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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023119736
(43)【公開日】2023-08-29
(54)【発明の名称】植物用抵抗性誘導剤
(51)【国際特許分類】
A01N 61/00 20060101AFI20230822BHJP
A01P 3/00 20060101ALI20230822BHJP
A01N 37/44 20060101ALN20230822BHJP
【ＦＩ】
A01N61/00 C
A01P3/00
A01N37/44
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022022742
(22)【出願日】2022-02-17
(71)【出願人】
【識別番号】000003296
【氏名又は名称】デンカ株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】591060980
【氏名又は名称】岡山県
(74)【代理人】
【識別番号】100088155
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹
(74)【代理人】
【識別番号】100128381
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 義憲
(74)【代理人】
【識別番号】100185591
【弁理士】
【氏名又は名称】中塚 岳
(74)【代理人】
【識別番号】100211100
【弁理士】
【氏名又は名称】福島 直樹
(72)【発明者】
【氏名】本田 一馬
(72)【発明者】
【氏名】飯野 藤樹
(72)【発明者】
【氏名】鳴坂 義弘
(72)【発明者】
【氏名】鳴坂 真理
【テーマコード（参考）】
4H011
【Ｆターム（参考）】
4H011AA01
4H011BA06
4H011BB20
4H011BC06
4H011DA13
4H011DF04
(57)【要約】
【課題】新たな植物用抵抗性誘導剤を提供すること。
【解決手段】腐植酸を有効成分として含有する、植物用抵抗性誘導剤。
【選択図】なし
【解決手段】腐植酸を有効成分として含有する、植物用抵抗性誘導剤。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
腐植酸を有効成分として含有する、植物用抵抗性誘導剤。
【請求項2】
メラニックインデックスが２．０以上である、請求項１に記載の植物用抵抗性誘導剤。
【請求項3】
前記腐植酸の質量平均分子量が１００～６，０００である、請求項１又は２に記載の植物用抵抗性誘導剤。
【請求項4】
前記有効成分が腐植酸抽出液であり、
前記腐植酸抽出液の全有機炭素濃度が１５，０００ｍｇ／Ｌ以上である、請求項１～３のいずれか一項に記載の植物用抵抗性誘導剤。
前記腐植酸抽出液の全有機炭素濃度が１５，０００ｍｇ／Ｌ以上である、請求項１～３のいずれか一項に記載の植物用抵抗性誘導剤。
【請求項5】
褐炭由来である、請求項１～４のいずれか一項に記載の植物用抵抗性誘導剤。
【請求項6】
植物の病害抵抗性を高める方法であって、
前記植物に腐植酸を施用することを含む、方法。
前記植物に腐植酸を施用することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、植物用抵抗性誘導剤に関する。
【背景技術】
【0002】
植物を病害から保護するために、病原菌、ウイルスの防除剤が用いられる場合がある。例えば、特許文献１には、金属のキレートまたは塩を有効成分とする、植物病原菌の防除剤が開示されている。例えば、特許文献２には、グルコン酸亜鉛およびグルコン酸銅の少なくとも１つを有効成分とする、植物ウイルス病の防除剤が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】特開２０２０－１３２５５２号公報
【特許文献2】特許第６６３４３２５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明は、新たな植物用抵抗性誘導剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明は、以下の各発明に関する。
［１］腐植酸を有効成分として含有する、植物用抵抗性誘導剤。
［２］メラニックインデックスが２．０以上である、［１］に記載の植物用抵抗性誘導剤。
［３］腐植酸の質量平均分子量が１００～６，０００である、［１］又は［２］に記載の植物用抵抗性誘導剤。
［４］有効成分が腐植酸抽出液であり、腐植酸抽出液の全有機炭素濃度が１５，０００ｍｇ／Ｌ以上である、［１］～［３］のいずれかに記載の植物用抵抗性誘導剤。
［５］褐炭由来である、［１］～［４］のいずれかに記載の植物用抵抗性誘導剤。
［６］植物の病害抵抗性を高める方法であって、植物に腐植酸を施用することを含む、方法。
［１］腐植酸を有効成分として含有する、植物用抵抗性誘導剤。
