特開 2023-123701 エチレングリコールの生物生産のための微生物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023123701

(43)【公開日】2023-09-05

(54)【発明の名称】エチレングリコールの生物生産のための微生物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20230829BHJP

   C12N 15/53 20060101ALI20230829BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20230829BHJP

   C12N 15/60 20060101ALI20230829BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20230829BHJP

   C12N 15/61 20060101ALI20230829BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20230829BHJP

   C12P 7/18 20060101ALI20230829BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20230829BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20230829BHJP

   C12N 15/52 20060101ALI20230829BHJP

【ＦＩ】

C12N1/21 ZNA

C12N15/53

C12N15/54

C12N15/60

C12N15/31

C12N15/61

C12N15/55

C12P7/18

C12N1/00 Q

C12N1/00 R

C12N1/20 D

C12N1/20 F

C12N1/20 Z

C12N15/52 Z

【審査請求】有

【請求項の数】20

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023105168

(22)【出願日】2023-06-27

(62)【分割の表示】P 2020532013の分割

【原出願日】2018-12-19

(31)【優先権主張番号】62/607,446

(32)【優先日】2017-12-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/683,454

(32)【優先日】2018-06-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】518403425

【氏名又は名称】ランザテク，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100196966

【弁理士】

【氏名又は名称】植田 渉

(72)【発明者】

【氏名】ケプケ，マイケル

(72)【発明者】

【氏名】ジェンセン，ラスムス

(57)【要約】      （修正有）

【課題】ガス状基質から高収量のエチレングリコールおよびエチレングリコール前駆体を生成することができる、遺伝子操作された微生物、ならびに前記前駆体の生成方法を提供する。
【解決手段】ガス状基質からエチレングリコールまたはエチレングリコールの前駆体を生成できる遺伝子操作されたＣ１固定微生物であって、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、２，５－ジオキソ吉草酸デヒドロゲナーゼ、ベタイン－アルデヒドデヒドロゲナーゼ、またはアルデヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される異種酵素をコードする核酸を含む、微生物を提供する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ガス状基質からエチレングリコールまたはエチレングリコールの前駆体を生成できる遺
伝子操作された微生物。

【請求項2】

前記微生物が、５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸、オキサロ酢酸、クエン酸、リン
ゴ酸、およびグリシンからなる群から選択される１つ以上の中間体を介してエチレングリ
コールまたはエチレングリコールの前駆体を生成する、請求項１に記載の微生物。

【請求項3】

前記微生物が、
ａ．オキサロ酢酸をクエン酸に変換できる異種酵素、
ｂ．グリシンをグリオキシル酸に変換できる異種酵素、
ｃ．イソクエン酸をグリオキシル酸に変換できる異種酵素、および
ｄ．グリコール酸をグリコアルデヒドに変換できる異種酵素、のうちの１つ以上を含む
、請求項１に記載の微生物。

【請求項4】

ａ．オキサロ酢酸をクエン酸に変換できる前記異種酵素が、クエン酸［Ｓｉ］－シンタ
ーゼ［２．３．３．１］、ＡＴＰクエン酸シンターゼ［２．３．３．８］またはクエン酸
（Ｒｅ）－シンターゼ［２．３．３．３］であり、
ｂ．グリシンをグリオキシル酸に変換できる前記異種酵素が、アラニン－グリオキシル
酸トランスアミナーゼ［２．６．１．４４］、セリン－グリオキシル酸トランスアミナー
ゼ［２．６．１．４５］、セリン－ピルビン酸トランスアミナーゼ［２．６．１．５１］
、グリシン－オキサロ酢酸トランスアミナーゼ［２．６．１．３５］、グリシントランス
アミナーゼ［２．６．１．４］、グリシンデヒドロゲナーゼ［１．４．１．１０］、アラ
ニンデヒドロゲナーゼ［１．４．１．１］、またはグリシンデヒドロゲナーゼ［１．４．
２．１］であり、
ｃ．イソクエン酸をグリオキシル酸に変換できる前記異種酵素が、イソクエン酸リアー
ゼ［４．１．３．１］であり、かつ／または
ｄ．グリコール酸をグリコールアルデヒドに変換できる前記異種酵素が、グリコールア
ルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．１．２１］、ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ［
１．２．１．２２］、コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．１．２４］、
２，５－ジオキソ吉草酸デヒドロゲナーゼ［１．２．１．２６］、アルデヒドデヒドロゲ
ナーゼ［１．２．１．３／４／５］、ベタイン－アルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．
１．８］、またはアルデヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼ［１．２．７．５］で
ある、請求項３に記載の微生物。

【請求項5】

前記異種酵素のうちの１つ以上が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｌ
ｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、
Ｓｅｄｉｍｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、
Ｔｈｅｒｍｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ、およびＺｅａからなる
群から選択される属に由来する、請求項３に記載の微生物。

【請求項6】

前記異種酵素のうちの１つ以上が、前記微生物における発現のためにコドン最適化され
ている、請求項３に記載の微生物。

【請求項7】

前記微生物は、アセチル－ＣｏＡをピルビン酸に変換できる酵素、ピルビン酸をオキサ
ロ酢酸に変換できる酵素、ピルビン酸をリンゴ酸に変換できる酵素、ピルビン酸をホスフ
ェノールピルビン酸に変換できる酵素、オキサロ酢酸をシトリル－ＣｏＡに変換できる酵
素、シトリル－ＣｏＡをクエン酸に変換できる酵素、クエン酸をアコニット酸に、および
アコニット酸をイソクエン酸に変換できる酵素、ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢
酸に変換きる酵素、ホスホエノールピルビン酸を２－ホスホ－Ｄ－グリセリン酸に変換で
きる酵素、２－ホスホ－Ｄ－グリセリン酸を３－ホスホ－Ｄ－グリセリン酸に変換できる
酵素、３－ホスホ－Ｄ－グリセリン酸を３－ホスホノオキシピルビン酸に変換できる酵素
、３－ホスホノオキシピルビン酸を３－ホスホ－Ｌ－セリンに変換できる酵素、３－ホス
ホ－Ｌ－セリンをセリンに変換できる酵素、セリンをグリシンに変換できる酵素、５，１
０－メチレンテトラヒドロ葉酸をグリシンに変換できる酵素、セリンをヒドロキシピルビ
ン酸に変換できる酵素、Ｄ－グリセリン酸をヒドロキシピルビン酸に変換できる酵素、リ
ンゴ酸をグリオキシル酸に変換できる酵素、グリオキシル酸をグリコール酸に変換できる
酵素、ヒドロキシピルビン酸をグリコアルデヒドに変換できる酵素、およびグリコアルデ
ヒドをエチレングリコールに変換できる酵素、のうちの１つ以上をさらに含む、請求項３
に記載の微生物。

【請求項8】

前記微生物が、
ａ．前記オキサロ酢酸をクエン酸に変換できる異種酵素、
ｂ．前記グリシンをグリオキシル酸に変換できる異種酵素および／または
ｃ．前記グリコール酸をグリコアルデヒドに変換できる異種酵素、を過剰発現する、請
求項３に記載の微生物。

【請求項9】

前記微生物が、
ａ．前記ピルビン酸をオキサロ酢酸に変換できる酵素、
ｂ．前記クエン酸をアコニット酸に、およびアコニット酸をイソクエン酸に変換できる
酵素、
ｃ．前記ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸に変換できる酵素、
ｄ．前記セリンをグリシンに変換できる酵素、
ｅ．前記５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸をグリシンに変換できる酵素、
ｆ．前記グリオキシル酸をグリコール酸に変換できる酵素、および／または
ｇ．前記グリコアルデヒドをエチレングリコールに変換できる酵素、を過剰発現する、
請求項７に記載の微生物。

【請求項10】

前記微生物が、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、グリセリン酸デヒドロゲナーゼ、グリ
コール酸デヒドロゲナーゼ、グリセリン酸デヒドロゲナーゼ、グリコール酸デヒドロゲナ
ーゼ、アルデヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼ、およびアルデヒドデヒドロゲナ
ーゼのうちの１つ以上に破壊的変異を含む、請求項１に記載の微生物。

【請求項11】

前記微生物が、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｂｌａ
ｕｔｉａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ、およびＴｈｅ
ｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒからなる群から選択される属のメンバーである、請求項
１に記載の微生物。

【請求項12】

前記微生物が、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕ
ｌｕｍ ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃ
ｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉ
ｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｓｋａｔｉｉ、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃ
ｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉ
ｕｍ ｍａｇｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄ
ｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏ
ｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａ
ｃｅｔｉｃａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａ
ｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅ
ｒｏｉｄｅｓ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｕｖｉからなる群か
ら選択される親微生物に由来する、請求項１に記載の微生物。

【請求項13】

前記微生物が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓ
ｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄ
ａｌｅｉからなる群から選択される親細菌に由来する、請求項１２に記載の微生物。

【請求項14】

前記微生物が、天然または異種のＷｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を含む、請求項１
に記載の微生物。

【請求項15】

前記エチレングリコールの前駆体がグリオキシル酸またはグリコール酸である、請求項
１に記載の微生物。

【請求項16】

前記ガス状基質の存在下、栄養培地中で請求項１に記載の微生物を培養し、それによっ
て前記微生物がエチレングリコールまたはエチレングリコールの前駆体を生成することを
含む、エチレングリコールまたはエチレングリコールの前駆体の生成方法。

【請求項17】

前記ガス状基質が、ＣＯ、ＣＯ_２、およびＨ_２のうちの１つ以上を含む、請求項１６に
記載の方法。

【請求項18】

前記エチレングリコールの前駆体がグリオキシル酸またはグリコール酸である、請求項
１６に記載の方法。

【請求項19】

前記栄養培地からエチレングリコールまたはエチレングリコールの前駆体を分離するこ
とをさらに含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項20】

前記微生物がエタノール、２，３－ブタンジオール、およびコハク酸うちの１つ以上を
さらに生成する、請求項１６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

背景
本発明は、遺伝子操作された微生物と、微生物発酵による、具体的には、ガス状基質の
微生物発酵によるにエチレングリコールおよびエチレングリコール前駆体の生産のための
方法とに関する。

【背景技術】

【0002】

モノエチレングリコール（ＭＥＧ）としても知られるエチレングリコールの現在の市場
価値は３３０億ドルを超え、多種多様な産業、医療、消費者製品の重要な構成要素である
。エチレングリコールは現在、大量のエネルギーと水を必要とし、多くの望ましくない副
産物を生成し、石油化学原料に依存する化学触媒プロセスを使用して生産されている。持
続可能な材料の需要は、サトウキビ由来のエタノールからのエチレングリコールの触媒的
な生産など、いくつかの技術進歩をもたらしている。

【0003】

エチレングリコール前駆体も商業的に価値がある。例えば、グリコール酸はスキンケア
、パーソナルケア、染色、日焼け、および洗浄剤として使用される。グリオキシル酸は、
バニリン、農薬、抗生物質、アラントイン、および錯化剤の中間体である。

【0004】

しかしながら、エチレングリコールを生物学的に生産できる微生物は知られておらず、
エチレングリコールの生産への完全な生物学的経路は十分に確立されていない。糖からの
エチレングリコールへのいくつかの生物学的経路が文献に記載されている。例えば、Ａｌ
ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ，１４：１２７，２０１５は
、Ｅ．ｃｏｌｉでの（Ｄ）－キシロースからのエチレングリコールの生成を実証したが、
高収量を達成するには好気性条件が必要であることに着目した。同様に、Ｐｅｒｅｉｒａ
ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ，３４：８０－８７，２０１６では、Ｅ．ｃｏｌｉ
でのペントースからのエチレングリコール生成を達成した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで
のペントースからのエチレングリコール生成に関するいくつかの研究も行われているが、
一貫性のない結果が示されている。例えば、Ｕｒａｎｕｋｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａ
ｂ Ｅｎｇ，５１：２０－３１，２０１８を参照されたい。

【0005】

ガス発酵は、産業廃棄ガス、合成ガス、化学薬品や燃料に改質されたメタンなど、すぐ
に入手できる低コストのＣ１原料を幅広く使用するための経路を提供する。ガス発酵代謝
は糖発酵代謝とは大きく異なるので、上記の経路の使用は、これらの経路がエネルギーネ
ガティブプロセスである糖新生を介してガスから糖前駆体を生成する必要があるため、実
用的ではない。今日まで、ガス状基質からエチレングリコールを製造する方法は得られて
いない。

【0006】

Ｉｓｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ，４１：１７３－１８１，２０１７は
、探索的演習で、ケモインフォマティクスツールを使用してＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉ
ａで合成ガスからエチレングリコールを生成するための数百の仮説的な経路を予測した。
しかしながら、経路の多くは熱力学的または他の制約のために実行不可能であるため、当
業者でさえこれらの経路をガス発酵生物に組み込むことは不可能である。例えば、Ｉｓｌ
ａｍ ｅｔ ａｌ．には、ほぼ２，０００の酸素または酸素ラジカルに依存する反応が含
まれており、厳密な嫌気性システムでは実行できない。既知の反応を有するＩｓｌａｍ
ｅｔ ａｌ．による唯一確認された仮説の経路は、中間体として糖新生またはエタノール
を必要とする。したがって、ガス状基質から高収量のエチレングリコールおよびエチレン
グリコール前駆体を生成することができる、有効な、エネルギー的に好ましい組換え生成
システムが依然として必要とされている。

【発明の概要】

【0007】

本発明が従来技術に勝る特定の利点および進歩を提供するのは、上記の背景においてで
ある。

【0008】

本明細書に開示される本発明は、特定の利点または機能に限定されないが、本発明は、
ガス状基質からエチレングリコールまたはエチレングリコールの前駆体を生成できる遺伝
子操作された微生物を提供する。

【0009】

本明細書に開示される微生物のいくつかの態様において、微生物は、５，１０－メチレ
ンテトラヒドロ葉酸、オキサロ酢酸、クエン酸、リンゴ酸、およびグリシンからなる群か
ら選択される１つ以上の中間体を介してエチレングリコールまたはエチレングリコールの
前駆体を生成する。

【0010】

本明細書に開示される微生物のいくつかの態様では、微生物は、オキサロ酢酸をクエン
酸に変換できる異種酵素、グリシンをグリオキシル酸に変換できる異種酵素、イソクエン
酸をグリオキシル酸に変換できる異種酵素、およびグリコール酸をグリコアルデヒドに変
換できる異種酵素のうちの１つ以上を含む。

【0011】

本明細書に開示される微生物のいくつかの態様において、オキサロ酢酸をクエン酸に変
換できる前記異種酵素が、クエン酸［Ｓｉ］－シンターゼ［２．３．３．１］、ＡＴＰク
エン酸シンターゼ［２．３．３．８］またはクエン酸（Ｒｅ）－シンターゼ［２．３．３
．３］であり、グリシンをグリオキシル酸に変換できる前記異種酵素が、アラニン－グリ
オキシル酸トランスアミナーゼ［２．６．１．４４］、セリン－グリオキシル酸トランス
アミナーゼ［２．６．１．４５］、セリン－ピルビン酸トランスアミナーゼ［２．６．１
．５１］、グリシン－オキサロ酢酸トランスアミナーゼ［２．６．１．３５］、グリシン
トランスアミナーゼ［２．６．１．４］、グリシンデヒドロゲナーゼ［１．４．１．１０
］、アラニンデヒドロゲナーゼ［１．４．１．１］、またはグリシンデヒドロゲナーゼ［
１．４．２．１］であり、イソクエン酸をグリオキシル酸に変換できる前記異種酵素が、
イソクエン酸リアーゼ［４．１．３．１］であり、かつ／またはグリコール酸をグリコア
ルデヒドに変換できる前記異種酵素が、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２
．１．２１］、ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．１．２２］、コハク酸セミ
アルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．１．２４］、２，５－ジオキソ吉草酸デヒドロゲ
ナーゼ［１．２．１．２６］、アルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．１．３／４／５］
、ベタイン－アルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．１．８］、またはアルデヒドフェレ
ドキシンオキシドレダクターゼ［１．２．７．５］である。

【0012】

本明細書に開示される微生物のいくつかの態様では、異種酵素は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｈｙ
ｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕ
ｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｅｄｉｍｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ
、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔ
ｏｇａ、およびＺｅａからなる群から選択される属に由来する。

【0013】

本明細書に開示される微生物のいくつかの態様では、異種酵素のうちの１つ以上は、微
生物における発現のためにコドン最適化されている。

【0014】

本明細書に開示される微生物のいくつかの態様では、微生物は、アセチル－ＣｏＡをピ
ルビン酸に変換できる酵素、ピルビン酸をオキサロ酢酸に変換できる酵素、ピルビン酸を
リンゴ酸に変換できる酵素、ピルビン酸をホスフェノールピルビン酸に変換できる酵素、
オキサロ酢酸をシトリル－ＣｏＡに変換できる酵素、シトリル－ＣｏＡをクエン酸に変換
できる酵素、クエン酸をアコニット酸に、およびアコニット酸をイソクエン酸に変換でき
る酵素、ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸に変換きる酵素、ホスホエノールピル
ビン酸を２－ホスホ－Ｄ－グリセリン酸に変換できる酵素、２－ホスホ－Ｄ－グリセリン
酸を３－ホスホ－Ｄ－グリセリン酸に変換できる酵素、３－ホスホ－Ｄ－グリセリン酸を
３－ホスホノオキシピルビン酸に変換できる酵素、３－ホスホノオキシピルビン酸を３－
ホスホ－Ｌ－セリンに変換できる酵素、３－ホスホ－Ｌ－セリンをセリンに変換できる酵
素、セリンをグリシンに変換できる酵素、５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸をグリシ
ンに変換できる酵素、セリンをヒドロキシピルビン酸に変換できる酵素、Ｄ－グリセリン
酸をヒドロキシピルビン酸に変換できる酵素、リンゴ酸をグリオキシル酸に変換できる酵
素、グリオキシル酸をグリコール酸に変換できる酵素、ヒドロキシピルビン酸をグリコア
ルデヒドに変換できる酵素、かつ／またはグリコアルデヒドをエチレングリコールに変換
できる酵素、のうちの１つ以上をさらに含む。

