特開 2023-11586 アルツハイマー病の治療におけるＰＩ４ＫＩＩＩαタンパク質および関連膜タンパク質複合体の利用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023011586

(43)【公開日】2023-01-24

(54)【発明の名称】アルツハイマー病の治療におけるＰＩ４ＫＩＩＩαタンパク質および関連膜タンパク質複合体の利用

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/00 20060101AFI20230117BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20230117BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230117BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230117BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20230117BHJP

   A61K 31/555 20060101ALI20230117BHJP

   A61K 31/285 20060101ALI20230117BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20230117BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20230117BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230117BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20230117BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20230117BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20230117BHJP

【ＦＩ】

A61K45/00

A61P25/28

A61P43/00 111

A61K39/395 D

A61K39/395 P

A61K31/7088

A61K31/555

A61K31/285

A61K31/7105

A61K31/713

A61K48/00

G01N33/68

G01N33/50 Z

G01N33/15 Z

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2022161004

(22)【出願日】2022-10-05

(62)【分割の表示】P 2020142213の分割

【原出願日】2020-08-26

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2015/078058

(32)【優先日】2015-04-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】517381234

【氏名又は名称】ジャンスー・ヌオ－ベータ・ファーマシューティカル・テクノロジー・カンパニー・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100100158

【弁理士】

【氏名又は名称】鮫島 睦

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(72)【発明者】

【氏名】黄 福徳

(72)【発明者】

【氏名】張 瀟

(72)【発明者】

【氏名】王 文安

(72)【発明者】

【氏名】張 楽

(72)【発明者】

【氏名】蒋 理想

(72)【発明者】

【氏名】朱 通

(72)【発明者】

【氏名】劉 海燕

(72)【発明者】

【氏名】周 ▲ゆう▼東

(72)【発明者】

【氏名】何 洋

(72)【発明者】

【氏名】魏 万国

(57)【要約】      （修正有）

【課題】アルツハイマー病を治療するための医薬組成物、及びアルツハイマー病を治療するための薬剤をスクリーニングする方法を提供する。
【解決手段】PI4KIIIα阻害剤による、アルツハイマー病の治療方法であって、該PI4KIIIα阻害剤が、PI4KIIIαに対する抗体、PI4KIIIαに特異的な阻害ヌクレオチド、またはPI4KIIIαに特異的な低分子化合物阻害剤である方法が提供される。また、神経細胞によるAβ分泌が促進されるか否かによって、アルツハイマー病を治療する薬物をスクリーニングする方法が提供される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

PI4KIIIα阻害剤による、アルツハイマー病の治療方法。

【請求項2】

該PI4KIIIα阻害剤が、PI4KIIIαに対する抗体、PI4KIIIαに特異的な阻害ヌクレオチド、またはPI4KIIIαに特異的な低分子化合物阻害剤である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

該PI4KIIIαに特異的な特異的阻害ヌクレオチドが、配列番号：6で示されるヌクレオチド配列を有する、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

該PI4KIIIα阻害剤が、低分子化合物阻害剤である、PAO、PAO誘導体、G1、A1、G1またはA1の類縁体の1つ以上から選択される、請求項２に記載の方法。

【請求項5】

該PAO誘導体が、

【化1】

【化2】

【化3】

【化4】

を含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B阻害剤による、アルツハイマー病の治療方法。

【請求項7】

該RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B阻害剤が、RBO/EFR3/EFR3A/EFR3Bに対する抗体である、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

PI₄P阻害剤による、アルツハイマー病の治療方法。

【請求項9】

該PI₄P阻害剤が、PI₄Pに対する抗体、OSH2-PH2X融合タンパク質、またはOSH2-2x-PH融合タンパク質である、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

1つ以上の以下の物質：PI4KIIIα阻害剤、RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B阻害剤、およびPI₄P阻害剤；および任意の医薬担体を含む医薬組成物。

【請求項11】

Aβに対する抗体、および/または神経細胞外Aβプラークまたは沈着物を除去することができる化合物の1つ以上をさらに含む、請求項１０に記載の医薬組成物。

【請求項12】

神経細胞外Aβプラークまたは沈着物を除去することができる該化合物が、海洋由来硫酸化オリゴ糖HSH971およびその類縁体、アカンプロセートおよびその類縁体、エダラボンおよびその類縁体から選択される、請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項13】

標的として、PI4KIIIαタンパク質のキナーゼ活性を用いて、アルツハイマー病を治療するための薬剤をスクリーニングする方法であって、
PI4KIIIαのホスホキナーゼ活性における候補薬剤の効果を観察し；
候補薬剤がPI4KIIIαのホスホキナーゼ活性を阻害することができる場合、候補薬剤がアルツハイマー病の治療のための潜在的な薬剤であることを示す；
ことを含む方法。

【請求項14】

標的として、RBO/EFR3/EFR3A/EFR3Bタンパク質、TTC7タンパク質およびPI4KIIIαタンパク質の間の相互作用を用いて、アルツハイマー病を治療するための薬剤をスクリーニングする方法であって、
RBO/EFR3/EFR3A/EFR3Bタンパク質、TTC7タンパク質およびPI4KIIIαタンパク質の相互作用に対する候補薬剤の効果を観察し；
候補薬剤がRBO/EFR3/EFR3A/EFR3Bタンパク質、TTC7タンパク質およびPI4KIIIαタンパク質の相互作用を阻害し、それによってRBO/EFR3/EFR3A/EFR3B-TTC7-PI4KIIIαタンパク質複合体の形成を減少させることができる場合、候補薬剤がアルツハイマー病の治療のための潜在的な薬物であることを示す；
ことを含む方法。

【請求項15】

標的として、細胞膜PI₄Pレベルを用いて、アルツハイマー病を治療するための薬剤をスクリーニングする方法であって、
候補薬剤が細胞膜上のPI₄Pのレベルに影響を及ぼすかどうかを観察し；
候補薬剤が細胞膜PI₄Pレベルを抑制することができる場合、それは候補薬剤がアルツハイマー病の治療のための潜在的な薬物であることを示す；
ことを含む方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

資金援助研究に関する陳述
本発明は、これまで、中国の973の科学技術省プログラム(許可番号2013CB530900および2011CBA00408)、国家自然科学財団(許可番号81371400、81071026および81571101)、および上海基本主要プログラム(許可番号06dj14010)によって支持されてきた。
技術分野
本発明は、特に、アルツハイマー病を治療するためにRBF/EFR3/EFR3A/EFR3Bタンパク質とTTC7タンパク質とで形成されたPI4KIIIαキナーゼおよびその膜タンパク質複合体を関連する阻害剤を用いてダウンレギュレーションする方法に関する。別の局面において、本発明は、細胞からのAβ分泌が促進されるか否かに応じて、アルツハイマー病の治療のための医薬および治療標的をスクリーニングする方法に関する。別の態様では、本発明は、細胞からのAβ分泌が促進されるか否かに応じて、アルツハイマー病の治療のための医薬および治療標的をスクリーニングする方法に関する。

【背景技術】

【0002】

アルツハイマー病(AD)は、高齢者における最も一般的な神経変性疾患であり、学習および記憶能力の進行性喪失を特徴とする。シナプスの機能不全および喪失は、ADの初期段階で起こるが、Aβ(特にAβ₄₂)の蓄積が、重要な役割を果たすADの学習および記憶機能不全の主要な細胞機構として広く認識されている。1つの可能な説明は、これらの医薬または治療法が、ADの学習および記憶障害を引き起こす重要な病因を変えられなかったことである。ADにおけるAβ蓄積のすべての形態において、より深い理解が必要である。

