特開 2023-12552 免疫活性の増加における使用のためのＴＧＦβおよびＡＣＴＲＩＩアンタゴニスト

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023012552

(43)【公開日】2023-01-25

(54)【発明の名称】免疫活性の増加における使用のためのＴＧＦβおよびＡＣＴＲＩＩアンタゴニスト

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/06 20060101AFI20230118BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230118BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20230118BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20230118BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20230118BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20230118BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20230118BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20230118BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20230118BHJP

   A61P 13/10 20060101ALI20230118BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230118BHJP

   A61P 1/02 20060101ALI20230118BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20230118BHJP

   A61P 11/02 20060101ALI20230118BHJP

   A61P 11/04 20060101ALI20230118BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20230118BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20230118BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20230118BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20230118BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20230118BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20230118BHJP

   A61P 31/10 20060101ALI20230118BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20230118BHJP

   A61P 33/00 20060101ALI20230118BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20230118BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230118BHJP

   C07K 16/22 20060101ALI20230118BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20230118BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20230118BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20230118BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20230118BHJP

   C07K 14/71 20060101ALI20230118BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230118BHJP

【ＦＩ】

A61K45/06 ZNA

A61P35/00

A61P37/04

A61K39/00 H

A61P31/00

A61P35/02

A61P17/00

A61P11/00

A61P13/12

A61P13/10

A61P43/00 105

A61P1/02

A61P1/04

A61P11/02

A61P11/04

A61P1/16

A61P15/00

A61P25/00

A61P21/00

A61P35/04

A61P31/04

A61P31/10

A61P31/12

A61P33/00

A61K45/00

A61K39/395 N

A61K39/395 D

A61P43/00 121

C07K16/22

C07K16/46

C07K16/18

C07K16/28

C07K14/705

C07K14/71

C07K19/00

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2022181719

(22)【出願日】2022-11-14

(62)【分割の表示】P 2019562229の分割

【原出願日】2018-01-31

(31)【優先権主張番号】62/453,413

(32)【優先日】2017-02-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．プルロニック

(71)【出願人】

【識別番号】509125475

【氏名又は名称】アクセルロン ファーマ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】ロバート スコット ピアーソル

(72)【発明者】

【氏名】ラビンドラ クマール

(57)【要約】

【課題】免疫活性の増加における使用のためのＴＧＦβおよびＡＣＴＲＩＩアンタゴニストの提供。
【解決手段】本明細書には、ＴＧＦβアンタゴニストおよびＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ならびに例えばがん患者を含む、それを必要とする患者の免疫応答および／または活性を増加させるための方法が開示されている。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＦｃおよびＴＧＦβ抗体の組合せを、がんの処置に、ならびに免疫応答を誘導するための方法、免疫疲弊を処置または予防するための方法、抗原に対する免疫応答を誘導または強化するための方法、病原体またはがん抗原と組み合わせて病原体またはがんに対してワクチン接種するための方法、およびワクチンにより誘導された免疫応答を強化するための方法に使用するための方法が開示されている。さらに、同じ方法での抗ＴＧＦベータ単独療法が含まれる。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

明細書に記載の発明。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０１７年２月１日に出願された米国仮出願第６２／４５３，４１３号の優先権の利益を主張する。上記出願の明細書全体が、参照によって本明細書に援用される。

【背景技術】

【0002】

本発明の背景
がん処置では、化学療法は高い毒性を伴い、耐性がん細胞バリアントの出現に結び付く場合があることが長らく認識されてきた。腫瘍生存および成長に重要な過剰発現または活性化された腫瘍性タンパク質に対する標的療法でさえ、がん細胞は、頻繁に突然変異および適応して、冗長経路の利用などにより、標的経路に対する依存性を低減させる。がん免疫療法は、がん細胞を標的とする代わりに免疫系の活性化に着目する、がん処置における新しいパラダイムである。その原理は、宿主の免疫応答、特に適応性Ｔ細胞応答を再武装して、がん細胞を特定および死滅させ、持続性の防御免疫を達成することである。こうした療法は、免疫系の活性増加に向けられているため、がん免疫療法剤は、他の障害において、特に病原体が、免疫回避性であり、および／または宿主免疫系を危険にさらす感染性疾患において免疫応答を向上させる能力についても調査されている。

【0003】

２０１１年に、黒色腫の処置に対する抗ＣＴＬＡ－４抗体イピリムマブがＦＤＡ承認されたことにより、がん免疫療法の新時代が幕を開けた。抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１療法が、黒色腫、腎臓および肺がんにおいて永続性応答を誘導したことが臨床試験で実証されたことは、免疫療法が幅広い範囲のがんの処置に使用される可能性をさらに示している（Pardoll, D. M.、Nat Immunol. ２０１２年；１３巻：１１２９～３２頁）。しか
しながら、利用可能なまたは臨床試験でのがん免疫療法の多くは、制限を有する。例えば、イピリムマブ療法は、おそらくは、抗ＣＴＬＡ－４処置が、一次Ｔ細胞阻害チェックポイントに干渉することにより、新しい自己反応性Ｔ細胞の生成に結び付く場合があるため、高い毒性プロファイルを示す。ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用の阻害は、性質がほとんど抗ウイルス性または抗がん性である疲弊Ｔ細胞における既存の慢性免疫応答の脱阻害をもたらすが（Wherry, E. J.、Nat Immunol. ２０１１年；１２巻：４９２～９頁）、しかし、抗ＰＤ－１療法は、時として潜在的に致死性の肺関連自己免疫有害事象をもたらす場合がある。

【0004】

このように、患者、特にがんまたは感染性疾患を有する患者の免疫応答を増加させるための有効な療法には、未だ満たされていない高い必要性が依然として存在している。したがって、本開示の目的は、それを必要とする患者の免疫応答を向上増加させるための、ならびにがんおよび感染性疾患を処置するための方法を提供することである。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Pardoll, D. M.、Nat Immunol. ２０１２年；１３巻：１１２９～３２頁

【非特許文献2】Wherry, E. J.、Nat Immunol. ２０１１年；１２巻：４９２～９頁

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の要旨
部分的には、本明細書で示されたデータは、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（阻害剤）およびＴＧＦβアンタゴニスト（特に、ＴＧＦβ２の阻害剤）を、単独でまたは組み合わせて使用して、がんを処置することができることを実証する。特に、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、または汎特異性ＴＧＦβ抗体による処置は、別々に、がんモデルの腫瘍負荷を減少させ、生存期間を増加させたことが示された。さらに、ＴＧＦβアンタゴニストと組み合わせてＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用すると、いずれか一方の作用剤のみで観察される効果と比較して、抗腫瘍活性を相乗的に増加させることができることが示された。したがって、本開示は、部分的には、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＴＧＦβアンタゴニスト、またはＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよびＴＧＦβアンタゴニストの組合せを、単独でまたは１つもしくは複数の支持療法および／もしくは活性剤と組み合わせて使用して、がんを処置するための、特にがんの１つまたは複数の合併症を処置または予防するための（例えば、腫瘍負荷を低減するための）方法を提供する。加えて、データは、ＡｃｔＲＩＩおよびＴＧＦβアンタゴニスト療法の有効性が、免疫系に依存することを示す。したがって、部分的には、本開示は、ＡｃｔＲＩＩおよびＴＧＦβアンタゴニストを、免疫療法剤として使用して、特に、幅広い様々ながん（例えば、免疫抑制および／または免疫疲弊に関連したがん）を処置することができるという発見に関する。他の公知の免疫腫瘍学的作用剤と同様に、ＡｃｔＲＩＩおよびＴＧＦβアンタゴニストが患者の免疫応答を強化する能力は、がん分野以外でもより幅広い治療的意義を有する場合がある。例えば、免疫強化剤が、幅広い様々な感染性疾患、特に免疫抑制および／または免疫疲弊を促進する病原性因子の処置に有用であり得ることが提案されている。また、そのような免疫強化剤は、ワクチン（例えば、感染性疾患およびがんワクチン）の免疫化有効性のブーストに有用であり得る。したがって、本開示は、単独でまたは組み合わせて使用して、必要に応じて１つまたは複数の支持療法および／または追加活性剤と組み合わせて、それを必要とする対象の免疫応答を増加させ、がんを処置し、感染性疾患を処置し、および／または免疫化有効性を増加させることができる種々のＡｃｔＲＩＩおよびＴＧＦβアンタゴニストを提供する。

【0007】

例に記載されているＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、およびＴＧＦβ抗体は、ＡｃｔＲＩＩ結合リガンドおよび／またはＴＧＦβＲＩＩ結合リガンドの阻害以外の機序により免疫系および／またはがんに影響を及ぼす場合があるが［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えばアクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、およびアクチビンＡＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ１、およびＴＧＦβ３の１つまたは複数の阻害は、作用剤が、おそらくはこのリガンドスーパーファミリーの他のメンバーを含む幅広い追加作用剤の活性を阻害する傾向があることを示すものである場合があり、そのような集団的な阻害は、例えばがんに対する所望の効果に結び付く場合がある］、他のタイプのＡｃｔＲＩＩシグナル伝達およびＴＧＦβＲＩＩシグナル伝達経路阻害剤［例えば、ＡｃｔＲＩＩおよび／またはＴＧＦβＲＩＩリガンド阻害剤；Ｉ型、ＩＩ型、および／または共受容体阻害剤（例えば、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦβＲＩＩ、およびベータグリカンの１つまたは複数の阻害剤）；および下流シグナル伝達阻害剤（例えば、Ｓｍａｄ２および３などの１つまたは複数のＳｍａｄタンパク質の阻害剤）］は、例えば、抗体アンタゴニスト、核酸アンタゴニスト、低分子アンタゴニスト、およびリガンドトラップ（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体、ホリスタチンポリペプチド、およびＦＬＲＧポリペプチド）を含む、本開示の方法および使用により有用であることが予想される。本明細書で使用される場合、ＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）活性を阻害する作用剤は、総称して「ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト」または「ＡｃｔＲＩＩ阻害剤」と呼ばれ、例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、およびＡｃｔＲＩＩリガンド［例えば、アクチビン（例えばアクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、およびアクチビンＡＥ）、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］の１つまたは複数を阻害する作用剤が挙げられる。本明細書で使用される場合、ＴＧＦβＲＩＩ活性を阻害する作用剤は、総称して、「ＴＧＦβアンタゴニスト」または「ＴＧＦβ阻害剤」と呼ばれ、例えば、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ５、ベータグリカン、およびＴＧＦβＲＩＩリガンド（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３）の１つまたは複数を阻害する作用剤が挙げられる。

【0008】

ある特定の態様では、本開示は、患者の免疫応答を誘導するための方法であって、それを必要とする患者に、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよびＴＧＦβアンタゴニストを投与することを含み、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよびＴＧＦβアンタゴニストは有効量で投与される方法に関する。他の態様では、本開示は、患者の免疫応答を強化するための方法であって、それを必要とする患者に、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよびＴＧＦβアンタゴニストを投与することを含み、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよびＴＧＦβアンタゴニストは有効量で投与される方法に関する。一部の態様では、本開示は、それを必要とする患者の免疫応答を誘導または強化するための、ＴＧＦβアンタゴニストと組み合わせたＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの使用に関する。一部の態様では、本開示は、それを必要とする患者の免疫応答を誘導または強化するための、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストと組み合わせたＴＧＦβアンタゴニストの使用に関する。一部の実施形態では、患者は、がんを有する。一部の実施形態では、患者は、腫瘍を有する。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、がんに対するものである。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、腫瘍に対するものである。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、がんの成長を阻害する。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、腫瘍の成長を阻害する。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、患者のがん細胞負荷を減少させる。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、患者の腫瘍細胞負荷を減少させる。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、がん転移を処置または予防する。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、腫瘍転移を処置または予防する。一部の実施形態では、がんは、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、がんは、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんは、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんは、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、腫瘍は、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、患者は、以下のものからなる群から選択されるがんまたは腫瘍を有する：白血病、黒色腫（例えば、転移性黒色腫）、肺がん（例えば、扁平上皮非小細胞肺がん）、腎細胞癌、膀胱がん、中皮腫（例えば、転移性中皮腫）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、食道がん、胃がん、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、多形性神経膠芽腫、および肉腫（例えば、転移性肉腫）。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、病原体に対するものである。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、病原体による患者の感染を処置する。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、病原体による患者の感染を予防する。一部の実施形態では、病原体は、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、病原体は、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、病原体は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、病原体は、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、病原体は、細菌性、ウイルス性、真菌性、または寄生虫性病原体からなる群から選択される。一部の実施形態では、患者は、免疫疲弊を発症するリスクがある。一部の実施形態では、患者は、免疫疲弊に関連した疾患または状態を有する。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、Ｔ細胞免疫応答を含む。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、がんまたは病原体に対して患者にワクチン接種する。一部の実施形態では、患者には、がんまたは腫瘍を処置するための１つまたは複数の追加活性剤および／または支持療法がさらに投与される。一部の実施形態では、患者には、病原体を処置するための１つまたは複数の追加活性剤および／または支持療法がさらに投与される。一部の実施形態では、患者には、１つまたは複数の追加免疫腫瘍学的作用剤がさらに投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加免疫腫瘍学的作用剤は、以下のものからなる群から選択される：アレムツズマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オファツムマブ（ofatmumab
）、リツキシマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ（atexolizumab）、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合剤（例えば、ＰＤ－Ｌ１抗体）、ＣＤ２０指向性細胞溶解結合剤（例えば、ＣＤ－２０抗体）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）結合剤（例えば、ＣＴＬＡ－４抗体）、およびプログラム死受容体１（ＰＤ－１）結合剤（例えば、ＰＤ－１抗体）。一部の実施形態では、患者は、自己免疫疾患を有していない。一部の実施形態では、患者は、組織もしくは臓器移植を経験している最中でもなく、組織もしくは臓器移植を受けたこともない。一部の実施形態では、患者は、移植片対宿主疾患を有していない。

【0009】

ある特定の態様では、本開示は、患者のがんを処置するための方法であって、それを必要とする患者にＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよびＴＧＦβアンタゴニストを投与することを含み、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよびＴＧＦβアンタゴニストは有効量で投与される方法に関する。他の態様では、本開示は、患者の腫瘍を処置するための方法であって、それを必要とする患者にＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよびＴＧＦβアンタゴニストを投与することを含み、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよびＴＧＦβアンタゴニストは有効量で投与される方法に関する。一部の態様では、本開示は、それを必要とする患者のがんまたは腫瘍を処置するための、ＴＧＦβアンタゴニストと組み合わせたＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの使用に関する。一部の態様では、本開示は、それを必要とする患者のがんまたは腫瘍を処置するための、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストと組み合わせたＴＧＦβアンタゴニストの使用に関する。一部の実施形態では、方法は、がんの成長を阻害する。一部の実施形態では、方法は、腫瘍の成長を阻害する。一部の実施形態では、方法は、患者のがん細胞負荷を減少させる。一部の実施形態では、方法は、患者の腫瘍細胞負荷を減少させる。一部の実施形態では、方法は、がん転移を処置または予防する。一部の実施形態では、方法は、腫瘍転移を処置または予防する。一部の実施形態では、がんは、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、がんは、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんは、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんは、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、腫瘍は、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、患者は、以下のものからなる群から選択されるがんまたは腫瘍を有する：白血病、黒色腫（例えば、転移性黒色腫）、肺がん（例えば、扁平上皮非小細胞肺がん）、腎細胞癌、膀胱がん、中皮腫（例えば、転移性中皮腫）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、食道がん、胃がん、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、多形性神経膠芽腫、および肉腫（例えば、転移性肉腫）。一部の実施形態では、患者は、免疫疲弊を発症するリスクがある。一部の実施形態では、患者は、免疫疲弊に関連した疾患または状態を有する。一部の実施形態では、患者には、がんまたは腫瘍を処置するための１つまたは複数の追加活性剤および／または支持療法がさらに投与される。一部の実施形態では、患者には、１つまたは複数の追加免疫腫瘍学的作用剤がさらに投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加免疫腫瘍学的作用剤は、以下のものからなる群から選択される：アレムツズマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合剤（例えば、ＰＤ－Ｌ１抗体）、ＣＤ２０指向性細胞溶解結合剤（例えば、ＣＤ－２０抗体）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）結合剤（例えば、ＣＴＬＡ－４抗体）、およびプログラム死受容体１（ＰＤ－１）結合剤（例えば、ＰＤ－１抗体）。一部の実施形態では、患者は、自己免疫疾患を有していない。一部の実施形態では、患者は、組織もしくは臓器移植を経験している最中でもなく、組織もしくは臓器移植を受けたこともない。一部の実施形態では、患者は、移植片対宿主疾患を有していない。

【0010】

ある特定の態様では、本開示は、患者の免疫疲弊を処置するための方法であって、それを必要とする患者にＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよびＴＧＦβアンタゴニストを投与することを含み、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよびＴＧＦβアンタゴニストは有効量で投与される方法に関する。一部の態様では、本開示は、患者の免疫疲弊を予防するための方法であって、それを必要とする患者にＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよびＴＧＦβアンタゴニストを投与することを含み、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよびＴＧＦβアンタゴニストは有効量で投与される方法に関する。一部の態様では、本開示は、免疫疲弊を処置または予防するための、ＴＧＦβアンタゴニストと組み合わせたＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの使用に関する。一部の態様では、本開示は、免疫疲弊を処置または予防するための、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストと組み合わせたＴＧＦβアンタゴニストの使用に関する。一部の実施形態では、患者は、がんを有する。一部の実施形態では、患者は、腫瘍を有する。一部の実施形態では、方法は、がんの成長を阻害する。一部の実施形態では、方法は、腫瘍の成長を阻害する。一部の実施形態では、方法は、患者のがん細胞負荷を減少させる。一部の実施形態では、方法は、患者の腫瘍細胞負荷を減少させる。一部の実施形態では、方法は、がん転移を処置または予防する。一部の実施形態では、方法は、腫瘍転移を処置または予防する。一部の実施形態では、がんは、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、がんは、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんは、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんは、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、腫瘍は、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、患者は、以下のものからなる群から選択されるがんまたは腫瘍を有する：白血病、黒色腫（例えば、転移性黒色腫）、肺がん（例えば、扁平上皮非小細胞肺がん）、腎細胞癌、膀胱がん、中皮腫（例えば、転移性中皮腫）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、食道がん、胃がん、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、多形性神経膠芽腫、および肉腫（例えば、転移性肉腫）。一部の実施形態では、患者は病原体に感染している。一部の実施形態では、方法は、病原体による患者の感染を処置する。一部の実施形態では、方法は、病原体による患者の感染を予防する。一部の実施形態では、病原体は、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、病原体は、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、病原体は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、病原体は、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、病原体は、細菌性、ウイルス性、真菌性、または寄生虫性病原体からなる群から選択される。一部の実施形態では、免疫疲弊は、Ｔ細胞免疫疲弊を含む。一部の実施形態では、患者には、がんまたは腫瘍を処置するための１つまたは複数の追加活性剤および／または支持療法がさらに投与される。一部の実施形態では、患者には、病原体を処置するための１つまたは複数の追加活性剤および／または支持療法がさらに投与される。一部の実施形態では、患者には、１つまたは複数の追加免疫腫瘍学的作用剤がさらに投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加免疫腫瘍学的作用剤は、以下のものからなる群から選択される：アレムツズマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合剤（例えば、ＰＤ－Ｌ１抗体）、ＣＤ２０指向性細胞溶解結合剤（例えば、ＣＤ－２０抗体）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）結合剤（例えば、ＣＴＬＡ－４抗体）、およびプログラム死受容体１（ＰＤ－１）結合剤（例えば、ＰＤ－１抗体）。一部の実施形態では、患者は、自己免疫疾患を有していない。一部の実施形態では、患者は、組織もしくは臓器移植を経験している最中でもなく、組織もしくは臓器移植を受けたこともない。一部の実施形態では、患者は、移植片対宿主疾患を有していない。

【0011】

ある特定の態様では、本開示は、抗原に対する患者の免疫応答を誘導するための方法であって、それを必要とする患者に、ＴＧＦβアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、および抗原を投与することを含み、ＴＧＦβアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、および抗原は、有効量で投与される方法に関する。一部の態様では、本開示は、抗原に対する患者の免疫応答を強化するための方法であって、それを必要とする患者に、ＴＧＦβアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、および抗原を投与することを含み、ＴＧＦβアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、および抗原は、有効量で投与される方法に関する。一部の態様では、本開示は、抗原に対する免疫応答を誘導または強化するための、ＴＧＦβアンタゴニストと組み合わせたＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの使用に関する。一部の実施形態では、抗原は、がん抗原である。一部の実施形態では、抗原は、腫瘍抗原である。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍抗原は、以下のものからなる群から選択されるがんまたは腫瘍に関連する：白血病、黒色腫（例えば、転移性黒色腫）、肺がん（例えば、扁平上皮非小細胞肺がん）、腎細胞癌、膀胱がん、中皮腫（例えば、転移性中皮腫）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、食道がん、胃がん、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、多形性神経膠芽腫、および肉腫（例えば、転移性肉腫）。一部の実施形態では、抗原は、病原体抗原である。一部の実施形態では、病原体抗原は、細菌性病原体、ウイルス性病原体、真菌性病原体、または寄生虫性病原体からなる群から選択される病原体に関連する。一部の実施形態では、がん抗原は、ワクチン接種プロトコールに従って投与される。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、ワクチン接種プロトコールに従って投与される。一部の実施形態では、病原体抗原は、ワクチン接種プロトコールに従って投与される。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、がんに対して患者にワクチン接種する。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、腫瘍に対して患者にワクチン接種する。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、病原体に対して患者にワクチン接種する。一部の実施形態では、患者には、がんまたは腫瘍を処置するための１つまたは複数の追加活性剤および／または支持療法がさらに投与される。一部の実施形態では、患者には、病原体を処置するための１つまたは複数の追加活性剤および／または支持療法がさらに投与される。一部の実施形態では、患者には、１つまたは複数の追加免疫腫瘍学的作用剤がさらに投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加免疫腫瘍学的作用剤は、以下のものからなる群から選択される：アレムツズマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合剤（例えば、ＰＤ－Ｌ１抗体）、ＣＤ２０指向性細胞溶解結合剤（例えば、ＣＤ－２０抗体）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）結合剤（例えば、ＣＴＬＡ－４抗体）、およびプログラム死受容体１（ＰＤ－１）結合剤（例えば、ＰＤ－１抗体）。一部の実施形態では、がんは、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、がんは、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんは、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんは、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、腫瘍は、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、病原体は、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、病原体は、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、病原体は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、病原体は、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、患者は、免疫疲弊に関連した疾患または状態を有する。一部の実施形態では、患者は、自己免疫疾患を有していない。一部の実施形態では、患者は、組織もしくは臓器移植を経験している最中でもなく、組織もしくは臓器移植を受けたこともない。一部の実施形態では、患者は、移植片対宿主疾患を有していない。

【0012】

ある特定の態様では、本開示は、がんに対して患者にワクチン接種するための方法であって、それを必要とする患者に、ＴＧＦβアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、およびがん抗原を投与することを含み、ＴＧＦβアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、および抗原は、患者のワクチン接種に有効な量で投与される方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、病原体に対して患者にワクチン接種するための方法であって、それを必要とする患者に、ＴＧＦβアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、および病原体抗原を投与することを含み、ＴＧＦβアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、および抗原は、患者のワクチン接種に有効な量で投与される方法に関する。一部の態様では、本開示は、がんに対して患者にワクチン接種するための、ＴＧＦβアンタゴニストおよびがん抗原と組み合わせたＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの使用に関する。一部の態様では、本開示は、がんに対して患者にワクチン接種するための、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよびがん抗原と組み合わせたＴＧＦβアンタゴニストの使用に関する。一部の態様では、本開示は、病原体に対して患者にワクチン接種するための、ＴＧＦβアンタゴニストおよび病原体抗原と組み合わせたＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの使用に関する。一部の態様では、本開示は、病原体に対して患者にワクチン接種するための、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび病原体抗原と組み合わせたＴＧＦβアンタゴニストの使用に関する。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍抗原は、以下のものからなる群から選択されるがんまたは腫瘍に関連する：白血病、黒色腫（例えば、転移性黒色腫）、肺がん（例えば、扁平上皮非小細胞肺がん）、腎細胞癌、膀胱がん、中皮腫（例えば、転移性中皮腫）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、食道がん、胃がん、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、多形性神経膠芽腫、および肉腫（例えば、転移性肉腫）。一部の実施形態では、病原体抗原は、細菌性病原体、ウイルス性病原体、真菌性病原体、または寄生虫性病原体からなる群から選択される病原体に関連する。一部の実施形態では、がん抗原は、ワクチン接種プロトコールに従って投与される。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、ワクチン接種プロトコールに従って投与される。一部の実施形態では、病原体抗原は、ワクチン接種プロトコールに従って投与される。一部の実施形態では、患者には、がんまたは腫瘍を処置するための１つまたは複数の追加活性剤および／または支持療法がさらに投与される。一部の実施形態では、患者には、病原体を処置するための１つまたは複数の追加活性剤および／または支持療法がさらに投与される。一部の実施形態では、患者には、１つまたは複数の追加免疫腫瘍学的作用剤がさらに投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加免疫腫瘍学的作用剤は、以下のものからなる群から選択される：アレムツズマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合剤（例えば、ＰＤ－Ｌ１抗体）、ＣＤ２０指向性細胞溶解結合剤（例えば、ＣＤ－２０抗体）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）結合剤（例えば、ＣＴＬＡ－４抗体）、およびプログラム死受容体１（ＰＤ－１）結合剤（例えば、ＰＤ－１抗体）。一部の実施形態では、がんは、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、がんは、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんは、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんは、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、腫瘍は、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、病原体は、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、病原体は、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、病原体は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、病原体は、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、患者は、免疫疲弊に関連した疾患または状態を有する。一部の実施形態では、患者は、自己免疫疾患を有していない。一部の実施形態では、患者は、組織もしくは臓器移植を経験している最中でもなく、組織もしくは臓器移植を受けたこともない。一部の実施形態では、患者は、移植片対宿主疾患を有していない。

【0013】

ある特定の態様では、本開示は、ワクチンにより誘導された患者の免疫応答を強化するための方法であって、患者に、ＴＧＦβアンタゴニストおよびＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを、ワクチンにより誘導された患者の免疫応答を強化するための有効な量で投与することを含む方法に関する。一部の態様では、本開示は、それを必要とする患者の、ワクチンにより誘導された免疫応答を強化するための、ＴＧＦβアンタゴニストと組み合わせたＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの使用に関する。一部の態様では、本開示は、それを必要とする患者の、ワクチンにより誘導された免疫応答を強化するための、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストと組み合わせたＴＧＦβアンタゴニストの使用に関する。一部の実施形態では、ワクチンは、がんワクチンである。一部の実施形態では、ワクチンは、腫瘍ワクチンである。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、がんの成長を阻害する。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、腫瘍の成長を阻害する。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、患者のがん細胞負荷を減少させる。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、患者の腫瘍細胞負荷を減少させる。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、がん転移を処置または予防する。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、腫瘍転移を処置または予防する。一部の実施形態では、がんは、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、がんは、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんは、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんは、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、腫瘍は、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、患者は、以下のものからなる群から選択されるがんまたは腫瘍を有する：白血病、黒色腫（例えば、転移性黒色腫）、肺がん（例えば、扁平上皮非小細胞肺がん）、腎細胞癌、膀胱がん、中皮腫（例えば、転移性中皮腫）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、食道がん、胃がん、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、多形性神経膠芽腫、および肉腫（例えば、転移性肉腫）。一部の実施形態では、ワクチンは、病原体ワクチンである。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、病原体による患者の感染を処置する。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、病原体による患者の感染を予防する。一部の実施形態では、病原体は、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、病原体は、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、病原体は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、病原体は、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、病原体は、細菌性、ウイルス性、真菌性、または寄生虫性病原体からなる群から選択される。一部の実施形態では、患者は、免疫疲弊を発症するリスクがある。一部の実施形態では、患者は、免疫疲弊に関連した疾患または状態を有する。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、Ｔ細胞免疫応答を含む。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、がんまたは病原体に対して患者にワクチン接種する。一部の実施形態では、患者には、がんまたは腫瘍を処置するための１つまたは複数の追加活性剤および／または支持療法がさらに投与される。一部の実施形態では、患者には、病原体を処置するための１つまたは複数の追加活性剤および／または支持療法がさらに投与される。一部の実施形態では、患者には、１つまたは複数の追加免疫腫瘍学的作用剤がさらに投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加免疫腫瘍学的作用剤は、以下のものからなる群から選択される：アレムツズマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合剤（例えば、ＰＤ－Ｌ１抗体）、ＣＤ２０指向性細胞溶解結合剤（例えば、ＣＤ－２０抗体）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）結合剤（例えば、ＣＴＬＡ－４抗体）、およびプログラム死受容体１（ＰＤ－１）結合剤（例えば、ＰＤ－１抗体）。一部の実施形態では、患者は、自己免疫疾患を有していない。一部の実施形態では、患者は、組織もしくは臓器移植を経験している最中でもなく、組織もしくは臓器移植を受けたこともない。一部の実施形態では、患者は、移植片対宿主疾患を有していない。

【0014】

ある特定の態様では、本開示は、患者の免疫応答を誘導するための方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＴＧＦβアンタゴニストを投与することを含む方法に関する。一部の態様では、本開示は、患者の免疫応答を強化するための方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＴＧＦβアンタゴニストを投与することを含む方法に関する。一部の態様では、本開示は、それを必要とする患者の免疫応答を誘導または強化するための、ＴＧＦβアンタゴニストの使用に関する。一部の実施形態では、患者は、がんを有する。一部の実施形態では、患者は、腫瘍を有する。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、がんに対するものである。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、腫瘍に対するものである。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、がんの成長を阻害する。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、腫瘍の成長を阻害する。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、患者のがん細胞負荷を減少させる。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、患者の腫瘍細胞負荷を減少させる。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、がん転移を処置または予防する。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、腫瘍転移を処置または予防する。一部の実施形態では、がんは、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、がんは、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんは、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんは、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、腫瘍は、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、患者は、以下のものからなる群から選択されるがんまたは腫瘍を有する：白血病、黒色腫（例えば、転移性黒色腫）、肺がん（例えば、扁平上皮非小細胞肺がん）、腎細胞癌、膀胱がん、中皮腫（例えば、転移性中皮腫）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、食道がん、胃がん、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、多形性神経膠芽腫、および肉腫（例えば、転移性肉腫）。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、病原体に対するものである。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、病原体による患者の感染を処置する。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、病原体による患者の感染を予防する。一部の実施形態では、病原体は、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、病原体は、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、病原体は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、病原体は、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、病原体は、細菌性、ウイルス性、真菌性、または寄生虫性病原体からなる群から選択される。一部の実施形態では、患者は、免疫疲弊を発症するリスクがある。一部の実施形態では、患者は、免疫疲弊に関連した疾患または状態を有する。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、Ｔ細胞免疫応答を含む。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、がんまたは病原体に対して患者にワクチン接種する。一部の実施形態では、患者には、がんまたは腫瘍を処置するための１つまたは複数の追加活性剤および／または支持療法がさらに投与される。一部の実施形態では、患者には、病原体を処置するための１つまたは複数の追加活性剤および／または支持療法がさらに投与される。一部の実施形態では、患者には、１つまたは複数の追加免疫腫瘍学的作用剤がさらに投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加免疫腫瘍学的作用剤は、以下のものからなる群から選択される：アレムツズマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合剤（例えば、ＰＤ－Ｌ１抗体）、ＣＤ２０指向性細胞溶解結合剤（例えば、ＣＤ－２０抗体）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）結合剤（例えば、ＣＴＬＡ－４抗体）、およびプログラム死受容体１（ＰＤ－１）結合剤（例えば、ＰＤ－１抗体）。一部の実施形態では、患者は、自己免疫疾患を有していない。一部の実施形態では、患者は、組織もしくは臓器移植を経験している最中でもなく、組織もしくは臓器移植を受けたこともない。一部の実施形態では、患者は、移植片対宿主疾患を有していない。

【0015】

ある特定の態様では、本開示は、患者のがんを処置するための方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＴＧＦβアンタゴニストを投与することを含む方法に関する。一部の態様では、本開示は、患者の腫瘍を処置するための方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＴＧＦβアンタゴニストを投与することを含む方法に関する。一部の態様では、本開示は、それを必要とする患者のがんまたは腫瘍を処置するための、ＴＧＦβアンタゴニストの使用に関する。一部の実施形態では、方法は、がんの成長を阻害する。一部の実施形態では、方法は、腫瘍の成長を阻害する。一部の実施形態では、方法は、患者のがん細胞負荷を減少させる。一部の実施形態では、方法は、患者の腫瘍細胞負荷を減少させる。一部の実施形態では、方法は、がん転移を処置または予防する。一部の実施形態では、方法は、腫瘍転移を処置または予防する。一部の実施形態では、がんは、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、がんは、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんは、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんは、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、腫瘍は、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、患者は、以下のものからなる群から選択されるがんまたは腫瘍を有する：白血病、黒色腫（例えば、転移性黒色腫）、肺がん（例えば、扁平上皮非小細胞肺がん）、腎細胞癌、膀胱がん、中皮腫（例えば、転移性中皮腫）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、食道がん、胃がん、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、多形性神経膠芽腫、および肉腫（例えば、転移性肉腫）。一部の実施形態では、患者は、免疫疲弊を発症するリスクがある。一部の実施形態では、患者は、免疫疲弊に関連した疾患または状態を有する。一部の実施形態では、患者には、がんまたは腫瘍を処置するための１つまたは複数の追加活性剤および／または支持療法がさらに投与される。一部の実施形態では、患者には、１つまたは複数の追加免疫腫瘍学的作用剤がさらに投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加免疫腫瘍学的作用剤は、以下のものからなる群から選択される：アレムツズマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合剤（例えば、ＰＤ－Ｌ１抗体）、ＣＤ２０指向性細胞溶解結合剤（例えば、ＣＤ－２０抗体）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）結合剤（例えば、ＣＴＬＡ－４抗体）、およびプログラム死受容体１（ＰＤ－１）結合剤（例えば、ＰＤ－１抗体）。一部の実施形態では、患者は、自己免疫疾患を有していない。一部の実施形態では、患者は、組織もしくは臓器移植を経験している最中でもなく、組織もしくは臓器移植を受けたこともない。一部の実施形態では、患者は、移植片対宿主疾患を有していない。

【0016】

ある特定の態様では、本開示は、患者の免疫疲弊を処置するための方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＴＧＦβアンタゴニストを投与することを含む方法に関する。一部の態様では、本開示は、患者の免疫疲弊を予防するための方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＴＧＦβアンタゴニストを投与することを含む方法に関する。一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者の免疫疲弊を処置または予防するための、ＴＧＦβアンタゴニストの使用に関する。一部の実施形態では、患者は、がんを有する。一部の実施形態では、患者は、腫瘍を有する。一部の実施形態では、方法は、がんの成長を阻害する。一部の実施形態では、方法は、腫瘍の成長を阻害する。一部の実施形態では、方法は、患者のがん細胞負荷を減少させる。一部の実施形態では、方法は、患者の腫瘍細胞負荷を減少させる。一部の実施形態では、方法は、がん転移を処置または予防する。一部の実施形態では、方法は、腫瘍転移を処置または予防する。一部の実施形態では、がんは、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、がんは、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんは、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんは、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、腫瘍は、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、患者は、以下のものからなる群から選択されるがんまたは腫瘍を有する：白血病、黒色腫（例えば、転移性黒色腫）、肺がん（例えば、扁平上皮非小細胞肺がん）、腎細胞癌、膀胱がん、中皮腫（例えば、転移性中皮腫）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、食道がん、胃がん、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、多形性神経膠芽腫、および肉腫（例えば、転移性肉腫）。一部の実施形態では、患者は病原体に感染している。一部の実施形態では、方法は、病原体による患者の感染を処置する。一部の実施形態では、方法は、病原体による患者の感染を予防する。一部の実施形態では、病原体は、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、病原体は、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、病原体は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、病原体は、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、病原体は、細菌性、ウイルス性、真菌性、または寄生虫性病原体からなる群から選択される。一部の実施形態では、免疫疲弊は、Ｔ細胞免疫疲弊を含む。一部の実施形態では、患者には、がんまたは腫瘍を処置するための１つまたは複数の追加活性剤および／または支持療法がさらに投与される。一部の実施形態では、患者には、病原体を処置するための１つまたは複数の追加活性剤および／または支持療法がさらに投与される。一部の実施形態では、患者には、１つまたは複数の追加免疫腫瘍学的作用剤がさらに投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加免疫腫瘍学的作用剤は、以下のものからなる群から選択される：アレムツズマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合剤（例えば、ＰＤ－Ｌ１抗体）、ＣＤ２０指向性細胞溶解結合剤（例えば、ＣＤ－２０抗体）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）結合剤（例えば、ＣＴＬＡ－４抗体）、およびプログラム死受容体１（ＰＤ－１）結合剤（例えば、ＰＤ－１抗体）。一部の実施形態では、患者は、自己免疫疾患を有していない。一部の実施形態では、患者は、組織もしくは臓器移植を経験している最中でもなく、組織もしくは臓器移植を受けたこともない。一部の実施形態では、患者は、移植片対宿主疾患を有していない。

【0017】

ある特定の態様では、本開示は、抗原に対する患者の免疫応答を誘導するための方法であって、それを必要とする患者に、ＴＧＦβアンタゴニストおよび抗原を投与することを含み、ＴＧＦβアンタゴニストおよび抗原は、有効量で投与される方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、抗原に対する患者の免疫応答を強化するための方法であって、それを必要とする患者に、ＴＧＦβアンタゴニストおよび抗原を投与することを含み、ＴＧＦβアンタゴニストおよび抗原は、有効量で投与される方法に関する。一部の態様では、本開示は、それを必要とする患者の抗原に対する免疫応答を誘導または強化するための、ＴＧＦβアンタゴニストの使用に関する。一部の実施形態では、抗原は、がん抗原である。一部の実施形態では、抗原は、腫瘍抗原である。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍抗原は、以下のものからなる群から選択されるがんまたは腫瘍に関連する：白血病、黒色腫（例えば、転移性黒色腫）、肺がん（例えば、扁平上皮非小細胞肺がん）、腎細胞癌、膀胱がん、中皮腫（例えば、転移性中皮腫）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、食道がん、胃がん、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、多形性神経膠芽腫、および肉腫（例えば、転移性肉腫）。一部の実施形態では、抗原は、病原体抗原である。一部の実施形態では、病原体抗原は、細菌性病原体、ウイルス性病原体、真菌性病原体、または寄生虫性病原体からなる群から選択される病原体に関連する。一部の実施形態では、がん抗原は、ワクチン接種プロトコールに従って投与される。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、ワクチン接種プロトコールに従って投与される。一部の実施形態では、病原体抗原は、ワクチン接種プロトコールに従って投与される。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、がんに対して患者にワクチン接種する。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、腫瘍に対して患者にワクチン接種する。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、病原体に対して患者にワクチン接種する。一部の実施形態では、患者には、がんまたは腫瘍を処置するための１つまたは複数の追加活性剤および／または支持療法がさらに投与される。一部の実施形態では、患者には、病原体を処置するための１つまたは複数の追加活性剤および／または支持療法がさらに投与される。一部の実施形態では、患者には、１つまたは複数の追加免疫腫瘍学的作用剤がさらに投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加免疫腫瘍学的作用剤は、以下のものからなる群から選択される：アレムツズマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合剤（例えば、ＰＤ－Ｌ１抗体）、ＣＤ２０指向性細胞溶解結合剤（例えば、ＣＤ－２０抗体）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）結合剤（例えば、ＣＴＬＡ－４抗体）、およびプログラム死受容体１（ＰＤ－１）結合剤（例えば、ＰＤ－１抗体）。一部の実施形態では、がんは、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、がんは、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんは、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんは、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、腫瘍は、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、病原体は、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、病原体は、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、病原体は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、病原体は、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、患者は、免疫疲弊に関連した疾患または状態を有する。一部の実施形態では、患者は、自己免疫疾患を有していない。一部の実施形態では、患者は、組織もしくは臓器移植を経験している最中でもなく、組織もしくは臓器移植を受けたこともない。一部の実施形態では、患者は、移植片対宿主疾患を有していない。

【0018】

ある特定の態様では、本開示は、がんに対して患者にワクチン接種するための方法であって、それを必要とする患者に、ＴＧＦβアンタゴニストおよびがん抗原を投与することを含み、ＴＧＦβアンタゴニストおよび抗原は、患者のワクチン接種に有効な量で投与される方法に関する。一部の態様では、本開示は、病原体に対して患者にワクチン接種するための方法であって、それを必要とする患者に、ＴＧＦβアンタゴニストおよび病原体抗原を投与することを含み、ＴＧＦβアンタゴニストおよび抗原は、患者のワクチン接種に有効な量で投与される方法に関する。一部の態様では、本開示は、病原体またはがんに対して患者にワクチン接種するための、病原体またはがん抗原と組み合わせたＴＧＦβアンタゴニストの使用に関する。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍抗原は、以下のものからなる群から選択されるがんまたは腫瘍に関連する：白血病、黒色腫（例えば、転移性黒色腫）、肺がん（例えば、扁平上皮非小細胞肺がん）、腎細胞癌、膀胱がん、中皮腫（例えば、転移性中皮腫）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、食道がん、胃がん、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、多形性神経膠芽腫、および肉腫（例えば、転移性肉腫）。一部の実施形態では、病原体抗原は、細菌性病原体、ウイルス性病原体、真菌性病原体、または寄生虫性病原体からなる群から選択される病原体に関連する。一部の実施形態では、がん抗原は、ワクチン接種プロトコールに従って投与される。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、ワクチン接種プロトコールに従って投与される。一部の実施形態では、病原体抗原は、ワクチン接種プロトコールに従って投与される。一部の実施形態では、患者には、がんまたは腫瘍を処置するための１つまたは複数の追加活性剤および／または支持療法がさらに投与される。一部の実施形態では、患者には、病原体を処置するための１つまたは複数の追加活性剤および／または支持療法がさらに投与される。一部の実施形態では、患者には、１つまたは複数の追加免疫腫瘍学的作用剤がさらに投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加免疫腫瘍学的作用剤は、以下のものからなる群から選択される：アレムツズマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合剤（例えば、ＰＤ－Ｌ１抗体）、ＣＤ２０指向性細胞溶解結合剤（例えば、ＣＤ－２０抗体）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）結合剤（例えば、ＣＴＬＡ－４抗体）、およびプログラム死受容体１（ＰＤ－１）結合剤（例えば、ＰＤ－１抗体）。一部の実施形態では、がんは、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、がんは、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんは、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんは、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、腫瘍は、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、病原体は、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、病原体は、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、病原体は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、病原体は、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、患者は、免疫疲弊に関連した疾患または状態を有する。一部の実施形態では、患者は、自己免疫疾患を有していない。一部の実施形態では、患者は、組織もしくは臓器移植を経験している最中でもなく、組織もしくは臓器移植を受けたこともない。一部の実施形態では、患者は、移植片対宿主疾患を有していない。

【0019】

ある特定の態様では、本開示は、ワクチンにより誘導された患者の免疫応答を強化することであって、ＴＧＦβアンタゴニストを、ワクチンにより誘導された患者の免疫応答を強化するための有効な量で患者に投与することを含むことに関する。一部の態様では、本開示は、それを必要とする患者の、ワクチンにより誘導された免疫応答を強化するための、ＴＧＦβアンタゴニストの使用に関する。一部の実施形態では、ワクチンは、がんワクチンである。一部の実施形態では、ワクチンは、腫瘍ワクチンである。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、がんの成長を阻害する。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、腫瘍の成長を阻害する。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、患者のがん細胞負荷を減少させる。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、患者の腫瘍細胞負荷を減少させる。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、がん転移を処置または予防する。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、腫瘍転移を処置または予防する。一部の実施形態では、がんは、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、がんは、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんは、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、腫瘍は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、がんは、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、腫瘍は、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、患者は、以下のものからなる群から選択されるがんまたは腫瘍を有する：白血病、黒色腫（例えば、転移性黒色腫）、肺がん（例えば、扁平上皮非小細胞肺がん）、腎細胞癌、膀胱がん、中皮腫（例えば、転移性中皮腫）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、食道がん、胃がん、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、多形性神経膠芽腫、および肉腫（例えば、転移性肉腫）。一部の実施形態では、ワクチンは、病原体ワクチンである。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、病原体による患者の感染を処置する。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、病原体による患者の感染を予防する。一部の実施形態では、病原体は、患者の免疫抑制を促進する。一部の実施形態では、病原体は、患者の免疫細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、病原体は、Ｔ細胞疲弊を促進する。一部の実施形態では、病原体は、免疫療法に応答性である。一部の実施形態では、病原体は、細菌性、ウイルス性、真菌性、または寄生虫性病原体からなる群から選択される。一部の実施形態では、患者は、免疫疲弊を発症するリスクがある。一部の実施形態では、患者は、免疫疲弊に関連した疾患または状態を有する。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、Ｔ細胞免疫応答を含む。一部の実施形態では、開始または強化された免疫応答は、がんまたは病原体に対して患者にワクチン接種する。一部の実施形態では、患者には、がんまたは腫瘍を処置するための１つまたは複数の追加活性剤および／または支持療法がさらに投与される。一部の実施形態では、患者には、病原体を処置するための１つまたは複数の追加活性剤および／または支持療法がさらに投与される。一部の実施形態では、患者には、１つまたは複数の追加免疫腫瘍学的作用剤がさらに投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加免疫腫瘍学的作用剤は、以下のものからなる群から選択される：アレムツズマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合剤（例えば、ＰＤ－Ｌ１抗体）、ＣＤ２０指向性細胞溶解結合剤（例えば、ＣＤ－２０抗体）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）結合剤（例えば、ＣＴＬＡ－４抗体）、およびプログラム死受容体１（ＰＤ－１）結合剤（例えば、ＰＤ－１抗体）。一部の実施形態では、患者は、自己免疫疾患を有していない。一部の実施形態では、患者は、組織もしくは臓器移植を経験している最中でもなく、組織もしくは臓器移植を受けたこともない。一部の実施形態では、患者は、移植片対宿主疾患を有していない。

【0020】

一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、特に下流シグナル伝達を阻害する、ＡｃｔＲＩＩ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）および／またはＡＬＫ４を阻害することができる作用剤である。したがって、一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩおよび／またはＡＬＫ４結合リガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、および／またはＢＭＰ９］を阻害することができる作用剤である。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、ＡｃｔＲＩＩおよび／またはＡＬＫ４シグナル伝達経路の１つまたは複数の細胞内メディエータ（例えば、Ｓｍａｄ２および３）を阻害することができる作用剤である。そのようなＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト剤としては、例えば、以下のものが挙げられる：ＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢ）ポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩポリペプチドの組合せ、ならびにそれらのバリアント（例えば、ＧＤＦトラップポリペプチド）；１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩリガンド、ＡＬＫ４受容体、および／またはＡｃｔＲＩＩ受容体を阻害する抗体または抗体の組合せ；１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩリガンド、ＡＬＫ４、ＡｃｔＲＩＩ受容体、ならびに／またはＡｃｔＲＩＩおよび／もしくはＡＬＫ４下流シグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ）を阻害するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せ；１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩリガンド、ＡＬＫ４、ＡｃｔＲＩＩ受容体、ならびに／またはＡｃｔＲＩＩおよび／もしくはＡＬＫ４下流シグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ）を阻害する低分子または低分子の組合せ、ならびにそれらの組合せ。ある特定の好ましい実施形態では、本開示の教示に従って使用されるＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともアクチビン、特にアクチビンＡを阻害する。

【0021】

ある特定の態様では、本明細書に記載の方法および使用に従って使用されるＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＧＤＦ１１を阻害する作用剤である。ＧＤＦ１１阻害に対する効果は、例えば、本明細書に記載のもの（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む、細胞に基づくアッセイを使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ１１アンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＧＤＦ１１に結合することができる。リガンド結合活性は、例えば、本明細書に記載のものを含む、例えば、結合親和性アッセイを使用して決定することができる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０^－７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０^－８Ｍ、少なくとも１×１０^－９Ｍ、少なくとも１×１０^－１０Ｍ、少なくとも１×１０^－１１Ｍ、または少なくとも１×１０^－１２Ｍ）のＫ_Ｄで少なくともＧＤＦ１１に結合する。

【0022】

ある特定の態様では、本明細書に記載の方法および使用に従って使用されるＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＧＤＦ８を阻害する作用剤である。ＧＤＦ８阻害に対する効果は、例えば、本明細書に記載のもの（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む、細胞に基づくアッセイを使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ８アンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＧＤＦ８に結合することができる。リガンド結合活性は、例えば、本明細書に記載のものを含む、例えば、結合親和性アッセイを使用して決定することができる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０^－７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０^－８Ｍ、少なくとも１×１０^－９Ｍ、少なくとも１×１０^－１０Ｍ、少なくとも１×１０^－１１Ｍ、または少なくとも１×１０^－１２Ｍ）のＫ_Ｄで少なくともＧＤＦ８に結合する。

【0023】

ある特定の態様では、本明細書に記載の方法および使用に従って使用されるＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、およびアクチビンＡＥ）を阻害する作用剤である。アクチビン阻害に対する効果は、例えば、本明細書に記載のもの（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む、細胞に基づくアッセイを使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示のアクチビンアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともアクチビンに結合することができる。リガンド結合活性は、例えば、本明細書に記載のものを含む、例えば、結合親和性アッセイを使用して決定することができる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０^－７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０^－８Ｍ、少なくとも１×１０^－９Ｍ、少なくとも１×１０^－１０Ｍ、少なくとも１×１０^－１１Ｍ、または少なくとも１×１０^－１２Ｍ）のＫ_Ｄで、少なくともアクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、および／またはアクチビンＥに結合する。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０^－７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０^－８Ｍ、少なくとも１×１０^－９Ｍ、少なくとも１×１０^－１０Ｍ、少なくとも１×１０^－１１Ｍ、または少なくとも１×１０^－１２Ｍ）のＫ_Ｄで、少なくともアクチビンＡに結合する。

【0024】

ある特定の態様では、本明細書に記載の方法および使用に従って使用されるＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＢＭＰ６を阻害する作用剤である。ＢＭＰ６阻害に対する効果は、例えば、本明細書に記載のもの（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む、細胞に基づくアッセイを使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示のＢＭＰ６アンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＢＭＰ６に結合することができる。リガンド結合活性は、例えば、本明細書に記載のものを含む、例えば、結合親和性アッセイを使用して決定することができる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０^－７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０^－８Ｍ、少なくとも１×１０^－９Ｍ、少なくとも１×１０^－１０Ｍ、少なくとも１×１０^－１１Ｍ、または少なくとも１×１０^－１２Ｍ）のＫ_Ｄで少なくともＢＭＰ６に結合する。

【0025】

ある特定の態様では、本明細書に記載の方法および使用に従って使用されるＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＧＤＦ３を阻害する作用剤である。ＧＤＦ３阻害に対する効果は、例えば、本明細書に記載のもの（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む、細胞に基づくアッセイを使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示のＧＤＦ３アンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＧＤＦ３に結合することができる。リガンド結合活性は、例えば、本明細書に記載のものを含む、例えば、結合親和性アッセイを使用して決定することができる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０^－７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０^－８Ｍ、少なくとも１×１０^－９Ｍ、少なくとも１×１０^－１０Ｍ、少なくとも１×１０^－１１Ｍ、または少なくとも１×１０^－１２Ｍ）のＫ_Ｄで少なくともＧＤＦ３に結合する。

【0026】

ある特定の態様では、本明細書に記載の方法および使用に従って使用されるＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＢＭＰ９を阻害する作用剤である。ＢＭＰ９阻害に対する効果は、例えば、本明細書に記載のもの（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む、細胞に基づくアッセイを使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示のＢＭＰ９アンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＢＭＰ９に結合することができる。リガンド結合活性は、例えば、本明細書に記載のものを含む、例えば、結合親和性アッセイを使用して決定することができる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０^－７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０^－８Ｍ、少なくとも１×１０^－９Ｍ、少なくとも１×１０^－１０Ｍ、少なくとも１×１０^－１１Ｍ、または少なくとも１×１０^－１２Ｍ）のＫ_Ｄで少なくともＢＭＰ９に結合する。

【0027】

ある特定の態様では、本明細書に記載の方法および使用に従って使用されるＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＢＭＰ１０を阻害する作用剤である。ＢＭＰ１０阻害に対する効果は、例えば、本明細書に記載のもの（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む、細胞に基づくアッセイを使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示のＢＭＰ１０アンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＢＭＰ１０に結合することができる。リガンド結合活性は、例えば、本明細書に記載のものを含む、例えば、結合親和性アッセイを使用して決定することができる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０^－７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０^－８Ｍ、少なくとも１×１０^－９Ｍ、少なくとも１×１０^－１０Ｍ、少なくとも１×１０^－１１Ｍ、または少なくとも１×１０^－１２Ｍ）のＫ_Ｄで少なくともＢＭＰ１０に結合する。

【0028】

ある特定の態様では、本明細書に記載の方法および使用に従って使用されるＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩＡを阻害する作用剤である。ＡｃｔＲＩＩＡ阻害に対する効果は、例えば、本明細書に記載のもの（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む、細胞に基づくアッセイを使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩＡに結合することができる。リガンド結合活性は、例えば、本明細書に記載のものを含む、例えば、結合親和性アッセイを使用して決定することができる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０^－７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０^－８Ｍ、少なくとも１×１０^－９Ｍ、少なくとも１×１０^－１０Ｍ、少なくとも１×１０^－１１Ｍ、または少なくとも１×１０^－１２Ｍ）のＫ_Ｄで少なくともＡｃｔＲＩＩＡに結合する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡに結合および／または阻害するＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、ＡｃｔＲＩＩＢにさらに結合および／または阻害することができる。

【0029】

ある特定の態様では、本明細書に記載の方法および使用に従って使用されるＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩＢを阻害する作用剤である。ＡｃｔＲＩＩＢ阻害に対する効果は、例えば、本明細書に記載のもの（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む、細胞に基づくアッセイを使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩＢに結合することができる。リガンド結合活性は、例えば、本明細書に記載のものを含む、例えば、結合親和性アッセイを使用して決定することができる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０^－７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０^－８Ｍ、少なくとも１×１０^－９Ｍ、少なくとも１×１０^－１０Ｍ、少なくとも１×１０^－１１Ｍ、または少なくとも１×１０^－１２Ｍ）のＫ_Ｄで少なくともＡｃｔＲＩＩＢに結合する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢに結合および／または阻害するＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、ＡｃｔＲＩＩＡにさらに結合および／または阻害することができる。

【0030】

ある特定の態様では、本明細書に記載の方法および使用に従って使用されるＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＡＬＫ４を阻害する作用剤である。ＡＬＫ４阻害に対する効果は、例えば、本明細書に記載のもの（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を含む、細胞に基づくアッセイを使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくともＡＬＫ４に結合することができる。リガンド結合活性は、例えば、本明細書に記載のものを含む、例えば、結合親和性アッセイを使用して決定することができる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはアンタゴニストの組合せは、少なくとも１×１０^－７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０^－８Ｍ、少なくとも１×１０^－９Ｍ、少なくとも１×１０^－１０Ｍ、少なくとも１×１０^－１１Ｍ、または少なくとも１×１０^－１２Ｍ）のＫ_Ｄで少なくともＡＬＫ４に結合する。

【0031】

ある特定の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドを含む組成物、およびそれらの使用に関する。用語「ＡｃｔＲＩＩポリペプチド」は、総称として、天然に存在するＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ならびに本明細書に記載のものなどのそれらの短縮体およびバリアント（例えば、ＧＤＦトラップポリペプチド）を指す。好ましくは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはその修飾（バリアント）形態のリガンド結合ドメインを含むか、から本質的になるか、またはからなる。例えば、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドのＡｃｔＲＩＩＡリガンド結合ドメイン、例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメインの部分を含む。同様に、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのＡｃｔＲＩＩＢリガンド結合ドメイン、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインの部分を含んでいてもよい。好ましくは、本明細書に記載の方法により使用されるＡｃｔＲＩＩポリペプチドは可溶性ポリペプチドである。

