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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023116876
(43)【公開日】2023-08-23
(54)【発明の名称】抗酸化用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 35/741 20150101AFI20230816BHJP
A61K 35/742 20150101ALI20230816BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20230816BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20230816BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20230816BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230816BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230816BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230816BHJP
【ＦＩ】
A61K35/741
A61K35/742
A61P1/16
A61P3/10
A61P9/10
A61P25/00
A61P11/00
A61P43/00
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022019232
(22)【出願日】2022-02-10
(71)【出願人】
【識別番号】000114282
【氏名又は名称】ミヤリサン製薬株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000671
【氏名又は名称】ＩＢＣ一番町弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】金 倫基
(72)【発明者】
【氏名】秋山 雅博
(72)【発明者】
【氏名】高橋 志達
(72)【発明者】
【氏名】岡 健太郎
(72)【発明者】
【氏名】林 篤史
(72)【発明者】
【氏名】山田 裕貴
【テーマコード（参考）】
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C087BC30
4C087BC68
4C087NA14
4C087ZA01
4C087ZA45
4C087ZA59
4C087ZA75
4C087ZB26
4C087ZC35
4C087ZC41
(57)【要約】
【課題】新規な抗酸化用組成物を提供する。
【解決手段】アネロトランカス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ）属、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ドレア（Ｄｏｒｅａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ファカリカテナ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ）属、ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）属およびコプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属からなる群から選択される少なくとも１種の微生物またはその培養物を有効成分として含む、抗酸化用組成物。
【選択図】なし
【解決手段】アネロトランカス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ）属、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ドレア（Ｄｏｒｅａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ファカリカテナ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ）属、ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）属およびコプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属からなる群から選択される少なくとも１種の微生物またはその培養物を有効成分として含む、抗酸化用組成物。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アネロトランカス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ）属、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ドレア（Ｄｏｒｅａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ファカリカテナ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ）属、ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）属およびコプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属からなる群から選択される少なくとも１種の微生物またはその培養物を有効成分として含む、抗酸化用組成物。
【請求項2】
前記微生物が腸内細菌由来の微生物である、請求項１に記載の抗酸化用組成物。
【請求項3】
前記微生物がアネロトランカス・コリホミニス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ）、ルミノコッカス・グナバス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓ）、ドレア・フォルミシゲネランス（Ｄｏｒｅａ ｆｏｒｍｉｄｉｇｅｎｅｒａｎｓ）、クロストリジウム・インドリス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｉｎｄｏｌｉｓ）、クロストリジウム・ボルテエ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ）、クロストリジウム・ラバレンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌａｖａｌｅｎｓｅ）、ドレア・ロンギカテナ（Ｄｏｒｅａ ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ）、ファカリカテナ・オロティカ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ ｏｒｏｔｉｃａ）、ブラウティア・ハンセニ（Ｂｌａｕｔｉａ ｈａｎｓｅｎｉｉ）、コプロコッカス・コメス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｍｅｓ）、クロストリジウム・シンビオサム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ）およびクロストリジウム・セレレクレセンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｅｒｅｃｒｅｓｃｅｎｓ）からなる群から選択される少なくとも１種の微生物である、請求項１または２に記載の抗酸化用組成物。
【請求項4】
酸化ストレス低減のために使用される、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗酸化用組成物。
【請求項5】
アネロトランカス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ）属、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ドレア（Ｄｏｒｅａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ファカリカテナ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ）属、ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）属およびコプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属からなる群から選択される少なくとも１種の微生物またはその培養物を含む、活性イオウ分子産生促進用組成物。
【請求項6】
アネロトランカス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ）属、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ドレア（Ｄｏｒｅａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ファカリカテナ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ）属、ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）属およびコプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属からなる群から選択される少なくとも１種の微生物またはその培養物と、シスチンとを接触させることを含む、活性イオウ分子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗酸化用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
フリーラジカル、活性酸素窒素種（ＲＯＮＳ）などのオキシダントの生成による酸化ストレスは、脂質、タンパク質、核酸などの高分子の過剰な酸化的修飾を引き起こす。これは、細胞機能不全および重要な細胞プロセスの崩壊を誘発し（非特許文献１）、それによって、がん、神経障害、動脈硬化、糖尿病、肝炎、慢性閉塞性肺疾患などの広範な病理を誘発することが知られている（非特許文献２および３）。
【0003】
近年の研究により、腸内細菌が産生する代謝物が、腸内外の生理機能に関連していることが明らかになっている（非特許文献４）。しかし、全身の活性イオウ分子（ＲＳＳ）プールおよび宿主の抗酸化能に対する腸内細菌の寄与は、依然として不明である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Sharifi-Rad et al., (2020). Lifestyle, Oxidative Stress, and Antioxidants: Back and Forth in the Pathophysiology of Chronic Diseases. Front Physiol. 11, 694
【非特許文献2】Li et al., (2015). The Role of Oxidative Stress and Antioxidants in Liver Diseases. Int J Mol Sci. 16(11), 26087-26124
【非特許文献3】Liguori et al., (2018). Oxidative stress, aging, and diseases. Clin Interv Aging. 13, 757-772
【非特許文献4】Fan and Pedersen, (2021). Gut microbiota in human metabolic health and disease. Nat Rev Microbiol. 19(1), 55-71
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
腸内細菌由来の新たな有効成分を提供することにより、酸化ストレスに起因する疾患などの治療、予防などに対して、新たな手段を提供することができる。
【0006】
