特開 2023-120635 プライマーセット、ならびにテンサイ根腐病の検診キット及び検診方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023120635

(43)【公開日】2023-08-30

(54)【発明の名称】プライマーセット、ならびにテンサイ根腐病の検診キット及び検診方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/689 20180101AFI20230823BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20230823BHJP

   G01N 33/569 20060101ALI20230823BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALN20230823BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20230823BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/689 Z ZNA

G01N33/53 M

G01N33/569 F

C12Q1/6844 Z

C12N15/09 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022023587

(22)【出願日】2022-02-18

(71)【出願人】

【識別番号】000231981

【氏名又は名称】日本甜菜製糖株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100145126

【弁理士】

【氏名又は名称】金丸 清隆

(72)【発明者】

【氏名】小田 一登

(72)【発明者】

【氏名】内野 浩克

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QQ06

4B063QQ09

4B063QQ42

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR62

4B063QS10

4B063QS24

4B063QS36

4B063QX01

(57)【要約】

【課題】 テンサイ根腐病の病原菌である特定のリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）由来の核酸を特異的に増幅するプライマーセット、当該プライマーセットを含むテンサイ根腐病の検診キット、ならびに、当該プライマーセット及び当該検診キットの少なくともいずれかを用いて、被験体から得られた検体において特定のリゾクトニア・ソラニを検出する工程を含むテンサイ根腐病の検診方法を提供する。
【解決手段】 ＬＡＭＰ法により、特定のリゾクトニア・ソラニ由来の核酸を特異的に増幅する。
【選択図】 図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＬＡＭＰ法により、リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＶ由来の核酸及びリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＩＩＢ由来の核酸を特異的に増幅するプライマーセットであって、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のプライマーを含むプライマーセット；
（ａ）配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
（ｂ）配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
（ｃ）配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、
（ｄ）配列番号５の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー。

【請求項2】

前記ポリヌクレオチドがリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＶのリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域及び／またはリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＩＩＢのリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域に由来する、請求項１に記載のプライマーセット。

【請求項3】

アファノミセス・コクリオイデス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓ ｃｏｃｈｌｉｏｉｄｅｓ）由来の核酸を増幅しない、請求項１または請求項２に記載のプライマーセット。

【請求項4】

リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ１－１由来の核酸及びリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ４由来の核酸を増幅しない、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載のプライマーセット。

【請求項5】

請求項１から請求項４のいずれか一項に記載のプライマーセットを含む、テンサイ根腐病の検診キット。

【請求項6】

請求項１から請求項４のいずれか一項に記載のプライマーセット及び請求項５に記載の検診キットの少なくともいずれかを用いて、ＬＡＭＰ法により、被験体から得られた検体においてリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＶ及び／またはリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＩＩＢを検出する工程を含む、テンサイ根腐病の検診方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＬＡＭＰ法により、リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＶ由来の核酸及びリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＩＩＢ由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセット、当該プライマーセットを含むテンサイ根腐病の検診キット、及び、当該プライマーセット等を用いて、ＬＡＭＰ法により、被験体から得られた検体においてリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶ及び／またはリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＩＩＢを検出する工程を含む、テンサイ根腐病の検診方法に関する。

【背景技術】

【0002】

テンサイ根腐病（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｒｏｏｔ ｒｏｔ）は、一般的にはリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＶ、まれにリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＩＩＢによる、テンサイの重要病害の一つである。テンサイ根腐病に罹病したテンサイ（甜菜、サトウダイコン、Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｌ.）には、発症の初期では葉柄の基部や冠部に茶褐色の病斑が形成され、それが徐々に根部まで進展していく（非特許文献１）。そして、重症個体においては、根部全体が腐敗枯死してしまう。

【0003】

リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）は、土壌に棲息する植物病害の病原菌であり、イネ、畑作物、野菜など多くの作物に感染する。リゾクトニア属は、菌糸融合反応に基づいて１３群以上に分類されており、日本では主にＡＧ１～ＡＧ５が農作物へ被害を及ぼす群として注意が向けられている。そのうち、テンサイ根腐病の病原菌となるのは、ＡＧ２の中から亜群として区分されるＡＧ２－２ＩＶ及びＡＧ２－２ＩＩＩＢである（非特許文献２）。