【0032】

ある特定の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、それを含む組成物、およびそれらの使用に関する。例えば、一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸３０～１１０の配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号５０のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。またさらに他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号５４のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号５７のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0033】

他の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、それを含む組成物、およびそれらの使用に関する。例えば、一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２９～１０９の配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２９～１０９の配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１を基準にして７９位に酸性アミノ酸［天然に存在するか（ＥまたはＤ）または人工の酸性アミノ酸］を含まない。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２５～１３１の配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２５～１３１の配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１を基準にして７９位に酸性アミノ酸を含まない。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１を基準にして７９位に酸性アミノ酸を含まない。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１を基準にして７９位に酸性アミノ酸を含まない。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１を基準にして７９位に酸性アミノ酸を含まない。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号４を基準にして７９位に酸性アミノ酸を含まない。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号４を基準にして７９位に酸性アミノ酸を含まない。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号４を基準にして７９位に酸性アミノ酸を含まない。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号５８のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号５８のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１を基準にして７９位に酸性アミノ酸を含まない。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６０のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６０のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１を基準にして７９位に酸性アミノ酸を含まない。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６３のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６３のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１を基準にして７９位に酸性アミノ酸を含まない。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６４のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６４のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１を基準にして７９位に酸性アミノ酸を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６５のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６５のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１を基準にして７９位に酸性アミノ酸を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６６のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６６のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１を基準にして７９位に酸性アミノ酸を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６８のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６８のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１を基準にして７９位に酸性アミノ酸を含まない。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６９のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６９のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなっていてもよく、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１を基準にして７９位に酸性アミノ酸を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号７０のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号７０のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１を基準にして７９位に酸性アミノ酸を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１２３のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では
、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１２３のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１を基準にして７９位に酸性アミノ酸を含まない。またさらに他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１３１のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１３１のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１を基準にして７９位に酸性アミノ酸を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１３２のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１３２のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１を基準にして７９位に酸性アミノ酸を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１３３のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１３３のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１を基準にして７９位に酸性アミノ酸を含む。

【0034】

他の態様では、本開示は、ＧＤＦトラップポリペプチドを含む組成物、およびそれらの使用に関する。一部の実施形態では、変更されたＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインを含むＧＤＦトラップは、アクチビンＡ結合のＫ_ｄのＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８結合のＫ_ｄに対する比が、野生型リガンド結合ドメインの比と比べて、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、またはさらに１０００倍大きい。必要に応じて、変更されたリガンド結合ドメインを含むＧＤＦトラップは、アクチビンＡ阻害のＩＣ_５０のＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８阻害のＩＣ_５０に対する比が、野生型ＡｃｔＲＩＩリガンド結合ドメインと比べて、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、１００倍、またはさらに１０００倍大きい。必要に応じて、変更されたリガンド結合ドメインを含むＧＤＦトラップは、アクチビンＡ阻害のＩＣ_５０よりも、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、またはさらに１００倍小さいＩＣ_５０で、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８を阻害する。こうしたＧＤＦトラップは、免疫グロブリンＦｃドメイン（野生型または突然変異体のいずれでもよい）を含む融合タンパク質であってよい。ある特定の場合では、主題の可溶性ＧＤＦトラップは、ＧＤＦ８および／またはＧＤＦ１１媒介性細胞内シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達）のアンタゴニスト（阻害剤）である。

【0035】

一部の実施形態では、本開示は、変更されたリガンド結合（例えば、ＧＤＦ１１結合）ドメインを含む可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドであるＧＤＦトラップを提供する。変更されたリガンド結合ドメインを有するＧＤＦトラップは、例えば、ヒトＡｃｔＲＩＩＢのＥ３７、Ｅ３９、Ｒ４０、Ｋ５５、Ｒ５６、Ｙ６０、Ａ６４、Ｋ７４、Ｗ７８、Ｌ７９、Ｄ８０、Ｆ８２、およびＦ１０１などのアミノ酸残基に、１つまたは複数の突然変異を含んでいてもよい（付番は、配列番号１を基準とする）。必要に応じて、変更されたリガンド結合ドメインは、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体の野生型リガンド結合ドメインと比べて、ＧＤＦ８／ＧＤＦ１１などのリガンドに対する増加された選択性を有することができる。例示のためだが、こうした突然変異は、変更されたリガンド結合ドメインの、ＧＤＦ１１（およびしたがっておそらくは、ＧＤＦ８）に対する選択性を、アクチビンよりも増加させることが本明細書で実証されている：Ｋ７４Ｙ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ、Ｌ７９Ｄ、Ｌ７９Ｅ、およびＤ８０Ｉ。以下の突然変異は、逆の効果を有し、アクチビン結合の比をＧＤＦ１１よりも増加させる：Ｄ５４Ａ、Ｋ５５Ａ、Ｌ７９Ａ、およびＦ８２Ａ。全体的な（ＧＤＦ１１およびアクチビン）結合活性は、「尾部」領域またはおそらくは構造不定のリンカー領域の介在により、およびさらにＫ７４Ａ突然変異の使用により増加させることができる。リガンド結合親和性の全体的な減少を引き起こした他の突然変異としては、Ｒ４０Ａ、Ｅ３７Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｗ７８Ａ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｒ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｍ、およびＤ８０Ｎが挙げられる。突然変異は、所望の効果を達成するために組み合わせることができる。例えば、ＧＤＦ１１：アクチビン結合の比に影響を及ぼす突然変異の多くは、リガンド結合に対して全体的に負の効果を示すため、それらを、一般にリガンド結合を増加させる突然変異と組み合わせて、リガンド選択性を有する向上された結合タンパク質を生成することができる。例示的な実施形態では、ＧＤＦトラップは、必要に応じて、追加のアミノ酸置換、付加、または欠失と組み合わせて、Ｌ７９ＤまたはＬ７９Ｅ突然変異を含むＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドである。

【0036】

一部の実施形態では、本開示のＴＧＦβアンタゴニストは、特に下流シグナル伝達を阻害する、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ５、および／またはベータグリカンを阻害することができる作用剤である。したがって、一部の実施形態では、本開示のＴＧＦβアンタゴニストは、１つまたは複数のＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ５、および／またはベータグリカン結合リガンド［例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、および／またはＴＧＦβ３］を阻害することができる作用剤である。一部の実施形態では、本開示のＴＧＦβアンタゴニストは、ＴＧＦβおよび／またはＡＬＫ５シグナル伝達経路の１つまたは複数の細胞内メディエータ（例えば、Ｓｍａｄ）を阻害することができる作用剤である。そのようなＴＧＦβアンタゴニスト剤としては、例えば、以下のものが挙げられる：ＴＧＦβＲＩＩポリペプチドならびにそれらのバリアント；１つまたは複数のＴＧＦβリガンド、ＡＬＫ５受容体、ベータグリカン、および／またはＴＧＦβＲＩＩ受容体を阻害する抗体または抗体の組合せ；１つまたは複数のＴＧＦβリガンド、ＡＬＫ５、ベータグリカン、ＴＧＦβＲＩＩ受容体、ならびに／またはＴＧＦβＲＩＩおよび／もしくはＡＬＫ５下流シグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ）を阻害するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せ；１つまたは複数のＴＧＦβリガンド、ＡＬＫ５、ベータグリカン、ＴＧＦβＲＩＩ受容体、ならびに／またはＴＧＦβＲＩＩおよび／もしくはＡＬＫ５下流シグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ）を阻害する低分子または低分子の組合せ、ならびにそれらの組合せ。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、ＴＧＦβ１に結合および／または阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、ＴＧＦβ２に結合および／または阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、ＴＧＦβ３に結合および／または阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に結合および／または阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２に結合および／または阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に結合および／または阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３に結合および／または阻害する。

【0037】

ある特定の態様では、本開示は、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、それを含む組成物、およびそれらの使用に関する。例えば、一部の実施形態では、本開示のＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、配列番号３５のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１４８のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。またさらに他の実施形態では、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１５０のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0038】

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法および使用に従って使用される作用剤は、ＡｃｔＲＩＩおよびＴＧＦβの両方のアンタゴニストである（ＡｃｔＲＩＩ：ＴＧＦβ）。ＡｃｔＲＩＩ：ＴＧＦβアンタゴニストは、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡｃｔＲＩＩ－およびＡＬＫ４－結合リガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、および／またはＢＭＰ９］、および下流シグナル伝達メディエータ（例えば、Ｓｍａｄ）の１つまたは複数を阻害することができ、ならびにＴＧＦβＲＩＩ；ＡＬＫ５；ベータグリカン；ＴＧＦβＲＩＩ－、ＡＬＫ５－、およびベータグリカン－結合リガンド［例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、および／またはＴＧＦβ３］、および下流シグナル伝達メディエータ（例えば、Ｓｍａｄ）の１つまたは複数を阻害することができる作用剤である。例えば、ＡｃｔＲＩＩ：ＴＧＦβアンタゴニストは、アクチビンＡおよびＴＧＦβ２の両方に結合し、両方を阻害する二重特異性抗体であってもよい。別の例として、ＡｃｔＲＩＩ：ＴＧＦβアンタゴニストは、１つまたは複数のＳｍａｄ、特にＳｍａｄ２および３を阻害するポリヌクレオチドまたは低分子であってもよい。

【0039】

本明細書に記載されているように、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、およびそれらのバリアントは、ホモ多量体、例えばホモ二量体、ホモ三量体、ホモ四量体、ホモ五量体、およびより高次のホモ多量体複合体であってもよい。ある特定の好ましい実施形態では、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、ホモ二量体である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびＴＧＦβＲＩＩポリペプチド二量体は、第２のＡｃｔＲＩＩまたはＴＧＦβＲＩＩポリペプチドと共有結合でまたは非共有結合で会合している第１のＡｃｔＲＩＩまたはＴＧＦβＲＩＩポリペプチドを含み、第１のポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩドメインまたはＴＧＦβＲＩＩドメインおよび相互作用対の第１のメンバー（または第２のメンバー）（例えば、免疫グロブリンの定常ドメイン）のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＴＧＦβＲＩＩポリペプチドおよび相互作用対の第２のメンバー（または第１のメンバー）のアミノ酸配列を含む。

【0040】

ある特定の態様では、それらのバリアントを含む、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、融合タンパク質であってもよい。例えば、一部の実施形態では、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチドのＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドドメインまたはＴＧＦβＲＩＩポリペプチドドメインおよび１つまたは複数の異種性（非ＡｃｔＲＩＩまたは非ＴＧＦβＲＩＩ）ポリペプチドドメインを含む融合タンパク質であってもよい。一部の実施形態では、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチドのＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＴＧＦβＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩ受容体、ＴＧＦβＲＩＩ受容体、またはそれらのバリアントのリガンド結合ドメイン）、および薬物動態の向上、より容易な精製、特定組織の標的化などの所望の特性を提供する１つまたは複数の異種性ドメインに由来するアミノ酸配列を１つのドメインとして有する融合タンパク質であってもよい。例えば、融合タンパク質のドメインは、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期、取込み／投与、組織局在化または分布、タンパク質複合体の形成、融合タンパク質の多量体化、および／または精製の１つまたは複数を増強することができる。必要に応じて、融合タンパク質のＴＧＦβＲＩＩポリペプチドドメインのＡｃｔＲＩＩポリペプチドドメインは、１つまたは複数の異種性ポリペプチドドメインに直接接続（融合）されているか、またはリンカーなどの介在配列が、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチドのＡｃｔＲＩＩポリペプチドのアミノ酸配列と、１つまたは複数の異種性ドメインのアミノ酸配列との間に位置してもよい。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩまたはＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質は、異種性ドメインと、ＴＧＦβＲＩＩドメインのＡｃｔＲＩＩドメインとの間に位置した比較的構造不定なリンカーを含む。リンカーは、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインのＣ末端のおよそ４～１５アミノ酸の構造不定領域（「尾部」）に対応してもよく、または二次構造を比較的含まない３～１５、２０、３０、５０、もしくはそれよりも多くのアミノ酸の人工配列であってもよい。リンカーは、グリシンおよびプロリン残基を多く含んでいてもよく、例えば、トレオニン／セリンおよびグリシンの反復配列を含んでいてもよい。リンカーの例としては、これらに限定されないが、配列ＴＧＧＧ（配列番号３１）、ＳＧＧＧ（配列番号３２）、ＴＧＧＧＧ（配列番号２９）、ＳＧＧＧＧ（配列番号３０）、ＧＧＧＧＳ（配列番号３３）、ＧＧＧＧ（配列番号２８）、およびＧＧＧ（配列番号２７）が挙げられる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩまたはＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質は、例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分を含む、免疫グロブリンの定常ドメインを含んでいてもよい。例えば、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＥ、またはＩｇＭ免疫グロブリンのＦｃドメインに由来するアミノ酸配列。例えば、免疫グロブリンドメインのＦｃ部分は、配列番号２２～２６のいずれか１つと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでいてもよく、から本質的になっていてもよく、またはからなっていてもよい。そのような免疫グロブリンドメインは、変更されたＦｃ活性を付与する、例えば１つまたは複数のＦｃエフェクター機能を減少させる１つまたは複数のアミノ酸修飾（例えば、欠失、付加、および／または置換）を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質のＡｃｔＲＩＩは、式Ａ－Ｂ－Ｃで示されるようなアミノ酸配列を含む。例えば、Ｂ部分は、本明細書に記載のようなＮ－およびＣ末端短縮ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＴＧＦβＲＩＩポリペプチドである。ＡおよびＣ部分は、独立して、ゼロ、１つ、または１つよりも多くのアミノ酸であってもよく、ＡおよびＣ部分は両方とも、Ｂに対して異種性である。Ａおよび／またはＣ部分は、リンカー配列を介してＢ部分に付着していてもよい。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質のＡｃｔＲＩＩは、リーダー配列を含む。リーダー配列は、天然ＡｃｔＲＩＩもしくはＴＧＦβＲＩＩリーダー配列（例えば、天然ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、もしくはＴＧＦβＲＩＩリーダー配列）または異種性リーダー配列であってもよい。ある特定の実施形態では、リーダー配列は、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）リーダー配列である。

【0041】

本明細書に記載されているように、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体タンパク質複合体は、対応するＡｃｔＲＩＩＢおよびＡＬＫ４ホモ二量体と比較して、異なるリガンド結合プロファイル／選択性を有することが発見された。特に、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、いずれかのホモ二量体と比較してアクチビンＢに対して増強された結合を示し、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体で観察されるような、アクチビンＡ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１との強力な結合を保持し、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ３との実質的に低減された結合を示す。特に、ＢＭＰ９は、低いか観察可能ではないＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体に対する親和性を示すが、このリガンドは、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体に強力に結合する。ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体と同様に、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、ＢＭＰ６に対する中レベルの結合を保持する。図１９を参照されたい。したがって、こうした結果は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体が、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体と比較して、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１のより選択的なアンタゴニスト（阻害剤）であることを実証する。したがって、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、そのような選択的アンタゴニズムが有利であるようなある特定の応用では、ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体よりも有用であろう。例としては、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１の１つまたは複数のアンタゴニズムは保持するが、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ３の１つまたは複数のアンタゴニズムを最小限に抑えることが望ましい治療応用が挙げられる。さらに、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体は、患者のがんを処置することが示された。したがって、本開示は、部分的には、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体、および特にＴＧＦβアンタゴニストと組み合わせたその使用に関する。特定の作用機序に束縛されることは望まないが、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、およびアクチビンＡＣ）、ＧＤＦ８、および／またはＧＤＦ１１のうちの少なくとも１つまたは複数に結合するＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体ならびにそれらのバリアントは、がん患者において有益な効果を促進するための有用な作用剤となることが予想される。

【0042】

したがって、本開示は、少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドおよび少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体複合体（ヘテロ多量体）（ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体）、ならびにそれらの使用を提供する。好ましくは、ＡＬＫ４ポリペプチドは、ＡＬＫ４受容体のリガンド結合ドメイン、例えば、ＡＬＫ４細胞外ドメインの部分を含む。同様に、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、一般に、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体のリガンド結合ドメイン、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインの部分を含む。好ましくは、そのようなＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ならびに得られるそれらのヘテロ多量体は、可溶性である。

【0043】

ある特定の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１４のアミノ酸３４～１０１と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１５と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１９と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１４３と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１４５と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号７９と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号８０と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡＬＫ４アミノ酸配列を含む。

【0044】

ある特定の態様では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１のアミノ酸２９～１０９と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号２と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号３と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号５と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号６と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号５８と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号６０と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号６３と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１３９と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む。またさらに他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１４１と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号７７と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号７８と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＡｃｔＲＩＩＢアミノ酸配列を含んでいてもよい。ある特定の好ましい実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１のＬ７９に対応する位置に酸性アミノ酸（例えば、ＥまたはＤ）を含むＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含まない。

【0045】

本明細書に記載されているように、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体構造としては、例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体、ヘテロ五量体、およびより高次のヘテロ多量体複合体が挙げられる。例えば、図２１～２３を参照されたい。ある特定の好ましい実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ヘテロ二量体である。ある特定の態様では、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、融合タンパク質であってもよい。ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、本明細書に記載されているＡｃｔＲＩＩおよびＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質について上記に記載されているものと類似した融合タンパク質として生成されてもよい。

【0046】

それらのバリアントを含む、ＡｃｔＲＩＩ、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはＡＬＫ４ポリペプチドは、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン配列、およびＧＳＴ融合体などの精製部分配列を含んでいてもよい。必要に応じて、ＡｃｔＲＩＩ、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはＡＬＫ４ポリペプチドは、以下のものから選択される１つまたは複数の修飾アミノ酸残基を含む：グリコシル化アミノ酸、ペグ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分にコンジュゲートされたアミノ酸、および有機誘導体化剤にコンジュゲートされたアミノ酸。ＡｃｔＲＩＩ、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはＡＬＫ４ポリペプチドは、少なくとも１つのＮ－連結糖を含んでいてもよく、２つ、３つ、またはそれよりも多くのＮ－連結糖を含んでいてもよい。また、そのようなポリペプチドは、Ｏ－連結糖を含んでいてもよい。一般に、ＡｃｔＲＩＩ、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはＡＬＫ４ポリペプチドは、患者に不利な免疫応答の可能性を減少させるように、ポリペプチドの適切な天然グリコシル化を媒介する哺乳動物細胞株で発現されることが好ましい。ＡｃｔＲＩＩ、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはＡＬＫ４ポリペプチドは、操作された昆虫または酵母細胞、ならびにＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、およびＮＳＯ細胞などの哺乳動物細胞を含む、患者使用に好適な様式でタンパク質をグリコシル化する様々な細胞株で産生してもよい。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩ、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはＡＬＫ４ポリペプチドは、グリコシル化されており、チャイニーズハムスター卵巣細胞株から取得可能なグリコシル化パターンを有する。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩ、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはＡＬＫ４ポリペプチドは、哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）で、少なくとも４、６、１２、２４、３６、４８、または７２時間の血清半減期を示す。必要に応じて、ＡｃｔＲＩＩ、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはＡＬＫ４ポリペプチドは、哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）で、少なくとも６、８、１０、１２、１４、２０、２５、または３０日の血清半減期を示してもよい。

【0047】

ある特定の態様では、本開示は、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび／またはＴＧＦβアンタゴニストおよび薬学的に許容される担体を含む医薬調製物を提供する。また、医薬調製物は、本明細書に記載のような障害または状態［白血病、黒色腫（例えば、転移性黒色腫）、肺がん（例えば、扁平上皮非小細胞肺がん）、腎細胞癌、膀胱がん、中皮腫（例えば、転移性中皮腫）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、食道がん、胃がん、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、多形性神経膠芽腫、および肉腫（例えば、転移性肉腫）］を処置または予防するために使用される化合物などの１つまたは複数の追加活性剤を含んでいてもよい。

【0048】

本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび／またはＴＧＦβアンタゴニストはいずれも、医薬調製物（組成物）として製剤化されていてもよい。一部の実施形態では、医薬調製物は、薬学的に許容される担体を含む。医薬調製物は、好ましくは、パイロジェンフリーであろう（治療に使用するための製品の品質を管理する規制により要求される程度にパイロジェンフリーであること意味する）。また、医薬調製物は、本明細書に記載されている障害／状態を処置するために使用される化合物などの１つまたは複数の追加化合物を含んでいてもよい。一般に、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体医薬調製物は、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体を実質的に含まない。例えば、一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体医薬調製物は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満のＡＬＫ４ホモ多量体を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体医薬調製物は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満のＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体を含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体医薬調製物は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満のＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体を含む。

【0049】

ある特定の態様では、本開示のＴＧＦβアンタゴニストは、抗体または抗体の組合せである。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、ＴＧＦβ１に結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、ＴＧＦβ２に結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、ＴＧＦβ３に結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、多重特異性抗体である。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、二重特異性抗体である。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２に結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２に結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３に結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、フレソリムマブである。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、ＴＧＦβＲＩＩに結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦβＲＩＩに結合するＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＡＬＫ５、およびベータグリカンの１つまたは複数にさらに結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、ＡＬＫ５に結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ５に結合するＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴＧＦβＲＩＩ、およびベータグリカンの１つまたは複数にさらに結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、ベータグリカンに結合する。一部の実施形態では、ベータグリカンに結合するＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴＧＦβＲＩＩ、およびＡＬＫ５の１つまたは複数にさらに結合する。一部の実施形態では、本開示のＴＧＦβアンタゴニスト抗体は、特に多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体の場合、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体でもある。したがって、一部の実施形態では、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ５、およびベータグリカンの１つまたは複数に結合する抗体は、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９の１つまたは複数にさらに結合する。一部の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、およびアクチビンの１つまたは複数に結合する。一部の実施形態では、本開示の多重特異性抗体は、ＴＧＦβ２およびアクチビンＡに結合する。

【0050】

ある特定の態様では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、抗体または抗体の組合せである。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、多重特異性抗体である。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、二重特異性抗体である。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体は、以下のものからなる群から選択される１つまたは複数のリガンドに結合する：アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体は、アクチビンＡに結合する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体は、ＡｃｔＲＩＩＡに結合する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体は、ＡｃｔＲＩＩＢに結合する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体は、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢに結合する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体はＡＬＫ４に結合する。一部の実施形態では、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９の１つまたは複数に結合するＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体は、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４の１つまたは複数にさらに結合する。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体は、特に多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体の場合、ＴＧＦβアンタゴニスト抗体でもある。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９の１つまたは複数に結合する抗体は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ５、およびベータグリカンの１つまたは複数にさらに結合する。

【図面の簡単な説明】

【0051】

【図1】図１は、枠で示されるリガンドに直接接触させるために、複数のＡｃｔＲＩＩＢおよびＡｃｔＲＩＩＡ結晶構造の複合解析に基づいて、本明細書において推測される残基とヒトＡｃｔＲＩＩＢおよびヒトＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメインとのアライメントを示す。

【0052】

【図2】図２は、様々な脊椎動物ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質（配列番号１００～１０５）およびヒトＡｃｔＲＩＩＡ（配列番号１２２）の複数の配列アライメント、ならびにアライメントから誘導したコンセンサスＡｃｔＲＩＩ配列（配列番号１０６）を示す。

【0053】

【図3】図３は、様々な脊椎動物ＡｃｔＲＩＩＡタンパク質およびヒトＡｃｔＲＩＩＡ（配列番号１０７～１１４）の複数の配列アライメントを示す。

【0054】

【図4】図４は、様々な脊椎動物ＡＬＫ４タンパク質およびヒトＡＬＫ４（配列番号１１５～１２１）の複数の配列アライメントを示す。

【0055】

【図5】図５は、ＣＨＯ細胞において発現されたＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃの精製を示す。タンパク質は、サイジングカラム（上のパネル）およびクマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（下のパネル）によって可視化した場合、単一の明確なピークとして精製される（左のレーン：分子量標準物質；右のレーン：ＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃ）。

【0056】

【図6】図６は、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイによって測定した場合のアクチビン（上のパネル）およびＧＤＦ－１１（下のパネル）に対するＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃの結合を示す。

【0057】

【図7】図７は、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５～１３１）－ｈＦｃの完全な非プロセシングアミノ酸配列（配列番号１２３）を示す。ＴＰＡリーダー（残基１～２２）および２回短縮ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（残基２４～１３１、配列番号１の天然配列を基準とする付番を使用する）をそれぞれ、下線で示す。成熟融合タンパク質のＮ－末端アミノ酸であることがシークエンシングによって判明したグルタミン酸を強調して示し、これは配列番号１と比べて２５位に存在する。

【0058】

【図8-1】図８は、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５～１３１）－ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列を示す（コード鎖、配列番号１２４を上に示し、相補鎖、配列番号１２５を下に３’－５’で示す）。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１～６６）およびＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７３～３９６）をコードする配列を下線で示す。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５～１３１）の対応するアミノ酸配列も示す。

【図8-2】図８は、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５～１３１）－ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列を示す（コード鎖、配列番号１２４を上に示し、相補鎖、配列番号１２５を下に３’－５’で示す）。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１～６６）およびＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７３～３９６）をコードする配列を下線で示す。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５～１３１）の対応するアミノ酸配列も示す。

【0059】

【図9-1】図９は、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５～１３１）－ｈＦｃをコードする代替のヌクレオチド配列を示す（コード鎖、配列番号１２６を上に示し、相補鎖、配列番号１２７を下に３’－５’で示す）。この配列は、最初の形質転換体においてより大きいタンパク質発現レベルを付与し、細胞株の発達をより迅速なプロセスにする。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１～６６）およびＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７３～３９６）をコードする配列を下線で示し、ＥＣＤの野生型ヌクレオチド配列（図８を参照されたい）における置換を強調して示す。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５～１３１）の対応するアミノ酸配列も示す。

【図9-2】図９は、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５～１３１）－ｈＦｃをコードする代替のヌクレオチド配列を示す（コード鎖、配列番号１２６を上に示し、相補鎖、配列番号１２７を下に３’－５’で示す）。この配列は、最初の形質転換体においてより大きいタンパク質発現レベルを付与し、細胞株の発達をより迅速なプロセスにする。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１～６６）およびＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７３～３９６）をコードする配列を下線で示し、ＥＣＤの野生型ヌクレオチド配列（図８を参照されたい）における置換を強調して示す。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５～１３１）の対応するアミノ酸配列も示す。

【0060】

【図10】図１０は、ヒトＴＧＦβＩＩ型受容体（ｈＴβＲＩＩ）のＢ（短鎖）アイソフォームの天然前駆体のアミノ酸配列（ＮＰ＿００３２３３．４；配列番号３４）を示す。実線の下線は、成熟細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（残基２３～１５９）を示し、二重下線は、Ａ（長鎖）アイソフォームにおいて置き換えられているバリンを示す。破線の下線は、リーダー（残基１～２２）を示す。

【0061】

【図11】図１１は、ヒトＴβＲＩＩ（ＮＰ＿００１０２００１８．１；配列番号３５）のＡ（長鎖）アイソフォームの天然前駆体のアミノ酸配列を示す。実線の下線は、成熟ＥＣＤ（残基２３～１８４）を示し、二重下線は、スプライシングによって生成されたイソロイシン置換を示す。破線の下線はリーダー（残基１～２２）を示す。

【0062】

【図12】図１２は、ＴＰＡリーダー（二重下線）、短縮ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１の残基２５～１３１；一重下線）、およびｈＦｃドメインを含む短縮ＧＤＦトラップＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５～１３１）－ｈＦｃの完全なアミノ酸配列（配列番号１３１）を示す。シークエンシングによって成熟融合タンパク質のＮ－末端残基であることが判明したグルタミン酸と同様に、天然配列の７９位で置換されたアスパラギン酸を二重下線で、かつ強調して示す。

【0063】

【図13】図１３は、リーダーを有しない短縮ＧＤＦトラップＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５～１３１）－ｈＦｃ（配列番号１３２）のアミノ酸配列を示す。短縮ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１の残基２５～１３１）を下線で示す。シークエンシングによって成熟融合タンパク質のＮ－末端残基であることが判明したグルタミン酸と同様に、天然配列の７９位で置換されたアスパラギン酸を二重下線で、かつ強調して示す。

【0064】

【図14】図１４は、リーダー、ｈＦｃドメイン、およびリンカーを有しない短縮ＧＤＦトラップＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５～１３１）のアミノ酸配列（配列番号１３３）を示す。シークエンシングによって成熟融合タンパク質のＮ－末端残基であることが判明したグルタミン酸と同様に、天然配列の７９位で置換されたアスパラギン酸を下線で、かつ強調して示す。

【0065】

【図15-1】図１５は、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５～１３１）－ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号１３４はセンス鎖に対応し、配列番号１３５はアンチセンス鎖に対応する。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１～６６）を二重下線で示し、短縮ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７６～３９６）を、一重下線で示す。ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１の残基２５～１３１）のアミノ酸配列も示す。

【図15-2】図１５は、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５～１３１）－ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号１３４はセンス鎖に対応し、配列番号１３５はアンチセンス鎖に対応する。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１～６６）を二重下線で示し、短縮ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７６～３９６）を、一重下線で示す。ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１の残基２５～１３１）のアミノ酸配列も示す。

【0066】

【図16-1】図１６は、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５～１３１）－ｈＦｃをコードする代替ヌクレオチド配列を示す。配列番号１３６はセンス鎖に対応し、配列番号１３７はアンチセンス鎖に対応する。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１～６６）を二重下線で示し、短縮ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７６～３９６）を下線で示し、細胞外ドメインの野生型ヌクレオチド配列における置換を二重下線で、かつ強調して示す。ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１の残基２５～１３１）のアミノ酸配列も示す。

【図16-2】図１６は、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５～１３１）－ｈＦｃをコードする代替ヌクレオチド配列を示す。配列番号１３６はセンス鎖に対応し、配列番号１３７はアンチセンス鎖に対応する。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１～６６）を二重下線で示し、短縮ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７６～３９６）を下線で示し、細胞外ドメインの野生型ヌクレオチド配列における置換を二重下線で、かつ強調して示す。ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１の残基２５～１３１）のアミノ酸配列も示す。

【0067】

【図17】図１７は、図１６に示した代替ヌクレオチド配列（配列番号１３６）のヌクレオチド７６～３９６（配列番号１３８）を示す。図１６に示した同じヌクレオチド置換も本明細書において下線で、かつ強調して示す。配列番号１３８は、Ｌ７９Ｄ置換を有する短縮ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１の残基２５～１３１に対応する）、例えばＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５～１３１）のみをコードする。

【0068】

【図18】図１８は、Ｃｌｕｓｔａｌ ２．１を使用したヒトＩｇＧアイソタイプのＦｃドメインの複数の配列アライメントを示す。ヒンジ領域を破線の下線で示す。二重下線は、非対称鎖の対形成を促進するためにＩｇＧ１ Ｆｃにおいて操作された位置の例、ならびに他のアイソタイプＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４に関して対応する位置を示す。

【0069】

【図19】図１９は、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ４－Ｆｃホモ二量体と比較したＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体タンパク質複合体のリガンド結合データの比較を示す。各々のタンパク質複合体に関して、リガンドを、リガンドのシグナル伝達阻害と良好に相関する速度論定数であるｋ_ｏｆｆによってランク付けし、結合親和性の降順に記載する（最も強固に結合したリガンドを上位に記載する）。左側の黄色、赤色、緑色、および青色の線は、解離速度定数の大きさを示す。実線の黒色の線は、ヘテロ二量体に対するその結合がホモ二量体と比較して増強されたかまたは不変であるリガンドを示し、破線の赤色の線は、ホモ二量体と比較して実質的に低減された結合を示す。示すように、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体は、いずれかのホモ二量体と比較してアクチビンＢに対して増強された結合を示し、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体に関して観察されたように、アクチビンＡ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１に対して強い結合を保持し、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ３に対して実質的に低減された結合を示す。ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体と同様に、ヘテロ二量体は、ＢＭＰ６に対して中間レベルの結合を保持する。

【0070】

【図20】図２０は、本明細書に記載されるＡ－２０４レポーター遺伝子アッセイによって決定した場合の、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体／ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体ＩＣ_５０データの比較を示す。ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体は、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体と同様に、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１シグナル伝達経路を阻害する。しかし、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０シグナル伝達経路のＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体による阻害は、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体と比較して有意に低減される。これらのデータは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体が、対応するＡｃｔＲＩＩＢ：ＡｃｔＲＩＩＢホモ二量体と比較して、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１のより選択的なアンタゴニストであることを実証している。

【0071】

【図21】図２１Ａおよび２１Ｂは、Ｉ型受容体とＩＩ型受容体ポリペプチドとを含むヘテロマータンパク質複合体の２つの概略的例を示す。図２１Ａは、１つのＩ型受容体融合ポリペプチドと１つのＩＩ型受容体融合ポリペプチドとを含むヘテロ二量体タンパク質複合体を描写し、これらは各々のポリペプチド鎖内に含まれる多量体形成ドメインを介して共有結合または非共有結合によりアセンブルすることができる。２つのアセンブルされた多量体形成ドメインは、誘導性または非誘導性のいずれかであり得る相互作用対を構成する。図２１Ｂは、図２１Ａに描写される２つのヘテロ二量体複合体を含むヘテロ四量体タンパク質複合体を描写する。より高次の複合体も想像することができる。

【0072】

【図22】図２２は、Ｉ型受容体ポリペプチド（「Ｉ」として示す）（例えば、ヒトまたは本明細書に記載の種などの他の種由来のＡＬＫ４タンパク質の細胞外ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリペプチド）と、ＩＩ型受容体ポリペプチド（「ＩＩ」として示す）（例えば、ヒトまたは本明細書に記載の種などの他の種由来のＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の細胞外ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリペプチド）とを含むヘテロマータンパク質複合体の概略的な例を示す。例証される実施形態では、Ｉ型受容体ポリペプチドは、相互作用対の第１のメンバー（「Ｃ_１」）を含む融合ポリペプチドの一部であり、ＩＩ型受容体ポリペプチドは、相互作用対の第２のメンバー（「Ｃ_２」）を含む融合ポリペプチドの一部である。各々の融合ポリペプチドにおいて、リンカーは、Ｉ型またはＩＩ型受容体ポリペプチドと、相互作用対の対応するメンバーとの間に位置し得る。相互作用対の第１および第２のメンバーは、誘導性（非対称）対であってもよく、これは、対のメンバーが自己会合するよりはむしろ互いに優先的に会合することを意味し、または相互作用対は非誘導性であってもよく、これは、対のメンバーが、実質的な優先性を示さずに互いに会合するかまたは自己会合してもよく、同じまたは異なるアミノ酸配列を有してもよいことを意味する。従来のＦｃ融合タンパク質および抗体は、非誘導性相互作用対の例であるが、操作された多様なＦｃドメインは、誘導性（非対称）相互作用対として設計されている［例えば、Spiessら、（２０１５年）Molecular Immunology、６７巻（２Ａ号）：９５～１０６頁を参照されたい］。

【0073】

【図23A】図２３Ａ～２３Ｄは、ＡＬＫ４ポリペプチド（例えば、ヒトまたは本明細書に記載の種などの他の種由来のＡＬＫ４タンパク質の細胞外ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリペプチド）と、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、ヒトまたは本明細書に記載の種などの他の種由来のＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の細胞外ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリペプチド）とを含むヘテロマータンパク質複合体の概略的な例を示す。例証される実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチドは、相互作用対の第１のメンバー（「Ｃ_１」）を含む融合ポリペプチドの一部であり、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、相互作用対の第２のメンバー（「Ｃ_２」）を含む融合ポリペプチドの一部である。適した相互作用対には、例えば重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン相互作用対、その短縮体、およびバリアント、例えば本明細書に記載されるものが含まれた［例えば、Spiessら、（２０１５年）Molecular Immunology、６７巻（２Ａ号）：９５～１０６頁を参照されたい］。各々の融合ポリペプチドにおいて、リンカーは、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと、相互作用対の対応するメンバーとの間に位置し得る。相互作用対の第１および第２のメンバーは、非誘導性であってもよく、これは、対のメンバーが、実質的な優先性を示さずに互いに会合するかまたは自己会合してもよく、同じまたは異なるアミノ酸配列を有してもよいことを意味する。図２３Ａを参照されたい。あるいは、相互作用対は、誘導性（非対称）対であってもよく、これは、対のメンバーが自己会合するよりはむしろ互いに優先的に会合することを意味する。図２３Ｂを参照されたい。より高次の複合体も想像することができる。図２３Ｃおよび２３Ｄを参照されたい。

【図23B】図２３Ａ～２３Ｄは、ＡＬＫ４ポリペプチド（例えば、ヒトまたは本明細書に記載の種などの他の種由来のＡＬＫ４タンパク質の細胞外ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリペプチド）と、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、ヒトまたは本明細書に記載の種などの他の種由来のＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の細胞外ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリペプチド）とを含むヘテロマータンパク質複合体の概略的な例を示す。例証される実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチドは、相互作用対の第１のメンバー（「Ｃ_１」）を含む融合ポリペプチドの一部であり、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、相互作用対の第２のメンバー（「Ｃ_２」）を含む融合ポリペプチドの一部である。適した相互作用対には、例えば重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン相互作用対、その短縮体、およびバリアント、例えば本明細書に記載されるものが含まれた［例えば、Spiessら、（２０１５年）Molecular Immunology、６７巻（２Ａ号）：９５～１０６頁を参照されたい］。各々の融合ポリペプチドにおいて、リンカーは、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと、相互作用対の対応するメンバーとの間に位置し得る。相互作用対の第１および第２のメンバーは、非誘導性であってもよく、これは、対のメンバーが、実質的な優先性を示さずに互いに会合するかまたは自己会合してもよく、同じまたは異なるアミノ酸配列を有してもよいことを意味する。図２３Ａを参照されたい。あるいは、相互作用対は、誘導性（非対称）対であってもよく、これは、対のメンバーが自己会合するよりはむしろ互いに優先的に会合することを意味する。図２３Ｂを参照されたい。より高次の複合体も想像することができる。図２３Ｃおよび２３Ｄを参照されたい。

【図23C】図２３Ａ～２３Ｄは、ＡＬＫ４ポリペプチド（例えば、ヒトまたは本明細書に記載の種などの他の種由来のＡＬＫ４タンパク質の細胞外ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリペプチド）と、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、ヒトまたは本明細書に記載の種などの他の種由来のＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の細胞外ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリペプチド）とを含むヘテロマータンパク質複合体の概略的な例を示す。例証される実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチドは、相互作用対の第１のメンバー（「Ｃ_１」）を含む融合ポリペプチドの一部であり、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、相互作用対の第２のメンバー（「Ｃ_２」）を含む融合ポリペプチドの一部である。適した相互作用対には、例えば重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン相互作用対、その短縮体、およびバリアント、例えば本明細書に記載されるものが含まれた［例えば、Spiessら、（２０１５年）Molecular Immunology、６７巻（２Ａ号）：９５～１０６頁を参照されたい］。各々の融合ポリペプチドにおいて、リンカーは、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと、相互作用対の対応するメンバーとの間に位置し得る。相互作用対の第１および第２のメンバーは、非誘導性であってもよく、これは、対のメンバーが、実質的な優先性を示さずに互いに会合するかまたは自己会合してもよく、同じまたは異なるアミノ酸配列を有してもよいことを意味する。図２３Ａを参照されたい。あるいは、相互作用対は、誘導性（非対称）対であってもよく、これは、対のメンバーが自己会合するよりはむしろ互いに優先的に会合することを意味する。図２３Ｂを参照されたい。より高次の複合体も想像することができる。図２３Ｃおよび２３Ｄを参照されたい。

【図23D】図２３Ａ～２３Ｄは、ＡＬＫ４ポリペプチド（例えば、ヒトまたは本明細書に記載の種などの他の種由来のＡＬＫ４タンパク質の細胞外ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリペプチド）と、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、ヒトまたは本明細書に記載の種などの他の種由来のＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の細胞外ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリペプチド）とを含むヘテロマータンパク質複合体の概略的な例を示す。例証される実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチドは、相互作用対の第１のメンバー（「Ｃ_１」）を含む融合ポリペプチドの一部であり、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、相互作用対の第２のメンバー（「Ｃ_２」）を含む融合ポリペプチドの一部である。適した相互作用対には、例えば重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン相互作用対、その短縮体、およびバリアント、例えば本明細書に記載されるものが含まれた［例えば、Spiessら、（２０１５年）Molecular Immunology、６７巻（２Ａ号）：９５～１０６頁を参照されたい］。各々の融合ポリペプチドにおいて、リンカーは、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと、相互作用対の対応するメンバーとの間に位置し得る。相互作用対の第１および第２のメンバーは、非誘導性であってもよく、これは、対のメンバーが、実質的な優先性を示さずに互いに会合するかまたは自己会合してもよく、同じまたは異なるアミノ酸配列を有してもよいことを意味する。図２３Ａを参照されたい。あるいは、相互作用対は、誘導性（非対称）対であってもよく、これは、対のメンバーが自己会合するよりはむしろ互いに優先的に会合することを意味する。図２３Ｂを参照されたい。より高次の複合体も想像することができる。図２３Ｃおよび２３Ｄを参照されたい。

【0074】

【図24】図２４は、ｈＴβＲＩＩ_短鎖短縮体およびそのｈＴβＲＩＩ_長鎖相対物のＮ－末端アライメントを示す。ｈＴβＲＩＩ_長鎖短縮体に存在する２５アミノ酸の挿入を下線で示す。スプライシングプロセスによって、短鎖アイソフォームにおける挿入部位に隣接するバリンが、長鎖アイソフォームにおいてイソロイシンにより置き換えられることに注意されたい。枠内の配列はリーダーを指す。

【発明を実施するための形態】

【0075】

本発明の詳細な説明
１．概要
ＴＧＦβスーパーファミリーは、ＴＧＦβ、アクチビン、ｎｏｄａｌ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、増殖および分化因子（ＧＤＦ）、および抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）を含む、３０個よりも多くの分泌因子で構成されている［Weissら（２０１３年）Developmental Biology、２巻（１号）：４７～６３頁］。スーパーファミリーのメンバーは、
脊椎動物および無脊椎動物の両方に見出され、動物の生涯にわたって発生の最初期段階中に、多様な組織および機能にて遍在的に発現される。実際、ＴＧＦβスーパーファミリータンパク質は、幹細胞自己再生、原腸形成、分化、臓器形態形成、および成体組織恒常性の重要なメディエータである。この遍在的活性と一致して、異常なＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達は、広範なヒト病理に関連している。

【0076】

ＴＧＦβスーパーファミリーのリガンドは、一方の単量体の中央３－１／２ターンヘリックスが、他方の単量体のベータ－ストランドにより形成される陥凹表面に対してパッキングされている同じ二量体構造を共有する。大多数のＴＧＦβファミリーメンバーは、分子間ジスルフィド結合によりさらに安定化されている。このジスルフィド結合は、２つの他のジスルフィド結合により形成される環をくぐり抜け、「システインノット（cysteine
knot）」モチーフと名付けられているものを生じている［Linら（２００６年）Reproduction １３２巻：１７９～１９０頁；およびHinckら（２０１２年） FEBS Letters
５８６巻：１８６０～１８７０頁］。

【0077】

ＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達は、リガンド刺激されると下流ＳＭＡＤタンパク質（例えば、ＳＭＡＤタンパク質１、２、３、５、および８）をリン酸化および活性化する、Ｉ型およびＩＩ型セリン／トレオニンキナーゼ受容体のヘテロマー複合体により媒介される［Massague（２０００年）Nat. Rev. Mol. Cell Biol. １巻：１６９～
１７８頁］。こうしたＩ型およびＩＩ型受容体は、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および推定セリン／トレオニンキナーゼ特異性を有する細胞質ドメインで構成される膜貫通型タンパク質である。一般に、Ｉ型受容体は、細胞内シグナル伝達を媒介し、ＩＩ型受容体は、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドへの結合に必要とされる。Ｉ型およびＩＩ型受容体は、リガンド結合後に安定複合体を形成し、ＩＩ型受容体によるＩ型受容体のリン酸化がもたらされる。

【0078】

ＴＧＦβファミリーは、それらが結合するＩ型受容体およびそれらが活性化するＳｍａｄタンパク質に基づき、２つの系統発生分岐に分類することができる。１つは、より最近になって進化した分岐であり、例えば、Ｓｍａｄ２および３を活性化するＩ型受容体を介してシグナル伝達するＴＧＦβ、アクチビン、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ３、およびｎｏｄａｌが挙げられる［Hinck（２０１２年）FEBS Letters ５８６巻：１８６０～１８７０頁］。他の分岐は、スーパーファミリーのより遠縁のタンパク質を含み、例えば、Ｓｍａｄ１、５、および８を介してシグナル伝達するＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ１、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、およびＧＤＦ７が挙げられる。

【0079】

ＴＧＦβアイソフォームは、ＴＧＦβスーパーファミリーの創始メンバーであり、哺乳動物には、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３と名付けられているその３つの公知アイソフォームが存在する。成熟した生物活性ＴＧＦβリガンドは、ホモ二量体として機能し、主に、Ｉ型受容体ＡＬＫ５を介してシグナル伝達するが、内皮細胞では、さらにＡＬＫ１を介してシグナル伝達することも見出されている［Goumansら（２００３年） Mol Cell １２巻（４号）：８１７～８２８頁］。ＴＧＦβ１は、最も多量におよび遍在的に発現されるアイソフォームである。ＴＧＦβ１は、創傷治癒に重要な役割を有することが公知であり、構成的に活性なＴＧＦβ１導入遺伝子を発現するマウスは、繊維症を発症する［Clouthierら（１９９７年）J Clin. Invest. １００巻（１１号）：２６９７～２７１３頁］。ＴＧＦβ１発現は、最初は、ヒト神経膠芽腫細胞で報告された。ＴＧＦβ１発現は、胚神経系のニューロンおよび星状膠細胞に生じる。ＴＧＦβ３は、ヒト横紋筋肉腫細胞株から最初に単離された。それ以来、肺腺癌および腎癌細胞株に見出されている。ＴＧＦβ３は、口蓋および肺形態形成に重要であることが公知である［Kubiczkovaら（２０１２年）Journal of Translational Medicine １０巻：１８３頁］。

【0080】

アクチビンは、ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーであり、最初は、卵胞刺激ホルモンの分泌の調節因子として発見されが、その後、種々の生殖および非生殖役割が特徴付けられている。２つの密接に関連するβサブユニットのホモ／ヘテロ二量体（それぞれ、β_Ａβ_Ａ、β_Ｂβ_Ｂ、およびβ_Ａβ_Ｂ）である３つの主要アクチビン形態（Ａ、Ｂ、およびＡＢ）が存在する。また、ヒトゲノムは、主に肝臓で発現されるアクチビンＣおよびアクチビンＥをコードし、β_Ｃまたはβ_Ｅを含むヘテロ二量体形態も公知である。ＴＧＦβスーパーファミリーのアクチビンは、卵巣および胎盤細胞でのホルモン産生を刺激することができ、ニューロン細胞生存を支持することができ、細胞タイプに応じて細胞周期進行に正のまたは負の影響を及ぼすことができ、少なくとも両生動物胚で中胚葉分化を誘導することができる独特な多機能性因子である［DePaoloら（１９９１年）Proc Soc Ep Biol Med. １９８巻：５００～５１２頁；Dysonら（１９９７年）Curr Biol. ７巻：８１～８４頁；およびWoodruff（１９９８年）Biochem Pharmacol. ５５巻：９５３～９
６３頁］。幾つかの組織では、アクチビンシグナル伝達は、その関連ヘテロ二量体であるインヒビンによりアンタゴナイズされる。例えば、下垂体からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）分泌の調節では、アクチビンは、ＦＳＨ合成および分泌を促進するが、インヒビンは、ＦＳＨ合成および分泌を低減させる。アクチビン生物活性を調節することができる、および／またはアクチビンに結合することができる他のタンパク質としては、ホリスタチン（ＦＳ）、ホリスタチン関連タンパク質（ＦＳＲＰ；ＦＬＲＧまたはＦＳＴＬ３としても公知）およびα_２－マクログロブリンが挙げられる。

【0081】

本明細書に記載されているように、「アクチビンＡ」に結合する作用剤は、単離されたβ_Ａサブユニットの状況であるか、または二量体複合体（例えば、β_Ａβ_Ａホモ二量体またはβ_Ａβ_Ｂヘテロ二量体）としてであるかに関わらず、β_Ａサブユニットに特異的に結合する作用剤である。ヘテロ二量体複合体（例えば、β_Ａβ_Ｂヘテロ二量体）の場合、「アクチビンＡ」に結合する作用剤は、β_Ａサブユニット内に存在するエピトープに特異的であるが、複合体の非β_Ａサブユニット（例えば、複合体のβ_Ｂサブユニット）内に存在するエピトープには結合しない。同様に、「アクチビンＡ」をアンタゴナイズする（阻害する）本明細書で開示された作用剤は、単離されたβ_Ａサブユニットの状況であるか、または二量体複合体（例えば、β_Ａβ_Ａホモ二量体またはβ_Ａβ_Ｂヘテロ二量体）としてであるかに関わらず、β_Ａサブユニットにより媒介される１つまたは複数の活性を阻害する作用剤である。β_Ａβ_Ｂヘテロ二量体の場合、「アクチビンＡ」を阻害する作用剤は、β_Ａサブユニットの１つまたは複数の活性を特異的に阻害するが、複合体の非β_Ａサブユニット（例えば、複合体のβ_Ｂサブユニット）の活性を阻害しない作用剤である。この原則は、「アクチビンＢ」、「アクチビンＣ」、および「アクチビンＥ」に結合および／または阻害する作用剤にも当てはまる。「アクチビンＡＢ」をアンタゴナイズする本明細書で開示された作用剤は、β_Ａサブユニットにより媒介されるような１つまたは複数の活性、およびβ_Ｂサブユニットにより媒介されるような１つまたは複数の活性を阻害する作用剤である。

【0082】

ＢＭＰおよびＧＤＦは共に、ＴＧＦβスーパーファミリーの特徴的フォールドを共有するシステインノットサイトカインのファミリーを形成する［Riderら（２０１０年）Biochem J.、４２９巻（１号）：１～１２頁］。このファミリーとしては、例えば、以下のものが挙げられる：ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ２ａ、ＢＭＰ３、ＢＭＰ３ｂ（ＧＤＦ１０としても公知）、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９（ＧＤＦ２としても公知）、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１（ＧＤＦ１１としても公知）、ＢＭＰ１２（ＧＤＦ７としても公知）、ＢＭＰ１３（ＧＤＦ６としても公知）、ＢＭＰ１４（ＧＤＦ５としても公知）、ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１、ＧＤＦ３（ＶＧＲ２としても公知）、ＧＤＦ８（ミオスタチンとしても公知）、ＧＤＦ９、ＧＤＦ１５、およびデカペンタプレジック。ＢＭＰにそれらの名称を与えることになった骨形成を誘導する能力の他に、ＢＭＰ／ＧＤＦは、広範な組織の発生に形態形成活性を示す。ＢＭＰ／ＧＤＦホモおよびヘテロ二量体は、Ｉ型およびＩＩ型受容体二量体の組合せと相互作用して、複数の考え得るシグナル伝達複合体を生成し、ＳＭＡＤ転写因子の２つの競合セットの１つの活性化に結び付く。ＢＭＰ／ＧＤＦは、非常に特異的および局所的な機能を有する。これらは、ＢＭＰ／ＧＤＦ発現の発生制限、およびサイトカインに高親和性で結合する幾つかの特異的なＢＭＰアンタゴニストタンパク質の分泌によることを含む幾つかの様式で調節される。興味深いことには、これらのアンタゴニストの幾つかは、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドに相似している。

【0083】

部分的には、本明細書で示されたデータは、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（阻害剤）およびＴＧＦβアンタゴニストを、単独でまたは組み合わせて使用して、がんを処置することができることを実証する。特に、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、または汎特異性ＴＧＦβ抗体による処置は、別々に、がんモデルの腫瘍負荷を減少させ、生存期間を増加させたことが示された。さらに、ＴＧＦβアンタゴニストと組み合わせてＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用すると、いずれか一方の作用剤のみで観察される効果と比較して、抗腫瘍活性を相乗的に増加させることができることが示された。データは、ＴＧＦβシグナル伝達の阻害に関連する抗腫瘍効果が、ＴＧＦβ２アンタゴニズムによるものであることを示しているが、本明細書では、ＴＧＦβの３つのアイソフォーム（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３）すべての阻害剤が、抗腫瘍活性を有することが示された。したがって、多くの実施形態では、本開示の方法および使用に従って使用されるＴＧＦβアンタゴニストは、ＴＧＦβ２を阻害することが好ましいが、ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ３を阻害するＴＧＦβアンタゴニストも、抗腫瘍応答の促進に有用であろうということが予想される。

【0084】

したがって、本開示は、部分的には、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＴＧＦβアンタゴニスト、またはＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよびＴＧＦβアンタゴニストの組合せを、単独でまたは１つもしくは複数の支持療法および／もしくは追加活性剤と組み合わせて使用して、がんを処置するための、特にがんの１つまたは複数の合併症を処置または予防するための（例えば、腫瘍負荷を低減するための）方法を提供する。加えて、データは、ＡｃｔＲＩＩおよびＴＧＦβアンタゴニスト療法の有効性が、免疫系に依存することを示す。したがって、部分的には、本開示は、ＡｃｔＲＩＩおよびＴＧＦβアンタゴニストを、免疫療法剤として使用して、特に、幅広い様々ながん（例えば、免疫抑制および／または免疫疲弊に関連したがん）を処置することができるという発見に関する。他の公知の免疫腫瘍学的作用剤と同様に、ＡｃｔＲＩＩおよびＴＧＦβアンタゴニストが患者の免疫応答を強化する能力は、がん分野以外でもより幅広い治療的意義を有する場合がある。例えば、免疫強化剤が、幅広い様々な感染性疾患、特に免疫抑制および／または免疫疲弊を促進する病原性因子の処置に有用であり得ることが提案されている。また、そのような免疫強化剤は、ワクチン（例えば、感染性疾患およびがんワクチン）の免疫化有効性のブーストに有用であり得る。したがって、本開示は、単独でまたは組み合わせて使用して、必要に応じて１つまたは複数の支持療法および／または追加活性剤と組み合わせて、それを必要とする対象の免疫応答を増加させ、がんを処置し、感染性疾患を処置し、および／または免疫化有効性を増加させることができる種々のＡｃｔＲＩＩおよびＴＧＦβアンタゴニストを提供する。

【0085】

本明細書で使用される用語は、一般に、本開示の状況内の、および各用語が使用される具体的な状況での、当技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。ある用語は、本開示の組成物および方法ならびにそれらの製作および使用方法の説明において従事者に追加の指針を提供するために、本明細書の下記でまたは他所で考察されている。用語の任意の使用の範囲または意味は、それが使用される具体的な状況から明白になるであろう。

【0086】

「ヘテロマー」または「ヘテロ多量体」という用語は、本明細書で使用される場合、少なくとも第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含み、第２のポリペプチド鎖は、アミノ酸配列が、第１のポリペプチド鎖と少なくとも１つのアミノ酸残基で異なる複合体を指す。ヘテロマーは、第１および第２のポリペプチド鎖により形成された「ヘテロ二量体」を含んでいてもよく、または第１および第２のポリペプチド鎖に加えて、１つまたは複数のポリペプチド鎖が存在するより高次の構造を形成していてもよい。ヘテロ多量体の例示的な構造としては、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体およびさらなるオリゴマー構造が挙げられる。ヘテロ二量体は、本明細書ではＸ：Ｙとして、または同義的にＸ－Ｙと表記されており、Ｘは、第１のポリペプチド鎖を表し、Ｙは第２のポリペプチド鎖を表す。より高次のヘテロマーおよびオリゴマー構造は、本明細書では、対応する様式で表記されている。