したがって、本発明は、新規な抗酸化用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、驚くべきことに、腸内細菌が宿主生体内における活性イオウ分子量に影響を与えることを見出した。そして、この知見に基づき、本発明を完成させるに至った。
【0008】
すなわち、本発明の一形態によれば、アネロトランカス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ）属、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ドレア（Ｄｏｒｅａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ファカリカテナ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ）属、ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）属およびコプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属からなる群から選択される少なくとも１種の微生物またはその培養物を有効成分として含む、抗酸化用組成物が提供される。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、新規な抗酸化用組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1A】ＳＰＦマウスおよび抗生物質処理ＳＰＦマウス（Ａｂｘマウス）における血漿中活性イオウ分子濃度の測定結果を示すグラフである。
【図1B】ＧＦマウスおよびｅｘＧＦマウスにおける血漿中活性イオウ分子濃度の測定結果を示すグラフである。
【図2A】ＳＰＦマウス（抗生物質無投与）の糞便サンプルをメチオニン、システインまたはシスチンの存在下培養した結果を示すグラフである。
【図2B】ＳＰＦマウス（抗生物質無投与）およびＡｂｘマウスの糞便からのＨＭＷ画分の精製物とシスチンとを反応させた結果を示すグラフである。
【図3A】Ｃ５７ＢＬ／６マウス（抗生物質無投与または抗生物質投与）にシスチンを経口投与し、血漿中活性イオウ分子濃度を測定した結果を示すグラフである。
【図3B】ＣｏｎＡ誘発肝炎モデルマウスの血清ＡＬＴレベルおよびＭＤＡレベルを測定した結果を示すグラフである。
【図3C】抗生物質を投与したＣｏｎＡ誘発肝炎モデルマウスの血清ＡＬＴレベルを測定した結果を示すグラフである。
【図4A】異なるスペクトラムを有する抗生物質を投与したマウスの糞便における活性イオウ分子レベルを測定した結果を示すグラフである。
【図4B】１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングを用いた腸内細菌叢の組成解析の結果を示すグラフである。
【図4C】１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングを用いた腸内細菌叢の組成解析の結果を示すグラフである。
【図4D】単一株を用いて細胞培養を行い、シスチン投与後のシステインパースルフィド産生能を評価した結果を示すグラフである。
【図4E】アネロトランカス・コリホミニス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ）、ドレア・ロンギカテナ（Ｄｏｒｅａ ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ）およびクロストリジウム・ボルテエ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ）をメチオニン、システインまたはシスチン存在下で培養後の各菌株におけるシステインパースルフィド産生量の結果を示すグラフである。
【図4F】アネロトランカス・コリホミニス、ドレア・ロンギカテナ、クロストリジウム・ボルテエおよびバクテロイデス・テタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）からの精製タンパク質とシスチンとＡＯＡＡとを反応させた結果を示すグラフである。
【図5】クロストリジウム・ボルテエ培養溶液の投与群およびクロストリジウム・ボルテエ培養溶液の非投与群における血漿中の活性イオウ分子レベルを測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、本発明の一形態に係る実施の形態を説明する。本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。
【0012】
本明細書において、範囲を示す「Ｘ～Ｙ」は「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０～２５℃）／相対湿度４０～５０％ＲＨの条件で測定する。
【0013】
本明細書において、抗酸化とは、活性酸素などによる生体の酸化を防止する作用を意味する。
【0014】
本明細書において、活性イオウ分子（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｓｕｌｆｕｒ Ｓｐｅｃｉｅｓ；ＲＳＳ）とは、チオールに硫黄原子が過剰に付加したポリスルフィド構造を有する化合物である。活性イオウ分子としては、例えばシステインパースルフィド（ＣｙｓＳＳＨ）、グルタチオンパースルフィド（ＧＳＳＨ）、過硫化水素（ＨＳＳＨ）などが挙げられる。
【0015】
＜抗酸化用組成物＞
本発明の一形態は、アネロトランカス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ）属、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ドレア（Ｄｏｒｅａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ファカリカテナ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ）属、ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）属およびコプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属からなる群から選択される少なくとも１種の微生物またはその培養物を有効成分として含む、抗酸化用組成物である。
本発明の一形態は、アネロトランカス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ）属、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ドレア（Ｄｏｒｅａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ファカリカテナ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ）属、ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）属およびコプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属からなる群から選択される少なくとも１種の微生物またはその培養物を有効成分として含む、抗酸化用組成物である。
【0016】
本明細書において、「アネロトランカス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ）属、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ドレア（Ｄｏｒｅａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ファカリカテナ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ）属、ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）属およびコプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属からなる群から選択される少なくとも１種の微生物」を単に「本発明に係る微生物」とも称する。
【0017】
アネロトランカス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ）属の微生物としては、アネロトランカス・コリホミニス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ）などが挙げられる。
【0018】
ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属の微生物としては、ルミノコッカス・グナバス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓ）、ルミノコッカス・アルバス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ）、ルミノコッカス・ブロミイ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒｏｍｉｉ）、ルミノコッカス・ガウブレアウイ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｕｖｒｅａｕｉｉ）、ルミノコッカス・ラクタリス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔａｒｉｓ）、ルミノコッカス・トルキース（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｏｒｑｕｅｓ）、ルミノコッカス・フェシス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｓ）、ルミノコッカス・カリダス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｌｌｉｄｕｓ）、フラベファシエンス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ）、ルミノコッカス・シャンパネレンシス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｃｈａｍｐａｎｅｌｌｅｎｓｉｓ）、ルミノコッカス・オベウム（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｏｂｅｕｍ）などが挙げられる。
【0019】
ドレア（Ｄｏｒｅａ）属の微生物としては、ドレア・フォルミシゲネランス（Ｄｏｒｅａ ｆｏｒｍｉｄｉｇｅｎｅｒａｎｓ）、ドレア・ロンギカテナ（Ｄｏｒｅａ ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ）などが挙げられる。
【0020】
クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属の微生物としては、クロストリジウム・インドリス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｉｎｄｏｌｉｓ）、クロストリジウム・ボルテエ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ）、クロストリジウム・ラバレンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌａｖａｌｅｎｓｅ）、クロストリジウム・シンビオサム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ）、クロストリジウム・セレレクレセンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｅｒｅｃｒｅｓｃｅｎｓ）、クロストリジウム・シンデンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃｉｎｄｅｎｓ）、クロストリジウム・アスパラギフォルメ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｓｐａｒａｇｉｆｏｒｍｅ）、クロストリジウム・クロストリジフォルメ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｆｏｒｍｅ）、クロストリジウム・ハセワイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈａｔｈｅｗａｙｉ）、クロストリジウム・ネキシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｅｘｉｌｅ）、クロストリジウム・グリシルリジニリチクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎｉｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・アミノバレリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｍｉｎｏｖａｌｅｒｉｃｕｍ）、クロストリジウム・クラリフラバム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｌａｒｉｆｌａｖｕｍ）などが挙げられる。
