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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023124433
(43)【公開日】2023-09-06
(54)【発明の名称】評価システム及び評価方法
(51)【国際特許分類】
C12M 1/34 20060101AFI20230830BHJP
C12N 5/074 20100101ALI20230830BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20230830BHJP
C12M 3/00 20060101ALI20230830BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20230830BHJP
【ＦＩ】
C12M1/34 A
C12N5/074
C12M1/00 A
C12M3/00 Z
C12Q1/02
【審査請求】未請求
【請求項の数】14
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022028184
(22)【出願日】2022-02-25
(71)【出願人】
【識別番号】000005108
【氏名又は名称】株式会社日立製作所
(74)【代理人】
【識別番号】110000176
【氏名又は名称】弁理士法人一色国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】平井 格郎
(72)【発明者】
【氏名】斉藤 洸
(72)【発明者】
【氏名】加藤 美登里
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA01
4B029AA08
4B029BB11
4B029CC01
4B029FA15
4B029GA08
4B029GB06
4B063QA20
4B063QQ08
4B063QR77
4B063QS36
4B063QS39
4B063QX02
4B065AA93X
4B065AC20
4B065BA30
4B065CA44
4B065CA46
(57)【要約】
【課題】本発明は、細胞の状態を評価するための新規の評価システム及び評価方法を提供することを目的とする。
【解決手段】
細胞の培養上清に含まれる細胞外小胞に対してラマン分光分析をするためのラマン分光装置と、前記ラマン分光分析によって得られたラマンスペクトルに基づいて、前記細胞の状態を評価するための解析装置と、を有する評価システムを提供する。
【選択図】図１
【解決手段】
細胞の培養上清に含まれる細胞外小胞に対してラマン分光分析をするためのラマン分光装置と、前記ラマン分光分析によって得られたラマンスペクトルに基づいて、前記細胞の状態を評価するための解析装置と、を有する評価システムを提供する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞の状態を評価するための評価システムであって、
前記細胞の培養上清に含まれる細胞外小胞に対してラマン分光分析をするためのラマン分光装置と、
前記ラマン分光分析によって得られたラマンスペクトルに基づいて、前記細胞の状態を評価するための解析装置と、
を有する評価システム。
前記細胞の培養上清に含まれる細胞外小胞に対してラマン分光分析をするためのラマン分光装置と、
前記ラマン分光分析によって得られたラマンスペクトルに基づいて、前記細胞の状態を評価するための解析装置と、
を有する評価システム。
【請求項2】
前記細胞は、多能性幹細胞、ドーパミン神経前駆細胞、外胚葉、又は中胚葉である、
請求項１に記載の評価システム。
請求項１に記載の評価システム。
【請求項3】
前記細胞の状態は、細胞の分化段階である、
請求項１または２に記載の評価システム。
請求項１または２に記載の評価システム。
【請求項4】
前記細胞外小胞は、エクソソームである、
請求項１～３のいずれか１項に記載の評価システム。
請求項１～３のいずれか１項に記載の評価システム。
【請求項5】
前記ラマンスペクトルにおいて、７１３±１０、８３０±１０、８５８±１０、８８５±１０、８９５±１０、９１９±１０、９４２±１０、９９７±１０、１０４０±１０、１０６５±１０、１１０７±１０、１１３３±１０、１１７５±１０、１２９９±１０、１３７２±１０、１４２０±１０、１４４３±１０、１７３９±１０、２６６３±１０、２７３０±１０、２８５０±１０、２８８７±１０、２９３６±１０、２９６４±１０ ｃｍ-1からなる群から選択される少なくとも一つの範囲における測定結果に基づいて、前記細胞の状態が評価される
請求項１～４のいずれか１項に記載の評価システム。
請求項１～４のいずれか１項に記載の評価システム。
【請求項6】
前記ラマンスペクトルと前記ラマンスペクトルに対応する前記細胞の状態のデータとの組からなる教師データにより生成された評価モデルを利用して、前記細胞の状態が評価される、
請求項１～５のいずれか１項に記載の評価システム。
請求項１～５のいずれか１項に記載の評価システム。
【請求項7】
表示装置をそなえる、請求項１～６のいずれか１項に記載の評価システム。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか１項に記載の評価システムと前記細胞を培養するための自動培養装置を備える、自動培養システム。
【請求項9】
細胞の状態を評価するための評価方法であって、
前記細胞の培養上清から単離された細胞外小胞に対してラマン分光分析を行う工程と、
前記ラマン分光分析によって得られたラマンスペクトルに基づいて、前記細胞の状態を評価する工程と、
を含む、評価方法。
前記細胞の培養上清から単離された細胞外小胞に対してラマン分光分析を行う工程と、
