効率に対する、ＧＥ１７４１の影響を示す図である。
【図10】Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞に対するＧＥ１７４１の毒性を調べるための、第１の実験の結果を示す図である。
【図11】Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞に対するＧＥ１７４１の毒性を調べるための、第２の実験の結果を示す図である。
【図12】標的化自殺遺伝子治療の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0063】
代表的な実施形態：Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ ｅｌｅｇａｎｓ Ｍ．ＢｉｅｂからのサポニンＧＥ１７４１の単離
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ ｅｌｅｇａｎｓ Ｍ．Ｂｉｅｂからの種子を、独国ブランデンブルク州のフィールドに播種した。成熟植物を収穫し、根を切断した。根を洗浄し、凍結乾燥し、そして粉砕して粉末とした。粉末を、水中９０％メタノールにより抽出した。濾過の後、減圧蒸留によりメタノールを除去した。残留する水性抽出物を最後に凍結乾燥させた（乾燥抽出物）。乾燥抽出物を、３０％メタノール中で６０ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解した。
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ ｅｌｅｇａｎｓ Ｍ．Ｂｉｅｂからの種子を、独国ブランデンブルク州のフィールドに播種した。成熟植物を収穫し、根を切断した。根を洗浄し、凍結乾燥し、そして粉砕して粉末とした。粉末を、水中９０％メタノールにより抽出した。濾過の後、減圧蒸留によりメタノールを除去した。残留する水性抽出物を最後に凍結乾燥させた（乾燥抽出物）。乾燥抽出物を、３０％メタノール中で６０ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解した。
【0064】
溶液（各０．５ｍＬ）を、Ｋｉｎｅｔｅｘ（キネテクス、登録商標）５μｍ Ｃ１８ １００Å、ＬＣカラム２５０ｘ１０．０ｍｍを用いたセミ分取ＨＰＬＣに供した。メタノール（Ａ）／水、０．０１％ＴＦＡ（Ｂ）勾配を、３０％から９０％（Ａ）まで２０分間にわたり、そして次に３０％（Ａ）まで１０分間にわたり使用した。流量は、４ｍＬ／分であった。検出波長は、２１０および３００ｎｍであった。対応するクロマトグラムは図１に図示され、これにおいて、上部の曲線は２１０ｎｍにおける検出器シグナルを、下部の曲線は３００ｎｍにおける検出器シグナルを示す。保持時間（ＲＴ）およそ１８から２０（およそ１９）分におけるピーク（Ｐ２として示される）を収集した。多数の単離サイクルを繰り返して、収集したピークを最終的にプールした。メタノールを真空遠心分離により蒸発させ、残留する水を凍結乾燥により除去した。
【0065】
乾燥した材料を、５０％アセトニトリル中で４ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解した。溶液（各０．５ｍＬ）を、Ｋｉｎｅｔｅｘ（登録商標）５μｍ Ｃ１８ １００Å、ＬＣカラム２５０×１０．０ｍｍを用いたセミ分取ＨＰＬＣに供した。アセトニトリル（Ａ）／水、０．０１％ＴＦＡ（Ｂ）勾配を、３０％から５０％（Ａ）まで２４分間にわたり、そして次に３０％（Ａ）まで１分間にわたり使用した。検出波長は、２１０ｎｍであった。流量は、４ｍＬ／分であった。ＲＴおよそ１８分のピークを収集した。数サイクルを繰り返した。アセトニトリルを真空遠心分離により蒸発させ、残留する水を凍結乾燥により除去した。
【0066】
サンプルは、Ａｇｉｌｅｎｔ（アジレント）６２００シリーズＱ－ＴＯＦ ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳシステムを用いることにより分析した。回収された分画のＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ分析には、Ｋｉｎｅｔｅｘ（登録商標）Ｃ１８ ＨＰＬＣカラム（２．６μｍ、１００Å、（１５０×４．６ｍｍ）、アセトニトリル（Ａ）／水（Ｂ）勾配、０．０１％ギ酸を使用し、３０％から開始して７０％（Ａ）まで３０分間にわたり、０．７ｍＬ／分の流量を使用した。対応するクロマトグラムを図２に図示する。２つの顕著なピークが検出された。第１のピークの物質には質量１５３８．６７が、そして第２のピークの物質には質量１７４１．７３が帰属された。第２のピークをさらなる精製用に選んだ。
【0067】
第２のピークの乾燥した材料を、５０％アセトニトリル中で４ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解した。溶液（各０．５ｍＬ）を、セミ分取Ｋｉｎｅｔｅｘ（登録商標）Ｃ－１８カラムを用いたセミ分取ＨＰＬＣ（上記参照）に供した。アセトニトリル（Ａ）／水、０．０１％ＴＦＡ（Ｂ）勾配を３０％から５０％（Ａ）まで２４分間にわたり、そして次に３０％（Ａ）まで１分間にわたり、流量４．０ｍＬ／分を用いて使用した。検出波長は２１０ｎｍであった。ＲＴおよそ１８分のピークを、数回の反復サイクルにおいて収集した。アセトニトリルを真空遠心分離により除去し、残留する水を凍結乾燥により除去した。
【0068】
乾燥した材料を、５０％アセトニトリル中に溶解し、そして（ラン当たり０．５ｍＬを）Ｕｌｔｒａｓｅｐ（ウルトラセップ）ＥＳ ＰＥＯ、ＬＣカラム、２５０×４ｍｍ、５μｍを用いたＨＰＬＣに供した。カラムを、５％アセトニトリルによりコンディショニングした。溶媒の極性は、アセトニトリル（Ａ）／水、０．０１％ＴＦＡ（Ｂ）勾配を、１００％で開始して５％まで（Ａ）、１．２５から２１分まで適用することにより急激に変化した。検出波長は２１０ｎｍであり、流量は１ｍｌ／分であった。生成物（ＧＥ１７４１；ジプソフィロシドＡとも称される）を、ＲＴ４－６分において収集した。アセトニトリルを、真空遠心分離により除去した。凍結乾燥後、ＧＥ１７４１を白色粉末として得た。
【0069】
生成物を再び、ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳにより上記に概説したように分析した。対応するクロマトグラムを図３に図示する。ただ１つの顕著なピークが検出され、精製が成功したことが示された。質量１７４１．７３は、このピークの物質に帰属された。この質量が生成物にその名称、ＧＥ１７４１を与えた。
【0070】
ＧＥ１７４１の化学構造を解明するため、ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ測定を実施した。対応するスペクトルを図４に図示する。
【0071】
この質量分析データおよびＮＭＲ分光法によって得られたさらなるデータ（詳細は以下を参照）に基づき、このサポニンの構造が式（ＶＩＩＩ）［式中、Ｒ１はキシロース残基である］に対応することを確認することができた。しかしながら、ＧＥ１７４１の生物学的機能はおそらくは残基Ｒ１の具体的な構造によるものではないことが推定される。むしろ、ＧＥ１７４１のキノボース残基上の少なくとも１つのアセチル残基の存在が、ＧＥ１７４１の特性の関連因子であると考えられ、このことは以下にさらに詳細に説明される。ＧＥ１７４１は２つのアセチル残基（Ｃ３位に１つ、そしてＣ４位に１つ）を含んでいるが、予備データはアセチル残基の量および位置が、個々のサポニンの特性を有意に変えることなく、示された範囲内で可変であることを示唆している。
【0072】
ＧＥ１７４１の特性試験
細胞培養
ネズミ神経芽細胞腫細胞（Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞、ＡＴＴＣ ＣＣＬ－１３１（商標））およびヒト結腸直腸癌細胞（ＨＴＣ－１１６、（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２４７（商標））を、１ｇ／ＬのＤ－グルコース、１０％ＦＢＳ、および安定化グルタミンを含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。Ｎｅｕｒｏ－２Ａ－細胞は、３７℃および５％ＣＯ２においてインキュベートされた。これらの細胞を、次にＤＮＡナノ粒子（ＹＤ）とともに、新規サポニンＧＥ１７４１の有無しで、インキュベートした。
細胞培養