【0021】
ファカリカテナ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ）属の微生物としては、ファカリカテナ・オロティカ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ ｏｒｏｔｉｃａ）、ファカリカテナ・コントルタ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ ｃｏｎｔｏｒｔａ）、ファカリカテナ・フィシカテナ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ ｆｉｓｓｉｃａｔｅｎａ）などが挙げられる。
【0022】
ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）属の微生物としては、ブラウティア・ハンセニ（Ｂｌａｕｔｉａ ｈａｎｓｅｎｉｉ）、ブラウティア・ウェクレラ（Ｂｌａｕｔｉａ ｗｅｘｌｅｒａｅ）、ブラウティア・ルティ（Ｂｌａｕｔｉａ ｌｕｔｉ）、ブラウティア・ファエシス（Ｂｌａｕｔｉａ ｆａｅｃｉｓ）、ブラウティア・グルセラセア（Ｂｌａｕｔｉａ ｇｌｕｃｅｒａｓｅａ）、ブラウティア・コッコイデス（Ｂｌａｕｔｉａ ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ）、ブラウティア・プロダクタ（Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ）、ブラウティア・スターコリス（Ｂｌａｕｔｉａ ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ）、ブラウティア・ヒドロゲノトロフィカ（Ｂｌａｕｔｉａ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、ブラウティア・オベウム（Ｂｌａｕｔｉａ ｏｂｅｕｍ）などが挙げられる。
【0023】
コプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属の微生物としては、コプロコッカス・コメス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｍｅｓ）、コプロコッカス・カツス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｔｕｓ）、コプロコッカス・エウタクタス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｅｕｔａｃｔｕｓ）などが挙げられる。
【0024】
本発明に係る微生物は、好ましくは腸内細菌由来の微生物である。
【0025】
好ましい実施形態では、本発明に係る微生物は、アネロトランカス・コリホミニス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ）、ルミノコッカス・グナバス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓ）、ドレア・フォルミシゲネランス（Ｄｏｒｅａ ｆｏｒｍｉｄｉｇｅｎｅｒａｎｓ）、クロストリジウム・インドリス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｉｎｄｏｌｉｓ）、クロストリジウム・ボルテエ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ）、クロストリジウム・ラバレンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌａｖａｌｅｎｓｅ）、ドレア・ロンギカテナ（Ｄｏｒｅａ ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ）、ファカリカテナ・オロティカ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ ｏｒｏｔｉｃａ）、ブラウティア・ハンセニ（Ｂｌａｕｔｉａ ｈａｎｓｅｎｉｉ）、コプロコッカス・コメス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｏｍｅｓ）、クロストリジウム・シンビオサム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ）およびクロストリジウム・セレレクレセンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｅｒｅｃｒｅｓｃｅｎｓ）からなる群から選択される少なくとも１種の微生物であり、より好ましくはアネロトランカス・コリホミニス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ）、ドレア・ロンギカテナ（Ｄｏｒｅａ ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ）およびクロストリジウム・ボルテエ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ）からなる群から選択される少なくとも１種の微生物である。
【0026】
本発明に係る抗酸化用組成物は、上記本発明に係る微生物に加え、ファーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、フラボニフラクター（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ）属、アナエロスティペス（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ）属、ユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブチリビブリオ（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ）属、サブドリグラヌラム（Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ）属、フシカテニバクター（Ｆｕｓｉｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒ）属、ロセブリア（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）属、オシリバクター（Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ）属、ロニソニエラ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎｉｅｌｌａ）属など微生物を含むことができる。
【0027】
ファーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の微生物としては、ファーカリバクテリウム・プラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）などが挙げられる。
【0028】
フラボニフラクター（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ）属の微生物としては、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉｉ）などが挙げられる。
【0029】
アナエロスティペス（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ）属の微生物としては、アナエロスティペス・ハドラス（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ ｈａｄｒｕｓ）、アナエロスティペス・ブチラティカス（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ ｂｕｔｙｒａｔｉｃｕｓ）などが挙げられる。
【0030】
ユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の微生物としては、ユーバクテリウム・レクタレ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ）、ユーバクテリウム・ラムラス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｍｕｌｕｓ）、ユーバクテリウム・ハリイ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｌｉｉ）などが挙げられる。
【0031】
ブチリビブリオ（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ）属の微生物としては、ブチリビブリオ・フィブリソルベンス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ）、ブチリビブリオ・クロッソツス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｃｒｏｓｓｏｔｕｓ）などが挙げられる。
【0032】
サブドリグラヌラム（Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ）属の微生物としては、サブドリグラヌラム・バリアビレ（Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ ｖａｒｉａｂｉｌｅ）などが挙げられる。
【0033】
フシカテニバクター（Ｆｕｓｉｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒ）属の微生物としては、フシカテニバクター・サッカリボランス（Ｆｕｓｉｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｉｖｏｒａｎｓ）などが挙げられる。
【0034】
ロセブリア（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）属の微生物としては、ロセブリア・ファエシス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｆａｅｃｉｓ）、ロセブリア・ホミニス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｈｏｍｉｎｉｓ）、ロセブリア・インテスティナリス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）などが挙げられる。
【0035】
オシリバクター（Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ）属の微生物としては、オシリバクター・バレリシゲネス（Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ ｖａｌｅｒｉｃｉｇｅｎｅｓ）などが挙げられる。
【0036】
ロニソニエラ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎｉｅｌｌａ）属の微生物としては、ロビソニエラ・ペオリエンシス（Ｒｏｂｉｎｓｏｎｉｅｌｌａ ｐｅｏｒｉｅｎｓｉｓ）などが挙げられる。
【0037】
上記微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）、理化学研究所 微生物材料開発室（ＪＣＭ）、ナショナルバイオリソースプロジェクト（ＮＢＲＰ）、米国菌培養収集所（ＡＴＣＣ）、ドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ）などから入手することができる。
