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特開2023-119596Ｃ末端ヘリカル領域にシステインを有するＦＣ結合タンパク質
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023119596
(43)【公開日】2023-08-28
(54)【発明の名称】Ｃ末端ヘリカル領域にシステインを有するＦＣ結合タンパク質
(51)【国際特許分類】
C07K 14/00 20060101AFI20230821BHJP
C07K 17/00 20060101ALI20230821BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230821BHJP
B01J 20/281 20060101ALI20230821BHJP
B01J 20/24 20060101ALI20230821BHJP
B01J 20/34 20060101ALI20230821BHJP
B01D 15/38 20060101ALI20230821BHJP
【ＦＩ】
C07K14/00 ZNA
C07K17/00
C07K19/00
B01J20/22 D
B01J20/24 C
B01J20/34 G
B01D15/38
B01J20/281 R
B01J20/281 X
【審査請求】有
【請求項の数】30
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023067367
(22)【出願日】2023-04-17
(62)【分割の表示】P 2020506937の分割
【原出願日】2018-08-06
(31)【優先権主張番号】PCT/EP2017/069976
(32)【優先日】2017-08-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】18154731.6
(32)【優先日】2018-02-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】18163964.2
(32)【優先日】2018-03-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】504232044
【氏名又は名称】レプリゲン・コーポレイション
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＰＬＩＧＥＮ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
(74)【代理人】
【識別番号】110003579
【氏名又は名称】弁理士法人山崎国際特許事務所
(74)【代理人】
【識別番号】100118647
【弁理士】
【氏名又は名称】赤松 利昭
(74)【代理人】
【識別番号】100123892
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 忠雄
(74)【代理人】
【識別番号】100169993
【弁理士】
【氏名又は名称】今井 千裕
(74)【代理人】
【識別番号】100173978
【弁理士】
【氏名又は名称】朴 志恩
(72)【発明者】
【氏名】フィードラー、エリック
(72)【発明者】
【氏名】ハウプトス、ウルリッヒ
【テーマコード（参考）】
4D017
4G066
4H045
【Ｆターム（参考）】
4D017AA09
4D017BA07
4D017CA12
4D017CA14
4D017CB01
4D017DA03
4D017DB02
4G066AC01C
4G066AC03B
4G066BA36
4G066BA38
4G066CA54
4G066DA07
4G066EA02
4G066GA11
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045EA61
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】 （修正有）
【課題】高ｐＨにおいてＦｃ結合能力を低減することなく長時間にわたる改善される安定性とともに高い動的結合能力を有するＦｃ結合タンパク質、および該Ｆｃ結合タンパク質を使用したアフィニティー精製の方法を提供する。
【解決手段】本発明は、Ｃ末端ヘリカル領域にシステインを有する１つ以上のドメインを含んでいるＦｃ結合タンパク質を提供する。本発明はさらに、本発明のＦｃ結合タンパク質を含んでいるアフィニティーマトリックスに関する。本発明はまた、免疫グロブリンをアフィニティー精製するためのこれらのＦｃ結合タンパク質またはアフィニティーマトリックスの使用、および本発明のＦｃ結合タンパク質を使用したアフィニティー精製の方法に関する。
【選択図】図４
【解決手段】本発明は、Ｃ末端ヘリカル領域にシステインを有する１つ以上のドメインを含んでいるＦｃ結合タンパク質を提供する。本発明はさらに、本発明のＦｃ結合タンパク質を含んでいるアフィニティーマトリックスに関する。本発明はまた、免疫グロブリンをアフィニティー精製するためのこれらのＦｃ結合タンパク質またはアフィニティーマトリックスの使用、および本発明のＦｃ結合タンパク質を使用したアフィニティー精製の方法に関する。
【選択図】図４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
１つ以上のドメインを含んでいる苛性安定性のＦｃ結合タンパク質であって、少なくと
も１つのドメインが、配列番号３～８６、９０～９９のアミノ酸配列または前記アミノ酸
配列のそれぞれと少なくとも８９．５％の同一性を有するアミノ酸配列、のいずれか1つ
を含んでおり、配列番号３に対応する位置４０、４２、４３、４６、４７、４９、５０、
５１、５３または５４での少なくとも１つのアミノ酸がシステインである、Ｆｃ結合タン
パク質。
も１つのドメインが、配列番号３～８６、９０～９９のアミノ酸配列または前記アミノ酸
配列のそれぞれと少なくとも８９．５％の同一性を有するアミノ酸配列、のいずれか1つ
を含んでおり、配列番号３に対応する位置４０、４２、４３、４６、４７、４９、５０、
５１、５３または５４での少なくとも１つのアミノ酸がシステインである、Ｆｃ結合タン
パク質。
【請求項2】
１つ以上のドメインを含んでいる苛性安定性のＦｃ結合タンパク質であって、少なくと
も１つのドメインが、配列番号２のアミノ酸配列を含んでおり、配列番号２に対応する位
置４０、４２、４３、４６、４７、４９、５０、５１、５３または５４での少なくとも１
つのアミノ酸がシステインである、Ｆｃ結合タンパク質。
も１つのドメインが、配列番号２のアミノ酸配列を含んでおり、配列番号２に対応する位
置４０、４２、４３、４６、４７、４９、５０、５１、５３または５４での少なくとも１
つのアミノ酸がシステインである、Ｆｃ結合タンパク質。
【請求項3】
少なくとも１つのドメインが、配列番号３～１６のアミノ酸配列、または配列番号３～
１６のそれぞれと少なくとも８９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでおり、配
列番号３～１６に対応する位置４０、４２、４３、４６、４７、５０、５１、５３または
５４での少なくとも１つのアミノ酸がシステインである、請求項１に記載のＦｃ結合タン
パク質。
１６のそれぞれと少なくとも８９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでおり、配
列番号３～１６に対応する位置４０、４２、４３、４６、４７、５０、５１、５３または
５４での少なくとも１つのアミノ酸がシステインである、請求項１に記載のＦｃ結合タン
パク質。
【請求項4】
少なくとも１つのドメインが、配列番号７～８のアミノ酸配列、または配列番号７～８
のそれぞれと少なくとも８９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでおり、配列番
号７～８に対応する位置４０、４２、４３、４６、４７、５０、５１、５３または５４で
の少なくとも１つのアミノ酸がシステインである、請求項１に記載のＦｃ結合タンパク質
。
のそれぞれと少なくとも８９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでおり、配列番
号７～８に対応する位置４０、４２、４３、４６、４７、５０、５１、５３または５４で
の少なくとも１つのアミノ酸がシステインである、請求項１に記載のＦｃ結合タンパク質
。
【請求項5】
配列番号３に対応する位置４３、４６または４７での少なくとも１つのアミノ酸がシス
テインである、請求項1に記載のＦｃ結合タンパク質。
テインである、請求項1に記載のＦｃ結合タンパク質。
【請求項6】
少なくとも１つのドメインが、配列番号１７～８６、９０～９９の群から選ばれたアミ
ノ酸配列、または前記配列番号１７～８６、９０～９９の群から選ばれたアミノ酸配列の
それぞれと少なくとも８９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいる、請求項1
に記載のＦｃ結合タンパク質。
ノ酸配列、または前記配列番号１７～８６、９０～９９の群から選ばれたアミノ酸配列の
それぞれと少なくとも８９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいる、請求項1
に記載のＦｃ結合タンパク質。
【請求項7】
前記ドメインが、前記ドメインのＮ末端の最初の４つのアミノ酸のうちの１つ、２つま
たは３つのアミノ酸の欠失および／または前記ドメインのＣ末端の最初の２つのアミノ酸
のうちの１つまたは２つのアミノ酸の欠失を有する、請求項1に記載のＦｃ結合タンパク
質。
たは３つのアミノ酸の欠失および／または前記ドメインのＣ末端の最初の２つのアミノ酸
のうちの１つまたは２つのアミノ酸の欠失を有する、請求項1に記載のＦｃ結合タンパク
質。
【請求項8】
前期タンパク質が、互いに連結された２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つ
のドメインを含んでいる、請求項１～７のいずれか１項に記載のＦｃ結合タンパク質。
のドメインを含んでいる、請求項１～７のいずれか１項に記載のＦｃ結合タンパク質。
【請求項9】
前期タンパク質がホモ多量体またはヘテロ多量体である、請求項８に記載のＦｃ結合タ
ンパク質。
ンパク質。
【請求項10】
前期１つ以上のドメインが、互いに直接または１つ以上のリンカー、好ましくはペプチ
ドリンカーで連結されている、請求項９に記載のＦｃ結合タンパク質。
ドリンカーで連結されている、請求項９に記載のＦｃ結合タンパク質。
【請求項11】
前記タンパク質が、固体担体に、好ましくは位置４０、４２、４３、４６、４７、５０
、５１、５３または５４でのシステインを介してコンジュゲートされる、請求項１～１０
のいずれか１項に記載のＦｃ結合タンパク質。
、５１、５３または５４でのシステインを介してコンジュゲートされる、請求項１～１０
のいずれか１項に記載のＦｃ結合タンパク質。
【請求項12】
前記タンパク質が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、Ｆｃ領域を含ん
でいるＩｇ断片、ＩｇのＦｃ部位を含んでいる融合タンパク質、およびＩｇのＦｃ部位を
含んでいるコンジュゲートに結合する、請求項１～１１のいずれか１項に記載のＦｃ結合
タンパク質。
でいるＩｇ断片、ＩｇのＦｃ部位を含んでいる融合タンパク質、およびＩｇのＦｃ部位を
含んでいるコンジュゲートに結合する、請求項１～１１のいずれか１項に記載のＦｃ結合
タンパク質。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか１項に記載のＦｃ結合タンパク質を含んでいる、アフィニテ
ィー分離マトリックス。
ィー分離マトリックス。
【請求項14】
Ｆｃ配列を含んでいる任意のタンパク質のアフィニティー精製のための、請求項１～１
２のいずれか１項に記載のＦｃ結合タンパク質または請求項１３に記載のアフィニティー
分離マトリックスの使用。
２のいずれか１項に記載のＦｃ結合タンパク質または請求項１３に記載のアフィニティー
分離マトリックスの使用。
【請求項15】
Ｆｃ配列を含んでいるタンパク質のアフィニティー精製の方法であって、以下の工程を
含む方法：（ａ）Ｆｃ配列を含んでいるタンパク質を含有する液体を準備する工程；（ｂ
）アフィニティー分離マトリックスにカップリングされた請求項１～１２のいずれか１項
に記載の少なくとも１つのＦｃ結合タンパク質を含んでいる前記アフィニティー分離マト
リックスを準備する工程；（ｃ）前記アフィニティー分離マトリックスと前記液体とを、
前記請求項１～１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＦｃ結合タンパク質がＦｃ
配列を含んでいるタンパク質に結合することを可能にする条件の下で接触させる工程；お
よび（ｄ）前記アフィニティー精製マトリックスから前記Ｆｃ配列を含んでいるタンパク
質を溶出させる工程。
含む方法：（ａ）Ｆｃ配列を含んでいるタンパク質を含有する液体を準備する工程；（ｂ
）アフィニティー分離マトリックスにカップリングされた請求項１～１２のいずれか１項
に記載の少なくとも１つのＦｃ結合タンパク質を含んでいる前記アフィニティー分離マト
リックスを準備する工程；（ｃ）前記アフィニティー分離マトリックスと前記液体とを、
前記請求項１～１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＦｃ結合タンパク質がＦｃ
配列を含んでいるタンパク質に結合することを可能にする条件の下で接触させる工程；お
よび（ｄ）前記アフィニティー精製マトリックスから前記Ｆｃ配列を含んでいるタンパク
質を溶出させる工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｃ末端ヘリカル領域にシステインを有する１つ以上のドメインを含んでいる
Ｆｃ結合タンパク質に関する。本発明はさらに、本発明のＦｃ結合タンパク質を含んでい
るアフィニティーマトリックスに関する。本発明はまた、免疫グロブリンをアフィニティ
ー精製するためのこれらのＦｃ結合タンパク質またはアフィニティーマトリックスの使用
、および本発明のＦｃ結合タンパク質を使用したアフィニティー精製の方法に関する。
Ｆｃ結合タンパク質に関する。本発明はさらに、本発明のＦｃ結合タンパク質を含んでい
るアフィニティーマトリックスに関する。本発明はまた、免疫グロブリンをアフィニティ
ー精製するためのこれらのＦｃ結合タンパク質またはアフィニティーマトリックスの使用
、および本発明のＦｃ結合タンパク質を使用したアフィニティー精製の方法に関する。
【背景技術】
【0002】
多くの生物工学的および製薬学的用途では、抗体を含んでいるサンプルから汚染物質を
除去することが要求される。抗体を捕捉しおよび精製するための確立された方法は、免疫
グロブリン用の選択的リガンドとして黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ）由来の細菌細胞表面タンパク質Ａを使用したアフィニティークロマトグラ
フィーである（たとえば、Ｈｕｓｅら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ、５１、２００２年、２１７～２３１頁を参照せよ。）。
除去することが要求される。抗体を捕捉しおよび精製するための確立された方法は、免疫
グロブリン用の選択的リガンドとして黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ）由来の細菌細胞表面タンパク質Ａを使用したアフィニティークロマトグラ
フィーである（たとえば、Ｈｕｓｅら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ、５１、２００２年、２１７～２３１頁を参照せよ。）。
【0003】
野生型タンパク質Ａは、高い親和性（アフィニティ－）および選択性でＩｇＧ分子のＦ
ｃ領域に結合し、高温度および広い範囲のｐＨ値において安定である。アルカリ安定性の
ような改善された特性を有するタンパク質Ａの変異体が、抗体を精製するために利用可能
であり、タンパク質Ａリガンドを含んでいる様々なクロマトグラフィーマトリックスが市
販されている。しかし、野生型タンパク質Ａに基くクロマトグラフィーマトリックスは特
に、アルカリ性条件に曝露された後に免疫グロブリンに対する結合能力の喪失を示す。
［本発明の根底にある技術的課題］
ｃ領域に結合し、高温度および広い範囲のｐＨ値において安定である。アルカリ安定性の
ような改善された特性を有するタンパク質Ａの変異体が、抗体を精製するために利用可能
であり、タンパク質Ａリガンドを含んでいる様々なクロマトグラフィーマトリックスが市
販されている。しかし、野生型タンパク質Ａに基くクロマトグラフィーマトリックスは特
に、アルカリ性条件に曝露された後に免疫グロブリンに対する結合能力の喪失を示す。
［本発明の根底にある技術的課題］
【0004】
抗体またはＦｃ含有融合タンパク質の大規模製造プロセスの多くは、アフィニティー精
製のためにタンパク質Ａを使用する。しかし、アフィニティークロマトグラフィーにおけ
るタンパク質Ａの適用には限界があるために、免疫グロブリンのアフィニティー精製を容
易にするためには、免疫グロブリンに特異的に結合する改善された特性を有する新規なＦ
ｃ結合タンパク質を提供する必要が当該技術分野に存在する。
製のためにタンパク質Ａを使用する。しかし、アフィニティークロマトグラフィーにおけ
るタンパク質Ａの適用には限界があるために、免疫グロブリンのアフィニティー精製を容
易にするためには、免疫グロブリンに特異的に結合する改善された特性を有する新規なＦ
ｃ結合タンパク質を提供する必要が当該技術分野に存在する。
【0005】
Ｆｃ結合タンパク質を含んでいるクロマトグラフィーマトリックスの価値を最大限に引
き出すためには、アフィニティーリガンドマトリックスを複数回使用することが望ましい
。クロマトグラフィーサイクルの間に、マトリックス上の残留汚染物質の消毒および除去
のために徹底的な洗浄手順が必要である。この手順では、高濃度ＮａＯＨのアルカリ溶液
をアフィニティーリガンドマトリックスに施与することが一般的な慣行である。野生型タ
ンパク質Ａドメインは、そのような過酷なアルカリ性条件に長時間耐えることができず、
免疫グロブリンに対する結合能力を急速に失う。したがって、アルカリ性条件下での長時
間の処理に耐えることができる新規なＦｃ結合タンパク質を得るための継続した必要が当
該分野に存在する。
き出すためには、アフィニティーリガンドマトリックスを複数回使用することが望ましい
。クロマトグラフィーサイクルの間に、マトリックス上の残留汚染物質の消毒および除去
のために徹底的な洗浄手順が必要である。この手順では、高濃度ＮａＯＨのアルカリ溶液
をアフィニティーリガンドマトリックスに施与することが一般的な慣行である。野生型タ