ネズミ神経芽細胞腫細胞（Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞、ＡＴＴＣ ＣＣＬ－１３１（商標））およびヒト結腸直腸癌細胞（ＨＴＣ－１１６、（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２４７（商標））を、１ｇ／ＬのＤ－グルコース、１０％ＦＢＳ、および安定化グルタミンを含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。Ｎｅｕｒｏ－２Ａ－細胞は、３７℃および５％ＣＯ２においてインキュベートされた。これらの細胞を、次にＤＮＡナノ粒子（ＹＤ）とともに、新規サポニンＧＥ１７４１の有無しで、インキュベートした。
【0073】
トランスフェクション実験に用いたＤＮＡナノ粒子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＤＮＡを含有していた。それにより、対応するＤＮＡナノ粒子とともにインキュベートされた細胞の蛍光を検出することで、トランスフェクション効率を非常に容易にモニターすることができた。対応するインキュベーション時間は、この場合には、４８時間となるべく選択された。
【0074】
ネガティブコントロールとして（図５の左パネル）、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞には何らＤＮＡナノ粒子を全く添加しなかった。０．３７％の見かけ上のトランスフェクション効率を示す蛍光が観察できた。この値は測定エラーを意味する。
【0075】
ペプチドミニサークルＤＮＡ粒子（ＰＭ）が、何らトランスフェクションエンハンサーを用いずにＮｅｕｒｏ２ａ細胞へ添加された場合では、わずか１．３５％のトランスフェクション効率が、検出された蛍光に基づき観察できたにすぎない（図５の中央パネル）。しかしながら、同じペプチドミニサークルＤＮＡ粒子がＧＥ１７４１（新規サポニン）と一緒に添加された場合、９８．６５％のトランスフェクション効率を、検出された蛍光に基づき観察することができた（図５の右パネル）。蛍光性細胞を検出するこれらのフローサイトメトリー法は、既に、ＧＥ１７４１による高いトランスフェクション効率の増強を示している。
【0076】
ＰＤ／ＹＤ－ナノ粒子の生成
インテグリン受容体標的化アミノ配列の有る（Ｙ）および無し（Ｐ）の、正に帯電したポリリジンポリペプチド２０ｍｇを、Ｇｅｎｅｃｕｓｔから購入した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするベクター、ｐ－ＥＧＦＰ－Ｎ３は、ＤＨ５α－Ｅ．Ｃｏｌｉ細胞を用いて取得され、かつ伝播された（１．６４５ｍｇ／ｍＬ）。ＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）ｅＧＦＰｍＲＮＡ（２０μｇ）およびＧＦＰをコードするミニサークルＤＮＡ（ジェンバンク寄託（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）：Ｕ５５７６１）を、さらなる核酸として使用した。トランスフェクションを行うため、ナノプレクスを以下のように生成した：ポリ－リジンペプチド（ＰまたはＹ）およびｐ－ＥＧＦＰ－Ｎ３（Ｄ）、ｍＲＮＡ（ｍ）またはミニサークル（Ｍ）ベクターを、４：１の割合で、水（各５０μＬ）中に希釈して、素早くピペッティングすることにより完全に混合した。ナノプレックスは３０分間のインキュベーション工程において生成させた。その後、ナノプレックス懸濁液をＯｐｔｉＭＥＭで希釈して、全体積を１ｍＬとした。市販のトランスフェクション試薬、ＴｒａｎｓＩＴ－Ｘ２（登録商標）ダイナミック・デリバリー・システム、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ（商標）ＨＰトランスフェクション試薬、ＧｅｎｅＣｅｌｌｉｎ、およびリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（登録商標））は、製造業者により記載されたように配合した。
インテグリン受容体標的化アミノ配列の有る（Ｙ）および無し（Ｐ）の、正に帯電したポリリジンポリペプチド２０ｍｇを、Ｇｅｎｅｃｕｓｔから購入した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするベクター、ｐ－ＥＧＦＰ－Ｎ３は、ＤＨ５α－Ｅ．Ｃｏｌｉ細胞を用いて取得され、かつ伝播された（１．６４５ｍｇ／ｍＬ）。ＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）ｅＧＦＰｍＲＮＡ（２０μｇ）およびＧＦＰをコードするミニサークルＤＮＡ（ジェンバンク寄託（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）：Ｕ５５７６１）を、さらなる核酸として使用した。トランスフェクションを行うため、ナノプレクスを以下のように生成した：ポリ－リジンペプチド（ＰまたはＹ）およびｐ－ＥＧＦＰ－Ｎ３（Ｄ）、ｍＲＮＡ（ｍ）またはミニサークル（Ｍ）ベクターを、４：１の割合で、水（各５０μＬ）中に希釈して、素早くピペッティングすることにより完全に混合した。ナノプレックスは３０分間のインキュベーション工程において生成させた。その後、ナノプレックス懸濁液をＯｐｔｉＭＥＭで希釈して、全体積を１ｍＬとした。市販のトランスフェクション試薬、ＴｒａｎｓＩＴ－Ｘ２（登録商標）ダイナミック・デリバリー・システム、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ（商標）ＨＰトランスフェクション試薬、ＧｅｎｅＣｅｌｌｉｎ、およびリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（登録商標））は、製造業者により記載されたように配合した。
【0077】
サポフェクション（トリテルペンサポニンを用いたトランスフェクション）
Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞またはＨＴＣ－１１６細胞（１５，０００細胞／ウェル）を、培地４００μＬのウェル体積をもつ２４ウェルプレートに播種し、２４時間培養した。トランスフェクション試薬は、上記記載のように配合し、必要に応じてサポニン溶液と混合した。培地を、最終量５００ｎｇのＤＮＡ／ＲＮＡを用いたトランスフェクション培地で置き換えた。４８時間（ＤＮＡトランスフェクション）または２４時間（ＲＮＡトランスフェクション）のインキュベーション時間の後、トランスフェクション培地を除去し、細胞をトリプシン処理して、フローサイトメトリー用（Ｃｙｔｏｆｌｅｘ）のポリスチレンチューブに移した。各測定には１０，０００個の細胞が取得された。トランスフェクション効率は、解析ソフトウェア、Ｃｙｆｌｏｇｉｃにより測定された（サンプルプロットを蛍光についてネガティブコントロールと比較することによる）。
Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞またはＨＴＣ－１１６細胞（１５，０００細胞／ウェル）を、培地４００μＬのウェル体積をもつ２４ウェルプレートに播種し、２４時間培養した。トランスフェクション試薬は、上記記載のように配合し、必要に応じてサポニン溶液と混合した。培地を、最終量５００ｎｇのＤＮＡ／ＲＮＡを用いたトランスフェクション培地で置き換えた。４８時間（ＤＮＡトランスフェクション）または２４時間（ＲＮＡトランスフェクション）のインキュベーション時間の後、トランスフェクション培地を除去し、細胞をトリプシン処理して、フローサイトメトリー用（Ｃｙｔｏｆｌｅｘ）のポリスチレンチューブに移した。各測定には１０，０００個の細胞が取得された。トランスフェクション効率は、解析ソフトウェア、Ｃｙｆｌｏｇｉｃにより測定された（サンプルプロットを蛍光についてネガティブコントロールと比較することによる）。
【0078】
細胞インピーダンス測定
リアルタイム毒性試験のために、インピーダンス測定装置、ｉＣＥＬＬｉｇｅｎｅ（登録商標）を配備した。ウェル当たり８０００個のＮｅｕｒｏ２ａ細胞を、２つの８ウェルＥ－プレート、Ｌ８に播種し、８００μＬの体積において２４時間インキュベートした。トランスフェクション毒性研究には、５０μＬの試薬を、それぞれ対応する体積の培地を除去した後に添加した。非毒性濃度である２μｇ／ｍＬのＧＥ１７４１を適用した。透過性試験には、２．５μｇ／ｍＬから６０μｇ／ｍＬまで濃度を増していくＧＥ１７４１を細胞に適用した。１０分ごとに、インピーダンス／生存率を測定した。結果は、ＲＴＣＡデータ分析ソフトウェアにより分析し表示した。
リアルタイム毒性試験のために、インピーダンス測定装置、ｉＣＥＬＬｉｇｅｎｅ（登録商標）を配備した。ウェル当たり８０００個のＮｅｕｒｏ２ａ細胞を、２つの８ウェルＥ－プレート、Ｌ８に播種し、８００μＬの体積において２４時間インキュベートした。トランスフェクション毒性研究には、５０μＬの試薬を、それぞれ対応する体積の培地を除去した後に添加した。非毒性濃度である２μｇ／ｍＬのＧＥ１７４１を適用した。透過性試験には、２．５μｇ／ｍＬから６０μｇ／ｍＬまで濃度を増していくＧＥ１７４１を細胞に適用した。１０分ごとに、インピーダンス／生存率を測定した。結果は、ＲＴＣＡデータ分析ソフトウェアにより分析し表示した。
