(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023121264
(43)【公開日】2023-08-31
(54)【発明の名称】変異ウイルスの検出方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/70 20060101AFI20230824BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20230824BHJP
C12Q 1/6888 20180101ALI20230824BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20230824BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/70
C12Q1/686 Z
C12Q1/6888 Z
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】30
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022024507
(22)【出願日】2022-02-21
(71)【出願人】
【識別番号】000001993
【氏名又は名称】株式会社島津製作所
(74)【代理人】
【識別番号】110001069
【氏名又は名称】弁理士法人京都国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】四方 正光
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ10
4B063QQ28
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR35
4B063QR56
4B063QR62
4B063QR79
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ＲＮＡウイルス変異株を、迅速に、かつ偽陰性を生じることなく検出する方法を提供する。
【解決手段】検体中のＲＮＡウイルスを検出する方法であって、
以下の（１）～（５）の存在下でＰＣＲを行う工程；
（１）前記ＲＮＡウイルスから逆転写反応により調製されたｃＤＮＡおよび内部コントロールＤＮＡ
（２）前記ＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に低い遺伝子を増幅する１以上のＰＣＲプライマー対および変異頻度が相対的に高い遺伝子を増幅する１以上のＰＣＲプライマー対、ならびに前記内部コントロールＤＮＡを増幅するＰＣＲプライマー対
（３）増幅された前記変異頻度が相対的に低い遺伝子、前記変異頻度が相対的に高い遺伝子および内部コントロールＤＮＡのそれぞれを検出するためのオリゴヌクレオチド蛍光標識プローブ
（４）ＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素
（５）ＰＣＲ緩衝液
を含む、前記方法。
【選択図】なし
【解決手段】検体中のＲＮＡウイルスを検出する方法であって、
以下の（１）～（５）の存在下でＰＣＲを行う工程；
（１）前記ＲＮＡウイルスから逆転写反応により調製されたｃＤＮＡおよび内部コントロールＤＮＡ
（２）前記ＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に低い遺伝子を増幅する１以上のＰＣＲプライマー対および変異頻度が相対的に高い遺伝子を増幅する１以上のＰＣＲプライマー対、ならびに前記内部コントロールＤＮＡを増幅するＰＣＲプライマー対
（３）増幅された前記変異頻度が相対的に低い遺伝子、前記変異頻度が相対的に高い遺伝子および内部コントロールＤＮＡのそれぞれを検出するためのオリゴヌクレオチド蛍光標識プローブ
（４）ＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素
（５）ＰＣＲ緩衝液
を含む、前記方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
検体中のＲＮＡウイルスを検出する方法であって、
以下の（１）～（５）の存在下でＰＣＲを行う工程；
（１）前記ＲＮＡウイルスから逆転写反応により調製されたｃＤＮＡおよび内部コントロールＤＮＡ
（２）前記ＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に低い遺伝子を増幅する１以上のＰＣＲプライマー対および変異頻度が相対的に高い遺伝子を増幅する１以上のＰＣＲプライマー対、ならびに前記内部コントロールＤＮＡを増幅するＰＣＲプライマー対
（３）増幅された前記変異頻度が相対的に低い遺伝子、前記変異頻度が相対的に高い遺伝子および内部コントロールＤＮＡのそれぞれを検出するためのオリゴヌクレオチド蛍光標識プローブ
（４）ＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素
（５）ＰＣＲ緩衝液
増幅された前記変異頻度が相対的に低い遺伝子および前記変異頻度が相対的に高い遺伝子を検出する工程；および、
検出された前記変異頻度が相対的に高い遺伝子の存在量に基づき、前記検体中に変異したＲＮＡウイルスが存在するか否かを判定する工程；
を含む、前記方法。
以下の（１）～（５）の存在下でＰＣＲを行う工程；
（１）前記ＲＮＡウイルスから逆転写反応により調製されたｃＤＮＡおよび内部コントロールＤＮＡ
（２）前記ＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に低い遺伝子を増幅する１以上のＰＣＲプライマー対および変異頻度が相対的に高い遺伝子を増幅する１以上のＰＣＲプライマー対、ならびに前記内部コントロールＤＮＡを増幅するＰＣＲプライマー対
（３）増幅された前記変異頻度が相対的に低い遺伝子、前記変異頻度が相対的に高い遺伝子および内部コントロールＤＮＡのそれぞれを検出するためのオリゴヌクレオチド蛍光標識プローブ
（４）ＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素
（５）ＰＣＲ緩衝液
増幅された前記変異頻度が相対的に低い遺伝子および前記変異頻度が相対的に高い遺伝子を検出する工程；および、
検出された前記変異頻度が相対的に高い遺伝子の存在量に基づき、前記検体中に変異したＲＮＡウイルスが存在するか否かを判定する工程；
を含む、前記方法。
【請求項2】
前記変異頻度が相対的に低い遺伝子が、前記ＲＮＡウイルスのヌクレオカプシドタンパク質をコードする遺伝子（Ｎ遺伝子）である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記変異頻度が相対的に高い遺伝子が、前記ＲＮＡウイルスのスパイクタンパク質をコードする遺伝子（Ｓ遺伝子）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＲＮＡウイルスが、新型コロナウイルスである、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記Ｓ遺伝子増幅用の１以上のＰＣＲプライマー対が、Ｋ４１７Ｎ、Ｋ４１７Ｔ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｑ４９３Ｋ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ａ５７０Ｄ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｒ、Ｐ６８１Ｈ、Ｖ１１７６Ｆおよびｄｅｌ６９／７０の変異をコードするＳ遺伝子領域をそれぞれ増幅することのできるＰＣＲプライマー対から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記Ｓ遺伝子増幅用のＰＣＲプライマー対が、さらに、野生型５０１ＮをコードするＳ遺伝子領域を増幅することのできるＰＣＲプライマー対を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記内部コントロールＤＮＡが、概ね５０～２００ｂｐであって、ＧＣ含量が概ね４０～６０％である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記ＰＣＲを行う工程前に、検体を、水酸化ナトリウムを主成分とする検体処理液と混合する工程をさらに含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記ＰＣＲを行う工程前に、検体を、水酸化ナトリウムを主成分とする検体処理液と混合し、得られた混合液を、常温～９５℃で３～５分間インキュベーションする工程をさらに含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記検体処理液が、グリコールエーテルジアミン四酢酸および／またはジチオスレイトーを含む、請求項８または９に記載の方法。
【請求項11】
前記検体処理液が、界面活性剤を含む、請求項８～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記検体が、生物試料、生物由来試料、環境試料および環境由来試料からなる群から選ばれる、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記検体が、排泄物試料、排泄物由来試料、嘔吐物および嘔吐物由来試料からなる群から選ばれる、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