【0004】

リゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶやリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＩＩＢが感染したテンサイは、生育が遅滞し、根中糖分が減少するとともに品質も低下することから、耕作者にとって、直接、収入の減少につながるとともに、製糖業者にとっても作業効率が低下する大きな要因となり、また、収穫されてから製糖工程に入るまでの貯蔵期間中に、腐敗が進行して品質が低下する場合があり、多方面で大きな問題となっている。

【0005】

リゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶ及びリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＩＩＢは、菌核などの耐久体の形で越冬し、地温の上昇ともに菌糸を発芽させ、土壌中では菌糸の状態で存在する。寄主がなくとも土壌中の植物残渣などを分解して棲息し、寄主となる植物がその土壌に植えられることにより、その植物に感染する。感染は時期を問わないが、比較的高い温度を好み、根部の肥大率が大きい６月下旬から７月中旬にかけて特に感染し、罹病が発生しやすい。

【0006】

テンサイ根腐病の薬剤防除は広く行われており、発症直後に病状の進行を抑制する目的で行う場合の他、感染前に予防目的で行う場合があり、それぞれで薬剤の種類が使い分けされる。前者においては、発症の早期発見が病状の進行を抑制するうえで特に重要となるところ、前者において用いられる薬剤は、テンサイ根腐病の病状の進行抑制に対しては効果があるものの、テンサイ根腐病と原因菌の種類が全く異なるにもかかわらず、病徴のみから判別することが困難なテンサイ黒根病などの、他の病害には効果を示さないため、テンサイ根腐病の感染や罹病についての正確な検診に基づいて防除しなければ、病害の抑制ができないとともに、薬剤散布が無意味となってしまいかねない。他方、後者においては、テンサイ根腐病による被害をより効果的に回避するために、病害の初発時期より前に、土壌中にリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶやリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＩＩＢ棲息することを特定したうえで、病害の予防を目的とする薬剤散布を行うという方法が取られている。

【0007】

病害を発見する方法としては、例えば、テンサイの罹病組織を所定の培地で培養し、検鏡により同定する方法が用いられているが、罹病組織の切片を培地上に置いてから検出することができるまでに７～１０日を要するため、その間に病状が進行してしまい、早期にテンサイ根腐病の発病を発見して効果的な防除を行うということができなくなる。また、この方法は、検出感度が低いため、判定に際してはさらに顕微鏡を用いて形態観察する必要があり、植物病理学的な専門知識や技術が必要となってしまう。

【0008】

他の作物においては、分子生物学的手法によりリゾクトニア・ソラニを検出する方法として、ＰＣＲ法を用いてリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２を検出する方法が採用されている（特許文献１）。また、ＬＡＭＰ法により、リゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＩＩＢのリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域に基づいて設計されたＬＡＭＰプライマーを用いて、リゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶやリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＩＩＢ、その他の菌糸融合群（Ａｎａｓｔｏｍｏｓｉｓ ｇｒｏｕｐ（以下、「ＡＧ」という。））の菌体を検出することにより、芝生の紋枯病を検診する方法が用いられている（特許文献２）。

【0009】

しかしながら、特許文献１のＰＣＲ法を用いた検出方法では、精密な温度制御と迅速な温度変化を要するポリメラーゼ連鎖反応を経る必要があることから、温度の制御が不可欠となり、サーマルサイクラーや電気泳動装置が必須となる。また、多段階の工程を経る必要がある他、検出までに時間を要するうえに、操作には一定の技術習得も必要である。また、特許文献２の検出方法において用いられているプライマーは、テンサイ根腐病の病原菌であるリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶ及びリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＩＩＢの他、リゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶ及びリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＩＩＢとは異なるＡＧに属するリゾクトニア・ソラニＡＧ－１やリゾクトニア・ソラニＡＧ－４をも検出してしまい、テンサイ根腐病の検診においてそのプライマーを用いると、正確かつ迅速に検診することが困難になり、ひいてはテンサイ根腐病の病害防除を早期かつ適正に行うことができなくなる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】特開平１０－２３４３８１号公報