【0079】
ＮＭＲ分光法
ＮＭＲ－分光法用のサンプルは、２ｍｇのＧＥ１７４１を６００μｌのｄ４－メタノール（重水素含量９９，９５％、デューテロ（Ｄｅｕｔｅｒｏ）、独国、カステウラン）中に溶解すること、および４ｍｇのＧＥ１７４１を６００μｌのｄ５－ピリジン（重水素含量９９，９％、デューテロ、独国、カステラウン）中に溶解することにより調製し、それぞれ１．９および３．８ｍＭ／ｌの濃度を生じた。溶液を５ｍｍのサンプルチューブに移し、これを密封して溶媒の蒸発または水の凝集を防止した。
ＮＭＲ－分光法用のサンプルは、２ｍｇのＧＥ１７４１を６００μｌのｄ４－メタノール（重水素含量９９，９５％、デューテロ（Ｄｅｕｔｅｒｏ）、独国、カステウラン）中に溶解すること、および４ｍｇのＧＥ１７４１を６００μｌのｄ５－ピリジン（重水素含量９９，９％、デューテロ、独国、カステラウン）中に溶解することにより調製し、それぞれ１．９および３．８ｍＭ／ｌの濃度を生じた。溶液を５ｍｍのサンプルチューブに移し、これを密封して溶媒の蒸発または水の凝集を防止した。
【0080】
ＮＭＲスペクトルは、単軸自己遮蔽勾配を備えた、低温冷却された５ｍｍのＴＣｌ－三重共鳴プローブを用いるブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）ＡＶ－ＩＩＩ分光計（ブルカー・バイオスピン（Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｉｎ）、独国、ラインシュテッテン）において、６００（１Ｈ周波数）において３００Ｋで記録した。分光計を制御するために用いたソフトウェアは、ｔｏｐｓｐｉｎ ３．５ ｐｌ６であった。温度は、ｄ４－メタノールおよびフィンダイセンら（Ｆｉｎｄｅｉｓｅｎ ｅｔ ａｌ．）の式（Ｆｉｎｄｅｉｓｅｎ ２００７年）を用いて較正した。
【0081】
メタノール中のサンプルを用いた実験：一次元１Ｈ－および１３Ｃ－スペクトルは、６００ＭＨｚにおいて、それぞれ３２および１８４３２スキャンを用いて記録した。炭素スペクトルの場合、プロトンブロードバンドデカップリングを適用した。同種核スペクトル：ＤＱＦ－ＣＯＳＹ（Ｐｉａｎｔｉｎｉら、１９８２年）、ＴＯＣＳＹ（ＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｌｅｒおよびＥｒｎｓｔ、１９８３年；ＢａｘおよびＤａｖｉｓ、１９８５年ａ）、およびＮＯＥＳＹ（Ｊｅｅｎｅｒら、１９７９年）は、２０４８×５１２の複素数データポイントと、Ｆ２およびＦ１でそれぞれ２０４および６１ミリ秒の取込み時間とを用いて記録した。ＤＱＦ－ＣＯＳＹおよびＴＯＣＳＹ（混合時間８０ミリ秒）は、８スキャンを用いて、ＮＥＯＳＹは、８０ミリ秒の混合時間で６４スキャンを用いて記録した。
【0082】
異種核スペクトルは、以下のように記録した：１３Ｃ－ＨＳＱＣ（ＢｏｄｅｎｈａｕｓｅｎおよびＲｕｂｅｎ、１９８０年）、１３Ｃ－ＨＳＱＣ－ＴＯＣＳＹ、１３Ｃ－ＨＳＱＣ－ＣＬＩＰ－ＣＯＳＹ、および１３Ｃ－ＨＳＱＣ－ＮＯＥＳＹは、５１２×１０２４の複素数データポイント、Ｆ２およびＦ１でそれぞれ５１および４５ミリ秒の取込み時間、およびそれぞれ４８、９６、９６、および２８８スキャンを用いて記録した。１３Ｃ－ＤＥＰＴ－ＨＭＱＣ（Ｋｅｓｓｌｅｒら、１９８９年）および１３Ｃ－ＨＱＱＣ（Ｋｅｓｓｌｅｒら、１９９１年）は、５１２×５１２の複素数データポイント、Ｆ２およびＦ１でそれぞれ５１および２３ミリ秒の取込み時間、およびそれぞれ６４および６０スキャンを用いて記録した。１Ｊ ＨＣおよび３Ｊ ＨＨの測定には、１３Ｃ－ＨＳＱＣは、リフォーカシングおよび炭素デカップリング無しに、１６３８４×５１２の複素数データポイント、Ｆ２およびＦ１でそれぞれ１６８３および７３ミリ秒の取込み時間を使用し、３２スキャンを用いて記録した。上記の全ての異種核スペクトルは、１２Ｃに結合したプロトンの抑制のため、ＢＩＲＤパルスを用いて記録した（ＢａｘおよびＳｕｂｒａｍａｎｉａｎ、１９８６年）。勾配増強１３Ｃ－ＨＭＢＣ（ＢａｘおよびＳｕｍｍｅｒｓ、１９８６年；Ｃｉｃｅｒｏら、２００１年）は、２０４８×１０２４の複素数データポイント、Ｆ２およびＦ１でそれぞれ２０４および３３ミリ秒の取込み時間、および１２８スキャンを用いて記録した。
【0083】
ピリジン中のサンプルを用いた実験：一次元１Ｈ－および１３Ｃ－スペクトルは、６００ＭＨｚにおいて、それぞれ３２および１４３４９スキャンを用いて記録した。炭素スペクトルの場合、プロトンブロードバンドデカップリングを適用した。ＤＱＦ－ＣＯＳＹ（Ｐｉａｎｔｉｎｉら、１９８２年）は、２０４８×５１２の複素数データポイントと、８スキャンと、Ｆ２およびＦ１でそれぞれ２０４および６１ミリ秒の取込み時間とを用いて記録した。１３Ｃ－ＨＳＱＣ（ＢｏｄｅｎｈａｕｓｅｎおよびＲｕｂｅｎ、１９８０年）は、５１２×１０２４の複素数データポイント、３２スキャン、およびＦ２およびＦ１でそれぞれ５１および４５ミリ秒の取込み時間を用いて記録した。勾配増強１３Ｃ－ＨＭＢＣ（ＢａｘおよびＳｕｍｍｅｒｓ、１９８６年；Ｃｉｃｅｒｏら、２００１年）は、２０４８×１０２４の複素数データポイント、Ｆ２およびＦ１でそれぞれ２０４および３３ミリ秒の取込み時間、および６４スキャンを用いて記録した。
【0084】
データは、ｔｏｐｓｐｉｎ３．２を使用して加工し、典型的には９０℃までシフトされたサインベル２乗を双方の次元に用い、ＨＭＢＣの場合には、サインベルをＦ２において使用した。データセットを加工して、４０９６×２０４８ポイントのデータマトリックスを生じた。
【0085】
ＧＥ１７４１の分離および特性評価
最初に、種子および根の抽出物を、トランスフェクション増強活性について試験した。結果を図６に示す。乾燥された根の抽出物のＨＰＬＣクロマトグラム（図１参照）を分析し、ピークＰ２、Ｐ３、およびＰ４を収集して、それらの生物学的活性をそれらの生物学的活性について試験した。これらの結果もまた図６に示されている。続いてＰ２を、上記に説明したように、さらなるＨＰＬＣ精製に供した。続くＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ誘導性のセミ分取精製工程（図２および図３参照）は、ピークの単離をもたらし、その活性が繰返し試験された。ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ測定は、負のイオン化モードにおいて、脱プロトン化分子イオンシグナル［Ｍ－Ｈ］－を、ｍ／ｚ １７４１において検出した（図４参照）。ｍ／ｚ ９５５におけるＭＳ／ＭＳフラグメントイオンシグナルは、キラ酸のＣ２８に結合したジアセチルペンタサッカライド鎖の離脱後のサポニンに帰属され、ｍ／ｚ ４６０は、Ｃ３におけるトリサッカライド単位のさらなる切断後に生じた。分子式は、負に帯電したイオンについて測定された質量（ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ １７４１．７３３６）から、Ｃ７９Ｈ１２２Ｏ４２（計算値：１７４１．７３３２５）と決定された。これは、わずか０．２ｐｐｍの質量差に相当するに過ぎない。
最初に、種子および根の抽出物を、トランスフェクション増強活性について試験した。結果を図６に示す。乾燥された根の抽出物のＨＰＬＣクロマトグラム（図１参照）を分析し、ピークＰ２、Ｐ３、およびＰ４を収集して、それらの生物学的活性をそれらの生物学的活性について試験した。これらの結果もまた図６に示されている。続いてＰ２を、上記に説明したように、さらなるＨＰＬＣ精製に供した。続くＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ誘導性のセミ分取精製工程（図２および図３参照）は、ピークの単離をもたらし、その活性が繰返し試験された。ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ測定は、負のイオン化モードにおいて、脱プロトン化分子イオンシグナル［Ｍ－Ｈ］－を、ｍ／ｚ １７４１において検出した（図４参照）。ｍ／ｚ ９５５におけるＭＳ／ＭＳフラグメントイオンシグナルは、キラ酸のＣ２８に結合したジアセチルペンタサッカライド鎖の離脱後のサポニンに帰属され、ｍ／ｚ ４６０は、Ｃ３におけるトリサッカライド単位のさらなる切断後に生じた。分子式は、負に帯電したイオンについて測定された質量（ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ １７４１．７３３６）から、Ｃ７９Ｈ１２２Ｏ４２（計算値：１７４１．７３３２５）と決定された。これは、わずか０．２ｐｐｍの質量差に相当するに過ぎない。