前記ＰＣＲ緩衝液が、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２およびｄＮＴＰミックス（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰからなる混合物）を含むトリス緩衝液である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
前記ＰＣＲ緩衝液が、ＤＮＡポリメラーゼに吸着する生体由来の負電荷物質およびＤＮＡに吸着する生体由来の正電荷物質であってＰＣＲを阻害する物質に結合し、前記負電荷物質および正電荷物質のＰＣＲ阻害作用を中和する物質を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
検体中のＲＮＡウイルスを検出するキットであって、
（１）内部コントロールＤＮＡ；
（２）前記ＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に低い遺伝子を増幅する１以上のＰＣＲプライマー対および変異頻度が相対的に高い遺伝子を増幅する１以上のＰＣＲプライマー対、ならびに前記内部コントロールＤＮＡを増幅するＰＣＲプライマー対；
（３）増幅された前記変異頻度が相対的に低い遺伝子、前記変異頻度が相対的に高い遺伝子および内部コントロールＤＮＡのそれぞれを検出するためのオリゴヌクレオチド蛍光標識プローブ；
（４）ＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素；ならびに
（５）ＰＣＲ緩衝液；
を含む前記キット。
（１）内部コントロールＤＮＡ；
（２）前記ＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に低い遺伝子を増幅する１以上のＰＣＲプライマー対および変異頻度が相対的に高い遺伝子を増幅する１以上のＰＣＲプライマー対、ならびに前記内部コントロールＤＮＡを増幅するＰＣＲプライマー対；
（３）増幅された前記変異頻度が相対的に低い遺伝子、前記変異頻度が相対的に高い遺伝子および内部コントロールＤＮＡのそれぞれを検出するためのオリゴヌクレオチド蛍光標識プローブ；
（４）ＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素；ならびに
（５）ＰＣＲ緩衝液；
を含む前記キット。
【請求項18】
前記変異頻度が相対的に低い遺伝子が、前記ＲＮＡウイルスのヌクレオカプシドをコードする遺伝子（Ｎ遺伝子）である、請求項１７に記載のキット。
【請求項19】
前記変異頻度が相対的に高い遺伝子が、前記ＲＮＡウイルスのスパイクタンパク質をコードする遺伝子（Ｓ遺伝子）である、請求項１７または１８に記載のキット。
【請求項20】
前記ＲＮＡウイルスが、新型コロナウイルスである、請求項１７～１９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項21】
前記Ｓ遺伝子増幅用の１以上のＰＣＲプライマー対が、Ｎ５０１Ｙ、Ｅ４８４Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｅ４８４Ｑ、Ｔ４７８Ｋ、Ｐ６８１Ｒ、Ｐ６８１Ｈ、Ｋ４１７Ｔ、Ａ５７０Ｄ、Ｋ４１７Ｎ、Ｖ１１７６Ｆおよびｄｅｌ６９／７０の変異をコードするＳ遺伝子領域をそれぞれ増幅することのできるＰＣＲプライマー対から選択される、請求項２０に記載のキット。
【請求項22】
前記Ｓ遺伝子増幅用のＰＣＲプライマー対が、さらに、野生型５０１ＮをコードするＳ遺伝子領域を増幅することのできるＰＣＲプライマー対を含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項23】
前記内部コントロールＤＮＡが、概ね５０～２００ｂｐであって、ＧＣ含量が概ね４０～６０％である、請求項１７～２２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項24】
さらに、検体と混合するための、水酸化ナトリウムを主成分とする検体処理液を含む、請求項１７～２３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項25】
前記検体処理液が、グリコールエーテルジアミン四酢酸および／またはジチオスレイトーを含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項26】
前記検体処理液が、界面活性剤を含む、請求項２４または２５に記載のキット。
【請求項27】
前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、請求項２６に記載のキット。
【請求項28】
前記内部コントロールＤＮＡが、概ね５０～２００ｂｐであって、ＧＣ含量が概ね４０～６０％である、請求項１７～２７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項29】
前記ＰＣＲ緩衝液が、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２およびｄＮＴＰミックス（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰからなる混合物）を含むトリス緩衝液である、請求項１７～２８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項30】
前記ＰＣＲ緩衝液が、ＤＮＡポリメラーゼに吸着する生体由来の負電荷物質およびＤＮＡに吸着する生体由来の正電荷物質であってＰＣＲを阻害する物質に結合し、前記負電荷物質および正電荷物質のＰＣＲ阻害作用を中和する物質を含む、請求項１７～２９のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、検体中のＲＮＡウイルスの検出方法であって、ウイルス感染または汚染の有無および変異ウイルスの存在の有無を同時に検出する方法、および当該方法を実行するためのキットに関する。
【背景技術】
【0002】
ウイルス感染症において、ウイルスの感染力、ウイルス感染後の疾患重篤化の可能性およびウイルス感染に対する薬物効果を予測するためには、変異株の出現を検知することは重要である。例えば、ＲＮＡウイルスである新型コロナウイルスは、ＳＡＲＳコロナウイルス２型（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）と呼ばれ、２０１９年末には急性呼吸器疾患を引き起こすことが判明した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の初発流行地は中国湖北省武漢市とされているが、その後世界的に流行し、世界各地で、ゲノムＲＮＡを構成する塩基配列が野生株とは異なる変異株の出現が報告されている。これらの変異株の中には、野生株と比較して感染力が増加した変異株が含まれるため、公衆衛生上、変異株の監視は重要である。またＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症治療薬の効果を予測する上で、変異株を検出することは非常に重要である。
【0003】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したかどうかの判定のために、国立感染症研究所から、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法が公表されている（非特許文献１）。この方法は、ＲＮＡウイルスであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む検体からウイルス由来のＲＮＡを抽出し、抽出したＲＮＡを、ＲＴ（reverse transcription）-ＰＣＲ（ＲＴ-ＰＣＲ）によりｃＤＮＡとして増幅し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】国立感染症研究所 病原体検出マニュアル ２０１９－ｎＣｏＶ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
インフルエンザウイルス、エイズウイルスおよびコロナウイルスは、一本鎖のＲＮＡをゲノムとして持つウイルスであるが、これらのウイルスにおいては遺伝子変異の生じる頻度が高いことが報告されている。また、ゲノムの変異において、ウイルスのヌクレオカプシド（Nucleocapsid）タンパク質をコードする遺伝子（Ｎ遺伝子）は、通常遺伝子変異が起こりにくいが、ウイルス表面に存在し、感染力と関係するスパイク状のタンパク質（スパイクタンパク質）をコードする遺伝子（Ｓ遺伝子）は、変異を生じやすいことが報告されている。例えば、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）では、短期間に多くの変異株が報告されているが、これらはＳ遺伝子変異に起因する変異株である。
【0006】
ＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲ産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを用いる新型コロナウイルスの検出において、Ｎ遺伝子のみを検出対象とするＰＣＲプライマーを用いる場合、基本的にそのウイルスの存在を検出することができるが、変異株であるかどうかの判断は困難である。一方、Ｓ遺伝子のみを新型コロナウイルスの検出対象とするＰＣＲプライマーを用いる場合、Ｓ遺伝子においてＰＣＲプライマーにより挟み込み、増幅対象とした領域が変異した変異株の存在を検出することができるが、Ｓ遺伝子において増幅対象としなかった他の領域が変異した変異株は検出することができない。その結果、ウイルス感染または汚染をも検出することができない。したがって、ウイルス感染または汚染を検出し、かつ該ウイルスが変異株かどうかを判定するためには、先ずＮ遺伝子の存在を検査し、Ｎ遺伝子が陽性であった場合に、さらにＳ遺伝子の変異の有無および種類を検査しなければならない。
