特開 2023-123588 可変ドメインと定常ドメインとの間のエルボー領域に機能的ドメインを有する抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023123588

(43)【公開日】2023-09-05

(54)【発明の名称】可変ドメインと定常ドメインとの間のエルボー領域に機能的ドメインを有する抗体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20230829BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20230829BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230829BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230829BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20230829BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20230829BHJP

   C07K 14/52 20060101ALI20230829BHJP

   C12N 15/19 20060101ALI20230829BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230829BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230829BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230829BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230829BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230829BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20230829BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20230829BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230829BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20230829BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230829BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230829BHJP

   G01N 33/531 20060101ALI20230829BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C12N15/13 ZNA

C12N15/12

C07K19/00

C07K14/705

C07K16/46

C07K14/52

C12N15/19

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 C

C12P21/08

A61K39/395 A

A61K39/395 H

A61K31/7088

A61K48/00

A61K35/76

G01N33/531 A

【審査請求】有

【請求項の数】70

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023097920

(22)【出願日】2023-06-14

(62)【分割の表示】P 2020505231の分割

【原出願日】2018-07-30

(31)【優先権主張番号】PCT/EP2017/069357

(32)【優先日】2017-07-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】511017287

【氏名又は名称】インスティテュート・フォー・リサーチ・イン・バイオメディシン

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＦＯＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮ ＢＩＯＭＥＤＩＣＩＮＥ

(74)【代理人】

【識別番号】100107766

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠重

(74)【代理人】

【識別番号】100070150

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠彦

(74)【代理人】

【識別番号】100135079

【弁理士】

【氏名又は名称】宮崎 修

(72)【発明者】

【氏名】アントニオ・ランツァヴェッキア

(72)【発明者】

【氏名】ルカ・ピッコリ

(57)【要約】      （修正有）

【課題】更なる機能性を有する新規抗体フォーマット、例えば、レポーター機能、転座機能、又はキャリア機能などの更なる機能性を提供するようにエンジニアードされた抗体を提供する。
【解決手段】抗体又は抗原結合断片のエルボー領域に追加の機能的ドメインが挿入された、エンジニアード抗体及び抗原結合断片を提供する。また、係る抗体及び抗原結合断片をコードするベクターなどの核酸分子、係る抗体、抗原結合断片、又は核酸分子を含む宿主細胞及び組成物、並びにそれらの使用を提供する。例えば、抗体又は抗原結合断片のエルボー領域に追加の結合部位（特異性）が挿入された多重特異性抗体フォーマットが提供される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを含む抗体又はその抗原結合断片であって、
前記第１のポリペプチド鎖が、ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）１つ以上の可変ドメイン；
（ｉｉ）機能的ドメイン；及び
（ｉｉｉ）１つ以上の定常ドメインを含み、
前記第２のポリペプチド鎖が、ＮからＣ末端方向に、
（ｉｖ）前記第１のポリペプチド鎖の前記１つ以上の可変ドメインと抗原結合部位を形成する１つ以上の可変ドメイン；
（ｖ）任意に、機能的ドメイン；及び
（ｖｉ）１つ以上の定常ドメインを含み、
前記第１のポリペプチド鎖の前記機能的ドメイン（ｉｉ）が前記第２のポリペプチド鎖の断片を含まず、前記第２のポリペプチド鎖の前記任意の機能的ドメイン（ｖ）が前記第１のポリペプチド鎖の断片を含まないことを特徴とする抗体又はその抗原結合断片。

【請求項2】

前記第２のポリペプチド鎖が機能的ドメイン（ｖ）を含まず、前記第２のポリペプチド鎖の最もＣ末端側の可変ドメインのＣ末端が前記第２のポリペプチド鎖の最もＮ末端側の定常ドメインのＮ末端に直接結合している請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項3】

第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを含む抗体又はその抗原結合断片であって、
前記第１のポリペプチド鎖が、ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）１つ以上の可変ドメイン；
（ｉｉ）機能的ドメイン；及び
（ｉｉｉ）１つ以上の定常ドメインを含み、
前記第２のポリペプチド鎖が、ＮからＣ末端方向に、
（ｉｖ）前記第１のポリペプチド鎖の前記１つ以上の可変ドメインと抗原結合部位を形成する１つ以上の可変ドメイン；及び
（ｖ）１つ以上の定常ドメインを含み、
前記第２のポリペプチド鎖の最もＣ末端側の可変ドメインのＣ末端が前記第２のポリペプチド鎖の最もＮ末端側の定常ドメインのＮ末端に直接結合していることを特徴とする抗体又はその抗原結合断片。

【請求項4】

（ａ）前記第１のポリペプチド鎖の前記１つ以上の定常ドメインが少なくともＣＨ１定常ドメインを含む重鎖定常ドメインであり、前記第１のポリペプチド鎖の前記１つ以上の可変ドメインが重鎖可変ドメインＶＨであり、前記第２のポリペプチド鎖の前記定常ドメインが軽鎖定常ドメインＣＬであり、前記第２のポリペプチド鎖の前記１つ以上の可変ドメインが軽鎖可変ドメインＶＬである、又は
（ｂ）前記第１のポリペプチド鎖の前記定常ドメインが軽鎖定常ドメインＣＬであり、前記第１のポリペプチド鎖の前記１つ以上の可変ドメインが軽鎖可変ドメインＶＬであり、前記第２のポリペプチド鎖の前記１つ以上の定常ドメインが少なくともＣＨ１定常ドメインを含む重鎖定常ドメインであり、前記第２のポリペプチド鎖の前記１つ以上の可変ドメインが重鎖可変ドメインＶＨである請求項１から３のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項5】

前記ＣＨ１ドメイン、及び任意に更なる重鎖定常ドメインが、以下のクラス：γ、α、μ、ε、及びδから選択され、好ましくはγであり、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４から選択される請求項４に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項6】

前記ＣＬドメインが、以下のクラス：κ及びλから選択される請求項４から５のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項7】

前記抗体又はその抗原結合断片が、組換え抗体又は抗原結合断片である請求項１から６のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項8】

前記第１のポリペプチド鎖の前記機能的ドメイン（ｉｉ）及び／又は前記第２のポリペプチド鎖の前記機能的ドメイン（ｖ）が、リンカーではない、特にＧＳリンカーではない請求項１から７のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項9】

前記第１のポリペプチド鎖の前記機能的ドメイン（ｉｉ）及び／又は前記第２のポリペプチド鎖の前記機能的ドメイン（ｖ）が、Ｉｇ様ドメインを含む又はからなる請求項１から８のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項10】

前記Ｉｇ様ドメインが、ＰＤ１、ＳＬＡＭ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ８０、又はＣＤ８６、好ましくはＣＤ４のＩｇ様ドメインから選択される請求項９に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項11】

前記第１のポリペプチド鎖の前記機能的ドメイン（ｉｉ）及び／又は前記第２のポリペプチド鎖の前記機能的ドメイン（ｖ）が、キャリアドメイン、レポータードメイン、タグ、局在化ドメイン、（独立した）結合部位、酵素若しくは酵素ドメイン、受容体若しくはその機能的断片、又はリガンド若しくはその機能的断片を含む又はからなる請求項１から１０のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項12】

前記第１のポリペプチド鎖の前記機能的ドメイン（ｉｉ）及び／又は前記第２のポリペプチド鎖の前記機能的ドメイン（ｖ）が、キャリアドメインを含む又はからなる請求項１１に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項13】

前記キャリアドメインが、前記抗体又はその抗原結合断片の、薬剤又は造影剤へのコンジュゲーションを提供する請求項１２に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項14】

前記第１のポリペプチド鎖の前記機能的ドメイン（ｉｉ）及び／又は前記第２のポリペプチド鎖の前記機能的ドメイン（ｖ）が、レポータードメインを含む又はからなる請求項１１に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項15】

前記レポータードメインが、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ルシフェラーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、又はペルオキシダーゼをコードするアミノ酸配列を含む又はからなる請求項１４に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項16】

前記第１のポリペプチド鎖の前記機能的ドメイン（ｉｉ）及び／又は前記第２のポリペプチド鎖の前記機能的ドメイン（ｖ）が、局在化ドメインを含む又はからなる請求項１１に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項17】

前記第１のポリペプチド鎖の前記機能的ドメイン（ｉｉ）及び／又は前記第２のポリペプチド鎖の前記機能的ドメイン（ｖ）が、酵素又は酵素ドメイン、例えば触媒ドメインを含む又はからなる請求項１１に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項18】

前記第１のポリペプチド鎖の前記機能的ドメイン（ｉｉ）及び／又は前記第２のポリペプチド鎖の前記機能的ドメイン（ｖ）が、タグを含む又はからなる請求項１１に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項19】

前記タグが、親和性タグ、可溶化タグ、クロマトグラフィータグ、エピトープタグ、又は蛍光タグである請求項１８に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項20】

前記第１のポリペプチド鎖の前記機能的ドメイン（ｉｉ）及び／又は前記第２のポリペプチド鎖の前記機能的ドメイン（ｖ）が、受容体又はその機能的断片、例えば、受容体のＩｇ様ドメインを含む又はからなる請求項１１に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項21】

前記機能的ドメインが、（ｉ）ＰＤ１、ＳＬＡＭ、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２００Ｒ１、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＴＬＴ２、ＬＩＬＲＢ４、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＩＣＯＳ、又はＣＤ２８からなる群から選択される受容体、又は（ｉｉ）受容体の機能的断片、例えば、以下の受容体：ＰＤ１、ＳＬＡＭ、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２００Ｒ１、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＴＬＴ２、ＬＩＬＲＢ４、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＩＣＯＳ、又はＣＤ２８のいずれかのＩｇ様ドメインを含む又はからなる請求項２０に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項22】

前記第１のポリペプチド鎖の前記機能的ドメイン（ｉｉ）及び／又は前記第２のポリペプチド鎖の前記機能的ドメイン（ｖ）が、リガンド又はその機能的断片を含む又はからなる請求項１１に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項23】

前記リガンドが、サイトカイン及び／又はＰＤ１、ＳＬＡＭ、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２００Ｒ１、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＴＬＴ２、ＬＩＬＲＢ４、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＩＣＯＳ、又はＣＤ２８のリガンドである請求項２２に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項24】

前記リガンドが、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－１、Ｂ７－２、Ｂ７－Ｈ４（Ｂ７ホモログ）、ガレクチン－９、ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ）、ＯＸ－２膜糖タンパク質、ＣＤ４８、Ｂ７－Ｈ３（Ｂ７ホモログ）、ＭＨＣＩ、ＩＣＯＳ－Ｌからなる群から選択される請求項２２に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項25】

前記リガンドが、サイトカインのＳＩＳファミリー、サイトカインのＳＩＧファミリー、サイトカインのＳＣＹファミリー、血小板因子４スーパーファミリー、インタークリン、ＣＣケモカインリガンド（ＣＣＬ）－１～－２８、ＣＸＣＬ１～ＣＸＣＬ１７、ＸＣＬ１（リンホタクチン－α）及びＸＣＬ２（リンホタクチン－β）、フラクタルカイン（又はＣＸ_３ＣＬ１）；インターフェロン、例えば、Ｉ型ＩＦＮ、ＩＩ型ＩＦＮ、及びＩＩＩ型ＩＦＮ、特にＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－ε、ＩＦＮ－κ、ＩＦＮ－ω、ＩＬ１０Ｒ２（ＣＲＦ２－４とも呼ばれる）、及びＩＦＮＬＲ１（ＣＲＦ２－１２とも呼ばれる）；インターロイキン、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３４、ＩＬ－３５、及びＩＬ－３６；リンホカイン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＧＭ－ＣＳＦ、及びインターフェロン－ガンマ；腫瘍壊死因子、例えば、ＣＤ４０ＬＧ（ＴＮＦＳＦ５）；ＣＤ７０（ＴＮＦＳＦ７）；ＥＤＡ；ＦＡＳＬＧ（ＴＮＦＳＦ６）；ＬＴＡ（ＴＮＦＳＦ１）；ＬＴＢ（ＴＮＦＳＦ３）；ＴＮＦ、ＴＮＦα、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０Ｌ）；ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ１５３）；ＴＮＦＳＦ９；ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）；ＴＮＦＳＦ１１（ＲＡＮＫＬ）；ＴＮＦＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ）；ＴＮＦＳＦ１３；ＴＮＦＳＦ１３Ｂ；ＴＮＦＳＦ１４；ＴＮＦＳＦ１５；及びＴＮＦＳＦ１８；コロニー刺激因子、例えば、ＣＳＦ１（マクロファージコロニー刺激因子）、ＣＳＦ２（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（Ｇ－ＣＳＦ）、及び合成ＣＳＦ、例えば、プロメガポエチンからなる群から選択される請求項２２に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項26】

前記第１のポリペプチド鎖の前記機能的ドメイン（ｉｉ）及び／又は前記第２のポリペプチド鎖の前記機能的ドメイン（ｖ）が、（独立した）結合部位を含む又はからなる請求項１１に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項27】

前記（独立した）結合部位が、受容体又は結合部位を含むその機能的断片、リガンド又は結合部位を含むその機能的断片、ＣＤ分子又はその機能的断片、単鎖抗体又はその抗原結合断片、抗原又はその機能的断片、又は結合部位を含むタグを含む又はからなる請求項２６に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項28】

前記（独立した）結合部位が、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ又はＶＨＨ）若しくはその抗原結合断片、又は抗原若しくはその機能的断片を含む又はからなる請求項２７に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項29】

前記機能的ドメインが、Ｉｇ様ドメイン、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ、又はＳｔｒｅｐタグを含む又はからなる請求項１から２８のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項30】

前記機能的ドメインが、配列番号１３～２０のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するその機能的配列変異体を含む又はからなる請求項２９に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項31】

前記第１のポリペプチド鎖が、前記機能的ドメイン（ｉｉ）のＮ末端に１つの単一の可変ドメイン（ｉ）を含み、前記第２のポリペプチド鎖が、前記任意の機能的ドメイン（ｖ）のＮ末端又は前記１つ以上の定常ドメイン（ｖｉ）のＮ末端に１つの単一の可変ドメイン（ｉｖ）を含み、前記第２のポリペプチド鎖の前記１つの単一の可変ドメイン（ｉｖ）が前記第１のポリペプチド鎖の前記可変ドメイン（ｉ）と抗原結合部位を形成する請求項１から３０のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項32】

前記第１のポリペプチド鎖が、前記機能的ドメイン（ｉｉ）のＮ末端に２つ以上の可変ドメイン（ｉ）を含み、前記第２のポリペプチド鎖が、前記任意の機能的ドメイン（ｖ）のＮ末端又は前記１つ以上の定常ドメイン（ｖｉ）のＮ末端に２つ以上の可変ドメイン（ｉｖ）を含み、前記第２のポリペプチド鎖の前記２つ以上の可変ドメイン（ｉｖ）が前記第１のポリペプチド鎖の前記２つ以上の可変ドメイン（ｉ）と抗原結合部位を形成する請求項１から３０のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項33】

前記第１のポリペプチド鎖が、単鎖抗体、例えばｓｃＦｖ、又は単一ドメイン抗体、例えばＶＨＨを、最もＮ末端側の可変ドメイン（ｉ）のＮ末端及び／又は最もＣ末端側の定常ドメイン（ｉｉｉ）のＣ末端に含む請求項１から３２のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項34】

前記第２のポリペプチド鎖が、単鎖抗体、例えばｓｃＦｖ、又は単一ドメイン抗体、例えばＶＨＨを、最もＮ末端側の可変ドメイン（ｉ）のＮ末端及び／又は最もＣ末端側の定常ドメイン（ｖｉ）のＣ末端に含む請求項１から３３のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項35】

前記第１のポリペプチド鎖及び前記第２のポリペプチド鎖のそれぞれが、１つの単一の定常ドメイン、特にＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインをそれぞれ含む請求項１から３４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項36】

前記第１のポリペプチド鎖又は前記第２のポリペプチド鎖が、１つの単一の定常ドメイン、特にＣＬドメインを含み、前記第１のポリペプチド鎖又は前記第２のポリペプチド鎖の他方が、ＣＨ１ドメインと、１つ以上の更なる定常ドメイン、例えばＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインとを含む請求項１から３５のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項37】

前記抗体又はその抗原結合断片が、Ｆｃ部分又はＦｃ領域を含む請求項１から３６のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項38】

前記第１のポリペプチド鎖及び／又は前記第２のポリペプチド鎖が、１つ以上のリンカーを含む請求項１から３７のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項39】

前記第１のポリペプチド鎖及び／又は前記第２のポリペプチド鎖が、リンカーを含まない請求項１から３８のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項40】

前記第１のポリペプチド鎖が、Ｖ－Ｄ－ＣＨ１を含む又はからなり、式中、
Ｖは、可変ドメイン（ｉ）であり、
Ｄは、機能的ドメイン（ｉｉ）であり、
ＣＨ１は、ＣＨ１定常ドメイン（ｉｉｉ）である請求項１から３９のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項41】

前記第１のポリペプチド鎖が、Ｖ－Ｄ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３を含む又はからなり、式中、ＣＨ２とＣＨ３はそれぞれ、ＣＨ２定常ドメインとＣＨ３定常ドメインである請求項４０に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項42】

前記第１のポリペプチド鎖が、（Ｖ）_Ａ－Ｄ－ＣＨ１を含む又はからなり、式中、Ａは、１～５、好ましくは１～４、より好ましくは１～３、更により好ましくは１又は２の整数であり、前記可変ドメインＶは、直接又はリンカーを介して互いに結合されてもよい請求項３９から４１のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項43】

前記第２のポリペプチド鎖が、Ｖ－ＣＬを含む又はからなり、式中、
Ｖは、可変ドメイン（ｉｖ）であり、
ＣＬは、定常ドメイン（ｖｉ）である請求項１から４１のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項44】

前記第２のポリペプチド鎖が、（Ｖ）_Ａ－ＣＬを含む又はからなり、式中、
Ａは、１～５、好ましくは１～４、より好ましくは１～３、更により好ましくは１又は２の整数であり、前記可変ドメインＶは、直接又はリンカーを介して互いに結合されてもよい請求項４３に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項45】

前記第１のポリペプチド鎖の前記可変ドメイン（ｉ）が、配列番号１、５、８、又は１０のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するその機能的配列変異体を含む又はからなる請求項１から４４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項46】

前記第２のポリペプチド鎖の前記可変ドメイン（ｉｖ）が、配列番号２、６、９、又は１１のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するその機能的配列変異体を含む又はからなる請求項１から４５のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項47】

前記抗体又はその抗原結合断片が、１つの単一の又は２つの第１のポリペプチド鎖と、１つの単一の又は２つの第２のポリペプチド鎖とを含む請求項１から４６のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項48】

前記第１のポリペプチド鎖と前記第２のポリペプチド鎖とがジスルフィド結合により連結され、それにより対を形成する請求項１から４７のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項49】

前記抗体又はその抗原結合断片が、２つの第１のポリペプチド鎖と２つの第２のポリペプチド鎖とを含み、前記２つの第１のポリペプチド鎖及び／又は前記２つ第２のポリペプチド鎖が、１つ以上の、例えば２つのジスルフィド結合によって連結される請求項４７から４８のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項50】

前記抗体又はその抗原結合断片が、各特異性／抗原に対して二価である請求項１から４９のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項51】

前記抗体又はその抗原結合断片が、各特異性（抗原）に対して一価である請求項１から４９のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項52】

前記第１及び第２のポリペプチド鎖の第１の対の前記１つ以上の可変ドメインによって形成される抗原結合部位と、前記第１及び第２のポリペプチド鎖の第２の対の前記１つ以上の可変ドメインによって形成される抗原結合部位は、同一又は異なる請求項５０から５１のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項53】

前記抗体又はその抗原結合断片が、同一又は異なっていてもよい少なくとも２つの機能的ドメインを含む請求項１から５２のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項54】

前記抗体又はその抗原結合断片が、第１及び第２のポリペプチド鎖の第１及び第２の対を形成する２つの第１のポリペプチド鎖及び２つの第２のポリペプチド鎖を含み、第１及び第２のポリペプチド鎖の前記第１の対が、少なくとも１つの機能的ドメインを含む、及び／又は第１及び第２のポリペプチド鎖の前記第２の対が、少なくとも１つの機能的ドメインを含む請求項１から５３のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項55】

前記抗体又はその抗原結合断片が、ＩｇＧ様抗体、Ｆａｂ、又はＦ（ａｂ）_２に由来する請求項１から５４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項56】

前記抗体又はその抗原結合断片の２つ以上の可変ドメイン（ｉ）及び（ｉｖ）が、モノクローナル抗体に由来する請求項１から５５のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項57】

前記抗体又はその抗原結合断片の前記可変ドメイン及び／又は前記定常ドメインが、ヒト又はヒト化されている請求項１から５６のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項58】

前記抗体又はその抗原結合断片の前記（追加の）機能的ドメインが、ヒト又はヒト化されたアミノ酸配列を含む又はからなる請求項１から５７のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項59】

前記第１のポリペプチド鎖が、配列番号５３、５５、５６、５８、５９、６０、６１、６２、６４、６５、６６、６８、６９、又は７０のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するその機能的配列変異体を含む又はからなる、及び／又は前記第２のポリペプチド鎖が、配列番号５４、５７、６３、又は６７のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するその機能的配列変異体を含む又はからなる請求項１から５８のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項60】

前記第１及び／又は第２のポリペプチド鎖が、配列番号７５～９２又は９６～１１２のいずれかに示されるアミノ酸配列を含まない又はからならない、好ましくは、前記第１及び／又は第２のポリペプチド鎖が、配列番号７５～９５のいずれかに示されるアミノ酸配列を含まない又はからならない、より好ましくは、前記第１及び／又は第２のポリペプチド鎖の前記機能的ドメインが、配列番号１１３～１３０のいずれかに示されるアミノ酸配列を含まない又はからならない、更により好ましくは、前記第１及び／又は第２のポリペプチド鎖の前記機能的ドメインが、配列番号１１３～１３３のいずれかに示されるアミノ酸配列を含まない又はからならない、最もより好ましくは、前記第１及び／又は第２のポリペプチド鎖が、配列番号７５～１３３のいずれかに示されるアミノ酸配列を含まない又はからならない請求項１から５９のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項61】

請求項１から６０のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片の第１のポリペプチド鎖をコードする第１のポリヌクレオチド及び／又は請求項１から６０のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片の第２のポリペプチド鎖をコードする第２のポリペプチドを含むことを特徴とする核酸分子。

【請求項62】

請求項１から６０のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片の第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする核酸分子。

【請求項63】

前記核酸分子が、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子である請求項６１から６２のいずれかに記載の核酸分子。

【請求項64】

請求項６１から６３のいずれかに記載の核酸分子を含むことを特徴とするベクター。

【請求項65】

請求項６１から６３のいずれかに記載の核酸分子又は請求項６４に記載のベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。

【請求項66】

請求項１から６０のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項６１から６３のいずれかに記載の核酸分子、請求項６４に記載のベクター、又は請求項６５に記載の宿主細胞を含むことを特徴とする組成物。

【請求項67】

請求項１から６０のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片を製造するためのプロセスであって、
ａ）第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖をコードする請求項６１から６３のいずれかに記載の１つ以上の核酸分子を組み込むことにより真核宿主細胞を形質転換すること；
ｂ）前記核酸分子が発現されるように適切な条件下で前記宿主細胞を培養すること；
ｃ）前記第１及び第２のポリペプチド鎖を組み合わせて、前記抗体又はその抗原結合断片を形成すること；及び
ｄ）任意に、培養培地から前記抗体又はその抗原結合断片を精製することを含むことを特徴とするプロセス。

【請求項68】

医学における使用のための、請求項１から６０のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項６１から６３のいずれかに記載の核酸分子、請求項６４に記載のベクター、請求項６５に記載の宿主細胞、又は請求項６６に記載の組成物。

【請求項69】

被験体における疾患又は障害を予防又は治療する方法であって、請求項１から６０のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項６１から６３のいずれかに記載の核酸分子、請求項６４に記載のベクター、請求項６５に記載の宿主細胞、又は請求項６６に記載の組成物を前記被験体に投与するステップを含むことを特徴とする方法。

【請求項70】

抗原を検出するための又は抗原結合の定量化のためのアッセイであって、
ａ）抗原の多価抗体への結合を可能にする条件下で、請求項１から６０のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片と共に前記抗原をインキュベートすること；及び
ｂ）抗原抗体結合を検出することを含むことを特徴とするアッセイ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、多重特異性抗体フォーマットなど、更なる機能的ドメインを有するエンジニアード抗体の分野に関する。特に、本発明は、抗体のエルボー領域に更なる機能的ドメインが挿入されているエンジニアード抗体に関する。したがって、例えば、抗体のエルボー領域に更なる結合部位（特異性）が挿入されている多重特異性抗体フォーマットが提供される。

【背景技術】

【0002】

近年、１つの抗原タイプに特異的に結合するＩｇＧなどの古典的な天然抗体の分子エンジニアリングに基づいて、様々な多重特異性抗体フォーマットが登場した。ＩｇＧなどの古典的な天然抗体とは対照的に、多重特異性抗体は２つ以上の異なるターゲットに結合することができ、それにより広範な用途を提供する。

【0003】

古典的な天然抗体は、４つのポリペプチド鎖、即ち、２つの重鎖と２つの軽鎖を含むＹ字型分子である（図１Ａ）。各軽鎖は２つのドメインからなり、Ｎ末端ドメインは可変ドメイン又はＶＬドメイン、Ｃ末端ドメインは定常ドメイン又はＣＬとして知られる。各重鎖は、抗体のクラスに応じて４つ又は５つのドメインからなる。重鎖のＮ末端ドメインは、可変ドメイン又はＶＨドメインとして知られる。Ｎ－Ｃ末端方向の次のドメインは、最初の定常ドメイン又はＣＨ１ドメインとして知られる。重鎖の次の部分はヒンジ領域として知られ、通常、その後に、２番目、３番目、場合により、４番目の定常ドメイン、即ち、それぞれＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４ドメインが続く。定常ドメインを含む定常領域は、同じアイソタイプの全ての抗体で同一であるが、異なるアイソタイプの抗体では異なる。重鎖γ、α、δには、３つのタンデム（一列に）Ｉｇドメインから構成される定常領域と、柔軟性を高めるためのヒンジ領域がある。重鎖μ及びεには、４つの免疫グロブリンドメインから構成される定常領域がある。

【0004】

ヒンジ領域に加えて、エルボー領域も抗原結合ための柔軟性を提供することが知られている。エルボー領域は、抗体の重鎖と軽鎖の可変ドメインと定常ドメインとの間の接合部である。通常、可変ドメイン（ＶＨ又はＶＬ）のＣ末端は、最もＮ末端側の定常ドメイン（通常、ＣＨ１又はＣＬ）のＮ末端に直接結合し、可変ドメイン（ＶＨ又はＶＬ）のＣ末端と、最もＮ末端側の定常ドメイン（通常、ＣＨ１又はＣＬ）のＮ末端との間の接合部は、「エルボー」又は「エルボー領域」と呼ばれる。エルボー領域は、定常ドメインに対する可変ドメインの屈曲と回転を可能にする。エルボー領域は、エルボー領域によって提供される可動域に基づいて「分子球関節（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｌｌ－ａｎｄ－ｓｏｃｋｅｔ ｊｏｉｎｔ）」とも呼ばれる（非特許文献１）。

【0005】

組み立てられた抗体において、ＶＬ及びＶＨドメインは互いに会合して抗原結合部位を形成する。また、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインが互いに会合して、１つの重鎖と１つの軽鎖との会合状態を維持する。各重鎖ヒンジ領域は、少なくとも１つ、多くの場合複数のシステイン残基を含む。組み立てられた抗体において、２つの重鎖ヘテロダイマーを互いに共有結合させるヒンジ領域のシステイン残基間にジスルフィド結合が形成できるように、重鎖のシステイン残基が整列する。したがって、完全に組み立てられた抗体は、１つの抗原タイプに結合するという点で単一特異性であり、２つの独立した抗原結合部位を有するという点で二価である。

【0006】

このような単一特異性で二価の古典的天然抗体の構造に基づいて、様々な多重特異性抗体フォーマットが設計された（参考として、非特許文献２及び非特許文献３を参照）。一般に、先行技術の多重特異性抗体フォーマットは、５つの異なる構造グループに分類できる：（ｉ）多重特異性ＩｇＧ、（ｉｉ）付加（ａｐｐｅｎｄｅｄ）ＩｇＧ、（ｉｉｉ）多重特異性抗体断片、（ｉｖ）多重特異性融合タンパク質、及び（ｖ）多重特異性抗体コンジュゲート（非特許文献２）。

【0007】

多重特異性ＩｇＧ抗体フォーマットは、通常、各特異性（抗原）に対して一価である。治療目的で異なる標的抗原に対する２つの完全な抗体の結合特異性を組み合わせる最初の試みは、化学的に融合したヘテロコンジュゲート分子を利用した（非特許文献４）。二重特異性抗体が、ヘテロハイブリドーマ技術によりハイブリッドハイブリドーマから産生された（非特許文献５）。多重特異性ＩｇＧ抗体フォーマットとしては、例えば、非特許文献２に記載されるＣｒｏｓｓＭａｂ、ＤＡＦ（ツーインワン）、ＤＡＦ（フォーインワン）、ＤｕｔａＭａｂ、ＤＴ－ＩｇＧ、ノブインホールコモンＬＣ（Ｋｎｏｂｓ－ｉｎ－ｈｏｌｅｓ ｃｏｍｍｏｎ ＬＣ）、ノブインホールアセンブリ（Ｋｎｏｂｓ－ｉｎ－ｈｏｌｅｓ ａｓｓｅｍｂｌｙ）、チャージペア（Ｃｈａｒｇｅ ｐａｉｒ）、Ｆａｂ－アーム交換（Ｆａｂ－ａｒｍ ｅｘｃｈａｎｇｅ）、ＳＥＥＤボディ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ，）、Ｔｒｉｏｍａｂ、ＬＵＺ－Ｙ、Ｆｃａｂ、κλ－ボディ、及び直交Ｆａｂ（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ Ｆａｂ）が挙げられる。

【0008】

付加ＩｇＧ抗体フォーマットにおいては、古典的な単一特異性ＩｇＧが、重鎖及び／又は軽鎖のＮ及び／又はＣ末端に更なる抗原結合部分を付加することによりエンジニアードされている。そのような更なる抗原結合部分の例としては、単一ドメイン抗体（不対ＶＨ又はＶＬ）、Ｆｖ又はｓｃＦｖなどの対形成抗体可変ドメイン、又はエンジニアードタンパク質足場が挙げられる。付加ＩｇＧ抗体フォーマットは、例えば、非特許文献２に記載されるＤＶＤ－ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｈ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－（Ｈ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－（Ｌ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ，Ｈ）－Ｆｖ、ＩｇＧ（Ｈ）－Ｖ、Ｖ（Ｈ）－ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）－Ｖ、Ｖ（Ｌ）－ＩｇＧ、ＫＩＨ ＩｇＧ－ｓｃＦａｂ、２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、ＩｇＧ－２ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ４－Ｉｇ、及びＺｙｂｏｄｙが挙げられる。ＤＶＩ－ＩｇＧ（フォーインワン）は、前述のように、多重特異性ＩｇＧ抗体フォーマットと組み合わされた添付ＩｇＧ抗体フォーマットである。付加多重特異性ＩｇＧフォーマットの１つの潜在的な利点は、全ての可変ドメインに抗原を同時に結合できるため、より高い特異的結合能を提供できることである。

【0009】

多重特異性抗体断片は、通常、天然の抗体と比較して１つ以上の定常ドメインを欠いている。多重特異性抗体断片としては、例えば、非特許文献２に記載される、ナノボディ；ナノボディ－ＨＡＳ；ＢｉＴＥ；ダイアボディ；ＤＡＲＴ；ＴａｎｄＡｂ；ｓｃダイアボディ；ｓｃ－ダイアボディ－ＣＨ３；ダイアボディ－ＣＨ３；トリプルボディ；ミニ抗体；ミニボディ；ＴｒｉＢｉミニボディ；ｓｃＦｖ－ＣＨ３ ＫＩＨ；Ｆａｂ－ｓｃＦｖ；ｓｃＦｖ－ＣＨ－ＣＬ－ｓｃＦｖ；Ｆ（ａｂ’）２；Ｆ（ａｂ’）２－ｓｃＦｖ２；ｓｃＦｖ－ＫＩＨ；Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ；四価ＨＣＡｂ；ｓｃダイアボディ－Ｆｃ；ダイアボディ－Ｆｃ；タンデムｓｃＦｖ－Ｆｃ；及びイントラボディが挙げられる。多重特異性融合タンパク質としては、例えば、非特許文献２、特に、図１と対応する記載（９５～１０１ページ）に記載される、Ｄｏｃｋ ａｎｄ Ｌｏｃｋ;ＩｍｍＴＡＣ；ＨＳＡボディ；ｓｃダイアボディ－ＨＡＳ；及びタンデムｓｃＦｖ－毒素が挙げられる。多重特異性抗体コンジュゲートとしては、非特許文献２、特に、図１と対応する記載（９５～１０１ページ）に記載される、ＩｇＧ－ＩｇＧ；Ｃｏｖ－Ｘ－ボディ；及びｓｃＦｖ１－ＰＥＧ－ｓｃＦｖ２が挙げられる。

【0010】

通常、抗体のフォーマットは、想定される用途に応じて選択される。例えば、多くの用途では長い薬理学的半減期が望ましい。一般的にはＦｃ領域を含有させることで達成されるが、他の用途では、半減期が短い（したがってＦｃ領域を有しない）が有利な場合がある。更に、特に、単一の宿主細胞における２つの異なる軽鎖と重鎖の共発現による多重特異性ＩｇＧ抗体フォーマットの生産は非常に困難であることが知られており、除去困難であり得る誤対合抗体をもたらす可能性があるため、生産収率が役割を果たし得る。加えて、付加ＩｇＧ抗体フォーマットなどの多くの抗体フォーマットは、通常、異なる抗原の同時結合に十分な柔軟性を提供するためにリンカーを必要とするが、リンカーの柔軟性により、タンパク質分解による切断を受け易くなり得、抗体の安定性、凝集、及び免疫原性の増加が低下する。注目すべきは、特定の用途では、用途に応じて、抗体の安定性が結合能力よりも重要である場合があり、その逆も同様である。更に、特異性に応じて抗体フォーマットを選択することができる。即ち、特定の抗原結合部位が、特定のフォーマットでより良好な生産収率、安定性、及び／又は結合値を達成し、一方で、他の仕様が、他の抗体フォーマットにおける良好な特性（例えば、標的抗原のサイズ／構造／性質）を達成する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Ｌｅｓｋ ＡＭ， Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ． Ｅｌｂｏｗ ｍｏｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｉｎｖｏｌｖｅｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｌｌ－ａｎｄ－ｓｏｃｋｅｔ ｊｏｉｎｔ． Ｎａｔｕｒｅ． １９８８ Ｓｅｐ ８；３３５（６１８６）：１８８－９０

【非特許文献2】Ｓｐｉｅｓｓ Ｃ， Ｚｈａｉ Ｑ， Ｃａｒｔｅｒ ＰＪ． Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍａｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１５ Ｏｃｔ；６７（２ Ｐｔ Ａ）：９５－１０６

【非特許文献3】Ｗｅｉｄｌｅ ＵＨ， Ｔｉｅｆｅｎｔｈａｌｅｒ Ｇ， Ｗｅｉｓｓ ＥＨ， Ｇｅｏｒｇｅｓ Ｇ， Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｕ． Ｔｈｅ ｉｎｔｒｉｇｕｉｎｇ ｏｐｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒｍａｔｓ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． ２０１３ Ｊａｎ－Ｆｅｂ；１０（１）：１－１８

【非特許文献4】Ｓｔａｅｒｚ ｅｔ ａｌ．（１９８５）， Ｎａｔｕｒｅ ３１４： ６２８－６３１

【非特許文献5】Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ＆ Ｃｕｅｌｌｏ （１９８３） Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７－５４０

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

したがって、明確な特徴を提供する更なる抗体フォーマットが必要である。それに鑑みて、本発明の目的は、更なる機能性を有する新規抗体フォーマット、例えば、レポーター機能、転座機能、又はキャリア機能などの更なる機能性を提供するようにエンジニアードされた抗体を提供することである。新規抗体フォーマットは、例えば、複数の結合部位を有する抗体又は更なる機能性を有する二重特異性抗体を得るために、知られたの抗体フォーマットと任意に組み合わせることができる。これらの目的は、以下及び添付の特許請求の範囲に示す主題によって達成される。

【0013】

以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は、本明細書に記載の特定の方法、プロトコル、及び試薬に、これらは変わる可能性があるので、限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用する用語は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。特段の断りがない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。

【0014】

以下に、本発明の要素について説明する。これら要素は、具体的な実施形態と共に列挙されるが、これらを任意の方式で任意の数組み合わせて更なる実施形態を生み出すことができることを理解すべきである。様々に記載される実施例及び好ましい実施形態は、本発明を明示的に記載される実施形態に限定することを意図するものではない。この記載は、明示的に記載された実施形態を任意の数の開示された及び／又は好ましい要素と組み合わせる実施形態をサポート及び包含すると理解すべきである。更に、特に指定しない限り、本願における全ての記載された要素の任意の入れ換え及び組合せが本願の記載によって開示されるとみなすべきである。

【0015】

本明細書及びその後に続く特許請求の範囲全体を通して、特に必要としない限り、用語「含む」並びに「含み」及び「含んでいる」等の変形は、指定されている部材、整数、又は工程を含むが、任意の他の指定されていない部材、整数、又は工程を除外するものではないことを意味すると理解される。用語「からなる」は、任意の他の指定されていない部材、整数、又は工程が除外される、用語「含む」の具体的な実施形態である。本発明において、用語「含む」は、用語「からなる」を包含する。したがって、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、Ｘのみからなっていてもよく、追加の何かを含んでいてもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。

【0016】

用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」、並びに本発明の説明（特に、特許請求の範囲）において使用される同様の参照は、本明細書に指定されているか又は文脈上明示的に否定されていない限り、単数及び複数の両方を網羅すると解釈すべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、範囲内の各別個の値を個別に参照する簡易的な方法として機能することを意図する。本明細書において特に指定しない限り、各個別の値は、本明細書に個々に列挙されているかのように明細書に組み込まれる。明細書中のいずれの言語も、本発明の実施に必須の任意の請求されていない要素を示すと解釈されるべきではない。