前記ラマン分光分析によって得られたラマンスペクトルに基づいて、前記細胞の状態を評価する工程と、
を含む、評価方法。
【請求項10】
前記ラマンスペクトルと前記ラマンスペクトルに対応する前記細胞の状態のデータとの組からなる教師データにより生成された評価モデルを利用して、前記細胞の状態が評価される、請求項９に記載の評価方法。
【請求項11】
前記細胞は、多能性幹細胞、ドーパミン神経前駆細胞、外胚葉、又は中胚葉である、
請求項９または１０に記載の評価方法。
請求項９または１０に記載の評価方法。
【請求項12】
前記細胞の状態は、細胞の分化段階である、
請求項９～１１のいずれか１項に記載の評価方法。
請求項９～１１のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項13】
前記細胞外小胞は、エクソソームである、
請求項９～１２のいずれか１項に記載の評価方法。
請求項９～１２のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項14】
前記ラマンスペクトルにおいて、７１３±１０、８３０±１０、８５８±１０、８８５±１０、８９５±１０、９１９±１０、９４２±１０、９９７±１０、１０４０±１０、１０６５±１０、１１０７±１０、１１３３±１０、１１７５±１０、１２９９±１０、１３７２±１０、１４２０±１０、１４４３±１０、１７３９±１０、２６６３±１０、２７３０±１０、２８５０±１０、２８８７±１０、２９３６±１０、２９６４±１０ ｃｍ-1からなる群から選択される少なくとも一つの範囲における測定結果に基づいて、前記細胞の状態が評価される
請求項９～１３のいずれか１項に記載の評価方法。
請求項９～１３のいずれか１項に記載の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、評価システム及び評価方法に関する。
【背景技術】
【0002】
細胞培養は、一般的に細胞加工施設（Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ：ＣＰＣ）というクリーンルームで、技術者の手技によって行われる。培養容器の開閉が多発する手技培養では生物学的汚染リスクがある為、培養環境の無菌性を担保した閉鎖系自動培養装置の開発が推進されている。
【0003】
細胞は継代数や細胞株、その他制御しきれていない培養工程におけるわずかな差に影響を受け、生育状況が変化する。従って、細胞状態をモニタリングし培養条件を逐次最適化することで、より良好な増殖率や分化誘導効率を達成できる可能性がある。
【0004】
一方、細胞状態の一般的な評価は、細胞を回収し、フローサイトメトリや定量ＲＴ－ＰＣＲ等で特異的マーカーの発現量を計測することで行われる。本手法は、細胞の回収を伴うため、モニタリングに適用することが困難である。
【0005】
細胞が生きたまま細胞状態を評価する手法として、細胞培養系から回収することが可能な培養上清中の成分を測定する手法が提案されている。例えば、ＷＯ２０１５１６６８４５Ａ１（特許文献１）では、「分化状態が未知の幹細胞あるいは幹細胞より分化誘導を行った細胞を被検細胞とし、該被検細胞の培養上清における所定物質の存在量に基づいて該被検細胞の分化状態を評価する」という記載がある。またＵＳ２０２１－０３０１２４８（特許文献２）では、「培養上清中のエクソソームのマーカーの含有量が細胞の分化誘導過程に応じて３つのパターンで変化する」という記載がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】ＷＯ２０１５１６６８４５Ａ１
【特許文献2】ＵＳ２０２１－０３０１２４８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、細胞の状態を評価するための新規の評価システム及び評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明の一実施形態は、細胞の状態を評価するための評価システムであって、前記細胞の培養上清に含まれる細胞外小胞に対してラマン分光分析をするためのラマン分光装置と、前記ラマン分光分析によって得られたラマンスペクトルに基づいて、前記細胞の状態を評価するための解析装置と、を有する評価システムである。前記細胞は、多能性幹細胞、ドーパミン神経前駆細胞、外胚葉、又は中胚葉であってもよい。前記細胞の状態は、細胞の分化段階であってもよい。前記細胞外小胞は、エクソソームであってもよい。前記ラマンスペクトルにおいて、７１３±１０、８３０±１０、８５８±１０、８８５±１０、８９５±１０、９１９±１０、９４２±１０、９９７±１０、１０４０±１０、１０６５±１０、１１０７±１０、１１３３±１０、１１７５±１０、１２９９±１０、１３７２±１０、１４２０±１０、１４４３±１０、１７３９±１０、２６６３±１０、２７３０±１０、２８５０±１０、２８８７±１０、２９３６±１０、２９６４±１０ ｃｍ-1から
なる群から選択される少なくとも一つの範囲における測定結果に基づいて、前記細胞の状態が評価されてもよい。前記ラマンスペクトルと前記ラマンスペクトルに対応する前記細胞の状態のデータとの組からなる教師データにより生成された評価モデルを利用して、前記細胞の状態が評価されてもよい。表示装置をそなえてもよい。
本発明の他の実施形態は、上記いずれかの評価システムと前記細胞を培養するための自動培養装置を備える、自動培養システムである。