【0007】
このような状況に鑑み、本発明の目的は、ウイルス変異株を、迅速に、かつ偽陰性を生じることなく検出する方法および当該方法を実行するためのキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
すなわち、本発明の目的は、以下の発明により達成される。
〔１〕検体中のＲＮＡウイルスを検出する方法であって、
以下の（１）～（５）の存在下でＰＣＲを行う工程；
（１）前記ＲＮＡウイルスから逆転写反応により調製されたｃＤＮＡおよび内部コントロールＤＮＡ
（２）前記ＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に低い遺伝子を増幅する１以上のＰＣＲプライマー対および変異頻度が相対的に高い遺伝子を増幅する１以上のＰＣＲプライマー対、ならびに前記内部コントロールＤＮＡを増幅するＰＣＲプライマー対
（３）増幅された前記変異頻度が相対的に低い遺伝子、前記変異頻度が相対的に高い遺伝子および内部コントロールＤＮＡのそれぞれを検出するためのオリゴヌクレオチド蛍光標識プローブ
（４）ＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素
（５）ＰＣＲ緩衝液
増幅された前記変異頻度が相対的に低い遺伝子および前記変異頻度が相対的に高い遺伝子を検出する工程；および、
検出された前記変異頻度が相対的に高い遺伝子の存在量に基づき、前記検体中に変異したＲＮＡウイルスが存在するか否かを判定する工程；
を含む、前記方法。
〔２〕前記変異頻度が相対的に低い遺伝子が、前記ＲＮＡウイルスのヌクレオカプシドタンパク質をコードする遺伝子（Ｎ遺伝子）である、〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記変異頻度が相対的に高い遺伝子が、前記ＲＮＡウイルスのスパイクタンパク質をコードする遺伝子（Ｓ遺伝子）である、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕前記ＲＮＡウイルスが、新型コロナウイルスである、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕前記Ｓ遺伝子増幅用の１以上のＰＣＲプライマー対が、Ｋ４１７Ｎ、Ｋ４１７Ｔ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｑ４９３Ｋ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ａ５７０Ｄ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｒ、Ｐ６８１Ｈ、Ｖ１１７６Ｆおよびｄｅｌ６９／７０の変異をコードするＳ遺伝子領域をそれぞれ増幅することのできるＰＣＲプライマー対から選択される、〔４〕に記載の方法。
〔６〕前記Ｓ遺伝子増幅用のＰＣＲプライマー対が、さらに、野生型５０１ＮをコードするＳ遺伝子領域を増幅することのできるＰＣＲプライマー対を含む、〔５〕に記載の方法。
〔７〕前記内部コントロールＤＮＡが、概ね５０～２００ｂｐであって、ＧＣ含量が概ね４０～６０％である、〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の方法
〔８〕前記ＰＣＲを行う工程前に、検体を、水酸化ナトリウムを主成分とする検体処理液と混合する工程をさらに含む、〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕前記ＰＣＲを行う工程前に、検体を、水酸化ナトリウムを主成分とする検体処理液と混合し、得られた混合液を、常温～９５℃で３～５分間インキュベーションする工程をさらに含む、〔１〕～〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕前記検体処理液が、グリコールエーテルジアミン四酢酸および／またはジチオスレイトーを含む、〔８〕または〔９〕に記載の方法。
〔１１〕前記検体処理液が、界面活性剤を含む、〔８〕～〔１０〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕前記検体が、生物試料、生物由来試料、環境試料および環境由来試料からなる群から選ばれる、〔１〕～〔１２〕のいずれかに記載の方法。
〔１４〕前記検体が、排泄物試料、排泄物由来試料、嘔吐物および嘔吐物由来試料からなる群から選ばれる、〔１〕～〔１２〕のいずれかに記載の方法。
〔１５〕前記ＰＣＲ緩衝液が、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２およびｄＮＴＰミックス（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰからなる混合物）を含むトリス緩衝液である、〔１〕～〔１４〕のいずれかに記載の方法。
〔１６〕前記ＰＣＲ緩衝液が、ＤＮＡポリメラーゼに吸着する生体由来の負電荷物質およびＤＮＡに吸着する生体由来の正電荷物質であってＰＣＲを阻害する物質に結合し、前記負電荷物質および正電荷物質のＰＣＲ阻害作用を中和する物質を含む、〔１〕～〔１５〕いずれかに記載の方法。
〔１７〕検体中のＲＮＡウイルスを検出するキットであって、
（１）内部コントロールＤＮＡ；
（２）前記ＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に低い遺伝子を増幅する１以上のＰＣＲプライマー対および変異頻度が相対的に高い遺伝子を増幅する１以上のＰＣＲプライマー対、ならびに前記内部コントロールＤＮＡを増幅するＰＣＲプライマー対；
（３）増幅された前記変異頻度が相対的に低い遺伝子、前記変異頻度が相対的に高い遺伝子および内部コントロールＤＮＡのそれぞれを検出するためのオリゴヌクレオチド蛍光標識プローブ；
（４）ＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素；ならびに
（５）ＰＣＲ緩衝液；
を含む前記キット。
〔１８〕前記変異頻度が相対的に低い遺伝子が、前記ＲＮＡウイルスのヌクレオカプシドをコードする遺伝子（Ｎ遺伝子）である、〔１７〕に記載のキット。
〔１９〕前記変異頻度が相対的に高い遺伝子が、前記ＲＮＡウイルスのスパイクタンパク質をコードする遺伝子（Ｓ遺伝子）である、〔１７〕または〔１８〕に記載のキット。
〔２０〕前記ＲＮＡウイルスが、新型コロナウイルスである、〔１７〕～〔１９〕のいずれかに記載のキット。
〔２１〕前記Ｓ遺伝子増幅用の１以上のＰＣＲプライマー対が、Ｎ５０１Ｙ、Ｅ４８４Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｅ４８４Ｑ、Ｔ４７８Ｋ、Ｐ６８１Ｒ、Ｐ６８１Ｈ、Ｋ４１７Ｔ、Ａ５７０Ｄ、Ｋ４１７Ｎ、Ｖ１１７６Ｆおよびｄｅｌ６９／７０の変異をコードするＳ遺伝子領域をそれぞれ増幅することのできるＰＣＲプライマー対から選択される、〔２０〕に記載のキット。
〔２２〕前記Ｓ遺伝子増幅用のＰＣＲプライマー対が、さらに、野生型５０１ＮをコードするＳ遺伝子領域を増幅することのできるＰＣＲプライマー対を含む、〔２１〕に記載のキット。
〔２３〕前記内部コントロールＤＮＡが、概ね５０～２００ｂｐであって、ＧＣ含量が概ね４０～６０％である、〔１７〕～〔２２〕のいずれかに記載のキット。
〔２４〕さらに、検体と混合するための、水酸化ナトリウムを主成分とする検体処理液を含む、〔１７〕～〔２３〕のいずれかに記載のキット。
〔２５〕前記検体処理液が、グリコールエーテルジアミン四酢酸および／またはジチオスレイトーを含む、〔２４〕に記載のキット。
〔２６〕前記検体処理液が、界面活性剤を含む、〔２４〕または〔２５〕に記載のキット。
〔２７〕前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、〔２６〕に記載のキット。
〔２８〕前記内部コントロールＤＮＡが、概ね５０～２００ｂｐであって、ＧＣ含量が概ね４０～６０％である、〔１７〕～〔２７〕のいずれかに記載のキット。
〔２９〕前記ＰＣＲ緩衝液が、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２およびｄＮＴＰミックス（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰからなる混合物）を含むトリス緩衝液である、〔１７〕～〔２８〕のいずれかに記載のキット。
〔３０〕前記ＰＣＲ緩衝液が、ＤＮＡポリメラーゼに吸着する生体由来の負電荷物質およびＤＮＡに吸着する生体由来の正電荷物質であってＰＣＲを阻害する物質に結合し、前記負電荷物質および正電荷物質のＰＣＲ阻害作用を中和する物質を含む、〔１７〕～〔２９〕のいずれかに記載のキット。
〔１〕検体中のＲＮＡウイルスを検出する方法であって、
以下の（１）～（５）の存在下でＰＣＲを行う工程；
（１）前記ＲＮＡウイルスから逆転写反応により調製されたｃＤＮＡおよび内部コントロールＤＮＡ
