(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023125047
(43)【公開日】2023-09-07
(54)【発明の名称】ＣＬＥＣ－２および／またはＧＰＶＩの拮抗剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/41 20060101AFI20230831BHJP
A61P 7/02 20060101ALI20230831BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230831BHJP
【ＦＩ】
A61K31/41 ZNA
A61P7/02
A61P43/00 111
【審査請求】未請求
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022028955
(22)【出願日】2022-02-28
(71)【出願人】
【識別番号】000125369
【氏名又は名称】学校法人東海大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000109
【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス
(72)【発明者】
【氏名】渡邊 信央
(72)【発明者】
【氏名】猪口 貞樹
(72)【発明者】
【氏名】平山 令明
(72)【発明者】
【氏名】城所 正子
(72)【発明者】
【氏名】篠崎 よし子
(72)【発明者】
【氏名】萩原 早苗
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC62
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA54
4C086ZC42
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ＰＤＰＮとＣＬＥＣ－２との結合による血小板活性化から発生する血小板凝集を阻害し、かつ活性化惹起物質に対して選択性の高い化合物を提供すること。
【解決手段】下記一般式（１）：
で表される化合物を含むＣＬＥＣ－２および／またはＧＰＶＩの拮抗剤である。（式中、ｎは０～５の整数であり、Ｒ１は、フェニル基の環上の置換基であり、それぞれ独立に、Ｃ１－Ｃ６アルキル基またはＣ１－Ｃ６アルコキシ基であり、Ａｒは、置換もしくは無置換のフェニル基または置換もしくは無置換のナフチル基である。）
【選択図】なし
【解決手段】下記一般式（１）：
で表される化合物を含むＣＬＥＣ－２および／またはＧＰＶＩの拮抗剤である。（式中、ｎは０～５の整数であり、Ｒ１は、フェニル基の環上の置換基であり、それぞれ独立に、Ｃ１－Ｃ６アルキル基またはＣ１－Ｃ６アルコキシ基であり、Ａｒは、置換もしくは無置換のフェニル基または置換もしくは無置換のナフチル基である。）
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記一般式（１）で表される化合物を含むＣＬＥＣ－２および／またはＧＰＶＩの拮抗剤。
式中、ｎは０～５の整数であり、Ｒ１は、フェニル基の環上の置換基であり、それぞれ独立に、Ｃ１－Ｃ６アルキル基またはＣ１－Ｃ６アルコキシ基であり、
Ａｒは、置換もしくは無置換のフェニル基または置換もしくは無置換のナフチル基であり、
Ａｒが、
である場合、
ｍは０～５の整数であり、Ｒ２は、フェニル基の環上の置換基であり、それぞれ独立に、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、またはＣ１－Ｃ６ハロゲン化アルキル基であり、
Ａｒが、
または
である場合、
ｍ’は０～５の整数であり、Ｒ３は、ナフチル環上の置換基であり、それぞれ独立に、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、またはＣ１－Ｃ６ハロゲン化アルキル基である。
【化1】
Ａｒは、置換もしくは無置換のフェニル基または置換もしくは無置換のナフチル基であり、
Ａｒが、
【化2】
ｍは０～５の整数であり、Ｒ２は、フェニル基の環上の置換基であり、それぞれ独立に、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、またはＣ１－Ｃ６ハロゲン化アルキル基であり、
Ａｒが、
【化3】
【化4】
ｍ’は０～５の整数であり、Ｒ３は、ナフチル環上の置換基であり、それぞれ独立に、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、またはＣ１－Ｃ６ハロゲン化アルキル基である。
【請求項2】
前記一般式（１）中、
Ｒ１は、それぞれ独立に、メチル基またはメトキシ基であり、
Ｒ２および３は、それぞれ独立に、メチル基、エチル基、イソプロピル基、またはトリフルオロメチル基である、請求項１に記載の拮抗剤。
Ｒ１は、それぞれ独立に、メチル基またはメトキシ基であり、
Ｒ２および３は、それぞれ独立に、メチル基、エチル基、イソプロピル基、またはトリフルオロメチル基である、請求項１に記載の拮抗剤。
【請求項3】
ｎ、ｍおよびｍ’は、それぞれ独立に、０～３の整数である、請求項１または２に記載の拮抗剤。
【請求項4】
請求項１から３の何れか一項に記載の拮抗剤を含む血小板凝集抑制剤。
【請求項5】
請求項１から３の何れか一項に記載の拮抗剤を含む抗血栓薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＣＬＥＣ－２および／またはＧＰＶＩの拮抗剤に関する。さらに、本発明は、ＣＬＥＣ－２および／またはＧＰＶＩの拮抗剤を含む血小板凝集抑制剤または抗血栓薬に関する。
【背景技術】
【0002】
血栓症は動脈、静脈を問わず多くの疾患に頻発し、実質的に日本人の死因の上位を占める。動脈硬化巣（プラーク）の崩壊などが引き金となる動脈血栓は脳梗塞や心筋梗塞などを引き起こす。寝たきりの入院患者では下肢に深部静脈血栓が頻発し、これは致死率の高い肺梗塞を引き起こす。末期癌や敗血症などの感染症では全身の微小血管に血栓が生じる播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を頻発し、多臓器不全を引き起こす。
【0003】
これら血栓症の発症に重要な役割を果たすのが血小板である。血小板は一旦活性化が起こると、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）やトロンボキサンＡ２（ＴｘＡ２）を放出し、これが周囲の血小板に作用し連鎖反応的に活性化を引き起こす。現在臨床で用いられている抗血小板薬はＡＤＰ受容体阻害剤（クロピドグレルなど）とＴｘＡ２産生を抑えるシクロオキシゲナーゼ阻害剤（アスピリンなど）である。これらは、連鎖反応的な活性化を抑えるため幅広い適用が可能である反面、出血リスクを高める欠点があり、活性化惹起物質に対して選択性の高い薬剤の出現が望まれている（非特許文献１）。
【0004】
ところで、血小板活性化ドメインを有する膜タンパク質としてポドプラニン（ＰＤＰＮ）が知られている。ＰＤＰＮは血小板膜上のＣ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ２（ＣＬＥＣ－２）と結合してＣＬＥＣ－２をクラスター化し血小板を活性化する。通常、ＰＤＰＮはリンパ管の内皮細胞など、血小板と接触のない組織・部位に発現しているが、ある種の癌細胞、ならびに感染・炎症時に活性化された血管内皮細胞やマクロファージ、動脈硬化巣に集積したマクロファージにも発現し、血小板活性化を介して血栓形成に寄与する。したがってＰＤＰＮとＣＬＥＣ－２との結合を阻害できる化合物は、このような炎症性疾患に付随する血栓症に対して選択的な抗血小板作用を示す可能性があり注目を集めている。
【0005】
ＰＤＰＮとＣＬＥＣ－２との結合による血小板活性化から発生する血栓等の血小板凝集を阻害する化合物として、非特許文献２にはベンゾイルニトロスチレン誘導体（２ＣＰ）が開示され、非特許文献３と特許文献１にはコバルト配位ヘマトポルフィリンが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】ＷＯ２０１７／１１９４１７（特許６８０５４７０）
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Nat Rev Drug Discov., 19, 333, 2020.
【非特許文献2】Oncotarget, 2015, 6, 42733.