【0017】

用語「実質的に」は、「完全に」を除外するものではなく、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含んでいなくてもよい。必要な場合、用語「実質的に」は、本発明の定義から省略されることもある。

【0018】

数値ｘに関連する用語「約」は、ｘ±１０％を意味する。

【0019】

本明細書で使用するとき、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」は、それぞれ、好ましくは通常のペプチド結合、又は修飾されたペプチド結合（例えば、等価（ｉｓｏｓｔｅｒｉｃ）ペプチドの場合など）によって互いに結合された少なくとも２つのアミノ酸を含む融合タンパク質を含むペプチド、オリゴペプチド、又はタンパク質を意味する。特に、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」は、非ペプチド構造要素を含むペプチドアナログとして定義される「ペプチド模倣物」も含まれ、このペプチドは、天然の親ペプチドの生物学的作用を模倣する又は拮抗することができる。ペプチド模倣物は、酵素的に切断可能なペプチド結合などの古典的なペプチド特性を欠く。ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質は、遺伝暗号で定義される２０種のアミノ酸のいずれかで構成され得る。更に、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質は、これらのアミノ酸に加えて、遺伝暗号によって定義される２０個のアミノ酸以外のアミノ酸も含んでもよく、又は遺伝暗号によって定義される２０個のアミノ酸以外のアミノ酸から構成されてもよい。特に、本発明の文脈におけるペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質は、翻訳後成熟プロセスなどの天然プロセス又は化学プロセスによって修飾されたアミノ酸から等しく構成することができ、これは当業者によく知られている。そのような修飾は、文献に十分に記載されている。これらの修飾は、ポリペプチドの任意に箇所、即ち、ペプチド骨格、アミノ酸鎖、又はカルボキシ又はアミノ末端においても現れる可能性がある。特に、ペプチド又はポリペプチドは、ユビキチン化に続いて分岐するか、分岐の有無にかかわらず環状であり得る。このタイプの修飾は、当業者によく知られた天然又は合成の翻訳後プロセスの結果であり得る。本発明の文脈における用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」には、特に、修飾されたペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質も含まれる。例えば、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ－リボシル化、アミド化、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合固定、脂質又は脂質誘導体の共有結合固定、ホスファチジルイノシトールの共有結合固定、共有結合又は非共有結合の架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、ペグ化を含むグリコシル化、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセス、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セネロイル化、硫酸化、アルギニル化などのアミノ酸付加、又はユビキチン化が含まれる。このような修飾は、文献に十分に記載されている（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ （１９９３） ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｔ． Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ； Ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ （１９８３） Ｂ． Ｃ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ； Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２： ６２６－６４６ ａｎｄ Ｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ， Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， ６６３： ４８－６２）。したがって、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」には、好ましくは、例えば、リポペプチド、リポタンパク質、糖ペプチド、糖タンパク質などが含まれる。

【0020】

しかしながら、好ましくは、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドは、「古典的な」ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質であり、「古典的な」ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質は、通常、遺伝コードによって定義される２０種のアミノ酸から選択され、通常のペプチド結合によって互いに結合されるアミノ酸で構成される。

【0021】

本明細書で使用される「第１のポリペプチド鎖」という用語は、第２のポリペプチド（「第２のポリペプチド鎖」）と会合されるポリペプチドを意味する。特に、第１及び第２のポリペプチド鎖は、ジスルフィド結合を介して会合する。第１のポリペプチド鎖は、１つ、２つ、３つの抗体重定常ドメインを含むことができる。好ましい実施形態では、それは、３つの抗体重定常ドメイン、即ち、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３、並びにＣＨ１とＣＨ２の間のヒンジ領域を含む。前記重鎖定常ドメインは、マウス、キメラ、合成、ヒト化、又はヒト、及びモノクローナル又はポリクローナルである抗体に由来することができる。第１のポリペプチド鎖は、１つ以上の可変ドメイン、好ましくは抗体重鎖の可変ドメインを含むことができる。

【0022】

本明細書で使用される「第２のポリペプチド鎖」という用語は、第１のポリペプチド（「第１のポリペプチド鎖」）と会合されるポリペプチドを意味する。特に、第１及び第２のポリペプチド鎖は、ジスルフィド結合を介して会合する。第２のポリペプチド鎖は、抗体軽鎖定常領域ＣＬを含むことができる。前記軽鎖定常ドメインは、マウス、キメラ、合成、ヒト化、又はヒト、及びモノクローナル又はポリクローナルである抗体に由来することができる。第２のポリペプチド鎖は、１つ以上の可変ドメイン、好ましくは抗体軽鎖の可変ドメインを含むことができる。

【0023】

一般に、「抗体」は、抗原に特異的に結合するタンパク質である。通常、抗体は、その対応する抗原との特異的結合を可能とするユニークな構造を有するが、一般に、抗体は類似した構造を有し、特に免疫グロブリン（Ｉｇ）としても知られる。本明細書で使用される「抗体」という用語は、本発明に係る特徴的な性質が維持される限り、限定するものではないが、抗体全体、抗体断片、特に抗原結合断片、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、組換え抗体、及び遺伝子操作された抗体（変異体又は突然変異抗体）を含む各種形態の抗体を含む。特許請求の範囲を含む明細書は、一部の箇所で、抗体の抗原結合断片、抗体断片、変異体、及び／又は誘導体に明示的に言及する場合があるが、用語「抗体」は、抗体の全てのカテゴリー、即ち、抗体の抗原結合断片、抗体断片、変異体、及び誘導体を含む。

【0024】

本明細書で使用される「抗原結合断片」、「断片」、及び「抗体断片」という用語は、相互変換可能に用いられ、（ｉ）抗体の抗原結合活性と、（ｉｉ）（追加の）機能的ドメインによって提供される追加機能性、例えば、（独立した）結合部位によって提供される結合活性とを保持する本発明の抗体の任意の断片を意味する。本発明に係る抗原結合断片では、本発明に係る特徴的な性質が保持される。一般に、抗体断片の例としては、限定するものではないが、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）_２が挙げられる。抗体の断片は、ペプシン又はパパインなどの酵素による消化を含む方法によって、及び／又は化学還元によるジスルフィド結合の切断によって抗体から得ることができる。或いは、抗体の断片は、重鎖又は軽鎖の配列の一部のクローニング及び発現によって得ることができる。更に、本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗体及びその抗原結合断片の両方を含む。

【0025】

本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことが意図される。ヒト抗体は、現在の技術水準でよく知られている（ｖａｎ Ｄｉｊｋ， Ｍ． Ａ．， ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ， Ｊ． Ｇ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ５ （２００１） ３６８－３７４）。また、ヒト抗体は、免疫感作時に内因性免疫グロブリン産生の非存在下で、ヒト抗体の完全なレパートリー又は一揃いを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）で産生することができる。そのような生殖細胞系突然変異マウスにおけるヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原接種時にヒト抗体の産生をもたらす（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０ （１９９３） ２５５１－２５５５； Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３６２ （１９９３） ２５５－２５８； Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｙｅａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７ （１９９３） ３３４０参照）。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーでも作製できる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ， Ｈ． Ｒ．， ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ， Ｇ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７ （１９９２） ３８１－３８８； Ｍａｒｋｓ， Ｊ． Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２ （１９９１） ５８１－５９７）。Ｃｏｌｅら及びＢｏｅｒｎｅｒらの技術は、また、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， ｐ． ７７ （１９８５）；及びＢｏｅｒｎｅｒ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７ （１９９１） ８６－９５）。好ましくは、ヒトモノクローナル抗体は、Ｔｒａｇｇｉａｉ Ｅ， Ｂｅｃｋｅｒ Ｓ， Ｓｕｂｂａｒａｏ Ｋ， Ｋｏｌｅｓｎｉｋｏｖａ Ｌ， Ｕｅｍａｔｓｕ Ｙ， Ｇｉｓｍｏｎｄｏ ＭＲ， Ｍｕｒｐｈｙ ＢＲ， Ｒａｐｐｕｏｌｉ Ｒ， Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ Ａ． （２００４）： Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｍａｋｅ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｍｅｍｏｒｙ Ｂ ｃｅｌｌｓ： ｐｏｔｅｎｔ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ． Ｎａｔ Ｍｅｄ． １０（８）：８７１－５に記載されるように、改善されたＥＢＶ－Ｂ細胞不死化を使用して調製される。本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、本明細書に記載の本発明に係る性質を生成するように修飾された抗体も含む。

【0026】

本発明に係る抗体は、精製された形態で提供され得る。したがって、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、精製された抗体又は抗原結合断片であることができる。典型的には、抗体は、他のポリペプチドを実質的に含まない組成物（例えば、組成物の９０％（重量）未満、通常６０％未満、より通常５０％未満が他のポリペプチドで構成される場合）に存在する。

【0027】

本明細書で使用される「可変ドメイン」（「可変領域」とも呼ばれる；軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ））という用語は、古典的な天然抗体におけるＮ末端ドメイン、典型的には古典的な天然抗体における最大の可変性を提供するドメインであり、且つ抗原への抗体の結合に直接関与する抗体のドメイン又はその抗原結合断片を意味する。通常、可変ヒト軽鎖及び重鎖のドメインは同一の一般的構造を有し、各ドメインは、その配列が広く保存されているフレームワーク（ＦＲ）領域（特に、４つのフレームワーク（ＦＲ）領域）及び３つの「超可変領域」又は相補性決定領域、ＣＤＲ（特に、３つの「超可変領域」／ＣＤＲ）を含む。フレームワーク領域は、通常、βシート構造を採用し、ＣＤＲは、βシート構造をつなぐループを形成することができる。各鎖のＣＤＲは、通常、フレームワーク領域によってその３次元構造に保持され、他の鎖のＣＤＲと共に抗原結合部位を形成する。

【0028】

本明細書で使用される「超可変領域」という用語は、抗原結合を司る抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ ｅｄ．， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． （１９９１）の標準的な定義にしたがって決定することができる。通常、特にネイティブな単一特異性ＩｇＧ抗体では、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）が可変ドメインに非連続的に配置される。換言すれが、重鎖及び／又は軽鎖上のＣＤＲは、例えば、フレームワーク領域によって分離されることができ、フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲより「可変」ではない可変ドメイン内の領域である。例えば、抗体において、可変ドメイン（又はそれぞれの各可変ドメイン）は、好ましくは、３つのＣＤＲにより分離された４つのフレームワーク領域を含み得る。特に、抗体の可変ドメイン（軽鎖又は重鎖可変ドメインＶＨ又はＶＬ）は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。各鎖のＣＤＲは、そのようなフレームワークアミノ酸によって分離される。通常、重鎖の３つのＣＤＲと、連結された軽鎖の３つのＣＤＲとが共に、抗原結合部位（パラトープ）を形成する。換言すれば、特にネイティブな単一特異性ＩｇＧ抗体では、抗原結合部位が、通常、２つの可変ドメインで構成されるので、各抗原結合部位に６つのＣＤＲが存在する（重鎖：ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３；軽鎖：ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）。単一抗体、特に単一のネイティブな単一特異性ＩｇＧ抗体は、通常、２つの（同一の）抗原結合部位を有するので、１２個のＣＤＲ（即ち、２×６個のＣＤＲ）を含む。

【0029】

その「多重特異性」、即ち異なる抗原結合部位のため、多重特異性抗体の重鎖及び／又は軽鎖、又はその抗原結合断片は、（それぞれ）３超のＣＤＲ、特に３超の異なるＣＤＲを含み得る。例えば、多重特異性抗体又はその抗原結合断片は、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含むことができ、前記少なくとも２つの異なる可変ドメインは、それぞれ、異なる単一特異性抗体、例えばＩｇＧ型の抗体に由来する。そのような単一特異性抗体は通常、抗原結合部位を形成する重鎖に３つのＣＤＲ及び軽鎖に３つのＣＤＲを含むため、本発明に係る多重特異性抗体は、特に、第１の抗体の重鎖の３つのＣＤＲ及び第１の抗体の軽鎖の３つのＣＤＲ、第２の抗体の重鎖の３つのＣＤＲ及び第２の抗体の軽鎖の３つのＣＤＲ、任意に、第３の抗体の重鎖の３つのＣＤＲ及び第３の抗体の軽鎖の３つのＣＤＲなどを含むことができる。したがって、多重特異性抗体の重鎖及び／又は軽鎖に含まれるＣＤＲの数は、好ましくは３の倍数、例えば３、６、９、１２などである。それにより、多重特異性抗体の重鎖及び軽鎖の両方に含まれるＣＤＲの合計が６の倍数、例えば６、１２、１８などであることが好ましい。「抗原結合部位」は通常、ＣＤＲ、即ちＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３並びにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３により特徴付けられるので、本発明に係る多重特異性抗体においては、ＣＤＲは、その順序（例えば、同一の単一特異性抗体に由来するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３及び／又はＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）が、抗原結合部位を保持するように、即ち、抗原の特定部位に特異的に結合する能力を保持するように維持される。これは、例えば、一続きのアミノ酸における第１の単一特異性抗体に由来するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３の順序が、好ましくは第２の単一特異性抗体に由来するＣＤＲによって中断されないことを意味する。重要なことには、多重特異性抗体が少なくとも２つの異なる単一特異性抗体に由来する抗原結合部位を含む場合、これらの単一特異性抗体のＣＤＲ又は可変ドメインは、ＣＤＲ（又は可変領域）が由来する各単一特異性抗体の「抗原受容体」が保持される、即ち、抗原の特定部位に特異的に結合する能力が保持されるように、本発明に係る多重特異性抗体に配置される。

【0030】

本発明の文脈において、可変ドメインは、天然の抗体の任意の可変ドメイン（特に、ＶＨ及び／又はＶＬ）であり得るか、又は可変ドメインは、改変／エンジニアードされた可変ドメインであり得る。改変／エンジニアードされた可変ドメインは、当技術分野で知られている。通常、可変ドメインは、１つ以上の機能を削除又は追加するように、例えば、体細胞突然変異を「生殖系列化（ｇｅｒｍｌｉｎｉｎｇ）」（体細胞突然変異を「除去」）する又はヒト化することによって改変／エンジニアードされる。

【0031】

本明細書で使用される「定常ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、様々なエフェクタ機能を示す抗体のドメインを意味する。典型的に、重鎖は、免疫グロブリンのクラスに応じて、３つ又は４つの定常ドメイン、即ち、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及び任意にＣＨ４を（ＮＣ末端方向に）含む。したがって、重鎖の定常領域は通常、（ＮからＣ末端方向に）ＣＨ１－ヒンジ（重鎖の第１の定常ドメインと第２の定常ドメインとの間にアミノ酸を含む柔軟なポリペプチド）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４）によって形成される。軽鎖は通常、ＣＬと呼ばれる単一定常ドメインを１つだけ含み、これは通常、軽鎖の定常領域も形成する。本発明の文脈において、定常ドメインは、天然の抗体の任意の定常ドメイン（特に、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及び／又はＣＨ４）であり得る、又は定常ドメインは、改変／エンジニアードされた定常ドメインであり得る。改変／エンジニアードされた定常領域は、当技術分野で知られている。通常、定常ドメインは、例えばＦｃ領域の機能性の文脈において、１つ以上の関数を削除又は追加するように改変／エンジニアードされる。重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体又は免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭのクラスに分けられ、これらのいくつかは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２のサブクラスに更に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域はそれぞれ、α、ε、γ、及びμと呼ばれる。本発明に係る抗体は、好ましくはＩｇＧ型のものである。

【0032】

一般に、抗体は任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、即ち、α、γ、又はμ重鎖）のものであり得るが、好ましくはＩｇＧである。ＩｇＧアイソタイプ内で、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブクラスであることができ、ＩｇＧ１が好ましい。抗体は、κ又はλ軽鎖を有することができる。

【0033】

本明細書で使用される「組換え抗体」という用語は、天然には存在しない全ての抗体、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされる組換え発現ベクター（例えば、１つ以上の定常ドメインを提供する）を使用して発現される抗体を含むことが意図される。

【0034】

本明細書で使用するとき、抗体又はその抗原結合断片の文脈における「多重特異性」という用語は、抗体又は抗原結合断片が、例えば異なる抗原上又は同一抗原上の少なくとも２つの異なるエピトープに結合する能力を意味する。したがって、「二重特異性」、「三重特異性」、「四特異性」などの用語は、抗体が結合できる異なるエピトープの数を意味する。例えば、従来の単一特異性ＩｇＧ型抗体は、２つの同一の抗原結合部位（パラトープ）を有し、したがって、同一のエピトープにのみ結合できる（異なるエピトープには結合できない）。対照的に、多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるタイプのパラトープ／結合部位を有し、したがって、少なくとも２つの異なるエピトープに結合できる。本明細書で使用する「パラトープ」とは、抗体の抗原結合部位を意味する。更に、単一の「特異性」とは、単一の抗体における１、２、３、又はそれ以上の同一のパラトープを意味し得る（１つの単一の抗体分子におけるパラトープ／結合部位の実際の数は、「価（ｖａｌｅｎｃｙ）」と呼ばれる）。例えば、単一のネイティブなＩｇＧ抗体は、２つの同一のパラトープを有するの、単一特異性で二価である。したがって、多重特異性抗体は、少なくとも２つの（異なる）パラトープ／結合部位を含む。したがって、「多重特異性抗体」という用語は、１超のパラトープと２つ以上の異なるエピトープに結合する能力を有する抗体を意味する。「多重特異性抗体」という用語は、特に上に定義された二重特異性抗体を含むが、典型的にはタンパク質、例えば、特に３つ以上の異なるエピトープに結合する抗体、足場、即ち、３つ以上のパラトープ／結合部位を有する抗体も含む。

【0035】

特に、多重特異性抗体又はその抗原結合断片は、２つ以上のパラトープ／結合部位を含むことができ、抗体の全てのパラトープ／結合部位が少なくとも２つの異なるタイプのパラトープ／結合部位に属し、したがって、抗体が少なくとも２つの特異性を有するように、いくつかのパラトープ／結合部位が同一であることができる。例えば、多重特異性抗体又はその抗原結合断片は、４つのパラトープ／結合部位を含むことができ、各２つのパラトープ／結合部位が同一であり（即ち、同一の特異性を有し）、したがって、抗体又はその断片は二重特異性で四価（２つの特異性のそれぞれに対して２つの同一のパラトープ／結合部位）である。したがって、「１つの特異性」は、特に同一の特異性を示す１つ以上のパラトープ／結合部位（通常、そのような１つ以上のパラトープ／結合部位が同一であることを意味する）を意味し、したがって、「２つの特異性」は、２つだけの特異性に言及している限り、２、３、４、５、６、又はそれ以上のパラトープ／結合部位によって実現され得る。或いは、多重特異性抗体は、（少なくとも２つの）特異性ごとに１つの単一のパラトープ／結合部位を含むことができ、即ち、多重特異性抗体は、合計で少なくとも２つのパラトープ／結合部位を含む。例えば、二重特異性抗体は、２つの特異性のそれぞれに対して１つの単一のパラトープ／結合部位を含む、即ち、抗体は合計２つのパラトープ／結合部位を含む。また、抗体は、２つの特異性のそれぞれについて２つの（同一の）パラトープ／結合部位を含む、即ち、抗体は合計４つのパラトープ／結合部位を含むことも好ましい。好ましくは、抗体は、２つの特異性のそれぞれについて３つの（同一の）パラトープ／結合部位を含む、即ち、抗体は合計６つのパラトープ／結合部位を含む。

【0036】

本明細書で使用される「抗原」という用語は、適応免疫応答の受容体の標的、特に抗体、Ｔ細胞受容体、及び／又はＢ細胞受容体の標的として機能する任意の構造物質を意味する。「抗原決定基」としても知られる「エピトープ」は、免疫系、特に抗体、Ｔ細胞受容体、及び／又はＢ細胞受容体によって認識される抗原の一部（又は断片）である。したがって、１つの抗原は少なくとも１つのエピトープを有する、即ち、単一の抗原は１つ以上のエピトープを有する。抗原は、（ｉ）ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質、（ｉｉ）多糖、（ｉｉｉ）脂質、（ｉｖ）リポタンパク質又はリポペプチド、（ｖ）糖脂質、（ｖｉ）核酸、又は（ｖｉｉ）低分子薬又は毒素であり得る。したがって、抗原は、ペプチド、タンパク質、多糖類、脂質、リポタンパク質及び糖脂質を含むそれらの組合せ、核酸（例えば、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、デコイＤＮＡ、プラスミド）、又は低分子薬（例えば、シクロスポリンＡ、パクリタキセル、ドキソルビシン、メトトレキサート、５－アミノレブリン酸）、又はそれらの任意の組合せであり得る。好ましくは、抗原は、（ｉ）ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質、（ｉｉ）多糖、（ｉｉｉ）脂質、（ｉｖ）リポタンパク質又はリポペプチド、及び（ｖ）糖脂質から選択され、より好ましくは、抗原は、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質である。

【0037】

本明細書で使用される「抗原結合部位」という用語は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、相補的である領域を含む抗体の一部を意味する。抗原が大きい場合、抗体は抗原の特定の部分のみに結合することがあり、その部分を「エピトープ」と呼ぶ。典型的には、２つの可変ドメイン、特に重鎖可変ドメインＶＨ及び軽鎖可変ドメインＶＬが会合して、抗原結合部位を形成する。特に、抗原結合部位は、重鎖可変ドメインの３つのＣＤＲと軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲとが一緒になって、即ち前記したように６つのＣＤＲによって形成される。

【0038】

「特異的に結合する」という用語及び同様の記載は、非特異的な付着（ｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｔｉｃｋｉｎｇ）は含まない。

【0039】

本明細書で使用される用語「リンカー」（「スペーサー」とも呼ばれる）は、抗体又はその抗原結合断片などの、ポリペプチド又はタンパク質の異なるドメインを接続するように適合されたペプチドを意味する。リンカーは当技術分野で知られており、Ｒｅｄｄｙ Ｃｈｉｃｈｉｌｉ ＶＰ， Ｋｕｍａｒ Ｖ， Ｓｉｖａｒａｍａｎ Ｊ． Ｌｉｎｋｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ： Ａ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ． ２０１３；２２（２）：１５３－１６７）に詳細に記載される。通常、リンカーは、機能性に影響を与えないように設計される。特に、リンカーは、標的に特異的に結合しない。リンカーは任意のアミノ酸を含むことができ、アミノ酸は、グリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）が好ましいことがある。好ましくは、リンカーは、アミノ酸グリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）から構成される（「ＧＳリンカー」）。１つのポリペプチド又はタンパク質中に２つ以上のリンカーが存在する場合、リンカーは、互いに等しくても異なっていてもよい。更に、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のアミノ酸の長さを有する。

【0040】

本明細書で使用される「核酸又は核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖でも二本鎖でもよい。

【0041】

本明細書で使用されるとき、「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養」という用語は相互変換可能にに使用され、その記載はいずれも子孫を含む。したがって、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という用語は、一次対象細胞、及び継代（ｔｒａｎｓｆｅｒｓ）の数に関わらず、それに由来する培養物を含む。また、故意又は偶発的な変異のために、全ての子孫のＤＮＡ含量が正確に同一ではないことがあることも理解される。最初に形質転換された細胞でスクリーニングされたものと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体子孫が含まれる。異なる記載が意図される場合には、文脈から明確となろう。

【0042】

本明細書で使用するとき、「配列変異体」（「変異体」とも称する）は、レファレンス配列における任意の変化を指し、レファレンス配列は、「配列の表及び配列番号」（配列表）に列挙されている配列、即ち、配列番号１～配列番号１３３のいずれかである。したがって、用語「配列変異体」は、ヌクレオチド配列変異体及びアミノ酸配列変異体を含む。注目すべきことに、本明細書で言及される配列変異体は、特に機能的配列変異体、即ち、例えば、抗体の生物学的機能を維持する配列変異体である。本発明の文脈において好ましい維持された生物学的機能は、（ｉ）抗体のその抗原への結合、及び（ｉｉ）（追加の）機能的ドメインによって提供される機能、例えば、（独立した）結合部位のその標的への結合を含む。したがって、好ましい配列変異体は、レファレンス配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する機能的配列変異体である。本明細書に使用される表現「少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する機能的配列変異体」という表現は、（ｉ）配列変異体が本明細書に記載されるように機能的であり、且つ（ｉｉ）％配列同一性が高いほど、より好ましい配列変異体であることを意味する。換言すれば、表現「少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する機能的配列変異体」は、特に、機能的配列改変体がそれぞれのレファレンス配列に対して少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも９２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、特に好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、特に好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有することを意味する。

【0043】

「配列変異体」という用語は、特に、レファレンス配列と比較して突然変異及び／又は置換を含む変異体を含む。Ｆｃ部分配列の例示的な変異体は、限定するものではないが、ＣＨ２ ４、ＣＨ２ ５、又はその両方の位置にＬからＡへの置換を有するものを含む。

【0044】

配列同一性は、通常、レファレンス配列（即ち、本願に列挙される配列）の完全長に対して計算される。本明細書において言及するとき、同一性パーセントは、例えば、ＮＣＢＩ（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって指定されたデフォルトパラメータ［Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリクス；ギャップオープンペナルティ＝１１、及びギャップエクステンションペナルティ＝１］を用いるＢＬＡＳＴを使用して決定することができる。

【0045】

本明細書で使用するとき、「ヌクレオチド配列変異体」は、レファレンス配列におけるヌクレオチドのうちの１つ以上が欠失若しくは置換されているか、又は１つ以上のヌクレオチドがレファレンスヌクレオチド配列の配列に挿入されている、変化した配列を有する。ヌクレオチドは、標準的な一文字表記（Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴ）によって本明細書に言及される。遺伝子コードの縮重に起因して、「ヌクレオチド配列変異体」は、それぞれのレファレンスアミノ酸配列に変化をもたらす、即ち、「アミノ酸配列変異体」を生じさせる場合もあり、そうではない場合もある。好ましい配列変異体は、アミノ酸配列変異体を生じさせない（サイレント突然変異）ヌクレオチド配列変異体である。しかし、他の非サイレント突然変異も範囲内であり、具体的には、レファレンス配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を生じさせる、突然変異ヌクレオチド配列も範囲内である。

【0046】

「アミノ酸配列変異体」は、レファレンスアミノ酸におけるアミノ酸のうちの１つ以上が欠失、置換、又は１つ以上のアミノ酸がレファレンスアミノ酸配列の配列に挿入されている、変化した配列を有する。変化の結果、アミノ酸配列変異体は、レファレンス配列と少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一、最も好ましくは少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する。少なくとも９０％同一の変異体配列は、レファレンス配列の１００アミノ酸当たり１０以下の変化、即ち、欠失、挿入、又は置換の任意の組合せを有する。

【0047】

非保存的アミノ酸置換を有することが可能であるが、置換は、置換されたアミノ酸が、レファレンス配列における対応するアミノ酸と類似の構造的又は化学的性質を有する保存的アミノ酸置換であることが好ましい。一例として、保存的アミノ酸置換は、ある脂肪族又は疎水性のアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、及びイソロイシン）の別の脂肪族又は疎水性のアミノ酸による置換；あるヒドロキシル含有アミノ酸（例えば、セリン及びトレオニン）の別のヒドロキシル含有アミノ酸による置換；ある酸性残基（例えば、グルタミン酸又はアスパラギン酸）の別の酸性残基による置換；あるアミド含有残基（例えば、アスパラギン及びグルタミン）の別のアミド含有残基による置換；ある芳香族残基（例えば、フェニルアラニン及びチロシン）の別の芳香族残基による置換；ある塩基性残基（例えば、リジン、アルギニン、及びヒスチジン）の別の塩基性残基による置換；並びにある小アミノ酸（例えば、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン、及びグリシン）の別の小アミノ酸による置換を含む。

【0048】

アミノ酸配列の挿入は、１残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドに及ぶ長さの範囲のアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、アミノ酸配列のＮ又はＣ末端のレポーター分子又は酵素への融合が挙げられる。

【0049】

重要なことに、配列変異体における変化は、本件におけるそれぞれのレファレンス配列の機能、例えば、その抗原に結合するための抗体又はその抗原結合断片の配列の機能性、及び／又は機能的ドメインによって提供される追加の機能性、例えば、（独立した）結合部位の標的に結合するための機能性を消失させるものではない。かかる機能を消失させることなしにそれぞれどのヌクレオチド及びアミノ酸残基を置換、挿入、又は欠失させることができるかを決定するための指針は、当技術分野において周知のコンピュータプログラムを使用することによって見出される。

【0050】

本明細書で使用するとき、指定の核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に「由来する」核酸配列又はアミノ酸配列は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の起源を指す。好ましくは、特定の配列に由来する核酸配列又はアミノ酸配列は、これらが由来する配列又はその一部と本質的に同一のアミノ酸配列を有し、「本質的に同一」とは、上に定義した配列変異体を含む。好ましくは、特定のペプチド又はタンパク質に由来する核酸配列又はアミノ酸配列は、特定のペプチド又はタンパク質における対応するドメインに由来する。それに関して、「対応する」とは、特に、同じ機能に言及する。例えば、「細胞外ドメイン」は、（別のタンパク質の）別の「細胞外ドメイン」に対応する、又は「膜貫通ドメイン」は、（別のタンパク質の）別の「膜貫通ドメイン」に対応する。したがって、ペプチド、タンパク質、及び核酸の「対応する」部分は、当業者によって容易に同定可能である。同様に、他の配列に「由来する」配列は、通常、前記配列中にその起源を有することが当業者によって容易に同定可能である。

【0051】

好ましくは、別の核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に由来する核酸配列又はアミノ酸配列は、（それが由来する）出発核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質と同一であり得る。しかし、別の核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に由来する核酸配列又はアミノ酸配列は、（それが由来する）出発核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に対して１つ以上の突然変異を有していてもよく、具体的には、別の核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に由来する核酸配列又はアミノ酸配列は、（それが由来する）出発核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の上記機能性配列変異体であってよい。例えば、ペプチド／タンパク質において、１つ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換してもよく、１つ以上のアミノ酸残基が挿入又は欠失してもよい。

【0052】

本明細書で使用するとき、用語「突然変異」は、レファレンス配列、例えば、対応するゲノム配列と比較した、核酸配列及び／又はアミノ酸配列の変化に関する。例えばゲノム配列と比較した突然変異は、（自然界に存在する）体細胞突然変異、自然突然変異、例えば、酵素、化学物質、若しくは放射線によって誘導される誘導突然変異、又は部位特異的突然変異誘発（核酸配列及び／又はアミノ酸配列を特異的且つ故意に変化させるための分子生物学的方法）によって得られる突然変異であってよい。したがって、用語「突然変異」又は「突然変異する」とは、例えば、核酸配列及び／又はアミノ酸配列において突然変異を物理的に作製することも含むと理解されるものとする。突然変異は、１つ以上のヌクレオチド又はアミノ酸の置換、欠失、及び挿入に加えて、幾つか（２つ以上）の連続するヌクレオチド又はアミノ酸の逆位も含む。アミノ酸配列に突然変異を生じさせるために、好ましくは、（組み換え）突然変異型ポリペプチドを発現させるために、前記アミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列に突然変異を導入してよい。突然変異は、例えば、あるアミノ酸をコードしている核酸分子のコドンを、例えば部位特異的突然変異誘発によって、変化させて異なるアミノ酸をコードしているコドンを生じさせることにより、又は核酸分子の１つ以上のヌクレオチドを突然変異させる必要無しに、ポリペプチドをコードしている核酸分子のヌクレオチド配列を理解し、ポリペプチドの変異体をコードしているヌクレオチド配列を含む核酸分子の合成を設計することによって、配列変異体を合成することにより行ってよい。

【0053】

本発明の文脈において使用される用語「疾患」は、ヒト若しくは動物の身体又は正常な機能が損なわれているその部分のうちの１つの異常な状態を全て反映し、典型的には、識別可能な徴候及び症状によって顕在化し、且つヒト又は動物の寿命及び／又は生活の質を低減するという点で、用語「疾病」及び（健康状態のような）「状態」と略同義であることを意図し、互換的に使用される。

【0054】

本明細書の本文中には幾つかの文献が引用されている。本明細書中に引用した各文献（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造者の明細書、指示書などを含む）は、上記又は下記のいずれかにかかわらず、参照によりその全体を本明細書に援用する。本明細書中のいかなるものも、本発明が、先行する発明によってそのような開示よりも先行する資格がないと認めるものとして解釈されるものではない。

【0055】

本発明は、本明細書に記載の特定の方法、プロトコル、及び試薬に、これらは変わる可能性があるので、限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためにのみ用いられるのであって、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。特段の断りがない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。

【0056】

エルボーに機能的ドメインを有する抗体及び抗原結合断片
第１の態様において、本発明は、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを含む抗体又はその抗原結合断片であって、
前記第１のポリペプチド鎖は、ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）１つ以上の可変ドメイン；
（ｉｉ）（追加の）機能的ドメイン；及び
（ｉｉｉ）１つ以上の定常ドメインを含み、
前記第２のポリペプチド鎖は、ＮからＣ末端方向に、
（ｉｖ）前記第１のポリペプチド鎖の前記１つ以上の可変ドメイン（ｉ）と抗原結合部位を形成する１つ以上の可変ドメイン；
（ｖ）任意に、（追加の）機能的ドメイン；及び
（ｖｉ）１つ以上の定常ドメインを含み、
前記第１のポリペプチド鎖の前記（追加の）機能的ドメイン（ｉｉ）が前記第２のポリペプチド鎖の断片を含まず、前記第２のポリペプチド鎖の前記任意の（追加の）機能的ドメイン（ｖ）が前記第１のポリペプチド鎖の断片を含まない抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0057】

本発明は、（追加の）機能的ドメインが抗体のエルボー領域、即ち、可変ドメインと最もＮ末端側の定常ドメイン、特にＣＨ１又はＣＬとの間に挿入することができるという驚くべき知見に基づく。図１Ａは、矢印で示されたエルボー領域を有する古典的な天然抗体を示す。本発明者らは、驚くべきことに、そのような更なる機能的ドメインを含むようにエルボー領域においてエンジニアードされた抗体が、本明細書に記載される実施例に示されるように、例えば、（１）その可変ドメインによって標的化される抗原と、（２）抗体のエルボー領域に導入された結合部位によって標的化される更なる標的とに同時に結合できることを見出した。更なる結合部位が重鎖／軽鎖対を異なる特異性を有する別の重鎖／軽鎖対で置換することによって（各特異性に対して多くの場合一価である、前記した多重特異性ＩｇＧ抗体フォーマットのように）又は更なる結合部位を重鎖又は軽鎖のＮ又はＣ末端に付加することによって（前記した付加ＩｇＧ抗体フォーマットのように）得られる先行技術の多重特異性抗体フォーマットとは異なり、本発明の抗体においては、更なる機能的ドメイン、例えば、更なる結合部位（特異性）が、重鎖及び／又は軽鎖、即ち、エルボー領域に挿入される。驚くべきことに、結合部位などの、挿入された機能的ドメインの可変ドメイン（例えば、ＶＨ）のＮ末端は、他のポリペプチド鎖（例えば、ＶＬ）の対応する可変ドメインと共に、他のポリペプチド鎖がエルボーにおいて改変されていない場合であっても、十分に機能的な抗原結合部位を形成する。同じことが、多重特異性抗体にも当てはまる。即ち、挿入された機能的ドメインにかかわらず、挿入された機能的ドメインの可変ドメインのＮ末端は、他のポリペプチド鎖の対応する可変ドメインと会合して機能的抗原結合部位を形成する（例えば、一方のポリペプチド鎖のＶＬ１－ＶＬ２と他方のポリペプチド鎖のＶＬ１－ＶＬ２）。

【0058】

したがって、本発明に係る抗体及びその抗原結合断片は、「Ｉｎ－Ｅｌｂｏｗ－Ｉｎｓｅｒｔ」Ｉｇ分子（「ＩＥＩ－Ｉｇ」）と呼ばれる。本発明者らの知見の重要性は、図１に例示されるように、それが様々な新しい抗体フォーマットを生じるという事実によって反映される。本発明に係るＩＥＩ－Ｉｇ抗体及びその抗原結合断片は、図１Ｂに例示されるように、古典的な天然抗体に基づくか、又は他の（多重特異性）抗体フォーマットと組み合わせて、図１Ｃに例示されるように、更により多くの特異性を有する新しい抗体フォーマットを得ることができる。

【0059】

例えば、本発明に係る抗体を得るために、古典的な単一特異性抗体、好ましくはヒトモノクローナル抗体が「足場」抗体として機能することができ、結合部位などの更なる機能的ドメインが、足場抗体の重鎖及び／又は軽鎖のエルボー領域に挿入される（即ち、可変と最もＮ末端側の定常ドメインとの間、特に、可変ドメインのＣ末端と、ＣＨ１及び／又はＣＬのＮ末端との間）。他の例では、（ｉ）重鎖及び軽鎖などの少なくとも２つのポリペプチド鎖と、（ｉｉ）各ポリペプチド鎖に、少なくとも可変ドメイン及び定常ドメインを含む古典的な単一特異性抗体の断片、好ましくはヒトモノクローナル抗体の断片が「足場抗体」として機能することができ、結合部位などの機能的ドメインは、足場抗体断片の第１及び／又は第２のポリペプチド鎖のエルボー領域に挿入される。結合部位などの機能的ドメインをエルボー領域に挿入することによって本発明に係る抗体を得るために足場として使用することができるそのような抗体断片の好ましい例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）_２が挙げられる。更に、（ｉ）重鎖及び軽鎖などの少なくとも２つのポリペプチド鎖と、（ｉｉ）各ポリペプチド鎖に、少なくとも可変ドメイン及び定常ドメインを含む多特異性（特に、二特異性）抗体又はその断片などの組換え抗体又はその断片が「足場」抗体として機能することができ、結合部位などの機能的ドメインは、組換え足場抗体（断片）の第１及び／又は第２のポリペプチド鎖のエルボー領域に挿入される。