本発明のさらなる実施形態は、細胞の状態を評価するための評価方法であって、前記細胞の培養上清から単離された細胞外小胞に対してラマン分光分析を行う工程と、前記ラマン分光分析によって得られたラマンスペクトルに基づいて、前記細胞の状態を評価する工程と、を含む、評価方法である。前記ラマンスペクトルと前記ラマンスペクトルに対応する前記細胞の状態のデータとの組からなる教師データにより生成された評価モデルを利用して、前記細胞の状態が評価されてもよい。前記細胞は、多能性幹細胞、ドーパミン神経前駆細胞、外胚葉、又は中胚葉であってもよい。前記細胞の状態は、細胞の分化段階であってもよい。前記細胞外小胞は、エクソソームであってもよい。前記ラマンスペクトルにおいて、７１３±１０、８３０±１０、８５８±１０、８８５±１０、８９５±１０、９１９±１０、９４２±１０、９９７±１０、１０４０±１０、１０６５±１０、１１０７±１０、１１３３±１０、１１７５±１０、１２９９±１０、１３７２±１０、１４２０±１０、１４４３±１０、１７３９±１０、２６６３±１０、２７３０±１０、２８５０±１０、２８８７±１０、２９３６±１０、２９６４±１０ ｃｍ-1からなる群から選択される少なくとも一つの範囲における測定結果に基づいて、前記細胞の状態が評価されてもよい。
なる群から選択される少なくとも一つの範囲における測定結果に基づいて、前記細胞の状態が評価されてもよい。前記ラマンスペクトルと前記ラマンスペクトルに対応する前記細胞の状態のデータとの組からなる教師データにより生成された評価モデルを利用して、前記細胞の状態が評価されてもよい。表示装置をそなえてもよい。
本発明の他の実施形態は、上記いずれかの評価システムと前記細胞を培養するための自動培養装置を備える、自動培養システムである。
本発明のさらなる実施形態は、細胞の状態を評価するための評価方法であって、前記細胞の培養上清から単離された細胞外小胞に対してラマン分光分析を行う工程と、前記ラマン分光分析によって得られたラマンスペクトルに基づいて、前記細胞の状態を評価する工程と、を含む、評価方法である。前記ラマンスペクトルと前記ラマンスペクトルに対応する前記細胞の状態のデータとの組からなる教師データにより生成された評価モデルを利用して、前記細胞の状態が評価されてもよい。前記細胞は、多能性幹細胞、ドーパミン神経前駆細胞、外胚葉、又は中胚葉であってもよい。前記細胞の状態は、細胞の分化段階であってもよい。前記細胞外小胞は、エクソソームであってもよい。前記ラマンスペクトルにおいて、７１３±１０、８３０±１０、８５８±１０、８８５±１０、８９５±１０、９１９±１０、９４２±１０、９９７±１０、１０４０±１０、１０６５±１０、１１０７±１０、１１３３±１０、１１７５±１０、１２９９±１０、１３７２±１０、１４２０±１０、１４４３±１０、１７３９±１０、２６６３±１０、２７３０±１０、２８５０±１０、２８８７±１０、２９３６±１０、２９６４±１０ ｃｍ-1からなる群から選択される少なくとも一つの範囲における測定結果に基づいて、前記細胞の状態が評価されてもよい。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、細胞の状態を評価するための新規の評価システム及び評価方法を提供することができる。上記した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施形態にて示す。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】本発明の一実施形態である評価システムの構成を示す模式図である。
【図2】本発明の一実施形態である評価システムが有するディスプレイに表示されるユーザインターフェースを示す模式図である。
【図3】本発明の一実施形態における評価システムが有する解析装置による制御フローチャートである。
【図4】本発明の一実施形態における自動培養装置を備えた自動培養システムの模式図である。
【図5】本発明の一実施例において、ｉＰＳ細胞の培養上清から単離した細胞外小胞画分の代表的なラマンスペクトルである。
【図6】本発明の一実施例において、ｉＰＳ細胞からドーパミン神経前駆細胞への分化培養工程における培養上清から単離した細胞外小胞のラマンスペクトルの変化を示す散布図である。
【図7】本発明の一実施例において、ｉＰＳ細胞から外胚葉、中胚葉への分化培養工程における培養上清から単離した細胞外小胞のラマンスペクトルの変化を示す散布図である。
【図8】本発明の一実施例において、ｉＰＳ細胞の培養条件における培養上清から単離した細胞外小胞由来ラマンスペクトルの変化を示す散布図である。
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。但し、これらの実施形態は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明の技術的範囲を限定するものではない。
【0012】
＝＝評価システム＝＝
図１は本発明に係る評価システム１０１の模式図である。細胞の状態を評価するための評価システム１０１は細胞の培養上清に含まれる細胞外小胞に対してラマン分光分析をするためのラマン分光装置１０５と、ラマン分光分析によって得られたラマンスペクトルに基づいて、細胞の状態を評価するための解析装置１０８とを備える。
解析装置１０８はＣＰＵなどを有し、ＣＰＵは、ラマンスペクトルを入力するためのラマン分光装置１０５におけるラマン分光分析によって得られたラマンスペクトルと、そのラマンスペクトルを得た細胞の状態のデータとを入力するための入力部１０６と、ラマンスペクトルとそのラマンスペクトルを得た細胞の状態のデータとを対応付けたデータベースや、ラマンスペクトルに基づいて、細胞の状態を評価するための評価プログラムなどを有する記憶部１０７と、ラマン分光分析によって得られたラマンスペクトルに基づいて、細胞の状態を評価するための解析部１１０と、評価システム１０１の各装置の作動を制御する制御部１１１を備える。
評価システム１０１は、さらに、培養上清から細胞外小胞を単離するための細胞外小胞単離装置１０３、不要な溶液を排出するための溶液排出装置１０４、解析結果を表示するためのディスプレイなどの表示装置１０９、などの装置を備えていてもよい。