【0015】

本明細書に開示される微生物のいくつかの態様では、微生物は、オキサロ酢酸をクエン
酸に変換できる異種酵素、グリシンをグリオキシル酸に変換できる異種酵素、および／ま
たはグリコール酸をグリコアルデヒドに変換できる異種酵素を過剰発現する。

【0016】

本明細書に開示される微生物のいくつかの態様において、微生物は、ピルビン酸をオキ
サロ酢酸に変換できる酵素、クエン酸をアコニット酸に、アコニット酸をイソクエン酸に
変換できる酵素、ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸に変換できる酵素、セリンを
グリシンに変換できる酵素、５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸をグリシンに変換でき
る酵素、グリオキシル酸をグリコール酸に変換できる酵素および／またはグリコアルデヒ
ドをエチレングリコールに変換できる酵素、を過剰発現する。

【0017】

本明細書に開示される微生物のいくつかの態様では、微生物は、イソクエン酸デヒドロ
ゲナーゼ、グリセリン酸デヒドロゲナーゼ、グリコール酸デヒドロゲナーゼ、グリセリン
酸デヒドロゲナーゼ、グリコール酸デヒドロゲナーゼ、アルデヒドフェレドキシンオキシ
ドレダクターゼ、およびアルデヒドデヒドロゲナーゼからなる群から選択される１つ以上
の酵素の破壊的変異を含む。

【0018】

本明細書に開示される微生物のいくつかの態様では、微生物が、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｏｘｏｂ
ａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒからな
る群から選択される属のメンバーである。

【0019】

本明細書に開示される微生物のいくつかの態様では、微生物が、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉ
ａ ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉ
ｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔ
ｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ
、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ
、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｇｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄ
ｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｅ
ｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏ
ｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐ
ｆｅｎｎｉｇｉｉ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａ
ｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、およびＴｈｅｒｍｏａｎ
ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｕｖｉからなる群から選択される親微生物に由来する。

【0020】

本明細書に開示される微生物のいくつかの態様では、微生物が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉ
ｉ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉからなる群から選択される親細
菌に由来する。

【0021】

本明細書に開示されている微生物のいくつかの態様では、微生物は、天然または異種の
Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を含む。

【0022】

本明細書に開示される微生物のいくつかの態様では、微生物は、エチレングリコールの
前駆体としてグリオキシル酸またはグリコール酸を生成する。

【0023】

本発明はさらに、本明細書に開示される微生物を栄養培地中および基質の存在下で培養
することを含み、それにより微生物はエチレングリコールまたはエチレングリコールの前
駆体を生成する、エチレングリコールまたはエチレングリコールの前駆体を生成する方法
を提供する。

【0024】

本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、基質は、ＣＯ、ＣＯ_２およびＨ_２の
うちの１つ以上を含む。

【0025】

本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、基質の少なくとも一部は、産業廃棄
ガス、産業オフガス、または合成ガスである。

【0026】

本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、微生物は、エチレングリコールの前
駆体としてグリオキシル酸またはグリコール酸を生成する。

【0027】

本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、方法は、栄養培地からエチレングリ
コールまたはエチレングリコール前駆体を分離することをさらに含む。

【0028】

本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、微生物は、エタノール、２，３－ブ
タンジオール、およびコハク酸のうちの１つ以上をさらに生成する。

【0029】

本発明はさらに、本明細書に記載されている方法によって生成されたエチレングリコー
ルを含む組成物を提供する。いくつかの態様では、組成物は、不凍液、防腐剤、脱水剤、
または掘削流体である。

【0030】

本発明はさらに、本明細書に記載されている方法により生成されたエチレングリコール
を含むポリマーを提供する。いくつかの態様では、ポリマーはホモポリマーまたはコポリ
マーである。いくつかの態様では、ポリマーは、ポリエチレングリコールまたはポリエチ
レンテレフタレートである。

【0031】

本発明はさらに、本明細書に記載されるポリマーを含む組成物を提供する。一部の態様
では、組成物は、繊維、樹脂、フィルム、またはプラスチックである。

【0032】

本発明のこれらおよび他の特徴および利点は、添付の特許請求の範囲とともに以下の詳
細な説明からより完全に理解されるであろう。特許請求の範囲の範囲が、その中の記述に
よって定義され、本明細書に記載された特徴および利点の具体的な議論によって定義され
ないことに留意されたい。

【0033】

本発明の実施形態の以下の詳細な説明は、同様の構造が同様の参照番号で示されている
以下の図面と併せて読むと最もよく理解することができる。

【図面の簡単な説明】

【0034】

【図1】ＣＯ、ＣＯ_２、および／またはＨ_２を含むガス状基質からのエチレングリコール、グリコール酸、グリオキシル酸の生成の経路を示す模式図_である。

【図2A】実施例１～４で使用したプラスミドのマップである。図２Ａは、実施例１に記載される発現シャトルベクター、ｐＩＰＬ１２のマップである。

【図2B】実施例１～４で使用したプラスミドのマップである。図２Ｂは、実施例１に記載される、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓクエン酸シンターゼ、Ｅ．ｃｏｌｉイソクエン酸リアーゼ、およびＧ．ｏｘｙｄａｎｓグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼを含むプラスミドｐＭＥＧ０４２のマップである。

【図2C】実施例１～４で使用したプラスミドのマップである。図２Ｃは、実施例２に記載される、Ｓ．ｔｈｉｏｔａｕｒｉｎｉアラニン－グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼおよびＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓアルデヒドデヒドロゲナーゼを含むプラスミドｐＭＥＧ０５８のマップである。

【図2D】実施例１～４で使用したプラスミドのマップである。図２Ｄは、実施例３に記載される、Ｓ．ｔｈｉｏｔａｕｒｉｎｉアラニン－グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼおよびＧ．ｏｘｙｄａｎｓアルデヒドデヒドロゲナーゼを含むプラスミドｐＭＥＧ０５９のマップである。

【図2E】実施例１～４で使用したプラスミドのマップである。図２Ｅは、実施例４に記載される、Ｃ．ａｃｉｄｕｒｉｃｉ ｃｌａｓｓ ＶアミノトランスフェラーゼおよびＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓアルデヒドデヒドロゲナーゼを含むプラスミドｐＭＥＧ０６１のマップである。

【図3A】ｐＭＥＧ０４２を発現するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（クローン１～３）または空のベクターを含むＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（陰性対照）のバイオマスレベル（ｇ乾燥細胞重量／Ｌ）を示す。

【図3B】陰性対照（空ベクター）と比較する、独立栄養的に増殖し、発現ベクターｐＭＥＧ０４２を保有するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍで経時的に生成される、エチレングリコールを示す。

【図3C】独立栄養的に成長し、発現ベクターｐＭＥＧ０４２を保有するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍで経時的に生成される、グリコール酸を示す。実施例１を参照されたい。

【図4A】ｐＭＥＧ０５８を発現するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（クローン１～２）または空のベクターを含むＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（陰性対照）のバイオマスレベル（ｇ乾燥細胞重量／Ｌ）を示す。

【図4B】陰性対照（空ベクター）と比較する、独立栄養的に増殖し、発現ベクターｐＭＥＧ０５８を保有するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍで経時的に生成される、エチレングリコールを示す。実施例２を参照されたい。

【図5A】ｐＭＥＧ０５９を発現するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（クローン１～３）または空のベクターを含むＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（陰性対照）のバイオマスレベル（ｇ乾燥細胞重量／Ｌ）を示す。

【図5B】陰性対照（空ベクター）と比較する、独立栄養的に増殖し、発現ベクターｐＭＥＧ０５９を保有するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍで経時的に生成される、エチレングリコールを示す。実施例３を参照されたい。

【図6A】ｐＭＥＧ０６１を発現するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（クローン１）または空のベクターを含むＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（陰性対照）のバイオマスレベル（ｇ乾燥細胞重量／Ｌ）を示す。

【図6B】陰性対照（空ベクター）と比較する、独立栄養的に増殖し、発現ベクターｐＭＥＧ０６１を保有するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍで経時的に生成される、エチレングリコールを示す。実施例４を参照されたい。

【発明を実施するための形態】

【0035】

本発明は、エチレングリコールの生物学的生産のための微生物を提供する。「微生物」
は、微小な生物、特に細菌、古細菌、ウイルス、または真菌である。好ましい実施形態で
は、本発明の微生物は細菌である。

【0036】

微生物に関して使用される場合の「非自然発生型」という用語は、参照種の野生型株を
含む参照種の自然発生型の株には見られない少なくとも１つの遺伝子改変を微生物が有す
ることを意味するように意図される。非自然発生型の微生物は、典型的には、実験室また
は研究施設で開発される。本発明の微生物は、非自然発生型である。

【0037】

「遺伝子改変」、「遺伝子変化」、または「遺伝子操作」という用語は、広範には、人
間の手による微生物のゲノムまたは核酸の操作を指す。同様に、「遺伝子修飾された」、
「遺伝子改変された」、または「遺伝子操作された」という用語は、そのような遺伝子修
飾、遺伝子改変、または遺伝子操作を含む微生物を指す。これらの用語は、実験室で生成
された微生物と自然発生の微生物を区別するために使用され得る。遺伝子改変の方法は、
例えば、異種遺伝子発現、遺伝子またはプロモータの挿入または欠失、核酸変異、改変遺
伝子発現または不活性化、酵素操作、指向性進化、知識ベース設計、ランダム変異導入法
、遺伝子シャフリング、およびコドン最適化を含む。本発明の微生物は、遺伝子操作され
ている。

【0038】

「組換え」は、核酸、タンパク質、または微生物が、遺伝子改変、操作、または組換え
の生成物であることを示す。一般に、「組換え」という用語は、微生物の２つ以上の異な
る株または種など、複数の源から誘導される遺伝物質を含有するか、またはそれによって
コードされる核酸、タンパク質、または微生物を指す。本発明の微生物は一般に組換えで
ある。

【0039】

「野生型」は、変異体または変異形とは区別されるように天然に存在する、生物、株、
遺伝子、または特性の典型的な形態を指す。

【0040】

「内在性」は、本発明の微生物が誘導される野生型または親微生物に存在または発現す
る核酸またはタンパク質を指す。例えば、内在性遺伝子は、本発明の微生物が誘導される
野生型または親微生物に天然に存在する遺伝子である。一実施形態では、内在性遺伝子の
発現は、外因性プロモータ等の外因性調節エレメントによって制御され得る。

【0041】

「外因性」は、本発明の微生物の外側から生じる核酸またはタンパク質を指す。例えば
、外因性遺伝子または酵素は、本発明の微生物に人工的または組換え的に作成され、導入
または発現され得る。外因性遺伝子または酵素は、異種微生物から単離され、本発明の微
生物に導入または発現され得る。外因性核酸は、本発明の微生物のゲノムに組み込まれる
ように、または本発明の微生物、例えばプラスミド中で染色体外の状態にとどまるように
適合され得る。

【0042】

「異種」は、本発明の微生物が由来する野生型または親微生物に存在しない核酸または
タンパク質を指す。例えば、異種遺伝子または酵素は、異なる株または種に由来し、本発
明の微生物に導入または発現され得る。異種遺伝子または酵素は、それが異なる株または
種で発生する形態で本発明の微生物で導入または発現させることができる。あるいは、異
種遺伝子または酵素は、例えば、本発明の微生物における発現のためにコドン最適化する
ことによって、または酵素活性の方向を逆転させるため、または基質特異性を変更するた
めなど、機能を変更するように操作することによって、何らかの方法で修飾することがで
きる。

【0043】

特に、本明細書に記載される微生物で発現される異種核酸またはタンパク質は、Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃ
ｔｅｒ、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｅｎｉｂ
ａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｅｄｉｍｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｐｏｒｏｓ
ａｒｃｉｎａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｔ
ｈｅｒｍｏｔｏｇａ、Ｚｅａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｈｉ
ｇｅｌｌａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏ
ｎａｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ、Ｈｅｌ
ｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓ
ｅｌｌａ、Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｒｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉ
ｌｌｕｓ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｓｕｌｆｕｒｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ
、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｈｏｍｏ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｂｒｅ
ｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ
、ｂｏｓ、ｇａｌｌｕｓ、Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｘｅｎｏｐｕｓ、Ａｍｂｌｙｒｈ
ｙｎｃｈｕｓ、ｒａｔｔｕｓ、ｍｕｓ、ｓｕｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｉｚｏｂ
ｉｕｍ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒｏｍ
ｕｓａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｆｉｃｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｙｓｉｎｉｂａｃ
ｉｌｌｕｓ、Ｏｒｎｉｔｈｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｋｕｒ
ｔｈｉａ、Ｌｅｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｏｌｉｂａｃ
ｉｌｌｕｓ、Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｐｏ
ｒｏｓａｒｃｉｎａ、Ｓａｌｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ、Ｐｌａ
ｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍａｅｒｏｂａｃｔｅｒ
、Ｓｕｌｆｏｂａｃｉｌｌｕｓ、またはＳｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属由来であって
よい。

【0044】

「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、および
「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用される。それらは、任意の長さのポ
リマー形態のヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいず
れか、またはそれらの類似体を指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有し得て
、既知または未知の任意の機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例
である：遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義さ
れる遺伝子座（複数可）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、
トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲ
ＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポ
リヌクレオチド、分枝鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離さ
れたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌ
クレオチドは、メチル化ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体などの１つ以上の修飾さ
れたヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造の修飾は、ポリマーの組
織化の前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によ
って割り込まれ得る。ポリヌクレオチドは、重合の後、例えば標識構成要素との接合によ
り、さらに修飾され得る。

【0045】

本明細書で使用する場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（例えば、
ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物へ）転写される過程、および／または転写されたｍＲＮ
Ａが、続いて、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質へ翻訳される過程を指す。転
写物およびコードされたポリペプチドは、集合的に「遺伝子産物」と呼ばれ得る。

【0046】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さの
アミノ酸のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。ポリマーは、直鎖であ
っても分枝鎖であってもよく、修飾アミノ酸を含んでいてもよく、非アミノ酸によって割
り込まれていてもよい。これらの用語は、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化
、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識構成要素との接合などの任意の他の操作に
より、修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。本明細書で使用される場合、「アミノ酸
」という用語は、グリシン、ＤまたはＬ光学異性体の両方、ならびにアミノ酸類似体およ
びペプチド模倣体を含む天然および／または非天然もしくは合成アミノ酸を含む。

【0047】

「酵素活性」または単に「活性」は、広範には、酵素の活性、酵素の量、または反応に
触媒作用を及ぼすための酵素の可用性を含むがこれらに限定されない、酵素的活性を指す
。したがって、酵素活性を「増加させること」は、酵素の活性を増大させること、酵素の
量を増加させること、または反応に触媒作用を及ぼすための酵素の可用性を増加させるこ
とを含む。同様に、酵素活性を「減少させること」は、酵素の活性を減少させること、酵
素の量を減少させること、または反応に触媒作用を及ぼすための酵素の可用性を減少させ
ることを含む。

【0048】

「変異した」は、本発明の微生物が誘導される野生型または親微生物と比較して、本発
明の微生物において修飾されている核酸またはタンパク質を指す。一実施形態において、
変異は、酵素をコードする遺伝子中の欠失、挿入、または置換であってもよい。別の実施
形態では、変異は、酵素中の１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、または置換であってもよ
い。

【0049】

「親微生物」は、本発明の微生物を生成するために使用される微生物である。親微生物
は、天然に存在する微生物（即ち、野生型微生物）または以前に修飾されたことのある微
生物（即ち、変異体または組換え微生物）であり得る。本発明の微生物は、親微生物にお
いて発現または過剰発現されていなかった１つ以上の酵素を発現または過剰発現させるよ
うに修飾され得る。同様に、本発明の微生物は、親微生物が含有しなかった１つ以上の遺
伝子を含有するように修飾され得る。本発明の微生物は、また、親微生物において発現し
た１つ以上の酵素を発現しないか、またはより少ない量を発現するように修飾され得る。

【0050】

本発明の微生物は、本質的に任意の親微生物に由来し得る。一実施形態では、本発明の
微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄ
ｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、およびＳａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからなる群から選択される親微生物に由来
し得る。他の実施形態では、微生物は、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、
Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔ、Ｂｕ
ｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉ
ｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｇｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ
、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉ
ｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌ
ａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、Ｓｐｏｒ
ｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍ
ｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉ
ｕｖｉからなる群から選択される親微生物に由来する。好ましい実施形態において、親細
菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉ
ｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉで
ある。好ましい実施形態において、親微生物は、２０１０年６月７日にドイツ、Ｄ－３８
１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｉｅｇ、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａβ ７Ｂに位置するＤｅ
ｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ
Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）に、ブダペスト条約の条項下で２０１
０年６月７日に寄託され、受託番号ＤＳＭ２３６９３を付与されたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＬＺ１５６１である。この株については、国際特
許出願第ＰＣＴ／ＮＺ２０１１／０００１４４号に記載されており、ＷＯ２０１２／０１
５３１７として公開されている。

【0051】

「～由来する」という用語は、核酸、タンパク質、または微生物が異なる（例えば、親
または野生型）核酸、タンパク質、または微生物から修飾または適合されて、新しい核酸
、タンパク質、または微生物を生成することを示す。そのような修飾または適合は、典型
的には、核酸または遺伝子の挿入、欠失、変異、または置換を含む。一般に、本発明の微
生物は、親微生物に由来する。一実施形態では、本発明の親微生物は、クロストリジウム
オートエタノゲヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、ク
ロストリジウムユングダーリー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、
またはクロストリジウムラグスダレイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ）
に由来する。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ２
３６９３の下で寄託される、クロストリジウムオートエタノゲヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉ
ｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）ＬＺ１５６１に由来する。

【0052】

本発明の微生物は、機能特徴に基づいてさらに分類され得る。例えば、本発明の微生物
は、Ｃ１固定微生物、嫌気性細菌、アセトゲン、エタノロゲン、カルボキシド栄養生物、
および／もしくはメタン資化性菌であり得るか、またはそれらから誘導され得る。

