ホーム > 特許ランキング > 株式会社ＣＰコスメティクス
▶ 株式会社ＣＰコスメティクスの特許一覧 ▶ 株式会社スタイリングライフ・ホールディングスの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023125375
(43)【公開日】2023-09-07
(54)【発明の名称】ＣＤ３９発現促進剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7032 20060101AFI20230831BHJP
A61K 8/60 20060101ALI20230831BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230831BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230831BHJP
A61Q 19/08 20060101ALI20230831BHJP
A61K 31/047 20060101ALI20230831BHJP
A61K 31/7028 20060101ALI20230831BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230831BHJP
A61K 8/34 20060101ALI20230831BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20230831BHJP
C07H 15/18 20060101ALI20230831BHJP
A23L 33/125 20160101ALN20230831BHJP
A23L 33/105 20160101ALN20230831BHJP
C12N 5/071 20100101ALN20230831BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20230831BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7032
A61K8/60
A61P29/00
A61P43/00 105
A61Q19/08
A61K31/047
A61K31/7028
A61P43/00 111
A61P17/00
A61K8/34
A61Q19/00
C07H15/18
A23L33/125 ZNA
A23L33/105
C12N5/071
C12N15/09 Z
【審査請求】有
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022029423
(22)【出願日】2022-02-28
(11)【特許番号】
(45)【特許公報発行日】2023-08-15
(71)【出願人】
【識別番号】511032637
【氏名又は名称】株式会社ＣＰコスメティクス
(71)【出願人】
【識別番号】510200369
【氏名又は名称】株式会社スタイリングライフ・ホールディングス
(74)【代理人】
【識別番号】100205914
【弁理士】
【氏名又は名称】堀越 総明
(74)【代理人】
【識別番号】100162189
【弁理士】
【氏名又は名称】堀越 真弓
(72)【発明者】
【氏名】粂田 麻由
(72)【発明者】
【氏名】原 卓也
(72)【発明者】
【氏名】橋本 仁志
(72)【発明者】
【氏名】谷 孝二
(72)【発明者】
【氏名】川野 仁
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 光将
(72)【発明者】
【氏名】鎌田 昂
【テーマコード（参考）】
4B018
4B065
4C057
4C083
4C086
4C206
【Ｆターム（参考）】
4B018MD08
4B018MD27
4B018MD48
4B018ME07
4B018MF01
4B018MF10
4B065AA90X
4B065AC14
4B065BB06
4B065BB14
4B065BB26
4B065CA24
4B065CA41
4B065CA44
4B065CA50
4C057AA06
4C057BB02
4C057DD01
4C057JJ19
4C083AD391
4C083AD392
4C083AD531
4C083AD532
4C083BB51
4C083CC02
4C083EE13
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086EA07
4C086GA16
4C086GA17
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA63
4C086NA14
4C086ZA89
4C086ZB11
4C086ZC41
4C206AA01
4C206AA02
4C206AA03
4C206CA14
4C206KA04
4C206KA17
4C206KA18
4C206MA01
4C206MA04
4C206MA83
4C206NA14
4C206ZA89
4C206ZB11
4C206ZC41
(57)【要約】
【課題】ダルマギク中に含まれる、優れたＣＤ３９発現促進作用をもつ有効成分を明らかにし、その有効成分を含むＣＤ３９発現促進剤を提供すること。
【解決手段】本発明の皮膚ランゲルハンス細胞におけるＣＤ３９発現促進剤は、二環式ジテルペン骨格を有する化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有し、二環式ジテルペン骨格を有する化合物が、スクラレオール、スクラレオール配糖体及びイソマノオール配糖体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である。
【選択図】なし
【解決手段】本発明の皮膚ランゲルハンス細胞におけるＣＤ３９発現促進剤は、二環式ジテルペン骨格を有する化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有し、二環式ジテルペン骨格を有する化合物が、スクラレオール、スクラレオール配糖体及びイソマノオール配糖体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
二環式ジテルペン骨格を有する化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有し、
前記二環式ジテルペン骨格を有する化合物が、スクラレオール、スクラレオール配糖体及びイソマノオール配糖体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物であることを特徴とする皮膚ランゲルハンス細胞におけるＣＤ３９発現促進剤。
前記二環式ジテルペン骨格を有する化合物が、スクラレオール、スクラレオール配糖体及びイソマノオール配糖体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物であることを特徴とする皮膚ランゲルハンス細胞におけるＣＤ３９発現促進剤。
【請求項2】
前記スクラレオール配糖体を構成する糖が、６－デオキシイドース、フコース又はこれらの誘導体であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚ランゲルハンス細胞におけるＣＤ３９発現促進剤。
【請求項3】
前記スクラレオール配糖体が、下記式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表される化合物であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚ランゲルハンス細胞におけるＣＤ３９発現促進剤。
（式中、Ｒ１は水素原子又はアセチル基を示す。）
（式中、Ｒ２は水素原子又はアセチル基を示す。）
【化1】
【化2】
【請求項4】
前記イソマノオール配糖体を構成する糖が、６－デオキシイドース、フコース又はこれらの誘導体であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚ランゲルハンス細胞におけるＣＤ３９発現促進剤。
【請求項5】
前記イソマノオール配糖体が、下記式（ＩＩＩ）又は式（ＩＶ）で表される化合物であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚ランゲルハンス細胞におけるＣＤ３９発現促進剤。
（式中、Ｒ３は水素原子又はアセチル基を示す。）
（式中、Ｒ４は水素原子又はアセチル基を示す。）
【化3】
【化4】
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項に記載のＣＤ３９発現促進剤を有効成分として含有する皮膚ランゲルハンス細胞におけるＣＤ３９発現促進用皮膚外用剤。
【請求項7】
請求項１～５のいずれか１項に記載のＣＤ３９発現促進剤を有効成分として含有する皮膚ランゲルハンス細胞におけるＣＤ３９発現促進用化粧料。