ンパク質Ａドメインは、そのような過酷なアルカリ性条件に長時間耐えることができず、
免疫グロブリンに対する結合能力を急速に失う。したがって、アルカリ性条件下での長時
間の処理に耐えることができる新規なＦｃ結合タンパク質を得るための継続した必要が当
該分野に存在する。
【0006】
本発明は、免疫グロブリンのアフィニティー精製に特によく適しているにもかかわらず
、従来技術の欠点をも克服するＦｃ結合タンパク質を提供する。特に、本発明のＦｃ結合
タンパク質の重要な利点は、高ｐＨにおいてＦｃ結合能力を低減することなく長時間にわ
たる改善される安定性とともに高い動的結合能力である。さらに、この新規なＦｃ結合タ
ンパク質は、マトリックスに固定化されたＦｃ結合タンパク質から、３．５以上のｐＨに
おいて、結合されたＦｃタンパク質の９５％超の溶出が可能である。
、従来技術の欠点をも克服するＦｃ結合タンパク質を提供する。特に、本発明のＦｃ結合
タンパク質の重要な利点は、高ｐＨにおいてＦｃ結合能力を低減することなく長時間にわ
たる改善される安定性とともに高い動的結合能力である。さらに、この新規なＦｃ結合タ
ンパク質は、マトリックスに固定化されたＦｃ結合タンパク質から、３．５以上のｐＨに
おいて、結合されたＦｃタンパク質の９５％超の溶出が可能である。
【0007】
以上の概説は、本発明により解決される必ずしも全ての課題を記載しているわけではな
い。
い。
【発明の概要】
【0008】
本発明の第１の様相は、アフィニティー精製に適しているＦｃ結合タンパク質を提供す
ることである。これは、１つ以上のＦｃ結合ドメインを含んでいるＦｃ結合タンパク質を
用いて達成され、この１つ以上のＦｃ結合ドメインでは配列番号２に対応する位置４０、
４２、４３、４６、４７、４９、５０、５１、５３または５４での少なくとも１つのアミ
ノ酸がシステインである。ヘリックス３中の１つまたは２つのアミノ酸がシステインであ
ることが好ましい。
ることである。これは、１つ以上のＦｃ結合ドメインを含んでいるＦｃ結合タンパク質を
用いて達成され、この１つ以上のＦｃ結合ドメインでは配列番号２に対応する位置４０、
４２、４３、４６、４７、４９、５０、５１、５３または５４での少なくとも１つのアミ
ノ酸がシステインである。ヘリックス３中の１つまたは２つのアミノ酸がシステインであ
ることが好ましい。
【0009】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質は１つ以上のＦｃ結合ドメインを含んで
おり、少なくとも１つのドメインは配列番号２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも
８９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでおりまたはそれから本質的に成りまた
はそれから成り、その配列では配列番号２に対応する位置４０、４２、４３、４６、４７
、４９、５０、５１、５３または５４での少なくとも１つのアミノ酸がシステインである
。
おり、少なくとも１つのドメインは配列番号２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも
８９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでおりまたはそれから本質的に成りまた
はそれから成り、その配列では配列番号２に対応する位置４０、４２、４３、４６、４７
、４９、５０、５１、５３または５４での少なくとも１つのアミノ酸がシステインである
。
【0010】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのドメインは配列番号３～１６のアミノ酸配
列、またはそれらのそれぞれと少なくとも８９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含
んでおりまたはそれから本質的に成りまたはそれから成り、その配列では配列番号３～１
６に対応する位置４０、４２、４３、４６、４７、４９、５０、５１、５３または５４で
の少なくとも１つのアミノ酸がシステインである。
列、またはそれらのそれぞれと少なくとも８９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含
んでおりまたはそれから本質的に成りまたはそれから成り、その配列では配列番号３～１
６に対応する位置４０、４２、４３、４６、４７、４９、５０、５１、５３または５４で
の少なくとも１つのアミノ酸がシステインである。
【0011】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのドメインは配列番号７～８のアミノ酸配列
、またはそれらのそれぞれと少なくとも８９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含ん
でおりまたはそれから本質的に成りまたはそれから成り、その配列では配列番号７～８に
対応する位置４０、４２、４３、４６、４７、４９、５０、５１、５３または５４での少
なくとも１つのアミノ酸がシステインである。
、またはそれらのそれぞれと少なくとも８９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含ん
でおりまたはそれから本質的に成りまたはそれから成り、その配列では配列番号７～８に
対応する位置４０、４２、４３、４６、４７、４９、５０、５１、５３または５４での少
なくとも１つのアミノ酸がシステインである。
【0012】
いくつかの実施形態では、配列番号２に対応する位置４３、４６または４７での１つま
たは２つのアミノ酸はシステインであり、好ましくは位置４３、４６または４７での１つ
のアミノ酸はシステインであり、または位置４３および４６または４３および４７での２
つのアミノ酸はシステインである。
たは２つのアミノ酸はシステインであり、好ましくは位置４３、４６または４７での１つ
のアミノ酸はシステインであり、または位置４３および４６または４３および４７での２
つのアミノ酸はシステインである。
【0013】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのドメインは配列番号１７～７７、９０～９
９の群から選ばれたアミノ酸配列、またはそれらのそれぞれと少なくとも８９．５％の同
一性を有するアミノ酸配列を含んでおりまたはそれから本質的に成りまたはそれから成る
。
９の群から選ばれたアミノ酸配列、またはそれらのそれぞれと少なくとも８９．５％の同
一性を有するアミノ酸配列を含んでおりまたはそれから本質的に成りまたはそれから成る
。
【0014】
第２の様相では、本発明は第１の様相のＦｃ結合タンパク質を含んでいるアフィニティ
ー分離マトリックスに関する。
ー分離マトリックスに関する。
【0015】
第３の様相では、本発明は、第１の様相のＦｃ結合タンパク質の使用、または免疫グロ
ブリンまたは免疫グロブリンのＦｃ部分を含んでいるタンパク質をアフィニティー精製す
るための第２の様相のアフィニティー分離マトリックスの使用に関する。
ブリンまたは免疫グロブリンのＦｃ部分を含んでいるタンパク質をアフィニティー精製す
るための第２の様相のアフィニティー分離マトリックスの使用に関する。
【0016】
第４の様相では、本発明は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンのＦｃ部分を含んで
いるタンパク質のアフィニティー精製の方法であって、以下の工程を含む方法に関する：
（ａ）免疫グロブリンを含んでいる液体を準備する工程；
（ｂ）アフィニティー分離マトリックスにカップリングされた第１の様相の固定化された
Ｆｃ結合タンパク質を含んでいる当該アフィニティー分離マトリックスを準備する工程；
（ｃ）当該液体と当該アフィニティー分離マトリックスとを接触させて、当該免疫グロブ
リンが当該固定化されたＦｃ結合タンパク質に結合する工程；および
（ｄ）当該マトリックスから当該免疫グロブリンを溶出させ、それによって当該免疫グロ
ブリンを含んでいる溶出液を得る工程。
いるタンパク質のアフィニティー精製の方法であって、以下の工程を含む方法に関する：
（ａ）免疫グロブリンを含んでいる液体を準備する工程；
（ｂ）アフィニティー分離マトリックスにカップリングされた第１の様相の固定化された
Ｆｃ結合タンパク質を含んでいる当該アフィニティー分離マトリックスを準備する工程；
（ｃ）当該液体と当該アフィニティー分離マトリックスとを接触させて、当該免疫グロブ
リンが当該固定化されたＦｃ結合タンパク質に結合する工程；および
（ｄ）当該マトリックスから当該免疫グロブリンを溶出させ、それによって当該免疫グロ
ブリンを含んでいる溶出液を得る工程。
【0017】
本発明のこの概要は、必ずしも本発明の全ての特徴を説明するものではない。他の実施
形態は以下の詳細な説明の検討から明らかになる。
形態は以下の詳細な説明の検討から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1A】Ｃ末端ヘリカル領域（ヘリックス３）中にシステインを有するＦｃ結合ドメインのアミノ酸配列を示す図である。第１行の数字は、Ｆｃ結合ドメインの対応するアミノ酸の位置を指す。図１Ａは、配列番号２のＦｃ結合ドメインを示す図である。
【図1B】Ｃ末端ヘリカル領域（ヘリックス３）中にシステインを有するＦｃ結合ドメインのアミノ酸配列を示す図である。第１行の数字は、Ｆｃ結合ドメインの対応するアミノ酸の位置を指す。図１Ｂは、ヘリックス３中にＣｙｓを有するＦｃ結合ドメインの例を示す図である。
【図2A】ヘリックス３中にシステインを有するＦｃ結合ドメインの固定化を示す図である。図２Ａは、エポキシマトリックス上の位置４３、４６、４７、５０または５８にシステインを有するＩＢ１４タンパク質のカップリング効率を示す図である。Ｙ軸はナノモル／ｍｌ単位でのカップリングされたタンパク質の量を示す。
【図2B】ヘリックス３中にシステインを有するＦｃ結合ドメインの固定化を示す図である。図２Ｂは、エポキシ活性化されたセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）６Ｂマトリックスへのｃｓ１４ ４３Ｃおよびｃｓ１４ ４６Ｃのカップリングを示す図である。Ｙ軸はナノモル単位でのｎ（樹脂ｍｌ当たりのタンパク質の量）を示す。
【図3A】ヘリックス３３中にシステインを有するＦｃ結合タンパク質の苛性安定性を示す図である。図３Ａは、位置４３、４６、４７、５０または５８にシステインを有するＩＢ１４のアルカリ安定性の分析結果を示す。Ｙ軸はＦｃ結合タンパク質ＩＢ１４およびＣｙｓ変異体の％単位での残存ＩｇＧ結合活性である。灰色（ブランク）のカラム：６時間の連続的な０．５ＭのＮａＯＨ処理後のＩｇＧ結合活性。黒色（斜線）のカラム：ＮａＯＨを含まない場合のＩｇＧ結合活性。
【図3B】ヘリックス３３中にシステインを有するＦｃ結合タンパク質の苛性安定性を示す図である。図３Ｂは、位置４３または４６にシステインを有するｃｓ１４の苛性安定性およびＤＢＣ １０％を示す。Ｙ軸はＤＢＣ １０％（ｍｇ／ｍｌ）である。黒色（右上がりの斜線）：ＤＢＣ １０％（ｍｇ／ｍｌ）、０時間のＮａＯＨ処理。明るい灰色（ブランク）：ＤＢＣ １０％（ｍｇ／ｍｌ）、１８時間のＮａＯＨ処理。暗い灰色（右下がりの斜線）：ＤＢＣ １０％（ｍｇ／ｍｌ）、７２時間のＮａＯＨ処理。Ｃｙｓ変異体が、（位置５８の後に）Ｃ末端システインを有するｃｓ１４と、およびタンパク質Ａと、比較された。
【図4】６、２４および３６時間の連続的な０．５ＭのＮａＯＨ処理の後の（％単位での）残存結合能力がｃｓ２６ ４６Ｃについて示され、位置４６にＣｙｓを有しないｃｓ２６と比較され、および野生型タンパク質ＡドメインＣと比較される図である。Ｘ軸は、時間単位での０．５ＭのＮａＯＨインキュベーション時間を示す。
【図5】動的結合能力（ＤＢＣ；ｍｇ／ｍｌ）が、ｃｓ２６ ４６Ｃ（モノマーおよびダイマー）について示され、位置４６にＣｙｓを有しないｃｓ２６と比較され、および組み換え野生型タンパク質Ａと比較される図である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
定義
本発明が以下に詳細に記載される前に、本発明は、本明細書に記載された特定の方法、
プロトコルおよび試薬に限定されるものではなく、それらが変更可能であることが理解さ
れるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することの
みを目的とするものであり、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は添付
された特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。他様に定義
されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属す
る技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
本発明が以下に詳細に記載される前に、本発明は、本明細書に記載された特定の方法、
プロトコルおよび試薬に限定されるものではなく、それらが変更可能であることが理解さ
れるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することの
みを目的とするものであり、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は添付
された特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。他様に定義
されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属す
る技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【0020】
好ましくは、本明細書で使用される用語は、「バイオテクノロジー用語の多言語用語集
（ＩＵＰＡＣ勧告）（Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）
）」、Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｗ、Ｎａｇｅｌ，Ｂ．およびＫｏｌｂｌ，Ｈ．
編、（１９９５年）、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ社刊，スイス国、Ｂ
ａｓｅｌ、ＣＨ－４０１０）に規定された定義と一致している。
（ＩＵＰＡＣ勧告）（Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）
）」、Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｗ、Ｎａｇｅｌ，Ｂ．およびＫｏｌｂｌ，Ｈ．
編、（１９９５年）、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ社刊，スイス国、Ｂ
ａｓｅｌ、ＣＨ－４０１０）に規定された定義と一致している。
【0021】
本明細書および添付された特許請求の範囲の全体にわたって、文脈上別の必要がない限
り、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（を含んでいる）」の語および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「
ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などのその変化形は、記載された構成員、整数もしくは工程また
は構成員、整数もしくは工程の群の包含を意味するが、いかなる他の構成員、整数もしく
は工程または構成員、整数もしくは工程の群の排除をも意味するものではないことが理解
されるべきである。
り、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（を含んでいる）」の語および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「
ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などのその変化形は、記載された構成員、整数もしくは工程また
は構成員、整数もしくは工程の群の包含を意味するが、いかなる他の構成員、整数もしく
は工程または構成員、整数もしくは工程の群の排除をも意味するものではないことが理解
されるべきである。
【0022】
本発明の説明および添付された特許請求の範囲で使用される単数形の「ａ（１つの）」
、「ａｎ（１つの）」および「ｔｈｅ（その）」は互換的に使用され、文脈が明らかに他
様に指示しない限り、複数形も同様に含み、各意味の中に含まれることが意図されている
。また、本明細書で使用される「および／または」は、列挙された項目の１つ以上の任意
のおよび全ての可能な組合わせを指し、かつそれらを包含し、同様に選択枝（「または」
）に解釈される場合には組合わせの欠如を指している。本明細書で使用される用語「約」
は、明示的に記載された量とともにそれからの士１０％の偏差を包含する。より好ましく
は、偏差５％が用語「約」に包含される。
、「ａｎ（１つの）」および「ｔｈｅ（その）」は互換的に使用され、文脈が明らかに他
様に指示しない限り、複数形も同様に含み、各意味の中に含まれることが意図されている
。また、本明細書で使用される「および／または」は、列挙された項目の１つ以上の任意
のおよび全ての可能な組合わせを指し、かつそれらを包含し、同様に選択枝（「または」
）に解釈される場合には組合わせの欠如を指している。本明細書で使用される用語「約」
は、明示的に記載された量とともにそれからの士１０％の偏差を包含する。より好ましく
は、偏差５％が用語「約」に包含される。
【0023】
本明細書の本文全体に、いくつかの文書（たとえば、特許、特許出願、科学刊行物、製
造業者の仕様書等）が引用されている。本明細書中のいかなる記載も、本発明が従来発明
によってそのような開示物よりも先行する権利がないと認めるものとして解釈されてはな
らない。本明細書で引用される文書のいくつかは、「参照によって組み込まれる」ものと
して特徴付けられている。そのように組み込まれた文献の定義または教示と本明細書に記
載された定義または教示との間に矛盾がある場合には、本明細書の本文が優先される。
造業者の仕様書等）が引用されている。本明細書中のいかなる記載も、本発明が従来発明
によってそのような開示物よりも先行する権利がないと認めるものとして解釈されてはな
らない。本明細書で引用される文書のいくつかは、「参照によって組み込まれる」ものと
して特徴付けられている。そのように組み込まれた文献の定義または教示と本明細書に記
載された定義または教示との間に矛盾がある場合には、本明細書の本文が優先される。