【特許文献2】特表２０２１－５１２６０９号公報

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ ／ Ｖｏｌ. ９６ Ｎｏ. ３

【非特許文献2】微生物遺伝資源利用マニュアル（４１）（２０１９）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

そこで、本発明は、テンサイ根腐病の病原菌であるリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＶ由来の核酸及びリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＩＩＢ由来の核酸を特異的に増幅するプライマーセット、当該プライマーセットを含むテンサイ根腐病の検診キット、ならびに、当該プライマーセット及び当該検診キットの少なくともいずれかを用いて、被験体から得られた検体においてリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶ及び／またはリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＩＩＢを検出する工程を含むテンサイ根腐病の検診方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明者らは、鋭意研究の結果、テンサイ根腐病の病原菌であるリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＶ由来の核酸及びリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＩＩＢ由来の核酸に特異的に反応するＬＡＭＰプライマーを設計し、ＬＡＭＰプライマーセットを完成させ、そして、当該ＬＡＭＰプライマーセットを用いたテンサイ根腐病の検診キットや、当該ＬＡＭＰプライマーセットや当該検診キットを用いた、ＬＡＭＰ法によりテンサイ根腐病を検診する方法を見出し、下記の各発明を完成した。

【0014】

（１）ＬＡＭＰ法により、リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＶ由来の核酸及びリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＩＩＢ由来の核酸を特異的に増幅するプライマーセットであって、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のプライマーを含むプライマーセット；
（ａ）配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
（ｂ）配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
（ｃ）配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、
（ｄ）配列番号５の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー。

【0015】

（２）前記ポリヌクレオチドがリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＶのリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域及び／またはリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＩＩＢのリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域に由来する、（１）に記載のプライマーセット。

【0016】

（３）アファノミセス・コクリオイデス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓ ｃｏｃｈｌｉｏｉｄｅｓ）由来の核酸を増幅しない、（１）または（２）に記載のプライマーセット。

【0017】

（４）リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ１－１由来の核酸及びリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ４由来の核酸を増幅しない、（１）から（３）のいずれか一項に記載のプライマーセット。

【0018】

（５）（１）から（４）のいずれか一項に記載のプライマーセットを含む、テンサイ根腐病の検診キット。

【0019】

（６）（１）から（４）のいずれか一項に記載のプライマーセット及び請求項５に記載の検診キットの少なくともいずれかを用いて、ＬＡＭＰ法により、被験体から得られた検体においてリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＶ及び／またはリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＩＩＢを検出する工程を含む、テンサイ根腐病の検診方法。

【発明の効果】

【0020】

本発明によれば、ＬＡＭＰ法を用いて、リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＶ由来の核酸及びリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＩＩＢ由来の核酸を特異的に増幅することができる新規のプライマーセットが提供される。当該プライマーセットを用いることにより、農場現場において、テンサイ根腐病の病原菌であるリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶやリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＩＩＢを即時に高感度で検出し得るうえに、感染初期の個体を正確に検診できることから早期に防除や排水対策などを講じることができ、その結果、当該病害の進行を効果的に抑制することができる。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】リゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶのリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列における、リゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶ及びリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＩＩＢ検出用プライマーが認識する塩基配列の位置関係を示す。

【図2】実施例１におけるＬＡＭＰ反応後の反応チューブの色の変化を示す写真である。

【発明を実施するための形態】

【0022】

以下、本発明に係るプライマーセット、テンサイ根腐病の検診キット、及び、テンサイ根腐病の検診方法について詳細に説明する。

【0023】

本発明に係るプライマーセットは、ＬＡＭＰ法により、リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＶ由来の核酸及びリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＩＩＢ由来の核酸を特異的に増幅するプライマーセットであって、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のプライマーを含む；
（ａ）配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
（ｂ）配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
（ｃ）配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、
（ｄ）配列番号５の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー。

【0024】

ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ-Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法は、納富らによって開発され、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法で不可欠とされる温度制御を不要とする核酸の増幅方法であり、日本特許第３３１３３５８号公報に報告されている。一般的に、ＬＡＭＰ法は、ＰＣＲを用いた方法に比べて短時間で簡易に遺伝子を増幅できるうえ、特異性が高く、サンプル中の不純物の影響も受けにくい。そのため、簡便なサンプルの前処理で目的の核酸の増幅を行うことが可能である。