【0060】

足場抗体として機能することができる抗体の好ましい例としては、抗体ＧＣＥ５３６（ＶＨ：配列番号１、ＶＬ：配列番号２、重鎖定常領域：配列番号３、軽鎖定常領域：配列番号４；Ｐｉｃｃｏｌｉ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ． Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ＧＭ－ＣＳＦ ｂｙ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｌｖｅｏｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｏｓｉｓ． Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ６， ７３７５ （２０１５））；「Ｃ１」（実施例１参照；ＶＨ：配列番号５、ＶＬ：配列番号６、重鎖定常領域：配列番号３、軽鎖定常領域：配列番号７）；「Ｃ１ｂ」（ＶＨ：配列番号８、ＶＬ：配列番号９、重鎖定常領域：配列番号３、軽鎖定常領域：配列番号４）、及びＦＩ１７４（ＶＨ：配列番号１０、ＶＬ：配列番号１１、重鎖定常領域：配列番号３、軽鎖定常領域：配列番号４；Ｐａｐｐａｓ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ． Ｒａｐｉｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｂｒｏａｄｌｙ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ． Ｎａｔｕｒｅ ５１６， ４１８－４２２ （２０１４））が挙げられる。

【0061】

本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、例えば、重鎖及び／又は軽鎖などの定常ドメイン／領域を含む市販のＩｇＧベクター又はベクターセットなどによるクローニング技術によっても得ることができる。例えば、第１の抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインＶＨ及びＶＬなどの対応する可変ドメインは、ベクターにより提供されるそれぞれのポリペプチド鎖にクローニングすることができ、更に、更なる機能的ドメインを、（最もＣ末端側の）可変ドメインと（最もＮ末端側の）定常ドメインとの間、即ち、エルボー領域に位置するように、第１及び／又は第２のポリペプチド鎖にクローニングすることができる。

【0062】

本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の第１及び／又は第２のポリペプチド鎖は、（追加の）機能的ドメインを含む。特に、「機能的ドメイン」は、（通常の）ペプチド結合によって抗体又は抗原結合断片のポリペプチド鎖の隣接ドメインに連結されるペプチド又はポリペプチドである。特に、（追加の）機能的ドメインのＮ末端は、（最もＣ末端側の）可変ドメインのＣ末端に結合され、（追加の）機能的ドメインのＣ末端は、（最もＮ末端側の）定常ドメインのＮ末端にペプチド結合によって結合される。

【0063】

一般に、「機能的ドメイン」という用語は、例えば、抗体又は抗原結合断片の機能的単位を意味する。典型的には、機能的ドメインは、タンパク質（例えば、抗体又は抗原結合断片）に（追加の）機能を提供する。したがって、（追加の）機能的ドメインは通常、（追加の）機能を提供するために必要な全てのアミノ酸／配列を含む。特に、第１のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメイン（ｉｉ）は、第２のポリペプチド鎖の断片を含まず、第２のポリペプチド鎖の任意の（追加の）機能的ドメイン（ｖ）は、第１のポリペプチド鎖の断片を含まない。換言すれば、第２のポリペプチド鎖（特に、その任意の断片（アミノ酸１個の場合も含む））は、第１のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメイン（の機能性）に必要ではなく、関与もしない。更に、第２のポリペプチド鎖も（追加の）機能的ドメインを含む場合、第１のポリペプチド鎖（特に、その任意の断片（アミノ酸１個の場合も含む））は、第２のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメイン（の機能性）に必要ではなく、関与もしない。むしろ、第１及び／又は第２のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインの機能性に必要な又はそれに関与する全てのアミノ酸（アミノ酸配列）が、そのポリペプチド鎖自体の（追加の）機能的ドメインに含まれ、他のポリペプチド鎖の断片もアミノ酸も必要ではなく／関与もない。したがって、（追加の）機能的ドメインは、例えば、第１のポリペプチド鎖の可変ドメインと第２のポリペプチド鎖の可変ドメインとによって形成される抗原結合部位とは異なる。換言すれば、（追加の）機能的ドメインは、例えば、２つの異なるポリペプチド鎖の可変ドメインによって形成される抗原結合部位とは異なる（ただし、以下に詳細に記載するように、関連する可変ドメインが単一のポリペプチド鎖上に位置する場合、（追加の）機能的ドメインは、抗原結合部位を含むことがある）。

【0064】

特に好ましくは、第１及び／又は第２のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインは、Ｉｇ様ドメイン、例えば、以下に例示するようなタンパク質又は（ポリ）ペプチドのＩｇ様ドメインを含む又はからなる。免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の基本構造は、ジスルフィド結合で結合された２つの軽鎖と２つの重鎖の四量体である。軽鎖には、カッパとラムダの２種類があり、それぞれ定常ドメイン（ＣＬ）と可変ドメイン（ＶＬ）で構成される。重鎖には、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューの５種類があり、いずれも可変ドメイン（ＶＨ）及び３種（アルファ、デルタ、及びガンマ）又は４種（イプシロン及びミュー）の定常ドメイン（ＣＨ１～ＣＨ４）からなる。Ｉｇ分子は高度にモジュール化されたタンパク質であり、可変ドメインと定常ドメインは、明確な保存された配列パターンを有する。Ｉｇ及びＩｇ様分子におけるドメインは、Ｖセット（可変）、Ｃ１セット（定常１）、Ｃ２セット（定常２）、及びＩセット（中間）の４種に分類される。構造研究により、これらのドメインが、ベータシートにおけるストランドの数とその配列パターンが異なるタイプと、共通のコアのグリークキーベータサンドイッチ構造を共有することが示された。配列と構造の両方に関連する免疫グロブリン様ドメインは、いくつかの多様なタンパク質ファミリーに見られる。Ｉｇ様ドメインは、細胞間認識、細胞表面受容体、筋肉構造、免疫系など、さまざまな機能に関与する。

【0065】

Ｉｇ様ドメインの好ましい例としては、以下のタンパク質又は（ポリ）ペプチドのいずれかのＩｇ様ドメインが挙げられる：Ａ１ＢＧ（アルファ－１－β糖タンパク質）、ＡＣＡＭ、ＡＤＡＭＴＳＬ１（ＡＤＡＭＴＳ様１）、ＡＤＡＭＴＳＬ３（ＡＤＡＭＴＳ様３）、ＡＧＥＲ（終末糖化産物特異的受容体）、ＡＬＣＡＭ（活性化白血球細胞接着分子）、ＡＬＰＫ３（アルファキナーゼ３）、ＡＭＩＧＯ１（Ｉｇ様ドメイン１を有する接着分子）、ＡＭＩＧＯ２（Ｉｇ様ドメイン２を有する接着分子）、ＡＭＩＧＯ３（Ｉｇ様ドメイン３を有する接着分子）、ＡＸＬ（ＡＸＬ受容体チロシンキナーゼ）、ＢＣＡＭ（基底細胞接着分子（ルーテル式血液型））、ＢＯＣ（ＢＯＣ細胞接着関連、癌遺伝子調節）、ＢＳＧ（バシジン（Ｏｋ血液型）））、ＢＴＬＡ（Ｂ及びＴリンパ球関連）、Ｃ１０ｏｒｆ７２、Ｃ２０ｏｒｆ１０２、ＣＡＤＭ１（細胞接着分子１）、ＣＡＤＭ３（細胞接着分子３）、ＣＡＤＭ４（細胞接着分子４）、ＣＣＤＣ１４１（コイルドコイルドメイン含有１４１）、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ８０、ＣＤ８４、ＣＤ８６、ＣＤ９６、ＣＤ１０１、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２４４、ＣＤ２７６、ＣＤＯＮ（細胞接着関連、癌遺伝子調節）、ＣＥＡＣＡＭ１（癌胎児性抗原関連細胞接着分子１）、ＣＥＡＣＡＭ５（癌胎児性抗原関連細胞接着分子５）、ＣＥＡＣＡＭ６（癌胎児性抗原関連細胞接着分子６）、ＣＥＡＣＡＭ７（癌胎児性抗原関連細胞接着分子７）、ＣＥＡＣＡＭ８（癌胎児性抗原関連細胞接着分子８）、ＣＥＡＣＡＭ１６（癌胎児性抗原関連細胞接着分子１６）、ＣＥＡＣＡＭ１８（癌胎児性抗原関連細胞接着分子１８）、ＣＥＡＣＡＭ２０（癌胎児性抗原関連細胞接着分子２０）、ＣＥＡＣＡＭ２１（癌胎児性抗原関連細胞接着分子２１）、ＣＨＬ１（細胞接着分子Ｌ１様）、ＣＩＬＰ（軟骨中間層タンパク質）、ＣＩＬＰ２（軟骨中間層タンパク質２）、ＣＬＭＰ（ＣＸＡＤＲ様膜タンパク質）、ＣＮＴＦＲ（繊毛神経栄養因子受容体）、ＣＮＴＮ１（コンタクチン１）、ＣＮＴＮ２（コンタクチン２）、ＣＮＴＮ３（コンタクチン３、ＣＮＴＮ４（コンタクチン４）、ＣＮＴＮ５（コンタクチン５）、ＣＮＴＮ６（コンタクチン６）、ＣＳＦ１Ｒ（コロニー刺激因子１受容体）、ＣＸＡＤＲ（ＣＸＡＤＲ、Ｉｇ様細胞接着分子）、ＤＳＣＡＭ（ＤＳ細胞接着分子）、ＤＳＣＡＭＬ１（ＤＳ細胞接着分子様１）、ＥＭＢ（エンビジン）、ＥＳＡＭ（内皮細胞接着分子）、Ｆ１１Ｒ（Ｆ１１受容体）、ＦＡＩＭ３、ＦＣＭＲ（ＩｇＭ受容体のＦｃ断片）、ＨＭＣＮ１（ヘミセンチン１）、ＨＭＣＮ２（ヘミセンチン２）、ＦＣＡＲ（ＩｇＡ受容体のＦｃ断片）、ＦＣＥＲ１Ａ（ＩｇＥ受容体ＩａのＦｃ断片）、ＦＣＧＲ１Ａ（ＩｇＧ受容体ＩａのＦｃ断片）、ＦＣＧＲ１Ｂ（ＩｇＧ受容体ＩｂのＦｃ断片）、ＦＣＧＲ１ＣＰ（ＩｇＧ受容体ＩｃのＦｃ断片、偽遺伝子）、ＦＣＧＲ２Ａ（ＩｇＧ受容体ＩＩａのＦｃ断片）、ＦＣＧＲ２Ｂ（ＩｇＧ受容体ＩＩｂのＦｃ断片）、ＦＣＧＲ２Ｃ（ＩｇＧ受容体ＩＩｃのＦｃ断片）、ＦＣＧＲ３Ａ（ＩｇＧ受容体ＩＩＩａのＦｃ断片）、ＦＣＧＲ３Ｂ（ＩｇＧ受容体ＩＩＩｂのＦｃ断片）、ＦＣＲＨ１、ＦＣＲＨ３、ＦＣＲＨ４、ＦＣＲＬ１（Ｆｃ受容体様１）、ＦＣＲＬ２（Ｆｃ受容体様２）、ＦＣＲＬ３（Ｆｃ受容体様３）、ＦＣＲＬ４（Ｆｃ受容体様４）、ＦＣＲＬ５（Ｆｃ受容体様５）、ＦＣＲＬ６（Ｆｃ受容体様６）、ＦＣＲＬＡ（Ｆｃ受容体様Ａ）、ＦＣＲＬＢ（Ｆｃ受容体様Ｂ）、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＧＦＲＬ１、ＦＬＴ１（ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１）、ＦＬＴ３（ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３）、ＦＬＴ４（ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ４）、ＦＳＴＬ４（フォリスタチン様４）、ＦＳＴＬ５（フォリスタチン様５）、ＧＰ６（糖タンパク質ＶＩ血小板）、ＧＰＡ３３（糖タンパク質Ａ３３、ＧＰＲ１１６、ＧＰＲ１２５、ＡＤＧＲＦ５（接着Ｇタンパク質結合受容体Ｆ５）、ＡＤＧＲＡ２（接着Ｇタンパク質結合受容体Ａ２）、ｈＥＭＭＰＲＩＮ、ＨＥＰＡＣＡＭ（肝細胞及びグリア細胞接着分子）、ＨＥＰＡＣＡＭ２（ＨＥＰＡＣＡＭファミリーメンバー２）、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＨＬＡ－ＤＭＢ、ＨＬＡ－ＤＱＢ、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＮＴ、ＨＳＰＧ２（ヘパラン硫酸プロテオグリカン２）、ＨＹＳＴ２４７７、ＩＣＡＭ１（細胞間接着分子１）、ＩＣＡＭ２（細胞間接着分子２）、ＩＣＡＭ３（細胞間接着分子３）、ＩＣＡＭ４（細胞間接着分子４（Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ－Ｗｉｅｎｅｒ血液型））、ＩＣＡＭ５（細胞間接着分子５）、ＤＣＣ（ＤＣＣネトリン１受容体）、ＮＥＯ１（ネオゲニン１）、ＩＧＨＡ１、ＩＧＨＤ、ＩＧＨＥ、ＩＧＤＣＣ４（免疫グロブリンスーパーファミリーＤＣＣサブクラスメンバー４）、ＩＧＬＯＮ５（ＩｇＬＯＮファミリーメンバー５）、ＩＧＳＦ１（免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー１）、ＩＧＳＦ２（免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２）、ＩＧＳＦ３（免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３）、ＩＧＳＦ５（免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー５）、ＩＧＳＦ９（免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー９）、ＩＧＳＦ９Ｂ（免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー９Ｂ）、ＩＧＳＦ１０（免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー１０）、ＩＧＳＦ１１（免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー１１）、ＩＧＳＦ２１（免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２１）、ＩＧＳＦ２３（免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２３）、ＩＬ１Ｒ１（インターロイキン１受容体１型）、ＩＬ１Ｒ２（インターロイキン１受容体２型）、ＩＬ１ＲＡＰ（インターロイキン１受容体アクセサリータンパク質）、ＩＬ１ＲＡＰＬ１（インターロイキン１受容体アクセサリータンパク質様１）、ＩＬ１ＲＡＰＬ２（インターロイキン１受容体アクセサリータンパク質様２）、ＩＬ１ＲＬ１（インターロイキン１受容体様１）、ＩＬ１ＲＬ２（インターロイキン１受容体様２）、ＩＬ６Ｒ（インターロイキン６受容体）、ＩＬ１１ＲＡ（インターロイキン１１受容体サブユニットアルファ）、ＩＬ１２Ｂ（インターロイキン１２Ｂ）、ＩＬ１８ＢＰ（インターロイキン１８結合タンパク質）、ＩＬ１８Ｒ１（インターロイキン１８受容体１）、ＩＬ１８ＲＡＰ（インターロイキン１８受容体アクセサリータンパク質）、ＩＳＬＲ２（ロイシンリッチリピート２を含む免疫グロブリンスーパーファミリー）、ＪＡＭ２（接合部接着分子２）、ＪＡＭ３（接合部接着分子３）、ＫＤＲ（キナーゼ挿入ドメイン受容体）、ＫＩＲ－１２３ＦＭ、ＫＩＲ２ＤＬ１（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのＩｇドメインと長い細胞質テール１）、ＫＩＲ２ＤＬ２（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのＩｇドメインと長い細胞質テール２）、ＫＩＲ２ＤＬ３（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのＩｇドメインと長い細胞質テール３）、ＫＩＲ２ＤＬ４（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのＩｇドメインと長い細胞質テール４）、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのＩｇドメインと長い細胞質テール５Ａ）、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのＩｇドメインと長い細胞質テール５Ｂ）、ＫＩＲ２ＤＬＸ、ＫＩＲ２ＤＳ１（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのＩｇドメインと短い細胞質テール１）、ＫＩＲ２ＤＳ２（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのＩｇドメインと短い細胞質テール２）、ＫＩＲ２ＤＳ３（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのＩｇドメインと短い細胞質テール３）、ＫＩＲ２ＤＳ４（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのＩｇドメインと短い細胞質テール４）、ＫＩＲ２ＤＳ５（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのＩｇドメインと短い細胞質テール５）、ｋｉｒ３ｄ、ＫＩＲ３ＤＬ１（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３つのＩｇドメインと長い細胞質テール１）、ＫＩＲ３ＤＬ２（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３つのＩｇドメインと長い細胞質テール２）、ＫＩＲ３ＤＬ３（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３つのＩｇドメインと長い細胞質テール３）、ＫＩＲ３ＤＰ１（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３つのＩｇドメイン偽遺伝子１、ＫＩＲ３ＤＳ１（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３つのＩｇドメインと短い細胞質テール１）、ＫＩＲ３ＤＸ１（キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３つのＩｇドメインＸ１）、ＫＩＲＲＥＬ１（ｋｉｒｒｅ様ネフリンファミリー接着分子１）、ＫＩＲＲＥＬ２（ｋｉｒｒｅ様ネフリンファミリー接着分子２）、ＫＩＲＲＥＬ３（ｋｉｒｒｅ様ネフリンファミリー接着分子３）、ＫＩＴ（ＫＩＴ癌原遺伝子受容体チロシンキナーゼ）、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＡＧ３（リンパ球活性化３）、ＬＡＩＲ１（白血球関連免疫グロブリン様受容体１）、ＬＡＩＲ２（白血球関連免疫グロブリン様受容体２）、ＬＥＰＲ（レプチン受容体）、ＬＩＬＲＡ１（白血球免疫グロブリン様受容体Ａ１）、ＬＩＬＲＡ２（白血球免疫グロブリン様受容体Ａ２）、ＬＩＲＬＡ３（白血球免疫グロブリン様受容体Ａ３、ＬＩＲＬＡ４（白血球免疫グロブリン様受容体Ａ４）、ＬＩＬＲＡ５（白血球免疫グロブリン様受容体Ａ５）、ＬＩＬＲＡ６（白血球免疫グロブリン様受容体Ａ６）、ＬＩＬＲＢ１（白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ１）、ＬＩＬＲＢ２（白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ２）、ＩＬＲＲＢ３（白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ３）、ＬＩＬＲＢ４（白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ４）、ＬＩＲＬＢ５（白血球免疫グロブリン様受容体Ｂ５）、ＬＩＬＲＰ２、ＬＲＩＧ１、ＬＲＩＧ２、ＬＲＩＧ３、ＬＲＩＴ１、ＬＲＲＣ４、ＬＳＡＭＰ、ＬＳＲ（脂肪分解刺激リポタンパク質受容体）、ＬＹ９（リンパ球抗原９）、ＭＡＤＣＡＭ１（粘膜血管アドレッシン細胞接着分子１）、ＭＡＧ（ミエリン関連糖タンパク質）、ＭＡＬＴ１（ＭＡＬＴ１パラカスパーゼ）、ＭＣＡＭ（ミエローマ細胞接着分子）、ＭＤＧＡ１（グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー１を含むＭＡＭドメイン）、ＭＤＧＡ２（グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー２を含むＭＡＭドメイン）、ＭＥＲＴＫ（ＭＥＲ癌原遺伝子、チロシンキナーゼ）、ＭＦＡＰ３、ＭＩＲ、ＭＩＬＲ１（マスト細胞免疫グロブリン様受容体１）、ＭＭＰ２３Ａ（マトリクスメタロペプチダーゼ２３Ａ（偽遺伝子））、ＭＭＰ２３Ｂ（マトリクスメタロペプチダーゼ２３Ｂ）、ＭＵＳＫ（筋肉関連受容体チロシンキナーゼ）、ＭＸＲＡ５（マトリクスリモデリング関連５）、ＭＹＢＰＣ３、ＭＹＯＭ１（ミオメシン１）、ＭＹＯＭ２（ミオメシン２）、ＭＹＯＭ３（ミオメシン３）、ＮＣＡ、ＮＣＡＭ１、ＮＣＡＭ２、ＮＣＲ１（自然細胞傷害性トリガー受容体１）、ＮＥＧＲ１、ＮＥＯ１、ＮＦＡＳＣ、ＮＯＰＥ、ＮＰＨＳ１（ＮＰＨＳ１、ネフリン）、ＮＰＴＮ（ニューロプラスチン）、ＮＲＣＡＭ（神経細胞接着分子）、ＮＴＲＫ１（神経栄養性受容体チロシンキナーゼ１）、ＮＲＧ１、ＮＴ、ＮＴＲＫ３、ＯＢＳＣＮ、ＯＢＳＬ１（オブスキュリン様１）、ＯＰＣＭＬ、ＯＳＣＡＲ（破骨細胞関連、免疫グロブリン様受容体）、ＰＡＰＬＮ、ＰＤＣＤ１ＬＧ２（プログラム細胞死１リガンド２）、ＰＤＧＦＲＡ（血小板由来成長因子受容体アルファ）、ＰＤＧＦＲＢ（血小板由来成長因子受容体ベータ）、ＰＤＧＦＲＬ（血小板由来成長因子受容体様）、ＰＥＣＡＭ１（血小板及び内皮細胞接着分子１）、ＰＲＯＤＨ２、ＰＳＧ１（妊娠特異的ベータ１糖タンパク質１）、ＰＳＧ２（妊娠特異的ベータ１糖タンパク質２）、ＰＳＧ３（妊娠特異的ベータ１糖タンパク質３）、ＰＳＧ４（妊娠特異的ベータ１糖タンパク質４）、ＰＳＧ５（妊娠特異的ベータ１糖タンパク質５）、ＰＳＧ６（妊娠特異的ベータ１糖タンパク質６）、ＰＳＧ７（妊娠特異的ベータ１糖タンパク質７（遺伝子／偽遺伝子））、ＰＳＧ８（妊娠特異的ベータ１糖タンパク質８）、ＰＳＧ９（妊娠特異的ベータ１糖タンパク質９）、ＰＳＧ１０（妊娠特異的ベータ１糖タンパク質１０）、ＰＳＧ１１（妊娠特異的ベー
タ１糖タンパク質１１）、ＰＳＧ１１ｓ’（妊娠特異的ベータ１糖タンパク質１１ｓ’）、ＰＴＧＦＲＮ（プロスタグランジンＦ２受容体阻害剤）、ＰＴＫ７（タンパク質チロシンキナーゼ７（不活性））、ＰＴＰＲＤ（タンパク質チロシンホスファターゼ、受容体タイプＤ）、ＰＴＰＲＫ（タンパク質チロシンホスファターゼ、受容体タイプＫ）、ＰＴＰＲＭ（タンパク質チロシンホスファターゼ、受容体タイプＭ）、ＰＴＰＲＳタンパク質チロシンホスファターゼ、受容体タイプＳ）、ＰＴＰＲＴ（タンパク質チロシンホスファターゼ、受容体タイプＴ）、ＰＴＰシグマ、ＰＵＮＣ、ＰＶＲ（ポリオウイルス受容体）、ＰＶＲＬ１、ＰＶＲＬ２、ＰＶＲＬ４、ＮＥＣＴＩＮ１（ネクチン細胞接着分子１）、ＮＥＣＴＩＮ２（ネクチン細胞接着分子２）、ＮＥＣＴＩＮ３（ネクチン細胞接着分子３）、ＲＡＧＥ、ＲＯＢＯ３（ラウンドアバウト誘導受容体３）、ＳＣＮ１Ｂ（ナトリウム電圧ゲートチャネルベータサブユニット１）、ＳＤＫ１（サイドキック細胞接着分子１）、ＳＤＫ２（サイドキック細胞接着分子２）、ＳＥＭＡ３Ａ（セマフォリン３Ａ）、ＳＥＭＡ３Ｂ（セマフォリン３Ｂ）、ＳＥＭＡ３Ｅ（セマフォリン３Ｅ）、ＳＥＭＡ３Ｆ（セマフォリン３Ｆ）、ＳＥＭＡ３Ｇ（セマフォリン３Ｇ）、ＳＥＭＡ４Ｃ（セマフォリン４Ｃ）、ＳＥＭＡ４Ｄ（セマフォリン４Ｄ）、ＳＥＭＡ４Ｇ（セマフォリン４Ｇ）、ＳＥＭＡ７Ａ ８セマフォリン７Ａ（ジョンミルトンハーゲン血液型））、ＳＩＧＩＲＲ（単一ＩｇとＴＩＲドメイン含有）、ＳＩＧＬＥＣ１（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン１）、ＳＩＧＬＥＣ５（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン５）、ＳＩＧＬＥＣ６（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン６）、ＳＩＧＬＥＣ７（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン７）、ＳＩＧＬＥＣ８（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン８）、ＳＩＧＬＥＣ９（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン９）、ＳＩＧＬＥＣ１０（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン１０）、ＳＩＧＬＥＣ１１（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン１１）、ＳＩＧＬＥＣ１２（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン１２）（遺伝子／偽遺伝子））、ＳＩＧＬＥＣ１４（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン１４）、ＳＩＧＬＥＣ１５（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン１５）、ＳＬＡＭＦ１（シグナル伝達リンパ球活性化分子ファミリーメンバー１）、ＳＬＡＭＦ６（ＳＬＡＭファミリーメンバー６）、ＳＬＡＭＦ８（ＳＬＡＭファミリーメンバー８）、ＳＩＲＰＧ；ＴＡＲＭ１（Ｔ細胞相互作用骨髄細胞活性化受容体１）、ＴＥＫ（ＴＥＫ受容体チロシンキナーゼ）、ＴＨＹ１ Ｔｈｙ－１細胞表面抗原）、ＴＩＥ１（免疫グロブリン様及びＥＧＦ様ドメイン１を有するチロシンキナーゼ）、ＴＭＥＭ８１（膜貫通タンパク質８１）、ＴＭＩＧＤ１（膜貫通及び免疫グロブリンドメイン含有１）、ＴＭＩＧＤ２（膜貫通及び免疫グロブリンドメイン含有２）、ＴＴＮ（チチン）、ＴＹＲＯ３（ＴＹＲＯ３タンパク質チロシンキナーゼ）、ＵＮＣ５Ｄ、ＶＣＡＭ１（血管細胞接着分子１）、ＶＳＩＧ１（Ｖセット及び免疫グロブリンドメイン含有１）、ＶＳＩＧ２（Ｖセット及び免疫グロブリンドメイン含有２）、ＶＳＩＧ４（Ｖセット及び免疫グロブリンドメイン含有４）、ＶＳＩＧ１０（Ｖセット及び免疫グロブリンドメイン含有１０）、ＶＳＩＧ１０Ｌ（Ｖセット及び免疫グロブリンドメイン含有１０様）、ＶＳＴＭ１（Ｖセット及び膜貫通ドメイン含有１）、ＶＴＣＮ１（Ｖセットドメイン含有Ｔ細胞活性化阻害剤１）、ＺＰＢＰ（透明帯結合タンパク質）、又はＺＰＢＰ２（透明帯結合タンパク質２）。

【0066】

より好ましくは、Ｉｇ様ドメインは、以下のタンパク質：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ８０、ＣＤ８６のいずれか、特にＣＤ４のＩｇ様ドメインである。

【0067】

Ｉｇ様ドメインの更に好ましい例について、本明細書中、以下に記載する。

【0068】

また、好ましくは、第１及び／又は第２のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインは、（知られた）タンパク質の細胞外及び／又は細胞内ドメインを含む又はからなる。更に、好ましくは、第１及び／又は第２のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインは、（知られた）可溶性球状タンパク質のドメインを含む又はからなることができる。より好ましくは、第１及び／又は第２のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインは、（知られた）タンパク質の細胞外ドメイン又は（知られた）可溶性球状タンパク質のドメインを含む又はからなる。

【0069】

好ましくは、第１及び／又は第２のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインは、最大１０００個のアミノ酸、より好ましくは最大７５０個のアミノ酸、更により好ましくは最大５００個のアミノ酸、更により好ましくは最大４００個のアミノ酸、特に好ましくは最大３００個のアミノ酸、最も好ましくは最大２７５個又は２５０個のアミノ酸の長さを有する。更に、第１及び／又は第２のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインは、５～１０００個のアミノ酸、より好ましくは１０～７５０個のアミノ酸、更により好ましくは２０～５００個のアミノ酸、更により好ましくは５０～４００個のアミノ酸、特に好ましくは７０～３００個のアミノ酸、最も好ましくは７５～２７５個又は１００～２５０個のアミノ酸の長さを有することが好ましい。

【0070】

また、第１及び／又は第２のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインは、最大１５０ｋＤａ、より好ましくは最大１００ｋＤａ、更により好ましくは最大８０ｋＤａ、更により好ましくは最大７０ｋＤａ、特に好ましくは最大５０ｋＤａ、最も好ましくは最大３０又は２５ｋＤａのサイズを有することが好ましい。更に、第１及び／又は第２のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインは、０．５ｋＤａ～１５０ｋＤａ、より好ましくは１ｋＤａ～１００ｋＤａ、更により好ましくは２．５ｋＤａ～８０ｋＤａ、更により好ましくは５ｋＤａ～７０ｋＤａ、特に好ましくは７．５ｋＤａ～５０ｋＤａ、最も好ましくは１０ｋＤａ～３０又は２５ｋＤａのサイズを有することが好ましい。

【0071】

第１及び／又は第２のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインは、単量体ドメイン又は多量体ドメインを含み得る。単量体ドメインは、更なる（追加の）ドメインの関与なしに機能を媒介するドメインである。多量体ドメイン、例えば二量体を形成する２つのドメイン又は三量体を形成する３つのドメインは、特に多量体、例えば二量体又は三量体としてそれらの機能を一緒に媒介する。多量体ドメインの場合、第１及び／又は第２のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインは、多量体を形成するのに十分な柔軟性を提供するために本明細書に記載のリンカーを含むことができ、特にリンカーは、１つ以上の多量体ドメインに（直接）隣接して配置され得る、例えば、２つの多量体ドメイン間又は全ての多量体ドメインの各側に配置され得る。好ましくは、第１及び／又は第２のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインは、１つ以上の単量体ドメインを含む又はからなる。

【0072】

一般に、第１及び／又は第２のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインは、１つの単一タンパク質ドメイン又は１超のタンパク質ドメインを含む又はからなることができる。「１超のタンパク質ドメイン」は、前記の多量体ドメイン及び／又は前記の１つ以上の単量体ドメインであることができる。例えば、第１及び／又は第２のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインは、同一又は異なる機能を媒介し得る及び／又は任意にリンカーによって接続され得る２つ又は３つの単量体ドメインを含む又はからなることができる。例えば、第１及び／又は第２のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の（異なる）タンパク質ドメインを含むことができる。

【0073】

好ましくは、（追加の）機能的ドメインは、ヒトタンパク質、ペプチド、若しくはポリペプチド、又はその断片（特に、ドメイン）若しくは誘導体である。

【0074】

特に、（追加の）機能的ドメインは、ＧＳリンカーなどのリンカー（ペプチド）ではない。（追加の）機能的ドメインがＧＳリンカーなどのリンカー（ペプチド）を任意に含むことがあるとしても、ＧＳリンカーなどのリンカー（ペプチド）からならないことが好ましい。換言すれば、（追加の）機能的ドメインがＧＳリンカーなどのリンカー（ペプチド）を含む場合でも、２つのペプチドを互いに（純粋に）結合するのとは異なる機能を媒介する追加のアミノ酸配列を含むことが好ましい。したがって、（追加の）機能的ドメインは、ＧＳリンカーなどのリンカー（ペプチド）とは異なることが好ましい。特に、（追加の）機能的ドメインは、ＧＳリンカーなどのリンカー（ペプチド）を含まなくてもよい。一般に、（追加の）機能的ドメインによって提供される機能は、２つの（ポリ）ペプチドの単なる結合ではないことが好ましい。（追加の）機能的ドメインが、隣接する可変ドメインや定常ドメインなどの２つの（ポリ）ペプチドを「結合」し、任意に柔軟性を提供する場合でも、（追加の）機能的ドメインは、（ポリ）ペプチド結合と柔軟性とは異なる（追加の）機能を提供することが好ましい。

【0075】

好ましくは、第２のポリペプチド鎖は、（追加の）機能的ドメイン（ｖ）を含む。この場合、第１及び第２のポリペプチド鎖はいずれも（追加の）機能的ドメインを含み、それにより２つの異なる（別個の）（追加の）機能的ドメインを有する抗体又はその抗原結合断片をもたらす。第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインは、同一又は異なる、即ち、同一又は異なる機能的ドメインであり得る。換言すれば、第１及び第２のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインが同一のアミノ酸配列を有していても、それらの（追加の）機能的ドメインは「独立」している、即ち、それらは互いに独立して機能を媒介する。例えば、第１及び第２のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインは、別々の標的（例えば、別々の抗原又は同一抗原の別々のエピトープ；同一抗原の別々の分子又は別々の部分）に結合し、独立した結合部位のいずれも、その標的に結合するために、他を必要とすることも関与することもない。

【0076】

しかし、より好ましくは、第２のポリペプチド鎖が（追加の）機能的ドメイン（ｖ）を含まず、第２のポリペプチド鎖の最もＣ末端側の可変ドメインのＣ末端が第２のポリペプチド鎖の最もＮ末端側の定常ドメインのＮ末端に直接結合することが好ましい。例えば、第２のポリペプチド鎖が軽鎖である場合、最もＣ末端側のＶＬドメイン（又は唯一のＶＬドメイン）のＣ末端が、ＣＬドメインのＮ末端に直接結合されることが好ましい。例えば、第２のポリペプチド鎖が重鎖である場合、最もＣ末端側のＶＨドメイン（又は唯一のＶＨドメイン）のＣ末端が、ＣＨ１ドメインのＮ末端に直接結合することが好ましい。

【0077】

したがって、本発明はまた、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含む抗体又はその抗原結合断片であって、
前記第１のポリペプチド鎖が、ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）１つ以上の可変ドメイン；
（ｉｉ）（追加の）機能的ドメイン；及び
（ｉｉｉ）１つ以上の定常ドメインを含み、
前記第２のポリペプチド鎖が、ＮからＣ末端方向に、
（ｉｖ）第１のポリペプチド鎖の１つ以上の可変ドメインと抗原結合部位を形成する１つ以上の可変ドメイン；及び
（ｖ）１つ以上の定常ドメインを含み、
前記第２のポリペプチド鎖の最もＣ末端側の可変ドメインのＣ末端が、第２のポリペプチド鎖の最もＮ末端側の定常ドメインのＮ末端に直接結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0078】

繰り返しになるが、「機能的ドメイン」という用語は、例えば、前記した抗体又は抗原結合断片の機能的単位を意味する。簡単に言えば、機能的ドメインは、典型的にはタンパク質、例えば、抗体又は抗原結合断片に前記した（追加の）機能を提供する。したがって、（追加の）機能的ドメインは通常、（追加の）機能を提供するために必要な全てのアミノ酸／配列を含む。特に、第１のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメイン（ｉｉ）は、より詳細に前述したように、第２のポリペプチド鎖の断片を含まない。

【0079】

特に好ましくは、第１のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインは、前記のＩｇ様ドメインを含む又はからなる。Ｉｇ様ドメインの好ましい例は、前記したもの及び本明細書中の以下に記載するものを含む。

【0080】

また、好ましくは、第１のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインは、（知られた）タンパク質の細胞外及び／又は細胞内ドメインを含む又はからなる。更に、好ましくは、第１のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインは、（知られた）可溶性球状タンパク質のドメインを含む又はからなることができる。より好ましくは、第１のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインは、（知られた）タンパク質の細胞外ドメイン又は（知られた）可溶性球状タンパク質のドメインを含む又はからなる。

【0081】

好ましくは、第１のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインは、最大１０００個のアミノ酸、より好ましくは最大７５０個のアミノ酸、更により好ましくは最大５００個のアミノ酸、更により好ましくは最大４００個のアミノ酸、特に好ましくは最大３００個のアミノ酸、最も好ましくは最大２７５個又は２５０個のアミノ酸の長さを有する。更に、第１のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインは、５～１０００個のアミノ酸、より好ましくは１０～７５０個のアミノ酸、更により好ましくは２０～５００個のアミノ酸、更により好ましくは５０～４００個のアミノ酸、特に好ましくは７０～３００個のアミノ酸、最も好ましくは７５～２７５個又は１００～２５０個のアミノ酸の長さを有することが好ましい。

【0082】

また、第１のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインは、最大１５０ｋＤａ、より好ましくは最大１００ｋＤａ、更により好ましくは最大８０ｋＤａ、更により好ましくは最大７０ｋＤａ、特に好ましくは最大５０ｋＤａ、最も好ましくは最大３０又は２５ｋＤａのサイズを有することが好ましい。更に、第１のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインは、０．５ｋＤａ～１５０ｋＤａ、より好ましくは１ｋＤａ～１００ｋＤａ、更により好ましくは２．５ｋＤａ～８０ｋＤａ、更により好ましくは５ｋＤａ～７０ｋＤａ、特に好ましくは７．５ｋＤａ～５０ｋＤａ、最も好ましくは１０ｋＤａ～３０又は２５ｋＤａのサイズを有することが好ましい。

【0083】

第１のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインは、前記した単量体ドメイン又は多量体ドメインを含むことができる。更に、第１のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインは、前記したように、１つの単一のタンパク質ドメイン又は１超のタンパク質ドメインを含む又はからなることができる。

【0084】

好ましくは、（追加の）機能的ドメインは、ヒトタンパク質、ペプチド、若しくはポリペプチド、又はその断片（特に、ドメイン）若しくは誘導体である。

【0085】

特に、（追加の）機能的ドメインは、前記したように、ＧＳリンカーなどのリンカー（ペプチド）ではない。（追加の）機能的ドメインがＧＳリンカーなどのリンカー（ペプチド）を任意に含むことがあるとしても、ＧＳリンカーなどのリンカー（ペプチド）からならないことが好ましい。換言すれば、（追加の）機能的ドメインがＧＳリンカーなどのリンカー（ペプチド）を含む場合でも、２つのペプチドを互いに（純粋に）結合するのとは異なる機能を媒介する追加のアミノ酸配列を含むことが好ましい。したがって、（追加の）機能的ドメインは、ＧＳリンカーなどのリンカー（ペプチド）とは異なることが好ましい。特に、（追加の）機能的ドメインは、ＧＳリンカーなどのリンカー（ペプチド）を含まなくてもよい。一般に、（追加の）機能的ドメインによって提供される機能は、２つの（ポリ）ペプチドの単なる結合ではないことが好ましい。（追加の）機能的ドメインが、隣接する可変ドメインや定常ドメインなどの２つの（ポリ）ペプチドを「結合」し、任意に柔軟性を提供する場合でも、（追加の）機能的ドメインは、（ポリ）ペプチド結合と柔軟性とは異なる（追加の）機能を提供することが好ましい。

【0086】

更に、第２のポリペプチド鎖の最もＣ末端側の可変ドメインのＣ末端が第２のポリペプチド鎖の最もＮ末端側の定常ドメインのＮ末端に直接結合することが好ましい。例えば、第２のポリペプチド鎖が軽鎖である場合、最もＣ末端側のＶＬドメイン（又は唯一のＶＬドメイン）のＣ末端が、ＣＬドメインのＮ末端に直接結合されることが好ましい。例えば、第２のポリペプチド鎖が重鎖である場合、最もＣ末端側のＶＨドメイン（又は唯一のＶＨドメイン）のＣ末端が、ＣＨ１ドメインのＮ末端に直接結合することが好ましい。