［２］メラニックインデックスが２．０以上である、［１］に記載の植物用抵抗性誘導剤。
［３］腐植酸の質量平均分子量が１００～６，０００である、［１］又は［２］に記載の植物用抵抗性誘導剤。
［４］有効成分が腐植酸抽出液であり、腐植酸抽出液の全有機炭素濃度が１５，０００ｍｇ／Ｌ以上である、［１］～［３］のいずれかに記載の植物用抵抗性誘導剤。
［５］褐炭由来である、［１］～［４］のいずれかに記載の植物用抵抗性誘導剤。
［６］植物の病害抵抗性を高める方法であって、植物に腐植酸を施用することを含む、方法。
【発明の効果】
【0006】
本発明によれば、新たな植物用抵抗性誘導剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】試験例１におけるＰＲ１遺伝子の発現解析結果を示すグラフである。
【図2】試験例２におけるＰＲ１遺伝子の発現解析結果を示すグラフである。
【図3】試験例３において腐植酸抽出液の施用による発病度の抑制効果を確認した結果を示すグラフである。
【図4】試験例４において腐植酸抽出液の施用による発病度の抑制効果を確認した結果を示すグラフである。
【図5】試験例５において腐植酸抽出液の施用による発病度の抑制効果を確認した結果を示すグラフである。
【図6】試験例６において腐植酸抽出液の施用による発病度の抑制効果を確認した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0008】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【0009】
〔植物用抵抗性誘導剤〕
本実施形態に係る植物用抵抗性誘導剤は、腐植酸を有効成分として含有する。本実施形態に係る植物用抵抗性誘導剤は、これを使用しない場合と比べて、植物の病害抵抗性を高めることができる。本実施形態に係る植物用抵抗性誘導剤は、その効果がマイルドであるため、薬害を発生させることなく、植物の病害抵抗性を高めることができる。本実施形態に係る植物用抵抗性誘導剤は、作物保護に好適に用いることができる。抵抗性が誘導されていることは、例えば、感染特異的タンパク質（ＰＲタンパク質）遺伝子（例えば、ＰＲ１遺伝子）の発現量によって確認することができる。
本実施形態に係る植物用抵抗性誘導剤は、腐植酸を有効成分として含有する。本実施形態に係る植物用抵抗性誘導剤は、これを使用しない場合と比べて、植物の病害抵抗性を高めることができる。本実施形態に係る植物用抵抗性誘導剤は、その効果がマイルドであるため、薬害を発生させることなく、植物の病害抵抗性を高めることができる。本実施形態に係る植物用抵抗性誘導剤は、作物保護に好適に用いることができる。抵抗性が誘導されていることは、例えば、感染特異的タンパク質（ＰＲタンパク質）遺伝子（例えば、ＰＲ１遺伝子）の発現量によって確認することができる。
【0010】
抵抗性誘導剤の対象となる植物は、特に制限されないが、例えば、ナス科植物、ウリ科植物、バラ科植物、アブラナ科植物、イネ科植物、サトイモ科植物、マメ科植物が挙げられる。ナス科植物としては、トマト、ナス、ピーマン、トウガラシ、タバコ、ジャガイモ等が挙げられる。ウリ科植物としては、キュウリ、カボチャ、メロン等が挙げられる。バラ科植物としては、イチゴ、リンゴ、ナシ、ウメ、モモ等が挙げられる。アブラナ科植物としては、例えば、ハクサイ、チンゲンサイ、キャベツ、コマツナ、シロイヌナズナ等が挙げられる。イネ科植物としては、イネ、コムギ等が挙げられる。サトイモ科植物としては、サトイモ等が挙げられる。マメ科植物としては、ダイズ、エンドウ等が挙げられる。
【0011】
本実施形態に係る植物用抵抗性誘導剤は、植物種に応じた種々の病害に対する抵抗性を高めることができる。病害と、植物（宿主植物）との関係は、例えば、日本植物病名データベース（農業生物資源ジーンバンク）に収載されている。病原菌としては、例えば、トマト斑葉細菌病菌（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）、アブラナ科野菜黒斑細菌病菌（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃａｎｎａｂｉｎａ ｐｖ． ａｌｉｓａｌｅｎｓｉｓ）が挙げられる。
【0012】
＜腐植酸＞
本明細書における「腐植酸」には、フミン酸及びフルボ酸が含まれる。腐植酸は、腐植酸及び腐植酸塩からなる群より選択される１種以上を含む。腐植酸は、作物体の生育を促進する、環境ストレス（例えば、温暖化の影響）を受けにくくなる等の農業上の利点を有するため、本実施形態に係る植物用抵抗性誘導剤によれば、植物病害の抵抗性を誘導するとともに、植物の生育を促進する、及び、環境ストレス（例えば、温暖化の影響）を受けにくくなる等の効果を得ることができる。
本明細書における「腐植酸」には、フミン酸及びフルボ酸が含まれる。腐植酸は、腐植酸及び腐植酸塩からなる群より選択される１種以上を含む。腐植酸は、作物体の生育を促進する、環境ストレス（例えば、温暖化の影響）を受けにくくなる等の農業上の利点を有するため、本実施形態に係る植物用抵抗性誘導剤によれば、植物病害の抵抗性を誘導するとともに、植物の生育を促進する、及び、環境ストレス（例えば、温暖化の影響）を受けにくくなる等の効果を得ることができる。