【0087】

「相同的」は、そのあらゆる文法形態およびスペリングバリエーションにおいて、生物の同じ種のスーパーファミリーに由来するタンパク質、ならびに生物の異なる種に由来する相同的タンパク質を含む、「共通の進化起原」を有する２つのタンパク質間の関係性を指す。そのようなタンパク質（およびそれらのコード核酸）は、同一性パーセントによるか、または具体的な残基もしくはモチーフおよび保存位置の存在によるかに関わらず、それらの配列類似性により反映される配列相同性を有する。しかしながら、一般的な使用法および本出願では、用語「相同的」は、「高度に」などの副詞で修飾されている場合、配列類似性を指す場合があり、共通の進化起原に関していてもよく、またはいなくともよい。

【0088】

用語「配列類似性」は、そのあらゆる文法形態において、共通の進化起原を共有していてもよく、またはしていなくともよい核酸またはアミノ酸配列間の同一性または一致の度合いを指す。

【0089】

参照ポリペプチド（またはヌクレオチド）配列に対する「配列同一性パーセント（％）」は、配列をアラインし、必要な場合はギャップを導入して、配列同一性の一部として一切の保存的置換を考慮せずに、最大配列同一性パーセントを達成した後の、参照ポリペプチド（ヌクレオチド）配列のアミノ酸残基（または核酸）と同一である、候補配列のアミノ酸残基（または核酸）のパーセンテージであると規定される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当技術分野の技術内にある種々の様式で達成することができる。当業者であれば、比較しようとする配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適切なパラメーターを決定することができる。しかしながら、本明細書の目的では、アミノ酸（核酸）配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．の著作物であり、ソースコードは、米国著作権局、ワシントンＤ．Ｃ．２０５５９にユーザー文書と共に提出されており、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７号として登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州から公的に入手可能であるか、またはソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、使用するためには、ｄｉｇｉｔａｌ ＵＮＩＸ（登録商標） Ｖ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステムでコンパイルされるべきである。配列比較パラメーターはすべて、ＡＬＩＧＮ－２プログラムにより設定されており、変更しない。

【0090】

「アゴナイズする」は、そのあらゆる文法形態において、タンパク質および／もしくは遺伝子を活性化するか（例えば、そのタンパク質の遺伝子発現を活性化もしくは増幅することにより、または不活性タンパク質を誘導して活性状態にすることにより）またはタンパク質のおよび／もしくは遺伝子の活性を増加させるプロセスを指す。

【0091】

「アンタゴナイズする」は、そのあらゆる文法形態において、タンパク質および／もしくは遺伝子を阻害するか（例えば、そのタンパク質の遺伝子発現を阻害もしくは減少させるにより、または活性タンパク質を誘導して不活性状態にすることにより）またはタンパク質のおよび／もしくは遺伝子の活性を減少させるプロセスを指す。

【0092】

用語「約」および「およそ」は、本明細書および特許請求の範囲の全体にわたって、数値に関して使用される場合、当業者によく知られており、許容され得る、正確性の区間を示す。一般に、そのような正確性の区間は、±１０％である。その代わりおよび特に生物系では、用語「約」および「およそ」は、所与の値の同じ桁内、好ましくは≦５倍、およびより好ましくは≦２倍である値を意味する場合がある。

【0093】

本明細書で開示された数値の範囲は、範囲を規定する数値を含む。

【0094】

用語「ａ」および「ａｎ」は、用語が使用される状況が明白にそうではないと示さない限り、複数の指示物を含む。用語「ａ」（または「ａｎ」）ならびに用語「１つまたは複数」および「少なくとも１つ」は、本明細書では同義的に使用することができる。さらに、「および／または」は、本明細書で使用される場合、他方を有しているかまたは有していない２つまたはそれよりも多くの具体的な特徴または成分の各々の具体的な開示であると理解されるべきである。したがって、本明細書で「Ａおよび／またはＢ」などの語句に使用される用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」単独を含むことが意図されている。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの語句に使用される用語「および／または」は、以下の態様の各々を包含することが意図されている：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。

【0095】

２．ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体
ある特定の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびそれらの使用（例えば、それを必要とする対象の免疫応答を増加させること、およびがんまたは病原体を処置すること）に関する。本明細書で使用される場合、用語「ＡｃｔＲＩＩ」は、ＩＩ型アクチビン受容体のファミリーを指す。このファミリーは、アクチビン受容体ＩＩＡ型（ＡｃｔＲＩＩＡ）およびアクチビン受容体ＩＩＢ型（ＡｃｔＲＩＩＢ）を含む。一部の態様では、本開示は、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含み、本明細書では「ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体」または「ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体複合体」と一般に呼ばれるヘテロ多量体、およびそれらの使用（例えば、それを必要とする対象の免疫応答を増加させること、およびがんまたは病原体を処置すること）に関する。

【0096】

本明細書で使用される場合、用語「ＡｃｔＲＩＩＢ」は、任意の種に由来するアクチビン受容体ＩＩＢ型（ＡｃｔＲＩＩＢ）タンパク質のファミリー、および突然変異誘発または他の修飾によりそのようなＡｃｔＲＩＩＢタンパク質から導出されたバリアントを指す。本明細書におけるＡｃｔＲＩＩＢへの言及は、現在特定されている形態のいずれか１つへの言及であることが理解される。ＡｃｔＲＩＩＢファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチ領域を含むリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および推定セリン／トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成される膜貫通型タンパク質である。

【0097】

用語「ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド」は、ＡｃｔＲＩＩＢファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチド、ならびに有用な活性を保持するそれらの任意のバリアント（突然変異体、断片、融合体、およびペプチド模倣形態を含む）を含むポリペプチドを含む。そのようなバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの例は、本開示の全体にわたって、ならびに国際特許出願公開第２００６／０１２６２７号、国際公開第２００８／０９７５４１号、および国際公開第２０１０／１５１４２６号に提供されている。これらの文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されているすべてのＡｃｔＲＩＩＢ関連ポリペプチドのアミノ酸の付番は、具体的にそうではないと記載されていない限り、下記に提供されているヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質配列（配列番号１）の付番に基づく。

【0098】

ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質配列は以下の通りである。

【化1】

【0099】

シグナルペプチドは、一重下線で示されており、細胞外ドメインは太字体で示されており、潜在的な内因性Ｎ－連結グリコシル化部位は、二重下線で示されている。

【0100】

プロセシングされた細胞外ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド配列は、以下の通りである。

【化2】

【0101】

一部の実施形態では、Ｎ末端に「ＳＧＲ．．．」配列を有するタンパク質が生成される場合がある。細胞外ドメインのＣ末端「尾部」は、一重下線により示されている。「尾部」が欠失した配列（Δ１５配列）は、以下の通りである。

【化3】

【0102】

また、配列番号１の６４位にアラニン（Ａ６４）を有するＡｃｔＲＩＩＢの形態が、文献に報告されている。例えばHildenら（１９９４年）Blood、８３巻（８号）：２１６３
～２１７０頁を参照されたい。Ａ６４置換を有するＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインを含むＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質は、アクチビンおよびＧＤＦ１１に対して比較的低い親和性を有することが確認されている。対照的に、６４位にアルギニン（Ｒ６４）を有する同じＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質は、アクチビンおよびＧＤＦ１１に対する親和性が、低ナノモル～高ピコモル範囲である。したがって、Ｒ６４を有する配列を、本開示のヒトＡｃｔＲＩＩＢの「野生型の」参照配列として使用する。

【0103】

６４位にアラニンを有するＡｃｔＲＩＩＢの形態は以下の通りである。

【化4】

【0104】

シグナルペプチドは、一重下線により示されており、細胞外ドメインは太字体により示されている。

【0105】

代替的Ａ６４形態のプロセシングされた細胞外ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド配列は、以下の通りである。

【化5】

【0106】

一部の実施形態では、Ｎ末端に「ＳＧＲ．．．」配列を有するタンパク質が生成される場合がある。細胞外ドメインのＣ末端「尾部」は、一重下線により示されている。「尾部」が欠失した配列（Δ１５配列）は、以下の通りである。

【化6】

【0107】

ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質をコードする核酸配列は、下記に示されており（配列番号７）、ＡｃｔＲＩＩＢ前駆体のアミノ酸１～５１３をコードするＧｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１１０６．３のヌクレオチド２５～１５６０を表す。示されている配列は、６４位にアルギニンを提供し、代わりにアラニンを提供するように修飾されていてもよい。シグナル配列には下線が引かれている。

【化7-1】

【化7-2】

【0108】

プロセシングされた細胞外ヒトＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする核酸配列は、以下の通りである（配列番号８）。示されている配列は、６４位にアルギニンを提供し、代わりにアラニンを提供するように修飾されていてもよい。

【化8】

【0109】

ヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインおよびヒトＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメインのアミノ酸配列のアラインメントは、図１に例示されている。このアラインメントは、ＡｃｔＲＩＩリガンドと直接接触すると考えられる、両受容体内のアミノ酸残基を示す。例えば、複合ＡｃｔＲＩＩ構造は、ＡｃｔＲＩＩＢリガンド結合ポケットが、部分的には、残基Ｙ３１、Ｎ３３、Ｎ３５、Ｌ３８～Ｔ４１、Ｅ４７、Ｅ５０、Ｑ５３～Ｋ５５、Ｌ５７、Ｈ５８、Ｙ６０、Ｓ６２、Ｋ７４、Ｗ７８～Ｎ８３、Ｙ８５、Ｒ８７、Ａ９２、およびＥ９４～Ｆ１０１により規定されることを示した。これらの位置では、保存的突然変異が許容されることになると予想される。

【0110】

加えて、ＡｃｔＲＩＩＢは、脊椎動物で良好に保存されており、細胞外ドメインの大きな区間が完全に保存されている。例えば、図２は、種々のＡｃｔＲＩＩＢオルソログと比較した、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインの多重配列アラインメントを示す。ＡｃｔＲＩＩＢに結合するリガンドの多くも、高度に保存されている。したがって、こうしたアラインメントから、正常なＡｃｔＲＩＩＢリガンド結合活性にとって重要であるリガンド結合ドメイン内の重要なアミノ酸位置を予測すること、ならびに正常なＡｃｔＲＩＩＢリガンド結合活性を著しく変更せずに置換に許容性である可能性が高いアミノ酸位置を予測することが可能である。したがって、本開示の方法により有用な活性ヒトＡｃｔＲＩＩＢバリアントポリペプチドは、別の脊椎動物ＡｃｔＲＩＩＢ配列に由来する１つまたは複数のアミノ酸を対応する位置に含んでいてもよく、またはヒトもしくは他の脊椎動物配列の残基と類似する残基を含んでいてもよい。限定を意味しないが、以下の例は、活性ＡｃｔＲＩＩＢバリアントを規定するための本手法を例示する。ヒト細胞外ドメイン（配列番号１０３）のＬ４６は、Ｘｅｎｏｐｕｓ ＡｃｔＲＩＩＢ（配列番号１０５）ではバリンであり、したがってこの位置は変更することができ、必要に応じて、Ｖ、Ｉ、もしくはＦなどの別の疎水性残基、またはＡなどの無極性残基に変更することができる。ヒト細胞外ドメインのＥ５２は、ＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、この部位が、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｇ、Ｙなどの極性残基、およびおそらくはＡを含む、幅広く様々な変化に許容性であり得ることを示す。ヒト細胞外ドメインのＴ９３は、ＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、この位置では幅広い構造バリエーションが許容され、Ｓ、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｄ、Ｈ、Ｇ、Ｐ、Ｇ、およびＹなどの極性残基が有利であることを示す。ヒト細胞外ドメインのＦ１０８は、ＸｅｎｏｐｕｓではＹであり、したがって、Ｙ、またはＩ、Ｖ、もしくはＬなどの他の疎水基が許容されるはずである。ヒト細胞外ドメインのＥ１１１は、ＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、この位置では、Ｄ、Ｒ、Ｋ、およびＨを含む荷電残基、ならびにＱおよびＮが許容されることになることを示す。ヒト細胞外ドメインのＲ１１２は、ＸｅｎｏｐｕｓではＫであり、この位置では、ＲおよびＨを含む塩基性残基が許容されることを示す。ヒト細胞外ドメインの１１９位のＡは、保存が比較的不良であり、げっ歯動物ではＰとしておよびＸｅｎｏｐｕｓではＶとして出現し、したがってこの位置では、本質的に任意のアミノ酸が許容されるはずである。

【0111】

さらに、当技術分野では、ＡｃｔＲＩＩタンパク質は、特にリガンド結合に関する構造的および機能的特徴の点で特徴付けられている［Attisanoら（１９９２年）Cell ６８巻（１号）：９７～１０８頁；Greenwaldら（１９９９年）Nature Structural Biology ６巻（１号）：１８～２２頁；Allendorphら（２００６年）PNAS １０３巻（２０号）：７６４３～７６４８頁；Thompsonら（２００３年）The EMBO Journal ２２巻（７号）：１５５５～１５６６頁；ならびに米国特許第７，７０９，６０５号、第７，６１２，０４１号、および第７，８４２，６６３号］。本明細書の教示に加えて、これら参考文献は、１つまたは複数の正常な活性（例えば、リガンド結合活性）を保持するＡｃｔＲＩＩＢバリアントを生成する方法の指針を詳細に提供する。

【0112】

例えば、スリーフィンガー毒素フォールド（three-finger toxin fold）として公知
の特徴的構造モチーフは、Ｉ型およびＩＩ型受容体によるリガンド結合に重要であり、各単量体受容体の細胞外ドメイン内の様々な位置に位置する保存されたシステイン残基により形成される［Greenwaldら（１９９９年）Nat Struct Biol ６巻：１８～２２頁；およびHinck（２０１２年）FEBS Lett ５８６巻：１８６０～１８７０頁］。したがって
、ヒトＡｃｔＲＩＩＢのコアリガンド結合ドメインは、こうした保存されたシステインのうちの最も外側のシステインにより境界が示され、配列番号１（ＡｃｔＲＩＩＢ前駆体）の２９～１０９位に対応する。必ずしもリガンド結合を変更することなく、こうしたシステインにより境界が示されるコア配列に隣接する、構造的にあまり秩序だっていないアミノ酸を、Ｎ末端では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８個残基、および／またはＣ末端では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個残基だけ短縮することができる。Ｎ末端および／またはＣ末端短縮の例示的なＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインとしては、配列番号２、３、５、および６が挙げられる。

【0113】

Attisanoらは、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインのＣ末端のプロリンノット（proline
knot）の欠失が、アクチビンに対する受容体の親和性を低減させたことを示した。本配列番号１のアミノ酸２０～１１９を含むＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質「ＡｃｔＲＩＩＢ（２０～１１９）－Ｆｃ」は、プロリンノット領域および完全な膜近傍ドメインを含むＡｃｔＲＩＩＢ（２０～１３４）－Ｆｃと比べて（例えば、米国特許第７，８４２，６６３号を参照）、ＧＤＦ１１およびアクチビンに対する結合を低減させた。しかしながら、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０～１２９）－Ｆｃタンパク質は、たとえプロリンノット領域が破壊されても、野生型と比べて、同様であるが幾らか低減された活性を保持する。

【0114】

したがって、アミノ酸１３４、１３３、１３２、１３１、１３０、および１２９（配列番号１を基準にして）で終了するＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインはすべて、活性であることが予想されるが、１３４または１３３で終了する構築物が、最も活性であり得る。同様に、残基１２９～１３４（配列番号１を基準にして）のいずれかの突然変異は、リガンド結合親和性を大幅に変更しないと予想される。これを支持するものとして、Ｐ１２９およびＰ１３０（配列番号１を基準にして）の突然変異は、リガンド結合を実質的には減少させないことが当技術分野で公知である。したがって、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、アミノ酸１０９（最後のシステイン）で早めに終了してもよいが、１０９～１１９でまたはその間（例えば、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、または１１９）で終了する形態は、リガンド結合が低減されると予想される。アミノ酸１１９（本配列番号１を基準にして）は、保存が不良であり、したがって直ちに変更または短縮される。１２８（配列番号１を基準にして）またはそれ以降で終了するＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢに基づくＧＤＦトラップは、リガンド結合活性を保持するはずである。配列番号１を基準にして、１１９～１２７でまたはその間（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、または１２７）で終了するＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢに基づくＧＤＦトラップは、中程度の結合能力を有することになる。こうした形態はいずれも、臨床または実験の設定に応じて、使用が望ましいものであり得る。

【0115】

ＡｃｔＲＩＩＢのＮ末端では、アミノ酸２９またはその前から（配列番号１を基準にして）始まるタンパク質は、リガンド結合活性を保持することになると予想される。アミノ酸２９は、最初のシステインである。２４位（配列番号１を基準にして）におけるアラニンからアスパラギンへの突然変異は、リガンド結合に実質的な影響を及ぼさずに、Ｎ－連結グリコシル化配列を導入する［米国特許第７，８４２，６６３号］。これにより、アミノ酸２０～２９に対応する、シグナル切断ペプチドとシステイン架橋領域との間の領域での突然変異が良好に許容されることが確認される。特に、２０、２１、２２、２３、および２４位（配列番号１を基準にして）から始まるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢに基づくＧＤＦトラップは、一般的なリガンド結合活性を保持するべきであり、２５、２６、２７、２８、および２９位（配列番号１を基準にして）から始まるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢに基づくＧＤＦトラップも、リガンド結合活性を保持することが予想される。例えば、米国特許第７，８４２，６６３号では、驚くべきことに、２２、２３、２４、または２５から始まるＡｃｔＲＩＩＢ構築物が、最も高い活性を有することになることが実証されている。

【0116】

まとめると、ＡｃｔＲＩＩＢの活性部分（例えば、リガンド結合部分）の一般式は、配列番号１のアミノ酸２９～１０９を含む。したがって、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、例えば、配列番号１のアミノ酸２０～２９のいずれか１つに対応する残基から始まり（例えば、アミノ酸２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９のいずれか１つから始まり）、配列番号１のいずれか１つのアミノ酸１０９～１３４に対応する位置で終了する（例えば、アミノ酸１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４のいずれか１つで終了する）ＡｃｔＲＩＩＢの部分と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなっていてもよい。他の例としては、配列番号１の２０～２９（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９位のいずれか１つ）または２１～２９（例えば、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９位のいずれか１つ）の位置から始まり、配列番号１の１１９～１３４（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または、１３４位のいずれか１つ）、１１９～１３３（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、または１３３位のいずれか１つ）、１２９～１３４（例えば、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４位のいずれか１つ）、または１２９～１３３（例えば、１２９、１３０、１３１、１３２、または１３３位のいずれか１つ）の位置で終了するポリペプチドが挙げられる。他の例としては、配列番号１の２０～２４（例えば、２０、２１、２２、２３、または２４位のいずれか１つ）、２１～２４（例えば、２１、２２、２３、または２４位のいずれか１つ）、または２２～２５（例えば、２２、２２、２３、または２５位のいずれか１つ）の位置から始まり、配列番号１の１０９～１３４（例えば、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または、１３４位のいずれか１つ）、１１９～１３４（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４位のいずれか１つ）、または１２９～１３４（例えば、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４位のいずれか１つ）の位置で終了する構築物が挙げられる。また、こうした範囲内にあるバリアント、特に、配列番号１の対応する部分と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるものも企図される。

【0117】

本明細書に記載されているバリエーションは、種々の様式で組み合わせることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢバリアントは、リガンド結合ポケットに１、２、５、６、７、８、９、１０、または１５個以下の保存的アミノ酸変化、必要に応じて、リガンド結合ポケットの４０、５３、５５、７４、７９、および／または８２位に、ゼロ、１つまたは複数の非保存的変更を含む。変異性が特に良好に許容され得る、結合ポケットの外部の部位としては、細胞外ドメインのアミノおよびカルボキシ末端（上述のような）、ならびに４２～４６および６５～７３位（配列番号１を基準にして）が挙げられる。６５位におけるアスパラギンからアラニンへの変更（Ｎ６５Ａ）は、Ｒ６４バックグラウンドではリガンド結合を減少させないと考えられる［米国特許第７，８４２，６６３号］。この変化は、おそらくはＡ６４バックグラウンドにおいてＮ６５のグリコシル化を排除するため、この領域では著しい変化が許容される可能性が高いことを示す。Ｒ６４Ａ変化の許容性は不良であるが、Ｒ６４Ｋは良好に許容される。したがって、６４位では、Ｈなどの別の塩基性残基が許容され得る［米国特許第７，８４２，６６３号］。加えて、当技術分野で報告されている突然変異誘発プログラムの結果は、保存することが有益であることが多いアミノ酸位置が、ＡｃｔＲＩＩＢに存在することを示す。そうしたアミノ酸位置としては、配列番号１を基準にして、８０位（酸性または疎水性アミノ酸）、７８位（疎水性、および特にトリプトファン）、３７位（酸性、および特にアスパラギン酸またはグルタミン酸）、５６位（塩基性アミノ酸）、６０位（疎水性アミノ酸、特にフェニルアラニンまたはチロシン）が挙げられる。したがって、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに保存されていてもよいアミノ酸のフレームワークを提供する。保存することが望ましい場合がある他の位置は、以下の通りである：すべて配列番号１を基準にして、５２位（酸性アミノ酸）、５５位（塩基性アミノ酸）、８１位（酸性）、９８（極性または荷電、特にＥ、Ｄ、Ｒ、またはＫ）。

【0118】

ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインへのさらなるＮ－連結グリコシル化部位（Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ）の付加は、良好に許容されることが以前に実証されている（例えば、米国特許第７，８４２，６６３号を参照）。したがって、Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ配列は、一般に、例えば、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの、図１で規定されているリガンド結合ポケットの外部の位置に導入することができる。非内因性Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ配列の導入に特に好適な部位としては、アミノ酸２０～２９、２０～２４、２２～２５、１０９～１３４、１２０～１３４、または１２９～１３４が挙げられる（配列番号１を基準にして）。また、Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ配列は、ＡｃｔＲＩＩＢ配列とＦｃドメインまたは他の融合成分との間のリンカーに、ならびに必要に応じて融合成分自体に導入してもよい。そのような部位は、既存のＳまたはＴに対して正確な位置にＮを導入することにより、または既存のＮに対応する位置にＳまたはＴを導入することにより、最小限の労力で導入することができる。したがって、Ｎ－連結グリコシル化部位を生成することになる望ましい変更は、Ａ２４Ｎ、Ｒ６４Ｎ、Ｓ６７Ｎ（おそらくはＮ６５Ａ変更と組み合わせて）、Ｅ１０５Ｎ、Ｒ１１２Ｎ、Ｇ１２０Ｎ、Ｅ１２３Ｎ、Ｐ１２９Ｎ、Ａ１３２Ｎ、Ｒ１１２Ｓ、およびＲ１１２Ｔである（配列番号１を基準にして）。グリコシル化により得られる保護のため、免疫原性部位を生成せずに、グリコシル化されると予測される任意のＳをＴに変更することができる。同様に、グリコシル化されると予測される任意のＴをＳに変更することができる。したがって、変更Ｓ６７ＴおよびＳ４４Ｔ（配列番号１を基準にして）が企図される。同様に、Ａ２４Ｎバリアントでは、Ｓ２６Ｔ変更を使用することができる。したがって、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、上記に記載されている１つまたは複数の追加の非内因性Ｎ－連結グリコシル化コンセンサス配列を有するバリアントであってもよい。

【0119】

ある特定の実施形態では、本開示は、それらの断片、機能的バリアント、および修飾形態を含む少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（阻害剤）、ならびにそれらの使用（例えば、それを必要とする患者の免疫応答を増加させることおよびがんを処置すること）に関する。好ましくは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、可溶性である（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン）。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、および／またはＢＭＰ９］の活性（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）をアンタゴナイズする。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、および／またはＢＭＰ９］に結合する。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２０～２９に対応する残基から始まり（例えば、アミノ酸２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９のいずれか１つから始まり）、配列番号１のアミノ酸１０９～１３４に対応する位置で終了する（例えば、アミノ酸１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４のいずれか１つで終了する）ＡｃｔＲＩＩＢの部分と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２９～１０９と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、からなるか、またはから本質的になる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２９～１０９と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、からなるか、またはから本質的になり、配列番号１のＬ７９に対応する位置は、酸性アミノ酸（天然に存在する酸性アミノ酸ＤおよびＥまたは人工酸性アミノ酸）である。ある特定の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２５～１３１と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、からなるか、またはから本質的になる。ある特定の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２５～１３１と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、からなるか、またはから本質的になり、配列番号１のＬ７９に対応する位置は、酸性アミノ酸である。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、５８、５９、６０、６３、６４、６５、６６、６８、６９、７０、７３、７７、７８、１２８、１３１、１３２、および１３３のいずれか１つのアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、からなるか、またはから本質的になる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、５８、５９、６０、６３、６４、６５、６６、６８、６９、７０、７３、７７、７８、１２８、１３１、１３２、および１３３のいずれか１つのアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、からなるか、またはから本質的になり、配列番号１のＬ７９に対応する位置は、酸性アミノ酸である。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むか、からなるか、またはから本質的になり、配列番号１のＬ７９に対応する位置は、酸性アミノ酸ではない（つまり、天然に存在する酸アミノ酸ＤもしくはＥでも、人工酸性アミノ酸残基でもない）。

【0120】

ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドに関する。本明細書で使用される場合、用語「ＡｃｔＲＩＩＡ」は、任意の種に由来するアクチビン受容体ＩＩＡ型（ＡｃｔＲＩＩＡ）タンパク質のファミリー、および突然変異誘発または他の修飾によりそのようなＡｃｔＲＩＩＡタンパク質から導出されたバリアントを指す。本明細書におけるＡｃｔＲＩＩＡへの言及は、現在特定されている形態のいずれか１つへの言及であることが理解される。ＡｃｔＲＩＩＡファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチ領域を含むリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および推定セリン／トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成される膜貫通型タンパク質である。

【0121】

用語「ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド」は、ＡｃｔＲＩＩＡファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドならびに有用な活性を保持するそれらの任意のバリアント（突然変異体、断片、融合体、およびペプチド模倣形態を含む）を含むポリペプチドを含む。そのようなバリアントＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの例は、本開示の全体にわたって、ならびに国際特許出願公開第２００６／０１２６２７号および国際公開第２００７／０６２１８８号に提供されている。これらの文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されているすべてのＡｃｔＲＩＩＡ関連ポリペプチドのアミノ酸の付番は、具体的にそうではないと記載されていない限り、下記に提供されているヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質配列（配列番号９）の付番に基づく。

【0122】

ヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質配列は以下の通りである。

【化9】

【0123】

シグナルペプチドは、一重下線で示されており、細胞外ドメインは太字体で示されており、潜在的な内因性Ｎ－連結グリコシル化部位は、二重下線で示されている。

【0124】

プロセシングされた細胞外ヒトＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド配列は、以下の通りである。

【化10】

【0125】

細胞外ドメインのＣ末端「尾部」は、一重下線により示されている。「尾部」が欠失した配列（Δ１５配列）は、以下の通りである。

【化11】

【0126】

ヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質をコードする核酸配列は、下記に示されており（配列番号１２）、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１６１６．４のヌクレオチド１５９～１７００の通りである。シグナル配列には下線が引かれている。

【化12-1】

【化12-2】

【0127】

プロセシングされたヒトＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドをコードする核酸配列は、以下の通りである。

【化13】

【0128】

ＡｃｔＲＩＩＡは、脊椎動物で良好に保存されており、細胞外ドメインの大きな区間が完全に保存されている。例えば、図３は、種々のＡｃｔＲＩＩＡオルソログと比較した、ヒトＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメインの多重配列アラインメントを示す。ＡｃｔＲＩＩＡに結合するリガンドの多くも、高度に保存されている。したがって、こうしたアラインメントから、正常なＡｃｔＲＩＩＡリガンド結合活性にとって重要であるリガンド結合ドメイン内の重要なアミノ酸位置を予測すること、ならびに正常なＡｃｔＲＩＩＡリガンド結合活性を著しく変更せずに置換に耐容性である可能性が高いアミノ酸位置を予測することが可能である。したがって、本開示の方法により有用な活性ヒトＡｃｔＲＩＩＡバリアントポリペプチドは、別の脊椎動物ＡｃｔＲＩＩＡの配列に由来する１つまたは複数のアミノ酸を対応する位置に含んでいてもよく、またはヒトもしくは他の脊椎動物配列の残基と類似した残基を含んでいてもよい。

【0129】

限定を意味しないが、以下の例は、活性ＡｃｔＲＩＩＡバリアントを規定するための本手法を例示する。図３に例示されているように、ヒト細胞外ドメインのＦ１３は、Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ（配列番号１０８）、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ（配列番号１１１）、Ｂｏｓ Ｔａｕｒｕｓ（配列番号１１２）、Ｔｙｔｏ ａｌｂａ（配列番号１１３）、およびＭｙｏｔｉｓ ｄａｖｉｄｉｉ（配列番号１１４）ＡｃｔＲＩＩＡではＹであり、この位置では、Ｆ、Ｗ、およびＹを含む芳香族残基が許容されることを示す。ヒト細胞外ドメインのＱ２４は、Ｂｏｓ Ｔａｕｒｕｓ ＡｃｔＲＩＩＡではＲであり、この位置では、Ｄ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、およびＥを含む荷電残基が許容されることになることを示す。ヒト細胞外ドメインのＳ９５は、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓおよびＴｙｔｏ ａｌｂａ ＡｃｔＲＩＩＡではＦであり、この部位が、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｇ、Ｙなどの極性残基、およびおそらくはＬ、Ｉ、またはＦなどの疎水性残基を含む、幅広く様々な変化に許容性であり得ることを示す。ヒト細胞外ドメインのＥ５２は、Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ ＡｃｔＲＩＩＡではＤであり、この位置では、ＤおよびＥを含む酸性残基が許容されることを示す。ヒト細胞外ドメインのＰ２９は、保存が比較的不良であり、Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ ＡｃｔＲＩＩＡではＳとして、およびＭｙｏｔｉｓ ｄａｖｉｄｉｉ ＡｃｔＲＩＩＡではＬとして出現し、したがってこの位置では、本質的に任意のアミノ酸が許容されるはずである。

【0130】

さらに、上記で考察されているように、ＡｃｔＲＩＩタンパク質は、当技術分野では、特にリガンド結合に関する構造的／機能的特徴の点で特徴付けられている［Attisanoら（１９９２年）Cell ６８巻（１号）：９７～１０８頁；Greenwaldら（１９９９年）Nature Structural Biology ６巻（１号）：１８～２２頁；Allendorphら（２００６年）PNAS １０３巻（２０号）：７６４３～７６４８頁；Thompsonら（２００３年）The EMBO
Journal ２２巻（７号）：１５５５～１５６６頁；ならびに米国特許第７，７０９，
６０５号、第７，６１２，０４１号、および第７，８４２，６６３号］。本明細書の教示に加えて、これら参考文献は、１つまたは複数の所望の活性（例えば、リガンド結合活性）を保持するＡｃｔＲＩＩＡバリアントを生成する方法の指針を詳細に提供する。

【0131】

例えば、スリーフィンガー毒素フォールドとして公知の特徴的構造モチーフは、Ｉ型およびＩＩ型受容体によるリガンド結合に重要であり、各単量体受容体の細胞外ドメイン内の様々な位置に位置する保存されたシステイン残基により形成される［Greenwaldら（１
９９９年）Nat Struct Biol ６巻：１８～２２頁；およびHinck（２０１２年）FEBS Lett ５８６巻：１８６０～１８７０頁］。したがって、ヒトＡｃｔＲＩＩＡのコアリガンド結合ドメインは、こうした保存されたシステインのうちの最も外側のシステインにより境界が示され、配列番号９（ＡｃｔＲＩＩＡ前駆体）の３０～１１０位に対応する。したがって、必ずしもリガンド結合を変更することなく、こうしたシステインにより境界が示されるコア配列に隣接する、構造的にあまり秩序だっていないアミノ酸を、Ｎ末端では約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９個残基、およびＣ末端では、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個残基だけ短縮することができる。例示的なＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメイン短縮体としては、配列番号１０および１１が挙げられる。

【0132】

したがって、ＡｃｔＲＩＩＡの活性部分（例えば、リガンド結合）の一般式は、配列番号９のアミノ酸３０～１１０を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチドである。したがって、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、例えば、配列番号９のアミノ酸２１～３０のいずれか１つに対応する残基から始まり（例えば、アミノ酸２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のいずれか１つから始まり）、配列番号９のいずれか１つのアミノ酸１１０～１３５に対応する位置で終了する（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３５のいずれか１つで終了する）ＡｃｔＲＩＩＡの部分と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなっていてもよい。他の例としては、配列番号９の２１～３０（例えば、アミノ酸２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のいずれか１つから始まる）、２２～３０（例えば、アミノ酸２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のいずれか１つから始まる）、２３～３０（例えば、アミノ酸２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のいずれか１つからから始まる）、２４～３０（例えば、アミノ酸２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のいずれか１つから始まる）から選択される位置から始まり、配列番号９の１１１～１３５（例えば、アミノ酸１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、または１３５のいずれか１つで終了する）、１１２～１３５（例えば、アミノ酸１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、または１３５のいずれか１つで終了する）、１１３～１３５（例えば、アミノ酸１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、または１３５のいずれか１つで終了する）、１２０～１３５（例えば、アミノ酸１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、または１３５のいずれか１つで終了する）、１３０～１３５（例えば、アミノ酸１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、または１３５のいずれか１つで終了する）、１１１～１３４（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４のいずれか１つで終了する）、１１１～１３３（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、または１３３のいずれか１つで終了する）、１１１～１３２（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、または１３２のいずれか１つで終了する）、または１１１～１３１（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、または１３１のいずれか１つで終了する）から選択される位置で終了する構築物が挙げられる。こうした範囲内にあるバリアント、特に、配列番号９の対応する部分と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるものも企図される。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸３０～１１０と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリペプチドを含んでいてもよく、から本質的になってもよく、またはからなっていてもよい。必要に応じて、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸３０～１１０と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリペプチドを含み、リガンド結合ポケットに１、２、５、１０、または１５個以下の保存的アミノ酸変化を含む。

【0133】

ある特定の実施形態では、本開示は、それらの断片、機能的バリアント、および修飾形態を含む、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドを含むＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（阻害剤）、ならびにそれらの使用（例えば、それを必要とする患者の免疫応答を増加させることおよびがんを処置すること）に関する。好ましくは、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、可溶性である（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメイン）。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、および／またはＢＭＰ９］の（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、および／またはＢＭＰ９］に結合する。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸２１～３０に対応する残基から始まり（例えば、アミノ酸２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のいずれか１つから始まり）、配列番号９のいずれか１つのアミノ酸１１０～１３５に対応する位置で終了する（例えば、アミノ酸１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３５のいずれか１つで終了する）ＡｃｔＲＩＩＡの部分と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸３０～１１０と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、からなるか、またはから本質的になる。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸２１～１３５と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、からなるか、またはから本質的になる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９、１０、１１、５０、５４、および５７のいずれか１つのアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、からなるか、またはから本質的になる。

【0134】

ある特定の態様では、本開示は、ＧＤＦトラップポリペプチド（「ＧＤＦトラップ」とも呼ばれる）に関する。一部の実施形態では、本開示のＧＤＦトラップは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、「野生型」または未修飾ＡｃｔＲＩＩポリペプチド）の細胞外ドメイン（リガンド結合ドメインとも呼ばれる）に１つまたは複数の突然変異（例えば、アミノ酸付加、欠失、置換、およびそれらの組合せ）を含むバリアントＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）であり、バリアントＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、対応する野生型のＡｃｔＲＩＩポリペプチドとは異なる１つまたは複数の変更されたリガンド結合活性を有する。好ましい実施形態では、本開示のＧＤＦトラップポリペプチドは、対応する野生型ＡｃｔＲＩＩポリペプチドと同様の少なくとも１つの活性を保持する。例えば、好ましいＧＤＦトラップは、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８に結合し、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８の機能を阻害する（例えば、アンタゴナイズする）。一部の実施形態では、本開示のＧＤＦトラップは、ＴＧＦβスーパーファミリーのリガンドの１つまたは複数にさらに結合および阻害する。したがって、本開示は、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩリガンドに対して変更された結合特異性を有するＧＤＦトラップポリペプチドを提供する。

【0135】

例示のためだが、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、および／またはアクチビンＥ）、特にアクチビンＡなどの１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩ結合リガンドよりも、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８に対する変更されたリガンド結合ドメインの選択性を増加させる１つまたは複数の突然変異を選択してもよい。必要に応じて、変更されたリガンド結合ドメインは、アクチビン結合に対するＫ_ｄのＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８に対するＫ_ｄに対する比が、野生型リガンド結合ドメインの比と比べて、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、またはさらに１０００倍大きい。必要に応じて、変更されたリガンド結合ドメインは、アクチビン阻害のＩＣ_５０のＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８阻害のＩＣ_５０に対する比が、野生型のリガンド結合ドメインと比べて、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、またはさらに１０００倍大きい。必要に応じて、変更されたリガンド結合ドメインは、アクチビン阻害のＩＣ_５０よりも、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、またはさらに１０００倍低いＩＣ_５０で、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８を阻害する。

【0136】

ある特定の好ましい実施形態では、本開示のＧＤＦトラップは、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８（ミオスタチンとしても公知）に優先的に結合するように設計されている。必要に応じて、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８結合トラップは、アクチビンＢにさらに結合してもよい。必要に応じて、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８結合トラップは、ＢＭＰ６にさらに結合してもよい。必要に応じて、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８結合トラップは、ＢＭＰ１０にさらに結合してもよい。必要に応じて、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８結合トラップは、アクチビンＢおよびＢＭＰ６にさらに結合してもよい。ある特定の実施形態では、本開示のＧＤＦトラップは、例えば、野生型ＡｃｔＲＩＩポリペプチドと比較して、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＡ／Ｂ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）に対する結合親和性を減少させる。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のＧＤＦトラップポリペプチドは、アクチビンＡに対する結合親和性を減少させる。

【0137】

ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質のアミノ酸残基（例えば、配列番号１を基準にして、Ｅ３９、Ｋ５５、Ｙ６０、Ｋ７４、Ｗ７８、Ｌ７９、Ｄ８０、およびＦ１０１）は、ＡｃｔＲＩＩＢリガンド結合ポケットにあり、例えば、アクチビンＡ、ＧＤＦ１１、およびＧＤＦ８を含むそのリガンドに対する結合の媒介を支援する。したがって、本開示は、そうしたアミノ酸残基に１つまたは複数の突然変異を含むＡｃｔＲＩＩＢ受容体の変更されたリガンド結合ドメイン（例えば、ＧＤＦ８／ＧＤＦ１１結合ドメイン）を含むＧＤＦトラップポリペプチドを提供する。

【0138】

具体的な例として、ＡｃｔＲＩＩＢのリガンド結合ドメインの正荷電アミノ酸残基Ａｓｐ（Ｄ８０）を、異なるアミノ酸残基に突然変異させて、ＧＤＦ８に優先的に結合するが、アクチビンには結合しないＧＤＦトラップポリペプチドを生成することができる。好ましくは、配列番号１を基準にしてＤ８０残基は、非荷電アミノ酸残基、負のアミノ酸残基、および疎水性アミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基に変更されている。さらなる具体的な例として、配列番号１の疎水性残基Ｌ７９を変更して、変更されたアクチビン－ＧＤＦ１１／ＧＤＦ８結合特性を付与することができる。例えば、Ｌ７９Ｐ置換は、ＧＤＦ１１結合を、アクチビン結合よりも大きく低減する。対照的に、Ｌ７９の酸性アミノ酸による置き換え［アスパラギン酸またはグルタミン酸；Ｌ７９ＤまたはＬ７９Ｅ置換］は、アクチビンＡ結合親和性を大幅に低減するが、ＧＤＦ１１結合親和性は保持される。例示的な実施形態では、本明細書に記載の方法は、必要に応じて、１つまたは複数の追加のアミノ酸置換、付加、または欠失と組み合わせて、配列番号１の７９位に対応する位置に酸性アミノ酸（例えば、ＤまたはＥ）を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドであるＧＤＦトラップポリペプチドを利用する。

【0139】

ある特定の態様では、本開示は、ＡＬＫ４ポリペプチドおよびそれらの使用（例えば、それを必要とする患者の免疫応答を増加させること、およびがんまたは病原体を処置すること）に関する。本明細書で使用される場合、用語「ＡＬＫ４」は、任意の種に由来するアクチビン受容体様キナーゼ４タンパク質のファミリー、および突然変異誘発または他の修飾によりそのようなＡＬＫ４タンパク質から導出されたバリアントを指す。本明細書におけるＡＬＫ４への言及は、現在特定されている形態のいずれか１つへの言及であることが理解される。ＡＬＫ４ファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および推定セリン／トレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成される膜貫通型タンパク質である。

【0140】

用語「ＡＬＫ４ポリペプチド」は、ＡＬＫ４ファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドならびに有用な活性を保持するそれらの任意のバリアント（突然変異体、断片、融合体、およびペプチド模倣形態を含む）を含むポリペプチドを含む。本明細書に記載されているすべてのＡＬＫ４関連ポリペプチドのアミノ酸の付番は、具体的にそうではないと記載されていない限り、下記のヒトＡＬＫ４前駆体タンパク質配列（配列番号１４）の付番に基づく。

【0141】

標準ヒトＡＬＫ４前駆体タンパク質配列（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００４２９３）は、以下のとおりである。

【化14】

【0142】

シグナルペプチドは、一重下線により示されており、細胞外ドメインは太字体により示されている。

【0143】

プロセシングされた細胞外ヒトＡＬＫ４ポリペプチド配列は、以下の通りである。

【化15】

【0144】

ＡＬＫ４前駆体タンパク質をコードする核酸配列は、下記（配列番号１６）に示されており、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００４３０２．４のヌクレオチド７８～１５９２に対応する。シグナル配列には下線が引かれており、細胞外ドメインは、太字体で示されている。

【化16】

【0145】

細胞外ＡＬＫ４ポリペプチドをコードする核酸配列は、以下の通りである。

【化17】

【0146】

ヒトＡＬＫ４前駆体タンパク質配列の代替アイソフォームであるアイソフォームＢ（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０６４７３２．３）は、以下の通りである。

【化18】

【0147】

細胞外ドメインは、太字体で示されている。

【0148】

プロセシングされた細胞外ＡＬＫ４ポリペプチド配列は、以下の通りである。

【化19】

【0149】

ＡＬＫ４前駆体タンパク質（アイソフォームＢ）をコードする核酸配列は、下記（配列番号２０）に示されており、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿０２０３２７．３のヌクレオチド１８６～１５４７に対応する。細胞外ドメインをコードするヌクレオチドは、太字体で示されている。

【化20】

【0150】

細胞外ＡＬＫ４ポリペプチド（アイソフォームＢ）をコードする核酸配列は、以下の通りである。

【化21】

【0151】

ＡＬＫ４は、脊椎動物で良好に保存されており、細胞外ドメインの大きな区間が完全に保存されている。例えば、図４は、種々のＡＬＫ４オルソログと比較した、ヒトＡＬＫ４細胞外ドメインの多重配列アラインメントを示す。ＡＬＫ４に結合するリガンドの多くも、高度に保存されている。したがって、こうしたアラインメントから、正常なＡＬＫ４リガンド結合活性にとって重要であるリガンド結合ドメイン内の重要なアミノ酸位置を予測すること、ならびに正常なＡＬＫ４リガンド結合活性を著しく変更せずに置換に許容性である可能性が高いアミノ酸位置を予測することが可能である。したがって、本開示の方法により有用な活性ヒトＡＬＫ４バリアントポリペプチドは、別の脊椎動物ＡＬＫ４の配列に由来する１つまたは複数のアミノ酸を対応する位置に含んでいてもよく、またはヒトもしくは他の脊椎動物配列の残基と類似した残基を含んでいてもよい。

【0152】

限定を意味しないが、以下の例は、活性ＡＬＫ４バリアントを規定するための本手法を例示する。図４に例示されているように、ヒトＡＬＫ４細胞外ドメイン（配列番号１１５）のＶ６は、Ｍｕｓ ｍｕｃｕｌｕｓ ＡＬＫ４（配列番号１１９）ではイソロイシンであり、したがって、この位置を変更してもよく、必要に応じて、Ｌ、Ｉ、またはＦなどの別の疎水性残基、またはＧａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ ＡＬＫ４（配列番号１１８）に観察されるようにＡなどの無極性残基に変更してもよい。ヒト細胞外ドメインのＥ４０は、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ ＡＬＫ４ではＫであり、この部位が、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｇ、Ｙなどの極性残基、およびおそらくはＡなどの無極性残基を含む、幅広く様々な変化に許容性であり得ることを示す。ヒト細胞外ドメインのＳ１５は、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ ＡＬＫ４ではＤであり、この位置では幅広い構造バリエーションが許容され、Ｓ、Ｔ、Ｒ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ｐ、Ｇ、およびＹなどの極性残基が有利であることを示す。ヒト細胞外ドメインのＥ４０は、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ ＡＬＫ４ではＫであり、この位置では、Ｄ、Ｒ、Ｋ、Ｈを含む荷電残基、ならびにＱおよびＮが許容されることになることを示す。ヒト細胞外ドメインのＲ８０は、Ｃｏｎｄｙｌｕｒａ ｃｒｉｓｔａｔａ ＡＬＫ４（配列番号１１６）ではＫであり、この位置では、Ｒ、Ｋ、およびＨを含む塩基性残基が許容されることを示す。ヒト細胞外ドメインのＹ７７は、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ ＡＬＫ４（配列番号１２０）ではＦであり、この位置では、Ｆ、Ｗ、およびＹを含む芳香族残基が許容されることを示す。ヒト細胞外ドメインのＰ９３は、保存が比較的不良であり、Ｅｒｉｎａｃｅｕｓ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ ＡＬＫ４（配列番号１１７）ではＳとして、およびＧａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ ＡＬＫ４ではＮとして出現し、したがってこの位置では、本質的に任意のアミノ酸が許容されるはずである。

【0153】

さらに、ＡＬＫ４タンパク質は、当技術分野では、特にリガンド結合に関する構造的および機能的特徴の点で特徴付けられている［例えば、Harrisonら（２００３年）J Biol
Chem ２７８巻（２３号）：２１１２９～２１１３５頁；Romanoら（２０１２年）J Mol Model １８巻（８号）：３６１７～３６２５頁；およびCalvaneseら（２００９年）１５巻（３号）：１７５～１８３頁］。本明細書の教示に加えて、これら参考文献は、１つまたは複数の正常な活性（例えば、リガンド結合活性）を保持するＡＬＫ４バリアントを生成する方法の指針を詳細に提供する。

【0154】

例えば、スリーフィンガー毒素フォールドとして公知の特徴的構造モチーフは、Ｉ型およびＩＩ型受容体によるリガンド結合に重要であり、各単量体受容体の細胞外ドメイン内の様々な位置に位置する保存されたシステイン残基により形成される［Greenwaldら（１
９９９年）Nat Struct Biol ６巻：１８～２２頁；およびHinck（２０１２年）FEBS Lett ５８６巻：１８６０～１８７０頁］。したがって、ヒトＡＬＫ４のコアリガンド結合ドメインは、こうした保存されたシステインのうちの最も外側のシステインにより境界が示され、配列番号１４（ＡＬＫ４前駆体）の３４～１０１位に対応する。必ずしもリガンド結合を変更することなく、こうしたシステインにより境界が示されるコア配列に隣接する、構造的にあまり秩序だっていないアミノ酸を、Ｎ末端では１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３個残基、および／またはＣ末端では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個残基だけ短縮することができる。Ｎ末端および／またはＣ末端短縮の例示的なＡＬＫ４細胞外ドメインとしては、配列番号１５および１９が挙げられる。

【0155】

したがって、ＡＬＫ４の活性部分（例えば、リガンド結合部分）の一般式は、配列番号１４を基準にしてアミノ酸３４～１０１を含む。したがって、ＡＬＫ４ポリペプチドは、例えば、配列番号１４のアミノ酸２４～３４のいずれか１つに対応する残基から始まり（例えば、アミノ酸２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４のいずれか１つから始まり）、配列番号１４のいずれか１つのアミノ酸１０１～１２６に対応する位置で終了する（例えば、アミノ酸１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、または１２６のいずれか１つで終了する）ＡＬＫ４の部分と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでいてもよく、から本質的になっていてもよく、またはからなっていてもよい。他の例としては、配列番号１４の２４～３４（例えば、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４位のいずれか１つ）、２５～３４（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４位のいずれか１つ）、または２６～３４（例えば、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４位のいずれか１つ）の位置から始まり、配列番号１４の１０１～１２６（例えば、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、または１２６位のいずれか１つ）、１０２～１２６（例えば、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、または１２６位のいずれか１つ）、１０１～１２５（例えば、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、または１２５位のいずれか１つ）、１０１～１２４（例えば、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、または１２４位のいずれか１つ）、１０１～１２１（例えば、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、または１２１位のいずれか１つ）、１１１～１２６（例えば、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、または１２６位のいずれか１つ）、１１１～１２５（例えば、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、または１２５位のいずれか１つ）、１１１～１２４（例えば、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、または１２４位のいずれか１つ）、１２１～１２６（例えば、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、または１２６位のいずれか１つ）、１２１～１２５（例えば、１２１、１２２、１２３、１２４、または１２５位のいずれか１つ）、１２１～１２４（例えば、１２１、１２２、１２３、または１２４位のいずれか１つ）、または１２４～１２６（例えば、１２４、１２５、または１２６位のいずれか１つ）の位置で終了する構築物が挙げられる。また、こうした範囲内にあるバリアント、特に、配列番号１４の対応する部分と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するものが企図される。

【0156】

本明細書に記載されているバリエーションは、種々の様式で組み合わせることができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４バリアントは、リガンド結合ポケットに１、２、５、６、７、８、９、１０、または１５個以下の保存的アミノ酸変化を含む。変異性が特に良好に許容され得る、結合ポケットの外部の部位としては、細胞外ドメインのアミノおよびカルボキシ末端（上述のような）が挙げられる。

【0157】

ある特定の実施形態では、本開示は、それらの断片、機能的バリアント、および修飾形態を含む、少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含むヘテロ多量体であるＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（阻害剤）、ならびにそれらの使用（例えば、それを必要とする患者の免疫応答を増加させること、およびがんを処置すること）に関する。好ましくは、ＡＬＫ４ポリペプチドは、可溶性である（例えば、ＡＬＫ４の細胞外ドメイン）。一部の実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチドを含むヘテロ多量体は、１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、および／またはＢＭＰ９］の（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４ポリペプチドを含むヘテロ多量体は、１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、および／またはＢＭＰ９］に結合する。一部の実施形態では、ヘテロ多量体は、配列番号１４を基準にして、アミノ酸３４～１０１と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ヘテロ多量体は、配列番号１４、１５、１８、１９、７３、７４、７６、７７、７９、および８０のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ヘテロ多量体は、配列番号１４、１５、１８、１９、７４、７６、７７、７９、８０、１４３、および１４５のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドからなる、またはから本質的になる少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含む。

【0158】

ある特定の態様では、本開示は、１つまたは複数のＡＬＫ４受容体ポリペプチド（例えば、配列番号１４、１５、１８、１９、７４、７６、７７、７９、８０、１４３、および１４５、ならびにそれらのバリアント）および１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢ受容体ポリペプチド（例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、５８、５９、６０、６３、６４、６５、６６、６８、６９、７０、７１、７３、７７、７８、１３１、１３２、１３３、１３９、１４１、およびそれらのバリアント）を含み、本明細書では一般に「ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体複合体」または「ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体」と呼ばれるヘテロ多量体複合体に関し、それらの使用（例えば、それを必要とする患者の免疫応答を増加させること、およびがんを処置すること）を含む。好ましくは、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、可溶性である［例えば、ヘテロ多量体複合体は、ＡＬＫ４受容体の可溶性部分（ドメイン）およびＡｃｔＲＩＩＢ受容体の可溶性部分（ドメイン）を含む］。一般に、ＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインは、これら受容体の可溶性部分に対応する。したがって、一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ＡＬＫ４受容体の細胞外ドメインおよびＡｃｔＲＩＩＢ受容体の細胞外ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、および／またはＢＭＰ９］の（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、および／またはＢＭＰ９］に結合する。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１４、１５、１８、１９、７４、７６、７７、７９、８０、１４３、および１４５のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体複合体は、配列番号１４のアミノ酸２４～３４、２５～３４、または２６～３４のいずれか１つに対応する残基から始まり、配列番号１４の１０１～１２６、１０２～１２６、１０１～１２５、１０１～１２４、１０１～１２１、１１１～１２６、１１１～１２５、１１１～１２４、１２１～１２６、１２１～１２５、１２１～１２４、または１２４～１２６の位置で終了するＡＬＫ４の部分と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む、から本質的になる、からなる少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１４を基準にしてアミノ酸３４～１０１と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む、から本質的になる、からなる少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４－ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１、２、３、４、５、６、５８、５９、６０、６３、６４、６５、６６、６８、６９、７０、７１、７３、７７、７８、１３１、１３２、１３３、１３９、１４１のいずれか１つのアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む、から本質的になる、からなる少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体複合体は、アミノ酸２０～２９、２０～２４、２１～２４、２２～２５、または２１～２９のいずれか１つに対応する残基から始まり、配列番号１の１０９～１３４、１１９～１３４、１１９～１３３、１２９～１３４、または１２９～１３３の位置で終了するＡｃｔＲＩＩＢの部分と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む、から本質的になる、からなる少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１のアミノ酸２９～１０９と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む、から本質的になる、からなる少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、配列番号１のアミノ酸２５～１３１と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む、から本質的になる、からなる少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体複合体は、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含み、配列番号１のＬ７９に対応する位置は、酸性アミノ酸ではない（つまり、天然に存在するＤまたはＥアミノ酸残基でも、人工酸性アミノ酸残基でもない）。本開示のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体としては、例えば、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体、およびさらにより高次のオリゴマー構造が挙げられる。例えば、図２１～２３を参照されたい。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のヘテロ多量体複合体は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体である。

【0159】

天然に存在するＴＧＦβＲＩＩタンパク質は、細胞の外部に位置するタンパク質の部分（細胞外部分）および細胞の内部に位置するタンパク質の部分（細胞内部分）を有する膜貫通型タンパク質である。本開示の態様は、ＴＧＦβＲＩＩの細胞外ドメインおよび／または細胞外ドメインの短縮部分内に突然変異を含むバリアントＴＧＦβＲＩＩポリペプチドを包含する。上記に記載されているように、ヒトＴＧＦβＲＩＩは、天然では、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の選択的スプライシングにより生成されるＡ（長鎖）およびＢ（短鎖）の少なくとも２つのアイソフォームとして存在する（図１１および１０ならびに配列番号３５および３４）。配列番号１４８は、配列番号３５の残基２３～１８４に対応し、ＴＧＦβＲＩＩの長鎖アイソフォームの天然全長細胞外ドメインを示す。別様の記載がない限り、ＴＧＦβＲＩＩ短鎖および長鎖アイソフォームに基づくバリアントに関するアミノ酸位置の付番は、それぞれ、天然前駆体である配列番号３４および配列番号３５における対応する位置を指す。