【0003】

Aβは、細胞外空間に蓄積するだけでなく、ニューロンにも蓄積する。増加していく証拠は、Aβがニューロン中の種々の細胞内器官に蓄積し、シナプス欠損、アミロイド斑形成、ニューロン死等のAD病因変化に関与することを示唆している。さらに、シナプスおよび認知機能に対して最も有害な効果であると考えられるオリゴマーAβは、細胞内で形成され、AD患者およびAPPトランスジェニックマウスの脳ニューロンまたは細胞膜に蓄積する。このような膜結合型Aβは、ニューロンの細胞膜または細胞内器官の膜に存在し得る。たとえば細胞外Aβのエンドサイトーシス、オートファゴソームに減少した細胞内で生成されたAβの分泌の分泌低下、オートファゴソーム中のAβ産生および蓄積、および細胞内Aβ分解の低下などのニューロンAβ蓄積をもたらす可能性がある。

【0004】

Aβは、細胞内および細胞外に蓄積するが、AD患者または初期AD患者の脳脊髄液(CSF)中のAβ₄₂濃度は対照集団の約半分まで減少する。ADモデルマウスでは、脳脊髄液および脳間質液(ISF)中のAβ₄₂濃度は日齢依存的低下を示すが、ISFではAβ二量体は検出されない。CSF中のAβ₄₂濃度の減少は、細胞外アミロイド斑の金属イオン封鎖効果、Aβ₄₂分泌の低下、ニューロンまたは脳細胞膜中のAβ₄₂蓄積によっておそらく引き起こされると推定される。

【0005】

研究は、リン脂質およびそれらの代謝酵素が：
1)Aβ₄₂が、脂質膜に挿入され、酸性リン脂質に結合し、Aβ₄₂中のランダムコイルのβ構造への変換を誘発し、膜内または膜上のAβ₄₂凝集を導くこと；
2)血漿ホスファチジルイノシトール-4,5-リン酸(PIP₂)レベルが、培養細胞からのAβ₄₂分泌を逆相関させること；
3)Aβ₄₂の発現が、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ(PI3K)の阻害によって救済することができるハエのニューロンの機能不全および学習および記憶機能不全を誘発すること；
4)ホスファチジルイノシトール4-キナーゼ(PI4KIIIα)の産物である、ホスファチジルイノシトール-4-リン酸(PI₄P)が、AD患者の大脳皮質において有意に増加し、増加したレベルが、AD患者における認知障害の程度と密接に関連しているという最近の発見(Zhu、L.、et al.、Proc Natl Acad Sci U S A、2015)；などのAβとのその相互作用またはAD関連変化への関与を介する種々の細胞および分子プロセスを介してAD病因に寄与し得ることを実証している。

【0006】

ショウジョウバエでは、ローリングブラックアウト(rbo)遺伝子は、ジアシルグリセロールリアーゼと一定の相同性を有する細胞膜タンパク質RBOをコードする。RBOタンパク質は、ショウジョウバエのリン脂質代謝、光形質導入、シナプス伝達およびバルクエンドサイトーシスにおいて機能する。RBOタンパク質は、酵母からヒトまで保存的である。酵母(EFR3)およびマウス(EFR3AおよびEFR3B)のRBOの同族体は、PI4KIIIαを細胞膜上に固定し、さらに、ホスファチジルイノシトール4-リン酸(PI₄P)およびPIP₂の血漿レベルを調節するように、ホスファチジルイノシトール4-キナーゼIIIα(PI4KIIIα)および細胞膜上の足場タンパク質と複合体を形成する(Tetratricopeptide repeat domain 7、TTC7と呼ばれる、Baird D、Stefan Cら、2008、J Cell Biol; Nakatsu F、Baskin JFら、2012、J Cell Biol)。

【0007】

ショウジョウバエでは、分泌シグナルペプチドと融合した汎ニューロン発現Aβ₄₂は、ニューロン内Aβ蓄積および神経欠損を誘導する。本発明者らは、単純な神経経路であるショウジョウバエ巨大繊維(GF)経路における分泌シグナルペプチドを含むAβ₄₂の発現が、ニューロン内Aβ蓄積および日齢依存性シナプス不全および運動能力欠損を引き起こすことをこれまでに明らかにしている。Aβ₄₂を発現するそのようなショウジョウバエは、ニューロン内Aβ₄₂蓄積および関連するシナプス欠損における候補遺伝子の役割を試験するための便利なプラットフォームを提供する。これを念頭において、本発明者らは、このモデルにおいて、遺伝子rbo、PI4KIIIα、およびttc7、ならびに共通のPI4KIIIαタンパク質阻害剤が神経変性疾患に及ぼす変異または過剰発現の効果を試験した。本発明者らは、海馬ニューロンの萎縮におけるEfr3a(rbo遺伝子のマウスホモログ)ノックダウンの効果、および学習と記憶によく用いられるPI4KIIIαの阻害剤である低分子阻害剤フェニルアルシンオキシド(PAO)の効果、CSFおよび脳実質膜におけるAβ42のレベル、ならびにPI4KA遺伝子(PI4KIIIαタンパク質をコードする)の学習および記憶におけるダウンレギュレーションの効果、およびリポソーム中のAβ₄₂のオリゴマー形成におけるPI4KIIIα生成物PI₄Pの効果をAPP/PS1トランスジェニックマウスにおいてさらに検討した。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

発明の概略
本発明は、ショウジョウバエおよびマウスADモデルにおける神経欠損を改善するために、遺伝的手段または関連する阻害剤を用いて、PI4KIIIαタンパク質、RBO/EFR3/EFR3A/EFR3Bタンパク質、TTC7タンパク質、およびそれらの膜タンパク質複合体の量または関連酵素の活性のダウンレギュレーションが、ニューロン細胞のAβ(特にAβ₄₂)分泌を促進し、それに対応して、ニューロン内Aβ蓄積を減少させることができることを開示する。したがって、本発明は、AD治療におけるニューロンAβ₄₂分泌の本質的役割を明らかにし、AD治療のための新規戦略を提供する；一方、本発明は、ADを治療するための新規な医薬を提供し、ADの治療のための医薬および治療標的のスクリーニングの新たな方向性を指摘する。

【課題を解決するための手段】

【0009】

1つの態様では、本発明は、ADを治療する新規な方法に関する。本発明の特定の実施態様によれば、本発明は、抗PI4KIIIα抗体、PI4KIIIαに特異的な阻害ヌクレオチドまたはPI4KIIIαに特異的な低分子化合物阻害剤であり得る、PI4KIIIα阻害剤を用いてADを治療する方法を開示する。好ましくは、PI4KIIIαに対する特異的阻害ヌクレオチドは、配列番号：6で示されるヌクレオチド配列であり得る；PI4KIIIα阻害剤は、以下の低分子化合物阻害剤の1つ以上から選択される：PAO、PAOの誘導体、G1、A1、G1またはA1の類縁体。

【0010】

本発明の別の実施態様によれば、本発明はまた、RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B阻害剤を用いてADを治療する方法を開示する。RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B阻害剤は、抗RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B抗体であってもよい。

【0011】

一方、本発明の他の実施態様によれば、本発明は、PI₄P阻害剤を用いてADを治療する方法も開示する。PI₄P阻害剤は、抗PI₄P抗体、OSH2-PH2X融合タンパク質、またはOSH2-2x-PH融合タンパク質であってもよい。

【0012】

別の態様では、本発明は、また、PI4KIIIα阻害剤、RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B阻害剤、およびPI₄P阻害剤の1つ以上および場合により薬学的担体を含むADの治療に使用することができる医薬組成物に関する。好ましくは、医薬組成物は、1つ以上の抗Aβ抗体および/または海洋性オリゴ糖炭水化物HSH971およびその類縁体、アカンプロセートおよびその類縁体、ならびにエダラボンおよびその類縁体から選択される細胞外Aβプラークまたは沈着物を除去または除去することができる化合物をさらに含み得る。