【非特許文献3】Blood Adv. 2018, 2, 2214.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
しかしながら、上記の二種類の化合物は実用化に至っていない。よって、ＰＤＰＮとＣＬＥＣ－２との相互作用を阻害できる化合物の開発が求められている。また、出血リスクを少なくするためには、血小板活性化惹起物質に対して選択性の高い化合物の開発が求められている。
【0009】
よって、本発明は、ＰＤＰＮとＣＬＥＣ－２との結合による血小板活性化から発生する血小板凝集を阻害しかつ活性化惹起物質に対して選択性の高い化合物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＰＤＰＮ誘導性の血小板凝集を阻害しかつ血小板活性化惹起物質に対して高い選択性を有する化合物を見出した。
【0011】
本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］ 下記一般式（１）で表される化合物を含むＣＬＥＣ－２および／またはＧＰＶＩの拮抗剤。
式中、ｎは０～５の整数であり、Ｒ１は、フェニル基の環上の置換基であり、それぞれ独立に、Ｃ１－Ｃ６アルキル基またはＣ１－Ｃ６アルコキシ基であり、
Ａｒは、置換もしくは無置換のフェニル基または置換もしくは無置換のナフチル基であり、
Ａｒが、
である場合、
ｍは０～５の整数であり、Ｒ２は、フェニル基の環上の置換基であり、それぞれ独立に、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、またはＣ１－Ｃ６ハロゲン化アルキル基であり、
Ａｒが、
または
である場合、
ｍ’は０～５の整数であり、Ｒ３は、ナフチル環上の置換基であり、それぞれ独立に、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、またはＣ１－Ｃ６ハロゲン化アルキル基である。
［２］ 前記一般式（１）中、
Ｒ１は、それぞれ独立に、メチル基またはメトキシ基であり、
Ｒ２および３は、それぞれ独立に、メチル基、エチル基、イソプロピル基、またはトリフルオロメチル基である、［１］に記載の拮抗剤。
［３］ ｎ、ｍおよびｍ’は、それぞれ独立に、０～３の整数である、［１］または［２］に記載の拮抗剤。
［４］ ［１］から［３］の何れか一に記載の拮抗剤を含む血小板凝集抑制剤。
［５］ ［１］から［３］の何れか一に記載の拮抗剤を含む抗血栓薬。
［６］ ［１］から［３］の何れか一に定義した一般式（１）を有する化合物の治療的有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象のＣＬＥＣ－２および／またはＧＰＶＩをアンタゴナイズする方法。
［７］ ［１］から［３］の何れか一に定義した一般式（１）を有する化合物の治療的有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象の血小板凝集を抑制する方法。
［８］ ［１］から［３］の何れか一に定義した一般式（１）を有する化合物の治療的有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象の血栓症を治療または予防する方法。
［９］ ＣＬＥＣ－２および／またはＧＰＶＩの拮抗に使用するための、［１］から［３］の何れか一に定義した一般式（１）を有する化合物。
［１０］ 対象の血小板凝集を抑制する方法に使用するための、［１］から［３］の何れか一に定義した一般式（１）を有する化合物。
［１１］ 対象の血栓症を治療または予防する方法に使用するための、［１］から［３］の何れか一に定義した一般式（１）を有する化合物。
［１２］ ＣＬＥＣ－２および／またはＧＰＶＩの拮抗剤の製造における、［１］から［３］の何れか一に定義した一般式（１）を有する化合物の使用。
［１３］ 血小板凝集を抑制する医薬の製造における、［１］から［３］の何れか一に定義した一般式（１）を有する化合物の使用。
［１４］ 血栓症を治療または予防するための医薬の製造における、［１］から［３］の何れか一に定義した一般式（１）を有する化合物の使用。
［１５］ 対象においてＣＬＥＣ－２および／またはＧＰＶＩをアンタゴナイズする方法における、［１］から［３］の何れか一に定義した一般式（１）を有する化合物の使用。
［１６］ 対象の血小板凝集を抑制する方法における、［１］から［３］の何れか一に定義した一般式（１）を有する化合物の使用。
［１７］ 対象の血栓症を治療または予防する方法における、［１］から［３］の何れか一に定義した一般式（１）を有する化合物の使用。
［１］ 下記一般式（１）で表される化合物を含むＣＬＥＣ－２および／またはＧＰＶＩの拮抗剤。
【化1】
Ａｒは、置換もしくは無置換のフェニル基または置換もしくは無置換のナフチル基であり、
Ａｒが、
【化2】
ｍは０～５の整数であり、Ｒ２は、フェニル基の環上の置換基であり、それぞれ独立に、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、またはＣ１－Ｃ６ハロゲン化アルキル基であり、
Ａｒが、
【化3】
【化4】
ｍ’は０～５の整数であり、Ｒ３は、ナフチル環上の置換基であり、それぞれ独立に、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、またはＣ１－Ｃ６ハロゲン化アルキル基である。
［２］ 前記一般式（１）中、
Ｒ１は、それぞれ独立に、メチル基またはメトキシ基であり、
Ｒ２および３は、それぞれ独立に、メチル基、エチル基、イソプロピル基、またはトリフルオロメチル基である、［１］に記載の拮抗剤。
［３］ ｎ、ｍおよびｍ’は、それぞれ独立に、０～３の整数である、［１］または［２］に記載の拮抗剤。
［４］ ［１］から［３］の何れか一に記載の拮抗剤を含む血小板凝集抑制剤。
［５］ ［１］から［３］の何れか一に記載の拮抗剤を含む抗血栓薬。
［６］ ［１］から［３］の何れか一に定義した一般式（１）を有する化合物の治療的有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象のＣＬＥＣ－２および／またはＧＰＶＩをアンタゴナイズする方法。
［７］ ［１］から［３］の何れか一に定義した一般式（１）を有する化合物の治療的有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象の血小板凝集を抑制する方法。
［８］ ［１］から［３］の何れか一に定義した一般式（１）を有する化合物の治療的有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象の血栓症を治療または予防する方法。
［９］ ＣＬＥＣ－２および／またはＧＰＶＩの拮抗に使用するための、［１］から［３］の何れか一に定義した一般式（１）を有する化合物。
［１０］ 対象の血小板凝集を抑制する方法に使用するための、［１］から［３］の何れか一に定義した一般式（１）を有する化合物。
［１１］ 対象の血栓症を治療または予防する方法に使用するための、［１］から［３］の何れか一に定義した一般式（１）を有する化合物。
［１２］ ＣＬＥＣ－２および／またはＧＰＶＩの拮抗剤の製造における、［１］から［３］の何れか一に定義した一般式（１）を有する化合物の使用。
［１３］ 血小板凝集を抑制する医薬の製造における、［１］から［３］の何れか一に定義した一般式（１）を有する化合物の使用。
［１４］ 血栓症を治療または予防するための医薬の製造における、［１］から［３］の何れか一に定義した一般式（１）を有する化合物の使用。
［１５］ 対象においてＣＬＥＣ－２および／またはＧＰＶＩをアンタゴナイズする方法における、［１］から［３］の何れか一に定義した一般式（１）を有する化合物の使用。
［１６］ 対象の血小板凝集を抑制する方法における、［１］から［３］の何れか一に定義した一般式（１）を有する化合物の使用。
［１７］ 対象の血栓症を治療または予防する方法における、［１］から［３］の何れか一に定義した一般式（１）を有する化合物の使用。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、ＰＤＰＮとＣＬＥＣ－２との結合による血小板活性化から発生する血小板凝集を阻害しかつ活性化惹起物質に対して選択性の高い化合物を提供することができる。本発明によれば、ＣＬＥＣ－２および／またはＧＰＶＩの拮抗剤、血小板凝集抑制剤および抗血栓薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1A】ＣＬＥＣ－２によるＰＤＰＮのプルダウンと、スロットブロットによるＰＤＰＮ量の測定を模式的に示した図である。この評価系では、被検化合物がＣＬＥＣ－２とＰＤＰＮとの結合を阻害するとプルダウンされるＰＤＰＮの量が低下する。
【図1B】スロットブロットによるＰＤＰＮ量の測定結果の一部を示す図である。
【0014】
【図2-1】ヒト洗浄血小板（１×１０９／ｍＬ）のＰＤＰＮ－ＣＨＯ細胞（２×１０６／ｍＬ）による惹起による凝集に対して、１２種類のＣＬＥＣ－２阻害化合物が５０μＭにおいて完全抑制を示すことを示す結果である。血小板凝集反応が起こると血小板懸濁液の透過率（ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｃｙ（％））が上昇する。（Ａ）化合物１、化合物２、化合物１１、（Ｂ）化合物４、化合物５、化合物６、（Ｃ）化合物３、化合物７、化合物１０、（Ｄ）化合物８、化合物９、化合物１２。
【0015】
【図3】ヒト洗浄血小板（１×１０９／ｍＬ）のＰＤＰＮ－ＣＨＯ細胞（２×１０６／ｍＬ）による惹起による凝集に対する化合物１、化合物５、化合物１１による抑制作用の濃度依存性を示す結果である。（Ａ）化合物１、（Ｂ）化合物５、（Ｃ）化合物１１。これらの化合物は、＜６．２５μＭで凝集を完全抑制できる。
【0016】