【0024】
本明細書で言及される全ての配列は添付された配列表に開示されており、その配列表の
内容および開示の全体は本明細書の一部である。
内容および開示の全体は本明細書の一部である。
【0025】
本発明の文脈では、「Ｆｃ結合タンパク質」または「免疫グロブリン結合タンパク質」
または「Ｉｇ結合タンパク質」の用語は、免疫グロブリンのＦｃ領域に特異的に結合する
ことができるタンパク質を記載するために使用される。Ｆｃ結合タンパク質は、少なくと
も１つの「Ｆｃ結合ドメイン」または「免疫グロブリン結合ドメイン」または「Ｉｇ結合
ドメイン」を含んでおり、これはアミノ酸残基７～１９からのヘリックス１、アミノ酸残
基２３～３７からのヘリックス２およびアミノ酸残基４０～５５からのヘリックス３を有
する５８個のアミノ酸の３－ヘリックス束によって特徴付けられる。Ｆｃ結合ドメインは
、３－ヘリックス束構造を失うことなく、欠失、たとえばＮ末端での６個までのアミノ酸
またはＣ末端での４個までのアミノ酸の欠失を含んでいてもよい。
または「Ｉｇ結合タンパク質」の用語は、免疫グロブリンのＦｃ領域に特異的に結合する
ことができるタンパク質を記載するために使用される。Ｆｃ結合タンパク質は、少なくと
も１つの「Ｆｃ結合ドメイン」または「免疫グロブリン結合ドメイン」または「Ｉｇ結合
ドメイン」を含んでおり、これはアミノ酸残基７～１９からのヘリックス１、アミノ酸残
基２３～３７からのヘリックス２およびアミノ酸残基４０～５５からのヘリックス３を有
する５８個のアミノ酸の３－ヘリックス束によって特徴付けられる。Ｆｃ結合ドメインは
、３－ヘリックス束構造を失うことなく、欠失、たとえばＮ末端での６個までのアミノ酸
またはＣ末端での４個までのアミノ酸の欠失を含んでいてもよい。
【0026】
本明細書で理解される「免疫グロブリン」としては、哺乳動物ＩｇＧ、たとえば例とし
てヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ４、マウスＩｇＧ、ラットＩｇＧ、ヤギＩｇ
Ｇ、牛ＩｇＧ、ギニアＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＡおよびＦｃ領域を
含んでいる免疫グロブリン断片が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。Ｆｃ領
域への特異的な結合の故に、本発明の「Ｆｃ結合タンパク質」または「Ｉｇ結合タンパク
質」は、免疫グロブリンの全体に、およびＦｃ領域を含んでいる免疫グロブリン断片、免
疫グロブリンのＦｃ領域を含んでいる融合タンパク質、および免疫グロプリンのＦｃ領域
を含んでいるコンジュゲートに結合することができる。本発明のＦｃ結合タンパク質は免
疫グロブリンのＦｃ領域への特異的な結合を示すけれども、Ｆｃ結合タンパク質は低減さ
れた親和性でさらに他の領域、たとえば免疫グロブリンのＦａｂ領域に結合することがで
きることは排除されない。
てヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ４、マウスＩｇＧ、ラットＩｇＧ、ヤギＩｇ
Ｇ、牛ＩｇＧ、ギニアＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＡおよびＦｃ領域を
含んでいる免疫グロブリン断片が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。Ｆｃ領
域への特異的な結合の故に、本発明の「Ｆｃ結合タンパク質」または「Ｉｇ結合タンパク
質」は、免疫グロブリンの全体に、およびＦｃ領域を含んでいる免疫グロブリン断片、免
疫グロブリンのＦｃ領域を含んでいる融合タンパク質、および免疫グロプリンのＦｃ領域
を含んでいるコンジュゲートに結合することができる。本発明のＦｃ結合タンパク質は免
疫グロブリンのＦｃ領域への特異的な結合を示すけれども、Ｆｃ結合タンパク質は低減さ
れた親和性でさらに他の領域、たとえば免疫グロブリンのＦａｂ領域に結合することがで
きることは排除されない。
【0027】
本発明による用語「結合」は、好ましくは特異的結合に関する。「特異的結合」とは、
Ｆｃ結合タンパク質またはＦｃ結合ドメインが免疫グロブリンに、より強力に結合し、そ
れ故に他の非免疫グロプリン標的への結合に比較して特異的であることを意味する。
Ｆｃ結合タンパク質またはＦｃ結合ドメインが免疫グロブリンに、より強力に結合し、そ
れ故に他の非免疫グロプリン標的への結合に比較して特異的であることを意味する。
【0028】
用語「結合活性」は、本発明のＦｃ結合タンパク質が免疫グロプリンに結合する能力を
指す。たとえば、結合活性は、アルカリ処理の前および／または後に測定されることがで
きる。結合活性は、Ｆｃ結合タンパク質についてまたはマトリックスにカップリングされ
たＦｃ結合タンパク質、すなわち固定化結合タンパク質について測定されることができる
。
指す。たとえば、結合活性は、アルカリ処理の前および／または後に測定されることがで
きる。結合活性は、Ｆｃ結合タンパク質についてまたはマトリックスにカップリングされ
たＦｃ結合タンパク質、すなわち固定化結合タンパク質について測定されることができる
。
【0029】
用語「人工的」とは、天然に存在しない物体を指す、すなわちこの用語はヒトによって
製造されまたは改変されていない物体を指す。たとえば、ヒトによって（たとえば、遺伝
子工学、シャッフリング法または化学反応等によって実験室で）生成されまたは意図的に
改変されたポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、人工的である。
製造されまたは改変されていない物体を指す。たとえば、ヒトによって（たとえば、遺伝
子工学、シャッフリング法または化学反応等によって実験室で）生成されまたは意図的に
改変されたポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、人工的である。
【0030】
用語「解離定数」または「ＫＤ」とは、特異的結合アフィニティー（親和性）を定義す
る。本明細書で使用される用語「ＫＤ」（通常「モル／Ｌ」単位で測定され、「Ｍ」と略
称されることもある。）は、第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の特定の相互作
用の解離平衡定数を指すことが意図されている。本発明の文脈では、用語ＫＤは、Ｆｃ結
合タンパク質と免疫グロブリンとの間の結合アフィニティーを記述するために特に使用さ
れる。Ｆｃ結合タンパク質が、少なくとも１μＭ以下、または好ましくは１００ｎＭ以下
、より好ましくは５０ｎＭ以下、さらにより好ましくは１０ｎＭ以下の免疫グロブリンへ
の解離定数ＫＤを有するならば、本発明のＦｃ結合タンパク質は免疫グロブリンに結合し
ていると見なされる。
る。本明細書で使用される用語「ＫＤ」（通常「モル／Ｌ」単位で測定され、「Ｍ」と略
称されることもある。）は、第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の特定の相互作
用の解離平衡定数を指すことが意図されている。本発明の文脈では、用語ＫＤは、Ｆｃ結
合タンパク質と免疫グロブリンとの間の結合アフィニティーを記述するために特に使用さ
れる。Ｆｃ結合タンパク質が、少なくとも１μＭ以下、または好ましくは１００ｎＭ以下
、より好ましくは５０ｎＭ以下、さらにより好ましくは１０ｎＭ以下の免疫グロブリンへ
の解離定数ＫＤを有するならば、本発明のＦｃ結合タンパク質は免疫グロブリンに結合し
ていると見なされる。
【0031】
用語「タンパク質」および「ポリペプチド」とは、ペプチド結合によって連結された２
個以上のアミノ酸の任意の線状分子鎖を指し、生成物の特定の長さを指すものではない。
したがって、「ペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または２個以上のアミノ酸
の鎖を指すために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、用
語「ポリペプチド」は、任意のこれらの用語の代わりにまたは互換的に使用されることが
できる。用語「ポリペプチド」は、ポリペプチドの翻訳後修飾生成物を指すことも意図さ
れており、それには、当技術分野で周知のグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド
化、タンパク質分解切断、天然に存在しないアミノ酸による修飾および類似の修飾が含ま
れるが、これらに限定されない。したがって、２個以上のタンパク質ドメインを含んでい
るＩｇ結合タンパク質も、用語「タンパク質」または「ポリペプチド」の定義に含まれる
。
個以上のアミノ酸の任意の線状分子鎖を指し、生成物の特定の長さを指すものではない。
したがって、「ペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または２個以上のアミノ酸
の鎖を指すために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、用
語「ポリペプチド」は、任意のこれらの用語の代わりにまたは互換的に使用されることが
できる。用語「ポリペプチド」は、ポリペプチドの翻訳後修飾生成物を指すことも意図さ
れており、それには、当技術分野で周知のグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド
化、タンパク質分解切断、天然に存在しないアミノ酸による修飾および類似の修飾が含ま
れるが、これらに限定されない。したがって、２個以上のタンパク質ドメインを含んでい
るＩｇ結合タンパク質も、用語「タンパク質」または「ポリペプチド」の定義に含まれる
。
【0032】
用語「アルカリ安定性の」または「アルカリ安定性」または「苛性安定性の」または「
苛性安定性」（本明細書では「ｃｓ」とも略称される。）とは、免疫グロブリンに結合す
る能力が著しく損なわれないでアルカリ性条件に耐える本発明のＦｃ結合タンパク質の能
力を指す。この分野の当業者は、たとえば実施例に記載されたようにＦｃ結合タンパク質
を水酸化ナトリウム溶液でインキュベートし、当業者に知られている通常の実験、たとえ
ばクロマトグラフィー法を用いて、免疫グロブリンへの結合活性の試験を行うことによっ
て、アルカリ安定性を容易に試験することができる。
苛性安定性」（本明細書では「ｃｓ」とも略称される。）とは、免疫グロブリンに結合す
る能力が著しく損なわれないでアルカリ性条件に耐える本発明のＦｃ結合タンパク質の能
力を指す。この分野の当業者は、たとえば実施例に記載されたようにＦｃ結合タンパク質
を水酸化ナトリウム溶液でインキュベートし、当業者に知られている通常の実験、たとえ
ばクロマトグラフィー法を用いて、免疫グロブリンへの結合活性の試験を行うことによっ
て、アルカリ安定性を容易に試験することができる。
【0033】
本発明のＦｃ結合タンパク質とともに本発明のＦｃ結合タンパク質を含んでいるマトリ
ックスは、「増加した」または「改善された」アルカリ安定性を示し、これは、参照タン
パク質と比較して、当該Ｆｃ結合タンパク質を組み込んでいる分子およびマトリックスが
長時間にわたってアルカリ性条件下で安定であることを意味する。
ックスは、「増加した」または「改善された」アルカリ安定性を示し、これは、参照タン
パク質と比較して、当該Ｆｃ結合タンパク質を組み込んでいる分子およびマトリックスが
長時間にわたってアルカリ性条件下で安定であることを意味する。
【0034】
本明細書で使用される用語「親タンパク質」または「親ドメイン」における用語「親」
とは、Ｆｃ結合タンパク質を指し、これはその後に改変されて、当該親タンパク質または
ドメインの変異体を生成する。当該親タンパク質またはドメインは、人工的ドメイン（た
とえば、これらに限定されないが配列番号７８～８３）、天然型の黄色ブドウ球菌（Ｓｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）タンパク質Ａドメイン（たとえば、ドメイン
Ｃについて配列番号８４、ドメインＢについて配列番号８５）、または天然型の黄色ブド
ウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）タンパク質Ａドメインの変異体
もしくは遺伝子組み換え版（たとえば、ドメインＺについて配列番号８６）であってもよ
い。
とは、Ｆｃ結合タンパク質を指し、これはその後に改変されて、当該親タンパク質または
ドメインの変異体を生成する。当該親タンパク質またはドメインは、人工的ドメイン（た
とえば、これらに限定されないが配列番号７８～８３）、天然型の黄色ブドウ球菌（Ｓｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）タンパク質Ａドメイン（たとえば、ドメイン
Ｃについて配列番号８４、ドメインＢについて配列番号８５）、または天然型の黄色ブド
ウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）タンパク質Ａドメインの変異体
もしくは遺伝子組み換え版（たとえば、ドメインＺについて配列番号８６）であってもよ
い。
【0035】
本明細書で使用される用語「変異体」は、Ｆｃ結合タンパク質またはドメインのアミノ
酸配列であって、別のアミノ酸配列と少なくとも1個のアミノ酸の置換、欠失または挿入
の分だけ異なっているアミノ酸配列を含んでいる。これらの改変は、遺伝子工学によって
、または人によって行なわれた化学合成または化学反応によって生成されてもよい。たと
えば、配列番号２７（ｃｓ２６ Ａ４６Ｃ）は配列番号７（ｃｓ２６）の変異体である。
酸配列であって、別のアミノ酸配列と少なくとも1個のアミノ酸の置換、欠失または挿入
の分だけ異なっているアミノ酸配列を含んでいる。これらの改変は、遺伝子工学によって
、または人によって行なわれた化学合成または化学反応によって生成されてもよい。たと
えば、配列番号２７（ｃｓ２６ Ａ４６Ｃ）は配列番号７（ｃｓ２６）の変異体である。
【0036】
本明細書で使用される用語「コンジュゲート」は、少なくとも１つの第１のタンパク質
が他の物質、たとえば第２のタンパク質または非タンパク質性部分に化学的に付加された
ものを含んでいる、またはそれから本質的に成る分子に関する。
が他の物質、たとえば第２のタンパク質または非タンパク質性部分に化学的に付加された
ものを含んでいる、またはそれから本質的に成る分子に関する。
【0037】
用語「改変」または「アミノ酸改変」とは、親ポリペプチド配列内の特定の位置でのア
ミノ酸の、別のアミノ酸との交換、欠失または挿入に関する。公知の遺伝子コードならび
に組換えおよび合成ＤＮＡ技術を所与として、当業者はアミノ酸変異体をコードするＤＮ
Ａを容易に構築することができる。
ミノ酸の、別のアミノ酸との交換、欠失または挿入に関する。公知の遺伝子コードならび
に組換えおよび合成ＤＮＡ技術を所与として、当業者はアミノ酸変異体をコードするＤＮ
Ａを容易に構築することができる。
【0038】
用語「置換」または「アミノ酸置換」とは、親ポリペプチド配列内の特定の位置でのア
ミノ酸の別のアミノ酸による交換を指す。たとえば、置換Ｇ４６Ｃとは、位置４６でのグ
リシンがシステインによって置き換えられたＦｃ結合タンパク質を指す。この例の場合、
４６Ｃは位置４６でのシステインを指す。本明細書の目的のためには、多数の置換は、典
型的にはスラッシュによって分けられる。たとえば、Ａ１Ｉ／Ｓ１１Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ａ４
６Ｃは、置換Ａ１Ｉ、Ｓ１１Ａ、Ｋ３５ＲおよびＡ４６Ｃの組み合わせを含む変異体を指
す。
ミノ酸の別のアミノ酸による交換を指す。たとえば、置換Ｇ４６Ｃとは、位置４６でのグ
リシンがシステインによって置き換えられたＦｃ結合タンパク質を指す。この例の場合、
４６Ｃは位置４６でのシステインを指す。本明細書の目的のためには、多数の置換は、典
型的にはスラッシュによって分けられる。たとえば、Ａ１Ｉ／Ｓ１１Ａ／Ｋ３５Ｒ／Ａ４
６Ｃは、置換Ａ１Ｉ、Ｓ１１Ａ、Ｋ３５ＲおよびＡ４６Ｃの組み合わせを含む変異体を指
す。
【0039】
用語「欠失」または「アミノ酸欠失」とは、親ポリペプチド配列内の特定の位置でのア
ミノ酸の除去を指す。
ミノ酸の除去を指す。
【0040】
用語「挿入」または「アミノ酸挿入」とは、親ポリペプチド配列へのアミノ酸の付加を
指す。
指す。
【0041】
【0042】
用語「アミノ酸配列同一性」とは、２つ以上のタンパク質のアミノ酸配列の同一性（ま
たは差異）の定量的比較を指す。参照ポリペプチド配列に対して「パーセント（％）アミ
ノ酸配列同一性」または「パーセント同一の」または「パーセント同一性」とは、２つの
配列のアラインメントをし、必要に応じてギャップを導入して、最大パーセントの配列同
一性を達成した後の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一であるその配列中の
アミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。
たは差異）の定量的比較を指す。参照ポリペプチド配列に対して「パーセント（％）アミ
ノ酸配列同一性」または「パーセント同一の」または「パーセント同一性」とは、２つの
配列のアラインメントをし、必要に応じてギャップを導入して、最大パーセントの配列同
一性を達成した後の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一であるその配列中の
アミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。
【0043】
配列同一性を決定するためには、照会のタンパク質の配列を参照タンパク質の配列とア
ラインメントする。アラインメントの方法は、当技術分野において周知である。たとえば
、参照アミノ酸配列に対する任意のポリペプチドのアミノ酸配列同一性の程度を決定する
ためには、ＳＩＭ局所類似性プログラムが好ましくは使用され（Ｘｉａｏｑｕｉｎ Ｈｕ
ａｎｇおよびＷｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ（１９９１年）、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ、第１２巻、３３７～３５７頁）、これは無料で入手で
きる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｓｉｍ－ｐｒｏｔ．
ｈｔｍｌも参照せよ。）。多重アラインメント分析のためには、ＣｌｕｓｔａｌＷが好ま
しくは使用される（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、（１９９４年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．、第２２巻、４６７３～４６８０頁）。好ましくは、配列同一性パーセンテージ