【0160】

ある特定の実施形態では、本開示は、バリアントＴＧＦβＲＩＩポリペプチドを提供する。本開示のＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、これらに限定されないが、ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３などの、ＴＧＦβスーパーファミリーメンバーに結合し、その機能を阻害することができる。ＴＧＦβＲＩＩポリペプチドとしては、そのＣ末端が、配列番号３４のアミノ酸１５３～１５９（例えば、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、または１５９）のいずれかで生じる、天然に存在するＴＧＦβＲＩＩポリペプチドの短縮ＥＣＤドメインと、少なくとも８０％同一の、および必要に応じて少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列からなるまたは含むポリペプチドを挙げることができる。ＴＧＦβＲＩＩポリペプチドとしては、そのＣ末端が、配列番号３５のアミノ酸１７８～１８４（例えば、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、または１８４）のいずれかで生じる、天然に存在するＴＧＦβＲＩＩポリペプチドの短縮ＥＣＤドメインと、少なくとも８０％同一の、および必要に応じて少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列からなるまたは含むポリペプチドを挙げることができる。必要に応じて、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸１６０～５６７からなる配列に由来する、または配列番号３５のアミノ酸１８５～５９２からなる配列に由来する、５つよりも多くの連続アミノ酸も、１０、２０、３０、４０、５０、５２、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、もしくは２００個、もしくはそれを超える数よりも多くの連続アミノ酸も含まない。プロセシングされていないＴＧＦβＲＩＩポリペプチドには、任意のシグナル配列ならびにシグナル配列のＮ末端側の任意の配列がいずれも含まれていてもよく、またはいずれも除外されていてもよい。本明細書で説明されているように、成熟（プロセシングされた）ＴＧＦβＲＩＩポリペプチドのＮ末端は、配列番号３４のアミノ酸２３～３５または配列番号３５の２３～６０のいずれで生じてもよい。当業者であれば、ＴＧＦβＲＩＩの長鎖アイソフォームに基づく対応するバリアントは、２５アミノ酸の挿入をコードするヌクレオチド配列を、挿入のＣ末端側の隣接位置にある保存的Ｖａｌ－Ｉｌｅ置換と共に含むことになることを理解するであろう。したがって、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、短鎖および長鎖アイソフォームを両方とも含む、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチドの単離された細胞外部分、それらのバリアント（例えば、配列番号３４のアミノ酸２３～１５９または配列番号３５のアミノ酸２３～１８４に対応する配列に、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、または３５個以下のアミノ酸置換を含むバリアントを含む）、それらの断片、および先述のもののいずれかを含む融合タンパク質を含んでいてもよいが、各々の場合、好ましくは、先述のＴＧＦβＲＩＩポリペプチドはいずれも、ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３の少なくとも１つに対する実質的な親和性を保持することになる。一般に、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、生物学的に意義のある温度、ｐＨレベル、およびオスモル濃度で、水溶液に可溶性であるように設計されることになる。

【0161】

まとめると、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチドの活性部分は、配列番号３４のアミノ酸配列２３～１５３、２３～１５４、２３～１５５、２３～１５６、２３～１５７、または２３～１５８、ならびに配列番号３４のアミノ酸２４～３５のいずれかから始まる、こうした配列のバリアントを含んでいてもよい。同様に、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチドの活性部分は、配列番号３５のアミノ酸配列２３～１７８、２３～１７９、２３～１８０、２３～１８１、２３～１８２、または２３～１８３、ならびに配列番号３５のアミノ酸２４～６０のいずれかから始まる、こうした配列のバリアントを含んでいてもよい。例示的なＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸配列２９～１５９、３５～１５９、２３～１５３、２９～１５３、および３５～１５３、または配列番号３５のアミノ酸配列２９～１８４、６０～１８４、２３～１７８、２９～１７８、および６０～１７８を含む。また、こうした範囲内にあるバリアント、特に、配列番号３４または配列番号３５の対応する部分と、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するものが企図される。配列番号３４のアミノ酸１６０～５６７からなる配列も、配列番号３５のアミノ酸１８５～５９２からなる配列も含まないＴＧＦβＲＩＩポリペプチドを選択してもよい。

【0162】

加えて、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、種々のリーダー配列のいずれかをＮ末端に含んでいてもよい。そのような配列は、ペプチドが、真核生物系で発現され、分泌経路を標的とすることを可能にするであろう。例えば、Ernstら、米国特許第５，０８２，７８３
号（１９９２年）を参照されたい。あるいは、天然ＴＧＦβＲＩＩシグナル配列を使用して、細胞からの放出を達成してもよい。考え得るリーダー配列としては、天然リーダーである組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）およびミツバチメリチンが挙げられる。シグナルペプチドのプロセシングは、他の変数の中でも、選択されたリーダー配列、使用される細胞タイプ、および培養条件に応じて様々であり得る。したがって、成熟ＴＧＦβＲＩＩポリペプチドの実際のＮ末端開始部位は、１、２、３、４、または５個のアミノ酸だけ、Ｎ末端またはＣ末端方向のいずれかにシフトする場合がある。ＴＧＦβＲＩＩ－Ｆｃ融合タンパク質の例としては、本明細書に示されている配列番号１４８および１５０が挙げられ、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド部分には下線が引かれている。当業者であれば、ＴＧＦβＲＩＩの長鎖アイソフォームに基づく対応するバリアントは、２５アミノ酸の挿入を、挿入のＣ末端側の隣接位置にある保存的Ｖａｌ－Ｉｌｅ置換と共に含むことになることを理解するであろう。ある特定の態様では、本開示は、配列番号１５０のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、ならびに本明細書に記載の方法によるその使用に関する。ある特定の態様では、本開示は、配列番号１４８のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、ならびに本明細書に記載の方法によるその使用に関する。ある特定の態様では、本開示は、配列番号１４８のアミノ酸２５～４６（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、または４６）のいずれか１つから始まり、配列番号１４８のアミノ酸１７０～１８６（例えば、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、または１８６）のいずれか１つで終了するアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、ならびに本明細書に記載の方法によるその使用に関する。

【0163】

一部の実施形態では、本開示は、治療有効性または安定性（例えば、保管寿命、およびｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質分解性分解に対する耐性）を増強させるなどの目的で、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、および／またはＴＧＦβＲＩＩポリペプチドの構造を修飾することにより機能的バリアントを製作することを企図する。バリアントは、アミノ酸置換、欠失、付加、またはそれらの組合せにより生成することができる。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンによる、アスパラギン酸のグルタミン酸による、トレオニンのセリンによる単独の置き換え、またはアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸による類似の置き換え（例えば、保存的突然変異）は、得られる分子の生物活性に大きな影響を及ぼさないであろうと予想することは合理的である。保存的置き換えは、それらの側鎖が関連するアミノ酸のファミリー内で生じるものである。本開示のポリペプチドのアミノ酸配列の変化が、機能的相同体をもたらすか否かは、バリアントポリペプチドが、細胞にて野生型のポリペプチドと同様の様式の応答をもたらす能力、または例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびレフティを含む１つまたは複数のリガンドに結合する能力を評価することにより、直ちに決定することができる。

【0164】

ある特定の実施形態では、本開示は、ポリペプチドのグリコシル化を変更するような、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、および／またはＴＧＦβＲＩＩポリペプチドの具体的な突然変異を企図する。そのような突然変異は、Ｏ－連結またはＮ－連結グリコシル化部位などの、１つまたは複数のグリコシル化部位を導入または排除するように選択することができる。アスパラギン連結グリコシル化認識部位は、一般に、適切な細胞グリコシル化酵素により特異的に認識されるトリペプチド配列アスパラギン－Ｘ－トレオニンまたはアスパラギン－Ｘ－セリンを含む（式中、「Ｘ」は、任意のアミノ酸である）。また、変更は、１つまたは複数のセリンまたはトレオニン残基（Ｏ－連結グリコシル化部位のための）を、ポリペプチドの配列に付加または置換することにより行ってもよい。グリコシル化認識部位の第１または第３のアミノ酸位置の一方または両方における様々なアミノ酸置換または欠失（および／または第２の位置におけるアミノ酸欠失）は、修飾トリペプチド配列の非グリコシル化をもたらす。ポリペプチドの糖鎖の個数を増加させるための別の手段は、グリコシドをポリペプチドに化学的または酵素的にカップリングすることによる。使用されるカップリングモードに応じて、糖は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインにあるものなどの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニン、もしくはヒドロキシプロリンにあるものなどの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンにあるものものなどの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に付着させることができる。ポリペプチドに存在する１つまたは複数の糖鎖の除去は、化学的および／または酵素的に達成することができる。化学的脱グリコシル化は、例えば、ポリペプチドを、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価な化合物に曝露させることを含んでいてもよい。この処理は、アミノ酸配列の完全性を保ったまま、連結糖（Ｎ－アセチルグルコサミンまたはＮ－アセチルガラクトサミン）以外のほとんどまたはすべての糖の切断をもたらす。ポリペプチドの糖鎖の酵素的切断は、Thotakuraら［Meth. Enzymol.（１９８７年）１３８巻：３５０頁］により記載されているように、様々なエンド－およびエキソ－グリコシダーゼを使用することにより達成することができる。哺乳動物、酵母、昆虫、および植物細胞はすべて、異なるグリコシル化パターンを導入することができ、それらはペプチドのアミノ酸配列により影響を受ける場合があるため、ポリペプチドの配列は、使用される発現系のタイプに応じて適切に調整することができる。一般に、ヒトで使用される場合、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、およびヘテロ多量体は、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞株などの、適切なグリコシル化を提供する哺乳動物細胞株で発現させることができるが、他の哺乳動物発現細胞株も同様に有用であると予想される。

【0165】

本開示は、突然変異体、特にＡＬＫ４、ＡｃｔＲＩＩ、および／またはＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、ならびに短縮突然変異体のコンビナトリアル突然変異体のセットを生成するための方法をさらに企図する。コンビナトリアル突然変異体のプールは、機能的に活性な（例えば、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンド結合性の）ＡＬＫ４、ＡｃｔＲＩＩ、および／またはＴＧＦβＲＩＩ配列の特定に特に有用である。そのようなコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、変更された薬物動態または変更されたリガンド結合などの、変更された特性を有するポリペプチドバリアントを生成するためであってもよい。様々なスクリーニングアッセイが下記に提供されており、そのようなアッセイを、バリアントの評価に使用することができる。例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体バリアントを、１つまたは複数のリガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびレフティ）に結合する能力について、ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドのＴＧＦβスーパーファミリー受容体への結合を防止する能力について、および／またはリガンドにより引き起こされるシグナル伝達に干渉する能力についてスクリーニングしてもよい。

【0166】

また、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の活性を、細胞に基づくアッセイでまたはｉｎ ｖｉｖｏで試験してもよい。例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の、がん細胞のがん成長に関与する遺伝子の発現に対する効果を評価してもよい。これは、必要な場合、１つまたは複数の組換えリガンドタンパク質（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびレフティ）の存在下で実施してもよく、細胞を、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体（heteromultimes）および必要に応じてＴＧＦβスーパーファミリーリガンドを産生するように、トランスフェクトしてもよい。同様に、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を、マウスまたは他の動物に投与してもよく、当技術分野で認識されている方法を使用して、筋肉形成および強度などの１つまたは複数の測定値を評価してもよい。同様に、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体、またはそれらのバリアントの活性を、がん細胞において、例えば本明細書に記載のようなアッセイにより、および当技術分野で常識的なアッセイにより、こうした細胞の成長に対する任意の効果について試験してもよい。ＳＭＡＤ応答性レポーター遺伝子を、そのような細胞株で使用して、下流シグナル伝達に対する効果をモニターしてもよい。

【0167】

参照ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体と比べて、選択性の増加または概して効力の増加を示すコンビナトリアル由来バリアントを生成することができる。そのようなバリアントは、組換えＤＮＡ構築物から発現される場合、遺伝子治療プロトコールで使用することができる。同様に、突然変異誘発は、対応する未修飾ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体とは劇的に異なる細胞内半減期を有するバリアントを生じさせることができる。例えば、変更されたタンパク質を、タンパク質分解性分解、または未修飾ポリペプチド破壊もしくはそうでなければ不活化をもたらす他の細胞プロセスに対して、より安定かまたはより不安定かのいずれかにすることができる。そのようなバリアントおよびそれらをコードする遺伝子を利用して、ポリペプチドの半減期をモジュレ－トすることにより、ポリペプチド複合体レベルを変更することができる。例えば、半減期が短いと、より一過性の生物学的効果を生じさせることができ、誘導可能な発現系の一部である場合、細胞内の組換えポリペプチド複合体レベルのより厳密な制御を可能にすることができる。Ｆｃ融合タンパク質では、リンカー（該当する場合）および／またはＦｃ部分に突然変異を製作して、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の半減期を変更することができる。

【0168】

コンビナトリアルライブラリーは、各々が潜在的なＡＬＫ４ ＴＧＦβＲＩＩおよび／またはＡｃｔＲＩＩ配列の少なくとも部分を含むポリペプチドのライブラリーをコードする遺伝子の縮重ライブラリーから生成することができる。例えば、潜在的なＡＬＫ４、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはＡｃｔＲＩＩコードヌクレオチド配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、またはその代わりにより大型の融合タンパク質のセットとして（例えば、ファージディスプレイの場合）発現可能になるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、遺伝子配列に酵素的にライゲーションすることができる。

【0169】

潜在的相同体のライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から生成することができる方法は多数存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合成機で実施することができ、その後、合成遺伝子を、発現のために適切なベクターにライゲーションすることができる。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当技術分野で周知である［Narang, SA（１
９８３年）Tetrahedron ３９巻：３頁；Itakuraら（１９８１年）Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules、AG Walton編、Amsterdam: Elsevier、２７３～２８９頁；Itakuraら（１９８４年）Annu. Rev. Biochem. ５３巻：３２
３頁；Itakuraら（１９８４年）Science １９８巻：１０５６頁；およびIkeら（１９８
３年）Nucleic Acid Res. １１巻：４７７頁］。そのような技法は、他のタンパク質
の定向進化に使用されている［Scottら、（１９９０年）Science ２４９巻：３８６～３９０頁；Robertsら（１９９２年）PNAS USA ８９巻：２４２９～２４３３頁；Devlinら（１９９０年）Science ２４９巻：４０４～４０６頁；Cwirlaら、（１９９０年）PNAS
USA ８７巻：６３７８～６３８２頁；ならびに米国特許第５，２２３，４０９号、第
５，１９８，３４６号、および第５，０９６，８１５号］。

【0170】

あるいは、突然変異誘発の他の形態を利用して、コンビナトリアルライブラリーを生成してもよい。例えば、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発を使用したスクリーニングにより［Rufら（１９９４年
）Biochemistry ３３巻：１５６５～１５７２頁；Wangら（１９９４年）J. Biol. Chem. ２６９巻：３０９５～３０９９頁；Balintら（１９９３年）Gene １３７巻：１０９～１１８頁；Grodbergら（１９９３年）Eur. J. Biochem. ２１８巻：５９７～６０１頁；Nagashimaら（１９９３年）J. Biol. Chem. ２６８巻：２８８８～２８９２頁；Lowmanら（１９９１年）Biochemistry ３０巻：１０８３２～１０８３８頁；およびCunninghamら（１９８９年）Science ２４４巻：１０８１～１０８５頁］、リンカースキャニング突然変異誘発により［Gustinら（１９９３年）Virology １９３巻：６５３～６６０頁；およびBrownら（１９９２年）Mol. Cell Biol. １２巻：２６４４～２６５２頁；McKnightら（１９８２年）Science ２３２巻：３１６頁]、飽和突然変異誘発により[Meyersら（１９８６年）Science ２３２巻：６１３頁]、ＰＣＲ突然変異誘発により［Leungら（１９８９年）Method Cell Mol Biol １巻：１１～１９頁］、または化学的突然
変異誘発［Millerら（１９９２年）A Short Course in Bacterial Genetics、CSHL
Press、Cold Spring Harbor、NY；およびGreenerら（１９９４年）Strategies in Mol Biol ７巻：３２～３４頁］を含むランダム突然変異誘発により、ライブラリーか
ら生成し、単離することができる。リンカースキャニング突然変異誘発は、特にコンビナトリアル設定では、ＡＬＫ４、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはＡｃｔＲＩＩポリペプチドの短縮（生物活性）形態を特定するための魅力的な方法である。

【0171】

点突然変異および短縮により製作されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、およびさらに言えば、ある特定の特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための広範な技法が、当技術分野で公知である。そのような技法は、一般に、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体のコンビナトリアル突然変異誘発により生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適応可能であろう。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も幅広く使用されている技法は、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングし、適切な細胞を得られたベクターのライブラリーで形質転換し、所望の活性の検出により、産物が検出された遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離が容易にされる条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。好ましいアッセイとしては、リガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびレフティ）結合アッセイ、および／またはリガンド媒介性細胞シグナル伝達アッセイが挙げられる。

【0172】

ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ＡＬＫ４、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはＡｃｔＲＩＩポリペプチドに天然に存在する任意のものに加えて、翻訳後修飾をさらに含んでいてもよい。そのような修飾としては、これらに限定されないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が挙げられる。その結果、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、ポリエチレングリコール、脂質、ポリサッカリドまたはモノサッカリド、およびホスフェートなどの非アミノ酸エレメントを含んでいてもよい。ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の機能性に対するそのような非アミノ酸エレメントの影響を、他のヘテロ多量体複合体バリアントについて、本明細書に記載のように試験してもよい。本開示のポリペプチドが、ポリペプチドの新生形態の切断により細胞中で産生される場合、翻訳後プロセシングも、タンパク質の正確なフォールディングおよび／または機能に重要であり得る。様々な細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ－３Ｔ３、またはＨＥＫ２９３）が、そのような翻訳後活性のための特定の細胞機構および特徴的な機序を有し、ＡＬＫ４、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはＡｃｔＲＩＩポリペプチドの正確な修飾およびプロセシングを保証するように選択することができる。

【0173】

ある特定の態様では、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、および／またはＡＬＫ４ポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）、ＴＧＦβＲＩＩ、またはＡＬＫ４ポリペプチドの少なくとも部分（ドメイン）、および１つまたは複数の異種性部分（ドメイン）を含む融合タンパク質である。そのような融合ドメインの周知の例としては、これらに限定されないが、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、またはヒト血清アルブミンが挙げられる。融合ドメインは、所望の特性を付与するように選択することができる。例えば、一部の融合ドメインは、親和性クロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。親和性精製の目的では、グルタチオン－、アミラーゼ－、およびニッケル－またはコバルト－コンジュゲート樹脂などの親和性クロマトグラフィー用の関連マトリックスが使用される。そのようなマトリックスの多くは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＧＳＴ精製系および（ＨＩＳ_６）融合パートナーに有用なＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）系（Ｑｉａｇｅｎ）などの「キット」形態で入手可能である。別の例として、融合ドメインは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの検出を容易にするように選択してもよい。そのような検出ドメインの例としては、種々の蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）、ならびに通常は、特異的抗体が利用可能な短鎖ペプチド配列である「エピトープタグ」が挙げられる。特異的モノクローナル抗体が直ちに利用可能な周知のエピトープタグとしては、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）、およびｃ－ｍｙｃタグが挙げられる。一部の場合では、融合ドメインは、第Ｘａ因子またはトロンビンなどに対するプロテアーゼ切断部位を有し、それにより、関連プロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化し、それにより組換えタンパク質をそこから解放することが可能になる。その後、解放されたタンパク質を、その後のクロマトグラフィー分離により融合ドメインから単離することができる。選択することができる他のタイプの融合ドメインとしては、多量体化（例えば、二量体化、四量体化）ドメイン、および例えば免疫グロブリンに由来する定常ドメイン（例えば、Ｆｃドメイン）を含む（追加の生物学的機能を付与する）機能的ドメインが挙げられる。本明細書に記載のように、一部の実施形態では、好ましい多量体化ドメインは、非対称的対合を促進して、ヘテロ多量体構造（例えば、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体）を形成する修飾Ｆｃドメインである。

【0174】

ある特定の態様では、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、および／またはＡＬＫ４ポリペプチドは、ポリペプチドを「安定化」することが可能な１つまたは複数の修飾を含む。「安定化」とは、それが、破壊の減少、腎臓によるクリアランスの減少、または作用剤の他の薬物動態学的影響によるか否かに関わらず、ｉｎ ｖｉｔｒｏ半減期、血清半減期を増加させるものすべてを意味する。例えば、そのような修飾は、ポリペプチドの保管寿命を増強し、ポリペプチドの循環半減期を増強し、および／またはポリペプチドのタンパク質分解性分解を低減する。そのような安定化修飾としては、これらに限定されないが、融合タンパク質（例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、またはＡＬＫ４ポリペプチドドメイン、およびスタビライザードメインを含む融合タンパク質を含む）、グリコシル化部位の修飾（例えば、本開示のポリペプチドに対するグリコシル化部位の付加を含む）、および糖鎖の修飾（例えば、本開示のポリペプチドからの糖鎖の除去を含む）が挙げられる。本明細書で使用される場合、用語「スタビライザードメイン」は、融合タンパク質の場合の融合ドメイン（例えば、免疫グロブリンＦｃドメイン）を指すだけでなく、糖鎖、またはポリエチレングリコールなどの非タンパク質性部分などの非タンパク質性修飾も含む。ある特定の好ましい実施形態では、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、および／またはＡＬＫ４ポリペプチドは、ポリペプチドを安定化する異種性ドメイン（「スタビライザー」ドメイン）と、好ましくはｉｎ ｖｉｖｏでポリペプチドの安定性を増加させる異種性ドメインと融合されている。免疫グロブリンの定常ドメイン（例えば、Ｆｃドメイン）との融合は、広範なタンパク質に、望ましい薬物動態学的特性を付与することが公知である。同様に、ヒト血清アルブミンとの融合は、望ましい安定化特性を付与することができる。

【0175】

一部の実施形態では、本開示のＡＬＫ４、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、Ｆｃ融合タンパク質である。ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（Ｇ１Ｆｃ）に使用することができる天然アミノ酸配列の例は、下記に示されている（配列番号２２）。点線の下線は、ヒンジ領域を示し、実線の下線は、天然に存在するバリアントを有する位置を示す。部分的には、本開示は、配列番号２２と、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチドを提供する。Ｇ１Ｆｃにおける天然に存在するバリアントとしては、配列番号２２で使用されている付番方式によるＥ１３４ＤおよびＭ１３６Ｌが挙げられるであろう（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８５７を参照）。

【化22】

【0176】

必要に応じて、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、Ａｓｐ－２６５、リシン３２２、およびＡｓｎ－４３４などの残基に１つまたは複数の突然変異を有する。ある特定の場合では、こうした突然変異の１つまたは複数（例えば、Ａｓｐ－２６５突然変異）を有する突然変異体ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比べて、Ｆｃγ受容体に結合する能力の低減を示す。他の場合では、こうした突然変異の１つまたは複数（例えば、Ａｓｎ－４３４突然変異）を有する突然変異体Ｆｃドメインは、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比べて、ＭＨＣクラスＩ関連Ｆｃ受容体（ＦｃＲＮ）に結合する能力の増加を示す。

【0177】

ヒトＩｇＧ２のＦｃ部分（Ｇ２Ｆｃ）に使用することができる天然アミノ酸配列の例は、下記に示されている（配列番号２３）。点線の下線はヒンジ領域を示し、二重下線は、配列にデータベース矛盾がある位置を示す（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０１８５９による）。部分的には、本開示は、配列番号２３と、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチドを提供する。

【化23】

【0178】

ヒトＩｇＧ３のＦｃ部分（Ｇ３Ｆｃ）に使用することができるアミノ酸配列の２つの例は、下記に示されている。Ｇ３Ｆｃのヒンジ領域は、他のＦｃ鎖では最大で４倍も長い場合があり、類似の１７個残基セグメントによって先行される３つの同一の１５個残基セグメントを含む。下記（配列番号２４）に示されている第１のＧ３Ｆｃ配列は、単一の１５個残基セグメントからなる短鎖ヒンジ領域を含むが、第２のＧ３Ｆｃ配列（配列番号２５）は、全長ヒンジ領域を含む。各々の場合で、点線の下線は、ヒンジ領域を示し、実線の下線は、ＵｎｉＰｒｏｔＰ０１８５９による天然に存在するバリアントを有する位置を示す。部分的には、本開示は、配列番号２４または２５と、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチドを提供する。

【化24】

【0179】

Ｇ３Ｆｃにおける天然に存在するバリアント（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８６０を参照）としては、配列番号２４で使用されている付番方式に変換すると、Ｅ６８Ｑ、Ｐ７６Ｌ、Ｅ７９Ｑ、Ｙ８１Ｆ、Ｄ９７Ｎ、Ｎ１００Ｄ、Ｔ１２４Ａ、Ｓ１６９Ｎ、Ｓ１６９ｄｅｌ、Ｆ２２１Ｙが挙げられる。本開示は、こうしたバリエーションの１つまたは複数を含むＧ３Ｆｃドメインを含む融合タンパク質を提供する。加えて、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ３遺伝子（ＩＧＨＧ３）は、異なるヒンジ長により特徴付けられる構造的遺伝子多型を示す［Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８５９を参照］。具体的には、バリアントＷＩＳは、Ｖ領域のほとんどおよびＣＨ１領域のすべてを欠如している。それは、通常はヒンジ領域に存在する１１位に加えて７位に追加の鎖間ジスルフィド結合を有する。バリアントＺＵＣは、Ｖ領域のほとんど、ＣＨ１領域のすべて、およびヒンジの一部を欠如する。バリアントＯＭＭは、対立遺伝子形態または別のガンマ鎖サブクラスである場合がある。本開示は、こうしたバリアントの１つまたは複数を含むＧ３Ｆｃドメインを含む追加の融合タンパク質を提供する。

【0180】

ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分（Ｇ４Ｆｃ）に使用することができる天然アミノ酸配列の例は、下記に示されている（配列番号２６）。点線の下線は、ヒンジ領域を示す。部分的には、本開示は、配列番号２６と、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチドを提供する。

【化25】

【0181】

Ｆｃドメインの様々な操作された突然変異は、本明細書ではＧ１Ｆｃ配列（配列番号２２）を基準にして提示されており、Ｇ２Ｆｃ、Ｇ３Ｆｃ、およびＧ４Ｆｃにおける類似の突然変異は、図１８に示されているＧ１Ｆｃとのアラインメントから導き出すことができる。ヒンジの長さが異なるため、アイソタイプアラインメント（図１８）に基づく類似のＦｃ位置は、配列番号２２、２３、２４、２５および２６では、異なるアミノ酸番号を有する。また、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３領域からなる免疫グロブリン配列（例えば、配列番号２２、２３、２４、２５、および２６）における所与のアミノ酸位置は、付番が、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースにあるようなＩｇＧ１重鎖定常ドメイン全体（Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３領域からなる）を包含する場合の同じ位置とは異なる番号により特定されることになることを理解することができる。例えば、ヒトＧ１Ｆｃ配列（配列番号２２）と、ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８５７）と、ヒトＩｇＧ１重鎖の、選択されたＣ_Ｈ３位置間の対応は、以下の通りである。

【表1】

【0182】

ある特定の態様では、本明細書で開示されたポリペプチドは、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと共有結合でまたは非共有結合で会合している少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドを含むタンパク質複合体を形成していてもよい。好ましくは、本明細書で開示されたポリペプチドは、ヘテロ二量体複合体を形成するが、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体、およびさらなるオリゴマー構造などを含むがそれらに限定されない、より高次のヘテロ多量体複合体（ヘテロ多量体）も含まれる（例えば、図２１～２３を参照）。一部の実施形態では、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、少なくとも１つの多量体化ドメインを含む。本明細書で開示されているように、用語「多量体化ドメイン」は、少なくとも第１のポリペプチドと少なくとも第２のポリペプチドとの間の共有結合相互作用または非共有結合相互作用を促進するアミノ酸またはアミノ酸の配列を指す。本明細書で開示されたポリペプチドは、多量体化ドメインに共有結合でまたは非共有結合で接合されていてもよい。好ましくは、多量体化ドメインは、第１のポリペプチド（例えば、ＡＬＫ４ポリペプチド）と第２のポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）との間の相互作用を促進して、ヘテロ多量体形成（例えば、ヘテロ二量体形成）を促進し、必要に応じて、ホモ多量体形成（例えば、ホモ二量体形成）を妨害またはそうでなければ不利にして、それにより所望のヘテロ多量体の収率を増加させる（例えば、図２２を参照）。

【0183】

当技術分野で公知の多数の方法を使用して、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を生成することができる。例えば、天然に存在しないジスルフィド結合は、遊離チオールが第２のポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）の別の遊離チオール含有残基と相互作用して、第１および第２のポリペプチド間でジスルフィド結合が形成されるように、第１のポリペプチド（例えば、ＡＬＫ４ポリペプチド）の天然に存在するアミノ酸を、システインなどの遊離チオール含有残基により置き換えることにより構築することができる。ヘテロ多量体形成を促進する相互作用の追加の例としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：Kjaergaardらの国際公開第２００７１４７９０１号に記載のものなどのイオン性相互作用；Kannanらの米国特許第８，５９２，５６２号に記載のものなどの静電気指向性効果；Christensenらの米国特許出願公開第２０１２０３０２７
３７号に記載のものなどのコイルドコイル相互作用；PackおよびPlueckthun、（１９９２年）Biochemistry ３１巻：１５７９～１５８４年に記載のものなどのロイシンジッパー；Packら（１９９３年）Bio/Technology １１巻：１２７１～１２７７頁に記載のものなどのヘリックス－ターン－ヘリックスモチーフ。種々のセグメントの連結は、例えば、化学的架橋、ペプチドリンカー、ジスルフィド架橋などによる共有結合、またはアビジン－ビオチンもしくはロイシンジッパー技術などによる親和性相互作用により得ることができる。

【0184】

ある特定の態様では、多量体化ドメインは、相互作用対の１つの成分を含んでいてもよい。一部の実施形態では、本明細書で開示されたポリペプチドは、第２のポリペプチドに共有結合でまたは非共有結合で会合している第１のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドは、ＡＬＫ４ポリペプチドのアミノ酸配列および相互作用対の第１のメンバーのアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアミノ酸配列および相互作用対の第２のメンバーのアミノ酸配列を含むタンパク質複合体を形成してもよい。相互作用対は、相互作用して、複合体、特にヘテロ二量体複合体を形成する任意の２つのポリペプチド配列であってもよいが、有効な実施形態は、ホモ二量体複合体を形成することができる相互作用対も使用することができる。相互作用対の一方のメンバーは、例えば、配列番号２、３、５、６、１５、および１９のいずれか１つの配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、またはからなるポリペプチド配列を含む、本明細書に記載のようなＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと融合されていてもよい。相互作用対は、血清半減期の増加などの特性／活性の向上を付与するか、または別の部分が特性／活性の向上を提供するように付着されているアダプターとして作用するように選択することができる。例えば、ポリエチレングリコール部分を、相互作用対の一方または両方の成分に付着させて、血清半減期の向上などの特性／活性の向上を提供してもよい。

【0185】

相互作用対の第１および第２のメンバーは、非対称対であってもよく、それは、対のメンバーが、自己会合性ではなく、優先的に互いに会合することを意味する。したがって、非対称相互作用対の第１および第２のメンバーは、会合して、ヘテロ二量体複合体を形成することができる（例えば、図２２を参照）。あるいは、相互作用対は、非誘導性であってもよい。これは、対のメンバーが、実質的な優先性を示さずに互いに会合するかまたは自己会合してもよく、したがって、同じまたは異なるアミノ酸配列を有してしてもよいことを意味する。したがって、非誘導性相互作用対の第１および第２のメンバーは、会合して、ホモ二量体複合体またはヘテロ二量体複合体を形成することができる。必要に応じて、相互作用対（例えば、非対称対または非誘導性相互作用対）の第１のメンバーは、相互作用対の第２のメンバーと共有結合で会合する。必要に応じて、相互作用対（例えば、非対称対または非誘導性相互作用対）の第１のメンバーは、相互作用対の第２のメンバーと非共有結合で会合する。

【0186】

具体的な例として、本開示は、ヘテロ多量体形成を促進するように修飾されている、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４に由来するＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３ドメインなどの、免疫グロブリンの定常ドメインを含むポリペプチドに融合されたＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢを含む融合タンパク質を提供する。非対称性の免疫グロブリンに基づくタンパク質を単一の細胞株から大規模生成する際に生じる問題は、「鎖会合問題」として公知である。二重特異性抗体の産生時に顕著に直面するような鎖会合問題は、異なる重鎖および／または軽鎖を単一細胞株で産生する場合に必然的に生じる、複数の組合せの中から所望の多重鎖タンパク質を効率的に生成するという課題に関する［Kleinら（２０１２年）mAbs ４巻：６５３～６６３頁］。この問題は、２つの異なる重
鎖および２つの異なる軽鎖が同じ細胞中で産生される場合に最も深刻であり、その場合、合計１６通りの考え得る鎖の組合せがある（もっとも、これらの一部は同一である）が、典型的には１つのみが所望である。にも関わらず、同じ原理は、２つの異なる（非対称性）重鎖のみが組み込まれている所望の多重鎖融合タンパク質の収率が、わずかしかないことを説明する。

【0187】

単一細胞株にてＦｃ含有融合ポリペプチド鎖の望ましい対合を増加させて、許容される収率で好ましい非対称性融合タンパク質を生成するための種々の方法が、当技術分野で公知である［Kleinら（２０１２年）mAbs ４巻：６５３～６６３頁；およびSpiessら（２
０１５年）Molecular Immunology ６７巻（２Ａ号）：９５～１０６頁］。Ｆｃ含有鎖
の所望の対合を得るための方法としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：電荷に基づく対合（静電気指向性）、「ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ」立体対合、ＳＥＥＤｂｏｄｙ対合、およびロイシンジッパーに基づく対合［Ridgwayら（１９
９６年）Protein Eng ９巻：６１７～６２１頁；Merchantら（１９９８年）Nat Biotech １６巻：６７７～６８１頁；Davisら（２０１０年）Protein Eng Des Sel ２３
巻：１９５～２０２頁；Gunasekaranら（２０１０年）；２８５巻：１９６３７～１９６
４６頁；Wranikら（２０１２年）J Biol Chem ２８７巻：４３３３１～４３３３９頁
；米国特許第５９３２４４８号；国際公開第１９９３／０１１１６２号；国際公開第２００９／０８９００４号、および国際公開第２０１１／０３４６０５号］。本明細書に記載されているように、こうした方法を使用して、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ多量体複合体を生成することができる。例えば、図２３を参照されたい。

【0188】

ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体、およびそのようなヘテロ多量体を製作するための方法は、以前に開示されている。例えば、国際公開第２０１６／１６４４９７号を参照されたい。この文献の教示は全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0189】

融合タンパク質（例えば、免疫グロブリンＦｃ融合タンパク質）の様々なエレメントを、所望の機能性と一致する任意の様式で配置することができることが理解される。例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドドメイン、ＡＬＫ４ポリペプチドドメイン、またはＴＧＦβＲＩＩポリペプチドドメインを、異種性ドメインのＣ末端側に配置してもよく、またはその代わりに異種性ドメインを、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドドメイン、ＡＬＫ４ポリペプチドドメイン、またはＴＧＦβＲＩＩポリペプチドドメインのＣ末端側に配置してもよい。ＡｃｔＲＩＩポリペプチドドメイン、ＡＬＫ４ポリペプチドドメイン、またはＴＧＦβＲＩＩポリペプチドドメイン、および異種性のドメインは、融合タンパク質において隣接している必要はなく、追加のドメインまたはアミノ酸配列が、いずれかのドメインのＣ末端側もしくはＮ末端側に含まれていてもよく、またはドメイン間に含まれていてもよい。

【0190】

例えば、ＡｃｔＲＩＩ（またはＡＬＫ４またはＴＧＦβＲＩＩ）受容体融合タンパク質は、式Ａ－Ｂ－Ｃで示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。Ｂ部分は、ＡｃｔＲＩＩ（またはＡＬＫ４またはＴＧＦβＲＩＩ）ポリペプチドドメインに対応する。ＡおよびＣ部分は、独立して、ゼロ、１つ、または１つよりも多くのアミノ酸であってもよく、ＡおよびＣ部分は、存在する場合、両方とも、Ｂに対して異種性である。Ａおよび／またはＣ部分は、リンカー配列を介してＢ部分に付着されていてもよい。リンカーは、グリシンが多く含まれていてもよく（例えば、２～１０、２～５、２～４、２～３個のグリシン残基）またはグリシンおよびプロリン残基が多く含まれていてもよく、例えば、トレオニン／セリンおよびグリシンの単一配列、またはトレオニン／セリンおよび／もしくはグリシンの反復配列、例えば、ＧＧＧ（配列番号２７）、ＧＧＧＧ（配列番号２８）、ＴＧＧＧＧ（配列番号２９）、ＳＧＧＧＧ（配列番号３０）、ＴＧＧＧ（配列番号３１）、ＳＧＧＧ（配列番号３２）、またはＧＧＧＧＳ（配列番号３３）シングレットもしくはリピートを含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩ（またはＡＬＫ４またはＴＧＦβＲＩＩ）融合タンパク質は、式Ａ－Ｂ－Ｃで示されるアミノ酸配列を含み、式中、Ａは、リーダー（シグナル）配列であり、Ｂは、ＡｃｔＲＩＩ（またはＡＬＫ４またはＴＧＦβＲＩＩ）ポリペプチドドメインからなり、Ｃは、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期、取込み／投与、組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成、および／または精製の１つまたは複数を増強するポリペプチド部分である。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩ（またはＡＬＫ４またはＴＧＦβＲＩＩ）融合タンパク質は、式Ａ－Ｂ－Ｃで示されるアミノ酸配列を含み、式中、Ａは、ＴＰＡリーダー配列であり、Ｂは、ＡｃｔＲＩＩ（またはＡＬＫ４またはＴＧＦβＲＩＩ）受容体ポリペプチドドメインからなり、Ｃは、免疫グロブリンＦｃドメインである。好ましい融合タンパク質は、配列番号５０、５４、５７、５８、６０、６３、６４、６６、７０、７１、７３、７４、７６、７７、７８、７９、８０、１２３、１３１、１３２、１３９、１４１、１４３、１４５、１４８、および１５０のいずれか１つに示されているアミノ酸配列を含む。

【0191】

あるいは、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、必要に応じて、１つまたは複数のＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと共有結合でまたは非共有結合で会合していてもよい１つまたは複数の単鎖リガンドトラップならびに追加のＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ単鎖リガンドトラップを含んでいてもよい［米国特許出願公開第２０１１／０２３６３０９号および第２００９／００１０８７９号］。本明細書に記載されているように、単鎖リガンドトラップは、多価性になるために、コイルドコイルＦｃドメインなどのいかなる多量体化ドメインとの融合も必要としない。一般に、本開示の単鎖リガンドトラップは、少なくとも１つのＡＬＫ４ポリペプチドドメインおよび１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインを含む。本明細書では一般に結合性ドメイン（ＢＤ）と呼ばれるＡＬＫ４およびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインは、必要に応じて、リンカー領域により接合されていてもよい。ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ単鎖リガンドトラップは、以前に記載されている。例えば、国際公開第２０１６／１６４４９７号を参照されたい。この文献の教示は全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0192】

ある特定の好ましい実施形態では、本明細書に記載の方法に従って使用されるＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、単離された複合体である。本明細書で使用される場合、単離されたタンパク質（もしくはタンパク質複合体）またはポリペプチド（もしくはポリペプチド複合体）は、その自然環境の成分から分離されているものである。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドまたはヘテロ多量体は、例えば、電気泳動法（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動法）またはクロマトグラフィー法（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）により決定して、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％よりも高い純度に精製されている。抗体純度を評価するための方法は、当技術分野で周知である［Flatmanら、（２００７年）J. Chromatogr. B ８４８巻：７９～８７頁］。

【0193】

ある特定の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体は、当技術分野で公知の様々な技法により産生することができる。例えば、本開示のポリペプチドは、以下に記載されているものなどの標準的タンパク質化学技法を使用して合成することができる：Bodansky, M.、Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag,
Berlin（１９９３年）およびGrant G. A.（編）Synthetic Peptides: A User's Guide、W. H. Freeman and Company、New York（１９９２年）。加えて、自動ペプ
チド合成機が、市販されている（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ Ｍｏｄｅｌ ３９６；Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ ９６００）。あるいは、それらの断片またはバリアントを含む、本開示のポリペプチドおよび複合体は、当技術分野で周知のような種々の発現系［Ｅ．ｃｏｌｉ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、バキュロウイルス］を使用して、組換え的に産生することができる。さらなる実施形態では、本開示の修飾または未修飾ポリペプチドは、組換え的に産生された全長ＡＬＫ４、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、例えばプロテアーゼ、例えばトリプシン、サーモリシン、キモトリプシン、ペプシン、または対形成塩基性アミノ酸変換酵素（ＰＡＣＥ、paired basic amino acid converting enzyme）を使用して消化することにより産生することができる。コンピュータ分析を使用して（市販のソフトウェア、例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、Ｏｍｅｇａ、ＰＣＧｅｎｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ， Ｉｎｃ．を使用して）、タンパク質分解切断部位を特定することができる。

【0194】

３． ＡｃｔＲＩＩ、ＡＬＫ４、およびＴＧＦβＲＩＩポリペプチドをコードする核酸
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書で開示されたＡｃｔＲＩＩ、ＡＬＫ４、および／またはＴＧＦβＲＩＩポリペプチド（それらの断片、機能的バリアント、および融合タンパク質を含む）をコードする単離されたおよび／または組換え核酸を提供する。例えば、配列番号１６は、天然に存在するヒトＡＬＫ４前駆体ポリペプチドをコードし、配列番号１７は、ＡＬＫ４のプロセシングされた細胞外ドメインをコードする。本主題の核酸は、一本鎖であってもよく、または二本鎖であってもよい。そのような核酸は、ＤＮＡ分子であってもよく、またはＲＮＡ分子であってもよい。こうした核酸を、例えば、本明細書に記載のＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を製作するための方法において使用することができる。

【0195】

本明細書で使用される場合、単離された核酸は、その自然環境の成分から分離されている核酸分子を指す。単離された核酸は、その核酸分子を通常含む細胞に含まれている核酸分子を含むが、核酸分子は、染色体外に存在するか、またはその天然染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。

【0196】

ある特定の実施形態では、本開示のＡＬＫ４、ＡｃｔＲＩＩ、またはＴＧＦβＲＩＩポリペプチドをコードする核酸は、配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、２０、２１、５５、６１、６７、７２、７５、１２４、１２５、１２６、１２７、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、および１４９ならびにそれらのバリアントのいずれか１つを含むことが理解される。バリアントヌクレオチド配列としては、対立遺伝子バリアントを含む、１つまたは複数のヌクレオチド置換、付加、または欠失により異なる配列が挙げられ、したがって、配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、２０、２１、５５、６１、６７、７２、７５、１２４、１２５、１２６、１２７、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、および１４９のいずれか１つで指定されているヌクレオチド配列と異なるコード配列が挙げられることになる。

【0197】

ある特定の実施形態では、本開示のＡＬＫ４、ＡｃｔＲＩＩ、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、２０、２１、５５、６１、６７、７２、７５、１２４、１２５、１２６、１２７、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、および１４９と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる単離されたまたは組換え核酸配列によりコードされる。当業者であれば、配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、２０、２１、５５、６１、６７、７２、７５、１２４、１２５、１２６、１２７、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、および１４９と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の配列に相補的な配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる核酸配列も、本開示の範囲内であることを理解するであろう。さらなる実施形態では、本開示の核酸配列は、単離されていてもよく、組換えであってもよく、および／または異種性ヌクレオチド配列と融合されていてもよく、またはＤＮＡライブラリーに存在していてもよい。

【0198】

また、他の実施形態では、本開示の核酸は、配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、２０、２１、５５、６１、６７、７２、７５、１２４、１２５、１２６、１２７、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、および１４９に指定されているヌクレオチド配列またはそれらの断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。当業者であれば、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件は様々であり得ることを直ちに理解するであろう。例えば、約４５℃にて６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）を用いてハイブリダイゼーションを実施し、その後５０℃にて２．０×ＳＳＣを用いて洗浄することができる。例えば、洗浄ステップの塩濃度は、５０℃での約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから５０℃での約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまで、選択することができる。加えて、洗浄ステップの温度は、低ストリンジェンシー条件の室温、約２２℃から、高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで増加させることができる。温度および塩は両方とも様々であってもよく、または温度もしくは塩濃度を一定に保持して、他の変数を変化させてもよい。一実施形態では、本開示は、低ストリンジェンシー条件下の室温にて６×ＳＳＣでハイブリダイズし、その後、室温にて２×ＳＳＣで洗浄される核酸を提供する。

【0199】

配列番号７、８、１２、１３、１６、１７、２０、２１、５５、６１、６７、７２、７５、１２４、１２５、１２６、１２７、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、および１４９に示されている核酸と異なり、遺伝子コードに縮重を示す単離された核酸も、本開示の範囲内である。例えば、多くのアミノ酸は、１つよりも多くのトリプレットで指定されている。同じアミノ酸を指定するコドン、つまりシノニム（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣは、ヒスチジンのシノニムである）は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレント」突然変異をもたらすことができる。しかしながら、哺乳動物細胞間には、本主題のタンパク質のアミノ酸配列の変化に結び付くＤＮＡ配列遺伝子多型が存在することになることが予想される。当業者であれば、天然の対立遺伝子バリエーションが存在するため、所与の種の個体間には、特定のタンパク質をコードする核酸の１つまたは複数のヌクレオチド（ヌクレオチドの約３～５％以内）におけるこうしたバリエーションが存在する場合があることを認識するであろう。ありとあらゆるそのようなヌクレオチドバリエーションおよび得られるアミノ酸遺伝子多型は、本開示の範囲内である。

【0200】

ある特定の実施形態では、本開示の組換え核酸は、発現構築物の１つまたは複数の調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結していてもよい。調節ヌクレオチド配列は、一般に、発現に使用される宿主細胞に適切なものであろう。様々な宿主細胞のための、多数のタイプの適切な発現ベクターおよび好適な調節配列が、当技術分野で公知である。前記１つまたは複数の調節ヌクレオチド配列としては、典型的には、これらに限定されないが、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、ならびにエンハンサーまたは活性化因子配列を挙げることができる。当技術分野で公知の構成的または誘導可能なプロモーターが、本開示により企図される。プロモーターは、天然に存在するプロモーターまたは１つよりも多くのプロモーターのエレメントの組合せであるハイブリッドプロモーターのいずれであってもよい。発現構築物は、プラスミドなどのエピソームで細胞に存在していてもよく、または発現構築物は、染色体に挿入されていてもよい。一部の実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするように、選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択可能なマーカー遺伝子は、当技術分野において周知であり、使用される宿主細胞に応じて様々であろう。

【0201】

本開示のある特定の態様では、本主題の核酸は、ＡＬＫ４、ＡｃｔＲＩＩ、および／またはＴＧＦβＲＩＩポリペプチドをコードし、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結したヌクレオチド配列を含む発現ベクターで提供される。調節配列は、当技術分野で認識されており、ＡＬＫ４、ＡｃｔＲＩＩ、および／またはＴＧＦβＲＩＩポリペプチドの発現を指図するように選択される。したがって、用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメントを含む。例示的な調節配列は、Goeddel；Gene Expression Technology: Methods in Enzymology、Academic Press、San Diego、CA（１９９０年）に記載されている。例えば、それに作用可能に連結されているとＤＮＡ配列の発現を制御する幅広く様々な発現制御配列のいずれかを、こうしたベクターで使用して、ＡＬＫ４、ＡｃｔＲＩＩＢ、および／またはＴＧＦβＲＩＩポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現させることができる。そのような有用な発現制御配列としては、例えば、以下のものが挙げられる：ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルス最初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣまたはＴＲＣ系、その発現がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼにより指図されるＴ７プロモーター、ファージラムダの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３－ホスホグリセレートキナーゼまたは他の解糖酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼ、例えばＰｈｏ５のプロモーター、酵母α－接合因子のプロモーター、バキュロウイルス系の多面体プロモーター、および原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが公知である他の配列、およびそれらの種々の組合せ。発現ベクターの設計は、形質転換しようとする宿主細胞の選択および／または発現させようとするタンパク質のタイプなどの要因に依存する場合があることが理解されるべきである。さらに、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、および抗生物質マーカーなどの、ベクターによりコードされている任意の他のタンパク質の発現も、考慮されるべきである。

【0202】

本開示の組換え核酸は、クローニングした遺伝子またはその部分を、原核細胞、真核細胞（酵母、トリ、昆虫、または哺乳動物）のいずれかまたは両方での発現に好適なベクターにライゲーションすることにより産生することができる。組換えＴＧＦβスーパーファミリーＩ型および／またはＩＩ型受容体ポリペプチドを産生するための発現媒体としては、プラスミドおよび他のベクターが挙げられる。例えば、好適なベクターとしては、以下のタイプのプラスミドが挙げられる：Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞での発現のためのｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミド、およびｐＵＣ由来プラスミド。

【0203】

一部の哺乳動物発現ベクターは、細菌におけるベクターの増幅を容易にするための原核生物配列、および真核細胞で発現される１つまたは複数の真核生物転写ユニットを両方とも含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ－ｎｅｏ、およびｐＨｙｇ由来ベクターは、真核細胞のトランスフェクションに好適な哺乳動物発現ベクターの例である。こうしたベクターの一部は、原核細胞および真核細胞の両方での複製および薬物耐性選択を容易にするために、ｐＢＲ３２２などの細菌プラスミドに由来する配列で修飾されている。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ－１）またはエプスタインバーウイルスなどのウイルスの誘導体（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来、およびｐ２０５）を、真核細胞でのタンパク質の一過性発現に使用することができる。他のウイルス（レトロウイルスを含む）発現系の例は、下記の遺伝子治療送達系の説明に見出すことができる。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換に使用される種々の方法は、当技術分野で周知である。原核細胞および真核細胞の両方に好適な他の発現系ならびに一般的な組換え手順については、［Molecular Cloning A Laboratory Manual、第３版、Sambrook編、Fritsch and Maniatis Cold Spring Harbor Laboratory Press、２００１年］。一部の場合では、バキュロウイルス発現系の使用により組換えポリペプチドを発現することが望ましい場合がある。そのようなバキュロウイルス発現系の例としては、ｐＶＬ由来ベクター（ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、およびｐＶＬ９４１などの）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（ｐＡｃＵＷ１など）、およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクター（β－ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩなど）が挙げられる。

【0204】

好ましい実施形態では、Ｐｃｍｖ－Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）、およびｐＣＩ－ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃ．）などのベクターが、ＣＨＯ細胞において本主題のＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩポリペプチドを産生するために設計されるであろう。明白になることだが、本主題の遺伝子構築物を使用して、培養で増幅させた細胞において本主題のＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩポリペプチドの発現を引き起こし、例えば、精製のための融合タンパク質またはバリアントタンパク質を含むタンパク質を生成することができる。

【0205】

また、本開示は、本主題のＡＬＫ４、ＡｃｔＲＩＩＢ、および／またはＴＧＦβＲＩＩポリペプチドの１つまたは複数のコード配列を含む組換え遺伝子をトランスフェクトした宿主細胞に関する。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であってもよい。例えば、ＡＬＫ４、ＡｃｔＲＩＩＢ、および／またはＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用して）、酵母、または哺乳動物細胞［例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株］で発現させることができる。他の好適な宿主細胞が、当業者に公知である。

【0206】

したがって、本開示は、本主題のＡＬＫ４、ＡｃｔＲＩＩＢ、および／またはＴＧＦβＲＩＩポリペプチドを産生するための方法にさらに関する。例えば、ＡＬＫ４、ＡｃｔＲＩＩＢ、および／またはＴＧＦβＲＩＩポリペプチドをコードする発現ベクターをトランスフェクトした宿主細胞を、ＡＬＫ４、ＡｃｔＲＩＩＢ、および／またはＴＧＦβＲＩＩポリペプチドの発現が生じることを可能にする適切な条件下で培養することができる。ポリペプチドを分泌させ、細胞とポリペプチドを含む培地との混合物から単離することができる。あるいは、ＡＬＫ４、ＡｃｔＲＩＩＢ、および／またはＴＧＦβＲＩＩポリペプチドを、回収して溶解した細胞から得られる細胞質または膜画分から単離してもよい。細胞培養は、宿主細胞、培地、および他の副産物を含む。細胞培養に好適な培地は、当技術分野で周知である。本主題のポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、ＡＬＫ４、ＡｃｔＲＩＩＢ、および／またはＴＧＦβＲＩＩポリペプチドの特定のエピトープに特異的な抗体を用いた免疫親和性精製、ならびにＡＬＫ４、ＡｃｔＲＩＩＢ、および／またはＴＧＦβＲＩＩポリペプチドと融合されているドメインに結合する作用剤を用いた親和性精製（例えば、プロテインＡカラムを使用して、ＡＬＫ４－Ｆｃ、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ、および／またはＴＧＦβＲＩＩ－Ｆｃ融合タンパク質を精製することができる）を含む、タンパク質を精製するための当技術分野で公知の技法を使用して、細胞培養培地、宿主細胞、または両方から単離することができる。一部の実施形態では、ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、その精製を容易にするドメインを含む融合タンパク質である。

【0207】

一部の実施形態では、精製は、例えば、以下のものの３つまたはそれよりも多くを任意の順番で含む一連のカラムクロマトグラフィーステップにより達成される：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィー。精製は、最後にウイルス濾過および緩衝液交換を行ってもよい。ＡＬＫ４－Ｆｃ、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ、および／またはＴＧＦβＲＩＩ－Ｆｃ融合タンパク質、ならびにそれらのヘテロマー複合体は、サイズ排除クロマトグラフィーで決定して＞９０％、＞９５％、＞９６％、＞９８％、または＞９９％の、およびＳＤＳ ＰＡＧＥで決定して＞９０％、＞９５％、＞９６％、＞９８％、または＞９９％の純度に精製することができる。精製の目標レベルは、哺乳動物系、特に非ヒト霊長類、げっ歯動物（マウス）、およびヒトにおいて望ましい結果を達成するのに十分なレベルであるべきである。

【0208】

別の実施形態では、組換えＡＬＫ４、ＡｃｔＲＩＩＢ、および／またはＴＧＦβＲＩＩポリペプチドの所望部分のＮ末端のポリ－（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位配列などの精製リーダー配列をコードする融合遺伝子は、発現された融合タンパク質が、Ｎｉ^２＋金属レジンを使用する親和性クロマトグラフィーにより精製されることを可能にすることができる。その後、エンテロキナーゼで処理することにより精製リーダー配列を除去して、精製されたＡＬＫ４、ＡｃｔＲＩＩＢ、および／またはＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、ならびにそれらのヘテロマー複合体を提供することができる［Hochuliら（１９８７年
）J. Chromatography ４１１巻：１７７頁；およびJanknechtら（１９９１年）PNAS USA ８８巻：８９７２頁］。

【0209】

融合遺伝子を製作するための技法は、周知である。本質的に、異なるポリペプチド配列をコードする種々のＤＮＡ断片の接合は、平滑末端化または突出末端化された末端をライゲーションに使用し、制限酵素消化して適切な末端を準備し、必要な場合は付着末端を平滑化し、アルカリホスファターゼ処理して、望ましくない接合を回避し、酵素ライゲーションを行う、従来技法に従って実施される。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含む従来技法により合成することができる。あるいは、２つの連続した遺伝子断片間の相補的突出を生じさせ、その後それをアニーリングしてキメラ遺伝子配列を生成することができるアンカープライマーを使用して、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を実施してもよい。例えば、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubelら編、John Wiley & Sons：１９９２年を参照されたい。

【0210】

４．抗体アンタゴニスト
ある特定の態様では、本開示は、抗体または抗体の組合せであるＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（阻害剤）に関する。ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］、または１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）に結合することができる。特に、本開示は、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体またはＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体の組合せを、単独で、または１つもしくは複数の追加の支持療法および／もしくは活性剤と組み合わせて使用して、それを必要とする対象にて所望の効果（例えば、それを必要とする対象の免疫応答を増加させること、およびがんまたは病原体を処置すること）を達成するための方法を提供する。ある特定の好ましい実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体は、ＴＧＦβＲＩＩアンタゴニストと組み合わせて使用してもよい。