【0038】
本発明に係る微生物は、従来公知の方法を用いてヒトの糞便から得ることができる。
【0039】
本発明に係る微生物は、１種のみが単独で用いられてもよいし、２種以上が併用されてもよい。
【0040】
本発明において、本発明に係る微生物の培養物は、微生物を培養した培養液、前記培養液を遠心分離して得られる上清、前記培養液を遠心分離して得られる菌を含む残渣、前記残渣からの精製物および前記残渣の乾燥物を意味する。
【0041】
残渣からの精製物（例えば、タンパク質）は、従来公知の手法に記載の方法に従って得ることができる。
【0042】
残渣の乾燥物は、培養液を遠心分離して得られる菌を含む残渣を風乾処理または減圧乾燥処理を行うことにより得ることができる。
【0043】
本発明に係る微生物の培養物は、従来公知の微生物の培養方法により得ることができる。例えば、微生物の培養に使用する培地は、固体または液体培地のいずれでもよく、また、使用する微生物が資化しうる炭素源、適量の窒素源、無機塩及びその他の栄養素を含有する培地であれば、合成培地または天然培地のいずれでもよい。通常、培地は、炭素源、窒素源および無機物を含む。
【0044】
本発明に係る微生物の培養において使用できる炭素源としては、使用する菌株が資化できる炭素源であれば特に制限されない。具体的には、微生物の資化性を考慮して、グルコン酸、カプリン酸、アジピン酸、リンゴ酸、クエン酸、酢酸フェニル、酢酸、乳酸、コハク酸、グルクロン酸、ピルピン酸等の有機酸類およびその塩、ヘキサデカン等の炭化水素、麦、米等の天然物、グリセロール、メタノール、エタノール等のアルコール類、糖類などが挙げられる。上記炭素源は、培養する微生物による資化性を考慮して適宜選択される。上記炭素源は、１種または２種以上選択して使用することができる。
【0045】
本発明に係る微生物の培養において使用できる窒素源としては、肉エキス、魚肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、トリプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆加水分解物、大豆粉末、カゼイン、ミルクカゼイン、カザミノ酸、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸等の各種アミノ酸、コーンスティープリカー、その他の動物、植物、微生物の加水分解物等の有機窒素源；アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、亜硝酸ナトリウムなどの亜硝酸塩、尿素等の無機窒素源などが挙げられる。上記窒素源は、培養する微生物による資化性を考慮して適宜選択される。上記窒素源は、１種または２種以上選択して使用することができる。
【0046】
本発明に係る微生物の培養において使用できる無機物としては、マグネシウム、マンガン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、銅、鉄及び亜鉛などの、リン酸塩、塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩、塩化物等のハロゲン化物などが挙げられる。上記無機物は、培養する微生物による資化性を考慮して適宜選択される。また、上記無機物を１種または２種以上選択して使用することができる。また、培地中に、必要に応じて、界面活性剤等を添加してもよい。
【0047】
本発明に係る微生物の培養は、通常の方法によって行える。例えば、微生物の種類によって、好気的条件下または嫌気的条件下で、微生物を培養する。前者の場合には、微生物の培養は、振盪あるいは通気攪拌などによって行われる。また、微生物を連続的にまたはバッチで培養してもよい。培養条件は、培地の組成や培養法によって適宜選択され、本発明に係る微生物が増殖できる条件であれば特に制限されず、培養する微生物の種類に応じて適宜選択されうる。培養温度は、通常２０～４２℃、好ましくは３５～４０℃である。また、培養に適当な培地のｐＨは、特に制限されないが、好ましくは５～１１であり、より好ましくは６～１０である。さらに、培養時間は、特に制限されず、培養する微生物の種類、培地の量、培養条件などによって異なる。通常は、培養時間は、好ましくは１６～４８時間、より好ましくは２０～３０時間である。
【0048】
本発明に係る微生物は、後述の実施例において示すように、生体内における活性イオウ分子のサプライヤーである。活性イオウ分子は、高い抗酸化能を示す生体内物質であることが知られている。そのため、本発明に係る微生物を含む抗酸化用組成物は、対象における酸化ストレスを低減することができる。
【0049】
すなわち、一実施形態において、本発明に係る抗酸化用組成物は、酸化ストレス低減のために使用される。他の一実施形態において、本発明に係る抗酸化用組成物は、酸化ストレスに起因する疾患または症状の予防、治療または改善のために使用される。
【0050】
本発明に係る抗酸化用組成物の対象は、哺乳動物であり、好ましくは酸化ストレスに起因する疾患または症状を示す、または前記酸化ストレスに起因する疾患または症状の可能性がある哺乳動物である。ここで、哺乳動物は、ヒト、サル、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン等の霊長類、ならびにマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ラクダ、ヤギなどの非ヒト哺乳動物双方を包含する。これらのうち、対象は、好ましくはヒトである。
【0051】
酸化ストレスに起因する疾患または症状としては、がん、神経障害、動脈硬化（虚血性心疾患、心筋梗塞、脳虚血、脳梗塞など）、糖尿病、肝炎、慢性閉塞性肺疾患、関節リウマチ、ベーチェット病などの組織障害、神経変性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病など）、喫煙などが原因の肺疾患、白内障、肩凝り、冷え性、しわ形成、弾力低下などの皮膚の老化、皮膚の黒化、シミ、ソバカスなどの色素沈着が挙げられる。
【0052】
本発明に係る抗酸化用組成物は、所望の効果を発揮するのに十分な量（すなわち、有効量）の本発明に係る微生物またはその培養物を含む。
【0053】
本発明に係る抗酸化用組成物は、本発明に係る微生物またはその培養物そのものでもよく、他の成分をさらに含んでもよい。他の成分としては、シスチンが挙げられる。本発明に係る微生物またはその培養物は、後述の実施例において示すように、他の硫黄含有化合物（例えば、メチオニン、システイン）と比べて、基質としてシスチンを用いることにより、システインパースルフィドを顕著に生成することができる。なお、シスチンは、本発明に係る抗酸化用組成物と併用されて投与されてもよい。
【0054】
本発明に係る抗酸化用組成物は、さらに製剤化のために許容されうる添加剤を併用して、常法に従い、経口製剤または非経口製剤として調製されてもよい。抗酸化用組成物は、簡易性の観点から、好ましくは経口製剤である。製剤化のために許容されうる添加剤としては、例えば、賦形剤、安定剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、滑沢剤、甘味料、着色料、香料、緩衝剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、結合剤、増粘剤、分散剤、懸濁化剤、崩壊剤、制菌剤、界面活性剤などを挙げることができる。剤形は特に制限されず、適宜設定すればよいが、例えば錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、徐放剤、溶液、懸濁液、乳濁液、ローション剤、注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤、貼付剤などである。
【0055】
本発明に係る抗酸化用組成物は、飲食品の形態であってもよい。
【0056】
飲食品は、本発明に係る抗酸化用組成物に安定剤等の慣用の添加成分を加えて飲食品として調製したもの、各種タンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類等を、それらにさらに配合して調製したもの、液状、半液体状もしくは固体状にしたもの、ペースト状にしたもの、または、一般の飲食品へ本発明に係る抗酸化用組成物を添加したものであってもよい。
【0057】
本明細書において、「飲食品」は、医薬以外のものであって、哺乳動物などが経口摂取可能な形態のものであれば特に制限はなく、その形態も液状物（溶液、懸濁液、乳濁液など）、半液体状物、粉末、または固体成形物のいずれのものであってもよい。このため飲食品は、例えば飲料の形態であってもよく、また、サプリメントのような栄養補助食品の錠剤形態であってもよい。
【0058】
飲食品として具体的には、例えば、即席麺、レトルト食品、缶詰、電子レンジ食品、即席スープ・みそ汁類、フリーズドライ食品などの即席食品類；清涼飲料、果汁飲料、野菜飲料、豆乳飲料、コーヒー飲料、茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、栄養飲料、アルコール飲料などの飲料類；パン、パスタ、麺、ケーキミックス、唐揚げ粉、パン粉などの小麦粉製品；飴、キャラメル、チューイングガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、デザート菓子などの菓子類；ソース、トマト加工調味料、風味調味料、調理ミックス、たれ類、ドレッシング類、つゆ類、カレー・シチューの素類などの調味料；加工油脂、バター、マーガリン、マヨネーズなどの油脂類；乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料、アイスクリーム類、クリーム類などの乳製品；魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品などの水産加工品；畜肉ハム・ソーセージなどの畜産加工品；農産缶詰、ジャム・マーマレード類、漬け物、煮豆、シリアルなどの農産加工品；冷凍食品；栄養食品などが挙げられる。
【0059】
本明細書において「飲食品」には、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、疾病リスク低減表示が付された食品、または、病者用食品のような分類のものも包含される。さらに「飲食品」という用語は、ヒト以外の哺乳動物を対象として使用される場合には、飼料を含む意味で用いられうる。
【0060】
本発明に係る飲食品においては、他の機能を有する成分をさらに添加してもよい。また例えば、日常生活で摂取する食品、健康食品、機能性食品、サプリメント（例えば、カルシウム、マグネシウム等のミネラル類、ビタミンＫ等のビタミン類を１種以上含有する食品）に本発明の有効成分を配合することにより、本発明による効果に加えて、他の成分に基づく機能を併せ持つ飲食品を提供することができる。
【0061】
＜活性イオウ分子産生促進用組成物および活性イオウ分子の製造方法＞
本発明の一形態は、アネロトランカス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ）属、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ドレア（Ｄｏｒｅａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ファカリカテナ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ）属、ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）属およびコプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属からなる群から選択される少なくとも１種の微生物またはその培養物を含む、活性イオウ分子産生促進用組成物である。