【図4-1】ヒト洗浄血小板（５×１０８／ｍＬ）の抗ＣＬＥＣ－２ポリクローナル抗体（４μｇ／ｍＬ）によるＣＬＥＣ－２クラスター化による凝集に対する１２種類のＣＬＥＣ－２阻害化合物の５０μＭにおける影響を示す結果である。（Ａ）化合物１、化合物５、化合物１１、（Ｂ）化合物３、化合物８、化合物１２、（Ｃ）化合物２、化合物６、化合物９、（Ｄ）化合物４、化合物７、化合物１０。
【0017】
【図5-1】ヒト洗浄血小板（３×１０８／ｍＬ）のトロンビン（０．５Ｕ／ｍＬ）惹起による凝集に対する、１２種類のＣＬＥＣ－２阻害化合物の５０μＭにおける影響を示す結果である。（Ａ）化合物１、化合物５、化合物１１、（Ｂ）化合物４、化合物２、化合物６、（Ｃ）化合物３、化合物７、化合物１０、（Ｄ）化合物８、化合物９、化合物１２。
【0018】
【図6-1】ヒト洗浄血小板（３×１０８／ｍＬ）のＡＤＰ（２０μＭ）＋フィブリノーゲン（０．６ｍｇ／ｍＬ）惹起による凝集に対する、１２種類のＣＬＥＣ－２阻害化合物の５０μＭにおける影響を示す結果である。（Ａ）化合物１、化合物５、化合物１１、（Ｂ）化合物２、化合物６、化合物７、（Ｃ）化合物８、化合物９、化合物１２、（Ｄ）化合物３、化合物４、化合物８。
【0019】
【図7-1】ヒト洗浄血小板（１×１０９／ｍＬ）のコラーゲン（２μｇ／ｍＬ）惹起による凝集に対する、１２種類のＣＬＥＣ－２阻害化合物の５０μＭにおける影響を示す結果である。（Ａ）化合物５、化合物６、化合物１１、（Ｂ）化合物８、化合物９、化合物１２、（Ｃ）化合物４、化合物７（Ｄ）化合物３、化合物１０。
【0020】
【図8】ヒト洗浄血小板（１×１０９／ｍＬ）のコラーゲン（２μｇ／ｍＬ）惹起による凝集に対する、選抜化合物（Ａ）化合物１、（Ｂ）化合物５、（Ｃ）化合物１１による抑制作用の濃度依存性を示すグラフである。
【0021】
【図9-1】マウス洗浄血小板（１×１０９／ｍＬ）のＰＤＰＮ－ＣＨＯ細胞（２×１０６／ｍＬ）による惹起による凝集に対する、１２種類のＣＬＥＣ－２阻害化合物の１００μＭにおける抑制効果を示す結果である。（Ａ）化合物１、化合物９、化合物１１、（Ｂ）化合物２、化合物３、化合物６、（Ｃ）化合物５、化合物７、化合物１１、（Ｄ）化合物４、化合物８、化合物１０。
【図9-2】図９－１の続き。（Ｅ）Ｃａｎｇｒｅｌｏｒ（３．１μＭ）、（Ｆ）１００μＭにおける各測定時におけるコントロール（ＤＭＳＯ）の凝集カーブに対する各化合物添加時のＡｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ（ＡＵＣ）の相対値を示すグラフである。グラフ中、ＣａｎｇｒｅｌｏｒをＣａｎｇと記載した。
【図10】マウス洗浄血小板（１×１０９／ｍＬ）のＰＤＰＮ－ＣＨＯ細胞（２×１０６／ｍＬ）による惹起による凝集に対する、選抜化合物の化合物１、化合物５、化合物１１による抑制作用の濃度依存性を示す結果である。（Ａ）化合物１、（Ｂ）化合物５、（Ｃ）化合物１１。
【0022】
【図11-1】マウス洗浄血小板（３×１０８／ｍＬ）のトロンビン（０．５Ｕ／ｍＬ）惹起による凝集に対する、１２種類のＣＬＥＣ－２阻害化合物の５０μＭにおける抑制効果を示す結果である。（Ａ）化合物１、化合物５、化合物１１、（Ｂ）化合物３、化合物４、化合物８、（Ｃ）化合物２、化合物１０、化合物１２、（Ｄ）化合物３、化合物４、化合物８。
【0023】
【図12-1】マウス洗浄血小板（５×１０８／ｍＬ）のＡＤＰ（５０μＭ）＋フィブリノーゲン（０．６ｍｇ／ｍＬ）惹起による凝集に対する、１２種類のＣＬＥＣ－２阻害化合物の５０μＭにおける抑制効果を示す結果である。（Ａ）化合物１、化合物２、化合物３、（Ｂ）化合物４、化合物５、化合物６、（Ｃ）化合物７、化合物８、化合物９、（Ｄ）化合物１０、化合物１１、化合物１２。
【0024】
【図13-1】マウス洗浄血小板（１×１０９／ｍＬ）のコラーゲン（２μｇ／ｍＬ）惹起による凝集に対する、１２種類のＣＬＥＣ－２阻害化合物の５０μＭにおける抑制効果を示す結果である。（Ａ）化合物２、化合物４、化合物６、（Ｂ）化合物５、化合物８、化合物１２、（Ｃ）化合物３、化合物１０、化合物１１、（Ｄ）化合物１、化合物７、化合物９。
【0025】
【図14】マウス洗浄血小板（１×１０９／ｍＬ）のコラーゲン（２μｇ／ｍＬ）惹起による凝集に対する、化合物１、化合物５、化合物１１による抑制作用の濃度依存性を示す結果である。（Ａ）化合物１、（Ｂ）化合物５、（Ｃ）化合物１１。
【0026】
【図15】コラーゲン受容体であるＧＰＶＩと化合物５（Ａ）または化合物１１（Ｂ）との相互作用をｉｎ ｓｉｌｉｃｏ化合物ドッキングシミュレーションした図である。ＣＲＰ（コラーゲン関連ペプチド）は参照として示す。ＧＰＶＩ：リボンモデル（マンガモデル）、化合物５（Ａ）および化合物１１（Ｂ）：空間充填モデル、ＣＲＰ：表面モデル。
【0027】
【図16】血小板の電顕像を示す。ｕｎｔｒｅａｔｅｄ：非処理の血小板像、ＰＤＰＮ＋ＤＭＳＯ：ＤＭＳＯ（コントロール）の存在下ＰＤＰＮ処理された血小板像、ＰＤＰＮ＋化合物５：５０μＭの化合物５の存在下ＰＤＰＮ処理された血小板像、コラーゲン＋ＤＭＳＯ：ＤＭＳＯ（コントロール）の存在下コラーゲン処理された血小板像、コラーゲン＋化合物５：５０μＭの化合物５の存在下コラーゲン処理された血小板像。
【発明を実施するための形態】
【0028】
以下に記載する本発明の説明は、代表的な実施形態や具体例に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に限定されるものではない。なお、本明細書において「～」を用いて表される数値範囲は「～」の前後に記載される数値を下限値および上限値として含む範囲を意味する。
【0029】
本明細書において、特に断らない限り、各用語は、次の意味を有する。
予防とは、発症の阻害、発症リスクの低減または発症の遅延などを意味する。
治療とは、疾患または症状の改善または進行の抑制などを意味する。
治療的有効量とは、投与された場合（単回投与として、または複数回投与の時間経過として）、疾患症状の重症度の減少、疾患症状のない期間の頻度および期間の増加、または疾患の苦痛による障害または障害の予防によって証明される疾患退縮を促進する量を含む。治療的有効量は、疾患を発症するリスクがあるか、または疾患の再発を患うリスクがある対象に投与された場合、疾患の発症または再発を阻害する量である「予防的有効量」を含む。
対象とは、ヒトを含む哺乳動物を意味する。
予防とは、発症の阻害、発症リスクの低減または発症の遅延などを意味する。
治療とは、疾患または症状の改善または進行の抑制などを意味する。
治療的有効量とは、投与された場合（単回投与として、または複数回投与の時間経過として）、疾患症状の重症度の減少、疾患症状のない期間の頻度および期間の増加、または疾患の苦痛による障害または障害の予防によって証明される疾患退縮を促進する量を含む。治療的有効量は、疾患を発症するリスクがあるか、または疾患の再発を患うリスクがある対象に投与された場合、疾患の発症または再発を阻害する量である「予防的有効量」を含む。
対象とは、ヒトを含む哺乳動物を意味する。
【0030】
（ＣＬＥＣ－２および／またはＧＰＶＩの拮抗剤）
本発明のＣＬＥＣ－２および／またはＧＰＶＩの拮抗剤は、Ｎ,３―ジアリール－２－テトラゾール－プロパンアミド化合物を含み、より具体的には下記一般式（１）で表される化合物を含む。
本発明のＣＬＥＣ－２および／またはＧＰＶＩの拮抗剤は、Ｎ,３―ジアリール－２－テトラゾール－プロパンアミド化合物を含み、より具体的には下記一般式（１）で表される化合物を含む。
【0031】
前記ＣＬＥＣ－２および／またはＧＰＶＩの拮抗剤は、血小板膜上の血小板活性化惹起物質受容体であるＣＬＥＣ－２および／またはＧＰＶＩの機能を抑制する作用を有する。
【0032】
ＣＬＥＣ－２（Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ２）は、血小板上に発現する膜タンパク質である。ＣＬＥＣ－２の生体内リガンドは、ＰＤＰＮ（ポドプラニン）である。ＰＤＰＮは、血小板活性化ドメインを有する膜タンパク質であり、リンパ管上皮や腎臓ポドサイトなどに構成的に発現する。ＣＬＥＣ－２がＰＤＰＮにより活性化されると、血小板凝集が促進され、血栓形成が促進される。本発明の拮抗剤は、ＣＬＥＣ－２に特異的に結合するか、またはＰＤＰＮと競合することによりＣＬＥＣ－２の機能を抑制する拮抗剤として機能する。
【0033】
ＧＰＶＩ（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ＶＩ）は、巨核球、血小板上に発現する、１型膜貫通型受容体であり、コラーゲン結合領域を含む２つのイムノグロブリンドメインを有し、コラーゲンによる血小板の活性化に関与する。ＧＰＶＩのアゴニストとして、コラーゲン（Ｉ型およびＩＩＩ型）のほか、クロスリンクしたＣＲＰ（コラーゲン関連ペプチド）などが知られている（血栓止血誌１８（１）：６１－６５、２００７）。血管損傷部位では、多段階の血小板凝集反応の１つとして、血小板のＧＰＶＩが、損傷部位のコラーゲンに結合し、活性化され、血小板血栓が形成される。本発明の拮抗剤は、ＧＰＶＩに特異的に結合するか、またはコラーゲンやＣＲＰ等と競合することによりＧＰＶＩの機能を抑制する拮抗剤として機能する。
【0034】
前記ＣＬＥＣ－２および／またはＧＰＶＩの拮抗剤は、ＣＬＥＣ－２とＰＤＰＮとの結合を阻害する作用を有すること、および／またはＧＰＶＩとＧＰＶＩのアゴニスト（例えば、コラーゲンやＣＲＰ）との結合を阻害する作用を有することが好ましく、ＣＬＥＣ－２とＰＤＰＮとの結合を阻害する作用を有し、かつＧＰＶＩとＧＰＶＩのアゴニスト（例えば、コラーゲンやＣＲＰ）との結合を阻害する作用をすることがより好ましい。
【0035】
（一般式（１）で表される化合物）
式中、ｎは０～５の整数であり、Ｒ１は、フェニル基の環上の置換基であり、それぞれ独立に、Ｃ１－Ｃ６アルキル基またはＣ１－Ｃ６アルコキシ基であり、
Ａｒは、置換もしくは無置換のフェニル基または置換もしくは無置換のナフチル基であり、
