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特開2023-11720皮膚透過性核酸複合体を有効成分として含有するアトピー皮膚炎の予防又は治療用組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023011720
(43)【公開日】2023-01-24
(54)【発明の名称】皮膚透過性核酸複合体を有効成分として含有するアトピー皮膚炎の予防又は治療用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/713 20060101AFI20230117BHJP
C12N 15/117 20100101ALI20230117BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20230117BHJP
C07K 7/00 20060101ALI20230117BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230117BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20230117BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20230117BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230117BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20230117BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230117BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20230117BHJP
A61K 9/06 20060101ALI20230117BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20230117BHJP
A61K 9/70 20060101ALI20230117BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20230117BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20230117BHJP
A61K 47/52 20170101ALI20230117BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20230117BHJP
A61K 8/64 20060101ALI20230117BHJP
A61K 8/30 20060101ALI20230117BHJP
A61K 8/19 20060101ALI20230117BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20230117BHJP
A61K 8/72 20060101ALI20230117BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230117BHJP
【ＦＩ】
A61K31/713
C12N15/117 Z ZNA
C12N15/11 Z
C07K7/00
A61P17/00
A61P37/08
A61P17/06
A61P35/00
A61P17/02
A61P43/00 105
A61P43/00 111
A61K9/08
A61K9/06
A61K9/10
A61K9/70 401
A61K47/64
A61K47/54
A61K47/52
A61K47/02
A61K8/64
A61K8/30
A61K8/19
A61Q19/00
A61K8/72
A61K48/00
【審査請求】有
【請求項の数】20
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022171043
(22)【出願日】2022-10-26
(62)【分割の表示】P 2021525129の分割
【原出願日】2019-10-23
(31)【優先権主張番号】10-2018-0135892
(32)【優先日】2018-11-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】519045000
【氏名又は名称】シーサン・セラピューティクス
(74)【代理人】
【識別番号】100139594
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 健次郎
(72)【発明者】
【氏名】ユ ジヨン
(72)【発明者】
【氏名】キム ヘジュ
(72)【発明者】
【氏名】カン ユサン
(72)【発明者】
【氏名】イ トンイン
(72)【発明者】
【氏名】パク ヒギョン
(57)【要約】 （修正有）
【課題】皮膚透過性核酸複合体を含有する、アトピー性皮膚炎の予防、改善又は治療用医薬組成物又は化粧料組成物を提供する。
【解決手段】ＩＬ－４Ｒα遺伝子と結合可能な配列を有する生理活性核酸及びキャリアペプチド核酸が相補的に結合した皮膚透過性核酸複合体を有効成分として含有する、皮膚疾患の予防、改善又は治療用医薬組成物又は化粧料組成物とする。
【選択図】なし
【解決手段】ＩＬ－４Ｒα遺伝子と結合可能な配列を有する生理活性核酸及びキャリアペプチド核酸が相補的に結合した皮膚透過性核酸複合体を有効成分として含有する、皮膚疾患の予防、改善又は治療用医薬組成物又は化粧料組成物とする。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＴＬＲ２又はＩＬ－４Ｒα遺伝子と結合可能な配列を有する生理活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）；及びキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）が相補的に結合した皮膚透過性核酸複合体を有効成分として含有する、皮膚疾患の予防、改善又は治療用医薬組成物又は化粧料組成物。
【請求項2】
前記生理活性核酸は、配列番号１～４からなる群から選ばれる配列で表されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記キャリアペプチド核酸は、配列番号５～１８からなる群から選ばれる配列で表されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
前記ＴＬＲ２遺伝子と結合可能な生理活性核酸は、配列番号２の配列で表されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項5】
前記ＩＬ－４Ｒα遺伝子と結合可能な生理活性核酸は、配列番号４の配列で表されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項6】
前記核酸複合体は、配列番号２又は４の配列で表される生理活性核酸；及び配列番号５～１８からなる群から選ばれるいずれか一つの配列で表されるキャリアペプチド核酸を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項7】
前記ＴＬＲ２又はＩＬ－４Ｒα遺伝子と結合可能な生理活性核酸及びキャリアペプチド核酸の結合力（融解温度、ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，Ｔｍ）は、生理活性核酸と生理活性核酸の目的とするＴＬＲ２又はＩＬ－４Ｒα遺伝子との結合力よりも低いことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項8】
前記生理活性核酸又はキャリアペプチド核酸は、それぞれの核酸の５’末端又は３’－末端にエンドソーム脱出を促進する物質がさらに結合していることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項9】
前記エンドソーム脱出を促進する物質は、ペプチド、脂質ナノ物質（ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、接合体ナノ物質（ｐｏｌｙｐｌｅｘ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、高分子ナノ球（ｐｏｌｙｍｅｒ ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ）、無機物ナノ物質（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、陽イオン脂質ナノ物質（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ－ｂａｓｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、陽イオン高分子（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒ）及びｐＨ感応高分子（ｐＨ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ
ｐｏｌｙｍｅｒｓ）からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
ｐｏｌｙｍｅｒｓ）からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
前記ペプチドは、ＧＬＦＤＩＩＫＫＩＡＥＳＦ（配列番号１９）又はＨｉｓｔｉｄｉｎｅ（１０）であることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項11】
前記生理活性核酸は、全体として陰電荷又は中性を有することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項12】
前記キャリアペプチド核酸は、全体として陽電荷を有するように１個以上のガンマ又はアルファバックボーン修飾ペプチド核酸単量体を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項13】
前記ガンマ又はアルファバックボーン修飾ペプチド核酸単量体は、陽電荷を有するアミノ酸を有する単量体が陰電荷を有するアミノ酸を有する単量体に比べてより多く含まれ、全体としてキャリアペプチド核酸の電荷が陽性となることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
前記陽電荷を有するアミノ酸は、リジン（Ｌｙｓｉｎｅ，Ｌｙｓ，Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ，Ａｒｇ，Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，Ｈｉｓ，Ｈ）、ジアミノ酪酸（Ｄｉａｍｉｎｏ ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ，ＤＡＢ）、オルニチン（Ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ，Ｏｒｎ）及びアミノ酸類似体からなる群から選ばれる一つ以上であることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項15】
前記陰電荷を有するアミノ酸は、グルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ，Ｇｌｕ，Ｅ）、アスパラギン酸（Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ，Ａｓｐ，Ｄ）又はアミノ酸類似体であることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項16】
前記核酸複合体は、全体として陽電荷を有することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項17】
前記核酸複合体は、皮膚残留性を有する皮膚透過性であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項18】
前記皮膚疾患は、アトピー皮膚炎、乾癬、皮膚癌、皮膚損傷、色素沈着及びケロイド性疾患からなる群から選ばれるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項19】
請求項１に記載の組成物を含む剤形。
【請求項20】
水性液、ゲル、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、塗抹剤、パッチから選ばれるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１９に記載の剤形。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、皮膚透過性核酸複合体を有効成分として含有する皮膚疾患の予防又は治療用組成物に関し、より詳細には、ＴＬＲ２又はＩＬ－４Ｒαを標的とする生理活性核酸とキャリアペプチド核酸とが相補的に結合した皮膚透過性核酸複合体を含有する、アトピー皮膚炎の予防、改善又は治療用医薬組成物又は化粧料組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
伝統的な薬剤と違い、核酸薬剤は、標的特異的伝令ＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ，ｍＲＮＡ）の発現を抑制することにより、タンパク質を標的とする既存薬剤で治療不可能だった研究領域を扱うことが可能になった（Ｋｏｌｅ Ｒ．等 Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１２；１１；１２５－１４０．、Ｗｉｌｓｏｎ Ｃ．等 Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．２００６；１０：６０７－６１４．）。
【0003】
オリゴ核酸（Ｏｌｉｇｏ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）に基づく遺伝子発現調節の優れた効果及び様々な用途にもかかわらず、核酸に基づく治療剤を開発するためには克服すべき課題が多数存在する。例えば、オリゴ核酸は、核酸分解酵素（ｎｕｃｌｅａｓｅ）などによる損傷の危険があり、オリゴ核酸の電気的性質（電荷）及び大きさによって受動拡散（ｐａｓｓｉｖｅ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）による細胞膜透過が不可能な点などがある。前記問題点を解消するために、核酸の修飾による生物学的安定性を確保しようとする努力が続いており、修飾された人工核酸（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）の場合、生物学的な活性の損失無しで標的核酸との親和性を高めることが可能になった。修飾された人工核酸の一種であるペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ，ＰＮＡ）は、（２－アミノエチル）－グリシンペプチドバックボーン（（２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）－ｇｌｙｃｉｎｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｂａｃｋｂｏｎｅ）が導入された人工核酸であり、相補的な塩基配列を有するＲＮＡ及びＤＮＡに強く結合する性質を有している。特に、前記ペプチド核酸は、核酸分解酵素に対して抵抗性があり、生物学的安定性が高いため、様々なオリゴ核酸に基づく治療剤関連研究が行われている。しかし、前記ペプチド核酸は、電気的中性を有する特性のため細胞への導入が難しいという短所がある（Ｊｏｅｒｇｅｎｓｅｎ Ｍ．等 Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ２０１１，２１；２９－３７．）。オリゴ核酸自体の細胞膜透過能力は非常に低く、特に、ＤＮＡ又はＲＮＡは陰電荷を帯びているため、細胞の疎水性リン脂質二重膜を通過できず、単純拡散による細胞内伝達が難しい。レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）或いはＡＡＶ（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）などのウイルス運搬体の使用は、オリゴ核酸の細胞内導入を可能にするが、意図しない免疫活性と発癌遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）の組換え可能性といった危険性がある（Ｃｏｕｔｏ Ｌ．Ｂ．等 Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１０，５；５３４－５４２．）。
【0004】
このような理由で、細胞毒性が少なく、免疫活性の低い非ウイルス性オリゴ核酸に基づく核酸運搬体開発の重要性が一層高まりつつあり、そのために、陽電荷性脂質（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ）、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）、安定した核酸脂質粒子（ｓｔａｂｌｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｌｉｐｉｄ ｐａｒｔｉｃｌｅ，ＳＮＡＬＰ）、ポリマー及び細胞透過粒子（ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）を用いた細胞導入技法が開発されている（Ｚｈｉ Ｄ．等 Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２０１３，２４；４８７－５１９．、Ｂｕｙｅｎｓ Ｋ．等 Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，２０１２，１５８；３６２－７０．、ＲＯＳＳＩ，Ｊ．Ｊ．等 Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．２００６，１３；５８３－５８４．、Ｙｏｕｓｅｆｉ Ａ．等 Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，２０１３，１７０；２０９－１８．、Ｔｒａｂｕｌｏ Ｓ．等 Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．２０１３，１９；２８９５－９２３．）。このような核酸伝達技法は、直接的な結合によって機能性残基を有する複合体の形成のための段階を含み、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）構造のエンドソームエスケープ（ｅｎｄｏｓｏｍｅ ｅｓｃａｐｅ）効率及び生体毒性などの問題点があるため、オリゴ核酸導入機能の向上と、製造手順及び副作用に関連した問題点の解消が必要である。