【請求項8】
請求項１～５のいずれか１項に記載のＣＤ３９発現促進剤を含有する皮膚ランゲルハンス細胞におけるＣＤ３９発現促進用飲食品。
【請求項9】
請求項１～５のいずれか１項に記載のＣＤ３９発現促進剤を含むことを特徴とする細胞外ＡＴＰにより生じる炎症抑制剤。
【請求項10】
下記式（Ｖ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物。
【化5】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はＣＤ３９発現促進剤に関し、特に、皮膚のランゲルハンス細胞に発現しており、皮膚免疫応答に関与すると共に、細胞外ＡＴＰに由来する炎症抑制に関与するＣＤ３９の発現を促進することができるＣＤ３９発現促進剤に関する。
【背景技術】
【0002】
ＣＤ３９は、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１、ＮＴＰＤａｓｅ１としても知られる膜タンパク質であり、細胞外表面に触媒作用部位を有し、ＡＴＰやＡＤＰをＡＭＰに加水分解するエクトヌクレオチダーゼである。ＣＤ３９はＢ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞及び血管内皮細胞等に発現しており、細胞外ＡＴＰ・ＡＤＰを分解することによって、炎症反応の抑制や血小板機能の活性化等に関与している。
【0003】
細胞が物理的又は化学的な外部刺激を受けると、細胞外ＡＴＰが分泌され、アラームシグナル伝達物質となることが知られている。この細胞外ＡＴＰの放出量は加齢と共に増大する。そして、細胞外ＡＴＰが老化細胞を刺激すると、炎症性サイトカイン、ケモカイン及びプロテアーゼを主成分とする様々な分泌因子を高発現するＳＡＳＰと呼ばれる現象（ＳＡＳＰ：senescence-associated secretory phenotype）が生じ、周囲の組織に炎症を引き起こす。ＳＡＳＰ因子の一部は、老化した細胞周期の停止を強化する等の生体にとって有益な作用を有するが、他のＳＡＳＰ因子は炎症及び腫瘍形成の促進に関連しており、慢性炎症やがん等の様々な疾患の発症に関与することが報告されている（非特許文献１）。それゆえ、細胞外ＡＴＰを分解することにより細胞外ＡＴＰの蓄積を防ぎ、ＳＡＳＰを抑制する、というＣＤ３９の機能が注目されている。
【0004】
他方、皮膚は表皮、真皮及び皮下組織から構成されている。このうち、皮膚バリア機能を担う皮膚の最外層である表皮は、主に角化細胞（ケラチノサイト）又はこの角化細胞が変化した細胞から構成され、外側から角質層、顆粒細胞層、有棘細胞層及び基底細胞層の順に構成されている。表皮は機械的、物理的又は化学的な外力や異物の侵入から体内を保護する機能を有するところ、角質化されて厚く積み重なった角質層のみがバリアとして機能するのではなく、表皮に特異的に存在する免疫細胞が外部から侵入する異物を排除することで、そのバリア機能を確実なものとしている。代表的な皮膚免疫細胞として、表皮の有棘細胞層に存在するランゲルハンス細胞が挙げられる。ランゲルハンス細胞は樹状細胞であり、角質層を通過した外来抗原を補足すると特定のリンパ節に移動してＴ細胞に抗原提示を行い、Ｔ細胞を活性化させる。活性化したＴ細胞は皮膚に移行し、抗原を認識するとサイトカインを産生して細菌等の異物を殺傷する。その一方で、外来抗原を感知しない定常状態では、ランゲルハンス細胞は免疫寛容の誘導にも関与している。
【0005】
この表皮ランゲルハンス細胞には、上述したＣＤ３９が発現しており、それゆえ、このＣＤ３９によるＡＴＰａｓｅ活性はランゲルハンス細胞のマーカーとして用いられてきた。ケラチノサイトは、剪断力や伸縮等の物理的刺激及び化学的刺激によって細胞外ＡＴＰを放出するところ、放出された細胞外ＡＴＰはシグナル伝達物質となり、アポトーシスや皮膚の炎症を引き起こす。そこで、ＣＤ３９を発現するランゲルハンス細胞は、細胞外ＡＴＰが蓄積しないように、ＣＤ３９により細胞外ＡＴＰを分解することで、炎症反応の抑制及び免疫応答機能の調節を行っている（非特許文献２）。また、亜鉛摂取量が不足することによりランゲルハンス細胞の数が減少すると、ＣＤ３９も減少して細胞外ＡＴＰの分解が十分になされなくなり、細胞外ＡＴＰが蓄積して皮膚の炎症が生じることが報告されている（非特許文献３）。
【0006】
そこで、炎症の抑制及びＳＡＳＰ等による過剰免疫応答の抑制を図るために、ＣＤ３９の発現量を増加させること、又はランゲルハンス細胞の減少抑制若しくは活性化についての研究が進められている。特許文献１では、ＣＤ３９遺伝子発現促進剤として、カルボキシメチル・ベータグルカン・ナトリウム、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）／ポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）ランダム共重合体ジメチルエーテル及びローズ水の３成分を含むＣＤ３９遺伝子発現促進剤が提案されている。また、特許文献２では、クジン、エンジュ、オウバク、カンゾウ、シコン、テンチャ又はトウキから選択される植物抽出物を有効成分とするランゲルハンス細胞減少抑制剤が提案され、特許文献３では、アミガサタケ由来のノイラミン酸誘導体がランゲルハンス細胞活性化作用を呈することが記載されている。
【0007】
さらに、本願の出願人らによる特許文献４では、ダルマギク（Ａｓｔｅｒ ｓｐａｔｈｕｌｉｆｏｌｉｕｓ）抽出物に皮膚ランゲルハンス細胞におけるＣＤ３９発現促進作用があることが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】特表２０１７－５１１７９０号公報
【特許文献2】特開２０００－２３９１４４号公報
【特許文献3】特開２０１７－１４００００号公報
【特許文献4】特許第６８８７６４９号公報
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Shin Yoshimoto et al., “Obesity-induced gut microbial metabolite promotes liver cancer through senescence secretome”, Nature, Vol. 499, 2013年, p.97-101
【非特許文献2】Norikatsu Mizumoto et al., “CD39 is the dominant Langerhans cell-associated ecto-NTPDase: Modulatory roles in inflammation and immune responsiveness”, Nature Medicine, Vol. 8, No. 4, 2002年, p.358-365
【非特許文献3】Tatsuyoshi Kawamura et al., “Severe dermatitis with loss of epidermal Langerhans cells in human and mouse zinc deficiency”, The Journal of Clinical Investigation, Vol. 122, No. 2, 2012年, p.722-732
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
しかしながら、特許文献１で報告されたＣＤ３９遺伝子発現促進剤には、化学合成により製造された成分が含まれており、それゆえ、人体に対して高い安全性を有する天然由来成分からなるＣＤ３９遺伝子発現促進剤が依然として期待されている。また、特許文献２、３には、それぞれランゲルハンス細胞の減少抑制作用又は活性化作用を有する特定の植物抽出物が記載されているものの、ＣＤ３９の発現促進に関する作用は検討されていない。
【0011】
そして、特許文献４には、皮膚ランゲルハンス細胞におけるＣＤ３９発現促進剤としてダルマギク抽出物を用いることが記載されているが、ＣＤ３９発現促進作用に関する効果確認は、一般的に生体内に比べて反応条件が整えられた条件にて行われているところ、ダルマギク抽出物を細胞培養液に０．１～０．２％（すなわち、１０００～２０００ｐｐｍ）という添加割合で添加した場合にＣＤ３９発現促進作用がみられたことが報告されている。よって、このダルマギク抽出物をＣＤ３９発現促進剤として使用するにあたっては、パーセントオーダーで用いる必要があると推察される。
【0012】
また、特許文献４で開示されたダルマギク抽出物は、複数の成分が含まれる混合物であり、ＣＤ３９発現促進剤としての有効成分が具体的に何であるのかは示されていない。
【0013】
したがって、本発明は上述した点に鑑みてなされたもので、その目的は、ダルマギク中に含まれる、優れたＣＤ３９発現促進作用をもつ有効成分を特定し、その有効成分を含むＣＤ３９発現促進剤を提供することにある。