【0086】
ＧＥ１７４１の１Ｄ－および２Ｄ－ＮＭＲ分光法
バイデスモシック（ｂｉｄｅｓｍｏｓｉｃ）キラ酸型サポニン、ＧＥ１７４１の構造は、１Ｈ、１３Ｃ、およびＨＳＱＣ、ＨＭＢＣ、ＨＱＱＣ、ＤＱＦ－ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、ＨＳＱＣ－ＴＯＣＳＹ、およびＮＯＥＳＹを含む、ｄ４－メタノールを用いた１Ｄおよび２Ｄ－ＮＭＲ分光実験により完全に解明された。ＧＥ１７４の１３Ｃ ＮＭＲスペクトルのシグナルの中で、２つの２倍強度の共鳴（δＣ ７５．３３、７１．４３ｐｐｍ）は、Ｃ原子の完全な重なりを示した。部分的な構造単位として、トリテルペン成分と、２つのアセチル化の点をもつ８つの糖の存在が確かめられた。ＨＳＱＣおよびＨＱＱＣ実験を用いて、トリテルペン成分にはメチル基として６つのｓｐ３－混成共鳴（δＣ １０．９、１６．４、１７．７、２４．８、２７．１、３３．３ｐｐｍ）が認識され、さらに３つのメチル基がデオキシ糖に帰属された（δＣ １７．０、１７．６、１８．３）。１ＨＮＭＲは、トリテルペンメチル官能基についてシングレット共鳴（δＨ ０．７４、０．８７、０．９４、１．００、１．１６、１．３８ｐｐｍ）、デオキシ官能基についてはダブレット（δＨ １．１６、１．２３、１．３１）を示した
バイデスモシック（ｂｉｄｅｓｍｏｓｉｃ）キラ酸型サポニン、ＧＥ１７４１の構造は、１Ｈ、１３Ｃ、およびＨＳＱＣ、ＨＭＢＣ、ＨＱＱＣ、ＤＱＦ－ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、ＨＳＱＣ－ＴＯＣＳＹ、およびＮＯＥＳＹを含む、ｄ４－メタノールを用いた１Ｄおよび２Ｄ－ＮＭＲ分光実験により完全に解明された。ＧＥ１７４の１３Ｃ ＮＭＲスペクトルのシグナルの中で、２つの２倍強度の共鳴（δＣ ７５．３３、７１．４３ｐｐｍ）は、Ｃ原子の完全な重なりを示した。部分的な構造単位として、トリテルペン成分と、２つのアセチル化の点をもつ８つの糖の存在が確かめられた。ＨＳＱＣおよびＨＱＱＣ実験を用いて、トリテルペン成分にはメチル基として６つのｓｐ３－混成共鳴（δＣ １０．９、１６．４、１７．７、２４．８、２７．１、３３．３ｐｐｍ）が認識され、さらに３つのメチル基がデオキシ糖に帰属された（δＣ １７．０、１７．６、１８．３）。１ＨＮＭＲは、トリテルペンメチル官能基についてシングレット共鳴（δＨ ０．７４、０．８７、０．９４、１．００、１．１６、１．３８ｐｐｍ）、デオキシ官能基についてはダブレット（δＨ １．１６、１．２３、１．３１）を示した
【0087】
Ｃ３０の実体は、予想より少ない２つのメチル基を示したが、そのことは、アルデヒド官能基（δＣ ２１１．５ｐｐｍ、δＨ ９．４７ｐｐｍ）および酸性官能基（δＣ １７５．９ｐｐｍ）の存在によって説明された。δＣ １２３．２（ＣＨ）における二重結合、１４４．８ｐｐｍ（第４級炭素）、幅広いトリプレットシグナル（δＨ ５．３１ｐｐｍ）の共鳴と一緒に、ＨＭＢＣ相関データと組合せされたＣ－３における置換オキシメチン官能基（δＣ ８６．４、δＨ ｄｄ ３．８６）が、ヒドロキシ－オレアナン－１２－エン型の主鎖を解明した。対応する結果を図７に示し、さらなる詳細を以下に説明する。
【0088】
アルデヒドプロトンδ９．４７ｐｐｍから、Ｃ－４（５６．３ｐｐｍ）、ＣＨ３－２４（δ１０．９）、およびＣ－５までの２，３Ｊ ＣＨ相関。Ｈ－３（δ３．８６）の、第四級の位置Ｃ－４およびＣ－２４に対するロングレンジ相関は、ＣＨＯ－官能基がＣ－２３にあることを示唆した。Ｃ－１６（δＣ７４．５）における第２のヒドロキシル化は、Ｈ－１８（δ２．９４），ＣＨ２－２２（δ１．９３、１．１６）のプロトンからの２，３Ｊ－ＣＨシグナルによって確かめられた。合計数８個の単糖が、アノマー共鳴の特徴的な化学シフトの観察による１Ｈ－および１３ＣＮＭＲ分光法により、ＧＥ１７４１の構造において検出された。ＧＥ１７４１の命名は、以下の通りである：３－Ｏ－（β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→２）－［β－Ｄ－キシロピラノシル－（１→３）］－β－Ｄ－グルクロノピラノシル）－２８－Ｏ－（β－Ｄ－キシロピラノシル－（１→３）－［β－Ｄ－キシロピラノシル－（１→４）］－α－Ｌ－ラムノピラノシル－（１→２）－［３，４－ジ－（Ｏ－アセチル）－β－Ｄ－キノボピラノシル］－（１→４）－β－Ｄ－フコピラノシル）－キラ酸
【0089】
このビスデスモシディック（ｂｉｓｄｅｓｍｏｓｉｄｉｃ）なキラ酸型サポニンにおいては、三糖単位はＣ－３に、そして六糖はＣ－２８に結合される。糖の識別、および個々の１Ｈ／１３Ｃ結合性による結合は、ＨＭＢＣ（図７参照）、ＨＳＱＣ（高分解能）、ＨＳＱＣ－ＤＥＰＴ、ＨＱＱＣ、ＨＳＱＣ－ＴＯＣＳＹ、およびＤＱＦ－ＣＯＳＹ、１Ｈ／１Ｈ－ＴＯＣＳＹ、１Ｈ／１Ｈ－ＮＯＥＳＹ、および非デカップルＨＳＱＣの組合せにより、明確に同定された。全ての糖のメチン原子の１ＪＣＨ－結合性は、間接次元における高い分解能を用いて記録されたＨＳＱＣにより明確に導かれた（ＴＤ：Ｆ２ １０２４、Ｆ１ ２０４８）。
【0090】
Ｃ－３に結合した三糖は、グルクロン酸（これにおいて、Ｃ６における遊離のカルボン酸官能基は、１３ＣによってもＨＭＢＣによっても検出されなかった）、ガラクトース、およびキシロースからなり、δＨ／δＣ［ｐｐｍ］および３ＪＨＨ／１ＪＣＨ［Ｈｚ］におけるアノメリックな共鳴をもつ：β－ＧｌｃＡ（δ４．４２、１０４．６；ｄ、７．４、１６１）、β－Ｇａｌ－１（δ４．８０、１０３．７；ｄ、７．８、１６３）、β－Ｘｙｌ－１（δ４．５７、１０４．９；ｄ、７．８、１６２）。Ｃ２８における五糖単位は、β－Ｆｕｃ－１（δ５．２９，９４．８；ｄ、７．８、１６６）、α－Ｒｈａ－１（δ５．３６、１０１．５；ｄ、１．４、１７１）、β－Ｘｙｌ’－１（δ４．４９、１０７．０；ｄ、７．２、１５９）、β－Ｑｕｉ－１（δ４．６１、１０５．８；ｄ、８．２、１６１）、β－Ｘｙｌ”－１（δ４．５１、１０５．６；ｄ、７．０、１６２）からなる。
【0091】
グリコシド結合の立体化学的特性は、それぞれ３Ｊ ＨＨおよび１Ｊ ＣＨカップリング定数Ｊ（Ｈｚ）の特徴的な値によって測定された。グルコースおよびガラクトース型の糖の場合には、Ｈ－１／Ｈ－２についての大きなトランスジアキシャルカップリング（３ＪＨＨ：７－８Ｈｚ）がβ－構造を規定する。特徴的な１ＪＣＨカップリング値は、α構造については～１７０Ｈｚにより、かつβ構造については～１６０Ｈｚにより、ヘキソピラノースのアノマー配置を示す。検出された値は、これらの文献データと絶対的に一致しており、またキノボース（６－デオキシ－ｇｌｃ）、フコース（６－デオキシｇａｌ）、およびラムノース（６－デオキシ－マンノース）にも適用可能である。
【0092】
アノマーについての１ＪＣＨカップリング値Ｊ［Ｈｚ］は、ＨＭＢＣから直接導かれた。ＧＥ１７４１の１Ｈ ＮＭＲでは、非アノメリックプロトンをもついわゆる「バルク領域」が３．１５－３．９５ｐｐｍの範囲に生じ、部分的に４から５個の糖プロトンシグナルが重複していた。異なる糖環系における３ＪＨＨメチンプロトンカップリングパターンが検出され、高度に混みあったシグナル範囲（１Ｈ：δ３．１５－３．９５ｐｐｍ、および１３Ｃ：δ６０－９０ｐｐｍ において測定された非デカップルＨＳＱＣ実験により抽出され、ここで、１ＪＣＨおよびほぼ全ての３ＪＨＨカップリング定数が可視化され、かつ正確に測定された。非デカップルＨＳＱＣは、ＧｌｃＡ－Ｈ－４（δ３．５５ｐｐｍ）のＨ－３およびＨ－５に対するＪ８．０Ｈｚ（トリプレット）の大きなトランスジアキシャルカップリングパターンによって確かめられた、Ｃ－３に結合した、可能性のあるＧａｌＡから、ＧｌｃＡを明らかに区別し解明した。また、ＴＯＣＳＹシグナル ＧｌｃＡ－Ｈ－１（４．４２ｐｐｍ）（スピンロック時間：５０ミリ秒）、およびＨＳＱＣ－ＴＯＣＳＹは、このスピン系において大きなカップリング定数を示す、位置ＧｌｃＡ－５を検出した。
【0093】
同定されたアノマー１Ｈ シグナルを、「構造リポーター基」（Ｖｌｉｅｇｅｎｔｈａｒｔ、２００６年）（Ｂｕｂｂ、２００３年）、（Ｄｕｕｓら、２０００年）として使用した。ＧＥ１７４１のオリゴサッカライド鎖において存在する「バルク領域」（δＨ：３．１５－４．７ｐｐｍ）にスカラーカップリングをもつ、全ての独立したスピン系が、ＤＱＦ－ＣＯＳＹ、１Ｈ／１Ｈ－ＴＯＣＳＹの組合せにより解明され、ＨＳＱＣ－ＴＯＣＳＹ実験により確認された。ロングレンジＨＭＢＣ相関シグナル（図７参照）は、グリコシド間結合点、例えば、Ｆｕｃ－Ｈ－１（δ５．２９）によって確かめられるＣ－２８への結合（δ１７７．１）、および中央の糖単位であるフコースをもつ、分枝した五糖単位の配列および結合を明確に同定した：Ｑｕｉ－Ｃ－１（δ１０５．８）へのＦｕｃ－ Ｈ－４（δ３．７６）、Ｒｈａ－Ｃ－１（δ１０１．５）へのＦｕｃ－Ｈ－２（δ３．７９）、Ｘｙｌ’－Ｃ－１（δ１０７．０）へのＲｈａ－Ｈ－４（δ３．５１）、およびＸｙｌ”－Ｃ－１（δ１０５．６）へのＸｙｌ’－Ｈ－４（δ３．５２）。