【0013】
腐植酸としては、泥炭及び風化炭等の天然に産出される天然腐植酸、褐炭の硝酸酸化等により人工的に製造される人工腐植酸、及び、天然腐植酸又は人工腐植酸をナトリウム、カリウム、アンモニア、カルシウム及びマグネシウム等のアルカリ物質で中和した腐植酸塩等が挙げられる。腐植酸としては、フルボ酸、フミン酸、ニトロフミン酸、フミン酸アンモニウム、フミン酸カルシウム、フミン酸マグネシウム、ニトロフミン酸アンモニウム、ニトロフミン酸カルシウム及びニトロフミン酸マグネシウム、フミン酸カリウム、ニトロフミン酸カリウム等が挙げられる。
【0014】
有効成分は、腐植酸抽出液であってよい。腐植酸抽出液は、若年炭の硝酸酸化物を、水と必要によりアルカリを含む抽出溶媒により抽出した抽出物であってよい。
【0015】
若年炭とは、瀝青炭等に比べ炭素含有量の少ない石炭であり、炭素含有率が８３質量％以下であるものと定義される。若年炭としては、例えば、泥炭、亜炭、褐炭、亜瀝青炭等が挙げられる。若年炭は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用してよい。腐植酸は、抵抗性誘導効果の点から、褐炭由来であってよい。
【0016】
若年炭の硝酸酸化物は、若年炭を硝酸で酸化分解させて得られる。硝酸としては濃硝酸が好ましい。安全性と反応性の点で、濃度４０～６０質量％の硝酸を用いることが好ましい。酸化分解の際の硝酸（ＨＮＯ３）の使用量は、若年炭２０質量部に対して、１０質量部以上、又は２０質量部以上であってよく、３００質量部以下、２５０質量部以下、２００質量部以下、１５０質量部以下、１００質量部以下、５０質量部以下、３６質量部以下、又は２０質量部以下であってよい。硝酸（ＨＮＯ３）の使用量は、若年炭２０質量部に対して、１０～２０質量部であってよく、２０～３６質量部であってよい。ここで、硝酸の使用量は１００％硝酸（１００％ＨＮＯ３）に換算した値である。
【0017】
酸化分解の際の温度は、例えば、７０～９５℃であってよい。酸化反応のスターターとして、湯浴等で７０～９５℃に加温すると酸化反応が速やかに進行しやすい。反応時間は、例えば、２０分間以上、０．５時間以上、又は１時間以上であってよく、６時間以下、４時間以下、又は１時間以下であってよい。
【0018】
腐植酸抽出液は、例えば、若年炭の硝酸酸化物（以下、腐植酸粗製物という）と、水及びアルカリを含む抽出溶媒とを攪拌した後、固液分離工程を行うことにより、液状物として得られる。
【0019】
アルカリとしては、水酸化物、アンモニア等が挙げられる。水酸化物としては、アルカリ金属の水酸化物、水酸化アンモニウム等が挙げられる。水酸化物としては、アルカリ金属の水酸化物が好ましい。アルカリ金属の水酸化物としては、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム等が挙げられる。水酸化物としては、水酸化カリウム、酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム（アンモニア水）のうちの１種以上が好ましい。抽出溶媒のｐＨは、０．５～７．０、０．５～４．０又は１．０～３．０であってよい。
【0020】
腐植酸粗製物を抽出溶媒で抽出する際の温度（抽出温度）は、抽出液の凍結及び品質低下を更に抑制する観点から、例えば、４０～９０℃であってよい。腐植酸粗製物を抽出溶媒で抽出する時間（抽出時間）は、例えば、０．５時間以上であってよく、２４時間以下であってよく、１時間以下であってもよい。
【0021】
腐植酸粗製物を調製するために用いた原料の若年炭の量に対する抽出溶媒の量を、固液比と定義する。例えば、若年炭２０ｇから調製された粗製物に抽出溶媒（水）１００ｇ（１００ｍＬ）を添加した場合、固液比（抽出溶媒／若年炭）は５となる。固液比は３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上又は１０以上であってよく、１５以下、１３以下、１１以下、９以下、７以下、又は６以下であってよい。固液比は、水の添加によって調整することができる。固液比は、ｐＨを調整後に目的の固液比となるように調整されてよい。固液分離する方法は、遠心分離、フィルタープレス等であってよい。
【0022】
腐植酸抽出液の全有機炭素濃度（ＴＯＣ）は１５，０００ｍｇ／Ｌ以上、１５，３００ｍｇ／Ｌ以上、１５，５００ｍｇ／Ｌ以上、１６，０００ｍｇ／Ｌ以上、１６，５００ｍｇ／Ｌ以上、１７，０００ｍｇ／Ｌ以上、１７，５００ｍｇ／Ｌ以上、１８，０００ｍｇ／Ｌ以上、１８，５００ｍｇ／Ｌ以上、１９，０００ｍｇ／Ｌ以上、１９，５００ｍｇ／Ｌ以上、２０，０００ｍｇ／Ｌ以上、又は２０，５００ｍｇ／Ｌ以上であってよい。腐植酸抽出液のＴＯＣは、７５，０００ｍｇ／Ｌ以下、７０，０００ｍｇ／Ｌ以下、６５，０００ｍｇ／Ｌ以下、６０，０００ｍｇ／Ｌ以下、５５，０００ｍｇ／Ｌ以下、５０，０００ｍｇ／Ｌ以下、４５，０００ｍｇ／Ｌ以下、４０，０００ｍｇ／Ｌ以下、３５，０００ｍｇ／Ｌ以下、３０，０００ｍｇ／Ｌ以下、２５，０００ｍｇ／Ｌ以下、２４，０００ｍｇ／Ｌ以下、２３，０００ｍｇ／Ｌ以下、又は２２，０００ｍｇ／Ｌ以下であってよい。