本発明の一形態は、アネロトランカス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ）属、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ドレア（Ｄｏｒｅａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ファカリカテナ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ）属、ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）属およびコプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属からなる群から選択される少なくとも１種の微生物またはその培養物を含む、活性イオウ分子産生促進用組成物である。
【0062】
本発明の一形態は、アネロトランカス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ）属、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ドレア（Ｄｏｒｅａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ファカリカテナ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ）属、ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）属およびコプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属からなる群から選択される少なくとも１種の微生物またはその培養物と、シスチンとを接触させることを含む、活性イオウ分子の製造方法である。
【0063】
これらの形態において、「微生物」および「培養物」は、抗酸化用組成物において説明した事項と同じであるため、説明を省略する。
【0064】
本発明に係る微生物またはその培養物は、後述の実施例において示すように、他の硫黄含有化合物（例えば、メチオニン、システイン）と比べて、基質としてシスチンを用いることにより、システインパースルフィドを顕著に生成することができる。そのため、本発明に係る活性イオウ分子産生促進用組成物は、好ましくはシスチンをさらに含む、またはシスチンと併用される。
【0065】
本発明に係る活性イオウ分子の製造方法において、本発明に係る微生物またはその培養物とシスチンとを接触させる方法は、特に制限されず、例えばシスチンを含む培地で微生物を培養する方法、微生物を培養した培養液とシスチンとを混合する方法、培養液を遠心分離して得られる上清とシスチンとを混合する方法、培養液を遠心分離して得られる菌を含む残渣、残渣からの精製物または残渣の乾燥物とを混合する方法などが挙げられる。
【0066】
本発明に係る活性イオウ分子の製造方法において、製造条件は特に制限されず、適宜選択することができる。例えば、微生物とシスチンとを接触させる場合、培養温度、培養時間などは、使用する微生物に応じて適宜選択される。また、培養物とシスチンとを接触させる場合、インキュベーション温度、インキュベーション時間などは、使用した微生物に従って適宜選択される。
【0067】
本発明に係る活性イオウ分子産生促進用組成物および活性イオウ分子の製造方法により得られる活性イオウ分子は、抗酸化活性を持つ医薬品、合成用の実験試薬などの用途で使用することができる。
【実施例0068】
以下に具体例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらの例に限定されない。なお、特記しない限り、作業は室温（２５℃）で行った。
【0069】
試験例１
＜実験モデルおよび対象の詳細＞
（細菌株および培養条件）
大腸菌は、ナショナルバイオリソースプロジェクト（ＮＢＲＰ）から購入した。他の細菌株は、微生物材料開発室（ＪＣＭ）から購入した。表１に、使用した細菌株に関する情報を示す。全ての細菌は、嫌気性条件下、３７℃でＧＡＭブロス（日水製薬株式会社）中で増殖させた。細菌増殖を測定するために、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉＤ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いてＯＤ６００測定を行った。
＜実験モデルおよび対象の詳細＞
（細菌株および培養条件）
大腸菌は、ナショナルバイオリソースプロジェクト（ＮＢＲＰ）から購入した。他の細菌株は、微生物材料開発室（ＪＣＭ）から購入した。表１に、使用した細菌株に関する情報を示す。全ての細菌は、嫌気性条件下、３７℃でＧＡＭブロス（日水製薬株式会社）中で増殖させた。細菌増殖を測定するために、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉＤ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いてＯＤ６００測定を行った。
【0070】
【表1】
【0071】
（マウス）
全てのマウスは、日本クレア株式会社から購入した。ジャームフリー（ＧＦ）ＩＱＩマウスはビニールアイソレーターで飼育し、γ線滅菌したＣＥ－２飼料（日本クレア株式会社）を与えた。一方、ｅｘＧＦおよびコンベンショナルのＣ５７ＢＬ／６マウスは、従来の条件下で飼育され、ＣＥ－２飼料を与えられた。１２匹の６週齢ＧＦマウスを２群に分け、一方の群（６匹の雌）は、ビニールアイソレーターで４週間飼育したが、もう一方の群（６匹の雌）は腸内微生物叢を回復させるために通常の条件下でケージに４週間置いた（ｅｘＧＦマウス）。すべてのマウスは、慶應大学の動物施設で飼育した。Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｆｒｅｅ（ＳＰＦ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＳＰＦマウス）は、筑波大学の動物施設で、ＳＰＦ条件下で飼育し、γ線滅菌したＭＦ飼料（オリエンタル酵母工業株式会社）を与えた。使用した全てのマウスは雌（８～１０週齢）であり、実験手順で使用する前に少なくとも１週間順応させた。すべてのマウスを、１２時間の明暗サイクル下、２１～２２℃で飼育した。すべての実験は、日本学術会議によって発行された「動物実験の適切な実施のためのガイドライン」に従って行われた。
全てのマウスは、日本クレア株式会社から購入した。ジャームフリー（ＧＦ）ＩＱＩマウスはビニールアイソレーターで飼育し、γ線滅菌したＣＥ－２飼料（日本クレア株式会社）を与えた。一方、ｅｘＧＦおよびコンベンショナルのＣ５７ＢＬ／６マウスは、従来の条件下で飼育され、ＣＥ－２飼料を与えられた。１２匹の６週齢ＧＦマウスを２群に分け、一方の群（６匹の雌）は、ビニールアイソレーターで４週間飼育したが、もう一方の群（６匹の雌）は腸内微生物叢を回復させるために通常の条件下でケージに４週間置いた（ｅｘＧＦマウス）。すべてのマウスは、慶應大学の動物施設で飼育した。Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｆｒｅｅ（ＳＰＦ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＳＰＦマウス）は、筑波大学の動物施設で、ＳＰＦ条件下で飼育し、γ線滅菌したＭＦ飼料（オリエンタル酵母工業株式会社）を与えた。使用した全てのマウスは雌（８～１０週齢）であり、実験手順で使用する前に少なくとも１週間順応させた。すべてのマウスを、１２時間の明暗サイクル下、２１～２２℃で飼育した。すべての実験は、日本学術会議によって発行された「動物実験の適切な実施のためのガイドライン」に従って行われた。
【0072】
［動物への処置］
６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、抗生物質（１ｍｇ／ｍＬのアンピシリン（ナカライテスク株式会社）および０．５ｍｇ／ｍＬのバンコマイシン（富士フイルム和光純薬株式会社））を含む水または抗生物質を含まない水へのアクセスを２週間与え、その後、それらの血液および糞便を収集した。５週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、抗生物質（１ｇ／Ｌのアンピシリンおよび０．５ｇ／Ｌのバンコマイシン）を含む水または抗生物質を含まない水へのアクセスを３週間与えた。投与期間中、マウスに９０ｍｇのＬ－シスチン（東京化学工業株式会社）を脱イオン水で最後の１週間は連日経口投与し、その後、それらの血液を採取した。５週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、バンコマイシン（０．５ｇ／Ｌ）、ストレプトマイシン（ナカライテスク株式会社）（５ｇ／Ｌ）、またはエリスロマイシン（ナカライテスク株式会社）（０．２ｇ／Ｌ）を含む水または抗生物質を含まない水へのアクセスを３週間与えた。投与期間中、最後の１週間は、ＣＥ－２飼料を、３．７５％シスチンを含むＣＥ－２に変更し、糞便を採取した。採取した血液から血漿を４℃で、８００×ｇで１５分間遠心分離し、ＲＳＳレベルの測定に用いた。採取した糞便サンプルをＲＳＳおよび１６Ｓ分析に用いた。
６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、抗生物質（１ｍｇ／ｍＬのアンピシリン（ナカライテスク株式会社）および０．５ｍｇ／ｍＬのバンコマイシン（富士フイルム和光純薬株式会社））を含む水または抗生物質を含まない水へのアクセスを２週間与え、その後、それらの血液および糞便を収集した。５週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、抗生物質（１ｇ／Ｌのアンピシリンおよび０．５ｇ／Ｌのバンコマイシン）を含む水または抗生物質を含まない水へのアクセスを３週間与えた。投与期間中、マウスに９０ｍｇのＬ－シスチン（東京化学工業株式会社）を脱イオン水で最後の１週間は連日経口投与し、その後、それらの血液を採取した。５週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、バンコマイシン（０．５ｇ／Ｌ）、ストレプトマイシン（ナカライテスク株式会社）（５ｇ／Ｌ）、またはエリスロマイシン（ナカライテスク株式会社）（０．２ｇ／Ｌ）を含む水または抗生物質を含まない水へのアクセスを３週間与えた。投与期間中、最後の１週間は、ＣＥ－２飼料を、３．７５％シスチンを含むＣＥ－２に変更し、糞便を採取した。採取した血液から血漿を４℃で、８００×ｇで１５分間遠心分離し、ＲＳＳレベルの測定に用いた。採取した糞便サンプルをＲＳＳおよび１６Ｓ分析に用いた。
【0073】
［ＣｏｎＡ誘発肝炎モデル］
コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ（ＩＶ型）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）（１５ｍｇ／ｋｇ）を８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に静脈内注射した。注射の１２時間後、肝臓と血液とを採取した。過酸化脂質（マロンジアルデヒド（ＭＤＡ））アッセイのために、肝臓組織を採取した。血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性アッセイのために血清を採取した。肝臓組織中のＭＤＡのレベルを、製造業者の指示に従って、脂質過酸化アッセイキット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用して決定した。ＡＬＴのレベルは、富士ドライケム ３５００マシン（富士フイルム株式会社）を用いた富士ドライケムスライドを用いて測定した。
コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ（ＩＶ型）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）（１５ｍｇ／ｋｇ）を８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に静脈内注射した。注射の１２時間後、肝臓と血液とを採取した。過酸化脂質（マロンジアルデヒド（ＭＤＡ））アッセイのために、肝臓組織を採取した。血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性アッセイのために血清を採取した。肝臓組織中のＭＤＡのレベルを、製造業者の指示に従って、脂質過酸化アッセイキット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用して決定した。ＡＬＴのレベルは、富士ドライケム ３５００マシン（富士フイルム株式会社）を用いた富士ドライケムスライドを用いて測定した。