＝＝自動培養システム＝＝
図４は自動培養装置（４０１～４０９を含む）と評価システム（４１０～４２０を含む）とを備えた自動培養システムの模式図である。
細胞培養液は培養液保存容器４０１より溶液供給流路４０４を経て培養容器４０９に供給される。培養環境内の圧力は気圧調節流路４０２と外気フィルタ４０３によって保たれる。培養環境の各種気体濃度はガスボンベ４０７、ガス供給流路４０６にて調節される。これら培養液、ガスの動きはそれぞれ弁４０５とポンプ４０８にて調節される。
培養上清は、培養容器４０９から、溶液廃棄流路４１０を経て細胞外小胞単離装置４１１に供給される。細胞外小胞単離装置４１１は、培養上清導入部１０２において培養上清を受け取り、培養上清から細胞外小胞を単離する。単離方法は特に限定されず、公知の手法を用いることができる。細胞外小胞は試料流路４１２を経てラマン分光装置４１３に供給される。細胞外小胞単離装置４１１及びラマン分光装置４１３において生じた排液は溶液廃棄流路４２０を経て排液保存容器４１４に廃棄される。解析装置として、装置制御、データ解析、データストレージを担う端末４１５は各種弁、ポンプ、装置の制御及びラマン分光装置４１３で得られたラマンスペクトルの保存、解析を行う。端末４１５で得られたモニタリング結果に基づき、細胞培養の継続、中止、条件変更がなされる。本判断は作業者が実施してもよく、またあらかじめ設定した基準に従い、解析装置が実施してもよい。
＝＝解析装置による制御フロー＝＝
図１は本発明に係る評価システム１０１の模式図である。細胞の状態を評価するための評価システム１０１は細胞の培養上清に含まれる細胞外小胞に対してラマン分光分析をするためのラマン分光装置１０５と、ラマン分光分析によって得られたラマンスペクトルに基づいて、細胞の状態を評価するための解析装置１０８とを備える。
解析装置１０８はＣＰＵなどを有し、ＣＰＵは、ラマンスペクトルを入力するためのラマン分光装置１０５におけるラマン分光分析によって得られたラマンスペクトルと、そのラマンスペクトルを得た細胞の状態のデータとを入力するための入力部１０６と、ラマンスペクトルとそのラマンスペクトルを得た細胞の状態のデータとを対応付けたデータベースや、ラマンスペクトルに基づいて、細胞の状態を評価するための評価プログラムなどを有する記憶部１０７と、ラマン分光分析によって得られたラマンスペクトルに基づいて、細胞の状態を評価するための解析部１１０と、評価システム１０１の各装置の作動を制御する制御部１１１を備える。
評価システム１０１は、さらに、培養上清から細胞外小胞を単離するための細胞外小胞単離装置１０３、不要な溶液を排出するための溶液排出装置１０４、解析結果を表示するためのディスプレイなどの表示装置１０９、などの装置を備えていてもよい。
＝＝自動培養システム＝＝
図４は自動培養装置（４０１～４０９を含む）と評価システム（４１０～４２０を含む）とを備えた自動培養システムの模式図である。
細胞培養液は培養液保存容器４０１より溶液供給流路４０４を経て培養容器４０９に供給される。培養環境内の圧力は気圧調節流路４０２と外気フィルタ４０３によって保たれる。培養環境の各種気体濃度はガスボンベ４０７、ガス供給流路４０６にて調節される。これら培養液、ガスの動きはそれぞれ弁４０５とポンプ４０８にて調節される。
培養上清は、培養容器４０９から、溶液廃棄流路４１０を経て細胞外小胞単離装置４１１に供給される。細胞外小胞単離装置４１１は、培養上清導入部１０２において培養上清を受け取り、培養上清から細胞外小胞を単離する。単離方法は特に限定されず、公知の手法を用いることができる。細胞外小胞は試料流路４１２を経てラマン分光装置４１３に供給される。細胞外小胞単離装置４１１及びラマン分光装置４１３において生じた排液は溶液廃棄流路４２０を経て排液保存容器４１４に廃棄される。解析装置として、装置制御、データ解析、データストレージを担う端末４１５は各種弁、ポンプ、装置の制御及びラマン分光装置４１３で得られたラマンスペクトルの保存、解析を行う。端末４１５で得られたモニタリング結果に基づき、細胞培養の継続、中止、条件変更がなされる。本判断は作業者が実施してもよく、またあらかじめ設定した基準に従い、解析装置が実施してもよい。
＝＝解析装置による制御フロー＝＝
【0013】
図２は表示装置１０９に表示されるユーザインターフェースの一例の模式図である。また図３は評価システム１０１の制御部１１１による制御フローチャートである。
まず、作業者は、例えば、評価対象とする細胞状態の項目２０１及び細胞種２０２を入力することにより、評価条件の設定を行う（３０１）。制御部１１１が、設定された評価条件に従って、記憶部１０７に格納されている解析プログラムを読み込み（３０２）、それに従って解析手法２０３および解析するラマン信号２０４を表示するのが好ましいが、解析手法２０３および解析するラマン信号２０４を作業者が手動で入力してもよい。次に、作業者は、例えば、１スペクトルを取得する際のレーザ露光時間２０５、レーザパワー２０６、計測するラマン信号帯域２０７、計測データ数２０８を入力することにより、計測条件の設定を行う（３０３）。
制御部１１１は、培養容器４０９から培養上清を細胞外小胞単離装置４１１に供給する（３０４）。引き続き、制御部１１１は、以下のように制御を行う。
培養上清を得た細胞外小胞単離装置４１１は、培養上清から細胞外小胞を単離する（３０５）。細胞外小胞単離装置４１１は、単離した細胞外小胞をラマン分光装置１０５に送る。ラマン分光装置１０５は、細胞外小胞のラマン分光分析を開始する（３０６）。設定