【0023】
腐植酸抽出液のＴＯＣの測定方法は、次のように定義される。腐植酸抽出液を、３，０００×ｇで遠心分離した上澄み液を、全有機体炭素計（島津製作所製ＴＯＣ－Ｌ）を用いて燃焼触媒酸化方式で測定した値である。肥料成分である尿素等の非腐植物質を含む場合は、国際腐植物質学会法（藤嶽、ＨｕｍｉｃＳｕｂｓｔａｎｃｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌ３、Ｐ１－９）に準じて分別したもの（フミン酸画分及びフルボ酸画分）を上記の手法にて定量し、腐植酸抽出液のＴＯＣを測定する。
【0024】
腐植酸のメラニックインデックス（ＭＩ）は、例えば、１．５以上、２．０以上、２．２以上、２．５以上、３．０以上、又は３．５以上であってよい。腐植酸のＭＩは、６．５以下、６．０以下、５．５以下、５．０以下、４．５以下、４．０以下、３．５以下、又は３．０以下であってよい。
【0025】
ＭＩとは、腐植酸の分類に用いられている指標であり、水酸化ナトリウム抽出液の吸収スペクトルの波長４５０ｎｍと５２０ｎｍにおける吸光度の比（Ａ４５０／Ａ５２０）である。（熊田恭一著、土壌有機物の化学第２版 学会出版センター（１９８１）、日本土壌肥料学雑誌 第７１号 第１号 ｐ．８２～８５（２０００））。
【0026】
より具体的には、ＭＩとは、次の方法によって算出されるものである。試料を乳鉢と２５０μｍ篩を用い２５０μｍ篩下品に粉砕する。その約１０ｇを、質量が既知の秤量ビンに取り精秤する。この秤量ビンを温度１０５℃に保持した乾燥機で約１２時間放置し、その後、デシケーター中で室温に戻してから再度精秤する。その質量減少分を水分とみなして試料の含水率を求める。次に、５０ｍｌ遠沈管に、上記２５０μｍ篩下品を乾燥質量相当量で０．１０ｇと、０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液４５ｍｌとを入れ、室温２０℃で約１時間、２５０ｒｐｍの速度で振とうした後、３，０００×ｇ、約１０分間の遠心分離を実施し、その上澄み液をアドバンテック社製Ｎｏ．５Ｃの濾紙で濾過する。濾液の４５０ｎｍの吸光度と５２０ｎｍの吸光度を、蒸留水をブランクとして測定する。この場合、４５０ｎｍの吸光度が１．０以上を示したならば、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を添加し吸光度が０．８以上１．０未満に調整してから、５２０ｎｍの吸光度を測定する。（４５０ｎｍでの吸光度／５２０ｎｍでの吸光度）の比を算出し、ＭＩとする。
【0027】
腐植酸の質量平均分子量は、１００～６，０００であってよい。腐植酸の質量平均分子量の下限は、例えば、２００以上、３００以上、４００以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、又は１０００以上であってよい。腐植酸の質量平均分子量の上限は、例えば、５，５００以下、５，０００以下、４，５００以下、４，０００以下、３，５００以下、３，０００以下、２，５００以下、２，０００以下、１，５００以下、１，２０００以下、又は１，０００以下であってよい。
【0028】
腐植酸の質量平均分子量は、Ｗａｔｅｒｓ社製Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍを用い、ＨＰＳＥＣ法（ＧＰＣ法）により測定される。カラムは昭和電工（株）ＳＢ－８０３ＨＱ、標準試料はポリスチレンスルホン酸ナトリウムを用い、検出波長は２６０ｎｍとする。移動相は２５質量％アセトニトリル含有の１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液とし、流速は０．８ｍｌ／分とし、カラムの温度は４０℃（カラムオーブンの設定値）とする。
【0029】
植物用抵抗性誘導剤の剤型は、例えば、液剤又は粉剤であってよい。粉剤は、例えば、液剤である植物用抵抗性誘導剤を凍結乾燥等によってドライアップすることにより、再溶解可能な粉剤として得ることができる。
【0030】
植物用抵抗性誘導剤は、腐植酸以外の他の成分を含んでいてよい。他の成分としては、例えば、展着剤、肥料、植物活性剤が挙げられる。肥料としては、例えば、硫酸アンモニウム、硝酸カリウム、リン酸アンモニウムが挙げられる。植物活性剤としては例えば海藻抽出エキス、アミノ酸が挙げられる。アミノ酸としては、例えば、グリシン、プロリン、グルタミン酸が挙げられる。植物用抵抗性誘導剤がグリシンを含む場合、病害の抑制効果を更に高めることができる。
【0031】
本実施形態に係る植物の病害抵抗性を高める方法は、植物に腐植酸を施用することを含む。
【0032】
植物に腐植酸を施用する方法として、植物に対して散布、塗付等を行う方法、土壌潅注又は土壌混和等を行う方法が挙げられる。
【0033】