【0013】

加えて、本発明はまた、ADを治療するための薬物をスクリーニングする方法に関する。本発明の特定の実施態様によれば、本発明は、PI4KIIIαタンパク質のキナーゼ活性を標的とするAD薬物のスクリーニングする方法であって、PI4KIIIαのホスホキナーゼ活性における薬剤候補の効果を観察し、候補薬物がPI4KIIIαのホスホキナーゼ活性を阻害することができる場合、候補薬物がADの治療のための潜在的な薬物であることを示す、ことを含む方法を開示する。

【0014】

本発明の別の実施態様によれば、本発明はまた、RBO/EFR3/EFR3A/EFR3Bタンパク質、TTC7タンパク質およびPI4KIIIαタンパク質の間の相互作用を標的とすることによるAD標的薬物のスクリーニング方法であって、RBO/EFR3/EFR3A/EFR3Bタンパク質、TTC7タンパク質およびPI4KIIIαタンパク質の相互作用に対する候補薬物の効果を観察し、候補薬物がRBO/EFR3/EFR3A/EFR3Bタンパク質、TTC7タンパク質およびPI4KIIIαタンパク質の相互作用を阻害し、それによってRBO/EFR3/EFR3A/EFR3B-TTC7-PI4KIIIαタンパク質複合体の形成を減少させることができる場合、候補薬物がADの治療のための潜在的な薬物であることを示す、ことを含む方法を開示する。

【0015】

本発明の別の特定の実施形態によれば、本発明はまた、細胞膜上のPI₄Pのレベルを標的とするAD薬物のスクリーニング方法を開示し、この方法は、薬物候補が細胞膜上のPI₄Pのレベルに影響を及ぼすかどうかを観察し、候補薬物が細胞膜上のPI₄Pレベルを低下させることができる場合、それは候補薬物がADを治療するための潜在的な薬物であることを示す、ことを含む。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】rbo遺伝子突然変異は、Aβ_arc発現ハエにおける神経欠損を改善し、PI4KIIIαタンパク質発現レベルを低下させるか、またはPI4KIIIαタンパク質とRBOタンパク質との相互作用を弱める。

【図2】PI4KIIIαタンパク質発現レベルのダウンレギュレーションまたは薬学的阻害は、Aβ_arc発現ハエの神経欠損を改善する。

【図3】RBO/PI4KIIIαタンパク質の発現レベルまたは機能のダウンレギュレーションは、ニューロン内Aβ蓄積を減少させる。

【図4】RBO/PI4KIIIαタンパク質の発現レベルまたは機能のダウンレギュレーションは、Aβ₄₂分泌を促進する。

【図5】APP/PS1マウスおよび対照マウスにおける海馬CA3およびDG領域におけるニューロンの樹状突起直径および棘密度におけるEfr3a遺伝子ノックダウンの効果。

【図6】APP/PS1マウスおよび対照マウスにおける、学習および記憶、CSFおよび脳膜関連Aβ₄₂レベルにおけるPAO処置の効果。

【図7】rbo遺伝子突然変異は、Aβ_arc発現ハエの神経欠損を改善する。

【図8】rboおよびshibire遺伝子突然変異がAβ_arcまたはショウジョウバエタウをそれぞれ過剰発現するハエの運動能力および寿命に及ぼす効果。

【図9】Aβ_arc発現ハエにおけるrboS^358Aおよびitpr^SV35遺伝子突然変異の効果。

【図10】N2a細胞の細胞外AβのエンドサイトーシスにおけるEfr3a遺伝子ノックダウンの効果、およびAβ_arc発現ハエのAβ_arc転写におけるrboおよびPI4KA遺伝子変異の効果。

【図11】マウスのHEK293細胞または初代海馬ニューロンにおけるEfr3aまたはPI4KA遺伝子ノックダウンの効率。

【図12】APP/PS1マウスのPI4KA遺伝子の1コピーへのトランスポゾン挿入は、学習および記憶障害を有意に改善する。

【図13】PI₄Pは、リポソーム中のAβ₄₂のオリゴマー化を促進する。

【図14】APP発現レベルおよびα、β、およびγセクレターゼ活性におけるPAOの効果。

【図15】Aβ_arcを発現するハエの神経欠損におけるttc7遺伝子突然変異および過剰発現の効果。

【図16】APPで安定にトランスフェクトされたHEK293T由来のAβ₄₂分泌に対するPAOの促進効果の濃度依存性。

【図17】PAOによるヒトPI4KIIIαの酵素活性中心の結合の構造シミュレーション。

【図18】高月齢期のAPP/PS1マウスの認知障害におけるPAOの治療効果。

【図19】PI4KIIIα発現レベルのダウンレギュレーションおよびPAOによるPI4KIIIα酵素活性の阻害は両方とも、マウスの海馬におけるシナプス伝達可塑性障害を有意に改善する。

【発明を実施するための形態】

【0017】

詳細な記載
明細書および特許請求の範囲を含む本発明において、他に特定されない限り、以下の用語は以下の意味で用いられる：

【0018】

用語「rbo/Efr3/Efr3a/Efr3b遺伝子」は、ショウジョウバエ由来のrbo遺伝子、酵母由来のEfr3遺伝子、または哺乳動物由来のEfr3a遺伝子およびEfr3b遺伝子を意味する；用語「RBO/EFR3/EFR3A/EFR3Bタンパク質」は、ショウジョウバエ由来のrbo遺伝子、酵母由来のEfr3遺伝子、または哺乳動物由来のEfr3a/Efr3b遺伝子によってコードされるタンパク質を意味する。

【0019】

本明細書で使用される用語「PI4KIIIα/PI4KA遺伝子」は、ショウジョウバエまたは哺乳動物に由来するPI4KIIIα遺伝子またはPI4KA遺伝子を意味する；本明細書で使用される用語「PI4KIIIαタンパク質」は、ショウジョウバエまたは哺乳動物におけるPI4KIIIα/PI4KA遺伝子によってコードされるタンパク質を意味する。

【0020】

本明細書で使用される用語「ttc7遺伝子」は、ショウジョウバエおよび哺乳動物に由来するttc7遺伝子を意味する；本明細書で使用される用語「TTC7タンパク質」は、上記ショウジョウバエおよび哺乳動物においてttc7によってコードされるタンパク質を意味する。

【0021】

本明細書で使用される用語「阻害剤」は、標的物体の量、特定の機能、および特定の特性を、低下させ、減少させ、または排除することができる材料を意味する。前記標的物体はタンパク質、ポリペプチド、核酸などであってもよく、前記阻害剤は、対象物の量、特定の機能、および特定の特性の対応する低下、減少、または排除をもたらすように、標的物体の量、特定の機能、および特定の特性に直接的または間接的に影響を及ぼす。前記阻害剤は、タンパク質、ポリペプチド、核酸、低分子化合物などであり得る。

【0022】

たとえば、本明細書で使用される「PI4KIIIα阻害剤」という用語は、PI4KIIIα/ PI4KA遺伝子の発現、転写、翻訳および/またはそこから産生されるPI4KIIIαタンパク質の安定性、RBO/EFR3/EFR3A/EFR3Bタンパク質およびTTC7タンパク質への結合能、およびそのホスホキナーゼ活性などを低下させ、低減させまたは排除することができる物質を意味し、PI4KIIIα/PI4KAに特異的な阻害性ヌクレオチド、PI4KIIIαタンパク質に対する抗体、PI4KIIIαキナーゼ活性を阻害することができる低分子化合物阻害剤、および/またはPI4KIIIαタンパク質と他の膜タンパク質との間の相互作用を阻害することができる物質などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0023】