Ａｒが、
である場合、
ｍは０～５の整数であり、Ｒ２は、フェニル基の環上の置換基であり、それぞれ独立に、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、またはＣ１－Ｃ６ハロゲン化アルキル基であり、好ましくは、Ｃ１－Ｃ３アルキル基、Ｃ１－Ｃ３アルコキシ基、またはＣ１－Ｃ３ハロゲン化アルキル基であり、
Ａｒが、
または
である場合、
ｍ’は０～５の整数であり、Ｒ３は、ナフチル環上の置換基であり、それぞれ独立に、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、またはＣ１－Ｃ６ハロゲン化アルキル基であり、好ましくは、Ｃ１－Ｃ３アルキル基、Ｃ１－Ｃ３アルコキシ基、またはＣ１－Ｃ３ハロゲン化アルキル基である。
【化5】
Ａｒは、置換もしくは無置換のフェニル基または置換もしくは無置換のナフチル基であり、
Ａｒが、
【化6】
ｍは０～５の整数であり、Ｒ２は、フェニル基の環上の置換基であり、それぞれ独立に、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、またはＣ１－Ｃ６ハロゲン化アルキル基であり、好ましくは、Ｃ１－Ｃ３アルキル基、Ｃ１－Ｃ３アルコキシ基、またはＣ１－Ｃ３ハロゲン化アルキル基であり、
Ａｒが、
【化7】
【化8】
ｍ’は０～５の整数であり、Ｒ３は、ナフチル環上の置換基であり、それぞれ独立に、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基、またはＣ１－Ｃ６ハロゲン化アルキル基であり、好ましくは、Ｃ１－Ｃ３アルキル基、Ｃ１－Ｃ３アルコキシ基、またはＣ１－Ｃ３ハロゲン化アルキル基である。
【0036】
一般式（１）中、ｎは０～３の整数であることが好ましく、１～３の整数であることがより好ましく、１または２であることがさらにより好ましい。Ｒ１は、それぞれ独立に、メチル基またはメトキシ基であることが好ましい。
【0037】
Ａｒが、
である場合、ｍは、０～３の整数であることが好ましく、１～３の整数であることがより好ましく、１または２であることがさらにより好ましい。Ｒ２は、それぞれ独立に、メチル基、エチル基、イソプロピル基、またはトリフルオロメチル基であることが好ましい。
【化9】
【0038】
Ａｒが、
または
である場合、ｍ’は０～３の整数であることが好ましい。Ｒ３は任意選択的であり、ｍ’は０であってもよく、一般式（１）のＡｒは無置換の１－ナフチルまたは２－ナフチルであり得る。ｍ’が１以上の整数である場合、Ｒ３は、それぞれ独立に、メチル基、エチル基、イソプロピル基、またはトリフルオロメチル基であり得る。
【化10】
【化11】
【0039】
本発明で用いる化合物としては、さらに好ましくは、一般式（１）中、
ｎは１または２であり、Ｒ１は、それぞれ独立に、メチル基またはメトキシ基であり、および
Ａｒが、
であり、ｍは１または２であり、Ｒ２は、それぞれ独立に、メチル基、エチル基、イソプロピル基、またはトリフルオロメチル基であるか、または
Ａｒが、無置換のナフチル基である。
ｎは１または２であり、Ｒ１は、それぞれ独立に、メチル基またはメトキシ基であり、および
Ａｒが、
【化12】
Ａｒが、無置換のナフチル基である。
【0040】
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の置換位置は、それぞれ独立に、任意である。特に限定されないが、Ｒ２がイソプロピル基のとき、窒素原子に対してパラ位であることが好ましい。
【0041】
「Ｃ１－Ｃ６アルキル基」は、炭素原子が１～６個の直鎖または分枝鎖のアルキル分子を意味し、非限定的な例として、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、１－メチルブチル基、２－メチルブチル基、３－メチルブチル基、１－エチルプロピル基、１，１－ジメチルプロピル基、１，２－ジメチルプロピル基、２，２－ジメチルプロピル基、ヘキシル基、１－メチルペンチル基、２－メチルペンチル基、１，１－ジメチルブチル基および１，３－ジメチルブチル基が挙げられる。
【0042】
「Ｃ１－Ｃ６アルコキシ基」は、酸素原子を介して主鎖の炭素原子と結合する、上に定義したアルキル基を意味し、非限定的な例として、メトキシ基、エトキシ基が挙げられる。
【0043】
「Ｃ１－Ｃ６ハロゲン化アルキル基」は、1個以上のハロゲン原子で置換されたアルキルを意味し、例えば、フルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基が挙げられる。
【0044】
前記一般式（１）で表される化合物は、全ての立体異性体（例えば、シス-トランス異性体）および全ての光学異性体（例えば、ＲおよびＳ鏡像異性体）をとり得る場合があり、その場合、いずれかの構造、あるいはそれら複数が混在した状態、すなわち、そのような異性体のラセミ体および他の混合物で用いることができる。全ての立体異性体が本発明の特許請求の範囲内に包含されるが、当業者であれば、特定の立体異性体が好ましいことを認識し得る。
【0045】
前記一般式（１）で表される化合物は、その薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくはそれらの溶媒和物として用いてもよい。塩としては、塩酸塩、硫酸塩等の鉱酸塩や、酢酸、プロピオン酸、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸および安息香酸等の有機酸との塩が挙げられる。塩や遊離形態の化合物の他、これらの任意の水和物あるいは溶媒和物を有効成分として用いてもよい。上記の溶媒和物を形成し得る溶媒としては、例えば、エタノール、イソプロパノール、アセトン、酢酸エチル、塩化メチレン等が挙げられる。
【0046】
前記一般式（１）で表される化合物としては、以下を挙げることができるが、これらに限定されない。
【化13】
【化14】
【0047】
前記一般式（１）で表される化合物は、化学合成法により製造することができる。また、一般式（１）で表される化合物は、ナミキ商事株式会社（サプライヤー：ＡＳＩＮＥＸ社、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ社、Ｖｉｔａｓ－Ｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）から購入することができる。
【0048】
被検化合物がＣＬＥＣ－２とその生体内リガンドであるＰＤＰＮとの結合を阻害する作用を有することは、後記する実施例のとおり、本発明者らによって開発されたｉｎ ｖｉｔｒｏ 化合物結合阻害能評価系であるプルダウンースロットブロット系を用いて評価することができる（Watanabe N et al. (2019) A pull-down and slot blot-based screening system for inhibitor compounds of the podoplanin-CLEC-2 interaction. PLoS ONE 14(9): e0222331）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ化合物結合阻害能評価系の前に、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ化合物ドッキングシミュレーションを行い、候補化合物をスクリーニングしてもよい。
【0049】
一般式（１）で表される化合物が抗血小板凝集作用を有することは、後記する実施例のとおり、被検化合物の存在下、血小板懸濁液に種々の血小板活性化惹起物質を添加し、血小板懸濁液の透過率（ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｃｙ（％））を、血小板凝集測定装置を用いて測定することにより、検証することができる。血小板凝集反応が起こると血小板懸濁液の透過率（％）が上昇する。血小板活性化惹起物質としては、ＰＤＰＮ（ポドプラニン）、コラーゲン、ＣＲＰ（コラーゲン関連ペプチド）、トロンビン、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）やトロンボキサンＡ２（ＴｘＡ２）などを挙げることができるが、これらに限定されない。これらの受容体としては、ポドプラニン受容体（ＣＥＬＥＣ－２）、コラーゲン受容体（ＧＰＩｂ－ＩＶ－Ｖ複合体、ＧＰＶＩ、ＧＰＩａ／ＩＩａ）、トロンビン受容体（ＰＡＲ１）、ＡＤＰ受容体（Ｐ２Ｙ１２）、トロンボキサンＡ２受容体（ＴＰ）を挙げることができる。
【0050】
一般式（１）で表される化合物が抗血小板凝集作用を有することは、電子顕微鏡等を用いて、血小板の形態を観察することにより検証することができる。血小板は、正常時、凹凸のない滑らかな表面を有するが、出血時には血小板活性化惹起物質により血小板内の細胞骨格系が変化し、多数の長い突起を出し、それと同時に新たに細胞膜上に細胞接着因子が発現する。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでも、血小板懸濁液に血小板活性化惹起物質を添加すると、通常、血小板に多数の長い突起が現れる。被検化合物の存在下、血小板懸濁液に特定の血小板活性化惹起物質を添加し、突起の出現が観察されないかまたは突起の数が被検化合物の非存在下と比較して減少する場合、被検化合物が、その特定の血小板活性化惹起物質による血小板活性化を抑制しているということができる。
【0051】
本発明のＣＬＥＣ－２および／またはＧＰＶＩの拮抗剤は、ＰＤＰＮ誘導血小板凝集を強力に阻害することができる（＜６．２５μＭで完全抑制）。またコラーゲン誘導血小板凝集も抑制することができる（＜１２．５μＭで完全抑制）。一方で、本発明のＣＬＥＣ－２および／またはＧＰＶＩの拮抗剤は、抗ＣＬＥＣ－２抗体、トロンビンおよびＡＤＰのそれぞれにより誘導される血小板凝集を抑制せず、ＰＤＰＮおよびコラーゲンのそれぞれにより誘導される血小板凝集を選択的に阻害することができる。血小板活性化惹起物質に対して選択性の高い化合物は、多数の活性化惹起物質に適用が可能である化合物と比較して、出血リスクが低いと考えられる。