した計測数のデータを取得したところで（３０７）、計測を終了する（３０８）ラマン分光装置１０５は、計測データを解析装置１０８に送ると、解析装置１０８は入力部１０６で計測データを受信し、解析部１１０で解析を行う。解析前に計測データを、一旦記憶部１０７に格納してもよい。解析装置１０８は、解析部１１０で得られた結果を計測データとともに表示装置１０９に送り、表示装置１０９は作業者に計測データ２０９および結果２１０を表示する。表示装置１０９では、解析結果は、計測した各ラマンスペクトルの分類に基づき、細胞状態の割合として表示されてもよい。
まず、作業者は、例えば、評価対象とする細胞状態の項目２０１及び細胞種２０２を入力することにより、評価条件の設定を行う（３０１）。制御部１１１が、設定された評価条件に従って、記憶部１０７に格納されている解析プログラムを読み込み（３０２）、それに従って解析手法２０３および解析するラマン信号２０４を表示するのが好ましいが、解析手法２０３および解析するラマン信号２０４を作業者が手動で入力してもよい。次に、作業者は、例えば、１スペクトルを取得する際のレーザ露光時間２０５、レーザパワー２０６、計測するラマン信号帯域２０７、計測データ数２０８を入力することにより、計測条件の設定を行う（３０３）。
制御部１１１は、培養容器４０９から培養上清を細胞外小胞単離装置４１１に供給する（３０４）。引き続き、制御部１１１は、以下のように制御を行う。
培養上清を得た細胞外小胞単離装置４１１は、培養上清から細胞外小胞を単離する（３０５）。細胞外小胞単離装置４１１は、単離した細胞外小胞をラマン分光装置１０５に送る。ラマン分光装置１０５は、細胞外小胞のラマン分光分析を開始する（３０６）。設定
した計測数のデータを取得したところで（３０７）、計測を終了する（３０８）ラマン分光装置１０５は、計測データを解析装置１０８に送ると、解析装置１０８は入力部１０６で計測データを受信し、解析部１１０で解析を行う。解析前に計測データを、一旦記憶部１０７に格納してもよい。解析装置１０８は、解析部１１０で得られた結果を計測データとともに表示装置１０９に送り、表示装置１０９は作業者に計測データ２０９および結果２１０を表示する。表示装置１０９では、解析結果は、計測した各ラマンスペクトルの分類に基づき、細胞状態の割合として表示されてもよい。
【0014】
＝＝細胞状態の評価方法＝＝
本発明では、培養上清中の細胞外小胞のラマンスペクトルに基づいて細胞状態を評価する。その評価方法は特に限定されないが、以下に述べる方法はその一例である。なお、本発明において、細胞状態とは、細胞の分化段階、細胞の生死、細胞の分裂段階、特定のシグナル伝達が活性化していること、遺伝子が導入されたこと、などが例示できる。例えば、細胞の状態が細胞の分化段階をあらわすとき、細胞の分化段階の特定方法は特に限定されず、例えば分化開始後の所定の日数によって特定したり、所定の分化マーカーが発現していることによって特定したり、所定の細胞形態をとっていることによって特定したりすることが例示できる。細胞の分化方向は特に限定されず、内胚葉、中胚葉、外胚葉などの特定の胚葉への分化であってもよく、神経細胞、線維芽細胞、上皮細胞、血液細胞、などの特定の細胞タイプへの分化であってもよい。分化させる細胞種は特に限定されず、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の多能性幹細胞、神経幹細胞や間葉系幹細胞等の幹細胞、神経前駆細胞や骨髄系前駆細胞等の前駆細胞といった未分化細胞が挙げられる
あらかじめ細胞状態が特定されている細胞から細胞外小胞を単離し、そのラマンスペクトルデータを複数、教師データとして用い、多変量解析、機械学習、ディープラーニング等の数値解析用いた細胞状態評価プログラムを構築する。この時、具体的な教師データとしては、ラマンスペクトルの波形全体または一部、または特徴的な波形部分を用いることが考えられる。また、ラマン分光計測法は限定されず、例えば自発ラマン散乱、表面増強ラマン、非線形ラマン散乱等が挙げられる。
本発明では、培養上清中の細胞外小胞のラマンスペクトルに基づいて細胞状態を評価する。その評価方法は特に限定されないが、以下に述べる方法はその一例である。なお、本発明において、細胞状態とは、細胞の分化段階、細胞の生死、細胞の分裂段階、特定のシグナル伝達が活性化していること、遺伝子が導入されたこと、などが例示できる。例えば、細胞の状態が細胞の分化段階をあらわすとき、細胞の分化段階の特定方法は特に限定されず、例えば分化開始後の所定の日数によって特定したり、所定の分化マーカーが発現していることによって特定したり、所定の細胞形態をとっていることによって特定したりすることが例示できる。細胞の分化方向は特に限定されず、内胚葉、中胚葉、外胚葉などの特定の胚葉への分化であってもよく、神経細胞、線維芽細胞、上皮細胞、血液細胞、などの特定の細胞タイプへの分化であってもよい。分化させる細胞種は特に限定されず、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の多能性幹細胞、神経幹細胞や間葉系幹細胞等の幹細胞、神経前駆細胞や骨髄系前駆細胞等の前駆細胞といった未分化細胞が挙げられる
あらかじめ細胞状態が特定されている細胞から細胞外小胞を単離し、そのラマンスペクトルデータを複数、教師データとして用い、多変量解析、機械学習、ディープラーニング等の数値解析用いた細胞状態評価プログラムを構築する。この時、具体的な教師データとしては、ラマンスペクトルの波形全体または一部、または特徴的な波形部分を用いることが考えられる。また、ラマン分光計測法は限定されず、例えば自発ラマン散乱、表面増強ラマン、非線形ラマン散乱等が挙げられる。
【0015】