同様に、本明細書で使用される「RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B阻害剤」という用語は、rbo/Efr3/Efr3a/Efr3b遺伝子の発現、転写、翻訳および/またはそこから産生されるRBO/EFR3/EFR3A/EFR3Bタンパク質の安定性、PI4KIIIαタンパク質等への結合能を阻害し、低下させ、または排除することができる物質を意味し、rbo/Efr3/Efr3a/Efr3bに特異的な阻害性ヌクレオチド、RBO/EFR3/EFR3A/EFR3Bタンパク質に対する抗体、およびRBO/EFR3/EFR3A/EFR3Bタンパク質およびPI4KIIIαタンパク質の複合体の形成を阻害することができる物質などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0024】

本明細書で使用される「TTC7阻害剤」という用語は、ttc7遺伝子の発現、転写、翻訳および/またはそこから産生されるTTC7タンパク質の安定性およびRBO/EFR3/EFR3A/EFR3Bタンパク質等への結合能を低下させ、低減させ、または除去することができる物質を意味し、ttc7に特異的な阻害性ヌクレオチド、TTC7タンパク質に対する抗体、および/またはTTC7タンパク質と膜タンパク質RBO/EFR3/EFR3A/EFR3Bとの間の相互作用を阻害することができる物質などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0025】

上記と同様に、本明細書で使用される「PI₄P阻害剤」という用語は、細胞膜上のPI₄Pの量レベルを阻害し、低下させ、または除去することができる物質を意味し、PI₄Pに対する抗体、およびPI₄Pに特異的に結合することができるOSH2-PH2X融合タンパク質またはOSH2-2x-PH融合タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0026】

本明細書で使用される用語「抗体」は、特定のエピトープに結合する任意の免疫グロブリンまたは完全分子およびその断片を意味する。該抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、および親抗体の抗原結合能力を保持する限り、インタクトな抗体の断片および/または部分が挙げられるが、これらに限定されない。本発明において、たとえば、「PI4KIIIαに対する抗体」は、PI4KIIIαタンパク質、またはその機能的変異体もしくは機能的フラグメントに特異的に結合し得るモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体および免疫学的活性断片またはその部分を意味する。本発明において、「PI4KIIIα抗体」、「PI4KIIIαに対する抗体」、および「抗PI4KIIIα抗体」等の用語は、互換的に用いられる。

【0027】

本発明において、「機能的変異体」は、そのアミノ酸配列中に1つ以上のアミノ酸修飾を有する本発明のタンパク質またはポリペプチドを意味する。修飾は、「保存的」修飾(置換されたアミノ酸が類似の構造または化学的性質を有する)または「非保存的」修飾であり得る；同様の修飾には、アミノ酸の付加または欠失またはその両方が含まれる。しかしながら、アミノ酸残基の修飾もアミノ酸の付加または欠失も、元のアミノ酸配列の生物学的または免疫学的活性および機能を部分的に変化させたり、損傷したりすることはない。本発明において、同様に、「機能的断片」は、それがその一部であるタンパク質またはポリペプチドと実質的に類似または同一の生物学的または免疫学的活性および機能を保持する本発明のタンパク質またはポリペプチドの任意の部分(親タンパク質またはポリペプチド)を意味する。

【0028】

本明細書で使用される用語「阻害ヌクレオチド」は、特定の遺伝子に結合してその発現を阻害することができるヌクレオチド化合物を意味する。典型的な阻害ヌクレオチドとして、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんDNA、RNAアプタマー、リボザイム、低分子干渉RNA(siRNA)、短鎖ヘアピンRNA(shRNA)およびマイクロRNAが挙げられるが、これらに限定されない。これらのヌクレオチド化合物は、他のヌクレオチド配列よりも高い親和性で前記特定の遺伝子に結合し、特定の遺伝子の発現を阻害する。

【0029】

本明細書で使用される用語「低分子化合物」は、天然または化学合成され得る分子量3kダルトン未満の有機化合物を意味する。本明細書で使用される用語「誘導体」は、親有機化合物と類似の構造およびそれらの機能における同様の効果を有する、1つ以上の化学反応によって親有機化合物を修飾することによって生成される化合物を意味する。本明細書で使用される用語「類縁体」は、親有機化合物を化学的に修飾することによって生成されないが、親有機化合物と構造が類似し、それらの機能において同様の効果を有する化合物を意味する。

【0030】

本明細書で使用される用語「アルツハイマー病」(AD)は、進行性学習および記憶機能障害を特徴とする加齢性神経変性疾患を意味する。中期および進行期のほとんどのAD患者は、神経細胞外ベータアミロイド斑、Tauタンパク質で形成された細胞内神経原線維変化、またはシナプスおよび神経細胞の喪失を有する。この疾患は、ヒトまたは動物(イヌなど)に存在し得る。

【0031】

本明細書で使用される用語「Aβ」は、アミロイド前駆体タンパク質(APP)のセクレターゼ切断によって生成される38～48アミノ酸の長さを有する一連のポリペプチドを意味し、同じアミノ酸配列を有するポリペプチドAβ₃₈、Aβ₄₀、Aβ₄₂、Aβ₄₄、Aβ₄₅などが挙げられる。本発明では、Aβはまた、トランスジェニック法により発現されるAβ融合タンパク質の他のタンパク質切断酵素を切断することにより、または特定の発現系によりウイルスベクターで細胞を感染させることによっても生成されうるものであり、たとえば、Aβは、そのN-末端を介して、ショウジョウバエの壊死遺伝子(アミノ酸配列：MASKVSILLLLTVHLLAAQTFAQDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA)(配列番号：1))によってコードされるタンパク質に由来する分泌シグナルペプチド、またはラットプレプロエンケファリン(アミノ酸配列：MAQFLRLCILLALGSCLLATVQA)(配列番号：2)等に由来する分泌型シグナルペプチドと融合タンパク質を形成し得る。

【0032】

本明細書で使用される「Aβ分泌」という用語は、細胞内Aβ蓄積を減少させることができる、細胞膜を介して細胞内または細胞膜上に生成されたAβの排出プロセスを意味する。ここで、「Aβ₄₂分泌」は、具体的には、細胞内Aβ₄₂蓄積を減少させることができる、細胞内または細胞膜を介して細胞膜上に生成されたAβ₄₂の排出プロセスを意味する。

【0033】

本明細書で使用される用語「治療標的」は、特定の疾患を治療するために使用され得る様々な物質、および動物またはヒトの体内の物質の標的を意味する。前記疾患に対する治療効果は、前記物質が前記標的に作用するときに得られる。前記物質は、該物質が、遺伝子、タンパク質、タンパク質複合体、または疾患、症状、機能、相互作用関係に影響を与えて疾患を治療することができる限りは、タンパク質、ポリペプチド、核酸、低分子化合物などの様々な材料であり得、前記標的は、特定の遺伝子(遺伝子の特定配列を含む)、特定のタンパク質(タンパク質の特定部位を含む)、特定のタンパク質複合体(その特異的結合部位を含む)などの物質、あるいは特定の特性、特定の機能、前述の遺伝子および／またはタンパク質の周辺物質および環境との特定の相互作用関係などであり得る。

【0034】

本明細書で使用される用語「治療する」、「治療すること」、または「治療」は、その用語が適用される疾患の進行または疾患の1つ以上の症状の逆転、改善または阻害を意味する。本明細書で使用される場合、患者の状態に応じて、この用語はまた、疾患の予防またはそれに関連する任意の症状の発症を含む疾患の予防、および発症前の症状の改善または重症度の低下を含む。