【0025】

ＬＡＭＰ法は、６つの遺伝子領域を認識する４つのプライマーを用いて、鋳型となるヌクレオチドに当該プライマーの３‘末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とするとともに、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能とする。また、プライマーの３’末端が、常に試料に由来する領域に対してアニールしており、塩基配列の相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能することとなり、高感度かつ特異性の高い核酸増幅反応を可能とする。

【0026】

ＬＡＭＰ法では、２本鎖の鋳型ＤＮＡの一方の鎖の３‘末端側から順にＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３と称する領域をそれぞれ規定し、これらの領域の塩基配列に基づいて設計されるＦ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーと称する４種類で１セットとなるプライマーを使用する。

【0027】

Ｆ３プライマーは、Ｆ３ｃ領域と相補的な塩基配列であるＦ３領域の塩基配列を持つように設計する。ＦＩＰプライマーは、Ｆ２ｃ領域と相補的な塩基配列であるＦ２領域の塩基配列を３’末端側に持ち、５’末端側にＦ１ｃ領域の塩基配列と同じ塩基配列を持つように設計する。ＢＩＰプライマーは、Ｂ２領域の塩基配列を３’末端側に持ち、５’末端側にＢ１領域と相補的な塩基配列であるＢ１ｃ領域の塩基配列を持つように設計する。Ｂ３プライマーは、Ｂ３領域の塩基配列を持つように設計する。

【0028】

これらのプライマーのうち、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマーをインナープライマーと、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマーをアウタープライマーと称される。ここで、インナープライマーは、標的領域上の特定の塩基配列領域を認識し、かつ合成起点を与える塩基配列を３’末端に有し、同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を５’末端に有するポリヌクレオチドである。このインナープライマーは、Ｆ２領域とＦ１ｃ領域の間、またはＢ２領域とＢ１ｃ領域の間に、塩基数０～５０のいずれかの長さの任意の塩基配列を有していてもよい。

【0029】

一方、アウタープライマーは、標的領域上の特定の塩基配列領域の３'末端側に存在する配列領域を認識かつ合成起点を与える塩基配列を有するポリヌクレオチドである。

【0030】

ＬＡＭＰ法によるＤＮＡの増幅反応は、インナープライマーを起点に合成されたＤＮＡ鎖を鋳型ＤＮＡから一本鎖として剥がすために用いられる２種類のアウタープライマーにより生成する、ステムループ構造を持つダンベル型の構造を起点とし、伸長反応と鎖置換型伸長反応を繰り返すことにより進行する。また、ダンベル構造の５’末端側のループの一本鎖部分に相補的な配列を持つ２種類のループプライマーを用いることにより、ＤＮＡ合成の起点を増やし、反応時間を短縮することが可能となる。

【0031】

以下、ＬＡＭＰ法によるリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＶ及び／またはリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＩＩＢの検出について、（１）検体からの核酸の抽出、（２）プライマーセットの設計、（３）核酸の増幅、（４）増幅産物の有無の確認の順に説明する。

【0032】

（１）検体からの核酸の抽出
本発明において、検体としては、リゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶ及び／またはリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＩＩＢを含有するものすべてを対象とすることができるが、テンサイ（甜菜、サトウダイコン、Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｌ.）の根、葉、茎、苗などを用いることが好ましい。特に検出に適しているのはテンサイの根であり、検出率を高めることができる。

【0033】

その他、土壌を検体とすることができる。リゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶ及びリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＩＩＢは、土壌中にも広く存在し、土壌を介して感染することから、土壌を検体としてリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶ及びリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＩＩＢの有無を確認することにより、テンサイ根腐病の発生や拡大を未然に防ぐことができる。

【0034】

検体からＤＮＡを調製する方法としては、リゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶ及びリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＩＩＢの検出を行うのに十分な精製度及び量のＤＮＡが得られるのであれば特に制限されず、未精製の状態でも使用できるが、さらに分離、抽出、濃縮、精製等の前処理をして使用することもできる。例えば、フェノール及びクロロホルム抽出による精製や、市販の抽出キットを用いた精製によって、核酸の純度を高めて使用することができる。