腐植酸の施用量及び施用期間は特に限られず、土壌施用の場合は全有機炭素濃度として０．１～１０００ｍｇ／Ｌを月に１～３０回若しくは全有機炭素濃度として０．１～１００ｍｇ／Ｌ程度を毎日とすることができ、水耕栽培の場合は全有機炭素濃度として０．１～１０００ｍｇ／Ｌを全栽培期間とすることができ、葉面施用の場合は全有機炭素濃度として０．１～１０００ｍｇ／Ｌで月に１～１２回とすることができる。
【実施例0034】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。但し、本発明は、以下の実施例により限定されるものではない。
【0035】
［腐植酸抽出液Ａの準備］
ドラフト中で、炭素含有率が７７質量％の褐炭５００ｇを１,０００ｍｌのビーカーに入れて、濃度４８質量％の硝酸６２５ｇ（若年炭１００質量部に対して１００％硝酸６０質量部）を添加した。８０℃の水浴中で３時間酸化反応を行った。この操作で得た腐植酸を含む粗製物を以下の抽出操作に供した。
この粗製物１００ｇに０．５ｍｏｌ／Ｌの水酸化カリウム水溶液を約９００ｍＬ加え、ｐＨ計でモニタしながら１.０ｍｏｌ／Ｌの水酸化カリウム水溶液を適宜加えｐＨ６．５とした。固液比（抽出溶媒／若年炭）１０：１となるように水を加え、８０℃で１時間抽出した。この抽出液を、３，０００×ｇで遠心分離し、得られた上澄み液は適宜希釈し、質量平均分子量、全有機炭素濃度（ＴＯＣ）及びメラニックインデックス（ＭＩ）を測定した。
ドラフト中で、炭素含有率が７７質量％の褐炭５００ｇを１,０００ｍｌのビーカーに入れて、濃度４８質量％の硝酸６２５ｇ（若年炭１００質量部に対して１００％硝酸６０質量部）を添加した。８０℃の水浴中で３時間酸化反応を行った。この操作で得た腐植酸を含む粗製物を以下の抽出操作に供した。
この粗製物１００ｇに０．５ｍｏｌ／Ｌの水酸化カリウム水溶液を約９００ｍＬ加え、ｐＨ計でモニタしながら１.０ｍｏｌ／Ｌの水酸化カリウム水溶液を適宜加えｐＨ６．５とした。固液比（抽出溶媒／若年炭）１０：１となるように水を加え、８０℃で１時間抽出した。この抽出液を、３，０００×ｇで遠心分離し、得られた上澄み液は適宜希釈し、質量平均分子量、全有機炭素濃度（ＴＯＣ）及びメラニックインデックス（ＭＩ）を測定した。
【0036】
腐植酸抽出液Ａ中の腐植酸のＭＩは２．２であった。腐植酸抽出液Ａの全有機炭素濃度（ＴＯＣ）は、３４，０００ｍｇ／Ｌであった。腐植酸抽出液Ａ中の腐植酸の質量平均分子量は４，３００であった。
【0037】
［腐植酸抽出液Ｂの準備］
ドラフト中で、炭素含有率が７７質量％の褐炭５００ｇを１,０００ｍｌのビーカーに入れて、濃度４８質量％の硝酸１５６２．５ｇ（若年炭１００質量部に対して１００％硝酸１５０質量部）を添加した。８０℃の水浴中で３時間酸化反応を行った。この操作で得た腐植酸を含む粗製物を以下の抽出操作に供した。
この粗製物１００ｇに０．５ｍｏｌ／Ｌの水酸化カリウム水溶液を約４５０ｍＬ加え、ｐＨ計でモニタしながら１.０ｍｏｌ／Ｌの水酸化カリウム水溶液を適宜加えｐＨ２．０とした。固液比（抽出溶媒／若年炭）５：１となるように水を加え、８０℃で１時間抽出した。この抽出液を、３，０００×ｇで遠心分離し、得られた上澄み液は適宜希釈し、質量平均分子量、全有機炭素濃度（ＴＯＣ）及びメラニックインデックス（ＭＩ）を測定した。
ドラフト中で、炭素含有率が７７質量％の褐炭５００ｇを１,０００ｍｌのビーカーに入れて、濃度４８質量％の硝酸１５６２．５ｇ（若年炭１００質量部に対して１００％硝酸１５０質量部）を添加した。８０℃の水浴中で３時間酸化反応を行った。この操作で得た腐植酸を含む粗製物を以下の抽出操作に供した。
この粗製物１００ｇに０．５ｍｏｌ／Ｌの水酸化カリウム水溶液を約４５０ｍＬ加え、ｐＨ計でモニタしながら１.０ｍｏｌ／Ｌの水酸化カリウム水溶液を適宜加えｐＨ２．０とした。固液比（抽出溶媒／若年炭）５：１となるように水を加え、８０℃で１時間抽出した。この抽出液を、３，０００×ｇで遠心分離し、得られた上澄み液は適宜希釈し、質量平均分子量、全有機炭素濃度（ＴＯＣ）及びメラニックインデックス（ＭＩ）を測定した。
【0038】
腐植酸抽出液Ｂ中の腐植酸のＭＩは４．８であった。腐植酸抽出液Ｂの全有機炭素濃度（ＴＯＣ）は、２２,０００ｍｇ／Ｌであった。腐植酸抽出液Ｂ中の腐植酸の質量平均分子量は５３０であった。
【0039】
［質量平均分子量］
腐植酸の質量平均分子量は、Ｗａｔｅｒｓ社製Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍを用い、ＨＰＳＥＣ法（ＧＰＣ法）により測定した。カラムは昭和電工（株）ＳＢ－８０３ＨＱ、標準試料はポリスチレンスルホン酸ナトリウムを用い、検出波長は２６０ｎｍとした。移動相は２５質量％アセトニトリル含有の１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液とし、流速は０．８ｍｌ／分とし、カラムの温度は４０℃（カラムオーブンの設定値）とした。