を計算するときに、ＳＩＭ局所類似性プログラムまたはＣｌｕｓｔａｌＷのデフォルトパ
ラメーターが使用される。
ラインメントする。アラインメントの方法は、当技術分野において周知である。たとえば
、参照アミノ酸配列に対する任意のポリペプチドのアミノ酸配列同一性の程度を決定する
ためには、ＳＩＭ局所類似性プログラムが好ましくは使用され（Ｘｉａｏｑｕｉｎ Ｈｕ
ａｎｇおよびＷｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ（１９９１年）、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ、第１２巻、３３７～３５７頁）、これは無料で入手で
きる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｓｉｍ－ｐｒｏｔ．
ｈｔｍｌも参照せよ。）。多重アラインメント分析のためには、ＣｌｕｓｔａｌＷが好ま
しくは使用される（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、（１９９４年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．、第２２巻、４６７３～４６８０頁）。好ましくは、配列同一性パーセンテージ
を計算するときに、ＳＩＭ局所類似性プログラムまたはＣｌｕｓｔａｌＷのデフォルトパ
ラメーターが使用される。
【0044】
本発明の文脈では、配列同一性の程度は一般に、明示的に別段の断りがなければ、改変
されていない配列の全長に対して計算される。
されていない配列の全長に対して計算される。
【0045】
所与の位置での参照アミノ酸配列と異なる照会配列の各アミノ酸は、１つの差異として
数えられる。差異の合計が次に参照配列の長さに関連付けられて、非同一性のパーセンテ
ージが得られる。同一性の定量的パーセンテージは、１００から非同一性のパーセンテー
ジを差し引いたものとして計算される。
数えられる。差異の合計が次に参照配列の長さに関連付けられて、非同一性のパーセンテ
ージが得られる。同一性の定量的パーセンテージは、１００から非同一性のパーセンテー
ジを差し引いたものとして計算される。
【0046】
本明細書で使用される語句「パーセント同一の」または「パーセント（％）アミノ酸配
列同一性」または「パーセント同一性」は、２つのポリペプチド配列の文脈では、最大の
一致となるように比較されアラインメントされたときに、以下の配列比較アルゴリズムを
使用して測定されてまたは目視検査されて、いくつかの実施形態では少なくとも約８０％
の、いくつかの実施形態では少なくとも８２％の、いくつかの実施形態では少なくとも８
４％の、いくつかの実施形態では少なくとも８６％の、いくつかの実施形態では少なくと
も８７％の、いくつかの実施形態では少なくとも８９．５％の、いくつかの実施形態では
少なくとも９１％の、いくつかの実施形態では少なくとも９３％の、いくつかの実施形態
では少なくとも９４％の、いくつかの実施形態では少なくとも９６％の、いくつかの実施
形態では少なくとも９８％の、およびいくつかの実施形態では１００％の、アミノ酸残基
の同一性を有する２つ以上の配列または部分配列を指す。明確にするために言うと、たと
えば少なくとも８９．５％の同一性を有する配列は、８９．５％の同一性よりも高い同一
性、たとえば少なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９６
％、少なくとも９８％、１００％を有する実施形態の全ての配列を含む。
列同一性」または「パーセント同一性」は、２つのポリペプチド配列の文脈では、最大の
一致となるように比較されアラインメントされたときに、以下の配列比較アルゴリズムを
使用して測定されてまたは目視検査されて、いくつかの実施形態では少なくとも約８０％
の、いくつかの実施形態では少なくとも８２％の、いくつかの実施形態では少なくとも８
４％の、いくつかの実施形態では少なくとも８６％の、いくつかの実施形態では少なくと
も８７％の、いくつかの実施形態では少なくとも８９．５％の、いくつかの実施形態では
少なくとも９１％の、いくつかの実施形態では少なくとも９３％の、いくつかの実施形態
では少なくとも９４％の、いくつかの実施形態では少なくとも９６％の、いくつかの実施
形態では少なくとも９８％の、およびいくつかの実施形態では１００％の、アミノ酸残基
の同一性を有する２つ以上の配列または部分配列を指す。明確にするために言うと、たと
えば少なくとも８９．５％の同一性を有する配列は、８９．５％の同一性よりも高い同一
性、たとえば少なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９６
％、少なくとも９８％、１００％を有する実施形態の全ての配列を含む。
【0047】
パーセント同一性は、いくつかの実施形態では少なくとも５０残基数の領域にわたって
、少なくとも５２残基数にわたって、いくつかの実施形態では少なくとも５３残基数の領
域にわたって、いくつかの実施形態では少なくとも５４残基数の領域にわたって、いくつ
かの実施形態では少なくとも５５残基数の領域にわたって、いくつかの実施形態では少な
くとも５６残基数の領域にわたって、いくつかの実施形態では少なくとも５７残基数の領
域にわたって、およびいくつかの実施形態では少なくとも５８残基数の領域にわたって存
在する。
、少なくとも５２残基数にわたって、いくつかの実施形態では少なくとも５３残基数の領
域にわたって、いくつかの実施形態では少なくとも５４残基数の領域にわたって、いくつ
かの実施形態では少なくとも５５残基数の領域にわたって、いくつかの実施形態では少な
くとも５６残基数の領域にわたって、いくつかの実施形態では少なくとも５７残基数の領
域にわたって、およびいくつかの実施形態では少なくとも５８残基数の領域にわたって存
在する。
【0048】
用語「融合され」とは、成分がペプチド結合によって、直接的にあるいはペプチドリン
カーを介してのいずれかで、連結されていることを意味する。
カーを介してのいずれかで、連結されていることを意味する。
【0049】
用語「融合タンパク質」とは、少なくとも１つの第２タンパク質に遺伝子的に連結され
た少なくとも１つの第１のタンパク質を含んでいるタンパク質に関する。融合タンパク質
は、元々は別々のタンパク質のためにコードされた２つ以上の遺伝子が連結されることに
よって作り出される。したがって、融合タンパク質は、単一の線状ポリペプチドとして発
現される、同一のまたは異なるタンパク質の多量体を含んでいることがある。
た少なくとも１つの第１のタンパク質を含んでいるタンパク質に関する。融合タンパク質
は、元々は別々のタンパク質のためにコードされた２つ以上の遺伝子が連結されることに
よって作り出される。したがって、融合タンパク質は、単一の線状ポリペプチドとして発
現される、同一のまたは異なるタンパク質の多量体を含んでいることがある。
【0050】
本明細書中で使用される用語「リンカー」とは、その最も広い意味において、少なくと
も２つの他の分子を共有結合で連結する分子を指す。本発明の典型的な実施形態では、「
リンカー」は、Ｆｃ結合ドメインを少なくとも１つのさらなるＦｃ結合ドメインと結合す
る部分、すなわち２つのタンパク質ドメインを互いに連結して多重体を生成する部分とし
て理解されるべきである。好ましい実施形態では、「リンカー」はペプチドリンカー、す
なわち２つのタンパク質ドメインを連結する部分が、１つの単一アミノ酸または２つ以上
のアミノ酸を含んでいるペプチドである。
も２つの他の分子を共有結合で連結する分子を指す。本発明の典型的な実施形態では、「
リンカー」は、Ｆｃ結合ドメインを少なくとも１つのさらなるＦｃ結合ドメインと結合す
る部分、すなわち２つのタンパク質ドメインを互いに連結して多重体を生成する部分とし
て理解されるべきである。好ましい実施形態では、「リンカー」はペプチドリンカー、す
なわち２つのタンパク質ドメインを連結する部分が、１つの単一アミノ酸または２つ以上
のアミノ酸を含んでいるペプチドである。
【0051】
用語「クロマトグラフィー」とは、移動相および固定相を用いて、サンプル中の１つの
種類の分子（たとえば、免疫グロブリン）を他の分子（たとえば、混入物質）から分離す
るための分離技術を指す。液体移動相は、分子の混合物を含み、固定相（たとえば、固体
マトリックス）を横断させてまたはその中を通してそれらを移送する。移動相中の異なる
複数の分子の固定相との差分的な相互作用に起因して、移動相中の複数の分子が分離され
ることができる。
種類の分子（たとえば、免疫グロブリン）を他の分子（たとえば、混入物質）から分離す
るための分離技術を指す。液体移動相は、分子の混合物を含み、固定相（たとえば、固体
マトリックス）を横断させてまたはその中を通してそれらを移送する。移動相中の異なる
複数の分子の固定相との差分的な相互作用に起因して、移動相中の複数の分子が分離され
ることができる。
【0052】
用語「アフィニティークロマトグラフィー」とは、クロマトグラフィーの特定の様式を
指し、この様式では、固定相にカップリングされたリガンドが移動相（サンプル）中の分
子（すなわち、免疫グロブリン）と相互作用する、すなわちリガンドは精製されるべき分
子に対して特異的な結合親和性を有する。本発明の文脈において理解されるように、アフ
ィニティークロマトグラフィーは、クロマトグラフィーリガンド、たとえば本発明のＦｃ
結合タンパク質を含んでいる固定相に、免疫グロブリンを含有するサンプルを添加するこ
とに関する。
用語「固体支持体」または「固体マトリックス」は、固定相と互換的に使用される。
指し、この様式では、固定相にカップリングされたリガンドが移動相（サンプル）中の分
子（すなわち、免疫グロブリン）と相互作用する、すなわちリガンドは精製されるべき分
子に対して特異的な結合親和性を有する。本発明の文脈において理解されるように、アフ
ィニティークロマトグラフィーは、クロマトグラフィーリガンド、たとえば本発明のＦｃ
結合タンパク質を含んでいる固定相に、免疫グロブリンを含有するサンプルを添加するこ
とに関する。
用語「固体支持体」または「固体マトリックス」は、固定相と互換的に使用される。
【0053】
本明細書で互換的に使用される用語「アフィニティーマトリックス」または「アフィニ
ティー分離マトリックス」または「アフィニティークロマトグラフィーマトリックス」は
、アフィニティーリガンド、たとえば本発明のＦｃ結合タンパク質が付着されたマトリッ
クス、たとえばクロマトグラフィーマトリックスを指す。リガンド（たとえば、Ｆｃ結合
タンパク質）は、目的の分子（たとえば、上で定義された免疫グロブリン）に特異的に結
合して、目的の分子が精製されまたは混合物から除去されることができる。
ティー分離マトリックス」または「アフィニティークロマトグラフィーマトリックス」は
、アフィニティーリガンド、たとえば本発明のＦｃ結合タンパク質が付着されたマトリッ
クス、たとえばクロマトグラフィーマトリックスを指す。リガンド（たとえば、Ｆｃ結合
タンパク質）は、目的の分子（たとえば、上で定義された免疫グロブリン）に特異的に結
合して、目的の分子が精製されまたは混合物から除去されることができる。
【0054】
本明細書で使用される用語「アフィニティー精製」とは、マトリックスに固定化された
Ｆｃ結合タンパク質に上で定義された免疫グロブリンを結合させることによって、液体か
ら上で定義された免疫グロブリンを精製する方法を指す。それによって、免疫グロブリン
以外の混合物の他の全ての成分が除去される。さらなる工程では、結合された免疫グロブ
リンは、精製された形態で溶出される。
Ｆｃ結合タンパク質に上で定義された免疫グロブリンを結合させることによって、液体か
ら上で定義された免疫グロブリンを精製する方法を指す。それによって、免疫グロブリン
以外の混合物の他の全ての成分が除去される。さらなる工程では、結合された免疫グロブ
リンは、精製された形態で溶出される。
【0055】
本発明の実施形態
本発明がこれからさらに説明される。以下の節では、本発明の様々な様相がより詳細に
定義される。以下に定義される各様相は、明確に反対の表示がない限り、１または複数の
任意の他の様相と組み合わされることができる。特に、好ましいまたは有利であると示さ
れる任意の特徴は、好ましいまたは有利であると示される１または複数の他の任意の特徴
と組み合わされることができる。
本発明がこれからさらに説明される。以下の節では、本発明の様々な様相がより詳細に
定義される。以下に定義される各様相は、明確に反対の表示がない限り、１または複数の
任意の他の様相と組み合わされることができる。特に、好ましいまたは有利であると示さ
れる任意の特徴は、好ましいまたは有利であると示される１または複数の他の任意の特徴
と組み合わされることができる。
【0056】
第１の様相では、本発明はＦｃ結合タンパク質に関し、配列番号２に対応する位置４０
、４２、４３、４６、４７、４９、５０、５１、５３または５４での少なくとも１つのア
ミノ酸がシステインであり、好ましくは配列番号２に対応する位置４０、４２、４３、４
６、４７、４９、５０、５１、５３および５４の群から選択された１つの位置でのアミノ
酸がシステインである。第１の様相の１つの実施形態では、配列番号２に対応する位置４
３でのアミノ酸、位置４６でのアミノ酸、位置４７でのアミノ酸、位置５０でのアミノ酸
、位置５１でのアミノ酸または位置５３でのアミノ酸がシステインである。
、４２、４３、４６、４７、４９、５０、５１、５３または５４での少なくとも１つのア
ミノ酸がシステインであり、好ましくは配列番号２に対応する位置４０、４２、４３、４
６、４７、４９、５０、５１、５３および５４の群から選択された１つの位置でのアミノ
酸がシステインである。第１の様相の１つの実施形態では、配列番号２に対応する位置４
３でのアミノ酸、位置４６でのアミノ酸、位置４７でのアミノ酸、位置５０でのアミノ酸
、位置５１でのアミノ酸または位置５３でのアミノ酸がシステインである。
【0057】
第１の様相では、Ｆｃタンパク質は１つ以上のドメインを含んでおり、少なくとも１つ
のドメインは、配列番号２のアミノ酸配列または少なくとも８０％、少なくとも８１％、
少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくと
も８９．５％、少なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９
６％、少なくとも９８％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでおり、ま
たはそれから本質的に成り、またはそれから成り、配列番号２に対応する位置４０、４２
、４３、４６、４７、５０、５１、５３または５４での少なくとも１つのアミノ酸がシス
テインである。２つ以下のシステイン残基が、配列番号２～８６、９０～９９またはそれ
らと少なくとも８９．５％の同一性を有するアミノ酸配列のヘリックス３の中にあること
が好ましい。
のドメインは、配列番号２のアミノ酸配列または少なくとも８０％、少なくとも８１％、
少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくと
も８９．５％、少なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９
６％、少なくとも９８％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでおり、ま
たはそれから本質的に成り、またはそれから成り、配列番号２に対応する位置４０、４２
、４３、４６、４７、５０、５１、５３または５４での少なくとも１つのアミノ酸がシス
テインである。２つ以下のシステイン残基が、配列番号２～８６、９０～９９またはそれ
らと少なくとも８９．５％の同一性を有するアミノ酸配列のヘリックス３の中にあること
が好ましい。
【0058】
本発明のＦｃ結合ドメインは、典型的にはアミノ酸残基７～１９からのヘリックス１、
アミノ酸残基２３～３７からのヘリックス２およびアミノ酸残基４０～５５からのヘリッ
クス３を有する５８個のアミノ酸の３つのヘリックス束として理解される。Ｆｃ結合はヘ
リックス１およびヘリックス２によって介在される。ヘリックス３の中にシステインを有
するＦｃ結合タンパク質の驚くべき利点は、それが、Ｆｃ結合特性を損なわずに、かつ高
い結合能力を提供するマトリックスへの部位特異的なカップリング効率とともに長時間に
わたるアルカリ安定性を与えることである。本発明のＦｃ結合タンパク質は、少なくとも
６時間から少なくとも７２時間にわたる０．５ＭのＮａＯＨ中でインキュベートされた後
でも、結合能力の低下は２０％未満である。たとえば、マトリックスが数回使用されるこ
とができるように、高いＮａＯＨ濃度のアルカリ溶液を使用してマトリックス上の汚染物
質を除去するクリーニング方法を用いるクロマトグラフィーの取り組みにとって、この特
徴は重要である。さらに、高い苛性安定性を有することに加えて、ヘリックス３の中にＣ
ｙｓを有するＦｃ結合タンパク質は高いカップリング効率を示す。
例として、たとえば位置４６にＣｙｓを有する変異体の動的結合能力は、組換えタンパク
質Ａと比較して優れている（図５を参照せよ）。
アミノ酸残基２３～３７からのヘリックス２およびアミノ酸残基４０～５５からのヘリッ
クス３を有する５８個のアミノ酸の３つのヘリックス束として理解される。Ｆｃ結合はヘ
リックス１およびヘリックス２によって介在される。ヘリックス３の中にシステインを有
するＦｃ結合タンパク質の驚くべき利点は、それが、Ｆｃ結合特性を損なわずに、かつ高
い結合能力を提供するマトリックスへの部位特異的なカップリング効率とともに長時間に
わたるアルカリ安定性を与えることである。本発明のＦｃ結合タンパク質は、少なくとも
６時間から少なくとも７２時間にわたる０．５ＭのＮａＯＨ中でインキュベートされた後
でも、結合能力の低下は２０％未満である。たとえば、マトリックスが数回使用されるこ
とができるように、高いＮａＯＨ濃度のアルカリ溶液を使用してマトリックス上の汚染物
質を除去するクリーニング方法を用いるクロマトグラフィーの取り組みにとって、この特
徴は重要である。さらに、高い苛性安定性を有することに加えて、ヘリックス３の中にＣ
ｙｓを有するＦｃ結合タンパク質は高いカップリング効率を示す。
例として、たとえば位置４６にＣｙｓを有する変異体の動的結合能力は、組換えタンパク
質Ａと比較して優れている（図５を参照せよ）。
【0059】
ヘリックス３の中にシステインを有する好ましいＦｃ結合タンパク質
いくつかの実施形態は、配列番号１～８６、９０～９９から成る群から選ばれたアミノ
酸を有する配列に関する。いくつかの実施形態は、配列番号１～８６、９０～９９から成
る群から選ばれたアミノ酸と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、
少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８９．５％、少な
くとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９４．５％、少なくとも９６％、少なくと
も９８％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列に関し、但しそれらが、位置
４０、４２、４３、４６、４７、４９、５０、５１、５３または５４の中に少なくとも１
つのシステインを有することを条件とする。好ましいのは、位置４０、４２、４３、４６
、４７、４９、５０、５１、５３または５４に、好ましくは位置４３または／および４６
に、より好ましくは位置４６に少なくとも１つのシステインを有する配列番号１～８６、
９０～９９から成る群から選ばれたアミノ酸と、少なくとも８９．５％の同一性を有する
配列を有する実施形態である。好ましいのは、ヘリックス３の中に１つまたは２つのシス
テインを有するＦｃ結合タンパク質の実施形態である。
いくつかの実施形態は、配列番号１～８６、９０～９９から成る群から選ばれたアミノ
酸を有する配列に関する。いくつかの実施形態は、配列番号１～８６、９０～９９から成
る群から選ばれたアミノ酸と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、
少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８９．５％、少な
くとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９４．５％、少なくとも９６％、少なくと
も９８％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列に関し、但しそれらが、位置
４０、４２、４３、４６、４７、４９、５０、５１、５３または５４の中に少なくとも１
つのシステインを有することを条件とする。好ましいのは、位置４０、４２、４３、４６
、４７、４９、５０、５１、５３または５４に、好ましくは位置４３または／および４６
に、より好ましくは位置４６に少なくとも１つのシステインを有する配列番号１～８６、
９０～９９から成る群から選ばれたアミノ酸と、少なくとも８９．５％の同一性を有する
配列を有する実施形態である。好ましいのは、ヘリックス３の中に１つまたは２つのシス
テインを有するＦｃ結合タンパク質の実施形態である。
【0060】
本発明のＦｃ結合タンパク質のアミノ酸配列は、さらなる改変、たとえば挿入、欠失ま
たはさらなる置換を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃ結合ドメインは１
、２、３、４、５または６つのさらなる置換を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ結
合ドメインは、そのＮ末端の最初の４つのアミノ酸以内に１、２、３または４つのアミノ
酸の欠失および／またはＣ末端に１つまたは２つのアミノ酸の欠失を有する。いくつかの
実施形態では、Ｆｃ結合ドメインは、Ｎ末端に、たとえば位置１、２および４にまたは位
置１、２および３に欠失を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ結合ドメインは、Ｃ末
端に、たとえば位置５７および／または５８に（たとえば、配列番号３３～３４に限定さ
れないが、配列番号３３～３４に示されたように）欠失を有する。いくつかの実施形態は
、上記の配列番号（たとえば、配列番号１～８６、９０～９９に限定されないが、配列番
号１～８６、９０～９９）のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも８９．５％の配列同一
性を有するアミノ酸配列に関する。位置４０、４２、４３、４６、４７、４９、５０、５
１、５３または５４に少なくとも１つのＣｙｓ、好ましくは１つのＣｙｓを有するＦｃ結
合ドメインの例は、たとえば図１に示されたアミノ酸配列を含むが、これに限定されない
。
たはさらなる置換を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃ結合ドメインは１
、２、３、４、５または６つのさらなる置換を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ結
合ドメインは、そのＮ末端の最初の４つのアミノ酸以内に１、２、３または４つのアミノ
酸の欠失および／またはＣ末端に１つまたは２つのアミノ酸の欠失を有する。いくつかの
実施形態では、Ｆｃ結合ドメインは、Ｎ末端に、たとえば位置１、２および４にまたは位
置１、２および３に欠失を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ結合ドメインは、Ｃ末
端に、たとえば位置５７および／または５８に（たとえば、配列番号３３～３４に限定さ
れないが、配列番号３３～３４に示されたように）欠失を有する。いくつかの実施形態は
、上記の配列番号（たとえば、配列番号１～８６、９０～９９に限定されないが、配列番
号１～８６、９０～９９）のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも８９．５％の配列同一
性を有するアミノ酸配列に関する。位置４０、４２、４３、４６、４７、４９、５０、５
１、５３または５４に少なくとも１つのＣｙｓ、好ましくは１つのＣｙｓを有するＦｃ結
合ドメインの例は、たとえば図１に示されたアミノ酸配列を含むが、これに限定されない
。
【0061】
配列番号７（ｃｓ２６）および変異体
いくつかの実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列の、また
はそれと少なくとも８９．５％の同一性を有する、位置４０、４２、４３、４６、４７、
４９、５０、５１、５３または５４でのシステインによる改変に適したアミノ酸配列の、
１つ以上のドメインを含んでいる。たとえば、配列番号７に少なくとも８９．５％の同一
性を有するアミノ酸配列はｃｓ２４（配列番号８）を含んでいるが、これに限定されない
。位置４０、４２、４３、４６、４７、４９、５０、５１、５３または５４にＣｙｓを有
するｃｓ２６の変異体の例は、たとえば配列番号２６～３９および９０～９９を含んでい
るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列の、また
はそれと少なくとも８９．５％の同一性を有する、位置４０、４２、４３、４６、４７、
４９、５０、５１、５３または５４でのシステインによる改変に適したアミノ酸配列の、
１つ以上のドメインを含んでいる。たとえば、配列番号７に少なくとも８９．５％の同一
性を有するアミノ酸配列はｃｓ２４（配列番号８）を含んでいるが、これに限定されない
。位置４０、４２、４３、４６、４７、４９、５０、５１、５３または５４にＣｙｓを有
するｃｓ２６の変異体の例は、たとえば配列番号２６～３９および９０～９９を含んでい
るが、これらに限定されない。
【0062】
配列番号８（ｃｓ２６）および変異体
いくつかの実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列の、また
それと少なくとも８９．５％の同一性を有する、位置４０、４２、４３、４６、４７、４
９、５０、５１、５３または５４でのシステインによる改変に適したアミノ酸配列の、１
つ以上のドメインを含んでいる。たとえば、配列番号８に少なくとも８９．５％の同一性
を有するアミノ酸配列はｃｓ２６（配列番号７）を含んでいるが、これに限定されない。
位置４０、４２、４３、４６、４７、４９、５０、５１、５３または５４にＣｙｓを有す
るｃｓ２６の変異体の例は、たとえば配列番号２６～３９および９０～９９を含んでいる
が、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列の、また
それと少なくとも８９．５％の同一性を有する、位置４０、４２、４３、４６、４７、４
９、５０、５１、５３または５４でのシステインによる改変に適したアミノ酸配列の、１
つ以上のドメインを含んでいる。たとえば、配列番号８に少なくとも８９．５％の同一性
を有するアミノ酸配列はｃｓ２６（配列番号７）を含んでいるが、これに限定されない。
位置４０、４２、４３、４６、４７、４９、５０、５１、５３または５４にＣｙｓを有す
るｃｓ２６の変異体の例は、たとえば配列番号２６～３９および９０～９９を含んでいる
が、これらに限定されない。
【0063】
配列番号３（ｃｓ１４）および変異体
いくつかの実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列の、また
それと少なくとも８９．５％の同一性を有する、位置４０、４２、４３、４６、４７、４
９、５０、５１、５３または５４でのシステインによる改変に適したアミノ酸配列の１つ
以上のドメインを含んでいる。たとえば、配列番号３に少なくとも８９．５％の同一性を
有するアミノ酸配列は、配列番号１０（ｃｓ２５）、配列番号１１（ｃｓ４７ｈ３）、配
列番号１２（ｃｓ４７ｈ４）、配列番号１３（ｃｓ７４ｈ１）および配列番号１４（ｃｓ
７４ｈ２）を含んでいるが、これらに限定されない。位置４０、４２、４３、４６、４７
、４９、５０、５１、５３または５４にＣｙｓを有するｃｓ１４の変異体の例は、たとえ
ば配列番号1７～２０、４０～５２、６４、６５、７０、７１および７４～７６を含んで
いるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列の、また
それと少なくとも８９．５％の同一性を有する、位置４０、４２、４３、４６、４７、４
９、５０、５１、５３または５４でのシステインによる改変に適したアミノ酸配列の１つ
以上のドメインを含んでいる。たとえば、配列番号３に少なくとも８９．５％の同一性を
有するアミノ酸配列は、配列番号１０（ｃｓ２５）、配列番号１１（ｃｓ４７ｈ３）、配
列番号１２（ｃｓ４７ｈ４）、配列番号１３（ｃｓ７４ｈ１）および配列番号１４（ｃｓ
７４ｈ２）を含んでいるが、これらに限定されない。位置４０、４２、４３、４６、４７
、４９、５０、５１、５３または５４にＣｙｓを有するｃｓ１４の変異体の例は、たとえ
ば配列番号1７～２０、４０～５２、６４、６５、７０、７１および７４～７６を含んで
いるが、これらに限定されない。
【0064】
配列番号４（ｃｓ２７）および変異体
いくつかの実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列の、また
それと少なくとも８９．５％の同一性を有する、位置４０、４２、４３、４６、４７、４
９、５０、５１、５３または５４でのシステインによる改変に適したアミノ酸配列の１つ
以上のドメインを含んでいる。位置４０、４２、４３、４６、４７、４９、５０、５１、
５３または５４にＣｙｓを有するｃｓ２７の変異体の例は、たとえば配列番号２１～２５
を含んでいるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列の、また
それと少なくとも８９．５％の同一性を有する、位置４０、４２、４３、４６、４７、４
９、５０、５１、５３または５４でのシステインによる改変に適したアミノ酸配列の１つ
以上のドメインを含んでいる。位置４０、４２、４３、４６、４７、４９、５０、５１、
５３または５４にＣｙｓを有するｃｓ２７の変異体の例は、たとえば配列番号２１～２５
を含んでいるが、これらに限定されない。
【0065】
配列番号５（ｃｓ２０）および変異体
いくつかの実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列の、また
それと少なくとも８９．５％の同一性を有する、位置４０、４２、４３、４６、４７、４
９、５０、５１、５３または５４でのシステインによる改変に適したアミノ酸配列の１つ
以上のドメインを含んでいる。たとえば、配列番号５に少なくとも８９．５％の同一性を
有するアミノ酸配列は配列番号９（ｃｓ１７）を含んでいるが、これに限定されない。位
置４０、４２、４３、４６、４７、４９、５０、５１、５３または５４にＣｙｓを有する
ｃｓ２０の変異体の例は、たとえば配列番号５３～５７を含んでいるが、これらに限定さ
れない。
いくつかの実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列の、また
それと少なくとも８９．５％の同一性を有する、位置４０、４２、４３、４６、４７、４
９、５０、５１、５３または５４でのシステインによる改変に適したアミノ酸配列の１つ
以上のドメインを含んでいる。たとえば、配列番号５に少なくとも８９．５％の同一性を
有するアミノ酸配列は配列番号９（ｃｓ１７）を含んでいるが、これに限定されない。位
置４０、４２、４３、４６、４７、４９、５０、５１、５３または５４にＣｙｓを有する
ｃｓ２０の変異体の例は、たとえば配列番号５３～５７を含んでいるが、これらに限定さ
れない。
【0066】
配列番号６（ｃｓ４２）および変異体
いくつかの実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列の、また
それと少なくとも８９．５％の同一性を有する、位置４０、４２、４３、４６、４７、４
９、５０、５１、５３または５４でのシステインによる改変に適したアミノ酸配列の１つ
以上のドメインを含んでいる。たとえば、配列番号１６に少なくとも８９．５％の同一性
を有するアミノ酸配列はｃｓ２８（位置４で異なる。）またはｃｓ４１（配列番号１５）
を含んでいるが、これに限定されない。位置４０、４２、４３、４６、４７、４９、５０
、５１、５３または５４にＣｙｓを有するｃｓ４２の変異体の例は、たとえば配列番号５
８～６３を含んでいるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列の、また
それと少なくとも８９．５％の同一性を有する、位置４０、４２、４３、４６、４７、４
９、５０、５１、５３または５４でのシステインによる改変に適したアミノ酸配列の１つ
以上のドメインを含んでいる。たとえば、配列番号１６に少なくとも８９．５％の同一性
を有するアミノ酸配列はｃｓ２８（位置４で異なる。）またはｃｓ４１（配列番号１５）
を含んでいるが、これに限定されない。位置４０、４２、４３、４６、４７、４９、５０
、５１、５３または５４にＣｙｓを有するｃｓ４２の変異体の例は、たとえば配列番号５
８～６３を含んでいるが、これらに限定されない。
【0067】
配列番号１６（ｃｓ４３）および変異体
いくつかの実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質は、配列番号１６のアミノ酸配列の、ま
たそれと少なくとも８９．５％の同一性を有する、位置４０、４２、４３、４６、４７、
４９、５０、５１、５３または５４でのシステインによる改変に適したアミノ酸配列の１
つ以上のドメインを含んでいる。たとえば、配列番号１６に少なくとも８９．５％の同一
性を有するアミノ酸配列はｃｓ４４（位置４４で異なる。）、ｃｓ３１（位置２５および
５４で異なる。）またはｃｓ４５（位置２５および２６で異なる。）を含んでいるが、こ
れに限定されない。位置４０、４２、４３、４６、４７、４９、５０、５１、５３または
５４にＣｙｓを有するｃｓ４３の変異体の例は、たとえば配列番号６６～６９および７２
を含んでいるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質は、配列番号１６のアミノ酸配列の、ま
たそれと少なくとも８９．５％の同一性を有する、位置４０、４２、４３、４６、４７、
４９、５０、５１、５３または５４でのシステインによる改変に適したアミノ酸配列の１
つ以上のドメインを含んでいる。たとえば、配列番号１６に少なくとも８９．５％の同一
性を有するアミノ酸配列はｃｓ４４（位置４４で異なる。）、ｃｓ３１（位置２５および
５４で異なる。）またはｃｓ４５（位置２５および２６で異なる。）を含んでいるが、こ
れに限定されない。位置４０、４２、４３、４６、４７、４９、５０、５１、５３または
５４にＣｙｓを有するｃｓ４３の変異体の例は、たとえば配列番号６６～６９および７２
を含んでいるが、これらに限定されない。
【0068】
Ｆｃ結合タンパク質の配列；好ましいアミノ酸の位置
驚いたことに、Ｆｃ結合ドメインのヘリックス３中のシステインは、図および実施例に
示されるように、ヘリックス３中にシステインを有しないドメインと比較して、Ｆｃ結合
ドメインのアルカリ安定性を増加させ、かつマトリックスへのＦｃ結合タンパク質の部位
特異的なカップリングを改善し、これは能力を改善する。
驚いたことに、Ｆｃ結合ドメインのヘリックス３中のシステインは、図および実施例に
示されるように、ヘリックス３中にシステインを有しないドメインと比較して、Ｆｃ結合
ドメインのアルカリ安定性を増加させ、かつマトリックスへのＦｃ結合タンパク質の部位
特異的なカップリングを改善し、これは能力を改善する。
【0069】
いくつかの実施形態では、当該Ｆｃ結合ドメインは位置１にイソロイシンを含んでいる
。Ｆｃ結合ドメインの位置１でのアミノ酸はトレオニン（Ｔ）でないことが好ましい。位
置１でのアミノ酸はイソロイシン（Ｉ）またはアラニン（Ａ）であることが好ましい。あ
るいは、位置１は欠失されてもよい。
。Ｆｃ結合ドメインの位置１でのアミノ酸はトレオニン（Ｔ）でないことが好ましい。位
置１でのアミノ酸はイソロイシン（Ｉ）またはアラニン（Ａ）であることが好ましい。あ
るいは、位置１は欠失されてもよい。
【0070】
いくつかの実施形態では、当該Ｆｃ結合ドメインは位置１１にアラニン（Ａ）、グルタ
ミン酸（Ｅ）またはイソロイシン（Ｉ）を含んでいる。位置１１でのアミノ酸はアスパラ
ギン（Ｎ）またはリジン（Ｋ）でないことが好ましい。位置１１でのアミノ酸はアラニン
（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）またはプロリン（
Ｐ）であることが好ましく、より好ましくはＡ、ＩまたはＥ、最も好ましくはＡである。
あるいは、位置１１でのアミノ酸はセリン（Ｓ）である。
ミン酸（Ｅ）またはイソロイシン（Ｉ）を含んでいる。位置１１でのアミノ酸はアスパラ
ギン（Ｎ）またはリジン（Ｋ）でないことが好ましい。位置１１でのアミノ酸はアラニン
（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）またはプロリン（
Ｐ）であることが好ましく、より好ましくはＡ、ＩまたはＥ、最も好ましくはＡである。
あるいは、位置１１でのアミノ酸はセリン（Ｓ）である。
【0071】
いくつかの実施形態では、当該Ｆｃ結合ドメインは位置３５にアルギニン（Ｒ）または
イソロイシン（Ｉ）を含んでいる。位置３５でのアミノ酸はプロリン（Ｐ）、アスパラギ
ン（Ｎ）、グリシン（Ｇ）、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）、グルタミン（Ｑ）