【0094】
ＱＵｉ－Ｈ－３（δ５．０１）およびＱｕｉ－Ｈ－４（δ４．６３）について観察された２つの有意なアセチル化シフトは、キノボースにおけるアセチル化を明らかに示し、かつ糖メチンの共鳴を「プロトンバルク領域」の外へ移動させた。アセチル化の２つの点は、Ｑｕｉ－Ｈ－３およびＱｕｉ－Ｈ－４からアセタートカルボニル官能基までの（δ１７２．１、１７１．６）、ＨＭＢＣにおける２，３ＪＣＨロングレンジクロスシグナルにより明確に解明された（図７参照。ＧＥ１７４１のキノボース単位における、このダブルのアセチル化は予想外であり、かつ関連性のある構造特性として、また恐らくは行われたアッセイにおけるこのサポニンの高い活性のための重要な要因として見なすことができる。
【0095】
グルクロン酸において始まる分枝した三糖の結合は、ＧｌｃＡ－Ｈ－１（δ４．４２）からＣ－３（δ８６．４）へ、および逆にＨ－３（δ３．８６）からＧｌｃＡ－Ｈ－１への、２，３ＪＣＨによって確かめられた。ガラクトースはＧｌｃＡに結合されており、ＧｌｃＡ－Ｈ２（δ３．６４）からＧａｌ－Ｃ－１（δ１０３．７）へ、および逆にＧａｌ－Ｈ－１（δ４．８０）からＦｕｃ－Ｃ－２（δ７５．１）への２，３ＪＣＨによって確かめられた。キシロースは、ＧｌｃＡ－Ｃ－３に結合され、Ｘｙｌ－Ｈ－１（δ４．５７）のＧｌｃＡ－Ｃ－３（δ８６．６）への、および逆方向のＧｌｃ－Ｈ－３からＸｙｌ－Ｃ－１への２，３ＪＣＨによって確かめられた。グリコシド間結合はまた、グリコシド結合を超えるスルースペース相互作用を示すＮＯＥＳＹにおいても、部分的に確かめられた。糖単位における２，３ＪＣＨロングレンジシグナルに関連する全ての構造が、図７に提示される。
【0096】
Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ ｅｌｅｇａｎｓ Ｍ．ｂｉｅｂ．サポニンのトランスフェクション効率
粗抽出物から、いくつかの精製工程を経て単離されたサポニンＧＥ１７４１までの、トランスフェクション効率を測定した。全ての試験されたサポニンは、ＰＤナノプレックスの単独の適用に比較して、トランスフェクション効率を有意に上昇させた。種子および根の抽出物は、匹敵するトランスフェクション効率を生じた（～４０％）。しかしながら、より低い濃度が根の抽出物には使用された（５μｇ／ｍＬ）。Ｐ２は、Ｐ３（２９％）およびＰ４（２７％）に比較して有意に高いトランスフェクション増強ポテンシャル（７２％）を示した。Ｐ２から単離されたＧＥ１７４１は、６０％トランスフェクト細胞を以て著しい効率を達成した。
粗抽出物から、いくつかの精製工程を経て単離されたサポニンＧＥ１７４１までの、トランスフェクション効率を測定した。全ての試験されたサポニンは、ＰＤナノプレックスの単独の適用に比較して、トランスフェクション効率を有意に上昇させた。種子および根の抽出物は、匹敵するトランスフェクション効率を生じた（～４０％）。しかしながら、より低い濃度が根の抽出物には使用された（５μｇ／ｍＬ）。Ｐ２は、Ｐ３（２９％）およびＰ４（２７％）に比較して有意に高いトランスフェクション増強ポテンシャル（７２％）を示した。Ｐ２から単離されたＧＥ１７４１は、６０％トランスフェクト細胞を以て著しい効率を達成した。
【0097】
これらの結果は、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞におけるナノプレックス±トリテルペンサポニンのトランスフェクション効率を図示する図６に示されている。異なる精製工程の生物学的活性を、ＧＥ１７４１の最終的な単離まで調べた。原抽出物のＨＰＬＣ精製後に得られたＰ２は、単離されたＧＥ１７４１をも上回る、最も高い効率を達成した。星印（＊）は、ｔ検定により、ｐ＜０．０５およびｎ＞３で決定されるような、ＧＥ１７４１の同時投与無しのトランスフェクション法に対して結果が有意であることを述べている。
【0098】
核酸の送達
図８は、ＧＥ１７４１（「新規サポニン」）によるトランスフェクション効率の増強を、先行技術のサポニン（ＳＯ１８６１）ならびに現在の「ゴールドスタンダード」であるリポフェクタミンによるトランスフェクション効率の増強と比較する。
図８は、ＧＥ１７４１（「新規サポニン」）によるトランスフェクション効率の増強を、先行技術のサポニン（ＳＯ１８６１）ならびに現在の「ゴールドスタンダード」であるリポフェクタミンによるトランスフェクション効率の増強と比較する。
【0099】
ネガティブコントロールとして、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞を、核酸を含む粒子を添加せずにインキュベートした。
【0100】
ｍＲＮＡに結合したペプチド（ＰｍＲＮＡ）を含む粒子を添加すると、一桁台の範囲のトランスフェクション効率が見られた。個々の細胞懸濁液に増強剤としてサポニンを添加した後、トランスフェクション効率は、ＳＯ１８６１を用いた場合は約１５％まで、しかしＧＥ１７４１を用いた場合にはさらに３５％まで上昇できた。
【0101】
Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞を、ＤＮＡに結合されたペプチドを含む粒子（ＰＤ）とインキュベートした場合、再び一桁台の範囲のトランスフェクション効率が見られた。準拠する細胞懸濁液にＳＯ１８６１が添加された場合、トランスフェクション効率は約３５％に上昇した。ＳＯ１８６１の代わりにＧＥ１７４１を使用した場合、ほぼ６０％のトランスフェクション効率が見られた。
【0102】
Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞を、ミニサークルＤＮＡに結合されたペプチドを含むナノ粒子（ＰＭ）とインキュベートした場合、再び一桁台の範囲のトランスフェクション効率が見られた。ＳＯ１８６１を、準拠する細胞懸濁液に添加した後、トランスフェクション効率は４０％よりも多く上昇することができた。一方、ＧＥ１７４１を細胞懸濁液に添加した場合、トランスフェクション効率はほぼ８０％まで上昇した。
【0103】
ペプチドミニサークルＤＮＡナノ粒子を用いた場合のほぼ８０％のトランスフェクション効率は、「ゴールドスタンダード」であるリポフェクタミンについて観察された約７０％のトランスフェクション効率よりもさらに良好である。したがってＧＥ１７４１は、既に単離されたサポニンよりも良好であるばかりでなく、現在市販されているゴールドスタンダードよりもさらに高いトランスフェクション効率の上昇を示す。
【0104】
図８の星印は、ｔ－検定（ｐ＜０．０５、ｎ＞３）を適用することにより、サポニンの同時投与無しのトランスフェクション法に対する有意差を示す。
【0105】
市販のトランスフェクション法とのＧＥ１７４１の併用
トランスフェクション効率に対するＧＥ１７４１の影響を調べる目的で、ＨＣＴ－１１６細胞を市販のトランスフェクション試薬でトランスフェクトした。結果を図９に示す。ＧＥ１７４１の添加は、それぞれのトランスフェクション法のトランスフェクション効率に上昇をもたらした。ＴａｎｓＩＴによるトランスフェクション効率は、３パーセントポイントのわずかな上昇に過ぎず、またＸｔｒｅｍｅ Ｇｅｎｅのそれは８パーセントポイントであったのに対し、ＧＥ１７４１は、Ｇｅｎｅｃｅｌｌｉｎのトランスフェクション効率を１２％（ＧＥ１７４１無し）から４２％（ＧＥ１７４１有り）までの、３０パーセントポイント押し上げた。
トランスフェクション効率に対するＧＥ１７４１の影響を調べる目的で、ＨＣＴ－１１６細胞を市販のトランスフェクション試薬でトランスフェクトした。結果を図９に示す。ＧＥ１７４１の添加は、それぞれのトランスフェクション法のトランスフェクション効率に上昇をもたらした。ＴａｎｓＩＴによるトランスフェクション効率は、３パーセントポイントのわずかな上昇に過ぎず、またＸｔｒｅｍｅ Ｇｅｎｅのそれは８パーセントポイントであったのに対し、ＧＥ１７４１は、Ｇｅｎｅｃｅｌｌｉｎのトランスフェクション効率を１２％（ＧＥ１７４１無し）から４２％（ＧＥ１７４１有り）までの、３０パーセントポイント押し上げた。
【0106】
ＧＥ１７４１の細胞毒性および透過性
ＧＥ１７４１の毒性および透過化特性を測定する目的で、細胞生存率との直接的な関係を示すインピーダンスを調べた。
ＧＥ１７４１の毒性および透過化特性を測定する目的で、細胞生存率との直接的な関係を示すインピーダンスを調べた。
【0107】