【0087】

一般に、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片では、第１のポリペプチド鎖の１つ以上の定常ドメインが、少なくともＣＨ１定常ドメインを好ましくは含む重鎖定常ドメインであり、第２のポリペプチド鎖の定常ドメインが軽鎖定常ドメインＣＬであることが好ましい。より好ましくは、第１のポリペプチド鎖の１つ以上の定常ドメインが、少なくともＣＨ１定常ドメインを好ましくは含む重鎖定常ドメインであり、第１のポリペプチド鎖の１つ以上の可変ドメインが重鎖可変ドメインＶＨであり、第２のポリペプチド鎖の定常ドメインが軽鎖定常ドメインＣＬであり、第２のポリペプチド鎖の１つ以上の可変ドメインが軽鎖可変ドメインＶＬである。換言すれば、第１のポリペプチド鎖が重鎖である又は重鎖に由来し、第２のポリペプチド鎖が軽鎖である又は軽鎖に由来することが好ましい。特に好ましくは、第１のポリペプチド鎖の定常領域は、３つの定常ドメイン、即ち、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３（特に、ＮからＣ末端方向にＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）を含み、最も好ましくは、ＣＨ１とＣＨ２との間にヒンジ領域を含む。

【0088】

或いは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片において、第１のポリペプチド鎖の定常ドメインが軽鎖定常ドメインＣＬであり、第２のポリペプチド鎖の１つ以上の定常ドメインが、少なくともＣＨ１定常ドメインを好ましくは含む重鎖定常ドメインであることも好ましい。より好ましくは、第１のポリペプチド鎖の定常ドメインが軽鎖定常ドメインＣＬであり、第１のポリペプチド鎖の１つ以上の可変ドメインが軽鎖可変ドメインＶＬであり、第２のポリペプチド鎖の１つ以上の定常ドメインが、少なくともＣＨ１定常ドメインを好ましくは含む重鎖定常ドメインであり、第２のポリペプチド鎖の１つ以上の可変ドメインが重鎖可変ドメインＶＨである。換言すれば、第２のポリペプチド鎖が重鎖である又は重鎖に由来し、第１のポリペプチド鎖が軽鎖である又は軽鎖に由来することが好ましい。特に好ましくは、第２のポリペプチド鎖の定常領域は、３つの定常ドメイン、即ち、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３（特に、ＮからＣ末端方向にＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）を含み、最も好ましくは、ＣＨ１とＣＨ２との間にヒンジ領域を含む。

【0089】

更に、第１及び／又は第２のポリペプチド鎖において、（追加の）機能的ドメイン（及び／又は第２のポリペプチドが（追加の）機能的ドメインを含まない場合は可変領域）に直接隣接する定常ドメインがＦｃ領域に寄与しないことが好ましい。ネイティブな抗体では、可変ドメインに隣接する定常領域、ＣＨ１及びＣＬは、通常、Ｆｃ領域に寄与しない。したがって、１つのポリペプチド鎖（第１又は第２）がＣＨ１定常ドメインを含み、一方、他のポリペプチド鎖（第１又は第２の他方）がＣＬ定常ドメインを含むことが好ましい。

【0090】

好ましくは、重鎖定常ドメイン、特にＣＨ１、又は任意の他の重鎖定常ドメインは、以下のクラスから選択される：γ、α、μ、ε、及びδ；好ましくはγであり、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４である。

【0091】

更に、軽鎖定常ドメイン、特にＣＬは、以下のクラス：κ及びλから選択されることが好ましい。

【0092】

好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、組換え抗体又は抗原結合断片である。本明細書で使用するとき、「組換え」という用語は、組換え抗体又は抗体断片が天然には存在しないことを意味する。

【0093】

好ましくは、本発明に係る抗体又は抗原結合断片の第１のポリペプチド鎖の機能的ドメイン（ｉｉ）及び／又は第２のポリペプチド鎖の機能的ドメイン（ｖ）は、キャリアドメイン、レポータードメイン、タグ、局在化ドメイン、（独立した）結合部位、酵素又は酵素ドメイン、受容体又はその機能的断片、又はリガンド又はその機能的断片を含む又はからなる。

【0094】

好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の第１のポリペプチド鎖の機能的ドメイン（ｉｉ）及び／又は第２のポリペプチド鎖の機能的ドメイン（ｖ）は、酵素又はその酵素ドメインを含む又はからなる。「酵素」は、ポリペプチド又はタンパク質の触媒であり、即ち、酵素は典型的には化学反応を加速させる。酵素が作用し得る分子は基質と呼ばれ、酵素は基質を生成物として知られる異なる分子に変換する。細胞内のほぼ全ての代謝プロセスは、生命を維持するのに十分に早い速度で行われるために酵素を必要とする。好ましい酵素としては、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、溶解酵素、イソメラーゼ、及びリガーゼが挙げられる。二量体を形成する酵素の場合、第１及び／又は第２のポリペプチド鎖の機能的ドメインは、リンカーによって接続された２つの同一のドメインを含むことができる。例えば、酵素は、特定部位、例えば腫瘍でプロドラッグを活性化させるのに有用であることができる。好ましい酵素の例及びそのような酵素を含む抗体の使用は、Ａｎｄｒａｄｙ Ｃ， Ｓｈａｒｍａ ＳＫ， Ｃｈｅｓｔｅｒ ＫＡ； Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｅｎｚｙｍｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ； Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． ２０１１ Ｆｅｂ；３（２）：１９３－２１１ ａｎｄ ｉｎ Ｂｏａｄｏ ＲＪ１， Ｚｈａｎｇ Ｙ， Ｚｈａｎｇ Ｙ， Ｘｉａ ＣＦ， Ｗａｎｇ Ｙ， Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ ＷＭ； Ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｅｎｚｙｍｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ； Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ． ２００８ Ｆｅｂ １；９９（２）：４７５－８４に記載される。

【0095】

好ましい酵素は、デヒドロゲナーゼ、ルシフェラーゼ、ＤＭＳＯレダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、アミノプロパノールオキシドレダクターゼ、ジアセチルレダクターゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、プロパンジオール－リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ＋）、Ｄ－キシルロースレダクターゼ、Ｌ－キシルロースレダクターゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ、グルコースオキシダーゼ、Ｌ－グロノラクトンオキシダーゼ、チアミンオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ、ビリベルジンレダクターゼ、モノアミンオキシダーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、サルコシンオキシダーゼ、ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、尿酸オキシダーゼ、亜硫酸レダクターゼ、亜硫酸レダクターゼ、グルタチオンレダクターゼ、チオレドキシンレダクターゼ、亜硫酸酸化酵素、シトクロムｃオキシダーゼ、コエンザイムＱシトクロムｃレダクターゼ、カテコールオキシダーゼ、ラッカーゼ、シトクロムｃペルオキシダーゼ、カタラーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、甲状腺ペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、４－ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、レニラルシフェリン－２－モノオキシゲナーゼ、ウミホタルルシフェリン－２－モノオキシゲナーゼ、ホタルルシフェラーゼ、ホタルイカルシフェリン－２－モノオキシゲナーゼ、発光エビルシフェリン－２－モノオキシゲナーゼ、アロマターゼ、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、シトクロムＰ４５０オキシダーゼ、一酸化窒素ジオキシゲナーゼ、一酸化窒素シンターゼ、アロマターゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、チロシナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、セルロプラスミン、ニトロゲナーゼ、デヨージナーゼ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ、カテコール－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ＡＴＣａｓｅ、オルニチントランスカルバモイラーゼ、アミノレブリン酸シンターゼ、コリンアセチルトランスフェラーゼ、第ＸＩＩＩ因子、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、チアミナーゼ、アラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、酪酸キナーゼ、ヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、酸ヒドロラーゼ、ホスホリパーゼＡ、ホスホリパーゼＣ、アセチルコリンエステラーゼ、コリンエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ、ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１、ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、フルクトースビスホスファターゼ、ＣＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼタイプ５、ホスホリパーゼＤ、制限酵素タイプ１、制限酵素タイプ２、制限酵素タイプ３、制限酵素タイプ４、デオキシリボヌクレアーゼＩ、ＲＮａｓｅ Ｈ、リボヌクレアーゼ、アミラーゼ、スクラーゼ、キチナーゼ、リゾチーム、マルターゼ、ラクターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、アデノシルメチオニンヒドロラーゼ、Ｓ－アデノシル－Ｌ－ホモシステインヒドロラーゼ、アルケニルグリセロホスホコリンヒドロラーゼ、アルケニルグリセロホスホエタノールアミンヒドロラーゼ、コレステロール－５，６－オキシドヒドロラーゼ、ヘポキシリン－エポキシドヒドロラーゼ、イソコリスマターゼ、ロイコトリエン－Ａ４ヒドロラーゼ、リモネン－１，２－エポキシドヒドロラーゼ、ミクロソームエポキシドヒドロラーゼ、トランスエポキシコハク酸ヒドロラーゼ、アラニンアミノペプチダーゼ、アンギオテンシン変換酵素、セリンプロテアーゼ、キモトリプシン、トリプシン、トロンビン、第Ｘ因子、プラスミン、アクロシン、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、プロリルオリゴペプチダーゼ、第ＸＩ因子、エラスターゼ、第ＸＩＩ因子、プロテイナーゼＫ、組織プラスミノーゲン活性化因子、プロテインＣ、セパラーゼ、ペプシン、レンネット、レニン、トリプシノーゲン、プラスメプシン、マトリクスメタロプロテイナーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、ウレアーゼ、ベータラクタマーゼ、アルギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ、ニトリラーゼ、ヘリカーゼ、ＤｎａＢヘリカーゼ、ＲｅｃＱヘリカーゼ、ＡＴＰアーゼ、ＮａＫＡＴＰアーゼ、ＡＴＰシンターゼ、キヌレニナーゼ、ハロ酢酸デハロゲナーゼ、リアーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、ウリジン一リン酸シンテターゼ、芳香族－Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ、ルビスコ、炭酸脱水酵素、トリプトファンシンターゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、シスタチオニンガンマリアーゼ、シスタチオニンベータリアーゼ、ロイコトリエンＣ４シンターゼ、ジクロロメタンデヒロゲナーゼ、ハロヒドリンデハロゲナーゼ、アデニル酸シクラーゼ、グアニル酸シクラーゼ、アミノ酸ラセマーゼ：フェニルラニンラセマーゼ、セリンラセマーゼ、マンデル酸ラセマーゼ、ＵＤＰ－グルコース４－エピメラーゼ、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼ、ＦＫＢＰ：ＦＫＢＰ１Ａ、ＦＫＢＰ１Ｂ、ＦＫＢＰ２、ＦＫＢＰ３、ＦＫＢＰ５、ＦＫＢＰ６、ＦＫＢＰ８、ＦＫＢＰ９、ＦＫＢＰ１０、ＦＫＢＰ５２、ＦＫＢＰＬ、シクロフィリン、パルブリン、プロリルイソメラーゼ、２－クロロ－４－カルボキシメチレンブト－２－エン－１，４－オリドイソメラーゼ、ベータカロテンイソメラーゼ、ファルネソール２－イソメラーゼ、フリルフラミドイソメラーゼ、リノール酸イソメラーゼ、マレイン酸イソメラーゼ、マレイルアセト酢酸イソメラーゼ、マレイルピルビン酸イソメラーゼ、パルブリン、フォトイソメラーゼ、プロリコペンイソメラーゼ、プロリルイソメラーゼ、レチナールイソメラーゼ、レチノールイソメラーゼ、ゼータカロテンイソメラーゼ、エノイルＣｏＡイソメラーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ムコン酸シクロイソメラーゼ、３－カルボキシ－シス，シス－ムコン酸シクロイソメラーゼ、テトラヒドロキシプテリジンシクロイソメラーゼ、イノシトール－３－リン酸シンターゼ、カルボキシ－シス，シス－ムコン酸シクラーゼ、カルコンイソメラーゼ、クロロムコン酸シクロイソメラーゼ、（＋）－ボルニル二リン酸シンターゼ、シクロユーカレノールシクロイソメラーゼ、アルファピネンオキシドデシクラーゼ、ジクロロムコン酸シクロイソメラーゼ、コパリル二リン酸シンターゼ、Ｅｎｔ－コパリル二リン酸シンターゼ、Ｓｙｎ－コパリル二リン酸シンターゼ、テルペンテジエニル二リン酸シンターゼ、ハリマジエニル二リン酸シンターゼ（Ｈａｌｉｍａｄｉｅｎｙｌ－ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、（Ｓ）－ベータ－マクロカルペンシンターゼ、リコペンイプシロン－シクラーゼ、リコペンベータ－シクラーゼ、プロソラナピロン－ＩＩＩシクロイソメラーゼ、Ｄ－リボースピラナーゼ、ステロイドデルタイソメラーゼ、トポイソメラーゼ、６－カルボキシテトラヒドロプテリンシンターゼ、ＦＡＲＳＢ、グルタミンシンテターゼ、ＣＴＰシンターゼ、アルギニノコハク酸シンテターゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、及びＤＮＡリガーゼからなる群から選択される。

【0096】

より好ましい酵素は、カルボキシペプチダーゼ、β－ラクタマーゼ、シトシンデアミナーゼ、β－グルクロニダーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、グランザイムＢ、カスパーゼ、及びＲＮａｓｅ、例えばＨＰＲ（ヒト膵臓ＲＮａｓｅ、バルナーゼ、ウシ精液ＲＮａｓｅ、オンコナーゼ、ＲａｐＬＲ１、アンギオゲニン、ダイサー、ＤＩＳ３様エキソヌクレアーゼ２、ホスホジエステラーゼＥＬＡＣ ２、ＲＮａｓｅ ＨＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｔ２、及びｔＲＮＡスプライシングリボヌクレアーゼからなる群から選択することができる。

【0097】

酵素の機能的断片は、機能を媒介する能力を有する酵素の任意の断片であることができる。通常、このような断片は「ドメイン」と呼ばれる。したがって、酵素の機能的断片は、酵素の任意のドメインであることができる。好ましい例としては、前記の（例示された）酵素の機能的断片（例えば、ドメイン）が挙げられる。好ましくは、（追加の）機能的ドメインに含まれる酵素の機能的断片が酵素の触媒ドメインである。酵素の触媒ドメインは、その基質と相互作用して酵素反応を引き起こす酵素の領域である。例えば、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインは、以下の酵素のいずれかの触媒ドメインであることができる：カルボキシペプチダーゼ、β－ラクタマーゼ、シトシンデアミナーゼ、β－グルクロニダーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、グランザイムＢ、カスパーゼ、及びＨＰＲ（ヒト膵臓ＲＮａｓｅ、バルナーゼ、ウシ精液ＲＮａｓｅ、オンコナーゼ、ＲａｐＬＲ１、アンギオゲニン、ダイサー、ＤＩＳ３様エキソヌクレアーゼ２、ホスホジエステラーゼＥＬＡＣ ２、ＲＮａｓｅ ＨＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ｔ２、及びｔＲＮＡスプライシングリボヌクレアーゼ。

【0098】

好ましくは、本発明に係る抗体又は抗原結合断片の第１のポリペプチド鎖の機能的ドメイン（ｉｉ）及び／又は第２のポリペプチド鎖の機能的ドメイン（ｖ）は、キャリアドメインを含む又はからなる。本明細書で使用するとき、「キャリアドメイン」は、抗体の別分子へのコンジュゲーションを提供するアミノ酸配列を意味する。好ましい例において、キャリアドメインは、抗体又はその抗原結合断片の、例えば薬剤、造影剤、又はナノ粒子へのコンジュゲーションを提供する。一般に、本発明の文脈において有用であり得るコンジュゲートの好ましい例は、Ｗｕ， Ａ． Ｍ．， ａｎｄ Ｓｅｎｔｅｒ， Ｐ． Ｄ． （２００５） Ａｒｍｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３， １１３７－１１４６に記載される。

【0099】

例えば、抗体にコンジュゲートすることができる薬剤としては、Ｔｈｏｍａｓ Ａ， Ｔｅｉｃｈｅｒ ＢＡ， Ｈａｓｓａｎ Ｒ； Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ； Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ． ２０１６ Ｊｕｎ；１７（６）：ｅ２５４－６２． ｄｏｉ： １０．１０１６／Ｓ１４７０－２０４５（１６）３００３０－４に記載されるものなどの抗癌剤が挙げられる。例えば、抗体にコンジュゲートすることができる造影剤は、Ｓｔｅｖｅ Ｋｎｕｔｓｏｎ， Ｅｒｕｍ Ｒａｊａ， Ｒｙａｎ Ｂｏｍｇａｒｄｅｎ， Ｍａｒｉｅ Ｎｌｅｎｄ， Ａｏｓｈｕａｎｇ Ｃｈｅｎ， Ｒａｍａｓｗａｍｙ Ｋａｌｙａｎａｓｕｎｄａｒａｍ， ａｎｄ Ｓｕｒｂｈｉ Ｄｅｓａｉ； Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ； ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１６； １１（６）： ｅ０１５７７６２に記載される。そのような薬剤は、好ましくは細胞毒性剤である。本発明の抗体又は抗原結合断片にコンジュゲートすることができる薬剤の好ましい例としては、ドキソルビシン、トランケートされたシュードモナス外毒素Ａ、マイタンシノイドＤＭ１が挙げられる。

【0100】

本発明の抗体又は抗原結合断片にコンジュゲートすることができる造影剤の例としては、Ｓｃｈｕｂｅｒｔ Ｍ， Ｂｅｒｇｍａｎｎ Ｒ， Ｆｏｅｒｓｔｅｒ Ｃ， Ｓｉｈｖｅｒ Ｗ， Ｖｏｎｈｏｆｆ Ｓ， Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ Ｓ， Ｂｅｔｈｇｅ Ｌ， Ｗａｌｔｈｅｒ Ｍ， Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ Ｊ， Ｐｉｅｔｚｓｃｈ Ｊ， Ｓｔｅｉｎｂａｃｈ Ｊ， Ｐｉｅｔｚｓｃｈ ＨＪ； Ｎｏｖｅｌ Ｔｕｍｏｒ Ｐｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｌ－Ｃｏｎｆｉｇｕｒｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ； Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ． ２０１７ Ａｐｒ １９；２８（４）：１１７６－１１８８ ａｎｄ ｉｎ Ｂｈｕｓａｒｉ Ｐ， Ｖａｔｓａ Ｒ， Ｓｉｎｇｈ Ｇ^， Ｐａｒｍａｒ Ｍ， Ｂａｌ Ａ， Ｄｈａｗａｎ ＤＫ， Ｍｉｔｔａｌ ＢＲ， Ｓｈｕｋｌａ Ｊ； Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｕ－１７７－ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｆｏｒ ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ＨＥＲ２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ； Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ． ２０１７ Ｆｅｂ １５；１４０（４）：９３８－９４７に記載されるものなどの放射性同位体が挙げられる。放射性同位体の好ましい例としては、^９０Ｙ、^１３１Ｉ、及び^１７７Ｌｕが挙げられる。

【0101】

本発明の抗体又は抗原結合断片にコンジュゲートすることができる造影剤の更なる例としては、蛍光色素、量子ドット、及び酸化鉄が挙げられる。蛍光色素の例としては、レポータードメインとして以下に記載されるものが挙げられる。酸化鉄ナノ粒子の例は、Ｈｅｎｇｙｉ Ｘｕ， Ｚｏｒａｉｄａ Ｐ． Ａｇｕｉｌａｒ， Ｌｉｌｙ Ｙａｎｇ， Ｍｉｎ Ｋｕａｎｇ， Ｈｏｎｇｗｅｉ Ｄｕａｎ， Ｙｏｎｇｈｕａ Ｘｉｏｎｇ， Ｈｕａ Ｗｅｉ， ａｎｄ Ａｎｄｒｅｗ Ｗａｎｇ： Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｉｒｏｎ Ｏｘｉｄｅ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｆｒｅｓｈ Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ． ２０１１ Ｄｅｃ； ３２（３６）： ９７５８－９７６５に記載される。

【0102】

抗体コンジュゲート（即ち、他の分子にコンジュゲートされた抗体）は、当技術分野で知られている。特に、抗体にコンジュゲートされた分子は、切断可能又は非切断可能なリンカーによって抗体に連結することができる（例えば、Ｔｈｏｍａｓ Ｈ． Ｐｉｌｌｏｗ． Ｎｏｖｅｌ ｌｉｎｋｅｒｓ ａｎｄ ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｔｏ ｔｒｅａｔ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｔ Ｖｏｌ． ６， Ｎｏ． １， Ｆｅｂｒｕａｒｙ ３ｒｄ， ２０１７， ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．４１５５／ｐｐａ－２０１６－００３２； ｏｒ ｉｎ： Ｂｅｃｋ Ａ， Ｇｏｅｔｓｃｈ Ｌ， Ｄｕｍｏｎｔｅｔ Ｃ， Ｃｏｒｖａｉａ Ｎ． Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． ２０１７ Ｍａｙ；１６（５）：３１５－３３７に記載）。分子を抗体又は抗原結合断片に連結するために使用することができるそのようなリンカーの例は、例えば、ＥＰ２９２７２２７、及びＴｈｏｍａｓ Ｈ． Ｐｉｌｌｏｗ． Ｎｏｖｅｌ ｌｉｎｋｅｒｓ ａｎｄ ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｔｏ ｔｒｅａｔ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｔ Ｖｏｌ． ６， Ｎｏ． １， Ｆｅｂｒｕａｒｙ ３ｒｄ， ２０１７， ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．４１５５／ｐｐａ－２０１６－００３２に記載される。しかし、先行技術では、リンカーは、抗体のＩｇドメイン（即ち、抗体の可変及び／又は定常ドメイン）に直接結合し、これは抗体のＩｇドメインの機能を妨害する可能性がある。それを考慮して、本発明に係る抗体又は抗原結合断片の（追加の）機能的ドメインは、リンカーの抗体への付着に使用することができる。好ましいリンカーは、追加のシステイン又はリジンを含むようにエンジニアードされているという点で、「古典的な」リンカーとは異なる。好ましくは、キャリアドメインは、例えば、Ｌｉｎｋ ＡＪ， Ｍｏｃｋ ＭＬ， Ｔｉｒｒｅｌｌ ＤＡ． Ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００３ Ｄｅｃ；１４（６）：６０３－９に記載されているように、部位特異的コンジュゲーションに有用な１つ以上の非標準アミノ酸（ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）を含む。更に、キャリアドメインは、Ｄｅｎｎｌｅｒ Ｐ．， Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｅ．， Ｓｃｈｉｂｌｉ Ｒ． Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ： Ｆｒｏｍ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｄｅｆｉｎｅｄ ｒｅａｇｅｎｔｓ． Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． ２０１５；４：１９７－２２４のセクション６に記載されるように、後にコンジュゲーションに使用され得る特定のアミノ酸を修飾する特定の酵素（例えば、ホルミルグリシン生成酵素、ソルターゼ、及び／又はトランスグルタミナーゼ）によって認識されるように設計することができる。

【0103】

更なる好ましいキャリアドメインは、例えば、Ｐｉｃｈｉｃｈｅｒｏ ＭＥ： Ｐｒｏｔｅｉｎ ｃａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ： ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ， ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ， Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ２０１３ Ｄｅｃ；９（１２）：２５０５－２３に記載されるような、ジフテリア毒素、破傷風トキソイド（Ｔ）、髄膜炎菌外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、ジフテリアトキソイド（Ｄ）、及びインフルエンザタンパク質Ｄ（ＨｉＤ）の遺伝子組換え交差反応物質（ＣＲＭ）などの、コンジュゲーション用ドメインである。

【0104】

好ましくは、本発明に係る抗体又は抗原結合断片の第１のポリペプチド鎖の機能的ドメイン（ｉｉ）及び／又は第２のポリペプチド鎖の機能的ドメイン（ｖ）は、レポータードメインを含む又はからなる。レポータードメインは通常、レポーター遺伝子によってコードされる。レポータードメインは、（例えば、細胞、生物内において）その存在が容易に観察できるドメインである。レポータードメインは、例えば、ＧＦＰ／ＥＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質／強化緑色蛍光タンパク質）、ＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）、及びＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）、ルシフェラーゼなどの蛍光タンパク質、並びにベータガラクトシダーゼ及びペルオキシダーゼなどの酵素を含む。レポータードメインは、インビボ及びエクスビボアプローチに有用であり得る。例えば、蛍光タンパク質は、特定の波長の光で励起されると細胞に蛍光を発せさせ、ルシフェラーゼは、細胞に発光反応を触媒させ、ベータ－ガラクトシダーゼなどの酵素は、基質を着色産物に変換する。特定のレポーター及び望まれる特性データに応じて、レポーターを測定又は定量するいくつかの異なる方法がある。一般に、顕微鏡検査は、特に単一細胞レベルでのレポーター活性に関する空間的及び時間的情報の取得に有用である。フローサイトメーターは、大規模な細胞集団に亘るレポーター活性の分布を測定するのに最適である。プレートリーダーは、一般に、多くの異なるサンプルの経時的な集団平均測定に最適である。所定の基質と反応することができるベータガラクトシダーゼ及びペルオキシダーゼなどの酵素は、例えば腫瘍診断における、ヒトサンプルのエクスビボ染色に有用であり得る。

【0105】

好ましくは、レポータードメインは、ＧＦＰ／ＥＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ルシフェラーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、又はペルオキシダーゼをコードするアミノ酸配列を含む又はからなる。更に、以下に記載する蛍光タグは、レポータードメインとしても有用である。

【0106】

好ましくは、本発明に係る抗体又は抗原結合断片の第１のポリペプチド鎖の機能的ドメイン（ｉｉ）及び／又は第２のポリペプチド鎖の機能的ドメイン（ｖ）は、局在化ドメインを含む又はからなる。一般に、局在化ドメインは、例えば生物又は細胞のレベルで、タンパク質を特定の標的に向ける。局在化ドメインは、本発明に係る抗体又は抗原結合断片を、細胞の特定の物理的位置、例えば核、膜、ペリプラズム、細胞外への分泌、身体の特定の部分又は他の箇所に向けることができる。

【0107】

例えば、本発明に係る抗体又は抗原結合断片を細胞内に向けるために、（追加の）機能的ドメインは、細胞透過性ペプチドを含む又はからなることができる。「細胞透過性ペプチド」（「ＣＰＰ」、「タンパク質形質導入ドメイン」／「ＰＴＤ」とも呼ばれる）という用語は、一般に、原形質膜を介して異なるタイプのカーゴ分子を輸送し、さまざまな分子カーゴ（ナノサイズの粒子から小さな化学分子及びＤＮＡの大きな断片まで）の細胞取り込みを促進することができる短いペプチドを示すために使用される。細胞透過性ペプチドは、通常、リジン又はアルギニンなどの正に帯電したアミノ酸を高い相対存在量で有する、又は極性／帯電アミノ酸と非極性の疎水性アミノ酸の交互パターンを含む配列を有するアミノ酸組成を有する。これら２つのタイプの構造は、それぞれポリカチオン性又は両親媒性と呼ばれる。通常、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、細胞膜を通過して大部分の細胞種に侵入する能力を有する８～５０残基のペプチドである。或いは、それらは、天然タンパク質に存在するものとしてその起源を反映するタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）とも呼ばれる。ＦｒａｎｋｅｌとＰａｂｏは、ＧｒｅｅｎとＬｏｗｅｎｓｔｅｉｎと同時に、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－ＴＡＴ）に由来するトランス活性化転写活性化因子の細胞への形質導入能について記述した（Ｆｒａｎｋｅｌ， Ａ．Ｄ． ａｎｄ Ｃ．Ｏ． Ｐａｂｏ， Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ． Ｃｅｌｌ， １９８８． ５５（６）： ｐ． １１８９－９３）。１９９１年に、キイロショウジョウバエに由来するアンテナペディアホメオドメイン（ＤＮＡ結合ドメイン）の神経細胞への形質導入が記述された（Ｊｏｌｉｏｔ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｎｅｕｒａｌ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， １９９１． ８８（５）： ｐ． １８６４－８）。１９９４年に、ペネトラチンと呼ばれる最初の１６マーペプチドＣＰＰが、アンテナペディアのホメオドメインの３番目のヘリックスから特徴付けられ（Ｄｅｒｏｓｓｉ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｈｅｌｉｘ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， １９９４． ２６９（１４）： ｐ． １０４４４－５０）、その後、１９９８年に、タンパク質形質導入に必要なＴＡＴの最小ドメインが同定された（Ｖｉｖｅｓ， Ｅ．， Ｐ． Ｂｒｏｄｉｎ， ａｎｄ Ｂ． Ｌｅｂｌｅｕ， Ａ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ＨＩＶ－１ Ｔａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂａｓｉｃ ｄｏｍａｉｎ ｒａｐｉｄｌｙ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅｕｓ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， １９９７． ２７２（２５）： ｐ． １６０１０－７）。過去２０年に亘って、ウイルスタンパク質（例えば、ＶＰ２２）（Ｅｌｌｉｏｔｔ， Ｇ． ａｎｄ Ｐ． Ｏ’Ｈａｒｅ， Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｂｙ ａ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｃｅｌｌ， １９９７． ８８（２）： ｐ． ２２３－３３）を含む各種起源、又は毒液、例えばメリチン（Ｄｅｍｐｓｅｙ， Ｃ．Ｅ．， Ｔｈｅ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｅｌｉｔｔｉｎ ｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ， １９９０． １０３１（２）： ｐ． １４３－６１）、マストパラン（ｍａｓｔｏｐｏｒａｎ）（Ｋｏｎｎｏ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｅｕｍｅｎｉｎｅ ｍａｓｔｏｐａｒａｎ－ＡＦ （ＥＭＰ－ＡＦ）、孤立スズメバチ（オオフタオビドロバチ）の毒液中の新たなマスト細胞脱顆粒ペプチド（Ｔｏｘｉｃｏｎ， ２０００． ３８（１１）： ｐ． １５０５－１５）、マウロカルシン（Ｅｓｔｅｖｅ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｃｏｒｐｉｏｎ ｔｏｘｉｎ ｍａｕｒｏｃａｌｃｉｎｅ ｉｎｔｏ ｃｅｌｌｓ． Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｏｘｉｎ ｃｒｏｓｓｅｓ ｔｈｅ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２００５． ２８０（１３）： ｐ． １２８３３－９）、クロタミン（Ｎａｓｃｉｍｅｎｔｏ， Ｆ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｏｔａｍｉｎｅ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎｔｏ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２００７． ２８２（２９）： ｐ． ２１３４９－６０）又はブフォリン（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｕｆｏｒｉｎ ２． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００４． ４３（４９）： ｐ． １５６１０－６）に由来する数十のペプチドが報告された。ポリアルギニン（Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、及びＲ１２）（Ｆｕｔａｋｉ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｒｇｉｎｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ａｎ ａｂｕｎｄａｎｔ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｈａｖｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｓ ｃａｒｒｉｅｒｓ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２００１． ２７６（８）： ｐ． ５８３６－４０）又はトランスポータン（Ｐｏｏｇａ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ． ＦＡＳＥＢ Ｊ， １９９８． １２（１）： ｐ． ６７－７７）を含む合成ＣＰＰも設計された。前記したＣＰＰはいずれも、本発明に係る抗体又は抗原結合断片における細胞透過性ペプチドとして使用することができる。本発明に係る抗体又は抗原結合断片中の細胞透過性ペプチドとして使用することができる各種ＣＰＰが、レビュー：Ｍｉｌｌｅｔｔｉ， Ｆ．， Ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ： ｃｌａｓｓｅｓ， ｏｒｉｇｉｎ， ａｎｄ ｃｕｒｒｅｎｔ ｌａｎｄｓｃａｐｅ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ １７ （１５－１６）： ８５０－６０， ２０１２にも開示されている。

【0108】

本発明に係る抗体又は抗原結合断片において使用することができる局在化ドメインの他の例は、例えば、Ｆａｒｒｉｎｇｔｏｎ ＧＫ， Ｃａｒａｍ－Ｓａｌａｓ Ｎ， Ｈａｑｑａｎｉ ＡＳ， Ｂｒｕｎｅｔｔｅ Ｅ， Ｅｌｄｒｅｄｇｅ Ｊ， Ｐｅｐｉｎｓｋｙ Ｂ， Ａｎｔｏｇｎｅｔｔｉ Ｇ， Ｂａｕｍａｎｎ Ｅ， Ｄｉｎｇ Ｗ， Ｇａｒｂｅｒ Ｅ， Ｊｉａｎｇ Ｓ， Ｄｅｌａｎｅｙ Ｃ， Ｂｏｉｌｅａｕ Ｅ， Ｓｉｓｋ ＷＰ， Ｓｔａｎｉｍｉｒｏｖｉｃ ＤＢ． Ａ ｎｏｖｅｌ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ－ｃｒｏｓｓｉｎｇ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ． ＦＡＳＥＢ Ｊ． ２０１４ Ｎｏｖ；２８（１１）：４７６４－７８に記載される血液脳関門を通過するためのドメインである。

【0109】

局在化ドメインの更なる例は、核局在化ドメインである。核局在化ドメインは、タンパク質、特に本発明に係る抗体又は抗原結合断片を、細胞核に向ける。核局在化ドメインは、抗体又は抗原結合断片が転写因子の活性を遮断し、遺伝子発現を調節するのに有用であり得る。核局在化ドメインの好ましい例は、Ｋａｌｄｅｒｏｎ Ｄ， Ｒｏｂｅｒｔｓ ＢＬ， Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ＷＤ， Ｓｍｉｔｈ ＡＥ （１９８４） “Ａ ｓｈｏｒｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｂｌｅ ｔｏ ｓｐｅｃｉｆｙ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｔｉｏｎ” Ｃｅｌｌ ３９ （３ Ｐｔ ２）： ４９９－５０９ ａｎｄ ｉｎ Ｌｕｓｋ ＣＰ， Ｂｌｏｂｅｌ Ｇ， Ｋｉｎｇ ＭＣ （Ｍａｙ ２００７） “Ｈｉｇｈｗａｙ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｎｅｒ ｎｕｃｌｅａｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ： ｒｕｌｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｏａｄ” Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８ （５）： ４１４－２０に記載される。

【0110】

好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の第１のポリペプチド鎖の機能的ドメイン（ｉｉ）及び／又は第２のポリペプチド鎖の機能的ドメイン（ｖ）は、タグを含む又はからなる。より好ましくは、タグは、親和性タグ、可溶化タグ、クロマトグラフィータグ、エピトープタグ、又は蛍光タグである。

【0111】

タグは、組換えタンパク質にグラフトされたペプチド配列である。タグの例としては、アフィニティータグ、可溶化タグ、クロマトグラフィータグ、エピトープタグ、蛍光タグ、タンパク質タグが挙げられる。親和性タグを使用して、親和性技法を用いて粗生物源からタンパク質を精製することができる。親和性タグの例としては、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、及びグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が挙げられる。更なる例は、金属マトリックスに結合するポリ（Ｈｉｓ）タグである。特に大腸菌などのシャペロン欠乏種で発現する組換えタンパク質の場合には、タンパク質の適切なフォールディングを助け、沈殿を防ぐために、可溶化タグを使用することができる。可溶化タグの例としては、チオレドキシン（ＴＲＸ）及びポリ（ＮＡＮＰ）が挙げられる。クロマトグラフィータグを使用してタンパク質のクロマトグラフィー特性を変更し、特定の分離技法で異なる分解能を提供できる。クロマトグラフィータグは、多くの場合、ＦＬＡＧタグなどのポリアニオン性アミノ酸からなる。エピトープタグは、高親和性抗体を多くの異なる種で確実に産生できるので、選択される短いペプチド配列である。これらは通常、ウイルス遺伝子に由来し、高い免疫反応性を示す。エピトープタグとしては、Ｖ５タグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、及びＮＥタグが挙げられる。これらのタグは、ウエスタンブロット、免疫蛍光、免疫沈降実験に特に有用であるが、抗体精製にも使用できる。蛍光タグを使用して、タンパク質を視覚的に読み取ることができる。ＧＦＰとその変異体は、最も一般的に使用される蛍光タグである。ＧＦＰは、フォールディングレポーターとして使用できる（フォールディングされている場合は蛍光、そうでない場合は無色）。タンパク質タグは、特定の酵素修飾（例えば、ビオチンリガーゼによるビオチン化）又は化学修飾（例えば、蛍光イメージングのためのＦｌＡｓＨ－ＥＤＴ２との反応）を可能にする。例えば、タンパク質を複数の他のコンポーネントに結合させるために、タグを組み合わせることができる。タグは、化学物質又はタンパク質分解若しくはインテインスプライシングなどの酵素的手段によって除去可能であり得る。