またはメチオニン（Ｍ）でないことが好ましい。
いくつかの実施形態では、当該Ｆｃ結合ドメインは位置４２にロイシン（Ｌ）を含んで
いる。位置４２のアミノ酸はチロシン（Ｙ）でないことが好ましい。
イソロイシン（Ｉ）を含んでいる。位置３５でのアミノ酸はプロリン（Ｐ）、アスパラギ
ン（Ｎ）、グリシン（Ｇ）、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）、グルタミン（Ｑ）
またはメチオニン（Ｍ）でないことが好ましい。
いくつかの実施形態では、当該Ｆｃ結合ドメインは位置４２にロイシン（Ｌ）を含んで
いる。位置４２のアミノ酸はチロシン（Ｙ）でないことが好ましい。
【0072】
いくつかの実施形態では、４０Ｃ、４２Ｃ、４３Ｃ、４６Ｃ、４７Ｃ、４９Ｃ、５０Ｃ
、５１Ｃ、５３Ｃまたは５４Ｃに加えて、Ｆｃ結合ドメインは１Ｉ、１１Ａ、１１Ｓ、３
５Ｒおよび４２Ｌから成る群から選ばれたアミノ酸の位置のうちの２、３または４つを含
んでいる。
、５１Ｃ、５３Ｃまたは５４Ｃに加えて、Ｆｃ結合ドメインは１Ｉ、１１Ａ、１１Ｓ、３
５Ｒおよび４２Ｌから成る群から選ばれたアミノ酸の位置のうちの２、３または４つを含
んでいる。
【0073】
いくつかの実施形態では、位置１Ｉ、３Ａ、６Ｄ、９Ｑ、１０Ｑ、１２Ａ、１３Ｆ、１
４Ｙ、１５Ｅ、１６Ｉ、１７Ｌ、１８Ｈ、１９Ｌ、２０Ｐ、２１Ｎ、２２Ｌ、２３Ｔ、２
４Ｅ、２６Ｑ、２７Ｒ、２８Ｎ、２９Ａ、３０Ｆ、３１Ｉ、３２Ｑ、３３Ｓ、３４Ｌ、３
６Ｄ、３７Ｄ、３８Ｐ、３９Ｓ、４１Ｓ、４２Ｌ、４５Ｌ、４８Ａ、５２Ｎ、５５Ｑ、５
６Ａ、５７Ｐの少なくとも９０％は、本発明のＦｃ結合ドメイン群において同一である。
位置２はＡまたはＤであり、位置４はＫまたはＱであり、位置５はＨまたはＦであり、位
置７はＫまたはＥであり、位置８はＤ、ＡまたはＥであり、位置１１はＡ、Ｓ、Ｉまたは
Ｅであり、位置２５はＤまたはＥであり、位置３５はＲまたはＩであり、位置４０はＶ、
Ｔ、ＱまたはＣであり、位置４２はＬまたはＣであり、位置４３はＥ、ＳまたはＣであり
、位置４４はＩ、VまたはLであり、位置４６はＣ、ＡまたはＧであり、位置４７はＥまた
はＣであり、位置４９はＫ、ＱまたはＣである、位置５０はＫまたはＣであり、位置５１
はＬまたはＣであり、位置５３はＤまたはＥまたはＣであり、位置５４はＡ、ＳまたはＣ
であり、および位置５８はＰまたはＫであることが好ましい。
４Ｙ、１５Ｅ、１６Ｉ、１７Ｌ、１８Ｈ、１９Ｌ、２０Ｐ、２１Ｎ、２２Ｌ、２３Ｔ、２
４Ｅ、２６Ｑ、２７Ｒ、２８Ｎ、２９Ａ、３０Ｆ、３１Ｉ、３２Ｑ、３３Ｓ、３４Ｌ、３
６Ｄ、３７Ｄ、３８Ｐ、３９Ｓ、４１Ｓ、４２Ｌ、４５Ｌ、４８Ａ、５２Ｎ、５５Ｑ、５
６Ａ、５７Ｐの少なくとも９０％は、本発明のＦｃ結合ドメイン群において同一である。
位置２はＡまたはＤであり、位置４はＫまたはＱであり、位置５はＨまたはＦであり、位
置７はＫまたはＥであり、位置８はＤ、ＡまたはＥであり、位置１１はＡ、Ｓ、Ｉまたは
Ｅであり、位置２５はＤまたはＥであり、位置３５はＲまたはＩであり、位置４０はＶ、
Ｔ、ＱまたはＣであり、位置４２はＬまたはＣであり、位置４３はＥ、ＳまたはＣであり
、位置４４はＩ、VまたはLであり、位置４６はＣ、ＡまたはＧであり、位置４７はＥまた
はＣであり、位置４９はＫ、ＱまたはＣである、位置５０はＫまたはＣであり、位置５１
はＬまたはＣであり、位置５３はＤまたはＥまたはＣであり、位置５４はＡ、ＳまたはＣ
であり、および位置５８はＰまたはＫであることが好ましい。
【0074】
本発明のＦｃ結合タンパク質は１つ以上のＦｃ結合ドメインを含んでおり、Ｆｃ結合ド
メインは配列番号２のアミノ酸配列またはそれと少なくとも８９．５％同一のアミノ酸配
列を含んでおり、またはそれから本質的に成り、またはそれから成る。配列番号２のアミ
ノ酸配列は以下のアミノ酸配列である：
ＩＸ２ＡＸ４Ｘ５ＤＸ７Ｘ８ＱＱＸ１１ＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＴＥＸ２５ＱＲＮＡＦＩ
ＱＳＬＸ３５ＤＤＰＳＸ４０ＳＬＸ４３Ｘ４４ＬＸ４６Ｘ４７ＡＸ４９Ｘ５０Ｘ５１ＮＸ
５３Ｘ５４ＱＡＰＸ５８。
この配列で、位置１でのアミノ酸はＩから選ばれまたは欠失され、位置２（Ｘ２）での
アミノ酸はＡまたはＤから選ばれまたは欠失され、位置３でのアミノ酸はＡから選ばれる
または欠失され、位置４（Ｘ４）でのアミノ酸はＫまたはＱから選ばれまたは欠失され、
位置５（Ｘ５）でのアミノ酸はＨまたはＦから選ばれ、位置７（Ｘ７）でのアミノ酸はＫ
またはＥから選ばれ、位置８（Ｘ８）でのアミノ酸はＤ、ＡまたはＥから選ばれ、位置１
１（Ｘ１１）でのアミノ酸はＡ、Ｓ、ＩまたはＥから選ばれ、位置２５（Ｘ２５）でのア
ミノ酸はＤまたはＥから選ばれ、位置３５（Ｘ３５）でのアミノ酸はＲまたはＩから選ば
れ、位置４０（Ｘ４０）でのアミノ酸はＱ、Ｔ、ＶまたはＣから選ばれ、位置４２（Ｘ４
２）でのアミノ酸はＬまたはＣから選ばれ、位置４３（Ｘ４３）でのアミノ酸はＥ、Ｓま
たはＣから選ばれ、位置４４（Ｘ４４）でのアミノ酸はＩ、ＬまたはＶから選ばれ、位置
４６（Ｘ４６）でのアミノ酸はＧ、ＡまたはＣから選ばれ、位置４７（Ｘ４７）でのアミ
ノ酸はＥまたはＣから選ばれ、位置４９（Ｘ４９）でのアミノ酸はＫ、ＱまたはＣから選
ばれ、位置５０（Ｘ５０）でのアミノ酸はＫまたはＣであり、位置５１（Ｘ５１）でのア
ミノ酸はＬまたはＣであり、位置５３（Ｘ５３）でのアミノ酸はＤ、ＥまたはＣから選ば
れ、位置５４（Ｘ５４）でのアミノ酸はＡまたはＳまたはＣから選ばれ、位置５７でのア
ミノ酸はＰから選ばれまたは欠失され、および位置５８（Ｘ５８）でのアミノ酸はＰまた
はＫから選ばれまたは欠失される。本発明のＦｃ結合タンパク質は以下の位置のうちの１
つまたは２つにシステインを有する：４０、４２、４３、４６、４７、４９、５０、５１
、５３および５４。本発明のＦｃ結合ドメイン用に選ばれる例としては、たとえば配列番
号１７～７３および９０～９９が挙げられるが、これらに限定されない。
メインは配列番号２のアミノ酸配列またはそれと少なくとも８９．５％同一のアミノ酸配
列を含んでおり、またはそれから本質的に成り、またはそれから成る。配列番号２のアミ
ノ酸配列は以下のアミノ酸配列である：
ＩＸ２ＡＸ４Ｘ５ＤＸ７Ｘ８ＱＱＸ１１ＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＴＥＸ２５ＱＲＮＡＦＩ
ＱＳＬＸ３５ＤＤＰＳＸ４０ＳＬＸ４３Ｘ４４ＬＸ４６Ｘ４７ＡＸ４９Ｘ５０Ｘ５１ＮＸ
５３Ｘ５４ＱＡＰＸ５８。
この配列で、位置１でのアミノ酸はＩから選ばれまたは欠失され、位置２（Ｘ２）での
アミノ酸はＡまたはＤから選ばれまたは欠失され、位置３でのアミノ酸はＡから選ばれる
または欠失され、位置４（Ｘ４）でのアミノ酸はＫまたはＱから選ばれまたは欠失され、
位置５（Ｘ５）でのアミノ酸はＨまたはＦから選ばれ、位置７（Ｘ７）でのアミノ酸はＫ
またはＥから選ばれ、位置８（Ｘ８）でのアミノ酸はＤ、ＡまたはＥから選ばれ、位置１
１（Ｘ１１）でのアミノ酸はＡ、Ｓ、ＩまたはＥから選ばれ、位置２５（Ｘ２５）でのア
ミノ酸はＤまたはＥから選ばれ、位置３５（Ｘ３５）でのアミノ酸はＲまたはＩから選ば
れ、位置４０（Ｘ４０）でのアミノ酸はＱ、Ｔ、ＶまたはＣから選ばれ、位置４２（Ｘ４
２）でのアミノ酸はＬまたはＣから選ばれ、位置４３（Ｘ４３）でのアミノ酸はＥ、Ｓま
たはＣから選ばれ、位置４４（Ｘ４４）でのアミノ酸はＩ、ＬまたはＶから選ばれ、位置
４６（Ｘ４６）でのアミノ酸はＧ、ＡまたはＣから選ばれ、位置４７（Ｘ４７）でのアミ
ノ酸はＥまたはＣから選ばれ、位置４９（Ｘ４９）でのアミノ酸はＫ、ＱまたはＣから選
ばれ、位置５０（Ｘ５０）でのアミノ酸はＫまたはＣであり、位置５１（Ｘ５１）でのア
ミノ酸はＬまたはＣであり、位置５３（Ｘ５３）でのアミノ酸はＤ、ＥまたはＣから選ば
れ、位置５４（Ｘ５４）でのアミノ酸はＡまたはＳまたはＣから選ばれ、位置５７でのア
ミノ酸はＰから選ばれまたは欠失され、および位置５８（Ｘ５８）でのアミノ酸はＰまた
はＫから選ばれまたは欠失される。本発明のＦｃ結合タンパク質は以下の位置のうちの１
つまたは２つにシステインを有する：４０、４２、４３、４６、４７、４９、５０、５１
、５３および５４。本発明のＦｃ結合ドメイン用に選ばれる例としては、たとえば配列番
号１７～７３および９０～９９が挙げられるが、これらに限定されない。
【0075】
Ｆｃ結合タンパク質のＣ末端領域にシステインを有する結果としての高いアルカリ安定性
いくつかの実施形態では、実施例および図に示されるように、ヘリックス３中にシステ
インを有するＦｃ結合タンパク質は、Ｆｃ結合タンパク質の驚くほど特に良好なアルカリ
安定性を提供する。ヘリックス３中にシステインを有するＦｃ結合タンパク質が、数時間
のアルカリ処理の後でさえもＩｇに結合することができることは最も驚くべきことであり
かつ予期し得ないことであった。Ｆｃ結合タンパク質のアルカリ安定性は、０．５ＭのＮ
ａＯＨ中で少なくとも６時間のインキュベーション後のＩｇ結合活性の損失量を比較する
ことによって測定される（図３を参照せよ。）。たとえば、ｃｓ２６ ４６Ｃの結合能力
は、０．５ＭのＮａＯＨを用いた長時間（たとえば、３６時間）のインキュベーション後
の野生型ドメインＣよりも少なくとも２０％高く保持されている（図４を参照せよ。）。
いくつかの実施形態では、実施例および図に示されるように、ヘリックス３中にシステ
インを有するＦｃ結合タンパク質は、Ｆｃ結合タンパク質の驚くほど特に良好なアルカリ
安定性を提供する。ヘリックス３中にシステインを有するＦｃ結合タンパク質が、数時間
のアルカリ処理の後でさえもＩｇに結合することができることは最も驚くべきことであり
かつ予期し得ないことであった。Ｆｃ結合タンパク質のアルカリ安定性は、０．５ＭのＮ
ａＯＨ中で少なくとも６時間のインキュベーション後のＩｇ結合活性の損失量を比較する
ことによって測定される（図３を参照せよ。）。たとえば、ｃｓ２６ ４６Ｃの結合能力
は、０．５ＭのＮａＯＨを用いた長時間（たとえば、３６時間）のインキュベーション後
の野生型ドメインＣよりも少なくとも２０％高く保持されている（図４を参照せよ。）。
【0076】
免疫グロブリンへの親和力
本発明の全てのＦｃ結合タンパク質は、好ましくは５００ｎＭ未満、または１００未満
ｎＭ、さらにより好ましくは１０ｎＭ以下の解離定数ＫＤで免疫グロブリンに結合する。
Ｆｃ結合タンパク質またはドメインの結合親和力を測定する方法、すなわち解離定数ＫＤ
を測定する方法は、当業者に知られており、たとえば当技術分野で知られた以下の方法か
ら選ばれることができる：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基いた技術、バイオ層干渉計
使用法（ＢＬＩ）、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、等
温滴定熱量測定法（ＩＴＣ）、分析的超遠心分離、放射免疫検定（ＲＩＡまたはＩＲＭＡ
）および増強化学発光（ＥＣＬ）。これらの方法のいくつかは実施例にさらに記載される
。
本発明の全てのＦｃ結合タンパク質は、好ましくは５００ｎＭ未満、または１００未満
ｎＭ、さらにより好ましくは１０ｎＭ以下の解離定数ＫＤで免疫グロブリンに結合する。
Ｆｃ結合タンパク質またはドメインの結合親和力を測定する方法、すなわち解離定数ＫＤ
を測定する方法は、当業者に知られており、たとえば当技術分野で知られた以下の方法か
ら選ばれることができる：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基いた技術、バイオ層干渉計
使用法（ＢＬＩ）、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、等
温滴定熱量測定法（ＩＴＣ）、分析的超遠心分離、放射免疫検定（ＲＩＡまたはＩＲＭＡ
）および増強化学発光（ＥＣＬ）。これらの方法のいくつかは実施例にさらに記載される
。
【0077】
典型的には、解離定数ＫＤは２０℃、２５℃または３０℃で測定される。特に指定のな
い限り、本明細書に記載されたＫＤ値は表面プラズモン共鳴によって２２℃±３℃で測定
される。第１の様相の実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質は、０．１ｎＭ～１００ｎＭ、
好ましくは０．１ｎＭ～５０ｎＭの範囲のヒトＩｇＧ１に対する解離定数ＫＤを有する。
い限り、本明細書に記載されたＫＤ値は表面プラズモン共鳴によって２２℃±３℃で測定
される。第１の様相の実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質は、０．１ｎＭ～１００ｎＭ、
好ましくは０．１ｎＭ～５０ｎＭの範囲のヒトＩｇＧ１に対する解離定数ＫＤを有する。
【0078】
多量体
本発明の１つの実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質は１、２、３、４、５、６、７また
は８つ、好ましくは２、３、４、５または６つの互いに連結されたＦｃ結合ドメインを含
んでいる、すなわちＦｃ結合タンパク質は、たとえば単量体、二量体、三量体、四量体、
五量体または六量体であることができる。多量体は２、３、４つまたはさらにそれより多
くの結合ドメインを含んでいてもよい。本発明の多量体は、一般に当業者に周知の組換え
ＤＮＡ技術によって人工的に生成された融合タンパク質である。
本発明の１つの実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質は１、２、３、４、５、６、７また
は８つ、好ましくは２、３、４、５または６つの互いに連結されたＦｃ結合ドメインを含
んでいる、すなわちＦｃ結合タンパク質は、たとえば単量体、二量体、三量体、四量体、
五量体または六量体であることができる。多量体は２、３、４つまたはさらにそれより多
くの結合ドメインを含んでいてもよい。本発明の多量体は、一般に当業者に周知の組換え
ＤＮＡ技術によって人工的に生成された融合タンパク質である。
【0079】
いくつかの実施形態では、多量体はホモ多量体である、たとえば、Ｆｃ結合タンパク質
の全てのＦｃ結合ドメインのアミノ酸配列は同一である。
多量体は２つ以上のＦｃ結合ドメインを含んでいてもよく、その場合に当該Ｆｃ結合ド
メインは、好ましくは上記の配列を含んでおり、またはそれから本質的に成り、但しそれ
らがヘリックス３中に少なくとも１つのシステインを有することを条件とする。
たとえば、配列番号２７または配列番号２２が使用されて、本明細書の実施例１に記載
されたホモ多量体融合構成物が生成される。たとえば配列番号３２、配列番号３５または
配列番号２５を参照せよ。
の全てのＦｃ結合ドメインのアミノ酸配列は同一である。
多量体は２つ以上のＦｃ結合ドメインを含んでいてもよく、その場合に当該Ｆｃ結合ド
メインは、好ましくは上記の配列を含んでおり、またはそれから本質的に成り、但しそれ
らがヘリックス３中に少なくとも１つのシステインを有することを条件とする。
たとえば、配列番号２７または配列番号２２が使用されて、本明細書の実施例１に記載
されたホモ多量体融合構成物が生成される。たとえば配列番号３２、配列番号３５または
配列番号２５を参照せよ。
【0080】
いくつかの実施形態では、多量体はヘテロ多量体である。たとえば、少なくとも１つの
アルカリ安定性のＦｃ結合ドメインは、免疫グロブリンに結合しているタンパク質内の他
のＦｃ結合ドメインとは異なるアミノ酸配列を有する。
アルカリ安定性のＦｃ結合ドメインは、免疫グロブリンに結合しているタンパク質内の他
のＦｃ結合ドメインとは異なるアミノ酸配列を有する。
【0081】
リンカー
第１の様相のいくつかの実施形態では、１つ以上のＦｃ結合ドメインは、互いに直接連
結される。他の実施形態では、１つ以上のＦｃ結合ドメインは、互いに１つ以上のリンカ
ーによって連結される。これらの典型的な実施形態で好ましいのは、ペプチドリンカーで
ある。これは、ペプチドリンカーが第１のＦｃ結合ドメインを第２のＦｃ結合ドメインに
結合するアミノ酸配列であることを意味する。ペプチドリンカーは、第１のＦｃ結合ドメ
インおよび第２のＦｃ結合ドメインに、これらのドメインのＣ末端とＮ末端の間のペプチ
ド結合によって結合され、それによって単一の線状のポリペプチド鎖を生成する。リンカ
ーの長さおよび構成は、少なくとも１個と約３０個までのアミノ酸の間で様々であっても
よい。より具体的には、ペプチドリンカーは、１～３０個のアミノ酸、たとえば１、２、
３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８
、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個のアミ
ノ酸の長さを有する。
第１の様相のいくつかの実施形態では、１つ以上のＦｃ結合ドメインは、互いに直接連
結される。他の実施形態では、１つ以上のＦｃ結合ドメインは、互いに１つ以上のリンカ
ーによって連結される。これらの典型的な実施形態で好ましいのは、ペプチドリンカーで
ある。これは、ペプチドリンカーが第１のＦｃ結合ドメインを第２のＦｃ結合ドメインに
結合するアミノ酸配列であることを意味する。ペプチドリンカーは、第１のＦｃ結合ドメ
インおよび第２のＦｃ結合ドメインに、これらのドメインのＣ末端とＮ末端の間のペプチ
ド結合によって結合され、それによって単一の線状のポリペプチド鎖を生成する。リンカ
ーの長さおよび構成は、少なくとも１個と約３０個までのアミノ酸の間で様々であっても
よい。より具体的には、ペプチドリンカーは、１～３０個のアミノ酸、たとえば１、２、
３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８
、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個のアミ
ノ酸の長さを有する。
【0082】
ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、苛性条件およびプロテアーゼに対して安定してい
ることが好ましい。リンカーは、Ｆｃ結合タンパク質の中のドメインの配座を不安定にす
るべきではない。周知なのは、小さいアミノ酸、たとえばグリシンおよびセリンを含んで
いるまたはそれから成るリンカーである。リンカーはグリシンに富むことができる（たと
えば、リンカー中の残基の５０％超がグリシン残基であることができる。）。同様に好ま
しいのは、さらなるアミノ酸を含んでいるリンカーである。本発明の他の実施形態は、ア
ラニン、プロリンおよびセリンから成るリンカーを含む。タンパク質の融合用の他のリン
カーが当技術分野で知られており、それらが使用されることができる。いくつかの実施形
態では、Ｆｃ結合タンパク質の多量体は、Ｆｃ結合ドメインを結合する１つ以上のリンカ
ーを含んでおり、それらは同一であるかまたは異なっている。
ることが好ましい。リンカーは、Ｆｃ結合タンパク質の中のドメインの配座を不安定にす