Ｔｈｅｒ．２００６，１３；５８３－５８４．、Ｙｏｕｓｅｆｉ Ａ．等 Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，２０１３，１７０；２０９－１８．、Ｔｒａｂｕｌｏ Ｓ．等 Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．２０１３，１９；２８９５－９２３．）。このような核酸伝達技法は、直接的な結合によって機能性残基を有する複合体の形成のための段階を含み、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）構造のエンドソームエスケープ（ｅｎｄｏｓｏｍｅ ｅｓｃａｐｅ）効率及び生体毒性などの問題点があるため、オリゴ核酸導入機能の向上と、製造手順及び副作用に関連した問題点の解消が必要である。
【0005】
一方、皮膚は人体において表面積が最も大きい器官であり、適切な方法を用いる場合、効果的に薬物を伝達できる経路となる。したがって、通常、経皮伝達（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）と呼ばれる、皮膚を通じた治療用薬物などの生理的活性剤の投与は、相対的に簡単な薬物などの投与療法であるなどの特徴から、大きく関心を受けてきた。構造的に皮膚は２つの主要部分である、相対的に薄い最外側の層である表皮層（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ，ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｌａｙｅｒ）と、これよりも厚い内側領域である真皮層（ｄｅｒｍｉｓ，ｄｅｒｍａｌ ｌａｙｅｒ）とからなる。特に、表皮層の最外側の層である角質層（ｓｔｒａｔｕｍ ｃｏｒｎｅｕｍ）は、ケラチンが詰まっている扁平な死んだ細胞からなる。角質層の扁平な死んだ細胞同士間の領域は、皮膚の天然障壁特性に寄与するラメラ相（ｌａｍｅｌｌａｒ ｐｈａｓｅ）を形成する脂質で構成されている。皮膚の最外側に存在する角質層（ｓｔｒａｔｕｍ ｃｏｒｎｅｕｍ）などが天然障壁として働き、治療用薬物などの外部物質の皮膚透過度は極端に低いため、分子量が大きくて親水性のある物質の伝達に困難がある。
【0006】
このような皮膚への治療用薬物などの伝達時に皮膚障壁の外部物質に対する防御機序を克服するために様々な皮膚透過方法に関する研究が試みられたが、物理的に皮膚を損傷又は刺激することなく化学物質の特性を用いて薬物を伝達することは非常に難しいとされているものの、これを克服した素材に期待できる様々な長所から、依然としてその開発が望まれるのが現状である。このような要求に応じて、大きい分子量の薬物を効果的に伝達するためのリポソーム、ナノパーティクル、又はペプチドリガンドなどの皮膚透過伝達素材に関する研究が多数報告されており［Ｌａｄｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００７（Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２００７ Ｍａｙ；６６（２）：１５９－６４．）、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６ａ（Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２００６Ｎｏｖ；３１９（２）：７６５－７５．）、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６ｂ（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６ Ａｐｒ；２４（４）：４５５－６０．）］、これによる実用化段階の開発費用が増加するにもかかわらず、伝達しようとする薬物の効率と安定性を保障できないため、皮膚透過機能と体内有効性を同時に有する素材の開発が要求されている。皮膚表面に塗布する外用的処置素材の有効性は、表皮及び真皮を通過しなければならない技術的難題から、多くの努力が要求される。
【0007】
これと関連して、本発明者らは、生理活性核酸と全体として陽電荷を有するように修飾されたキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）が相補的に結合した核酸複合体が、細胞透過性（ｃｅｌｌ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）が驚くほど向上し、これを用いて標的遺伝子の発現を非常に効率的に調節できることを確認し、このような細胞毒性が低く、生理活性核酸の細胞透過性及び遺伝子発現調節能力が向上した新しい構造体に関する特許を出願したことがある（ＰＣＴ／ＫＲ２０１７／００８６３６）。
【0008】
前記構造体及び治療用薬物などの皮膚透過及び細胞伝達機能の向上に関する研究を続けた結果、本発明者らは、生理活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）と全体として陽電荷を有するように修飾されたキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）が相補的に結合した核酸複合体が、皮膚、好ましくは角質層及び／又は表皮層を非常に効率的に通過する特性を有し、当該核酸複合体が皮膚透過性に優れることを確認した。
【0009】
そこで、本発明者らは、皮膚透過性に優れた核酸複合体を皮膚疾患の治療に適用するために鋭意努力した結果、ＴＬＲ２又はＩＬ－４Ｒαを標的とする生理活性核酸とキャリアとが相補的に結合した皮膚透過性核酸複合体が、アトピー皮膚炎の予防又は治療に優れた効果を奏すること糾明し、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【0010】
本発明の目的は、皮膚透過性及び皮膚残留性が高く、アトピー性皮膚炎の予防又は治療効果に優れた核酸複合体である、ＴＬＲ２又はＩＬ－４Ｒαを標的とする生理活性核酸とキャリアとが相補的に結合した皮膚透過性核酸複合体を有効成分として含有する、皮膚疾患の予防、改善又は治療用医薬組成物又は化粧料組成物を提供することにある。
【0011】
上記の目的を達成するために、本発明は、ＴＬＲ２又はＩＬ－４Ｒα遺伝子と結合可能な配列を有する生理活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）；及びキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）が相補的に結合した皮膚透過性核酸複合体を有効成分として含有する、皮膚疾患の予防、改善又は治療用医薬組成物又は化粧料組成物を提供する。
【0012】
本発明はまた、前記組成物を含む剤形を提供する。
【0013】
本発明はまた、ＴＬＲ２又はＩＬ－４Ｒα遺伝子と結合可能な配列を有する生理活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）；及びキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）が相補的に結合した皮膚透過性核酸複合体を投与する段階を含む皮膚疾患の予防又は治療方法を提供する。
【0014】
本発明はまた、ＴＬＲ２又はＩＬ－４Ｒα遺伝子と結合可能な配列を有する生理活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）；及びキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）が相補的に結合した皮膚透過性核酸複合体を皮膚疾患の予防又は治療に用いる用途を提供する。
【0015】
本発明はまた、皮膚疾患の予防又は治療用薬剤の製造のためのＴＬＲ２又はＩＬ－４Ｒα遺伝子と結合可能な配列を有する生理活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ）；及びキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）が相補的に結合した皮膚透過性核酸複合体の用途を提供する。
Ａｃｉｄ）；及びキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）が相補的に結合した皮膚透過性核酸複合体の用途を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【0017】
図１Ａは、イエダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅ）抽出物から誘導したアトピー皮膚炎誘発ヒト由来角質細胞株において、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸とが結合した構造の種類による細胞生存率を示すものである。。
【0018】
図１Ｂは、イエダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）抽出物から誘導したアトピー皮膚炎誘発ヒト由来角質細胞株において、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸とが結合した構造の種類による細胞生存率を示すものである。
【0019】
図１Ｃは、シックハウス症候群誘発化学物質（２－ｄｉｎｉｔｒｏｃｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ）ＤＮＣＢで誘導したアトピー皮膚炎誘発ヒト由来角質細胞株において、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸とが結合した構造の種類による細胞生存率を示すものである。
【0020】
【0021】
図２Ａは、イエダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅ）抽出物から誘導したアトピー皮膚炎誘発ヒト由来角質細胞株において、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸とが結合した構造の種類による、標的遺伝子ＴＬＲ２の発現及び下位段階遺伝子発現に与える影響を示すものである。
【0022】
図２Ｂは、イエダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）抽出物から誘導したアトピー皮膚炎誘発ヒト由来角質細胞株において、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸とが結合した構造の種類による、標的遺伝子ＴＬＲ２の発現及び下位段階遺伝子発現に与える影響を示すものである。
【0023】
図２Ｃは、シックハウス症候群誘発化学物質（２－ｄｉｎｉｔｒｏｃｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ）ＤＮＣＢで誘導したアトピー皮膚炎誘発ヒト由来角質細胞株において、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸とが結合した構造の種類による、標的遺伝子ＴＬＲ２の発現及び下位段階遺伝子発現に与える影響を示すものである。
【0024】
【0025】
図３Ａは、ＮＣ／Ｎｇａマウスにおいて核酸複合体によってマウスのアトピー皮膚炎表現型が減少することを示す写真である。
【0026】
図３Ｂは、イエダニ抽出物でアトピー皮膚炎を誘発したＮＣ／Ｎｇａマウスにおいて、核酸複合体によって血清内ＩｇＥの濃度が減少することを示すものである。
【0027】
図３Ｃは、イエダニ抽出物でアトピー皮膚炎を誘発したＮＣ／Ｎｇａマウスにおいて、核酸複合体によって血清内ＴＡＲＣの濃度が減少することを示すものである。
【0028】
図３Ｄは、イエダニ抽出物でアトピー皮膚炎を誘発したＮＣ／Ｎｇａマウス皮膚組織において、核酸複合体による標的遺伝子ＴＬＲ２及び下位段階遺伝子の発現減少を示すものである。
【0029】
図３Ｅは、イエダニ抽出物でアトピー皮膚炎を誘発したＮＣ／Ｎｇａマウス皮膚組織において、核酸複合体による経皮厚さの減少を示すものである。
【0030】
図３Ｆは、イエダニ抽出物でアトピー皮膚炎を誘発したＮＣ／Ｎｇａマウスにおいて、核酸複合体による炎症性マーカーＣＤ３の減少を示すものである。
【0031】
図３Ｇは、イエダニ抽出物でアトピー皮膚炎を誘発したＮＣ／Ｎｇａマウスにおいて、核酸複合体による炎症性マーカーＣＤ１１ｃの減少を示すものである。
【0032】
図３Ｈは、イエダニ抽出物でアトピー皮膚炎を誘発したＮＣ／Ｎｇａマウスにおいて、核酸複合体による炎症性マーカーＣＤ３／ＣＤ１１ｃの減少を数値化して示すものである。
【0033】
【0034】
図４Ａは、ＩＬ－４で誘導したアトピー皮膚炎誘発ヒト由来角質細胞株において、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸とが結合した構造の種類による細胞生存率を示すものである。
【0035】
図４Ｂは、ＩＬ－１３で誘導したアトピー皮膚炎誘発ヒト由来角質細胞株において、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸とが結合した構造の種類による細胞生存率を示すものである。
【0036】
【0037】
図５Ａは、ＩＬ－４で誘導したアトピー皮膚炎誘発ヒト由来角質細胞株において、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸とが結合した構造の種類による、標的遺伝子ＩＬ－４Ｒαの発現及び下位段階遺伝子発現に与える影響を示すものである。
【0038】
図５Ｂは、ＩＬ－１３で誘導したアトピー皮膚炎誘発ヒト由来角質細胞株において、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸とが結合した構造の種類による、標的遺伝子ＩＬ－４Ｒαの発現及び下位段階遺伝子発現に与える影響を示すものである。
【0039】
【0040】
図６Ａは、ＩＬ－４で誘導したアトピー皮膚炎誘発ヒト由来Ｔリンパ球（Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）において、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸とが結合した構造の種類による、標的遺伝子ＩＬ－４Ｒαの発現及び下位段階遺伝子発現に与える影響を示すものである。
【0041】
図６Ｂは、ＩＬ－４、ＰＭＡ（Ｐｈｏｒｂｏｌ－１２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ－１３－ａｃｅｔａｔｅ）及びイオノマイシンで誘導したアトピー皮膚炎誘発ヒト由来Ｔリンパ球において、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸とが結合した構造の種類による、標的遺伝子ＩＬ－４Ｒαの発現及び下位段階遺伝子発現に与える影響を示すものである。
【0042】
図７Ａ及び図７Ｂは、ＤＮＣＢでアトピー皮膚炎を誘発したＮＣ／Ｎｇａマウスモデルにおいて、類似細胞モデルを用いて選別した生理活性核酸及びキャリアペプチド核酸の組合せによるアトピー皮膚炎治療効果を、組織表現型の改善と組織内タンパク質発現抑制効果で示すものである。
【0043】
図７Ａは、ＤＮＣＢで誘導したアトピー皮膚炎誘発動物モデルにおいて核酸複合体によって皮膚表現型が改善されることを示すものである。
【0044】
図７Ｂは、ＤＮＣＢで誘導したアトピー皮膚炎動物モデルにおいて、核酸複合体によってアトピー皮膚炎誘発皮膚組織内標的遺伝子であるＩＬ－４Ｒαの発現量が減少することを示すものである。
【0045】
図８Ａ及び図８Ｂは、ＤＮＣＢでアトピー皮膚炎を誘発したＮＣ／Ｎｇａマウスモデルにおいて、類似細胞モデルを用いて選別した生理活性核酸及びキャリアペプチド核酸の組合せによるアトピー皮膚炎治療効果を、ＥＬＩＳＡ分析とＳＣＯＲＡＤ（アトピー皮膚炎行動評価、掻痒症及び紅斑）分析によって示すものである。
【0046】
図８Ａは、ＤＮＣＢで誘導したアトピー皮膚炎誘発動物モデルにおいて、核酸複合体によって血清内ＩｇＥ、ＴＡＲＣ及びＩＬ－４の量が減少することを示すものである。
【0047】
図８Ｂは、ＤＮＣＢで誘導したアトピー皮膚炎動物モデルにおいて、核酸複合体によってアトピー皮膚炎誘発マウスにおける掻痒症と紅斑が改善されることを示すものである。
【0048】
図９Ａ及び図９Ｂは、ＤＮＣＢでアトピー皮膚炎を誘発したＮＣ／Ｎｇａマウスモデルにおいて、類似細胞モデルを用いて選別した生理活性核酸及びキャリアペプチド核酸の組合せによるアトピー皮膚炎治療効果を、アトピー皮膚炎皮膚組織のＨ＆Ｅ染色と免疫染色を通じて確認して示すものである。
【0049】
図９Ａは、ＤＮＣＢで誘導したアトピー皮膚炎誘発動物モデル皮膚組織のＨ＆Ｅ染色を用いて、核酸複合体によって経皮組織の厚さが減少して炎症性細胞の発現が減少することを示すものである。
【0050】
図９Ｂは、ＤＮＣＢで誘導したアトピー皮膚炎動物モデル皮膚組織の免疫染色を用いて、核酸複合体によって皮膚組織内樹枝状細胞及び大食細胞マーカーであるＣＤ３とＣＤ１１ｃの発現が減少することを示すものである。
【発明を実施するための形態】
【0051】
別に断らない限り、本明細書で使われる全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使われる命名法は、本技術分野においてよく知られており、通常用いられるものである。
【0052】
本発明では、生理活性核酸及びキャリアペプチド核酸が相補的に結合した核酸複合体が皮膚透過性及び皮膚残留性を有することを確認し、特に、ＴＬＲ２又はＩＬ－４Ｒαを標的とする生理活性核酸とキャリアペプチド核酸とが相補的に結合した皮膚透過性核酸複合体の皮膚表面塗布によってアトピー皮膚炎のような皮膚疾患治療に活用できることを確認した。
【0053】