【0052】
（血小板凝集抑制剤および抗血栓薬）
前記ＣＬＥＣ－２および／またはＧＰＶＩの拮抗剤は、ＣＬＥＣ－２とＰＤＰＮとの結合を阻害する作用を有すること、および／またはＧＰＶＩとＧＰＶＩのアゴニスト（例えば、コラーゲンやＣＲＰ）との結合を阻害する作用を有することが好ましく、ＣＬＥＣ－２とＰＤＰＮとの結合を阻害する作用を有し、かつＧＰＶＩとＧＰＶＩのアゴニスト（例えば、コラーゲンやＣＲＰ）との結合を阻害する作用をすることがより好ましい。
前記ＣＬＥＣ－２および／またはＧＰＶＩの拮抗剤は、ＣＬＥＣ－２とＰＤＰＮとの結合を阻害する作用を有すること、および／またはＧＰＶＩとＧＰＶＩのアゴニスト（例えば、コラーゲンやＣＲＰ）との結合を阻害する作用を有することが好ましく、ＣＬＥＣ－２とＰＤＰＮとの結合を阻害する作用を有し、かつＧＰＶＩとＧＰＶＩのアゴニスト（例えば、コラーゲンやＣＲＰ）との結合を阻害する作用をすることがより好ましい。
【0053】
本発明の血小板凝集抑制剤は、本発明のＣＬＥＣ－２および／またはＧＰＶＩの拮抗剤を含む。前記血小板凝集抑制剤は、血小板の凝集を抑制する作用を有する薬剤である。
【0054】
本発明の抗血栓薬は、本発明の前記ＣＬＥＣ－２および／またはＧＰＶＩの拮抗剤を含む。前記抗血栓薬は、血栓の形成を抑制し、血管閉塞を予防する作用を有する薬剤である。
【0055】
前記血小板凝集抑制剤および前記抗血栓薬は、血小板膜上の血小板活性化惹起物質受容体であるＣＬＥＣ－２および／またはＧＰＶＩの機能抑制を介して作用することが好ましく、ＣＬＥＣ－２とその生体内リガンドであるＰＤＰＮとの結合を阻害する作用を有することおよび／またはＧＰＶＩとそのアゴニスト（例えば、コラーゲンやＣＲＰ）との結合を阻害する作用をすることがより好ましい。
【0056】
（医薬組成物）
本発明のＣＬＥＣ－２および／またはＧＰＶＩの拮抗剤、一般式（１）で表される化合物、血小板凝集抑制剤、および抗血栓薬の少なくともいずれかを含み、更に必要に応じて薬学的に許容可能な添加物などのその他の成分を含む医薬組成物も本発明の意図する範疇である。
本発明のＣＬＥＣ－２および／またはＧＰＶＩの拮抗剤、一般式（１）で表される化合物、血小板凝集抑制剤、および抗血栓薬の少なくともいずれかを含み、更に必要に応じて薬学的に許容可能な添加物などのその他の成分を含む医薬組成物も本発明の意図する範疇である。
【0057】
前記薬学的に許容可能な添加物としては、例えば等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、凍結保護剤、抗生物質等を例示できる。具体的には、水、エタノール、塩化ナトリウム、ブドウ糖、アルブミン等が挙げられる。また、薬学的に許容される添加物の別の例としては、賦形剤、結合剤、滑沢剤等を例示できる。賦形剤としては、例えば、乳糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、ソルビトール、結晶セルロース、二酸化ケイ素等が挙げられる。結合剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、エチルセルロース、メチルセルロース、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ等が挙げられる。
【0058】
前記医薬組成物は、投与経路に応じて最適な剤形で処方される。医薬組成物は、錠剤、顆粒剤、細粒剤、粉剤、カプセル剤等の固形製剤または液剤、ゼリー剤、シロップ剤等の経口投与用製剤であってもよく、注射剤、坐剤、軟膏剤、貼付剤等の非経口投与用製剤であってもよい。
【0059】
本発明の医薬組成物の製造は、医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理規則に適合した条件（ｇｏｏｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅ、ＧＭＰ）で実施されることが好ましい。
【0060】
前記医薬組成物を投与する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて投与経路、投与タイミング、投与量、投与スケジュール等の投与条件を適宜選択することができる。前記投与経路としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、静脈内投与、経皮投与、経口投与が好ましい。
【0061】
前記医薬組成物の投与量としては、特に制限はなく、処置を必要とする対象の疾患状態、体重等の要因に応じて適宜選択することができるが、一日当たり、１ｍｇ～１，０００ｍｇが好ましく、１０ｍｇ～２００ｍｇがより好ましい。
【実施例0062】
以下の例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【0063】
実施例１
ＰＤＰＮ／ＣＬＥＣ－２相互作用に対する阻害能の測定
化合物１から化合物１２は、ナミキ商事株式会社（サプライヤー：ＡＳＩＮＥＸ社、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ社、Ｖｉｔａｓ－Ｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）から購入したものを用いた。
ＰＤＰＮ／ＣＬＥＣ－２相互作用に対する阻害能の測定
化合物１から化合物１２は、ナミキ商事株式会社（サプライヤー：ＡＳＩＮＥＸ社、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ社、Ｖｉｔａｓ－Ｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）から購入したものを用いた。
【表1】
【0064】
実験方法
１）イムノグロブリンＦｃ領域融合ＣＬＥＣ－２（Ｆｃ－ＣＬＥＣ－２）と、ＰＤＰＮ過剰発現ＨｅＬａ細胞由来のライゼートとを混合して、Ｆｃ－ＣＬＥＣ－２によってＰＤＰＮを捕捉するプルダウン評価系を構築した（図１Ａ）。Ｆｃ－ＣＬＥＣ－２とＰＤＰＮ複合体または遊離のＦｃ－ＣＬＥＣはＰｒｏｔｅｉｎ Ａ結合ビーズ（ＫＡＮＥＫＡ ＫａｎＣａｐＡTM）で回収し、遠心フィルターユニット（ＵＦＣ３０ＤＶ００ ｕｌｔｒａ－ｆｒｅｅ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で洗浄操作を行った。ＧｌｙＨＣｌ （ｐＨ２．８）でタンパク質を溶出させ、スロットブロット（ＭｉｌｌｉＢｌｏｔ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にてｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＶＤＦ）膜上に吸着させた。ＰＶＤＦ膜のブロッキングを行った後、ＣＬＥＣ－２ならびにＰＤＰＮはそれぞれ抗ＣＬＥＣ－２抗体（ＡＦ１７１８，Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、抗ＰＤＰＮ抗体（ＮＺ－１，Ａｎｇｉｏ Ｂｉｏ Ｃｏ．）を反応させ、続いて西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識の２次抗体と反応させた後、化学発光法で発光させ、ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＴＴＯ，Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）でシグナルを記録した。スロットの強度は画像解析ソフト（ＮＩＨ，Ｉｍａｇｅ Ｊ）を用いて定量化した。被検化合物を共存させ、ＰＤＰＮの沈降のみが抑制した場合、その化合物はＣＬＥＣ－２とＰＤＰＮとの結合を特異的に阻害したことになる。
１）イムノグロブリンＦｃ領域融合ＣＬＥＣ－２（Ｆｃ－ＣＬＥＣ－２）と、ＰＤＰＮ過剰発現ＨｅＬａ細胞由来のライゼートとを混合して、Ｆｃ－ＣＬＥＣ－２によってＰＤＰＮを捕捉するプルダウン評価系を構築した（図１Ａ）。Ｆｃ－ＣＬＥＣ－２とＰＤＰＮ複合体または遊離のＦｃ－ＣＬＥＣはＰｒｏｔｅｉｎ Ａ結合ビーズ（ＫＡＮＥＫＡ ＫａｎＣａｐＡTM）で回収し、遠心フィルターユニット（ＵＦＣ３０ＤＶ００ ｕｌｔｒａ－ｆｒｅｅ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で洗浄操作を行った。ＧｌｙＨＣｌ （ｐＨ２．８）でタンパク質を溶出させ、スロットブロット（ＭｉｌｌｉＢｌｏｔ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にてｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＶＤＦ）膜上に吸着させた。ＰＶＤＦ膜のブロッキングを行った後、ＣＬＥＣ－２ならびにＰＤＰＮはそれぞれ抗ＣＬＥＣ－２抗体（ＡＦ１７１８，Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、抗ＰＤＰＮ抗体（ＮＺ－１，Ａｎｇｉｏ Ｂｉｏ Ｃｏ．）を反応させ、続いて西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識の２次抗体と反応させた後、化学発光法で発光させ、ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＴＴＯ，Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）でシグナルを記録した。スロットの強度は画像解析ソフト（ＮＩＨ，Ｉｍａｇｅ Ｊ）を用いて定量化した。被検化合物を共存させ、ＰＤＰＮの沈降のみが抑制した場合、その化合物はＣＬＥＣ－２とＰＤＰＮとの結合を特異的に阻害したことになる。