【0112】

タグの好ましい例としては、限定されるものではないが、以下が挙げられる：：ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇ（ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ；配列番号２０）；ＡｖｉＴａｇ、酵素ＢｉｒＡによるビオチン化を可能にするペプチドであり、ストレプトアビジンによってタンパク質を単離できる（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ；配列番号２１）；カルモジュリンタグ、タンパク質カルモジュリンが結合したペプチド（ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ；配列番号２２）；ポリグルタミン酸タグ、Ｍｏｎｏ－Ｑなどのアニオン交換樹脂に効率的に結合するペプチド（ＥＥＥＥＥＥ；配列番号２３）；Ｅタグ、抗体によって認識されるペプチド（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ；配列番号２４）；ＦＬＡＧタグ、抗体によって認識されるペプチド（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号２５）；ＨＡタグ、抗体によって認識されるヘマトグルチニン由来のペプチド（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ；配列番号２６）；Ｈｉｓタグ、ニッケル又はコバルトキレートが結合した５～１０個のヒスチジン（ＨＨＨＨＨＨ；配列番号２７）；Ｍｙｃタグ、抗体によって認識されるｃ－ｍｙｃ由来のペプチド（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ；配列番号２８）；ＮＥタグ、モノクローナルＩｇＧ１抗体によって認識される１８アミノ酸合成ペプチド（ＴＫＥＮＰＲＳＮＱＥＥＳＹＤＤＮＥＳ；配列番号２９）、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、免疫沈降、及び組換えタンパク質のアフィニティ精製を含む幅広い用途に有用である；Ｓタグ、リボヌクレアーゼＡ由来のペプチド（ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ；配列番号３０）；ＳＢＰタグ、ストレプトアビジンに結合するペプチド（ＭＤＥＫＴＴＧＷＲＧＧＨＶＶＥＧＬＡＧＥＬＥＱＬＲＡＲＬＥＨＨＰＱＧＱＲＥＰ；配列番号３１）；Ｓｏｆｔａｇ １、哺乳類発現用（ＳＬＡＥＬＬＮＡＧＬＧＧＳ；配列番号３２）；Ｓｏｆｔａｇ ３、原核生物発現用（ＴＱＤＰＳＲＶＧ；配列番号３３）；Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ、ストレプトアビジン又はストレプトアクチンと呼ばれる修飾ストレプトアビジンに結合するペプチド（Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ ＩＩ：ＷＳＨＰＱＦＥＫ；配列番号３４）；ＴＣタグ、ＦｌＡｓＨ及びＲｅＡｓＨ二ヒ素化合物によって認識されるテトラシステインタグ（ＣＣＰＧＣＣ；配列番号３５）；Ｖ５タグ、抗体によって認識されるペプチド（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ；配列番号３６）；ＶＳＶタグ、抗体によって認識されるペプチド（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ；配列番号３７）；Ｘｐｒｅｓｓタグ（ＤＬＹＤＤＤＤＫ；配列番号３８）；イソペプタグ、ピリン－Ｃタンパク質に共有結合するペプチド（ＴＤＫＤＭＴＩＴＦＴＮＫＫＤＡＥ；配列番号３９）；ＳｐｙＴａｇ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質に共有結合するペプチド（ＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫ；配列番号４０）；ＳｎｏｏｐＴａｇ、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒタンパク質に共有結合するペプチド（ＫＬＧＤＩＥＦＩＫＶＮＫ；配列番号４１）；Ｔｙ１タグ（ＥＶＨＴＮＱＤＰＬＤ；配列番号４２）；ＢＣＣＰ（ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質）、ストレプトアビジンによる認識を可能にするＢｉｒＡによってビオチン化されるタンパク質ドメイン；グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、固定化グルタチオンに結合するタンパク質；緑色蛍光タンパク質タグ、自然に蛍光を発し、ナノボディが結合できるタンパク質；ＨａｌｏＴａｇ、反応性ハロアルカン基質に共有結合する変異細菌ハロアルカンデハロゲナーゼであり、広範囲の基質への結合が可能；マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、アミロースアガロースに結合するタンパク質；Ｎｕｓ（Ｎ－利用物質）タグ；チオレドキシン（Ｔｒｘ）タグ；肝蛭８ｋＤａ抗原（Ｆｈ８）タグ；小ユビキチン修飾（ＳＵＭＯ）タグ；溶解度向上ペプチド配列（ＳＥＴ）タグ；プロテインＧのＩｇＧドメインＢ１（ＧＢ１）タグ；プロテインＡ（ＺＺ）のＩｇＧリピートドメインＺＺタグ；溶解度向上ユビキタスタグ（ＳＮＵＴ）タグ；１７キロダルトンタンパク質（Ｓｋｐ）タグ；ファージＴ７プロテインキナーゼ（Ｔ７ＰＫ）タグ；大腸菌分泌プロテインＡ（ＥｓｐＡ）タグ；単量体バクテリオファージＴ７ ０．３タンパク質（Ｏｒｃタンパク質）／Ｍｏｃｒタグ；大腸菌トリプシン阻害剤（Ｅｃｏｔｉｎ）タグ；カルシウム結合タンパク質（ＣａＢＰ）タグ；ストレス応答性ヒ酸レダクターゼ（ＡｒｓＣ）タグ；翻訳開始因子ＩＦ２のＮ末端断片（ＩＦ２ドメインＩ）タグ；発現度タグ（翻訳開始因子ＩＦ２のＮ末端断片）；ストレス応答性タンパク質ＲｐｏＡ、ＳｌｙＤ、Ｔｓｆ、ＲｐｏＳ、ＰｏｔＤ、Ｃｒｒタグ；大腸菌酸性タンパク質ｍｓｙＢ、ｙｊｇＤ、ｒｐｏＤタグ（例えば、Ｃｏｓｔａ Ｓ， Ａｌｍｅｉｄａ Ａ， Ｃａｓｔｒｏ Ａ， Ｄｏｍｉｎｇｕｅｓ Ｌ． Ｆｕｓｉｏｎ ｔａｇｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ， ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ： ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ Ｆｈ８ ｓｙｓｔｅｍ． Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． ２０１４；５：６３， ｉｎ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ Ｔａｂｌｅ １ ｉｎ Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．， ２０１４参照）。

【0113】

したがって、タグは、配列番号２０～４２のいずれかに係るアミノ酸配列又はその配列変異体を含む又はからなることが好ましい。最も好ましくは、タグは、特に配列番号２０又は３４に係るＳｔｒｅｐタグである。

【0114】

好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の第１のポリペプチド鎖の機能的ドメイン（ｉｉ）及び／又は第２のポリペプチド鎖の機能的ドメイン（ｖ）は、受容体又はその機能的断片を含む又はからなる。「受容体」は、特定の（シグナル）分子、そのリガンドに結合し、例えば細胞内において、応答を開始することができるポリペプチド又はタンパク質である。天然には、受容体は、特に細胞膜上又は細胞膜内（細胞表面受容体）又は細胞内（細胞内受容体）に位置する。好ましい受容体は、イオンチャネル結合（イオンチャネル型）受容体、Ｇタンパク質結合（代謝型）ホルモン受容体、酵素結合ホルモン受容体、細胞質受容体、及び核受容体を含む。二量体を形成する受容体の場合、第１及び／又は第２のポリペプチド鎖の機能的ドメインは、リンカーによって接続された２つの同一のドメインを含むことができる。

【0115】

好ましい受容体は、Ｉｇ様ドメインを含む受容体である。特に、受容体は、Ｉｇ様ドメインを含む阻害剤受容体又はＩｇ様ドメインを含む活性化受容体であり得る。Ｉｇ様ドメインを含む阻害性受容体の好ましい例としては、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１又はＰＤ１）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有３（ＴＩＭ－３；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２（ＨＡＶＣＲ２）としても知られる）、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、細胞表面糖タンパク質ＣＤ２００受容体１（ＣＤ２００Ｒ１）、２Ｂ４（ＣＤ２４４；ＳＬＡＭＦ４）、Ｔｒｅｍ（ミエロイド細胞に発現するトリガー受容体）様転写物２（ＴＬＴ２）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー４（ＬＩＬＲＢ４）、及びキラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのＩｇドメイン及び長い細胞質テール２（ＫＩＲ２ＤＬ２）が挙げられる。Ｉｇ様ドメインを含む活性化受容体の好ましい例としては、誘導性Ｔ細胞ＣＯＳ刺激因子（ＩＣＯＳ）及びＣＤ２８が挙げられる。特に好ましくは、受容体は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１又はＰＤ１）又はシグナリングリンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）である。

【0116】

更なる好ましい受容体は、例えばＨｅａｎｅｙ ＭＬ， Ｇｏｌｄｅ ＤＷ． Ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ． １９９８ Ａｕｇ；６４（２）：１３５－４６に開示される可溶性受容体である。その例としては、ＴＮＦＲ（腫瘍壊死因子受容体）、ｐ５５、ｐ７５、Ｆａｓ（ＣＤ９５）、神経成長因子受容体、ＣＤ２７、ＣＤ３０、成長ホルモン受容体、ＧＭ－ＣＳＦ受容体、エリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）、トロンボポエチン受容体、Ｇ－ＣＳＦ受容体、ＩＬ－１ＲＩ（インターロイキン１受容体Ｉ）、ＩＬ－１ＲＩＩ（インターロイキン１受容体ＩＩ）、ＩＬ－２Ｒα（インターロイキン２受容体α、Ｔａｃ、ＣＤ２５）、ＩＬ－４Ｒ（インターロイキン４受容体）、ＩＬ－５Ｒα（インターロイキン５受容体α）、ＩＬ－７Ｒ（インターロイキン７受容体）、ＩＬ－６Ｒα（インターロイキン６受容体α）、ｇｐ１３０、ＣＮＴＦＲ（繊毛神経栄養因子受容体）、ＬＩＦＲ（白血病阻止因子受容体）、レプチン受容体、ＩＬ－１１Ｒ（インターロイキン１１受容体）、ＩＬ－１２ ｐ４０（インターロイキン１２受容体ｐ４０）、幹細胞因子受容体（ｃ－ｋｉｔ）、インターフェロン受容体、リポ多糖受容体（ＣＤ１４）、補体受容体Ｉ型（ＣＤ３５）、ヒアルロン酸受容体（ＣＤ４４）、ＣＤ５８、ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩＩ、ＣＤ２３）、ＩｇＧ受容体（ＦｃγＲＩＩ）、ＩＣＡＭ－１（ＣＤ５４）、ＩＣＡＭ－３（ＣＤ５０）、トランスフォーミング成長因子β受容体ＩＩＩ、表皮成長因子受容体（ｃ－ｅｒｂ Ｂ）、血管内皮成長因子受容体、血小板由来成長因子受容体、線維芽細胞成長因子、コロニー刺激因子－１受容体（ＭＣＦＲ、ｃ－ｆｍｓ）、ＡＲＫ（アドレナリン受容体キナーゼ）、Ｔｉｅ（アンジオポエチン受容体）、インスリン受容体、インスリン様成長因子－ＩＩ受容体、及びマンノース６－リン酸受容体が挙げられる。

【0117】

より好ましくは、可溶性受容体は、可溶性サイトカイン受容体であり、例えば、クラスＩサイトカイン受容体スーパーファミリー受容体、クラスＩＩサイトカイン受容体スーパーファミリー受容体、ＩＬ－１／ＴＬＲファミリー受容体、ＴＧＦ－β受容体ファミリー受容体、ＴＮＦＲスーパーファミリー受容体、又はＩＬ－１７Ｒなどである。クラスＩサイトカイン受容体スーパーファミリーの好ましい受容体は、ＩＬ－４Ｒα、ＩＬ－５Ｒα、ＩＬ－６Ｒα、ＩＬ－７Ｒα、ＩＬ－９Ｒα、ＥｐｏＲ、Ｇ－ＣＳＦＲ、ＧＭ－ＣＳＦＲα、ｇｐ１３０、及びＬＩＦＲαを含む。クラスＩＩサイトカイン受容体スーパーファミリーの好ましい受容体は、ＩＦＮＡＲ１及びＩＦＮＡＲ２αなどのＩ型ＩＦＮＲを含む。ＩＬ－１／ＴＬＲファミリーの好ましい受容体は、ＩＬ－１ＲＩＩ及びＩＬ－１ＲａｃＰを含む。ＴＧＦ－β受容体ファミリーの好ましい受容体は、ＴβＲ－１及びアクチビン受容体様キナーゼ７を含む。ＴＮＦＲスーパーファミリーの好ましい受容体は、ＴＮＦＲＳＦ６／Ｆａｓ／ＣＤ９５及びＴＮＦＲＳＦ９／４－１ＢＢ／ＣＤ１３７を含む。したがって、サイトカイン受容体の好ましい例としては、ＩＬ－４Ｒα、ＩＬ－５Ｒα、ＩＬ－６Ｒα、ＩＬ－７Ｒα、ＩＬ－９Ｒα、ＥｐｏＲ、Ｇ－ＣＳＦＲ、ＧＭ－ＣＳＦＲα、ｇｐ１３０、ＬＩＦＲα、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２α、ＩＬ－１ＲＩＩ、ＩＬ－１ＲａｃＰ、ＴβＲ－Ｉ、アクチビン受容体様キナーゼ７、ＴＮＦＲＳＦ６／Ｆａｓ／ＣＤ９５、ＴＮＦＲＳＦ９／４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、及びＩＬ－１７Ｒが挙げられる。そのような受容体又はその機能的断片を含む機能的ドメインを含む抗体又は抗原結合断片は、抗体がその標的に到達する間に炎症応答を調節することができる。例えば、主にさまざまな刺激に応答するタンパク質分解切断によって生成される可溶性ＩＩ型ＩＬ－１受容体（ｓＩＬ－１ＲＩＩ）は、ＩＬ－１βを優先的に結合することにより、過剰なＩＬ－１生物活性を減らすことができる。例えば、可溶性ＩＬ－１ＲＡｃＰは、外部ドメインの切断ではなく、選択的スプライシングによって生成されます。例えば、可溶性ＩＬ－６受容体は、膜ＩＬ－６Ｒと同様の親和性でＩＬ－６に結合し、それによりＩＬ－６の半減期を延長する。

【0118】

受容体の機能的断片は、機能を媒介する能力を有する受容体の任意の断片であり得る。通常、このような断片は「ドメイン」と呼ばれる。したがって、受容体の機能的断片は、受容体の任意のドメインであり得る。好ましい例としては、前記の（例示した）受容体の機能的断片（例えば、ドメイン）が挙げられる。好ましくは、（追加の）機能的ドメインに含まれる受容体の機能的断片は、受容体の細胞外ドメインである。例えば、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインは、以下の受容体のいずれかの細胞外ドメインであり得る：ＩＬ－４Ｒα、ＩＬ－５Ｒα、ＩＬ－６Ｒα、ＩＬ－７Ｒα、ＩＬ－９Ｒα、ＥｐｏＲ、Ｇ－ＣＳＦＲ、ＧＭ－ＣＳＦＲα、ｇｐ１３０、ＬＩＦＲα、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２α、ＩＬ－１ＲＩＩ、ＩＬ－１ＲａｃＰ、ＴβＲ－Ｉ、アクチビン受容体様キナーゼ７、ＴＮＦＲＳＦ６／Ｆａｓ／ＣＤ９５、ＴＮＦＲＳＦ９／４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＩＬ－１７Ｒ、ｐ５５、ｐ７５、神経成長因子受容体、ＣＤ２７、ＣＤ３０、成長ホルモン受容体、トロンボポエチン受容体、ＩＬ－１ＲＩ（インターロイキン１受容体Ｉ）、ＩＬ－２Ｒα（インターロイキン２受容体α、Ｔａｃ、ＣＤ２５）、ＣＮＴＦＲ（繊毛神経栄養因子受容体）、レプチン受容体、ＩＬ－１１Ｒ（インターロイキン１１受容体）、ＩＬ－１２ ｐ４０（インターロイキン１２受容体ｐ４０）、幹細胞因子受容体（ｃ－ｋｉｔ）、インターフェロン受容体、リポ多糖受容体（ＣＤ１４）、補体受容体Ｉ型（ＣＤ３５）、ヒアルロン酸受容体（ＣＤ４４）、ＣＤ５８、ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩＩ、ＣＤ２３）、ＩｇＧ受容体（ＦｃγＲＩＩ）、ＩＣＡＭ－１（ＣＤ５４）、ＩＣＡＭ－３（ＣＤ５０）、トランスフォーミング成長因子β受容体ＩＩＩ、上皮成長因子受容体（ｃ－ｅｒｂ Ｂ）、血管内皮成長因子受容体、血小板由来成長因子受容体、線維芽細胞成長因子、コロニー刺激因子－１受容体（ＭＣＦＲ、ｃ－ｆｍｓ）、ＡＲＫ（アドレナリン受容体キナーゼ）、Ｔｉｅ（アンジオポエチン受容体）、インスリン受容体、インスリン様成長因子－ＩＩ受容体、及びマンノース６－リン酸受容体。

【0119】

好ましくは、（追加の）機能的ドメインに含まれる受容体の機能的断片は、Ｉｇ様ドメインである。例えば、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインは、以下の受容体のいずれかのＩｇ様ドメインであり得る：ＰＤ１、ＳＬＡＭ、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２００Ｒ１、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＴＬＴ２、ＬＩＬＲＢ４、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＩＣＯＳ、又はＣＤ２８。好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の第１のポリペプチド鎖の機能的ドメイン（ｉｉ）及び／又は第２のポリペプチド鎖の機能的ドメイン（ｖ）は、膜貫通ドメインを含まない。最も好ましくは、受容体は、配列番号１３～１５のいずれかに記載のアミノ酸配列又はその機能的配列変異体を含む又はからなる。

【0120】

更に、国際公開第２０１６／２０７４０２Ａ１号に記載されるように、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖の機能的ドメインは、変異白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）断片を含む又はからなることが特に好ましい。配列番号１３に示される変異ＬＡＩＲ１断片、又は少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは９０％、特に好ましくは９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するその配列変異体が最も好ましい。

【0121】

特に好ましくは、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖の機能的ドメインは、配列番号１４又は配列番号１５に示されるアミノ酸配列などのＰＤ１又はＳＬＡＭのＩｇ様断片、又は少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するその配列変異体を含む又はからなる。

【0122】

好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の第１のポリペプチド鎖の機能的ドメイン（ｉｉ）及び／又は第２のポリペプチド鎖の機能的ドメイン（ｖ）は、リガンド又はその機能的断片を含む又はからなる。「リガンド」とは、タンパク質又は他の分子の特定部位に特異的に結合する分子である。本発明の文脈においては、リガンドはポリペプチド鎖に含まれるため、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質である。リガンドの結合は、特にイオン結合、水素結合、ファンデルワールス力などの分子間力によって生じる。リガンドの好ましい例としては、前記した受容体のいずれか、特に受容体ＰＤ１、ＳＬＡＭ、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２００Ｒ１、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＴＬＴ２、ＬＩＲＢ４、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＩＣＯＳ、又はＣＤ２８、例えば、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－１、Ｂ７－２、Ｂ７－Ｈ４（Ｂ７ホモログ）、ガレクチン－９、ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ）、ＯＸ－２膜糖タンパク質、ＣＤ４８、Ｂ７－Ｈ３（Ｂ７ホモログ）、ＭＨＣＩ、及びＩＣＯＳ－Ｌなどのいずれかのサイトカイン及びリガンドである。

【0123】

好ましくは、リガンドは、サイトカイン又はその機能的断片である。サイトカインは通常、細胞シグナル伝達に重要な小さなタンパク質（～約５～２０ｋＤａ）である。それらは細胞によって放出され、他の細胞の挙動に影響を及ぼし、放出する細胞自体の挙動に影響を及ぼす場合もある。サイトカインは、サイトカインのＳＩＳファミリー、サイトカインのＳＩＧファミリー、サイトカインのＳＣＹファミリー、血小板因子４スーパーファミリー及びインタークリンＣＣケモカインリガンド（ＣＣＬ）－１～－２８（特に、ＣＣＬ１２）、ＣＸＣＬ１～ＣＸＣＬ１７、ＸＣＬ１（リンホタクチン－α）及びＸＣＬ２（リンホタクチン－β）、フラクタルカイン（又はＣＸ_３ＣＬ１）などのケモカイン；Ｉ型ＩＦＮ、ＩＩ型ＩＦＮ、ＩＩＩ型ＩＦＮ、特にＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－ε、ＩＦＮ－κ、ＩＦＮ－ω、ＩＬ１０Ｒ２（ＣＲＦ２－４とも呼ばれる）及びＩＦＮＬＲ１（ＣＲＦ２－１２とも呼ばれる）などのインターフェロン；ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３４、ＩＬ－３５、及びＩＬ－３６などのインターロイキン；ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＧＭ－ＣＳＦ、インターフェロンガンマなどのリンホカイン；ＣＤ４０ＬＧ（ＴＮＦＳＦ５）などの腫瘍壊死因子；ＣＤ７０（ＴＮＦＳＦ７）；ＥＤＡ；ＦＡＳＬＧ（ＴＮＦＳＦ６）；ＬＴＡ（ＴＮＦＳＦ１）；ＬＴＢ（ＴＮＦＳＦ３）；ＴＮＦ、ＴＮＦα、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０Ｌ）；ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ１５３）；ＴＮＦＳＦ９；ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）；ＴＮＦＳＦ１１（ＲＡＮＫＬ）；ＴＮＦＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ）；ＴＮＦＳＦ１３；ＴＮＦＳＦ１３Ｂ；ＴＮＦＳＦ１４；ＴＮＦＳＦ１５；及びＴＮＦＳＦ１８；並びにＣＳＦ１（「マクロファージコロニー刺激因子」とも呼ばれる）、ＣＳＦ２（「顆粒球マクロファージコロニー刺激因子」とも呼ばれる；ＧＭ－ＣＳＦ及びサルグラモスチム）；ＣＳＦ３（「顆粒球コロニー刺激因子」としても知られる）；Ｇ－ＣＳＦ及びフィルグラスチム）、並びにプロメガポエチンなどの合成ＣＳＦなどのコロニー刺激因子から選択することができる。したがって、サイトカインの好ましい例としては、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３４、ＩＬ－３５、ＩＬ－３６、ＣＣＬ－１、ＣＣＬ－２、ＣＣＬ－３、ＣＣＬ－４、ＣＣＬ－５、ＣＣＬ－６、ＣＣＬ－７、ＣＣＬ－８、ＣＣＬ－９、ＣＣＬ－１０、ＣＣＬ－１１、ＣＣＬ－１２、ＣＣＬ－１３、ＣＣＬ－１４、ＣＣＬ－１５、ＣＣＬ－１６、ＣＣＬ－１７、ＣＣＬ－１８、ＣＣＬ－１９、ＣＣＬ－２０、ＣＣＬ－２１、ＣＣＬ－２２、ＣＣＬ－２３、ＣＣＬ－２４、ＣＣＬ－２５、ＣＣＬ－２６、ＣＣＬ－２７、ＣＣＬ－２８、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、フラクタルカイン、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－ε、ＩＦＮ－κ、ＩＦＮ－ω、ＩＬ１０Ｒ２、ＩＦＮＬＲ１、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＤ７０、ＥＤＡ、ＦＡＳＬＧ（ＴＮＦＳＦ６）、ＬＴＡ（ＴＮＦＳＦ１）、ＬＴＢ（ＴＮＦＳＦ３）、ＴＮＦα、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０Ｌ）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ１５３）、ＴＮＦＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１１（ＲＡＮＫＬ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ）、ＴＮＦＳＦ１３、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦＳＦ１８、ＣＳＦ１、ＣＳＦ２（ＧＭ－ＣＳＦ）、及びＣＳＦ３（Ｇ－ＣＳＦ）が挙げられる。サイトカインのより好ましい例としては、ＩＬ－２、ＩＬ６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、インターフェロン、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＴＮＦが挙げられる。サイトカインは、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、マスト細胞などの免疫細胞、内皮細胞、線維芽細胞、及び各種間質細胞などの広範囲に亘る細胞によって産生され、所定のサイトカインが１種超の細胞によって産生され得る。そのようなサイトカイン又はその機能的断片を含む機能的ドメインを含む抗体又は抗原結合断片は、選択されたサイトカインに応じて、炎症誘発性免疫刺激応答又は抗炎症性免疫抑制又は細胞傷害性応答を誘発し得る。

【0124】

他の好ましいリガンドは、例えば、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質であるホルモンを含む。ホルモンは、循環系によって輸送され、遠く離れた臓器を標的とし、特に生理学と挙動を調節するシグナル伝達分子である。ホルモンは通常、多細胞生物の腺によって産生される。特に好ましいホルモンは（ヒト）成長ホルモンである。ホルモンの更なる例としては、ＴＲＨ、バソプレシン、インスリン、プロラクチン、ＡＣＴＨ、オキシトシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、グルカゴン、ソマトスタチン、コレシストキニン、ガストリン、レプチン、アンギオテンシンＩＩ、塩基性線維芽細胞成長因子２、及び副甲状腺ホルモン関連タンパク質が挙げられる。

【0125】

リガンドの機能的断片は、機能を媒介する能力を有するリガンドの任意の断片であり得る。通常、このような断片は「ドメイン」と呼ばれる。したがって、リガンドの機能的断片は、リガンドの任意のドメインであり得る。好ましい例としては、前記の（例示した）リガンドの機能的断片（例えば、ドメイン）が挙げられる。好ましくは、（追加の）機能的ドメインに含まれるリガンドの機能的断片は、Ｉｇ様ドメインである。

【0126】

好ましくは、本発明に係る抗体又は抗原結合断片の第１のポリペプチド鎖の機能的ドメイン（ｉｉ）及び／又は第２のポリペプチド鎖の機能的ドメイン（ｖ）は、（独立した）結合部位を含む。したがって、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の第１及び／又は第２のポリペプチド鎖は、（独立した）結合部位を含むことが好ましい。

【0127】

一般に、「（独立した）結合部位」は、特に、化学結合、例えば非共有結合を形成することによって、特定の標的（例えば、分子及び／又はイオン）が結合できるポリペプチド鎖の領域である。非共有結合は、電子の密接な共有を伴わない比較的弱い化学結合である。複数の非共有結合は、しばしば高分子の立体構造を安定化し、分子間の高度に特異的な相互作用を媒介する。したがって、結合部位は、結合機能を提供する第１及び／又は第２のポリペプチド鎖の機能的ドメインである。特に、結合部位は、ＧＳリンカーなどのリンカーではない。結合部位は、ＧＳリンカーなどのリンカー（ペプチド）を任意に含んでもよいが、ＧＳリンカーなどのリンカー（ペプチド）からならないことが好ましい。換言すれば、結合部位がＧ－リンカーなどのリンカー（ペプチド）を含む場合でも、２つのペプチドを互いに（純粋に）結合することとは異なる機能を媒介する追加のアミノ酸配列を含むことが好ましい。したがって、結合部位は、ＧＳリンカーなどのリンカー（ペプチド）とは異なることが好ましい。特に、結合部位は、ＧＳリンカーなどのリンカー（ペプチド）を含まないことができる。リンカーは、通常、結合機能を提供しない。

【0128】

重要なことには、第一のポリペプチド鎖の（独立した）結合部位（ｉｉ）は、第２のポリペプチド鎖の断片を含まない。したがって、第２のポリペプチド鎖の任意の独立した結合部位（ｖ）は、第１のポリペプチド鎖の断片を含まない。換言すれば、第２のポリペプチド鎖（特に、その任意の断片（アミノ酸１個の場合も含む））は、第１のポリペプチド鎖の独立した結合部位に必要でもないし関与もしない。更に、第２のポリペプチド鎖も独立した結合部位を含む場合、第１のポリペプチド鎖（特に、その任意の断片（アミノ酸１個の場合も含む））は、第２のポリペプチド鎖の独立した結合部位に必要でもないし関与もしない。したがって、独立した結合部位は、第２のポリペプチド鎖の可変ドメインと共に第１のポリペプチド鎖の可変ドメインによって形成される抗原結合部位とは異なる。換言すれば、独立した結合部位は、２つの異なるポリペプチド鎖の可変ドメインによって形成される抗原結合部位とは異なる（ただし、以下に詳細に記載するように、関連する可変ドメインが単一のポリペプチド鎖上に位置する場合、独立した結合部位は、抗原結合部位を含むことがある）。

【0129】

好ましくは、（独立した）結合部位は、受容体及びその機能的断片、リガンド及びその機能的断片、ＣＤ分子及びその機能的断片、単鎖抗体及びその抗原結合断片、抗原及びその機能的断片、並びにタグからなる群から選択される。

【0130】

より好ましくは、（独立した）結合部位は、受容体又はその機能的断片を含む又はからなる。受容体は通常、（特定の）リガンドに結合できる。したがって、受容体は、（独立した）結合部位とも呼ばれる。様々な受容体が前述されており、その好ましい実施形態及び例が同様に適用される。

【0131】

結合部位の文脈において、受容体の機能的断片は、そのリガンドに結合する受容体の能力を保持する受容体の断片である。結合部位は受容体又はその機能的断片を含み得るので、それは、用語「機能的」が結合部位の文脈において言及する受容体の結合機能である。受容体の他の断片／ドメインは、（独立した）結合部位に含まれないことが好ましい場合がある。例えば、受容体は、受容体の結合機能に通常関与しない、したがって好ましくは（独立した）結合部位に含まれない１つ以上の膜貫通ドメインを含むことができる。したがって、（独立した）結合部位に含まれる受容体の断片は、（特に、受容体の更なるドメインなしに）単に受容体の結合部位であることが最も好ましい。

【0132】

また、（独立した）結合部位がリガンド又はその機能的断片を含む又はからなることもより好ましい。リガンドは通常、（特定の）受容体に結合することができる。

【0133】

したがって、リガンドは、（独立した）結合部位と呼ばれることもある。様々なリガンドが前述されており、その好ましい実施形態及び例が同様に適用される。

【0134】

結合部位の文脈において、リガンドの機能的断片は、リガンドの結合能を保持するリガンドの断片である。結合部位はリガンド又はその機能的断片を含み得るので、それは、用語「機能的」が結合部位の文脈において言及するリガンドの結合機能である。リガンドの他の断片／ドメインは、（独立した）結合部位に含まれないことが好ましい場合がある。したがって、（独立した）結合部位に含まれるリガンドの断片は、（特に、リガンドの更なるドメインなしに）単にリガンドの結合部位であることが最も好ましい。

【0135】

好ましくは、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖の（独立した）結合部位は、ＣＤ（表面抗原分類）分子又はその機能的断片である。ＣＤ（表面抗原分類）分子は細胞表面マーカーです。ＣＤ分子はしばしば受容体又はリガンドとして作用する又は細胞接着に関与する。ＣＤ命名法は、１９８２年に開始したＨＬＤＡ（ヒト白血球分化抗原）ワークショップを通して開発され、維持されている。本発明の文脈において結合部位として機能し得るＣＤ分子の例としては、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｈｕｍａｎ－ｃｄ－ｃｈａｒｔ．ｈｔｍ， ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ’ｓ “Ｈｕｍａｎ ａｎｄ Ｍｏｕｓｅ ＣＤ Ｍａｒｋｅｒ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｃｄ＿ｍａｒｋｅｒ＿ｈａｎｄｂｏｏｋ．ｐｄｆで取得可能）又はｗｗｗ．ｈｃｄｍ．ｏｒｇ．などの当業者に知られた様々なソースから取得できる。したがって、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖の（独立した）結合部位は、ＣＤマーカー又はその機能的断片、例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ’ｓ “Ｈｕｍａｎ ａｎｄ Ｍｏｕｓｅ ＣＤ Ｍａｒｋｅｒ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｃｄ＿ｍａｒｋｅｒ＿ｈａｎｄｂｏｏｋ．ｐｄｆで取得可能）又は適切な結合部位を選択できるように、典型的には、結合パートナーも示す他の「ＣＤマーカーチャート」のソースに記載される（ヒト）ＣＤマーカーであることができる。

【0136】

ＣＤ分子の機能的断片は、ＣＤ分子の結合能を保持するＣＤ分子の断片である。本発明の文脈において、結合部位は、ＣＤ分子又はその機能的断片を含むことができ、それは、用語「機能的」が言及するＣＤ分子の結合機能である。ＣＤ分子の他の断片／ドメインは、（独立した）結合部位に含まれないことが好ましい場合がある。したがって、（独立した）結合部位に含まれるＣＤ分子の断片は、（特に、ＣＤ分子の更なるドメインなしに）単にＣＤ分子の結合部位であることが最も好ましい。好ましくは、（独立した）結合部位に含まれるＣＤ分子の機能的断片は、Ｉｇ様ドメインである。

【0137】

好ましくは、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖の（独立した）結合部位は、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ又はＶＨＨ）又はその抗原結合断片である。また、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖の（独立した）結合部位は、抗原又はエピトープなどのその機能的断片であることが好ましい。

【0138】

好ましくは、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖の（独立した）結合部位は、単鎖抗体又はその抗原結合断片である。単鎖抗体は、単一のポリペプチド鎖からなる組換え抗体である。単鎖抗体の好ましい例としては、単ドメイン抗体、単鎖可変断片に基づく単鎖抗体（ｓｃＦｖ’ｓ）、及び単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）などの定常ドメインを有しない単鎖抗体、並びに単鎖Ｆａｂ断片（ｓｃＦａｂ；Ｈｕｓｔ Ｍ， Ｊｏｓｔｏｃｋ Ｔ， Ｍｅｎｚｅｌ Ｃ， Ｖｏｅｄｉｓｃｈ Ｂ， Ｍｏｈｒ Ａ， Ｂｒｅｎｎｅｉｓ Ｍ， Ｋｉｒｓｃｈ ＭＩ， Ｍｅｉｅｒ Ｄ， Ｄｕｅｂｅｌ Ｓ． Ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆａｂ （ｓｃＦａｂ） ｆｒａｇｍｅｎｔ． ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００７ Ｍａｒ ８；７：１４）などの定常ドメインを有する単鎖抗体が挙げられる。

【0139】

単鎖可変断片に基づく単鎖抗体（ｓｃＦｖ’ｓ）の好ましい例としては、ｓｃＦｖ（１つの単一ＶＨ及び１つの単一ＶＬドメイン）及びタンデムｓｃＦｖ’ｓ、例えば、タンデム－ジ－ｓｃＦｖ（ＢｉＴＥ）、タンデム－トリ－ｓｃＦｖ、及びタンデム－テトラ－ｓｃＦｖが挙げられる。

【0140】

単一ドメイン抗体（「ナノボディ」とも呼ばれる）は、１つの単一（単量体）可変ドメインのみを含む／からなる抗体断片である。抗体全体と同様に、単一ドメイン抗体は、特定の抗原に選択的に結合できる。最初の単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物に存在する重鎖抗体からエンジニアードされ、これらは、「ＶＨＨ」又は「ＶＨＨ断片」と呼ばれる。軟骨魚類も重鎖抗体（ＩｇＮＡＲ、「免疫グロブリン新規抗原受容体」）を有し、これから「ＶＮＡＲ」又は「ＶＮＡＲ断片」と呼ばれる単一ドメイン抗体を得ることができる。別のアプローチは、ヒト又はマウスからの一般的な免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の二量体可変ドメインを単量体に分割することである。したがって、単一ドメイン抗体は、重鎖又は軽鎖可変ドメイン（ＶＨ又はＶＬ）に由来し得る。単一ドメイン抗体の好ましい例としては、ＶＨＨ、ＶＮＡＲ、ＩｇＧ由来ＶＨ、及びＩｇＧ由来ＶＬを挙げられる。

【0141】

最も好ましくは、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖の機能的ドメインは、ＶＨＨ又はｓｃＦｖである。ＶＨＨの最も好ましい例は、Ｔ３－ＶＨＨ又はＦ４－ＶＨＨである。例えば、単一ドメイン抗体は、好ましくは、配列番号１６又は１８に示されるアミノ酸配列、又は少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは９０％、特に好ましくは９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するその配列変異体を含む又はからなる。ｓｃＦｖの最も好ましい例は、ＴＴ３９．７－ｓｃＦｖ又はＭＰＥ８－ｓｃＦｖである。例えば、単一ドメイン抗体は、好ましくは、配列番号１７又は１９に示されるアミノ酸配列、又は少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは９０％、特に好ましくは９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するその配列変異体を含む又はからなる。

【0142】

好ましくは、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖の（独立した）結合部位は、抗原又はその機能的断片、特にエピトープである。抗原は、分子、又は抗体が結合できる分子の一部である。抗原又はその機能的断片はポリペプチド鎖に含まれるので、本発明の文脈においては、結合部位が抗原又はその機能的断片である場合、前記抗原又はその機能的断片はペプチド又はポリペプチドであることが理解される。抗原は、典型的には、１つ以上のエピトープを含む。エピトープは、抗体によって結合される（抗体によって「認識される」）抗原の一部である。抗原の好ましい例としては、限定されるものではないが、血清タンパク質、例えば、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ９、及びＩＬ１３、生理活性ペプチド、細胞表面分子、例えば、受容体、輸送体、イオンチャネル、ウイルス及び細菌タンパク質、ＲＡＧＥ（終末糖化産物受容体）、ＧＰＶＩ、及びコラーゲンが挙げられる。

【0143】

抗原の機能的断片は、抗原の結合能を保持する抗原の断片である。したがって、抗原の断片は、好ましくはエピトープである、又は１つ以上のエピトープを含む。抗原の他の断片／ドメインは、（独立した）結合部位に含まれないことが好ましい場合がある。したがって、（独立した）結合部位に含まれる抗原の断片は、エピトープである又は（特に、抗原の更なるドメインなしに）１超のエピトープを含むことが最も好ましい。

【0144】

また、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖の（独立した）結合部位は、結合部位を含むタグであることも好ましい。大部分のタグは結合できる（例えば、親和性タグ）。したがって、別の分子に結合する能力を有するこれらのタグは、（独立した）結合部位と呼ばれることもある。結合部位を含むタグを含む様々なタグが前述されており、その好ましい実施形態及び例が同様に適用される。

【0145】

最も好ましくは、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインは、Ｉｇ様ドメイン、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ、又はＳｔｒｅｐタグである。特に、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖の（追加の）機能的ドメインは、好ましくは、配列番号１３～２０のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するその機能的配列変異体を含む又はからなる。

【0146】

好ましくは、第１のポリペプチド鎖が、（追加の）機能的ドメイン（ｉｉ）のＮ末端に１つの単一可変ドメイン（ｉ）を含み、第２のポリペプチド鎖が、任意の（追加の）機能的ドメイン（ｖ）のＮ末端又は１つ以上の定常ドメイン（ｖｉ）のＮ末端に１つの単一可変ドメイン（ｉｖ）を含み、第２のポリペプチド鎖の１つの単一可変ドメイン（ｉｖ）が、第１のポリペプチド鎖の可変ドメイン（ｉ）と抗原結合部位を形成する。本発明に係るそのような抗体及び抗原結合断片の好ましい例を、図１Ｂ及び図１Ｃに示す（図１Ｃの最下段パネルに示されるＤＶＤ－Ｉｇに基づく抗体を除く、図１Ｂ及び１Ｃの全てのフォーマット）。

【0147】

或いは、第１のポリペプチド鎖が、（追加の）機能的ドメイン（ｉｉ）のＮ末端に２つ以上の可変ドメイン（ｉ）を含むことができ、第２のポリペプチド鎖が、任意の（追加）機能的ドメイン（ｖ）のＮ末端又は１つ以上の定常ドメイン（ｖｉ）のＮ末端に２つ以上の可変ドメイン（ｉｖ）を含むことができ、第２のポリペプチド鎖の２つ以上の可変ドメイン（ｉｖ）が、第１のポリペプチド鎖の２つ以上の可変ドメイン（ｉ）と抗原結合部位を形成する。例えば、そのエルボー領域に（追加の）機能的ドメインが挿入される足場抗体は、例えば図１Ｃ、最下段パネル「ＤＶＤ－Ｉｇ」に示される、ＤＶＤ－Ｉｇフォーマットの二重特異性抗体であり得る。