【0211】

ある特定の態様では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＧＤＦ１１を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＧＤＦ１１に結合する。本明細書で使用される場合、ＧＤＦ１１抗体（抗ＧＤＦ１１抗体）は、一般に、ＧＤＦ１１を標的とする上で診断剤および／または治療剤として抗体が有用となるのに十分な親和性でＧＤＦ１１に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＧＤＦ１１抗体が無関係の非ＧＤＦ１１タンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質間相互作用もしくは結合親和性アッセイにより測定して、ＧＤＦ１１に対する抗体の結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＧＤＦ１１抗体は、異なる種に由来するＧＤＦ１１で保存されているＧＤＦ１１のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＧＤＦ１１抗体は、ヒトＧＤＦ１１に結合する。他の好ましい実施形態では、抗ＧＤＦ１１抗体は、同種Ｉ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）に対するＧＤＦ１１の結合を阻害し、したがって、こうした受容体を介したＧＤＦ１１媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。ＧＤＦ１１は、ＧＤＦ８と高い配列相同性を有するため、ＧＤＦ１１に結合する抗体は、一部の場合では、ＧＤＦ８にも結合および／または阻害する場合があることが留意されるべきである。一部の実施形態では、抗ＧＤＦ１１抗体は、１つまたは複数の追加のリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］に結合する、ならびに／または１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ４）に結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せ、ならびにそれらの使用に関し、抗体の組合せは、抗ＧＤＦ１１抗体、ならびに、例えば、異なるリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］に結合する、ならびに／または１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ４）に結合する１つまたは複数の追加の抗体を含む。

【0212】

ある特定の態様では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＧＤＦ８を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＧＤＦ８に結合する。本明細書で使用される場合、ＧＤＦ８抗体（抗ＧＤＦ８抗体）は、一般に、ＧＤＦ８を標的とする上で診断剤および／または治療剤として抗体が有用となるのに十分な親和性でＧＤＦ８に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＧＤＦ８抗体が無関係の非ＧＤＦ８タンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質間相互作用もしくは結合親和性アッセイにより測定して、ＧＤＦ８に対する抗体の結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＧＤＦ８抗体は、異なる種に由来するＧＤＦ８で保存されているＧＤＦ８のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＧＤＦ８抗体は、ヒトＧＤＦ８に結合する。他の好ましい実施形態では、抗ＧＤＦ８抗体は、同種Ｉ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）に対するＧＤＦ８の結合を阻害し、したがって、こうした受容体を介したＧＤＦ８媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。ＧＤＦ８は、ＧＤＦ１１と高い配列相同性を有するため、ＧＤＦ８に結合する抗体は、一部の場合では、ＧＤＦ１１にも結合および／または阻害する場合があることが留意されるべきである。一部の実施形態では、抗ＧＤＦ８抗体は、１つまたは複数の追加のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］に結合する、ならびに／または１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ４）に結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せ、ならびにそれらの使用に関し、抗体の組合せは、抗ＧＤＦ８抗体、ならびに、例えば、異なるリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］に結合する、ならびに／または１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ４）に結合する１つまたは複数の追加の抗体を含む。

【0213】

ある特定の態様では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともアクチビンに結合する。本明細書で使用される場合、アクチビン抗体（抗アクチビン抗体）は、一般に、アクチビンを標的とする上で診断剤および／または治療剤として抗体が有用となるのに十分な親和性でアクチビンに結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗アクチビン抗体が無関係の非アクチビンタンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質間相互作用もしくは結合親和性アッセイにより測定して、アクチビンに対する抗体の結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗アクチビン抗体は、異なる種に由来するアクチビンで保存されているアクチビンのエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗アクチビン抗体は、ヒトアクチビンに結合する。他の好ましい実施形態では、抗アクチビン抗体は、同種Ｉ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）に対するアクチビンの結合を阻害し、したがって、こうした受容体を介したアクチビン媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。アクチビンは、配列相同性を共有するため、１つのアクチビン（例えばアクチビンＡ）に結合する抗体は、１つまたは複数の追加のアクチビン（例えば、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＣ）に結合する場合があることが留意されるべきである。一部の実施形態では、抗アクチビン抗体は、少なくともアクチビンＡおよびアクチビンＢに結合する。一部の実施形態では、抗アクチビン抗体は、１つまたは複数の追加のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］に結合し、ならびに／または１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ４）に結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せ、ならびにそれらの使用に関し、抗体の組合せは、抗アクチビン抗体、ならびに、例えば、異なるリガンド［例えば、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］に結合する、ならびに／または１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ４）に結合する１つまたは複数の追加の抗体を含む。一部の実施形態では、本開示の方法および使用に従って使用される抗体または抗体の組合せは、アクチビンおよびＴＧＦβに結合する。一部の実施形態では、本開示の方法および使用に従って使用される抗体または抗体の組合せは、アクチビンＡおよびＴＧＦβ２に結合する。一部の実施形態では、本開示の方法および使用に従って使用される抗体または抗体の組合せは、ＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）およびＴＧＦβに結合する。一部の実施形態では、本開示の方法および使用に従って使用される抗体または抗体の組合せは、ＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）およびＴＧＦβ２に結合する。

【0214】

ある特定の態様では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＧＤＦ３を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＧＤＦ３に結合する。本明細書で使用される場合、ＧＤＦ３抗体（抗ＧＤＦ３抗体）は、一般に、ＧＤＦ３を標的とする上で診断剤および／または治療剤として抗体が有用となるのに十分な親和性でＧＤＦ３に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＧＤＦ３抗体が無関係の非ＧＤＦ３タンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質間相互作用もしくは結合親和性アッセイにより測定して、ＧＤＦ３に対する抗体の結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＧＤＦ３抗体は、異なる種に由来するＧＤＦ３で保存されているＧＤＦ３のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＧＤＦ３抗体は、ヒトＧＤＦ３に結合する。他の好ましい実施形態では、抗ＧＤＦ３抗体は、同種Ｉ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）に対するＧＤＦ３の結合を阻害し、したがって、こうした受容体を介したＧＤＦ３媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。一部の実施形態では、抗ＧＤＦ３抗体は、１つまたは複数の追加のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］に結合し、ならびに／または１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ４）に結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せ、ならびにそれらの使用に関し、抗体の組合せは、抗ＧＤＦ３抗体、ならびに、例えば、異なるリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］に結合する、ならびに／または１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ４）に結合する１つまたは複数の追加の抗体を含む。

【0215】

ある特定の態様では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ６を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ６に結合する。本明細書で使用される場合、ＢＭＰ６抗体（抗ＢＭＰ６抗体）は、一般に、ＢＭＰ６を標的とする上で診断剤および／または治療剤として抗体が有用となるのに十分な親和性でＢＭＰ６に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＢＭＰ６抗体が無関係の非ＢＭＰ６タンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質間相互作用もしくは結合親和性アッセイにより測定して、ＢＭＰ６に対する抗体の結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＢＭＰ６抗体は、異なる種に由来するＢＭＰ６で保存されているＢＭＰ６のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＢＭＰ６抗体は、ヒトＢＭＰ６に結合する。他の好ましい実施形態では、抗ＢＭＰ６抗体は、同種Ｉ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）に対するＢＭＰ６の結合を阻害し、したがって、こうした受容体を介したＢＭＰ６媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。一部の実施形態では、抗ＢＭＰ６抗体は、１つまたは複数の追加のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］に結合し、ならびに／または１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ４）に結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せ、ならびにそれらの使用に関し、抗体の組合せは、抗ＢＭＰ６抗体、ならびに、例えば、異なるリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］に結合する、ならびに／または１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ４）に結合する１つまたは複数の追加の抗体を含む。

【0216】

ある特定の態様では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ９を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ９に結合する。本明細書で使用される場合、ＢＭＰ９抗体（抗ＢＭＰ９抗体）は、一般に、ＢＭＰ９を標的とする上で診断剤および／または治療剤として抗体が有用となるのに十分な親和性でＢＭＰ９に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＢＭＰ９抗体が無関係の非ＢＭＰ９タンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質間相互作用もしくは結合親和性アッセイにより測定して、ＢＭＰ９に対する抗体の結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＢＭＰ９抗体は、異なる種に由来するＢＭＰ９で保存されているＢＭＰ９のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＢＭＰ９抗体は、ヒトＢＭＰ９に結合する。他の好ましい実施形態では、抗ＢＭＰ９抗体は、同種Ｉ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）に対するＢＭＰ９の結合を阻害し、したがって、こうした受容体を介したＢＭＰ９媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。一部の実施形態では、抗ＢＭＰ９抗体は、１つまたは複数の追加のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ６、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］に結合し、ならびに／または１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ４）に結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せ、ならびにそれらの使用に関し、抗体の組合せは、抗ＢＭＰ９抗体、ならびに、例えば、異なるリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ６、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］に結合する、ならびに／または１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ４）に結合する１つまたは複数の追加の抗体を含む。

【0217】

ある特定の態様では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ１０を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＢＭＰ１０に結合する。本明細書で使用される場合、ＢＭＰ１０抗体（抗ＢＭＰ１０抗体）は、一般に、ＢＭＰ１０を標的とする上で診断剤および／または治療剤として抗体が有用となるのに十分な親和性でＢＭＰ１０に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＢＭＰ１０抗体が無関係の非ＢＭＰ１０タンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質間相互作用もしくは結合親和性アッセイにより測定して、ＢＭＰ１０に対する抗体の結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＢＭＰ１０抗体は、異なる種に由来するＢＭＰ１０で保存されているＢＭＰ１０のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＢＭＰ１０抗体は、ヒトＢＭＰ１０に結合する。他の好ましい実施形態では、抗ＢＭＰ１０抗体は、同種Ｉ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）に対するＢＭＰ１０の結合を阻害し、したがって、こうした受容体を介したＢＭＰ１０媒介性シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。一部の実施形態では、抗ＢＭＰ１０抗体は、１つまたは複数の追加のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］に結合し、ならびに／または１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ４）に結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せ、ならびにそれらの使用に関し、抗体の組合せは、抗ＢＭＰ１０抗体、ならびに、例えば、異なるリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］に結合する、ならびに／または１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ４）に結合する１つまたは複数の追加の抗体を含む。

【0218】

他の態様では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩ受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩＡに結合するが、ＡｃｔＲＩＩＢには結合しないかまたは実質的に結合しない（例えば、１×１０^－７Ｍよりも大きなＫ_ＤでＡｃｔＲＩＩＢに結合するか、または比較的わずかな結合性、例えば、約１×１０^－８Ｍまたは約１×１０^－９Ｍを有する）。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩＢに結合するが、ＡｃｔＲＩＩＡには結合しないかまたは実質的に結合しない（例えば、１×１０^－７Ｍよりも大きなＫ_ＤでＡｃｔＲＩＩＡに結合するか、または比較的わずかな結合性、例えば、約１×１０^－８Ｍまたは約１×１０^－９Ｍを有する）。さらに他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢに結合する。本明細書で使用される場合、ＡｃｔＲＩＩ抗体（抗ＡｃｔＲＩＩ抗体）は、一般に、ＡｃｔＲＩＩを標的とする上で診断剤および／または治療剤として抗体が有用となるのに十分な親和性でＡｃｔＲＩＩ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩ抗体が無関係の非ＡｃｔＲＩＩタンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質間相互作用もしくは結合親和性アッセイにより測定して、ＡｃｔＲＩＩに対する抗体の結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩ抗体は、異なる種に由来するＡｃｔＲＩＩで保存されているＡｃｔＲＩＩ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩ抗体は、ヒトＡｃｔＲＩＩ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）に結合する。他の好ましい実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩ抗体は、ＡｃｔＲＩＩ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）に対する、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］の結合を阻害することができる。ＡｃｔＲＩＩＡは、ＡｃｔＲＩＩＢと配列相同性を有するため、ＡｃｔＲＩＩＡに結合する抗体は、一部の場合では、ＡｃｔＲＩＩＢにも結合および／または阻害する場合があり、その逆も同様であることが留意されるべきである。一部の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩ抗体は、ＡｃｔＲＩＩ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）、および１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］に結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩ抗体は、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢに結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せならびにそれらの使用に関し、抗体の組合せは、少なくとも抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体および少なくともＡｃｔＲＩＩＢ抗体を含む。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せ、ならびにそれらの使用に関し、抗体の組合せは、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、ならびに、例えば、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ４、および／またはＡＬＫ５に結合する１つまたは複数の追加の抗体を含む。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せ、ならびにそれらの使用に関し、抗体の組合せは、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体、ならびに、例えば、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ４、および／またはＡＬＫ５に結合する１つまたは複数の追加の抗体を含む。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せ、ならびにそれらの使用（例えば、それを必要とする対象の免疫応答を増加させること、およびがんを処置すること）に関し、抗体の組合せは、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体、ならびに、例えば、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ４、および／またはＡＬＫ５に結合する少なくとも１つまたは複数の追加の抗体を含む。

【0219】

ある特定の態様では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＡＬＫ４を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＡＬＫ４に結合する。本明細書で使用される場合、ＡＬＫ４抗体（抗ＡＬＫ４抗体）は、一般に、ＡＬＫ４を標的とする上で診断剤および／または治療剤として抗体が有用となるのに十分な親和性でＡＬＫ４に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＡＬＫ４抗体が無関係の非ＡＬＫ４タンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質間相互作用もしくは結合親和性アッセイにより測定して、ＡＬＫ４に対する抗体の結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＡＬＫ４抗体は、異なる種に由来するＡＬＫ４で保存されているＡＬＫ４のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＡＬＫ４抗体は、ヒトＡＬＫ４に結合する。他の好ましい実施形態では、抗ＡＬＫ４抗体は、ＡＬＫ４に対する、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］の結合を阻害することができる。一部の実施形態では、抗ＡＬＫ４抗体は、ＡＬＫ４、ならびに１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）、および／またはＡＬＫ５に結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せ、ならびにそれらの使用に関し、抗体の組合せは、抗ＡＬＫ４抗体、ならびに、例えば、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）、および／またはＡＬＫ５に結合する１つまたは複数の追加の抗体を含む。

【0220】

ある特定の態様では、本明細書で開示された方法および使用に従って使用されるＴＧＦβＲＩＩアンタゴニストは、ＴＧＦβＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せである。ＴＧＦβＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、例えば、１つまたは複数のＴＧＦβＲＩＩリガンド（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３）、ＴＧＦβＲＩＩ受容体、ＴＧＦβＲＩＩ関連Ｉ型受容体（例えば、ＡＬＫ５）、および／またはＴＧＦβＲＩＩ共受容体（例えば、ベータグリカン）を阻害および／または結合することができる。一部の実施形態では、ＴＧＦβＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せが、シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害し、および／または標的に結合する能力は、例えば、本明細書に記載されているものを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは細胞に基づくアッセイで決定される。本明細書に記載されているように、ＴＧＦβＲＩＩアンタゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体の組合せを、単独で、または１つもしくは複数の追加の支持療法もしくは活性剤（例えば、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト）と組み合わせて使用して、本明細書に記載のような障害または状態を処置または予防することができる。

【0221】

ある特定の態様では、ＴＧＦβＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＴＧＦβ１を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＴＧＦβＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＴＧＦβ１に結合する。本明細書で使用される場合、ＴＧＦβ１抗体（抗ＴＧＦβ１抗体）は、一般に、ＴＧＦβ１を標的とする上で診断剤および／または治療剤として抗体が有用となるのに十分な親和性でＴＧＦβ１に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＴＧＦβ１抗体が無関係の非ＴＧＦβ１タンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定して、ＴＧＦβ１に対する抗体の結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＴＧＦβ１抗体は、異なる種に由来するＴＧＦβ１で保存されているＴＧＦβ１のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＴＧＦβ１抗体は、ヒトＴＧＦβ１に結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１抗体は、Ｉ型、ＩＩ型、および／または共受容体（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ５、および／またはベータグリカン）に対するＴＧＦβ１の結合を阻害することができ、したがって、ＴＧＦβ１シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。ＴＧＦβ１は、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３とある程度の配列相同性を共有することが留意されるべきである。したがって、ＴＧＦβ１に結合する抗体は、一部の実施形態では、ＴＧＦβ２および／またはＴＧＦβ３にも結合する場合がある。一部の実施形態では、本開示は、ＴＧＦβ１に結合し、例えば、１つまたは複数の追加のＴＧＦβＲＩＩリガンド（例えば、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、またはＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３）、１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＴＧＦβＲＩＩおよびＡＬＫ５）、ならびに／または１つもしくは複数の共受容体（例えば、ベータグリカン）にさらに結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）およびその使用に関する。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せ、ならびにそれらの使用に関し、抗体の組合せは、ＴＧＦβ１抗体、ならびに、例えば、１つまたは複数の追加のＴＧＦβＲＩＩリガンド（例えば、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、またはＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３）、１つもしくは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＴＧＦβＲＩＩおよびＡＬＫ５）、ならびに／または１つもしくは複数の共受容体（例えば、ベータグリカン）に結合する１つまたは複数の追加の抗体を含む。一部の実施形態では、抗ＴＧＦβ１抗体は、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはベータグリカンに結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せ、ならびにそれらの使用に関し、抗体の組合せは、抗ＴＧＦβ１抗体、ならびに、例えば、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはベータグリカンに結合する１つまたは複数の追加の抗体を含む。

【0222】

ある特定の実施形態では、ＴＧＦβＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＴＧＦβ２を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＴＧＦβＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＴＧＦβ２に結合する。本明細書で使用される場合、ＴＧＦβ２抗体（抗ＴＧＦβ２抗体）は、一般に、ＴＧＦβ２を標的とする上で診断剤および／または治療剤として抗体が有用となるのに十分な親和性でＴＧＦβ２に結合することが可能な抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＴＧＦβ２抗体が無関係の非ＴＧＦβ２タンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定して、ＴＧＦβ２に対する抗体の結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＴＧＦβ２抗体は、異なる種に由来するＴＧＦβ２で保存されているＴＧＦβ２のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＴＧＦβ２抗体は、ヒトＴＧＦβ２に結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ２抗体は、Ｉ型、ＩＩ型、および／または共受容体（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ５、および／またはベータグリカン）に対するＴＧＦβ２の結合を阻害することができ、したがって、ＴＧＦβ２シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。ＴＧＦβ２は、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３とある程度の配列相同性を共有することが留意されるべきである。したがって、ＴＧＦβ２に結合する抗体は、一部の実施形態では、ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ３にも結合する場合がある。一部の実施形態では、本開示は、ＴＧＦβ２に結合し、例えば、１つまたは複数の追加のＴＧＦβＲＩＩリガンド（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、またはＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３）、１つまたは複数のＩ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＴＧＦβＲＩＩおよびＡＬＫ５）、ならびに／または１つもしくは複数の共受容体（例えば、ベータグリカン）にさらに結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、およびその使用に関する。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せ、およびそれらの使用に関し、抗体の組合せは、ＴＧＦβ２抗体、ならびに、例えば、１つまたは複数の追加のＴＧＦβＲＩＩリガンド（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、またはＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３）、１つまたは複数のＩ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＴＧＦβＲＩＩおよびＡＬＫ５）、および／または１つもしくは複数の共受容体（例えば、ベータグリカン）に結合する１つまたは複数の追加の抗体を含む。一部の実施形態では、抗ＴＧＦβ２抗体は、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはベータグリカンに結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せ、ならびにそれらの使用に関し、抗体の組合せは、抗ＴＧＦβ２抗体、ならびに、例えば、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはベータグリカンに結合する１つまたは複数の追加の抗体を含む。

【0223】

ある特定の実施形態では、ＴＧＦβＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＴＧＦβ３を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＴＧＦβＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＴＧＦβ３に結合する。本明細書で使用される場合、ＴＧＦβ３抗体（抗ＴＧＦβ３抗体）は、一般に、ＴＧＦβ３を標的とする上で診断剤および／または治療剤として抗体が有用となるのに十分な親和性でＴＧＦβ３に結合することが可能な抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＴＧＦβ３抗体が無関係の非ＴＧＦβ３タンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定して、ＴＧＦβ３に対する抗体の結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＴＧＦβ３抗体は、異なる種に由来するＴＧＦβ３で保存されているＴＧＦβ３のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＴＧＦβ３抗体は、ヒトＴＧＦβ３に結合する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ３抗体は、Ｉ型、ＩＩ型、および／または共受容体（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ５、および／またはベータグリカン）に対するＴＧＦβ３の結合を阻害することができ、したがって、ＴＧＦβ３シグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することができる。ＴＧＦβ３は、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ１とある程度の配列相同性を共有することが留意されるべきである。したがって、ＴＧＦβ３に結合する抗体は、一部の実施形態では、ＴＧＦβ２および／またはＴＧＦβ１にも結合する場合がある。一部の実施形態では、本開示は、ＴＧＦβ３に結合し、例えば、１つまたは複数の追加のＴＧＦβＲＩＩリガンド（例えば、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ１、またはＴＧＦβ２およびＴＧＦβ１）、１つまたは複数のＩ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＴＧＦβＲＩＩおよびＡＬＫ５）、および／または１つもしくは複数の共受容体（例えば、ベータグリカン）にさらに結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、およびその使用に関する。一部の実施形態では、抗ＴＧＦβ３抗体は、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはベータグリカンに結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せ、ならびにそれらの使用に関し、抗体の組合せは、抗ＴＧＦβ３抗体、ならびに、例えば、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはベータグリカンに結合する１つまたは複数の追加の抗体を含む。

【0224】

ある特定の態様では、ＴＧＦβＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＴＧＦβＲＩＩを阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＴＧＦβＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＴＧＦβＲＩＩに結合する。本明細書で使用される場合、ＴＧＦβＲＩＩ抗体（抗ＴＧＦβＲＩＩ抗体）は、一般に、ＴＧＦβＲＩＩを標的とする上で診断剤および／または治療剤として抗体が有用となるのに十分な親和性でＴＧＦβＲＩＩに結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＴＧＦβＲＩＩ抗体が無関係の非ＴＧＦβＲＩＩタンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質間相互作用もしくは結合親和性アッセイにより測定して、ＴＧＦβＲＩＩに対する抗体の結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＴＧＦβＲＩＩ抗体は、異なる種に由来するＴＧＦβＲＩＩで保存されているＴＧＦβＲＩＩのエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＴＧＦβＲＩＩ抗体は、ヒトＴＧＦβＲＩＩに結合する。一部の実施形態では、抗ＴＧＦβＲＩＩ抗体は、ＴＧＦβＲＩＩに対する、１つまたは複数のＴＧＦβＲＩＩリガンド［例えば、ＴＧＦβ１；ＴＧＦβ２；ＴＧＦβ３；ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３；ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２；ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３；またはＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］の結合を阻害することができる。一部の実施形態では、抗ＴＧＦβＲＩＩ抗体は、ＴＧＦβＲＩＩ、ならびに１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）、ＡＬＫ５、および／またはベータグリカンに結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せ、およびそれらの使用に関し、抗体の組合せは、抗ＴＧＦβＲＩＩ抗体、ならびに、例えば、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）、ＡＬＫ５、および／またはベータグリカンに結合する１つまたは複数の追加の抗体を含む。

【0225】

ある特定の態様では、ＴＧＦβＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＡＬＫ５を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＴＧＦβＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともＡＬＫ５に結合する。本明細書で使用される場合、ＡＬＫ５抗体（抗ＡＬＫ５抗体）は、一般に、ＡＬＫ５を標的とする上で診断剤および／または治療剤として抗体が有用となるのに十分な親和性でＡＬＫ５に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＡＬＫ５抗体が無関係の非ＡＬＫ５タンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質間相互作用もしくは結合親和性アッセイにより測定して、ＡＬＫ５に対する抗体の結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＡＬＫ５抗体は、異なる種に由来するＡＬＫ５で保存されているＡＬＫ５のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＡＬＫ５抗体は、ヒトＡＬＫ５に結合する。一部の実施形態では、抗ＡＬＫ５抗体は、ＡＬＫ５に対する、１つまたは複数のＴＧＦβＲＩＩリガンド［例えば、ＴＧＦβ１；ＴＧＦβ２；ＴＧＦβ３；ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３；ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２；ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３；またはＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］の結合を阻害することができる。一部の実施形態では、抗ＡＬＫ５抗体は、ＡＬＫ５、ならびに１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）、および／またはベータグリカンに結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せ、およびそれらの使用に関し、抗体の組合せは、抗ＡＬＫ５抗体、ならびに、例えば、１つまたは複数のＴＧＦβＲＩＩリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）、および／またはベータグリカンに結合する１つまたは複数の追加の抗体を含む。

【0226】

ある特定の態様では、ＴＧＦβＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともベータグリカンを阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＴＧＦβＲＩＩアンタゴニスト抗体または抗体の組合せは、少なくともベータグリカンに結合する。本明細書で使用される場合、ベータグリカン抗体（抗ベータグリカン抗体）は、一般に、ベータグリカンを標的とする上で診断剤および／または治療剤として抗体が有用となるのに十分な親和性でベータグリカンに結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ベータグリカン抗体が無関係の非ベータグリカンタンパク質に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質間相互作用もしくは結合親和性アッセイにより測定して、ベータグリカンに対する抗体の結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ベータグリカン抗体は、異なる種に由来するベータグリカンで保存されているベータグリカンのエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ベータグリカン抗体は、ヒトベータグリカンに結合する。一部の実施形態では、抗ベータグリカン抗体は、ベータグリカンに対する、１つまたは複数のＴＧＦβＲＩＩリガンド［例えば、ＴＧＦβ１；ＴＧＦβ２；ＴＧＦβ３；ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３；ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２；ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３；またはＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］の結合を阻害することができる。一部の実施形態では、抗ベータグリカン抗体は、ベータグリカン、ならびに１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）、および／またはＡＬＫ５に結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組合せ、およびそれらの使用に関し、抗体の組合せは、抗ベータグリカン抗体、ならびに、例えば、１つまたは複数のＴＧＦβＲＩＩリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩ（ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ）、および／またはＡＬＫ５に結合する１つまたは複数の追加の抗体を含む。

【0227】

用語「抗体」は、本明細書では、最も幅広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限り、これらに限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片を含む、種々の抗体構造を包含する。抗体断片は、無傷抗体が結合する抗原に結合する無傷抗体の部分を含む、無傷抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、これらに限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２；ダイアボディ；直鎖抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。例えば、Hudsonら（２００３年）Nat. Med. ９巻：１２９～１３４頁；Pluckthun、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies、１１３巻、RosenburgおよびMoore編、（Springer-Verlag、New York）中、２６９～３１５頁（１９９４年）；国際公開第９３／１６１８５号；ならびに米国特許第５，５７１，８９４号、第５，５８７，４５８号、および第５，８６９，０４６号を参照されたい。本明細書で開示された抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、またはモノクローナル抗体であってもよい。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、それに付着され、検出することができる標識を含む（例えば、標識は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素コファクターであってもよい）。好ましい実施形態では、本開示の抗体は、単離された抗体である。

【0228】

ダイアボディは、二価または二重特異性であってもよい２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４，０９７；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudsonら（２００３年）Nat. Med. ９巻：１２９～１３４頁（２００３年）；およびHollingerら（１９９３年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９０巻：６４４４～６４４８頁
を参照されたい。また、トリアボディ（triabody）およびテトラボディ（tetrabody）は
、Hudsonら（２００３年）Nat. Med. ９巻：１２９～１３４頁に記載されている。

【0229】

単一ドメイン抗体は、重鎖可変ドメインのすべてもしくは部分または抗体の軽鎖可変ドメインのすべてもしくは部分を含む抗体断片である。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である。例えば、米国特許第６，２４８，５１６号を参照されたい。

【0230】

抗体断片は、これらに限定されないが、本明細書に記載のように、無傷抗体のタンパク質分解性消化、ならびに組換え宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはファージ）による産生を含む、種々の技法により製作することができる。

【0231】

本明細書の抗体は、任意のクラスであってもよい。抗体のクラスは、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。５つの主なクラスの抗体がある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ。これらの幾つかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、およびＩｇＡ_２にさらに分類することができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。

【0232】

一般に、本明細書で開示された方法に使用される抗体は、好ましくは高結合親和性でその標的抗原に特異的に結合する。親和性は、Ｋ_Ｄ値として表すことができ、固有の結合親和性を反映する（例えば、最小化された結合力効果を有する）。典型的には、結合親和性は、無細胞設定かまたは細胞関連設定かに関わらず、ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定される。本明細書で開示されたものを含む、例えば、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイ）、放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）、およびＥＬＩＳＡを含む、当技術分野で公知の多くのアッセイのいずれかを使用して、結合親和性測定を得ることができる。一部の実施形態では、本開示の抗体は、それらの標的抗原［例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡＬＫ４、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ５、および／またはベータグリカン］に、少なくとも１×１０^－７もしくはそれよりも強力な、１×１０^－８もしくはそれよりも強力な、１×１０^－９もしくはそれよりも強力な、１×１０^－１０もしくはそれよりも強力な、１×１０^－１１もしくはそれよりも強力な、１×１０^－１２もしくはそれよりも強力な、１×１０^－１３もしくはそれよりも強力な、または１×１０^－１４もしくはそれよりも強力なＫ_Ｄで結合する。

【0233】

ある特定の実施形態では、Ｋ_Ｄは、以下のアッセイにより記載のように、目的の抗体のＦａｂ版およびその標的抗原を用いて実施されるＲＩＡにより測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、滴定系列の未標識抗原の存在下にて、最小濃度の放射性標識抗原（例えば、^１２５Ｉ標識）でＦａｂを平衡化し、その後、結合した抗原を抗Ｆａｂ抗体コーティングプレートで捕捉することにより測定される［例えば、Chenら（１９９９年）J. Mol. Biol. ２９３巻：８６５～８８１頁を参照］。アッセイの条件を確立する
ため、多ウェルプレート（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標））を、捕捉抗Ｆａｂ抗体（例えば、Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ製の）でコーティングし（例えば、一晩）、その後ウシ血清アルブミンを用いて、好ましくは室温（例えば、およそ２３℃）でブロッキングする。非吸着性プレートにて、放射性標識抗原を、目的のＦａｂの系列希釈物と混合する［例えば、Prestaら、（１９９７年）Cancer Res. ５７巻：４５９３～４５９９頁における、抗ＶＥＧＦ抗体であるＦａｂ－１２の評価と同じように］。その後、目的のＦａｂを、好ましくは一晩インキュベートするが、インキュベーションは、平衡に到達していることを保証するため、より長期間（例えば、約６５時間）継続してもよい。その後、混合物を、捕捉プレートに移して、好ましくは室温で約１時間インキュベーションする。その後、溶液を除去し、プレートを、好ましくはポリソルベート２０およびＰＢＳ混合物で数回洗浄する。プレートが乾燥したら、シンチラント（scintillant）（例えば、Ｐａｃｋａｒｄ製のＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ（登録商
標））を添加し、プレートをガンマ計数器（例えば、Ｐａｃｋａｒｄ製のＴＯＰＣＯＵＮＴ（登録商標））で計数する。

【0234】

別の実施形態によると、Ｋ_Ｄは、表面プラズモン共鳴アッセイを使用して、例えば、約１０応答ユニット（ＲＵ）で固定された抗原ＣＭ５チップで、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用して測定する。手短に言えば、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を、供給業者の使用説明書に従って、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシサクシニミド（ＮＨＳ）で活性化する。例えば、抗原を、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．８で５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈してから、５μｌ／分の流速で注入して、カップリングされたタンパク質のおよそ１０応答ユニット（ＲＵ）を達成してもよい。抗原を注入した後、１Ｍエタノールアミンを注入して、未反応基をブロッキングする。動力学測定は、Ｆａｂの２倍系列希釈物（０．７８ｎＭ～５００ｎＭ）を、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０（登録商標））界面活性剤（ＰＢＳＴ）を有するＰＢＳで、およそ２５μｌ／分の流速にて注入する。会合速度（ｋ_ｏｎ）および解離速度（ｋ_ｏｆｆ）は、例えば、単純な１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）評価ソフトウェア バージョン３．２）を使用して、会合および解離センサグラムを同時にフィッティングすることにより算出する。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）は、比ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎとして算出する［例えば、Chenら、（１９９９年）J. Mol. Biol. ２９３巻：８６５～８８１頁を参照］。上記の表面プラズ
モン共鳴アッセイによるオン速度が、例えば、１０^６Ｍ^－１ｓ^－１を超える場合、オン速度は、漸増濃度の抗原の存在下でＰＢＳ中２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の蛍光発光強度の増加または減少を測定する（例えば、励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ；１６ｎｍバンドパス）蛍光クエンチング技法を使用することにより、ストップフローを装備した分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または撹拌キュベットを有する８０００系列ＳＬＭ－ＡＭＩＮＣＯ（登録商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定して決定することができる。

【0235】

ヒトＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡＬＫ４、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ５、および／またはベータグリカンの核酸およびアミノ酸配列は、当技術分野で周知であり、したがって、本開示に従って使用するための抗体アンタゴニストは、当業者であれば、当技術分野の知識および本明細書で提供された教示に基づき、日常的に製作することができる。

【0236】

ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。キメラ抗体は、重鎖および／または軽鎖の部分が、特定の供給源または種に由来するが、重鎖および／または軽鎖の残りは、異なる供給源または種に由来する抗体を指す。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；およびMorrisonら、（１９８４年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８１巻：６８５１～６８５５頁に記載されている。一部の実施形態では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域）およびヒト定常領域を含む。一部の実施形態では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが、親抗体のクラスまたはサブクラスから変化されている「クラススイッチ」抗体である。一般に、キメラ抗体は、その抗原結合性断片を含む。

【0237】

ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるキメラ抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体は、非ヒト超可変領域（ＨＶＲ）に由来するアミノ酸残基およびヒトフレームワーク領域（ＦＲ）に由来するアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むことになり、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、必要に応じて、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも部分を含んでいてもよい。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。

【0238】

ヒト化抗体、およびそれらを製作するための方法は、例えば、AlmagroおよびFransson
（２００８年）Front. Biosci. １３巻：１６１９～１６３３頁に総説されており、例
えば、Riechmannら（１９８８年）Nature ３３２巻：３２３～３２９頁；Queenら（１９８９年）Proc. Nat'l Acad. Sci. USA ８６巻：１００２９～１００３３頁；米国特許第５，８２１，３３７号、第７，５２７，７９１号、第６，９８２，３２１号、および第７，０８７，４０９号；Kashmiriら（２００５年）Methods ３６巻：２５～３４頁［
ＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）グラフトが記載されている］；Padlan、Mol. Immunol.（１９９１年）２８巻：４８９～４９８頁（「リサーフェシング」が記載されている）；Dall'Acquaら（２００５年）Methods ３６巻：４３～６０頁（「ＦＲシャフリング」が記載されて
いる）；Osbournら（２００５年）Methods ３６巻：６１～６８頁；およびKlimkaら、Br. J. Cancer（２０００年）８３巻：２５２～２６０頁（ＦＲシャフリングの「ガイド
選択」手法が記載されている）にさらに記載されている。

【0239】

ヒト化に使用することができるヒトフレームワーク領域としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域［例えば、Simsら（１９９３年）J. Immunol. １５１巻：２２９６頁を参照］；特定のサブグループの軽鎖または重鎖可変領域のヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域［例えば、Carterら（１９９２年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８９巻：４２８５頁；およびPrestaら（１９９３年）J. Immunol.、１５１巻：２６２３頁を参照］；ヒト成熟（体細胞性突然変異）フレームワーク領域またはヒト生殖系フレームワーク領域［例えば、AlmagroおよびFransson（２００８年）Front. Biosci. １３巻：１６１９～１６３３頁を参照］；およびＦＲライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域［例えば、Bacaら、（１９９７年）J. Biol. Chem. ２７２巻：１０６７８～１０６８４頁；およびRosokら、（１９９６年）J. Biol. Chem. ２７
１巻：２２６１１～２２６１８頁を参照］。

【0240】

ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の種々の技法を使用して産生することができる。ヒト抗体は、一般に、van Dijkおよびvan de Winkel（２００１年）Curr. Opin. Pharmacol. ５巻：３６８～７４頁およびLonberg（２００８年）Curr. Opin. Immunol. ２０巻：４５０～
４５９頁に記載されている。

【0241】

ヒト抗体は、免疫原［例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡＬＫ４、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ５、および／またはベータグリカン］を、抗原チャレンジに応答して無傷ヒト抗体またはヒト可変領域を有する無傷抗体を産生するように修飾されているトランスジェニック動物に投与することにより調製することができる。そのような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換えているか、または染色体外に存在するか、もしくは動物の染色体にランダムに組み込まれているヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべてまたは部分を含む。そのようなトランスジェニック動物では、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般には、不活化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説は、以下を参照されたい：例えば、Lonberg（２００５年）Nat. Biotechnol. ２３巻：１１１７～１１２５頁；米国特許第６，０７５，１８１号および第６，１５０，５８４号（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術が記載されている）；米国特許第５，７７０，４２９号（ＨｕＭａｂ（登録商標）技術が記載されている）；米国特許第７，０４１，８７０号（Ｋ－Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術が記載されている）；および米国特許出願公開第２００７／００６１９００号（ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術が記載されている）。そのような動物により生成された無傷抗体に由来するヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによりさらに修飾することができる。

【0242】

また、本明細書で提供されるヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法により製作することができる。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒトミエローマおよびマウス－ヒトヘテロミエローマ細胞株が報告されている［例えば、Kozbor J. Immunol.、（１９８４年）１３３巻：３００１頁；Brodeurら（１９８７年）Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、５１～６３頁、Marcel Dekker, Inc.、New York；およびBoernerら（１９９１年）J. Immunol.、１４７巻：８６頁を参照］。また
、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成されたヒト抗体は、Liら、（２００６年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、１０３巻：３５５７～３５６２頁に記載されている。追加の方法としては、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生が記載されている）およびNi、Xiandai Mianyixue（２００６年）２６巻（４号）：２６５～２６８頁（２００６年）（ヒト－ヒトハイブリドーマが記載されている）に記載されているものが挙げられる。また、ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）が、VollmersおよびBrandlein（２００５年）Histol. Histopathol.、２０巻（３号）：９２７～９３７頁（２００５年）およびVollmersおよびBrandlein（２００５年）Methods Find Exp. Clin. Pharmacol.、２７巻（３号）：１
８５～９１頁に記載されている。

【0243】

また、本明細書で提供されるヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することにより生成することができる。その後、そのような可変ドメイン配列を、所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技法は、本明細書に記載されている。

【0244】

例えば、本開示の抗体は、１つまたは複数の所望の活性を用いて、抗体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより単離することができる。ファージディスプレイライブラリーを生成するための、およびそのようなライブラリーを所望の結合特徴を有する抗体についてスクリーニングするための様々な方法が、当技術分野で公知である。そのような方法は、例えば、Hoogenboomら（２００１年）Methods in Molecular Biology中 １７８巻：１～３７頁、O'Brienら編、Human Press、Totowa、N.J.に総説されており、例えば、the McCaffertyら（１９９１年）Nature ３４８巻：５５２～５５４頁；Clacksonら、（１９９１年）Nature ３５２巻：６２４～６２８頁；Marksら（１
９９２年）J. Mol. Biol. ２２２巻：５８１～５９７頁；MarksおよびBradbury（２００３年）Methods in Molecular Biology中 ２４８巻：１６１～１７５頁、Lo編、Human Press、Totowa、N.J.；Sidhuら（２００４年）J. Mol. Biol. ３３８巻（２号）
：２９９～３１０頁；Leeら（２００４年）J. Mol. Biol. ３４０巻（５号）：１０７３～１０９３頁；Fellouse（２００４年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA １０１巻（３４号）：１２４６７～１２４７２頁；およびLeeら（２００４年）J. Immunol. Methods ２８４巻（１～２号）：１１９～１３２頁にさらに記載されている。

【0245】

ある特定のファージディスプレイ法では、ＶＨおよびＶＬ遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により別々にクローニングし、ファージライブラリーでランダムに組換え、それを、その後Winterら（１９９４年）Ann. Rev. Immunol.、１２巻：４３３～４５５頁に記載されているように、抗原結合性ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片またはＦａｂ断片のいずれかとして提示する。免疫された供給源に由来するライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なく、免疫原［例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡＬＫ４、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ５、および／またはベータグリカン］に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、未感作レパートリーをクローニングして（例えば、ヒトから）、Griffithsら（１９９３年）EMBO
J、１２巻：７２５～７３４頁に記載のように、免疫化を一切行わずに、広範な非自己
およびさらに自己抗原に対する抗体の単一供給源を提供することができる。最後に、また、未感作ライブラリーは、HoogenboomおよびWinter（１９９２年）J. Mol. Biol.、２
２７巻：３８１～３８８頁に記載のように、幹細胞に由来する未再編成Ｖ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用して、高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードし、ｉｎ ｖｉｔｒｏ再編成を達成することにより、合成的に製作することができる。ヒト抗体ファージライブラリーが記載されている特許刊行物としては、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、ならびに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、第２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号、および第２００９／０００２３６０号が挙げられる。

【0246】

ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体（典型的には、モノクローナル抗体）は、１つまたは複数の（例えば、２、３、４、５、６つ、またはそれよりも多くの）抗原の少なくとも２つの異なるエピトープ（例えば、２、３、４、５、もしくは６つ、またはそれよりも多くの）に対して結合特異性を有する。

【0247】

「オクトパス抗体」を含む、３つまたはそれよりも多くの機能的抗原結合部位を有する操作された抗体も、本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６Ａ１号を参照）。

【0248】

ある特定の実施形態では、本明細書で開示された抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指す。つまり、集団を構成する個々の抗体は、例えば、天然に存在する突然変異を含むか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる可能性のある、一般に少量で存在するバリアント抗体を除いて、同一であり、および／または同じエピトープに結合する。典型的には、異なるエピトープに対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一のエピトープに対する抗体である。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法により抗体が産生されることは必要とされていないと解釈されるべきである。例えば、本方法に従って使用されるモノクローナル抗体は、これらに限定されないが、以下のものを含む様々な技法により製作することができる：ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべてまたは一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法、本明細書に記載されているモノクローナル抗体を製作するためのそのような方法および他の例示的な方法。

【0249】

例えば、ＧＤＦ１１に由来する免疫原を使用することにより、抗タンパク質／抗ペプチド抗血清またはモノクローナル抗体を、標準的プロトコールにより製作することができる［例えば、Antibodies: A Laboratory Manual（１９８８年）HarlowおよびLane編、Cold Spring Harbor Pressを参照］。マウス、ハムスター、またはウサギなどの哺乳動
物を、ＧＤＦ１１ポリペプチドの免疫原性形態、抗体応答を誘発することが可能な抗原性断片、または融合タンパク質で免疫してもよい。タンパク質またはペプチドに免疫原性を付与するための技法としては、担体とのコンジュゲーションまたは当技術分野で周知の他の技法が挙げられる。ＧＤＦ１１ポリペプチドの免疫原性部分を、アジュバントの存在下で投与してもよい。免疫化の進行は、血漿または血清の抗体力価を検出することによりモニターすることができる。標準的ＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイを使用し、免疫原を抗原として用いて、抗体産生のレベルおよび／または結合親和性のレベルを評価することができる。

【0250】

ＧＤＦ１１の抗原性調製物により動物を免疫した後、抗血清を得ることができ、所望の場合、ポリクローナル抗体を血清から単離することができる。モノクローナル抗体を産生するためには、抗体産生細胞（リンパ球）を、免疫した動物から回収し、標準的体細胞融合手順により、ミエローマ細胞などの不死化細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を産出する。そのような技法は、当技術分野で周知であり、例えば、ハイブリドーマ技法［例えば、KohlerおよびMilstein（１９７５年）Nature、２５６巻：４９５～４９７頁を参照］、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法［例えば、Kozbarら（１９８３年）Immunology Today
、４巻：７２頁を参照］、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術［Coleら（１９８５年）Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R. Liss, Inc.、７７～９６頁］が挙げられる。ハイブリドーマ細胞を、ＧＤＦ
１１ポリペプチドに特異的に反応性である抗体の産生について免疫化学的にスクリーニングすることができ、そのようなハイブリドーマ細胞を含む培養からモノクローナル抗体を単離することができる。

【0251】

ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸修飾を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入して、それによりＦｃ領域バリアントを生成してもよい。Ｆｃ領域バリアントは、１つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換、欠失、および／または付加）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含んでいてもよい。

【0252】

例えば、本開示は、エフェクター機能の一部を有するがすべてを有しているわけではない抗体バリアントを企図する。そのような抗体バリアントは、抗体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期が重要であるが、ある特定のエフェクター機能［例えば、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）］が不要であるかまたは有害である応用のための望ましい候補である。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏ細胞傷害アッセイを実施して、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、抗体が、ＦｃγＲ結合を欠如する（したがって、ＡＤＣＣ活性を欠如する可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを確認することができる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲ発現は、例えば、RavetchおよびKinet（１９９１年）Annu. Rev. Immunol. ９巻：４５７～４９２頁に要約されている。目
的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号；Hellstrom, I.ら（１９８６年）Proc. Nat'l Acad. Sci. USA ８３巻：７０５９～７０６３頁；Hellstrom, Iら（１９８５年）Proc. Nat'l Acad. Sci. USA ８２巻：１４９９～１５０２頁；米国特許第５，８２１，３
３７号；およびBruggemann, M.ら（１９８７年）J. Exp. Med. １６６巻：１３５１
～１３６１頁に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を使用してもよい（例えば、ＡＣＴＩ（商標）、フローサイトメトリー用の非放射性細胞傷害アッセイ；ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．；およびＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害アッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいはまたはそれに加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Clynesら（１９９８年）Proc. Nat'l Acad. Sci. USA ９５巻：６５２～６５６頁に開示されているものなどの動物モデルで評価してもよい。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを実施して、抗体がＣ１ｑに結合することができず、したがってＣＤＣ活性を欠如することを確認してもよい［例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号および国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照］。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施してもよい［例えば、Gazzano-Santoroら（１９９６年）J. Immunol. Methods ２０２巻：１６３頁；Cragg, M. S.ら（２００３年）Blood １０１巻
：１０４５～１０５２頁；およびCragg, M. S.およびM. J. Glennie（２００４年）Blood １０３巻：２７３８～２７４３頁を参照］。また、ＦｃＲｎ結合およびｉｎ ｖｉｖｏクリアランス／半減期決定は、当技術分野で公知の方法を使用して実施することができる［例えば、Petkova, S. B.ら（２００６年）Int. Immunol. １８巻（１２号）：１７５９～１７６９頁を参照］。

【0253】

エフェクター機能が低減された本開示の抗体としては、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、および３２９の１つまたは複数の置換を有するものが挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ突然変異体としては、残基２６５および２９７がアラニンに置換されたいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、および３２７の２つまたはそれよりも多くに置換を有するＦｃ突然変異体が挙げられる（米国特許第７，３３２，５８１号）。

【0254】

ある特定の実施形態では、システイン操作された抗体、例えば、抗体の１つまたは複数の残基がシステイン残基と置換されている「ｔｈｉｏＭＡｂ」を生成することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、残基の置換は、抗体の接近可能な部位で生じる。そのような残基をシステインと置換することにより、反応性チオール基を、抗体の接近可能な部位に位置し、抗体を薬物部分またはリンカー薬物部分などの他の部分にコンジュゲートするために使用して、本明細書にさらに記載のようなイムノコンジュゲートを生成してもよい。ある特定の実施形態では、以下の残基の任意の１つまたは複数を、システインと置換してもよい：軽鎖のＶ２０５（カバット付番）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ付番）；および重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ付番）。システイン操作された抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載のように生成することができる。

【0255】

加えて、望ましい抗体を特定するために抗体をスクリーニングするために使用される技法は、得られる抗体の特性に影響を及ぼす場合がある。例えば、抗体が、溶液中での抗原結合に使用される場合、溶液結合を試験することが望ましい場合がある。様々な異なる技法が、抗体と抗原との相互作用を試験して、特に望ましい抗体を特定するために利用可能である。そのような技法としては、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴結合アッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）結合アッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、サンドイッチアッセイ（例えば、ＩＧＥＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄの常磁性ビーズ系）、ウェスタンブロット、免疫沈降アッセイ、および免疫組織化学法が挙げられる。

【0256】

ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体および／または結合性ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントが企図される。例えば、抗体および／または結合性ポリペプチドの結合親和性および／または他の生物学的特性を向上させることが望ましい場合がある。抗体および／または結合性ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、抗体および／または結合性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することにより、またはペプチド合成により調製することができる。そのような修飾としては、例えば、抗体および／または結合性ポリペプチドのアミノ酸配列からの欠失、および／または配列への挿入、および／または配列内の残基の置換が挙げられる。最終構築物が、所望の特徴、例えば、標的結合（ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡＬＫ４、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ５、および／またはベータグリカン結合）を有する限り、最終構築物に到達するために、任意の組合せの欠失、挿入、および置換をなすことができる。

【0257】

ＨＶＲに変更（例えば、置換）をなして、例えば、抗体親和性を向上させてもよい。ＨＶＲ「ホットスポット」、つまり体細胞性成熟プロセス中に高頻度に突然変異を起こすコドンによりコードされる残基（例えば、Chowdhury（２００８年）Methods Mol. Biol.
２０７巻：１７９～１９６頁（２００８年）を参照）、および／またはＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）にそのような変更をなして、得られたバリアントＶＨまたはＶＬを結合親和性について試験してもよい。二次ライブラリーから構築および再選択することによる親和性成熟は、当技術分野に記載されている［例えば、Hoogenboomら、Methods in Molecular Biology中 １７８巻：１～３７頁、O'Brienら編、Human Press、Totowa、N.J.（２００１年）を参照］。親和性成熟の一部の実施形態では、成熟のために選択されたバリアブル遺伝子に、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャフリング、またはオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発）のいずれかにより多様性を導入する。その後、二次ライブラリーを生成する。その後、ライブラリーをスクリーニングして、所望の親和性を有する任意の抗体バリアントを特定する。多様性を導入するための別の方法は、幾つかのＨＶＲ残基（例えば、一回に４～６個の残基）がランダム化されるＨＶＲ指定手法（HVR-directed approach）を含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発またはモデリングを使用して、特異的に特定することができる。ＣＤＲ－Ｈ３およびＣＤＲ－Ｌ３が、特に標的とされることが多い。

【0258】

ある特定の実施形態では、そのような変更が、抗体の抗原結合能力を実質的に低減させない限り、置換、挿入、または欠失が、１つまたは複数のＨＶＲ内に生じてもよい。例えば、結合親和性を実質的に低減しない保存的変更（例えば、本明細書で提供される保存的置換）を、ＨＶＲになすことができる。そのような変更は、ＨＶＲ「ホットスポット」またはＳＤＲの外部であってもよい。上記で提供されているバリアントＶＨおよびＶＬ配列のある特定の実施形態では、各ＨＶＲは、未変更であるか、または１つ、２つ、もしくは３つ以下のアミノ酸置換を含むかのいずれかである。

【0259】

突然変異誘発の標的にすることができる抗体および／または結合性ポリペプチドの残基または領域を特定するための有用な方法は、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれ、CunninghamおよびWells（１９８９年）Science、２４４巻：１０８１～１０８５頁によって記載されている。この方法では、残基または一群の標的残基（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの荷電残基）を特定し、中性または負荷電アミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）によって置き換えて、抗体または結合性ポリペプチドと抗原との相互作用が影響を受けるか否かを決定する。初期置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸位置に、さらなる置換を導入してもよい。その代わりにまたはそれに加えて、抗原－抗体複合体の結晶構造を使用して、抗体と抗原との接触地点を特定してもよい。そのような接触残基および近隣残基を、置換の候補として標的にしてもよく、または除去してもよい。バリアントをスクリーニングして、それらが所望の特性を含むか否かを決定してもよい。

【0260】

アミノ酸配列挿入としては、１個の残基から、１００個またはそれよりも多くの残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一のまたは複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入バリアントとしては、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴの場合）または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドを抗体のＮ末端またはＣ末端に融合させることが挙げられる。

【0261】

ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体および／または結合性ポリペプチドは、当技術分野で公知であり、容易に利用可能な追加の非タンパク質性部分を含むようにさらに修飾されていてもよい。抗体および／または結合性ポリペプチドの誘導体化に好適な部分としては、これらに限定されないが、水溶性ポリマーが挙げられる。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレン（propropylene）グリコールホモポリマー、プロリプロピレン（prolypropylene）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、およびそれらの混合物。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中で安定であるため、製造が有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量であってもよく、分岐していてもよく、または分岐していなくともよい。抗体および／または結合性ポリペプチドに付着されるポリマーの数は、様々であってもよく、１つよりも多くのポリマーが付着されている場合、それらは、同じ分子であってもよく、または異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数および／またはタイプは、抗体誘導体および／または結合性ポリペプチド誘導体が、規定の条件下で治療に使用されることになるか否かに関わらず、これらに限定されないが、向上させようとする抗体および／または結合性ポリペプチドの特定の特性または機能を含む考慮事項に基づいて決定することができる。

【0262】

５．低分子アンタゴニスト
他の態様では、本開示は、低分子または低分子の組合せであるＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（阻害剤）に関する。ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト低分子は、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］、１つまたは複数のＩ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）、または１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩ下流シグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ２および／または３）を阻害することができる。特に、本開示は、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト低分子またはＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト低分子の組合せを、単独で、または１つもしくは複数の追加の支持療法および／もしくは活性剤（例えば、ＴＧＦβアンタゴニスト）と組み合わせて使用して、それを必要とする対象にて所望の効果（例えば、それを必要とする対象の免疫応答を増加させること、およびがんまたは病原体を処置すること）を達成するための方法を提供する。

【0263】

一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＧＤＦ１１を阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１を阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはベータグリカンをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＧＤＦ８を阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＧＤＦ８を阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはベータグリカンをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、およびアクチビンＡＥ）を阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、アクチビンを阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはベータグリカンをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＧＤＦ３を阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＧＤＦ３を阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはベータグリカンをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＢＭＰ６を阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＢＭＰ６を阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはベータグリカンをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＢＭＰ１０を阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０を阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはベータグリカンをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＢＭＰ９を阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＢＭＰ９を阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはベータグリカンをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＡｃｔＲＩＩＡを阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡを阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはベータグリカンをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＡｃｔＲＩＩＢを阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢを阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはベータグリカンをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＡＬＫ４を阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＡＬＫ４を阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ５、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはベータグリカンをさらに阻害する。

【0264】

他の態様では、本開示は、低分子または低分子の組合せであるＴＧＦβアンタゴニスト（阻害剤）に関する。ＴＧＦβアンタゴニスト低分子は、１つもしくは複数のＴＧＦβリガンド［例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、１つもしくは複数のＩ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＴＧＦβＲＩＩおよびＡＬＫ５）、１つもしくは複数の共受容体（例えば、ベータグリカン）、および／または１つもしくは複数のＴＧＦβ下流シグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ２および／または３）を阻害することができる。特に、本開示は、ＴＧＦβアンタゴニスト低分子またはＴＧＦβアンタゴニスト低分子の組合せを、単独で、または１つもしくは複数の追加の支持療法および／もしくは活性剤（例えば、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト）と組み合わせて使用して、それを必要とする対象にて所望の効果（例えば、それを必要とする対象の免疫応答を増加させること、およびがんまたは病原体を処置すること）を達成するための方法を提供する。

【0265】

一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、少なくともＴＧＦβ１を阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１を阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ５、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはベータグリカンをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、少なくともＴＧＦβ２を阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＴＧＦβ２を阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、およびＴＧＦβ３］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ５、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはベータグリカンをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、少なくともＴＧＦβ３を阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＴＧＦβ３を阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、およびＴＧＦβ２］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ５、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはベータグリカンをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、少なくともＴＧＦβ３を阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＴＧＦβ３を阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、およびＴＧＦβ２］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ５、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはベータグリカンをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、少なくともＴＧＦβＲＩＩを阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＴＧＦβＲＩＩを阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ５、および／またはベータグリカンをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、少なくともＡＬＫ５を阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＡＬＫ５を阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはベータグリカンをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、少なくともベータグリカンを阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ベータグリカンを阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ５、および／またはＴＧＦβＲＩＩをさらに阻害する。