【0053】

【表1】

【0054】

「Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ」は、例えば、Ｒａｇｓｄａｌｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ
Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１７８４：１８７３－１８９８，２００８に記載されている
炭素固定のＷｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を指す。「Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ
微生物」は、予想通り、Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を含む微生物を指す。多くの
場合、本発明の微生物は天然のＷｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を含有する。本明細書
では、Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は、天然の未修飾のＷｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａ
ｈｌ経路であってもよく、またはＣＯ、ＣＯ_２、および／もしくはＨ_２をアセチル－Ｃｏ
Ａに変換するように依然として機能する限り、ある程度の遺伝子修飾（例えば、過剰発現
、異種発現、遺伝子欠損など）を有するＷｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路であってもよ
い。

【0055】

「Ｃ１」は、１炭素分子、例えば、ＣＯ、ＣＯ_２、ＣＨ_４、またはＣＨ_３ＯＨを指す。
「Ｃ１酸素化物」は、少なくとも１つの酸素原子も含む１炭素分子、例えば、ＣＯ、ＣＯ
_２、またはＣＨ_３ＯＨを指す。「Ｃ１炭素源」は、本発明の微生物のための部分的または
唯一の炭素源として機能する１炭素分子を指す。例えば、Ｃ１炭素源は、ＣＯ、ＣＯ_２、
ＣＨ_４、ＣＨ_３ＯＨ、またはＣＨ_２Ｏ_２のうちの１つ以上を含み得る。好ましくは、Ｃ１
炭素源は、ＣＯおよびＣＯ_２のうちの１つまたは両方を含む。「Ｃ１固定微生物」は、Ｃ
１炭素源から１つ以上の生成物を生成する能力を有する微生物である。多くの場合、本発
明の微生物はＣ１固定細菌である。好ましい実施形態では、本発明の微生物は、表１で同
定されるＣ１固定微生物に由来する。

【0056】

「嫌気性細菌」は、増殖のために酸素を必要としない微生物である。嫌気性細菌は、酸
素が特定の閾値を超えて存在する場合、負の反応を示し得るか、または死滅し得る。しか
し、一部の嫌気性菌は、「微小酸素（ｍｉｃｒｏｏｘｉｃ）状態」と呼ばれることもある
低レベルの酸素（例えば、０．０００００１～５％の酸素）に耐えることができる。多く
の場合、本発明の微生物は嫌気性菌である。好ましい実施形態では、本発明の微生物は、
表１で同定される嫌気性菌に由来する。

【0057】

「アセトゲン」は、エネルギー節約のため、およびアセテート等のアセチル－ＣｏＡお
よびアセチル－ＣｏＡ由来生成物の合成のためのその主要機構としてＷｏｏｄ－Ｌｊｕｎ
ｇｄａｈｌ経路を使用する、偏性嫌気性細菌である（Ｒａｇｓｄａｌｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ
Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１７８４：１８７３－１８９８，２００８）。特に、アセ
トゲンは、Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を、（１）ＣＯ_２からのアセチル－ＣｏＡ
の還元合成のための機構、（２）最終電子を受容する、エネルギー節約プロセス、（３）
細胞炭素の合成におけるＣＯ_２の固定（同化）のための機構として使用する（Ｄｒａｋｅ
，Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，Ｉｎ：Ｔｈｅ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔ
ｅｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ．３５４，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００６）。天
然に存在する全てのアセトゲンは、Ｃ１固定、嫌気性、独立栄養性、および非メタン資化
性である。多くの場合、本発明の微生物はアセトゲンである。好ましい実施形態では、本
発明の微生物は、表１で同定されるアセトゲンに由来する。

【0058】

「エタノロゲン」は、エタノールを生成する、または生成することができる微生物である
。多くの場合、本発明の微生物はエタノロゲンである。好ましい実施形態では、本発明の
微生物は、表１で同定されるエタノロゲンに由来する。

【0059】

「独立栄養生物」は、有機炭素の不在下で増殖することができる微生物である。代わり
に、独立栄養生物は、ＣＯおよび／またはＣＯ_２などの無機炭素源を使用する。多くの場
合、本発明の微生物は独立栄養生物である。好ましい実施形態では、本発明の微生物は、
表１で同定される独立栄養生物に由来する。

【0060】

「カルボキシド栄養生物」は、炭素およびエネルギーの唯一の供給源としてＣＯを利用
することができる微生物である。多くの場合、本発明の微生物はカルボキシド栄養生物で
ある。好ましい実施形態では、本発明の微生物は、表１で同定されるカルボキシド栄養生
物に由来する。

【0061】

「メタン資化性菌」は、炭素とエネルギーの唯一の供給源としてメタンを利用することが
可能な微生物である。特定の実施形態では、本発明の微生物は、メタン資化性菌であるか
、またはメタン資化性菌から誘導される。他の実施形態では、本発明の微生物は、メタン
資化性菌ではないか、メタン資化性菌から誘導されない。

【0062】

好ましい実施形態において、本発明の微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅ
ｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ種、および
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ種を含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉａのクラスタ
ーから得られる。これらの種は、Ａｂｒｉｎｉ，Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１６１
：３４５－３５１，１９９４（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕ
ｍ）、Ｔａｎｎｅｒ，Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔｅｍ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，４３：２３２－
２３６，１９９３（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、およびＨｕｈ
ｎｋｅ，ＷＯ２００８／０２８０５５（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ）
によって初めて報告され、かつ特徴付けられた。

【0063】

これらの３つの種は、多くの類似点を有する。特に、これらの種は全て、Ｃ１固定、嫌
気性、アセトゲン系、エタノロゲン系、およびカルボキシド栄養性のＣｌｏｓｔｒｉｄｉ
ｕｍ属メンバーである。これらの種は、同様の遺伝子型および表現型ならびにエネルギー
節約および発酵代謝のモードを有する。さらに、これらの種は、９９％を超えて同一であ
る１６Ｓ ｒＲＮＡ ＤＮＡを有するクロストリジウムｒＲＮＡホモロジー群Ｉ内に群生
し、約２２～３０ｍｏｌ％の含有量でＤＮＡ Ｇ＋Ｃを有し、グラム陽性であり、同様の
形態およびサイズを有し（０．５～０．７×３～５μｍの対数増殖細胞）、中温性であり
（３０～３７℃で最適に増殖する）、約４～７．５の同様のｐＨ範囲を有し（約５．５～
６の最適ｐＨ）、シトクロムを欠いており、Ｒｎｆ複合体を介してエネルギーを節約する
。また、カルボン酸のそれらの対応するアルコールへの還元が、これらの種において示さ
れている（Ｐｅｒｅｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，１１０：１０６６－１０
７７，２０１２）。重要なことに、これらの種はまた、全て、ＣＯ含有ガスで強い独立栄
養性増殖を示し、主要な発酵生成物としてエタノールおよびアセテート（または酢酸）を
生成し、特定の条件下で少量の２，３－ブタンジオールおよび乳酸を生成する。

【0064】

しかしながら、これら３つの種は、いくつかの違いも有する。これらの種は、Ｃｌｏｓ
ｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍはウサギの腸から、Ｃｌｏｓｔｒｉｄ
ｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉは養鶏場の廃棄物から、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｒａｇｓｄａｌｅｉは淡水堆積物からというように、異なる供給源から単離された。こ
れらの種は、様々な糖（例えば、ラムノース、アラビノース）、酸（例えば、グルコン酸
、クエン酸）、アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン）、および他の基質（例えば
、べタイン、ブタノール）の利用において異なる。さらに、これらの種は、特定のビタミ
ン（例えば、チアミン、ビオチン）に対する栄養要求性において異なる。これらの種は、
Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路遺伝子およびタンパク質の核酸およびアミノ酸配列に
おいて違いを有するが、これらの遺伝子およびタンパク質の一般的構成および数は、全て
の種において同じであることが分かっている（Ｋｏｐｋｅ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ，２２：３２０－３２５，２０１１）。

【0065】

したがって、要約すると、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ
、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｒａｇｓｄａｌｅｉの特性の多くは、その種に特有なのではなく、むしろＣ１固定、嫌気
性、アセトゲン系、エタノロゲン系、およびカルボキシド栄養性のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍ属メンバーのこのクラスターの一般的な特性である。しかしながら、これらの種は、実
際は、全く異なるため、これらの種のうちの１つの遺伝子修飾または操作は、これらの種
のうちの別のものにおいては同一の効果を有しない場合がある。例えば、増殖、性能、ま
たは生成物生成における違いが観察され得る。

【0066】

本発明の微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇ
ｓｄａｌｅｉの分離株または変異体から得ることもできる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａ
ｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの単離物および突然変異体には、ＪＡ１－１（ＤＳＭ１０
０６１）（Ａｂｒｉｎｉ，Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１６１：３４５－３５１，１
９９４）、ＬＢＳ１５６０（ＤＳＭ１９６３０）（ＷＯ２００９／０６４２００）、およ
びＬＺ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）（ＷＯ２０１２／０１５３１７）が含まれる。Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの単離物および突然変異体には、ＡＴＣＣ
４９５８７（Ｔａｎｎｅｒ，Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，４３：２３２
－２３６，１９９３）、ＰＥＴＣＴ（ＤＳＭ１３５２８、ＡＴＣＣ ５５３８３）、ＥＲ
Ｉ－２（ＡＴＣＣ５５３８０）（ＵＳ５，５９３，８８６）、Ｃ－０１（ＡＴＣＣ５５９
８８）（ＵＳ６，３６８，８１９）、Ｏ－５２（ＡＴＣＣ５５９８９）（ＵＳ６，３６８
，８１９）、およびＯＴＡ－１（Ｔｉｒａｄｏ－Ａｃｅｖｅｄｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ ｆｒｏｍ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇａｓ ｕｓｉｎｇ
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ，ＰｈＤ ｔｈｅｓｉｓ，Ｎｏｒｔｈ
Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１０）が含まれる。Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉの単離物および突然変異体には、ＰＩ １（Ａ
ＴＣＣ ＢＡＡ－６２２、ＡＴＣＣ ＰＴＡ－７８２６）（ＷＯ２００８／０２８０５５
）が含まれる。

【0067】

しかしながら、上記のように、本発明の微生物はまた、本質的に任意の親微生物、例えば
、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ 、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、およびＳａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからなる群から選択される親微生物に由来し得る
。

【0068】

本発明は、エチレングリコール、グリオキシル酸、およびグリコール酸を生成できる微
生物、ならびに本発明の微生物を基質の存在下で培養し、それによって微生物がエチレン
グリコールを生成することを含む、エチレングリコール、グリオキシル酸、およびグリコ
ール酸を生成する方法を提供する。

【0069】

本発明の微生物はアセチル－ＣｏＡ、例えば、Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路によ
って生成されるアセチル－ＣｏＡをピルビン酸に変換する（図１の反応１）酵素を含むこ
とができる。この酵素は、ピルビン酸シンターゼ（ＰＦＯＲ）［１．２．７．１］または
ＡＴＰ：ピルビン酸、オルトリン酸ホスホトランスフェラーゼ［１．２．７．１］であり
得る。いくつかの実施形態では、アセチル－ＣｏＡをピルビン酸に変換する酵素は、内在
性酵素である。

【0070】

本発明の微生物は、ピルビン酸をオキサロ酢酸に変換する（図１の反応２）酵素を含む
ことができる。この酵素はピルビン酸：二酸化炭素リガーゼ［ＡＤＰ形成］［６．４．１
．１］であり得る。いくつかの実施形態では、ピルビン酸をオキサロ酢酸に変換する酵素
は、内在性酵素である。いくつかの実施形態では、ピルビン酸をオキサロ酢酸に変換する
酵素が過剰発現される。

【0071】

本発明の微生物は、オキサロ酢酸をシトリル－ＣｏＡに変換する（図１の反応３）酵素
を含むことができる。この酵素はシトリル－ＣｏＡリアーゼ［４．１．３．３４］であり
得る。いくつかの実施形態では、オキサロ酢酸をシトリル－ＣｏＡに変換する酵素は、内
在性酵素である。

【0072】

本発明の微生物は、シトリル－ＣｏＡをクエン酸に変換する（図１の反応４）酵素を含
むことができる。この酵素は、クエン酸－ＣｏＡトランスフェラーゼ［２．８．３．１０
］であり得る。いくつかの実施形態では、シトリル－ＣｏＡをクエン酸に変換する酵素は
、内在性酵素である。

【0073】

本発明の微生物は、オキサロ酢酸をクエン酸に変換する（図１の反応５）酵素を含むこ
とができる。この酵素は、クエン酸［Ｓｉ］－シンターゼ［２．３．３．１］、ＡＴＰク
エン酸シンターゼ［２．３．３．８］、またはクエン酸（Ｒｅ）－シンターゼ［２．３．
３．３］であってよい。いくつかの実施形態では、オキサロ酢酸をクエン酸に変換する酵
素は、内在性酵素である。他の実施形態では、オキサロ酢酸をクエン酸に変換する酵素は
、異種酵素である。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列
番号２に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含
むように、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のクエン酸シンターゼ１ ［ＥＣ ２．３．３．１
６］を含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号４に示され
るアミノ酸配列をコードする配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｃ．
ｋｌｕｙｖｅｒｉ由来のクエン酸（Ｒｅ）－シンターゼを含む。いくつかの実施形態では
、本発明の微生物は、微生物が配列番号６に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号
５に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種属由来のクエン
酸（Ｓｉ）－シンターゼを含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が
配列番号８に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号７に示されるヌクレオチド配列
を含むように、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のクエン酸シンターゼ２を含む。いくつかの実
施形態では、オキサロ酢酸をクエン酸に変換する酵素が過剰発現される。

【0074】

本発明の微生物は、クエン酸をアコニット酸に、およびアコニット酸をイソクエン酸に
変換する（図１の反応６）酵素を含むことができる。この酵素は、アコニット酸ヒドラタ
ーゼ［４．２．１．３］であり得る。いくつかの実施形態では、クエン酸をアコニット酸
に、アコニット酸をイソクエン酸に変換する酵素は、内在性酵素である。いくつかの実施
形態では、クエン酸をアコニット酸に、およびアコニット酸をイソクエン酸に変換する酵
素が過剰発現される。

【0075】

本発明の微生物は、イソクエン酸をグリオキシル酸に変換する（図１の反応７）酵素を
含むことができる。この酵素はイソクエン酸リアーゼ［４．１．３．１］であり得る。い
くつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号１０に示されるアミノ酸配
列をコードする配列番号９に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｚ．ｍａｙｓ由来
のイソクエン酸リアーゼを含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が
配列番号１２に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号１１に示されるヌクレオチド
配列を含むように、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のイソクエン酸リアーゼを含む。いくつかの実施形
態では、

【0076】

本発明の微生物は、グリオキシル酸をグリコール酸に変換する（図１の反応８）酵素を
含むことができる。この酵素は、グリセリン酸デヒドロゲナーゼ［１．１．１．２９］、
グリオキシル酸レダクターゼ［１．１．１．２６／７９］、またはグリコール酸デヒドロ
ゲナーゼ［１．１．９９．１４］であリ得る。いくつかの実施形態では、グリオキシル酸
をグリコール酸に変換する酵素は、内在性酵素である。いくつかの実施形態では、グリオ
キシル酸をグリコール酸に変換する酵素が過剰発現される。

【0077】

本発明の微生物は、グリコール酸をグリコアルデヒドに変換する（図１の反応９）酵素
を含むことができる。この酵素は、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．１
．２１］、ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．１．２２］、コハク酸セミアル
デヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．１．２４］、２，５－ジオキソ吉草酸デヒドロゲナー
ゼ［１．２．１．２６］、アルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．１．３／４／５］、ベ
タイン－アルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．１．８］、またはアルデヒドフェレドキ
シンオキシドレダクターゼ［１．２．７．５］であり得る。いくつかの実施形態では、グ
リコール酸をグリコアルデヒドに変換する酵素は、内在性酵素である。他の実施形態では
、グリコール酸をグリコアルデヒドに変換する酵素は、異種酵素である。例えば、いくつ
かの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号５０に示されるアミノ酸配列を
コードする配列番号４９に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の
γ－アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む。いくつかの実施形態において、本
発明の微生物は、微生物が配列番号５２に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号５
１に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のアルデヒドデヒドロゲ
ナーゼを含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号５４に示
されるアミノ酸配列をコードする配列番号５３に示されるヌクレオチド配列を含むように
、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＮＡＤＰ－依存コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼＩを含む
。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号５６に示されるアミノ
酸配列をコードする配列番号５５に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｇ．ｏｘｙ
ｄａｎｓ由来のラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ／グリコールアルデヒドデヒドロゲナ
ーゼを含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物がそれぞれ、配列番号
５８または配列番号６０で示されるアミノ酸配列をコードする配列番号５７または配列番
号５９に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のア
ルデヒドデヒドロゲナーゼＡを含む。グリコール酸をグリコアルデヒドに変換する酵素の
追加の非限定的な例は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＷＰ＿００３２０２０９８、ＷＰ＿００
３１８２５６７、ＡＣＴ３９０４４、ＡＣＴ３９０７４、ＷＰ＿０４１１１２００５、お
よびＡＣＴ４０１７０に見出すことができる。いくつかの実施形態では、グリコール酸を
グリコアルデヒドに変換する酵素が過剰発現される。

【0078】

本発明の微生物は、グリコアルデヒドをエチレングリコールに変換する（図１の反応１
０）酵素を含んでいてもよい。この酵素は、ラクトアルデヒドレダクターゼ［１．１．１
．７７］、アルコールデヒドロゲナーゼ［１．１．１．１］、アルコールデヒドロゲナー
ゼ（ＮＡＤＰ＋）［１．１．１．２］、グリセロールデヒドロゲナーゼ［１．１．１．７
２］、グリセロール－３－リン酸デヒドロゲナーゼ［１．１．１．８］、またはアルデヒ
ドレダクターゼ［１．１．１．２１］であり得る。いくつかの実施形態では、グリコアル
デヒドをエチレングリコールに変換する酵素は、内在性酵素である。いくつかの実施形態
では、グリコアルデヒドをエチレングリコールに変換する内在性酵素が過剰発現される。
他の実施形態では、グリコアルデヒドをエチレングリコールに変換する酵素は、異種酵素
である。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号６２に示される
アミノ酸配列をコードする配列番号６１に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｃ．
ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ由来のラクトアルデヒドレダク
ターゼを含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号６４に示
されるアミノ酸配列をコードする配列番号６３に示されるヌクレオチド配列を含むように
、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ由来のラクトアルデヒドレダクターゼを含む。いくつかの
実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号６６に示されるアミノ酸配列をコー
ドする配列番号６５に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のラク
トアルデヒドレダクターゼを含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物
が配列番号６８に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号６７に示されるヌクレオチ
ド配列を含むように、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ由来のラクトアルデヒドレダクター
ゼを含む。いくつかの実施形態では、グリコアルデヒドをエチレングリコールに変換する
異種酵素が過剰発現される。