したがって、本発明は、一観点において、ＴＬＲ２又はＩＬ－４Ｒα遺伝子と結合可能な配列を有する生理活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）；及びキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）が相補的に結合した皮膚透過性核酸複合体を有効成分として含有する、皮膚疾患の予防、改善又は治療用医薬組成物又は化粧料組成物に関する。
【0054】
本発明において、生理活性核酸とキャリアペプチドとが相補的に結合した核酸複合体は、下記構造式（１）の構造を有することを特徴とし得る。
構造式（１）
[Ａ≡Ｃ（＋）］
前記構造式（１）において、
Ａは、目的とする遺伝子と結合可能な配列を有する生理活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）であり、
Ｃは、生理活性核酸と結合可能なキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）であり、
‘≡’は、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との相補的な結合を意味し、
Ａで表される生理活性核酸は、全体として陰電荷又は中性を有し、
Ｃ（＋）は、キャリアペプチド核酸が全体として陽電荷を有するということを意味し、
キャリアペプチド核酸は、キャリアペプチド核酸が全体として陽電荷を帯びるように修飾されたペプチド核酸単量体を一つ以上含む。
構造式（１）
[Ａ≡Ｃ（＋）］
前記構造式（１）において、
Ａは、目的とする遺伝子と結合可能な配列を有する生理活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）であり、
Ｃは、生理活性核酸と結合可能なキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）であり、
‘≡’は、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸との相補的な結合を意味し、
Ａで表される生理活性核酸は、全体として陰電荷又は中性を有し、
Ｃ（＋）は、キャリアペプチド核酸が全体として陽電荷を有するということを意味し、
キャリアペプチド核酸は、キャリアペプチド核酸が全体として陽電荷を帯びるように修飾されたペプチド核酸単量体を一つ以上含む。
【0055】
本発明に係る核酸複合体における生理活性核酸とキャリアペプチド核酸は、逆平行結合（ａｎｔｉ－ｐａｒａｌｌｅｌ ｂｉｎｄｉｎｇ）又は平行結合（ｐａｒａｌｌｅｌ ｂｉｎｄｉｎｇ）の形態を有することができる。
【0056】
本発明において、“生理活性核酸”は、発現を減少させようとする目的の標的遺伝子と結合可能な相補的な配列、特に、このような目的とする標的遺伝子のｍＲＮＡに結合可能な相補的な配列を有する核酸で、当該遺伝子の発現を抑制するなどの遺伝子発現調節に関与する核酸のことを意味し、発現を減少させようとする標的遺伝子に相補的な配列を有する核酸でよい。
【0057】
特に、本発明における“生理活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）”は、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）又は生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で標的遺伝子及びこれを含む塩基配列と結合して当該遺伝子の固有機能（例えば、転写体（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）発現又はタンパク質発現）を阻害させるなどの機能を有することを特徴とし得る。
【0058】
したがって、本発明における“生理活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）”は、アトピー皮膚炎疾患標的遺伝子であるＴＬＲ２（Ｔｏｌｌ ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）及びＩＬ－４Ｒα（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１４ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α）のアンチセンスペプチド核酸であることが好ましく、より好ましくは、配列番号１～４からなる群から選ばれるアミノ酸配列で表されるものであるが、これに限定されない。
【0059】
また、ＴＬＲ２遺伝子と結合可能な生理活性核酸は、配列番号２のアミノ酸配列で表されることが好ましく、ＩＬ－４Ｒα遺伝子と結合可能な生理活性核酸は、配列番号４のアミノ酸配列で表されることが好ましいが、これに限定されない。
【0060】
本発明において、“キャリアペプチド核酸”は、生理活性核酸と一部或いは全部の塩基が相補的に結合して機能性を付与する核酸を意味し、本発明で使われるキャリアペプチド核酸は、ペプチド核酸（ＰＮＡ：Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）の他、これと類似の修飾された核酸を使用することもでき、ペプチド核酸が好ましいが、これに限定される意味ではない。
【0061】
特に、本発明において、前記キャリアペプチド核酸は、配列番号５～１８からなる群から選ばれるアミノ酸配列で表されることが好ましいが、これに限定されない。
【0062】
本発明において、“皮膚透過性核酸複合体”とは、皮膚との接触を通じて生活性物質を体内、究極としては細胞内に浸透させることができ、具体的には、皮膚の表皮層の最外側の層である角質層及び／又は表皮層を通過して、表皮層や真皮層に伝達するか、真皮層までも通過して体内に伝達できる能力を有する。
【0063】
本発明に係る皮膚透過性核酸複合体における実効電荷量（ｎｅｔ ｃｈａｒｇｅ）及び／又は核酸複合体における生理活性核酸及び／又はキャリアペプチド核酸の個数などによって、角質層、表皮層又は真皮層に残留したり、或いは真皮層まで通過して体内に伝達され得る。
【0064】
これによって、本発明において、前記核酸複合体は皮膚残留性を有することを特徴とし得る。
【0065】
本発明において、“皮膚透過性核酸複合体”において生理活性核酸自体が治療用薬物として機能してもよく、すなわち、複合体自体が皮膚透過性伝達体であるとともに、治療剤自体としての利用が可能であってもよい。
【0066】
特に、本発明に係る“皮膚透過性核酸複合体”とは、皮膚を通じて体内に経皮伝達（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）された後、目的とする細胞内に伝達され得る特性を有し、前記核酸複合体を含有するいかなる形態にも利用可能である。
【0067】
本発明において、前記皮膚透過性核酸複合体は、配列番号２又は４のアミノ酸配列で表される生理活性核酸；及び配列番号５～１８からなる群から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列で表されるキャリアペプチド核酸を含むことが好ましいが、これに限定されない。
【0068】
また、前記ＴＬＲ２又はＩＬ－４Ｒα遺伝子と結合可能な生理活性核酸及びキャリアペプチド核酸の結合力（融解温度、ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，Ｔｍ）は、生理活性核酸と生理活性核酸の目的とするＴＬＲ２又はＩＬ－４Ｒα遺伝子との結合力よりも低いことを特徴とし得る。
【0069】
本発明において、生理活性核酸又はキャリアペプチド核酸は、それぞれの核酸における５’末端又は３’末端に、エンドソーム脱出を促進する物質がさらに結合したことを特徴とし得る。すなわち、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸のエンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍｅ ｅｓｃａｐｅ）を促進する物質をさらに含み、下記の構造式（２）の構造を有することを特徴とし得る。
構造式（２）
[ｍＡ≡ｍＣ（＋）］
前記構造式（２）において、
‘ｍ’は、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸のエンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍｅ ｅｓｃａｐｅ）を促進する物質を意味する。
構造式（２）
[ｍＡ≡ｍＣ（＋）］
前記構造式（２）において、
‘ｍ’は、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸のエンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍｅ ｅｓｃａｐｅ）を促進する物質を意味する。
【0070】
本発明において、“エンドソーム脱出を促進する物質”は、エンドソーム内部の滲透圧を増加させたり、或いはエンドソームの膜を不安定化させる方法によって、生理活性核酸のエンドソームで脱出を促進することを特徴とし得る。生理活性核酸がより効率的で迅速に核や細胞質に移動して標的遺伝子に出会って作用するように促進するものを意味する（Ｄ．Ｗ．Ｐａｃｋ，Ａ．Ｓ．Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｐｕｎ，Ｐ．Ｓ．Ｓｔａｙｔｏｎ，“Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，” Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．，４，５８１－５９３（２００５））。
【0071】
本発明において、前記エンドソーム脱出を促進する物質は、ペプチド、脂質ナノ物質（ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、接合体ナノ物質（ｐｏｌｙｐｌｅｘ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、高分子ナノ球（ｐｏｌｙｍｅｒ ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ）、無機物ナノ物質（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、陽イオン脂質ナノ物質（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ－ｂａｓｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、陽イオン高分子（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒ）及びｐＨ感応高分子（ｐＨ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ）からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とし得る。
【0072】
本発明において、前記エンドソーム脱出を促進する物質として、生理活性核酸には、ＧＬＦＤＩＩＫＫＩＡＥＳＦ（配列番号１９）の配列を有するペプチドがリンカー媒介で連結されてよく、キャリアペプチド核酸には、Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ（１０）をリンカー媒介で連結する方法で結合することを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
【0073】
本発明において、前記脂質ナノ物質（ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）は、脂質（Ｌｉｐｉｄ）、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ）、パルミチン酸セチル（ｃｅｔｙｌ ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、ポロキサマー１８（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ１８）、ツイン８５（Ｔｗｅｅｎ ８５）、トリステアリングリセリド（ｔｒｉｓｔｅａｒｉｎ ｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）及びツイン８０（Ｔｗｅｅｎ ８０）からなる群から選ばれることを特徴とし得る。
【0074】
本発明において、前記接合体ナノ物質（ｐｏｌｙｐｌｅｘ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）は、ポリ（アミドアミン）又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）であることを特徴とし得る。
【0075】
本発明において、前記高分子ナノ球（ｐｏｌｙｍｅｒ ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ）は、ポリカプロラクトン、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ（ｄ，ｌ－ラクチド）、キトサン及びＰＬＧＡ－ポリエチレングリコールからなる群から選ばれることを特徴とし得る。
【0076】
本発明において、前記無機物ナノ物質（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）は、Ｆｅ２Ｏ３Ｆｅ３Ｏ４、ＷＯ３及びＷＯ２．９からなる群から選ばれることを特徴とし得る。
【0077】
本発明において、前記陽イオン脂質ナノ物質（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ－ｂａｓｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）は、１－（アミノエチル）イミノビス［Ｎ－（オレイシルシステイニル－１－アミノ－エチル）プロピオンアミド］、ＰＴＡのＮ－アルキル化誘導体及び３，５－ジドデシルオキシベンズアミジンからなる群から選ばれることを特徴とし得る。
【0078】
本発明において、前記陽イオン高分子（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒ）は、ビニルピロリドン－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート酸コポリマージエチルサルフェート、ポリイソブチレン及びポリ（Ｎ－ビニルカルバゾール）からなる群から選ばれることを特徴とし得る。
【0079】
本発明において、前記ｐＨ感応高分子（ｐＨ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ）は、ポリ酸（ｐｏｌｙａｃｉｄｓ）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）及び加水分解されたポリアクリルアミド（ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）からなる群から選ばれることを特徴とし得る。
【0080】
本発明において、前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸はそれぞれ、２～５０個、好ましくは５～３０個、より好ましくは１０～２５個、最も好ましくは１５～１７個の核酸単量体を含むことを特徴とし得る。
【0081】
前記生理活性核酸は、天然（ｎａｔｕｒａｌ）核酸塩基及び／又は修飾された核酸単量体からなっていることを特徴とし得る。
【0082】
本発明において、前記生理活性核酸に用いられた単量体がＰＮＡの場合、生理活性ペプチド核酸といい、他の単量体が用いられた場合にも同じ方式で呼ばれる。
【0083】
本発明において、前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸は、ホスホジエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ）、２’－０－メチル（２’－０－ｍｅｔｈｙｌ）、２’－メトキシ－エチル（２’－ｍｅｔｈｏｘｙ－ｅｔｈｙｌ）、ホスホロアミダート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、メチルホスホナート（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）及びホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）からなる群から選ばれるいずれか一つ以上の作用基をさらに含むことを特徴とし得る。
【0084】
本発明において、前記キャリアペプチド核酸は、前記生理活性核酸と塩基配列の一部或いは全部が相補的な配列で構成されることを特徴とし得る。特に、キャリアペプチド核酸は、ユニバーザル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｓｅ）を一つ以上含むことができ、キャリアペプチド核酸が全てユニバーザル塩基で構成されてもよい。
【0085】
本発明において、前記皮膚透過性核酸複合体内の前記生理活性核酸及びキャリアペプチド核酸はそれぞれ、電気的特性が全体として、陽電荷（陽性）、陰電荷（陰性）又は中性電荷を有することを特徴とする複合体でよい。
【0086】
前記電気的特性の表現において、“全体として”とは、外部から見るとき、個別塩基の電気的特性ではなく全体的な生理活性核酸又はキャリアペプチド核酸のそれぞれの電荷の全体的な電気的特性を意味し、例えば、生理活性核酸内の一部単量体が陽性を有しても、陰性を有する単量体の個数が相対的に多く存在する場合には、生理活性核酸は“全体として”電気的特性を見るとき、陰電荷を有するものとなり、キャリアペプチド核酸内の一部の塩基及び／又はバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）が陰性を有しても、陽性を有する塩基及び／又はバックボーンの個数が相対的に多く存在する場合には、キャリアペプチド核酸は“全体として”電気的特性を見るとき、陽電荷を有するものとなる。
【0087】
このような観点で、本発明の核酸複合体は、全体として陽電荷を有することを特徴とし得る。前記核酸複合体において、好ましくは、前記生理活性核酸は、全体として電気的特性を見るとき、陰電荷又は中性の特性を有し、前記キャリアペプチド核酸は、全体として電気的特性を見るとき、陽電荷特性を有することを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
【0088】