腐植酸の質量平均分子量は、Ｗａｔｅｒｓ社製Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣ Ｓｙｓｔｅｍを用い、ＨＰＳＥＣ法（ＧＰＣ法）により測定した。カラムは昭和電工（株）ＳＢ－８０３ＨＱ、標準試料はポリスチレンスルホン酸ナトリウムを用い、検出波長は２６０ｎｍとした。移動相は２５質量％アセトニトリル含有の１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液とし、流速は０．８ｍｌ／分とし、カラムの温度は４０℃（カラムオーブンの設定値）とした。
【0040】
［全有機炭素濃度（ＴＯＣ）］
腐植酸抽出液のＴＯＣは、全有機体炭素計（島津製作所製ＴＯＣ－Ｌ）を用い、燃焼触媒酸化方式で測定した。
腐植酸抽出液のＴＯＣは、全有機体炭素計（島津製作所製ＴＯＣ－Ｌ）を用い、燃焼触媒酸化方式で測定した。
【0041】
［メラニックインデックス（ＭＩ）］
試料を乳鉢と２５０μｍ篩を用い２５０μｍ篩下品に粉砕した。その約１０ｇを、質量が既知の秤量ビンに取り精秤した。この秤量ビンを温度１０５℃に保持した乾燥機で約１２時間放置し、その後、デシケーター中で室温に戻してから再度精秤した。その質量減少分を水分とみなして試料の含水率を求めた。次に、５０ｍｌ遠沈管に、上記２５０μｍ篩下品を乾燥質量相当量で０．１０ｇと、０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液４５ｍｌとを入れ、室温２０℃で約１時間、２５０ｒｐｍの速度で振とうした後、３，０００×ｇ、約１０分間の遠心分離を実施し、その上澄み液をアドバンテック社製Ｎｏ．５Ｃの濾紙で濾過した。濾液の４５０ｎｍの吸光度と５２０ｎｍの吸光度を、蒸留水をブランクとして測定した。この場合、４５０ｎｍの吸光度が１．０以上を示したならば、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を添加し吸光度が０．８以上１．０未満に調整してから、５２０ｎｍの吸光度を測定した。（４５０ｎｍでの吸光度／５２０ｎｍでの吸光度）の比を算出し、ＭＩとした。
試料を乳鉢と２５０μｍ篩を用い２５０μｍ篩下品に粉砕した。その約１０ｇを、質量が既知の秤量ビンに取り精秤した。この秤量ビンを温度１０５℃に保持した乾燥機で約１２時間放置し、その後、デシケーター中で室温に戻してから再度精秤した。その質量減少分を水分とみなして試料の含水率を求めた。次に、５０ｍｌ遠沈管に、上記２５０μｍ篩下品を乾燥質量相当量で０．１０ｇと、０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液４５ｍｌとを入れ、室温２０℃で約１時間、２５０ｒｐｍの速度で振とうした後、３，０００×ｇ、約１０分間の遠心分離を実施し、その上澄み液をアドバンテック社製Ｎｏ．５Ｃの濾紙で濾過した。濾液の４５０ｎｍの吸光度と５２０ｎｍの吸光度を、蒸留水をブランクとして測定した。この場合、４５０ｎｍの吸光度が１．０以上を示したならば、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を添加し吸光度が０．８以上１．０未満に調整してから、５２０ｎｍの吸光度を測定した。（４５０ｎｍでの吸光度／５２０ｎｍでの吸光度）の比を算出し、ＭＩとした。
【0042】
［試験例１：シロイヌナズナの葉面に腐植酸を噴霧した際の遺伝子発現］
シロイヌナズナＣｏｌ－０（土植、播種から３週齢）に、０．１％アプローチＢＩ（農薬用展着剤、丸和バイオケミカル株式会社）を添加した２００倍（図１の×２００）希釈腐植酸抽出液Ａを噴霧処理し、１０、２４時間後にサンプリングを個体ごと（３サンプル）に行った。対照区（図１のＣｏｎｔ Ａｐ）として０．１％アプローチＢＩのみを処理した植物のサンプリングを行った。リアルタイムＰＣＲにより、ＰＲ１；Ａｔ２ｇ１４６１０の遺伝子発現を解析した。サンプル間のノーマライズにはＡｔＣＢＰ２０遺伝子を用いた。
シロイヌナズナＣｏｌ－０（土植、播種から３週齢）に、０．１％アプローチＢＩ（農薬用展着剤、丸和バイオケミカル株式会社）を添加した２００倍（図１の×２００）希釈腐植酸抽出液Ａを噴霧処理し、１０、２４時間後にサンプリングを個体ごと（３サンプル）に行った。対照区（図１のＣｏｎｔ Ａｐ）として０．１％アプローチＢＩのみを処理した植物のサンプリングを行った。リアルタイムＰＣＲにより、ＰＲ１；Ａｔ２ｇ１４６１０の遺伝子発現を解析した。サンプル間のノーマライズにはＡｔＣＢＰ２０遺伝子を用いた。
【0043】
一般的に植物のＰＲ１遺伝子は、植物病害に対する抵抗性誘導の指標となるマーカーであり、ＰＲ１の発現上昇は、植物病害に対する抵抗性が誘導されていることを示す。例えば、シロイヌナズナではＡｔＰＲ１(Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＰＲ１)、トマトではＳｌＰＲ１(Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ＰＲ１)である。
【0044】
【0045】
［試験例２：トマトの葉面に腐植酸を噴霧した際の遺伝子発現］