【0266】

低分子アンタゴニストは、直接的なまたは間接的な阻害剤であってもよい。例えば、間接的な低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、少なくとも１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、１つまたは複数のＩ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ４、およびＡＬＫ５）、１つまたは複数の共受容体（ベータグリカン）、または１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩ下流シグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ２および／または３）の発現（例えば、転写、翻訳、細胞分泌、またはそれらの組合せ）を阻害することができる。あるいは、直接的な低分子ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、例えば、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、１つまたは複数のＩ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＡＬＫ４、およびＡＬＫ５）、１つまたは複数の共受容体（ベータグリカン）、または１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩ下流シグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ２および／または３）の１つまたは複数に直接結合することができる。１つまたは複数の間接的なおよび１つまたは複数の直接的な低分子アンタゴニストの組合せを、本明細書で開示されている方法に従って使用することができる。

【0267】

本開示の結合性有機低分子アンタゴニストは、公知の方法論（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／００８２３およびＷＯ００／３９５８５を参照）を使用して特定し、化学的に合成することができる。一般に、本開示の低分子アンタゴニストは、通常、サイズが、約２０００ダルトン未満であり、あるいはサイズが、約１５００、７５０、５００、２５０、または２００ダルトン未満であり、そのような有機低分子は、本明細書に記載のようなポリペプチドに、好ましくは特異的に結合することが可能である。そのような低分子アンタゴニストは、周知の技法を使用して、過度の実験作業を行わずに特定することができる。この点で、ポリペプチド標的に結合することが可能な分子について、有機低分子ライブラリーをスクリーニングするための技法は、当技術分野で周知であることに留意されたい（例えば、国際公開第００／００８２３号および国際公開第００／３９５８５号を参照）。

【0268】

本開示の結合性有機低分子は、例えば、アルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、Ｎ置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバメート、カルボネート、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、ハロゲン化アリール、スルホン酸アリール、ハロゲン化アルキル、スルホン酸アルキル、芳香族化合物、複素環式化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアネート、塩化スルホニル、ジアゾ化合物、および酸塩化物であってもよい。

【0269】

６．ヌクレオチドアンタゴニスト
他の態様では、本開示は、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せであるＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（阻害剤）に関する。ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストポリヌクレオチドは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９］、１つまたは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡＬＫ４）、または１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩ下流シグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ２および／または３）を阻害することができる。特に、本開示は、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストポリヌクレオチドまたはＡｃｔＲＩＩアンタゴニストポリヌクレオチドの組合せを、単独で、または１つもしくは複数の追加の支持療法および／もしくは活性剤（例えば、ＴＧＦβＲＩＩアンタゴニスト）と組み合わせて使用して、それを必要とする対象にて所望の効果（例えば、それを必要とする対象の免疫応答を増加させること、およびがんまたは病原体を処置すること）を達成するための方法を提供する。

【0270】

一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＧＤＦ１１を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはベータグリカンをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＧＤＦ８を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＧＤＦ８を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはベータグリカンをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、およびアクチビンＡＥ）を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、アクチビンを阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはベータグリカンをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩポリヌクレオチドは、少なくともＧＤＦ３を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＧＤＦ３を阻害するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはベータグリカンをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＢＭＰ６を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＢＭＰ６を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはベータグリカンをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＢＭＰ１０を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはベータグリカンをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＢＭＰ９を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＢＭＰ９を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはベータグリカンをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＡｃｔＲＩＩＡを阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡを阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはベータグリカンをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＡｃｔＲＩＩＢを阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢを阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはベータグリカンをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＡＬＫ４を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＡＬＫ４を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ５、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはベータグリカンをさらに阻害する。

【0271】

他の態様では、本開示は、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せであるＴＧＦβアンタゴニスト（阻害剤）に関する。ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドは、１つまたは複数のＴＧＦβリガンド［例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、１つまたは複数のＩ型および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＴＧＦβＲＩＩおよびＡＬＫ５）、１つまたは複数の共受容体（例えば、ベータグリカン）、および／または１つもしくは複数のＴＧＦβ下流シグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ２および／または３）を阻害することができる。特に、本開示は、ＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドまたはＴＧＦβアンタゴニストポリヌクレオチドの組合せを、単独でまたは１つもしくは複数の追加の支持療法および／もしくは活性剤（例えば、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト）と組み合わせて使用して、それを必要とする対象にて所望の効果（例えば、それを必要とする対象の免疫応答を増加させること、およびがんまたは病原体を処置すること）を達成するための方法を提供する。

【0272】

一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、少なくともＴＧＦβ１を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ５、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはベータグリカンをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、少なくともＴＧＦβ２を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＴＧＦβ２を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、およびＴＧＦβ３］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ５、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはベータグリカンをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、少なくともＴＧＦβ３を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＴＧＦβ３を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、およびＴＧＦβ２］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ５、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはベータグリカンをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、少なくともＴＧＦβ３を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＴＧＦβ３を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、およびＴＧＦβ２］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ５、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはベータグリカンをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、少なくともＴＧＦβＲＩＩを阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＴＧＦβＲＩＩを阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ５、および／またはベータグリカンをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、少なくともＡＬＫ５を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ＡＬＫ５を阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはベータグリカンをさらに阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβアンタゴニストは、少なくともベータグリカンを阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せである。一部の実施形態では、ベータグリカンを阻害するポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、１つまたは複数のリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３］、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ５、および／またはＴＧＦβＲＩＩをさらに阻害する。

【0273】

本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストは、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ分子［例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）］、アプタマー、および／またはリボザイムであってもよい。ヒトＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＧＦβＲＩＩ、ベータグリカン、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、およびベータグリカンの核酸ならびにアミノ酸配列は、当技術分野で公知であり、したがって、本開示の方法に従って使用するためのポリヌクレオチドアンタゴニストは、当業者であれば、当技術分野の知識および本明細書で提供された教示に基づき、日常的に製作することができる。

【0274】

例えば、アンチセンス技術を使用して、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡにより、または三重らせん形成により遺伝子発現を制御することができる。アンチセンス技法は、例えば、Okano（１９９１年）J. Neurochem. ５６巻：５６０頁；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression、CRC Press、Boca Raton、Fla.（１９８８年）で考察されている。三重らせん形成は、例えば、Cooneyら（１９８８年）Science ２４１巻：４５６号；およびDervanら（１９９１年）Science ２５１巻：１３００頁で考察されている。本方法は、相補的ＤＮＡまたはＲＮＡに対するポリヌクレオチドの結合に基づく。一部の実施形態では、アンチセンス核酸は、所望の遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも部分に相補的な一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ配列を含む。しかしながら、絶対的な相補性は、好ましいものの、必要というわけではない。

【0275】

本明細書で参照されている「ＲＮＡの少なくとも部分に相補的な」配列は、ＲＮＡとハイブリダイズして、安定的な二重鎖を形成することができるような十分な相補性を有する配列を意味する。したがって、本明細書で開示された遺伝子の二本鎖アンチセンス核酸の場合、二重鎖ＤＮＡの一本鎖を試験してもよく、また、三重鎖形成をアッセイしてもよい。ハイブリダイズする能力は、相補性の度合いおよびアンチセンス核酸の長さの両方に依存するであろう。一般に、ハイブリダイズする核酸が大きいほど、ＲＮＡとの塩基ミスマッチがより多く含まれる場合があるが、それでも安定的な二重鎖（または場合によっては三重鎖）を形成することができる。当業者であれば、ハイブリダイズされた複合体の融点を決定するための標準的手順を使用することにより、許容可能なミスマッチの度合いを確かめることができる。

【0276】

メッセージの５’末端、例えば、ＡＵＧ開始コドンまでおよびそれを含む５’－非翻訳配列に相補的なポリヌクレオチドは、翻訳の阻害に最も効率的に作用するはずである。しかしながら、ｍＲＮＡの３’－非翻訳配列に相補的な配列も同様に、ｍＲＮＡの翻訳阻害に効果的であることが示されている［例えば、Wagner, R.、（１９９４年）Nature ３
７２巻：３３３～３３５頁を参照］。したがって、本開示の遺伝子の５’－または３’－非翻訳非コード領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチドを、内因性ｍＲＮＡの翻訳を阻害するためのアンチセンス手法に使用することができる。ｍＲＮＡの５’－非翻訳領域に相補的ポリヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補体を含むべきである。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスポリヌクレオチドは、それほど効率的でない翻訳阻害剤であるが、本開示の方法に従って使用することができるであろう。本開示のｍＲＮＡの５’－非翻訳、３’－非翻訳、またはコード領域のいずれにハイブリダイズするように設計されているかに関わらず、アンチセンス核酸は、長さが少なくとも６個のヌクレオチドであるべきであり、好ましくは、長さが６から約５０個ヌクレオチドまでの範囲のオリゴヌクレオチドである。具体的な態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０個のヌクレオチド、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも２５個のヌクレオチド、または少なくとも５０個のヌクレオチドである。

【0277】

一実施形態では、本開示のアンチセンス核酸は、外因性配列からの転写により細胞内で産生される。例えば、ベクターまたはその部分が転写されて、本開示の遺伝子のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）が産生される。そのようなベクターは、所望のアンチセンス核酸をコードする配列を含むことになる。そのようなベクターは、転写されて、所望のアンチセンスＲＮＡを産生することができる限り、エピソームのままであってもよく、または染色体に組み込まれてもよい。そのようなベクターは、当技術分野で標準的な組換えＤＮＡ技術法により構築することができる。ベクターは、脊椎動物細胞での複製および発現に使用されるプラスミド、ウイルス、または当技術分野で公知の他のものであってもよい。本開示の所望の遺伝子をコードする配列またはその断片の発現は、脊椎動物細胞、好ましくはヒト細胞で作用する当技術分野で公知の任意のプロモーターによるものであってもよい。そのようなプロモーターは、誘導可能であってもよく、または構成的であってもよい。そのようなプロモーターとしては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：ＳＶ４０初期プロモーター領域［例えば、BenoistおよびChambon（１９８１年）Nature ２９巻：３０４～３１０頁を参照］、ラウス肉腫ウイルスの３’ロングターミナルリピートに含まれているプロモーター［例えば、Yamamotoら（１９８０年）Cell ２２巻：７８７～７９７頁を参照］、ヘルペスチミジンプロモーター［例えば、Wagnerら（１９８１年）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. ７８巻：１４４１～１４４５頁を参照］、メタロチ
オネイン遺伝子の調節配列［例えば、Brinsterら（１９８２年）Nature ２９６巻：３９～４２頁を参照］。

【0278】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドアンタゴニストは、１つまたは複数の遺伝子の発現を標的とする干渉ＲＮＡまたはＲＮＡｉ分子である。ＲＮＡｉは、標的ｍＲＮＡの発現に干渉するＲＮＡの発現を指す。具体的には、ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）を介して特異的なｍＲＮＡと相互作用することにより、標的遺伝子をサイレンシングする。その後、ｄｓＲＮＡ複合体は、細胞による分解の標的となる。ｓｉＲＮＡ分子は、長さが１０～５０個ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡ二重鎖であり、十分に相補的である（例えば、遺伝子と少なくとも８０％同一である）標的遺伝子の発現に干渉する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列と、少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0279】

追加のＲＮＡｉ分子としては、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられ、短鎖干渉ヘアピンおよびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）も挙げられる。ｓｈＲＮＡ分子は、ループにより接続されている、標的遺伝子に由来するセンスおよびアンチセンス配列を含んでいる。ｓｈＲＮＡは、核から細胞質内へと輸送され、ｍＲＮＡと共に分解される。Ｐｏｌ
ＩＩＩまたはＵ６プロモーターを使用して、ＲＮＡｉ用のＲＮＡを発現させることができる。Paddisonら［Genes & Dev.（２００２年）１６巻：９４８～９５８頁、２００２年］は、ＲＮＡｉを達成する手段として、ヘアピンにフォールディングした小ＲＮＡ分子を使用している。したがって、そのような短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子も、本明細書に記載の方法で有利に使用される。機能性ｓｈＲＮＡのステムおよびループの長さは様々であり、ステム長は、約２５から約３０ｎｔまでのいずれの範囲であってもよく、ループサイズは、４～約２５ｎｔの範囲であってもよく、サイレンシング活性に影響を及ぼさない。任意の特定の理論により束縛されることは望まないが、こうしたｓｈＲＮＡは、ＤＩＣＥＲ ＲＮａｓｅの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）産物と相似しており、任意の事象において、特定遺伝子の発現を阻害する同じ能力を有すると考えられる。ｓｈＲＮＡは、レンチウイルスのベクターから発現させることができる。ｍｉＲＮＡは、「ステム－ループ」構造により特徴付けられるプレｍｉＲＮＡとして最初に転写され、その後、ＲＩＳＣによりさらにプロセシングされた後、成熟ｍｉＲＮＡへとプロセシングされる、長さが約１０～７０個ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡである。

【0280】

ｓｉＲＮＡが挙げられるがそれに限定されない、ＲＮＡｉを媒介する分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで化学合成により（Hohjoh、FEBS Lett、５２１巻：１９５～１９９頁、２００２年）、ｄｓＲＮＡの加水分解により（Yangら、Proc Natl Acad Sci USA ９９巻：９９４２～９９４７頁、２００２年）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼでのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により（Donzeetら、Nucleic Acids Res ３０巻：ｅ４６頁、２００２年、Yuら、Proc Natl Acad Sci USA ９９巻：６０４７～６０５２頁、２００２年）、およびＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ ＩＩＩなどのヌクレアーゼを使用した二本鎖ＲＮＡの加水分解により（Yangら、Proc Natl Acad Sci USA ９９巻：９９４２～９９４７頁、２００２年）産生することができる。

【0281】

別の態様によると、本開示は、デコイＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、複合体化ＤＮＡ、被包性ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ネイキッドＲＮＡ、被包性ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ干渉を生じさせることが可能な分子、またはそれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されないポリヌクレオチドアンタゴニストを提供する。

【0282】

一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストは、アプタマーである。アプタマーは、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＴＧＦβＲＩＩ、ベータグリカン、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＴＧＦβＲＩＩ、および／またはベータグリカンポリペプチドなどの標的分子に結合し、標的分子に特異的に結合する三次構造を形成する、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＲＮＡ分子を含む核酸分子である。アプタマーの生成および治療使用は、当技術分野で十分に確立されている。例えば、米国特許第５，４７５，０９６号を参照されたい。アプタマーに関する追加情報は、米国特許出願公開第２００６０１４８７４８号に見出すことができる。核酸アプタマーは、当技術分野で公知の方法を使用して、例えば、指数関数的濃縮によるリガンドの体系的進化（ＳＥＬＥＸ、Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）プロセスにより選択される。ＳＥＬＥＸは、標的分子に対して高度な特異的結合
性を有する核酸分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで進化させるための方法であり、例えば、米国特許第５，４７５，０９６号、第５，５８０，７３７号、第５，５６７，５８８号、第５，７０７，７９６号、第５，７６３，１７７号、第６，０１１，５７７号、および第６，６９９，８４３号に記載されている。アプタマーを特定するための別のスクリーニング法が、米国特許第５，２７０，１６３号に記載されている。ＳＥＬＥＸプロセスは、様々な二次元または三次元構造を形成する核酸の能力、ならびに単量体であるかまたは多量体であるかに関わらず、他の核酸分子およびポリペプチドを含む、事実上あらゆる化学的化合物に対するリガンドとして作用する（特異的結合対を形成する）、ヌクレオチドモノマー内で利用可能な化学的汎用性に基づく。任意のサイズまたは組成の分子が、標的としての役目を果たすことができる。ＳＥＬＥＸ法は、混合物から候補オリゴヌクレオチドを選択すること、ならびに同じ基本選択スキームを使用して、結合、分割、および増幅の段階的反復を行い、所望の結合親和性および選択性を達成することを含む。ＳＥＬＥＸ法は、ランダム化配列のセグメントを含んでいてもよい核酸の混合物から開始し、結合に有利な条件下で混合物を標的と接触させるステップ、標的分子に特異的に結合した核酸から未結合核酸を分割するステップ、核酸－標的複合体を解離させるステップ、核酸－標的複合体から解離した核酸を増幅して、核酸のリガンド濃縮混合物を産出するステップを含む。結合、分割、解離、および増幅ステップを、所望のサイクル回数だけ繰り返して、標的分子に対して高度に特異的な高親和性核酸リガンドを産出する。

【0283】

そのような結合性分子は、典型的には、別々に動物に投与されるが［例えば、O'Connor（１９９１年）J. Neurochem. ５６巻：５６０頁を参照］、そのような結合性分子は、宿主細胞により取り込まれたポリヌクレオチドからｉｎ ｖｉｖｏで発現させることもでき、ｉｎ ｖｉｖｏで発現させることもできる［例えば、Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression、CRC Press、Boca Raton、Fla.（１９
８８年）を参照］。

【0284】

７．ホリスタチンおよびＦＬＲＧアンタゴニスト
他の態様では、本明細書で開示された方法に従って使用するためのＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（阻害剤）は、ホリスタチンまたはＦＬＲＧポリペプチドであり、単独でまたは本明細書で開示されているような１つまたは複数の追加の支持療法および／または活性剤と組み合わせて使用して、所望の効果（例えば、それを必要とする対象の免疫応答を増加させること、および病原体のがんを処置すること）を達成することができる。

【0285】

用語「ホリスタチンポリペプチド」は、ホリスタチンの任意の天然に存在するポリペプチドならびに有用な活性を保持するそれらの任意のバリアント（突然変異体、断片、融合体、およびペプチド模倣形態を含む）を含むポリペプチドを含み、ホリスタチンの任意の機能性単量体または多量体をさらに含む。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のホリスタチンポリペプチドは、アクチビン活性、特にアクチビンＡに結合および／または阻害する。アクチビン結合特性を保持するホリスタチンポリペプチドのバリアントは、ホリスタチンおよびアクチビン相互作用に関する以前の研究に基づいて特定することができる。例えば、国際公開第２００８／０３０３６７号には、アクチビン結合に重要であることが示されている特異的ホリスタチンドメイン（「ＦＳＤ」）が開示されている。下記の配列番号４６～４８に示されているような、ホリスタチンＮ末端ドメイン（「ＦＳＮＤ」配列番号４６）、ＦＳＤ２（配列番号４８）、および程度はより低いがＦＳＤ１（配列番号４７）は、アクチビン結合に重要であるホリスタチン内の例示的なドメインである。加えて、ポリペプチドのライブラリーを製作および試験するための方法は、上記ではＡｃｔＲＩＩポリペプチドの状況に基づいて記載されているが、そのような方法は、ホリスタチンのバリアントの製作および試験にも関する。ホリスタチンポリペプチドとしては、ホリスタチンポリペプチドの配列と少なくとも約８０％同一であり、必要に応じて少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性の配列を有する任意の公知のホリスタチンの配列に由来するポリペプチドが挙げられる。ホリスタチンポリペプチドの例としては、成熟ホリスタチンポリペプチド、または例えば、国際公開第２００５／０２５６０１号に記載のようなヒトホリスタチン前駆体ポリペプチド（配列番号４４）のより短いアイソフォームまたは他のバリアントが挙げられる。

【0286】

ヒトホリスタチン前駆体ポリペプチドアイソフォームＦＳＴ３４４は、以下の通りである：

【化26】

【0287】

シグナルペプチドには下線が引かれており、また、このホリスタチンアイソフォームと、下記に示されているより短いホリスタチンアイソフォームＦＳＴ３１７との相違を示すＣ末端伸長である最後の２７個の残基にも、上記で下線が引かれている。

【0288】

ヒトホリスタチン前駆体ポリペプチドアイソフォームＦＳＴ３１７は、以下の通りである。

【化27】

【0289】

シグナルペプチドには下線が引かれている。

【0290】

ホリスタチンＮ末端ドメイン（ＦＳＮＤ）配列は、以下の通りである。

【化28】

ＦＳＤ１およびＦＳＤ２の配列は、以下の通りである。

【化29】

【0291】

他の態様では、本明細書で開示された方法に従って使用するためのＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、ホリスタチン関連のタンパク質３（ＦＳＴＬ３）としても公知のホリスタチン様関連遺伝子（ＦＬＲＧ）である。用語「ＦＬＲＧポリペプチド」は、ＦＬＲＧの任意の天然に存在するポリペプチドならびに有用な活性を保持するそれらの任意のバリアント（突然変異体、断片、融合体、およびペプチド模倣形態を含む）を含むポリペプチドを含む。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のＦＬＲＧポリペプチドは、アクチビン活性、特にアクチビンＡに結合および／または阻害する。アクチビン結合特性を保持するＦＬＲＧポリペプチドのバリアントは、ＦＬＲＧおよびアクチビン相互作用をアッセイするための日常的な方法を使用して特定することができる（例えば、米国特許第６，５３７，９６６号を参照）。加えて、ポリペプチドのライブラリーを製作および試験するための方法は、上記ではＡｃｔＲＩＩポリペプチドの状況に基づいて記載されているが、そのような方法は、ＦＬＲＧのバリアントの製作および試験にも関する。ＦＬＲＧポリペプチドとしては、ＦＬＲＧポリペプチドの配列と少なくとも約８０％同一であり、必要に応じて少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％。またはそれよりも高い同一性の配列を有する任意の公知のＦＬＲＧの配列に由来するポリペプチドが挙げられる。

【0292】

ヒトＦＬＲＧ前駆体（ホリスタチン関連タンパク質３前駆体）ポリペプチドは、以下の通りである。

【化30】

【0293】

シグナルペプチドには下線が引かれている。

【0294】

ある特定の実施形態では、ホリスタチンポリペプチドおよびＦＬＲＧポリペプチドの機能的バリアントまたは修飾形態としては、ホリスタチンポリペプチドまたはＦＬＲＧポリペプチドの少なくとも部分と、例えば、ポリペプチドの単離、検出、安定化、または多量体化を容易にするドメインなどの少なくとも１つまたは複数の融合ドメインとを有する融合タンパク質が挙げられる。好適な融合ドメインは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドに関して上記で詳細に考察されている。一部の実施形態では、本開示のアンタゴニスト剤は、Ｆｃドメインに融合されたホリスタチンポリペプチドのアクチビン結合性部分を含む融合タンパク質である。別の実施形態では、本開示のアンタゴニスト剤は、Ｆｃドメインに融合されたＦＬＲＧポリペプチドのアクチビン結合性部分を含む融合タンパク質である。

【0295】

８．スクリーニングアッセイ
ある特定の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストである化合物（作用剤）を特定するための、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、および／またはＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の使用に関する。他の態様では、本開示は、ＴＧＦβアンタゴニストである化合物（作用剤）を特定するための、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ５ポリペプチド、および／またはベータグリカンポリペプチドの使用に関する。このスクリーニングにより特定される化合物を試験して、骨、軟骨、筋肉、脂肪、および／またはニューロンなどの組織をモジュレートする能力を評価すること、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで組織成長をモジュレートする能力を評価することができる。こうした化合物は、例えば、動物モデルで試験することができる。

【0296】

ＴＧＦβスーパーファミリーリガンドシグナル伝達（例えば、ＳＭＡＤシグナル伝達）を標的とすることにより組織成長をモジュレートするための治療剤をスクリーニングするための手法は多数存在する。ある特定の実施形態では、化合物のハイスループットスクリーニングを実施して、選択された細胞株に対するＴＧＦβスーパーファミリー受容体媒介性効果を妨害する作用剤を特定することができる。ある特定の実施形態では、アッセイを実施して、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ５ポリペプチド、および／またはベータグリカンの、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびレフティを含む結合パートナーへの結合を特異的に阻害または低減する化合物をスクリーニングおよび特定する。あるいは、アッセイを使用して、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ５ポリペプチド、および／またはベータグリカンの、リガンドなどの結合パートナーへの結合を増強する化合物を特定することができる。さらなる実施形態では、化合物は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ５ポリペプチド、および／またはベータグリカンと相互作用する能力により特定することができる。

【0297】

様々なアッセイ形式が十分であり、当業者であれば、本開示に照らして、本明細書に明示的に記載されていないものでも、やはり理解することになるであろう。本明細書に記載されているように、本発明の試験化合物（作用剤）は、任意のコンビナトリアル化学法により生成することができる。あるいは、本主題の化合物は、天然に存在する生体分子であってもよく、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで合成されてもよい。組織成長のモジュレーターとして作用する能力について試験しようとする化合物（作用剤）は、例えば、細菌、酵母、植物、または他の生物により産生されてもよく（例えば、天然産物）、化学的に生産してもよく（例えば、ペプチド模倣物を含む低分子）、または組換え的に産生してもよい。本発明により企図される試験化合物としては、非ペプチジル有機分子、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、糖、ホルモン、および核酸分子が挙げられる。ある特定の実施形態では、試験剤は、約２，０００ダルトン未満の分子量を有する小有機分子である。

【0298】

本開示の試験化合物は、単一の個別の実体として提供してもよく、またはコンビナトリアルケミストリーにより製作されたものなど、複雑性がより高いライブラリーで提供してもよい。こうしたライブラリーは、例えば、アルコール、ハロゲン化アルキル、アミン、アミド、エステル、アルデヒド、エーテル、および他のクラスの有機化合物を含んでいてもよい。試験系に対する試験化合物の提示は、特に初期スクリーニングステップでは、化合物の単離形態で、または混合物としてのいずれであってもよい。必要に応じて、化合物は、必要に応じて、他の化合物で誘導体化され、化合物の単離を容易にする誘導体化基を有していてもよい。誘導体化基の非限定的な例としては、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン（digoxygenin）、緑色蛍光タンパク質、同位体、ポリヒスチジン、磁気ビ
ーズ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、光活性化可能な架橋剤、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。

【0299】

化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多数の薬物スクリーニングプログラムでは、所与の期間に調査する化合物の数を最大化するために、ハイスループットアッセイが望ましい。迅速な開発、および試験化合物により媒介される分子標的における変更の比較的容易な検出を可能にするように生成することができる点で、精製または半精製タンパク質を用いて得ることができるものなどの無細胞系で実施されるアッセイが、「一次」スクリーニングとして好ましいことが多い。さらに、試験化合物の細胞傷害性または生物学的利用能の影響は、一般に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系では無視することができ、その代わり、アッセイでは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ５ポリペプチド、および／またはベータグリカンと、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびレフティを含む結合パートナーとの結合親和性の変更として顕在化する場合がある、分子標的に対する薬物の効果に主眼がおかれる。

【0300】

例示のために過ぎないが、本開示の例示的なスクリーニングアッセイでは、目的の化合物を、通常はＴＧＦβスーパーファミリーリガンドに結合することが可能な単離および精製ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体と、アッセイの意図に見合うように接触させる。その後、化合物およびＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体の混合物を、適切なリガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびレフティ）を含む組成物に添加する。ヘテロ多量体－スーパーファミリーリガンド複合体の検出および定量化は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体とその結合タンパク質との複合体形成の阻害（または強化）に対する化合物の有効性を決定するための手段を提供する。化合物の有効性は、種々の濃度の試験化合物を使用して得られるデータから用量応答曲線を作成することにより評価することができる。さらに、対照アッセイを実施して、比較のためにベースラインを提供することもできる。例えば、対照アッセイでは、単離および精製リガンドを、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体を含む組成物に添加し、ヘテロ多量体－リガンド複合体の形成を、試験化合物の非存在下で定量化する。一般に、反応物を混合することができる順序は様々であってもよく、同時に混合してもよいことが理解されるであろう。さらに、精製タンパク質の代わりに、細胞抽出物および溶解物を使用して、好適な無細胞アッセイ系を実現してもよい。

【0301】

ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ５ポリペプチド、および／またはベータグリカンの、別のタンパク質への結合は、様々な技法により検出することができる。例えば、複合体の形成のモジュレーションは、例えば、放射性標識された（例えば、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、または^３Ｈ）、蛍光標識された（例えば、ＦＩＴＣ）、または酵素標識されたＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ５ポリペプチド、および／またはベータグリカン、および／または結合タンパク質などの検出可能な標識タンパク質を使用してイムノアッセイにより、またはクロマトグラフィー検出により、定量化することができる。

【0302】

ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ５ポリペプチド、および／またはベータグリカンと結合タンパク質との相互作用の度合いが直接的または間接的のいずれかで測定される蛍光偏光アッセイおよび蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）アッセイの使用を企図する。さらに、光導波路（ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２６４３２および米国特許第５，６７７，１９６号）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、表面電荷センサー、および表面力センサー（surface force sensor）に基づくものなど、他の検出モードが、本開示の多数の実施形態に適合する。

【0303】

さらに、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ５ポリペプチド、および／またはベータグリカンと結合パートナーとの相互作用を妨害または強化する作用剤を特定するための、「ツーハイブリッドアッセイ」としても公知の相互作用トラップアッセイの使用を企図する。例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Zervosら（１９９３年）Cell ７２巻：２２３～２３２頁；Maduraら（１９９３年）J Biol Chem ２６８巻
：１２０４６～１２０５４頁；Bartelら（１９９３年）Biotechniques １４巻：９２０
～９２４頁；およびIwabuchiら（１９９３年）Oncogene ８巻：１６９３～１６９６頁を参照されたい。具体的な実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ５ポリペプチド、および／またはベータグリカンと結合タンパク質との相互作用を解離させる化合物（例えば、低分子またはペプチド）を特定するための逆ツーハイブリッド系の使用を企図する［VidalおよびLegrain、（１９９９年）Nucleic Acids Res ２
７巻：９１９～２９頁；VidalおよびLegrain、（１９９９年）Trends Biotechnol １７巻：３７４～８１頁；ならびに米国特許第５，５２５，４９０号；第５，９５５，２８０号；および第５，９６５，３６８号］。

【0304】

ある特定の実施形態では、本主題の化合物は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ５ポリペプチド、および／またはベータグリカンと相互作用する能力により特定される。化合物と、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ５ポリペプチド、および／またはベータグリカンとの相互作用は、共有結合であってもよく、または非共有結合であってもよい。例えば、そのような相互作用は、タンパク質レベルでは、光架橋、放射性標識リガンド結合、および親和性クロマトグラフィーを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ生化学法を使用して特定することができる［Jakoby WBら（１９７４年）Methods in Enzymology
４６巻：１頁］。ある特定の場合では、化合物は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ５ポリペプチド、および／またはベータグリカンに結合する化合物を検出するためのアッセイなど、機序に基づくアッセイでスクリーニングすることができる。これは、固相または流体相の結合事象を含んでいてもよい。あるいは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ４ポリペプチド、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ多量体、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、ＡＬＫ５ポリペプチド、および／またはベータグリカンをコードする遺伝子を、レポーター系（例えば、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、または緑色蛍光タンパク質）と共に、細胞にトランスフェクトし、好ましくはハイスループットスクリーニングにより、ライブラリーに対して、またはライブラリーの個々のメンバーを用いてスクリーニングしてもよい。他の機序に基づく結合アッセイ、例えば、自由エネルギーの変化を検出する結合アッセイを使用してもよい。結合アッセイは、ウェル、ビーズ、またはチップに固定されているか、または固定された抗体により捕捉されているか、またはキャピラリー電気泳動により分離された標的を用いて実施することができる。結合した化合物は、通常、比色定量エンドポイントまたは蛍光もしくは表面プラズモン共鳴を使用して検出することができる。

【0305】

９．例示的な治療使用
本明細書に記載されているように、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（阻害剤）およびＴＧＦβアンタゴニストは、単独でまたは組合せで、がん患者の腫瘍負荷減少および生存期間増加に驚くべき効果を示すことが発見された。したがって、本開示は、部分的には、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよびＴＧＦβアンタゴニストを、単独でまたは組み合わせて、必要に応じて、１つまたは複数の追加の支持療法および／または活性剤と組み合わせて使用して、がんを処置するための、特にがんの１つまたは複数の合併症を処置または予防するための（例えば、腫瘍負荷を低減するための）方法を提供する。加えて、データは、ＡｃｔＲＩＩおよびＴＧＦβアンタゴニスト療法の有効性が、免疫系に依存することを示す。したがって、部分的には、本開示は、ＡｃｔＲＩＩおよびＴＧＦβアンタゴニストを、単独でまたは組み合わせて、免疫療法剤として使用して、特に、幅広く様々ながん（例えば、免疫抑制および／または免疫疲弊に関連するがん）を処置することができるという発見に関する。他の公知の免疫腫瘍学的作用剤と同様に、ＡｃｔＲＩＩおよび／またはＴＧＦβアンタゴニストが患者の免疫応答を強化する能力は、がん分野以外でもより幅広い治療的意義を有する場合がある。例えば、免疫強化剤が、幅広く様々な感染性疾患、特に免疫抑制および／または免疫疲弊を促進する病原性因子の処置に有用であり得ることが提案されている。また、そのような免疫強化剤は、ワクチン（例えば、病原体およびがんワクチン）の免疫化有効性のブーストに有用であり得る。したがって、本開示は、単独でまたは組み合わせて、必要に応じて１つまたは複数の追加の支持療法および／または活性剤と共に使用して、それを必要とする対象の免疫応答を増加させ、がんを処置し、感染性疾患を処置し、および／またはワクチン接種／免疫化有効性を増加させることができる種々のＡｃｔＲＩＩおよびＴＧＦβアンタゴニストを提供する。

【0306】

本明細書で記載および特許請求されている方法ならびにＡｃｔＲＩＩおよびＴＧＦβアンタゴニストを、単独でまたは組み合わせて使用して、悪性または前がん性状態を処置することができ、限定ではないが、本明細書に記載されている障害を含む、新生物性または悪性状態への進行を予防することができる。そのような使用は、新生物またはがんへの進行が進み、特に、過形成、化生、またはもっとも著しくは形成異常からなる非新生物性細胞成長が生じることが知られているかまたは疑われる状態に適用される。

【0307】

本明細書で使用される場合、障害または状態を「予防」する治療剤は、統計学的試料において、未処置対照試料と比較して、処置試料での障害または状態の発生を低減するか、または未処置対照試料と比較して、障害または状態の１つまたは複数の症状の発症を遅延するかまたは重症度を低減する化合物を指す。

【0308】

用語「処置すること」は、本明細書で使用される場合、それが確立された後の状態の軽快または解消を含む。いずれの場合でも、予防または処置は、医師または他の医療従事者、および治療剤の投与の意図されている結果により提供される診断の際に見極めることができる。

【0309】

一般に、本開示に記載されている疾患または状態の処置または予防は、ＡｃｔＲＩＩおよび／またはＴＧＦβアンタゴニストの１つまたは複数を有効量で投与することにより達成される。作用剤の有効量は、投薬量および所要期間で所望の治療または予防結果を達成するために有効な量を指す。本開示の作用剤の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重などの要因、ならびに個体において所望の応答を誘発する作用剤の能力に応じて、さまざまであってもよい。予防有効量は、投薬量および所要期間で所望の予防結果を達成するために有効な量を指す。

【0310】

一般に、「腫瘍」は、良性および悪性がんならびに潜伏腫瘍を指す。一般に、「がん」は、一次悪性細胞または腫瘍（例えば、その細胞が、元の悪性腫瘍または腫瘍の部位以外の対象の体内の部位に遊走していないもの）、および二次悪性細胞または腫瘍（例えば、転移、つまり悪性細胞または腫瘍細胞が、元の腫瘍の部位とは異なる二次部位へと遊走することから生じるもの）を指す。転移は、局所的である場合もあり、または離れている場合もある。転移は、具体的な症状のモニタリングに加えて、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャン、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、血液および血小板数、肝機能検査、胸部Ｘ線、骨スキャン、およびそれらの組合せを、単独でまたは組み合わせて使用することにより検出されることが最も多い。

【0311】

一般に、免疫応答は、刺激に対する、Ｂ細胞、Ｔ細胞（ＣＤ４またはＣＤ８）、調節性Ｔ細胞、抗原提示細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、好塩基球、好酸球、または好中球などの、免疫系の細胞による応答を指す。一部の実施形態では、応答は、特定の抗原に特異的であり（「抗原特異的応答」）、それらの抗原特異的受容体を介したＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、またはＢ細胞による応答を指す。一部の実施形態では、免疫応答は、ＣＤ４＋応答またはＣＤ８＋応答などのＴ細胞応答である。こうした細胞によるそのような応答としては、例えば、細胞傷害、増殖、サイトカインもしくはケモカイン産生、輸送、またはファゴサイトーシスを挙げることができ、応答を起こす免疫細胞の性質に依存する場合がある。免疫応答は、侵入病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、がん性もしくは他の異常細胞、または自己免疫もしくは病理学的炎症の場合は、正常な細胞もしくは組織を選択的に標的とし、結合し、損傷し、破壊し、および／または体内からの排除をもたらすことができる。

【0312】

宿主免疫応答の免疫抑制は、持続性感染および腫瘍免疫抑制など、様々な慢性免疫状態に役割を果たす。本明細書で使用される場合、免疫系に関する「不応答性」または「機能的疲弊」は、一般に、活性化受容体またはサイトカインによる刺激などの刺激に対する、免疫細胞の不応性（refractivity）を指す。不応答性は、例えば、免疫抑制剤への曝露、高用量または継続用量の抗原への曝露のため、またはＰＤ－１もしくはＴＩＭ－３などの阻害剤受容体の活性により生じる場合がある。本明細書で使用される場合、用語「不応答性」は、活性化刺激に対する不応性を含む。そのような不応性は、一般に、抗原特異的であり、抗原への曝露が途絶えた後も持続する。不応答性免疫細胞は、同じタイプの対応する対照免疫細胞と比べて、細胞傷害活性、サイトカイン産生、増殖、輸送、ファゴサイトーシス活性、またはそれらの任意の組合せの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはさらに１００％の低減を示す場合がある。

【0313】

一般に、免疫療法は、免疫応答を誘導、増強、抑制、またはそうでなければ修飾することを含む方法により、疾患に罹患しているか、または罹るリスクがあるか、または再発を被っている対象を処置することを指す。

【0314】

一般に、免疫応答の強化は、対象の既存の免疫応答の有効性または効力を活性化または増加させることを指す。有効性および効力のこうした活性化または増加は、例えば、内因性宿主免疫応答を抑制する機序を克服することにより、または内因性宿主免疫応答を活性化／増強する機序を刺激することにより達成することができる。

【0315】

本開示のＡｃｔＲＩＩおよびＴＧＦβアンタゴニストは、単独でまたは組み合わせて、これらに限定されないが、以下のものを含む、種々の形態のがんの処置に使用することができる：膀胱、胸腺、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、頚部、膵臓、直腸、前立腺、胃、表皮のがん；リンパ系統または骨髄系統の造血器腫瘍；線維肉腫または横紋筋肉腫などの間葉由来の腫瘍；黒色腫、奇形癌、神経芽細胞腫、神経膠腫、腺癌、および非小肺細胞癌腫などの他の腫瘍タイプ。がんの例としては、これらに限定されないが、癌腫、リンパ腫、神経膠芽腫、黒色腫、肉腫、および白血病、ミエローマ、またはリンパ系悪性腫瘍が挙げられる。そのようながんのより特定の例は下記に示されており、以下のものが挙げられる：扁平上皮がん（例えば、上皮扁平上皮がん）、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、星状細胞腫、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、および肺扁平上皮癌を含む肺がん、腹膜のがん、肝細胞がん、消化管がんを含む胃部または胃がん、膵臓がん、多形性神経膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、ヘパトーマ、肝細胞癌、神経内分泌腫瘍、髄様甲状腺がん、分化甲状腺癌、乳がん、卵巣がん、結腸がん、直腸がん、子宮内膜がんまたは子宮癌、唾液腺癌、腎臓がんまたは腎がん、前立腺がん、外陰がん、肛門癌、陰茎癌、ならびに頭頸部がん。

【0316】

がんまたは悪性腫瘍の他の例としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：急性幼年期リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病（Acute Lymphoblastic Leukemia）、急性リンパ性白血病（Acute Lymphocytic Leukemia）、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、成人（原発性）肝細胞がん、成人（原発性）肝臓がん、成人急性リンパ性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝臓がん、成人軟組織肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ＡＩＤＳ関連悪性腫瘍、肛門がん、星状細胞腫、胆管がん、骨がん、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳がん、腎盂および尿管のがん、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星細胞腫、大脳星状細胞腫、子宮頸がん、幼年期（原発性）肝細胞がん、幼年期（原発性）肝臓がん、幼年期急性リンパ性白血病、幼年期急性骨髄性白血病、幼年期脳幹神経膠腫、幼年期小脳星細胞腫、幼年期大脳星状細胞腫、幼年期頭蓋外胚細胞腫瘍、幼年期ホジキン病、幼年期ホジキンリンパ腫、幼年期視床下部および視路膠腫、幼年期リンパ芽球性白血病、幼年期髄芽細胞腫、幼年期非ホジキンリンパ腫、幼年期松果体およびテント上未分化神経外胚葉性腫瘍、幼年期原発性肝臓がん、幼年期横紋筋肉腫、幼年期軟部組織肉腫、幼年期視路および視床下部神経膠腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸がん、悪性皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌膵島細胞癌、子宮内膜がん、脳室上衣細胞腫、上皮がん、食道がん、ユーイング肉腫および関連腫瘍、膵外分泌がん、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝臓外胆管がん、眼がん、女性乳がん、ゴーシェ病、胆嚢がん、胃がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管腫瘍、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、毛様細胞性白血病、頭頸部がん、肝細胞がん、ホジキンリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、下咽頭がん、腸がん、眼球内黒色腫、島細胞癌、島細胞膵臓がん、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭がん、口唇および口腔がん、肝臓がん、肺がん、リンパ増殖性障害、マクログロブリン血症、男性乳がん、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽細胞腫、黒色腫、中皮腫、転移性潜在性原発性扁平上皮頚部がん、転移性原発性扁平上皮頚部がん、転移性扁平上皮頚部がん、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、骨髄白血病、骨髄増殖性障害、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽腔がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚がん、非小細胞肺がん、潜在性原発性転移性扁平上皮頚部がん、口腔咽頭がん、骨肉腫／悪性繊維性肉腫、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、骨肉腫／骨悪性線維性組織球腫、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、低悪性度卵巣腫瘍、膵臓がん、パラプロテイン血症、副甲状腺がん、陰茎がん、褐色細胞腫、下垂体部腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝臓がん、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、腎盂および尿管がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚がん、小細胞肺がん、小腸がん、軟組織肉腫、扁平上皮頚部がん、胃がん、テント上原発性神経外胚葉および松果体部腫瘍、Ｔ細胞性リンパ腫、精巣がん、胸腺腫、甲状腺がん、腎盂および尿管移行細胞がん、移行性腎盂および尿管がん、絨毛性腫瘍、尿管および腎盂細胞がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、視路および視床下部神経膠腫、外陰がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、ならびに上記に列挙されている臓器系に位置する、新生物に加えて、任意の他の過剰増殖性疾患。

【0317】

形成異常は、がんの前兆であることが多く、主に上皮に見出される。それは、個々の細胞均一性および細胞の構築配向性の喪失を含む、非新生物性細胞成長の最も無秩序な形態である。特徴的には、慢性刺激または炎症が存在する場合に形成異常が生じる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを、必要に応じて１つまたは複数の追加の支持療法および／または活性剤と組み合わせて使用して、形成異常障害を処置することができる。形成異常障害としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：無汗性外胚葉性形成異常、前後形成異常、窒息性胸郭形成異常、心房指形成異常、気管支肺異形成症、大脳形成異常、子宮頸部形成異常、軟骨外胚葉性形成異常、鎖骨頭蓋骨形成異常、先天性外胚葉性形成異常、頭蓋骨幹形成異常、頭蓋手根足根骨形成異常、頭蓋骨幹端形成異常、象牙質形成異常、骨幹形成異常、外胚葉性形成異常、エナメル形成異常、脳眼形成異常、骨端半肢形成異常、多発性骨端形成異常、点状骨端形成異常、上皮性形成異常、顔面指趾生殖器形成異常、家族性顎骨線維性形成異常、家族性白色襞性形成異常、線維筋性形成異常、線維性骨形成異常、開花性骨形成異常（florid osseous dysplasia）、遺伝性腎網膜形成異常、発汗性外胚葉形成異常、発汗減少性外胚葉性形成異常、リンパ球減少性胸腺形成異常、乳腺形成異常、下顎顔面形成異常、骨幹端形成異常、モンディーニ型内耳形成異常、単骨性線維性形成異常、粘膜上皮形成異常、多発性骨端形成異常、眼耳脊椎形成異常、眼歯指形成異常、眼脊椎異形成、歯牙形成異常、眼下顎形成異常（opthalmomandibulomelic dysplasia）、根尖性セメント質形成異常、多骨性線維性骨形成異常、偽
軟骨発育不全脊椎骨端形成異常、網膜形成異常、中隔視神経形成異常、脊椎骨端形成異常、および心室橈骨形成異常。

【0318】

必要に応じて、１つまたは複数の追加の支持療法および／または活性剤と組み合わせて、ＡｃｔＲＩＩおよび／またはＴＧＦβアンタゴニストで処置することができる追加の前新生物性障害としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：良性増殖異常障害（例えば、良性腫瘍、繊維嚢胞性状態、組織肥大、腸管ポリープまたは腺腫、および食道形成異常）、白斑症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、日光口唇炎、および日光角化症。

【0319】

必要に応じて、１つまたは複数の追加の支持療法および／または活性剤と組み合わせて、ＡｃｔＲＩＩおよび／またはＴＧＦβアンタゴニストで処置することができる追加の過剰増殖性疾患、障害、および／または状態としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、および赤白血病を含む）を含む）および慢性白血病（例えば、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）を含む）、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病などの悪性腫瘍および関連障害の進行および／または転移、ならびにこれらに限定されないが、以下のものを含む固形腫瘍：線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫（emangioblastoma）、聴神経腫、乏突起細胞腫、髄膜
腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫などの、肉腫および癌腫。

【0320】

ある特定の態様では、細胞傷害剤、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤、免疫調節剤、抗生物質、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、ケモカイン、薬物、プロドラッグ、毒素、酵素、または他の活性剤などのがん治療剤を、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩおよび／またはＴＧＦβアンタゴニストと組み合わせて使用することができる。有用な薬物は、例えば、抗有糸分裂剤、抗キナーゼ剤、アルキル化剤、抗代謝剤、抗生物質、アルカロイド、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤、およびそれらの組合せから選択される医薬品特性を有していてもよい。

【0321】

本明細書で使用される場合、「と組み合わせて」、「共投与」、「共に」は、追加の治療（例えば、第２の、第３の、第４のなど）が、体内で依然として有効であるような（例えば、複数の化合物は、患者において同時に有効であり、こうした化合物の相乗効果を含むことができる）、投与の任意の形態を指す。有効性は、血液、血清、または血漿中の作用剤の測定可能な濃度に相関しない場合がある。例えば、異なる治療化合物を、同じ製剤中でまたは別々の製剤中でのいずれかで、同時にまたは連続的のいずれかで、異なるスケジュールで投与してもよい。したがって、そのような処置を受ける個体は、異なる治療の併用効果から利益を得ることができる。本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩおよび／またはＴＧＦβアンタゴニストは、１つまたは複数の他の追加の作用剤および／または支持療法と同時に、その前に、またはその後に投与してもよい。一般に、各治療剤は、その特定の作用剤のために決定された用量および／または時間スケジュールで投与されることになる。レジメンに使用される特定の組合せは、本開示のアンタゴニストと、療法および／または所望のものとの適合性を考慮に入れることになる。

【0322】

有用な例示的な薬物としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：フルオロウラシル、アファチニブ、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、アキシチニブ、アミノグルテチミド、アムサクリン、ＡＶＬ－１０１、ＡＶＬ－２９１、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ブセレリン、ボルテゾミブ、ボスチニブ、ビカルタミド、ブリオスタチン－１、ブスルファン、カペシタビン、カリケアマイシン（calicheamycin）、カンプトテシン、カルボプラチン、１０－ヒドロキシカンプトテシ
ン、カルムスチン、セレブレックス、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、Ｃｏｘ－２阻害剤、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、ＳＮ－３８、クラドリビン、カンプトテシン（camptothecan）、クリゾチニブ、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、シプロテロン、クロドロネート、ダカルバジン、ダサチニブ、ジエネストロール、ジナシクリブ、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、２－ピロリノドキソルビシン（２Ｐ－ＤＯＸ）、シアノ－モルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エルロチニブ、エストラムスチン、エピポドフィロトキシン（epidophyllotoxin）、エルロチニブ、エンチノスタット、エストロゲン受容体結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、エトポシドホスフェート、エキセメスタン、フィルグラスチム、フィンゴリモド、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、フルオキシメステロン、３’，５’－Ｏ－ジオレオイル－ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ－ｄＯ）、フルドロコルチゾン、フルダラビン、フルタミド、ゴセレリン、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、フラボピリドール、フォスタマチニブ、ガネテスピブ、ＧＤＣ－０８３４、ＧＳ－１１０１、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イブルチニブ、イダルビシン、レバミソール、イデラリシブ、イホスファミド、イマチニブ、レトロゾール、アスパラギナーゼ、ロイプロリド、ラパチニブ、レナリドミド（lenolidamide）、ロイコボリン、イリノテカン（ironotecan）、ＬＦＭ－Ａ１３、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６－メルカプトプリン、メゲストロール、メトトレキサート、ミトキサントロン、ニルタミド、ミトラマイシン、ミトマイシン、ノコダゾール、オクトレオチド、ミトタン、ナベルビン、ネラチニブ、ニロチニブ、ニトロソウレア（nitrosurea）、オラパリブ、プリカマイシン（plicomycin）、プロカルバジン、パクリタキセル、オキサリプラチン、ＰＣＩ－３２７６５、ペントスタチン、プリカマイシン、ＰＳＩ－３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、ＳＵ１１２４８、スニチニブ、タモキシフェン、ポルフィマー、テモゾロミド、メスナ、テモゾロミド（temazolomide）（ＤＴＩＣの水性形態）、トランス白金（transplatinum）、サリドマイド、チオグアニン、ラル
チトレキセド、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、バタラニブ、ビノレルビン、ビンブラスチン、リツキシマブ、パミドロネート、ビンクリスチン、ビンカアルカロイド、およびＺＤ１８３９。

【0323】

有用な毒素としては、以下のものを挙げることができる：リシン、アブリン、アルファ毒素、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、例えば、オンコナーゼ、ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌腸毒素Ａ、ポークウィード抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、およびシュードモナス内毒素。

【0324】

有用なケモカインとしては、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ１－アルファ、ＭＩＰ１－ベータ、およびＩＰ－１０を挙げることができる。

【0325】

ある特定の実施形態では、アンギオスタチン、バキュロスタチン（baculostatin）、カンスタチン、マスピン、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＰｌＧＦペプチドおよび抗体、抗血管増殖因子抗体、抗Ｆｌｋ－１抗体、抗Ｆｌｔ－１抗体およびペプチド、抗Ｋｒａｓ抗体、抗ｃＭＥＴ抗体、抗ＭＩＦ（マクロファージ遊走阻害因子）抗体、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン－１２、ＩＰ－１０、Ｇｒｏ－ベータ、トロンボスポンジン、２－メトキシエストラジオール（2-methoxyoestradiol）、プロリフェリ
ン関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール（carboxiamidotriazole）、ＣＭ１０１、マリマスタット、ペントサンポリスルフェート、アンジオポエチン－２、インターフェロン－アルファ、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチン断片、リノミド（ロキニメックス）、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、ＴＮＰ－４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、ａｃｃｕｔｉｎ、アンギオスタチン、シドホビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ－１４７０、血小板第４因子、ＡＬＫ１ポリペプチド（例えば、ダランテルセプト（dalantercept））、またはミノサイクリンなどの抗血管新生剤が、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストと組み合わせて使用するために有用であり得る。

【0326】

有用な免疫調節剤は、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、およびそれらの組合せから選択することができる。具体的には、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのリンホトキシン、インターロイキン（ＩＬ）などの造血因子、果粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子、インターフェロン－アルファ、－ベータ、または－ラムダなどのインターフェロン、および「Ｓ１因子」と呼ばれるものなどの幹細胞増殖因子が有用である。サイトカインの中には、以下のものが含まれる：ヒト成長ホルモン、Ｎ－メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝臓増殖因子；プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質；腫瘍壊死因子－アルファおよび－ベータ；ミューラー管阻害物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ－ベータなどの神経成長因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ－アルファおよびＴＧＦβなどの形質転換増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子－Ｉおよび－ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導性因子；インターフェロン－アルファ、－ベータ、および－ガンマなどのインターフェロン；マクロファージ－ＣＳＦ（Ｍ－ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ－１、ＩＬ－１－アルファ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２；ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２５、ＬＩＦ、ｋｉｔ－リガンド、またはＦＬＴ－３などのインターロイキン（ＩＬ）、アンギオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子、ならびにＬＴ。

【0327】

有用な放射性核種としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：^１１１Ｉｎ、^１７７Ｌｕ、^２１２Ｂｉ、^２１３Ｂｉ、^２１１Ａｔ、^６２Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^９０Ｙ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３２Ｐ、^３３Ｐ、^４７Ｓｃ、^１１１Ａｇ、^６７Ｇａ、^１４２Ｐｒ、^１５３Ｓｍ、^１６１Ｔｂ、^１６６Ｄｙ、^１６６Ｈｏ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１８９Ｒｅ、^２１２Ｐｂ、^２２３Ｒａ、^２２５Ａｃ、^５９Ｆｅ、^７５Ｓｅ、^７７Ａｓ、^８９Ｓｒ、^９９Ｍｏ、^１０５Ｒｈ、^１０９Ｐｄ、^１４３Ｐｒ、^１４９Ｐｍ、^１６９Ｅｒ、^１９４Ｉｒ、^１９８Ａｕ、^１９９Ａｕ、^２１１Ｐｂ、および^２２７Ｔｈ。治療用放射性核種は、好ましくは２０～６，０００ｋｅＶの範囲の、好ましくは、オージェ放射体の場合は６０～２００ｋｅＶの、ベータ放射体の場合は１００～２，５００ｋｅＶの、およびアルファ放射体の場合は４，０００～６，０００ｋｅＶの範囲の崩壊エネルギーを有する。有用なベータ粒子放射核種の最大崩壊エネルギーは、好ましくは２０～５，０００ｋｅＶ、より好ましくは１００～４，０００ｋｅＶ、および最も好ましくは５００～２，５００ｋｅＶである。また、崩壊して実質的にオージェ放射粒子をもたらす放射性核種が好ましい。例えば、Ｃｏ－５８、Ｇａ－６７、Ｂｒ－８０ｍ、Ｔｃ－９９ｍ、Ｒｈ－１０３ｍ、Ｐｔ－１０９、Ｉｎ－１１１、Ｓｂ－１１９、１－１２５、Ｈｏ－１６１、Ｏｓ－１８９ｍ、およびＩｒ－１９２。有用なベータ粒子放射核種の崩壊エネルギーは、好ましくは＜１，０００ｋｅＶ、より好ましくは＜１００ｋｅＶ、および最も好ましくは＜７０ｋｅＶである。また、崩壊して実質的にアルファ粒子を発生させる放射性核種が好ましい。そのような放射性核種としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：Ｄｙ－１５２、Ａｔ－２１１、Ｂｉ－２１２、Ｒａ－２２３、Ｒｎ－２１９、Ｐｏ－２１５、Ｂｉ－２１１、Ａｃ－２２５、Ｆｒ－２２１、Ａｔ－２１７、Ｂｉ－２１３、Ｔｈ－２２７、およびＦｍ－２５５。有用なアルファ粒子放射放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは２，０００～１０，０００ｋｅＶ、より好ましくは３，０００～８，０００ｋｅＶ、および最も好ましくは４，０００～７，０００ｋｅＶである。有用な追加の考え得る放射性同位体としては、以下のものが挙げられる：^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^７５Ｂｒ、^１９８Ａｕ、^２２４Ａｃ、^１２６Ｉ、^１３３Ｉ、^１０３Ｒｕ、^１０５Ｒｕ、^１０７Ｈｇ、^２０３Ｈｇ、^１２１ｍＴｅ、^１２２ｍＴｅ、^１２５ｍＴｅ、^１６５Ｔｍ、^１６７Ｔｍ、^７７Ｂｒ、^１１３ｍＩｎ、^９５Ｒｕ、^９７Ｒｕ、^１６８Ｔｍ、^１９７Ｐｔ、^１０９Ｐｄ、^１０５Ｒｈ、^１４２Ｐｒ、^１４３Ｐｒ、^１６１Ｔｂ、^１６６Ｈｏ、^１９９Ａｕ、^５７Ｃｏ、^５８Ｃｏ、^５１Ｃｒ、^５９Ｆｅ、^７５Ｓｅ、^２０１Ｔｌ、^２２５Ａｃ、^７６Ｂｒ、および^１６９Ｙｂ。