（２）前記ＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に低い遺伝子を増幅する１以上のＰＣＲプライマー対および変異頻度が相対的に高い遺伝子を増幅する１以上のＰＣＲプライマー対、ならびに前記内部コントロールＤＮＡを増幅するＰＣＲプライマー対
（３）増幅された前記変異頻度が相対的に低い遺伝子、前記変異頻度が相対的に高い遺伝子および内部コントロールＤＮＡのそれぞれを検出するためのオリゴヌクレオチド蛍光標識プローブ
（４）ＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素
（５）ＰＣＲ緩衝液
増幅された前記変異頻度が相対的に低い遺伝子および前記変異頻度が相対的に高い遺伝子を検出する工程；および、
検出された前記変異頻度が相対的に高い遺伝子の存在量に基づき、前記検体中に変異したＲＮＡウイルスが存在するか否かを判定する工程；
を含む、前記方法。
〔２〕前記変異頻度が相対的に低い遺伝子が、前記ＲＮＡウイルスのヌクレオカプシドタンパク質をコードする遺伝子（Ｎ遺伝子）である、〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記変異頻度が相対的に高い遺伝子が、前記ＲＮＡウイルスのスパイクタンパク質をコードする遺伝子（Ｓ遺伝子）である、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕前記ＲＮＡウイルスが、新型コロナウイルスである、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕前記Ｓ遺伝子増幅用の１以上のＰＣＲプライマー対が、Ｋ４１７Ｎ、Ｋ４１７Ｔ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｑ４９３Ｋ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ａ５７０Ｄ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｒ、Ｐ６８１Ｈ、Ｖ１１７６Ｆおよびｄｅｌ６９／７０の変異をコードするＳ遺伝子領域をそれぞれ増幅することのできるＰＣＲプライマー対から選択される、〔４〕に記載の方法。
〔６〕前記Ｓ遺伝子増幅用のＰＣＲプライマー対が、さらに、野生型５０１ＮをコードするＳ遺伝子領域を増幅することのできるＰＣＲプライマー対を含む、〔５〕に記載の方法。
〔７〕前記内部コントロールＤＮＡが、概ね５０～２００ｂｐであって、ＧＣ含量が概ね４０～６０％である、〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の方法
〔８〕前記ＰＣＲを行う工程前に、検体を、水酸化ナトリウムを主成分とする検体処理液と混合する工程をさらに含む、〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕前記ＰＣＲを行う工程前に、検体を、水酸化ナトリウムを主成分とする検体処理液と混合し、得られた混合液を、常温～９５℃で３～５分間インキュベーションする工程をさらに含む、〔１〕～〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕前記検体処理液が、グリコールエーテルジアミン四酢酸および／またはジチオスレイトーを含む、〔８〕または〔９〕に記載の方法。
〔１１〕前記検体処理液が、界面活性剤を含む、〔８〕～〔１０〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕前記検体が、生物試料、生物由来試料、環境試料および環境由来試料からなる群から選ばれる、〔１〕～〔１２〕のいずれかに記載の方法。
〔１４〕前記検体が、排泄物試料、排泄物由来試料、嘔吐物および嘔吐物由来試料からなる群から選ばれる、〔１〕～〔１２〕のいずれかに記載の方法。
〔１５〕前記ＰＣＲ緩衝液が、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２およびｄＮＴＰミックス（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰからなる混合物）を含むトリス緩衝液である、〔１〕～〔１４〕のいずれかに記載の方法。
〔１６〕前記ＰＣＲ緩衝液が、ＤＮＡポリメラーゼに吸着する生体由来の負電荷物質およびＤＮＡに吸着する生体由来の正電荷物質であってＰＣＲを阻害する物質に結合し、前記負電荷物質および正電荷物質のＰＣＲ阻害作用を中和する物質を含む、〔１〕～〔１５〕いずれかに記載の方法。
〔１７〕検体中のＲＮＡウイルスを検出するキットであって、
（１）内部コントロールＤＮＡ；
（２）前記ＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に低い遺伝子を増幅する１以上のＰＣＲプライマー対および変異頻度が相対的に高い遺伝子を増幅する１以上のＰＣＲプライマー対、ならびに前記内部コントロールＤＮＡを増幅するＰＣＲプライマー対；
（３）増幅された前記変異頻度が相対的に低い遺伝子、前記変異頻度が相対的に高い遺伝子および内部コントロールＤＮＡのそれぞれを検出するためのオリゴヌクレオチド蛍光標識プローブ；
（４）ＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素；ならびに
（５）ＰＣＲ緩衝液；
を含む前記キット。
〔１８〕前記変異頻度が相対的に低い遺伝子が、前記ＲＮＡウイルスのヌクレオカプシドをコードする遺伝子（Ｎ遺伝子）である、〔１７〕に記載のキット。
〔１９〕前記変異頻度が相対的に高い遺伝子が、前記ＲＮＡウイルスのスパイクタンパク質をコードする遺伝子（Ｓ遺伝子）である、〔１７〕または〔１８〕に記載のキット。
〔２０〕前記ＲＮＡウイルスが、新型コロナウイルスである、〔１７〕～〔１９〕のいずれかに記載のキット。
〔２１〕前記Ｓ遺伝子増幅用の１以上のＰＣＲプライマー対が、Ｎ５０１Ｙ、Ｅ４８４Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｅ４８４Ｑ、Ｔ４７８Ｋ、Ｐ６８１Ｒ、Ｐ６８１Ｈ、Ｋ４１７Ｔ、Ａ５７０Ｄ、Ｋ４１７Ｎ、Ｖ１１７６Ｆおよびｄｅｌ６９／７０の変異をコードするＳ遺伝子領域をそれぞれ増幅することのできるＰＣＲプライマー対から選択される、〔２０〕に記載のキット。
〔２２〕前記Ｓ遺伝子増幅用のＰＣＲプライマー対が、さらに、野生型５０１ＮをコードするＳ遺伝子領域を増幅することのできるＰＣＲプライマー対を含む、〔２１〕に記載のキット。
〔２３〕前記内部コントロールＤＮＡが、概ね５０～２００ｂｐであって、ＧＣ含量が概ね４０～６０％である、〔１７〕～〔２２〕のいずれかに記載のキット。
〔２４〕さらに、検体と混合するための、水酸化ナトリウムを主成分とする検体処理液を含む、〔１７〕～〔２３〕のいずれかに記載のキット。
〔２５〕前記検体処理液が、グリコールエーテルジアミン四酢酸および／またはジチオスレイトーを含む、〔２４〕に記載のキット。
〔２６〕前記検体処理液が、界面活性剤を含む、〔２４〕または〔２５〕に記載のキット。
〔２７〕前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、〔２６〕に記載のキット。
〔２８〕前記内部コントロールＤＮＡが、概ね５０～２００ｂｐであって、ＧＣ含量が概ね４０～６０％である、〔１７〕～〔２７〕のいずれかに記載のキット。
〔２９〕前記ＰＣＲ緩衝液が、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２およびｄＮＴＰミックス（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰからなる混合物）を含むトリス緩衝液である、〔１７〕～〔２８〕のいずれかに記載のキット。
〔３０〕前記ＰＣＲ緩衝液が、ＤＮＡポリメラーゼに吸着する生体由来の負電荷物質およびＤＮＡに吸着する生体由来の正電荷物質であってＰＣＲを阻害する物質に結合し、前記負電荷物質および正電荷物質のＰＣＲ阻害作用を中和する物質を含む、〔１７〕～〔２９〕のいずれかに記載のキット。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、検体中のＲＮＡウイルスの存在を、前記ＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に低い遺伝子（例えば、新型コロナウイルスのＮ遺伝子）を増幅することにより検出し、同時に、ＲＮＡウイルス変異株の存在を、前記ＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に高い遺伝子（例えば、新型コロナウイルスのＳ遺伝子）を増幅することにより検出するため、ＲＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルス変異株を、迅速に、かつウイルスの存在について偽陰性を生じることなく検出することができる。例えば、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の存在を、変異頻度が相対的に低い遺伝子であるＮ遺伝子の増幅により検出し、同時に、感染力と関係し、変異頻度が相対的に高い遺伝子であるＳ遺伝子の変異領域を増幅することにより変異株を検出するため、目的とする変異株を１回の検査で、短時間で検出することができる。検体に別の新たなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株が含まれるとしても、Ｎ遺伝子は検出されるため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在が偽陰性となることはない。