【0074】
［糞便細菌培養］
糞便サンプルを、嫌気性チャンバー（Ｓｈｅｌｄｏｎ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ社）中、１ｍＭの硫黄含有アミノ酸（Ｌ－メチオニン、Ｌ－システイン、またはＬ－シスチン）（いずれも東京化成工業株式会社）を含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）（ナカライテスク株式会社）または上記硫黄含有アミノ酸を含まないＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中でホモジナイズした。次いで、糞便ホモジネート（１０ｍｇ／ｍＬ）を、３７℃で６０分間、振盪しながら嫌気培養した。培養後、サンプルを４℃で、１５分間１１００×ｇで遠心分離し、ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ分析のために上清を収集した。
糞便サンプルを、嫌気性チャンバー（Ｓｈｅｌｄｏｎ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ社）中、１ｍＭの硫黄含有アミノ酸（Ｌ－メチオニン、Ｌ－システイン、またはＬ－シスチン）（いずれも東京化成工業株式会社）を含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）（ナカライテスク株式会社）または上記硫黄含有アミノ酸を含まないＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中でホモジナイズした。次いで、糞便ホモジネート（１０ｍｇ／ｍＬ）を、３７℃で６０分間、振盪しながら嫌気培養した。培養後、サンプルを４℃で、１５分間１１００×ｇで遠心分離し、ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ分析のために上清を収集した。
【0075】
［単一細菌培養］
一晩培養した後、１１００×ｇで２０分間、４℃での遠心分離を用いて細菌をペレット化した。上清を除去し、細菌ペレットを、１ｍＭの硫黄含有アミノ酸（Ｌ－メチオニン、Ｌ－システイン、またはＬ－シスチン）を補充した１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。各サンプルを３７℃で振盪しながら６０分間培養した。培養後、サンプルを１１００×ｇで２０分間、４℃で遠心分離し、次いで、上清をＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ分析のために収集した。
一晩培養した後、１１００×ｇで２０分間、４℃での遠心分離を用いて細菌をペレット化した。上清を除去し、細菌ペレットを、１ｍＭの硫黄含有アミノ酸（Ｌ－メチオニン、Ｌ－システイン、またはＬ－シスチン）を補充した１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。各サンプルを３７℃で振盪しながら６０分間培養した。培養後、サンプルを１１００×ｇで２０分間、４℃で遠心分離し、次いで、上清をＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ分析のために収集した。
【0076】
［糞便中の高分子量（ＨＭＷ）画分］
糞便サンプルはプロテイナーゼ阻害剤を含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中でホモジナイズし、次いで４℃で１０分間、９０００×ｇで遠心分離した。ＨＭＷ画分を得るために、上清をＰＤ ＭｉｎｉＴｒａｐ（商標）Ｇ－２５カラム（排除限界、５０００分子量、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に適用した。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭシスチン、およびＨＭＷ画分（１５μＬ）を含有する反応混合物（５０μＬ）を３７℃で３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、混合物をメタノールで脱タンパクし、１４０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。上清をＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ分析のために得た。
糞便サンプルはプロテイナーゼ阻害剤を含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中でホモジナイズし、次いで４℃で１０分間、９０００×ｇで遠心分離した。ＨＭＷ画分を得るために、上清をＰＤ ＭｉｎｉＴｒａｐ（商標）Ｇ－２５カラム（排除限界、５０００分子量、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に適用した。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭシスチン、およびＨＭＷ画分（１５μＬ）を含有する反応混合物（５０μＬ）を３７℃で３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、混合物をメタノールで脱タンパクし、１４０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。上清をＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ分析のために得た。
【0077】
［細菌タンパク質の精製と酵素活性アッセイ］
２４時間の培養後、細菌を、４℃で２０分間、１１００×ｇでの遠心分離を使用してペレット化した。上清を除去し、０．１ｍｍおよび３．０ｍｍのジルコニアビーズ（Ｂｉｏｓｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）を用いて、シェイクマスターネオ細胞破壊装置（株式会社バイオメディカルサイエンス）中で、１％プロテアーゼ阻害剤およびＤＮａｓｅ Ｉ（２ｋＵ／ｍＬ）を含有する１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中で細菌ペレットをホモジナイズした。ホモジネートを１００００×ｇ、４℃で５分間遠心分離した後、タンパク質を含む可溶性画分をＰＤ ＭｉｎｉＴｒａｐＴＭ Ｇ－２５カラムにロードしてＨＭＷ画分を得、続いてＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒユニット（Ｍｅｒｃｋ社）を用いて濃縮した。タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（タカラバイオ株式会社）を用いて測定した。
２４時間の培養後、細菌を、４℃で２０分間、１１００×ｇでの遠心分離を使用してペレット化した。上清を除去し、０．１ｍｍおよび３．０ｍｍのジルコニアビーズ（Ｂｉｏｓｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）を用いて、シェイクマスターネオ細胞破壊装置（株式会社バイオメディカルサイエンス）中で、１％プロテアーゼ阻害剤およびＤＮａｓｅ Ｉ（２ｋＵ／ｍＬ）を含有する１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中で細菌ペレットをホモジナイズした。ホモジネートを１００００×ｇ、４℃で５分間遠心分離した後、タンパク質を含む可溶性画分をＰＤ ＭｉｎｉＴｒａｐＴＭ Ｇ－２５カラムにロードしてＨＭＷ画分を得、続いてＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒユニット（Ｍｅｒｃｋ社）を用いて濃縮した。タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（タカラバイオ株式会社）を用いて測定した。
【0078】
ＨＭＷ画分からの１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＬ－シスチン、および細菌タンパク質（３０μｇ）の混合物を、３７℃で３０分間インキュベーションした。アミノオキシ酢酸（ＡＯＡＡ，東京化成工業株式会社）の阻害効果を試験するために、反応混合物に１００μＭのＡＯＡＡを添加してから１５分後にシスチンを添加した。インキュベーション後、混合物をメタノールで脱タンパクし、１４０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。上清をＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ分析のために得た。
【0079】
［ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ分析］
ＲＳＳを含む硫黄求核剤のレベルを、β－（４－ヒドロキシフェニル）エチルヨードアセトアミド（ＨＰＥ－ＩＡＭ，コスモ・バイオ株式会社）を用いたＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ分析を用いて測定した。血漿サンプルを５ｍＭのＨＰＥ－ＩＡＭと３０分間３０℃で反応させ、続いてメタノールを添加し、遠心分離によって上清を収集した。糞便サンプルをメタノールでホモジナイズし、遠心分離によって得られた上清を３０℃で３０分間ＨＰＥ－ＩＡＭと反応させた。同様に、培養した排泄物からの上清を３０℃で３０分間ＨＰＥ－ＩＡＭと反応させた。これらの反応溶液を、既知量の同位体標識内部標準を含有する０．１％ギ酸（ナカライテスク株式会社）で４倍に希釈し、次いでＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳを用いて分析して、硫黄求核剤のレベルを決定した（Akaike et al. (2017). Cysteinyl-tRNA synthetase governs cysteine polysulfidation and mitochondrial bioenergetics. Nat Commun 8, 1177；Akiyama et al. (2019). Environmental Electrophile-Mediated Toxicity in Mice Lacking Nrf2, CSE, or Both. Environ Health Perspect 127, 67002）。
ＲＳＳを含む硫黄求核剤のレベルを、β－（４－ヒドロキシフェニル）エチルヨードアセトアミド（ＨＰＥ－ＩＡＭ，コスモ・バイオ株式会社）を用いたＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ分析を用いて測定した。血漿サンプルを５ｍＭのＨＰＥ－ＩＡＭと３０分間３０℃で反応させ、続いてメタノールを添加し、遠心分離によって上清を収集した。糞便サンプルをメタノールでホモジナイズし、遠心分離によって得られた上清を３０℃で３０分間ＨＰＥ－ＩＡＭと反応させた。同様に、培養した排泄物からの上清を３０℃で３０分間ＨＰＥ－ＩＡＭと反応させた。これらの反応溶液を、既知量の同位体標識内部標準を含有する０．１％ギ酸（ナカライテスク株式会社）で４倍に希釈し、次いでＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳを用いて分析して、硫黄求核剤のレベルを決定した（Akaike et al. (2017). Cysteinyl-tRNA synthetase governs cysteine polysulfidation and mitochondrial bioenergetics. Nat Commun 8, 1177；Akiyama et al. (2019). Environmental Electrophile-Mediated Toxicity in Mice Lacking Nrf2, CSE, or Both. Environ Health Perspect 127, 67002）。
【0080】
［１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のシーケンシングおよび解析］