【0035】

（２）プライマーセットの設計
＜プライマーセット＞
本発明に係るプライマーセットは、リゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶの塩基配列及びリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＩＩＢの塩基配列に特異的であり、かつ、種保存性が高いリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ Ｓｐａｃｅｒｓ）に基づいて設計される。当該標的領域は、リゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶ及びリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＩＩＢの多様性をカバーし得る塩基配列領域である。

【0036】

本発明におけるプライマーは、係る標的塩基配列を増幅対象として設計しうる限り特に限定されるものではなく、ＰＣＲ法やＬＡＭＰ法などの核酸増幅方法に用いる際のプライマーとして使用することができるが、ＬＡＭＰプライマーであることが好ましい。

【0037】

本発明に係るプライマーセットは、次のように設計する。まず、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘなどのアラインメントソフトを用いて、複数のリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶのリボゾームＤＮＡのＩＴＳ領域における塩基配列のアライメントを行う。次に、得られたアライメント情報をもとに、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｖ５（栄研化学株式会社製）等のソフトを用いて保存性の高い領域において、Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１ｃ、Ｂ１ｃ、Ｂ２、Ｂ３領域を選定し、ＬＡＭＰ法のプライマーを設計する。従って、本発明に係るプライマーセットは、ＬＡＭＰプライマーセットであることが好ましい。

【0038】

各プライマーにおいては、ＬＡＭＰ法におけるプライマー機能を有する限り、１または数個（例えば、１～１０個）の塩基が欠失、置換または付加した塩基配列を有するプライマーを代替的に用いることができる。

【0039】

本発明に係るプライマーセットとして、リゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶ及びリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＩＩＢの特異的な塩基配列であり、配列番号１の配列により示される当該菌体のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域（図１）をコードする塩基配列を標的とし、その塩基配列の一部と相補的となるように化学合成されたポリヌクレオチドであって、配列番号２～５の配列により示されるプライマーセットを選定した。

【0040】

リゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶ及びリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＩＩＢ検出用のプライマーセット（塩基配列（５’－３’））
ＦＩＰ（配列番号２） ＣＣＡＴＣＣＡＴＧＴＣＴＣＴＧＣＣＴＣＡＣＣＴＴＴＴＧＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＣＣＡＣ
ＢＩＰ（配列番号３） ＴＡＣＣＣＣＣＣＣＴＣＴＧＴＣＴＡＣＴＣＴＧＣＧＴＴＡＣＡＴＣＣＡＴＴＡＣＡＴＴＣ
Ｆ３（配列番号４） ＡＧＣＴＧＧＣＴＣＣＡＴＴＡＧＴＴＴＧ
Ｂ３（配列番号５） ＡＡＧＡＧＡＴＣＣＧＴＴＧＴＴＧＡＡＡＣ

【0041】

すなわち、本発明に係るプライマーセットは、リゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶ由来の核酸及びリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＩＩＢ由来の核酸を特異的に増幅するプライマーセットであって、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のプライマーを含むプライマーセットである；
（ａ）配列番号２の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦＩＰプライマー、
（ｂ）配列番号３の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢＩＰプライマー、
（ｃ）配列番号４の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＦ３プライマー、
（ｄ）配列番号５の配列により示されるポリヌクレオチドからなるＢ３プライマー。

【0042】

そしてそれ故、前記ポリヌクレオチドは、リゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶのリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域及び／またはリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＩＩＢのリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域に由来する。

【0043】

ここで、本発明において、「リゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶ由来の核酸及びリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＩＩＢ由来の核酸を特異的に増幅する」とは、リゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶ由来の核酸及びリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＩＩＢ由来の核酸については、通常の条件で核酸増幅反応を行ったときに増幅が可能であるが、リゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶ及びリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＩＩＢ以外の他の菌体由来の核酸については実質的に増幅しない（増幅したとしても検出限界以下である）ことを意味する。実際のところ、本発明に係るプライマーセットは、リゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶ及びリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＩＩＢとは異なるＡＧに属するリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ１－１由来の核酸及びリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ４由来の核酸を増幅しない。