本発明において、前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸の電気的特性の付与は、修飾されたペプチド核酸単量体を使用することができ、修飾されたペプチド核酸単量体は、陽電荷を有するキャリアペプチド核酸として、リジン（Ｌｙｓｉｎｅ，Ｌｙｓ，Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ，Ａｒｇ，Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，Ｈｉｓ，Ｈ）、ジアミノ酪酸（Ｄｉａｍｉｎｏ ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ，ＤＡＢ）、オルニチン（Ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ，Ｏｒｎ）及びアミノ酸類似体（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅ）からなる群から選ばれるいずれか一つ以上の陽電荷のアミノ酸を含み、陰電荷を有するキャリアペプチド核酸として、陰電荷のアミノ酸であるグルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ，Ｇｌｕ，Ｅ）又はアミノ酸類似体の陰電荷のアミノ酸を含むことを特徴とし得る。
【0089】
本発明において、前記キャリアペプチド核酸は、全体として陽電荷を有するように１個以上のガンマ又はアルファバックボーン修飾ペプチド核酸単量体を含むことを特徴とし得る。
【0090】
前記ガンマ或いはアルファバックボーン修飾ペプチド核酸単量体は、電気的陽性を有するように、リジン（Ｌｙｓｉｎｅ，Ｌｙｓ，Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ，Ａｒｇ，Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，Ｈｉｓ，Ｈ）、ジアミノ酪酸（Ｄｉａｍｉｎｏ ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ，ＤＡＢ）、オルニチン（Ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ，Ｏｒｎ）及びアミノ酸類似体からなる群から選ばれるいずれか一つ以上の陽電荷を有するアミノ酸をバックボーンに含むことを特徴とし得る。
【0091】
本発明において、電荷付与のためのペプチド核酸単量体の修飾は、前記バックボーン修飾の他にも、核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）が修飾されたペプチド核酸単量体を使用することができる。好ましくは、電気的陽性を有するようにアミン、トリアゾール、イミダゾール残基（ｍｏｉｅｔｙ）を核酸塩基に含むか、或いは電気的陰性を有するようにカルボン酸を塩基に含むことを特徴とし得る。
【0092】
本発明において、前記キャリアペプチド核酸の修飾ペプチド核酸単量体は、陰電荷をバックボーン或いは核酸塩基にさらに含むことができるが、修飾ペプチド核酸単量体は、陽電荷を有する単量体が陰電荷を有する単量体に比べてより多く含まれ、全体としてキャリアペプチド核酸の電荷が陽性になることが好ましい。
【0093】
好ましくは、本発明に係る前記核酸複合体は、全体として陽の電荷を有することを特徴とする。
【0094】
本発明に係る前記核酸複合体において、疎水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｍｏｉｅｔｙ）、親水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｍｏｉｅｔｙ）、標的抗原特異的抗体、アプタマー又は蛍光／発光標識子などからなる群から選ばれる一つ以上の物質が生理活性核酸及び／又はキャリアペプチド核酸に結合したことを特徴とし、好ましくは、前記疎水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｍｏｉｅｔｙ）、親水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｍｏｉｅｔｙ）、標的抗原特異的抗体、アプタマー及びイメージングのための蛍光／発光標識子などからなる群から選ばれる一つ以上の物質は、前記キャリアペプチド核酸に結合したものであり得る。
【0095】
本発明において、前記疎水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｍｏｉｅｔｙ）、親水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｍｏｉｅｔｙ）、標的抗原特異的抗体、アプタマー、消光子、蛍光標識子及び発光標識子からなる群から選ばれる一つ以上の物質と生理活性核酸及び／又はキャリアペプチド核酸との結合は、単純共有結合又はリンカー媒介の共有結合であることを特徴とし得るが、これに限定されない。好ましくは、前記核酸運搬体に結合した細胞透過、溶解度、安定性、運搬及びイメージング関連物質（例えば、疎水性残基など）は、標的遺伝子の発現を調節する生理活性核酸と独立して存在する。
【0096】
本発明において、上に述べたように、前記生理活性核酸及びキャリアペプチド核酸の相補的な結合形態は、大きく、逆平行結合（ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ ｂｉｎｄｉｎｇ）と平行結合（ｐａｒａｌｌｅｌ ｂｉｎｄｉｎｇ）の形態を有することを特徴とし得る。前記相補的な結合形態は、生理活性核酸の目的配列（生理活性核酸と相補的な配列）の存在下で分離される構造を有する。
【0097】
前記逆平行結合と平行結合は、ＤＮＡ－ＤＮＡ又はＤＮＡ－ＰＮＡの結合方式において、５’－方向性と３’－方向性によって決定される。逆平行結合は、一般のＤＮＡ－ＤＮＡ又はＤＮＡ－ＰＮＡの結合方式であり、本発明に係る核酸複合体を挙げて説明すれば、生理活性核酸は５’から３’方向に、キャリアペプチド核酸は３’から５’方向に互いに結合する形態を意味する。平行結合は、逆平行結合に比べては結合力が多少劣る形態であり、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸の両方とも５’から３’方向又は３’から５’方向に互いに結合する形態を意味する。
【0098】
本発明に係る核酸複合体において、好ましくは、前記生理活性核酸及びキャリアペプチド核酸の結合力は、生理活性核酸と生理活性核酸の目的とする遺伝子、特に、目的遺伝子のｍＲＮＡとの結合力よりも低いことを特徴とし得る。前記結合力は、融解温度（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，Ｔｍ）によって決定される。
【0099】
前記生理活性核酸及びキャリアペプチド核酸の結合力（融解温度；ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，Ｔｍ）が、生理活性核酸と生理活性核酸の目的とする遺伝子、特に目的遺伝子のｍＲＮＡとの結合力よりも低くなるようにするための具体的な方法の例としては、前記生理活性核酸とキャリアペプチド核酸とが平行結合（Ｐａｒａｌｌｅｌ ｂｉｎｄｉｎｇ）又は部分特異結合（Ｐａｒｔｉａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ）することを特徴とし得るが、これに限定されない。
【0100】
他の例として、前記キャリアペプチド核酸が、リンカー、ユニバーザル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｓｅ）及び生理活性核酸の対応する塩基と相補的でない塩基を有するペプチド核酸塩基からなる群から選ばれる一つ以上のペプチド核酸塩基を有することを特徴とし得るが、これに限定されない。
【0101】
本発明において、前記ユニバーザル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｓｅ）は、アデニン（ａｄｅｎｉｎｅ）、グアニン（ｇｕａｎｉｎｅ）、シトシン（ｃｙｔｏｓｉｎｅ）、チミン（ｔｈｙｍｉｎｅ）、ウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）などの天然塩基と選択性無しで結合し、相補的な結合力よりも低い結合力を有する塩基として、イノシンＰＮＡ（ｉｎｏｓｉｎｅ ＰＮＡ）、インドールＰＮＡ（ｉｎｄｏｌｅ ＰＮＡ）、ニトロインドールＰＮＡ（ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ ＰＮＡ）及び無塩基（ａｂａｓｉｃ）からなる群から選ばれる一つ以上を使用することができ、好ましくは、イノシンＰＮＡを使用することを特徴とし得る。
【0102】
本発明において、前記核酸複合体の機能調節のための核酸同士の結合形態と電気的性質との組合せを提供し、前記核酸の結合形態と電気的性質との組合せによって粒子サイズ及び作用時点を調節し、細胞透過性、溶解度及び特異度を向上させることを特徴とし得る。
【0103】
本発明において、前記生理活性ペプチド核酸とキャリアペプチド核酸との結合力調節により、目的遺伝子の存在下で、生理活性ペプチド核酸が目的配列と結合する時点（生理活性核酸の目的配列への置換される時点、標的特異的分離及び結合時点）などの調節が可能である。
【0104】
本発明に係る核酸複合体において、生理活性核酸の目的遺伝子への置換（ｓｔｒａｎｄ
ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）時点、標的特異的分離及び結合（ｔａｒｇｅｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｌｅａｓｅ ａｎｄ ｂｉｎｄ）時点の調節は、複合体の非特異結合のためのキャリアペプチド核酸の非特異塩基、ユニバーザル塩基及びリンカーの有無、個数及び位置によって調節可能であることを特徴とし得る。前記ペプチド複合体の相補的な結合の形態である平行（ｐａｒａｌｌｅｌ）又は逆平行（ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ）形態の結合など及び前記条件の組合せによって調節が可能であることを特徴とし得る。
ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）時点、標的特異的分離及び結合（ｔａｒｇｅｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｌｅａｓｅ ａｎｄ ｂｉｎｄ）時点の調節は、複合体の非特異結合のためのキャリアペプチド核酸の非特異塩基、ユニバーザル塩基及びリンカーの有無、個数及び位置によって調節可能であることを特徴とし得る。前記ペプチド複合体の相補的な結合の形態である平行（ｐａｒａｌｌｅｌ）又は逆平行（ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ）形態の結合など及び前記条件の組合せによって調節が可能であることを特徴とし得る。
【0105】
本発明において、前記核酸複合体の粒子は、５ｎｍ～３００ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ～８０ｎｍ、最も好ましくは１５ｎｍ～７０ｎｍのサイズを有することを特徴とし得る。
【0106】
本発明において、前記核酸複合体の粒子サイズは、生理活性ペプチド核酸とキャリアペプチド核酸の電荷バランス（ｃｈａｒｇｅ ｂａｌａｎｃｅ）を調節することによって調節されることを特徴とし得る。具体的には、キャリアペプチド核酸の陽電荷が増加すれば粒子のサイズが小さくなるが、キャリアペプチド核酸の陽電荷が一定レベルを超えると、粒子のサイズが大きくなる特徴を有する。また、粒子サイズを決定する他の重要な要素として、複合体をなす生理活性ペプチド核酸電荷による全般的なキャリアペプチド核酸との適切な電荷バランスによって粒子サイズが決定される。
【0107】
本発明に係るキャリアペプチド核酸の陽電荷は、１個～７個（陽電荷を持つ単量体が１個～７個含まれるとの意味）、好ましくは２個～５個、最も好ましくは２個～３個であり、生理活性核酸の電荷は、電荷バランスの実効電荷（ｎｅｔ ｃｈａｒｇｅ）が陰電荷０個～５個、好ましくは０個～３個である。
【0108】
本発明において、前記核酸複合体は、生理活性核酸及びキャリアペプチド核酸が適切な条件で混成化することによって製造されてよい。
【0109】
本発明における“混成化”とは、相補的な単一鎖核酸が二重鎖核酸を形成することを意味する。混成化は、２本の核酸鎖間の相補性が完全な場合（ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈ）に起きたり、又は不整合（ｍｉｓｍａｔｃｈ）塩基が一部存在しても起き得る。混成化に必要な相補性の程度は混成化条件によって変わり、特に、結合温度によって調節され得る。
【0110】
本発明における“標的遺伝子”とは、活性、抑制又は標識しようとする核酸配列（塩基配列）を意味し、用語“標的核酸”に相当し、本明細書で同じ意味で使われる。
【0111】
本発明において、標的遺伝子を含む標的核酸（塩基配列）が生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）又は生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で前記複合体と接触（結合）すると、キャリアペプチド核酸から生理活性核酸が分離され、生物学的活性を奏することになる。
【0112】
本発明において、前記核酸複合体を用いて予防、治療できる疾病は、前記核酸複合体における生理活性核酸が結合する標的遺伝子によって決定され得る。本発明では、生理活性核酸が結合する標的遺伝子がＴＬＲ２又はＩＬ－４Ｒαであることを特徴とし得る。
【0113】
したがって、本発明において、前記核酸複合体を用いて予防、治療できる疾病は皮膚疾患が好ましく、例えば、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、アトピー皮膚炎（ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）を含むアトピー疾患（ａｔｏｐｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）、黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）などの皮膚癌（ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、ケロイド（Ｋｅｌｏｉｄ）性疾患、皮膚損傷及び色素沈着などの疾患、腫瘍又は癌、炎症性疾患、加齢黄斑変性、糖尿病性網膜病症、希少疾患及び重症疾患、心血管疾患、代謝性疾患などの治療に用いることができるが、これに限定されない。
【0114】
一方、本発明において、用語“治療用組成物”は、“医薬（薬剤学的、薬学的）組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）”と同じ意味で使われてよく、本発明の生理活性核酸及び該核酸と結合するキャリアペプチド核酸を含む核酸複合体を有効成分として含み、さらに、前記核酸複合体に目的とする疾患を治療するための治療用薬物が結合した形態でよい。
【0115】
本発明の治療用組成物は、標準医薬実施によって皮膚伝達形態の剤形にすることができる。これらの剤形は、有効成分以外に薬学的に許容される、特に、皮膚に適用可能な形態の剤形に適した担体、賦形剤、補助剤又は希釈剤などの添加物を含有することができる。
【0116】
好ましくは、本発明に係る組成物は、水性液、ゲル、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、塗抹剤又はパッチの形態に剤形化できる。
【0117】
最も好ましくは、水性液の形態に剤形化でき、このとき、水性液は蒸留水及びバッファ溶液の形態を用いることができる。
【0118】
用語“薬学的に許容される（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）”とは、化合物の生物学的活性と物性を損傷させない特性を意味する。
【0119】
用語“担体（ｃａｒｒｉｅｒ）”とは、細胞又は組織内への核酸複合体の付加を容易にする化合物と定義される。例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、生物体の細胞又は組織内への多くの有機化合物の投入を容易にする通常の担体である。
【0120】
用語“希釈剤（ｄｉｌｕｅｎｔ）”とは、対象化合物の生物学的活性形態を安定化させる他、化合物を溶解させる水で希釈される化合物と定義される。バッファ溶液に溶解されている塩は、当該分野で希釈剤として用いられる。通常用いられるバッファ溶液は、ホスフェートバッファ食塩水であり、これは、ヒト溶液の塩状態を摸しているためである。バッファ塩は、低い濃度で溶液のｐＨを制御できるので、バッファ希釈剤が化合物の生物学的活性を変形させることは稀である。
【0121】
本発明における核酸複合体を含有する物質は、患者にそれ自体として又は併用療法（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）におけるように他の活性成分又は適当な担体や賦形剤と混合された医薬組成物として投与できる。
【0122】
本発明において使用に適切な医薬組成物には、活性成分がそれらの意図する目的を達成するのに有効な量で含まれている組成物が含まれる。さらにいうと、治療的有効量は、治療する客体の生存を延ばしたり、疾患の症状を防止、軽減又は緩和したりするのに有効な化合物の量を意味する。治療的有効量の決定は、特に、ここに提供された詳細な開示内容の側面において、通常の技術者の能力範囲内にある。
【0123】
本発明で使われる用語“予防”とは、前記皮膚透過性核酸複合体を含む治療用組成物の投与（又は、塗布）で疾患の発病を防ぐか、その進行を抑制させる全ての行為を意味する。
【0124】
本発明の用語“改善”とは、前記皮膚透過性核酸複合体を含む治療用組成物の投与（又は、塗布）で疾患が治療される状態と関連したパラメータ、例えば、症状の程度を少なくとも減少させる全ての行為を意味する。
【0125】
また、本発明で使われる用語“治療”とは、前記皮膚透過性核酸複合体を含む治療用組成物の投与（又は、塗布）で疾患の症状が好転又は完治する全ての行為を意味する。
【0126】