【0014】
また、本発明の他の目的は、新規なＣＤ３９発現促進剤を有効成分として含む皮膚外用剤、化粧料及び飲食品を提供することにある。
【0015】
また、本発明の他の目的は、新規なＣＤ３９発現促進剤を含む細胞外ＡＴＰにより生じる炎症抑制剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0016】
上記課題を解決するため、本発明者らは、ダルマギク抽出物に種々の分画処理を施し、得られた分画物を検討した結果、優れたＣＤ３９発現促進作用を有する二環式ジテルペン化合物を特定した。この知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【0017】
すなわち、本発明の皮膚ランゲルハンス細胞におけるＣＤ３９発現促進剤は、二環式ジテルペン骨格を有する化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有し、この二環式ジテルペン骨格を有する化合物が、スクラレオール、スクラレオール配糖体及びイソマノオール配糖体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である。二環式ジテルペン骨格を有する化合物である、スクラレオール、スクラレオール配糖体又はイソマノオール配糖体を投与することにより、対象細胞でのＣＤ３９発現が促進され、ＣＤ３９を増加させることができる。それゆえ、外部刺激や加齢などによって放出された細胞外ＡＴＰの分解が促進され、炎症及びＳＡＳＰ等による過剰免疫応答が抑制される。
【0018】
また、本発明の皮膚ランゲルハンス細胞におけるＣＤ３９発現促進剤は、上述したスクラレオール配糖体を構成する糖が、６－デオキシイドース、フコース又はこれらの誘導体であることも好ましい。これにより、好適なスクラレオール配糖体を構成する糖が選択される。
【0019】
また、本発明の皮膚ランゲルハンス細胞におけるＣＤ３９発現促進剤は、上述したスクラレオール配糖体が下記式（Ｉ）（式中、Ｒ１は水素原子又はアセチル基を示す。）又は式（ＩＩ）（式中、Ｒ２は水素原子又はアセチル基を示す。）で表される化合物であることも好ましい。これにより、ＣＤ３９発現促進剤として好適なスクラレオール配糖体が選択される。
【0020】
【化1】
【0021】
【化2】
【0022】
また、本発明の皮膚ランゲルハンス細胞におけるＣＤ３９発現促進剤は、上述したイソマノオール配糖体を構成する糖が、６－デオキシイドース、フコース又はこれらの誘導体であることも好ましい。これにより、好適なイソマノオール配糖体を構成する糖が選択される。
【0023】
また、本発明の皮膚ランゲルハンス細胞におけるＣＤ３９発現促進剤は、上述したイソマノオール配糖体が、下記式（ＩＩＩ）（式中、Ｒ３は水素原子又はアセチル基を示す。）又は式（ＩＶ）（式中、Ｒ４は水素原子又はアセチル基を示す。）で表される化合物であることも好ましい。これにより、ＣＤ３９発現促進剤として好適なイソマノオール配糖体が選択される。
【0024】
【化3】
【0025】
【化4】
【0026】
また、本発明の皮膚ランゲルハンス細胞におけるＣＤ３９発現促進用皮膚外用剤、ＣＤ３９発現促進用化粧料及びＣＤ３９発現促進用飲食品は、上述した二環式ジテルペン骨格を有する化合物等からなるＣＤ３９発現促進剤を有効成分として含有する。これにより、皮膚等の炎症の抑制及び過剰免疫応答の抑制を図ることのできる皮膚外用剤、化粧料及び飲食品が得られる。
【0027】
また、本発明の細胞外ＡＴＰにより生じる炎症抑制剤は、上述した二環式ジテルペン骨格を有する化合物等からなるＣＤ３９発現促進剤を含有する。上述した二環式ジテルペン骨格を有する化合物を投与することにより、対象細胞でのＣＤ３９発現が促進されてＣＤ３９が増加するため、細胞外ＡＴＰが十分に分解され、細胞外ＡＴＰに起因する炎症を抑制することができる。
【0028】
また、本発明は、下記式（Ｖ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物である。式（Ｖ）で表される化合物は、ダルマギク抽出物から分離、精製された新規スクラレオール配糖体であり、優れたＣＤ３９発現促進作用を有する。
【0029】
【化5】
【発明の効果】
【0030】
本発明によれば、以下のような優れた効果を有するＣＤ３９発現促進剤、皮膚外用剤、化粧料、飲食品及び細胞外ＡＴＰにより生じる炎症抑制剤を提供することができる。
（１）少ない投与量で対象細胞でのＣＤ３９発現を亢進させることができる。
（２）発現促進されたＣＤ３９によって細胞外ＡＴＰが十分に分解されるため、細胞外ＡＴＰに起因する炎症反応が抑制される。
（３）食用可能なダルマギクの抽出物から分離、精製された成分を有効成分とするものであるため、人体に対する安全性が高い。
（４）皮膚炎症の抑制作用及び過剰免疫応答の抑制作用を有する皮膚外用剤、化粧料及び飲食品が得られる。
（１）少ない投与量で対象細胞でのＣＤ３９発現を亢進させることができる。
（２）発現促進されたＣＤ３９によって細胞外ＡＴＰが十分に分解されるため、細胞外ＡＴＰに起因する炎症反応が抑制される。
（３）食用可能なダルマギクの抽出物から分離、精製された成分を有効成分とするものであるため、人体に対する安全性が高い。
（４）皮膚炎症の抑制作用及び過剰免疫応答の抑制作用を有する皮膚外用剤、化粧料及び飲食品が得られる。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図1】実施例１における、ダルマギク抽出物からシリカゲルカラムクロマトグラフィーによる分画物Ｆｒ．１～６を調製する方法を概略的に示すフローチャートである。
【図2】実施例２における、Ｆｒ．２から化合物ｃ及びｂを単離する方法を概略的に示すフローチャートである。
【図3】実施例２における、Ｆｒ．４から化合物ｅ、ａ及びｄを単離する方法を概略的に示すフローチャートである。
【図4】実施例２における、Ｆｒ．５から化合物ｆ、ｉ及びｇを単離する方法を概略的に示すフローチャートである。
【図5】実施例２における、Ｆｒ．６から化合物ｈを単離する方法を概略的に示すフローチャートである。
【図6】化合物ａの（ａ）１Ｈ－ＮＭＲスペクトル及び（ｂ）１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図7】化合物ｂの（ａ）１Ｈ－ＮＭＲスペクトル及び（ｂ）１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図8】化合物ｃの（ａ）１Ｈ－ＮＭＲスペクトル及び（ｂ）１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図9】化合物ｄの（ａ）１Ｈ－ＮＭＲスペクトル及び（ｂ）１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図10】化合物ｅの（ａ）１Ｈ－ＮＭＲスペクトル及び（ｂ）１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図11】化合物ｆの（ａ）１Ｈ－ＮＭＲスペクトル及び（ｂ）１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図12】化合物ｇの（ａ）１Ｈ－ＮＭＲスペクトル及び（ｂ）１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図13】化合物ｈの（ａ）１Ｈ－ＮＭＲスペクトル及び（ｂ）１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図14】化合物ｉの（ａ）１Ｈ－ＮＭＲスペクトル及び（ｂ）１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図15】実施例４における、化合物ａ～ｃをそれぞれ添加したＴＨＰ－１細胞のＣＤ３９発現レベルを示すグラフである。
【図16】実施例４における、化合物ｄ～ｆをそれぞれ添加したＴＨＰ－１細胞のＣＤ３９発現レベルを示すグラフである。
【図17】実施例４における、化合物ｇ～ｉをそれぞれ添加したＴＨＰ－１細胞のＣＤ３９発現レベルを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0032】
以下、本発明の二環式ジテルペン骨格を有する化合物であるスクラレオール、スクラレオール配糖体又はイソマノオール配糖体を含有するＣＤ３９発現促進剤、これを含むＣＤ３９発現促進用の皮膚外用剤、化粧料及び飲食品、並びに細胞外ＡＴＰにより生じる炎症抑制剤について説明する。
【0033】