【0044】

また、本発明に係るプライマーセットは、テンサイ黒根病の原因菌であるアファノミセス・コクリオイデス（Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓ ｃｏｃｈｌｉｏｉｄｅｓ）由来の核酸を増幅しない。このことは、テンサイ根腐病と原因菌の種類が全く異なるにもかかわらず、病徴のみから判別することが困難なテンサイ黒根病と、テンサイ根腐病を判別することができることを示している。

【0045】

（３）核酸の増幅
ＬＡＭＰ法によるＤＮＡの増幅反応においては、検体から抽出された核酸、及びプライマーセット、ならびにＤＮＡ増幅試薬として、核酸合成の基質となる４種類のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素などのＤＮＡポリメラーゼと、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、補助因子としての塩類（マグネシウム塩またはマンガン塩等）、及び酵素や鋳型を安定化する保護剤を、等温で一定時間静置すればよい。

【0046】

酵素活性に適した温度は、６０～７０℃、好ましくは６３～６５℃にてＤＮＡの増幅反応を行う。反応時間は、１５分以上であればＤＮＡの増幅を検出することができるが、好ましくは３０分～１２０分、より好ましくは６０～９０分の範囲に設定することができる。

【0047】

核酸合成で使用する酵素は、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、例えば、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Ｂｃａ（ｅｘｏ－）ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントなどを挙げることができ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）を好適な酵素として挙げることができる。また、上記ＤＮＡ増幅試薬は、等温核酸増幅法用キットとして市販されており、例えば、Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ増幅試薬キット（栄研化学株式会社製）、ＬＡＭＰ法用ＤＮＡ増幅試薬セット-動物種・植物病検査専用Ａ－(ニッポンジーン)などを使用することができる。

【0048】

ＤＮＡ増幅するための反応液は以下の組成が一般的に用いられる。
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７～９） １０ｍＭ～２５ｍＭ
ＫＣｌ ５ｍＭ～１５ｍＭ
ＭｇＳＯ_４ ５ｍＭ～４０ｍＭ
界面活性剤 ０．１％～０．４％
ベタイン ０．５～１Ｍ
ｄＮＴＰｓ 各１ｍＭ～１．５ｍＭ
鎖置換型核酸伸長酵素 ０．２～０．６Ｕ／μＬ

【0049】

（４）増幅産物の有無の確認
＜病原菌の検出＞
核酸増幅反応後の溶液において増幅されたＤＮＡの存在を確認する。被験試料中にリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶ及び／またはリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＩＩＢが含まれている場合、核酸増幅反応によりリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域における標的領域上のＤＮＡが増幅される。逆に、被験試料中にリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶ及び／またはリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＩＩＢが含まれていなければ、核酸増幅反応によって増幅されるＤＮＡはない。

【0050】

核酸増幅反応により増幅されたＤＮＡの有無の判定には公知の技術が適用できる。例えば、目視による判定方法として、核酸合成の副産物であるピロリン酸マグネシウムにより生成される濁度の肉眼での確認や、反応液にあらかじめＨＮＢ試薬やマラカイトグリーンを添加すること、目視検出試薬があらかじめ添加されたＤＮＡ増幅試薬キットを用いたＬＡＭＰ反応による該反応液の変色によりＤＮＡの増幅の判定を容易にする方法を挙げることができる。当該ＤＮＡ増幅試薬キットとして、例えば、ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標） Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ＬＡＭＰ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）などを挙げることができる。増幅されたＤＮＡの有無の判定方法として他に、リアルタイム濁度測定装置（例えば、栄研化学株式会社製のＬｏｏｐａｍｐＥＸＩＡ）で光学的に確認する方法や、Ｌｏｏｐａｍｐ(登録商標)蛍光・目視検出試薬（栄研化学株式会社製）などの蛍光インターカレーターを添加して増幅反応させた液をＵＶ照射して、核酸の増幅を示す発光を目視により検出する方法を挙げることができる。

【0051】

さらに、当該増幅産物の有無の判断は、本発明に係るプライマーセットの代わりに水を加えた陰性対照（ネガティブコントロール）との対比で行うことも好ましい。陰性対照を用いることにより、偽陽性に基づく判断を防止することができる。また、本発明のプライマーセットによってＬＡＭＰ反応が正常に進行する系となっていることを確認するために陽性対照（ポジティブコントロール）を用いてもよい。