ＧＥ１７４１は、トランスフェクション効率を増強するのに完全に充分である濃度において用いた場合、何ら細胞毒性効果を示さない。ＧＥ１７４１の毒性を試験するため、このサポニンを種々の濃度でＮｅｕｒｏ２ａ細胞に適用し、５０時間にわたりインキュベートした。２．５μｇ／ｍＬおよび６．２５μｇ／ｍＬの濃度では、正規化細胞指数は（測定誤差以内で）、ＧＥ１７４１の添加無しのトランスフェクションプロセスに供されたネガティブコントロールについて観察された正規化細胞指数と同じである。このことは、図１０において、別の３つが重なった曲線１によって示される。ＧＥ１７４１濃度が１２．５μｇ／ｍＬに上昇すると、わずかに減少した正規化細胞指数が見られた（曲線２）。ＧＥ１７４１濃度を２５μｇ／ｍＬまで増加させると、正規化細胞指数はさらにわずかに減少した（曲線３）。
【0108】
細胞生存率に対する有意な影響は、５０μｇ／ｍＬのＧＥ１７４１濃度においてのみ観察できた（曲線４）。この場合、正規化細胞指数はトランスフェクションの約１２時間後に著しく減少した。
【0109】
トランスフェクション効率の増強は、２μｇ／ｍＬのＧＥ１７４１濃度（この濃度は、その結果が例えば図５および８に示されている実験において使用された）において既に観察され得たことから、ＧＥ１７４１は適切な濃度範囲においては何ら細胞毒性を示さないと結論づけることができる。
【0110】
別の毒性試験では、ＤＮＡナノ粒子（曲線９）、２μｇ／ｍＬのＧＥ１７４１を加えたＤＮＡナノ粒子（ＧＥ１７４１；曲線１０）、または２μｇ／ｍＬのＧＥ１７４１のみ（曲線１１）がＮｅｕｒｏ２ａ細胞に添加された。これに関し、ＤＮＡナノ粒子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＤＮＡを含んでいた。緩衝液をネガティブコントロールとして使用した（曲線１２）。矢印および単語「トランスフェクション」を付した時点において個々の物質を細胞に添加した後、細胞生存率には何ら有意差が見られなかった。したがって、試験したいかなる物質にも何ら毒性効果は示されなかった。
【0111】
トランスフェクション効率
ＧＥ１７４１のトランスフェクション効率はまた、サポリンをコードするＤＮＡを用いて細胞をトランスフェクトすることによっても調べられた。サポリンは細胞毒性タンパク質である。トランスフェクションが成功すれば、トランスフェクトされた細胞は死ぬ。対応する結果は、図１２に示される。ネガティブコントロール（曲線５）は、何らペプチドＤＮＡナノ粒子を用いずにインキュベートされたＮｅｕｒｏ２ａ細胞を意味する。曲線６は、サポリンをコードするＤＮＡを含むナノ粒子を用いた、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞のトランスフェクション実験を意味する。この設定での正規化細胞指数は、ネガティブコントロールの正規化細胞指数にほぼ一致しており、非常に低いトランスフェクション効率が示唆される。緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡを含む、ペプチドＤＮＡナノ粒子が、２μｇ／ｍＬのＧＥ１７４１と一緒に細胞に添加された場合、同様に高い正規化細胞指数を観察することができた。先の図面に示したように、ペプチドＤＮＡナノ粒子とＧＥ１７４１とのかかる組合せは、高いトランスフェクション効率に役立つ。ＧＦＰはＮｅｕｒｏ２ａ細胞にとって無毒性であることから、この実験の設定での正規化細胞指数（曲線７）は、ネガティブコントロールの正規化細胞指数（曲線５）にだいたい一致する。
ＧＥ１７４１のトランスフェクション効率はまた、サポリンをコードするＤＮＡを用いて細胞をトランスフェクトすることによっても調べられた。サポリンは細胞毒性タンパク質である。トランスフェクションが成功すれば、トランスフェクトされた細胞は死ぬ。対応する結果は、図１２に示される。ネガティブコントロール（曲線５）は、何らペプチドＤＮＡナノ粒子を用いずにインキュベートされたＮｅｕｒｏ２ａ細胞を意味する。曲線６は、サポリンをコードするＤＮＡを含むナノ粒子を用いた、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞のトランスフェクション実験を意味する。この設定での正規化細胞指数は、ネガティブコントロールの正規化細胞指数にほぼ一致しており、非常に低いトランスフェクション効率が示唆される。緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡを含む、ペプチドＤＮＡナノ粒子が、２μｇ／ｍＬのＧＥ１７４１と一緒に細胞に添加された場合、同様に高い正規化細胞指数を観察することができた。先の図面に示したように、ペプチドＤＮＡナノ粒子とＧＥ１７４１とのかかる組合せは、高いトランスフェクション効率に役立つ。ＧＦＰはＮｅｕｒｏ２ａ細胞にとって無毒性であることから、この実験の設定での正規化細胞指数（曲線７）は、ネガティブコントロールの正規化細胞指数（曲線５）にだいたい一致する。
【0112】
しかしながら、サポリンをコードするＤＮＡを含むペプチドＤＮＡナノ粒子が、２μｇ／ｍＬのＧＥ１７４１と一緒にＮｅｕｒｏ２ａ細胞に添加された場合、トランスフェクションの約１５時間後には、さらなる細胞増殖を見ることはできなかった（曲線８）。むしろ、正規化細胞指数は３未満の値にとどまっており、それはネガティブコントロールの場合におけるよりもかなり低い。このことは、細胞毒性タンパク質サポリンをコードするＤＮＡによる、Ｎｅｕｒｏ２細胞の高効率のトランスフェクションを明確に示している。
【0113】
要約すれば、新規なトランスフェクション増強性の化合物が、ほぼ未調査の植物、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ ｅｌｅｇａｎｓ Ｍ．Ｂｉｅｂに対しバイオアッセイ誘導分離戦略を用いることにより同定できた。この戦略により、精製および活性試験という交互のアプローチを行って、高度な生化学試験のための最も活性の高い化合物が見いだされた。生の根の抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムは、注目すべき保持時間において多数のピークを示し、これらを直接的に、ペプチドベースのトランスフェクション法で試験した。低いレベルのＰ３およびＰ４に比較して、Ｐ２の明らかなトランスフェクション増強効果が、特定の分画中の高活性化合物の推定をもたらした。ＬＣ／ＭＳによるさらなる精製および単離、ならびにＭＳ／ＭＳによるＧＥ１７４１の同定により、１つの化合物が提供され、その強い活性が確認された。Ｐ２に対して低いＧＥ１７４１の効率は、ＧＥ１７４１の他にその末端キシロース残基がアラビノースで置換されているサポニンを含む、Ｐ２におけるサポニン混合物の存在によって説明可能であった。
【0114】
トランスフェクション実験におけるＧＥ１７４１の普遍的な適用可能性が調べられた。ナノプレックス内に取込まれた様々な核酸の送達を、かなり増大することが可能であった。ｍＲＮＡトランスフェクションは、細胞の酵素による迅速な分解のため、ＤＮＡトランスフェクションよりも低い効率であった。しかしながら、転写工程をなくすことにより、２４時間のインキュベーション時間後でも最高の効率が可能となり、それ故迅速なトランスフェクション法が示された。ミニサークルトランスフェクションは、おそらくはプラスミドＤＮＡに比べてよりサイズの小さいミニサークルＤＮＡによって引き起こされる、最高の効率をもたらした。
【0115】
普遍的で簡単な適用性を明らかに示すため、市販のトランスフェクション法に対するＧＥ１７４１の影響を評価した。トランスフェクション効率の上昇を、各方法について達成することができた。特に有意な上昇は、Ｇｅｎｅｃｅｌｌｉｎトランスフェクションについて達成できた。
【0116】
特定のインビトロおよびインビボ試験における、トランスフェクション試薬の使用に関する共通した問題および制限は、毒性効果であり、それはしばしば高い効率を伴ってくる。細胞生存率を表すインピーダンス測定を行うことにより、ＧＥ１７４１介在性のトランスフェクションを毒性の面で分析した。結果は、ナノプレックスとＧＥ１７４１の組合せを用いてトランスフェクトされた細胞が、未処理のネガティブコントロールと同様に生存可能であったことを示した。種々のＧＥ１７４１濃度の適用は、６．２５μｇ／ｍＬを超える濃度で始まる毒性と、５０μｇ／ｍＬの濃度における、かなりのインピーダンス低下によって示される最初の溶解性の効果とを示した。トランスフェクション効率の測定は、２μｇ／ｍＬの濃度において行われたことから、最終的には、何ら毒性のない高い活性をＧＥ１７４１について確認することができた。
【0117】
ＧＥ１７４１は、サポニン介在性のトランスフェクション、いわゆるサポフェクションのプロセスのための、新規で価値ある化合物である。
【0118】
先のセクションにおいて引用された刊行物のリスト：
Ｆｉｎｄｅｉｓｅｎ，Ｍ．；Ｂｒａｎｄ，Ｔ．；Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．著、Ａ １Ｈ－ＮＭＲ ｔｈｅｒｍｏｍｅｔｅｒ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｃｒｙｏｐｒｏｂｅｓ（クライオプローブに適した１Ｈ－ＮＭＲ温度計），「Ｍａｇｎ Ｒｅｓｏｎ Ｃｈｅｍ」，２００７年、第４５巻、第２号、Ｐ．１７５－８．