本発明におけるＣＤ３９とは、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１（Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1）、ＥＮＴＰＤ１又はＮＴＰＤａｓｅ１等と呼ばれ、基質として主にＡＴＰ・ＡＤＰをＡＭＰに分解するエクトヌクレオチダーゼである。ＣＤ３９はそのＮ末端とＣ末端に膜貫通ドメインを有する膜タンパク質であり、細胞外表面に触媒作用部位を有している。ＣＤ３９はＢ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞及び血管内皮細胞等に発現しており、皮膚を構成する細胞では、ランゲルハンス細胞の他、メラノサイトにも発現する。
【0034】
本発明におけるＣＤ３９発現促進とは、ＣＤ３９遺伝子の発現促進又はＣＤ３９（タンパク質）の発現促進のことをいい、本発明のＣＤ３９発現促進剤を添加又は投与されない状態のコントロールと比較して、ＣＤ３９遺伝子又はＣＤ３９（タンパク質）の発現が亢進していることを意味する。より具体的には、ＣＤ３９遺伝子の発現レベルがコントロールの１．２倍以上であることが好ましく、１．４倍以上であることがより好ましく、さらには１．６倍以上であることが好ましく、１．８倍以上であることが特に好ましい。ＣＤ３９遺伝子の発現レベルは、例えば、リアルタイムＰＣＲ（ＱＰＣＲ）やマイクロアレイ等の公知の方法で測定でき、ＣＤ３９の発現レベルは、例えば、免疫染色、ウエスタンブロッティング等の公知の方法で測定され得る。
【0035】
本発明のＣＤ３９発現促進剤には有効成分として、二環式ジテルペン骨格を有する化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物が含まれる。この二環式ジテルペン骨格を有する化合物としては、下記化学式で示されるスクラレオールのほか、スクラレオール配糖体又はイソマノオール配糖体が挙げられる。本発明に係る二環式ジテルペン骨格を有する化合物は塩であってもよく、薬理学的に許容される塩であることが好ましい。この化合物の薬理学的に許容される塩としては、酸又は塩基と形成される塩であればよく、特に限定されない。また、この化合物又はその塩は、溶媒和物であってもよく、特に限定されないが、例えば、水和物、エタノール等の有機溶媒和物が挙げられる。
【0036】
以下の化学式で示されるスクラレオールは、二環式ジテルペンアルコールに分類される化合物であり、シソ科植物のクラリセージ（Ｓａｌｖｉａ ｓｃｌａｒｅａ）に含まれていることが知られている。今回、本発明者らは、ダルマギク抽出物から分画された分画物からこのスクラレオールを単離すると共に、このスクラレオールがＣＤ３９発現促進作用を有することを見出した。
【0037】
【化6】
【0038】
同様に、本発明者らは、ダルマギク抽出物から分画された分画物からスクラレオール配糖体を単離すると共に、スクラレオール配糖体がＣＤ３９発現促進作用を有することを見出した。スクラレオール配糖体を構成する糖成分としては、６－デオキシイドース、フコース（６－デオキシガラクトース）又はこれらの誘導体が挙げられる。このうち、以下式（Ｉ）で示されるＬ－６－デオキシイドース、式（ＩＩ）で示されるＤ－フコースが好適に用いられる。また、下記式（Ｉ）のうち、Ｒ１で示される原子としては水素原子が好ましく、分子としては、アセチル基が好ましい。他方、下記式（ＩＩ）のうち、Ｒ２で示される原子としては水素原子が好ましく、分子としては、アセチル基が好ましい。
【0039】
【化7】
【0040】
【化8】
【0041】
この式（Ｉ）で表される化合物のうち、下記式（Ｖ）に示すスクラレオール配糖体が今回、新規化合物として発見された。
【0042】
【化9】
【0043】
さらに、本発明者らは、ダルマギク抽出物から分画された分画物からイソマノオール配糖体を単離すると共に、イソマノオール配糖体がＣＤ３９発現促進作用を有することを見出した。なお、後述する実施例４で示すように、イソマノオール配糖体のアグリコンであるイソマノオールそれ自体には、ＣＤ３９発現促進作用は確認されなかった。イソマノオール配糖体を構成する糖成分としては、６－デオキシイドース、フコース（６－デオキシガラクトース）又はこれらの誘導体が挙げられる。このうち、以下式（ＩＩＩ）で示されるＬ－６－デオキシイドース、式（ＩＶ）で示されるＤ－フコースが好適に用いられる。また、下記式（ＩＩＩ）のうち、Ｒ３で示される原子としては水素原子が好ましく、分子としては、アセチル基が好ましい。他方、下記式（ＩＶ）のうち、Ｒ４で示される原子としては水素原子が好ましく、分子としては、アセチル基が好ましい。
【0044】
【化10】
【0045】
【化11】
【0046】
上述した化合物、すなわち、スクラレオール、スクラレオール配糖体及びイソマノオール配糖体は、いずれもダルマギクの植物体から単離・精製することにより得ることができる。本発明で用いられるダルマギクとは、学名をＡｓｔｅｒ ｓｐａｔｈｕｌｉｆｏｌｉｕｓといい、キク科シオン属の植物である。海岸の岩場等に見られ、日本の本州西部及び九州地方、朝鮮半島などに分布するほか、園芸的にも栽培されている。本発明においては、産地や栽培環境は特に限定されず、あらゆる産地及び栽培環境のダルマギクを用いることができる。
【0047】
上述した化合物のダルマギク植物体からの分離方法について説明する。まず、ダルマギクの植物体から抽出物を得る。ダルマギクの植物体としては、全草を用いるほか、ダルマギクの花部、葉部、茎部、根部、幼芽及び種子等のうちの１つ又は複数の部位を選択して用いることも可能であり、特に花部、葉部又は茎部を用いることが好ましい。抽出処理は、採取された生の状態のダルマギクの植物体、又は乾燥処理が施された乾燥状態の植物体に対して行われるが、抽出効率の向上を図るため、又は取り扱いを容易とするために種々の前処理が施された植物体に対して抽出処理を施すことも可能である。前処理としては、特に限定されないが、乾燥処理、破砕処理又は粉砕処理等が挙げられ、これら前処理が施されたダルマギクの植物体に抽出処理を施し、ダルマギク抽出物を得てもよい。
【0048】
抽出溶媒としては、水、メチルアルコール、エチルアルコール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール又は２－ブタノール等の低級１価アルコール、及びグリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール又は１，３－ブチレングリコール等の液状多価アルコール等を含む溶媒が挙げられ、これらの一種または二種以上を組合わせた混合溶媒を用いることも可能である。このうち、人体への安全性及び抽出効率等の観点から、抽出溶媒としては、含水アルコールが好適に用いられ、アルコールとしては、エチルアルコールが好適に選択される。抽出溶媒として含水アルコールを選択した際のアルコール濃度としては、１～９５ｗ／ｗ％が好ましく、２０～９５ｗ／ｗ％がより好ましく、４０～９０ｗ／ｗ％が特に好ましい。また、抽出溶媒には、ダルマギクからの有用成分の抽出を妨げない範囲において、他の成分を含有させることも可能である。
【0049】
ダルマギクからの抽出方法としては、抽出溶媒にダルマギクの植物体を加えて浸漬させ、抽出を行う。例えば、ダルマギクの植物体を含水率１０％未満の乾燥破砕物とした場合には、植物体１重量部に対し、抽出溶媒を２～１００重量部用いることが好ましく、２～５０重量部用いることがより好ましく、３～３０重量部用いることが特に好ましい。また、抽出方法としては、室温（１～３０℃）での抽出、加温抽出、熱水抽出、加圧熱水抽出又は亜臨界抽出等のいずれの方法でも行うことが可能である。一例として、含水アルコールを用いた場合には１～３０℃の室温下、好ましくは１０～３０℃、より好ましくは２０～３０℃で抽出することができる。また、抽出時間は、抽出方法、植物体の状態、抽出溶媒の種類又は抽出温度等に応じて種々設定されるが、含水アルコールを用いて室温での抽出を行う場合には、１時間～２週間程度とすることが好ましく、１日～１０日間程度とすることがより好ましく、２日～８日間程度とすることが特に好ましい。上述した抽出処理後、残渣をデカンテーション、遠心分離又はろ過等により取り除くことによりダルマギク抽出物が得られる。得られた抽出物には減圧蒸留等の処理を施すことにより、濃縮液や固形物としたものも含まれる。
【0050】
上述のようにして得られたダルマギク抽出物に対し、酢酸エチルと水とで二層分配を行う。二層分配は複数行うことが好ましい。二層分配の回数は２～１０回程度が好ましく、４～５回程度が特に好ましい。この溶媒抽出操作により回収された酢酸エチル画分に本発明の化合物が含まれる。
【0051】
上述のようにして得られた酢酸エチル画分から常法に基づき精製することにより、本発明の化合物が単離され得る。精製方法としては、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィー等を挙げることができ、これらのうちの１種又は複数を組み合わせて精製することが可能である。各種クロマトグラフィーに用いられる担体や溶出溶媒等は、各種クロマトグラフィーに対応して適宣選択することができる。