ｉＰＳ細胞及びそこから分化した細胞の培養上清から単離した細胞外小胞のラマンスペクトルを用いる場合、７１３±１０、８３０±１０、８５８±１０、８８５±１０、８９５±１０、９１９±１０、９４２±１０、９９７±１０、１０４０±１０、１０６５±１０、１１０７±１０、１１３３±１０、１１７５±１０、１２９９±１０、１３７２±１０、１４２０±１０、１４４３±１０、１７３９±１０、２６６３±１０、２７３０±１０、２８５０±１０、２８８７±１０、２９３６±１０、２９６４±１０ ｃｍ-1からなる群から選択される波長領域にあるラマンスペクトルを少なくとも一つ用いてもよい。
【0016】
そして、細胞状態を評価したい細胞について、ラマンスペクトルデータを取得し、教師データと同様にラマンスペクトル分光分析を行って、細胞状態評価プログラムに代入することにより、当該細胞の細胞状態を評価することができる。
【実施例0017】
[実施例１]
本実施例では、幹細胞の分化誘導過程において、細胞外小胞に対するラマンスぺクトルのパターンが変化することを示す。具体的には、ｉＰＳ細胞株２０１Ｂ７を使用して、１２日間ドーパミン神経前駆細胞への分化誘導培養を行い、細胞外小胞のラマンスペクトル変化を評価した。尚、ドーパミン神経前駆細胞への分化誘導条件は、以下のように行った(Stem Cell Reports, vol.2 (2014), pp.337-350)。
まず、ＳｔｅｍＦｉｔ ｍｅｄｉａ（味の素社）で培養していたフィーダーフリーのｉＰＳ細胞を、ＴｒｙｐＬＥ ｓｅｌｅｃｔで１０分間処理した後、単一細胞に分離した。次にｉＰＳ細胞をＬＭ５１１－Ｅ８でコーティングした６ウェルプレートに４×１０5細
胞の密度で播種し、４日間培養したとき、コンフルエントな状態になった。そこで、培地を、８％ＫＳＲ、０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸（以上Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）、および０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノールを添加したＧＭＥＭを含む分化培地に変更し、分化誘導を開始した。なお、神経分化をさらに効率的に誘導するため、培地にＬＤＮ１９３１８９（ＳＴＥＭＧＥＮＴ）とＡ８３－０１（Ｗａｋｏ）を添加した（J. Neurosci. Res., vol.89 (2011), pp.117-126）。
本実施例では、幹細胞の分化誘導過程において、細胞外小胞に対するラマンスぺクトルのパターンが変化することを示す。具体的には、ｉＰＳ細胞株２０１Ｂ７を使用して、１２日間ドーパミン神経前駆細胞への分化誘導培養を行い、細胞外小胞のラマンスペクトル変化を評価した。尚、ドーパミン神経前駆細胞への分化誘導条件は、以下のように行った(Stem Cell Reports, vol.2 (2014), pp.337-350)。
まず、ＳｔｅｍＦｉｔ ｍｅｄｉａ（味の素社）で培養していたフィーダーフリーのｉＰＳ細胞を、ＴｒｙｐＬＥ ｓｅｌｅｃｔで１０分間処理した後、単一細胞に分離した。次にｉＰＳ細胞をＬＭ５１１－Ｅ８でコーティングした６ウェルプレートに４×１０5細
胞の密度で播種し、４日間培養したとき、コンフルエントな状態になった。そこで、培地を、８％ＫＳＲ、０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸（以上Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）、および０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノールを添加したＧＭＥＭを含む分化培地に変更し、分化誘導を開始した。なお、神経分化をさらに効率的に誘導するため、培地にＬＤＮ１９３１８９（ＳＴＥＭＧＥＮＴ）とＡ８３－０１（Ｗａｋｏ）を添加した（J. Neurosci. Res., vol.89 (2011), pp.117-126）。
【0018】
このようなｉＰＳ細胞からドーパミン神経前駆細胞への分化誘導培養を６ウェルプレートのうちの３ウェルでそれぞれ同様に実施し、分化誘導開始日のｉＰＳ細胞の培養上清と、分化誘導移行後８日目（分化中期）、分化誘導移行後１２日目（分化後期）の培養上清を回収した。フォスファチジルセリンアフィニティ法（Sci Rep., vol. 6 (2016), pp 33935)を用いて、単離した細胞外小胞の画分をラマン分光計測した。ラマンスペクトルの解析には図５のラマンスペクトルに示す信号周辺の波数として，８８１．０，８８３．１，８８５．１，８８７．２，８８９．２，８９１．３，８９３．３，８９５．４，８９７．４，８９９．５，９０９．７，９１１．７，９１３．８，９１５．８，９１７．８，９１９．９，９２１．９，９２４．０，９２６．０，９２８．０，９３０．１，９３２．１，９３４．２，９３６．２，９３８．２，９４０．３，９４２．３，９４４．３，９４６．４，９４８．４，９５０．４，９５２．５，９８６．９，９８９．０，９９１．０，９９３．０，９９５．０，９９７．１，９９９．１，１００１．１，１００３．１，１００５．１，１００７．２，１０２９．３，１０３１．４，１０３３．４，１０３５．４，１０３７．４，１０３９．４，１０４１．４，１０４３．４，１０４５．４，１０４７．５，１０４９．５，１０５５．５，１０５７．５，１０５９．５，１０６１．５，１０６３．５，１０６５．５，１０６７．５，１０６９．５，１０７１．５，１０７３．５，１０７５．５，１０９７．５，１０９９．５，１１０１．５，１１０３．５，１１０５．５，１１０７．５，１１０９．５，１１１１．５，１１１３．５，１１１５．５，１１１７．５，１１２３．５，１１２５．５，１１２７．５，１１２９．５，１１３１．４，１１３３．４，１１３５．４，１１３７．４，１１３９．４，１１４１．４，１１４３．４，１１６５．２，１１６７．２，１１６９．２，１１７１．１，１１７３．１，１１７５．１，１１７７．１，１１７９．