【0065】
２）Ｆｃ－ＣＬＥＣ－２は以下のように作製した。ヒト末梢血単核球からＲＮＡを調製し逆転写を行い、ｃＤＮＡを得た。ＣＬＥＣ－２の細胞外領域に相当する配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＭ＿０１６５０９の位置３５１－８９０の部分）をＢａｍＨ１またはＥｃｏＲＶ制限サイトを含む下記のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。
ＣＬＥＣ－２－Ｆ：５’－ＣＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＴＧＧＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＴＧＴＣＡＴ（配列番号１）
ＣＬＥＣ－２－Ｒ：５’－ＣＧＴＧＡＴＡＴＣＴＴＡＡＧＧＴＡＧＴＴＧＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧ（配列番号２）
ＣＬＥＣ－２－Ｆ：５’－ＣＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＴＧＧＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＴＧＴＣＡＴ（配列番号１）
ＣＬＥＣ－２－Ｒ：５’－ＣＧＴＧＡＴＡＴＣＴＴＡＡＧＧＴＡＧＴＴＧＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧ（配列番号２）
【0066】
これをＦｃ融合タンパク質発現ベクターｐＦＵＳＥＮ－ｈＧ１Ｆｃ（ＩｎＶＩＶＯＧｅｎ）へ連結し、ＨＥＫ２９３細胞へトランスフェクトし培地を回収した。ＡＫＴＡ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて培地からＦｃ－ＣＬＥＣ－２を精製した。
【0067】
３）ＰＤＰＮ発現細胞は以下のようにして樹立した。ヒト食道がん扁平上皮細胞株ＴＥ１１細胞（ＲＩＫＥＮ ＣＥＬＬ ＢＡＮＫ）よりＲＮＡを抽出しｃＤＮＡを得た。ＰＤＰＮのタンパク質の翻訳領域全長をＡｇｅ１またはＢａｍＨ１制限サイトを含む以下のプライマーを用いて増幅した（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ３９０１０６．１）。
ＰＤＰＮ－Ｆ：５’－ＡＣＧＡＣＣＧＧＴＡＴＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＴＣＡＧＣＴＣＴ（配列番号３）
ＰＤＰＮ－Ｒ：５’－ＣＧＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＧＧＣＧＡＧＴＡＣＣＴＴＣＣＣＧ（配列番号４）
ＰＤＰＮ－Ｆ：５’－ＡＣＧＡＣＣＧＧＴＡＴＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＴＣＡＧＣＴＣＴ（配列番号３）
ＰＤＰＮ－Ｒ：５’－ＣＧＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＧＧＣＧＡＧＴＡＣＣＴＴＣＣＣＧ（配列番号４）
【0068】
ＰＣＲ増幅物はレンチウイルス発現ベクター ＣＳＩＩ－ＭＣＳ－Ｖｅｎｕｓ（ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ ＤＮＡ ＢＡＮＫ）に連結しレンチウイルスベクターを作製した。レンチウイルスをＨｅＬａ細胞またはＣＨＯ細胞に感染させ、安定発現細胞をＦＡＣＳ（ＦＡＣＳＡｒｉａ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分離した。
【0069】
結果
１２種の化合物１から化合物１２について、ＣＬＥＣ－２とＰＤＰＮとの結合を抑制する効果を測定した結果を、図１Ｃ－１～３に示す。コントロール（ＤＭＳＯ）添加時のＰＤＰＮのスロットの発光強度を１として各濃度の化合物添加時の相対的発光強度をグラフ化した。１２種の化合物のすべてが、４ｍＭにおける結合抑制率８５％以上を示した。１２種の被検化合物の中でも、特に化合物１、化合物５、化合物６、化合物７、化合物１１は結合抑制が高く、相対的に高い阻害効果を示した。２ｍＭにおける結合抑制率は、化合物１：８４％、化合物５：８２％、化合物６：９７％、化合物７：７５％、化合物１１：６９％であった。
１２種の化合物１から化合物１２について、ＣＬＥＣ－２とＰＤＰＮとの結合を抑制する効果を測定した結果を、図１Ｃ－１～３に示す。コントロール（ＤＭＳＯ）添加時のＰＤＰＮのスロットの発光強度を１として各濃度の化合物添加時の相対的発光強度をグラフ化した。１２種の化合物のすべてが、４ｍＭにおける結合抑制率８５％以上を示した。１２種の被検化合物の中でも、特に化合物１、化合物５、化合物６、化合物７、化合物１１は結合抑制が高く、相対的に高い阻害効果を示した。２ｍＭにおける結合抑制率は、化合物１：８４％、化合物５：８２％、化合物６：９７％、化合物７：７５％、化合物１１：６９％であった。
【0070】
実施例２
血小板凝集測定
血液はクエン酸ナトリウムを抗凝固剤として健常人ならびにマウスから得た。血液は２００×Ｇで１０分間して過血小板血漿を回収し、続いてアピラーゼ（Ｓｉｇｍａ）、プロスタグランジンＩ２（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を添加して１０００×Ｇで１０分間遠心分離を行った。得られた血小板はTyrode's溶液にて再度アピラーゼ、プロスタグランジンＩ２存在下で遠心洗浄を行った後、１×１０９／ｍＬの密度でTyrode's溶液に懸濁し洗浄血小板とした。血小板凝集は４－チャンネル血小板凝集測定装置ＰＡ－２００（興和株式会社）で測定した。被検化合物は惹起物質添加の３０秒前に添加した。対照薬として、Ｃａｎｇｒｅｌｏｒ（Cangrelor Tetrasodium, Selleckchem.com, Catalog No.S3737）を用いた。
血小板凝集測定
血液はクエン酸ナトリウムを抗凝固剤として健常人ならびにマウスから得た。血液は２００×Ｇで１０分間して過血小板血漿を回収し、続いてアピラーゼ（Ｓｉｇｍａ）、プロスタグランジンＩ２（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を添加して１０００×Ｇで１０分間遠心分離を行った。得られた血小板はTyrode's溶液にて再度アピラーゼ、プロスタグランジンＩ２存在下で遠心洗浄を行った後、１×１０９／ｍＬの密度でTyrode's溶液に懸濁し洗浄血小板とした。血小板凝集は４－チャンネル血小板凝集測定装置ＰＡ－２００（興和株式会社）で測定した。被検化合物は惹起物質添加の３０秒前に添加した。対照薬として、Ｃａｎｇｒｅｌｏｒ（Cangrelor Tetrasodium, Selleckchem.com, Catalog No.S3737）を用いた。
【0071】
血小板凝集は以下の終濃度の惹起物質を用いた。
ｉ）ＰＤＰＮ－ＣＨＯ細胞（２×１０６／ｍＬ）、
ｉｉ）抗ＣＬＥＣ－２抗体、抗原アフィニティー精製ポリクローナルヤギＩｇＧ（ＡＦ１７１８、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、４μｇ／ｍＬ）
ｉｉｉ）ヒト由来トロンビン（Ｓｉｇｍａ、０．５Ｕ／ｍＬ）
ｉｖ）ＡＤＰ（ｎａｃａｌａｉ、２０μＭ）＋ヒト由来フィブリノーゲン（Ｗａｋｏ、０．６ｍｇ／ｍＬ）
ｖ）コラーゲン（Revohem collagen Sysmex社AW-993-82, ２μｇ／ｍＬ）、
ＰＤＰＮ発現ＣＨＯ細胞は、実施例１の３）に記載のとおり、作成した。
ｉ）ＰＤＰＮ－ＣＨＯ細胞（２×１０６／ｍＬ）、
ｉｉ）抗ＣＬＥＣ－２抗体、抗原アフィニティー精製ポリクローナルヤギＩｇＧ（ＡＦ１７１８、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、４μｇ／ｍＬ）
ｉｉｉ）ヒト由来トロンビン（Ｓｉｇｍａ、０．５Ｕ／ｍＬ）
ｉｖ）ＡＤＰ（ｎａｃａｌａｉ、２０μＭ）＋ヒト由来フィブリノーゲン（Ｗａｋｏ、０．６ｍｇ／ｍＬ）
ｖ）コラーゲン（Revohem collagen Sysmex社AW-993-82, ２μｇ／ｍＬ）、
ＰＤＰＮ発現ＣＨＯ細胞は、実施例１の３）に記載のとおり、作成した。
【0072】
結果
ヒト血小板の凝集に対する阻害効果について
ｉ）ＰＤＰＮ誘導血小板凝集に対する阻害効果
１２種の化合物１から化合物１２について、ＰＤＰＮ－ＣＨＯ細胞により惹起される血小板凝集に対する阻害効果を測定した。図２Ａ－Ｅは、血小板懸濁液の透過率（ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｃｙ（％））に示す。血小板凝集反応が起こると血小板懸濁液の透過率（％）が上昇する。ＰＤＰＮ－ＣＨＯ細胞添加後、ＤＭＳＯコントロールの透過率％は上昇しており、これは血小板凝集反応が起きていることを示す。１２種の化合物１から化合物１２のいずれかの存在下（５０μＭ）では、ＰＤＰＮ－ＣＨＯ細胞添加後も、透過率％は上昇しなかった（図２－１のＡ～Ｄ）。この結果は、１２種の化合物１から化合物１２が５０μＭにおいてＰＤＰＮ誘導血小板凝集を完全に抑制することを示す。対照薬Ｃａｎｇｒｅｌｏｒ（３．１２μＭ）の存在下でも、ＰＤＰＮ－ＣＨＯ細胞添加後に、透過率％は上昇しなかった（図２Ｅ）。図２－２のＦは、凝集抑制の度合いを示すため、各測定時におけるコントロール（ＤＭＳＯ）の凝集カーブに対する各化合物添加時のＡｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ（ＡＵＣ）の相対値を示すグラフである。１２種の化合物１から化合物１２のすべてが、ＰＤＰＮ誘導血小板凝集に対して阻害効果を有することが示された。