【0052】
さらに、本発明のスクラレオール、スクラレオール配糖体及びイソマノオール配糖体に係る化合物は、公知の方法で合成して得られた合成品であってもよい。
【0053】
本発明のＣＤ３９発現促進剤は、上述したスクラレオール、スクラレオール配糖体又はイソマノオール配糖体を有効成分として含むものであって、ＣＤ３９を発現する細胞において、ＣＤ３９発現を促進し、ＣＤ３９発現量を増加させる作用を有する。ＣＤ３９の発現が促進されることにより、対象細胞でのＣＤ３９が増加するため、細胞外ＡＴＰの分解が促進され、細胞外ＡＴＰの蓄積も抑制される。その結果、細胞外ＡＴＰに起因する炎症を抑制でき、ＳＡＳＰの発生も防ぐことができるため、過剰免疫応答も抑制される。特に、ＣＤ３９は皮膚免疫細胞であるランゲルハンス細胞に発現し、細胞外ＡＴＰを分解して炎症誘導シグナルの伝達を阻害する作用を有している。本発明のＣＤ３９発現促進剤をランゲルハンス細胞に付与することにより、ランゲルハンス細胞におけるＣＤ３９の発現量が増加するため、皮膚の炎症が抑制又は鎮静され、皮膚における過剰免疫応答も抑制される。
【0054】
本発明のＣＤ３９発現促進剤は、皮膚の炎症を抑制し、過剰免疫応答を抑制すると共に、皮膚を安定した状態に保つための皮膚外用剤として用いることができる。皮膚に付与することにより、ランゲルハンス細胞におけるＣＤ３９発現量が増加するため、外部刺激や老化等によって放出された細胞外ＡＴＰの分解が促進される。それゆえ、細胞外ＡＴＰによって生じる皮膚の炎症及びＳＡＳＰ等による過剰免疫応答が抑制され、皮膚を安定した状態に保つことができる。
【0055】
また、本発明のＣＤ３９発現促進剤は、皮膚炎症の抑制作用、過剰免疫応答の抑制作用及び皮膚を健やかに保つ作用を有する化粧料として用いることができる。皮膚に付与することにより、ランゲルハンス細胞におけるＣＤ３９発現量が増加するため、外部刺激や老化等によって放出された細胞外ＡＴＰの分解が促進される。それゆえ、皮膚の炎症や肌あれ、痒み、カブレ等が抑制され、皮膚を健やかな状態に保つことができる。なお、本発明の化粧料は、美容目的で皮膚の老化を予防又は改善するためにも好ましく適用され得る。
【0056】
本発明のＣＤ３９発現促進剤、皮膚外用剤及び化粧料の投与量又は添加量は、目標とする炎症抑制効果、投与方法、年齢などによって変化するので一概には規定できないが、本発明に係るスクラレオール、スクラレオール配糖体又はイソマノオール配糖体として、表皮単位面積（１ｃｍ２）当たり、０．０２ｎｇ／ｃｍ２・ｄａｙ～１００μｇ／ｃｍ２・ｄａｙとすることが好ましく、０．０２ｎｇ／ｃｍ２・ｄａｙ～１０μｇ／ｃｍ２・ｄａｙとすることがより好ましい。
【0057】
本発明のＣＤ３９発現促進剤、皮膚外用剤及び化粧料の剤形は、特に限定されず、例えば、低粘度液体、ローション等の液剤、乳液、ゲル、ペースト、クリーム、フォーム、パック、軟膏、粉剤、エアゾール又は貼付剤等、並びに錠剤、顆粒剤、カプセル剤又は内服用液剤等が挙げられる。なお、本発明に係るＣＤ３９発現促進剤は、化粧品、医薬部外品又は医薬品のいずれにも適用することができる。具体的な製品としては、特に限定されないが、化粧水、化粧クリーム、化粧乳液、美容液、化粧パック、化粧洗浄料、石鹸、ヘアケア剤、浴用剤又はメーキャップ化粧料等が挙げられる。
【0058】
本発明のＣＤ３９発現促進剤、皮膚外用剤及び化粧料中において、本発明に係るスクラレオール、スクラレオール配糖体又はイソマノオール配糖体を有効成分として配合させた際の配合量は、好ましくは０．００１質量ｐｐｍ～１質量％であり、より好ましくは０．０１質量ｐｐｍ～０．１質量％である。これら化合物の配合量をこの範囲内とすることにより、本化合物を安定に配合することができ、皮膚への安全性も高く、高いＣＤ３９発現促進効果、炎症抑制効果ないし美容効果を発揮することができる。
【0059】
また、本発明のＣＤ３９発現促進剤、皮膚外用剤及び化粧料には、本発明の作用効果を損なわない範囲において、通常用いられる各種の薬効成分、例えば、保湿剤、美白剤、抗炎症剤、細胞賦活剤、紫外線防御剤、血行促進剤及び抗酸化剤等から選ばれる薬効剤の一種または二種以上と併用することができる。それにより、本発明の効果をより高めることが可能である。
【0060】
保湿剤としては、例えば、アスパラギン酸、アスパラギン酸塩、アラニン、アルギニン、アルギン酸、アルギン酸ソーダ、キシリトール、グリシン、グルコース、シスチン、システイン、セリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン、ポリグリセリン、１，３－ブチレングリコール、１，２－ペンタンジオール、ヘキシレングリコール、ソルビトール、ＰＯＥメチルグルコシド、マルチトール、マルトース、マンニトール、リシン、ハチミツ、ローヤルゼリー、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、アセチルヒアルロン酸ナトリウム、ムコイチン硫酸、カロニン酸、トラネキサム酸、ベタイン、トレハロース、キトサン、尿素、セラミド、アテロコラーゲン、コレステリル－１２－ヒドロキシステアレート、乳酸ナトリウム、胆汁酸塩、ｄｌ－ピロリドンカルボン酸塩、可溶性コラーゲン、ジグリセリン（ＥＯ）ＰＯ付加物、アシタバ抽出物、アスパラガス抽出物、イザヨイバラ抽出物、クインスシード抽出物、グアバ葉抽出物、セイヨウノコギリソウ抽出物及びメリロート抽出物等から選択される１種又は２種以上の組み合わせを挙げることができる。
【0061】
また、美白剤としては、例えば、Ｌ－アスコルビン酸、Ｌ－アスコルビン酸塩、Ｌ－アスコルビン酸エチル、Ｌ－アスコルビン酸ジパルミチン酸エステル、Ｌ－アスコルビン酸モノパルミチン酸エステル、テトラ２－ヘキシルデカン酸アスコルビル、Ｌ－アスコルビン酸－２－硫酸ナトリウム、Ｌ－アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩、Ｌ－アスコルビン酸リン酸エステルナトリウム塩、Ｌ－アスコルビン酸ステアリン酸エステル、Ｌ－アスコルビン酸－２－グルコシド、ＤＬ－α－トコフェロール－Ｌ－アスコルビン酸リン酸ジエステルジカリウム等のビタミンＣ類、胎盤抽出物、コウジ酸、エラグ酸、カミツレ抽出物、火棘エキス、レンシュエキス、トコトリエノール、グルタチオン、アルブチン、トラネキサム酸、ウワウルシ抽出物、ユキノシタ抽出物、アセロラ抽出物、エイジツ抽出物、フェルラ酸、アデノシンリン酸二ナトリウム、リノール酸、４－ｎ－ブチルレゾルシン、４－（４－ヒドロキシフェニル）－２－ブタノール、５，５’－ジプロピル－ビフェニル－２，２’－ジオール、４－メトキシサリチル酸カリウム塩、ハイドロキノン、ハイドロキノンモノベンジルエーテル、パンテテイン－ｓ－スルホン酸カルシウム及び油溶性カンゾウ抽出物等から選択される１種又は２種以上の組み合わせを挙げることができる。
【0062】
抗炎症剤としては、例えば、アミノカプロン酸、アラントイン、インドメタシン、ビサボロール、サポニン、塩化リゾチウム、アズレン、グアイアズレン、グアイアズレンスルホン酸塩、グリチルリチン酸又はその誘導体、グリチルレチン酸又はその誘導体、サリチル酸又はその誘導体、ヒノキチオール、感光素、トラネキサム酸又はその誘導体、酸化亜鉛、ウコン抽出物、ゲンノショウコ抽出物、ボタン抽出物、レイシ抽出物及びワレモコウ抽出物等から選択される１種又は２種以上の組み合わせを挙げることができる。
【0063】
細胞賦活剤としては、例えば、アミノ酪酸、イチョウ抽出物、ウイキョウ抽出物、オランダカラシ抽出物、ニンジン抽出物、クララ抽出物、クロレラ抽出物、サフラン抽出物、ダイズ抽出物、タイソウ抽出物、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、パントテン酸又はその誘導体、ビオチン、レチノール、ロイシン、感光素、リボフラビン又はその誘導体、ピリドキシン又はその誘導体等から選択される１種又は２種以上の組み合わせを挙げることができる。
【0064】
紫外線防御剤としては、例えば、オキシベンゾン、オキシベンゾンスルホン酸、テトラヒドロキシベンゾフェノン、ジヒドロキシベンゾフェノン、ジヒドロキシジメトキシベンゾフェノン、ジヒドロキシジメトキシベンゾフェノンスルホン酸ナトリウム、２－ヒドロキシ－４－メトキシベンゾフェノン、２－ヒドロキシ－４－メトキシベンゾフェノン－５－スルホン酸塩、シノキサート、ジパラメトキシケイ皮酸モノ－２－エチルヘキサン酸グリセリル、ジイソプロピルケイ皮酸メチル、メトキシケイ皮酸メチル、パラメトキシケイ皮酸オクチル、パラメトキシケイ皮酸イソプロピル・ジイソプロピルケイ皮酸エステル混合物、パラアミノ安息香酸グリセリル、パラジメチルアミノ安息香酸アミル、パラジメチル安息香酸オクチル、パラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、パラアミノ安息香酸エチル、サリチル酸エチレングリコール、サリチル酸オクチル、サリチル酸フェニル、サリチル酸ホモメンチル、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチル、エチルヘキシルトリアゾン、ドロメトリゾール、ドロメトリゾールトリシロキサン、４－メトキシ－４’－ｔｅｒｔ－ブチルジベンゾイルメタン、酸化チタン、タルク、カルミン、ベントナイト、カオリン及び酸化亜鉛等から選択される１種又は２種以上の組み合わせを挙げることができる。