【0035】

用語「阻害する」、「弱める」、「ダウンレギュレートする」、「除去する」などはすべて、量または程度の削減または減少を意味する。このような削減または減少は、このような傾向を示す限り、限定されない。たとえば、削減または減少は、元の量または程度に対して100％であってもよく、または50％または1％以下であってもよい。

【0036】

本発明は、RBO/EFR3/EFR3A/EFR3Bタンパク質、TTC7タンパク質、またはPI4KIIIαタンパク質の発現をダウンレギュレートすること、RBO/EFR3/EFR3A/EFR3Bタンパク質、TTC7タンパク質、およびPI4KIIIαタンパク質間の相互作用を弱めること、およびPI4KIIIαの酵素活性を阻害することなどの多様な作用が、シナプス欠損およびAβ₄₂を発現する神経細胞の喪失などの加齢関連機能障害を改善することができることを明らかにし、これらの効果が、細胞のAβ(特にAβ₄₂)分泌を促進し、細胞膜または細胞におけるAβ(特にAβ₄₂)蓄積を減少させることによって達成されることを開示する。

【0037】

本発明では、たとえば、本発明者は、Efr3a遺伝子ノックダウンが、APP/PS1トランスジェニックマウスにおける海馬ニューロンの樹状突起および棘の萎縮を減少させることができる一方で、PI4KIIIαタンパク質の一般的な阻害剤であるフェニルアルシンオキシド(PAO)による胃管栄養は、脳脊髄液中のAβ₄₂含量の増加を伴い得るが、APP/PS1マウスの学習および記憶を有意に改善することができ、脳組織中の細胞膜Aβ₄₂(特にAβ₄₂凝集体/オリゴマー中のAβ₄₂)の含量を減少させることができることを発見した。これらの結果は、APP/PS1マウスの認知症症状が、Aβ₄₂のニューロン分泌を促進し、ニューロンまたはニューロン膜におけるAβ₄₂(特に、凝集したAβ₄₂)の蓄積を低減することによって改善され得ることを実証した。

【0038】

本発明者らは、細胞またはニューロンにおけるRBO/EFR3/EFR3A/EFR3Bタンパク質、TTC7タンパク質、またはPI4KIIIαタンパク質の発現をダウンレギュレートすること、または膜上のPI4KIIIαタンパク質の局在を減少させるタンパク質複合体の形成を防止すること、またはPI4KIIIαタンパク質のホスホキナーゼ活性を阻害することが、細胞およびニューロンのAβ₄₂分泌を促進し、ニューロンにおけるAβ₄₂の蓄積を減少させ、AD関連の神経変性および機能障害を改善することができることを発見した；同時に、APPを切断するAβ₄₂またはAPPの発現レベル、またはα、β、およびγ-セクレターゼの活性はいずれも有意に影響されなかった。さらに、本発明者らは、PI4KIIIタンパク質の産物であるPI₄Pが、Aβ₄₂モノマーのリポソーム内での凝集を促進するが、そのような促進はPI₄Pの前駆体(PI)およびその誘導体であるPI_4,5Pよりもずっと強力であることも発見した。

【0039】

本発明者らは、Aβ(Aβ₄₂を含む)が、血漿または細胞内器官から生成されると考えている；したがって、生成されたAβは、受動的放出、エキソサイトーシス、リソソーム媒介性放出、または他の未発見の経路によって細胞から分泌され得る。Aβの起源またはそれがどのように分泌されるにもかかわらず、細胞膜はAβがそれを通って細胞を離れる最後の経路である。Aβの疎水性のために、細胞膜上では、Aβは、一方では疎水性脂肪酸鎖領域に挿入され、他方では、ホスファチジルイノシトール(特にリン酸化ホスファチジルイノシトールPI₄P)および他の酸性リン脂質と相互作用し、このような相互作用は、Aβのランダムコイルからβ-構造への立体配座変化を促進し、さらにAβ凝集物として凝集して膜上に沈着するか、またはエンドサイトーシスによって細胞内に蓄積される。さらに、可溶性Aβ(Aβ₄₂を含む)凝集体/オリゴマーの細胞またはリポソーム膜に対する親和性は、Aβ単量体の親和性よりもはるかに高いことが研究によって実証されている。したがって、凝集Aβは細胞膜上に蓄積するのがはるかに容易である。

【0040】

PI₄Pは、PIおよびPIP₂よりもAβ凝集体/オリゴマーの形成に対してより強力な促進を示す、細胞膜リン酸化ホスファチジルイノシトールの主要成分である。本発明では、本発明者らは、リポソーム中のAβ₄₂凝集体/オリゴマー形成に対するPI₄Pの促進効果が明らかに用量依存性であることを発見した。RBO/EFR3/EFR3A/EFR3Bタンパク質、TTC7タンパク質、またはPI4KIIIαタンパク質の発現をダウンレギュレートするか、それらのタンパク質複合体の形成を防止するか、またはPI4KIIIαタンパク質のキナーゼ活性を阻害することにより、細胞膜上のPI₄P産生を減少させることができる。したがって、RBO/EFR3/EFR3A/EFR3Bタンパク質、TTC7タンパク質、またはPI4KIIIαタンパク質の発現をダウンレギュレートするか、またはRBO/EFR3/EFR3A/EFR3Bタンパク質、TTC7タンパク質、およびPI4KIIIαタンパク質の膜結合タンパク質複合体の形成を防止するか、またはPI4KIIIαタンパク質の対応するホスホキナーゼ活性を阻害することにより、細胞膜Aβ(Aβ₄₂を含む)とリン酸化ホスファチジルイノシトールとの間の相互作用を弱め、Aβ単量体のランダム形態に存在するより多くの細胞膜Aβをもたらすために、細胞膜リン酸化ホスファチジルイノシトール(特にPI₄P)の量を実質的に減少させることができる。上記のように、そのようなランダム形態のAβ単量体は膜に対する親和性が低く、したがって膜から比較的容易に遊離され、細胞外に分泌される。したがって、上記の調節挙動は、APPの発現レベルまたはα、β、およびγ-セクレターゼの活性に影響を及ぼすことなく、細胞外Aβレベルの明らかな増加をもたらすために、Aβの細胞内蓄積を効果的に減少させることができる。

【0041】

以前の研究では、ショウジョウバエにおけるAβ₄₂の蓄積がPI3Kおよび関連するPI3K/Aktのシナリング経路を活性化し、AD関連のシナプス欠損および長期記憶の喪失を誘導することが報告されている；対応して、関連研究では、PI3K活性を阻害することがADを治療する方法であり得ると考えられた。しかしながら、本発明において、本発明者らは、細胞内Aβ₄₂の蓄積が、ホスファチジルイノシトールキナーゼ(PI3Kを含む)のPI3K/Aktシナリング経路活性化によって引き起こされるのではなく、細胞膜ホスファチジルイノシトールキナーゼが活性化された後、膜上でリン酸化されたホスファチジルイノシトールにより直接的に引き起こされること；さらに、本発明に関与するホスファチジルイノシトールキナーゼが、PI3K/Aktのシグナル伝達経路においてPI3Kよりもむしろ主にPI4KIIIαであることを発見した。たとえば、本発明者らは、PI4KIIIαに高度に特異的であるがPA3などのPI3Kには感受性でないホスファチジルイノシトールキナーゼ阻害剤を用いることにより、細胞からのAβ₄₂分泌を効果的に低濃度で促進することができることを発見した。

【0042】

このように、本発明者らによって、AD治療を達成するために、神経細胞または細胞膜におけるAβ(Aβ₄₂を含む)蓄積を減少させるように、Aβ分泌、特にAβ₄₂分泌を促進する方法を採用することが可能であることが明らかにされる。しかしながら、Aβの増加した分泌は、APPのアップレギュレーションまたはα、βおよびγ分泌の活性の変化によって引き起こされるAβ産生の増加に起因するものではない。