Ｐｉａｎｔｉｎｉ，Ｕ；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｏ．Ｗ．；Ｅｒｎｓｔ，Ｒ．Ｒ著、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｑｕａｎｔｕｍ ｆｉｌｔｅｒｓ ｆｏｒ ｅｌｕｃｉｄａｔｉｎｇ ＮＭＲ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｎｅｔｗｏｒｋｓ（ＮＭＲカップリングネットワークを解明するための多量子フィルタ）、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ」、１９８２年、第１０４巻、Ｐ．６８００－６８０１．
Ｂａｘ，Ａ．；Ｄａｖｉｓ，Ｄ．Ｇ．著、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｔｉｏｎａｌ ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ ＮＯＥ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（２次元トランスバースＮＯＥ分光法の実用面）、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（１９６９）」、１９８５年、第６３巻、Ｐ．２０７－２１３．
Ｂｒａｕｍｓｃｈｗｅｉｌｅｒ，Ｌ．；Ｅｒｎｓｔ Ｒ．Ｒ．著、Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｙ ｉｓｏｔｒｏｐｉｃ ｍｉｘｉｎｇ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｐｒｏｔｏｎ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（等方性の混合によるコヒーレンス移動：プロトン相関分光法への適用）、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（１９６９）」、１９８３年、第５３巻、Ｐ．５２１－５２８．
Ｊｅｅｎｅｒ，Ｊ．；Ｍｅｉｅｒ，Ｂ．Ｈ．；Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｐ．；Ｅｒｎｓｔ，Ｒ．Ｒ．著、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｂｙ ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｔｉｏｎａｌ ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（２次元ＮＭＲ分光法による交換プロセスの研究）、「Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ」、１９７９年、第７１巻、Ｐ．４５４６－４５５３．
Ｂｏｄｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇ．；Ｒｕｂｅｎ，Ｄ．Ｊ．著、Ｎａｔｕｒａｌ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｎｉｔｒｏｇｅｎ－１５ ＮＭＲ ｂｙ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（強化された異種核分光法による窒素―１５の天然存在率）、「Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ」、１９８０年、第６９巻、Ｐ．１８５－１８９．
Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｈ．；Ｓｃｈｍｉｅｄｅｒ，Ｐ．；Ｋｏｃｋ，Ｍ．；Ｒｅｇｇｅｌｉｎ，Ｍ．著、Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌ ｒｅｓｏｎａｎｃｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｏｎ－ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｓｈｉｆｔ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ＨＱＱＣ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ（プロトン検出異種核シフト相関におけるメチル共鳴の選択、ＨＱＱＣ実験）、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（１９６９）」、１９９１年、第９１巻、Ｐ．３７５－３７９．
Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｈ．；Ｓｃｈｍｉｅｄｅｒ，Ｐ．；Ｋｕｒｚ，Ｍ．著、Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＤＥＰＴ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎ ｉｎｖｅｒｓｅ ｓｈｉｆｔ ｃｏｒｒｅｌａｔｏｎ；ｔｈｅ ＤＥＰＴ－ＨＭＱＣ（逆シフト相関におけるＤＥＰＴシーケンスの実現：ＤＥＰＴ－ＨＭＱＣ）、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（１９６９）」、１９８９年、第８５巻、Ｐ．４００－４０５．
Ｂａｘ，Ａ．；Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｓ．著、Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ－ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｗｏ－ｄｉｍｅｓｉｏｎａｌ ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｓｈｉｆｔ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（高感度化された２次元異種核シフト相関ＮＭＲ分光法）、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（１９６９）」、１９８６年、第６７巻、Ｐ．５６５－５６９．
Ｃｉｃｅｒｏ，Ｄ．Ｏ．；Ｂａｒｂａｔｏ，Ｇ．；Ｂａｚｚｏ，Ｒ．著、Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｎｇ－ｒａｎｇｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔｓ，ｂｙ ａ ｎｅｗ ｓｃｈｅｍｅ ｏｆ ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ（勾配によるコヒーレンス選択の新規スキームによる、異種核ロングレンジカップリング定数測定のための２次元実験の高感度化）、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（カリフォルニア州、サンディエゴ：１９９７）」、２００１年、第１４８巻、Ｐ．２０９－２１３．
Ｂａｘ，Ａ．；Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｆ．著、Ｐｒｏｔｏｎ ａｎｄ ｃａｒｂｏｎ－１３ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ－ｅｎｈａｎｃｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ－ｂｏｎｄ ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ２Ｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｑｕａｎｔｕｍ ＮＭＲ（２次元多量子ＮＭＲによる異種核多結合結合性の高感度化検出からのプロトンおよび炭素－１３の帰属）、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ」、１９８６年、第１０８巻、Ｐ．２０９３－２０９４．