【0065】
血行促進剤としては、例えば、サンショウ抽出物、ショウキョウ抽出物、センキュウ抽出物、チンピ抽出物、トウガラシ抽出物、トウキ抽出物、ボタン抽出物、ノニル酸ワレニルアミド、ニコチン酸ベンジルエステル、ニコチン酸β－ブトキシエチルエステル、カプサイシン、カンタリスチンキ、イクタモール、カフェイン、タンニン酸、α－ボルネオール、ニコチン酸トコフェロール、イノシトールヘキサニコチネート、アセチルコリン、セファランチン、γ－オリザノール等から選択される１種又は２種以上の組み合わせを挙げることができる。
【0066】
抗酸化剤としては、例えば、アスタキサンチン、β－カロテン、γ－オリザノール、カイネチン、トコフェロール、ジブチルヒドロキシトルエン、フラボノイド、ＳＯＤ、カタラーゼ、フラーレン、フィチン酸、フェルラ酸、クロロゲン酸、没食子酸プロピル、緑茶抽出物、ローズマリー抽出物、ローズヒップ抽出物、ショウブ抽出物、スギナ抽出物、ハマメリス抽出物、パセリ抽出物、ビワ葉抽出物、グレープフルーツ抽出物、シモツケソウ抽出物、ライチ抽出物、ヨモギ抽出物、モモ葉抽出物、マンゴウ抽出物、ボタンピ抽出物、マツ樹皮抽出物、白金、ユビキノン及びα－リポ酸等から選択される１種又は２種以上の組み合わせを挙げることができる。
【0067】
また、本発明のＣＤ３９発現促進剤、皮膚外用剤及び化粧料には、上述した成分以外にも、本発明の効果を損なわない範囲内で、皮膚外用剤及び化粧料に通常用いられる成分である水、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、植物抽出エキス類、ビタミン類、水溶性高分子、界面活性剤、金属石鹸、アルコール、多価アルコール、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、粉体、増粘剤、色素又はキレート剤等の成分を適宜配合することができる。
【0068】
さらに、本発明のＣＤ３９発現促進用飲食品は、上述したスクラレオール、スクラレオール配糖体又はイソマノオール配糖体を活性成分として含有している。本発明に係る飲食品組成物は、錠剤やカプセル剤、顆粒剤、シロップ剤などのサプリメント形態、清涼飲料、果汁飲料、アルコール飲料などの飲料、アメやガム、クッキー、ビスケット、チョコレート等の菓子、パン、粥、シリアル、麺類、ゼリー、スープ、乳製品、調味料等のあらゆる形態とすることができる。このように飲食品として用いる際には、本発明の有効成分の効能に影響を与えない範囲において、他の有効成分や、ビタミン、ミネラル若しくはアミノ酸等の栄養素等を種々組み合わせることも可能である。本発明の飲食品には、サプリメント、健康食品、機能性食品、特定保健用食品等が含まれる。また、本発明の飲食品の１日あたりの摂取量は、スクラレオール、スクラレオール配糖体又はイソマノオール配糖体として、通常一日５ｍｇ～５０００ｍｇ（６０ｋｇ体重）とすることが好ましく、１０ｍｇ～２０００ｍｇ（６０ｋｇ体重）とすることがより好ましい。
【0069】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例によってなんら限定されるものではない。
【実施例0070】
［実施例１］
１．ダルマギク抽出物の調製
採取後、乾燥処理されたダルマギク植物体から花部を回収し、粉砕機で粉砕した。この粉砕物３００ｇを２Ｌの９０ｗ／ｗ％エタノール水溶液に浸漬して３日間抽出した後、得られた抽出液を綿栓ろ過し、エバポレーターで減圧濃縮したものをエタノール抽出物とした（図１）。このエタノール抽出物を、２００ｍＬの酢酸エチルと２００ｍＬの水で二層分配した。分液漏斗にて激しく混合した後、静置し、酢酸エチル層のみを回収した（図１）。二層分配は合計４回繰り返し行った。酢酸エチル層をエバポレーターで乾固し、酢酸エチル画分（１６．３ｇ）を得た。
１．ダルマギク抽出物の調製
採取後、乾燥処理されたダルマギク植物体から花部を回収し、粉砕機で粉砕した。この粉砕物３００ｇを２Ｌの９０ｗ／ｗ％エタノール水溶液に浸漬して３日間抽出した後、得られた抽出液を綿栓ろ過し、エバポレーターで減圧濃縮したものをエタノール抽出物とした（図１）。このエタノール抽出物を、２００ｍＬの酢酸エチルと２００ｍＬの水で二層分配した。分液漏斗にて激しく混合した後、静置し、酢酸エチル層のみを回収した（図１）。二層分配は合計４回繰り返し行った。酢酸エチル層をエバポレーターで乾固し、酢酸エチル画分（１６．３ｇ）を得た。
【0071】
［実施例２］
２．ダルマギク抽出物の単離と精製
図１に示すように、実施例１で得られた酢酸エチル画分１．０ｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（オープンカラムクロマト管：φ２．５ｃｍ×高さ３３ｃｍ、シリカゲル６０（６３－２００μｍ）、メルク社製品）に供し、２００ｍＬのヘキサン：酢酸エチル＝９：１、２００ｍＬのヘキサン：酢酸エチル＝８：２、２００ｍＬのヘキサン：酢酸エチル＝７：３、２００ｍＬのヘキサン：酢酸エチル＝５：５、３００ｍＬの酢酸エチル、３００ｍＬのメタノールの順で溶出を行い、６つの溶出画分Ｆｒ．１～６を得た。それぞれ、Ｆｒ．１：７１ｍｇ、Ｆｒ．２：１７７．３ｍｇ、Ｆｒ．３：３６．７ｍｇ、Ｆｒ．４：２９９．５ｍｇ、Ｆｒ．５：３８４．７ｍｇ、Ｆｒ．６：２４８ｍｇと分画された。これら６つの溶出画分について、後述する実施例４と同様の材料及び方法により、ＣＤ３９発現促進効果を確認したところ、Ｆｒ．４、Ｆｒ．５及びＦｒ．６にＣＤ３９発現促進効果が確認された。また、これら６つの画分を１Ｈ－ＮＭＲプロファイリングに供したところ、Ｆｒ．２、Ｆｒ．４、Ｆｒ．５及びＦｒ．６に特徴的なピークが検出された。そこで、Ｆｒ．２、Ｆｒ．４、Ｆｒ．５及びＦｒ．６の４つの画分に含まれる化合物の単離を試みた。
２．ダルマギク抽出物の単離と精製
図１に示すように、実施例１で得られた酢酸エチル画分１．０ｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（オープンカラムクロマト管：φ２．５ｃｍ×高さ３３ｃｍ、シリカゲル６０（６３－２００μｍ）、メルク社製品）に供し、２００ｍＬのヘキサン：酢酸エチル＝９：１、２００ｍＬのヘキサン：酢酸エチル＝８：２、２００ｍＬのヘキサン：酢酸エチル＝７：３、２００ｍＬのヘキサン：酢酸エチル＝５：５、３００ｍＬの酢酸エチル、３００ｍＬのメタノールの順で溶出を行い、６つの溶出画分Ｆｒ．１～６を得た。それぞれ、Ｆｒ．１：７１ｍｇ、Ｆｒ．２：１７７．３ｍｇ、Ｆｒ．３：３６．７ｍｇ、Ｆｒ．４：２９９．５ｍｇ、Ｆｒ．５：３８４．７ｍｇ、Ｆｒ．６：２４８ｍｇと分画された。これら６つの溶出画分について、後述する実施例４と同様の材料及び方法により、ＣＤ３９発現促進効果を確認したところ、Ｆｒ．４、Ｆｒ．５及びＦｒ．６にＣＤ３９発現促進効果が確認された。また、これら６つの画分を１Ｈ－ＮＭＲプロファイリングに供したところ、Ｆｒ．２、Ｆｒ．４、Ｆｒ．５及びＦｒ．６に特徴的なピークが検出された。そこで、Ｆｒ．２、Ｆｒ．４、Ｆｒ．５及びＦｒ．６の４つの画分に含まれる化合物の単離を試みた。
【0072】
図２に示すように、Ｆｒ．２から９０ｍｇを取り分け、分取薄層クロマトグラフィー（ＰＴＬＣ：ＰＬＣ シリカゲル６０ Ｆ２５４、メルク社製品）に供した。展開溶媒にはトルエン（１００％）を用い、５つの画分Ｆｒ．２－１～２－５を得た。Ｆｒ．２－３について、ヘキサン：酢酸エチル＝９：１を展開溶媒とし、ＰＴＬＣに供した。得られた画分のうちのＦｒ．２－３－２をベンゼン１００％でＰＴＬＣに供し、Ｆｒ．２－３－２－３から化合物ｃ（２１．４ｍｇ）を単離した。他方、Ｆｒ．２－４についても、ヘキサン：酢酸エチル＝９：１を展開溶媒とし、ＰＴＬＣに供した。その結果、得られた画分Ｆｒ．２－４－２から化合物ｂ（１２．３ｍｇ）を得た。
【0073】
図３に示すように、Ｆｒ．４から２２５ｍｇを取り分け、ＰＴＬＣに供した。展開溶媒にはヘキサン：酢酸エチル＝３：１を用い、４つの画分Ｆｒ．４－１～４－４を得た。Ｆｒ．４－４について、クロロホルム：メタノール＝９８：２を展開溶媒とし、再びＰＴＬＣに供し、５つの画分Ｆｒ．４－４－１～４－４－５を得た。得られたＦｒ．４－４－３をヘキサン：酢酸エチル＝２：１の展開溶媒でＰＴＬＣに供し、Ｆｒ．４－４－３－３から化合物ｅ（１７．９ｍｇ）を単離した。他方、Ｆｒ．４－４－５もヘキサン：酢酸エチル＝２：１の展開溶媒でＰＴＬＣに供した。その結果、Ｆｒ．４－４－５－３及びＦｒ．４－４－５－４からはそれぞれ化合物ａ（９４．３ｍｇ）と化合物ｄ（２３．３ｍｇ）を得た。