本発明において、前記皮膚透過性核酸複合体は、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）などの伝達体を用いて投与（又は、塗布）することができる。前記リポソームは、リンパ組織のような特定組織に対して前記複合体を標的化したり或いは感染細胞に対して選択的に標的化するのに役立ち、また、前記複合体が含まれた組成物の半減期を増加させることに役立ち得る。リポソームには、エマルジョン、フォーム（ｆｏａｍ）、ミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）、不溶性単層、液晶、リン脂質分散物、ラメラ層（ｌａｍｅｌｌａｒ ｌａｙｅｒ）などがある。このような製剤において、送達される前記複合体は、単独で、又は特定細胞を対象に、ＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体のようなリンパ細胞のうち優勢な受容体に結合する分子と共に又はその他治療組成物と共に、リポソームの一部として混入させる。したがって、本発明の所定複合体で充填又は塗布されて（ｄｅｃｏｒａｔｅｄ）前記核酸複合体組成物を送達するリポソームは、リンパ細胞の前記部位に指向され得る。
【0127】
本発明にしたがって使用するためのリポソームは、一般に、中性及び陰電荷リン脂質及びコレステロールなどのステロールをはじめとする標準ベシクル（ｖｅｓｉｃｌｅ）形成脂質から形成される。一般に、例えば、血流中のリポソームの安定性、酸不安定性（ａｃｉｄ ｌａｂｉｌｉｔｙ）及びリポソームのサイズなどを考慮して脂質を選択する。リポソーム製造には様々な方法を用いることができる。例えば、文献［Ｓｚｏｋａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９：４６７，１９８０）、及び米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号及び第５，０１９，３６９号］に記載されているような方法を用いることができる。
【0128】
本発明は、さらに他の観点において、ＴＬＲ２又はＩＬ－４Ｒα遺伝子と結合可能な配列を有する生理活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）；及びキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）が相補的に結合した皮膚透過性核酸複合体を個体に投与する段階を含む皮膚疾患の予防又は治療方法に関する。
【0129】
本発明に係る核酸複合体を含む組成物は、皮膚疾患を治療するために又は皮膚疾患の症状を抑制（又は緩和）するために、医薬として効果的な量で皮膚に適用できる。皮膚疾患の種類、患者の年齢、体重、症状の特性及び程度、現在治療法の種類、治療回数、適用形態及び経路などの様々な要因によって変わってもよく、当該分野における専門家にとって容易に決定可能である。本発明の組成物は、上記の薬理学的又は生理学的成分を共に適用したり或いは順次に適用でき、さらに、追加の従来の治療剤と併用して適用されてもよく、従来の治療剤とは順次に又は同時に適用可能である。このような適用は、１回又は多回適用でよい。
【0130】
本発明において、“個体”は、本発明に係る皮膚透過性核酸複合体を投与（塗布）して軽減、抑制又は治療できる状態又は疾患を患っているか或いはその危険がある哺乳動物を意味し、好ましくはヒトを意味する。
【0131】
また、本発明の化合物の人体に対する投与量（塗布量）は、患者の年齢、体重、性別、投与（塗布）形態、健康状態及び疾患程度によって変わってよく、体重７０ｋｇの成人患者を基準にするとき、一般には０．００１～１，０００ｍｇ／日であり、好ましくは０．０１～５００ｍｇ／日であり、医師又は薬剤師の判断によって一定の時間間隔で１日１回又は数回で分割投与（塗布）できる。
【0132】
本明細書に記載の皮膚透過性核酸複合体を含む組成物の毒性と治療効率性は、例えば、ＬＤ５０（群集の５０％に対する致死量）、ＥＤ５０（群集の５０％に対して治療効果を有する線量）、ＩＣ５０（群集の５０％に対して治療抑制効果を有する線量）を決定するために、細胞培養又は実験動物における標準製薬過程によって算定することができる。毒性と治療効果との線量比が治療指数であり、これは、ＬＤ５０とＥＤ５０（又は、ＩＣ５０）との比率として表現できる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養分析から得られたデータは、ヒトに使用する線量の範囲を算定するのに用いることができる。そのような化合物の投与量（ｄｏｓａｇｅ）又は塗布量は、好ましくは毒性がないか或いはほとんどない状態でＥＤ５０（又は、ＩＣ５０）を含む循環濃度の範囲内にある。
【0133】
本発明の用語“投与”とは、いかなる適切な方法で個体に本発明の医薬組成物を導入する行為を意味し、投与経路は、目的組織に到達できる限り、経口又は非経口の様々な経路で投与できる。
【0134】
本発明の医薬組成物の投与経路は、目的組織に到達できるいかなる一般の経路を通じても投与可能である。本発明の医薬組成物は、特にこれに制限されないが、目的に応じて、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、血内投与、経口投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与できる。また、前記組成物は、活性物質が標的細胞へと移動可能な任意の装置によって投与されてもよい。
【0135】
上記の本発明の医薬組成物は、薬学的に有効な量で投与できるが、本発明の用語“薬剤学的に有効な量”とは、医学的治療又は予防に適用可能な合理的利益／危険の比率で疾患を治療又は予防するのに十分な量を意味し、有効容量レベルは、疾患の重症度、薬物の活性、患者の年齢、体重、健康、性別、患者の薬物に対する敏感度、使用された本発明の組成物の投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、使用された本発明の組成物と配合して又は同時に用いられる薬物を含む要素及びその他医学分野によく知られた要素によって決定することができる。
【0136】
本発明の医薬組成物は、個別治療剤として投与したり、或いは他の治療剤と併用して投与でき、従来の治療剤とは順次に又は同時に投与できる。そして、単一又は多重投与されてよい。前記要素を全て考慮し、副作用無しで最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要である。
【0137】
本発明の医薬組成物の投与量は、使用目的、疾患の重症度、患者の年齢、体重、性別、既往力、又は有効成分として用いられる物質の種類などを考慮して当業者が決定できる。例えば、本発明の医薬組成物を、ヒトを含む哺乳動物に１日に１０～１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１０～３０ｍｇ／ｋｇで投与でき、本発明の組成物の投与頻度は、特にこれに制限されないが、１日１回～３回投与したり、又は容量を分割して数回投与してもよい。
【0138】
本発明は、さらに他の観点において、ＴＬＲ２又はＩＬ－４Ｒα遺伝子と結合可能な配列を有する生理活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）；及びキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）が相補的に結合した皮膚透過性核酸複合体を皮膚疾患の予防又は治療に使用する用途に関する。
【0139】
本発明は、さらに他の観点において、皮膚疾患の予防又は治療用薬剤の製造のためのＴＬＲ２又はＩＬ－４Ｒα遺伝子と結合可能な配列を有する生理活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）；及びキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）が相補的に結合した皮膚透過性核酸複合体の用途に関する。
【0140】
本発明の化粧料組成物は、皮膚に適用される如何なる剤形でも適用可能である。より具体的に、スキンローション、スキンソフナー、スキントナー、アストリンゼント、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、ファウンデーション、エッセンス、栄養エッセンス、スプレー、パックなどのような化粧品類の他、石鹸、クレンジングフォーム、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディーローション、ボディークリーム、ボディーオイル、ボディー洗浄剤、シャンプー、軟膏、パッチ（ハイドロゲルスリミングパッチ）などとしても製造できるが、これに限定されない。その他にも、化粧、洗剤、及び繊維など、皮膚に接する皮膚接触物質として製造してもよい。
【0141】
本発明の化粧料組成物は、目的に応じて適切に選択可能である。
【0142】
本発明の剤形がペースト、クリーム又はジェルである場合には、担体成分として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク又は酸化亜鉛などを用いることができる。
【0143】
本発明の剤形がパウダー又はスプレーである場合には、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、カルシウムシリケート又はポリアミドパウダーを用いることができ、特に、スプレーである場合には、さらに、クロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタン又はジメチルエーテルのような推進剤を含むことができる。
【0144】
本発明の剤形が溶液又は乳濁液である場合には、担体成分として溶媒、可溶化剤又は乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３－ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール又はソルビタンの脂肪酸エステルがある。
【0145】
本発明の剤形が懸濁液である場合には、担体成分として水、エタノール又はプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天又はトラガカントなどを用いることができる。
【0146】
本発明の剤形が界面活性剤含有クレンザーである場合には、担体成分として脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホコハク酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体又はエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどを用いることができる。
【0147】
また、本発明の皮膚外用製剤には、上記の成分の他に、皮膚や粘膜に適用される化粧料や外用の医薬品・医薬部外品に配合される公知の各種成分を適量配合できる。
【0148】
具体的に、本発明の化粧料組成物は、それぞれの剤形に、必要によって、一般に化粧料に配合される他の成分を配合してもよい。前記添加可能な配合成分には、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、クエン酸のようなカルボン酸類；トコフェロール、ジブチルヒドロキシトルエンのようなフェノール類）、湿潤剤（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３－ブチレングリコールのようなグリコール類；ヒアルロン酸のような有機塩類；尿素のようなアミド類）、粘調剤（例えば、ポリエチレングリコールのような高分子化合物；カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシプロピルセルロースのようなセルロース類）、緩衝剤（例えば、クエン酸、乳酸、酒石酸のような有機酸類；塩酸、ホウ酸のような無機酸類；リン酸二水素ナトリウム、クエン酸ナトリウムのような塩類；トリエタノールアミンのような有機塩基類；水酸化ナトリウム、水酸化カリウムのような無機塩基）、吸着剤（例えば、カオリン、ベントナイトのような含水ケイ酸アルミニウム類；水酸化アルミナマグネシウム、水酸化アルミニウムのような無機塩類）、基剤（例えば、白色ワセリン、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、流動パラフィン、蜜ろう、ワセリン、ひまし油、シリコン油、硬化ひまし油、天然ゴム、ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、天然ゴムラテックス、１，３－ペンタジエン共重合樹脂のような有機物；ポリブテン、合成ゴムＳＢＲ、モノステアリン酸ポリエチレングリコール、モノステアリン酸ポリオキシエチレングリコール、ポリオキシエチレンセトステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルセチルエーテル、シリコン、アクリル酸澱粉３００、ポリアクリル酸ナトリウム、メタアクリル酸・アクリル酸ｎ－ブチルコポリマー、カルボキシビニルポリマーのような高分子化合物；ステアリン酸のような脂肪酸類；セタノール、ミリスチルアルコールのようなアルコール類；ミリスチン酸オクタドデシル、ミリスチン酸イソプロピル、オクタン酸セチルのような脂肪酸エステル類）、溶剤（例えば、エタノール、イソプロパノール、１，３－ブチレングリコール、ｎ－オクタデシルアルコール、クロタミトン、トリ（カプリル酸・カプロン）グリセリンのような炭水化物）、安定化剤（例えば、メタリン酸ナトリウム、酸化亜鉛、酸化チタンのような無機塩類；ポリオキシエチレンラウリル硫酸エーテル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウムのような有機塩類）、粘着剤（例えば、ポリアクリル酸ナトリウム、ジプロピレングリコールのような高分子化合物）、乳化剤（例えば、モノオレフィン酸ソルビタン、モノオレフィン酸ポリオキシエチレンソルビタン、Ｄ－ソルビトール、モノラウリン酸ポリグリセリン、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウムのような炭水化物）、界面活性剤（例えば、モノラウリン酸ポリグリセリン、ポリオキシエチレンオレイルアルコールエーテルのような高分子化合物）の他にも、香料、色素（染料、顔料）、金属封鎖剤、防臭剤、皮膜形成剤、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、ビタミン類などを含む。
【0149】
本発明の化粧料組成物は、適用しようとする皮膚面積によって適量を皮膚に塗布することによって適用することができ、必要によって１日１回～数回反復して使用することができる。適用する量及び回数は、個人の皮膚状態、剤形、投与対象の年齢、性別、体重、反応感応性、適用期間などによって必要によって適切に増減可能である。
【0150】
当業者は、目的とする効果に効果的な投与量を適切に選択できる。前記組成物の投与剤形は、単一投与又は反復投与の剤形でよく、上記の１日有効量を任意に数回に分けて投与してもよい。
【0151】
本発明の薬学又は化粧料組成物は、有効成分の透過力を増進させるための目的で、イオントフォレシス（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、ソノフォレシス（ｓｏｎｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、マイクロ電子パッチ（ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐａｔｃｈ）、機械的圧力、滲透圧勾配、遮蔽療法（ｏｃｃｌｕｓｉｖｅ ｃｕｒｅ）又は微細注入療法、又はこれらを組み合わせた投与方法によって皮膚に適用することができる。
【実施例0152】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということが、当業界で通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
【0153】
実施例１：生理活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）及びキャリアペプチド核酸、及びこれらを用いた複合体の製造
本発明の核酸複合体のアトピー皮膚炎効果検証のために、標的遺伝子としてアトピー皮膚炎疾患標的遺伝子であるＴＬＲ２（Ｔｏｌｌ ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）とＩＬ－４Ｒα（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１４ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α）を使用した。アレルギー誘発物質や細菌が皮膚に浸透する時に発現する遺伝子であるＴＬＲ２は、アトピー皮膚炎患者では過発現しているため、皮膚における炎症性サイトカインによる炎症増加によってアトピー皮膚炎を悪化させる。このため、アトピー皮膚炎において重要な標的となると予測される。
本発明の核酸複合体のアトピー皮膚炎効果検証のために、標的遺伝子としてアトピー皮膚炎疾患標的遺伝子であるＴＬＲ２（Ｔｏｌｌ ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）とＩＬ－４Ｒα（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１４ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α）を使用した。アレルギー誘発物質や細菌が皮膚に浸透する時に発現する遺伝子であるＴＬＲ２は、アトピー皮膚炎患者では過発現しているため、皮膚における炎症性サイトカインによる炎症増加によってアトピー皮膚炎を悪化させる。このため、アトピー皮膚炎において重要な標的となると予測される。
【0154】
アトピー皮膚炎患者に特徴的に見られる突然変異の一つであるＩＬ－４Ｒαの変異は、Ｔ細胞の分化中にＴ ｈｅｌｐｅｒ １／２タイプへの分化恒常性を崩してアトピー皮膚炎を誘発する因子と知られている。
【0155】
アトピー皮膚炎治療効果を確認するために、ＴＬＲ２及びＩＬ－４Ｒαに対する生理活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）としてアンチセンスペプチド核酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＰＮＡ）を使用した。
【0156】
本発明の対照群として使用した生理活性核酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＰＮＡ）は、配列番号１及び３で表される配列で構成されており、アトピー皮膚炎治療効果を確認するために使用した生理活性核酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＰＮＡ）は、配列番号２及び４で表される配列で構成されている。