また本発明によれば、ＰＣＲにおいて内部コントロールＤＮＡが添加されるため、ＰＣＲが適切に進行したか否かを判断することができる。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明における検体としては、生物試料、生物由来試料、環境試料および環境由来試料などが挙げられる。生物試料には、細胞、組織および／または臓器の破砕物および抽出液が含まれる。組織または臓器としては、脳、脊髄、骨髄、結膜、角膜、硝子体、心臓、僧帽弁、三尖弁、肺、胸膜、肝臓、脾臓、腹膜、腸、リンパ節および皮膚などが挙げられる。生物試料には、さらに、全血、血漿および血清などを含む血液ならびに血液関連試料、リンパ液、唾液、鼻汁、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、汗、涙液、組織液（組織間液、細胞間液および間質液）、体腔液（腹水、胸水、心嚢液、脳脊髄液、関節液および眼房水）、胸腔、腹腔、頭蓋腔もしくは脊柱管内の滲出液（胸水または腹水等）が含まれる。生物試料は、遠心分離し、遠心分離による上清または遠心沈渣を検体としてもよい。生物試料には、前記生体試料を培養液、緩衝液および検体保存液などと混合したものも含まれる。前記緩衝液としては、特に限定されないが、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＨＥＰＥＳなどのグッド（Ｇｏｏｄ）緩衝液が挙げられる。生物由来試料には、前記生体試料に対して、例えばソニケーションなどにより処理をしたものが含まれる。環境試料には、大気、土壌、塵埃、水などを含むあらゆる試料が含まれる。環境由来試料には、前記環境試料に対して、例えばソニケーションなどにより処理をしたものが含まれる。
【0011】
本発明の別の実施態様として、検体としては、排泄物試料、排泄物由来試料、嘔吐物および嘔吐物由来試料などが挙げられる。排泄物試料および嘔吐物試料は、そのまま検体とすることもできるが、蒸留水、生理食塩水または緩衝液により希釈または懸濁してもよい。前記緩衝液としては、特に限定されないが、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＨＥＰＥＳなどのグッド（Ｇｏｏｄ）緩衝液が挙げられる。前記試料の懸濁液は遠心分離し、遠心上清を検体として使用してもよい。排泄物由来試料および嘔吐物由来試料には、拭き取り試料が含まれる。拭き取り試料とは、手指、食器、調理設備、トイレ設備、住宅設備などを綿棒、カット綿などで拭き取ったものをリン酸緩衝液などに溶出させたものである。
【0012】
本発明において、検出対象となるウイルスは、ＲＮＡウイルスである。ＲＮＡウイルスは、ゲノムとしてＲＮＡを持つウイルスであり、脂質二重層からなる膜であるエンベロープを持つコロナウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルスおよびデングウイルスなど、またエンベロープを持たないノロウイルス、ロタウイルスおよびライノウイルスなどが挙げられるが、これらに限定されることはない。コロナウイルスには、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ＭＥＲＳコロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）および新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が含まれる。ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡは、逆転写酵素を用いる逆転写反応によりｃＤＮＡを生成させることによって「ウイルスから調製されたＤＮＡ」となる。ＲＮＡウイルスから逆転写反応により得られたｃＤＮＡである「ウイルスから調製されたＤＮＡ」は、ＰＣＲにおいて、標的遺伝子領域の増幅に使用するプライマー対（フォワードおよびリバース）の選択により、特定の塩基配列を増幅し、検出することができる。
【0013】
ウイルスから遺伝子を遊離させるため、検体を、水酸化ナトリウムを主成分とする検体処理液と混合してもよい。さらに検体を、水酸化ナトリウムを主成分とする検体処理液と混合し、得られた混合液を、常温～９５℃、好ましくは８０～９５℃で３分間～５分間インキュベーションしてもよい。なお常温とは通常２５℃前後である。本発明の一実施態様において、検体中のコロナウイルスなどのＲＮＡウイルスからＲＮＡを遊離させるためには、検体を、水酸化ナトリウムを主成分とする検体処理液と混合し、常温～９５℃、好ましくは８０～９５℃で３分間～５分間インキュベーションしてもよい。検体処理液は、水酸化ナトリウム以外に、ＲＴ（reverse transcription）-ＰＣＲ処理を効率的に行い、測定精度を高める目的で、グリコールエーテルジアミン四酢酸等の金属キレート剤および／またはジチオスレイトール等の還元剤を含んでもよい。検体処理液と混合した検体または検体処理液と混合し、上記インキュベーション処理した検体は、本発明のＰＣＲを行う工程において、ＲＴ-ＰＣＲを行うことができる。
【0014】
本発明の一実施態様において、検体中のＲＮＡウイルスから、ＲＮＡを遊離させるため、前記検体処理液に界面活性剤を含めてもよい。前記検体処理液に含める界面活性剤としては、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤または非イオン界面活性剤を選択することができる。陰イオン界面活性剤としては、アルキルサルフェート、アルキルエーテルサルフェート、ドキュセート、スルホネートフルオロ界面活性剤、アルキルベンゼンスルホネート、アルキルアリールエーテルホスフェート、アルキルエーテルホスフェート、アルキルカルボキシレート、ラウロイルサルコシンナトリウム、カルボキシレートフルオロ界面活性剤、コール酸ナトリウムおよびデオキシコール酸ナトリウムなどが挙げられるが、これらに限定されない。アルキルサルフェートとしては、ドデシル硫酸ナトリウム（Sodium Dodecyl Sulfate、ＳＤＳ）およびドデシル硫酸アンモニウムが好ましく、ドデシル硫酸ナトリウムがより好ましい。ドデシル硫酸ナトリウムは、ラウリル硫酸ナトリウム（Sodium Lauryl Sulfate、ＳＬＳ）とも称される。陽イオン界面活性剤としては、エチルトリメチルアンモニウムブロマイド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドおよびテトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドなどが挙げられるが、これらに限定されない。両性界面活性剤としては、例えば、ベタインおよびアルキルアミノ脂肪酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標））、ポリエチレングリコールモノ-４-オクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（登録商標））、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（ＮＰ－４０）、Ｂｒｉｊ－３５（登録商標）などが挙げられるが、これらに限定されない。使用する界面活性剤の濃度は、検体中のウイルスからＤＮＡまたはＲＮＡを効率よく遊離させるため、検体との混合時に０.０５～５％（ｗ/ｖ）であることが好ましい。前記検体処理液に含める界面活性剤は、好ましくは、非イオン界面活性剤である。前記検体処理液には、さらにプロテイナーゼＫを含めてもよい。プロテイナーゼＫは、ＤＮＡおよびＲＮＡ分解酵素を不活化する作用があり、検体との混合時に１００～３００μｇ／ｍＬであることが好ましい。
【0015】
前記ＰＣＲ緩衝液は、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２およびｄＮＴＰミックス（deoxyribonucleotide 5’-triphosphate；ｄＡＴＰ（deoxyadenosine triphosphate）、ｄＧＴＰ（deoxyguanosine triphosphate）、ｄＣＴＰ（deoxycytidine triphosphate）およびｄＴＴＰ（deoxythymidine triphosphate）からなる混合物）を含む。前記ＰＣＲ緩衝液としては、特に限定されず、リン酸緩衝液、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（トリス）緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＨＥＰＥＳなどのグッド（Ｇｏｏｄ）緩衝液が挙げられるが、効率的なＰＣＲまたはＲＴ－ＰＣＲを行う観点からトリス塩酸緩衝液が好ましい。ＰＣＲを行う工程におけるｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌおよび緩衝液成分については、当業者であれば適切な濃度を設定することができる。例えば、ＭｇＣｌ２が１.５ｍＭ、ＫＣｌが３５ｍＭ、ｄＮＴＰがそれぞれ２００μＭおよびトリス塩酸が１０ｍＭである。ｄＮＴＰミックスは、前記ＰＣＲ緩衝液に代えて、前記検体処理液に含めてもよい。
【0016】
本発明の一実施態様において、前記ＰＣＲ緩衝液は、ＤＮＡポリメラーゼに吸着する生体由来の負電荷物質（例えば、ある種の糖および色素等）およびＤＮＡに吸着する生体由来の正電荷物質（例えば、ある種のタンパク質等）であってＰＣＲを阻害する物質に結合し、前記負電荷物質および正電荷物質のＰＣＲ阻害作用を中和する物質を含んでもよい。前記ＰＣＲ緩衝液として、遺伝子増幅用試薬Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（登録商標、島津製作所）またはＡｍｐｄｉｒｅｃｔ Ｐｌｕｓ（登録商標、島津製作所）を使用してもよい。