【0079】

本発明の微生物は、ピルビン酸をリンゴ酸に変換する（図１の反応１１）を含むことが
できる。この酵素は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ［１．１．１．３７］、リンゴ酸デヒド
ロゲナーゼ（オキサロ酢酸脱炭酸）［１．１．１．３８］、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（
脱炭酸）［１．１．１．３９］、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（オキサロ酢酸脱炭酸）（Ｎ
ＡＤＰ＋）［１．１．１．４０］、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）［１．１．
１．８２］、Ｄ－リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（脱炭酸）［１．１．１．８３］、ジメチル
リンゴ酸デヒドロゲナーゼ［１．１．１．８４］、３－イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲ
ナーゼ［１．１．１．８５］、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ［ＮＡＤ（Ｐ）＋］［１．１．
１．２９９］、またはリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（キノン）［１．１．５．４］であり得
る。いくつかの実施形態では、ピルビン酸をリンゴ酸に変換する酵素は、内在性酵素であ
る。他の実施形態では、ピルビン酸をリンゴ酸に変換する酵素は、異種酵素である。例え
ば、いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号２４に示されるアミ
ノ酸配列をコードする配列番号２３に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｃ．ａｕ
ｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ由来のリンゴ酸デヒドロゲナーゼを含む。いくつかの実施形
態において、本発明の微生物は、微生物が配列番号２６に示されるアミノ酸配列をコード
する配列番号２５に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏ
ｇｅｎｕｍ由来のＮＡＤ依存リンゴ酸酵素を含む。

【0080】

本発明の微生物は、リンゴ酸をグリオキシル酸に変換する（図１の反応１２）酵素を含
むことができる。この酵素は、リンゴ酸シンターゼ［２．３．３．９］またはイソクエン
酸リアーゼ［４．１．３．１］であり得る。いくつかの実施形態では、リンゴ酸をグリオ
キシル酸に変換する酵素は、異種酵素である。例えば、いくつかの実施形態では、本発明
の微生物は、微生物がそれぞれ配列番号２８または配列番号３４に示されるアミノ酸をコ
ードする配列番号２７または配列番号３３に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｓ
ｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ種属からのリンゴ酸シンターゼＧを含む。いくつかの実施形態で
は、本発明の微生物は、微生物がそれぞれ配列番号３０または配列番号３６に示されるア
ミノ酸配列をコードする配列番号２９または配列番号３５に示されるヌクレオチド配列を
含むように、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種由来のリンゴ酸シンターゼＧを含む。いくつかの実施形
態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号３２に示されるアミノ酸配列をコードする
配列番号３１に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ由来
のリンゴ酸シンターゼを含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配
列番号３８に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号３７に示されるヌクレオチド配
列を含むように、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ由来のリンゴ酸シンターゼＧを含む。いくつかの
実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号４０に示されるアミノ酸配列をコー
ドする配列番号３９に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｃ．ｃｏｃｈｌｅａｒｉ
ｕｍ由来のリンゴ酸シンターゼを含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微
生物が配列番号４２に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号４１に示されるヌクレ
オチド配列を含むように、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍからのリンゴ酸シンターゼＧを含む
。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号４４に示されるアミノ
酸配列をコードする配列番号４３に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｐａｅｎｉ
ｂａｃｉｌｌｕｓ種由来のリンゴ酸シンターゼを含む。いくつかの実施形態において、本
発明の微生物は、微生物が配列番号４６に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号４
５に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ種由来のリ
ンゴ酸シンターゼを含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番
号４８に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号４７に示されるヌクレオチド配列を
含むように、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ由来のリンゴ酸シンターゼを含む。

【0081】

本発明の微生物は、ピルビン酸をホスホエノールピルビン酸に変換する（図１の反応１
３）酵素を含むことができる。この酵素は、ピルビン酸キナーゼ［２．７．１．４０］、
ピルビン酸リン酸ジキナーゼ［２．７．９．１］、またはピルビン酸水ジキナーゼ［２．
７．９．２］であり得る。いくつかの実施形態では、ピルビン酸をホスホエノールピルビ
ン酸に変換する酵素は、内在性酵素である。

【0082】

本発明の微生物は、ホスホエノールピルビン酸を２－ホスホ－Ｄ－グリセリン酸に変換
する（図１の反応１４）酵素を含むことができる。この酵素は、ホスホピルビン酸ヒドラ
ターゼ［４．２．１．１１］であり得る。いくつかの実施形態では、ホスホエノールピル
ビン酸を２－ホスホ－Ｄ－グリセリン酸に変換する酵素は、内在性酵素である。

【0083】

本発明の微生物は、２－ホスホ－Ｄ－グリセリン酸を３－ホスホ－Ｄ－グリセリン酸に
変換する（図１の反応１５）酵素を含むことができる。この酵素は、ホスホグリセリン酸
ムターゼ［５．４．２．１１／１２］であり得る。いくつかの実施形態では、２－ホスホ
－Ｄ－グリセリン酸を３－ホスホ－Ｄ－グリセリン酸に変換する酵素は、内在性酵素であ
る。

【0084】

本発明の微生物は、３－ホスホ－Ｄ－グリセリン酸を３－ホスホノオキシピルビン酸に
変換する（図１の反応１６）酵素を含むことができる。この酵素は、ホスホグリセリン酸
デヒドロゲナーゼ［１．１．１．９５］であり得る。いくつかの実施形態では、３－ホス
ホ－Ｄ－グリセリン酸を３－ホスホノオキシピルビン酸に変換する酵素は、内在性酵素で
ある。

【0085】

本発明の微生物は、３－ホスホノオキシピルビン酸を３－ホスホ－Ｌ－セリンに変換（
図１の反応１７）する酵素を含むことができる。この酵素は、ホスホセリントランスアミ
ナーゼ［２．６．１．５２］であり得る。いくつかの実施形態では、３－ホスホノオキシ
ピルビン酸を３－ホスホ－Ｌ－セリンに変換する酵素は、内在性酵素である。

【0086】

本発明の微生物は３－ホスホ－Ｌ－セリンをセリンに変換する（図１の反応１８）酵素
を含むことができる。この酵素はホスホセリンホスファターゼ［３．１．３．３］であり
得る。いくつかの実施形態では、３－ホスホ－Ｌ－セリンをセリンに変換する酵素は、内
在性酵素である。

【0087】

本発明の微生物はセリンをグリシンに変換する（図１の反応１９）酵素を含むことがで
きる。この酵素はグリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ［２．１．２．１］であ
り得る。いくつかの実施形態では、セリンをグリシンに変換する酵素は内在性酵素である
。いくつかの実施形態では、セリンをグリシンに変換する酵素が過剰発現される。

【0088】

本発明の微生物は、グリシンをグリオキシル酸に変換する酵素（図１の反応２０）を含
むことができる。この酵素は、アラニン－グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ／ト
ランスアミナーゼ［２．６．１．４４］、セリン－グリオキシル酸アミノトランスフェラ
ーゼ／トランスアミナーゼ［２．６．１．４５］、セリン－ピルビン酸アミノトランスフ
ェラーゼ／トランスアミナーゼ［２．６．１．５１］、グリシン－オキサロ酢酸アミノト
ランスフェラーゼ／トランスアミナーゼ［２．６．１．３５］、グリシントランスアミナ
ーゼ［２．６．１．４］、グリシンデヒドロゲナーゼ［１．４．１．１０］、アラニンデ
ヒドロゲナーゼ［１．４．１．１］、またはグリシンデヒドロゲナーゼ［１．４．２．１
］であり得る。いくつかの実施形態では、グリシンをグリオキシル酸に変換する酵素は、
内在性酵素である。他の実施形態では、グリシンをグリオキシル酸に変換する酵素は、異
種酵素である。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号
１４に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号１３に示されるヌクレオチド配列を含
むように、Ｈ．ｍｅｔｈｙｌｏｖｏｒｕｍ由来のセリン－グリオキシル酸アミノトランス
フェラーゼを含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号１６
に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号１５に示されるヌクレオチド配列を含むよ
うに、Ｓ．ｔｈｉｏｔａｕｒｉｎｉ由来のアラニン－グリオキシル酸アミノトランスフェ
ラーゼを含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が、配列番号１８に
示されるアミノ酸配列をコードする配列番号１７に示されるヌクレオチド配列を含むよう
に、Ｔ．Ｔｅｐｉｄａｒｉｕｓ由来のアラニン－グリオキシル酸アミノトランスフェラー
ゼを含む。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、微生物が、配列番号２０に示さ
れるアミノ酸配列をコードする配列番号１９に示されるヌクレオチド配列を含むように、
Ｃ．ａｃｉｄｕｒｉｃｉ由来のクラスＶアミノトランスフェラーゼを含む。いくつかの実
施形態では、本発明の微生物は、微生物が配列番号２２に示されるアミノ酸配列をコード
する配列番号２１に示されるヌクレオチド配列を含むように、Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ由来
のセリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼを含む。いくつかの実施形態では、グリ
シンをグリオキシル酸に変換する酵素が過剰発現される。

【0089】

本発明の微生物はセリンをヒドロキシピルビン酸に変換する（図１の反応２１）酵素を
含むことができる。この酵素は、セリン－ピルビン酸トランスアミナーゼ［２．６．１．
５１］、セリン－グリオキシル酸トランスアミナーゼ［２．６．１．４５］、アラニンデ
ヒドロゲナーゼ［１．４．１．１］、Ｌ－アミノ酸デヒドロゲナーゼ［１．４．１．５］
、セリン２－デヒドロゲナーゼ［１．４．１．７］、アラニントランスアミナーゼ［２．
６．１．２］、グルタミン－ピルビン酸トランスアミナーゼ［２．６．１．１５］、Ｄ－
アミノ酸トランスアミナーゼ［２．６．１．２１］、アラニン－グリオキシル酸トランス
アミナーゼ［２．６．１．４４］、またはセリン－ピルビン酸トランスアミナーゼ［２．
６．１．５１］であり得る。いくつかの実施形態では、セリンをヒドロキシピルビン酸に
変換する酵素は、内在性酵素である。他の実施形態では、セリンをヒドロキシピルビン酸
に変換する酵素は、異種酵素である。セリンをヒドロキシピルビン酸に変換することがで
きる酵素の非限定的な例は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＷＰ＿００９９８９３１１およびＮ
Ｐ＿５１１０６２．１に見出すことができる。いくつかの実施形態では、セリンをヒドロ
キシピルビン酸に変換する酵素が過剰発現される。

【0090】

本発明の微生物は、ヒドロキシピルビン酸をグリコアルデヒドに変換する（図１の反応
２２）酵素を含むことができる。この酵素は、ヒドロキシピルビン酸デカルボキシラーゼ
［４．１．１．４０］またはピルビン酸デカルボキシラーゼ［４．１．１．１］であり得
る。この酵素は、他のデカルボキシラーゼでもよい［４．１．１．－］。いくつかの実施
形態では、ヒドロキシピルビン酸をグリコアルデヒドに変換する酵素は、異種酵素である
。ヒドロキシピルビン酸をグリコアルデヒドに変換できる酵素の非限定的な例は、Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ受入番号ＣＣＧ２８８６６、ＳＶＦ９８９５３、ＰＡ００９６、ＣＡＡ５４５２
２、ＫＲＵ１３４６０、およびＫＬＡ２６３５６に見出すことができる。

【0091】

本発明の微生物はＤ－グリセリン酸をヒドロキシピルビン酸に変換する（図１の反応２
３）酵素を含むことができる。この酵素は、グリオキシル酸レダクターゼ［ＥＣ１．１．
１．２６］、グリセリン酸デヒドロゲナーゼ［ＥＣ１．１．１．２９］、またはヒドロキ
シピルビン酸レダクターゼ［ＥＣ１．１．１．８１］であり得る。いくつかの実施形態で
は、Ｄ－グリセリン酸をヒドロキシピルビン酸に変換する酵素は、異種酵素である。Ｄ－
グリセリン酸をヒドロキシピルビン酸に変換できる酵素の非限定的な例は、ＧｅｎＢａｎ
ｋ受入番号ＳＵＫ１６８４１、ＲＰＫ２２６１８、ＫＰＡ０２２４０、ＡＧＷ９０７６２
、ＣＡＣ１１９８７、Ｑ９ＣＡ９０、およびＱ９ＵＢＱ７に見出すことができる。

【0092】

本発明の微生物は、５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸をグリシンに変換する（図１
の反応２４）複合体の酵素を含むことができる。５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸は
、Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の還元的分岐における補因子であり、アセチル－Ｃ
ｏＡの生成における足場として機能する。この複合体は、グリシンデヒドロゲナーゼ［１
．４．４．２］、ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ［１．８．１．４］、およびアミノ
メチルトランスフェラーゼ（グリシンシンターゼ）［２．１．２．１０］を含むグリシン
開裂系であり得る。いくつかの実施形態では、５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸をグ
リシンに変換する複合体の酵素は、内在性酵素である。いくつかの実施形態では、グリシ
ン開裂系の酵素が過剰発現される。

【0093】

本発明の微生物は、ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸に変換する（図１の反応
２５）酵素を含むことができる。この酵素は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナ
ーゼ（ＡＴＰ）［４．１．１．４９］または（ＧＴＰ）［４．１．１．３２］であり得る
。いくつかの実施形態では、ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸に変換する酵素は
、内在性酵素である。他の実施形態では、ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸に変
換する酵素は、異種酵素である。いくつかの実施形態では、ホスホエノールピルビン酸を
オキサロ酢酸に変換する酵素が過剰発現される。

【0094】

いくつかの実施形態では、アセチル－ＣｏＡをピルビン酸に変換する（図１の反応１）
酵素、ピルビン酸をオキサロ酢酸に変換する（図１の反応２）酵素、オキサロ酢酸をクエ
ン酸に変換する（図１の反応５）酵素、クエン酸をアコニット酸に、アコニット酸をイソ
クエン酸に変換する（図１の反応６）酵素、イソクエン酸をグリオキシル酸に変換する（
図１の反応７）酵素、グリオキシル酸をグリコール酸に変換する（図１の反応８）酵素、
グリコール酸をグリコアルデヒドに変換する（図１の反応９）酵素、およびグリコアルデ
ヒドをエチレングリコールに変換する（図１の反応１０）酵素、を含む微生物は、エチレ
ングリコールを生成する。非限定的な例において、オキサロ酢酸をクエン酸に変換する酵
素は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のクエン酸シンターゼ（配列番号１～２）であり得る。
非限定的な例において、イソクエン酸をグリオキシル酸に変換する酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉ
由来のイソクエン酸リアーゼ（配列番号１１～１２）であり得る。非限定的な例において
、グリコール酸をグリコアルデヒドに変換する酵素は、Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ由来のグリコ
ールアルデヒドデヒドロゲナーゼ（配列番号５５～５６）またはＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ
ｎｓ由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（配列番号５７～５８）であり得る。図１に示す
ように、反応２、５、６、８、９、および１０を触媒する酵素の１つ以上が過剰発現され
得る。例えば、実施例１および図３Ｂを参照されたい。

【0095】

いくつかの実施形態では、アセチル－ＣｏＡをピルビン酸に変換する（図１の反応１）
酵素、ピルビン酸をホスホエノールピルビン酸に変換する（図１の反応１３）酵素、ホス
ホエノールピルビン酸を２－ホスホ－Ｄ－グリセリン酸に変換する（図１の反応１４）酵
素、２－ホスホ－Ｄ－グリセリン酸を３－ホスホ－Ｄ－グリセリン酸に変換する（図１の
反応１５）酵素、３－ホスホ－Ｄ－グリセリン酸を３－ホスホノオキシピルビン酸に変換
する（図１の反応１６）酵素、３－ホスホノオキシピルビン酸を３－ホスホ－Ｌ－セリン
に変換する（図１の反応１７）酵素、３－ホスホ－Ｌ－セリンをセリンに変換する（図１
の反応１８）酵素、セリンをグリシンに変換する（図１の反応１９）酵素、グリシンをグ
リオキシル酸に変換する（図１の反応２０）酵素、グリオキシル酸をグリコール酸に変換
する（図１の反応８）酵素、グリコール酸をグリコアルデヒドに変換する（図１の反応９
）酵素、およびグリコアルデヒドをエチレングリコールに変換する（図１の反応１０）酵
素、を含む微生物はエチレングリコールを生成する。非限定的な例において、グリシンを
グリオキシル酸に変換する酵素は、Ｓ．ｔｈｉｏｔａｕｒｉｎｉ由来のアラニン－グリオ
キシル酸アミノトランスフェラーゼ（配列番号１５～１６）またはＣ．ａｃｉｄｕｒｉｃ
ｉ由来のクラスＶアミノトランスフェラーゼ（配列番号１９～２０）であり得る。非限定
的な例において、グリコール酸をグリコアルデヒドに変換する酵素は、Ｇ．ｏｘｙｄａｎ
ｓ由来のグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ（配列番号５５～５６）またはＰ．ｆｌ
ｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（配列番号５７～５８）であり得
る。図１に示すように、ステップ１９、２０、８、９、および１０の反応を触媒する酵素
の１つ以上が過剰発現され得る。例えば、実施例２～４および図４Ｂ、５Ｂ、および６Ｂ
を参照されたい。