ヒト血小板の凝集に対する阻害効果について
ｉ）ＰＤＰＮ誘導血小板凝集に対する阻害効果
１２種の化合物１から化合物１２について、ＰＤＰＮ－ＣＨＯ細胞により惹起される血小板凝集に対する阻害効果を測定した。図２Ａ－Ｅは、血小板懸濁液の透過率（ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｃｙ（％））に示す。血小板凝集反応が起こると血小板懸濁液の透過率（％）が上昇する。ＰＤＰＮ－ＣＨＯ細胞添加後、ＤＭＳＯコントロールの透過率％は上昇しており、これは血小板凝集反応が起きていることを示す。１２種の化合物１から化合物１２のいずれかの存在下（５０μＭ）では、ＰＤＰＮ－ＣＨＯ細胞添加後も、透過率％は上昇しなかった（図２－１のＡ～Ｄ）。この結果は、１２種の化合物１から化合物１２が５０μＭにおいてＰＤＰＮ誘導血小板凝集を完全に抑制することを示す。対照薬Ｃａｎｇｒｅｌｏｒ（３．１２μＭ）の存在下でも、ＰＤＰＮ－ＣＨＯ細胞添加後に、透過率％は上昇しなかった（図２Ｅ）。図２－２のＦは、凝集抑制の度合いを示すため、各測定時におけるコントロール（ＤＭＳＯ）の凝集カーブに対する各化合物添加時のＡｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ（ＡＵＣ）の相対値を示すグラフである。１２種の化合物１から化合物１２のすべてが、ＰＤＰＮ誘導血小板凝集に対して阻害効果を有することが示された。
【0073】
さらに３つの化合物１、化合物５、化合物１１については、濃度６．２５μＭ、１２．５μＭおよび２５μＭ存在下での血小板懸濁液の透過率（％）を測定した。図３の結果から、少なくとも、化合物１、化合物５、化合物１１による、ＰＤＰＮ誘導血小板凝集に対する阻害効果は、濃度依存性を示すことがわかる。
【0074】
ｉｉ）抗ＣＬＥＣ－２抗体誘導血小板凝集に対する阻害効果
１２種の化合物１から化合物１２について、抗ＣＬＥＣ－２抗体によるＣＬＥＣ－２クラスター化により惹起される血小板凝集に対する阻害効果を測定した。図４Ａ－Ｅは、血小板懸濁液の透過率（ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｃｙ（％））に示す。ＣＬＥＣ－２抗体添加後、ＤＭＳＯコントロールの透過率％は上昇しており、これは血小板凝集反応が起きていることを示す。１２種の化合物１から化合物１２のいずれかの存在下（５０μＭ）でも、ＣＬＥＣ－２抗体添加後に、透過率％は上昇した（図４－１のＡ～Ｄ）。この結果は、１２種の化合物１から化合物１２が濃度５０μＭで、抗ＣＬＥＣ－２抗体誘導血小板凝集に対してほとんど抑制作用がないことを示す。対照薬Ｃａｎｇｒｅｌｏｒ（３．１２μＭ）の存在下では、抗ＣＬＥＣ－２抗体添加後に、透過率％は上昇せず、抗ＣＬＥＣ－２抗体誘導血小板凝集が抑制された（図４－２のＥ）。図４－２のＦは、凝集抑制の度合いを示すため、各測定時におけるコントロール（ＤＭＳＯ）の凝集カーブに対する各化合物添加時のＡｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ（ＡＵＣ）の相対値を示すグラフである。１２種の化合物１から化合物１２は、抗ＣＬＥＣ－２抗体誘導血小板凝集に対しては、Ｃａｎｇｒｅｌｏｒと異なり、ほとんど抑制作用がないことが示された。
１２種の化合物１から化合物１２について、抗ＣＬＥＣ－２抗体によるＣＬＥＣ－２クラスター化により惹起される血小板凝集に対する阻害効果を測定した。図４Ａ－Ｅは、血小板懸濁液の透過率（ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｃｙ（％））に示す。ＣＬＥＣ－２抗体添加後、ＤＭＳＯコントロールの透過率％は上昇しており、これは血小板凝集反応が起きていることを示す。１２種の化合物１から化合物１２のいずれかの存在下（５０μＭ）でも、ＣＬＥＣ－２抗体添加後に、透過率％は上昇した（図４－１のＡ～Ｄ）。この結果は、１２種の化合物１から化合物１２が濃度５０μＭで、抗ＣＬＥＣ－２抗体誘導血小板凝集に対してほとんど抑制作用がないことを示す。対照薬Ｃａｎｇｒｅｌｏｒ（３．１２μＭ）の存在下では、抗ＣＬＥＣ－２抗体添加後に、透過率％は上昇せず、抗ＣＬＥＣ－２抗体誘導血小板凝集が抑制された（図４－２のＥ）。図４－２のＦは、凝集抑制の度合いを示すため、各測定時におけるコントロール（ＤＭＳＯ）の凝集カーブに対する各化合物添加時のＡｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ（ＡＵＣ）の相対値を示すグラフである。１２種の化合物１から化合物１２は、抗ＣＬＥＣ－２抗体誘導血小板凝集に対しては、Ｃａｎｇｒｅｌｏｒと異なり、ほとんど抑制作用がないことが示された。
【0075】
ｉｉｉ）トロンビン誘導血小板凝集
１２種の化合物１から化合物１２について、トロンビンにより惹起される血小板凝集に対する阻害効果を測定した。１２種の化合物１から化合物１２のいずれかの存在下（５０μＭ）および対照薬Ｃａｎｇｒｅｌｏｒ（６．２５μＭ）の存在下でも、トロンビン添加後に、透過率％は上昇した（図５－１のＡ～Ｄ、および図５－２のＥ）。図５－２のＦは、凝集抑制の度合いを示すため、各測定時におけるコントロール（ＤＭＳＯ）の凝集カーブに対する各化合物添加時のＡｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ（ＡＵＣ）の相対値を示すグラフである。１２種の化合物１から化合物１２およびＣａｎｇｒｅｌｏｒは、トロンビン誘導血小板凝集に対しては、ほとんど抑制作用がないことが示された。
１２種の化合物１から化合物１２について、トロンビンにより惹起される血小板凝集に対する阻害効果を測定した。１２種の化合物１から化合物１２のいずれかの存在下（５０μＭ）および対照薬Ｃａｎｇｒｅｌｏｒ（６．２５μＭ）の存在下でも、トロンビン添加後に、透過率％は上昇した（図５－１のＡ～Ｄ、および図５－２のＥ）。図５－２のＦは、凝集抑制の度合いを示すため、各測定時におけるコントロール（ＤＭＳＯ）の凝集カーブに対する各化合物添加時のＡｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ（ＡＵＣ）の相対値を示すグラフである。１２種の化合物１から化合物１２およびＣａｎｇｒｅｌｏｒは、トロンビン誘導血小板凝集に対しては、ほとんど抑制作用がないことが示された。
【0076】
ｉｖ）ＡＤＰ誘導血小板凝集
１２種の化合物１から化合物１２について、ＡＤＰにより惹起される血小板凝集に対する阻害効果を測定した。ＡＤＰは、フィブリノーゲンと共に添加した。ＡＤＰは、損傷により活性化された血小板から連続的に進展する血小板凝集のカスケードの凝固メディエータの１つであり、活性化の過程で貯蔵顆粒から放出される。活性化された血小板の表面には、フィブリノーゲンや別の血小板が結合し、血小板同士が凝集する。しかし、本系のような洗浄血小板ではＡＤＰ刺激単独では凝集反応は起こらないため、通常フィブリノーゲンをともに添加する。
１２種の化合物１から化合物１２について、ＡＤＰにより惹起される血小板凝集に対する阻害効果を測定した。ＡＤＰは、フィブリノーゲンと共に添加した。ＡＤＰは、損傷により活性化された血小板から連続的に進展する血小板凝集のカスケードの凝固メディエータの１つであり、活性化の過程で貯蔵顆粒から放出される。活性化された血小板の表面には、フィブリノーゲンや別の血小板が結合し、血小板同士が凝集する。しかし、本系のような洗浄血小板ではＡＤＰ刺激単独では凝集反応は起こらないため、通常フィブリノーゲンをともに添加する。
【0077】
ＤＭＳＯコントロールの透過率％は、ＡＤＰ添加後数分で急上昇しており、これはＡＤＰにより血小板が活性化され血小板凝集反応が起きていることを示す（図６－１のＡ～Ｄ）。図６－１のＡ～Ｄの結果は、１２種の化合物１から化合物１２が濃度５０μＭで、ＡＤＰ誘導血小板凝集に対してほとんど抑制作用がないことを示す。対照薬Ｃａｎｇｒｅｌｏｒ（３．１μＭ）の存在下では、ＡＤＰ添加後に、透過率％は上昇せず、ＡＤＰ誘導血小板凝集が抑制された（図６－２のＥ）。図６－２のＦは、凝集抑制の度合いを示すため、各測定時におけるコントロール（ＤＭＳＯ）の凝集カーブに対する各化合物添加時のＡｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ（ＡＵＣ）の相対値を示すグラフである。１２種の化合物１から化合物１２は、ＡＤＰ誘導血小板凝集に対しては、Ｃａｎｇｒｅｌｏｒと異なり、抑制作用がないことが示された。
【0078】
ｖ）コラーゲン誘導血小板凝集
コラーゲン細胞添加後、ＤＭＳＯコントロールの透過率％は上昇しており、これはコラーゲン誘導血小板凝集反応が起きていることを示す。１２種の化合物１から化合物１２のいずれかの存在下（５０μＭ）では、コラーゲン細胞添加後、ＤＭＳＯコントロールと比較して、透過率％の上昇が、化合物により程度に違いがあるが、抑制されていた（図７－１のＡ～Ｄ、図７－２のＥ）。特に、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物１０、化合物１１、および化合物１２では、透過率％はほとんど上昇しなかった。この結果は、１２種の化合物１から化合物１２が５０μＭにおいてコラーゲン誘導血小板凝集を抑制することを示す。対照薬Ｃａｎｇｒｅｌｏｒ（３．１２μＭ）の存在下でも、コラーゲン添加後に、透過率％は上昇しなかった（図７－２のＦ）。図７－２のＧは、凝集抑制の度合いを示すため、各測定時におけるコントロール（ＤＭＳＯ）の凝集カーブに対する各化合物添加時のＡｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ（ＡＵＣ）の相対値を示すグラフである。１２種の化合物１から化合物１２のすべてが、コラーゲン誘導血小板凝集に対して阻害効果を有することが示された。