【0043】

Aβと細胞膜中の糖類、脂質およびタンパク質との結合または相互作用を弱めることを含む、神経細胞のAβ分泌を促進するための様々な経路が存在することが、当業者には理解可能である。本発明では、上記のように、細胞膜上のAβ(特にAβ₄₂)凝集を減少させることによって細胞のAβ分泌を促進することが好ましい。

【0044】

さらに、本発明は、RBO/EFR3/EFR3A/EFR3Bタンパク質、TTC7タンパク質、およびPI4KIIIαタンパク質の量および複合体を形成するそれらの能力を調節すること、ならびにPI4KIIIαタンパク質のホスホキナーゼ活性を調節することによって、細胞のAβ(特に、Aβ₄₂)分泌を促進するために、細胞膜上に形成されたAβ凝集体/オリゴマーを減少させることができ、したがって、これらのタンパク質およびそれらの関係が、ADを治療するための潜在的な治療標的を構成し得ることを明らかにする。

【0045】

したがって、rbo/Efr3/Efr3a/Efr3b遺伝子の発現、転写、または翻訳を阻害、低下、低減または排除することができ、それからコードされるRBO/EFR3/EFR3A/EFR3Bタンパク質の安定性を低下させることができる阻害剤または方法、ならびにホスファチジルイノシトールキナーゼPI4KIIIαタンパク質およびTTC7タンパク質とのタンパク質複合体の形成を阻害することができる阻害剤または方法は、ADの治療に用いられる得ることを当業者には理解しうる。前記RBO/EFR3/EFR3A/EFR3B阻害剤として、rbo/Efr3/Efr3a/Efr3b遺伝子(アンチセンスRNA、siRNA、miRNAなどを含む)の阻害ヌクレオチド、RBO/EFR3/EFR3A/EFR3Bタンパク質に対する抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0046】

rbo/Efr3/Efr3a/Efr3b遺伝子の阻害性ヌクレオチドは当該技術分野において周知であることが当業者には理解される(たとえば、www.genecards.orgを参照、および入手可能な製品：ORIGENE、カタログ番号SR308056およびカタログ番号TR303768)。同様に、RBO/EFR3/EFR3A/EFR3Bタンパク質に対する抗体は、当該分野において周知である(たとえば、www.genecards.orgを参照、および入手可能な製品：Novus、カタログ番号NBP1-81539; Thermo Fisher Scientific、カタログ番号PA5-24904)。

【0047】

また、上述したように、PI4KIIIα/PI4KA遺伝子の細胞発現、転写、または翻訳を調節すること、PI4KIIIα/PI4KA遺伝子からコードされるPI4KIIIαタンパク質の安定性を調節すること、膜タンパク質RBO/EFR3/EFR3A/EFR3BおよびTTC7タンパク質との、PI4KIIIαタンパク質の複合体形成能力を調節すること、およびPI4KIIIαタンパク質のホスホキナーゼ活性を調節することは、ADを治療する方法であるとみなすことができる。したがって、PI4KIIIα/PI4KA遺伝子の発現、転写、または翻訳を阻害、低下、減少または排除することができるか、またはそこからコードされるPI4KIIIαタンパク質の安定性を低下させることができる阻害剤または方法、限定的ではないが、PI4KIIIα/PI4KA遺伝子に特異的であるヌクレオチドなどの阻害ヌクレオチド、PI4KIIIαタンパク質に対する抗体、PI4KIIIαタンパク質と膜タンパク質とのタンパク質複合体形成を阻害し、キナーゼ活性を阻害し得る低分子化合物阻害剤が、ADを治療するために使用することができることが当業者には理解される。好ましくは、阻害剤は、低分子化合物、たとえばPAO(フェニルアルシンオキシド)、PAO誘導体、A1、G1、またはA1およびG1の類縁体である。より好ましくは、阻害剤は、PAOまたはPAO誘導体である。

【0048】

PAOは、オキソアルシン基とフェニル基とを含む塩基性構造を有する低分子化合物であり、PI4KIIIαタンパク質のホスホキナーゼ活性に強い阻害作用を示すことが当業者には理解される。PAOの化学構造は：

【化1】

フェニルアルシンオキシド(オキソ(フェニル)アルサン)
である。

【0049】

PAOの合成方法は、当業者に周知である。本発明によれば、ADの治療に用いることができる化合物は、化合物がPI4KIIIαタンパク質のホスホキナーゼ活性における阻害効果を示す限り、PAOの誘導体をさらに含む。そのような誘導体の合成方法は当該技術分野において周知であることが当業者には理解される。

【0050】

同様に、A1およびG1の両方が、PI4KIIIαタンパク質の低分子化合物阻害剤であり、類似の構造を有することは、当業者には理解される。ここで、A1の化学構造は：

【化2】

5-(2-アミノ-1-(4-(4-モルホリニル)フェニル)-1H-ベンゾイミダゾール-6-イル)-N-(2-フルオロフェニル)-2-メトキシ-3-ピリジンスルホンアミド
である。

【0051】

G1の化学構造は：

【化3】

(aS)-5-(2-アミノ-4-オキソ-3-(2-(トリフルオロメチル)フェニル)-3,4-ジヒドロキナゾリン-6-イル)-N-(2,4-ジフルオロフェニル)-2-メトキシピリジン-3-スルホンアミド
である。

【0052】

A1およびG1の合成方法は当該技術分野において周知である(たとえば、Bojjireddy、N.、et al.(2014)、JBC 289:6120-6132; Leivers、A.L.、et al.(2014)、JMC 57:2091-2106を参照)。本発明によれば、A1およびG1の構造類縁体は、それらがPI4KIIIαタンパク質のホスホキナーゼ活性に対して阻害効果を示す限り、ADを処置するために使用することができる。このような構造的類縁体の合成方法は当該技術分野において周知であることが当業者には理解される。

【0053】

さらに、PI4KIIIαタンパク質およびRBO/EFR3/EFR3A/EFR3Bタンパク質の膜複合体の形成は、足場タンパク質TTC7の補助を必要とする。したがって、本発明によれば、ttc7遺伝子の発現、転写、または翻訳を阻害、低下、低減、または排除することができ、およびそこからコードされるTTC7タンパク質の安定性を低下させることができる阻害剤または方法、ならびにRBO/EFR3/EFR3A/EFR3Bタンパク質およびPI4KIIIαタンパク質とのタンパク質複合体の形成を阻害することができる阻害剤または方法が、ADを治療するために使用することができることが当業者には理解される。前記TTC7阻害剤として、ttc7遺伝子の阻害性ヌクレオチド(アンチセンスRNA、siRNA、miRNAなどを含む)、TTC7タンパク質に対する抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0054】

さらに、本発明によれば、RBO/EFR3/EFR3A/EFR3Bタンパク質およびPI4KIIIαタンパク質の発現をダウンレギュレートするか、または膜上のPI4KIIIαタンパク質の分布を減少させるタンパク質複合体の形成を防止するか、またはPI4KIIIαタンパク質のホスホキナーゼ活性を阻害することが、本質的に、細胞膜PI₄Pの減少をもたらし、細胞のAβ分泌をさらに促進する。したがって、細胞膜PI₄Pの量またはレベルを減少させ、および細胞膜上のAβ凝集物/オリゴマーの形成をさらに減少させることができる任意の阻害剤または方法は、上記のようにADを治療する効果を達成することができることが当業者には理解される。