【0017】
本発明のＰＣＲを行う工程において、使用されるＤＮＡポリメラーゼは、好熱性細菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであり、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、ＫＯＤ、Ｐｆｕおよびこれらの変異体を使用することができるが、これらに限定されない。ＤＮＡポリメラーゼによる非特異的増幅を避けるため、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼを使用してもよい。ホットスタートＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、ＢＩＯＴＡＱ（登録商標）ホットスタートＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。ホットスタートＤＮＡポリメラーゼには、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体が結合したＤＮＡポリメラーゼおよび酵素活性部位を熱感受性化学修飾したＤＮＡポリメラーゼがあるが、本発明においてはいずれも使用することができる。
【0018】
本発明の検出方法において、検体中のＲＮＡウイルスからゲノムＲＮＡを遊離させた後、逆転写反応によりｃＤＮＡを生成させる。このため、本発明のＰＣＲを行う工程は、逆転写酵素および逆転写反応プライマーの存在下で実行される。すなわちＲＴ-ＰＣＲが実行される。逆転写酵素は、ＲＮＡを鋳型として、１本鎖のｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）を生成する酵素であり、逆転写反応を触媒する限り特に限定されないが、トリ骨髄芽球症ウイルス（Avian Myeloblastosis Virus、ＡＭＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（Moloney Murine Leukemia Virus、Ｍ－ＭＬＶ）およびヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus、ＨＩＶ）などのＲＮＡウイルス由来のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼならびにこれらの変異体を使用することができる。逆転写反応プライマーとしては、標的ＲＮＡの配列に特異的にハイブリダイズするプライマー、オリゴ（ｄＴ）プライマーまたはランダムプライマーを使用することができる。
【0019】
本発明のＰＣＲを行う工程において、ＰＣＲは、内部コントロールＤＮＡの存在下で実行される。内部コントロールＤＮＡは、ＰＣＲにおいて、ＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に低い遺伝子（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ遺伝子）および変異頻度が相対的に高い遺伝子（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ遺伝子）をそれぞれ増幅するためのＰＣＲプライマー、ならびに増幅された前記変異頻度が相対的に低い遺伝子および変異頻度が相対的に高い遺伝子のそれぞれを検出するためのオリゴヌクレオチド蛍光標識プローブとハイブリダイズしない配列を有する。このため、内部コントロールＤＮＡは、ＲＮＡウイルスから調製されたｃＤＮＡとは独立して増幅される。したがって、内部コントロールＤＮＡは、ＰＣＲが適切に進行したか否かを判断するための指標として用いることができる。ＰＣＲにおいて、内部コントロールＤＮＡが増幅される場合には、ＰＣＲが適切に進行していることが示されるが、増幅されない場合には、ＰＣＲそのものが進行していないことが示される。このため、検体中にウイルスが含まれているにも関わらず、ウイルス遺伝子が検出されないという誤判定（偽陰性）を避けることができる。
【0020】
内部コントロールＤＮＡの配列は、検体中のＲＮＡウイルスから調製されたｃＤＮＡの増幅対象となる配列を考慮して変更してもよく、好ましくは自然界に存在しない配列を人工合成したものである。内部コントロールＤＮＡの鎖長は、増幅効率をよくするため、概ね５０～２００ｂｐが好ましく、８０～１２０ｂｐがより好ましい。また、内部コントロールＤＮＡのＧＣ含量は、増幅効率の低下を避けるため、概ね４０～６０％が好ましい。前記鎖長および前記ＧＣ含量における「概ね」とは、増幅効率が低下しない場合には、前記鎖長においては５０～２００ｂｐの範囲外であってもよく、また前記ＧＣ含量においては４０～６０％の範囲外であってもよいことを意味し、当業者であれば容易に決定することができる。
【0021】
本発明のＰＣＲを行う工程において、ＰＣＲは、検体中のＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に低い遺伝子（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ遺伝子）を増幅する１以上のＰＣＲプライマー対、検体中のＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に高い遺伝子（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ遺伝子）を増幅する１以上のＰＣＲプライマー対および前記内部コントロールＤＮＡを増幅するＰＣＲプライマー対、ならびに増幅された前記Ｎ遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチド蛍光標識プローブ、前記Ｎ遺伝子以外のウイルス遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチド蛍光標識プローブおよび内部コントロールＤＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチド蛍光標識プローブの存在下で実行される。
【0022】
本発明の検出方法において、ＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に低い遺伝子を増幅する１以上のＰＣＲプライマー対および変異頻度が相対的に高い遺伝子を増幅する１以上のＰＣＲプライマー対は、標的とする塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（フォワードおよびリバース）である。前記内部コントロールＤＮＡを増幅するＰＣＲプライマー対は、前記内部コントロールＤＮＡの所定の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（フォワードおよびリバース）である。このストリンジェントな条件とは、ＰＣＲにおけるアニーリング、すなわち鋳型ＤＮＡにプライマーが結合するステップにおいて、鋳型ＤＮＡとプライマーとの結合が特異的である条件をいう。ＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に低い遺伝子を増幅する１以上のＰＣＲプライマー対および変異頻度が相対的に高い遺伝子を増幅する１以上のＰＣＲプライマー対は、内部コントロールＤＮＡにハイブリダイズせず、また内部コントロールＤＮＡを増幅するＰＣＲプライマー対は、検体中のＲＮＡウイルスから調製されたＤＮＡにハイブリダイズしない。これらのプライマーは、塩基長として、１５～３０塩基が好ましい。使用するプライマーの塩基配列は、それぞれのＰＣＲプライマー対による標的遺伝子領域の増幅が、ひとつのＰＣＲ反応系において良好に進行するように設計することができる。
【0023】
ＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に低い遺伝子を増幅するＰＣＲプライマーとしては、検出対象のＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に低い遺伝子の核酸配列に特異的なプライマーを使用することができる。本発明の一実施態様において、検出対象が新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の場合には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡから逆転写反応により生成したｃＤＮＡに対して、変異頻度が相対的に低い遺伝子を増幅するＰＣＲプライマーとしてＮ遺伝子の配列に特異的なプライマーを使用することができる。プライマーとしては、表１および表２に記載のプライマー対が例示される。例示されたＰＣＲプライマー対の増幅対象は、Ｎ遺伝子の二つの領域（Ｎ１およびＮ２）である。国立感染症症研究所の方法（表１）では、ＮセットのN_Sarbeco_F1（フォワード、配列番号１）およびN_Sarbeco_R1（リバース、配列番号２）ならびにＮセット No.2のNIID_2019-nCOV_N_F2（フォワード、配列番号３）およびNIID_2019-nCOV_N_R2（リバース、配列番号４）、またアメリカ疾病対策予防センターの方法（表２）では、N1 Forward Primer（配列番号５）およびN1 Reverse Primer（配列番号６）、ならびにN2 Forward Primer（配列番号７）およびN2 Reverse Primer（配列番号８）が例示される。本発明のＰＣＲを行う工程において、ＰＣＲは、Ｎ１およびＮ２領域を増幅するためのプライマー対のいずれか、または両方の存在下で実行される。