【0157】
本実施例で用いられたペプチド核酸基盤生理活性核酸は、エンドソーム脱出能を促進するためのペプチドであるＧＬＦＤＩＩＫＫＩＡＥＳＦ（配列番号１９）を５’に結合しており、塩基配列、単量体修飾及び構造は、下記表１の通りである。。下記表１は、ＴＬＲ２及びＩＬ－４Ｒを標的にするアトピー皮膚炎治療剤としての効果を確認するために用いられた生理活性核酸とキャリアペプチド核酸、及び対照群として用いられた生理活性核酸とキャリアペプチド核酸の配列情報を示している。配列番号１及び２の生理活性核酸、配列番号５～１３のキャリア核酸は、ＴＬＲ２を標的とし、配列番号３及び４の生理活性核酸、配列番号１４～１８のキャリア核酸は、ＩＬ－４Ｒαを標的とする。
【0158】
本発明で使用した全てのペプチド核酸は、パナジン（ＰＡＮＡＧＥＮＥ、韓国）でＨＰＬＣ精製方法を用いて合成した。本発明の実施例による全てのキャリアペプチド核酸の一部は、エンドソーム脱出能を促進するためのＨｉｓｔｉｄｉｎｅ（１０）のようなペプチドを５’又は３’末端に結合し、配列番号５番～１８番と記載される配列で構成されている（表１）。
【0159】
【表1】
【0160】
単量体の修飾は、電気的な性質を付与するために、ペプチド核酸のバックボーンを、電気的陽性はリジン（Ｌｙｓｉｎｅ，Ｌｙｓ，Ｋ，（＋）と表記）を、電気的陰性はグルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ，Ｇｌｕ，Ｅ，（－）と表記）に修飾されたペプチドバックボーンを有するように製作した。
【0161】
それぞれの生理活性核酸とキャリアペプチド核酸の組合せは、ＤＭＳＯ下で混成化され、その結果、生理活性核酸とキャリアペプチド核酸で構成された複合体が製作された。
【0162】
実施例２：皮膚透過性核酸複合体を用いたアトピー皮膚炎（Ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）様細胞モデルにおいて治療効果分析
実施例１によって、下記表２の構造で製造された、ＴＬＲ２を標的遺伝子とする生理活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸を含む皮膚透過性核酸複合体を用いて、アトピー皮膚炎治療効果を分析した。
実施例１によって、下記表２の構造で製造された、ＴＬＲ２を標的遺伝子とする生理活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸を含む皮膚透過性核酸複合体を用いて、アトピー皮膚炎治療効果を分析した。
【0163】
【表2】
【0164】
実施例２－１：細胞培養
ＣＬＳ（ＣＬＳ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ、ドイツ）から入手したヒト角質細胞（ＨａＣａＴ）を、ＤＭＥＭ培養培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ，ウェルジン、韓国）に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加し、３７℃５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。アトピー皮膚炎様細胞モデルを作るために、イエダニ抽出液５ｎｇ／ｍＬとＤＮＣＢ（２－ｄｉｎｉｔｒｏｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ）５μＭを処理して２４時間培養した。
ＣＬＳ（ＣＬＳ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ、ドイツ）から入手したヒト角質細胞（ＨａＣａＴ）を、ＤＭＥＭ培養培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ，ウェルジン、韓国）に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加し、３７℃５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。アトピー皮膚炎様細胞モデルを作るために、イエダニ抽出液５ｎｇ／ｍＬとＤＮＣＢ（２－ｄｉｎｉｔｒｏｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ）５μＭを処理して２４時間培養した。
【0165】
実施例２－２：ＭＴＴ（ＭＴＴ ａｓｓａｙ）によって角質細胞株において細胞生存率分析
実施例２－１における実験条件で９６ウェルにヒト由来角質細胞株を６×１０３でシードし、２４時間培養した後、表２の構造で製造された生理活性核酸及びキャリアペプチド核酸を含む複合体を用いて処理された細胞株に、ＭＴＴ（３－（４，５－Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２，５－Ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ）溶液を１Ｘ ＰＢＳに５ｍｇ／ｍＬ濃度で製造し、ウェル当たり２０μＬで処理して４時間培養後に、ＯＤ（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）をスペクトロフォトメーター（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）で測定して分析した。
実施例２－１における実験条件で９６ウェルにヒト由来角質細胞株を６×１０３でシードし、２４時間培養した後、表２の構造で製造された生理活性核酸及びキャリアペプチド核酸を含む複合体を用いて処理された細胞株に、ＭＴＴ（３－（４，５－Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２，５－Ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ）溶液を１Ｘ ＰＢＳに５ｍｇ／ｍＬ濃度で製造し、ウェル当たり２０μＬで処理して４時間培養後に、ＯＤ（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）をスペクトロフォトメーター（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）で測定して分析した。
【0166】
本実施例で使用した核酸複合体組合せは、下記表３の通りである。
【0167】
【表3】
【0168】
【0169】
実施例２－３：ウェスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｓｓａｙ）で遺伝子発現の分析
ヒト由来角質細胞株を６ウェルプレートに１×１０５で細胞をシードして２４時間培養後に、実施例２－１の条件で実験を行って生理活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸を含む複合体を処理し、２４、４８、７２時間培養した後、ＲＩＰＡバッファを各ウェルに３０μＬずつ添加してタンパク質溶解液（ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｙｓａｔｅ）を得た。タンパク質溶解液をＢＣＡアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）を用いてタンパク質の量を定量し、タンパク質３０μｇを電気泳動を用いてサイズ別に分離し、ＰＶＤＦ膜にタンパク質を移した後、１次抗体であるＴＬＲ２（ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、米国）、ｐ－ＮＦｋＢ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）、ＭｙＤ８８（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）、ＴＡＲＣ（Ａｂｃａｍ、米国）を１：１０００に処理し、４℃で１日放置した。１Ｘ ＴＢＳ－Ｔを用いて洗浄し、２次抗体であるヒツジ抗ウサギ、ヒツジ抗マウス（ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，米国）を１：２０００に処理して常温で２時間放置した。ＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌTMウェストフェムト最大感度基質（ＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌTM Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）を処理し、Ｉｍａｇｅ６００（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ドイツ）装備を用いて角質細胞株において標的遺伝子の発現抑制効率を分析した。
ヒト由来角質細胞株を６ウェルプレートに１×１０５で細胞をシードして２４時間培養後に、実施例２－１の条件で実験を行って生理活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸を含む複合体を処理し、２４、４８、７２時間培養した後、ＲＩＰＡバッファを各ウェルに３０μＬずつ添加してタンパク質溶解液（ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｙｓａｔｅ）を得た。タンパク質溶解液をＢＣＡアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）を用いてタンパク質の量を定量し、タンパク質３０μｇを電気泳動を用いてサイズ別に分離し、ＰＶＤＦ膜にタンパク質を移した後、１次抗体であるＴＬＲ２（ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、米国）、ｐ－ＮＦｋＢ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）、ＭｙＤ８８（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）、ＴＡＲＣ（Ａｂｃａｍ、米国）を１：１０００に処理し、４℃で１日放置した。１Ｘ ＴＢＳ－Ｔを用いて洗浄し、２次抗体であるヒツジ抗ウサギ、ヒツジ抗マウス（ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，米国）を１：２０００に処理して常温で２時間放置した。ＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌTMウェストフェムト最大感度基質（ＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌTM Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）を処理し、Ｉｍａｇｅ６００（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ドイツ）装備を用いて角質細胞株において標的遺伝子の発現抑制効率を分析した。
【0170】
本実施例では、実施例２－２で効果が検証された核酸の組合せ体を選別してイエダニ及びシックハウス症候群誘発化学物質を用いたアトピー皮膚炎様細胞モデルにおけるＴＬＲ２及び下位段階遺伝子発現変化を分析した。使用した核酸複合体の組合せは、下記表４の通りである。
【0171】
【表4】
【0172】
表４の核酸複合体組合せに対してアトピー皮膚炎様細胞モデルにおけるＴＬＲ２タンパク質及び下位経路遺伝子の発現パターン分析した。
【0173】
【0174】
実施例３：皮膚透過性核酸複合体を用いたアトピー皮膚炎（Ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）動物モデルにおける治療効果分析
実施例３－１：イエダニ抽出物を用いたアトピー皮膚炎誘導動物モデルにおけるアトピー皮膚炎表現型効果分析
ＮＣ／Ｎｇａマウスの背部を除毛し、ＡＤクリーム（イエダニ抽出物クリーム、Ｂｉｏｓｔｉｒ、日本）を１００ｍｇずつ１週間に２回で合計３週間塗布してイエダニによるアトピー皮膚炎誘発動物モデルを構築した。１週間に総２回のクリーム剤形の核酸複合体を処理し、アトピー皮膚炎動物モデル表現型を写真で分析し、背部位における毛の成長度合いをＩｍａｇｅＪで測定した。
実施例３－１：イエダニ抽出物を用いたアトピー皮膚炎誘導動物モデルにおけるアトピー皮膚炎表現型効果分析
ＮＣ／Ｎｇａマウスの背部を除毛し、ＡＤクリーム（イエダニ抽出物クリーム、Ｂｉｏｓｔｉｒ、日本）を１００ｍｇずつ１週間に２回で合計３週間塗布してイエダニによるアトピー皮膚炎誘発動物モデルを構築した。１週間に総２回のクリーム剤形の核酸複合体を処理し、アトピー皮膚炎動物モデル表現型を写真で分析し、背部位における毛の成長度合いをＩｍａｇｅＪで測定した。
【0175】
本実施例では、実施例２－２から効果が検証された核酸の組合せ体を選別し、イエダニ抽出物を用いたアトピー皮膚炎様動物モデルにおける表現型及び組織学的所見、ＴＬＲ２及び下位段階遺伝子発現変化を分析した。使用した核酸複合体組合せは、下記表５の通りである。
【0176】
【表5】
【0177】
その結果、アトピー皮膚炎表現型が核酸複合体グループにおいて減少することを確認し（図３Ａ）、アトピー皮膚炎を誘導した動物グループと比較したとき、核酸複合体を塗布したグループにおいて皮膚損傷による脱毛が減少することが確認できた（図３Ａ；クリーム対照群は、クリーム剤形を含むが、核酸複合体は含まないグループであり、陽性対照群は、既存治療剤であるデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）を含むクリーム剤形）。
【0178】
実施例３－２：血清内ＩｇＥ及びＴＡＲＣ濃度変化分析
実施例３－１の条件で行った動物実験において、最終実験終了日にマウス血液を眼窩採血を通じて収集し、常温で２時間以上放置し、遠心分離機（１４，０００ｒｐｍ、１５分）を用いて血清を収集した。収集した血清をＩｇＥ ＥＬＩＳＡキット（ゴマバイオテック、大韓民国）及びＴＡＲＣ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、米国）から提供する実験方法を用いて血清内ＩｇＥ及びＴＡＲＣの濃度を測定した。
実施例３－１の条件で行った動物実験において、最終実験終了日にマウス血液を眼窩採血を通じて収集し、常温で２時間以上放置し、遠心分離機（１４，０００ｒｐｍ、１５分）を用いて血清を収集した。収集した血清をＩｇＥ ＥＬＩＳＡキット（ゴマバイオテック、大韓民国）及びＴＡＲＣ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、米国）から提供する実験方法を用いて血清内ＩｇＥ及びＴＡＲＣの濃度を測定した。
【0179】
【0180】
実施例３－３：ウェスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｓｓａｙ）で遺伝子発現の分析
実施例３－１の条件で実験を行って生検したマウスの背組織の一部を得、ＲＩＰＡバッファを各ウェルに２００μＬずつ添加してタンパク質溶解液を得た。タンパク質溶解液をＢＣＡアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）を用いてタンパク質の量を定量し、タンパク質３０μｇを電気泳動を用いてサイズ別に分離し、ＰＶＤＦ膜にタンパク質を移した後、１次抗体であるＴＬＲ２（ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，米国）、ｐ－ＮＦｋＢ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）、ＭｙＤ８８（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）を１：１０００に処理し、４℃で１日放置した。１Ｘ ＴＢＳ－Ｔを用いて洗浄し、２次抗体であるヒツジ抗ウサギ、ヒツジ抗マウス（ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，米国）を１：２０００に処理して常温で２時間放置した。ＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌTMウェストフェムト最大感度基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）を処理し、Ｉｍａｇｅ６００（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ドイツ）装備を用いてマウスの背部組織において標的遺伝子の発現抑制効率を分析した。
実施例３－１の条件で実験を行って生検したマウスの背組織の一部を得、ＲＩＰＡバッファを各ウェルに２００μＬずつ添加してタンパク質溶解液を得た。タンパク質溶解液をＢＣＡアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）を用いてタンパク質の量を定量し、タンパク質３０μｇを電気泳動を用いてサイズ別に分離し、ＰＶＤＦ膜にタンパク質を移した後、１次抗体であるＴＬＲ２（ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，米国）、ｐ－ＮＦｋＢ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）、ＭｙＤ８８（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）を１：１０００に処理し、４℃で１日放置した。１Ｘ ＴＢＳ－Ｔを用いて洗浄し、２次抗体であるヒツジ抗ウサギ、ヒツジ抗マウス（ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，米国）を１：２０００に処理して常温で２時間放置した。ＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌTMウェストフェムト最大感度基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）を処理し、Ｉｍａｇｅ６００（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ドイツ）装備を用いてマウスの背部組織において標的遺伝子の発現抑制効率を分析した。
【0181】
図３Ｄに示すように、アトピー皮膚炎様動物モデル組織において、核酸複合体を処理したグループにおいてＴＬＲ２の発現及び下位段階遺伝子の発現が減少することを確認した。