【0148】

また、第１のポリペプチド鎖が、ｓｃＦｖなどの単鎖抗体又は単一ドメイン抗体、例えばＶＨＨを、最もＮ末端側の可変ドメイン（ｉ）のＮ末端及び／又は最もＣ末端側の定常ドメイン（ｉｉｉ）のＣ末端を含むことが好ましい。代替的に又は追加的に、第２のポリペプチド鎖は、ｓｃＦｖなどの単鎖抗体又は単一ドメイン抗体、例えばＶＨＨを、最もＮ末端側の可変ドメイン（ｉ）のＮ末端又は最もＣ末端側の定常ドメイン（ｖｉ）のＣ末端に含むことができる。その好ましい例は図１Ｃに示され、重鎖及び／又は軽鎖のエルボーに挿入された１つ以上の（追加の）機能的ドメインを有するｓｃＦｖ－（Ｈ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｈ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－（Ｌ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）－ｓｃＦｖ、Ｖ－（Ｈ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｈ）－Ｖ、Ｖ－（Ｌ）ＩｇＧ、及びＩｇＧ（Ｌ）－Ｖ抗体が挙げられる。

【0149】

好ましくは、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖はそれぞれ、１つの単一定常ドメイン、特にそれぞれＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインを含む。その好ましい例は図１Ｃに示さ、重鎖及び／又は軽鎖のエルボーに挿入された１つ以上の（追加の）機能的ドメインを有するＦ（ａｂ）_２及びＦａｂ抗体断片が挙げられる。

【0150】

或いは、第１のポリペプチド鎖又は第２のポリペプチド鎖が、１つの単一定常ドメイン、特にＣＬドメインを含み、第１のポリペプチド鎖又は第２のポリペプチド鎖の他方が、ＣＨ１ドメインと、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインなどの１つ以上の更なる定常ドメインとを含むことも好ましい。本発明に係るそのような抗体及び抗原結合断片の好ましい例を、図１Ｂ及び図１Ｃに示す（図１Ｃの上段パネルに示されるＦ（ａｂ）_２及びＦａｂに基づく抗体断片を除く、図１Ｂ及び図１Ｃの全てのフォーマット）。

【0151】

好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、Ｆｃ部分、特にＦｃ領域を含む。より好ましくは、Ｆｃ部分は、ヒト起源、例えば、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及び／又はＩｇＧ４に由来し、ヒトＩｇＧ１が特に好ましい。

【0152】

本明細書で使用するとき、「Ｆｃ部分」という用語は、パパイン切断部位（例えば、重鎖定常領域の最初の残基を１１４とすると、ネイティブのＩｇＧの残基２１６）のすぐ上流のヒンジ領域で始まり且つ免疫グロブリン重鎖のＣ末端で終わる免疫グロブリン重鎖の部分に由来する配列を意味する。したがって、Ｆｃ部分は、完全なＦｃ部分又はその一部（例えば、ドメイン）であり得る。完全なＦｃ部分は、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメイン（例えば、ＥＵアミノ酸位置２１６～４４６）を含む。追加のリジン残基（Ｋ）は、Ｆｃ部分のＣ末端に存在することがあるが、成熟抗体から切断されることが多い。Ｆｃ部分内の各アミノ酸位置は、当技術分野で認められているＫａｂａｔのＥＵナンバリングシステムにしたがって番号付けされる（例えば、Ｋａｂａｔらによる“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐｔ． Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， １９８３ ａｎｄ １９８７参照）。

【0153】

好ましくは、本発明の文脈において、Ｆｃ部分は、ヒンジ（例えば、上部、中間、及び／又は下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、又はその変異体、部分、又は断片の少なくとも１つを含む。好ましい実施形態では、Ｆｃ部分は、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、又はＣＨ３ドメインを含む。より好ましくは、Ｆｃ部分は完全なＦｃ部分である。Ｆｃ部分はまた、天然のＦｃ部分に対して、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、又は置換を含むことができる。例えば、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、又はＣＨ３ドメイン（又はその一部）の少なくとも１つが欠失されることができる。例えば、Ｆｃ部分は、（ｉ）ＣＨ２ドメイン（又はその一部）に融合したヒンジドメイン（又はその一部）、（ｉｉ）ＣＨ３ドメインに融合したヒンジドメイン（又はその一部）、（ｉｉｉ）ＣＨ３ドメイン（又はその一部）に融合したＣＨ２ドメイン（又はその一部）、（ｉｖ）ヒンジドメイン（又はその一部）、（ｖ）ＣＨ２ドメイン（又はその一部）、又は（ｖｉ）ＣＨ３ドメイン又はその一部を含む又はからなることができる。

【0154】

当業者は、天然のＦｃ部分によってもたらされる少なくとも１つの望ましい機能を保持しつつ、天然の免疫グロブリン分子の完全なＦｃ部分とアミノ酸配列が異なるようにＦｃ部分を改変できることを理解する。そのような機能は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能、プロテインＡ結合、プロテインＧ結合、及び補体結合を含む。そのような機能を司る及び／又はそれに必須である天然のＦｃ部分の部分は、当業者によく知られている。

【0155】

例えば、補体カスケードを活性化するために、Ｃ１ｑは、抗原標的に結合したＩｇＧ１の少なくとも２つの分子又はＩｇＭの１つの分子に結合する（Ｗａｒｄ， Ｅ． Ｓ．， ａｎｄ Ｇｈｅｔｉｅ， Ｖ．， Ｔｈｅｒ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２ （１９９５） ７７－９４）。Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．（Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２２ （１９８５） １６１－２０６）は、アミノ酸残基３１８～３３７を含む重鎖領域が補体固定に関与していることを記載した。Ｄｕｎｃａｎ，Ａ．Ｒ．及びＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．（Ｎａｔｕｒｅ ３３２（１９８８）７３８－７４０）は、部位特異的突然変異誘発を使用して、Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０、及びＬｙｓ３２２がＣ１ｑへの結合部位を形成することを報告した。Ｃ１ｑの結合におけるＧｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０、及びＬｙｓ３２２残基の役割は、これらの残基を含む短い合成ペプチドの補体媒介溶解を阻害する能力によって確認した。

【0156】

例えば、ＦｃＲ結合は、（抗体の）Ｆｃ部分と、造血細胞上の特殊な細胞表面受容体であるＦｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用によって媒介され得る。Ｆｃ受容体は免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、免疫複合体の食作用による抗体被覆病原体の除去、及び抗体依存性細胞媒介細胞傷害を介した、対応する抗体で被覆された赤血球及び様々な他の細胞標的（例えば、腫瘍細胞）の溶解の両方を媒介することが示されました（ＡＤＣＣ； Ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ， Ｊ． Ｇ．， ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｃ． Ｌ．， Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃ． Ｂｉｏｌ． ４９ （１９９１） ５１１－５２４）。ＦｃＲは、免疫グロブリンクラスに対する特異性によって定義され、ＩｇＧ抗体のＦｃ受容体はＦｃγＲ、ＩｇＥの場合はＦｃεＲ、ＩｇＡの場合はＦｃαＲなどと呼ばれ、新生児のＦｃ受容体はＦｃＲｎと呼ばれる。Ｆｃ受容体結合は、例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ， Ｊ． Ｖ．， ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ， Ｊ． Ｐ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９ （１９９１） ４５７－４９２； Ｃａｐｅｌ， Ｐ． Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４ （１９９４） ２５－３４； ｄｅ Ｈａａｓ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｌａｂ． Ｃｌｉｎ． Ｍｅｄ． １２６ （１９９５） ３３０－３４１； ａｎｄ Ｇｅｓｓｎｅｒ， Ｊ． Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ７６ （１９９８） ２３１－２４８に記載される。

【0157】

ネイティブＩｇＧ抗体のＦｃドメイン（ＦｃγＲ）による受容体の架橋は、食作用、抗体依存性細胞傷害、炎症性メディエーターの放出、免疫複合体のクリアランス、及び抗体産生の調節など、さまざまなエフェクタ機能を引き起こす。したがって、受容体の架橋を提供するＦｃ部分（ＦｃγＲ）が好ましい。ヒトにおいては、ＦｃγＲの３つのクラスが特徴付けられている：即ち、（ｉ）ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、単量体ＩｇＧに高い親和性で結合し、マクロファージ、単球、好中球、好酸球に発現する；（ｉｉ）ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、中程度から低い親和性で複合体化ＩｇＧに結合し、特に白血球で広く発現し、抗体媒介性免疫の中心的役割を果たすことが知られており、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、及びＦｃγＲＩＩＣに分けることができ、これらは、免疫系でさまざまな機能を果たしますが、ＩｇＧ－Ｆｃと同様の低親和性で結合し、これらの受容体の外部ドメインは高度に相同である；及び（ｉｉｉ）ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、中程度から低い親和性でＩｇＧに結合し、２つのタイプとして存在する：即ち、ＮＫ細胞、マクロファージ、好酸球、一部の単球、及びＴ細胞に存在し、好中球で高度に発現されるＡＤＣＣ及びＦｃγＲＩＩＩＢを媒介する。ＦｃγＲＩＩＡは、殺傷に関与する多くの細胞（マクロファージ、単球、好中球など）に存在し、殺傷プロセスを活性化可能と考えられる。ＦｃγＲＩＩＢは抑制プロセスに関与していると考えられ、Ｂ細胞、マクロファージ、マスト細胞、及び好酸球に存在する。

【0158】

ＦｃγＲＩ結合に関しては、ネイティブＩｇＧにおけるＥ２３３～Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、及びＰ３２９のうちの少なくとも１つを改変すると、ＦｃγＲＩへの結合が減少する。２３３位～２３６位におけるＩｇＧ２残基をＩｇＧ１及びＩｇＧ４に置換すると、ＦｃγＲＩへの結合が１０^３倍減少し、抗体感作赤血球に対するヒト単球応答が排除された（Ａｒｍｏｕｒ，Ｋ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（１９９９）２６１３－２６２４）。ＦｃγＲＩＩ結合に関しては、例えば、Ｅ２３３～Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｒ２９２、及びＫ４１４のうちの少なくとも１つのＩｇＧ突然変異について、ＦｃγＲＩＩＡの結合減少がみられる。ＦｃγＲＩＩＩ結合に関しては、例えば、Ｅ２３３～Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｓ２３９、Ｅ２６９、Ｅ２９３、Ｙ２９６、Ｖ３０３、Ａ３２７、Ｋ３３８、及びＤ３７６のうちの少なくとも１つの突然変異について、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合減少がみられる。Ｆｃ受容体についてのヒトＩｇＧ１における結合部位のマッピング、上述の突然変異部位、並びにＦｃγＩＲ及びＦｃγＲＩＩＡに対する結合を測定する方法は、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１－６６０４に記載されている。

【0159】

重要なＦｃγＲＩＩに対する結合に関しては、ネイティブＩｇＧ Ｆｃの２つの領域、即ち、（ｉ）ＩｇＧ Ｆｃの下方ヒンジ部位、特に、アミノ酸残基Ｌ、Ｌ、Ｇ、Ｇ（２３４～２３７、ＥＵ付番）、及び（ｉｉ）ＩｇＧ ＦｃのＣＨ２ドメインの隣接領域、特に、下方ヒンジ領域に隣接する上方ＣＨ２ドメイン、例えば、Ｐ３３１の領域におけるループ及び鎖は、ＦｃγＲＩＩ及びＩｇＧの相互作用にとって重要であると考えられる（Ｗｉｎｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；１６４：５３１３－５３１８）。更に、ＦｃγＲＩは、ＩｇＧ Ｆｃにおける同じ部位に結合すると考えられ、一方、ＦｃＲｎ及びプロテインＡは、ＩｇＧ Ｆｃにおける異なる部位（ＣＨ２－ＣＨ３界面であると考えられる）に結合する（Ｗｉｎｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；１６４：５３１３－５３１８）。

【0160】

例えば、Ｆｃ部分は、ＦｃＲｎの結合又は半減期の延長に必要であることが当技術分野において公知であるＦｃ部分の部分を少なくとも含んでいてもよく、又はからなっていてもよい。それに代えて又はそれに加えて、本発明の抗体のＦｃ部分は、プロテインＡの結合に必要であることが当技術分野において公知である部分を少なくとも含む、及び／又は本発明の抗体のＦｃ部分は、プロテインＧの結合に必要であることが当技術分野において公知であるＦｃｃ分子の一部を少なくとも含む。したがって、好ましいＦｃ部分は、ＦｃγＲの結合に必要であることが当技術分野において公知である部分を少なくとも含む。したがって、上に概説した通り、好ましいＦｃ部分は、（ｉ）ネイティブＩｇＧ Ｆｃの下方ヒンジ部位、特に、アミノ酸残基Ｌ、Ｌ、Ｇ、Ｇ（２３４～２３７、ＥＵ付番）、及び（ｉｉ）ネイティブＩｇＧ ＦｃのＣＨ２ドメインの隣接領域、特に、下方ヒンジ領域に隣接する上方ＣＨ２ドメイン、例えばＰ３３１の領域、例えば、ネイティブＩｇＧ Ｆｃのアミノ酸３２０～３４０（ＥＵ付番）等のＰ３３１周辺のネイティブＩｇＧ Ｆｃの上方ＣＨ２ドメインにおける少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個の連続するアミノ酸の領域におけるループ及び鎖を少なくとも含み得る。

【0161】

好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、Ｆｃ領域を含む。本明細書で使用するとき、用語「Ｆｃ領域」とは、抗体重鎖の２つ以上のＦｃ部分によって形成される免疫グロブリンの部分を指す。例えば、Ｆｃ領域は、単量体又は「単鎖」Ｆｃ領域（即ち、ｓｃＦｃ領域）であってよい。単鎖Ｆｃ領域は、（例えば、単一の連続する核酸配列にコードされている）単一のポリペプチド鎖内で結合しているＦｃ部分で構成される。例示的なｓｃＦｃ領域は、国際公開第２００８／１４３９５４Ａ２号に開示されている。好ましくは、Ｆｃ領域は、二量体Ｆｃ領域である。「二量体Ｆｃ領域」又は「ｄｃＦｃ」は、２つの別個の免疫グロブリン重鎖のＦｃ部分によって形成される二量体を指す。二量体Ｆｃ領域は、２つの同一のＦｃ部分のホモ二量体（例えば、天然免疫グロブリンのＦｃ領域）又は２つの非同一のＦｃ部分のヘテロ二量体であってよい。

【0162】

Ｆｃ領域のＦｃ部分は、同じ又は異なるクラス及び／又はサブクラスであってよい。例えば、Ｆｃ部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリン（例えば、ヒト免疫グロブリン）に由来していてよい。好ましくは、Ｆｃ領域のＦｃ部分は、同じクラス及びサブクラスである。しかし、Ｆｃ領域（又はＦｃ領域の１つ以上のＦｃ部分）はキメラであってもよく、キメラＦｃ領域は、異なる免疫グロブリンクラス及び／又はサブクラスに由来するＦｃ部分を含み得る。例えば、二量体又は単鎖Ｆｃ領域のＦｃ部分のうちの少なくとも２つは、異なる免疫グロブリンクラス及び／又はサブクラスに由来していてよい。それに加えて又はそれに代えて、キメラＦｃ領域は、１つ以上のキメラＦｃ部分を含み得る。例えば、キメラＦｃ領域又は部分は、第１のサブクラスの免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ３サブクラス）の免疫グロブリンに由来する１つ以上の部分を含み得るが、一方、Ｆｃ領域又は部分の残りは、異なるサブクラスである。例えば、ＦｃポリペプチドのＦｃ領域又は部分は、第１のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４サブクラス）の免疫グロブリンに由来するＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインと、第２のサブクラス（例えば、ＩｇＧ３サブクラス）の免疫グロブリンに由来するヒンジ領域とを含み得る。例えば、Ｆｃ領域又は部分は、第１のサブクラス（例えば、ＩｇＧ４サブクラス）の免疫グロブリンに由来するヒンジ及び／又はＣＨ２ドメインと、第２のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ３サブクラス）の免疫グロブリンに由来するＣＨ３ドメインとを含み得る。例えば、キメラＦｃ領域は、第１のサブクラス（例えば、ＩｇＧ４サブクラス）の免疫グロブリンに由来するＦｃ部分（例えば、完全Ｆｃ部分）と、第２のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ３サブクラス）の免疫グロブリンに由来するＦｃ部分とを含み得る。例えば、Ｆｃ領域又は部分は、ＩｇＧ４免疫グロブリンに由来するＣＨ２ドメインと、ＩｇＧ１免疫グロブリンに由来するＣＨ３ドメインとを含み得る。例えば、Ｆｃ領域又は部分は、ＩｇＧ４分子に由来するＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメインと、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ３ドメインとを含み得る。例えば、Ｆｃ領域又は部分は、抗体の特定のサブクラスに由来するＣＨ２ドメインの一部、例えば、ＣＨ２ドメインのＥＵ２９２位～３４０位を含み得る。例えば、Ｆｃ領域又は部分は、ＩｇＧ４部分に由来するＣＨ２の２９２位～３４０位のアミノ酸とＩｇＧ１部分に由来するＣＨ２の残りとを含み得る（或いは、ＣＨ２の２９２～３４０は、ＩｇＧ１部分に由来し、ＣＨ２の残りはＩｇＧ４部分に由来していてもよい）。

【0163】

更に、Ｆｃ領域又は部分は、（それに加えて又はそれに代えて）例えば、キメラヒンジ領域を含み得る。例えば、キメラヒンジは、例えば、一部はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４分子（例えば、上方及び下方の中央ヒンジ配列）に由来し得、一部はＩｇＧ３分子（例えば、中央ヒンジ配列）に由来し得る。別の例では、Ｆｃ領域又は部分は、一部がＩｇＧ１分子に由来し、一部がＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジを含み得る。別の例では、キメラヒンジは、ＩｇＧ４分子由来の上方及び下方ヒンジドメインと、ＩｇＧ１分子由来の中央ヒンジドメインとを含み得る。かかるキメラヒンジは、例えば、ＩｇＧ４ヒンジ領域の中央ヒンジドメインにおけるＥＵ２２８位にプロリン置換（Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ）を導入することによって作製され得る。別の実施形態では、キメラヒンジは、ＩｇＧ２抗体に由来するＥＵ２３３位～２３６位のアミノ酸及び／又はＳｅｒ２２８Ｐｒｏ突然変異を含み得、この場合、ヒンジの残りのアミノ酸は、ＩｇＧ４抗体由来である。本発明に係る抗体のＦｃ部分において用いることができるキメラヒンジは、米国特許出願第２００５／０１６３７８３Ａ１号明細書に記載されている。

【0164】

本発明では、Ｆｃ部分又はＦｃ領域は、ヒト免疫グロブリン配列に由来するアミノ酸配列（例えば、ヒトＩｇＧ分子由来のＦｃ領域又はＦｃ部分）を含む又はからなることが好ましい。しかし、ポリペプチドは、別の哺乳類種由来の１つ以上のアミノ酸を含み得る。例えば、霊長類Ｆｃ部分又は霊長類結合部位が被験体ポリペプチドに含まれていてもよい。或いは、１つ以上のマウスアミノ酸がＦｃ部分又はＦｃ領域に存在していてもよい。

【0165】

好ましくは、本発明に係る抗体は、特に上記Ｆｃ部分に加えて、定常領域、特にＩｇＧの定常領域、好ましくはＩｇＧ１の定常領域、より好ましくはヒトＩｇＧ１の定常領域に由来する他の部分を含む。より好ましくは、本発明に係る抗体は、特に上記Ｆｃ部分に加えて、定常領域の他の部分全て、特にＩｇＧの定常領域の他の部分全て、好ましくはＩｇＧ１の定常領域の他の部分全て、より好ましくはヒトＩｇＧ１の定常領域の他の部分全てを含む。

【0166】

定常領域の特に好ましい配列は、配列番号３、４、又は７に係るアミノ酸配列である。好ましくは、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１のＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３を含む又はからなり、特に、本明細書に記載の配列番号３に係るアミノ酸配列又はその機能的配列変異体を含む又はからなる。好ましくは、軽鎖定常領域は、ＩｇＧ１のＣＬを含む又はからなり、特に、本明細書に記載の配列番号４に係るアミノ酸配列又はその機能的配列変異体を含む又はからなる。

【0167】

また、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、Ｆｃ領域又はＦｃ部分を含まないことが好ましい。特に、エルボーに必要な定常ドメイン（ＣＨ１及びＣＬ）は、通常、Ｆｃ部分又はＦｃ領域に関与しない。したがって、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、好ましくは、Ｆｃ領域又はＦｃ部分を含まない。そのような抗体（又は抗体断片）の例としては、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ）_２（ＩＥＩ－Ｆａｂ又はＩＥＩ－Ｆ（ａｂ）_２）に基づくものが挙げられる。

【0168】

好ましくは、本発明に係る抗体又は抗原結合断片の第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖は、１つ以上のリンカーを含む。例えば、本発明に係る抗体又は抗原結合断片の第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のリンカーを含むことができる。より好ましくは、本発明に係る抗体又は抗原結合断片の第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖は、１つのリンカー又は２つのリンカーを含む。また、本発明に係る抗体又は抗原結合断片の第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖が、３つ又は４つのリンカーを含むことも好ましい。一般に、リンカーは、ポリペプチド鎖により高い柔軟性を提供し得る。好ましくは、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖は、定常領域と（追加の）機能的ドメインとの間にリンカーを含む。或いは、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖は、定常領域と（追加の）機能的ドメインとの間にリンカーを含まなくてもよい。第２のポリペプチドが（追加の）機能的ドメインを含まない場合、第２のポリペプチド鎖は、定常領域と可変領域との間にリンカーを含むことができる。或いは、第２のポリペプチド鎖は、定常領域と可変領域との間にリンカーを含まなくてもよい。好ましくは、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖は、（追加の）機能的ドメインと可変ドメイン、特に最もＣ末端側の可変ドメインとの間にリンカーを含む。或いは、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖は、（追加の）機能的ドメインと可変ドメイン、特に最もＣ末端側の可変ドメインとの間にリンカーを含まなくてもよい。第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖が１超の可変ドメインを含む場合、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖が可変ドメイン間に１つ以上のリンカーを含むことも好ましい。或いは、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖は、可変ドメイン間に１つ以上のリンカーを含まなくてもよい。より好ましくは、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖は、定常領域と（追加の）機能的ドメインとの間のリンカーと、（追加の）機能的ドメインと可変ドメイン、特に最もＣ末端側の可変ドメインとの間のリンカーとを含む。或いは、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖は、定常領域と（追加の）機能的ドメインとの間のリンカーも、（追加の）機能的ドメインと可変ドメイン、特に最もＣ末端側の可変ドメインとの間のリンカーも含まなくてもよい。更に、第１のポリペプチド鎖が、定常領域と（追加の）機能的ドメインとの間のリンカーと、（追加の）機能的ドメインと可変ドメイン、特に最もＣ末端側の可変ドメインとの間のリンカーを含むことができ、第２のポリペプチド鎖が、定常領域と可変領域との間に（追加の）機能的ドメインもリンカーも含まないことができる。また、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖が１超の可変ドメインを含む場合、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖が定常領域と（追加の）機能的ドメインとの間のリンカー；（追加の）機能的ドメインと可変ドメイン、特に最もＣ末端側の可変ドメインとの間のリンカー；及び可変ドメイン間の１つ以上のリンカーを含むことも好ましい。

【0169】

第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖が１超のリンカーを含む場合、これらのリンカーは、同一であっても異なっていてもよい。

【0170】

リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のアミノ酸などの最大２０個のアミノ酸からなることが好ましく、より好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸などの最大１５個のアミノ酸、より好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸などの最大１０個のアミノ酸、更により好ましくは、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸などの最大５個のアミノ酸からなる。リンカーは、隣接領域などの天然のアミノ酸配列、又は非天然アミノ酸配列に由来することができる。好ましくは、（追加の）機能的ドメインは、単一のエキソン又は１超のエキソンに対応し、リンカーのアミノ酸配列は、その単一のエキソン又は１超のエキソンに隣接するイントロン配列から取得される。例えば、（ｉ）可変領域と（追加の）機能的ドメイン（エキソン又はその配列変異体によってコードされる）との間のリンカーは、「（追加の）機能的ドメイン」として使用されるエキソン又はその配列変異体の（５’－３’方向の）直前の隣接するイントロン配列によってコードされ得る、及び／又は（ｉｉ）（追加の）機能的ドメイン（エキソン又はその配列変異体によってコードされる）と定常領域との間のリンカーは、「（追加の）機能的ドメイン」として使用されるエキソン又はその配列変異体の（５’－３’方向の）直前の隣接するイントロン配列によってコードされ得る。好ましくは、リンカーは、Ｃｙｓ（Ｃ）残基を含まない。好ましくは、リンカーは、１つ以上のグリシン（Ｇｌｙ）残基及び／又は１つ以上のセリン（Ｓｅｒ）残基（「ＧＳリンカー」）を含む又はからなる。ＧＳリンカーの好ましい例には、配列番号４３～４８に係るアミノ酸配列が挙げられ、最も好ましくは、リンカーは、配列番号４５で示される。イントロン配列リンカーの好ましい例としては、配列番号４９～５２に係るアミノ酸配列が挙げられる。最も好ましくは、リンカーは、配列番号４３～５２のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む又はからなる。

【0171】

例えば、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖は、（ＮからＣ末端方向に）配列番号４９に示されるリンカー又はその機能的配列変異体を含み、その直後に配列番号１４に示される（追加の）機能的ドメイン又はその機能的配列変異体を含むことができる。更に、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖は、（ＮからＣ末端方向に）配列番号１４に示される（追加の）機能的ドメイン又はその機能的配列変異体を含み、その直後に配列番号５０に示されるリンカー又はその機能的配列変異体を含むことができる。最も好ましくは、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖は、（ＮからＣ末端方向に）（可変ドメインと、その直接に）配列番号４９に示されるリンカー又はその機能的配列変異体、その直後に配列番号１４に示される（追加の）機能的ドメイン又はその機能的配列変異体、又は配列番号５０に示されるリンカー又はその機能的配列変異体（その直後に、定常ドメインが続く）を含む。

【0172】

例えば、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖は、（ＮからＣ末端方向に）配列番号５１に示されるリンカー又はその機能的配列変異体を含み、その直後に配列番号１５に示される（追加の）機能的ドメイン又はその機能的配列変異体を含むことができる。更に、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖は、（ＮからＣ末端方向に）配列番号１５に示される（追加の）機能的ドメイン又はその機能的配列変異体を含み、その直後に配列番号５２に示されるリンカー又はその機能的配列変異体を含むことができる。最も好ましくは、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖は、（ＮからＣ末端方向に）（可変ドメインと、その直接に）配列番号５１に示されるリンカー又はその機能的配列変異体、その直後に配列番号１５に示される（追加の）機能的ドメイン又はその機能的配列変異体、又は配列番号５２に示されるリンカー又はその機能的配列変異体（その直後に、定常ドメインが続く）を含む。

【0173】

或いは、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチドが、リンカーを含まないことも好ましい。

【0174】

好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の第１のポリペプチド鎖は、（ＮからＣ末端方向に）Ｖ－Ｄ－ＣＨ１を含む又はからなり、式中、
Ｖは、可変ドメイン（ｉ）であり、
Ｄは、（追加の）機能的ドメイン（ｉｉ）であり、
ＣＨ１は、ＣＨ１定常ドメイン（ｉｉｉ）である。

【0175】

ＶとＤ及び／又はＤとＣＨ１は、前記したようにリンカーを介して連結されてもよく、又は互いに直接連結されてもよい。

【0176】

より好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の第１のポリペプチド鎖は、（ＮからＣ末端方向に）Ｖ－Ｄ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３を含む又はからなり、式中、
Ｖ－Ｄ－ＣＨ１は、前記したとおりであり、
ＣＨ２とＣＨ３はそれぞれ、ＣＨ２定常ドメインとＣＨ３定常ドメインである。

【0177】

本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の第１のポリペプチド鎖は、（ＮからＣ末端方向に）（Ｖ）_Ａ－Ｄ－ＣＨ１を含む又はからなることも好ましく、Ｖ－Ｄ－ＣＨ１は、前記した通りであり、
Ａは、１～５、好ましくは１～４、より好ましくは１～３、更により好ましくは１又は２の整数であり、
可変ドメインＶは、直接又はリンカーを介して互いに結合されてもよい。

【0178】

好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の第２のポリペプチド鎖は、（ＮからＣ末端方向に）Ｖ－ＣＬを含む又はからなり、
Ｖは、可変ドメイン（ｉｖ）であり、
ＣＬは定常ドメイン（ｖｉ）である。
Ｖ及びＣＬは、前記したようにリンカーを介して連結されてもよく、又は互いに直接連結されてもよい。

【0179】

本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の第２のポリペプチド鎖は、（ＮからＣ末端方向に）（Ｖ）_Ａ－ＣＬを含む又はからなることも好ましく、式中、
Ｖ－ＣＬは、前記した通りであり、
Ａは、１～５、好ましくは１～４、より好ましくは１～３、更により好ましくは１又は２の整数であり、
可変ドメインＶは、直接又はリンカーを介して互いに結合されてもよい。

【0180】

例えば、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の第１のポリペプチド鎖の可変ドメイン（ｉ）は、配列番号１、５、８、又は１０のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するその機能的配列変異体を含む又はからなることができる。

【0181】

例えば、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の第２のポリペプチド鎖の可変ドメイン（ｉｖ）は、配列番号２、６、９、又は１１のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するその機能的配列変異体を含む又はからなることができる。

【0182】

好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、１つの単一又は２つの第１のポリペプチド鎖及び１つの単一又は２つの第２のポリペプチド鎖を含む。そのような抗体又はその抗原結合断片の例を、図１Ｂ及び図１Ｃに示す。また、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖がジスルフィド結合により連結され、それにより対を形成することも好ましい。特に、本発明に係る抗体の重鎖及び軽鎖、又はその抗原結合断片は、ジスルフィド結合により連結され、それにより対を形成することができる。更に、抗体又はその抗原結合断片は、２つの第１のポリペプチド鎖及び２つの第２のポリペプチド鎖を含み、２つの第１のポリペプチド鎖及び／又は２つの第２のポリペプチド鎖が、１つ以上の、例えば２つのジスルフィド結合によって連結されることも好ましい。特に、抗体又はその抗原結合断片の２つの重鎖は、１つ以上の、例えば２つのジスルフィド結合によって連結されてもよい。

【0183】

好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、各特異性／抗原について二価である。特に、（追加の）機能的ドメインは、（独立した）結合部位を含む又はからなり、（１）（独立した）結合部位と、（２）第１及び第２のポリペプチド鎖の第１の対の１つ以上の可変ドメインによって形成される抗原結合部位が、（１）（独立した）結合部位と、（２）第１及び第２のポリペプチド鎖の第２の対の１つ以上の可変ドメインによって形成される抗原結合部位に対応することが好ましい。或いは、抗体又はその抗原結合断片は、各特異性（抗原）について一価であり得る。

【0184】

したがって、第１及び第２のポリペプチド鎖の第１の対の１つ以上の可変ドメインによって形成される抗原結合部位と、第１及び第２のポリペプチド鎖の第２の対の１つ以上の可変ドメインによって形成される抗原結合部位は、同一又は異なることが好ましい。

【0185】

更に、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、同一又は異なってもよい少なくとも２つの（追加の）機能的ドメインを含むことが好ましい。例えば、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、２つ又は４つの（追加の）機能的ドメインを含むことができ、それらは同一又は異なってもよい。

【0186】

本発明に係る抗体又は抗原結合断片が、例えば同一又は異なるポリペプチド鎖に１超の（追加の）機能的ドメインを含む場合、（追加の）機能的ドメインは同一であっても異なってもよい。好ましくは、それらは機能的ドメインの同一又は異なるグループに属することができる。例えば、少なくとも２つ又は全ての（追加の）機能的ドメインは、（独立した）結合部位を含む又はからなることができる。例えば、少なくとも２つ又はすべての（追加の）機能的ドメインは、キャリアドメインを含む又はからなることができる。例えば、少なくとも２つ又はすべての（追加の）機能的ドメインは、レポータードメインを含む又はからなることができる。例えば、少なくとも２つ又はすべての（追加の）機能的ドメインは、タグを含む又はからなることができる。例えば、少なくとも２つ又はすべての（追加の）機能的ドメインは、局在化ドメインを含む又はからことができる。（追加の）機能的ドメインが機能的ドメインの同じグループに属している場合でも、サブグループ、特にそのアミノ酸配列は、同一又は異なってもよい。例えば、少なくとも２つ又はすべての（追加の）機能的ドメインは、同一のアミノ酸配列を含む又はからなることができる。或いは、（追加の）機能的ドメインが、機能的ドメインの異なるグループに属することも好ましい。例えば、１つの（追加の）機能的ドメインが（独立した）結合部位を含む又はからなることができ、一方、抗体又は抗原結合断片の別の（追加の）機能的ドメインがキャリアドメインを含む又はからなることができる。例えば、１つの（追加の）機能的ドメインが（独立した）結合部位を含む又はからなることができ、一方、抗体又は抗原結合断片の別の（追加の）機能的ドメインがレポータードメインを含む又はからなることができる。例えば、１つの（追加の）機能的ドメインが（独立した）結合部位を含む又はからなることができ、一方、抗体又は抗原結合断片の別の（追加の）機能的ドメインがタグを含む又はからなることができる。例えば、１つの（追加の）機能的ドメインが（独立した）結合部位を含む又はからなることができ、一方、抗体又は抗原結合断片の別の（追加の）機能的ドメインが局在化ドメインを含む又はからなることができる。例えば、１つの（追加の）機能的ドメインがキャリアドメインを含む又はからなることができ、一方、抗体又は抗原結合断片の別の（追加の）機能的ドメインがレポータードメインを含む又はからなることができる。例えば、１つの（追加の）機能的ドメインがキャリアドメインを含む又はからなることができ、一方、抗体又は抗原結合断片の別の（追加の）機能的ドメインがタグを含む又はからなることができる。例えば、１つの（追加の）機能的ドメインがキャリアドメインを含む又はからなることができ、一方、抗体又は抗原結合断片の別の（追加の）機能的ドメインが局在化ドメインを含む又はからなることができる。例えば、１つの（追加の）機能的ドメインがレポータードメインを含む又はからなることができ、一方、抗体又は抗原結合断片の別の（追加の）機能的ドメインがタグを含む又はからなることができる。例えば、１つの（追加の）機能的ドメインがレポータードメインを含む又はからなることができ、一方、抗体又は抗原結合断片の別の（追加の）機能的ドメインが局在化ドメインを含む又はからなることができる。例えば、１つの（追加の）機能的ドメインが局在化ドメインを含む又はからなることができ、一方、抗体又は抗原結合断片の別の（追加の）機能的ドメインがタグを含む又はからなることができる。

【0187】

更に、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、第１及び第２のポリペプチド鎖の第１及び第２の対を形成する２つの第１のポリペプチド鎖及び２つの第２のポリペプチド鎖を含み、第１及び第２のポリペプチド鎖の第１の対が少なくとも１つの（追加の）機能的ドメインを含む、及び／又は第１及び第２のポリペプチド鎖の第２の対が少なくとも１つの（追加の）機能的ドメインを含む。例えば、第１及び第２のポリペプチド鎖の第１の対が少なくとも１つの（追加の）機能的ドメインを含むことができ、一方、第１及び第２のポリペプチド鎖の第２の対は（追加の）機能的ドメインを含まないことができる。例えば、第１及び第２のポリペプチド鎖の第１対が（追加の）機能的ドメインを含まないことができ、一方、第１及び第２のポリペプチド鎖の第２対が少なくとも１つの（追加）機能的ドメインを含むことができる。最も好ましくは、第１及び第２のポリペプチド鎖の第１の対が少なくとも１つの（追加の）機能的ドメインを含み、且つ第１及び第２のポリペプチド鎖の第２の対が少なくとも１つの（追加の）機能的ドメインを含む。

【0188】

好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ様抗体、Ｆａｂ、又はＦ（ａｂ）_２に由来する。換言すれば、抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ様抗体、Ｆａｂ、又はＦ（ａｂ）_２の可変領域及び定常領域の全てを含む。特に、ＩｇＧ様抗体、Ｆａｂ、又はＦ（ａｂ）_２を、そのエルボー領域に（追加の）機能的ドメインが挿入される「足場」抗体として使用することができる。

【0189】

好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の２つ以上の可変ドメイン（ｉ）及び（ｉｖ）は、モノクローナル抗体に由来する。特に、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の２つ以上の可変ドメイン（ｉ）及び（ｉｖ）は、モノクローナル抗体の２つ以上の可変ドメインがである（に対応する）。

【0190】

また、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の可変ドメイン及び／又は定常ドメインは、ヒト又はヒト化されていることが好ましい。特に、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の可変ドメイン及び／又は定常ドメインは、ヒト又はヒト化抗体又はその抗原結合断片の可変ドメイン及び／又は定常ドメインに対応する。

【0191】

好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の（追加の）機能的ドメインは、ヒト又はヒト化されたアミノ酸配列を含む又はからなる。

【0192】

好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の第１のポリペプチド鎖が、配列番号５３、５５、５６、５８、５９、６０、６１、６２、６４、６５、６６、６８、６９、又は７０のいずれかに記載のアミノ酸配列、又は少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するその機能的配列変異体を含む又はからなる、及び／又は本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の第２のポリペプチド鎖が、配列番号５４、５７、６３、又は６７のいずれかに記載のアミノ酸配列、又は少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するその機能的配列変異体を含む又はからなる。

【0193】

好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の第１及び／又は第２のポリペプチド鎖が、配列番号７５～９２のいずれかに示されるアミノ酸配列を含まない又はからならないことができる。また、好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の第１及び／又は第２のポリペプチド鎖が、配列番号９６～１１２のいずれかに示されるアミノ酸配列を含まない又はからならないことができる。より好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の第１及び／又は第２のポリペプチド鎖が、配列番号７５～９５のいずれかに示されるアミノ酸配列を含まない又はからならないことができる。更により好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の第１及び／又は第２のポリペプチド鎖に含まれる（追加の）機能的ドメインが、配列番号１１３～１３０のいずれかに示されるアミノ酸配列を含まない又はからならないことができる。更により好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の第１及び／又は第２のポリペプチド鎖に含まれる（追加の）機能的ドメインが、配列番号１１３～１３３のいずれかに示されるアミノ酸配列を含まない又はからならないことができる。最も好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の第１及び／又は第２のポリペプチド鎖が、配列番号７５～１３３のいずれかに示されるアミノ酸配列を含まない又はからならないことができる。任意に、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の第１及び／又は第２のポリペプチド鎖に含まれる（追加の）機能的ドメインが、（変異）ＬＡＩＲ１断片を含まない又はからならないことができる。