【0055】

前述のPI₄P阻害剤が、PI₄Pに特異的に結合する抗体または他の分子であり得ることが当業者には理解される。現在、PI₄Pに対する抗体の合成方法は、当該技術分野において周知である(Brown BK and Karasavass N、et al.、2007、J virol; Wassef NM and Roerdink F、et al. 1984、Mol Immuolを参照)。たとえば、それはヒト由来の広範な中和抗体4E10およびPI₄Pに対する他の抗体であり得る。現在、PI₄Pに特異的に結合する分子の合成方法は、当該分野で周知である(Balla A and Kim YJ、et al.、2008、Mol Biol Cell; Zubenko GS and Stiffler et al.、1999、Biol Psychiaryを参照)。たとえば、それは、OSH2-PH2X融合タンパク質またはOSH2-2x-PH融合タンパク質であり得る。

【0056】

限定的ではないが、RBO/EFR3/EFR3A/EFR3Bに対する抗体、PI4KIIIαに対する抗体、TTC7に対する抗体、PI₄Pに対する抗体、rbo/Efr3/Efr3a/Efr3b遺伝子に特異的な阻害ポリペプチド、PI4KIIIα/PI4KA遺伝子に特異的な阻害ポリペプチド、PI4KIIIαタンパク質のホスホキナーゼ活性を阻害する低分子化合物などの、ADを治療するために用いることができるか、またはADに対する治療可能性を有する本発明により提供される前述の物質(以下、総称して「本発明の物質」という。)を単離、精製、合成および/または組換えすることができる。

【0057】

さらに、本発明の物質は、医薬組成物などの組成物に製剤化することもできる。これに関して、本発明は、上記抗体、阻害ポリペプチド、および/または低分子化合物のいずれか、ならびに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

【0058】

本発明の物質のいずれかを含有する本発明の医薬組成物は、抗体および低分子化合物、阻害ポリペプチドおよび抗体、または2種以上の抗体もしくは低分子化合物などの1種以上の本発明の物質を含むことができる。あるいは、医薬組成物は、本発明の物質を別の薬学的に活性な薬剤または薬物と組み合わせて含むこともできる。あるいは、医薬組成物は、本発明の物質を別の薬学的に活性な薬剤または薬物と組み合わせて含むこともできる。たとえば、それは、BapineuzumabなどのAβに対する抗体薬、または海洋由来硫酸化オリゴ糖HSH971およびその類縁体、アカンプロセート(トラミプロセート)およびその類縁体、エダラボンおよびその類縁体などのAβ凝集をブロックするために脳の神経細胞外Aβまたはβアミロイド斑に結合する化合物、またはAβ凝集物の脱凝集を促進する化合物を含むことができる。このようにして、医薬組成物は、一方ではニューロンからのAβ分泌を促進し、他方ではニューロン外のAβの除去を促進し、それによりADの治療に対してより良好な治療効果を達成する。

【0059】

別の態様では、本発明は、ADの治療のための新規医薬品または治療標的をスクリーニングするための方法を提供する。この方法は、本発明の前述の発見に基づいて設計されており、すなわち、AD関連神経変性および機能障害を改善および予防するために、Aβ₄₂分泌を促進することによって、細胞内Aβ₄₂蓄積を減少させることができる。したがって、医薬品または治療標的をスクリーニングするための基準は、医薬投与または治療標的の調節後のAβ分泌(特にAβ₄₂分泌)における促進効果であり、Aβ分泌の増加が、α、β、およびγ-セクレターゼの活性の変化によって引き起こされるAPPのアップレギュレーションまたはAβ産生の増加に起因することはありえない。

【0060】

本発明によれば、治療標的の調節は、治療標的の周辺環境との機能、特性、または関係を変化させるように、関連する物質を治療標的に直接的または間接的に作用させるために用いて、細胞のAβ分泌(特に、Aβ₄₂分泌)の促進を誘導することを意味する。

【0061】

アルツハイマー病を治療するのに有効な薬物を選択するために、スクリーニング試験のための細胞株は、哺乳動物、昆虫由等来真の核細胞株、たとえば、HEK293、COS7、N2a、SH-SY5Y、S2、sf9等であり得ることが当業者には理解される。方法は、アルツハイマー病を治療するのに有効な薬物を選択するために候補薬物がAβ蓄積、特にAβ₄₂の蓄積を細胞膜上または細胞内で減少させるかどうかを試験することを含む。好ましくは、Aβ分泌が増加しているかどうかの試験は、APPを過剰発現する細胞株(たとえば、ヒト由来APPで安定にトランスフェクトされたHEK293、COS7、N2a、SH-SY5Y細胞株)またはショウジョウバエのモデル、好ましくは第3齢ショウジョウバエの幼虫の組織で行われうる。Aβ分泌が増加するかどうかは、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)または電気化学発光アッセイ(ECLIA)などのイムノアッセイの方法で検出されうる。

【0062】

好ましくは、ADの治療のための医薬または治療標的をスクリーニングする方法は、PI4KIIIαの酵素活性における候補薬剤または標的調節の発明の効果を観察し、候補薬剤または標的調節の発明が、検出系におけるPI4KIIIαキナーゼの機能に否定的に影響を及ぼす場合、すなわち、PI4KIIIαキナーゼ活性または細胞膜PI₄Pレベルの低下を特徴とする場合、候補薬医薬、薬剤または標的がADを治療するための可能性のある薬剤または治療標的であることを示す；ことを含む。このようなスクリーニング後、細胞内Aβ(特にAβ₄₂)蓄積が減少するかどうか、および細胞外Aβ分泌が促進されるかどうかがさらに検出される。これらの方法では、候補のスクリーニング効率を大幅に改善することができる。

【0063】

本発明の1つの特定の実施態様によれば、ADの治療のための医薬または治療標的をスクリーニングする方法は、候補薬または治療標的の調節の発明が、膜上のPI4KIIIαタンパク質の量を減少させるように、細胞膜PI4KIIIαタンパク質を細胞質に再分布させるかどうか、および細胞膜Aβ単量体の凝集/オリゴマー化の減少ならびに細胞外分泌の増加を誘導するかどうか、を直接分析することに基づいて決定することを含みうる。好ましくは、蛍光標識PI4KIIIαが、蛍光タンパク質(GFP-PI4KIIIα)で標識したPI4KIIIαなどの観察のために選択され、蛍光標識PI4KIIIαが細胞膜から細胞質に移動するかどうかを観察することができる。

【0064】

本発明の1つの特定の実施態様によれば、AD治療のための医薬または治療標的をスクリーニングする方法は、タンパク質間の相互作用を分析する同時免疫沈降アッセイなどの方法で行うこともできる。候補薬剤または治療標的の調節の発明が、RBO/EFR3/EFR3A/EFR3Bタンパク質、TTC7タンパク質およびPI4KIIIαタンパク質間の相互作用を減少させる場合、薬剤または治療標的が、細胞膜Aβ単量体の凝集を減少させるように膜タンパク質複合体を形成する際のPI4KIIIαタンパク質の能力を弱め、ならびに、細胞外分泌を増加させることができることを示す

【0065】

本発明の1つの特定の実施態様によれば、候補薬剤または治療標的の調節の発明が、細胞膜PI₄Pレベルを低下させるかどうかを直接分析することによって、ADの治療のための医薬または治療標的をスクリーニングする方法を実施することもできる。好ましくは、蛍光タンパク質で標識されたOSH2-PH2XまたはOSH2-2x-PH融合タンパク質などのPI₄Pに特異的に結合する蛍光標識分子が、細胞膜量において減少するかどうか、または細胞膜から細胞質に転移するかどうかを観察するために、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、または2光子顕微鏡を利用することができる。

【0066】

以下、本発明をさらに詳細に説明する。しかしながら、本発明を実施する方法は、以下の実施例に限定されない。

【0067】

以降、主に動物および細胞培養実験によりデータを取得し、SPSSソフトウェアで分析する。特に明記しない限り、データは平均±SEMで表される。P＜0.05は、その差が統計的に有意であることを示す。これ以降に示されるすべてのデータは、平均±SEMで表される。「*」、「**」、および「***」はそれぞれ、それぞれp＜0.05、0.01および0.001を表す。