るべきではない。周知なのは、小さいアミノ酸、たとえばグリシンおよびセリンを含んで
いるまたはそれから成るリンカーである。リンカーはグリシンに富むことができる（たと
えば、リンカー中の残基の５０％超がグリシン残基であることができる。）。同様に好ま
しいのは、さらなるアミノ酸を含んでいるリンカーである。本発明の他の実施形態は、ア
ラニン、プロリンおよびセリンから成るリンカーを含む。タンパク質の融合用の他のリン
カーが当技術分野で知られており、それらが使用されることができる。いくつかの実施形
態では、Ｆｃ結合タンパク質の多量体は、Ｆｃ結合ドメインを結合する１つ以上のリンカ
ーを含んでおり、それらは同一であるかまたは異なっている。
【0083】
固体担体へのコンジュゲーション
本発明のいくつかの実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質は固体担体にコンジュゲートさ
れる。Ｆｃ結合ドメインのヘリックス３の中のシステインは、固体担体へのＦｃ結合タン
パク質の部位特異的な共有結合によるカップリングのための付加部位を含んでいる。位置
４０、４２、４３、４６、４７、４９、５０、５１、５３または５４での少なくとも１つ
のシステインは、固相の反応基との、または固相とタンパク質、たとえばＮ－ヒドロキシ
スクシンイミド、ヨードアセトアミド、マレイミド、エポキシまたはアルケン基から選ば
れたものとの間のリンカーとの特定の化学反応を可能にする。
本発明のいくつかの実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質は固体担体にコンジュゲートさ
れる。Ｆｃ結合ドメインのヘリックス３の中のシステインは、固体担体へのＦｃ結合タン
パク質の部位特異的な共有結合によるカップリングのための付加部位を含んでいる。位置
４０、４２、４３、４６、４７、４９、５０、５１、５３または５４での少なくとも１つ
のシステインは、固相の反応基との、または固相とタンパク質、たとえばＮ－ヒドロキシ
スクシンイミド、ヨードアセトアミド、マレイミド、エポキシまたはアルケン基から選ば
れたものとの間のリンカーとの特定の化学反応を可能にする。
【0084】
本発明のいくつかの実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質はまた、Ｎおよび／またはＣ末
端に追加のアミノ酸残基を、たとえばＮおよび／またはＣ末端にタグを有するまたは有し
ない追加の配列を含んでいてもよい。
端に追加のアミノ酸残基を、たとえばＮおよび／またはＣ末端にタグを有するまたは有し
ない追加の配列を含んでいてもよい。
【0085】
アフィニティー分離マトリックス
別の様相では、本発明は、第１の様相のＦｃ結合タンパク質を含んでいるアフィニティ
ー分離マトリックスに関する。
第２の様相の好ましい実施形態では、アフィニティー分離マトリックスは固体担体であ
る。アフィニティー分離マトリックスは、本発明の少なくとも１つのＦｃ結合タンパク質
を含んでいる。
アフィニティーマトリックスは免疫グロブリンの分離に有用であり、洗浄工程の際に適
用されるような高度にアルカリ性の条件の後でさえもＩｇ結合特性を保持するべきである
。マトリックスのそのような洗浄は、マトリックスの長期間の繰り返し使用にとって不可
欠である。
別の様相では、本発明は、第１の様相のＦｃ結合タンパク質を含んでいるアフィニティ
ー分離マトリックスに関する。
第２の様相の好ましい実施形態では、アフィニティー分離マトリックスは固体担体であ
る。アフィニティー分離マトリックスは、本発明の少なくとも１つのＦｃ結合タンパク質
を含んでいる。
アフィニティーマトリックスは免疫グロブリンの分離に有用であり、洗浄工程の際に適
用されるような高度にアルカリ性の条件の後でさえもＩｇ結合特性を保持するべきである
。マトリックスのそのような洗浄は、マトリックスの長期間の繰り返し使用にとって不可
欠である。
【0086】
アフィニティークロマトグラフィー用の固体担体マトリックスは当技術分野で知られて
おり、たとえば、アガロース（Ａｇａｒｏｓｅ）およびアガロースの安定化誘導体（たと
えば、セファロ－ス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）６Ｂ、Ｐｒａｅｓｔｏ（商標）Ｐｕｒｅ；Ｃ
ａｐｔｉｖＡ（商標）、ｒＰＲＯＴＥＩＮ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、
Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ（商標）、ＰｒｉｓｍＡ（商標）等）、セルロースまたはセルロース
の誘導体、細孔性ガラス（たとえば、ＰｒｏＳｅｐ（商標）ｖＡ樹脂）、モノリス（たと
えば、ＣＩＭ（商標）モノリス）、シリカ、酸化ジルコニウム（たとえばＣＭジルコニア
またはＣＰＧ（商標））、酸化チタンまたは合成ポリマー（たとえば、ポリスチレン、た
とえばＰｏｒｏｓ ５０ＡまたはＰｏｒｏｓ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ（商標）Ａ樹脂、ポリ
ビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリヒ
ドロキシアルキルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド等）およ
び様々な組成物のヒドロゲルが挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では
、担体はポリヒドロキシポリマー、たとえば多糖を含んでいる。担体に適した多糖の例は
、寒天、アガロース、デキストラン、でんぷん、セルロース、プルラン等およびこれらの
安定化変異体が挙げられるが、これらに限定されない。
おり、たとえば、アガロース（Ａｇａｒｏｓｅ）およびアガロースの安定化誘導体（たと
えば、セファロ－ス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）６Ｂ、Ｐｒａｅｓｔｏ（商標）Ｐｕｒｅ；Ｃ
ａｐｔｉｖＡ（商標）、ｒＰＲＯＴＥＩＮ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、
Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ（商標）、ＰｒｉｓｍＡ（商標）等）、セルロースまたはセルロース
の誘導体、細孔性ガラス（たとえば、ＰｒｏＳｅｐ（商標）ｖＡ樹脂）、モノリス（たと
えば、ＣＩＭ（商標）モノリス）、シリカ、酸化ジルコニウム（たとえばＣＭジルコニア
またはＣＰＧ（商標））、酸化チタンまたは合成ポリマー（たとえば、ポリスチレン、た
とえばＰｏｒｏｓ ５０ＡまたはＰｏｒｏｓ ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ（商標）Ａ樹脂、ポリ
ビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリヒ
ドロキシアルキルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド等）およ
び様々な組成物のヒドロゲルが挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では
、担体はポリヒドロキシポリマー、たとえば多糖を含んでいる。担体に適した多糖の例は
、寒天、アガロース、デキストラン、でんぷん、セルロース、プルラン等およびこれらの
安定化変異体が挙げられるが、これらに限定されない。
【0087】
固体担体マトリックスのためのフォーマットは、任意の適当な周知の種類のものである
ことができる。本発明のＦｃ結合タンパク質をカップリングさせるためのそのような固体
担体マトリックスは、たとえば以下の１つを含んでいてもよい：カラム、毛細管、粒子、
膜、フィルター、モノリス、ファイバー、パッド、ゲル、スライド、プレート、カセット
、またはクロマトグラフィーに一般的に使用され当業者に知られている他のフォーマット
。
ことができる。本発明のＦｃ結合タンパク質をカップリングさせるためのそのような固体
担体マトリックスは、たとえば以下の１つを含んでいてもよい：カラム、毛細管、粒子、
膜、フィルター、モノリス、ファイバー、パッド、ゲル、スライド、プレート、カセット
、またはクロマトグラフィーに一般的に使用され当業者に知られている他のフォーマット
。
【0088】
１つの実施形態では、マトリックスは実質的に球状の粒子から構成され、これはビーズ
としても知られており、たとえばセファロ－ス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズまたはアガ
ロース（Ａｇａｒｏｓｅ）ビーズがある。適当な粒子サイズは、５～５００μｍ、たとえ
ば１０～１００μｍ、たとえば２０～８０μｍ、たとえば４０～７０μｍの直径の範囲に
あってもよい。粒子形態のマトリックスは、充填床として、または懸濁形態で、たとえば
膨張層として使用されることができる。代わりの実施形態では、固体担体マトリックスは
膜、たとえばヒドロゲル膜である。いくつかの実施形態では、アフィニティー精製はマト
リックスとしての膜を含み、それに第１の様相のＦｃ結合タンパク質が共有結合で結合さ
れている。固体担体はまた、カートリッジ内の膜の形態をしていることができる。
としても知られており、たとえばセファロ－ス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズまたはアガ
ロース（Ａｇａｒｏｓｅ）ビーズがある。適当な粒子サイズは、５～５００μｍ、たとえ
ば１０～１００μｍ、たとえば２０～８０μｍ、たとえば４０～７０μｍの直径の範囲に
あってもよい。粒子形態のマトリックスは、充填床として、または懸濁形態で、たとえば
膨張層として使用されることができる。代わりの実施形態では、固体担体マトリックスは
膜、たとえばヒドロゲル膜である。いくつかの実施形態では、アフィニティー精製はマト
リックスとしての膜を含み、それに第１の様相のＦｃ結合タンパク質が共有結合で結合さ
れている。固体担体はまた、カートリッジ内の膜の形態をしていることができる。
【0089】
いくつかの実施形態では、アフィニティー精製は、第１の様相のＦｃ結合タンパク質が
共有結合で結合されている固体担体マトリックスを含んでいるクロマトグラフィーカラム
を含む。本発明のＦｃ結合タンパク質は、従来のカップリング技術によって適当な固体担
体マトリックスに付加されてもよい。固体担体へのタンパク質リガンドの固定化の方法は
この分野では周知であり、標準的な技術および装置を使用してこの分野の当業者によって
容易に実施される。
共有結合で結合されている固体担体マトリックスを含んでいるクロマトグラフィーカラム
を含む。本発明のＦｃ結合タンパク質は、従来のカップリング技術によって適当な固体担
体マトリックスに付加されてもよい。固体担体へのタンパク質リガンドの固定化の方法は
この分野では周知であり、標準的な技術および装置を使用してこの分野の当業者によって
容易に実施される。
【0090】
Ｆｃ結合タンパク質の使用
第３の様相では、本発明は、第１の様相のＦｃ結合タンパク質または第２の様相のアフ
ィニティーマトリックスの、免疫グロブリンまたはその変異体のアフィニティー精製への
使用に関する。すなわち、本発明のＦｃ結合タンパク質はアフィニティークロマトグラフ
ィーに使用される。いくつかの実施形態では、本発明のＦｃ結合タンパク質は、本発明の
第２の様相に記載された固体担体上に固定化される。
第３の様相では、本発明は、第１の様相のＦｃ結合タンパク質または第２の様相のアフ
ィニティーマトリックスの、免疫グロブリンまたはその変異体のアフィニティー精製への
使用に関する。すなわち、本発明のＦｃ結合タンパク質はアフィニティークロマトグラフ
ィーに使用される。いくつかの実施形態では、本発明のＦｃ結合タンパク質は、本発明の
第２の様相に記載された固体担体上に固定化される。
【0091】
免疫グロブリンのアフィニティー精製の方法
第４の様相では、本発明は、免疫グロブリンのアフィニティー精製の方法に関し、この
方法は以下の工程を含む：（ａ）免疫グロブリンを含んでいる液体を準備する工程；（ｂ
）アフィニティー分離マトリックスにカップリングされた第１の様相の固定化されたＦｃ
結合タンパク質を含んでいる当該アフィニティー分離マトリックスを準備する工程；（ｃ
）当該液体と当該アフィニティー分離マトリックスとを接触させて、当該免疫グロブリン
が当該固定化されたＦｃ結合タンパク質に結合する工程；および（ｄ）当該マトリックス
から当該免疫グロブリンを溶出させ、それによって当該免疫グロブリンを含有する溶離液
を得る工程。
第４の様相では、本発明は、免疫グロブリンのアフィニティー精製の方法に関し、この
方法は以下の工程を含む：（ａ）免疫グロブリンを含んでいる液体を準備する工程；（ｂ
）アフィニティー分離マトリックスにカップリングされた第１の様相の固定化されたＦｃ
結合タンパク質を含んでいる当該アフィニティー分離マトリックスを準備する工程；（ｃ
）当該液体と当該アフィニティー分離マトリックスとを接触させて、当該免疫グロブリン
が当該固定化されたＦｃ結合タンパク質に結合する工程；および（ｄ）当該マトリックス
から当該免疫グロブリンを溶出させ、それによって当該免疫グロブリンを含有する溶離液
を得る工程。
【0092】
いくつかの実施形態では、アフィニティー精製の方法は、アフィニティー分離マトリッ
クスからそこに非特異的に結合された一部または全ての分子を除去するのに十分な条件の
下で、工程（ｃ）と（ｄ）との間で実施される１つ以上の洗浄工程をさらに含んでもよい
。「非特異的に結合された」とは、本明細書に開示された本発明の対象である少なくとも
１つの結合ドメインと免疫グロブリンとの間の相互作用に関与しない任意の結合を意味す
る。
本明細書に開示された使用および方法に適したアフィニティー分離マトリックスは、上
に記載された実施形態によるおよび当業者に知られているマトリックスである。
クスからそこに非特異的に結合された一部または全ての分子を除去するのに十分な条件の
下で、工程（ｃ）と（ｄ）との間で実施される１つ以上の洗浄工程をさらに含んでもよい
。「非特異的に結合された」とは、本明細書に開示された本発明の対象である少なくとも
１つの結合ドメインと免疫グロブリンとの間の相互作用に関与しない任意の結合を意味す
る。
本明細書に開示された使用および方法に適したアフィニティー分離マトリックスは、上
に記載された実施形態によるおよび当業者に知られているマトリックスである。
【0093】
第４の様相のいくつかの実施形態では、工程（ｄ）におけるマトリックスからの免疫グ
ロブリンの溶出は、ｐＨの変化および／または塩濃度の変化によって達成される。任意の
適当な溶液が使用されることができ、たとえば、５以下のｐＨを有する溶液（たとえば、
実施例９の表３を参照せよ。）によって、またはｐＨ１１以上を有する溶液によって溶出
される。
ロブリンの溶出は、ｐＨの変化および／または塩濃度の変化によって達成される。任意の
適当な溶液が使用されることができ、たとえば、５以下のｐＨを有する溶液（たとえば、
実施例９の表３を参照せよ。）によって、またはｐＨ１１以上を有する溶液によって溶出
される。
【0094】
いくつかの実施形態では、アフィニティーマトリックスの効率的な洗浄および消毒のた
めに、さらなる工程（ｆ）が、好ましくはアルカリ性の液体、たとえば１３～１４のｐＨ
を有するアルカリ性の液体を使用する工程が加えられる。ある実施形態では、洗浄液は０
．１～１．０ＭのＮａＯＨまたはＫＯＨ、好ましくは０．２５～０．５ＭのＮａＯＨまた
はＫＯＨを含んでいる。本発明のＦｃ結合タンパク質の高いアルカリ安定性の故に、この
ような強アルカリ性溶液が洗浄の目的のために使用されることができる。
めに、さらなる工程（ｆ）が、好ましくはアルカリ性の液体、たとえば１３～１４のｐＨ
を有するアルカリ性の液体を使用する工程が加えられる。ある実施形態では、洗浄液は０
．１～１．０ＭのＮａＯＨまたはＫＯＨ、好ましくは０．２５～０．５ＭのＮａＯＨまた
はＫＯＨを含んでいる。本発明のＦｃ結合タンパク質の高いアルカリ安定性の故に、この
ような強アルカリ性溶液が洗浄の目的のために使用されることができる。
【0095】
いくつかの実施形態では、アフィニティーマトリックスは、少なくとも１０回、少なく
とも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、少なくとも５０回、少なくとも６０
回、少なくとも７０回、少なくとも８０回、少なくとも９０回または少なくとも１００回
、工程（ａ）～（ｅ）の反復により再使用されることができ、任意的に、（ａ）～（ｅ）
が少なくとも１０回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、少なく
とも５０回、少なくとも６０回、少なくとも７０回、少なくとも８０回、少なくとも９０
回または少なくとも１００回、繰り返されることができる。
とも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、少なくとも５０回、少なくとも６０
回、少なくとも７０回、少なくとも８０回、少なくとも９０回または少なくとも１００回
、工程（ａ）～（ｅ）の反復により再使用されることができ、任意的に、（ａ）～（ｅ）
が少なくとも１０回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、少なく
とも５０回、少なくとも６０回、少なくとも７０回、少なくとも８０回、少なくとも９０
回または少なくとも１００回、繰り返されることができる。
【0096】
一般に、アフィニティー精製の方法を実施するのに適した条件は当業者に周知である。
いくつかの実施形態では、開示されたＦｃ結合ドメインを含む、アフィニティー精製の開
示された使用および方法は、３．５以上の（たとえば約４．０、約４．５、約５．０、約
５．５、約６．０または約６．５の）ｐＨでＦｃ含有タンパク質の少なくとも約９０％、
少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％ま
たは少なくとも約９９％の溶出を提供してもよい。
いくつかの実施形態では、開示されたＦｃ結合ドメインを含む、アフィニティー精製の開
示された使用および方法は、３．５以上の（たとえば約４．０、約４．５、約５．０、約
５．５、約６．０または約６．５の）ｐＨでＦｃ含有タンパク質の少なくとも約９０％、
少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％ま
たは少なくとも約９９％の溶出を提供してもよい。
【0097】
核酸分子
第５の様相では、本発明は、上に開示された任意の実施形態のＦｃ結合タンパク質をコ
ードする核酸分子、好ましくは単離された核酸分子に関する。１つの実施形態では、本発
明は核酸分子を含んでいるベクターに関する。ベクターとは、タンパク質をコードする情