【0194】

核酸分子
別の態様では、本発明はまた、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の第１のポリペプチド鎖をコードする第１のポリヌクレオチド、及び／又は本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の第２のポリペプチド鎖をコードする第２のポリペプチドを含む核酸分子を提供する。

【0195】

核酸分子は、核酸成分を含む、好ましくは核酸成分からなる分子である。核酸分子という用語は、好ましくは、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を意味する。特に、それは用語「ポリヌクレオチド」と同義に使用される。好ましくは、核酸分子は、糖／リン酸骨格のホスホジエステル結合によって互いに共有結合しているヌクレオチドモノマーを含むか又はそれらからなるポリマーである。「核酸分子」という用語は、塩基修飾、糖修飾、又は骨格修飾などされたＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子などの修飾核酸分子も包含する。

【0196】

好ましくは、核酸分子は、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子である。核酸分子及び／又はポリヌクレオチドの例としては、例えば、組換えポリヌクレオチド、ベクター、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ分子（例えば、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｔＲＮＡ）、又はＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ）が挙げられる。第１及び／又は第２のポリペプチド鎖の一部又はすべてをコードする核酸配列が好ましい。したがって、好ましくは、本発明の例示的な抗体又は抗原結合断片の軽鎖及び重鎖の一部又はすべて、特にＶＨ及びＶＬ配列及び／又は（追加の）機能的ドメインをコードする核酸配列が本明細書に提供される。

【0197】

本発明に係る核酸分子はまた、本発明に係る（例示的な）抗体又はその抗原結合断片において使用される（追加の）機能的ドメイン、ＶＨ配列及び／又はＶＬ配列をコードする核酸と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含むことが好ましい。

【0198】

一般に、核酸分子は、特定の核酸配列を挿入、欠失、又は変更するよう操作することができる。そのような操作による変更には、制限部位の導入、コドン使用の修正、転写及び／又は翻訳調節配列の付加又は最適化などの変更が含まれるが、これに限定されない。核酸を変更してコードされているアミノ酸を変えることもできる。例えば、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を抗体のアミノ酸配列に導入することが有用であり得る。このような点突然変異は、エフェクタ機能、抗原結合親和性、翻訳後修飾、免疫原性などを改変することができ、共有結合基（例えば、標識）の結合のためにアミノ酸を導入したり、タグ（例えば、精製目的のために）を導入することができる。突然変異は、特定の部位に導入することができる、又はランダムに導入することができ、その後、選択（例えば、分子進化）を行うことができる。例えば、本発明の（例示的な）抗体の（追加の）機能的ドメイン、ＶＨ配列、及び／又はＶＬ配列のいずれかをコードする１つ以上の核酸は、コードされたアミノ酸に異なる性質を導入するように、ランダム又は指向的に突然変異させることができる。このような変化は、初期変化が保持され、他のヌクレオチド位置での新しい変化が導入される反復プロセスの結果であり得る。更に、独立したステップで達成される変化を組み合わせることができる。コードされたアミノ酸に導入される異なる特性は、増強された親和性を含み得るが、これに限定されない。

【0199】

ベクター
更に、本発明に係る核酸分子を含むベクター、例えば発現ベクターを提供も本発明の範囲に含まれる。好ましくは、ベクターは、前記の核酸分子を含む。

【0200】

「ベクター」という用語は、核酸分子、好ましくは組換え核酸分子、即ち、天然には存在しない核酸分子を意味する。本発明の文脈におけるベクターは、所望の核酸配列を組み込む又は含むことに適している。そのようなベクターは、保存ベクター、発現ベクター、クローニングベクター、移入ベクターなどであることができる。保存ベクターは、核酸分子の便利な保存を可能にするベクターである。したがって、ベクターは、例えば、本発明に係る所望の抗体又はその抗体断片に対応する配列を含み得る。発現ベクターは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質などの発現産物の産生に使用することができる。例えば、発現ベクターは、プロモーター配列などのベクターの配列範囲の転写に必要な配列を含むことができる。クローニングベクターは、典型的には、ベクターに核酸配列を組み込むために使用することができるクローニング部位を含むベクターである。クローニングベクターは、例えば、プラスミドベクター又はバクテリオファージベクターであることができる。移入ベクターは、核酸分子を細胞又は生物に移入するのに適したベクター、例えばウイルスベクターであることができる。本発明の文脈におけるベクターは、例えば、ＲＮＡベクター又はＤＮＡベクターであることができる。好ましくは、ベクターはＤＮＡ分子である。例えば、本願の意味におけるベクターは、クローニング部位、抗生物質耐性因子などの選択マーカー、及び複製起点などのベクターの増殖に適した配列を含む。好ましくは、本願の文脈におけるベクターはプラスミドベクターである。

【0201】

細胞
更なる態様では、本発明は、また、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片を発現する、及び／又は本発明に係る核酸分子又はベクターを含む細胞を提供する。

【0202】

そのような細胞の例としては、酵母細胞、動物細胞、又は植物細胞などの真核細胞が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、細胞は哺乳類細胞、より好ましくは哺乳動物細胞系である。好ましい例としては、ヒト細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＮＳ０細胞、ヒト肝細胞、骨髄腫細胞、又はハイブリドーマ細胞が挙げられる。

【0203】

特に、細胞は、好ましくは発現ベクターを用いて、本発明に係るベクターでトランスフェクトすることができる。「トランスフェクション」という用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）分子などの核酸分子を細胞、好ましくは真核細胞に導入することを意味する。本発明の文脈において、用語「トランスフェクション」は、核酸分子を細胞、好ましくは真核細胞、例えば哺乳動物細胞に導入するための当業者に公知の任意の方法を包含する。そのような方法には、例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、例えば、リン酸カルシウム沈殿、ナノ粒子に基づくトランスフェクション、ウイルスに基づくトランスフェクション、又はＤＥＡＥ－デキストラン又はポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーに基づくトランスフェクションを含む。好ましくは、導入は非ウイルス性である。

【0204】

更に、本発明の細胞は、例えば本発明に係る抗体又はその抗原結合断片を発現させるために、本発明に係るベクターで安定的又は一過的にトランスフェクトすることができる。好ましくは、細胞は、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片コードする本発明に係るベクターで安定的にトランスフェクトされる。或いは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片をコードする本発明に係るベクターで細胞に一過的にトランスフェクトすることも好ましい。

【0205】

組成物
本発明はまた、以下のうちの１つ以上を含む組成物を提供する。
（ｉ）本発明に係る抗体又はその抗体断片；
（ｉｉ）本発明に係る核酸分子；
（ｉｉｉ）本発明に係る核酸を含むベクター；及び／又は
（ｉｖ）本発明に係る抗体を発現する、又は本発明に係るベクター又は核酸分子を含む細胞。

【0206】

換言すれば、本発明はまた、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、及び／又は本発明に係る細胞を含む組成物を提供する。

【0207】

好ましくは、前記組成物は、医薬組成物である。医薬組成物は、好ましくは、薬学的に許容し得る担体、希釈剤、及び／又は賦形剤を含有していてもよい。担体又は賦形剤は投与を容易にすることができるが、好ましくは、それ自体が、組成物を摂取する個体にとって有害な抗体の産生を誘導してはならない。また、毒性であってもならない。好適な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、及び不活性ウイルス粒子等の、大きく、ゆっくりと代謝される巨大分子であってよい。一般的に、本発明に係る医薬組成物中の薬学的に許容し得る担体は、活性成分であっても不活性成分であってもよい。

【0208】

薬学的に許容し得る塩、例えば、鉱酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素塩、リン酸塩、及び硫酸塩）又は有機酸の塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、及び安息香酸塩）を用いてもよい。

【0209】

医薬組成物中の薬学的に許容し得る担体は、水、生理食塩水、グリセロール、及びエタノール等の液体を更に含有していてもよい。更に、湿潤剤若しくは乳化剤等の補助物質、又はｐＨ緩衝物質がかかる組成物中に存在していてもよい。かかる担体によって、被験体に服用させるために、医薬組成物を錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、及び懸濁剤として製剤化することができるようになる。

【0210】

本発明の医薬組成物は、様々な形態で調製することができる。例えば、前記組成物は、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして、注射液として調製してよい。注射する前に液体ビヒクルの溶液又は懸濁液にするのに好適な固体形態を調製してもよい（例えば、保存剤を含有する滅菌水で再構成するための、Ｓｙｎａｇｉｓ（商標）及びＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）と同様の凍結乾燥組成物）。前記組成物は、例えば軟膏剤、クリーム剤、又は粉剤として調製してもよい。前記組成物は、例えば錠剤若しくはカプセル剤として、噴霧剤として、又はシロップ剤として（任意で、風味付けされる）経口投与用に調製してもよい。前記組成物は、例えば微粉末又はスプレーを用いる吸入器として調製してもよい。前記組成物は、例えば点眼剤として調製してもよい。前記組成物は、例えば被験体に投与する直前に、複合組成物が再構成できるように設計されたキット形態であってもよい。例えば、凍結乾燥した抗体を、滅菌水又は滅菌バッファと共にキット形態で提供してよい。

【0211】

組成物中の活性成分は、本発明に係る抗体分子、抗体断片、又はその変異体及び誘導体であることが好ましく、特に、組成物中の活性成分は、本発明に係る抗体、抗体断片、又はその変異体及び誘導体であることが好ましい。組成物は、胃腸管での分解から抗体を保護するが、胃腸管から吸収されると抗体を放出する薬剤を含んでもよい。

【0212】

薬学的に許容し得る担体についての詳細な検討は、Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２から入手可能である。

【0213】

本発明の医薬組成物は、一般的に、５．５～８．５のｐＨを有し、幾つかの実施形態では、これは、６～８であり、他の実施形態では、約７である。ｐＨは、バッファを使用することによって維持することができる。前記組成物は、無菌及び／又はパイロジェンフリーであってよい。前記組成物は、ヒトに対して等張であってよい。一実施形態では、本発明の医薬組成物は、密封容器で提供される。

【0214】

前記組成物は、油性又は水性のビヒクルの懸濁液、溶液、又はエマルションの形態をとってもよく、特に、懸濁化剤、保存剤、安定剤、及び／又は分散剤等の調合剤を含有していてもよい。或いは、抗体分子は、適切な無菌液体を用いて使用前に再構成するために乾燥形態であってもよい。

【0215】

前記組成物は、水又は整理食塩水などのビヒクルを含んでもよい。ビヒクルは、典型的には、薬学的活性化合物等の化合物、特に、本発明に係る抗体を保存、輸送、及び投与するのに好適な物質であると理解される。例えば、ビヒクルは、薬学的活性化合物、特に、本発明に係る抗体を保存、輸送、及び／又は投与するのに好適な生理学的に許容し得る液体であってよい。

【0216】

前記組成物は、パイロジェンフリーであり且つ好適なｐＨ、等張性、及び安定性を有する非経口的に許容し得る水溶液であることができる。当業者は、例えば、生食注射、リンゲル液、乳酸加リンゲル液等の等張ビヒクルを用いて好適な溶液をうまく調製することができる。必要に応じて、保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤、及び／又は他の添加剤が含まれていてもよい。本発明に係る組成物を、例えばプレフィルドシリンジで提供してよい。

【0217】

上に定義された組成物は、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤、又は液剤が挙げられるがこれらに限定されない剤形であってもよい。錠剤の場合、一般的に使用される担体としては、ラクトース及びコーンスターチが挙げられる。ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤も典型的に添加される。カプセル形態の場合、有用な希釈剤としては、ラクトース及び乾燥コーンスターチが挙げられる。水性懸濁剤が必要な場合、活性成分を乳化剤及び懸濁化剤と合わせてもよい。必要に応じて、特定の甘味剤、着香剤、又は着色剤を添加してもよい。

【0218】

前記組成物に含有される担体の更なる例としては、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス及び水が挙げられるが、これらに限定されない。或いは、本発明の医薬組成物は、好適なローション又はクリームに製剤化することもできる。本発明において、好適な担体としては、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリールアルコール、２－オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、及び水が挙げられるが、これらに限定されない。

【0219】

一実施形態では、本発明の組成物は、本発明の抗体を含むことができ、抗体は、組成物中の総タンパク質の少なくとも５０重量％（例えば、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上）を構成することができる。そのような組成物において、抗体は、精製された形態であることが好ましい。

【0220】

医薬組成物は、特に複数回投与フォーマットにパッケージ化されている場合、抗微生物剤を含んでいてよい。前記医薬組成物は、洗浄剤、例えばＴｗｅｅｎ８０等のＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）を含んでいてよい。洗浄剤は、一般的に、低濃度、例えば、０．０１％未満で存在する。また、組成物は、等張にするためにナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含んでいてもよい。例えば、１０±２ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ濃度が典型的である。

【0221】

更に、医薬組成物は、特に、凍結乾燥される場合又は凍結乾燥物質から再構成された物質を含む場合、例えば、約１５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬ（例えば、２５ｍｇ／ｍＬ）の糖アルコール（例えば、マンニトール）又は二糖（例えば、スクロース又はトレハロース）を含んでいてよい。凍結乾燥用組成物のｐＨは、凍結乾燥前に５～８、又は５．５～７、又は約６．１に調整してよい。

【0222】

本発明の組成物はまた、１つ以上の免疫調節剤を含むことができる。一実施形態では、免疫調節剤の１つ以上はアジュバントを含む。

【0223】

抗体の製造
本発明に係る抗体は、当技術分野において公知の任意の方法によって作製することができる。例えば、足場抗体を提供し、エルボー領域で遺伝子操作することができる。例えば、足場抗体を得るために、例えば、ハイブリドーマ技術を使用してモノクローナル抗体を作製するための一般的な方法論は、周知である（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ，．１９７５；Ｋｏｚｂａｒ ｅｔ ａｌ．１９８３）。特に、国際公開第２００４／０７６６７７号に記載される代替のＥＢＶ不死化方法を使用することができる。

【0224】

好ましい方法は、国際公開第２００４／０７６６７７号に記載される。この方法では、本発明の抗体を産生するＢ細胞を、ＥＢＶ及びポリクローナルＢ細胞活性化剤で形質転換する。任意で、効率を更に高めるために、細胞の成長及び分化の更なる刺激剤を形質転換工程中に添加してもよい。これら刺激剤は、ＩＬ－２及びＩＬ－１５等のサイトカインであってよい。一態様では、ＩＬ－２を不死化工程中に添加して、不死化効率を更に向上させるが、その使用は必須ではない。次いで、これら方法を用いて産生された不死化Ｂ細胞を、当技術分野において公知の方法及びそれから単離された抗体を用いて培養してよい。

【0225】

別の好ましい方法は、国際公開第２０１０／０４６７７５号に記載されている。この方法では、プラズマ細胞を限定数又は単一プラズマ細胞としてマイクロウェル培養皿で培養する。プラズマ細胞培養物から抗体を単離することができる。更に、プラズマ細胞培養物からＲＮＡを抽出することができ、当技術分野において公知の方法を使用してＰＣＲを実施することができる。抗体のＶＨ及びＶＬ領域をＲＴ－ＰＣＲ（逆転写酵素ＰＣＲ）によって増幅させ、配列を決定し、発現ベクターにクローニングし、次いで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞又は他の宿主細胞にトランスフェクトすることができる。発現ベクターへの核酸のクローニング、宿主細胞のトランスフェクション、トランスフェクトされた宿主細胞の培養、及び産生された抗体の単離は、当業者に公知の任意の方法を使用して行うことができる。

【0226】

本発明の抗体の断片は、酵素、例えばペプシン又はパパインによる消化を含む方法によって、及び／又は化学還元によりジスルフィド結合を切断することによって前記抗体から得ることができる。或いは、抗体の断片は、重鎖又は軽鎖の配列の一部のクローニング及び発現によって得ることができる。抗体「断片」は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片を含む。

【0227】

例えば、本発明はまた、以下を含む、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片を製造するためのプロセスを提供する：即ち、
第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖をコードする前記した１つ以上の核酸分子、例えば、前記した本発明に係るベクターを、（例えば、前記のように）組み込むことにより真核宿主細胞を形質転換すること；
前記核酸分子が発現されるように適切な条件下で宿主細胞を培養すること；
前記第１及び第２のポリペプチド鎖を組み合わせて、抗体又はその抗原結合断片を形成すること；及び
任意に、培養培地から前記抗体又はその抗原結合断片を精製すること。

【0228】

分子生物学の標準的な技術を用いて、本発明の抗体又は抗原断片をコードしているＤＮＡ配列を調製することができる。オリゴヌクレオチド合成技術を用いて所望のＤＮＡ配列を完全に又は部分的に合成することができる。部位特異的突然変異誘発及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を適宜使用してよい。

【0229】

任意の好適な宿主細胞／ベクター系を、本発明の抗体分子又はその断片をコードしているＤＮＡ配列を発現させるために用いることができる。一部では、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片等の抗体断片、特にＦｖ断片及び単鎖抗体断片、例えば単鎖Ｆｖを発現させるために細菌、例えば大腸菌及び他の微生物系を使用してよい。完全抗体分子を含むより大きな抗体分子を産生させるために、真核生物、例えば哺乳類の宿主細胞発現系を使用してよい。好適な哺乳類宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＮＳ０、骨髄腫、又はハイブリドーマ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

【0230】

例えば、細胞株は、第１のベクターが第１のポリペプチド鎖、例えば重鎖ポリペプチドをコードし、第２のベクターが第２のポリペプチド鎖、例えば軽鎖ポリペプチドをコードする２種のベクターでトランスフェクトすることができる。或いは、第１及び第２のポリペプチド鎖、例えば、軽鎖及び重鎖ポリペプチドをコードする配列を含む単一のベクターを使用してもよい。

【0231】

抗体は、必要に応じて、濾過、遠心分離、及び様々なクロマトグラフィー法、例えば、ＨＰＬＣ又はアフィニティクロマトグラフィーを用いて更に精製することができる。医薬品グレードの抗体を産生するための技術を含む抗体、例えば、モノクローナル抗体を精製する技術は、当技術分野において周知である。

【0232】

方法及び使用
更なる態様において、本発明は、医学における使用のための、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る（医薬）組成物の使用を提供する。

【0233】

したがって、本発明はまた、被験体における疾患又は障害を予防又は治療する方法であって、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る（医薬）組成物を前記被験体に投与するステップを含む方法を提供する。

【0234】

本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の１つ以上の特異性は、予防及び／又は治療される疾患又は障害にしたがって選択できることが理解される。例えば、マラリアの予防及び／又は治療のために、抗体又はその抗原結合断片は、マラリア抗原に対する特異性、例えばマラリア抗原に特異的に結合する抗原結合部位（可変ドメインによって形成される）及び／又はエルボー領域の（追加）機能的ドメインを含むことができる。その例は、例えば、配列番号１３に係るアミノ酸配列、又は少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは９０％、特に好ましくは９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するその配列変異体を含む、本明細書に記載の変異ＬＡＩＲ１断片、特に、国際公開第２０１６／２０７４０２Ａ１号に記載の変異ＬＡＩＲ１断片である。そのような特異性を含む抗体（（抗原）結合部位）は、血液期マラリア原虫（ｂｌｏｏｄ ｓｔａｇｅ ｍａｌａｒｉａ ｐａｒａｓｉｔｅｓ）（特に、プラスモジウムファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ））に対する免疫を提供するのに特に有用であり得る。

【0235】

本発明に係る抗体／抗原結合断片、本発明に係る核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る組成物の使用により治療及び／又は予防される疾患は、癌、感染症、及び自己免疫障害を含む。癌及び／又は感染症の治療及び／又は予防が好ましい。

【0236】

好ましくは、本発明に係る抗体／抗原結合断片、本発明に係る核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る組成物は、癌又は腫瘍疾患の予防、治療、及び／又は寛解のために（のための薬剤の調製に）使用され得る。一般に、用語「癌」は、固形腫瘍、特に肉腫、癌腫、及びリンパ腫などの悪性固形腫瘍、及び白血病などの血液癌を含む。癌は、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞腫瘍、及び芽細胞腫を含む。

【0237】

好ましくは、本発明に係る抗体／抗原結合断片、本発明に係る核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る組成物は、感染症の予防、治療、及び／又は寛解のために（のための薬剤の調製に）使用され得る。感染症は、ウイルス性、レトロウイルス性、細菌性、及び原虫性の感染症を含む。

【0238】

更に、本発明に係る抗体／抗原結合断片、本発明に係る核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る組成物は、自己免疫障害の予防、治療、及び／又は寛解のために（のための薬剤の調製に）使用され得る。通常、自己免疫疾患は、体内に通常存在する物質や組織に対する身体の異常な免疫応答から生じる（自己免疫）。これは特定の臓器に限定される場合もあれば、様々な場所の特定の組織に関係する場合もある。自己免疫疾患は、過敏症の対応するタイプ、即ち、タイプＩ（即ち、自己血清によって誘発される蕁麻疹）、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ、又はタイプＩＶによって分類することができる。

【0239】

更に、本発明に係る抗体／抗原結合断片、本発明に係る核酸分子、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る（医薬）組成物は、（インビトロ）診断にも有用であり得る。診断方法は、抗体又は抗体断片を試料と接触させることを含み得る。かかる試料は、被験体から単離することができ、例えば、鼻道、鼻腔、唾液腺、肺、肝臓、膵臓、腎臓、眼、耳、胎盤、消化管、心臓、卵巣、脳下垂体、副腎、甲状腺、脳、皮膚、又は血液、好ましくは血漿又は血清から採取した単離組織サンプルであってよい。また、前記診断方法は、特に抗体又は抗体断片をサンプルと接触させた後に、抗原／抗体複合体を検出することを含んでいてよい。かかる検出工程は、典型的には、作業台で、即ち、ヒト又は動物の身体と全く接触することなしに実施される。検出方法の例は、当業者に周知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）が挙げられる。

【0240】

また、診断のために、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の１つ以上の特異性は、疾患の予防及び／又は治療について本質的に前記したように、予防及び／又は治療される疾患又は障害に応じて選択できることが理解される。

【0241】

更に、本発明はまた、抗原を検出するための又は抗原結合の定量化のための、以下を含むアッセイを提供する：
抗原の多価抗体への結合を可能にする条件下で、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片と共に前記抗原をインキュベートすること；及び
抗原抗体結合を検出すること。

【0242】

例えば、そのようなアッセイは、前記した診断の文脈において有用であり得る。

【0243】

以下、添付図面の簡単な説明をする。図面は、本発明をより詳細に説明することが意図されている。しかし、それらは本発明の主題を何ら限定することを意図するものではない。

【図面の簡単な説明】

【0244】

【図1】（Ａ）それぞれが単一の可変ドメインＶＨと３つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を有する２つの重鎖（灰色）と、それぞれ単一の可変ドメインＶＬと単一の定常ドメインＣＬを有する２つの軽鎖（白色）とを含む古典的な単一特異性抗体。エルボー領域を矢印で示す。（Ｂ）（Ａ）に示す古典的な単一特異性抗体に由来する本発明に係る抗体の好ましい例（イン－エルボー－インサートＩｇ分子；ＩＥＩ Ｉｇ）：各重鎖のエルボー領域に単一の（追加の）機能的ドメインを含むが、軽鎖にはエルボーインサートを含まない抗体；各軽鎖のエルボー領域に単一の（追加の）機能的ドメインを含むが、重鎖にはエルボーインサートを含まない抗体；各重鎖及び各軽鎖のエルボー領域に単一の（追加の）機能的ドメインを含む抗体；各重鎖のエルボー領域に２つの（追加の）機能的ドメインを含むが、軽鎖にはエルボーインサートを含まない抗体；及び各軽鎖のエルボー領域に２つの（追加の）機能的ドメインを含むが、重鎖にはエルボーインサートを含まない抗体。（Ｃ）抗体断片又は二重特性抗体に由来する本発明に係る抗原結合断片及び抗体の好ましい例（イン－エルボー－インサートＩｇ分子；ＩＥＩ Ｉｇ）：各重鎖のエルボー領域に単一の（追加の）機能的ドメインを含むが、軽鎖にはエルボーインサートを含まないＦ（ａｂ）_２断片；各軽鎖のエルボー領域に単一の（追加の）機能的ドメインを含むが、重鎖にはエルボーインサートを含まないＦ（ａｂ）_２断片；各重鎖のエルボー領域に単一の（追加の）機能的ドメインを含むが、軽鎖にはエルボーインサートを含まないＦ（ａｂ）断片；各軽鎖のエルボー領域に単一の（追加の）機能的ドメインを含むが、重鎖にはエルボーインサートを含まないＦ（ａｂ）断片；単一の重鎖のエルボー領域に単一の（追加の）機能的ドメインを含むが、軽鎖及び他の重鎖にはエルボーインサートを含まないＣｒｏｓｓＭａｂ／Ｋｎｏｂｓ－ｉｎ－ｈｏｌｅｓ／直交Ｆａｂ／Ｆａｂアーム交換抗体；各重鎖のエルボー領域に１つの単一の（追加の）機能的ドメインを含むが、軽鎖にはエルボーインサートを含まないｓｃＦｖ－（Ｈ）ＩｇＧ；各重鎖のエルボー領域に１つの単一の（追加の）機能的ドメインを含むが、軽鎖にはエルボーインサートを含まないＩｇＧ（Ｈ）－ｓｃＦｖ；各重鎖のエルボー領域に１つの単一の（追加の）機能的ドメインを含むが、軽鎖にはエルボーインサートを含まないｓｃＦｖ－（Ｌ）ＩｇＧ；各重鎖のエルボー領域に１つの単一の（追加の）機能的ドメインを含むが、軽鎖にはエルボーインサートを含まないＩｇＧ（Ｌ）－ｓｃＦｖ；及び各重鎖のエルボー領域に１つの単一の（追加の）機能的ドメインを含むが、軽鎖にはエルボーインサートを含まないＤＶＤ－Ｉｇ。

【図2】図２は、実施例１について、足場抗体（ＧＣＥ５３６，Ｃ１）と比較した本発明に係る７種の抗体構築物（Ｃ２からＣ８）のスキームを示す。

【図3】図３は、実施例２について、抗原又は抗ドメイン抗体のセットを使用して行ったＥＬＩＳＡ試験における結合値（ＯＤ）及び相対抗体濃度の非線形回帰分析によって決定したＥＣ５０値を示す。構築物を、ＩＥ（単離体９２１５）への結合についても試験し、１μｇ／ｍｌの濃度での結合値（％）を示す。

【図4】図４は、実施例３について、Ｃ４及び各種対照のＧＭ－ＣＳＦ及びコラーゲンに対するＳＰＲ結合曲線を示す。足場としてＧＣＥ５３６を使用するＣ４及びＣ５はＧＭ－ＣＳＦに結合するが、Ｃ４のみがコラーゲンに結合される。非特異的なＦＩ１７４及びコラーゲン特異的なＭＧＤ^ＵＣＡ抗体は、特異的な結合シグナルを示さない。

【図5】図５は、実施例３について、Ｃ４及び各種対照のＧＭ－ＣＳＦ及びコラーゲンに対するＳＰＲ結合曲線を示す。Ｃ４及びＧＣＥ５３６はＧＭ－ＣＳＦに結合するが、Ｃ４のみがコラーゲンによって認識される。コラーゲン特異的ＭＧＤ^ＵＣＡ抗体は、コラーゲンのみに結合する。対照抗体ＴＴ１０７は、ＴＴ特異的モノクローナル抗体であり、これは、ＳＰＲ実験で特異的な結合シグナルを示さない。

【図6】図６は、実施例４について、足場抗体（ＧＣＥ５３６）と比較したＣ５、Ｃ５ｂ、Ｃ６、及びＣ６ｂ構築物のＧＭ－ＣＳＦに対する又は抗ＰＤ１又は抗ＳＬＡＭ抗体によるＥＬＩＳＡ結合曲線を示す。ＰＤ１を含むＣ５及びＣ５ｂ並びにＳＬＡＭを含むＣ６及びＣ６ｂ構築物は、それぞれ抗ＰＤ１又は抗ＳＬＡＭ抗体によって認識される。構築物はいずれも、ＧＣＥ５３６としてＧＭ－ＣＳＦに結合する。Ｃ５ｂ及びＣ６中のリンカーの存在は、結合に影響を及ぼさない。

【図7】図７は、実施例６について、足場Ｃ１ｂと比較したＣ９構築物に対するＳｔｒｅｐ－タクチン抗体のＥＬＩＳＡ結合曲線を示す。Ｃ９構築物のエルボーに挿入されたＴｗｉｎ Ｓｔｒｅｐタグは、Ｓｔｒｅｐ－タクチン抗体によって特異的に認識される。

【図8】図８は、実施例７について、足場抗体（ＦＩ１７４）と比較した４つの更なる抗体構築物（Ｃ９～Ｃ１２）のスキームを示す。

【図9】図９は、実施例８について、Ｃ９及びＣ１０並びに各種対照のＨ１とＴＴに対するＳＰＲ結合曲線を示す。Ｃ９及びＣ１０は、Ｈ１とＴＴの両方に対する二重の結合を示す。ＴＴ１０７は、ＴＴ特異的なモノクローナル抗体である。

【図10】図１０は、実施例８について、Ｃ１１及びＣ１２並びに各種対照のＨ１及びＲＳＶ Ｆタンパク質に対するＳＰＲ結合曲線を示す。Ｃ１１及びＣ１２は、Ｈ１とＲＳＶ Ｆタンパク質の両方に対する二重の結合を示す。ＭＰＥ８は、ＲＳＶ Ｆタンパク質特異的なモノクローナル抗体である。

【実施例0245】

実施例
特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書に記載するものと類似又は等価な方法及び材料を本発明の実施又は試験で用いることができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書に記載する全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参照文献は、その全体が参照によって援用される。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。更に、材料、方法、及び実施例は、単なる例示であり、限定を意図するものではない。

【0246】

実施例１：足場抗体のエルボー領域に各種Ｉｇ様機能的ドメインを挿入する抗体変異体の設計及び構築
抗体の特異性に対する抗体のエルボー領域に挿入された異なる（追加の）機能的ドメインの効果を調べるために、非変異ＬＡＩＲ１（配列番号１２）、変異ＬＡＩＲ１（配列番号１３）、又は他のＩｇ様ドメインを足場として使用した抗体のエルボー領域に挿入した７種の構築物（「Ｃ２～Ｃ８」と命名）を設計した。構築物Ｃ２～Ｃ３は、構築物Ｃ１と同一の完全な重鎖定常領域を有する（ＶＨ：配列番号５、ＶＬ：配列番号６、重鎖定常領域：配列番号３、軽鎖定常領域：配列番号７）。構築物Ｃ４～Ｃ６は、抗体ＧＣＥ５３６と同一の完全な重鎖定常領域を有する（ＶＨ：配列番号１、ＶＬ：配列番号２、重鎖定常領域：配列番号３、カッパ軽鎖定常領域：配列番号：４；Ｐｉｃｃｏｌｉ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ． Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ＧＭ－ＣＳＦ ｂｙ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｌｖｅｏｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｏｓｉｓ． Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ６， ７３７５ （２０１５））。構築物Ｃ７～Ｃ８は、構築物Ｃ１ｂと同一の完全な重鎖定常領域を有する（ＶＨ：配列番号８、ＶＬ：配列番号９、重鎖定常領域：配列番号３、軽鎖定常領域：配列番号４）。構築物の軽鎖は、足場抗体と比較して改変しなかった。いずれの構築物も、最終的にモノクローナル抗体（重鎖及び軽鎖）として発現させた。

【0247】

以下の構築物を作製した。図２に模式的に示す。
１．「Ｃ１」（ＶＨ：配列番号５、ＶＬ：配列番号６、重鎖定常領域：配列番号３、軽鎖ラムダ定常領域：配列番号７）は、対照目的の組換え単一特異性抗体である。Ｃ１は、以下によって（ＮからＣ末端にこの順で）形成される：重鎖可変ドメインのＶ（可変）遺伝子セグメントの発現産物（「ＶＨ３－３０」）；重鎖可変ドメインのＤ（多様性）遺伝子セグメントの発現産物（「Ｄ」）；重鎖可変ドメインのＪ（結合）遺伝子セグメントエレメントの発現産物（「ＪＨ６」）；重鎖定常領域のＣ（定常）遺伝子セグメントの発現産物（ＩｇＧ１アイソタイプ）；及び別の鎖上に、軽鎖可変ドメインのＶ（可変）遺伝子セグメントの発現産物及び軽鎖可変ドメインのＪ（結合）遺伝子セグメントエレメントの発現産物；軽鎖ラムダ定常領域のＣ（定常）遺伝子セグメントの発現産物。

【0248】

２．「Ｃ１ｂ」（ＶＨ：配列番号８、ＶＬ：配列番号９、重鎖定常領域：配列番号３、軽鎖カッパ定常領域：配列番号４）は、対照目的の組換え単一特異性抗体である。Ｃ１は、以下によって（ＮからＣ末端にこの順で）形成される：重鎖可変ドメインのＶ（可変）遺伝子セグメントの発現産物（「ＶＨ３－２０」）；重鎖可変ドメインのＤ（多様性）遺伝子セグメントの発現産物（「Ｄ」）；重鎖可変ドメインのＪ（結合）遺伝子セグメントエレメントの発現産物（「ＪＨ３」）；重鎖定常領域のＣ（定常）遺伝子セグメントの発現産物（ＩｇＧ１アイソタイプ）；及び別の鎖上に、軽鎖可変ドメインのＶ（可変）遺伝子セグメントの発現産物及び軽鎖可変ドメインのＪ（結合）遺伝子セグメントエレメントの発現産物；軽鎖カッパ定常領域のＣ（定常）遺伝子セグメントの発現産物。

【0249】

３．構築物「Ｃ２」では、変異ＬＡＩＲ－１断片（「ＬＡＩＲ１^ｍｕｔ」；配列番号１３）を、組換え単一特異性抗体「Ｃ１」のエルボー領域に挿入した（前記参照）。変異ＬＡＩＲ１断片では、コラーゲンへのＬＡＩＲ１の結合は行われないが、変異ＬＡＩＲ１断片は、Ｐ．ファルシパルム感染赤血球に強力に結合する（Ｔａｎ， Ｊ．， Ｐｉｅｐｅｒ， Ｋ．， Ｐｉｃｃｏｌｉ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ． Ａ ＬＡＩＲ１ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｂｒｏａｄｌｙ ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｍａｌａｒｉａ ｖａｒｉａｎｔ ａｎｔｉｇｅｎｓ． Ｎａｔｕｒｅ ５２９， １０５－１０９ （２０１６）；国際公開第２０１６／２０７４０２Ａ１号）。構築物「Ｃ２」（完全な重鎖：配列番号５３、完全な軽鎖：配列番号５４）は、以下によって（ＮからＣ末端にこの順で）形成される：Ｃ１の重鎖可変ドメインのＶ（可変）遺伝子セグメントの発現産物（「ＶＨ３－３０」）；Ｃ１の重鎖可変ドメインのＤ（多様性）遺伝子セグメントの発現産物（「Ｄ」）；Ｃ１の重鎖可変ドメインのＪ（結合）遺伝子セグメントエレメントの発現産物（「ＪＨ６」）；ＭＧＤ２１の変異ＬＡＩＲ－１断片の発現産物（「ＬＡＩＲ１^Ｄ２１」）；重鎖定常領域のＣ（定常）遺伝子セグメントの発現産物（ＩｇＧ１アイソタイプ）；及び別の鎖上に、Ｃ１の軽鎖可変ドメインのＶ（可変）遺伝子セグメントの発現産物及びＣ１の軽鎖可変ドメインのＪ（結合）遺伝子セグメントエレメントの発現産物；軽鎖定常領域のＣ（定常）遺伝子セグメントの発現産物。

【0250】

４．構築物「Ｃ３」では、非変異ＬＡＩＲ－１断片（「ＬＡＩＲ１^ｇｅｎ」；配列番号１２）を、組換え単一特異性抗体「Ｃ１」のエルボー領域に挿入した（前記参照）。構築物「Ｃ３」（完全な重鎖：配列番号５５、完全な軽鎖：配列番号５４）は、以下によって（ＮからＣ末端にこの順で）形成される：Ｃ１の重鎖可変ドメインのＶ（可変）遺伝子セグメントの発現産物（「ＶＨ３－３０」）；Ｃ１の重鎖可変ドメインのＤ（多様性）遺伝子セグメントの発現産物（「Ｄ」）；Ｃ１の重鎖可変ドメインのＪ（結合）遺伝子セグメントエレメントの発現産物（「ＪＨ６」）；非変異ＬＡＩＲ－１断片の発現産物（「ＬＡＩＲ１^ｇｅｎ」）；重鎖定常領域のＣ（定常）遺伝子セグメントの発現産物（ＩｇＧ１アイソタイプ）；及び別の鎖上に、Ｃ１の軽鎖可変ドメインのＶ（可変）遺伝子セグメントの発現産物及びＣ１の軽鎖可変ドメインのＪ（結合）遺伝子セグメントエレメントの発現産物；軽鎖定常領域のＣ（定常）遺伝子セグメントの発現産物。

【0251】

５．構築物「Ｃ４」では、非変異ＬＡＩＲ－１断片（「ＬＡＩＲ１^ｇｅｎ」；配列番号１３）を、抗体ＧＣＥ５３６のエルボー領域に挿入した。構築物「Ｃ４」（完全な重鎖：配列番号５６、完全な軽鎖：配列番号５７）は、以下によって（ＮからＣ末端にこの順で）形成される：ＧＣＥ５３６の重鎖可変ドメインのＶ（可変）遺伝子セグメントの発現産物（「ＶＨ１－４６」）；ＧＣＥ５３６の重鎖可変ドメインのＤ（多様性）遺伝子セグメントの発現産物（「Ｄ」）；ＧＣＥ５３６の重鎖可変ドメインのＪ（結合）遺伝子セグメントエレメントの発現産物（「ＪＨ６」）；非変異ＬＡＩＲ－１断片の発現産物（「ＬＡＩＲ１^ｇｅｎ」）；重鎖定常領域のＣ（定常）遺伝子セグメントの発現産物（ＩｇＧ１アイソタイプ）；及び別の鎖上に、ＧＣＥ５３６の軽鎖可変ドメインのＶ（可変）遺伝子セグメントの発現産物及びＧＣＥ５３６の軽鎖可変ドメインのＪ（結合）遺伝子セグメントエレメントの発現産物；軽鎖定常領域のＣ（定常）遺伝子セグメントの発現産物。