１，１１８１．０，１１８３．０，１１８５．０，１２８９．１，１２９１．１，１２９３．０，１２９５．０，１２９６．９，１２９８．９，１３００．８，１３０２．８，１３０４．７，１３０６．７，１３０８．６，１３１０．６，１３６３．０，１３６４．９，１３６６．８，１３６８．８，１３７０．７，１３７２．６，１３７４．６，１３７６．５，１３７８．４，１３８０．４，１３８２．３，１４０９．３，１４１１．２，１４１３．１，１４１５．０，１４１７．０，１４１８．９，１４２０．８，１４２２．７，１４２４．６，１４２６．６，１４２８．５，１４３０．４，１４３２．３，１４３４．２，１４３６．２，１４３８．１，１４４０．０，１４４１．９，１４４３．８，１４４５．７，１４４７．７，１４４９．６，１４５１．５，１４５３．４，１７２９．９，１７３１．８，１７３３．６，１７３５．５，１７３７．３，１７３９．２，１７４１．０，１７４２．９，１７４４．７，１７４６．６，１７４８．４，１７５０．３，２６５３．３，２６５４．９，２６５６．５，２６５８．２，２６５９．８，２６６１．５，２６６３．１，２６６４．７，２６６６．４，２６６８．０，２６６９．７，２６７１．３，２６７２．９，２７２０．２，２７２１．９，２７２３．５，２７２５．１，２７２６．７，２７２８．４，２７３０．０，２７３１．６，２７３３．２，２７３４．９，２７３６．５，２７３８．１，２７３９．７，２８３９．６，２８４１．２，２８４２．８，２８４４．４，２８４６．０，２８４７．６，２８４９．２，２８５０．８，，２８５２．４，２８５４．０，２８５５．６，２８５７．２，２８５８．８，２８６０．４，２８７６．３，２８７７．９，２８７９．５，２８８１．１，２８８２．７，２８８４．３，２８８５．９，２８８７．４，２８８９．０，２８９０．６，２８９２．２，２８９３．８，２８９５．４，２８９７．０，２９２５．５，２９２７．１
，２９２８．７，２９３０．２，２９３１．８，２９３３．４，２９３５．０，２９３６．６，２９３８．１，２９３９．７，２９４１．３，２９４２．９，２９４４．４，２９４６．０，２９５２．３，２９５３．９，２９５５．５，２９５７．１，２９５８．６，２９６０．２，２９６１．８，２９６３．３，２９６４．９，２９６６．５，２９６８．１，２９６９．６，２９７１．２，２９７２．８，２９７４．４ cm-1を用いた。
培養した３ウェルの内、２ウェル分の計測データを教師データとし、１ウェル分をテストデータとした。教師データを用いて独立成分分析によりデータ特徴量の抽出を行い、ロジスティック回帰によって分類器の作成を行った。独立成分分析ではデータの次元を３次元に圧縮した。分類器に使用する独立成分分析の次元とロジスティック回帰のハイパーパラメータを１０分割交差検証法にて最適化した。最適化の結果、分類器に用いる独立成分分析の次元数は２次元となった。計測した全スペクトルデータの独立成分分析結果の散布図を図６に示す。
図６のグラフで示されるように、ｉＰＳ細胞、ドーパミン神経前駆細胞への分化誘導中期、分化誘導後期の各々でスペクトルデータが分離した。なお、解析にはPythonの機械学習ライブラリであるscikit-learn(0.23.1)を使用した。
作成した分類器によってテストデータを評価した結果、データの分類精度Ｆ値は８６%
となった。
このように、細胞の分化状態によって細胞外小胞の組成が変化し、その変化が細胞外小胞のラマンスペクトルに反映される。
，２９２８．７，２９３０．２，２９３１．８，２９３３．４，２９３５．０，２９３６．６，２９３８．１，２９３９．７，２９４１．３，２９４２．９，２９４４．４，２９４６．０，２９５２．３，２９５３．９，２９５５．５，２９５７．１，２９５８．６，２９６０．２，２９６１．８，２９６３．３，２９６４．９，２９６６．５，２９６８．１，２９６９．６，２９７１．２，２９７２．８，２９７４．４ cm-1を用いた。
培養した３ウェルの内、２ウェル分の計測データを教師データとし、１ウェル分をテストデータとした。教師データを用いて独立成分分析によりデータ特徴量の抽出を行い、ロジスティック回帰によって分類器の作成を行った。独立成分分析ではデータの次元を３次元に圧縮した。分類器に使用する独立成分分析の次元とロジスティック回帰のハイパーパラメータを１０分割交差検証法にて最適化した。最適化の結果、分類器に用いる独立成分分析の次元数は２次元となった。計測した全スペクトルデータの独立成分分析結果の散布図を図６に示す。
図６のグラフで示されるように、ｉＰＳ細胞、ドーパミン神経前駆細胞への分化誘導中期、分化誘導後期の各々でスペクトルデータが分離した。なお、解析にはPythonの機械学習ライブラリであるscikit-learn(0.23.1)を使用した。
作成した分類器によってテストデータを評価した結果、データの分類精度Ｆ値は８６%
となった。
このように、細胞の分化状態によって細胞外小胞の組成が変化し、その変化が細胞外小胞のラマンスペクトルに反映される。
【0019】
[実施例２]
本実施例では、実施例１と異なる分化誘導系においても、細胞外小胞由来のラマンスぺクトルのパターンが変化することを示す。具体的には、ｉＰＳ細胞株２０１Ｂ７を使用して、外胚葉及び中胚葉への分化誘導培養を行い、細胞外小胞のラマンスペクトル変化を評価した。尚、両胚葉への分化誘導は、ＳＴＥＭｄｉｆｆ Ｔｒｉｌｉｎｅａｇｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｒ）を用いて行った。
本実施例では、実施例１と異なる分化誘導系においても、細胞外小胞由来のラマンスぺクトルのパターンが変化することを示す。具体的には、ｉＰＳ細胞株２０１Ｂ７を使用して、外胚葉及び中胚葉への分化誘導培養を行い、細胞外小胞のラマンスペクトル変化を評価した。尚、両胚葉への分化誘導は、ＳＴＥＭｄｉｆｆ Ｔｒｉｌｉｎｅａｇｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｒ）を用いて行った。