報を宿主細胞中に転移するために使用されることができる任意の分子または部分（たとえ
ば、核酸、プラスミド、バクテリオファージまたはウィルス）を意味する。１つの実施形
態では、ベクターは発現ベクターである。
第５の様相では、本発明は、上に開示された任意の実施形態のＦｃ結合タンパク質をコ
ードする核酸分子、好ましくは単離された核酸分子に関する。１つの実施形態では、本発
明は核酸分子を含んでいるベクターに関する。ベクターとは、タンパク質をコードする情
報を宿主細胞中に転移するために使用されることができる任意の分子または部分（たとえ
ば、核酸、プラスミド、バクテリオファージまたはウィルス）を意味する。１つの実施形
態では、ベクターは発現ベクターである。
【0098】
第６の様相では、本発明は、上で開示された核酸またはベクターを含んでいる発現シス
テムに関し、たとえば原核生物の宿主細胞、例として大腸菌（Ｅ. Ｃｏｌｉ）、または真
核生物の宿主、例として酵母サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）もしくはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ
）、または哺乳類細胞、例としてＣＨＯ細胞に関する。
テムに関し、たとえば原核生物の宿主細胞、例として大腸菌（Ｅ. Ｃｏｌｉ）、または真
核生物の宿主、例として酵母サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）もしくはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ
）、または哺乳類細胞、例としてＣＨＯ細胞に関する。
【0099】
Ｆｃ結合タンパク質を産生する方法
第７の様相では、本発明は、以下の工程を含む本発明のＦｃ結合タンパク質を産生する
方法に関する：（ａ）当該Ｆｃ結合タンパク質を得るために、この結合タンパク質の発現
に適した条件の下で第６の様相の宿主細胞を培養する工程；および（ｂ）任意的に当該Ｆ
ｃ結合タンパク質を分離する工程。原核生物または真核生物の宿主の培養に適した条件は
当業者に周知である。
第７の様相では、本発明は、以下の工程を含む本発明のＦｃ結合タンパク質を産生する
方法に関する：（ａ）当該Ｆｃ結合タンパク質を得るために、この結合タンパク質の発現
に適した条件の下で第６の様相の宿主細胞を培養する工程；および（ｂ）任意的に当該Ｆ
ｃ結合タンパク質を分離する工程。原核生物または真核生物の宿主の培養に適した条件は
当業者に周知である。
【0100】
本発明のＦｃ結合分子は、多くの従来型で周知の技術、たとえば単純な有機合成戦略、
固相支援合成技術または市販の自動シンセサイザーのいずれかによって調製されてもよい
。他方において、本発明のＦｃ結合分子は、従来の組み換え技術によって単独でまたは従
来の合成技術との組み合わせで調製されてもよい。
固相支援合成技術または市販の自動シンセサイザーのいずれかによって調製されてもよい
。他方において、本発明のＦｃ結合分子は、従来の組み換え技術によって単独でまたは従
来の合成技術との組み合わせで調製されてもよい。
【0101】
本発明の１つの実施形態は、上で詳細に説明された本発明によるＦｃ結合タンパク質を
調製する方法に関し、当該方法は以下の工程を含む：（ａ）上に定義されたＦｃ結合タン
パク質をコードする核酸を準備する工程；（ｂ）当該核酸を発現ベクターに導入する工程
；（ｃ）当該発現ベクターを宿主細胞に導入する工程；（ｄ）宿主細胞を培養する工程；
（ｅ）Ｆｃ結合タンパク質が発現される培養条件に宿主細胞を付する工程、それによって
（ｅ）上に記載されたＦｃ結合タンパク質を産生する工程；任意的に、（ｆ）工程（ｅ）
で産生されたタンパク質を単離する工程；および（ｇ）任意的に、上に記載された固体マ
トリックスに当該タンパク質をコンジュゲートする工程。
本発明のさらなる実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質の産生は無細胞の生体外の転写／
翻訳によって実施される。
［実施例］
調製する方法に関し、当該方法は以下の工程を含む：（ａ）上に定義されたＦｃ結合タン
パク質をコードする核酸を準備する工程；（ｂ）当該核酸を発現ベクターに導入する工程
；（ｃ）当該発現ベクターを宿主細胞に導入する工程；（ｄ）宿主細胞を培養する工程；
（ｅ）Ｆｃ結合タンパク質が発現される培養条件に宿主細胞を付する工程、それによって
（ｅ）上に記載されたＦｃ結合タンパク質を産生する工程；任意的に、（ｆ）工程（ｅ）
で産生されたタンパク質を単離する工程；および（ｇ）任意的に、上に記載された固体マ
トリックスに当該タンパク質をコンジュゲートする工程。
本発明のさらなる実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質の産生は無細胞の生体外の転写／
翻訳によって実施される。
［実施例］
【0102】
以下の実施例は、本発明のさらなる例示のために提供される。しかし、本発明はそれに
限定されず、以下の実施例は上の記載に基いて本発明が実施可能であることを単に示すに
過ぎない。
限定されず、以下の実施例は上の記載に基いて本発明が実施可能であることを単に示すに
過ぎない。
【実施例0103】
Ｆｃに結合する人工モザイクタンパク質の産生
Ｆｃ結合タンパク質が、天然型のタンパク質Ａのドメイン（Ｅ、Ｂ、Ｄ、Ａ、Ｃ、Ｚ）
のシャッフリングプロセスによって初めに生成された。より詳細には、本明細書で理解さ
れるシャッフリングプロセスとは、１組の同一でない既知のアミノ酸配列から出発して人
工的なアミノ酸配列をもたらす組み立てプロセスである。シャッフリングプロセスは以下
の工程から構成される：ａ）５つの天然型のタンパク質ＡのドメインＥ、Ｂ、Ｄ、Ａおよ
びＣならびにタンパク質Ａ変異体ドメインＺの配列を準備する工程；およびｂ）当該配列
のアラインメント；ｃ）コンピューター内での統計的断片化によって、組み換えられた部
分配列を同定する工程；そして次にｄ）様々な断片から新規な人工的な配列を組み立てて
、モザイク産物、すなわち新規かつ人工的なアミノ酸配列を生成する工程。工程ｃ）で生
成された断片は任意の長さのもの、たとえば断片化された親配列がｎの長さを有していた
場合、断片は長さが１～ｎ－１であった。
Ｆｃ結合タンパク質が、天然型のタンパク質Ａのドメイン（Ｅ、Ｂ、Ｄ、Ａ、Ｃ、Ｚ）
のシャッフリングプロセスによって初めに生成された。より詳細には、本明細書で理解さ
れるシャッフリングプロセスとは、１組の同一でない既知のアミノ酸配列から出発して人
工的なアミノ酸配列をもたらす組み立てプロセスである。シャッフリングプロセスは以下
の工程から構成される：ａ）５つの天然型のタンパク質ＡのドメインＥ、Ｂ、Ｄ、Ａおよ
びＣならびにタンパク質Ａ変異体ドメインＺの配列を準備する工程；およびｂ）当該配列
のアラインメント；ｃ）コンピューター内での統計的断片化によって、組み換えられた部
分配列を同定する工程；そして次にｄ）様々な断片から新規な人工的な配列を組み立てて
、モザイク産物、すなわち新規かつ人工的なアミノ酸配列を生成する工程。工程ｃ）で生
成された断片は任意の長さのもの、たとえば断片化された親配列がｎの長さを有していた
場合、断片は長さが１～ｎ－１であった。
【0104】
モザイク産物中のアミノ酸の相対的位置は、出発のアミノ酸配列に関して維持された。
位置Ｑ９、Ｑ１０、Ａ１２、Ｆ１３、Ｙ１４、Ｌ１７、Ｐ２０、Ｌ２２、Ｑ２６、Ｒ２７
、Ｆ３０、Ｉ３１、Ｑ３２、Ｓ３３、Ｌ３４、Ｄ３６、Ｄ３７、Ｐ３８、Ｓ３９、Ｓ４１
、Ｌ４５、Ｅ４７、Ａ４８、Ｋ５０、Ｌ５１、Ｑ５５、Ａ５６、Ｐ５７の少なくとも９０
％は、たとえばＩＢ１４、ＩＢ２７、ＩＢ２４、ＩＢ２６、ＩＢ２８、ＩＢ２０（配列番
号７８～８３）の人工的なモザイクアミノ酸配列と天然型のタンパク質Ａドメインまたは
タンパク質Ａドメイン変異体との間で同一である。モザイクドメインおよび天然型のタン
パク質Ａドメインまたはタンパク質Ａドメイン変異体は、アミノ酸残基７～１９からのヘ
リックス１、アミノ酸残基２３～３７からのヘリックス２およびアミノ酸残基４０～５５
からのヘリックス３を有する５８個のアミノ酸の３つのヘリックス束によって特徴付けら
れる。たとえば人工のＦｃ結合ドメインＩＢ１４、ＩＢ２６およびＩＢ２７の全アミノ酸
配列は、それが天然型のタンパク質ＡドメインまたはドメインＺのいずれかの全アミノ酸
配列と８５％以下の同一性である点において人工的である。最初の人工的なＦｃ結合タン
パク質が生成された後に、いくつかの場合には、このタンパク質はアミノ酸配列の部位特
異的なランダム化によってさらに改変されて、生化学的な特性がさらに改変された。この
さらなる改変は、個々のアミノ酸残基の部位飽和突然変異生成によって導入された。
位置Ｑ９、Ｑ１０、Ａ１２、Ｆ１３、Ｙ１４、Ｌ１７、Ｐ２０、Ｌ２２、Ｑ２６、Ｒ２７
、Ｆ３０、Ｉ３１、Ｑ３２、Ｓ３３、Ｌ３４、Ｄ３６、Ｄ３７、Ｐ３８、Ｓ３９、Ｓ４１
、Ｌ４５、Ｅ４７、Ａ４８、Ｋ５０、Ｌ５１、Ｑ５５、Ａ５６、Ｐ５７の少なくとも９０
％は、たとえばＩＢ１４、ＩＢ２７、ＩＢ２４、ＩＢ２６、ＩＢ２８、ＩＢ２０（配列番
号７８～８３）の人工的なモザイクアミノ酸配列と天然型のタンパク質Ａドメインまたは
タンパク質Ａドメイン変異体との間で同一である。モザイクドメインおよび天然型のタン
パク質Ａドメインまたはタンパク質Ａドメイン変異体は、アミノ酸残基７～１９からのヘ
リックス１、アミノ酸残基２３～３７からのヘリックス２およびアミノ酸残基４０～５５
からのヘリックス３を有する５８個のアミノ酸の３つのヘリックス束によって特徴付けら
れる。たとえば人工のＦｃ結合ドメインＩＢ１４、ＩＢ２６およびＩＢ２７の全アミノ酸
配列は、それが天然型のタンパク質ＡドメインまたはドメインＺのいずれかの全アミノ酸
配列と８５％以下の同一性である点において人工的である。最初の人工的なＦｃ結合タン
パク質が生成された後に、いくつかの場合には、このタンパク質はアミノ酸配列の部位特
異的なランダム化によってさらに改変されて、生化学的な特性がさらに改変された。この
さらなる改変は、個々のアミノ酸残基の部位飽和突然変異生成によって導入された。
【0105】
人工的なＦｃ結合タンパク質用の遺伝子は当業者に知られた標準方法を使用して合成さ
れ、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）発現ベクター中にクローンが作られた。ＤＮＡシークエンシ
ングが使用されて、挿入された断片の正確な配列が検証された。
多量体Ｆｃ結合タンパク質を生成するために、２つまたは３つの同一のＦｃ結合ドメイン
が遺伝子工学的に融合された。
特定の精製については、任意的に、ｓｔｒｅｐタグ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ；配列番号８９）
がＦｃ結合タンパク質のＣ末端に付加された。
れ、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）発現ベクター中にクローンが作られた。ＤＮＡシークエンシ
ングが使用されて、挿入された断片の正確な配列が検証された。
多量体Ｆｃ結合タンパク質を生成するために、２つまたは３つの同一のＦｃ結合ドメイン
が遺伝子工学的に融合された。
特定の精製については、任意的に、ｓｔｒｅｐタグ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ；配列番号８９）
がＦｃ結合タンパク質のＣ末端に付加された。
【実施例0106】
変異体を生成する突然変異生成
部位特異的な突然変異生成については、Ｑ５（商標）部位特異的突然変異生成キット（
ＮＥＢ；カタログ番号Ｅ０５５４Ｓ）が製造業者の取扱説明書に従って使用された。ＰＣ
Ｒが、各特定の置換のそれぞれをコードするオリゴヌクレオチドおよびテンプレートを含
有するプラスミドを用いて実施された。産物がライゲーションされ、電気穿孔法によって
大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＸＬ２－ブルー細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）中に形質転換さ
れた。単一コロニーが単離され、ＤＮＡシークエンシングが挿入物含有クローンについて
使用されて、正確な配列が検証された。
部位特異的な突然変異生成については、Ｑ５（商標）部位特異的突然変異生成キット（
ＮＥＢ；カタログ番号Ｅ０５５４Ｓ）が製造業者の取扱説明書に従って使用された。ＰＣ
Ｒが、各特定の置換のそれぞれをコードするオリゴヌクレオチドおよびテンプレートを含
有するプラスミドを用いて実施された。産物がライゲーションされ、電気穿孔法によって
大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＸＬ２－ブルー細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）中に形質転換さ
れた。単一コロニーが単離され、ＤＮＡシークエンシングが挿入物含有クローンについて
使用されて、正確な配列が検証された。
【0107】
いくつかの点変異の組み合わせがＧｅｎｅＡｒｔ（商標）Ｓｔｒｉｎｇｓ（商標）合成
法（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）によって生成された。Ｓｔｒ
ｉｎｇｓのＤＮＡ断片は精製されたＰＣＲ産物に相当し、ｐＥＴ２８ａベクターの派生物
中にクローンされた。ライゲーション産物が電気穿孔法によって大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）
ＸＬ２－ブルー細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）中に形質転換された。単一コロニーがＰ
ＣＲによってスクリーニングされて、正しいサイズの挿入物を含有する構築物が同定され
た。ＤＮＡシークエンシングが使用されて、正確な配列が検証された。点変異を有するい
くつかの変異体が、たとえば図１に示される。
法（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）によって生成された。Ｓｔｒ
ｉｎｇｓのＤＮＡ断片は精製されたＰＣＲ産物に相当し、ｐＥＴ２８ａベクターの派生物
中にクローンされた。ライゲーション産物が電気穿孔法によって大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）
ＸＬ２－ブルー細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）中に形質転換された。単一コロニーがＰ
ＣＲによってスクリーニングされて、正しいサイズの挿入物を含有する構築物が同定され
た。ＤＮＡシークエンシングが使用されて、正確な配列が検証された。点変異を有するい
くつかの変異体が、たとえば図１に示される。
【実施例0108】
Ｆｃ結合タンパク質の発現
ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞が、Ｆｃ結合タンパク質をコードする発現プラス
ミドを用いて形質転換された。細胞は選択的寒天プレート（カナマイシン）上に広げられ
、３７℃で一晩インキュベートされた。予備培養物は１００ｍｌの２×ＹＴ培地中で単一
コロニーから接種を受けて、ラクトースおよび消泡剤を含んでいない１５０μｇ／ｍｌの
カナマイシンで補給された、バッフル付き１リットルのエルレンマイヤーフラスコ中の従
来型の軌道シェーカーの中で１６０ｒｐｍ、３７℃で１６時間培養された。ＯＤ６００の
計測値は６～１２の範囲にあるはずである。主培養物は、１５０μｇ／ｍｌのカナマイシ
ンで補給された、１リットルの厚肉エルレンマイヤーフラスコ内の４００ｍｌのスーパー
リッチ培地（変性Ｈ１５培地２％のグルコース、５％の酵母エキス、０．８９％のグリセ
リン、０．７６％のラクトース、２５０ｍＭのＭＯＰＳ、２０２ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ７
．４、消泡剤ＳＥ１５）中で、０．５の調整後の開始時ＯＤ６００計測値を有する先の一
晩培養物から接種を受けた。培養物は共鳴音響ミキサー（ＲＡＭｂｉｏ）に転送され、２
０×ｇ、３７℃でインキュベートされた。通気はＯｘｙ－Ｐｕｍｐストッパーによって促
進された。組み換えタンパク質の発現が、グルコースを代謝させ、引き続いてラクトース
を細胞内に進入させることによって誘導された。所定の時点でＯＤ６００が測定され、５
／ＯＤ６００に調整されたサンプルが抜き出され、ペレット化され、－２０℃で凍結され
た。細胞はおよそ２４時間にわたり一晩増殖させられて、約４５～６０の最終ＯＤ６００
に達した。バイオマスを収集するために、細胞は２０℃で１０分間、１６０００×ｇで遠
心分離された。ペレットは秤量（湿潤重量）され、ｐＨが上清中で測定された。細胞はプ
ロセッシングされるまで－２０℃で貯蔵された。
ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞が、Ｆｃ結合タンパク質をコードする発現プラス
ミドを用いて形質転換された。細胞は選択的寒天プレート（カナマイシン）上に広げられ
、３７℃で一晩インキュベートされた。予備培養物は１００ｍｌの２×ＹＴ培地中で単一
コロニーから接種を受けて、ラクトースおよび消泡剤を含んでいない１５０μｇ／ｍｌの
カナマイシンで補給された、バッフル付き１リットルのエルレンマイヤーフラスコ中の従
来型の軌道シェーカーの中で１６０ｒｐｍ、３７℃で１６時間培養された。ＯＤ６００の
計測値は６～１２の範囲にあるはずである。主培養物は、１５０μｇ／ｍｌのカナマイシ
ンで補給された、１リットルの厚肉エルレンマイヤーフラスコ内の４００ｍｌのスーパー
リッチ培地（変性Ｈ１５培地２％のグルコース、５％の酵母エキス、０．８９％のグリセ
リン、０．７６％のラクトース、２５０ｍＭのＭＯＰＳ、２０２ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ７
．４、消泡剤ＳＥ１５）中で、０．５の調整後の開始時ＯＤ６００計測値を有する先の一
晩培養物から接種を受けた。培養物は共鳴音響ミキサー（ＲＡＭｂｉｏ）に転送され、２
０×ｇ、３７℃でインキュベートされた。通気はＯｘｙ－Ｐｕｍｐストッパーによって促
進された。組み換えタンパク質の発現が、グルコースを代謝させ、引き続いてラクトース
を細胞内に進入させることによって誘導された。所定の時点でＯＤ６００が測定され、５
／ＯＤ６００に調整されたサンプルが抜き出され、ペレット化され、－２０℃で凍結され
た。細胞はおよそ２４時間にわたり一晩増殖させられて、約４５～６０の最終ＯＤ６００
に達した。バイオマスを収集するために、細胞は２０℃で１０分間、１６０００×ｇで遠
心分離された。ペレットは秤量（湿潤重量）され、ｐＨが上清中で測定された。細胞はプ
ロセッシングされるまで－２０℃で貯蔵された。