【0252】

６．構築物「Ｃ５」では、ＰＤ１分子の細胞外Ｉｇ様ドメイン（「ＰＤ１」；配列番号１４）を、抗体ＧＣＥ５３６のエルボー領域に挿入した。構築物「Ｃ５」（完全な重鎖：配列番号５８、完全な軽鎖：配列番号５７）は、以下によって（ＮからＣ末端にこの順で）形成される：ＧＣＥ５３６の重鎖可変ドメインのＶ（可変）遺伝子セグメントの発現産物（「ＶＨ１－４６」）；ＧＣＥ５３６の重鎖可変ドメインのＤ（多様性）遺伝子セグメントの発現産物（「Ｄ」）；ＧＣＥ５３６の重鎖可変ドメインのＪ（結合）遺伝子セグメントエレメントの発現産物（「ＪＨ６」）；ＰＤ１分子の細胞外Ｉｇ様ドメインの発現産物（「ＰＤ１」）；重鎖定常領域のＣ（定常）遺伝子セグメントの発現産物（ＩｇＧ１アイソタイプ）；及び別の鎖上に、ＧＣＥ５３６の軽鎖可変ドメインのＶ（可変）遺伝子セグメントの発現産物及びＧＣＥ５３６の軽鎖可変ドメインのＪ（結合）遺伝子セグメントエレメントの発現産物；軽鎖定常領域のＣ（定常）遺伝子セグメントの発現産物。

【0253】

７．構築物「Ｃ５ｂ」では、隣接イントロン配列（「１５－ｍｅｒ ＪＨ－ＰＤ１」、配列番号４９及び「１５－ｍｅｒ ＰＤ１－ＣＨ１」リンカー」、配列番号５０）を有するＰＤ１分子の細胞外Ｉｇ様ドメイン（「ＰＤ１」；配列番号１４）を、抗体ＧＣＥ５３６のエルボー領域に挿入した。構築物「Ｃ５」（完全な重鎖：配列番号５９、完全な軽鎖：配列番号５７）は、以下によって（ＮからＣ末端にこの順で）形成される：ＧＣＥ５３６の重鎖可変ドメインのＶ（可変）遺伝子セグメントの発現産物（「ＶＨ１－４６」）；ＧＣＥ５３６の重鎖可変ドメインのＤ（多様性）遺伝子セグメントの発現産物（「Ｄ」）；ＧＣＥ５３６の重鎖可変ドメインのＪ（結合）遺伝子セグメントエレメントの発現産物（「ＪＨ６」）；リンカーの発現産物（「１５－ｍｅｒ ＪＨ－ＰＤ１」）；ＰＤ１分子の細胞外Ｉｇ様ドメインの発現産物（「ＰＤ１」）；リンカーの発現産物（「１５－ｍｅｒ ＰＤ１－ＣＨ」）；重鎖定常領域のＣ（定常）遺伝子セグメントの発現産物（ＩｇＧ１アイソタイプ）；及び別の鎖上に、ＧＣＥ５３６の軽鎖可変ドメインのＶ（可変）遺伝子セグメントの発現産物及びＧＣＥ５３６の軽鎖可変ドメインのＪ（結合）遺伝子セグメントエレメントの発現産物；軽鎖カッパ定常領域のＣ（定常）遺伝子セグメントの発現産物。

【0254】

８．構築物「Ｃ６」では、ＳＬＡＭの細胞外Ｉｇ様ドメイン（「ＳＬＡＭ」；配列番号１５）を、抗体ＧＣＥ５３６のエルボー領域に挿入した。構築物「Ｃ６」（完全な重鎖：配列番号６０、完全な軽鎖：配列番号５７）は、以下によって（ＮからＣ末端にこの順で）形成される：ＧＣＥ５３６の重鎖可変ドメインのＶ（可変）遺伝子セグメントの発現産物（「ＶＨ１－４６」）；ＧＣＥ５３６の重鎖可変ドメインのＤ（多様性）遺伝子セグメントの発現産物（「Ｄ」）；ＧＣＥ５３６の重鎖可変ドメインのＪ（結合）遺伝子セグメントエレメントの発現産物（「ＪＨ６」）；ＳＬＡＭの細胞外Ｉｇ様ドメインの発現産物（「ＳＬＡＭ」）；重鎖定常領域のＣ（定常）遺伝子セグメントの発現産物（ＩｇＧ１アイソタイプ）；及び別の鎖上に、ＧＣＥ５３６の軽鎖可変ドメインのＶ（可変）遺伝子セグメントの発現産物及びＧＣＥ５３６の軽鎖可変ドメインのＪ（結合）遺伝子セグメントエレメントの発現産物；軽鎖定常領域のＣ（定常）遺伝子セグメントの発現産物。

【0255】

９．構築物「Ｃ６ｂ」では、隣接イントロン配列（「１５－ｍｅｒ ＪＨ－ＳＬＡＭ」、配列番号５１及び「１５－ｍｅｒ ＳＬＡＭ－ＣＨ１」リンカー」、配列番号５２）を有するＳＬＡＭ分子の細胞外Ｉｇ様ドメイン（「ＳＬＡＭ」；配列番号１５）を、抗体ＧＣＥ５３６のエルボー領域に挿入した。構築物「Ｃ６」（完全な重鎖：配列番号６１、完全な軽鎖：配列番号５７）は、以下によって（ＮからＣ末端にこの順で）形成される：ＧＣＥ５３６の重鎖可変ドメインのＶ（可変）遺伝子セグメントの発現産物（「ＶＨ１－４６」）；ＧＣＥ５３６の重鎖可変ドメインのＤ（多様性）遺伝子セグメントの発現産物（「Ｄ」）；ＧＣＥ５３６の重鎖可変ドメインのＪ（結合）遺伝子セグメントエレメントの発現産物（「ＪＨ６」）；リンカーの発現産物（「１５－ｍｅｒ ＪＨ－ＳＬＡＭ」）；ＳＬＡＭ分子の細胞外Ｉｇ様ドメインの発現産物（「ＳＬＡＭ」）；リンカーの発現産物（「１５－ｍｅｒ ＳＬＡＭ－ＣＨ」）；重鎖定常領域のＣ（定常）遺伝子セグメントの発現産物（ＩｇＧ１アイソタイプ）；及び別の鎖上に、ＧＣＥ５３６の軽鎖可変ドメインのＶ（可変）遺伝子セグメントの発現産物及びＧＣＥ５３６の軽鎖可変ドメインのＪ（結合）遺伝子セグメントエレメントの発現産物；軽鎖カッパ定常領域のＣ（定常）遺伝子セグメントの発現産物。

【0256】

１０．構築物「Ｃ７」では、ＰＤ１分子の細胞外Ｉｇ様ドメイン（「ＰＤ１」；配列番号１４）を、組換え単一特異性抗体「Ｃ１ｂ」のエルボー領域に挿入した（前記参照）。構築物「Ｃ７」（完全な重鎖：配列番号６２、完全な軽鎖：配列番号６３）は、以下によって（ＮからＣ末端にこの順で）形成される：重鎖可変ドメインのＶ（可変）遺伝子セグメントの発現産物（「ＶＨ３－２０」）；重鎖可変ドメインのＤ（多様性）遺伝子セグメントの発現産物（「Ｄ」）；重鎖可変ドメインのＪ（結合）遺伝子セグメントエレメントの発現産物（「ＪＨ３」）；ＰＤ１分子の細胞外Ｉｇ様ドメインの発現産物（「ＰＤ１」）；重鎖定常領域のＣ（定常）遺伝子セグメントの発現産物（ＩｇＧ１アイソタイプ）；及び別の鎖上に、軽鎖可変ドメインのＶ（可変）遺伝子セグメントの発現産物及び軽鎖可変ドメインのＪ（結合）遺伝子セグメントエレメントの発現産物；軽鎖定常領域のＣ（定常）遺伝子セグメントの発現産物。

【0257】

１１．構築物「Ｃ８」では、ＳＬＡＭ分子の細胞外Ｉｇ様ドメイン（「ＳＬＡＭ」；配列番号１５）を、組換え単一特異性抗体「Ｃ１ｂ」のエルボー領域に挿入した（前記参照）。構築物「Ｃ８」（完全な重鎖：配列番号６４、完全な軽鎖：配列番号６３）は、以下によって（ＮからＣ末端にこの順で）形成される：重鎖可変ドメインのＶ（可変）遺伝子セグメントの発現産物（「ＶＨ３－２０」）；重鎖可変ドメインのＤ（多様性）遺伝子セグメントの発現産物（「Ｄ」）；重鎖可変ドメインのＪ（結合）遺伝子セグメントエレメントの発現産物（「ＪＨ３」）；ＳＬＡＭ分子の細胞外Ｉｇ様ドメインの発現産物（「ＳＬＡＭ」）；重鎖定常領域のＣ（定常）遺伝子セグメントの発現産物（ＩｇＧ１アイソタイプ）；及び別の鎖上に、軽鎖可変ドメインのＶ（可変）遺伝子セグメントの発現産物及び軽鎖可変ドメインのＪ（結合）遺伝子セグメントエレメントの発現産物；軽鎖定常領域のＣ（定常）遺伝子セグメントの発現産物。

【0258】

実施例２：Ｉｇ様ドメインを抗体のエルボー領域に挿入して機能的抗体が得られる
実施例１に記載した８つの抗体構築物を、一過性トランスフェクションによる組換えにより産生した。この目的のために、抗体の重鎖及び軽鎖をヒトＩｇＧ１、Ｉｇκ、及びＩｇλ発現ベクターにクローニングし、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の一過性トランスフェクションにより発現させた。細胞株は、マイコプラズマ汚染について汎用法により試験した。

【0259】

次に、抗体構築物Ｃ１～Ｃ８及び対照抗体ＧＣＥ５３６（実施例１参照）の９２１５ ＩＥ（感染した赤血球）の染色について試験し、１μｇ／ｍｌの抗体濃度での結合値（％）を、シグモイド曲線モデル（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６）に当てはめた結合曲線の補間により計算した。更に、組換えヒトコラーゲン、抗ヒトＬＡＩＲ１抗体、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ、抗ＰＤ１、及び抗ＳＬＡＭ抗体への結合をＥＬＩＳＡで試験した。簡潔に説明すると、Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌ ４７０（ＥＲＭｓ－ＤＡ４７０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を標準として使用し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、２０４０－０１）でコーティングした９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）を使用して、総ＩｇＧを定量した。抗体構築物の特異的結合を試験するために、ＥＬＩＳＡプレートを２μｇｍｌ^－１のＩ型組換えヒトコラーゲン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＣＣ０５０）、２μｇｍｌ^－１の抗ヒトＬＡＩＲ１抗体（クローンＤＸ２６、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５５０８１０）、１μｇｍｌ^－１の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ（Ｇｅｎｔａｕｒ）、２μｇｍｌ^－１の抗ＰＤ１又は抗ＳＬＡＭ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＦ１０８６及びＡＦ１６４）でコーティングした。プレートを１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングし、滴定抗体と共にインキュベートした後、ＡＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０９－０５６－０９８）とインキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、基質（ｐ－ＮＰＰ、Ｓｉｇｍａ）を加え、プレートを４０５ｎｍで読み取った。

【0260】

各結合試験の結果を図３に示す。ＬＡＩＲ１を有する抗体構築物は、ＩＥを染色し、抗ＬＡＩＲ１抗体によって認識された。抗ＧＭ－ＣＳＦ抗体のエルボー領域へのＬＡＩＲ１、ＰＤ１、又はＳＬＡＭＩｇ様ドメインの挿入は、ＧＭ－ＣＳＦへの結合に影響を及ぼさず（構築物Ｃ４～Ｃ６）、このことは、この部位が、元の抗体特異性に影響を及ぼすことなく各種ドメインの挿入を許容する。対照的に、ＣＤＲ３へのＬＡＩＲ１の挿入は、ＧＭ－ＣＳＦへの結合を無効にした（データは示さず）。したがって、エルボー領域は、元の抗体特異性に影響を及ぼすことなく各種ドメインの挿入を許容する。

【0261】

実施例３：エルボーにＩｇ様ドメインを含む構築物は、２つの異なる抗原に同時に結合できる
エルボー領域に結合部位を有する二重特異性構築物が両方の特異性で同時に結合できるかどうかを試験するために、同時結合を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で調べた。この目的のために、ＧＭ－ＣＳＦに特異的なＶ（Ｄ）Ｊ領域を有し、エルボーに非変異ＬＡＩＲ１（コラーゲンの結合部位）を有する二重特異性構築物Ｃ４を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、ＧＭ－ＣＳＦとコラーゲンへの同時結合について試験した。

【0262】

１つの実験では、ＧＭ－ＣＳＦをセンサーチップの表面に固定化し、構築物を注入した後、コラーゲンを注入した。抗体Ｃ５及びＧＣＥ５３６（前記参照）、抗体ＭＧＤ^ＵＣＡ（非変異ＬＡＩＲ１を含むため、コラーゲンに結合可能；Ｔａｎ， Ｊ．， Ｐｉｅｐｅｒ， Ｋ．， Ｐｉｃｃｏｌｉ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ． Ａ ＬＡＩＲ１ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｂｒｏａｄｌｙ ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｍａｌａｒｉａ ｖａｒｉａｎｔ ａｎｔｉｇｅｎｓ． Ｎａｔｕｒｅ ５２９， １０５－１０９ （２０１６）；ＶＨ：配列番号７１、ＶＬ：配列番号７２、重鎖定常領域：配列番号３、軽鎖定常領域：配列番号４）及び抗体ＦＩ１７４（インフルエンザＨ１ヘマグルチニンに特異的；Ｐａｐｐａｓ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ． Ｒａｐｉｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｂｒｏａｄｌｙ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ． Ｎａｔｕｒｅ ５１６， ４１８－４２２ （２０１４）；（ＶＨ：配列番号１０、ＶＬ：配列番号１１、重鎖定常領域：配列番号３、軽鎖定常領域：配列番号４）を対照として使用した。簡潔に説明すると、ＧＭ－ＣＳＦ（２００ｎＭ）を１０ｍＭ酢酸バッファ（ｐＨ４．５）で安定化させ、エチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド／Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＥＤＣ／ＮＨＳ）（ｐｒｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＰｒｏｔｅＯｎｓｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐ （Ｂｉｏ－Ｒａｄ））上にアミンカップリングにより固定化し、未反応基を１ＭエタノールアミンＨＣｌの注入によりブロッキングした。ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）（１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｔｗｅｅｎ－２０）をランニングバッファーとして使用した。注入はいずれも、１００μｌ／ｍｉｎの流量で行った。モノクローナル抗体をＨＢＳで１０ｎＭに希釈し、ＧＭ－ＣＳＦでコーティングしたチップに２４０秒間注入し、続いて１２０秒間コラーゲン（５０ｎＭ）を注入した。チップの１つのチャネルにＨＢＳを注入し、分析のレファレンスとして使用した。ＧＭ－ＣＳＦ及びコラーゲンに対するモノクローナル抗体の各結合相互作用は、ＰｒｏｔｅＯＮＸＰＲ３６機器（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して評価し、データをＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアで処理した。

【0263】

結果を図４に示す。ＧＣＥ５３６を足場として使用する構築物Ｃ４及びＣ５（実施例１参照）は、ＧＭ－ＣＳＦに結合する。次いで、Ｃ４及びＣ５のうちＣ４（エルボー領域にＬＡＩＲ１を有する、一方、Ｃ５は、エルボー領域にＰＤ１のＩｇ様ドメインを有する）のみがコラーゲンに結合される。単一特異性抗ＧＭ－ＣＳＦ抗体ＧＣＥ５３６はＧＭ－ＣＳＦにのみ結合し、コラーゲンには結合しない。抗Ｈ１抗体ＦＩ１７４及びコラーゲン特異的ＭＧＤ^ＵＣＡ抗体は、特異的な結合シグナルを示さない。まとめると、これらのデータは、二重特異性構築物Ｃ４がＧＭ－ＣＳＦに結合し、次いで、コラーゲンがＣ４のＬＡＩＲ１ドメインに結合したことを示す。

【0264】

第２の実験では、タンパク質Ａを使用して構築物を捕捉した後、アナライトの同時注入（ＧＭ－ＣＳＦの後にコラーゲン）を行った。この実験では、抗体ＧＣＥ５３６及びＭＧＤ^ＵＣＡ（いずれも実施例１及び２に記載）及び抗体ＴＴ１０７（破傷風トキソイド（ＴＴ）に特異的；ＶＨ：配列番号７３、ＶＬ：配列番号７４、重鎖定常領域：配列番号３、軽鎖定常領域：配列番号４）を対照として使用した。簡潔に説明すると、タンパク質Ａ（２５μｇ／ｍｌ）を１０ｍＭ酢酸バッファ（ｐＨ４．５）で安定化させ、エチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド／Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＥＤＣ／ＮＨＳ）（ｐｒｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＰｒｏｔｅＯｎｓｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐ （Ｂｉｏ－Ｒａｄ））上にアミンカップリングにより固定化し、未反応基を１ＭエタノールアミンＨＣｌの注入によりブロッキングした。ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）（１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｔｗｅｅｎ－２０）をランニングバッファーとして使用した。注入はいずれも、１００μｌ／ｍｉｎの流量で行った。モノクローナル抗体をＨＢＳで１０ｎＭに希釈し、タンパク質Ａでコーティングしたチップに捕捉のために２４０秒間注入した後、ＧＭ－ＣＳＦコラーゲン（５０ｎＭ）とその直後にコラーゲン（５０ｎＭ）を合計１１０秒間同時注入した。チップの１つのチャネルにＨＢＳを注入し、分析のためのレファレンスとして使用した。ＧＭ－ＣＳＦ及びコラーゲンに対するモノクローナル抗体の各結合相互作用を、ＰｒｏｔｅＯＮＸＰＲ３６機器（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して評価し、データをＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアで処理した。

【0265】

結果を図５に示す。構築物Ｃ４及びＧＣＥ５３６は、ＧＭ－ＣＳＦに結合する。ただし、Ｃ４のみがコラーゲンによって認識される。コラーゲン特異的ＭＧＤ^ＵＣＡ抗体はコラーゲンのみに結合する。対照抗体ＴＴ１０７は、ＴＴ（破傷風トキソイド）特異的モノクローナル抗体であり、このＳＰＲ実験では特異的な結合シグナルを示さない。まとめると、これらの結果は、Ｉｇ様ドメインなどの（追加の）機能的ドメインをエルボー領域に含む構築物が、（ｉ）エルボー結合部位の結合パートナーと（ｉｉ）足場抗体の可変ドメインによって認識される抗原に同時に結合できることを示す。

【0266】

実施例４：Ｉｇ様ドメインは、抗体のエルボー領域に隣接リンカーと共に挿入され、機能的抗体がもたらされる
抗体構築物Ｃ５ｂ及びＣ６ｂは、Ｃ５及びＣ６構築物のエルボーに挿入された同一ドメイン（ＰＤ１又はＳＬＡＭ）を含み、ＪＨとドメインとの間及びドメインとＣＨ１との間に２つの追加１５－ｍｅｒアミノ酸リンカーが挿入されている。構築物を、ＥＬＩＳＡにより組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ、抗ＰＤ１、及び抗ＳＬＡＭ抗体への結合について試験した。簡潔に説明すると、Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌ ４７０（ＥＲＭｓ－ＤＡ４７０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を標準として使用し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、２０４０－０１）でコーティングした９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）を使用して、総ＩｇＧを定量した。抗体構築物の特異的結合を試験するために、ＥＬＩＳＡプレートを１μｇｍｌ^－１の組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ（Ｇｅｎｔａｕｒ）、２μｇｍｌ^－１の抗ＰＤ１又は抗ＳＬＡＭ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＦ１０８６及びＡＦ１６４）でコーティングした。プレートを１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングし、滴定抗体と共にインキュベートした後、ＡＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０９－０５６－０９８）とインキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、基質（ｐ－ＮＰＰ、Ｓｉｇｍａ）を加え、プレートを４０５ｎｍで読み取った。

【0267】

各結合試験の結果を図６に示す。隣接リンカーと共にＰＤ１又はＳＬＡＭ Ｉｇ様ドメインを抗ＧＭ－ＣＳＦ抗体のエルボー領域に挿入すると、ＧＭ－ＣＳＦへの結合に影響を及ぼさず、このことは、この部位が、元の抗体の特異性に影響を及ぼすことなく、隣接リンカーを有する各種ドメインの挿入が可能であることを示す。更に、Ｃ５とＣ５ｂの両方が抗ＰＤ１抗体によって同等に認識されたので、リンカーの存在は、Ｉｇ様ドメインを変更しなかった。抗ＳＬＡＭ抗体によって認識されるＣ６及びＣ６ｂについても同様の結果が得られた。まとめると、これらの知見は、ドメインを主要な抗体の足場から遠ざける追加のリンカーと共にドメインをエルボーに挿入することがきることを示唆する。理論に拘束されるものではないが、リンカーは、挿入物の柔軟性を高めることができると考えられる。

【0268】

実施例５：エルボー領域に挿入された分子タグを含む抗体の設計
抗体検出のために抗体のエルボー領域に挿入されたタグを使用する可能性について調べるために、ツインＳｔｒｅｐタグを足場抗体Ｃ１ｂ（実施例１参照）の重鎖のエルボー領域に挿入した１つの構築物（「Ｃ９」と名付ける）。構築物の軽鎖は、足場抗体と比較して変更しなかった。構築物は、最終的にモノクローナル抗体（重鎖及び軽鎖）として発現した。

【0269】

構築物「Ｃ９」を図２に模式的に示す。構築物「Ｃ９」では、ツインＳｔｒｅｐタグ（「２ＸＳＴ」；配列番号２０）を、組換え単一特異性抗体「Ｃ１ｂ」のエルボー領域に挿入した（前記参照）。構築物「Ｃ９」（完全な重鎖：配列番号６５、完全な軽鎖：配列番号６３）は、以下によって（ＮからＣ末端にこの順で）形成される：重鎖可変ドメインのＶ（可変）遺伝子セグメントの発現産物（「ＶＨ３－２０」）；重鎖可変ドメインのＤ（多様性）遺伝子セグメントの発現産物（「Ｄ」）；重鎖可変ドメインのＪ（結合）遺伝子セグメントエレメントの発現産物（「ＪＨ３」）；ツインＳｔｒｅｐタグの発現産物（「２ＸＳＴ」）；重鎖定常領域のＣ（定常）遺伝子セグメントの発現産物（ＩｇＧ１アイソタイプ）；及び別の鎖上に、軽鎖可変ドメインのＶ（可変）遺伝子セグメントの発現産物及び軽鎖可変ドメインのＪ（結合）遺伝子セグメントエレメントの発現産物；軽鎖カッパ定常領域のＣ（定常）遺伝子セグメントの発現産物。

【0270】

実施例６：分子タグが抗体のエルボー領域に挿入され、機能的抗体がもたらされる
実施例５に記載した抗体構築物「Ｃ９」を、一過性トランスフェクションによる組換えにより産生した。この目的のために、抗体の重鎖及び軽鎖をヒトＩｇＧ１及びＩｇκ発現ベクターにクローニングし、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の一過性トランスフェクションにより発現させた。細胞株は、マイコプラズマ汚染について汎用法により試験した。

【0271】

次に、抗体構築物Ｃ９及び対照抗体Ｃ１ｂ（実施例１参照）を、ＥＬＩＳＡによりＳｔｒｅｐタグ特異的Ｓｔｒｅｐタクチン分子による認識について試験した。簡潔に説明すると、Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌ ４７０（ＥＲＭｓ－ＤＡ４７０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を標準として使用し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、２０４０－０１）でコーティングした９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）を使用して、総ＩｇＧを定量した。抗体構築物の特異的結合を試験するために、ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇｍｌ^－１の抗ヒトＩｇＧ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）でコーティングし、プレートを１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングし、滴定抗体と共にインキュベートした後、ＡＰコンジュゲートＳｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（Ｉｂａ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）とインキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、基質（ｐ－ＮＰＰ、Ｓｉｇｍａ）を加え、プレートを４０５ｎｍで読み取った。

【0272】

結果を図７に示す。Ｓｔｒｅｐタグを有する抗体構築物「Ｃ９」は、Ｓｔｒｅｐタグ特異的なＳｔｒｅｐタクチンによって効率的且つ特異的に認識されたが、Ｓｔｒｅｐタグを有しない対照「Ｃ１ｂ」抗体は認識されなかった。これらの結果は、エルボーが抗体の認識と追跡を可能にする分子タグの挿入を許容することを示唆する。

【0273】

実施例７：エルボー領域に挿入された単鎖抗体可変ドメイン（ＶＨＨ）又は単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）を含む抗体の設計
Ｉｇ様ドメイン以外の（追加の）機能的ドメインのエルボー領域への挿入が機能的多重特異性抗体をもたらすかどうかを調べるために、４種の新たな構築物を設計した（Ｃ９～Ｃ１２）。４種の新たな構築物Ｃ９～Ｃ１２では、破傷風トキソイド（ＴＴ）又は呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の融合（Ｆ）タンパク質に特異的な、単鎖抗体可変ドメイン（ＶＨＨ）又は単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）それぞれを、インフルエンザＨ１ヘマグルチニンに特異的な抗体（ＦＩ１７４；Ｐａｐｐａｓ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ． Ｒａｐｉｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｂｒｏａｄｌｙ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ． Ｎａｔｕｒｅ ５１６， ４１８－４２２ （２０１４）；ＶＨ：配列番号１０、ＶＬ：配列番号１１、重鎖定常領域：配列番号３、軽鎖カッパ定常領域：配列番号１２／配列番号４）のエルボー領域に挿入した。構築物の軽鎖は、足場抗体ＦＩ１７４と比較して変更しなかった。いずれもの築物も、最終的にモノクローナル抗体（重鎖及び軽鎖）として発現させた。

【0274】

以下の変異体を作製した。図８に模式的に示す。
１．構築物「Ｃ１０」では、抗ＴＴ ＶＨＨ（「Ｔ３－ＶＨＨ」；Ｒｏｓｓｏｔｔｉ， Ｍ．Ａ．， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ． ｍＡｂｓ ７， ８２０－８２８ （２０１５）；配列番号１６）をＦＩ１７４のエルボー領域に挿入した。構築物「Ｃ１０」（完全な重鎖：配列番号６６、完全な軽鎖：配列番号６７）は、以下によって（ＮからＣ末端にこの順で）形成される：ＦＩ１７４の重鎖可変ドメインのＶ（可変）遺伝子セグメントの発現産物（「ＶＨ」）；ＦＩ１７４の重鎖可変ドメインのＤ（多様性）遺伝子セグメントの発現産物（「Ｄ」）；ＦＩ１７４の重鎖可変ドメインのＪ（結合）遺伝子セグメントエレメントの発現産物（「ＪＨ」）；抗ＴＴ ＶＨＨ（「Ｔ３－ＶＨＨ」；Ｒｏｓｓｏｔｔｉ， Ｍ．Ａ．， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ． ｍＡｂｓ ７， ８２０－８２８ （２０１５）の発現産物；重鎖定常領域のＣ（定常）遺伝子セグメントの発現産物（ＩｇＧ１アイソタイプ）；及び別の鎖上に、ＦＩ１７４の軽鎖可変ドメインのＶ（可変）遺伝子セグメントの発現産物及びＦＩ１７４の軽鎖可変ドメインのＪ（結合）遺伝子セグメントエレメントの発現産物；軽鎖定常領域のＣ（定常）遺伝子セグメントの発現産物。

【0275】

２．構築物「Ｃ１１」では、抗ＴＴ ＳｃＦｖ（「ＴＴ３９．７－ＳｃＦｖ」；配列番号１７）をＦＩ１７４のエルボー領域に挿入した。構築物「Ｃ１１」（完全な重鎖：配列番号６８、完全な軽鎖：配列番号６７）は、以下によって（ＮからＣ末端にこの順で）形成される：ＦＩ１７４の重鎖可変ドメインのＶ（可変）遺伝子セグメントの発現産物（「ＶＨ」）；ＦＩ１７４の重鎖可変ドメインのＤ（多様性）遺伝子セグメントの発現産物（「Ｄ」）；ＦＩ１７４の重鎖可変ドメインのＪ（結合）遺伝子セグメントエレメントの発現産物（「ＪＨ」）；抗ＴＴ ＳｃＦｖの発現産物（「ＴＴ３９．７－ＳｃＦｖ」）；重鎖定常領域のＣ（定常）遺伝子セグメントの発現産物（ＩｇＧ１アイソタイプ）；及び別の鎖上に、ＦＩ１７４の軽鎖可変ドメインのＶ（可変）遺伝子セグメントの発現産物及びＦＩ１７４の軽鎖可変ドメインのＪ（結合）遺伝子セグメントエレメントの発現産物；軽鎖定常領域のＣ（定常）遺伝子セグメントの発現産物。

【0276】

３．構築物「Ｃ１２」では、抗ＲＳＶ Ｆタンパク質ＶＨＨ（「Ｆ４－ＶＨＨ」； Ｒｏｓｓｅｙ， Ｉ．， ｅｔ ａｌ． Ｐｏｔｅｎｔ ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ａｒｒｅｓｔ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｉｔｓ ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ ｓｔａｔｅ． Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ８， １４１５８ （２０１７）；配列番号１８）をＦＩ１７４のエルボー領域に挿入した。構築物「Ｃ１２」（完全な重鎖：配列番号６９、完全な軽鎖：配列番号６７）は、以下によって（ＮからＣ末端にこの順で）形成される：ＦＩ１７４の重鎖可変ドメインのＶ（可変）遺伝子セグメントの発現産物（「ＶＨ」）；ＦＩ１７４の重鎖可変ドメインのＤ（多様性）遺伝子セグメントの発現産物（「Ｄ」）；ＦＩ１７４の重鎖可変ドメインのＪ（結合）遺伝子セグメントエレメントの発現産物（「ＪＨ」）；抗ＲＳＶ Ｆタンパク質ＶＨＨ（「Ｆ４－ＶＨＨ」； Ｒｏｓｓｅｙ， Ｉ．， ｅｔ ａｌ． Ｐｏｔｅｎｔ ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ａｒｒｅｓｔ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｉｔｓ ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ ｓｔａｔｅ． Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ８， １４１５８ （２０１７）の発現産物；重鎖定常領域のＣ（定常）遺伝子セグメントの発現産物（ＩｇＧ１アイソタイプ）；及び別の鎖上に、ＦＩ１７４の軽鎖可変ドメインのＶ（可変）遺伝子セグメントの発現産物及びＦＩ１７４の軽鎖可変ドメインのＪ（結合）遺伝子セグメントエレメントの発現産物；軽鎖定常領域のＣ（定常）遺伝子セグメントの発現産物。

【0277】

４．構築物「Ｃ１３」では、抗ＲＳＶ Ｆタンパク質ＳｃＦｖ（「ＭＰＥ８－ＳｃＦｖ」； Ｃｏｒｔｉ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ． Ｃｒｏｓｓ－ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ａ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ． Ｎａｔｕｒｅ ５０１， ４３９－４４３ （２０１３）；配列番号１９）をＦＩ１７４のエルボー領域に挿入した。構築物「Ｃ１３」（完全な重鎖：配列番号７０、完全な軽鎖：配列番号６７）は、以下によって（ＮからＣ末端にこの順で）形成される：ＦＩ１７４の重鎖可変ドメインのＶ（可変）遺伝子セグメントの発現産物（「ＶＨ」）；ＦＩ１７４の重鎖可変ドメインのＤ（多様性）遺伝子セグメントの発現産物（「Ｄ」）；ＦＩ１７４の重鎖可変ドメインのＪ（結合）遺伝子セグメントエレメントの発現産物（「ＪＨ」）；抗ＲＳＶ Ｆタンパク質ＳｃＦｖ（「ＭＰＥ８－ＳｃＦｖ」； Ｃｏｒｔｉ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ． Ｃｒｏｓｓ－ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ａ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ． Ｎａｔｕｒｅ ５０１， ４３９－４４３ （２０１３）の発現産物；重鎖定常領域のＣ（定常）遺伝子セグメントの発現産物（ＩｇＧ１アイソタイプ）；及び別の鎖上に、ＦＩ１７４の軽鎖可変ドメインのＶ（可変）遺伝子セグメントの発現産物及びＦＩ１７４の軽鎖可変ドメインのＪ（結合）遺伝子セグメントエレメントの発現産物；軽鎖定常領域のＣ（定常）遺伝子セグメントの発現産物。

【0278】

実施例８：ＶＨＨ及びＳｃＦｖがエルボー領域に挿入され、機能的二重特異性抗体が得られる
実施例４に記載した４種の新たな抗体構築物を、一過性トランスフェクションにより組換えにより産生した。この目的のために、抗体の重鎖及び軽鎖をヒトＩｇＧ１、Ｉｇκ、及びＩｇλ発現ベクターにクローニングし、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用したＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の一過性トランスフェクションにより発現させた。構築物を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、（ｉ）Ｈ１及び（ｉｉ）ＴＴ又はＲＳＶ Ｆタンパク質への二重の結合について試験した。

【0279】

第１の実験では、構築物Ｃ１０及びＣ１１（ＦＩ１７４のエルボー領域にＴＴ特異的ＶＨＨ又はｓｃＦｖを含む）を分析しました。この目的のために、プロテインＡを使用して構築物を捕捉し、続いてアナライトの同時注入を行った（最初のアナライトとしてＨ１、その直後にＴＴ）。対照として、ＴＴ特異的抗体ＴＴ１０７及びＨ１特異的抗体ＦＩ１７４を使用した。簡潔に説明すると、プロテインＡ（２５μｇ／ｍｌ）を１０ｍＭ酢酸バッファ（ｐＨ４．５）で安定化させ、エチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド／Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＥＤＣ／ＮＨＳ）（ｐｒｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＰｒｏｔｅＯｎｓｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐ （Ｂｉｏ－Ｒａｄ））上にアミンカップリングにより固定化し、未反応基を１ＭエタノールアミンＨＣｌの注入によりブロッキングした。ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）（１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｔｗｅｅｎ－２０）をランニングバッファーとして使用した。注入はいずれも、１００μｌ／ｍｉｎの流量で行った。モノクローナル抗体をＨＢＳで１０ｎＭに希釈し、プロテインＡでコーティングしたチップに捕捉のために２４０秒間注入した後、Ｈ１ カリフォルニアヘマグルチニン（５０ｎＭ）とその直後に破傷風トキソイド（５０ｎＭ）を合計１１０秒間同時注入した。チップの１つのチャネルにＨＢＳを注入し、分析のためのレファレンスとして使用した。Ｈ１及びＴＴに対するモノクローナル抗体の各結合相互作用を、ＰｒｏｔｅＯＮＸＰＲ３６機器（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して評価し、データをＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアで処理した。結果を図９に示す。構築物Ｃ１０及びＣ１１（ＴＴ特異的ドメイン（ＶＨＨ又はＳｃＦｖ）を有する）は、Ｈ１とＴＴの両方に結合し、対照抗体ＦＩ１７４及びＴＴ１０７は、それぞれＨ１のみ又はＴＴのみを認識する。

【0280】

第２の実験では、構築物Ｃ１２及びＣ１３（ＦＩ１７４のエルボー領域にＲＳＶ Ｆタンパク質特異的ＶＨＨ又はｓｃＦｖを含む）を分析しました。この目的のために、プロテインＡを使用して構築物を捕捉し、続いてアナライトの同時注入を行った（最初のアナライトとしてＨ１、その直後にＲＳＶ Ｆタンパク質）。対照として、ＲＳＶ Ｆタンパク質特異的抗体ＭＰＥ８及びＨ１特異的抗体ＦＩ１７４を使用した。簡潔に説明すると、プロテインＡ（２５μｇ／ｍｌ）を１０ｍＭ酢酸バッファ（ｐＨ４．５）で安定化させ、エチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド／Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＥＤＣ／ＮＨＳ）（ｐｒｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＰｒｏｔｅＯｎｓｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐ （Ｂｉｏ－Ｒａｄ））上にアミンカップリングにより固定化し、未反応基を１ＭエタノールアミンＨＣｌの注入によりブロッキングした。ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）（１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｔｗｅｅｎ－２０）をランニングバッファーとして使用した。注入はいずれも、１００μｌ／ｍｉｎの流量で行った。モノクローナル抗体をＨＢＳで１０ｎＭに希釈し、プロテインＡでコーティングしたチップに捕捉のために２４０秒間注入した後、Ｈ１ カリフォルニアヘマグルチニン（５０ｎＭ）とその直後にＲＳＶ Ｆタンパク質（５０ｎＭ）を合計１１０秒間同時注入した。チップの１つのチャネルにＨＢＳを注入し、分析のためのレファレンスとして使用した。Ｈ１及びＲＳＶ Ｆタンパク質に対するモノクローナル抗体の各結合相互作用を、ＰｒｏｔｅＯＮＸＰＲ３６機器（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して評価し、データをＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアで処理した。結果を図１０に示す。構築物Ｃ１２及びＣ１３（ＲＳＶ Ｆタンパク質特異的ドメイン（ＶＨＨ又はＳｃＦｖ）を有する）は、Ｈ１とＲＳＶ Ｆタンパク質の両方に結合し、対照抗体ＦＩ１７４及びＭＰＥ８は、それぞれＨ１のみ又はＲＳＶ Ｆタンパク質のみを認識する。

【0281】

まとめると、データは、ＦＩ１７４のエルボー領域へのＶＨＨ又はＳｃＦｖドメインの挿入が、Ｈ１ヘマグルチンへの結合に影響を及ぼさなかったことを示し、このことは、Ｉｇ様ドメインについて既に上で示したように、この部位が、元の抗体特異性に影響を及ぼすことなく、各種ドメインの挿入を許容することを示す。抗体足場のＶＤＪ領域とエルボーに挿入されたＶＨＨ又はＳｃＦｖドメインとによる２つの異なる特異的抗原の二重同時認識は、エルボーに異なるタイプの挿入物を有する機能的二重特異性抗体を生成できることを示す。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表1-6】

【表1-7】

【表1-8】

【表1-9】

【表1-10】

【表1-11】

【表1-12】

【表1-13】

【表1-14】

【表1-15】

【表1-16】

【表1-17】

【表1-18】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

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