【実施例0068】

ショウジョウバエ系統および遺伝学的方法
25℃の一定温度下で培養する標準培地、12時間明期および12時間暗期の交互サイクル。

【0069】

以下のトランスジェニックショウジョウバエ系統を本発明において利用した：rbo^S358A、[UAS]Aβ_arc、[UAS]Aβ₄₂、[UAS]dtau、[UAS]mCD8-gfp(Dr. Z. Wangによって提供された)、[UAS]shibire^ts1(Dr. A Guoによって提供された)、[Gal4]A307(Dr. O'Kaneによって提供された)。ここで、rbo^S358A遺伝子は、部位特異的突然変異によるrbo遺伝子を含む野生型ゲノムDNAから構築された導入遺伝子であり、その発現はrbo遺伝子自体のプレドライバによって駆動される。[Gal4]A307は、転写因子であるGal4を発現し、[UAS]Aβ_arc、[UAS]Aβ₄₂、[UAS]dtau、[UAS]mCD8-gfp、[UAS]shibire^ts1導入遺伝子を駆動させて、Aβ_arc、Aβ₄₂、dTau、mCD8-GFPまたは温度感受性突然変異Dynaminを、巨大繊維経路のニューロンおよび少量の他のニューロンにおいて発現させる。本発明で利用されるショウジョウバエ突然変異体として、以下のものが挙げられる：rbo^ts1(温度感受性ミスセンス突然変異)、rbo²(ノックダウン突然変異)、itpr^sv35(ナンセンス突然変異、ブルーミントンストック＃30740)、PI4KIIIα^def(PI4KIIIα遺伝子および末梢DNAの欠失を有する突然変異、ブルーミントンストック＃9518)、PI4KIIIα^GS27およびPI4KIIIα^GJ86(両方ともナンセンス突然変異)。P{lacW}l(2)k14710k¹⁵⁶⁰³トランスポゾンは、l(2)k14710(ブルーミントンストック＃11134)；P{EPgy2}bin3^EY09582(ブルーミントンストック＃20043)の転写を防止するために、l(2)k14710遺伝子の第一エクソンに挿入される。遺伝的バックグラウンドを精製するために、使用前に5世代以上にわたり、全ての導入遺伝子および突然変異体ハエを野生型の同質遺伝子型系統(同質遺伝子w¹¹¹⁸、ブルーミントンストック＃5905)と戻し交配した。

【0070】

本発明者らの先行研究は、GF経路のニューロンにおける野生型または北極変異体Aβ₄₂を発現するハエ(ショウジョウバエ)(Aβ₄₂またはAβ_arcハエもしくはショウジョウバエ)が、ニューロン内Aβ₄₂蓄積、日齢依存性シナプス伝達不全および早期死を示すことを発見した。このようなハエはまた、日齢に依存したクライミング能力の低下を示す。神経細胞内Aβ₄₂蓄積によって引き起こされる神経欠損におけるrbo遺伝子の役割を研究するために、rbo遺伝子の2つの突然変異、ミスセンス突然変異(rbo^ts1)およびノックダウン突然変異(rbo²)をAβ_arcハエに導入し、シナプス伝達、クライミング能力および日齢における効果をそれぞれ試験した。4群のハエを構築した：対照ハエ(コントロール、ctrl)、rbo^ts1/+またはrbo^2/+ヘテロ接合体(rbo)、Aβ_arcハエ(Aβ_arc)、およびrbo^ts1/+またはrbo^2/+ヘテロ接合突然変異を有するAβ_arcハエ(Aβ_arc-rbo))。各群は1～2系統を含み、ここで、「ctrl」は、[Gal4]A307導入遺伝子を有する野生型対照ハエを示す；「rbo^ts1/+」および「rbo^2/+」は、[Gal4]A307導入遺伝子の1コピーを有するrbo^ts1/+およびrbo^2/+ヘテロ接合性ハエを示し；「Aβ_arc」は、[Gal4]A307/[UAS]Aβ_arc二重トランスジェニックハエを示し；「Aβ_arc-rbo^ts1/+」および「Aβ_arc-rbo^2/+」は、それぞれ、[Gal4]A307-rbo^ts1/[UAS]Aβ_arcおよび[Gal4]A307-rbo²/[UAS]Aβ_arcを示す。最初の2群のハエはAβ_arcを発現せず、「ノンAβハエ」と分類され、後者の2群のハエはAβ_arcを発現し、「Aβハエ」と分類された。

【実施例0071】

rbo遺伝子突然変異は、シナプス伝達検査によって試験されるように、Aβ₄₂発現ショウジョウバエの神経欠損を特異的に抑制する。

【0072】

シナプス伝達の検査方法：
細胞内での巨大繊維(GF)系における興奮性接合電位(EJP)の記録。特定の日齢の成体雌ハエを、解剖顕微鏡下で低融点ワックスであるタッキーワックス(Boekel Scientific)でガラススライド上に腹側を下にして載せた。記録システムは、腹部内に1つの参照電極、2つの目に挿入された2つの刺激電極、および背側縦筋細胞に挿入された1つの記録電極を包含する。両眼を電気刺激(100Hz、50パルス)に付した。刺激強度は5～20ボルトであり、持続時間は0.2msであり、閾値刺激強度の約150％である。電気信号をAxonalクランプ900A(Molecular Devices)で記録および増幅し、Digidata 1440A(Molecular Devices)によって周波数10kHzでデジタル化した。データを、pClampソフトウェア(バージョン10.0；Molecular Devices)によって記録および分析した。すべての電極は、3M KCl溶液で満たされたガラス電極である。記録中の環境温度は25℃であった。

【0073】

図1は、4群のハエにおける異なる日齢における脳刺激されたEJPの代表的記録(図1a)を示し、誘発されたEJPの成功率の定量分析(図1b)を示す。特に、rbo突然変異は、Aβ_arcによって引き起こされる日齢依存性ニューロンシナプス伝達障害を有意に阻害することに留意されたい。統計解析は、第3-7日、第15-17日、および第25-27日(n=6-12)、第31-35日(n=10-23)のデータに対して一元配置ANOVAを用いて行った。

【0074】

上記のシナプス伝達検査方法によれば、羽化後、第3-7、第15-17、第25-27および第31-35日に、高周波電気刺激下(100Hz、50パルス)の背側縦筋線維におけるEJPの細胞内記録を行った。第1群における高周波電気刺激によって誘発されたEJPの成功率は、第3-7日および第15-17日における他の3群と有意に異ならなかった(図1a-1b)。第25-27日および第31-35日において、Aβ_arc-rboハエにおけるEJPの成功率は、対照ハエおよびrboハエのそれよりも低くなったが、Aβ_arcハエのそれより有意に高かった(図1aおよび1b)。

【0075】

これらの結果は、rbo遺伝子突然変異が、ニューロン内Aβ_arc蓄積によって引き起こされる日齢依存的なシナプス伝達障害を改善することを示している。4つの群のハエを作製するために使用されるトランスジェニックハエおよびrbo突然変異体の遺伝的バックグラウンドは、使用前に5世代以上にわたり野生型同遺伝子型系統(同遺伝子型w¹¹¹⁸)と戻し交配され、遺伝的バックグラウンドは本質的に精製されるので、遺伝的背景の違いが寛解に寄与したとは考えにくい。rbo遺伝子の完全ノックダウンは胚の致死性を引き起こすので、Aβ_arc誘導性シナプス伝達障害におけるその効果を調べることはできなかった。