コラーゲン細胞添加後、ＤＭＳＯコントロールの透過率％は上昇しており、これはコラーゲン誘導血小板凝集反応が起きていることを示す。１２種の化合物１から化合物１２のいずれかの存在下（５０μＭ）では、コラーゲン細胞添加後、ＤＭＳＯコントロールと比較して、透過率％の上昇が、化合物により程度に違いがあるが、抑制されていた（図７－１のＡ～Ｄ、図７－２のＥ）。特に、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物１０、化合物１１、および化合物１２では、透過率％はほとんど上昇しなかった。この結果は、１２種の化合物１から化合物１２が５０μＭにおいてコラーゲン誘導血小板凝集を抑制することを示す。対照薬Ｃａｎｇｒｅｌｏｒ（３．１２μＭ）の存在下でも、コラーゲン添加後に、透過率％は上昇しなかった（図７－２のＦ）。図７－２のＧは、凝集抑制の度合いを示すため、各測定時におけるコントロール（ＤＭＳＯ）の凝集カーブに対する各化合物添加時のＡｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ（ＡＵＣ）の相対値を示すグラフである。１２種の化合物１から化合物１２のすべてが、コラーゲン誘導血小板凝集に対して阻害効果を有することが示された。
【0079】
さらに化合物１、化合物５、化合物１１については、濃度１２．５μＭ、２５μＭおよび５０μＭ存在下での血小板懸濁液の透過率（％）を測定した。図８の結果から、少なくとも、化合物１、化合物５、化合物１１による、コラーゲン誘導血小板凝集に対する阻害効果は、濃度依存性を示すことがわかる。３つの化合物の中では化合物１１に強い凝集抑制作用が見られる。
【0080】
Ｃａｎｇｒｅｌｏｒについて
対照薬Ｃａｎｇｒｅｌｏｒは、ＡＤＰ受容体の競合阻害剤である。Ｃａｎｇｒｅｌｏｒはトロンビン惹起の血小板凝集以外、すべての惹起剤での凝集を阻害した。それ故、出血リスク伴うことが懸念される。
対照薬Ｃａｎｇｒｅｌｏｒは、ＡＤＰ受容体の競合阻害剤である。Ｃａｎｇｒｅｌｏｒはトロンビン惹起の血小板凝集以外、すべての惹起剤での凝集を阻害した。それ故、出血リスク伴うことが懸念される。
【0081】
マウス血小板の凝集に対する阻害効果について
マウス血小板を用いて、１２種の化合物１から化合物１２について、ＰＤＰＮ誘導血小板凝集、トロンビン誘導血小板凝集、ＡＤＰ誘導血小板凝集、およびコラーゲン誘導血小板凝集に対する阻害効果を測定した。ヒト血小板を用いた場合と同様の結果が得られた（図９～１４）。ヒト血小板を用いた場合と比較して、マウス血小板ＰＤＰＮ誘導血小板凝集およびコラーゲン誘導血小板凝集に対する阻害効果が弱い場合があるが、これはＣＬＥＣ－２ならびにＧＰＶＩのアミノ酸配列がヒトとマウスで若干異なるため、化合物の結合がマウスタンパク質に対しては弱くなっている可能性がある。
マウス血小板を用いて、１２種の化合物１から化合物１２について、ＰＤＰＮ誘導血小板凝集、トロンビン誘導血小板凝集、ＡＤＰ誘導血小板凝集、およびコラーゲン誘導血小板凝集に対する阻害効果を測定した。ヒト血小板を用いた場合と同様の結果が得られた（図９～１４）。ヒト血小板を用いた場合と比較して、マウス血小板ＰＤＰＮ誘導血小板凝集およびコラーゲン誘導血小板凝集に対する阻害効果が弱い場合があるが、これはＣＬＥＣ－２ならびにＧＰＶＩのアミノ酸配列がヒトとマウスで若干異なるため、化合物の結合がマウスタンパク質に対しては弱くなっている可能性がある。
【0082】
実施例３
ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ 化合物ドッキングシミュレーション
コラーゲン受容体であるＧＰＶＩのＣＲＰ（コラーゲン関連ペプチド）結合部位に対して演算機上（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）で化合物５および化合物１１をドッキングさせるドッキングシミュレーションを行った。
ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ 化合物ドッキングシミュレーション
コラーゲン受容体であるＧＰＶＩのＣＲＰ（コラーゲン関連ペプチド）結合部位に対して演算機上（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）で化合物５および化合物１１をドッキングさせるドッキングシミュレーションを行った。
【0083】
このドッキングシミュレーションにより、化合物５および化合物１１のそれぞれについてＧＰＶＩのコラーゲン結合部位への結合のしやすさ、阻害形式を判別することができる。
化合物のドッキング対象であるＧＰＶＩの３次元構造は蛋白質構造データバンク（プロテインデータバンク：http://pdbj.org/）から取得した（ＧＰＶＩ、ＰＤＢ ＩＤ：５ＯＵ９）。ドッキングシミュレーションには、ＡＳＥＤｏｃｋ（Goto, J.; Kataoka, R.; Muta, H.; Hirayama, N. “ASEDock-docking based on alpha spheres and excluded volumes” J Chem Inf Model.,2008, 48(3), 583-590.）を用いた。
化合物のドッキング対象であるＧＰＶＩの３次元構造は蛋白質構造データバンク（プロテインデータバンク：http://pdbj.org/）から取得した（ＧＰＶＩ、ＰＤＢ ＩＤ：５ＯＵ９）。ドッキングシミュレーションには、ＡＳＥＤｏｃｋ（Goto, J.; Kataoka, R.; Muta, H.; Hirayama, N. “ASEDock-docking based on alpha spheres and excluded volumes” J Chem Inf Model.,2008, 48(3), 583-590.）を用いた。
【0084】
(結果)
ドッキングシミュレーションから、ＧＰＶＩのＣＲＰ結合予測部位に、化合物５および化合物１１のそれぞれが結合しやすいことが示された。阻害形式は、競合阻害である。ドッキングシミュレーションから求められる相互作用の強さは、結合自由エネルギーに相当するＧＢＶＩ／ＷＳＡ ｄＧ（Corbeil, C. R.; Williams,C. I.; Labute, P. Variability in docking success rates due to dataset preparation. J. Comput.-Aided Mol. Des. 2012, 26, 775-786.）で評価した。化合物５および１１のＧＢＶＩ／ＷＳＡ ｄＧ値は各々－７．９４７および－８．００７ｋｃａｌ／ｍｏｌであり、両化合物ともＧＰＶＩのＣＲＰ結合予測部位に結合しやすいことが示された。
ドッキングシミュレーションから、ＧＰＶＩのＣＲＰ結合予測部位に、化合物５および化合物１１のそれぞれが結合しやすいことが示された。阻害形式は、競合阻害である。ドッキングシミュレーションから求められる相互作用の強さは、結合自由エネルギーに相当するＧＢＶＩ／ＷＳＡ ｄＧ（Corbeil, C. R.; Williams,C. I.; Labute, P. Variability in docking success rates due to dataset preparation. J. Comput.-Aided Mol. Des. 2012, 26, 775-786.）で評価した。化合物５および１１のＧＢＶＩ／ＷＳＡ ｄＧ値は各々－７．９４７および－８．００７ｋｃａｌ／ｍｏｌであり、両化合物ともＧＰＶＩのＣＲＰ結合予測部位に結合しやすいことが示された。
【0085】
実施例４
血小板の形態
実施例２で調製したマウスの洗浄血小板（１×１０９／ｍＬ）に、化合物５（５０μＭ）またはＤＭＳＯ（コントロール）の存在下、ＰＤＰＮ－ＣＨＯ細胞（２×１０６／ｍＬ）またはコラーゲン（２μｇ／ｍＬ）を添加して、血小板の形態を走査型電子顕微鏡（株式会社日本電子ＪＳＭ－６５１０ＬＶ）で観察した。
血小板の形態
実施例２で調製したマウスの洗浄血小板（１×１０９／ｍＬ）に、化合物５（５０μＭ）またはＤＭＳＯ（コントロール）の存在下、ＰＤＰＮ－ＣＨＯ細胞（２×１０６／ｍＬ）またはコラーゲン（２μｇ／ｍＬ）を添加して、血小板の形態を走査型電子顕微鏡（株式会社日本電子ＪＳＭ－６５１０ＬＶ）で観察した。
【0086】
図１６は、血小板の電顕像である。血小板は、正常時、凹凸のない滑らかな表面を有する（ｕｎｔｒｅａｔｅｄ）。ＰＤＰＮで処理された血小板は、多数の長い突起を出している（ＰＤＰＮ＋ＤＭＳＯ）。これは、ＰＤＰＮにより血小板が活性化された状態である。一方、化合物５の存在下でＰＤＰＮで処理された血小板（ＰＤＰＮ＋化合物５）は、非処理の血小板（ｕｎｔｒｅａｔｅｄ）と変わらず、突起を出していない。すなわち、血小板凝集抑制が活性化抑制に基づくことを示す。
【0087】
コラーゲンで処理された血小板は、多数の長い突起を出している（コラーゲン＋ＤＭＳＯ）。これは、コラーゲンにより血小板が活性化された状態である。一方、化合物５の存在下でコラーゲンで処理された血小板（コラーゲン＋化合物５）は、非処理の血小板（ｕｎｔｒｅａｔｅｄ）と変わらず、突起を出していない。
【0088】
これらの結果から、本発明のＣＬＥＣ－２／ＧＰＶＩデュアル阻害剤は、化合物５を例として、ＰＤＰＮ惹起およびコラーゲン惹起による血小板の活性化を抑制することにより、凝集を抑制することが確認された。
【配列表フリーテキスト】
【0089】
配列番号１から４：プライマー
【図1A】
【図1B】
【図1C-1】
【図1C-2】
【図1C-3】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【図7-1】
【図7-2】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図12-1】
【図12-2】
【図13-1】
【図13-2】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】