【0052】

次に、本発明に係るプライマーセットは、単独で、またはＬＡＭＰに必要な試薬とともに、テンサイ根腐病の検診キットとして提供することができる。ＬＡＭＰに必要な試薬としては、例えば、上述した鎖置換型核酸伸長酵素、ｄＮＴＰ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７～９）などの緩衝液、滅菌水、反応生成物の検出に必要な試薬などを挙げることができる。

【0053】

さらに、本発明は、以上に説明した本発明に係るプライマーセットまたはテンサイ根腐病の検診キットの少なくともいずれかを用いて、ＬＡＭＰ法により、被験体から得られた検体においてリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＶ及び／またはリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＩＩＢを検出する工程を含む、テンサイ根腐病の検診方法に関する。本発明に係る方法により、当該テンサイ根腐病の検診を可能とする。

【実施例0054】

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

【0055】

〔実施例１〕ＬＡＭＰプライマーによるリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶ及びリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＩＩＢの検出
（１）プライマーセットの設計
ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ.ｎｃｂｉ．ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）からリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）ＡＧ２－２ＩＶのリボソームＤＮＡにおけるＩＴＳ領域の塩基配列データを収集し、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘを用いたアラインメント解析により、ＩＴＳ領域上におけるリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶ及びリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＩＩＢの特異的な塩基配列を抽出した。

【0056】

得られたアラインメント情報をもとに、配列番号１の３３塩基から２６２塩基領域を用いＬＡＭＰ法プライマーを設計した（図１）。ＬＡＭＰ法プライマーを設計には、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｖ５（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｉｍｅｒｅｘｐｌｏｒｅｒ．ｊｐ／）を用いた。設計したＬＡＭＰプライマーを下掲の表１に示す。

【0057】

［表１］

【0058】

（２）病原菌からのＤＮＡ抽出
リゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶからのＤＮＡ抽出は、次の手順により行った。まず、腐敗したテンサイ根の黒変部と健全部の境界部を切り出し、水洗した後、１．５ｍＬのチューブに入れ、ジルコニアビーズと振盪破砕機を用いて組織を破砕した。次に、破砕組織片からＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（登録商標） ＤＮＡ Ｐｌａｎｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いてからＤＮＡを抽出した。

【0059】

（３）ＬＡＭＰ法による病原菌の検出
本実施例（２）で抽出したＤＮＡは、１０μｇ／ｍＬの濃度に調製して鋳型ＤＮＡ溶液とした。実施例１のＬＡＭＰ法を用いた検出方法（以下、単に「ＬＡＭＰ法」という。）は、下掲の表２の通り、鋳型ＤＮＡ溶液、ＷａｒｍＳｔａｒｔ（登録商標） Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ＬＡＭＰ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、滅菌蒸留水、及び、上掲の表１に記載の各プライマーセットを混合して調整した反応液を６３℃で６０分間反応させることにより行った。一方、検体として、リゾクトニア・ソラニＡＧ２－１、リゾクトニア・ソラニＡＧ４、テンサイ黒根病の病原菌であるアファノミセス・コクリオイデスを用いた以外は、同様の工程及び条件により、ＤＮＡを増幅する反応を行った。さらに、ネガティブコントロールとして、当該鋳型ＤＮＡ溶液に代えて滅菌蒸留水を添加したものを用いた。

【0060】

［表２］

【0061】

（４）ＤＮＡ増幅の確認
病原菌のＤＮＡの増幅評価は、目視により行った。その結果を図２に示す。図２に示す通り、リゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶから抽出したＤＮＡの反応液では、赤色から黄色に変色（黄色に呈色）したのに対し（図２の（ｂ）すべて及び（ｃ）５，６，７）、ネガティブコントロール（図２の（ａ）１及び（ｃ）１）、リゾクトニア・ソラニＡＧ２－１（図２の（ａ）２及び（ｃ）２）、リゾクトニア・ソラニＡＧ４（図２の（ａ）３及び（ｃ）３）、ならびに、アファノミセス・コクリオイデス（図２の（ｃ）４）では、反応液の色調の変化がなく赤色であった（赤色に呈色）。これより、リゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶから抽出したＤＮＡの反応液でのみ、ＤＮＡの増幅反応が生じたことが示された。