細菌のＤＮＡを、ＭａｇＬＥＡＤ １２ ｇＣ核酸抽出装置（プレシジョン・システム・サイエンス株式会社）を用いて、Kimizuka et al. (2021). Amino Acid-Based Diet Prevents Lethal Infectious Diarrhea by Maintaining Body Water Balance in a Murine Citrobacter rodentium Infection Model. Nutrients 13に記載の方法に従い糞便から抽出した。各ＤＮＡサンプルを、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３およびＶ４領域に特異的な以下のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した：フォワード、５’－ＧＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＧＣＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＴＡＡＧＡＣＡＧＴＡＡＧＡＣＡＧＴＡＣＧＧＧＮＧＣＷＣＡＧ－３’（配列番号１）；リバース、５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣ－３’（配列番号２）。ＰＣＲ産物をＡＭＰｕｒｅ ＸＰ Ｂｅａｄｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）により精製し、アダプターをＮｅｘｔｅｒａ ＸＴインデックスキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いたＰＣＲにより付加した。配列決定は、ＭｉＳｅｑ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いて行った。配列決定データを、ＱＩＩＭＥ２バージョン２０２０．１１（Bolyen et al. (2019). Reproducible, interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nat Biotechnol 37, 852-857）によって分析した。ＱＩＩＭＥ２（https://doi.org/10.14806/ej.17.1.200，アクセス日：２０２１年５月２７日）のＣｕｔａｄａｐｔプラグインを使用して、生配列からプライマー領域をトリミングした。プライマー領域を含まない配列をＤＡＤＡ２アルゴリズム（Callahan et al. (2016). DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods 13, 581-583）によって処理して、アンプリコン配列変異体（ＡＳＶ）配列の構築物を得た。ＳＩＬＶＡデータベース（バージョン１３８）（Callahan et al., 2016）に基づいて分類を割り当てるために、ＢＬＡＳＴ（Pruesse et al. (2007). SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids Research 35, 7188-7196. ）を使用した。フィーチャーテーブル（Weiss et al. (2017). Normalization and microbial differential abundance strategies depend upon data characteristics. Microbiome 5）を用いて高品質配列（１３ ７００）をランダムに選択した。
細菌のＤＮＡを、ＭａｇＬＥＡＤ １２ ｇＣ核酸抽出装置（プレシジョン・システム・サイエンス株式会社）を用いて、Kimizuka et al. (2021). Amino Acid-Based Diet Prevents Lethal Infectious Diarrhea by Maintaining Body Water Balance in a Murine Citrobacter rodentium Infection Model. Nutrients 13に記載の方法に従い糞便から抽出した。各ＤＮＡサンプルを、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３およびＶ４領域に特異的な以下のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した：フォワード、５’－ＧＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＧＣＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＴＡＡＧＡＣＡＧＴＡＡＧＡＣＡＧＴＡＣＧＧＧＮＧＣＷＣＡＧ－３’（配列番号１）；リバース、５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣ－３’（配列番号２）。ＰＣＲ産物をＡＭＰｕｒｅ ＸＰ Ｂｅａｄｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）により精製し、アダプターをＮｅｘｔｅｒａ ＸＴインデックスキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いたＰＣＲにより付加した。配列決定は、ＭｉＳｅｑ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いて行った。配列決定データを、ＱＩＩＭＥ２バージョン２０２０．１１（Bolyen et al. (2019). Reproducible, interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nat Biotechnol 37, 852-857）によって分析した。ＱＩＩＭＥ２（https://doi.org/10.14806/ej.17.1.200，アクセス日：２０２１年５月２７日）のＣｕｔａｄａｐｔプラグインを使用して、生配列からプライマー領域をトリミングした。プライマー領域を含まない配列をＤＡＤＡ２アルゴリズム（Callahan et al. (2016). DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods 13, 581-583）によって処理して、アンプリコン配列変異体（ＡＳＶ）配列の構築物を得た。ＳＩＬＶＡデータベース（バージョン１３８）（Callahan et al., 2016）に基づいて分類を割り当てるために、ＢＬＡＳＴ（Pruesse et al. (2007). SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids Research 35, 7188-7196. ）を使用した。フィーチャーテーブル（Weiss et al. (2017). Normalization and microbial differential abundance strategies depend upon data characteristics. Microbiome 5）を用いて高品質配列（１３ ７００）をランダムに選択した。
【0081】
［ＤＮＡ抽出と定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）］
細菌ＤＮＡの抽出および定量は、Ishizuka et al. (2012). Effects of administration of Bifidobacterium animalis subsp. lactis GCL2505 on defecation frequency and bifidobacterial microbiota composition in humans. Journal of Bioscience and Bioengineering 113, 587-591に記載の方法に従って行った。次のユニバーサルプライマー：フォワード、５’－ＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ－３’（配列番号３）、およびリバース、５’－ＧＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴ－３’（配列番号４）（Nadkarni et al. (2002). Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad-range (universal) probe and primers set. Microbiology 148, 257-266）を用いて、糞便中の総細菌数をｑＰＣＲにより分析した。ｑＰＣＲはＴＢ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（商標）（タカラバイオ株式会社）を用いたＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（登録商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により、以下のパラメーターで行った：９５℃で３０秒間の単一サイクル、次いで９５℃で５秒間の３５サイクル、および６０℃で３０秒間。
細菌ＤＮＡの抽出および定量は、Ishizuka et al. (2012). Effects of administration of Bifidobacterium animalis subsp. lactis GCL2505 on defecation frequency and bifidobacterial microbiota composition in humans. Journal of Bioscience and Bioengineering 113, 587-591に記載の方法に従って行った。次のユニバーサルプライマー：フォワード、５’－ＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ－３’（配列番号３）、およびリバース、５’－ＧＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴ－３’（配列番号４）（Nadkarni et al. (2002). Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad-range (universal) probe and primers set. Microbiology 148, 257-266）を用いて、糞便中の総細菌数をｑＰＣＲにより分析した。ｑＰＣＲはＴＢ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（商標）（タカラバイオ株式会社）を用いたＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（登録商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により、以下のパラメーターで行った：９５℃で３０秒間の単一サイクル、次いで９５℃で５秒間の３５サイクル、および６０℃で３０秒間。
【0082】
［定量化と統計解析］
統計分析を、ｕｎｐａｉｒｅｄスチューデントのｔ検定、クラスカル・ウォリス検定、およびテューキーの多重比較検定による一元配置分散分析を用いてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ．９．２．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）で行った。
統計分析を、ｕｎｐａｉｒｅｄスチューデントのｔ検定、クラスカル・ウォリス検定、およびテューキーの多重比較検定による一元配置分散分析を用いてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ．９．２．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）で行った。
【0083】
＜結果＞
１．腸内細菌は宿主における活性イオウ分子のサプライヤーである
ＳＰＦマウス（抗生物質無投与）および抗生物質処理ＳＰＦマウス（Ａｂｘマウス）における血漿中活性イオウ分子濃度を比較した結果を図１Ａに示す。
１．腸内細菌は宿主における活性イオウ分子のサプライヤーである