【0182】
実施例３－４：Ｈ＆Ｅ染色でアトピー皮膚炎誘導動物モデルにおける表現型分析
実施例３－１の条件で実験を行って最終実験終了日にマウスの背部組織を生検して４％ホルマリン溶液に１日固定し、固定した組織をパラフィン包埋して組織を５μｍにセクションしてスライドガラスにマウンティングした。マウンティングした組職をヘマトキシリン：エオジン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ：Ｅｏｓｉｎ）染色溶液に一定時間染色し、１Ｘ
ＰＢＳで水洗した後、顕微鏡で分析した。
実施例３－１の条件で実験を行って最終実験終了日にマウスの背部組織を生検して４％ホルマリン溶液に１日固定し、固定した組織をパラフィン包埋して組織を５μｍにセクションしてスライドガラスにマウンティングした。マウンティングした組職をヘマトキシリン：エオジン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ：Ｅｏｓｉｎ）染色溶液に一定時間染色し、１Ｘ
ＰＢＳで水洗した後、顕微鏡で分析した。
【0183】
その結果、図３Ｅに示すように、アトピー皮膚炎を誘導した対照群に比べて核酸複合体を処理したグループにおいて、経皮組織の厚さ及び炎症性細胞が減少したことが確認できた。
【0184】
実施例３－５：免疫染色でアトピー皮膚炎誘導動物モデルにおける組織内炎症性マーカー分析
実施例３－１の条件で実験を行って最終実験終了日にマウスの背部組織を生検して４％ホルマリン溶液に１日固定し、固定した組織をパラフィン包埋して５μｍにセクションしてスライドガラスにマウンティングした。マウンティングした組職を０．５％ ＢＳＡ溶液に１時間ブロッキングし、ＣＤ３、ＣＤ１１ｃ １次抗体溶液を処理して１日間置いた。続いて、１次抗体溶液を除去して１Ｘ ＰＢＳで洗浄後に２次抗体溶液を処理して常温で２時間処理し、ＤＡＢ染色によって分析した。
実施例３－１の条件で実験を行って最終実験終了日にマウスの背部組織を生検して４％ホルマリン溶液に１日固定し、固定した組織をパラフィン包埋して５μｍにセクションしてスライドガラスにマウンティングした。マウンティングした組職を０．５％ ＢＳＡ溶液に１時間ブロッキングし、ＣＤ３、ＣＤ１１ｃ １次抗体溶液を処理して１日間置いた。続いて、１次抗体溶液を除去して１Ｘ ＰＢＳで洗浄後に２次抗体溶液を処理して常温で２時間処理し、ＤＡＢ染色によって分析した。
【0185】
その結果、図３Ｆ～図３Ｇに示すように、、組織内炎症性マーカーであるＣＤ３とＣＤ１１ｃが、アトピー皮膚炎を誘導した対照群に比べて核酸複合体グループにおいて減少することを確認し、これを数値化して比較した時にも減少することを確認した（図３Ｈ）。
【0186】
実施例４：皮膚透過性核酸複合体を用いたアトピー皮膚炎（Ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）治療効果分析
実施例１によって、下記表６の構造で製造されたＩＬ－４Ｒαを標的遺伝子とする生理活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸を含む皮膚透過性核酸複合体を用いてアトピー皮膚炎治療効果を分析した。
実施例１によって、下記表６の構造で製造されたＩＬ－４Ｒαを標的遺伝子とする生理活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸を含む皮膚透過性核酸複合体を用いてアトピー皮膚炎治療効果を分析した。
【0187】
【表6】
【0188】
実施例４－１：細胞培養
ＣＬＳ（ＣＬＳ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ、ドイツ）から入手したヒト角質細胞（ＨａＣａＴ）を、ＤＭＥＭ培養培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ，ウェルジン、韓国）に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加し、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。アトピー皮膚炎様細胞モデルを作るために、ＩＬ－４１０ｎｇ／ｍＬとＩＬ－１３１０ｎｇ／ｍＬを処理して２４時間培養した。
ＣＬＳ（ＣＬＳ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ、ドイツ）から入手したヒト角質細胞（ＨａＣａＴ）を、ＤＭＥＭ培養培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ，ウェルジン、韓国）に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加し、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。アトピー皮膚炎様細胞モデルを作るために、ＩＬ－４１０ｎｇ／ｍＬとＩＬ－１３１０ｎｇ／ｍＬを処理して２４時間培養した。
【0189】
実施例４－２：ＭＴＴ（ＭＴＴ ａｓｓａｙ）で角質細胞株において細胞生存率分析
実施例４－１における実験条件で９６ウェルにヒト由来角質細胞株を６×１０３でシードし、２４時間培養した後、表５の構造で製造された生理活性核酸及びキャリアペプチド核酸を含む複合体を用いて処理された細胞株に、ＭＴＴ（３－（４，５－Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２，５－Ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ）溶液を１Ｘ ＰＢＳに５ｍｇ／ｍＬ濃度に製造し、ウェル当たり２０μＬで処理して４時間培養後に、ＯＤ（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）をスペクトロフォトメーターで測定して分析した。
実施例４－１における実験条件で９６ウェルにヒト由来角質細胞株を６×１０３でシードし、２４時間培養した後、表５の構造で製造された生理活性核酸及びキャリアペプチド核酸を含む複合体を用いて処理された細胞株に、ＭＴＴ（３－（４，５－Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２，５－Ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ）溶液を１Ｘ ＰＢＳに５ｍｇ／ｍＬ濃度に製造し、ウェル当たり２０μＬで処理して４時間培養後に、ＯＤ（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）をスペクトロフォトメーターで測定して分析した。
【0190】
本実施例で使用した核酸複合体組合せは、下記表７の通りである。
【0191】
【表7】
【0192】
【0193】
実施例４－３：ウェスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｓｓａｙ）で遺伝子発現の分析
ヒト由来角質細胞株を６ウェルプレートに１×１０５で細胞をシードして２４時間培養後に、実施例４－１の条件で実験を行って生理活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸を含む複合体を処理し、２４、４８、７２時間培養した後、ＲＩＰＡバッファを各ウェルに３０μＬずつ添加してタンパク質溶解液を得た。タンパク質溶解液をＢＣＡアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）を用いてタンパク質の量を定量し、タンパク質３０μｇを電気泳動を用いてサイズ別に分離し、ＰＶＤＦ膜にタンパク質を移した後、１次抗体であるＩＬ－４Ｒα（ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，米国）、ｐ－ＪＡＫ３（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）、ｐ－ｓｔａｔ６（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）を１：１０００に処理し、４℃で１日放置した。１Ｘ ＴＢＳ－Ｔを用いて洗浄し、２次抗体であるヒツジ抗ウサギ、ヒツジ抗マウス（ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，米国）を１：２０００に処理して常温で２時間放置した。ＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌTMウェストフェムト最大感度基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）を処理し、Ｉｍａｇｅ６００（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ドイツ）装備を用いて角質細胞株において標的遺伝子の発現抑制効率を分析した。
ヒト由来角質細胞株を６ウェルプレートに１×１０５で細胞をシードして２４時間培養後に、実施例４－１の条件で実験を行って生理活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸を含む複合体を処理し、２４、４８、７２時間培養した後、ＲＩＰＡバッファを各ウェルに３０μＬずつ添加してタンパク質溶解液を得た。タンパク質溶解液をＢＣＡアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）を用いてタンパク質の量を定量し、タンパク質３０μｇを電気泳動を用いてサイズ別に分離し、ＰＶＤＦ膜にタンパク質を移した後、１次抗体であるＩＬ－４Ｒα（ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，米国）、ｐ－ＪＡＫ３（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）、ｐ－ｓｔａｔ６（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）を１：１０００に処理し、４℃で１日放置した。１Ｘ ＴＢＳ－Ｔを用いて洗浄し、２次抗体であるヒツジ抗ウサギ、ヒツジ抗マウス（ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，米国）を１：２０００に処理して常温で２時間放置した。ＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌTMウェストフェムト最大感度基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）を処理し、Ｉｍａｇｅ６００（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ドイツ）装備を用いて角質細胞株において標的遺伝子の発現抑制効率を分析した。
【0194】
ＩＬ－４及びＩＬ－１３を用いたアトピー皮膚炎様細胞モデルにおけるＩＬ－４Ｒα及び下位段階遺伝子発現変化を分析した。使用した核酸複合体組合せは、下記表８の通りである。
【0195】
【表8】
【0196】
【0197】
実施例５：皮膚透過性核酸複合体を用いたＣＤ４陽性Ｔリンパ球のＴ ｈｅｌｐｅｒ ｔｙｐｅ ２分化抑制効果分析
実施例１によって上記表５の構造で製造された、ＩＬ－４Ｒαを標的遺伝子とする生理活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸を含む皮膚透過性核酸複合体を用いて、Ｔヘルパー細胞分化抑制効果を分析した。
実施例１によって上記表５の構造で製造された、ＩＬ－４Ｒαを標的遺伝子とする生理活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸を含む皮膚透過性核酸複合体を用いて、Ｔヘルパー細胞分化抑制効果を分析した。
【0198】
実施例５－１：細胞培養
ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国）から入手した純粋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ，ＣＤ４ ＋ ｎａｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ）を、ＲＰＭＩ－１６４０培養培地（ＡＴＣＣ、米国）に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加し、３７℃５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ｔｙｐｅ ２に分化させるために、ＩＬ－４１０ｎｇ／ｍＬ（図６Ａ）とＩＬ－４１０ｎｇ／ｍＬ＋ＰＭＡ（Ｐｈｏｒｂｏｌ－１２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ－１３－ａｃｅｔａｔｅ）＋イオノマイシン（図６Ｂ）を処理し、２４、４８、７２時間培養した。
ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国）から入手した純粋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ，ＣＤ４ ＋ ｎａｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ）を、ＲＰＭＩ－１６４０培養培地（ＡＴＣＣ、米国）に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加し、３７℃５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ｔｙｐｅ ２に分化させるために、ＩＬ－４１０ｎｇ／ｍＬ（図６Ａ）とＩＬ－４１０ｎｇ／ｍＬ＋ＰＭＡ（Ｐｈｏｒｂｏｌ－１２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ－１３－ａｃｅｔａｔｅ）＋イオノマイシン（図６Ｂ）を処理し、２４、４８、７２時間培養した。
【0199】
実施例５－２：ウェスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｓｓａｙ）で遺伝子発現の分析
純粋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ，ＣＤ４ ＋ ｎａｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ）を６ウェルプレートに２×１０５で細胞をシードして２４時間培養後に、実施例５－１の条件で実験を行って生理活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸を含む複合体を処理し、２４、４８、７２時間培養した後、ＲＩＰＡバッファを各ウェルに３０μＬずつ添加してタンパク質溶解液を得た。タンパク質溶解液をＢＣＡアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）を用いてタンパク質の量を定量し、タンパク質３０μｇを電気泳動を用いてサイズ別に分離し、ＰＶＤＦ膜にタンパク質を移した後、１次抗体であるＩＬ－４Ｒα（ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，米国）、ｐ－ｓｔａｔ６（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）を１：１０００に処理し、４℃で１日放置した。１Ｘ ＴＢＳ－Ｔを用いて洗浄し、２次抗体であるヒツジ抗ウサギ、ヒツジ抗マウス（ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，米国）を１：２０００に処理して常温で２時間放置した。ＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌTMウェストフェムト最大感度基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）を処理し、Ｉｍａｇｅ６００（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ドイツ）装備を用いて角質細胞株において標的遺伝子の発現抑制効率を分析した。
純粋Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ，ＣＤ４ ＋ ｎａｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ）を６ウェルプレートに２×１０５で細胞をシードして２４時間培養後に、実施例５－１の条件で実験を行って生理活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸を含む複合体を処理し、２４、４８、７２時間培養した後、ＲＩＰＡバッファを各ウェルに３０μＬずつ添加してタンパク質溶解液を得た。タンパク質溶解液をＢＣＡアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）を用いてタンパク質の量を定量し、タンパク質３０μｇを電気泳動を用いてサイズ別に分離し、ＰＶＤＦ膜にタンパク質を移した後、１次抗体であるＩＬ－４Ｒα（ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，米国）、ｐ－ｓｔａｔ６（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）を１：１０００に処理し、４℃で１日放置した。１Ｘ ＴＢＳ－Ｔを用いて洗浄し、２次抗体であるヒツジ抗ウサギ、ヒツジ抗マウス（ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，米国）を１：２０００に処理して常温で２時間放置した。ＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌTMウェストフェムト最大感度基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）を処理し、Ｉｍａｇｅ６００（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ドイツ）装備を用いて角質細胞株において標的遺伝子の発現抑制効率を分析した。
【0200】
ＩＬ－４及びＩＬ－４＋ＰＭＡを用いたＴ ｈｅｌｐｅｒ ｔｙｐｅ ２分化モデルにおけるＩＬ－４Ｒα及び下位段階遺伝子発現変化を分析した。使用した核酸複合体組合せは、表８の通りである。
【0201】
【0202】