【0328】

一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩおよび／またはＴＧＦβアンタゴニストは、少なくとも１つのアルキル化剤、ニトロソ尿素、抗代謝剤、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤、アントラサイクリン、コルチコステロイドホルモン、性ホルモン、および／または標的化抗腫瘍化合物と組み合わせて使用される。

【0329】

標的化抗腫瘍化合物は、標準的化学療法薬よりも特異的にがん細胞を攻撃するように設計されている薬物である。こうした化合物のほとんどは、ある特定の遺伝子の突然変異を内包する細胞、またはそうした遺伝子のコピーを過剰発現する細胞を攻撃する。一実施形態では、抗腫瘍化合物は、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ）、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）、またはベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）であってもよい。

【0330】

アルキル化剤は、ＤＮＡに直接作用して、がん細胞の増幅を防止する。こうした作用剤は、細胞周期の任意の特定の期に特異的ではない。一実施形態では、アルキル化剤は、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、およびテモゾロミドから選択することができる。

【0331】

抗代謝剤は、ＤＮＡおよびＲＮＡ合成に干渉する薬物のクラスを構成する。こうした作用剤は、細胞周期のＳ期中に作用し、白血病、乳腺、卵巣、および消化管の腫瘍、ならびに他のがんを処置するために一般に使用されている。一実施形態では、抗代謝剤は、５－フルオロウラシル、カペシタビン、６－メルカプトプリン、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン（ａｒａ－Ｃ）、フルダラビン、またはペメトレキセドであってもよい。

【0332】

トポイソメラーゼ阻害剤は、ＤＮＡ複製において重要なトポイソメラーゼ酵素に干渉する薬物である。トポイソメラーゼＩ阻害剤の一部の例としては、トポテカンおよびイリノテカンが挙げられ、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤の一部の代表的な例としては、エトポシド（ＶＰ－１６）およびテニポシドが挙げられる。

【0333】

アントラサイクリンは、ＤＮＡ複製に関与する酵素にも干渉する化学療法薬である。こうした作用剤は、細胞周期のすべての期で作用するため、様々ながんの処置として広く使用されている。一実施形態では、本発明に関して使用されるアントラサイクリンは、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、イダルビシン、またはミトキサントロンであってもよい。

【0334】

腫瘍は、特に、腫瘍抗原に特異的なＴ細胞において、ある特定の免疫チェックポイント経路を利用することにより免疫監視を回避することができる（Pardoll、２０１２年、Nature Reviews Cancer、１２巻：２５２～２６４頁）。がん治療にチェックポイント阻害剤抗体を用いた研究は、以前はがん処置に抵抗性であると考えられていたがん処置に成功している（例えば、OttおよびBhardwaj、２０１３年、Frontiers in Immunology ４巻：３４６頁；MenziesおよびLong、２０１３年、Ther Adv Med Oncol ５巻：２７８～８５頁；Pardoll、２０１２年、Nature Reviews Cancer １２巻：２５２～６４頁；MavilioおよびLugliを参照）。大多数の抗がん剤とは対照的に、チェックポイント阻害剤は、免疫系の内因性抗腫瘍活性を増強するために、腫瘍細胞を直接標的とせず、むしろリンパ球受容体またはそれらのリガンドを標的とする（Pardoll、２０１２年、Nature Reviews Cancer １２巻：２５２～２６４頁）。そのような阻害剤は、主に免疫応答を調節することにより、疾患細胞、組織、または病原体に作用するため、本主題のＡｃｔＲＩＩおよび／もしくはＴＧＦβアンタゴニスト、ＡＤＣ、ならびに／またはそのような作用剤の抗腫瘍効果を増強するインターフェロンなどの、他の治療モダリティと組み合わせて使用することができる。

【0335】

抗ＰＤ１抗体は、黒色腫、非小細胞肺がん、膀胱がん、前立腺がん、結腸直腸がん、頭頸部がん、三種陰性乳がん、白血病、リンパ腫、および腎細胞がんの処置に使用されている（Topalianら、２０１２年、N Engl J Med ３６６巻：２４４３～５４頁；Lipson
ら、２０１３年、Clin Cancer Res １９巻：４６２～８頁；Bergerら、２００８年、Clin Cancer Res １４巻：３０４４～５１頁；Gildener-Leapmanら、２０１３年、Oral
Oncol ４９巻：１０８９～９６頁；MenziesおよびLong、２０１３年、Ther Adv Med
Oncol ５巻：２７８～８５頁）。例示的な抗ＰＤ１抗体としては、ランブロリズマブ
（ＭＫ－３４７５、ＭＥＲＣＫ）、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＡＭＰ－２２４（Ｍｅｒｃｋ）、およびピディリズマブ（ＣＴ－０１１、Ｃｕｒｅｔｅｃｈ Ｌｔｄ．）が挙げられる。抗ＰＤ１抗体は、例えば、ＡＢＣＡＭ（ＡＢ１３７１３２）、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（ＥＨ１２．２Ｈ７、ＲＭＰ１－１４）、およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｊ１０５、Ｊ１１６、ＭＩＨ４）から商業的に入手可能である。

【0336】

抗ＣＴＬ４Ａ抗体は、黒色腫、前立腺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がんの処置の臨床試験に使用されている（RobertおよびGhiringhelli、２００９年、Oncologist １４巻：８４８～６１頁；Ottら、２０１３年、Clin Cancer Res １９巻：５３００頁；Weber、２００７年、Oncologist １２巻：８６４～７２頁；Wadaら、２０１３年、J Transl
Med １１巻：８９頁）。例示的な抗ＣＴＬＡ４抗体としては、イピリムマブ（Ｂｒｉ
ｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）およびトレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒ）が挙げられる。抗ＰＤ１抗体は、例えば、ＡＢＣＡＭ（ＡＢ１３４０９０）、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．（１１１５９－Ｈ０３Ｈ、１１１５９－Ｈ０８Ｈ）、およびＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ（ＰＡ５－２９５７２、ＰＡ５－２３９６７、ＰＡ５－２６４６５、ＭＡ１－１２２０５、ＭＡ１－３５９１４）から商業的に入手可能である。イピリムマブは、最近、転移性黒色腫の処置がＦＤＡ承認された（Wadaら、２０１３年、J Transl Med １１巻：８９頁）。

【0337】

ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、およびＰＤ－Ｌ１に対するチェックポイント阻害剤は、臨床的に最も進んでいるが、ＬＡＧ３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、およびＴＩＭ３など、他の有望なチェックポイント抗原が公知であり、本主題のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストと組み合わせた治療阻害剤の標的として使用することができる（Pardoll、２０１２年、Nature Reviews Cancer １２巻：２５２～２６４頁）。腫瘍および／または病原体に対する免疫応答を刺激するこれらのおよび他の公知の作用剤は、ＡｃｔＲＩＩａアンタゴニスト単独と組み合わせて使用してもよく、さらにインターフェロン－アルファなどのインターフェロンおよび／またはがん治療を向上させるための抗体－薬物コンジュゲートと組み合わせて使用してもよい。組み合わせて使用することができる他の公知の共刺激経路モジュレーターとしては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：アガトリモド、ベラタセプト、ブリナツモマブ、ＣＤ４０リガンド、抗Ｂ７－１抗体、抗Ｂ７－２抗体、抗Ｂ７－Ｈ４抗体、ＡＧ４２６３、エリトラン、抗ＯＸ４０抗体、ＩＳＦ－１５４、およびＳＧＮ－７０；Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－２、ＩＣＡＭ－３、ＣＤ４８、ＬＦＡ－３、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ４０リガンド、熱安定抗原、Ｂ７ｈ、ＯＸ４０リガンド、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ７０、およびＣＤ２４。

【0338】

治療剤としては、光活性剤または色素を挙げることができる。蛍光色素などの蛍光組成物、および可視光線に感受性のポルフィリンなどの他の色原体または色素は、好適な光を病変に向けることにより病変を検出および処置するために使用されている。治療の場合、これは、光放射線治療、光線治療、または光線力学療法と名付けられている。Joniら（編）、PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES (Libreria Progetto
１９８５年)；van den Bergh、Chem. Britain（１９８６年）、２２巻：４３０頁を参照されたい。さらに、光線治療を達成するために、モノクローナル抗体が、光活性化色素とカップリングされている。Mewら、J. Immunol.（１９８３年）、１３０巻：１４７
３頁；idem.、Cancer Res.（１９８５年）、４５巻：４３８０頁；Oseroffら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（１９８６年）、８３巻：８７４４頁；idem.、Photochem. Photobiol.（１９８７年）、４６巻：８３頁；Hasanら、Prog. Clin. Biol. Res.（１９
８９年）、２８８巻：４７１頁；Tatsutaら、Lasers Surg. Med.（１９８９年）、９巻：４２２頁；Pelegrinら、Cancer（１９９１年）、６７巻：２５２９頁を参照されたい。

【0339】

他の有用な治療剤は、オリゴヌクレオチド、特に、好ましくはｂｃｌ－２またはｐ５３などのオンコジーンおよびオンコジーン産物に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。治療用オリゴヌクレオチドの好ましい形態は、ｓｉＲＮＡである。当業者であれば、任意のｓｉＲＮＡまたは干渉ＲＮＡ種を、標的組織への送達のために抗体またはその断片に付着させることができることを理解するであろう。幅広く様々な標的に対する多数のｓｉＲＮＡ種が、当技術分野で公知であり、任意のそのような公知のｓｉＲＮＡを、本特許請求の方法および組成物に利用することができる。

【0340】

潜在的に有用な公知のｓｉＲＮＡ種としては、以下のものに特異的なものが挙げられる：ＩＫＫ－ガンマ（米国特許第７，０２２，８２８号）；ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ－１、およびＦｌｋ－１／ＫＤＲ（米国特許第７，１４８，３４２号）；Ｂｃｌ２およびＥＧＦＲ（米国特許第７，５４１，４５３号）；ＣＤＣ２０（米国特許第７，５５０，５７２号）；トランスデューシン（ベータ）様３（米国特許第７，５７６，１９６号）；ＫＲＡＳ（米国特許第７，５７６，１９７号）；炭酸脱水酵素ＩＩ（米国特許第７，５７９，４５７号）；補体成分３（米国特許第７，５８２，７４６号）；インターロイキン－１受容体関連キナーゼ４（ＩＲＡＫ４）（米国特許第７，５９２，４４３号）；サバイビン（米国特許第７，６０８，７０７０号）；スーパーオキシドジスムターゼ１（米国特許第７，６３２，９３８号）；ＭＥＴプロトオンコジーン（米国特許第７，６３２，９３９号）；アミロイドベータ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）（米国特許第７，６３５，７７１号）；ＩＧＦ－１Ｒ（米国特許第７，６３８，６２１号）；ＩＣＡＭ１（米国特許第７，６４２，３４９号）；補体因子Ｂ（米国特許第７，６９６，３４４号）；ｐ５３（米国特許第７，７８１，５７５号）、およびアポリポタンパク質Ｂ（米国特許第７，７９５，４２１号）。各参照特許の実施例セクションは、参照により本明細書に組み込まれる。

【0341】

追加のｓｉＲＮＡ種は、多数の他のものの中でも、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ
Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、Ｃａｌｉｆ．）、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、Ｃｏｌｏ．）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、およびＱｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆ．）など、公知の商業的供給源から入手可能である。ｓｉＲＮＡ種の他の公的に利用可能な供給源としては、ストックホルムバイオインフォマティクスセンターのｓｉＲＮＡｄｂデータベース、ＭＩＴ／ＩＣＢＰ ｓｉＲＮＡデータベース、Ｂｒｏａｄ研究所のＲＮＡｉコンソーシアムｓｈＲＮＡライブラリー、およびＮＣＢＩのプローブデータベースが挙げられる。例えば、ＮＣＢＩプローブデータベースには、３０，８５２個のｓｉＲＮＡ種が存在する。当業者であれば、任意の目的の遺伝子に対するｓｉＲＮＡ種は既に設計されているか、または公的に利用可能なソフトウェアツールを使用して容易に設計することができるかのいずれかであることを理解するであろう。任意のそのようなｓｉＲＮＡ種は、本主題のＤＮＬ（商標）複合体を使用して送達することができる。

【0342】

ＡｃｔＲＩＩおよび／またはＴＧＦβアンタゴニスト免疫療法は、ワクチン接種プロトコールと組み合わせると、より有効であり得る。腫瘍に対するワクチン接種は多数の実験戦略が考案されている（Rosenberg, S.、２０００年、Development of Cancer Vaccines、ASCO Educational Book Spring：６０～６２頁；Logothetis, C、２０００年、ASCO Educational Book Spring：３００～３０２頁；Khayat, D. ２０００年、ASCO
Educational Book Spring：４１４～４２８頁；Foon, K. ２０００年、ASCO Educational Book Spring：７３０～７３８頁を参照；また、DeVita, V.ら（編）、１９９７年、Cancer: Principles and Practice of Oncology．第５版のRestifo, N.およびSznol, M.、Cancer Vaccines、６１章、３０２３～３０４３頁を参照）。こうした戦略の１つでは、ワクチンは、自家または同種異系間腫瘍細胞を使用して調製される。こうした細胞性ワクチンは、腫瘍細胞がＧＭ－ＣＳＦを発現するように形質導入されている場合、有効性を増加させることが示されている（Dranoffら（１９９３年）Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. ９０巻：３５３９～４３頁）。したがって、一部の実施形態では、
１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、がん性細胞、精製腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチド、および炭水化物分子を含む）、細胞、および免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子がトランスフェクトされた細胞などの、免疫原性因子と組み合わせることができる（Heら（２００４年）J. Immunol. １７３巻：４９１９～２８頁）。使用することができる腫瘍ワクチンの非限定的な例としては、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ－２、ＭＡＲＴ１、および／またはチロシナーゼのペプチドなどの黒色腫抗原のペプチド、またはサイトカインＧＭ－ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞が挙げられる。

【0343】

種々の腫瘍における遺伝子発現および大規模遺伝子発現パターンに関する研究は、いわゆる腫瘍特異的抗原の明確化に結び付いている（Rosenberg, S A（１９９９年）Immunity １０巻：２８１～７頁）。多くの場合、こうした腫瘍特異的抗原は、腫瘍で、および腫瘍が発生した細胞で発現される分化抗原、例えば、メラノサイト抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、およびＴｒｐ－２である。より重要なことには、こうした抗原の多くは、宿主に見出される腫瘍特異的Ｔ細胞の標的であることが示されている場合がある。ＰＤ－Ｌ１遮断は、こうしたタンパク質に対する免疫応答を発生させるために、腫瘍で発現される組換えタンパク質および／またはペプチドのコレクションと共に使用することができる。こうしたタンパク質は、通常、免疫系により自己抗原とみなされるため、見逃される。また、腫瘍抗原は、染色体のテロメアの合成に必要であり、８５％よりも多くのヒトがんで発現され、限定的な数の体細胞組織でのみ発現されるタンパク質テロメラーゼを含んでいてもよい（Kim, Nら（１９９４年）Science ２６６巻：２０１１～２０１３頁）。こうした体細胞組織は、種々の手段により免疫攻撃から防御することができる。また、腫瘍抗原は、タンパク質配列を変更するかもしくは２つの無関係な配列（例えば、フィラデルフィア染色体のｂｅｒ－ａｂｌ）間の融合タンパク質を生成する体細胞突然変異のためがん細胞で、またはＢ細胞腫瘍に由来するイディオタイプで発現される「ネオ抗原」であってもよい。

【0344】

他の腫瘍ワクチンとしては、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、肝炎ウイルス（ＨＢＶおよびＨＣＶ）、およびカポジヘルペス肉腫ウイルス（ＫＨＳＶ）などのヒトがんに関与が示唆されるウイルスに由来するタンパク質が挙げられる。ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト療法と共に使用することができる腫瘍特異的抗原の別の形態は、腫瘍組織自体から単離された精製ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）である。こうしたヒートショックタンパク質は、腫瘍細胞に由来するタンパク質の断片を含み、こうしたＨＳＰは、腫瘍免疫を誘発するための抗原提示細胞への送達が高度に効率的である（Suot, RおよびSrivastava,
P（１９９５年）Science ２６９巻：１５８５～１５８８頁；Tamura, Y.ら（１９９
７年）Science ２７８巻：１１７～１２０頁）。

【0345】

樹状細胞（ＤＣ）は、抗原特異的応答を予備刺激するために使用することができる強力な抗原提示細胞である。ＤＣは、ｅｘ ｖｉｖｏで産生して、種々のタンパク質およびペプチド抗原ならびに腫瘍細胞抽出物を負荷することができる（Nestle, F.ら（１９９８
年）Nature Medicine ４巻：３２８～３３２頁）。また、ＤＣは、こうした腫瘍抗原を発現する遺伝子手段により形質導入することもできる。また、ＤＣは、免疫化の目的のために腫瘍細胞と直接融合されている（Kugler, A.ら（２０００年）Nature Medicine
６巻：３３２～３３６頁）。ワクチン接種の方法として、ＤＣ免疫化は、より強力な抗腫瘍応答を活性化するために、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストと有効に組み合わせることができる。

【0346】

本開示の他の方法は、特定の毒素または病原体に曝露されている患者を処置するために使用される。したがって、本開示の別の態様は、対象の感染性疾患（例えば、ウイルス感染症、細菌感染症、または寄生虫感染症）を処置または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩおよび／またはＴＧＦβアンタゴニストを投与することを含み、必要に応じて、感染性疾患を処置するための１つまたは複数の追加の支持療法および／または活性剤を投与することをさらに含む方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、例えば、感染性疾患に罹患している対象の内因性免疫応答を強化することにより、対象の感染性疾患を処置するための方法であって、対象に、治療有効量の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩおよび／またはＴＧＦβアンタゴニストを投与することを含み、必要に応じて、感染性疾患を処置するための１つまたは複数の追加の支持療法および／または活性剤を投与することをさらに含む方法を提供する。

【0347】

感染性ウイルスの例としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ（胃腸炎を引き起こす菌株など）；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、コロナウイルス）；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、エボラウイルス）；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、パラインフルエンザウイルス、おたふくかぜウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス）；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、インフルエンザウイルス）；Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ハンタンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルス、およびナイロウイルス）；Ａｒｅｎａ ｖｉｒｉｄａｅ（出血熱ウイルス）；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、レオウイルス、オルビウイルス（orbiviurs）、およびロタウイルス）；Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒ
ｉｄａｅ（Ｂ型肝炎ウイルス）；Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ（パルボウイルス）；Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ（ほとんどのアデノウイルス）；Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１およびＨＳＶ－２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；Ｐｏｘｙｉｒｉｄａｅ（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびＩｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ（アフリカブタ熱ウイルスなど）；および分類不能ウイルス（例えば、海綿状脳症の病原因子、デルタ肝炎（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損サテライトであると考えられる）の因子、非Ａ型、非Ｂ型肝炎（クラス１＝内部伝染；クラス２＝非経口伝染（つまりＣ型肝炎））の因子；ノーウォークおよび関連ウイルス、およびアストロウイルス）。本明細書に記載されているＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび方法は、こうしたウイルス因子による感染の処置に使用することが企図される。したがって、一部の実施形態では、本開示は、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを、必要に応じて１つまたは複数の支持療法および／または活性剤と組み合わせて使用して、以下のものを含むウイルス感染症を処置または予防するための方法を提供する：例えば、ＡＩＤＳ、ＡＩＤＳ関連症候群、水痘、風邪、ウイルス性気管支炎、サイトメガロウイルス感染症、コロラドダニ熱、デング熱、エボラ出血熱、流行性耳下腺炎、「手足口」病、肝炎、単純ヘルペス、帯状疱疹、ＨＰＶ、インフルエンザ（流感）、ラッサ熱、麻疹、マールブルグ出血熱、伝染性単核症、耳下腺炎、小児麻痺、進行性多巣性白質脳症（leukencephalopathy）、狂犬病、風疹、ＳＡＲＳ、天然痘、ウイルス脳炎、ウイルス性胃腸炎、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性肺炎、西ナイル熱、および黄熱病。

【0348】

感染性細菌の例としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉｓ、Ｂｏｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐｓ（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅなど）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ビリダンス群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（嫌気性種）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉａ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐ．、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｉｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、およびＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｌｉ。本明細書に記載されているＡｃｔＲＩＩ組成物および方法は、こうした細菌因子による感染症の処置に使用することが企図される。したがって、一部の実施形態では、本開示は、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを、必要に応じて１つまたは複数の支持療法および／または活性剤と組み合わせて使用して、以下のものを含む細菌感染症を処置または予防するための方法を提供する：例えば、炭疽菌、細菌性成人呼吸窮迫症候群、細菌性髄膜炎、ブルセラ症、カンピロバクター症、ネコひっかき病、気管支炎、コレラ、ジフテリア、発疹チフス、淋病、レジオネラ症、らい病（ハンセン病）、レプトスピラ症、リステリア症、ライム病、類鼻疽、ＭＲＳＡ感染症、マイコバクテリア感染、脳膜炎、ノカルジア症、腎炎、糸球体腎炎、歯槽膿漏症、百日咳（百日ぜき）、ペスト、肺炎球菌性肺炎、オウム病、Ｑ熱、ロッキー山紅斑熱（ＲＭＳＦ）、サルモネラ症、猩紅熱（scarlet dever）、細菌性赤痢、梅毒、敗血症性ショック、血行力学的ショック、敗血症症候群、破傷風、トラホーム、結核、野兎病、腸チフス。

【0349】

感染性真菌の例としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、およびＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ。本明細書に記載されているＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび方法は、こうした真菌因子による感染症の処置に使用することが企図される。したがって、一部の実施形態では、本開示は、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを、必要に応じて、１つまたは複数の支持療法および／または活性剤と組み合わせて使用して、例えば、アスペルギルス症、鵞口瘡、クリプトコッカス症、ブラストミセス症、コクシジオイデス症、およびヒストプラスマ症を含む真菌感染症を処置または予防するための方法を提供する。

【0350】

感染性寄生虫の例としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ、Ｎａｅｇｌｅｒｉａｆｏｗｌｅｒｉ、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ ｓｐ．、Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ、Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ。本明細書に記載されているＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび方法は、こうした因子による感染症の処置に使用することが企図される。したがって、一部の実施形態では、本開示は、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを、必要に応じて１つまたは複数の支持療法および／または活性剤と組み合わせて使用して、以下のものを含む真菌感染症を処置または予防するための方法を提供する：例えば、アフリカトリパノソーマ症、アメーバ症、回虫症、バベシア病、シャガス病、肝吸虫症、クリプトスポリジウム症、嚢虫症、裂頭条虫症、メジナ虫症、包虫症、蟯虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、フィラリア症、自由生活性アメーバ感染症、ジアルジア症、皮膚顎口虫症、膜様条虫症、イソスポーラ症、カラアザール、リーシュマニア症、マラリア、横川吸虫症、蠅蛆病、回旋系状虫症、シラミ寄生症、蟯虫感染、疥癬、住血吸虫症、条虫症、トキソカラ症、トキソプラズマ症、旋毛虫症（Trichinellosis）、旋毛虫症（Trichinosis）、鞭虫症、およびトリパノソーマ症。

【0351】

一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者に、有効量のＡｃｔＲＩＩおよび／またはＴＧＦβアンタゴニストを、単独で、または病原体を処置するための第２の治療剤、例えば、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス物質、または抗寄生虫薬と組み合わせて投与することにより、感染性疾患を処置するための方法を提供する。

【0352】

一般に、抗生物質は、細菌の成長を阻害するかまたは細菌を死滅させる任意の化合物を指す。有用な抗生物質の非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：リンコサミド（クリンダマイシン（clindomycin））；クロラムフェニコール；テトラサイクリン類（
テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、デメクロサイクリン、メタサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリンなど）；アミノグリコシド（ゲンタマイシン、トブラマイシン、ネチルミシン、アミカシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、ネオマイシンなど）；ベータラクタム（ペニシリン、セファロスポリン、イミペネム、アズトレオナムなど）；バンコマイシン；バシトラシン；マクロライド（エリスロマイシン）、アムホテリシン；スルホンアミド（スルファニルアミド、スルファメトキサゾール、スルファセタミド、スルファジアジン、スルフイソキサゾール、スルファシチン、スルファドキシン、マフェナイド、パラアミノ安息香酸、トリメトプリム－スルファメトキサゾールなど）；メテナミン；ニトロフラントイン；フェナゾピリジン；トリメトプリム；リファンピシン；メトロニダゾール；セファゾリン；リンコマイシン；スペクチノマイシン；ムピロシン；キノロン（ナリジクス酸、シノキサシン、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、ペルフロキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、フレロキサシン、レボフロキサシンなど）；ノボビオシン；ポリミキシン；グラミシジン；および抗シュードモナス剤（カルベニシリン、インダニルカルベニシリン、チカルシリン、アズロシリン、メズロシリン、ピペラシリンなど）、またはこれらの任意の塩もしくはバリアント。また、Physician's Desk Reference、第５９版、（２００５年）、Thomson P D R、Montvale、N.J.；Gennaroら編、Remington's The Science and Practice of Pharmacy、第２０版、（２
０００年）、Lippincott Williams and Wilkins、Baltimore Md.；Braunwaldら編、Harrison's Principles of Internal Medicine、第１５版、（２００１年）、McGraw
Hill、NY；Berkowら編、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy、（１９
９２年）、Merck Research Laboratories、Rahway、N.J.を参照されたい。使用される
抗生物質は、細菌感染症のタイプに依存するであろう。

【0353】

一般に、抗真菌剤は、真菌の成長を阻害するかまたは真菌を死滅させる任意の化合物を指す。非限定的な例としては、イミダゾール（グリセオフルビン、ミコナゾール、テルビナフィン、フルコナゾール、ケトコナゾール、ボリコナゾール、およびイトラコナゾール（itraconizole）など）；ポリエン（アムホテリシンＢおよびナイスタチンなど）；フルシトシン；およびカンジシジン、またはそれらの任意の塩もしくはバリアントが挙げられる。また、Physician's Desk Reference、第５９版、（２００５年）、Thomson P D
R、Montvale、N.J.；Gennaroら編、Remington's The Science and Practice of Pharmacy 第２０版、（２０００年）、Lippincott Williams and Wilkins、Baltimore Md.；Braunwaldら編、Harrison's Principles of Internal Medicine、第１５版
、（２００１年）、McGraw Hill、NY；Berkowら編、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy、（１９９２年）、Merck Research Laboratories、Rahway、N.J.を参照されたい。使用される抗真菌剤は、真菌感染症のタイプに依存するであろう。

【0354】

抗ウイルス薬は、ウイルスの作用を阻害する任意の化合物を指す。非限定的な例としては、インターフェロンアルファ、ベータ、もしくはガンマ、ジダノシン、ラミブジン、ザナミビル（zanamavir）、ロピナビル（lopanivir）、ネルフィナビル、エファビレンツ、インジナビル、バラシクロビル、ジドブジン、アマンタジン、リマンタジン（rimantidine）、リバビリン、ガンシクロビル、ホスカルネット、およびアシクロビル、またはそれ
らの任意の塩もしくはバリアントが挙げられる。また、Physician's Desk Reference、第５９版、（２００５年）、Thomson P D R、Montvale、N.J.；Gennaroら編、Remington's The Science and Practice of Pharmacy 第２０版、（２０００年）、Lippincott Williams and Wilkins、Baltimore Md.；Braunwaldら編、Harrison's Principles of Internal Medicine、第１５版、（２００１年）、McGraw Hill、NY；Berkowら編、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy、（１９９２年）、Merck Research Laboratories、Rahway、N.J.を参照されたい。使用される抗ウイルス剤は、ウイルス感染症のタイプに依存するであろう。

【0355】

抗寄生虫剤は、寄生虫の成長を阻害するかまたは寄生虫を死滅させる任意の化合物を指す。有用な抗寄生虫剤の非限定的な例としては、クロロキン、メフロキン、キニーネ、プリマキン、アトバクオン、スルファドキシン（sulfasoxine）、およびピリメタミン、ま
たはそれらの任意の塩もしくはバリアントが挙げられる。また、Physician's Desk Reference、第５９版、（２００５年）、Thomson P D R、Montvale、N.J.；Gennaroら編
、Remington's The Science and Practice of Pharmacy 第２０版、（２０００年）、Lippincott Williams and Wilkins、Baltimore Md.；Braunwaldら編、Harrison's Principles of Internal Medicine、第１５版、（２００１年）、McGraw Hill、NY；Berkowら編、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy、（１９９２年）、Merck Research Laboratories、Rahway、N.J.を参照されたい。使用される抗寄生虫剤
は、寄生虫感染症のタイプに依存するであろう。

【0356】

上記で考察されている腫瘍に対するその応用と同様に、本明細書に記載されているＡｃｔＲＩＩおよび／またはＴＧＦβアンタゴニストは、単独で、またはワクチンと組み合わせてアジュバントとして使用して、病原体、毒素、および自己抗原に対する免疫応答を刺激することができる。こうした手法は、サイトカイン処置などの免疫療法の他の形態（例えば、インターフェロン、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、またはＩＬ－２の投与）と組み合わせることができる。この治療手法が特に有用であり得る病原体の例としては、現在、有効なワクチンがない病原体、または従来のワクチンが十分に有効であるとは言い難い病原体が挙げられる。そのようなものとしては、これらに限定されないが、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、Ｂ、およびＣ）、インフルエンザ、ヘルペス、Ｇｉａｒｄｉａ、マラリア、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ａｅｒｕｇｉｎｏｓａが挙げられる。

【0357】

一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩおよび／またはＴＧＦβアンタゴニストは、乳がんを有する患者には投与されない。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩおよび／またはＴＧＦβアンタゴニストは、多発性骨髄腫を有する患者には投与されない。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩおよび／またはＴＧＦβアンタゴニストは、乳がんを有する患者には投与されない。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩおよび／またはＴＧＦβアンタゴニストは、骨髄異形成症候群を有する患者には投与されない。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩおよび／またはＴＧＦβアンタゴニストは、ＦＳＨ分泌下垂体腫瘍を有する患者には投与されない。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩおよび／またはＴＧＦβアンタゴニストは、前立腺がんを有する患者には投与されない。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩおよび／またはＴＧＦβアンタゴニストは、正常で健康な患者と比較して、望ましくない免疫活性上昇（例えば、Ｔ細胞活性の増加）を有する患者には投与されない。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩおよび／またはＴＧＦβアンタゴニストは、自己免疫障害または自己免疫関連障害を有する患者には投与されない。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩおよび／またはＴＧＦβアンタゴニストは、望ましくないＴ細胞活性上昇により媒介される自己免疫障害または自己免疫関連障害を有する患者には投与されない。例えば、一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩおよび／またはＴＧＦβアンタゴニストは、以下のものの１つまたは複数を有する患者には投与されない：急性散在性脳脊髄炎、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経異常症、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索＆ニューロンニューロパシー、バロー病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、キャッスルマン病、セリアック病、シャガス病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、慢性再発性多巣性骨髄炎、チャーグ－ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コーガン症候群、寒冷凝集素症、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ疾患、本態性混合型クリオグロブリン血症、脱髄性ニューロパシー、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エバンス症候群、線維化性肺胞炎、巨細胞性動脈炎、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、ヘノッホ－シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化症、免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性筋炎、川崎症候群、ランバート－イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、リニアＩｇＡ病（ＬＡＤ）、狼瘡（ＳＬＥ）、ライム病（慢性）、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムーシャ－ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、視神経脊髄炎（デビック病）、眼瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（ストレプトコッカス関連小児自己免疫性神経精神障害）、腫瘍随伴性小脳変性症、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリーロンベルグ症候群、パーソネイジ（Parsonnage）－ターナー症候群、毛様体扁平部炎（周辺性ブドウ膜炎）、天疱瘡、静脈周囲脳脊髄炎、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型自己免疫性多発内分泌腺症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変症、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、鞏膜炎、硬皮症、シェーグレン症候群、精子＆睾丸自己免疫、全身硬直症候群、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、トローザ－ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織疾患（ＵＣＴＤ）、水疱性皮膚病、ヴェグナー肉芽腫症。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩおよび／またはＴＧＦβアンタゴニストは、組織または臓器移植を経験している最中の患者には投与されない。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩおよび／またはＴＧＦβアンタゴニストは、組織または臓器移植を受けたことがある患者には投与されない。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩおよび／またはＴＧＦβアンタゴニストは、移植片対宿主疾患を有する患者には投与されない。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩおよび／またはＴＧＦβアンタゴニストは、１つまたは複数の免疫抑制剤および／または療法で処置されている患者には投与されない。

【0358】

ある特定の実施形態では、本開示は、患者の１つまたは複数の血液学的パラメーターを測定することにより、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストで処置された患者または処置しようとする候補である患者を管理するための方法を提供する。血液学的パラメーターを使用して、本開示のアンタゴニストで処置しようとする候補である患者のための適切な投薬を評価すること、処置中に血液学的パラメーターをモニターすること、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストで処置中に投薬量を調整するか否かを評価すること、および／または本開示の１つもしくは複数のアンタゴニストの適切な維持用量を評価することができる。血液学的パラメーターの１つまたは複数が、正常レベル外にある場合、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの投薬を低減、遅延、または中止してもよい。

【0359】

本明細書で提供される方法に従って測定することができる血液学的パラメーターとしては、例えば、赤血球レベル、血圧、鉄貯蔵、および当技術分野で認識されている方法を使用して体液中に見出される、赤血球レベル増加と相関する他の因子が挙げられる。そのようなパラメーターは、患者に由来する血液試料を使用して決定することができる。赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、および／またはヘマトクリットレベルの増加は、血圧の上昇を引き起こす場合がある。

【0360】

一実施形態では、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストで処置しようとする候補である患者の１つまたは複数の血液学的パラメーターが、正常範囲外にあるか、または正常値の高値側にある場合、血液学的パラメーターが、自然にまたは治療介入のいずれかにより正常レベルまたは許容されるレベルに戻るまで、１つまたは複数のアンタゴニストの投与開始を遅延させてもよい。例えば、候補患者が高血圧性または前高血圧性である場合、患者の血圧を下げるために、患者を血圧降下剤で処置してもよい。例えば、利尿剤、アドレナリン阻害剤（アルファ遮断剤およびベータ遮断剤を含む）、血管拡張剤、カルシウムチャネル遮断剤、アンジオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、またはアンジオテンシンＩＩ受容体遮断剤を含む、個々の患者の状態に適切な任意の血圧降下剤を使用することができる。あるいは、血圧は、食事および運動レジメンを使用して処置してもよい。同様に、候補患者が、正常値よりも低いか、または正常値の低値側にある鉄貯蔵を有する場合、患者の鉄貯蔵が正常レベルまたは許容されるレベルに戻るまで、食事および／または鉄補給食品の適切なレジメンで患者を処置してもよい。正常値よりも高い赤血球レベルおよび／またはヘモグロビンレベルを有する患者の場合、レベルが正常レベルまたは許容されるレベルに戻るまで、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの投与を遅延させてもよい。

【0361】

ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト剤で処置しようとする候補である患者の１つまたは複数の血液学的パラメーターが正常範囲外にあるか、または正常値の高値側にある場合、投与の開始を遅延させてはならない。しかしながら、１つまたは複数のアンタゴニストの投薬用量または投薬頻度は、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの投与時に生じる血液学的パラメーターの許容されない増加のリスクを低減することになる量に設定することができる。あるいは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを、望ましくないレベルの血液学的パラメーターに対処する治療剤と組み合わせた治療レジメンを、患者のために開発してもよい。例えば、患者が血圧上昇を示す場合、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび血圧降下剤の投与を含む治療レジメンを設計してもよい。所望よりも低い鉄貯蔵を有する患者の場合、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび鉄補給を含む治療レジメンを開発してもよい。

【0362】

一実施形態では、１つまたは複数の血液学的パラメーターのベースラインパラメーターを、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、およびベースライン値に基づいてその患者のために確立された適切な投薬レジメンで処置しようとする候補である患者について確立してもよい。あるいは、患者の病歴に基づいて確立されたベースラインパラメーターを使用して、患者のための適切なアンタゴニスト投薬レジメンを作り上げることができる。例えば、健康な患者が、規定の正常範囲よりも高い確立されたベースライン血圧測定値を示す場合、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストによる処置の前に、患者の血圧を、一般集団で正常であるとみなされる範囲内になるようにする必要はない場合がある。また、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストにより処置する前の患者の１つまたは複数の血液学的パラメーターのベースライン値を、本明細書に記載されている１つまたは複数のアンタゴニストで処置中の血液学的パラメーターの任意の変化をモニターするための関連比較値として使用することができる。

【0363】

ある特定の実施形態では、１つまたは複数の血液学的パラメーターは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストで処置されている患者で測定される。血液学的パラメーターを使用して、処置中に患者をモニターし、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの投薬、または別の治療剤の追加の投薬の調整または中止を可能にすることができる。例えば、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの投与が、血圧、赤血球レベル、またはヘモグロビンレベルの上昇、または鉄貯蔵の低減をもたらす場合、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの用量は、１つまたは複数の血液学的パラメーターに対する本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの効果を減少させるために、量または頻度を低減させてもよい。１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの投与が、患者に有害な１つまたは複数の血液学的パラメーターの変化をもたらす場合、本明細書に記載されている１つまたは複数のアンタゴニストの投薬は、血液学的パラメーターが許容されるレベルに戻るまで一時的に中止しても、または恒久的に中止してもよい。同様に、１つまたは複数の血液学的パラメーターが、本明細書に記載されている１つまたは複数のアンタゴニストの投与の用量または頻度を低減させた後でも許容される範囲内に戻らない場合、投薬を中止してもよい。本明細書に記載されている１つまたは複数のアンタゴニストの投薬を低減または中止する代わりにまたはそれに加えて、望ましくないレベルの血液学的パラメーターに対処する追加の治療剤、例えば血圧降下剤または鉄補給食品などを、患者に投与してもよい。例えば、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストで処置されている患者が、血圧上昇を示す場合、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの投薬を同じレベルで継続し、血圧降下剤を処置レジメンに追加してもよく、１つまたは複数のアンタゴニスト（例えば、量および／または頻度）および血圧降下剤の投薬を治療レジメンに追加し、または１つもしくは複数のアンタゴニストの投薬を中止し、患者を血圧降下剤で処置してもよい。

【0364】

１０．医薬組成物
ある特定の態様では、本開示のＡｃｔＲＩＩおよび／もしくはＴＧＦβアンタゴニストまたはそのようなアンタゴニストの組合せは、単独でまたは医薬製剤（治療用組成物または医薬組成物とも呼ばれる）の成分として投与することができる。医薬形成は、そこに含まれている活性成分（例えば、本開示の作用剤）の生物活性が有効であることを可能にするような形態であり、製剤が投与されることになる対象に許容しがたいほど毒性である追加の成分を含んでいない調製物を指す。本主題の化合物は、ヒト用のまたは獣医学的な薬に使用される任意の便利な様式で投与するために製剤化することができる。例えば、本開示の１つまたは複数の作用剤は、薬学的に許容される担体を用いて製剤化することができる。薬学的に許容される担体は、対象に対して一般に無毒性である、活性成分以外の、医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、これらに限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定化剤、および／または保存剤が挙げられる。一般に、本開示で使用される医薬製剤は、対象への投与時に、パイロジェンフリーで生理学的に許容される形態である。本明細書に記載されているもの以外の治療上有用な作用剤が、必要に応じて、上記に記載されているような製剤に含まれていてもよく、本開示の方法において本主題の作用剤と組み合わせて投与することができる。

【0365】

ある特定の実施形態では、組成物は、非経口的に投与されることになる［例えば、静脈内の（Ｉ．Ｖ．）注射、動脈内注射、骨内注射、筋肉内注射、髄腔内注射、皮下注射、または皮内注射により］。非経口投与に好適な医薬組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される無菌等張性水性もしくは非水性溶液、分散物、懸濁物、またはエマルジョン、または使用直前に無菌注射用溶液または分散物に復元することができる無菌粉末と組み合わせて、本開示の１つまたは複数の作用剤を含んでいてもよい。注射用溶液または分散物は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、懸濁化剤、増粘剤、または製剤を意図されているレシピエントの血液と等張性にする溶質を含んでいてもよい。本開示の医薬製剤に使用することができる好適な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、植物油（例えば、オリーブ油）、注射用有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）、およびそれらの好適な混合物が挙げられる。適切な流動度は、例えば、コーティング材料（例えば、レシチン）を使用することにより、分散物の場合は必要とされる粒子サイズを維持することにより、および界面活性剤を使用することにより維持することができる。

【0366】

一部の実施形態では、化合物は、例えば、局所的投与、眼内（例えば、硝子体内）注射により、またはインプラントもしくはデバイスにより、眼に投与されることになる。硝子体内注射は、例えば、毛様体扁平部から縁郭の３ｍｍ～４ｍｍ後部に注射することができる。眼に投与するための医薬組成物は、例えば、目薬、眼科用溶液、眼科用懸濁物、眼科用エマルジョン、硝子体内注射剤、テノン下注射剤、眼科用生体内分解性（biodrodible
）インプラント、および非生体内分解性（non-bioeordible）眼科用インサートまたはデ
ポーを含む、様々な様式で製剤化することができる。

【0367】

一部の実施形態では、本開示の治療方法は、医薬組成物を、インプラントまたはデバイスから全身的にまたは局所的に投与することを含む。さらに、医薬組成物は、封入されていてもよく、または標的組織部位（例えば、骨髄または筋肉）に送達するための形態で注射してもよい。ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、本開示の作用剤の１つまたは複数を、標的組織部位（例えば、骨髄または筋肉）に送達することが可能であり、発生中の組織に構造を提供し、至適には体内に再吸収可能なマトリックスを含んでいてもよい。例えば、マトリックスは、本開示の１つまたは複数の作用剤の徐放を提供することができる。そのようなマトリックスは、他の移植医学応用に現在使用されている材料で形成することができる。

【0368】

マトリックス材料の選択は、以下の１つまたは複数に基づいていてもよい：生体適合性、生分解性、機械的特性、美容的外観、および界面特性。本主題の組成物の特定の応用に応じて、適切な製剤が規定されることになる。組成物の考え得るマトリックスは、生分解性であり化学的に規定された硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、およびポリ酸無水物であってもよい。他の考え得る材料としては、例えば、骨または皮膚コラーゲンが挙げられ、生分解性であり、生物学的に十分に規定されている。さらなるマトリックスは、純粋なタンパク質または細胞外基質成分で構成される。他の考え得るマトリックスとしては、例えば、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミン酸塩、または他のセラミックスが挙げられ、非生物分解性であり、化学的に規定されている。マトリックスは、例えば、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイト、またはコラーゲンおよびリン酸三カルシウムを含む、上記で言及されているタイプの材料のいずれかの組合せで構成されていてもよい。バイオセラミックは、組成物を変更することができ（例えば、カルシウム－アルミネート－ホスフェート）、孔サイズ、粒子サイズ、粒子形状、および生分解性の１つまたは複数を変更するように処理することができる。

【0369】

ある特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、局所投与することができる。「局所的適用」または「局所に」は、例えば、皮膚、創傷部位、および粘膜を含む体表面に医薬組成物を接触させることを意味する。局所的医薬組成物は、種々の適用形態を有していてもよく、典型的には、組成物の局所投与時に組織の付近にまたは直接接触して位置するように構成されている薬物含有層を含む。局所的投与に好適な医薬組成物は、液体、ゲル、クリーム、ローション、軟膏、発泡体、ペースト、パテ、半固形物、または固形物として製剤化された本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢおよび／またはＴＧＦβアンタゴニストを組み合わせて含んでいてもよい。液体、ゲル、クリーム、ローション、軟膏、発泡体、ペースト、またはパテの形態の組成物は、組成物を標的組織に延展、噴霧、なすり付け、軽打、または回転させることにより塗布することができる。また、組成物は、無菌包帯、経皮貼付剤、硬膏剤、および絆創膏に含浸させてもよい。パテ、半固形物、または固形物形態の組成物は、変形可能であってもよい。それらは、弾性であってもよく、または弾性でなくともよい（例えば、可撓性または剛性）。ある特定の態様では、組成物は、複合材の一部を形成し、同じまたは異なる組成物を有するファイバー、粒子、または複数の層を含んでいてもよい。

【0370】

液体形態の局所的組成物は、薬学的に許容される溶液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、および懸濁物を含んでいてもよい。液体剤形は、活性成分に加えて、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および／または乳化剤［例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、または１，３－ブチレングリコール、油（例えば、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚油、オリーブ油、ヒマシ油、およびごま油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、およびそれらの混合物］を含む、当技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤を含んでいてもよい。

【0371】

局所的ゲル、クリーム、ローション、軟膏、半固形、または固形組成物は、ポリサッカリド、合成ポリマー、またはタンパク質に基づくポリマーなどの、１つまたは複数の増粘剤を含んでいてもよい。本発明の一実施形態では、本明細書のゲル化剤は、好適には無毒性であり、所望の粘性を付与するものである。増粘剤としては、以下のもののポリマー、コポリマー、およびモノマーを挙げることができる：ビニルピロリドン、メタクリルアミド、アクリルアミドＮ－ビニルイミダゾール、カルボキシビニル、ビニルエステル、ビニルエーテル、シリコーン、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ビニルアルコール、アクリル酸ナトリウム、アクリレート、マレイン酸、ＮＮ－ジメチルアクリルアミド、ジアセトンアクリルアミド、アクリルアミド、アクリロイルモルホリン、プルロニック、コラーゲン、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニレン、ケイ酸ポリビニル、糖（例えば、スクロース、グルコース、グルコサミン、ガラクトース、トレハロース、マンノース、またはラクトース）で置換されたポリアクリレート、アシルアミドプロパンスルホン酸、テトラメトキシオルトシリケート、メチルトリメトキシオルトシリケート、テトラアルコキシオルトシリケート、トリアルコキシオルトシリケート、グリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ポリサッカリド、アルギネート、デキストラン、シクロデキストリン、セルロース、変性セルロース、酸化セルロース、キトサン、キチン、グアー、カラギナン、ヒアルロン酸、イヌリン、デンプン、加工デンプン、アガロース、メチルセルロース、植物ゴム、ヒアルロナン（hylaronan）
、ヒドロゲル、ゼラチン、グリコサミノグリカン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ペクチン、低メトキシペクチン、架橋デキストラン、デンプン－アクリロニトリルグラフトコポリマー、デンプンポリアクリル酸ナトリウム、メタクリル酸ヒドロキシエチル、アクリル酸ヒドロキシルエチル、ポリビニレン、ポリエチルビニルエーテル、ポリメタクリル酸メチル、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリアルカノエート、ポリ乳酸、ポリラクテート、ポリ（３－ヒドロキシブチレート）、スルホン化ヒドロゲル、ＡＭＰＳ（２－アクリルアミド－２－メチル－１－プロパンスルホン酸）、ＳＥＭ（スルホエチルメタクリレート）、ＳＰＭ（スルホプロピルメタクリレート）、ＳＰＡ（スルホプロピルアクリレート）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－メタクリロキシエチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）アンモニウムベタイン、メタクリル酸アミドプロピル－ジメチルアンモニウムスルホベタイン、ＳＰＩ（イタコン酸－ビス（１－プロピルスルホニズ酸（sulfonizacid）－３）エステルジカリウム塩）、イタコン酸、ＡＭＢＣ（３－アクリルアミド－３－メチルブタン酸）、ベータ－カルボキシエチルアクリレート（アクリル酸二量体）、およびマレイン酸無水物－メチルビニルエーテルポリマー、それらの誘導体、それらの塩、それらの酸、およびそれらの組合せ。ある特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、例えば、各々が、所定量の本開示の化合物および必要に応じて１つまたは複数の他の活性成分を含むカプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ剤（スクロースおよびアカシアまたはトラガントなどの風味基剤を使用して）、散剤、粒剤、水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁物、水中油型もしくは油中水型エマルジョン、またはエリキシルもしくはシロップ、またはトローチ（ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤を使用して）、および／または口内洗浄剤の形態で、経口投与することができる。また、本開示の化合物および必要に応じて１つまたは複数の他の活性成分は、ボーラス剤、舐剤、またはペースト剤として投与してもよい。

【0372】

経口投与用の固形剤形（例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、糖剤、散剤、および粒剤）では、本開示の１つまたは複数の化合物は、例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸二カルシウム、充填剤または増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸）、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、およびアカシア）、保水剤（例えば、グリセロール）、崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、シリケート、および炭酸ナトリウム）、溶液遅延剤（例えば、パラフィン）、吸収促進剤（例えば、四級アンモニウム化合物）、湿潤剤（例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール）、吸収剤（例えば、カオリンおよびベントナイト粘土）、潤滑剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、着色剤、およびそれらの混合物を含む、１つまたは複数の薬学的に許容される担体と混合されていてもよい。また、カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、医薬製剤（組成物）は、緩衝剤を含んでいてもよい。また、同様のタイプの固形組成物を、例えば、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールを含む、１つまたは複数の賦形剤を使用して、軟質および硬質充填ゼラチンカプセル剤の充填剤として使用してもよい。

【0373】

医薬組成物を経口投与するための液体剤形は、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁物、シロップ剤、およびエリキシル剤を挙げることができる。液体剤形は、活性成分に加えて、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および／または乳化剤［例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、または１，３－ブチレングリコール、油（例えば、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚油、オリーブ油、ヒマシ油、およびごま油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、およびそれらの混合物］を含む、当技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤を含んでいてもよい。また、経口製剤は、不活性希釈剤の他に、例えば、湿潤剤、乳化および懸濁化剤、甘味剤、香味料、着色剤、芳香剤、保存剤、およびそれらの組合せを含むアジュバントを含んでいてもよい。

【0374】

懸濁物は、活性化合物に加えて、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、ソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天、トラガント、およびそれらの組合せを含む懸濁化剤を含んでいてもよい。

【0375】

微生物の作用および／または成長の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、およびフェノールソルビン酸を含む、種々の抗細菌剤および抗真菌剤を介在させることにより保証することができる。

【0376】

ある特定の実施形態では、例えば、糖または塩化ナトリウムを含む等張剤を、組成物に含めることが望ましい場合がある。加えて、注射可能な医薬品形態の持続吸収は、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含む、吸収を遅延させる作用剤を介在させることによりもたらすことができる。

【0377】

投薬量レジメンは、本開示の作用剤の１つまたは複数の作用を修飾する種々の要因を考慮して、主治医により決定されることになることが理解される。赤血球形成を促進するＡｃｔＲＩＩおよび／またはＴＧＦβアンタゴニストの場合、種々の要因としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：患者の赤血球数、ヘモグロビンレベル、所望の目標赤血球数、患者の年齢、患者の性別、患者の食事、赤血球レベルの低下に寄与する可能性のあるあらゆる疾患の重症度、投与の時間、および他の臨床要因。また、他の公知の活性剤を最終組成物に添加することは、投薬量に影響を及ぼす場合がある。赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、網状赤血球レベル、および造血プロセスの他の指標の１つまたは複数を定期的に評価することにより、進行をモニターすることができる。

【0378】

また、ある特定の実施形態では、本開示は、本開示の作用剤の１つまたは複数のｉｎ ｖｉｖｏ産生のための遺伝子治療を提供する。そのような治療は、作用剤配列を、上記に列挙されているような障害の１つまたは複数を有する細胞または組織に導入することにより、その治療効果を達成することになる。作用剤配列の送達は、例えば、キメラウイルスなどの組換え発現ベクターまたはコロイド分散系の使用により達成することができる。本開示の作用剤配列の１つまたは複数の好ましい治療送達は、標的指向性リポソームの使用である。

【0379】

本明細書で教示されているような遺伝子治療に利用することができる種々のウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、またはＲＮＡウイルス（例えば、レトロウイルス）が挙げられる。レトロウイルスベクターは、マウスまたはトリレトロウイルスの誘導体であってもよい。単一の外来性遺伝子を挿入することができるレトロウイルスベクターの例としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）。多くの追加のレトロウイルスベクターには、複数の遺伝子を組み込むことができる。こうしたベクターにはすべて、形質導入された細胞を特定および生成することができるように、選択可能なマーカーの遺伝子を移動または組み込むことができる。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質、またはタンパク質を付着することにより、標的特異的にすることができる。好ましい標的指向性は、抗体の使用により達成される。当業者であれば、特異的なポリヌクレオチド配列を、レトロウイルスゲノムに挿入するか、またはウイルスエンベロープに付着させて、本開示の作用剤の１つまたは複数を含むレトロウイルスベクターの標的特異的送達を可能にすることができることを理解するであろう。

【0380】

あるいは、レトロウイルス構造遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）をコードするプラスミドを、従来のリン酸カルシウムトランスフェクションにより、組織培養細胞に直接トランスフェクトすることができる。その後、目的の遺伝子を含むベクタープラスミドを、こうした細胞にトランスフェクトする。得られた細胞は、レトロウイルスベクターを培養培地に放出する。

【0381】

本開示の作用剤の１つまたは複数の別の標的送達系は、コロイド分散系である。コロイド分散系としては、例えば、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質に基づく系が挙げられる。ある特定の実施形態では、本開示の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソームは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの送達ビヒクルに有用である人工膜小胞である。ＲＮＡ、ＤＮＡ、および完全ビリオンを、水性内部に封入し、生物学的に活性な形態で細胞に送達することができる［Fraleyら（１９８１年）Trends Biochem. Sci.、６巻：７７頁］。リポソームビヒクルを使用した効率的な遺伝子移入法は、当技術分野で公知である［Manninoら（１９８８年）Biotechniques、６巻：６８２頁、１９８８年］。

【0382】

リポソームの組成は、通常は、リン脂質の組合せであり、ステロイド（例えば、コレステロール）を含んでいてもよい。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度、および２価カチオンの存在に依存する。また、例えば、ホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシド）、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、およびジステアロイルホスファチジルコリンを含む、他のリン脂質または他の脂質を使用することができる。また、例えば、臓器特異性、細胞特異性、および細胞器官特異性に基づくリポソームの標的指向性が可能であり、当技術分野で公知である。

【実施例0383】

本発明を一般的に説明してきたが、本発明は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解され、これらの実施例は、単に、本発明のある特定の実施形態を説明する目的のために含められ、本発明を制限することは意図されない。

【0384】

（実施例１）
ＡｃｔＲＩＩａ－Ｆｃ融合タンパク質
介在するリンカーによってヒトまたはマウスＦｃドメインに融合したヒトＡｃｔＲＩＩａの細胞外ドメインを有するＡｃｔＲＩＩＡ融合タンパク質を生成した。構築物をそれぞれ、ＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＩＩＡ－ｍＦｃと呼ぶ。

【0385】

ＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃを、ＣＨＯ細胞株からの精製型として以下に示す（配列番号５０）：

【化31】

【0386】

ＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＡ－ｍＦｃタンパク質を、ＣＨＯ細胞株において発現させた。異なる３つのリーダー配列は：
（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）：ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号５１）
（ｉｉ）組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号５２）
（ｉｉｉ）天然：ＭＧＡＡＡＫＬＡＦＡＶＦＬＩＳＣＳＳＧＡ（配列番号５３）
であると考えられた。

【0387】

選択した型は、ＴＰＡリーダーを使用し、以下の非プロセシングアミノ酸配列を有する：

【化32】

【0388】

このポリペプチドは、以下の核酸配列によってコードされる：

【化33-1】

【化33-2】

【0389】

ＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＡ－ｍＦｃはいずれも、組換え体の発現を顕著に行うことができた。図５に示すように、タンパク質を、タンパク質の単一の明確なピークとして精製した。Ｎ末端シークエンシングにより、－ＩＬＧＲＳＥＴＱＥ（配列番号５６）の単一の配列が明らかとなった。精製は、例えば以下の３つまたはそれより多くを任意の順序で含む一連のカラムクロマトグラフィーステップによって達成することができる：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィー。ウイルスの濾過および緩衝液交換によって、精製を完了することができる。ＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定した場合に＞９８％の純度に、およびＳＤＳ ＰＡＧＥによって決定した場合に＞９５％の純度に精製された。