【0096】

いくつかの実施形態では、アセチル－ＣｏＡをピルビン酸に変換する（図１の反応１）
酵素、ピルビン酸をオキサロ酢酸に変換する（図１の反応２）酵素、オキサロ酢酸をシト
リル－ＣｏＡに変換する（図１の反応３）酵素、シトリル－ＣｏＡをクエン酸に変換する
（図１の反応４）酵素、クエン酸をアコニット酸に、およびアコニット酸をイソクエン酸
に変換する（図１の反応６）酵素、イソクエン酸をグリオキシル酸に変換する（図１の反
応７）酵素、グリオキシル酸をグリコール酸に変換する（図１の反応８）酵素、グリコー
ル酸をグリコアルデヒドに変換する（図１の反応９）酵素、およびグリコアルデヒドをエ
チレングリコールに変換する（図１の反応１０）酵素、を含む微生物は、エチレングリコ
ールを生成する。非限定的な例において、イソクエン酸をグリオキシル酸に変換する酵素
は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のイソクエン酸リアーゼ（配列番号１１～１２）であり得る。非限
定的な例において、イソクエン酸をグリオキシル酸に変換する酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来
のイソクエン酸リアーゼ（配列番号１１～１２）であり得る。非限定的な例において、グ
リコール酸をグリコアルデヒドに変換する酵素は、Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ由来のグリコール
アルデヒドデヒドロゲナーゼ（配列番号５５～５６）またはＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ
由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（配列番号５７～５８）であり得る。図１に示すよう
に、反応２、６、８、９、および１０を触媒する酵素の１つ以上が過剰発現され得る。

【0097】

いくつかの実施形態では、アセチル－ＣｏＡをピルビン酸に変換する（図１の反応１）
酵素、ピルビン酸をリンゴ酸に変換する（図１の反応１１）酵素、リンゴ酸をグリオキシ
ル酸に変換する（図１の反応１２）酵素、グリオキシル酸をグリコール酸に変換する（図
１の反応８）酵素、グリコール酸をグリコアルデヒドに変換する（図１の反応９）酵素、
およびグリコアルデヒドをエチレングリコールに変換する（図１の反応１０）酵素、を含
む微生物は、エチレングリコールを生成する。非限定的な例において、グリコール酸をグ
リコアルデヒドに変換する酵素は、Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ由来のグリコールアルデヒドデヒ
ドロゲナーゼ（配列番号５５～５６）またはＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のアルデヒ
ドデヒドロゲナーゼ（配列番号５７～５８）であり得る。図１に示すように、ステップ８
、９、および１０の反応を触媒する酵素の１つ以上が過剰発現され得る。

【0098】

いくつかの実施形態では、５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸をグリシンに変換する
（図１の反応２４）酵素、グリシンをグリオキシル酸に変換する（図１の反応２０）酵素
、グリオキシル酸をグリコール酸に変換する（図１の反応８）酵素、グリコール酸をグリ
コアルデヒドに変換する（図１の反応９）酵素、およびグリコアルデヒドをエチレングリ
コールに変換する（図１の反応１０）酵素、の複合体を含む微生物は、エチレングリコー
ルを生成する。非限定的な例において、グリシンをグリオキシル酸に変換する酵素は、Ｓ
．ｔｈｉｏｔａｕｒｉｎｉ由来のアラニン－グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（
配列番号１５～１６）またはＣ．ａｃｉｄｕｒｉｃｉ由来のクラスＶアミノトランスフェ
ラーゼ（配列番号１９～２０）であり得る。非限定的な例において、グリコール酸をグリ
コアルデヒドに変換する酵素は、Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ由来のグリコールアルデヒドデヒド
ロゲナーゼ（配列番号５５～５６）またはＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のアルデヒド
デヒドロゲナーゼ（配列番号５７～５８）であり得る。ステップ８、９、１０、２０、お
よび２４の反応を触媒する酵素の１つ以上が過剰発現され得る。

【0099】

いくつかの実施形態では、アセチル－ＣｏＡをピルビン酸に変換する（図１の反応１）
酵素、ピルビン酸をホスホエノールピルビン酸に変換する（図１の反応１３）酵素、ホス
ホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸に変換する（図１の反応２５）酵素、オキサロ酢酸
をシトリル－ＣｏＡに変換する（図１の反応３）酵素、シトリル－ＣｏＡをクエン酸に変
換する（図１の反応４）酵素、クエン酸をアコニット酸に、およびアコニット酸をイソク
エン酸に変換する（図１の反応６）酵素、イソクエン酸をグリオキシル酸に変換する（図
１の反応７）酵素、グリオキシル酸をグリコール酸に変換する（図１の反応８）酵素、グ
リコール酸をグリコアルデヒドに変換する（図１の反応９）酵素、およびグリコアルデヒ
ドをエチレングリコールに変換する（図１の反応１０）酵素、を含む微生物は、エチレン
グリコールを生成する。非限定的な例において、イソクエン酸をグリオキシル酸に変換す
る酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のイソクエン酸リアーゼ（配列番号１１～１２）であり得る
。非限定的な例において、グリコール酸をグリコアルデヒドに変換する酵素は、Ｇ．ｏｘ
ｙｄａｎｓ由来のグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ（配列番号５５～５６）または
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（配列番号５７～５８）
であり得る。図１に示すように、反応２、６、８、９、１０、および２５を触媒する酵素
の１つ以上が過剰発現され得る。

【0100】

いくつかの実施形態では、アセチル－ＣｏＡをピルビン酸に変換する（図１の反応１）
酵素、ピルビン酸をホスホエノールピルビン酸に変換する（図１の反応１３）酵素、ホス
ホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸に変換する（図１の反応２５）酵素、オキサロ酢酸
をクエン酸に変換する（図１の反応５）酵素、クエン酸をアコニット酸に、アコニット酸
をイソクエン酸に変換する（図１の反応６）酵素、イソクエン酸をグリオキシル酸に変換
する（図１の反応７）酵素、グリオキシル酸をグリコール酸に変換する（図１の反応８）
酵素、グリコール酸をグリコアルデヒドに変換する（図１の反応９）酵素、およびグリコ
アルデヒドをエチレングリコールに変換する（図１の反応１０）酵素、を含む微生物は、
エチレングリコールを生成する。非限定的な例において、オキサロ酢酸をクエン酸に変換
する酵素は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のクエン酸シンターゼ（配列番号１～２）であり
得る。非限定的な例において、イソクエン酸をグリオキシル酸に変換する酵素は、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ由来のイソクエン酸リアーゼ（配列番号１１～１２）であり得る。非限定的な例に
おいて、グリコール酸をグリコアルデヒドに変換する酵素は、Ｇ．ｏｘｙｄａｎｓ由来の
グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ（配列番号５５～５６）またはＰ．ｆｌｕｏｒｅ
ｓｃｅｎｓ由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（配列番号５７～５８）であり得る。図１
に示すように、反応５、６、８、９、１０、および２５を触媒する酵素の１つ以上が過剰
発現され得る。

【0101】

いくつかの実施形態では、アセチル－ＣｏＡをピルビン酸に変換する（図１の反応１）
酵素、ピルビン酸をホスホエノールピルビン酸に変換する（図１の反応１３）酵素、ホス
ホエノールピルビン酸を２－ホスホ－Ｄ－グリセリン酸に変換する（図１の反応１４）酵
素、２－ホスホ－Ｄ－グリセリン酸を３－ホスホ－Ｄ－グリセリン酸に変換する酵素（図
１の反応１５）、３－ホスホ－Ｄ－グリセリン酸を３－ホスホノオキシピルビン酸に変換
する（図１の反応１６）酵素、３－ホスホノオキシピルビン酸を３－ホスホ－Ｌ－セリン
に変換する（図１の反応１７）酵素、３－ホスホ－Ｌ－セリンをセリンに変換する（図１
の反応１８）酵素、セリンをヒドロキシピルビン酸に変換する（図１の反応２１）酵素、
ヒドロキシピルビン酸をグリコアルデヒドに変換する（図１の反応２２）酵素、およびグ
リコアルデヒドをエチレングリコールに変換する（図１の反応１０）酵素、を含む微生物
はエチレングリコールを生成する。グリコアルデヒドからエチレングリコールへの変換を
触媒する酵素は過剰発現可能である。

【0102】

いくつかの実施形態では、Ｄ－グリセリン酸をヒドロキシピルビン酸に変換する（図１
の反応２３）酵素、ヒドロキシピルビン酸をグリコアルデヒドに変換する（図１の反応２
２）酵素、およびグリコアルデヒドをエチレングリコールに変換する（図１の反応１０）
酵素は、エチレングリコールを生成する。グリコアルデヒドからエチレングリコールへの
変換を触媒する酵素は過剰発現可能である。

【0103】

本発明の酵素は、本発明の微生物における発現のために最適化されたコドンであり得る
。「コドン最適化」は、特定の株または種における核酸の最適化または改善された翻訳の
ための、遺伝子等の核酸の変異を指す。コドン最適化により、翻訳速度の高速化または翻
訳精度の向上がもたらされ得る。好ましい実施形態では、本発明の遺伝子は、本発明の微
生物における発現のために最適化されたコドンである。コドン最適化は基礎となる遺伝子
配列を指すが、コドン最適化はしばしば翻訳の改善をもたらし、したがって酵素発現の改
善をもたらす。したがって、本発明の酵素はまた、コドンが最適化されていると説明する
こともできる。

【0104】

本発明の酵素のうちの１つ以上は、過剰発現され得る。「過剰発現した」とは、本発明
の微生物が由来する野生型または親微生物と比較して、本発明の微生物における核酸また
はタンパク質の発現の増加を指す。過剰発現は、遺伝子コピー数、遺伝子転写速度、遺伝
子翻訳速度、または酵素分解速度の変更を含む、当該技術分野において既知の任意の手段
によって達成することができる。上記のように、図１の反応２、５、６、８、９、１０、
１９、２０、２４、または２５を触媒する１つ以上の酵素が過剰発現され得る。

【0105】

本発明の酵素は破壊的変異を含み得る。「破壊的変異」は、遺伝子または酵素の発現ま
たは活性を低下または排除する（すなわち、「破壊する」）変異を指す。破壊的変異は、
遺伝子または酵素を、部分的に不活性化し得るか、完全に不活性化し得るか、または欠失
し得る。破壊的変異は、ノックアウト（ＫＯ）変異であり得る。破壊的変異は、酵素によ
って生成される生成物の生合成を低減、防止、または阻害する任意の変異であり得る。破
壊的変異は、例えば、酵素をコードする遺伝子における変異、酵素をコードする遺伝子の
発現に関与する遺伝子調節エレメントにおける変異、酵素の活性を低下または阻害するタ
ンパク質を生成する核酸の導入、または酵素の発現を阻害する核酸（例えば、アンチセン
スＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ）もしくはタンパク質の導入を含み得る。破壊的変
異は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して導入されてもよい。

【0106】

いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ［１．１
．１．４１］に破壊的変異を含む。イソクエン酸デヒドロゲナーゼはイソクエン酸を２－
オキソグルタル酸に変換する。イソクエン酸デヒドロゲナーゼの欠失などによるイソクエ
ン酸デヒドロゲナーゼの破壊により、イソクエン酸のレベルが増加する。

【0107】

いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、グリセリン酸デヒドロゲナーゼ［１．１
．１．２９］に破壊的変異を含む。グリセリン酸デヒドロゲナーゼはグリオキシル酸をグ
リコール酸に変換する。イソクエン酸デヒドロゲナーゼの欠失などによるグリセリン酸デ
ヒドロゲナーゼの破壊により、グリオキシル酸のレベルが増加する。

【0108】

いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、グリコール酸デヒドロゲナーゼ ［１．
１．９９．１４］に破壊的変異を含む。グリコール酸デヒドロゲナーゼはグリオキシル酸
をグリコール酸に変換する。グリコール酸デヒドロゲナーゼの欠失などによるグリコール
酸デヒドロゲナーゼの破壊により、グリオキシル酸のレベルが増加する。

【0109】

いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、アルデヒドフェレドキシンオキシドレダ
クターゼ［１．２．７．５］に破壊的変異を含む。アルデヒドフェレドキシンオキシドレ
ダクターゼは、グリコール酸をグリコアルデヒドに変換する。アルデヒドフェレドキシン
オキシドレダクターゼの欠失などによるアルデヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼ
の破壊により、グリコール酸のレベルが増加する。

【0110】

いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．
１．３／１．２．３．４／１．２．３．５］に破壊的変異を含む。アルデヒドデヒドロゲ
ナーゼはグリコール酸をグリコアルデヒドに変換する。アルデヒドデヒドロゲナーゼの欠
失などによるアルデヒドデヒドロゲナーゼの破壊により、グリコール酸のレベルが増加す
る。

【0111】

破壊的変異の導入は、本発明の微生物が誘導される親微生物と比較して、標的生成物を
生成しないかもしくは実質的に標的生成物を生成しないか、または低減された量の標的生
成物を生成する、本発明の微生物をもたらす。例えば、本発明の微生物は、標的生成物を
生成しないか、または親微生物よりも、少なくとも約１％、３％、５％、１０％、２０％
、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは９５％少ない標
的生成物を生成し得る。例えば、本発明の微生物は、約０．００１、０．０１、０．１０
、０．３０、０．５０、または１．０ｇ／Ｌ未満の標的生成物を生成することができる。

【0112】

例示的な配列および酵素の供給源は、本明細書において提供されるが、本発明は、これ
らの配列と供給源に限定されるものではなく－それはまた、変異体を包含する。「変異体
」という用語は、核酸およびタンパク質の配列が、従来技術において開示されるかまたは
本明細書に例示される参照核酸およびタンパク質の配列等の、参照核酸およびタンパク質
の配列とは異なる、核酸およびタンパク質を含む。本発明は、参照核酸またはタンパク質
と実質的に同じ機能を実行する変異体核酸またはタンパク質を使用して実施され得る。例
えば、変異体タンパク質は、参照タンパク質と実質的に同じ機能を実行するか、または実
質的に同じ反応に触媒作用を及ぼし得る。変異体遺伝子は、参照遺伝子と同じ、または実
質的に同じタンパク質をコードし得る。変異体プロモータは、参照プロモータと実質的に
同じ、１つ以上の遺伝子の発現を促進するための能力を有し得る。

【0113】

このような核酸またはタンパク質は、本明細書において「機能的に同等な変異体」と呼ば
れ得る。例として、核酸の機能的に同等な変異体には、対立遺伝子変異体、遺伝子の断片
、突然変異遺伝子、多型等が含まれ得る。他の微生物からの相同遺伝子も、機能的に同等
な変異体の例である。これらとしては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌ
ｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉ
ｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉなどの種の相同遺伝子が挙げられ、それらの詳細は、
ＧｅｎｂａｎｋまたはＮＣＢＩなどのウェブサイトで公開されており入手可能である。機
能的に同等な変異形としてはまた、特定の微生物のコドン最適化の結果として配列が変化
している核酸が挙げられる。核酸の機能的に同等な変異体は、好ましくは、参照核酸と少
なくとも約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、またはそれを
超える核酸配列同一性（相同性割合）を有する。タンパク質の機能的に同等な変異体は、
好ましくは、参照タンパク質と少なくとも約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約
９５％、約９８％、またはそれを超えるアミノ酸同一性（相同性割合）を有する。変異体
核酸またはタンパク質の機能的同等性は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して評
価され得る。

【0114】

核酸は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して、本発明の微生物に送達され得る
。例えば、核酸は裸の核酸として送達されてもよく、リポソーム等の１つ以上の薬剤とと
もに配合されてもよい。核酸は、必要に応じて、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはそれ
らの組み合わせであってもよい。ある特定の実施形態では、制限阻害剤を使用してもよい
。追加のベクターには、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、コスミド、および
人工染色体が含まれ得る。好ましい実施形態では、核酸は、プラスミドを使用して本発明
の微生物に送達される。例として、形質転換（形質導入またはトランスフェクションを含
む）は、エレクトロポレーション、超音波処理、ポリエチレングリコール媒介形質転換、
化学的または自然の能力、プロトプラスト形質転換、プロファージ誘発、または接合によ
って達成され得る。活性制限酵素系を有するある特定の実施形態では、核酸を微生物に導
入する前に核酸をメチル化する必要があり得る。

【0115】

さらに、特定の核酸の発現を増加または制御するために、プロモータ等の調節エレメン
トを含むように核酸を設計してもよい。プロモータは、構成的プロモータまたは誘導性プ
ロモータであり得る。理想的には、プロモータは、Ｗｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路プ
ロモータ、フェレドキシンプロモータ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ
プロモータ、Ｒｎｆ複合オペロンプロモータ、ＡＴＰシンターゼオペロンプロモータ、ま
たはホスホトランスアセチラーゼ／アセテートキナーゼオペロンプロモータである。

【0116】

「基質」は、本発明の微生物のための炭素源および／またはエネルギー源を指す。多く
の場合、基質は、ガス状であり、Ｃ１炭素源、例えば、ＣＯ、ＣＯ_２、および／またはＣ
Ｈ_４を含む。好ましくは、基質は、ＣＯまたはＣＯ＋ＣＯ_２のＣ１炭素源を含む。基質は
、Ｈ_２、Ｎ_２、または電子等の他の非炭素成分をさらに含み得る。しかしながら、他の実
施形態では、基質は、糖、デンプン、繊維、リグニン、セルロース、またはヘミセルロー
スまたはそれらの組み合わせなどの炭水化物であってもよい。例えば、炭水化物は、フル
クトース、ガラクトース、グルコース、ラクトース、マルトース、スクロース、キシロー
ス、またはそれらのいくつかの組み合わせであり得る。一部の実施形態では、基質は（Ｄ
）－キシロースを含まない（Ａｌｋｉｍ，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ，１４：１
２７，２０１５）。いくつかの実施形態では、基質はキシロースなどのペントースを含ま
ない（Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ，３４：８０－８７，２０１６）。いくつか
の実施形態では、基質は、ガス状基質および炭水化物基質の両方を含み得る（混合栄養発
酵）。

【0117】

ガス状基質は、概して、約１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、
８０、９０、または１００ｍｏｌ％のＣＯなどの少なくともいくらかの量のＣＯを含む。
ガス状基質は、約２０～８０、３０～７０、または４０～６０ｍｏｌ％のＣＯなど、ある
範囲のＣＯを含み得る。好ましくは、ガス状基質は、約４０～７０ｍｏｌ％のＣＯ（例え
ば、製鋼または高炉ガス）、約２０～３０ｍｏｌ％のＣＯ（例えば、塩基性酸素転炉ガス
）、または約１５～４５ｍｏｌ％のＣＯ（例えば、合成ガス）を含む。いくつかの実施形
態では、ガス状基質は、約１～１０または１～２０ｍｏｌ％のＣＯなどの比較的低量のＣ
Ｏを含み得る。本発明の微生物は、典型的には、ガス状基質中のＣＯの少なくとも一部分
を生成物に変換する。いくつかの実施形態では、ガス状基質は、ＣＯを含まないか、また
は実質的に含まない（１ｍｏｌ％未満）。