【0062】

〔実施例２〕設計したＬＡＭＰプライマーの特異性の検証
設計したＬＡＭＰプライマーについて、以下の表３に示す各種のリゾクトニア・ソラニを２４菌体、テンサイ黒根病の病原菌であるアファノミセス・コクリオイデスを７菌体、その近縁種３菌体を供して、実施例１（３）の条件でＬＡＭＰ反応を行った。その結果を下掲の表３に示す。

【0063】

［表３］

【0064】

上掲の表３に示すように、テンサイ根腐病の病原菌であるリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶ及びリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＩＩＢを特異的に検出した。一方で、他のＡＧのリゾクトニア・ソラニＡＧ１の核酸、リゾクトニア・ソラニＡＧ２－１の核酸、リゾクトニア・ソラニＡＧ３の核酸、リゾクトニア・ソラニＡＧ４の核酸、及び、リゾクトニア・ソラニＡＧ５の核酸の増幅反応は起こらなかった。さらに、テンサイ黒根病の病原菌であるアファノミセス・コクリオイデス及びその近縁種の核酸の増幅反応は起こらなかった。このことから、設計したＬＡＭＰプライマーは、リゾクトニア・ソラニのうち、テンサイ根腐病の病原菌となるリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＶ及びリゾクトニア・ソラニＡＧ２－２ＩＩＩＢを特異的に検出し、さらにテンサイ黒根病の病原菌であるアファノミセス・コクリオイデスを検出しないことから、当該設計したＬＡＭＰプライマーを用いて、テンサイ根腐病とテンサイ黒根病の判別が可能であることが確認された。

【0065】

〔実施例３〕腐敗テンサイ根を使用した従来の検出方法（テンサイ根腐菌用培地による培養物の検鏡による検出法）との検出感度の比較
腐敗テンサイ根３５個体を使用して、テンサイ根腐菌用培地を用いた検出方法（以下、「従来法」という。）と、実施例１のＬＡＭＰ法を用いた検出方法（以下、単に「ＬＡＭＰ法」という。）との検出感度を比較した。

【0066】

従来法は、次の手順より行った。腐敗したテンサイ根の黒変部と健全部の境界部分を切り出し、流水と滅菌水で洗浄した。滅菌ろ紙を用いて組織片の水分を十分に取り除いた後、素寒天培地に乳酸を添加した根腐病菌用培地に置床した。４～７日後に菌叢が生えた培地の培養物をＰＤＡ培地（ポテトデキストロース寒天培地）に移して培養後、検鏡して同定した。さらに、テンサイ黒根病の検出方法に関する特願２０２２－０２３３３５に記載のアファノミセス選択分離培地を用いた従来の検出方法及びＬＡＭＰ法による検出方法より、同じ腐敗テンサイ根３５個体を被験体として病原菌の同定を行った。両病原菌の検出における従来法とＬＡＭＰ法による結果を下掲の表４に示す。

【0067】

［表４］

【0068】

上掲の表４に示すように、テンサイ根腐病の検出における従来法では、３５個体中１４個体がテンサイ根腐病と判定された。一方、テンサイ根腐病の検出におけるＬＡＭＰ法では、３５個体中２１個体がテンサイ根腐病と判定された。テンサイ根腐病の検出における従来法で陽性と判定された個体が、ＬＡＭＰ法で陰性判定となることはなかった。また、検診にかかる時間は、従来法では早くとも１週間以上を要していたのに対し、ＬＡＭＰ法では１～２日で完了した。さらに、テンサイ黒根病と判定された個体がテンサイ根腐病と判定されること及びテンサイ根腐病と判定された個体がテンサイ黒根病と判定されることはなかった。

【0069】

以上の結果から、腐敗症状を呈したテンサイ根からＤＮＡを抽出し、ＬＡＭＰプライマーを用いてＬＡＭＰ法を行うことで、従来法と比較して精度よく、迅速にテンサイ黒根病とテンサイ根腐病の判別を行うことができると示唆された。

【図1】

【図2】

【配列表】

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