トマト（品種レジナ）（土植、播種から１７日齢、本葉２．５枚）に０．１％アプローチＢＩ（農薬用展着剤、丸和バイオケミカル株式会社）を添加した２００倍希釈腐植抽出液Ａ（図２の×２００）を噴霧処理し、５，１０，２４時間後にサンプリング（２個体から３サンプル）を行った。また、対照区（図２のＣｏｎｔ Ａｐ）として０．１％アプローチＢＩのみを処理した植物のサンプリングを行った。次いで、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡ合成を行った後に、リアルタイムＰＣＲにより、ＳｌＰＲ１遺伝子の発現を解析した。サンプル間のノーマライズにはＳｌＴＩＰ４１遺伝子を用いた。
トマト（品種レジナ）（土植、播種から１７日齢、本葉２．５枚）に０．１％アプローチＢＩ（農薬用展着剤、丸和バイオケミカル株式会社）を添加した２００倍希釈腐植抽出液Ａ（図２の×２００）を噴霧処理し、５，１０，２４時間後にサンプリング（２個体から３サンプル）を行った。また、対照区（図２のＣｏｎｔ Ａｐ）として０．１％アプローチＢＩのみを処理した植物のサンプリングを行った。次いで、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡ合成を行った後に、リアルタイムＰＣＲにより、ＳｌＰＲ１遺伝子の発現を解析した。サンプル間のノーマライズにはＳｌＴＩＰ４１遺伝子を用いた。
【0046】
【0047】
［試験例３：腐植酸抽出液Ａを用いた場合のトマトへの病原菌接種試験］
以下の方法で対照区、試験区（腐植酸抽出液Ａ（１５０ｐｐｍ））及びポジティブコントロールの薬剤を準備した。
対照区では水に０．１％の展着剤（アプローチＢＩ）を添加して散布液を調製した。試験区では腐植酸抽出液Ａ（全有機炭素濃度３４，０００ｍｇ／Ｌ）を水で希釈することで全有機炭素濃度１５０ｍｇ／Ｌの散布液を調整した。散布液には０．１％の展着剤（アプローチＢＩ）を添加した。
以下の方法で対照区、試験区（腐植酸抽出液Ａ（１５０ｐｐｍ））及びポジティブコントロールの薬剤を準備した。
対照区では水に０．１％の展着剤（アプローチＢＩ）を添加して散布液を調製した。試験区では腐植酸抽出液Ａ（全有機炭素濃度３４，０００ｍｇ／Ｌ）を水で希釈することで全有機炭素濃度１５０ｍｇ／Ｌの散布液を調整した。散布液には０．１％の展着剤（アプローチＢＩ）を添加した。
【0048】
トマト（品種レジナ）（播種後、１３日齢、本葉２．３枚）に、各剤を噴霧処理し、培養庫に静置した（２４℃、明暗下１６ｈ／８ｈサイクル、湿度５０％）。１週間おきに３回噴霧処理を行い、３回目噴霧から処理２日後にトマト斑葉細菌病菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ（１×１０７ｃｆｕ／ｍｌ）を噴霧接種した。接種５日後に発病度を調査した。
【0049】
発病度は、以下の式で表される。発病度は結果を図３に示す。
発病度＝｛（１ｎ１＋２ｎ２＋３ｎ３＋４ｎ４＋５ｎ５）／（５×調査数）｝×１００
発病調査は発病程度を以下の５つに区分して調査した。
０：病徴なし、１：微小斑点、２：葉の２５％未満の面積に病斑が認められる、３：葉の２５％以上５０％未満の面積に病斑が認められる、４：葉の５０％以上の面積に病斑が認められる、５：落葉又は枯死
ｎ１からｎ５は個体数を示す。
上記試験方法による発病度の抑制現象は、ポジティブコントロールを用いた試験により確認している。
発病度＝｛（１ｎ１＋２ｎ２＋３ｎ３＋４ｎ４＋５ｎ５）／（５×調査数）｝×１００
発病調査は発病程度を以下の５つに区分して調査した。
０：病徴なし、１：微小斑点、２：葉の２５％未満の面積に病斑が認められる、３：葉の２５％以上５０％未満の面積に病斑が認められる、４：葉の５０％以上の面積に病斑が認められる、５：落葉又は枯死
ｎ１からｎ５は個体数を示す。
上記試験方法による発病度の抑制現象は、ポジティブコントロールを用いた試験により確認している。
【0050】
図３のとおり、腐植酸抽出液Ａの施用により、発病度が抑制されることが確認された。
【0051】
［試験例４：腐植酸抽出液Ｂを用いた場合のトマトへの病原菌接種試験］
以下の方法で対照区、及び試験区（腐植酸抽出液Ｂ（１００ｐｐｍ又は４０ｐｐｍ））の薬剤を準備した。
対照区では水の０．１％の展着剤（アプローチＢＩ）を添加して散布液を調製した。
試験区では腐植酸抽出液Ｂ（全有機炭素濃度２２，０００ｍｇ／Ｌ）を水で希釈することで全有機炭素濃度１００ｍｇ／Ｌ又は４０ｍｇ／Ｌの散布液を調製した。散布液には０．１％の展着剤（アプローチＢＩ）を添加した。
以下の方法で対照区、及び試験区（腐植酸抽出液Ｂ（１００ｐｐｍ又は４０ｐｐｍ））の薬剤を準備した。
対照区では水の０．１％の展着剤（アプローチＢＩ）を添加して散布液を調製した。
試験区では腐植酸抽出液Ｂ（全有機炭素濃度２２，０００ｍｇ／Ｌ）を水で希釈することで全有機炭素濃度１００ｍｇ／Ｌ又は４０ｍｇ／Ｌの散布液を調製した。散布液には０．１％の展着剤（アプローチＢＩ）を添加した。
【0052】