【0118】

ガス状基質は、いくらかの量のＨ_２を含み得る。例えば、ガス状基質は、約１、２、５
、１０、１５、２０、または３０ｍｏｌ％のＨ_２を含み得る。いくつかの実施形態では、
ガス状基質は、約６０、７０、８０、または９０ｍｏｌ％のＨ_２など、比較的多量のＨ_２
を含み得る。さらなる実施形態では、ガス状基質は、Ｈ_２を含まないか、または実質的に
含まない（１ｍｏｌ％未満）。

【0119】

ガス状基質は、いくらかの量のＣＯ_２を含み得る。例えば、ガス状基質は、約１～８０
または１～３０ｍｏｌ％のＣＯ_２を含み得る。いくつかの実施形態において、ガス状基質
は、約２０、１５、１０、または５ｍｏｌ％未満のＣＯ_２を含み得る。別の実施形態にお
いて、ガス状基質は、ＣＯ_２を含まないか、または実質的に含まない（１ｍｏｌ％未満）
。

【0120】

ガス状基質は、代替形態で提供することもできる。例えば、ガス状基質は、液体に溶解
され得るか、または固体支持体上に吸着され得る。

【0121】

ガス状基質および／またはＣ１炭素源は、自動車の排出ガスまたはバイオマスガス化か
らなど、産業プロセスの副産物として、または何らかの他の源から得られる、廃ガスまた
はオフガスであってもよい。ある特定の実施形態では、産業過程は、製鋼所製造等の鉄金
属生成物製造、非鉄金属生成物製造、石油精製、石炭ガス化、電力生成、カーボンブラッ
ク生成、アンモニア生成、メタノール生成、およびコークス製造からなる群から選択され
る。これらの実施形態では、ガス状基質および／またはＣ１炭素源は、任意の従来の方法
を使用して、それが大気中に放出される前に産業プロセスから捕捉されてもよい。

【0122】

ガス状基質および／またはＣ１炭素源は、石炭もしくは精錬残渣のガス化、バイオマス
もしくはリグノセルロース物質のガス化、または天然ガスの改質によって得られる合成ガ
スなどの、合成ガスであってもよい。別の実施形態では、合成ガスは、都市固形廃棄物ま
たは産業固形廃棄物のガス化から得られてもよい。

【0123】

ガス状基質の組成は、反応の効率および／または費用に著しい影響を及ぼし得る。例え
ば、酸素（Ｏ_２）の存在は、嫌気性発酵過程の効率を低減し得る。基質の組成に応じて、
基質を処理、スクラブ、または濾過して、毒素、望ましくない成分、またはちり粒子等の
いかなる望ましくない不純物も除去すること、および／または所望の成分の濃度を増加さ
せることが望ましくあり得る。

【0124】

特定の実施形態において、発酵は、糖、デンプン、繊維、リグニン、セルロース、また
はヘミセルロースなどの炭水化物基質の不在下で実施される。

【0125】

いくつかの実施形態において、以下に示すように、ＣＯおよびＨ_２からエチレングリコ
ール（ＭＥＧ）への全体的なエネルギー論は、グルコースからエチレングリコールへのエ
ネルギー論よりも好ましく、ＣＯおよびＨ_２の、より負のギブス自由エネルギー、ΔｒＧ
´ｍ値は、エチレングリコールへのより大きな推進力を示している。基質としてのグルコ
ースとＣＯの比較のための全体的な反応デルタＧの計算を、生物学的システムにおける経
路または経路の個々のステップの全体的な実現可能性を評価するための標準的な方法であ
る、ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｏｒ．ｗｅｉｚｍ
ａｎｎ．ａｃ．ｉｌ／）を使用して実行した（Ｆｌａｍｈｏｌｚ，Ｅ．Ｎｏｏｒ，Ａ．Ｂ
ａｒ－Ｅｖｅｎ，Ｒ．Ｍｉｌｏ（２０１２）ｅＱｕｉｌｉｂｒａｔｏｒ－ｔｈｅ ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４０：Ｄ７７０－５；Ｎｏｏｒ，Ａ．Ｂａｒ－Ｅｖｅｎ，Ａ
．Ｆｌａｍｈｏｌｚ，Ｙ．Ｌｕｂｌｉｎｇ，Ｄ．Ｄａｖｉｄｉ，Ｒ．Ｍｉｌｏ（２０１２
）Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｏｐｅｎ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｆｏｒ ｔｈｅｒｍｏ
ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ ｃｏｍｂｉｎｅｓ ａｃｃｕ
ｒａｃｙ ａｎｄ ｃｏｖｅｒａｇｅＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２８：２０３７－
２０４４；Ｎｏｏｒ，Ｈ．Ｓ．Ｈａｒａｌｄｓｄｏｔｔｉｒ，Ｒ．Ｍｉｌｏ，Ｒ．Ｍ．Ｔ
．Ｆｌｅｍｉｎｇ（２０１３）Ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇ
ｉｂｂｓ Ｅｎｅｒｇｙ Ｕｓｉｎｇ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ
ｓ ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ ９（７）：ｅ１００３０９８；Ｎｏｏｒ，Ａ．
Ｂａｒ－Ｅｖｅｎ，Ａ．Ｆｌａｍｈｏｌｚ，Ｅ．Ｒｅｚｎｉｋ，Ｗ．Ｌｉｅｂｅｒｍｅｉ
ｓｔｅｒ，Ｒ．Ｍｉｌｏ（２０１４）Ｐａｔｈｗａｙ Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ
Ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｓ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｏｂｓｔａｃｌｅｓ ｉｎ Ｃｅｎｔｒａｌ
Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ １０（２）：ｅ１００３４
８３）。計算は次のとおりである。

【0126】

グルコース（ａｑ）＋３ＮＡＤＨ（ａｑ）

３ＭＥＧ（ａｑ）＋３ＮＡＤ^＋（ａｑ）ΔｒＧ´ｍ－１０４ｋＪ／ｍｏｌ

【0127】

６ＣＯ（ａｑ）＋３Ｈ_２（ａｑ）＋６ＮＡＤＨ（ａｑ）

３ＭＥＧ（ａｑ）＋６ＮＡＤ^＋（ａｑ）ΔｒＧ´ｍ－１９２ｋＪ／ｍｏｌ

【0128】

生理学的状態：

【0129】

グルコース（ａｑ）＋３ＮＡＤＨ（ａｑ）

３ＭＥＧ（ａｑ）＋３ＮＡＤ^＋（ａｑ）ΔｒＧ´ｍ－７０ｋＪ／ｍｏｌ

【0130】

６ＣＯ（ａｑ）＋３Ｈ_２（ａｑ）＋６ＮＡＤＨ（ａｑ）

３ＭＥＧ（ａｑ）＋６ＮＡＤ^＋（ａｑ）ΔｒＧ´ｍ－２９５ｋＪ／ｍｏｌ

【0131】

エチレングリコール、グリオキシル酸、および／またはグリコール酸に加えて、本発明
の微生物は、１つ以上の副産物を生成するために培養されてもよい。例えば、本発明の微
生物は、エタノール（ＷＯ２００７／１１７１５７）、アセテート（ＷＯ２００７／１１
７１５７）、ブタノール（ＷＯ２００８／１１５０８０およびＷＯ２０１２／０５３９０
５）、ブチレート（ＷＯ２００８／１１５０８０）、２，３－ブタンジオール（ＷＯ２０
０９／１５１３４２およびＷＯ２０１６／０９４３３４）、ラクテート（ＷＯ２０１１／
１１２１０３）、ブテン（ＷＯ２０１２／０２４５２２）、ブタジエン（ＷＯ２０１２／
０２４５２２）、メチルエチルケトン（２－ブタノン）（ＷＯ２０１２／０２４５２２お
よびＷＯ２０１３／１８５１２３）、エチレン（ＷＯ２０１２／０２６８３３）、アセト
ン（ＷＯ２０１２／１１５５２７）、イソプロパノール（ＷＯ２０１２／１１５５２７）
、脂質（ＷＯ２０１３／０３６１４７）、３－ヒドロキシプロピオネート（３－ＨＰ）（
ＷＯ２０１３／１８０５８１）、イソプレン（ＷＯ２０１３／１８０５８４）、脂肪酸（
ＷＯ２０１３／１９１５６７）、２－ブタノール（ＷＯ２０１３／１８５１２３）、１，
２－プロパンジオール（ＷＯ２０１４／０３６１５２）、１－プロパノール（ＷＯ２０１
４／０３６９１５２）、コリスメート由来生成物（ＷＯ２０１６／１９１６２５）、３－
ヒドロキシブチレート（ＷＯ２０１７／０６６４９８）、および１，３－ブタンジオール
（ＷＯ２０１７／００６６４９８）を生成することができるか、または生成するように操
作することができる。いくつかの実施形態では、本発明の微生物は、エチレングリコール
に加えて、エタノール、２，３－ブタンジオール、および／またはコハク酸も生成する。
特定の実施形態において、微生物バイオマス自体が生成物と見なされ得る。

【0132】

「天然生成物」は、遺伝子組換えされていない微生物によって生成される生成物である
。例えば、エタノール、アセテート、および２，３－ブタンジオールは、クロストリジウ
ムオートエタノゲヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、
クロストリジウムユングダーリー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）
、およびクロストリジウムラグスダレイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ
）の天然生成物である。「非天然生成物」は、遺伝子組換えされた微生物によって生成さ
れるが、遺伝子組換えされた微生物が由来する遺伝子組換えされていない微生物によって
生成されない生成物である。エチレングリコールは、自然界に存在する微生物によって生
成されることは知られていないため、すべての微生物の非天然生成物である。

【0133】

「選択性」は、微生物によって生成される全発酵生成物の生成に対する標的生成物の生
成の比率を指す。本発明の微生物は、特定の選択性で、または最小の選択性で生成物を生
成するように操作され得る。一実施形態では、標的生成物は、本発明の微生物によって生
成される全発酵生成物の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、５０％、
または７５％を占める。一実施形態では、本発明の微生物によって生成される全発酵生成
物の少なくとも１０％を占め、その結果エチレングリコールは、本発明の微生物が少なく
とも１０％のエチレングリコールに対する選択性を有する。一実施形態では、本発明の微
生物によって生成される全発酵生成物の少なくとも３０％を占め、その結果エチレングリ
コールは、本発明の微生物が少なくとも３０％のエチレングリコールに対する選択性を有
する。

【0134】

典型的には、培養は、バイオリアクタ中で実行される。「バイオリアクタ」という用語
は、連続撹拌槽反応器（ＣＳＴＲ）、固定化細胞反応器（ＩＣＲ）、トリクルベッド反応
器（ＴＢＲ）、気泡塔、ガスリフト発酵槽、静的ミキサ、またはガス－液体接触に好適な
他の容器もしくは他のデバイス等の１つ以上の容器、塔、または配管からなる培養／発酵
デバイスを含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、第１の増殖反応器および
第２の培養／発酵反応器を含み得る。基質は、これらの反応器のうちの１つまたは両方に
提供され得る。本明細書で使用する場合、「培養」および「発酵」という用語は、同じ意
味で使用される。これらの用語は、培養／発酵過程の増殖期および生成物生合成期の両方
を包含する。

【0135】

培養物は概して、微生物の増殖を可能にするのに十分な栄養素、ビタミン、および／ま
たは無機物を含有する水性培地中で維持される。好ましくは、水性培地は、最小嫌気性微
生物増殖培地などの嫌気性微生物培地である。好適な培地は、当該技術分野において周知
である。

【0136】

培養／発酵は、望ましくは、エチレングリコールの生成のために適切な条件下で実施さ
れるべきである。必要に応じて、培養／発酵は、嫌気性条件下で実施される。考慮する反
応条件は、圧力（または分圧）、温度、ガス流量、液体流量、培地ｐＨ、培地酸化還元電
位、撹拌速度（連続撹拌槽反応器を使用する場合）、接種レベル、液相中のガスが制限さ
れないことを確実にするための最大ガス基質濃度、および生成物阻害を回避するための最
大生成物濃度を含む。特に、基質の導入速度は、液相中のガスの濃度が制限的にならない
ことを確実にするように制御されてもよい。

【0137】

上昇した圧力でバイオリアクタを操作することにより、気相から液相へのガス物質移動
の速度を速めることができる。したがって、概して、大気圧よりも高い圧力で培養／発酵
を実施することが好ましい。また、所与のガス変換速度が部分的に基質保持時間の関数で
あり、かつ保持時間がバイオリアクタの必要な容積を示すため、加圧システムの使用は、
必要なバイオリアクタの容積、およびその結果として培養／発酵装置の資本コストを大幅
に削減することができる。これはさらに、バイオリアクタ中の液体体積を入力ガス流量で
除算したものとして定義される保持時間が、バイオリアクタが大気圧よりも上昇した圧力
に維持されるときに減少され得ることを意味する。最適反応条件は、使用される特定の微
生物に部分的に依存する。しかしながら、一般的には、大気圧より高い圧力で発酵を行う
ことが好ましい。また、所与のガス変換速度が部分的に基質保持時間の関数であり、かつ
所望の保持時間を達成することがバイオリアクタの必要な体積をさらに示すため、加圧シ
ステムの使用は、必要なバイオリアクタの体積、およびその結果として発酵装置の資本コ
ストを大幅に低減することができる。

【0138】

特定の実施形態において、発酵は、光の不在下で、または光合成微生物のエネルギー要
求を満たすには不十分な量の光の存在下で行われる。特定の実施形態において、本発明の
微生物は、非光合成微生物である。

【0139】

本発明の方法は、発酵ブロスからエチレングリコールを分離することをさらに含み得る
。エチレングリコールは、例えば、蒸留、模擬移動床プロセス、膜処理、蒸発、パーベー
パレーション、ガスストリッピング、相分離、イオン交換、または、例えば液－液抽出を
含む抽出発酵を含む、当技術分野で既知の任意の方法または方法の組み合わせを使用して
、発酵ブロスから分離または精製することができる。一実施形態では、エチレングリコー
ルは、逆浸透および／またはパーベーパレーションを使用して発酵ブロスから濃縮するこ
とができる（ＵＳ５，５５２，０２３）。蒸留により水を除去し、次いで、（高比率のエ
チレングリコールを含有する）底部を、蒸留または真空蒸留を使用して回収して、高純度
エチレングリコール流を生成することができる。あるいは、逆浸透および／またはパーベ
ーパレーションによる濃縮の有無にかかわらず、エチレングリコールは、アルデヒドとの
反応蒸留（Ａｔｕｌ，Ｃｈｅｍ Ｅｎｇ Ｓｃｉ，５９：２８８１－２８９０，２００４
）または炭化水素を使用する共沸蒸留（ＵＳ２，２１８，２３４）によってさらに精製で
きる。別のアプローチでは、エチレングリコールを水溶液から活性炭またはポリマー吸収
剤に補足させ（逆浸透および／またはパーベーパレーションありまたはなしで）、低沸点
有機溶媒を使用して回収できる（Ｃｈｉｎｎ，Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｌｓ
，Ｓｕｇａｒｓ，ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ－ＯＨ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ
ｓ ｆｒｏｍ Ｄｉｌｕｔｅ－Ａｑｕｅｏｕｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｅｇｅｎｅ
ｒａｂｌｅ Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｎｔｏ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃａｒｂｏｎｓ，
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，１９９９）。
次に、エチレングリコールを蒸留により有機溶媒から回収することができる。特定の実施
形態では、エチレングリコールは、発酵ブロスの一部分をバイオリアクタから連続除去し
、微生物細胞をブロスから分離し（濾過により簡便に）、かつエチレングリコールをブロ
スから回収することによって、発酵ブロスから回収される。アルコールや酸などの副産物
も、ブロスから分離または精製することができる。アルコールは、例えば、蒸留によって
回収され得る。酸は、例えば、活性炭上での吸着によって回収され得る。特定の実施形態
では、分離された微生物細胞をバイオリアクタに戻すことができる。標的生成物が取り出
された後に残っている無細胞透過液も、好ましくは、全体または部分的にバイオリアクタ
に戻される。追加の栄養素（ビタミンＢなど）が、無細胞透過液に添加されて、培地を補
充した後に、バイオリアクタに戻され得る。

【0140】

水性媒体からのジオールの回収は、いくつかの方法で実証されている。疑似移動床（Ｓ
ＭＢ）技術は、エタノールと関連する含酸素化合物の水性混合物から２，３－ブタエンジ
オールを回収するために使用されている（米国特許第８，６５８．８４５号）。反応性分
離は、効果的なジオール回収のためにも実証されている。いくつかの実施形態では、エチ
レングリコールの回収は、ジオール含有流とアルデヒドとの反応、ジオールの分別および
再生、濃縮されたジオール流を回収するための最終分別によって行われる。例えば、米国
特許第７，９５１，９８０号を参照されたい。

【0141】

本発明は、微生物によって、および本明細書に記載の方法に従って生成されたエチレン
グリコールを含む組成物を提供する。例えば、エチレングリコールを含む組成物は、不凍
液、防腐剤、脱水剤、または掘削流体であり得る。

【0142】

本発明はまた、微生物によって、および本明細書に記載される方法に従って生成された
エチレングリコールを含むポリマーを提供する。このようなポリマーは、例えば、ポリエ
チレングリコールなどのホモポリマーまたはポリエチレンテレフタレートなどのコポリマ
ーであり得る。これらのポリマーの合成方法は、当技術分野でよく知られている。例えば
、Ｈｅｒｚｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ．，１１６（４）：２１７０
－２２４３（２０１６）およびＸｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｄ Ｅｎｇ Ｃｈｅｍ Ｒ
ｅｓ．５４（２２）：５８６２－５８６９（２０１５）を参照されたい。