【0074】
図４に示すように、Ｆｒ．５から２２０ｍｇを取り分け、ＰＴＬＣに供した。展開溶媒にはヘキサン：酢酸エチル＝３：２を用い、４つの画分Ｆｒ．５－１～５－４を得た。このうちＦｒ．５－３について、クロロホルム：メタノール＝９８：２を展開溶媒とし、さらなるＰＴＬＣを行い、Ｆｒ．５－３－２から化合物ｆ（６．１ｍｇ）を得た。Ｆｒ．５－４については、ヘキサン：酢酸エチル＝１：１を展開溶媒とし、ＰＴＬＣに供した。得られたＦｒ．５－４－５をクロロホルム：メタノール＝９９：１を展開溶媒として、ＰＴＬＣに供し、Ｆｒ．５－４－５－３から化合物ｇ（３０．３ｍｇ）を得た。他方、Ｆｒ．５－４－４をクロロホルム：メタノール＝９８：２を展開溶媒として、ＰＴＬＣに供し、Ｆｒ．５－４－４－４を得た。Ｆｒ．５－４－４－４にアセトニトリル：水＝６：４を展開溶媒とした逆相ＰＴＬＣ（ＰＬＣ シリカゲル６０ ＲＰ－１８ Ｆ２５４Ｓ、メルク社製品）を行い、得られたＦｒ．５－４－４－４－５をメタノール：水＝６：４で逆相ＰＴＬＣに供した。その結果、Ｆｒ．５－４－４－４－５－２から新規化合物ｉ（４．４ｍｇ）を単離した。
【0075】
図５に示すように、Ｆｒ．６から２３０ｍｇを取り分け、ＰＴＬＣに供した。展開溶媒にクロロホルム：メタノール＝９：１を用い、Ｆｒ．６－３を得た。Ｆｒ．６－３に対して、展開溶媒に酢酸エチル（１００％）、酢酸エチル：メタノール＝９７：３を用いてＰＴＬＣを繰り返した。得られたＦｒ．６－３－３－２にアセトニトリル：水＝６：４を展開溶媒とした逆相ＰＴＬＣを行い、得られたＦｒ．６－３－３－２－４をメタノール：水＝６：４で逆相ＰＴＬＣに供した。その結果、Ｆｒ．６－３－３－２－４－２から化合物ｈ（２３．９ ｍｇ）を得た。
【0076】
［実施例３］
３．化合物ａ～ｉの構造決定
実施例２において単離した９つの化合物の構造解析を行った。構造解析にあたり、ＮＭＲ装置（ＪＮＭ－ＥＸ４００、日本電子株式会社製品）を用い、各化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲ分析を行った。測定時の重水素溶媒としては、ＣＤＣｌ３（クロロホルム－Ｄ１、９９．８ ａｔｏｍ％ Ｄ、メルク社製品）、重水（９９．９ ａｔｏｍ％ Ｄ、メルク社製品）を用いた。１Ｈ－ＮＭＲと１３Ｃ－ＮＭＲから得られた化学シフトを化合物データベース（ＳｃｉＦｉｎｄｅｒ、一般社団法人化学情報協会）と比較し、構造解析を行った。データベースに該当する化合物がない場合には、２Ｄ ＮＭＲ（ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣ、ＣＯＳＹ）を測定し、ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳなどのスペクトルデータと併せることで、化合物の平面構造を決定した。さらに、ＮＯＥＳＹを測定し、相対立体配置の検討を行った。また、構造解析の際、ＨＧＳの分子模型（丸善出版株式会社製品）と分子構造式エディタソフトのＣｈｅｍＤｒａｗ（株式会社ヒューリンクス製品）を使用し検討を行った。各化合物の１Ｈ－ＮＭＲ分析（観測周波数：４００ＭＨｚ）及び１３Ｃ－ＮＭＲ分析（観測周波数：１００ＭＨｚ）により得られた各スペクトルを図６～１４に示す。
３．化合物ａ～ｉの構造決定
実施例２において単離した９つの化合物の構造解析を行った。構造解析にあたり、ＮＭＲ装置（ＪＮＭ－ＥＸ４００、日本電子株式会社製品）を用い、各化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲ分析を行った。測定時の重水素溶媒としては、ＣＤＣｌ３（クロロホルム－Ｄ１、９９．８ ａｔｏｍ％ Ｄ、メルク社製品）、重水（９９．９ ａｔｏｍ％ Ｄ、メルク社製品）を用いた。１Ｈ－ＮＭＲと１３Ｃ－ＮＭＲから得られた化学シフトを化合物データベース（ＳｃｉＦｉｎｄｅｒ、一般社団法人化学情報協会）と比較し、構造解析を行った。データベースに該当する化合物がない場合には、２Ｄ ＮＭＲ（ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣ、ＣＯＳＹ）を測定し、ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳなどのスペクトルデータと併せることで、化合物の平面構造を決定した。さらに、ＮＯＥＳＹを測定し、相対立体配置の検討を行った。また、構造解析の際、ＨＧＳの分子模型（丸善出版株式会社製品）と分子構造式エディタソフトのＣｈｅｍＤｒａｗ（株式会社ヒューリンクス製品）を使用し検討を行った。各化合物の１Ｈ－ＮＭＲ分析（観測周波数：４００ＭＨｚ）及び１３Ｃ－ＮＭＲ分析（観測周波数：１００ＭＨｚ）により得られた各スペクトルを図６～１４に示す。
【0077】
解析の結果、Ｆｒ．２から単離した化合物ｃ（Ｆｒ．２－３－２－３）はゲルマクロンであり、化合物ｂ（Ｆｒ．２－４－２）はイソマノオールであった。
【0078】
また、解析の結果、Ｆｒ．４から単離した化合物ｅ（Ｆｒ．４－４－３－３）はイソマノオール配糖体の（１３Ｒ）－Ｌａｂｄａ－７，１４－ｄｉｅｎｅ １３－Ｏ－ａ－Ｌ－（４’－Ｏ－ａｃｅｔｙｌ）－６’－ｄｅｏｘｙｉｄｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅであり、化合物ａ（Ｆｒ．４－４－５－３）はスクラレオールであり、化合物ｄ（Ｆｒ．４－４－５－４）はイソマノオール配糖体の（１３Ｒ）－Ｌａｂｄａ－７，１４－ｄｉｅｎｅ １３－Ｏ－ａ－Ｌ－６’－ｄｅｏｘｙｉｄｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅであった。
【0079】
また、解析の結果、Ｆｒ．５から単離した化合物ｆ（Ｆｒ．５－３－２）はフラボノイド系化合物のネバデンシンであった。化合物ｉ（Ｆｒ．５－４－４－５－２）は今回新たに発見されたスクラレオール配糖体であって、下記式（Ｖ）に示す新規化合物であり、化合物ｇ（Ｆｒ．５－４－５－３）はイソマノオール配糖体の（１３Ｒ）－Ｌａｂｄａ－７，１４－ｄｉｅｎｅ １３－ Ｏ－β－Ｄ－ｆｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅであった。
【0080】
【化12】
【0081】
また、解析の結果、Ｆｒ．６から単離した化合物ｈ（Ｆｒ．６－３－３－２－４－２）はスクラレオール配糖体の（１３Ｒ）－Ｌａｂｄａ－１４（１５）－ｅｎｅ－８，１３－ｄｉｏｌ １３－Ｏ－α－Ｌ－６′－ｄｅｏｘｙｉｄｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅであった。
【0082】
［実施例４］
４．ランゲルハンス細胞様細胞におけるＣＤ３９発現促進作用の検討
ランゲルハンス細胞は、試験利用できる状態で、ヒト皮膚組織から分離すること及び長時間培養することが困難な細胞である。そのため、ランゲルハンス細胞の代替として、ランゲルハンス様細胞であるＴＨＰ－１細胞が、皮膚感作アッセイ等のランゲルハンス細胞に関する試験において多く用いられている。そして、上述した特許文献１及び特許文献４においても、ランゲルハンス細胞の代替としてＴＨＰ－１細胞が用いられている。そこで、本発明においても、ランゲルハンス細胞様細胞であり、ＣＤ３９を発現するＴＨＰ－１細胞を用いてＣＤ３９発現促進効果を調べた。
４．ランゲルハンス細胞様細胞におけるＣＤ３９発現促進作用の検討
ランゲルハンス細胞は、試験利用できる状態で、ヒト皮膚組織から分離すること及び長時間培養することが困難な細胞である。そのため、ランゲルハンス細胞の代替として、ランゲルハンス様細胞であるＴＨＰ－１細胞が、皮膚感作アッセイ等のランゲルハンス細胞に関する試験において多く用いられている。そして、上述した特許文献１及び特許文献４においても、ランゲルハンス細胞の代替としてＴＨＰ－１細胞が用いられている。そこで、本発明においても、ランゲルハンス細胞様細胞であり、ＣＤ３９を発現するＴＨＰ－１細胞を用いてＣＤ３９発現促進効果を調べた。
【0083】
まず、実施例２で単離した化合物ａ～ｉをそれぞれ無水エタノールに溶解させ、１０ｍｇ／ｍＬの試料溶解液を作成した。また、市販のスクラレオール（化合物ａ）試薬（製品コード：Ｓ０９１６、東京化成工業株式会社製品）とネバデンシン（化合物ｆ）試薬（製品コード：ＨＹ－Ｎ１３７７、ＭｅｄＣｈｅｍｅｘｐｒｅｓｓ社製品）を入手し、これらについてもそれぞれ無水エタノールに溶解させ、１０ｍｇ／ｍＬの試料溶解液を作成した。
【0084】