トマト（品種レジナ）（播種後、１０日齢、未展開の本葉２枚）に、各剤を噴霧処理し、培養庫に静置した（２４℃、明暗下１６ｈ／８ｈサイクル、湿度５０％）。１週間おきに３回噴霧処理を行い、３回目噴霧から処理２日後にトマト斑葉細菌病菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ（１×１０７ｃｆｕ／ｍｌ）を噴霧接種した。接種５日後に発病度を調査した。発病度の結果を図４に示す。
【0053】
図４のとおり、腐植酸抽出液Ｂの施用によっても、発病度が抑制されることが示された。
【0054】
［試験例５：グリシン（Ｇｌｙ）併用時のトマトへの病原菌接種試験］
以下の方法で対照区、試験区１（腐植酸抽出液Ｂ４０ｐｐｍ）、試験区２（腐植酸抽出液Ｂ４０ｐｐｍ＋Ｇｌｙ５０ｐｐｍ）、試験区３（Ｇｌｙ５０ｐｐｍ）及びポジティブコントロールの薬剤を準備した。
対照区では水に０．１％の展着剤（アプローチＢＩ）を添加して散布液を調製した。
試験区１又は試験区２では腐植酸抽出液Ｂ（全有機炭素濃度２２，０００ｍｇ／Ｌ）およびグリシン（和光純薬社製）を水で希釈することで腐植酸抽出液Ｂ４０ｍｇ／Ｌ又は腐植酸抽出液Ｂ４０ｍｇ／Ｌ＋Ｇｌｙ５０ｍｇ／Ｌの散布液を調製した。散布液には０．１％の展着剤（アプローチＢＩ）を添加した。
試験区３ではグリシンを水で希釈することでＧｌｙ５０ｍｇ／Ｌの散布液を調製した。散布液には０．１％の展着剤（アプローチＢＩ）を添加した。
以下の方法で対照区、試験区１（腐植酸抽出液Ｂ４０ｐｐｍ）、試験区２（腐植酸抽出液Ｂ４０ｐｐｍ＋Ｇｌｙ５０ｐｐｍ）、試験区３（Ｇｌｙ５０ｐｐｍ）及びポジティブコントロールの薬剤を準備した。
対照区では水に０．１％の展着剤（アプローチＢＩ）を添加して散布液を調製した。
試験区１又は試験区２では腐植酸抽出液Ｂ（全有機炭素濃度２２，０００ｍｇ／Ｌ）およびグリシン（和光純薬社製）を水で希釈することで腐植酸抽出液Ｂ４０ｍｇ／Ｌ又は腐植酸抽出液Ｂ４０ｍｇ／Ｌ＋Ｇｌｙ５０ｍｇ／Ｌの散布液を調製した。散布液には０．１％の展着剤（アプローチＢＩ）を添加した。
試験区３ではグリシンを水で希釈することでＧｌｙ５０ｍｇ／Ｌの散布液を調製した。散布液には０．１％の展着剤（アプローチＢＩ）を添加した。
【0055】
トマト（品種レジナ）（播種後、１７日齢、本葉２．３枚）に、各剤を噴霧処理し、培養庫に静置した（２４℃、明暗下１６ｈ／８ｈサイクル、湿度５０％）。処理２日後にトマト斑葉細菌病菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ（１×１０７ｃｆｕ／ｍｌ）を噴霧接種した。以上について湿室下（２４℃、明暗下１６ｈ／８ｈサイクル）にて培養し、接種５日後に病徴を検定した。発病度の結果を図５に示す。
【0056】
図５のとおり、グリシン併用時に発病度の抑制効果が向上した。
【0057】
［試験例６：トマトへの病原菌接種試験 株元潅注効果の検証］
以下の方法で対照区、試験区１（腐植酸抽出液Ａ１５０ｐｐｍ）、試験区２（腐植酸抽出液Ｂ１００ｐｐｍ）、試験区３（腐植酸抽出液Ｂ４０ｐｐｍ）及び試験区４（ＢＴＨ１００ｐｐｍ）の薬剤を準備した。ＢＴＨは、アシベンゾラルＳメチルである。ＢＴＨは、潅注処理により、発病度を抑制可能な資材である。
対照区では水のみを施用した。
試験区１では腐植酸抽出液Ａ（全有機炭素濃度３４，０００ｍｇ／Ｌ）を水で希釈することで全有機炭素濃度１５０ｍｇ／Ｌの薬剤を準備した。
試験区２又は試験区３では腐植酸抽出液Ｂ（全有機炭素濃度２２，０００ｍｇ／Ｌ）を水で希釈することで全有機炭素濃度１００ｍｇ／Ｌ又は４０ｍｇ／Ｌの薬剤を準備した。 試験区４ではＢＴＨ（和光純薬社製）を水で希釈することでＢＴＨ１００ｍｇ／Ｌの薬剤を準備した。
以下の方法で対照区、試験区１（腐植酸抽出液Ａ１５０ｐｐｍ）、試験区２（腐植酸抽出液Ｂ１００ｐｐｍ）、試験区３（腐植酸抽出液Ｂ４０ｐｐｍ）及び試験区４（ＢＴＨ１００ｐｐｍ）の薬剤を準備した。ＢＴＨは、アシベンゾラルＳメチルである。ＢＴＨは、潅注処理により、発病度を抑制可能な資材である。
対照区では水のみを施用した。
試験区１では腐植酸抽出液Ａ（全有機炭素濃度３４，０００ｍｇ／Ｌ）を水で希釈することで全有機炭素濃度１５０ｍｇ／Ｌの薬剤を準備した。
試験区２又は試験区３では腐植酸抽出液Ｂ（全有機炭素濃度２２，０００ｍｇ／Ｌ）を水で希釈することで全有機炭素濃度１００ｍｇ／Ｌ又は４０ｍｇ／Ｌの薬剤を準備した。 試験区４ではＢＴＨ（和光純薬社製）を水で希釈することでＢＴＨ１００ｍｇ／Ｌの薬剤を準備した。
【0058】
トマト（品種レジナ）（播種後、１１日齢、未展開の本葉２枚）に、各剤を潅注処理（１５ｍｌ/ポット）し、培養庫に静置した（２４℃、明暗下１６ｈ／８ｈサイクル、湿度５０％）。１週間おきに２回（合計３回）潅注処理した。最終の処理２日後にトマト斑葉細菌病菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ（５×１０６ｃｆｕ／ｍｌ）を噴霧接種した（個体ごとに４－５回噴霧）。以上について、湿室下（２４℃、明暗下１６ｈ／８ｈサイクル）にて培養し、接種５日後に病徴を検定した。結果を図６に示す。
【0059】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】