【0143】

本発明はさらに、微生物によって、および本明細書に記載される方法に従って生成され
るエチレングリコールを含むポリマーを含む組成物を提供する。例えば、組成物は、繊維
、樹脂、フィルム、またはプラスチックであり得る。

【実施例0144】

以下の実施例は、本発明をさらに例示するが、当然のことながら、いかなる方法によっ
てもその範囲を制限すると解釈されるべきではない。

【0145】

実施例１：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおけるＣＯおよび／またはＣＯ_２と
Ｈ_２からのエチレングリコールの生成のための、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓクエン酸シンター
ゼ、Ｅ．ｃｏｌｉイソクエン酸リアーゼ、およびＧ．ｏｘｙｄａｎｓグリコールアルデヒ
ドデヒドロゲナーゼを含む異種発現ベクターの構築

【0146】

Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のクエン酸シンターゼ（ｃｉｔＺ；配列番号１～２）、Ｅ．
ｃｏｌｉ由来のイソクエン酸リアーゼ（ｉｃｌ；配列番号１１～１２）、およびＧ．ｏｘ
ｙｄａｎｓ由来のグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄＡ１；配列番号５５～
５６）をコードする遺伝子は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍでの発現のためにコ
ドンに適合され（ｃｏｄｏｎ－ａｄａｐｔｅｄ）、合成された。適応遺伝子は、標準のＢ
ｓａＩゴールデンゲートクローニングキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ
，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して、発現シャトルベクターｐＩＰＬ１２にクローニン
グされた。ｐＩＰＬ１２は、Ｅ．ｃｏｌｉとＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの両方
の複製起点を含み、複製して両方の種で維持できるようにし、また ｐＩＰＬ１２は、ほ
とんどのＣｌｏｓｔｒｉｄｉａでも機能する。ｐＩＰＬ１２はさらに、ポジティブ選択の
ためにエリスロマイシン／クラリスロマイシン耐性を付与する２３Ｓ ｒＲＮＡ（アデニ
ン（２０５８）－Ｎ（６））－メチルトランスフェラーゼＥｒｍ（Ｂ）、大腸菌からの接
合伝達のためのＴｒａＪ、異種遺伝子の発現のためのプロモータを含む。図２Ａを参照さ
れたい。ｃｉｔＺ、ｉｃｌ、およびａｌｄＡ１をｐＩＰＬ１２にクローニングしたときに
作成された発現ベクターを、本明細書ではｐＭＥＧ０４２と呼ぶ（図２Ｂ）。

【0147】

【表2】

【0148】

ｐＭＥＧ０４２構築物は、接合によりＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍに形質転換
された。発現ベクターは、標準的な熱ショック形質転換を使用して、接合体ドナー株であ
るＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１＋Ｒ７０２（ＣＡ４３４）（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．
１９９０）（ドナー）に最初に導入された。ドナー細胞を３７℃で１時間ＳＯＣ培地で回
収した後、１００μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンおよび５００μｇ／ｍＬのエリスロマ
イシンを含むＬＢ培地プレートにプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。
翌日、１００μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンと５００μｇ／ｍＬのエリスロマイシンを
含む５ｍＬのＬＢアリコートにいくつかのドナーコロニーを接種し、３７℃で約４時間、
または培養液が目に見えて密度が高くなるまで、まだ静止期に入っていない状態で培養し
た。１．５ｍＬのドナー培養物を４０００ｒｐｍおよび２０～２５℃で２分間の遠心分離
によって収集し、上清を廃棄した。ドナー細胞を５００μＬの滅菌ＰＢＳ緩衝液に穏やか
に再懸濁し、４０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、ＰＢＳ上清を廃棄した。

【0149】

ペレットを嫌気性チャンバーに導入し、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ培養（レ
シピエント）の指数関数期の後期に２００μＬで穏やかに再懸濁した。Ｃ．ａｕｔｏｅｔ
ｈａｎｏｇｅｎｕｍ ＤＳＭ１００６１およびＤＳＭ２３６９３（ＤＳＭ１００６１の派
生物）は、ＤＳＭＺ（Ｔｈｅ Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏ
ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａ
βｅ ７Ｂ，３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から取得した。
菌株は、標準的な嫌気性技術（Ｈｕｎｇａｔｅ １９６９；Ｗｏｌｆｅ １９７１）を使
用して、ｐＨ５．６でＰＥＴＣ培地（米国特許第９，７３８，８７５号を参照）中、３７
℃で増殖させた。

【0150】

接合混合物（ドナー細胞とレシピエント細胞の混合物）をＰＥＴＣ－ＭＥＳ＋フルクト
ース寒天プレートにスポットし、放置して乾燥させた。スポットが、もはや目に見えて濡
れなくなったときに、プレートを、圧力ジャーに導入し、合成ガス（５０％ＣＯ、１０％
Ｎ_２、３０％ＣＯ_２、１０％Ｈ_２）で２５～３０ｐｓｉに加圧し、３７℃で約２４時間イ
ンキュベートした。次に、１０μＬの白金耳を使用して穏やかに掻き取ることにより、接
合混合物をプレートから取り出した。取り出した混合物を２００～３００μＬのＰＥＴＣ
培地に懸濁した。接合混合物の１００μＬアリコートを、５μｇ／ｍＬのクラリスロマイ
シンを補充したＰＥＴＣ培地寒天プレートにプレーティングし、プラスミドを担持する形
質転換体を選択した。

【0151】

ｐＭＥＧ０４２プラスミドを担持するＣ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの３つの異
なるコロニーを５μｇ／ｍＬのクラリスロマイシンを含む２ｍＬのＰＥＴＣ－ＭＥＳ培地
に接種し、５０％ＣＯ、１０％Ｎ_２、３０％ＣＯ_２、１０％Ｈ_２とともにおよび１００ｒ
ｐｍのオービタル振とうを用いて３日間、３７℃で独立栄養的に増殖させた。培養物を、
血清ボトル内で５μｇ／ｍＬのクラリスロマイシンを含む１０ｍＬのＰＥＴＣ－ＭＥＳ培
地でＯＤ_６００が０．０５になるように希釈し、５０％ＣＯ、１０％Ｎ_２、３０％ＣＯ_２
、１０％Ｈ_２および１００ｒｐｍのオービタル振とうを用いて３７℃で独立栄養的に最大
２０日間増殖させ、毎日サンプリングしてバイオマスと代謝産物を測定した（図３Ａおよ
び３Ｂ）。エチレングリコールの生成を、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ－ＭＳ
）を使用して測定し、他の代謝産物を、下記のように高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）を使用して測定した。

【0152】

エチレングリコール濃度は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＶＦ－ＷＡＸｍｓカラム（１５ｍ×０．
２５μｍ×０．２５μｍ）およびＲＳＨオートサンプラーを装備したＴｈｅｒｍｏ Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ ＩＳＱ ＬＴ ＧＣＭＳで測定した。２００μＬのブロスを２００μ
Ｌのメタノールで希釈して試料を調製した。試料をボルテックスした後、１４，０００ｒ
ｐｍで３分間遠心分離し、２００μＬの上澄みをインサート付きガラスバイアルに移した
。１．０μＬの注入、５対１のスプリット比、２４０℃の注入口温度を使用して、試料を
分析のためにオートサンプラーに移した。クロマトグラフィーは、８０℃、０．５分保持
、１０℃／分で１５０℃まで昇温、２５℃／分で２２０℃まで昇温、３分最終保持のオー
ブンプログラムを使用して、実行した。カラムの流量は４．０ｍＬ／分で、０．５分間保
持した後、キャリアガスとしてヘリウムを使用して、１００ｍｌ／分／分の速度で１．５
ｍｌ／分に低下させた。ＭＳイオン源は、トランスファーラインを２４０℃に設定して２
６０℃に維持した。定量は、３３．０ｍ／ｚを定量ピークとして、３１．０＋６２．０ｍ
／ｚを確認ピークとして使用して、線形外部標準キャリブレーションを使用して行った。

【0153】

エタノール、アセテート、２，３－ブタンジオール、グリオキシル酸、およびグリコー
ル酸の濃度は、屈折率（ＲＩ）検出を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔ
ｙ ＬＣのＨＰＬＣにより３５℃で測定した。試料は、８０℃で５分間加熱した後、１４
，０００ｒｐｍで３分間遠心分離して調製し、上清を分析のためにガラスバイアルに移し
た。分離は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｒｅｚｅｘ（商標）ＲＯＡ－有機酸Ｈ＋（８％）カ
ラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ×８μｍ）への１０μＬ注入で、０．７ｍＬ／分および３
５℃で、アイソクラティック条件下、５ｍＭ硫酸移動相を使用して行われた。

【0154】

独立栄養増殖の約３日後、エチレングリコール前駆体のグリコール酸が観察され、１０
日後、エチレングリコールの生成が観察された（図３Ｂ）。

【0155】

実施例２：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおけるＣＯおよび／またはＣＯ_２お
よびＨ_２からのエチレングリコールの生成のためのＳ．ｔｈｉｏｔａｕｒｉｎｉアラニン
－グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼおよびＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓアルデヒ
ドデヒドロゲナーゼを含む異種発現ベクターの構築。

【0156】

Ｓ．ｔｈｉｏｔａｕｒｉｎｉ由来のアラニン－グリオキシル酸アミノトランスフェラー
ゼ（ｐｕｃＧ；配列番号１５～１６）およびＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｑ８ｒ１－９
６由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄＡ１；配列番号５７～５８）をコードする
遺伝子は、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍでの発現のためコドンに適合され、合成
された。コドンに適合した遺伝子をｐＩＰＬ１２（図２Ａ）にクローニングし、得られた
発現ベクター、ｐＭＥＧ０５８を、実施例１に記載されているように、Ｃ．ａｕｔｏｅｔ
ｈａｎｏｇｅｎｕｍに導入した。図２Ｃを参照されたい。

【0157】

【表3】

【0158】

実施例１に記載されるように、ｐＭＥＧ０５８プラスミドを担持するＣ．ａｕｔｏｅｔ
ｈａｎｏｇｅｎｕｍの２つの異なるコロニーを、５μｇ／ｍＬのクラリスロマイシンを含
む２ｍＬのＰＥＴＣ－ＭＥＳ培地に接種し、独立栄養的に増殖させた。図４Ａを参照され
たい。独立栄養増殖の約３日後、グリコール酸が観察され、８日後、エチレングリコール
の生成が観察された（図４Ｂ）。

【0159】

実施例３：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおけるＣＯおよび／またはＣＯ_２お
よびＨ_２からのエチレングリコールの生成のための、Ｓ．ｔｈｉｏｔａｕｒｉｎｉアラニ
ン－グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼおよびＧ．ｏｘｙｄａｎｓグリコールアル
デヒドデヒドロゲナーゼを含む異種発現ベクターの構築

【0160】

Ｓ．ｔｈｉｏｔａｕｒｉｎｉ由来のアラニン－グリオキシル酸アミノトランスフェラー
ゼ（ｐｕｃＧ；配列番号１５～１６）およびＧ．ｏｘｙｄａｎｓ由来のグリコールアルデ
ヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄＡ１；配列番号５５～５６）をコードする遺伝子は、Ｃ．
ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍでの発現のためにコドンに適合され、合成された。コド
ンに適合した遺伝子をｐＩＰＬ１２（図２Ａ）にクローニングし、得られた発現ベクター
、ｐＭＥＧ０５９を、実施例１に記載されているように、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅ
ｎｕｍに導入した。図２Ｄを参照されたい。

【0161】

【表4】

【0162】

実施例１に記載されるように、ｐＭＥＧ０５９プラスミドを担持するＣ．ａｕｔｏｅｔ
ｈａｎｏｇｅｎｕｍの２つの異なるコロニーを、５μｇ／ｍＬのクラリスロマイシンを含
む２ｍＬのＰＥＴＣ－ＭＥＳ培地に接種し、独立栄養的に増殖させた。図５Ａを参照され
たい。独立栄養増殖の約３日後、グリコール酸が観察され、１０日後、エチレングリコー
ルの生成が観察された（図５Ｂ）。

【0163】

実施例４：Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍにおけるＣＯおよび／またはＣＯ_２お
よびＨ_２からのエチレングリコールの生成のためのアラニン－グリオキシル酸アミノトラ
ンスフェラーゼおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む異種発現ベクターの構築。

【0164】

Ｃ．ａｃｉｄｕｒｉｃｉ由来のクラスＶアミノトランスフェラーゼ（ＳｇＡ；配列番号
１９、２０）およびＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｑ８ｒ１－９６由来のアルデヒドデヒ
ドロゲナーゼ（ａｌｄＡ１；配列番号５７～５８）をコードする遺伝子は、Ｃ．ａｕｔｏ
ｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍでの発現のためコドンに適合され、合成された。コドンに適合し
た遺伝子をｐＩＰＬ１２（図２Ａ）にクローニングし、得られた発現ベクター、ｐＭＥＧ
０６１を、実施例１に記載されているように、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍに導
入した。図２Ｅを参照されたい。

【0165】

【表5】

【0166】

実施例１に記載されるように、ｐＭＥＧ０６１プラスミドを担持するＣ．ａｕｔｏｅｔ
ｈａｎｏｇｅｎｕｍの３つの異なるコロニーを、５μｇ／ｍＬのクラリスロマイシンを含
む２ｍＬのＰＥＴＣ－ＭＥＳ培地に接種し、独立栄養的に増殖させた。図６Ａを参照され
たい。独立栄養増殖の約３日後、グリコール酸が観察され、１６日後、エチレングリコー
ルの生成が観察された（図６Ｂ）。

【0167】

実施例５：エチレングリコールへのさまざまなルートの最大収量のモデリング
Ｍａｒｃｅｌｌｉｎ，Ｇｒｅｅｎ Ｃｈｅｍ，１８：３０２０－３０２８，２０１６に
記載されているようなＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのゲノ
ムスケールの代謝モデルを利用して、エチレングリコールへの異なるルートの最大収量を
予測した。異種代謝反応を野生型Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎ
ｕｍモデル構造に追加して、非天然化合物生成経路の組み込みを示した。本明細書に記載
の実験作業に使用されるモデルは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅ
ｎｕｍに基づくが、代謝の類似性を考慮すると、結果は、他のＷｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａ
ｈｌ微生物にも当てはまると期待することは当然であり得る。

【0168】

エチレングリコールの生成は、ｃｏｂｒａｐｙバージョン０．８．２（Ｅｂｒａｈｉｍ
．，ＣＯＢＲＡｐｙ：ＣＯｎｓｔｒａｉｎｔｓ－Ｂａｓｅｄ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉ
ｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｐｙｔｈｏｎ，ＢＭＣ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ
，７：７４，２０１３）を使用し、ソルバーインターフェイスとしてｏｐｔｌａｎｇバー
ジョン１．２．３（Ｊｅｎｓｅｎ，Ｏｐｔｌａｎｇ：Ａｎ Ａｌｇｅｂｒａｉｃ Ｍｏｄ
ｅｌｉｎｇ Ｌａｎｇｕａｇｅ ｆｏｒ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ Ｏｐｔｉｍｉｚａ
ｔｉｏｎ，”Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｐｅｎ Ｓｏｕｒｃｅ Ｓｏｆｔｗａｒ
ｅ，２，ｄｏｉ：１０．２１１０５／ｊｏｓｓ．００１３９，２０１７）を、最適化ソル
バーとしてＧｕｒｏｂｉ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒバージョン７．０．２を使用する、制約ベ
ースの計算モデリング技術フラックスバランス分析（ＦＢＡ）および代謝調整の線形最小
化（ＬＭＯＭＡ）を使用してシミュレートされた（Ｍａｉａ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ
ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｃｏｍｐｕｔａｔ
ｉｏｎ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｏｎ－ＧＥＣＣＯ´１７，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＡＣＭ Ｐｒｅｓｓ，１６６１－１６６８，２０１７）
。

【0169】

モデル化により、実施例１～４で本明細書に記載された経路により、０．３７ｍｏｌの
エチレングリコール／ｍｏｌＣＯの予測収量が明らかになった。これは、糖新生を必要と
し、予測される最高の収量が、約０．１８ｍｏｌのエチレングリコール／ｍｏｌ ＣＯに
相当する、約０．４４ｇのエチレングリコール／ｇ ＣＯであることが見出された、Ｉｓ
ｌａｍ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ，４１：１７３－１８１，２０１７によって記
述された仮説的経路による予測収量の２倍以上である。

【0170】

本明細書に列挙される公表文献、特許出願、および特許を含む全ての参考文献は、各参
考文献があたかも参照により組み込まれることが個々にかつ具体的に示され、かつその全
体が本明細書中に記載された場合と同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書における任意の先行技術への言及は、その先行技術が任意の国における努力傾注
分野の共通の一般的知識の一部をなすという承認ではなく、かつそのように解釈されるべ
きではない。

【0171】

本発明の記載との関連で（特に、以下の特許請求の範囲との関連で）、用語「ａ」およ
び「ａｎ」および「ｔｈｅ」ならびに同様の指示語の使用は、本明細書に別段の指示がな
い限り、または文脈によって明らかに相反することがない限り、単数および複数の両方を
包含すると解釈されるものとする。用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有す
ること」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含有すること」は、特に断り
のない限り、非限定的な用語（すなわち、「～を含むがこれらに限定されないこと」を意
味する）と解釈されるものとする。「から本質的になる」という用語は、組成物、プロセ
ス、または方法の範囲を、特定の材料もしくは工程、または組成物、プロセス、もしくは
方法の基本的かつ新規の特性に実質的に影響しないものに限定する。選択詞の使用（例え
ば「または」）は、選択詞の一方、両方、またはこれらの任意の組み合わせを意味すると
理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、別段の指示が
ない限り、指示された範囲、値、または構造の±２０％を意味する。

【0172】

本明細書の値の範囲の記述は、本明細書に別段の指示がない限り、範囲内に入る各個々
の値を個々に言及する省略法としての役割を果たすことを単に意図し、各個々の値は、あ
たかも本明細書に個々に列挙されたかのように、本明細書中に組み込まれる。例えば、任
意の濃度範囲、パーセント範囲、比率範囲、整数範囲、サイズ範囲、または厚さ範囲は、
別段の指示がない限り、列挙された範囲内の任意の整数の値、および適切な場合、その分
数（整数の１０分の１、および１００分の１など）を含むと理解されるべきである。