市販の２４ウェル細胞培養プレートの各ウェル（３．３４ｍＬ容量／ウェル）に約１０万個のＴＨＰ－１細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＴＩＢ－２０２）をそれぞれ播種し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０培地を９９８μＬ添加して、２４時間培養した。その後、以下表１に示す配合量にて化合物ａ～ｉ又は市販試薬の試料溶解液（いずれも１０ｍｇ／ｍＬ濃度）と無水エタノールとを混合して２μＬずつウェルに添加し、培地における各化合物の添加濃度を０μｇ／ｍＬ（対照）～２０μｇ／ｍＬとした。添加後、２４時間培養を行った。試験は各濃度についてＮ＝２で行った。
【0085】
【表1】
【0086】
培養終了後、各ウェルからＴＨＰ－１細胞を回収し、トータルＲＮＡ精製キット（ＦａｓｔＧｅｎｅ ＲＮＡ精製キット、日本ジェネティクス株式会社製品）を用いてトータルＲＮＡを得た。次に、ｃＤＮＡ合成キット（ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ、東洋紡株式会社製品）を用いて、各トータルＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを用い、リアルタイムＰＣＲ（ＱＰＣＲ）によりＣＤ３９の発現量を測定した。
【0087】
ＱＰＣＲは、市販のＱＰＣＲ試薬キット（PrimeTime（登録商標）Gene Expression Master Mix、Integrated DNA Technologies株式会社製品）とＱＰＣＲ測定装置（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製品）を用いて行った。ＱＰＣＲ用ＣＤ３９プライマー及びプローブは下記表２に示す配列番号１～３のプライマー及びプローブを用いた。他方、ハウスキーピング遺伝子であるヒト グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を内部標準として選択し、上述したＣＤ３９プライマー及びプローブに替えて下記表２に示す配列番号４～６のプライマー及びプローブを用いてＱＰＣＲを行った。いずれのプローブも３´末端に末端クエンチャーとしてＩＢＦＱが付加され、５´末端から９塩基－１０塩基の間に中間クエンチャーとしてＺＥＮが付加されたダブルクエンチャーシステムによるプローブを使用した（Integrated DNA Technologies株式会社製品）。なお、ＣＤ３９用プローブ（配列番号３）の５´末端に付加された蛍光色素はＦＡＭであり、ＧＡＰＤＨ用プローブ（配列番号６）の５´末端に付加された蛍光色素はＨＥＸであった。内部標準であるＧＡＰＤＨの発現量から相対発現量を算出し、ＣＤ３９の発現量とした。結果を図１５～図１７に示す。なお、これら図１５～図１７のグラフでは、化合物を添加していない対照（濃度０μｇ／ｍＬ）のＴＨＰ－１細胞におけるＣＤ３９発現量を１．００としたときの値を示している。
【0088】
【表2】
【0089】
図１５に示すように、化合物ａ（スクラレオール）をランゲルハンス様細胞であるＴＨＰ－１細胞に添加したところ、わずか２μｇ／ｍＬ（２ｐｐｍに相当）の添加濃度でＣＤ３９の発現量が１．２倍以上に増加することが明らかとなった。実施例２で単離された試料を用いた試験では、１６μｇ／ｍＬの添加濃度でＣＤ３９の発現量が１．９倍に達した（図１５（ａ））。また、市販のスクラレオール試薬を用いた場合には、１２μｇ／ｍＬの添加濃度で２．５５倍ものＣＤ３９発現量の増加が見られた（図１５（ｂ））。
【0090】
他方、スクラレオールとよく似た二環式ジテルペン骨格を有する化合物ｂ（イソマノオール）には、興味深いことにＣＤ３９発現量の増加はみられなかった（図１５（ｃ））。また、セスキテルペン骨格を有する化合物ｃ（ゲルマクロン）もイソマノオール同様にＣＤ３９発現促進効果は確認されなかった（図１５（ｄ））。さらに、フラボノイド系化合物の化合物ｆ（ネバデンシン）にもＣＤ３９発現促進効果は確認されなかった（図１６（ｃ）及び（ｄ））。
【0091】
上述したようにイソマノオール単体にはＣＤ３９発現促進効果は確認されなかったが、イソマノオール配糖体である化合物ｄ、化合物ｅ及び化合物ｇには、ＣＤ３９発現促進効果が確認された（図１６（ａ）及び（ｂ）、図１７（ａ））。このうち、フコピラノシドである化合物ｇのＣＤ３９発現促進効果が最も高く、１０μｇ／ｍＬの添加濃度でＣＤ３９の発現量が１．９５倍に達した（図１７（ａ））。なお、いずれのイソマノオール配糖体についても、スクラレオール及びスクラレオール配糖体と比べると、低用量（８～１２μｇ／ｍＬ程度）で効果のピークが得られることが明らかとなった。
【0092】
また、スクラレオール配糖体として単離された化合物ｈ及び化合物ｉにも、優れたＣＤ３９発現促進効果が確認された（図１７（ｂ）及び（ｃ））。このうち、６－デオキシイドピラノシドである化合物ｈは、２０μｇ／ｍＬの添加濃度でＣＤ３９の発現量が２．１１倍に達した（図１７（ｂ））。また、新規化合物として発見された化合物ｉ（４－Ｏ－アセチル－６－デオキシイドピラノシド）は、１２μｇ／ｍＬの添加濃度で１．６１倍のＣＤ３９の発現量の増加が観察された（図１７（ｃ））。
【0093】
このように、本発明によれば、スクラレオール、スクラレオール配糖体又はイソマノオール配糖体を用いることによって、ｐｐｍオーダーでの非常に少ない添加濃度で高いＣＤ３９発現促進効果が得られることが明らかとなった。
【0094】
本発明は、上記の実施形態又は実施例に限定されるものでなく、特許請求の範囲に記載された発明の要旨を逸脱しない範囲内での種々、設計変更した形態も技術的範囲に含むものである。
【産業上の利用可能性】
【0095】
本発明のＣＤ３９発現促進剤は、外部刺激や加齢などによって生じる炎症を抑制し、過剰免疫応答を抑制する作用を有するため、医療や美容の分野において幅広く利用されるものである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-06-28
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
二環式ジテルペン骨格を有する化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を２質量ｐｐｍ～０．１質量％含有し、
前記二環式ジテルペン骨格を有する化合物が、スクラレオール、スクラレオール配糖体及びイソマノオール配糖体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物であることを特徴とする皮膚ランゲルハンス細胞におけるＣＤ３９発現促進剤。
前記二環式ジテルペン骨格を有する化合物が、スクラレオール、スクラレオール配糖体及びイソマノオール配糖体からなる群より選択される少なくとも１種の化合物であることを特徴とする皮膚ランゲルハンス細胞におけるＣＤ３９発現促進剤。
【請求項2】
前記スクラレオール配糖体を構成する糖が、６－デオキシイドース又はフコースであることを特徴とする請求項１に記載の皮膚ランゲルハンス細胞におけるＣＤ３９発現促進剤。
【請求項3】
前記スクラレオール配糖体が、下記式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表される化合物であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚ランゲルハンス細胞におけるＣＤ３９発現促進剤。
（式中、Ｒ１は水素原子又はアセチル基を示す。）
（式中、Ｒ２は水素原子又はアセチル基を示す。）
【化1】
【化2】
【請求項4】
前記イソマノオール配糖体を構成する糖が、６－デオキシイドース又はフコースであることを特徴とする請求項１に記載の皮膚ランゲルハンス細胞におけるＣＤ３９発現促進剤。
【請求項5】
前記イソマノオール配糖体が、下記式（ＩＩＩ）又は式（ＩＶ）で表される化合物であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚ランゲルハンス細胞におけるＣＤ３９発現促進剤。
（式中、Ｒ３は水素原子又はアセチル基を示す。）
（式中、Ｒ４は水素原子又はアセチル基を示す。）
【化3】
【化4】
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項に記載のＣＤ３９発現促進剤を有効成分として含有する皮膚ランゲルハンス細胞におけるＣＤ３９発現促進用皮膚外用剤。
【請求項7】
請求項１～５のいずれか１項に記載のＣＤ３９発現促進剤を有効成分として含有する皮膚ランゲルハンス細胞におけるＣＤ３９発現促進用化粧料。
【請求項8】
請求項１～５のいずれか１項に記載のＣＤ３９発現促進剤を含有する皮膚ランゲルハンス細胞におけるＣＤ３９発現促進用飲食品。
【請求項9】
請求項１～５のいずれか１項に記載のＣＤ３９発現促進剤を含むことを特徴とする細胞外ＡＴＰにより生じる炎症抑制剤。
【請求項10】
下記式（Ｖ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物。
【化5】