ＳＰＦマウス（抗生物質無投与）および抗生物質処理ＳＰＦマウス（Ａｂｘマウス）における血漿中活性イオウ分子濃度を比較した結果を図１Ａに示す。
【0084】
図１Ａに示すように、Ａｂｘマウスでは、活性イオウ分子（システインパースルフィドおよびグルタチオンパースルフィド）の血漿中濃度が減少したことが分かる。
【0085】
次に、ＧＦマウスおよびｅｘＧＦマウスにおける血漿中活性イオウ分子濃度を比較した結果を図１Ｂに示す。
【0086】
図１Ｂに示すように、ｅｘＧＦマウスでは、活性イオウ分子（システインパースルフィドおよびグルタチオンパースルフィド）の血漿中濃度が顕著に増加したことが分かる。
【0087】
以上より、腸内細菌は、宿主生体内における活性イオウ分子の吸収レベルを増加させることが示唆される。
【0088】
ＳＰＦマウス（抗生物質無投与）の糞便サンプルをメチオニン、システインまたはシスチンの存在下培養した結果を図２Ａに示す。
【0089】
図２Ａに示すように、腸内細菌は、シスチンを主要な基質として活性イオウ分子を産生することが分かる。
【0090】
次に、ＳＰＦマウス（抗生物質無投与）およびＡｂｘマウスの糞便からのＨＭＷ画分の精製物とシスチンとを反応させた結果を図２Ｂに示す。
【0091】
図２Ｂに示すように、ＳＰＦマウス（抗生物質無投与）の糞便からのＨＭＷ画分の精製物とシスチンとを反応させることで、システインパースルフィドが得られた。一方、Ａｂｘマウスの糞便からのＨＭＷ画分の精製物とシスチンとを反応させても、システインパースルフィドがほとんど得られなかった。
【0092】
以上より、腸内細菌は、基質としてシスチンを用いて、酵素的にシステインパースルフィドの産生を行うことが示唆される。
【0093】
２．腸内細菌由来の活性イオウ分子は酸化ストレス性肝障害に対する保護効果を有する
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（抗生物質無投与または抗生物質投与）にシスチンを経口投与し、血漿中活性イオウ分子濃度を測定した結果を図３Ａに示す。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（抗生物質無投与または抗生物質投与）にシスチンを経口投与し、血漿中活性イオウ分子濃度を測定した結果を図３Ａに示す。
【0094】
図３Ａに示すように、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（抗生物質無投与）における血漿中活性イオウ分子濃度はシスチンの投与により増加する一方、この影響は、抗生物質による処置により強く抑制された。このことは、シスチンから腸内細菌により酵素的に産生された活性イオウ分子が宿主へ移行し、宿主中の活性イオウ分子のレベルへ影響を与えることを示唆する。
【0095】
次に、ＣｏｎＡ誘発肝炎モデルマウスの血清ＡＬＴレベルおよびＭＤＡレベルを測定した結果を図３Ｂに示す。図３Ｂにおいて、「Ｃｏｎｔ」は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（抗生物質無投与）に生理食塩水（コントロール）を経口投与した後、ＣｏｎＡを投与したマウス（コントロール群）であり、「Ｃｙｓｔｉｎｅ」は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（抗生物質無投与）にシスチンを経口投与した後、ＣｏｎＡを投与したマウス（シスチン処理群）である。
【0096】
図３Ｂに示すように、肝障害のマーカーである血清ＡＬＴのレベルは、ＣｏｎＡ投与後のコントロール群において上昇する一方、シスチン処理群において著しく減少した。肝障害および酸化ストレスマーカーであるＭＤＡの蓄積は、コントロール群と比べて、シスチン処理群において著しく抑制された。このことは、肝細胞の酸化ストレスの減少を示している。
【0097】
さらに、抗生物質を投与したＣｏｎＡ誘発肝炎モデルマウスの血清ＡＬＴレベルを測定した結果を図３Ｃに示す。図３Ｃにおいて、「Ｃｏｎｔ」は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（抗生物質投与）に生理食塩水（コントロール）を経口投与した後、ＣｏｎＡを投与したマウス（コントロール群）であり、「Ｃｙｓｔｉｎｅ」は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（抗生物質投与）にシスチンを経口投与した後、ＣｏｎＡを投与したマウス（シスチン処理群）である。
【0098】
図３Ｃに示すように、血清ＡＬＴのレベルは、コントロール群およびシスチン処理群で同程度であることが分かる。
【0099】
以上より、シスチンの保護効果は、腸内細菌依存であること、すなわちシスチンからの腸内細菌代謝物（例えば、活性イオウ分子）が酸化ストレス性肝障害における保護的な役割を果たすことが示唆される。
【0100】
３．ラクノスピラ科およびルミノコッカス科に属する腸内細菌は、高システインパースルフィド産生能を有する
異なるスペクトラムを有する抗生物質を投与したマウスの糞便における活性イオウ分子レベルを測定した結果を図４Ａに示す。図４Ａにおいて、「Ｃｏｎｔ」は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（抗生物質無投与）にシスチンを含む飼料を与えたマウスであり、「ＶＣＭ」、「Ｓｔｐ」および「Ｅｒｙ」は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（それぞれ、バンコマイシン、ストレプトマイシン、またはエリスロマイシン投与）にシスチンを含む飼料を与えたマウスである。
異なるスペクトラムを有する抗生物質を投与したマウスの糞便における活性イオウ分子レベルを測定した結果を図４Ａに示す。図４Ａにおいて、「Ｃｏｎｔ」は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（抗生物質無投与）にシスチンを含む飼料を与えたマウスであり、「ＶＣＭ」、「Ｓｔｐ」および「Ｅｒｙ」は、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（それぞれ、バンコマイシン、ストレプトマイシン、またはエリスロマイシン投与）にシスチンを含む飼料を与えたマウスである。
【0101】
図４Ａに示すように、Ｅｒｙ投与マウスの糞便におけるシステインパースルフィドのレベルは、すべての群のなかで最も高かった。
【0102】
【0103】
図４ＢおよびＣに示すように、ラクノスピラ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅ）科、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）科、およびオシロスピラ（Ｏｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａｃｅ）科の相対存在量は、Ｅｒｙ投与群において有意に増加した。
【0104】
【0105】
図４Ｄに示すように、ラクノスピラ科およびルミノコッカス科は、他の細菌科と比べて、高いシステインパースルフィドを産生することが分かる。
【0106】
アネロトランカス・コリホミニス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ）、ドレア・ロンギカテナ（Ｄｏｒｅａ ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ）およびクロストリジウム・ボルテエ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ）をメチオニン、システインまたはシスチン存在下で培養後の各菌株におけるシステインパースルフィド産生量の結果を図４Ｅに示す。
【0107】
図４Ｅに示すように、アネロトランカス・コリホミニス、ドレア・ロンギカテナおよびクロストリジウム・ボルテエは、シスチンを基質としてシステインパースルフィドを産生した。
【0108】
アネロトランカス・コリホミニス、ドレア・ロンギカテナ、クロストリジウム・ボルテエおよびバクテロイデス・テタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）からの精製タンパク質をシスチンと反応させた結果を図４Ｆに示す。
【0109】
図４Ｆに示すように、アネロトランカス・コリホミニス、ドレア・ロンギカテナおよびクロストリジウム・ボルテエからの精製タンパク質とシスチンとを反応させると、システインパースルフィドが顕著に生成されたが、バクテロイデス・テタイオタオミクロンからの精製タンパク質とシスチンとを反応させても、少量のシステインパースルフィドのみが生成された。このことは、アネロトランカス・コリホミニス、ドレア・ロンギカテナおよびクロストリジウム・ボルテエが基質としてのシスチンからシステインパースルフィドを生成する酵素をエンコードしていることを示唆する。
【0110】
哺乳類では、主なシステインパースルフィド産生酵素であるＣＳＥとＣＢＳとの間の酵素反応はＰＬＰ依存的であることが知られている。図４Ｆは、ＰＬＰ依存性酵素反応の阻害剤であるアミノオキシ酢酸（ＡＯＡＡ）の存在下、精製タンパク質とシスチンとを反応させた結果を示す。
【0111】
図４Ｆに示すように、ＡＯＡＡは、アネロトランカス・コリホミニス、ドレア・ロンギカテナおよびクロストリジウム・ボルテエからの精製タンパク質とシスチンとの反応におけるシステインパースルフィドの精製を阻害するが、バクテロイデス・テタイオタオミクロンからの精製タンパク質とシスチンとの反応におけるシステインパースルフィドの精製には影響がなかった。このことは、腸内細菌の高システインパースルフィド産生酵素がＰＬＰ依存的であることを示す。
【0112】
試験例２
７週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（日本クレア株式会社から購入）を以下の３群に分けて３週間飼育した。マウスは、実験手順で使用する前に少なくとも１週間順応させた。すべてのマウスを、１２時間の明暗サイクル下、２１～２２℃で飼育した。すべての実験は、日本学術会議によって発行された「動物実験の適切な実施のためのガイドライン」に従って行われた。
７週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（日本クレア株式会社から購入）を以下の３群に分けて３週間飼育した。マウスは、実験手順で使用する前に少なくとも１週間順応させた。すべてのマウスを、１２時間の明暗サイクル下、２１～２２℃で飼育した。すべての実験は、日本学術会議によって発行された「動物実験の適切な実施のためのガイドライン」に従って行われた。
【0113】
コントロール群（Ｃｏｎｔ）では、水道水を３週間自由飲水させた。
【0114】
クロストリジウム・ボルテエ培養溶液の非投与群（Ｎｏｎ）およびクロストリジウム・ボルテエ培養溶液の投与群（Ｂｏｌｔｅａｅ）では、抗生物質（１ｍｇ／ｍＬのアンピシリン（ナカライテスク株式会社）および０．５ｍｇ／ｍＬのバンコマイシン（富士フイルム和光純薬株式会社））を含む水を２週間自由飲水させた後、水道水を１週間自由飲水させた。
【0115】
３週間の飼育期間中、最後の１週間、Ｎｏｎ群は、変法ＧＡＭブイヨン（日水製薬株式会社）（２００μｌ）を、Ｂｏｌｔｅａｅ群は、クロストリジウム・ボルテエの培養溶液（２００μｌ）を毎日１回１週間経口投与した。
【0116】
クロストリジウム・ボルテエの培養溶液の調製方法は、以下のとおりである。
【0117】
クロストリジウム・ボルテエを変法ＧＡＭ寒天培地（日水製薬株式会社）に塗布し、培養を行った。４８時間後に明確なコロニーを採取し、１．６ｍＬの変法ＧＡＭブイヨン（日水製薬株式会社）で２４時間培養を行い、培養溶液を調製した。培養は全て３７℃、嫌気条件下で行なった。
【0118】
３週間の飼育期間中、最後の１週間は、Ｃｏｎｔ群を除く全ての群にＣＥ－２飼料（日本クレア株式会社）を、４％シスチンを含むＣＥ－２飼料に変更した。
【0119】
飼育終了時には心採血を実施した。採取した血液から血漿を４℃で、８００×ｇで１５分間遠心分離し、上述のＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ分析と同様の方法により血漿中のシステインパースルフィド（ＣｙｓＳＳＨ）およびグルタチオンパースルフィド（ＧＳＳＨ）レベルを測定した。結果を図５に示す。
【0120】
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図5】
【配列表】