【0173】

本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈と
明らかに相反することがない限り、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書に提供さ
れるありとあらゆる例または例示的な言葉（例えば、「など」）の使用は、本発明をより
よく解明することを単に意図し、別段の請求がない限り、本発明の範囲を制限しない。本
明細書におけるいかなる言葉も、本発明の実施に不可欠な任意の非請求要素を示すものと
解釈されるべきではない。

【0174】

本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載される。それらの好ましい実施形態の変化
形は、上記の説明を読むことによって当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者
が必要に応じてそのような変化形を採用することを予想し、本発明者らは、本発明が本明
細書に具体的に記載されるものとは別の方法で実施されることを意図する。したがって、
本発明は、適用法によって許可された通り、本明細書に添付される特許請求の範囲に記載
される主題の全ての修正物および均等物を含む。さらに、好ましい実施形態の全ての考え
られる変化形における上記の要素の任意の組み合わせは、本明細書で別段の指示がない限
り、または文脈と明らかに相反することがない限り、本発明によって包含される。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【配列表】

2023123701000001.app

【手続補正書】

【提出日】2023-07-03

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

ガス状基質からエチレングリコールまたはエチレングリコールの前駆体を生成できる遺伝子操作されたＣ１固定微生物であって、ＥＣ番号１．２．１．２１を有するグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＥＣ番号１．２．１．２２を有するラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＥＣ番号１．２．１．２４を有するコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＥＣ番号１．２．１．２６を有する２，５－ジオキソ吉草酸デヒドロゲナーゼ、ＥＣ番号１．２．１．８を有するベタイン－アルデヒドデヒドロゲナーゼ、またはＥＣ番号１．２．７．５を有するアルデヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される異種酵素をコードする核酸を含む、微生物。

【請求項2】

前記微生物が、５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸、オキサロ酢酸、クエン酸、リンゴ酸、およびグリシンからなる群から選択される１つ以上の中間体を介してエチレングリコールまたはエチレングリコールの前駆体を生成する、請求項１に記載の微生物。

【請求項3】

前記微生物が、
ｉ）オキサロ酢酸をクエン酸に変換できる異種酵素をコードする核酸、
ｉｉ）グリシンをグリオキシル酸に変換できる異種酵素をコードする核酸、
ｉｉｉ）イソクエン酸をグリオキシル酸に変換できる異種酵素をコードする核酸、および
ｉｖ）グリコール酸をグリコールアルデヒドに変換できる異種酵素をコードする核酸、のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の微生物。

【請求項4】

ａ．オキサロ酢酸をクエン酸に変換できる前記異種酵素が、クエン酸［Ｓｉ］－シンターゼ［２．３．３．１］、ＡＴＰクエン酸シンターゼ［２．３．３．８］またはクエン酸（Ｒｅ）－シンターゼ［２．３．３．３］であり、
ｂ．グリシンをグリオキシル酸に変換できる前記異種酵素が、アラニン－グリオキシル酸トランスアミナーゼ［２．６．１．４４］、セリン－グリオキシル酸トランスアミナーゼ［２．６．１．４５］、セリン－ピルビン酸トランスアミナーゼ［２．６．１．５１］、グリシン－オキサロ酢酸トランスアミナーゼ［２．６．１．３５］、グリシントランスアミナーゼ［２．６．１．４］、グリシンデヒドロゲナーゼ［１．４．１．１０］、アラニンデヒドロゲナーゼ［１．４．１．１］、またはグリシンデヒドロゲナーゼ［１．４．２．１］であり、かつ／または
ｃ．イソクエン酸をグリオキシル酸に変換できる前記異種酵素が、イソクエン酸リアーゼ［４．１．３．１］である、請求項３に記載の微生物。

【請求項5】

前記異種酵素のうちの１つ以上が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｅｄｉｍｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ、およびＺｅａからなる群から選択される属に由来する、請求項３に記載の微生物。

【請求項6】

前記異種酵素のうちの１つ以上が、前記微生物における発現のためにコドン最適化されている、請求項３に記載の微生物。

【請求項7】

前記微生物は、ＥＣ番号１．２．７．１を有するアセチル－ＣｏＡをピルビン酸に変換できる酵素、ＥＣ番号６．４．１．１を有するピルビン酸をオキサロ酢酸に変換できる酵素、ＥＣ番号１．１．１．３７、１．１．１．３８、１．１．１．３９、１．１．１．４０、１．１．１．８２、１．１．１．８３、１．１．１．８４、１．１．１．８５、１．１．１．２９９、または１．１．５．４を有するピルビン酸をリンゴ酸に変換できる酵素、ＥＣ番号２．７．１．４０または２．７．９．２を有するピルビン酸をホスフェノールピルビン酸に変換できる酵素、ＥＣ番号４．１．３．３４を有するオキサロ酢酸をシトリル－ＣｏＡに変換できる酵素、ＥＣ番号２．８．３．１０を有するシトリル－ＣｏＡをクエン酸に変換できる酵素、ＥＣ番号４．２．１．３を有するクエン酸をアコニット酸に、およびアコニット酸をイソクエン酸に変換できる酵素、ＥＣ番号４．１．１．４９または４．１．１．３２を有するホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸に変換できる酵素、ＥＣ番号４．２．１．１１を有するホスホエノールピルビン酸を２－ホスホ－Ｄ－グリセリン酸に変換できる酵素、ＥＣ番号５．４．２．１１／１２を有する２－ホスホ－Ｄ－グリセリン酸を３－ホスホ－Ｄ－グリセリン酸に変換できる酵素、ＥＣ番号１．１．１．９５を有する３－ホスホ－Ｄ－グリセリン酸を３－ホスホノオキシピルビン酸に変換できる酵素、ＥＣ番号２．６．１．５２を有する３－ホスホノオキシピルビン酸を３－ホスホ－Ｌ－セリンに変換できる酵素、ＥＣ番号３．１．３．３を有する３－ホスホ－Ｌ－セリンをセリンに変換できる酵素、ＥＣ番号２．１．２．１を有するセリンをグリシンに変換できる酵素、ＥＣ番号１．４．４．２、１．８１．４、または２．１．２．１０を有する５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸をグリシンに変換できる酵素、ＥＣ番号２．６．１．５１、２．６．１．４５、１．４．１．１、１．４．１．５、１．４．１．７、２．６．１．２、２．６．１．１５． ２．６．１．２１、または２．６．１．４４を有するセリンをヒドロキシピルビン酸に変換できる酵素、ＥＣ番号１．１．１．２９または１．１．１．８１を有するＤ－グリセリン酸をヒドロキシピルビン酸に変換できる酵素、ＥＣ番号２．３．３．９または４．１．３．１を有するリンゴ酸をグリオキシル酸に変換できる酵素、ＥＣ番号１．１．１．２９、１．１．１．２６／７９、または１．１．９９．１４を有するグリオキシル酸をグリコール酸に変換できる酵素、ＥＣ番号４．１．１．４０または４．１．１．１を有するヒドロキシピルビン酸をグリコールアルデヒドに変換できる酵素、およびＥＣ番号１．１．１．７７、１．１．１．１、１．１．１．２、１．１．１．７２、１．１．１．８、または１．１．１．２１．を有するグリコールアルデヒドをエチレングリコールに変換できる酵素、をコードする核酸のうちの１つ以上をさらに含む、請求項３に記載の微生物。

【請求項8】

前記微生物が、
ｉ）前記オキサロ酢酸をクエン酸に変換できる異種酵素、
ｉｉ）前記グリシンをグリオキシル酸に変換できる異種酵素および／または
ｉｉｉ）前記グリコール酸をグリコールアルデヒドに変換できる異種酵素、を過剰発現する、請求項３に記載の微生物。

【請求項9】

前記微生物が、
ｉ）ＥＣ番号６．４．１．１を有する前記ピルビン酸をオキサロ酢酸に変換できる酵素、
ｉｉ）ＥＣ番号４．２．１．３を有する前記クエン酸をアコニット酸に、およびアコニット酸をイソクエン酸に変換できる酵素、
ｉｉｉ）ＥＣ番号４．１．１．４９または４．１．１．３２を有する前記ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸に変換できる酵素、
ｉｖ）ＥＣ番号２．１．２．１を有する前記セリンをグリシンに変換できる酵素、
ｖ）ＥＣ番号１．４．４．２、１．８１．４、または２．１．２．１０を有する前記５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸をグリシンに変換できる酵素、
ｖｉ）ＥＣ番号２．３．３．９を有する前記グリオキシル酸をグリコール酸に変換できる酵素、および／または
ｖｉｉ）ＥＣ番号１．１．１．７７、１．１．１．１、１．１．１．２、１．１．１．７２、１．１．１．８、または１．１．１．２１を有する前記グリコールアルデヒドをエチレングリコールに変換できる酵素、を過剰発現する、請求項５に記載の微生物。

【請求項10】

前記微生物が、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、グリセリン酸デヒドロゲナーゼ、グリコール酸デヒドロゲナーゼ、グリセリン酸デヒドロゲナーゼ、グリコール酸デヒドロゲナーゼ、アルデヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼ、およびアルデヒドデヒドロゲナーゼのうちの１つ以上に破壊的変異を含む、請求項１に記載の微生物。

【請求項11】

前記微生物が、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒからなる群から選択される属のメンバーである、請求項１に記載の微生物。

【請求項12】

前記微生物が、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｇｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｕｖｉからなる群から選択される親微生物に由来する、請求項１に記載の微生物。

【請求項13】

前記微生物が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉからなる群から選択される親細菌に由来する、請求項１２に記載の微生物。

【請求項14】

前記微生物が、天然または異種のＷｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を含む、請求項１に記載の微生物。

【請求項15】

前記エチレングリコールの前駆体がグリオキシル酸またはグリコール酸である、請求項１に記載の微生物。

【請求項16】

前記ガス状基質の存在下、栄養培地中で請求項１に記載の微生物を培養し、それによって前記微生物がエチレングリコールまたはエチレングリコールの前駆体を生成することを含む、エチレングリコールまたはエチレングリコールの前駆体の生成方法。

【請求項17】

前記ガス状基質が、ＣＯ、ＣＯ_２、およびＨ_２のうちの１つ以上を含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記エチレングリコールの前駆体がグリオキシル酸またはグリコール酸である、請求項１６に記載の方法。

【請求項19】

前記栄養培地からエチレングリコールまたはエチレングリコールの前駆体を分離することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項20】

前記微生物がエタノール、２，３－ブタンジオール、およびコハク酸うちの１つ以上をさらに生成する、請求項１６に記載の方法。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１７４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0174】

本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載される。それらの好ましい実施形態の変化形は、上記の説明を読むことによって当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者が必要に応じてそのような変化形を採用することを予想し、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載されるものとは別の方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用法によって許可された通り、本明細書に添付される特許請求の範囲に記載される主題の全ての修正物および均等物を含む。さらに、好ましい実施形態の全ての考えられる変化形における上記の要素の任意の組み合わせは、本明細書で別段の指示がない限り、または文脈と明らかに相反することがない限り、本発明によって包含される。

本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．ガス状基質からエチレングリコールまたはエチレングリコールの前駆体を生成できる遺伝子操作された微生物。
２．前記微生物が、５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸、オキサロ酢酸、クエン酸、リンゴ酸、およびグリシンからなる群から選択される１つ以上の中間体を介してエチレングリコールまたはエチレングリコールの前駆体を生成する、上記１に記載の微生物。
３．前記微生物が、
ａ．オキサロ酢酸をクエン酸に変換できる異種酵素、
ｂ．グリシンをグリオキシル酸に変換できる異種酵素、
ｃ．イソクエン酸をグリオキシル酸に変換できる異種酵素、および
ｄ．グリコール酸をグリコアルデヒドに変換できる異種酵素、のうちの１つ以上を含む、上記１に記載の微生物。
４．ａ．オキサロ酢酸をクエン酸に変換できる前記異種酵素が、クエン酸［Ｓｉ］－シンターゼ［２．３．３．１］、ＡＴＰクエン酸シンターゼ［２．３．３．８］またはクエン酸（Ｒｅ）－シンターゼ［２．３．３．３］であり、
ｂ．グリシンをグリオキシル酸に変換できる前記異種酵素が、アラニン－グリオキシル酸トランスアミナーゼ［２．６．１．４４］、セリン－グリオキシル酸トランスアミナーゼ［２．６．１．４５］、セリン－ピルビン酸トランスアミナーゼ［２．６．１．５１］、グリシン－オキサロ酢酸トランスアミナーゼ［２．６．１．３５］、グリシントランスアミナーゼ［２．６．１．４］、グリシンデヒドロゲナーゼ［１．４．１．１０］、アラニンデヒドロゲナーゼ［１．４．１．１］、またはグリシンデヒドロゲナーゼ［１．４．２．１］であり、
ｃ．イソクエン酸をグリオキシル酸に変換できる前記異種酵素が、イソクエン酸リアーゼ［４．１．３．１］であり、かつ／または
ｄ．グリコール酸をグリコールアルデヒドに変換できる前記異種酵素が、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．１．２１］、ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．１．２２］、コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．１．２４］、２，５－ジオキソ吉草酸デヒドロゲナーゼ［１．２．１．２６］、アルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．１．３／４／５］、ベタイン－アルデヒドデヒドロゲナーゼ［１．２．１．８］、またはアルデヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼ［１．２．７．５］である、上記３に記載の微生物。
５．前記異種酵素のうちの１つ以上が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｅｄｉｍｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ、およびＺｅａからなる群から選択される属に由来する、上記３に記載の微生物。
６．前記異種酵素のうちの１つ以上が、前記微生物における発現のためにコドン最適化されている、上記３に記載の微生物。
７．前記微生物は、アセチル－ＣｏＡをピルビン酸に変換できる酵素、ピルビン酸をオキサロ酢酸に変換できる酵素、ピルビン酸をリンゴ酸に変換できる酵素、ピルビン酸をホスフェノールピルビン酸に変換できる酵素、オキサロ酢酸をシトリル－ＣｏＡに変換できる酵素、シトリル－ＣｏＡをクエン酸に変換できる酵素、クエン酸をアコニット酸に、およびアコニット酸をイソクエン酸に変換できる酵素、ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸に変換できる酵素、ホスホエノールピルビン酸を２－ホスホ－Ｄ－グリセリン酸に変換できる酵素、２－ホスホ－Ｄ－グリセリン酸を３－ホスホ－Ｄ－グリセリン酸に変換できる酵素、３－ホスホ－Ｄ－グリセリン酸を３－ホスホノオキシピルビン酸に変換できる酵素、３－ホスホノオキシピルビン酸を３－ホスホ－Ｌ－セリンに変換できる酵素、３－ホスホ－Ｌ－セリンをセリンに変換できる酵素、セリンをグリシンに変換できる酵素、５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸をグリシンに変換できる酵素、セリンをヒドロキシピルビン酸に変換できる酵素、Ｄ－グリセリン酸をヒドロキシピルビン酸に変換できる酵素、リンゴ酸をグリオキシル酸に変換できる酵素、グリオキシル酸をグリコール酸に変換できる酵素、ヒドロキシピルビン酸をグリコアルデヒドに変換できる酵素、およびグリコアルデヒドをエチレングリコールに変換できる酵素、のうちの１つ以上をさらに含む、上記３に記載の微生物。
８．前記微生物が、
ａ．前記オキサロ酢酸をクエン酸に変換できる異種酵素、
ｂ．前記グリシンをグリオキシル酸に変換できる異種酵素および／または
ｃ．前記グリコール酸をグリコアルデヒドに変換できる異種酵素、を過剰発現する、上記３に記載の微生物。
９．前記微生物が、
ａ．前記ピルビン酸をオキサロ酢酸に変換できる酵素、
ｂ．前記クエン酸をアコニット酸に、およびアコニット酸をイソクエン酸に変換できる酵素、
ｃ．前記ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸に変換できる酵素、
ｄ．前記セリンをグリシンに変換できる酵素、
ｅ．前記５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸をグリシンに変換できる酵素、
ｆ．前記グリオキシル酸をグリコール酸に変換できる酵素、および／または
ｇ．前記グリコアルデヒドをエチレングリコールに変換できる酵素、を過剰発現する、上記７に記載の微生物。
１０．前記微生物が、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、グリセリン酸デヒドロゲナーゼ、グリコール酸デヒドロゲナーゼ、グリセリン酸デヒドロゲナーゼ、グリコール酸デヒドロゲナーゼ、アルデヒドフェレドキシンオキシドレダクターゼ、およびアルデヒドデヒドロゲナーゼのうちの１つ以上に破壊的変異を含む、上記１に記載の微生物。
１１．前記微生物が、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒからなる群から選択される属のメンバーである、上記１に記載の微生物。
１２．前記微生物が、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｍａｇｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｉｕｖｉからなる群から選択される親微生物に由来する、上記１に記載の微生物。
１３．前記微生物が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉからなる群から選択される親細菌に由来する、上記１２に記載の微生物。
１４．前記微生物が、天然または異種のＷｏｏｄ－Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を含む、上記１に記載の微生物。
１５．前記エチレングリコールの前駆体がグリオキシル酸またはグリコール酸である、上記１に記載の微生物。
１６．前記ガス状基質の存在下、栄養培地中で上記１に記載の微生物を培養し、それによって前記微生物がエチレングリコールまたはエチレングリコールの前駆体を生成することを含む、エチレングリコールまたはエチレングリコールの前駆体の生成方法。
１７．前記ガス状基質が、ＣＯ、ＣＯ _２ 、およびＨ _２ のうちの１つ以上を含む、上記１６に記載の方法。
１８．前記エチレングリコールの前駆体がグリオキシル酸またはグリコール酸である、上記１６に記載の方法。
１９．前記栄養培地からエチレングリコールまたはエチレングリコールの前駆体を分離することをさらに含む、上記１６に記載の方法。
２０．前記微生物がエタノール、２，３－ブタンジオール、およびコハク酸うちの１つ以上をさらに生成する、上記１６に記載の方法。

【外国語明細書】