【0024】
【表1】
【0025】
【表2】
【0026】
ＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に高い遺伝子を増幅するＰＣＲプライマー対としては、検出対象のＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に高い遺伝子の核酸配列に特異的なプライマーを使用することができる。変異頻度が相対的に高いウイルス遺伝子としては、好ましくは、ウイルス表面に存在するスパイクタンパク質をコードする遺伝子（Ｓ遺伝子）が挙げられる。スパイクタンパク質は、宿主細胞上の特定の受容体に結合し、ウイルス感染の成立に重要なタンパク質である。ウイルスのヌクレオカプシドタンパク質をコードする遺伝子（Ｎ遺伝子）は変異を生じにくいが、Ｓ遺伝子は、Ｎ遺伝子と比較して変異を生じやすく、ウイルス変異株が出現する原因となる。本発明の一実施態様において、検出対象がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の場合には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡから逆転写反応により生成したｃＤＮＡに対して、Ｓ遺伝子の配列に特異的なプライマーを使用してもよい。
【0027】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株はいくつか報告されている。これらの変異株には、スパイクタンパク質の一部のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された変異株およびスパイクタンパク質の一部のアミノ酸残基が欠失した変異株などが含まれる。前記変異株における変異としては、例えば、Ｋ４１７Ｎ、Ｋ４１７Ｔ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｑ４９３Ｋ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ａ５７０Ｄ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｒ、Ｐ６８１Ｈ、Ｖ１１７６Ｆおよびｄｅｌ６９／７０から選んでもよく、これらのアミノ酸変異に対応する遺伝子変異をそれぞれ検出することのできるプライマー対を使用することにより、変異株を検出することができる。検出対象となる変異はこれらに限定されるわけではなく、他に報告のある変異および新たに見出された変異についても、変異を特異的に増幅することのできるプライマーを設計することにより検出対象にすることができる。
【0028】
Ｋ４１７Ｎ変異は、残基番号４１７のアミノ酸が、ＫからＮに置換したもの；Ｋ４１７Ｔ変異は、残基番号４１７のアミノ酸が、ＫからＴに置換したもの；Ｎ４４０Ｋ変異は、残基番号４４０のアミノ酸が、ＮからＫに置換したもの；Ｇ４４６Ｓは、残基番号４４６のアミノ酸が、ＧからＳに置換したもの、Ｌ４５２Ｒ変異は、残基番号４５２のアミノ酸が、ＬからＲに置換したもの；Ｓ４７７Ｎ変異は、残基番号４７７のアミノ酸が、ＳからＮに置換したもの；Ｔ４７８Ｋ変異は、残基番号４７８のアミノ酸が、ＴからＫに置換したもの；Ｅ４８４Ａ変異は、残基番号４８４のアミノ酸が、ＥからＡに置換したもの；Ｅ４８４Ｋ変異は、残基番号４８４のアミノ酸がＥからＫに置換したもの；Ｅ４８４Ｑ変異は、残基番号４８４のアミノ酸が、ＥからＱに置換したもの；Ｑ４９３Ｋ変異は、残基番号４９３のアミノ酸が、ＱからＫに置換したもの；Ｇ４９６Ｓ変異は、残基番号４９６のアミノ酸が、ＧからＳに置換したもの；Ｑ４９８Ｒ変異は、残基番号４９８のアミノ酸が、ＱからＲに置換したもの；Ｎ５０１Ｙ変異は、残基番号５０１のアミノ酸が、ＮからＹに置換したもの；Ｙ５０５Ｈ変異は、残基番号５０５のアミノ酸が、ＹからＨに置換したもの；Ａ５７０Ｄ変異は、残基番号５７０のアミノ酸が、ＡからＤに置換したもの；Ｈ６５５Ｙ変異は、残基番号６５５のアミノ酸が、ＨからＹに置換したもの；Ｎ６７９Ｋ変異は、残基番号６７９のアミノ酸が、ＮからＫに置換したもの；Ｐ６８１Ｒ変異は、残基番号６８１のアミノ酸が、ＰからＲに置換したもの；Ｐ６８１Ｈ変異は、残基番号６８１のアミノ酸が、ＰからＨに置換したもの；Ｖ１１７６Ｆ変異は、残基番号１１７６のアミノ酸が、ＶからＦに置換したもの：ｄｅｌ６９／７０変異は、残基番号６９～７０のアミノ酸が欠失したものを意味する。なおアミノ酸は、慣用的な１文字表記による略号で表示される。
【0029】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株において、Ｎ５０１Ｙ変異は、アルファ株、ベータ株およびガンマ株などで検出され；Ｅ４８４Ｋ変異は、ベータ株およびガンマ株などで検出され；Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ、Ｐ６８１ＲおよびＥ４８４Ｑの変異は、デルタ株などで検出され；ｄｅｌ６９／７０変異は、アルファ株などで検出される。また、オミクロン株は、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｋ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９ＫおよびＰ６８１Ｈなどの変異が認められている。
【0030】
このような変異株は、スパイクタンパク質をコードするＳ遺伝子の変異領域を、ＲＴ－ＰＣＲにより増幅することにより検出される。Ｓ遺伝子の変異領域を増幅するＰＣＲプライマーは、当業者であれば容易に設計することができる。例えば、変異した塩基配列部位を中心に１５塩基の重複領域を選び、変異部位から３'側に１８塩基伸ばした配列をプライマー配列としてもよい。このプライマー設計法は、置換および欠失のいずれの変異に対しても適用することができる。
【0031】
本発明のＰＣＲを行う工程において、ＰＣＲを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ遺伝子増幅用のＰＣＲプライマー対として、変異のない野生株を検出するために、野生型５０１Ｎ（残基番号５０１のアミノ酸がＮ）を含む領域を増幅するＰＣＲプライマー対の存在下で実行してもよい。
【0032】
本発明において、ＰＣＲ産物の検出はリアルタイム測定によって行うことができる。ＰＣＲ産物のリアルタイム測定は、リアルタイムＰＣＲとも呼ばれる。本発明では、ＰＣＲ産物を蛍光により検出するため、オリゴヌクレオチド蛍光標識プローブを使用する。ＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に低い遺伝子（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ遺伝子）、ＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に高い遺伝子（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ遺伝子）および内部コントロールＤＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチド蛍光標識プローブは、ＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に低い遺伝子（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ遺伝子）、ＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に高い遺伝子（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ遺伝子）および内部コントロールＤＮＡを増幅するＰＣＲプライマー対により増幅されたＰＣＲ産物に、それぞれストリンジェントな条件でハイブリダイズする。ストリンジェントな条件とは、ＰＣＲにより増幅された核酸断片とオリゴヌクレオチド蛍光標識プローブとの間で、アニーリング時に特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドは形成されない条件をいう。本発明において使用するオリゴヌクレオチド蛍光標識プローブは、塩基長として１５～２５塩基が好ましい。
【0033】
本発明の一実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡからＲＴ－ＰＣＲにより増幅されたＮ遺伝子の二つの領域（Ｎ１およびＮ２）に対して、表１および表２に記載のオリゴヌクレオチド蛍光標識プローブが例示される。国立感染症症研究所の方法（表１）に基づけば、ＮセットのN_Sarbeco_F1（フォワード、配列番号１）およびN_Sarbeco_R1（リバース、配列番号２）のプライマー対による増幅産物に対して、オリゴヌクレオチド蛍光標識プローブ（N_Sarbeco_P1、配列番号９）による検出が例示される。またＮセット No.2のNIID_2019-nCOV_N_F2（フォワード、配列番号３）およびNIID_2019-nCOV_N_R2（リバース、配列番号４）のプライマー対による増幅産物に対して、オリゴヌクレオチド蛍光標識プローブ（NIID_2019-nCOV_N_P2、配列番号１０）による検出が例示される。アメリカ疾病対策予防センターの方法（表２）に基づけば、Ｎ１セットのN1 Forward Primer（配列番号５）およびN1 Reverse Primer（配列番号６）のプライマー対による増幅産物に対して、オリゴヌクレオチド蛍光標識プローブ（N1 Probe、配列番号１１）による検出が例示される。またＮ２セットのN2 Forward Primer（配列番号７）およびN2 Reverse Primer（配列番号８）のプライマー対による増幅産物に対して、オリゴヌクレオチド蛍光標識プローブ（N2 Probe、配列番号１２）による検出が例示される。