実施例６：皮膚透過性核酸複合体を用いたＤＮＣＢ（２－Ｄｉｎｉｔｒｏｃｈｏｌｒｏｂｅｎｚｅｎｅ）誘導アトピー皮膚炎動物モデルにおけるアトピー皮膚炎治療効果分析
実施例６－１：ＤＮＣＢ（２－Ｄｉｎｉｔｒｏｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ）を用いたアトピー皮膚炎誘導動物モデルにおけるアトピー皮膚炎表現型効果分析
ＮＣ／Ｎｇａマウスを１週間馴化させた後に背部を除毛し、１％ ＤＮＣＢ溶液（アセトン：オリーブ油＝２：１）を塗布してまずアトピー皮膚炎の誘導を行い、その後、持続して０．４％ ＤＮＣＢ溶液を１週に２回ずつ総４週間塗布してアトピー皮膚炎誘発動物モデルを構築した。１週に総２回ずつ２週間クリーム剤形の核酸複合体を処理し、交互に０．４％ ＤＮＣＢ溶液を塗布してアトピー皮膚炎誘発動物モデルを保持し、クリーム剤形の核酸複合体処理が完了した時点にアトピー皮膚炎動物モデル表現型を写真で分析した。
実施例６－１：ＤＮＣＢ（２－Ｄｉｎｉｔｒｏｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ）を用いたアトピー皮膚炎誘導動物モデルにおけるアトピー皮膚炎表現型効果分析
ＮＣ／Ｎｇａマウスを１週間馴化させた後に背部を除毛し、１％ ＤＮＣＢ溶液（アセトン：オリーブ油＝２：１）を塗布してまずアトピー皮膚炎の誘導を行い、その後、持続して０．４％ ＤＮＣＢ溶液を１週に２回ずつ総４週間塗布してアトピー皮膚炎誘発動物モデルを構築した。１週に総２回ずつ２週間クリーム剤形の核酸複合体を処理し、交互に０．４％ ＤＮＣＢ溶液を塗布してアトピー皮膚炎誘発動物モデルを保持し、クリーム剤形の核酸複合体処理が完了した時点にアトピー皮膚炎動物モデル表現型を写真で分析した。
【0203】
本実施例では、実施例４及び５で効果が検証された核酸複合体を選別し、ＤＮＣＢを用いたアトピー皮膚炎誘発動物モデルにおける表現型及び組織学的所見、ＩＬ－４Ｒα標的遺伝子発現変化を分析した。使用した核酸複合体組合せは、下記表９の通りである。
【0204】
【表9】
【0205】
その結果、アトピー皮膚炎表現型が核酸複合体グループにおいて減少することを確認した（図７Ａ）。
【0206】
実施例６－２：ウェスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｓｓａｙ）で遺伝子発現の分析
実施例６－１の条件で実験を行って生検したマウスの背部組織の一部を得、ＲＩＰＡバッファを各ウェルに２００μＬずつ添加してタンパク質溶解液を得た。タンパク質溶解液をＢＣＡアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）を用いてタンパク質の量を定量し、タンパク質３０μｇを電気泳動を用いてサイズ別に分離し、ＰＶＤＦ膜にタンパク質を移した後、１次抗体であるＩＬ－４Ｒα（ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，米国）を１：１０００に処理し、４℃で１日放置した。１Ｘ ＴＢＳ－Ｔを用いて洗浄し、２次抗体であるヒツジ抗ウサギ、ヒツジ抗マウス（ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，米国）を１：２０００に処理して常温で２時間放置した。ＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌTMウェストフェムト最大感度基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）を処理し、Ｉｍａｇｅ６００（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ドイツ）装備を用いてマウスの背部組織において標的遺伝子の発現抑制効率を分析した。
実施例６－１の条件で実験を行って生検したマウスの背部組織の一部を得、ＲＩＰＡバッファを各ウェルに２００μＬずつ添加してタンパク質溶解液を得た。タンパク質溶解液をＢＣＡアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）を用いてタンパク質の量を定量し、タンパク質３０μｇを電気泳動を用いてサイズ別に分離し、ＰＶＤＦ膜にタンパク質を移した後、１次抗体であるＩＬ－４Ｒα（ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，米国）を１：１０００に処理し、４℃で１日放置した。１Ｘ ＴＢＳ－Ｔを用いて洗浄し、２次抗体であるヒツジ抗ウサギ、ヒツジ抗マウス（ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，米国）を１：２０００に処理して常温で２時間放置した。ＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌTMウェストフェムト最大感度基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）を処理し、Ｉｍａｇｅ６００（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ドイツ）装備を用いてマウスの背部組織において標的遺伝子の発現抑制効率を分析した。
【0207】
図７Ｂに示すように、核酸複合体を処理したグループの皮膚組織においてＩＬ－４Ｒαの発現が減少することを確認した。
【0208】
実施例６－３：血清内ＩｇＥ、ＴＡＲＣ及びＩＬ－４濃度変化分析
実施例６－１の条件で行った動物実験において最終実験終了日にマウス血液を眼窩採血を通じて収集して常温で２時間以上放置し、遠心分離機（１４，０００ｒｐｍ、１５分）を用いて血清を収集した。収集した血清に対して、ＩｇＥとＩＬ－４ＥＬＩＳＡキット（ゴマバイオテック、大韓民国）及びＴＡＲＣ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、米国）から提供する実験方法を用いて血清内ＩｇＥ、ＴＡＲＣ及びＩＬ－４の濃度を測定した。
実施例６－１の条件で行った動物実験において最終実験終了日にマウス血液を眼窩採血を通じて収集して常温で２時間以上放置し、遠心分離機（１４，０００ｒｐｍ、１５分）を用いて血清を収集した。収集した血清に対して、ＩｇＥとＩＬ－４ＥＬＩＳＡキット（ゴマバイオテック、大韓民国）及びＴＡＲＣ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、米国）から提供する実験方法を用いて血清内ＩｇＥ、ＴＡＲＣ及びＩＬ－４の濃度を測定した。
【0209】
その結果、図８Ａに示すように、アトピー皮膚炎を誘導した対照群に比べて核酸複合体を処理したグループにおいて、ＩｇＥ、ＴＡＲＣ及びＩＬ－４の濃度が陰性対照群と類似するレベルに減少したことが確認できた。
【0210】
実施例６－４：動物行動分析を用いたアトピー皮膚炎誘導動物モデルにおける掻痒症及び紅斑改善効果分析
実施例６－１の条件で行った動物実験において、アトピー皮膚炎誘発時に見られる代表的な症状である掻痒症の改善効果を確認するために、アトピー皮膚炎誘発して１週後にグループ間マウスの行動評価を行い、核酸複合体を投与した最後の週にグループ間マウスの行動評価を行って掻痒症の改善効果を確認した。また、アトピー皮膚炎誘発時に皮膚に現れる紅斑症状が改善されるか否かを確認するために、アトピー皮膚炎を誘導する期間に紅斑症状発現の有無を観察し、アトピー皮膚炎誘導完了時点と核酸複合体投与完了時点に紅斑症状の改善効果を確認した。
実施例６－１の条件で行った動物実験において、アトピー皮膚炎誘発時に見られる代表的な症状である掻痒症の改善効果を確認するために、アトピー皮膚炎誘発して１週後にグループ間マウスの行動評価を行い、核酸複合体を投与した最後の週にグループ間マウスの行動評価を行って掻痒症の改善効果を確認した。また、アトピー皮膚炎誘発時に皮膚に現れる紅斑症状が改善されるか否かを確認するために、アトピー皮膚炎を誘導する期間に紅斑症状発現の有無を観察し、アトピー皮膚炎誘導完了時点と核酸複合体投与完了時点に紅斑症状の改善効果を確認した。
【0211】
その結果、図８Ｂに示すように、アトピー皮膚炎を誘導した対照群に比べて核酸複合体を処理したグループにおいて、掻痒症及び紅斑症状が明確に改善されることが確認できた。
【0212】
実施例６－５：Ｈ＆Ｅ染色でアトピー皮膚炎誘導動物モデルにおける表現型分析
実施例６－１の条件で実験を行って最終実験終了日にマウスの背部組織を生検して４％ホルマリン溶液に１日固定し、固定した組織をパラフィン包埋して組織を５μｍにセクションしてスライドガラスにマウンティングした。マウンティングした組職をヘマトキシリン：エオジン染色溶液に一定時間染色し、１Ｘ ＰＢＳで水洗した後、顕微鏡で分析した。
実施例６－１の条件で実験を行って最終実験終了日にマウスの背部組織を生検して４％ホルマリン溶液に１日固定し、固定した組織をパラフィン包埋して組織を５μｍにセクションしてスライドガラスにマウンティングした。マウンティングした組職をヘマトキシリン：エオジン染色溶液に一定時間染色し、１Ｘ ＰＢＳで水洗した後、顕微鏡で分析した。
【0213】
その結果、図９Ａに示すように、アトピー皮膚炎を誘導した対照群に比べて核酸複合体を処理したグループにおいて、経皮組織の厚さ及び炎症性細胞が減少したことが確認できた。
【0214】
実施例６－６：免疫染色でアトピー皮膚炎誘導動物モデルにおける組織内炎症性マーカー分析
実施例６－１の条件で実験を行って最終実験終了日にマウスの背部組織を生検して４％ホルマリン溶液に１日固定し、固定した組織をパラフィン包埋して５μｍにセクションしてスライドガラスにマウンティングした。マウンティングした組職を０．５％ ＢＳＡ溶液に１時間ブロッキングし、ＣＤ３、ＣＤ１１ｃ １次抗体溶液を処理して１日放置した。続いて、１次抗体溶液を除去して１Ｘ ＰＢＳで洗浄後に、２次抗体溶液を処理して常温で２時間処理し、ＤＡＢ染色を用いて分析した。
実施例６－１の条件で実験を行って最終実験終了日にマウスの背部組織を生検して４％ホルマリン溶液に１日固定し、固定した組織をパラフィン包埋して５μｍにセクションしてスライドガラスにマウンティングした。マウンティングした組職を０．５％ ＢＳＡ溶液に１時間ブロッキングし、ＣＤ３、ＣＤ１１ｃ １次抗体溶液を処理して１日放置した。続いて、１次抗体溶液を除去して１Ｘ ＰＢＳで洗浄後に、２次抗体溶液を処理して常温で２時間処理し、ＤＡＢ染色を用いて分析した。
【0215】
その結果、図９Ｂに示すように、組織内炎症性マーカーであるＣＤ３とＣＤ１１ｃが、アトピー皮膚炎を誘導した対照群に比べて核酸複合体グループにおいて減少することを確認し、これを数値化して比較した時にも減少することを確認した。
【産業上の利用可能性】
【0216】
本発明に係るＴＬＲ２又はＩＬ－４Ｒαを標的とする生理活性核酸とキャリアペプチド核酸とが相補的に結合した皮膚透過性核酸複合体は、皮膚透過性及び皮膚残留性が高いので、アトピー性皮膚炎のような皮膚疾患の予防、改善又は治療に有用である。
【0217】
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述してきたところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は単に好ましい実施様態であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されるものでない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項及びそれらの等価物によって定義されるといえよう。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図3G】
【図3H】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-11-01
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＩＬ－４Ｒα遺伝子と結合可能な配列を有する生理活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）；及びキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）が相補的に結合した皮膚透過性核酸複合体を有効成分として含有する、皮膚疾患の予防、改善又は治療用医薬組成物又は化粧料組成物。
【請求項2】
前記生理活性核酸は、配列番号３～４からなる群から選ばれる配列で表されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記キャリアペプチド核酸は、配列番号５～１８からなる群から選ばれる配列で表されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
前記ＩＬ－４Ｒα遺伝子と結合可能な生理活性核酸は、配列番号４の配列で表されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項5】
前記核酸複合体は、配列番号４の配列で表される生理活性核酸；及び配列番号５～１８からなる群から選ばれるいずれか一つの配列で表されるキャリアペプチド核酸を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項6】
前記ＩＬ－４Ｒα遺伝子と結合可能な生理活性核酸及びキャリアペプチド核酸の結合力（融解温度、ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，Ｔｍ）は、生理活性核酸と生理活性核酸の目的とするＩＬ－４Ｒα遺伝子との結合力よりも低いことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項7】
前記生理活性核酸又はキャリアペプチド核酸は、それぞれの核酸の５’末端又は３’－末端にエンドソーム脱出を促進する物質がさらに結合していることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項8】
前記エンドソーム脱出を促進する物質は、ペプチド、脂質ナノ物質（ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、接合体ナノ物質（ｐｏｌｙｐｌｅｘ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、高分子ナノ球（ｐｏｌｙｍｅｒ ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ）、無機物ナノ物質（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、陽イオン脂質ナノ物質（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ－ｂａｓｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、陽イオン高分子（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒ）及びｐＨ感応高分子（ｐＨ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ）からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
【請求項9】
前記ペプチドは、ＧＬＦＤＩＩＫＫＩＡＥＳＦ（配列番号１９）又はＨｉｓｔｉｄｉｎｅ（１０）であることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
前記生理活性核酸は、全体として陰電荷又は中性を有することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項11】
前記キャリアペプチド核酸は、全体として陽電荷を有するように１個以上のガンマ又はアルファバックボーン修飾ペプチド核酸単量体を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項12】
前記ガンマ又はアルファバックボーン修飾ペプチド核酸単量体は、陽電荷を有するアミノ酸を有する単量体が陰電荷を有するアミノ酸を有する単量体に比べてより多く含まれ、全体としてキャリアペプチド核酸の電荷が陽性となることを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
【請求項13】
前記陽電荷を有するアミノ酸は、リジン（Ｌｙｓｉｎｅ，Ｌｙｓ，Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ，Ａｒｇ，Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，Ｈｉｓ，Ｈ）、ジアミノ酪酸（Ｄｉａｍｉｎｏ ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ，ＤＡＢ）、オルニチン（Ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ，Ｏｒｎ）及びアミノ酸類似体からなる群から選ばれる一つ以上であることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
前記陰電荷を有するアミノ酸は、グルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ，Ｇｌｕ，Ｅ）、アスパラギン酸（Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ，Ａｓｐ，Ｄ）又はアミノ酸類似体であることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【請求項15】
前記核酸複合体は、全体として陽電荷を有することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項16】
前記核酸複合体は、皮膚残留性を有する皮膚透過性であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項17】
前記皮膚疾患は、アトピー皮膚炎、乾癬、皮膚癌、皮膚損傷、色素沈着及びケロイド性疾患からなる群から選ばれるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項18】
請求項１に記載の組成物を含む剤形。
【請求項19】
水性液、ゲル、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、塗抹剤、パッチから選ばれるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１８に記載の剤形。
【外国語明細書】