【0020】
ｉＰＳ細胞から外胚葉、中胚葉への分化誘導培養を６ウェルプレートの中の２ウェルずつ行い、分化誘導開始日のｉＰＳ細胞の培養上清と、各胚葉の分化誘導最終日の培養上清を回収し、そこから単離した細胞外小胞をラマン分光計測した。ラマンスペクトルの解析は実施例1と同様に行った。図７はｉＰＳ細胞、外胚葉、中胚葉の全スペクトルデータの
独立成分分析結果の散布図である。
図７のグラフに示されるように、ｉＰＳ細胞と両胚葉のスペクトルデータがそれぞれ分離する傾向を示した。
培養した２ウェルの内、一方を教師データ、もう一方をテストデータとし、実施例１と同様に評価した分類精度は８７％となった。
以上により、実施例1と異なる分化誘導系においても細胞の分化状態を細胞外小胞のラ
マンスペクトルによって評価可能である。
独立成分分析結果の散布図である。
図７のグラフに示されるように、ｉＰＳ細胞と両胚葉のスペクトルデータがそれぞれ分離する傾向を示した。
培養した２ウェルの内、一方を教師データ、もう一方をテストデータとし、実施例１と同様に評価した分類精度は８７％となった。
以上により、実施例1と異なる分化誘導系においても細胞の分化状態を細胞外小胞のラ
マンスペクトルによって評価可能である。
【0021】
[実施例３]
本実施例では、幹細胞の未分化状態を逸脱させることによって細胞外小胞のラマンスぺクトルが変化することを示す。具体的には、ｉＰＳ細胞株２０１Ｂ７を増殖させる培養において、標準的な培養条件と並行して、未分化状態を逸脱させるため、ｉＰＳ細胞の未分化性維持に必要な塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２）を培地から除去した条件（以下、逸脱条件と称する）で、ｉＰＳ細胞を培養した。両条件は６ウェルプレートのうちの３ウェルずつで行った。逸脱条件では、実施例１と同様にｉＰＳ細胞を播種したのち、３日目にＦＧＦ２を除去した培地に交換した。両培養条件とも、培養開始から７日目に細胞と培養上清を回収した。細胞の未分化マーカーＮａｎｏｇの発現量を定量ＲＴ－ＰＣＲで評価した結果、標準条件と比較して逸脱条件の発現量は有意に低下した。また実施例１と同様にラマン分光計測及びラマンスペクトルの解析を行った。図８は両培養条件の全スペク
トルデータの独立成分分析結果の散布図である。
図８のグラフに示されるように、スペクトルデータが培養条件ごとに分離する傾向を示した。実施例１、２と同様に評価した分類精度は８５％となった。
このように、幹細胞の未分化状態を細胞外小胞由来ラマンスペクトルによって評価可能である。
本実施例では、幹細胞の未分化状態を逸脱させることによって細胞外小胞のラマンスぺクトルが変化することを示す。具体的には、ｉＰＳ細胞株２０１Ｂ７を増殖させる培養において、標準的な培養条件と並行して、未分化状態を逸脱させるため、ｉＰＳ細胞の未分化性維持に必要な塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２）を培地から除去した条件（以下、逸脱条件と称する）で、ｉＰＳ細胞を培養した。両条件は６ウェルプレートのうちの３ウェルずつで行った。逸脱条件では、実施例１と同様にｉＰＳ細胞を播種したのち、３日目にＦＧＦ２を除去した培地に交換した。両培養条件とも、培養開始から７日目に細胞と培養上清を回収した。細胞の未分化マーカーＮａｎｏｇの発現量を定量ＲＴ－ＰＣＲで評価した結果、標準条件と比較して逸脱条件の発現量は有意に低下した。また実施例１と同様にラマン分光計測及びラマンスペクトルの解析を行った。図８は両培養条件の全スペク
トルデータの独立成分分析結果の散布図である。
図８のグラフに示されるように、スペクトルデータが培養条件ごとに分離する傾向を示した。実施例１、２と同様に評価した分類精度は８５％となった。
このように、幹細胞の未分化状態を細胞外小胞由来ラマンスペクトルによって評価可能である。
【符号の説明】
【0022】
１０１：評価装置
１０２：培養上清導入部
１０３：細胞外小胞単離装置
１０４：溶液排出装置
１０５：ラマン分光装置
１０６：入力部
１０７：記憶部
１０８：解析装置
１０９：表示装置
１１０：解析部
１１１：制御部
２０１：評価項目
２０２：対象細胞種
２０３：解析手法
２０４：解析信号
２０５：露光時間
２０６：パワー
２０７：計測帯域
２０８：計測数
２０９：計測ラマンスペクトル
２１０：細胞状態の解析結果
４０１：培養液保存容器
４０２：気圧調節流路
４０３：外気フィルタ
４０４：溶液供給流路
４０５：弁
４０６：ガス供給流路
４０７：ガスボンベ
４０８：ポンプ
４０９：培養容器
４１０：溶液廃棄流路
４１１：細胞外小胞単離装置
４１２：試料流路
４１３：ラマン分光装置
４１４：排液保存容器
４１５：端末
１０２：培養上清導入部
１０３：細胞外小胞単離装置
１０４：溶液排出装置
１０５：ラマン分光装置
１０６：入力部
１０７：記憶部
１０８：解析装置
１０９：表示装置
１１０：解析部
１１１：制御部
２０１：評価項目
２０２：対象細胞種
２０３：解析手法
２０４：解析信号
２０５：露光時間
２０６：パワー
２０７：計測帯域
２０８：計測数
２０９：計測ラマンスペクトル
２１０：細胞状態の解析結果
４０１：培養液保存容器
４０２：気圧調節流路
４０３：外気フィルタ
４０４：溶液供給流路
４０５：弁
４０６：ガス供給流路
４０７：ガスボンベ
４０８：ポンプ
４０９：培養容器
４１０：溶液廃棄流路
４１１：細胞外小胞単離装置
４１２：試料流路
４１３：ラマン分光装置
４１４：排液保存容器
４１５：端末
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