【0034】
蛍光標識プローブとしては、加水分解プローブ、Molecular Beaconおよびサイクリングプローブなどが挙げられるが、これらに限定されない。加水分解プローブは、５'末端が蛍光色素で、また３'末端がクエンチャー物質で修飾されたオリゴヌクレオチドである。加水分解プローブは、ＰＣＲのアニーリング時に、鋳型ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするが、プローブ上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制される。その後の伸長反応ステップで、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのもつ５'→３'エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型ＤＮＡにハイブリダイズした加水分解プローブが分解されると、蛍光色素がプローブから遊離し、クエンチャーによる蛍光の発生の抑制が解除されて蛍光を発する。この蛍光強度を測定することにより、増幅産物の生成量を測定することができる。前記蛍光色素としては、ＦＡＭ（6-carboxyfluorescein）、ＲＯＸ（6-carboxy-X-rhodamine）、Ｃｙ３およびＣｙ５（Cyanine系色素）ならびにＨＥＸ（4,7,2',4',5',7'-hexachloro-6-carboxyfluorescein）などが挙げられるが、これらに限定されない。前記クエンチャーとしては、ＴＡＭＲＡ（登録商標）、ＢＨＱ（Black Hole Quencher、登録商標）１、ＢＨＱ２、ＭＧＢ－Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）およびＤＡＢＣＹＬなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0035】
ＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に低い遺伝子（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ遺伝子）、ＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に高い遺伝子（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ遺伝子）および内部コントロールＤＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチド蛍光標識プローブは、相互に異なる蛍光色素を結合することが好ましい。それぞれのプローブに結合する蛍光色素が相互に異なることにより、ＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に低い遺伝子（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ遺伝子）、ＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に高い遺伝子（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ遺伝子）および内部コントロールＤＮＡをそれぞれ増幅するＰＣＲプライマー対によるＰＣＲ産物を分別して測定することができる。相互に異なる蛍光色素の組み合わせは、蛍光特性が異なり、蛍光測定において相互に干渉がなければ特に限定されない。前記「干渉」とは、一方の蛍光色素の蛍光測定に対して、他方の蛍光色素が妨害することであり、その結果、正確な蛍光測定値を得ることができなくなることを指す。
【0036】
本発明のＰＣＲを行う工程において、ＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に低い遺伝子（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ遺伝子）の異なる領域を増幅するＰＣＲプライマー対を２以上用いてＰＣＲを実行する場合、該プライマー対によるＰＣＲ増幅産物をそれぞれ検出する２以上のオリゴヌクレオチド蛍光標識プローブは、相互に同一の蛍光色素を結合してもよく、相互に異なる蛍光色素を結合してもよい。
【0037】
本発明のＰＣＲを行う工程において、ＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に高い遺伝子（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ遺伝子）を増幅するＰＣＲプライマー対を２以上用いてＰＣＲを実行する場合、該プライマー対によるＰＣＲ増幅産物をそれぞれ検出する２以上のオリゴヌクレオチド蛍光標識プローブは、相互に同一の蛍光色素を結合してもよく、相互に異なる蛍光色素を結合してもよい。前記２以上のＰＣＲプライマー対が、それぞれＳ遺伝子の異なる変異領域を増幅する場合において、それぞれのＰＣＲ増幅産物を検出するオリゴヌクレオチド蛍光標識プローブが相互に同一の蛍光色素を結合する場合、変異株の存在を検出できるが、変異株を特定することが困難である場合がある。一方、前記オリゴヌクレオチド蛍光標識プローブが相互に異なる蛍光色素を結合する場合、変異株の存在を検出できることに加えて、変異株を特定することが可能となる。
【0038】
本発明の検出方法では、ＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に低い遺伝子の検出と同時に、変異した変異頻度が相対的に高い遺伝子の検出も行うことができる。変異頻度が相対的に高い遺伝子におけるの変異の検出は、用いるＰＣＲプライマー対がその変異領域を増幅することにより可能となる。しかしながら、前記ＰＣＲプライマー対が変異領域を増幅しない場合、変異した変異頻度が相対的に高い遺伝子を検出することができず、その結果、変化株を見落とす可能性がある。この場合であっても、本発明の検出方法によれば、１回の検査で、対象とするウイルスの存在を検出することができる。
【0039】
本発明のＰＣＲを行う工程において、ＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に高い遺伝子としてＳ遺伝子を増幅する場合であって、用いるＰＣＲプライマー対を２以上用いてＰＣＲを実行する場合、前記ＰＣＲプライマー対は、それぞれ変異株および野生株を検出するプライマー対を使用してもよい。
【0040】
本発明の検出方法において、増幅された変異頻度が相対的に低い遺伝子および変異頻度が相対的に高い遺伝子を検出する工程では、ＰＣＲ産物をリアルタイム測定し、使用する蛍光色素に対応した蛍光フィルターを用いてＰＣＲ産物の増幅曲線がモニタリングされる。増殖曲線は、ＰＣＲサイクル数に対する蛍光強度をプロットすることにより作成することができる。Ｃｔ値（Threshold Cycle）は、例えば、増殖曲線の立ち上がりの領域において設定した閾値（Threshold）と増幅曲線とが交わる点に対応するＰＣＲサイクル数などとして算出される。算出されたＣｔ値に基づき、検体中に変異ウイルスが存在するか否かを判定することができる。
【0041】
ＰＣＲ産物のリアルタイム測定は、ＰＣＲ用プレートのウェルまたはＰＣＲ用チューブを用いて行うことができる。ＰＣＲ用プレートは、例えば９６ウェルおよび３８６ウェルフォーマットのものを使用してもよい。ＰＣＲ用チューブとしては、用量サイズが０.１～０.５ｍL程度の単体チューブおよび２～１２連ストリップチューブを使用してもよい。ＰＣＲ用プレートまたはＰＣＲ用チューブの材質としては、ポリプロピレンなどが使用できる。チューブ色としては、無着色または白色が好ましい。
【0042】
本発明のキットは、内部コントロールＤＮＡ；検体中のＲＮＡウイルスの変異頻度が相対的に低い遺伝子を増幅する１以上のＰＣＲプライマー対および変異頻度が相対的に高い遺伝子を増幅する１以上のＰＣＲプライマー対、ならびに前記内部コントロールＤＮＡを増幅するＰＣＲプライマー対；前記変異頻度が相対的に低い遺伝子、前記変異頻度が相対的に高い遺伝子および内部コントロールＤＮＡのＰＣＲ産物をそれぞれ検出するためのオリゴヌクレオチド蛍光標識プローブ；ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素およびＰＣＲ緩衝液を、それぞれ独立して異なる容器に収容してもよい。操作の簡便性のために、内部コントロールＤＮＡ、ＰＣＲプライマー対、オリゴヌクレオチド蛍光標識プローブ、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素およびＰＣＲ緩衝液をそれぞれ所定量で混合し、一つの容器に収容してもよい。さらに、キットの使用目的に応じて、キット構成物を２～４個の容器に分散して収容してもよい。
【0043】
本発明のキットには、さらに、検体と混合するための水酸化ナトリウムを主成分とする検体処理液を含んでもよい。
【配列表】