Ｆｉｎｄｅｉｓｅｎ，Ｍ．；Ｂｒａｎｄ，Ｔ．；Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．著、Ａ １Ｈ－ＮＭＲ ｔｈｅｒｍｏｍｅｔｅｒ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｃｒｙｏｐｒｏｂｅｓ（クライオプローブに適した１Ｈ－ＮＭＲ温度計），「Ｍａｇｎ Ｒｅｓｏｎ Ｃｈｅｍ」，２００７年、第４５巻、第２号、Ｐ．１７５－８．
Ｐｉａｎｔｉｎｉ，Ｕ；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｏ．Ｗ．；Ｅｒｎｓｔ，Ｒ．Ｒ著、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｑｕａｎｔｕｍ ｆｉｌｔｅｒｓ ｆｏｒ ｅｌｕｃｉｄａｔｉｎｇ ＮＭＲ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｎｅｔｗｏｒｋｓ（ＮＭＲカップリングネットワークを解明するための多量子フィルタ）、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ」、１９８２年、第１０４巻、Ｐ．６８００－６８０１．
Ｂａｘ，Ａ．；Ｄａｖｉｓ，Ｄ．Ｇ．著、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｔｉｏｎａｌ ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ ＮＯＥ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（２次元トランスバースＮＯＥ分光法の実用面）、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（１９６９）」、１９８５年、第６３巻、Ｐ．２０７－２１３．
Ｂｒａｕｍｓｃｈｗｅｉｌｅｒ，Ｌ．；Ｅｒｎｓｔ Ｒ．Ｒ．著、Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｙ ｉｓｏｔｒｏｐｉｃ ｍｉｘｉｎｇ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｐｒｏｔｏｎ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（等方性の混合によるコヒーレンス移動：プロトン相関分光法への適用）、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（１９６９）」、１９８３年、第５３巻、Ｐ．５２１－５２８．
Ｊｅｅｎｅｒ，Ｊ．；Ｍｅｉｅｒ，Ｂ．Ｈ．；Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｐ．；Ｅｒｎｓｔ，Ｒ．Ｒ．著、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｂｙ ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｔｉｏｎａｌ ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（２次元ＮＭＲ分光法による交換プロセスの研究）、「Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ」、１９７９年、第７１巻、Ｐ．４５４６－４５５３．
Ｂｏｄｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇ．；Ｒｕｂｅｎ，Ｄ．Ｊ．著、Ｎａｔｕｒａｌ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｎｉｔｒｏｇｅｎ－１５ ＮＭＲ ｂｙ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（強化された異種核分光法による窒素―１５の天然存在率）、「Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ」、１９８０年、第６９巻、Ｐ．１８５－１８９．
Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｈ．；Ｓｃｈｍｉｅｄｅｒ，Ｐ．；Ｋｏｃｋ，Ｍ．；Ｒｅｇｇｅｌｉｎ，Ｍ．著、Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌ ｒｅｓｏｎａｎｃｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｏｎ－ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｓｈｉｆｔ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ＨＱＱＣ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ（プロトン検出異種核シフト相関におけるメチル共鳴の選択、ＨＱＱＣ実験）、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（１９６９）」、１９９１年、第９１巻、Ｐ．３７５－３７９．
Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｈ．；Ｓｃｈｍｉｅｄｅｒ，Ｐ．；Ｋｕｒｚ，Ｍ．著、Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＤＥＰＴ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎ ｉｎｖｅｒｓｅ ｓｈｉｆｔ ｃｏｒｒｅｌａｔｏｎ；ｔｈｅ ＤＥＰＴ－ＨＭＱＣ（逆シフト相関におけるＤＥＰＴシーケンスの実現：ＤＥＰＴ－ＨＭＱＣ）、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（１９６９）」、１９８９年、第８５巻、Ｐ．４００－４０５．
Ｂａｘ，Ａ．；Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｓ．著、Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ－ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｗｏ－ｄｉｍｅｓｉｏｎａｌ ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｓｈｉｆｔ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（高感度化された２次元異種核シフト相関ＮＭＲ分光法）、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（１９６９）」、１９８６年、第６７巻、Ｐ．５６５－５６９．
Ｃｉｃｅｒｏ，Ｄ．Ｏ．；Ｂａｒｂａｔｏ，Ｇ．；Ｂａｚｚｏ，Ｒ．著、Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｎｇ－ｒａｎｇｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔｓ，ｂｙ ａ ｎｅｗ ｓｃｈｅｍｅ ｏｆ ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ（勾配によるコヒーレンス選択の新規スキームによる、異種核ロングレンジカップリング定数測定のための２次元実験の高感度化）、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（カリフォルニア州、サンディエゴ：１９９７）」、２００１年、第１４８巻、Ｐ．２０９－２１３．
Ｂａｘ，Ａ．；Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｆ．著、Ｐｒｏｔｏｎ ａｎｄ ｃａｒｂｏｎ－１３ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ－ｅｎｈａｎｃｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ－ｂｏｎｄ ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ２Ｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｑｕａｎｔｕｍ ＮＭＲ（２次元多量子ＮＭＲによる異種核多結合結合性の高感度化検出からのプロトンおよび炭素－１３の帰属）、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ」、１９８６年、第１０８巻、Ｐ．２０９３－２０９４．
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】