【0390】

ＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＡ－ｍＦｃは、リガンドに対して高い親和性を示した。ＧＤＦ－１１またはアクチビンＡを、標準的なアミンカップリング手順を使用してＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＣＭ５チップに固定した。ＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＡ－ｍＦｃタンパク質をシステムにロードし、結合を測定した。ＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃは、アクチビンに対して５×１０^－１２の解離定数（Ｋ_Ｄ）で結合し、ＧＤＦ１１に対して９．９６×１０^－９のＫ_Ｄで結合した。図６を参照されたい。ＡｃｔＲＩＩＡ－ｍＦｃは、類似の挙動を示した。

【0391】

ＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃは、薬物動態試験において非常に安定であった。ラットにＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃタンパク質の１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇを投与し、タンパク質の血漿中レベルを、２４、４８、７２、１４４、および１６８時間で測定した。異なる試験では、ラットに、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または３０ｍｇ／ｋｇを投与した。ラットにおいて、ＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃは、１１～１４日の血清半減期を有し、薬物の循環中レベルは、２週間後で極めて高かった（１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または３０ｍｇ／ｋｇの初回投与後それぞれ、１１μｇ／ｍｌ、１１０μｇ／ｍｌ、または３０４μｇ／ｍｌ）。カニクイザルでは、血漿半減期は実質的に１４日間より長く、薬物の循環中レベルは、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または３０ｍｇ／ｋｇの初回投与後それぞれ、２５μｇ／ｍｌ、３０４μｇ／ｍｌ、または１４４０μｇ／ｍｌであった。

【0392】

本明細書に記載の方法に従って使用され得る多様なＡｃｔＲＩＩＡバリアントは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている国際公開第２００６／０１２６２７号（例えば、５５～５８頁を参照されたい）として公開された国際特許出願に記載されている。代替の構築物は、Ｃ末端尾部（ＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメインの最後の１５アミノ酸）の欠失を有していてもよい。そのような構築物の配列を以下に表す（Ｆｃ部分を下線で示す）（配列番号５７）：

【化34】

【0393】

（実施例２）
ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質の生成
介在するリンカーによってヒトまたはマウスＦｃドメインに融合したヒトＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインを有する可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質を構築した。構築物をそれぞれ、ＡｃｔＲＩＩＢ－ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ－ｍＦｃと呼ぶ。

【0394】

ＡｃｔＲＩＩＢ－ｈＦｃを、ＣＨＯ細胞株からの精製型として以下に示す（配列番号５８）：

【化35】

【0395】

ＡｃｔＲＩＩＢ－ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ－ｍＦｃタンパク質をＣＨＯ細胞株において発現させた。３つの異なるリーダー配列を検討した：（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）、ｉｉ）組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、および（ｉｉｉ）天然：ＭＧＡＡＡＫＬＡＦＡＶＦＬＩＳＣＳＳＧＡ（配列番号５９）。

【0396】

選択した型は、ＴＰＡリーダーを使用し、以下の非プロセシングアミノ酸配列（配列番号６０）を有する：

【化36】

【0397】

このポリペプチドは、以下の核酸配列（配列番号６１）によってコードされる：

【化37】

【0398】

ＣＨＯ細胞産生材料のＮ末端シークエンシングにより、－ＧＲＧＥＡＥ（配列番号６２）の主要な配列が明らかとなった。特に、文献に報告された他の構築物は、－ＳＧＲ…配列で始まる。

【0399】

精製は、例えば以下の３つまたはそれより多くを任意の順序で含む一連のカラムクロマトグラフィーステップによって達成することができる：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィー。ウイルスの濾過および緩衝液交換によって、精製を完了することができる。

【0400】

一連の変異を、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインにおいて生成し、これらの変異体タンパク質を、細胞外ＡｃｔＲＩＩＢとＦｃドメインとの間の可溶性融合タンパク質として産生した。バックグラウンドＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合体は、配列番号５８の配列を有する。

【0401】

ＮおよびＣ末端短縮を含む様々な変異を、バックグラウンドＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃタンパク質に導入した。本明細書で提示したデータに基づき、これらの構築物は、ＴＰＡリーダーと共に発現されると、Ｎ末端セリンを欠如すると予想される。ＰＣＲ変異誘発によって、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインに変異を生成した。ＰＣＲ後、断片を、Ｑｉａｇｅｎカラムを通して精製し、ＳｆｏＩおよびＡｇｅＩによって消化し、ゲル精製した。これらの断片を、ライゲーションによってヒトＩｇＧ１との融合キメラが生じるように、発現ベクターｐＡＩＤ４（国際公開第２００６／０１２６２７号を参照されたい）にライゲーションした。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５アルファに形質転換後、コロニーを採取し、ＤＮＡを単離した。マウス構築物（ｍＦｃ）の場合、マウスＩｇＧ２ａを、ヒトＩｇＧ１の代わりに使用した。全ての変異体の配列を確認した。

【0402】

変異体は全て、一過性のトランスフェクションによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞において産生した。要約すると、５００ｍｌスピナーフラスコにおいて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、容積２５０ｍｌのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地中、６×１０^５個／ｍｌで設定し、一晩成長させた。翌日、これらの細胞を、０．５μｇ／ｍｌ最終ＤＮＡ濃度のＤＮＡ：ＰＥＩ（１：１）複合体によって処置した。４時間後、培地２５０ｍｌを添加し、細胞を７日間成長させた。細胞を遠心沈降させることによって条件培地を回収し、濃縮した。

【0403】

変異体を、例えばプロテインＡカラムを含む様々な技術を使用して精製し、低ｐＨ（３．０）グリシン緩衝剤によって溶出した。中和後、これらをＰＢＳに対して透析した。

【0404】

変異体はまた、類似の方法論によってＣＨＯ細胞においても産生した。変異体を、参照により本明細書に組み込まれている国際公開第２００８／０９７５４１号および国際公開第２００６／０１２６２７号に記載されている結合アッセイおよび／またはバイオアッセイにおいて試験した。一部の例では、精製タンパク質ではなくて条件培地についてアッセイを実施した。ＡｃｔＲＩＩＢの追加のバリエーションは、米国特許第７，８４２，６６３号に記載されている。

【0405】

Ｎ末端およびＣ末端短縮を有するヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（天然タンパク質配列番号１の残基２５～１３１）を含むＡｃｔＲＩＩＢ（２５～１３１）－ｈＦｃ融合タンパク質を、Ｎ末端で天然ＡｃｔＲＩＩＢリーダーの代わりに置換したＴＰＡリーダー配列、およびＣ末端で最小のリンカー（３個のグリシン残基）を介してヒトＦｃドメインに融合した（図７；配列番号１２３）。この融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、図８（配列番号１２４はコード鎖および配列番号１２５は相補鎖）に示す。コドンを修飾して、最初の形質転換体の発現レベルの実質的な改善を提供するＡｃｔＲＩＩＢ（２５～１３１）－ｈＦｃタンパク質をコードするバリアント核酸が見出された（図９；配列番号１２６はコード鎖および配列番号１２７は相補鎖）。

【0406】

成熟タンパク質は、以下のアミノ酸配列を有する（Ｎ末端シークエンシングによりＮ末端を確認した）（配列番号６３）：

【化38】

【0407】

アミノ酸１～１０７は、ＡｃｔＲＩＩＢに由来する。

【0408】

発現された分子を、例えば以下の３つまたはそれより多くを任意の順序で含む一連のカラムクロマトグラフィーステップを使用して精製した：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィー。ウイルスの濾過および緩衝液交換によって、精製を完了することができる。

【0409】

ＡｃｔＲＩＩＢ（２５～１３１）－ｈＦｃおよびその完全長の相対物ＡｃｔＲＩＩＢ（２０～１３４）－ｈＦｃに対するいくつかのリガンドの親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）機器によってｉｎ ｖｉｔｒｏで評価し、結果を、以下の表に要約する。複合体の会合および解離が非常に速いためにｋ_ｏｎおよびｋ_ｏｆｆの正確な決定ができないことから、Ｋｄ値を定常状態での親和性のフィットによって得た。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５～１３１）－ｈＦｃは、高い親和性でアクチビンＡ、アクチビンＢ、およびＧＤＦ１１に結合した。ＡｃｔＲＩＩＢ－ｈＦｃ型のリガンド親和性：

【表2】

【0410】

（実施例３）
ＧＤＦトラップの生成
ＧＤＦトラップは以下のように構築した。ＧＤＦ１１および／またはミオスタチンと比べてアクチビンＡ結合が大きく低減された（配列番号１の７９位でのロイシンからアスパラギン酸への置換の結果として）ＡｃｔＲＩＩＢの修飾細胞外ドメイン（Ｌ７９Ｄ置換を有する配列番号１のアミノ酸２０～１３４）を有するポリペプチドを、介在する最小のリンカー（３つのグリシンアミノ酸）によってヒトまたはマウスＦｃドメインに融合した。構築物をそれぞれ、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２０～１３４）－ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２０～１３４）－ｍＦｃと呼ぶ。７９位でアスパラギン酸ではなくてグルタミン酸を有する代替型（Ｌ７９Ｅ）も類似の成績であった。以下の配列番号６４を基準にして２２６位でバリンではなくてアラニンを有する代替型も同様に生成したところ、調べた全ての点において同等の成績であった。７９位でのアスパラギン酸（配列番号１と比べて、または配列番号６４と比べて６０位）を、以下に二重下線で示す。配列番号６４と比べて２２６位でのバリンもまた、以下に二重下線で示す。

【0411】

ＧＤＦトラップのＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２０～１３４）－ｈＦｃを、ＣＨＯ細胞株からの精製型として以下に示す（配列番号６４）。

【化39】

【0412】

ＧＤＦトラップのＡｃｔＲＩＩＢ由来部分は、以下に示すアミノ酸配列（配列番号６５）を有し、その部分を単量体として、または単量体、二量体、もしくは高次複合体としての非Ｆｃ融合タンパク質として使用することができる。

【化40】

【0413】

ＧＤＦトラップタンパク質を、ＣＨＯ細胞株において発現させた。３つの異なるリーダー配列を検討した：
（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）、（ｉｉ）組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、および（ｉｉｉ）天然。

【0414】

選択した型はＴＰＡリーダーを使用し、以下の非プロセシングアミノ酸配列を有する：

【化41】

【0415】

このポリペプチドは、以下の核酸配列（配列番号６７）によってコードされる：

【化42】

【0416】

精製は、例えば以下の３つまたはそれより多くを任意の順序で含む一連のカラムクロマトグラフィーステップによって達成することができる：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィー。ウイルスの濾過および緩衝液交換によって、精製を完了することができる。精製スキームの例において、細胞培養培地を、プロテインＡカラムに通過させ、１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄した後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０によって溶出した。低いｐＨの溶出液を、ウイルスクリアランスステップとして室温で３０分間維持する。次に、溶出液を中和し、Ｑ－セファロースイオン交換カラムに通過させ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ中で洗浄し、ＮａＣｌ濃度が１５０ｍＭ～３００ｍＭである５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０中に溶出させた。次に、溶出液を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１．１Ｍ硫酸アンモニウムに変化させ、フェニルセファロースカラムに通過させて、洗浄し、硫酸アンモニウムが１５０～３００ｍＭである５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０中に溶出させた。溶出液を透析し、使用するために濾過した。

【0417】

追加のＧＤＦトラップ（アクチビンＡ結合の、ミオスタチンまたはＧＤＦ１１結合に対する比を低減させるように修飾したＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質）は、参照により本明細書に組み込まれている国際公開第２００８／０９７５４１号および国際公開第２００６／０１２６２７号に記載されている。

【0418】

（実施例４）
ＧＤＦ－１１およびアクチビン媒介性シグナル伝達に関するバイオアッセイ
Ａ－２０４レポーター遺伝子アッセイを使用して、ＧＤＦ－１１およびアクチビンＡによるシグナル伝達に対するＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃタンパク質およびＧＤＦトラップの効果を評価した。細胞株：ヒト横紋筋肉腫（筋肉由来）。レポーターベクター：ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２（Dennlerら、１９９８年、EMBO、１７巻：３０９１～３１００頁に記載）
。ＣＡＧＡ１２モチーフはＴＧＦβ応答性遺伝子（例えば、ＰＡＩ－１遺伝子）に存在することから、このベクターは、ＳＭＡＤ２および３を通してシグナル伝達する因子に関して一般的に有用である。

【0419】

１日目：Ａ－２０４細胞を４８ウェルプレートに分割する。

【0420】

２日目：Ａ－２０４細胞に、ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２ １０μｇまたはｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２（１０μｇ）＋ｐＲＬＣＭＶ（１μｇ）およびＦｕｇｅｎｅをトランスフェクトした。

【0421】

３日目：因子（培地＋０．１％ＢＳＡ中で希釈）を添加する。阻害剤は、細胞に添加する前に因子と共に１時間プレインキュベートする必要がある。６時間後、細胞をＰＢＳによってすすぎ、溶解させた。

【0422】

この後にルシフェラーゼアッセイを行う。いかなる阻害剤も存在しない場合、アクチビンＡは、レポーター遺伝子発現の１０倍刺激および約２ｎｇ／ｍｌのＥＤ５０を示した。ＧＤＦ－１１：１６倍刺激、ＥＤ５０：約１．５ｎｇ／ｍｌ。

【0423】

ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃタンパク質およびＧＤＦトラップの活性を、上記のように細胞に基づくアッセイにおいて試験した。結果を以下の表に要約する。一部のバリアントは、異なるＣ末端短縮構築物において試験した。ＧＤＦトラップ（Ｌ７９ＤおよびＬ７９Ｅバリアント）は、アクチビンＡ阻害の実質的な喪失を示したが、ＧＤＦ－１１のほぼ野生型の阻害を保持した。
可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ－ＦｃのＧＤＦ－１１およびアクチビンＡに対する結合：

【表3-1】

【表3-2】

【0424】

（実施例５）
短縮ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインを有するＧＤＦトラップの生成
ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５～１３１）－ｈＦｃと呼ばれる短縮ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインを有するＧＤＦトラップは、ＴＰＡリーダーと、ロイシンからアスパラギン酸への置換（配列番号１における残基７９での）を含む短縮細胞外ドメイン（配列番号１の残基２５～１３１）とのＮ末端融合、およびヒトＦｃドメインと、リンカー（３つのグリシン残基）とのＣ末端融合によって生成した（図１２、配列番号１３１）。ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５～１３１）－ｈＦｃの細胞精製型の配列を、図１３（配列番号１３２）に提示し、リーダー、リンカー、またはＦｃドメインを有しない成熟細胞外ドメインを図１４（配列番号１３３）に提示する。この融合タンパク質をコードする１つのヌクレオチド配列を、その相補的配列（配列番号１３５）と共に図１５（配列番号１３４）に示し、全く同じ融合タンパク質をコードする代替のヌクレオチド配列を、図１６（配列番号１３６）に示し、その相補的配列（配列番号１３７）を示す。

【0425】

（実施例６）
２回短縮ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインを有するＧＤＦトラップによる選択的リガンド結合
いくつかのリガンドに対するＧＤＦトラップおよび他のＡｃｔＲＩＩＢ－ｈＦｃタンパク質の親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）機器によってｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。結果を以下の表に要約する。複合体の会合および解離が非常に速いためにｋ_ｏｎおよびｋ_ｏｆｆの正確な決定ができないことから、Ｋｄ値を定常状態での親和性のフィットによって得た。
ＡｃｔＲＩＩＢ－ｈＦｃバリアントのリガンド選択性：

【表4】

【0426】

短縮細胞外ドメインを有するＧＤＦトラップ、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５～１３１）－ｈＦｃは、より長いバリアントＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２０～１３４）－ｈＦｃによって示されるリガンド選択性と等しいかまたは優れており、Ｌ７９Ｄ置換を欠如するＡｃｔＲＩＩＢ－ｈＦｃ相対物と比較して、より顕著なアクチビンＡ結合の喪失、アクチビンＢ結合の部分的喪失、およびほぼ完全なＧＤＦ１１結合の保持を示した。短縮体単独（Ｌ７９Ｄ置換を有しない）は、本明細書で示したリガンドにおける選択性を変更しなかったことに注意されたい［ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９ ２５～１３１）－ｈＦｃをＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９ ２０～１３４）－ｈＦｃと比較する］。ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５～１３１）－ｈＦｃもまた、Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達リガンドＧＤＦ８ならびにＳｍａｄ１／５／８リガンドＢＭＰ６およびＢＭＰ１０に対して強い結合から中間の結合を保持する。

【0427】

（実施例７）
ＡｃｔＲＩＩＢ５に由来するＧＤＦトラップ
他の研究者らは、ＡｃｔＲＩＩＢ膜貫通ドメインを含むエクソン４が異なるＣ末端配列により置き換えられているＡｃｔＲＩＩＢの代替の可溶性型（ＡｃｔＲＩＩＢ５と称された）を報告した（例えば、国際公開第２００７／０５３７７５号を参照されたい）。

【0428】

そのリーダーを有しない天然ヒトＡｃｔＲＩＩＢ５の配列は以下の通りである：

【化43】

【0429】

ロイシンからアスパラギン酸への置換、または他の酸への置換を、記載される天然位置７９（下線）で実施して、以下の配列を有するバリアントＡｃｔＲＩＩＢ５（Ｌ７９Ｄ）を構築してもよい：

【化44】

【0430】

このバリアントを、ＴＧＧＧリンカー（一重下線）によってヒトＦｃ（二重下線）に接続し、以下の配列を有するヒトＡｃｔＲＩＩＢ５（Ｌ７９Ｄ）－ｈＦｃ融合タンパク質を生成してもよい：

【化45】

【0431】

この構築物をＣＨＯ細胞において発現させてもよい。

【0432】

（実施例８）
ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体の生成
各々が、細胞外ドメインとＦｃドメインの間に位置するリンカーによって個別にＦｃドメインに融合されている、ヒトＡｃｔＲＩＩＢおよびヒトＡＬＫ４の細胞外ドメインを含むＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロマー複合体を構築した。個々の構築物をそれぞれ、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチドと呼び、各々の配列を以下に提供する。

【0433】

ＡｃｔＲＩＩＢ－ＦｃまたはＡＬＫ４－Ｆｃホモ二量体複合体とは対照的に、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロマー複合体の形成を促進する方法論は、非対称のヘテロマー複合体の形成を誘導するために、Ｆｃドメインのアミノ酸配列に変更を導入することである。Ｆｃドメインを使用して非対称の相互作用対を作製するための多くの異なるアプローチが本開示に記載されている。

【0434】

１つのアプローチにおいて、配列番号７１および７３、ならびに配列番号７４および７６のＡｃｔＲＩＩＢ－ＦｃおよびＡＬＫ４－Ｆｃポリペプチド配列においてそれぞれ例証されるように、１つのＦｃドメインを、相互作用面でカチオン性アミノ酸を導入するように変更し、他のＦｃドメインを、相互作用面でアニオン性アミノ酸を導入するように変更する。ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチドは各々、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）リーダーを使用する。

【0435】

ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃポリペプチド配列（配列番号７１）を以下に示す：

【化46】

【0436】

リーダー（シグナル）配列およびリンカーを下線で示す。可能性があるホモ二量体複合体のいずれかではなくてＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（酸性アミノ酸をリシンより置き換える）を、上記の二重下線によって示されるようにＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質のＦｃドメインに導入することができる。配列番号７１のアミノ酸配列は、必要に応じて、Ｃ末端からリシン（Ｋ）が除去された状態で提供され得る。

【0437】

このＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸配列（配列番号７２）によってコードされる：

【化47-1】

【化47-2】

【0438】

成熟ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号７３）は以下の通りであり、必要に応じてＣ末端からリシン（Ｋ）が除去された状態で提供され得る。

【化48】

【0439】

ＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチド（配列番号７４）の相補性型は以下の通りである：

【化49】

【0440】

リーダー配列およびリンカーを、下線で示す。上記の配列番号７１および７３のＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を誘導するために、２つのアミノ酸置換（リシンをアスパラギン酸により置き換える）を、上記の二重下線によって示されるようにＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入することができる。配列番号７４のアミノ酸配列は、必要に応じてＣ末端でリシン（Ｋ）が付加された状態で提供され得る。

【0441】

このＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸（配列番号７５）によってコードされる：

【化50-1】

【化50-2】

【0442】

成熟ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質配列（配列番号７６）は以下の通りであり、必要に応じて、Ｃ末端でリシン（Ｋ）が付加された状態で提供され得る。

【化51】

【0443】

配列番号７３および配列番号７６のＡｃｔＲＩＩＢ－ＦｃおよびＡＬＫ４－Ｆｃタンパク質をそれぞれ、同時発現させて、ＣＨＯ細胞株から精製し、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせてもよい。

【0444】

非対称Ｆｃ融合タンパク質を使用してヘテロ多量体複合体の形成を促進するための別のアプローチでは、Ｆｃドメインをそれぞれ、配列番号７７および７８ならびに配列番号７９および８０のＡｃｔＲＩＩＢ－ＦｃおよびＡＬＫ４－Ｆｃポリペプチド配列において例証されるように、相補的な疎水性相互作用および追加の分子間ジスルフィド結合を導入するように変更する。ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチドはそれぞれ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）リーダーを使用する。

【0445】

ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃポリペプチド配列（配列番号７７）を以下に示す：

【化52】

【0446】

リーダー（シグナル）配列およびリンカーを下線で示す。可能性があるホモ二量体複合体のいずれかではなくてＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインにより、およびスレオニンをトリプトファン（trytophan）により置き換える）を、上記の二重下線によって示されるよ
うに融合タンパク質のＦｃドメインに導入することができる。配列番号７７のアミノ酸配列は、必要に応じて、Ｃ末端からリシン（Ｋ）が除去された状態で提供され得る。

【0447】

成熟ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチドは以下の通りである：

【化53】

【0448】

ＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチドの相補性型（配列番号７９）は以下の通りであり、必要に応じて、Ｃ末端からリシン（Ｋ）が除去された状態で提供され得る。

【化54】

【0449】

リーダー配列およびリンカーを下線で示す。上記の配列番号７７および７８のＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチドのヘテロ二量体の形成を誘導するために、４つのアミノ酸置換を、上記の二重下線によって示されるようにＡＬＫ４融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入することができる。配列番号７９のアミノ酸配列は、必要に応じて、Ｃ末端からリシン（Ｋ）が除去された状態で提供され得る。

【0450】

成熟ＡＬＫ４－Ｆｃ融合タンパク質配列は以下の通りであり、必要に応じて、Ｃ末端からリシン（Ｋ）が除去された状態で提供され得る。

【化55】

【0451】

配列番号７８および配列番号８０のＡｃｔＲＩＩＢ－ＦｃおよびＡＬＫ４－Ｆｃタンパク質をそれぞれ、同時発現させてＣＨＯ細胞株から精製し、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせてもよい。

【0452】

様々なＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ複合体の精製は、例えば以下の３つまたはそれより多くを任意の順序で含む一連のカラムクロマトグラフィーステップによって達成することができる：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィー。ウイルスの濾過および緩衝液交換によって、精製を完了することができる。

【0453】

非対称Ｆｃ融合タンパク質を使用してヘテロマー複合体の形成を促進するための別のアプローチでは、Ｆｃドメインを、配列番号１３９～１４２および１４３～１４６のＡｃｔＲＩＩＢ－ＦｃおよびＡＬＫ４－Ｆｃポリペプチド配列においてそれぞれ例証されるように、分子の真の電荷に基づいて精製を容易にするために２つのＦｃドメインの間に、相補的な疎水性相互作用、追加の分子間ジスルフィド結合、および静電気的な差を導入するように変更する。ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチドおよびＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチドは各々、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）リーダーを使用する。

【0454】

ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃポリペプチド配列（配列番号１３９）を以下に示す：

【化56】

【0455】

リーダー配列およびリンカーを下線で示す。可能性があるホモ二量体複合体のいずれかではなくてＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体の形成を促進するために、２つのアミノ酸置換（セリンをシステインにより、およびスレオニンをトリプトファンにより置き換える）を、上記の二重下線によって示されるように融合タンパク質のＦｃドメインに導入することができる。ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体の精製を容易にするために、２つのアミノ酸置換（リシンを酸性アミノ酸により置き換える）をまた、上記の二重下線によって示されるように融合タンパク質のＦｃドメインに導入することができる。配列番号１３９のアミノ酸配列は、必要に応じて、Ｃ末端でリシンが付加された状態で提供され得る。

【0456】

このＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質は、以下の核酸（配列番号１４０）によってコードされる：

【化57】

【0457】

成熟ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチドは以下の通りであり（配列番号１４１）、必要に応じて、Ｃ末端でリシンが付加された状態で提供され得る。

【化58】

【0458】

このＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチドは以下の核酸（配列番号１４２）によってコードされる：

【化59】

【0459】

ＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチドの相補性型（配列番号１４３）は、以下の通りであり、必要に応じて、Ｃ末端からリシンが除去された状態で提供され得る。

【化60】

【0460】

リーダー配列およびリンカーを下線で示す。上記の配列番号１３９および１４１のＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を誘導するために、４つのアミノ酸置換（チロシンをシステインにより、スレオニンをセリンにより、ロイシンをアラニンにより、およびチロシンをバリンにより置き換える）を、上記の二重下線によって示されるようにＡＬＫ４融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入することができる。ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体の精製を容易にするために、２つのアミノ酸置換（アスパラギンをアルギニンにより、およびアスパラギン酸をアルギニンにより置き換える）をまた、上記の二重下線によって示されるようにＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃドメインに導入することができる。配列番号１４３のアミノ酸配列は、必要に応じて、Ｃ末端からリシンが除去された状態で提供され得る。

【0461】

このＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸（配列番号１４４）によってコードされる：

【化61-1】

【化61-2】

【0462】

成熟ＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチド配列は、以下の通りであり（配列番号１４５）、必要に応じて、Ｃ末端からリシンが除去された状態で提供され得る。

【化62】

【0463】

このＡＬＫ４－Ｆｃ融合ポリペプチドは、以下の核酸（配列番号１４６）によってコードされる：

【化63-1】

【化63-2】

【0464】

配列番号１４１および配列番号１４５のＡｃｔＲＩＩＢ－ＦｃおよびＡＬＫ４－Ｆｃタンパク質をそれぞれ、同時発現させて、ＣＨＯ細胞株から精製し、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃを含むヘテロマー複合体を生じさせてもよい。

【0465】

様々なＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ複合体の精製は、例えば、以下の３つまたはそれより多くを任意の順序で含む一連のカラムクロマトグラフィーステップによって達成することができる：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、エピトープに基づくアフィニティクロマトグラフィー（例えば、ＡＬＫ４またはＡｃｔＲＩＩＢ上のエピトープに対する抗体または機能的に同等なリガンドによる）、およびマルチモードクロマトグラフィー（例えば、静電気的および疎水性リガンドの両方を含む樹脂による）。ウイルスの濾過および緩衝液交換によって、精製を完了することができる。

【0466】

（実施例９）
ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体およびＡＬＫ４－Ｆｃホモ二量体と比較したＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体のリガンド結合プロファイル
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）に基づく結合アッセイを使用して、上記のＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体複合体のリガンド結合選択性を、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＦｃおよびＡＬＫ４－Ｆｃホモ二量体複合体のリガンド結合選択性と比較した。ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体、およびＡＬＫ４－Ｆｃホモ二量体を、抗Ｆｃ抗体を使用してシステム上で独立して捕捉した。リガンドを注入し、捕捉した受容体タンパク質の上に流れさせた。結果を以下の表に要約し、有効なリガンドトラップを最も示しているリガンドの解離速度（ｋ_ｄ）を灰色の影をつけて示す。

【表5】

【0467】

これらの比較結合データは、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体が、ＡｃｔＲＩＩＢ－ＦｃまたはＡＬＫ４－Ｆｃホモ二量体のいずれかと比べて変更された結合プロファイル／選択性を有することを実証している。ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体は、いずれかのホモ二量体と比較してアクチビンＢに対して増強された結合を示し、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体に関して観察されたように、アクチビンＡ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１に対して強い結合を保持し、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ３に対して実質的に低減された結合を示す。特に、ＢＭＰ９は、低いかまたは観察可能ではないＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体に対する親和性を示すが、このリガンドは、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体に対して強く結合する。ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体と同様に、ヘテロ二量体は、ＢＭＰ６に対して中間レベルの結合を保持する。図１９を参照されたい。

【0468】

加えて、Ａ－２０４レポーター遺伝子アッセイを使用して、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９によるシグナル伝達に対するＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体およびＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体の効果を評価した。細胞株：ヒト横紋筋肉腫（筋肉に由来する）。レポーターベクター：ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２（Dennlerら、１９９８年、EMBO、
１７巻：３０９１～３１００頁に記載されている）。ＣＡＧＡ１２モチーフは、ＴＧＦβ応答性遺伝子（ＰＡＩ－１遺伝子）に存在するため、このベクターは、Ｓｍａｄ２および３を通してシグナル伝達する因子に関して一般的に有用である。例示的なＡ－２０４レポーター遺伝子アッセイを以下に概説する。

【0469】

１日目：Ａ－２０４細胞を４８ウェルプレートに分割する。

【0470】

２日目：Ａ－２０４細胞に、ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２ １０μｇまたはｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２（１０μｇ）＋ｐＲＬＣＭＶ（１μｇ）およびＦｕｇｅｎｅをトランスフェクトした。

【0471】

３日目：因子（培地＋０．１％ＢＳＡ中で希釈）を添加する。阻害剤は、細胞に添加する前、因子と共に約１時間プレインキュベートする必要がある。約６時間後、細胞をＰＢＳによってすすいだ後、溶解した。

【0472】

上記のステップの後、ルシフェラーゼアッセイを実施した。

【0473】

ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体およびＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体はいずれも、このアッセイにおいてアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、およびＧＤＦ８の強力な阻害剤であると決定された。特に、図１９に例証したホモ二量体／ヘテロ二量体のＩＣ_５０データの比較において認められ得るように、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体は、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体と同様に、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１シグナル伝達経路を阻害する。しかし、ＢＭＰ９およびＢＭＰ１０シグナル伝達経路のＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体による阻害は、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体と比較して有意に低減される。このデータは、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体およびＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体の両方が、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１に対して強い結合を示したが、ＢＭＰ１０およびＢＭＰ９は、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体と比較してＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体に対して有意に低減された親和性を有することが観察された上記の結合データと一貫している。

【0474】

したがってまとめると、これらのデータは、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体が、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体と比較してアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１のより選択的なアンタゴニストであることを実証する。したがって、ＡＬＫ４－Ｆｃ：ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃヘテロ二量体は、そのような選択的アンタゴニズムが有利である、ある特定の応用ではＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃホモ二量体より有用である。例としては、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＣ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１の１つまたは複数のアンタゴニズムを保持するが、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、およびＢＭＰ６の１つまたは複数のアンタゴニズムを最小限に抑えることが望ましい治療応用が挙げられる。

【0475】

（実施例１０）
ＴＧＦβＲＩＩ－Ｆｃ融合タンパク質の生成
ヒトＴＧＦβＲＩＩは、天然では、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の選択的スプライシングによって生成されるＡ（長鎖）およびＢ（短鎖）の少なくとも２つのアイソフォームとして存在する（図１０および１１）。ＴＧＦβＲＩＩは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に対して高い親和性で結合する。以下に詳述するように、ＴＧＦβＲＩＩ 長鎖アイソフォームの細胞外ドメインを含むＴＧＦβＲＩＩ－Ｆｃ融合タンパク質（ＴβＲＩＩ_長鎖）を生成した。

【0476】

野生型ｈＴβＲＩＩ_長鎖（２３～１８４）配列を以下に示し（配列番号１４７）、２５アミノ酸の挿入を下線で示す。スプライシングによって挿入に対してＣ末端側の隣接位置で保存的アミノ酸置換（Ｖａｌ→Ｉｌｅ）が起こることに注意されたい。いくつかのｈＴβＲＩＩ_短鎖バリアントおよびそのｈＴβＲＩＩ_長鎖相対物の配列の関係を図２４に示す。

【化64】

【0477】

ｈＴβＲＩＩ_長鎖（２３～１８４）ドメインがＣ末端で（リンカーを介して）ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインに融合し、Ｎ末端でＴＰＡリーダー配列に融合したｈＴβＲＩＩ_長鎖（２３～１８４）－Ｆｃ融合タンパク質を生成し、これは以下のアミノ酸配列（配列番号１４８）を有する：

【化65】

【0478】

Ｎ末端リーダー配列およびＣ末端Ｆｃドメインを、一重下線で表し、リンカードメインを二重下線で示す。ｈＴβＲＩＩ_長鎖（２３～１８４）－Ｆｃ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、以下のヌクレオチド配列（配列番号１４９）を有する：

【化66-1】

【化66-2】

【0479】

ｈＴβＲＩＩ_長鎖（２３～１８４）－Ｆｃ融合タンパク質のプロセシング型は、以下のアミノ酸配列（配列番号１５０）を有する：

【化67】

【0480】

ｈＴβＲＩＩ_長鎖（２３～１８４）－Ｆｃ融合タンパク質を、ＣＨＯ細胞において発現させ、濾過およびプロテインＡクロマトグラフィーによって条件培地から精製した。レポーター遺伝子アッセイのための試料の純度を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析によって評価した。

【0481】

本明細書に記載されるある特定の動物モデルでの使用のために、本明細書においてｍＴβＲＩＩ_長鎖－Ｆｃと呼ぶ、マウスＴβＲＩＩアイソフォーム１の成熟完全長ＥＣＤを含むＦｃ融合タンパク質を生成した。マウスＴβＲＩＩアイソフォーム１は、ヒトＴβＲＩＩアイソフォームＡ（長鎖型）と相同であり、このように、上記のｈＴβＲＩＩ_長鎖（２３～１８４）－Ｆｃ融合タンパク質のマウス等価型である。ヒト型と同様に、ｍＴβＲＩＩ_長鎖－Ｆｃは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に対して高い親和性（ピコモル濃度）で結合するが、ＴＧＦβ２には結合しないことが決定された。加えて、ｈＴβＲＩＩ_長鎖（２３～１８４）－Ｆｃ融合タンパク質およびｍＴβＲＩＩ_長鎖－Ｆｃは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３活性の強力な阻害剤であるが、細胞に基づくアッセイにおいてＴＧＦβ２活性を阻害しないことが決定された。

【0482】

（実施例１１）
ＡｃｔＲＩＩおよびＴＧＦβアンタゴニストの抗腫瘍活性
ＡｃｔＲＩＩＡ－ｍＦｃ（配列番号５０のマウスＦｃ型）、ＡｃｔＲＩＩＢ－ｍＦｃ（配列番号５８のマウスＦｃ型）、およびＴβＲＩＩ_長鎖（２３～１８４）－ｍＦｃ（配列番号１５０のマウスＦｃ型）融合タンパク質にある可能性がある抗腫瘍活性を、同系マウス白血病モデルにおいて試験した。８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに、処置を無作為に割付し（ｎ＝１０匹／群）、ＡｃｔＲＩＩＡ－ｍＦｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＡｃｔＲＩＩＢ－ｍＦｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＴβＲＩＩ_長鎖（２３～１８４）－ｍＦｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）、またはビヒクル（リン酸緩衝食塩水、ＰＢＳ、５ｍｌ／ｋｇ）をがん細胞の投与の２日前に開始して週に２回腹腔内に処置した。０日目、ＰＢＳ（１００μＬ）中に懸濁させたＲＬ♂１（ＲＬｍａｌｅ１）細胞１×１０^６個を各マウスに皮下接種した。ＲＬｍａｌｅ１は、ＢＡＬＢ／ｃ起源のＸ線誘導白血病である（Sato Hら、１９７３年、J Exp Med、１３８巻：５９３～６０６頁）。マウスに接種後、体重および腫瘍体積を週に２回測定した。腫瘍体積は、キャリパーによって得た２次元測定から計算した：腫瘍体積（ｍｍ^３）＝（Ｌ×Ｗ×Ｗ）／２、式中ＬおよびＷはそれぞれ、腫瘍の長さおよび幅（ｍｍ）である。完全な腫瘍の退縮および無腫瘍生存率（ｔｕｍｏｒ－ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ）はいずれも、Teicher BA（編）Anticancer Drug Development Guide: Preclinical Screening, Clinical Trials, and Approval；Humana Press、１９９７年に従って定義した。地域のＩＡＣＵＣ規則に従って、生存分析のために使用したエンドポイントは、２０００ｍｍ^３より大きい腫瘍体積、２０％より大きい体重減少、または後肢の麻痺であった。異なる群の生存曲線を、生存期間の中央値ならびにログランク（マンテル－コックス）検定によって比較した。

【0483】

以下の表に示すように、ＡｃｔＲＩＩＡ－ｍＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ－ｍＦｃはいずれも、抗腫瘍活性を示した。しかし、ＴβＲＩＩ_長鎖（２３～１８４）－ｍＦｃは、このモデルにおいていかなる認識可能な抗腫瘍活性も実証しなかった。

【表6】

【0484】

ＡｃｔＲＩＩＡ－ｍＦｃまたはＡｃｔＲＩＩＢ－ｍＦｃによる処置によって、５６日目で無腫瘍状態のマウスは１０匹中２匹（２０％）であり、これに対し、ビヒクルおよびＴβＲＩＩ_長鎖（２３～１８４）－ｍＦｃ処置マウスではゼロであった。生存期間の中央値の増加およびログランク検定での高い有意性もまた、ＡｃｔＲＩＩＡ－ｍＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ－ｍＦｃが各々、腫瘍を有するマウスの生存を延長させたことを示している。ＡｃｔＲＩＩＢ－ｍＦｃに対する初回応答は、特に強く、ビヒクル処置群でのゼロと比較して、ＡｃｔＲＩＩＢ－ｍＦｃ処置マウスの５０％が３４日目までに完全な腫瘍の退縮を示した。これらの結果は、ＡｃｔＲＩＩＡ－ｍＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ－ｍＦｃがｉｎ
ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有し、これらのタンパク質、ならびに他のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストががんの処置において有用であり得ることを示している。対照的に、ＴβＲＩＩ_長鎖（２３～１８４）－ｍＦｃのデータは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３の阻害が、抗腫瘍応答を促進するには十分ではないことを示唆している。

【0485】

同じマウス白血病モデルを使用して、ＡｃｔＲＩＩＢ－ｈＦｃ（配列番号５８のホモ二量体）が、ＡｃｔＲＩＩＢ－ｍＦｃと類似の抗腫瘍活性を有するか否か、および抗腫瘍活性がＴ細胞媒介免疫に依存するか否かを評価した。８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに、処置（ｎ＝１０匹／群）を無作為に割付し、ＡｃｔＲＩＩＢ－ｍＦｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＡｃｔＲＩＩＢ－ｈＦｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）、またはビヒクル（ＰＢＳ、５ｍｌ／ｋｇ）を、がん細胞投与の２日前から開始して週に２回腹腔内に処置した。加えて、Ｔ細胞免疫が欠損している７週齢のＮＣｒヌードマウスに、処置（ｎ＝１０匹／群）を無作為に割付し、ＡｃｔＲＩＩＢ－ｍＦｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＡｃｔＲＩＩＢ－ｈＦｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）、またはビヒクル（ＰＢＳ、５ｍｌ／ｋｇ）を、がん細胞投与の２日前から開始して週に２回腹腔内に処置した。最後に、上記の実験期間の間およそ７週間無腫瘍のままであったマウス４匹（ＡｃｔＲＩＩＡ－ｍＦｃを処置したマウス２匹およびＡｃｔＲＩＩＢ－ｍＦｃを処置したマウス２匹）に、ＲＬｍａｌｅ１細胞を再チャレンジし、抗腫瘍免疫の記憶に関して試験した。０日目、各マウスに、ＰＢＳ（１００μＬ）に懸濁させたＲＬ♂１（ＲＬｍａｌｅ１）細胞１×１０^６個を皮下接種した。マウスに接種後、体重および腫瘍体積を週に２回測定した。地域のＩＡＣＵＣ規則に従って、生存分析のために使用したエンドポイントは、２０００ｍｍ^３より大きい腫瘍体積、２０％より大きい体重減少、または後肢の麻痺であった。

【0486】

以下の表に示すように、ＡｃｔＲＩＩＢ－ｍＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ－ｈＦｃの抗腫瘍効果はマウスの系統に依存した。

【表7】

【0487】

ＡｃｔＲＩＩＢ－ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ－ｍＦｃはいずれも、以下の表に示すように免疫コンピテントなＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて抗腫瘍活性を示した。ＡｃｔＲＩＩＢ－ｍＦｃまたはＡｃｔＲＩＩＢ－ｈＦｃによる処置によって、ビヒクル処置マウスでのゼロと比較して、５６日目で無腫瘍状態のマウスはそれぞれ１０％または３０％であった。増加した生存期間の中央値およびログランク検定における高い有意性もまた、ＡｃｔＲＩＩＢ－ｍＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ－ｈＦｃの各々が、腫瘍を有するマウスの生存を促進したことを実証している。重要なことに、ＮＣｒヌードマウスにおけるＡｃｔＲＩＩＢ－ｍＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ－ｈＦｃの抗腫瘍効果は、存在しなかったか、またはＢＡＬＢ／ｃマウスと比較して顕著に鈍化し、それによって、ＡｃｔＲＩＩＢリガンドのこれらの阻害剤の作用機序におけるＴ細胞免疫の関与を暗示していた。その上、前回の実験から引き継いだ４匹の無腫瘍マウスは全て、ＲＬｍａｌｅ１腫瘍細胞の繰り返し接種にもかかわらず、本実験を通して検出可能な腫瘍の成長を示さなかった。これらの結果は、免疫細胞が、ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドにおけるＡｃｔＲＩＩＡ－ｍＦｃまたはＡｃｔＲＩＩＢ－ｍＦｃによる処置によって引き起こされたＲＬｍａｌｅ１腫瘍の退縮を媒介するという証拠、および有効な抗腫瘍免疫応答が腫瘍抗原に対する免疫学的記憶を生成したという証拠をさらに提供する。さらに、これらの結果は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＡｃｔＲＩＩＢ－ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ－ｍＦｃの抗腫瘍活性を確認し、この活性におけるＴ細胞免疫の関与を強く暗示する。まとめると、データは、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用して、ｉｎ ｖｉｖｏで免疫活性を増強することができることを示唆しており、このためそのようなアンタゴニストは、免疫活性の増加が望ましい様々な障害および状況（例えば、免疫－腫瘍学応用ならびに多様な病原体の処置）を処置するために有用であり得る。

【0488】

（実施例１２）
ＡｃｔＲＩＩおよびＴＧＦβアンタゴニスト組合せ治療の抗腫瘍活性
実施例１１に記載されるモデルと同じマウス白血病モデルを使用して、本出願人らは、ＡｃｔＲＩＩＢ－ｈＦｃ抗腫瘍活性を、ＴＧＦβアンタゴニストと組み合わせることによって増強することができるか否かを調べた。組合せ試験に関して、汎特異的ＴＧＦβ抗体（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３に高い親和性で結合する抗体）を、ＴＧＦβアンタゴニストとして使用した。

【0489】

８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに、処置（ｎ＝１０匹／群）を無作為に割付し、ＡｃｔＲＩＩＢ－ｈＦｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＴＧＦβ抗体（ｍＡｂ）（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＡｃｔＲＩＩＡ－ｈＦｃとＴＧＦβ ｍＡｂの組合せ（いずれも１０ｍｇ／ｋｇ）、またはビヒクル（リン酸緩衝食塩水、ＰＢＳ、５ｍｌ／ｋｇ）を、がん細胞投与の２日前から開始して週に２回腹腔内に処置した。０日目に、各マウスに、ＰＢＳ（１００μＬ）中に懸濁させたＲＬ♂１（ＲＬｍａｌｅ１）細胞１×１０^６個を皮下接種した。ＲＬｍａｌｅ１は、ＢＡＬＢ／ｃ起源のＸ線誘発白血病である（Sato Hら、１９７３年、J Exp Med、１３８巻：５９３～６０６頁）。マウスへの接種後、体重および腫瘍体積を先の実施例に記載したように週に２回測定した。異なる群の生存曲線を、生存期間の中央値ならびにログランク（マンテル－コックス）検定によって比較した。

【0490】

以下の表に示すように、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストとＴＧＦβアンタゴニストの組合せ治療は、各々のアンタゴニスト単独に関して観察された場合より大きい抗腫瘍活性を示した。

【表8】

【0491】

ＡｃｔＲＩＩＢ－ｈＦｃ単独またはＴＧＦβ ｍＡｂ単独による処置は、このモデルにおいて腫瘍の退縮に対し控えめな効果を示し、それぞれ、３０％および２０％が無腫瘍状態であった。ＡｃｔＲＩＩＢ－ｈＦｃとＴＧＦβ ｍＡｂの組合せ治療によって、抗腫瘍活性の驚くべき有意な増加が起こり、７０％が無腫瘍状態であり、生存期間の中央値はほぼ倍加した。この型の相乗効果は一般的に、個々の作用剤が異なる細胞機序を通して作用するという証拠であると考えられている。したがって、ＡｃｔＲＩＩまたはＴＧＦβＲＩＩシグナル伝達経路のいずれかを阻害しても、抗腫瘍活性を促進し得るが、両方の経路の阻害を使用すると、抗腫瘍活性の増加が望ましいそのような実験的または臨床的状況において、抗腫瘍活性を相乗的に増加させることができる。まとめると、これらのデータは、ＡｃｔＲＩＩおよびＴＧＦβアンタゴニストは単独で使用することができるが、特にがんを処置するために組み合わせて使用することができることを示している。

【0492】

さらに、ＴＧＦβ ｍＡｂ処置単独の抗腫瘍活性は、このモデルにおいていかなる抗腫瘍活性も有しないことが観察されたＴβＲＩＩ_長鎖（２３～１８４）－ｍＦｃに関する上記のデータを考慮すると意外である。このことは、ＴＧＦβシグナル伝達経路の抗腫瘍活性の機序に対するさらなる洞察を提供し得る。既に記載したように、ＴβＲＩＩ_長鎖（２３～１８４）－ｍＦｃは、高い親和性でＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に結合し、細胞に基づくアッセイにおいてＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３シグナル伝達を中和することができる。しかし、ＴβＲＩＩ_長鎖（２３～１８４）－ｍＦｃは、ＴＧＦβ２に結合しない。これに対し、本試験で使用したＴＧＦβ ｍＡｂは、ＴＧＦβの３つ全てのアイソフォーム（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３）に対して高い親和性で結合する。活性の差を考慮すると、これらのデータは、ＴＧＦβ２が、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３と比較して腫瘍の発達にとってより重要であり得ることを示している。したがって、少なくともＴＧＦβ２活性を阻害するＴＧＦβアンタゴニストは、抗腫瘍応答の促進において有用であり得る。その上、データは、ＴＧＦβ２アンタゴニストをＡｃｔＲＩＩアンタゴニストと共に使用すると、抗腫瘍活性を相乗的に増加させることができ、このように、そのような組合せ治療はがんの処置において有用であり得ることを示唆している。

【0493】

参照による組み入れ
本明細書において言及した全ての刊行物および特許は、各々の個々の刊行物または特許が具体的におよび個々に参照により組み込まれていると示されているかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

【0494】

主題の特定の実施形態を考察してきたが、上記の明細書は、例示的であり、制限的ではない。多くのバリエーションが、本明細書および以下の特許請求の範囲を再検討することにより当業者に明らかとなるであろう。本発明の完全な範囲は、特許請求の範囲を、その、均等物の完全な範囲と共に参照して、および本明細書を、そのようなバリエーションと共に参照することによって決定すべきである。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
患者の免疫応答を誘導または強化するための方法であって、それを必要とする患者に
ａ． ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、および
ｂ． ＴＧＦβアンタゴニスト
を投与することを含み、前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび前記ＴＧＦβアンタゴニストは、有効量で投与される方法。
（項目２）
患者のがんまたは腫瘍を処置するための方法であって、それを必要とする患者に、
ａ． ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、および
ｂ． ＴＧＦβアンタゴニスト
を投与することを含み、前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび前記ＴＧＦβアンタゴニストは、有効量で投与される方法。
（項目３）
患者の免疫疲弊を処置または予防するための方法であって、それを必要とする患者に、
ａ． ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、および
ｂ． ＴＧＦβアンタゴニスト
を投与することを含み、前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストおよび前記ＴＧＦβアンタゴニストは、有効量で投与される方法。
（項目４）
抗原に対する患者の免疫応答を誘導または強化するための方法であって、それを必要とする患者に、ｉ）ＴＧＦβアンタゴニスト、ｉｉ）ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、およびｉｉｉ）前記抗原を投与することを含み、前記ＴＧＦβアンタゴニスト、前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、および前記抗原は、有効量で投与される方法。
（項目５）
病原体またはがんに対して患者にワクチン接種するための方法であって、それを必要とする患者に、ｉ）ＴＧＦβアンタゴニスト、ｉｉ）ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、およびｉｉｉ）病原体またはがん抗原を投与することを含み、前記ＴＧＦβアンタゴニスト、前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、および前記抗原は、前記患者のワクチン接種に有効な量で投与される方法。
（項目６）
ワクチンにより誘導された患者の免疫応答を強化するための方法であって、患者に、ｉ）ＴＧＦβアンタゴニストおよびｉｉｉ）ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを、前記ワクチンにより誘導される前記患者の免疫応答を強化するために有効な量で投与することを含む方法。
（項目７）
患者の免疫応答を強化するための方法であって、それを必要とする患者に、有効量の形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）アンタゴニストを投与することを含む方法。
（項目８）
患者のがんまたは腫瘍を処置するための方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＴＧＦβアンタゴニストを投与することを含む方法。
（項目９）
患者の免疫疲弊を処置または予防するための方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＴＧＦβアンタゴニストを投与することを含む方法。
（項目１０）
抗原に対する患者の免疫応答を誘導または強化するための方法であって、それを必要とする患者に、ｉ）ＴＧＦβアンタゴニストおよびｉｉ）前記抗原を投与することを含み、前記ＴＧＦβアンタゴニストおよび前記抗原は、有効量で投与される方法。
（項目１１）
病原体またはがんに対して患者にワクチン接種するための方法であって、それを必要とする患者に、ｉ）ＴＧＦβアンタゴニストおよびｉｉ）病原体またはがん抗原を投与することを含み、前記ＴＧＦβアンタゴニストおよび前記抗原は、前記患者のワクチン接種に有効な量で投与される方法。
（項目１２）
ワクチンにより誘導された患者の免疫応答を強化するための方法であって、患者に、ＴＧＦβアンタゴニストを、前記ワクチンにより誘導される前記患者の免疫応答を強化するために有効な量で投与することを含む方法。
（項目１３）
前記患者は、がんまたは腫瘍を有する、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目１４）
開始または強化された免疫応答は、がんまたは腫瘍に対するものである、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目１５）
前記開始または強化された免疫応答は、前記患者のがんまたは腫瘍細胞の成長を阻害する、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目１６）
前記開始または強化された免疫応答は、前記患者のがんまたは腫瘍細胞の負荷を減少させる、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目１７）
前記開始または強化された免疫応答は、がんまたは腫瘍転移を処置または予防する、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目１８）
前記がんまたは腫瘍は、前記患者の免疫抑制を促進する、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目１９）
前記がんまたは腫瘍は、前記患者の免疫細胞疲弊を促進する、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目２０）
前記がんまたは腫瘍は、Ｔ細胞疲弊を促進する、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目２１）
前記がんまたは腫瘍は、免疫療法に応答性である、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目２２）
前記患者は、白血病、黒色腫（例えば、転移性黒色腫）、肺がん（例えば、扁平上皮非小細胞肺がん）、腎細胞癌、膀胱がん、中皮腫（例えば、転移性中皮腫）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、食道がん、胃がん、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、多形性神経膠芽腫、および肉腫（例えば、転移性肉腫）からなる群から選択されるがんまたは腫瘍を有する、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目２３）
前記開始または強化された免疫応答は、病原体に対するものである、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目２４）
開始、刺激または強化された免疫応答は、病原体による前記患者の感染を処置または予防する、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目２５）
前記病原体は、前記患者の免疫抑制を促進する、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目２６）
前記病原体は、前記患者の免疫細胞疲弊を促進する、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目２７）
前記病原体は、Ｔ細胞疲弊を促進する、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目２８）
前記病原体は、免疫療法に応答性である、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目２９）
前記病原体は、細菌性、ウイルス性、真菌性、または寄生虫性病原体からなる群から選択される、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目３０）
前記患者は、免疫疲弊を発症するリスクがある、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目３１）
前記患者は、免疫疲弊に関連した疾患または状態を有する、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目３２）
前記開始または強化された免疫応答は、Ｔ細胞免疫応答を含む、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目３３）
前記抗原は、がんまたは腫瘍抗原である、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目３４）
前記がんまたは腫瘍抗原は、白血病、黒色腫（例えば、転移性黒色腫）、肺がん（例えば、扁平上皮非小細胞肺がん）、腎細胞癌、膀胱がん、中皮腫（例えば、転移性中皮腫）、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮がん）、食道がん、胃がん、結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、多形性神経膠芽腫、および肉腫（例えば、転移性肉腫）からなる群から選択されるがんまたは腫瘍に関連する、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目３５）
前記抗原は、病原体抗原である、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目３６）
前記病原体抗原は、細菌性病原体、ウイルス性病原体、真菌性病原体、または寄生虫性病原体からなる群から選択される病原体に関連する、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目３７）
前記がんまたは病原体抗原は、ワクチン接種プロトコールに従って投与される、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目３８）
前記開始または強化された免疫応答は、がんまたは病原体に対して前記患者にワクチン接種する、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目３９）
前記患者に、がんまたは腫瘍を処置するための１つまたは複数の追加の活性剤および／または支持療法がさらに投与される、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目４０）
前記患者に、病原体を処置するための１つまたは複数の追加の活性剤および／または支持療法がさらに投与される、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目４１）
前記患者に、１つまたは複数の追加の免疫腫瘍学的作用剤がさらに投与される、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目４２）
前記１つまたは複数の追加の免疫腫瘍学的作用剤は、アレムツズマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合剤（例えば、ＰＤ－Ｌ１抗体）、ＣＤ２０指向性細胞溶解結合剤（例えば、ＣＤ－２０抗体）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）結合剤（例えば、ＣＴＬＡ－４抗体）、およびプログラム死受容体１（ＰＤ－１）結合剤（例えば、ＰＤ－１抗体）からなる群から選択される、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記患者は、自己免疫疾患を有していない、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目４４）
前記患者は、組織もしくは臓器移植を経験している最中でもなく、組織もしくは臓器移植を受けたこともない、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目４５）
前記患者は、移植片対宿主疾患を有していない、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目４６）
前記ＴＧＦβアンタゴニストは、ＴＧＦβ２に結合する、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目４７）
前記ＴＧＦβアンタゴニストは、ＴＧＦβ２を阻害する、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目４８）
前記ＴＧＦβアンタゴニストは、細胞に基づくアッセイにてＴＧＦβ２を阻害する、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記ＴＧＦβアンタゴニストは、ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ３を阻害し、さらに結合する、項目４６～４８のいずれかに記載の方法。
（項目５０）
前記ＴＧＦβアンタゴニストは、ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ３を阻害する、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記ＴＧＦβアンタゴニストは、ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ３に実質的に結合しない（例えば、１×１０^－７Ｍよりも大きなＫ_ＤでＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ３に結合する）、項目４６に記載の方法。
（項目５２）
前記ＴＧＦβアンタゴニストは、抗体または抗体の組合せである、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目５３）
前記抗体は、ＴＧＦβ２に結合する、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記抗体または抗体の組合せは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に結合する、項目５２に記載の方法。
（項目５５）
前記抗体または抗体の組合せは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３に結合する、項目５２に記載の方法。
（項目５６）
前記抗体は、多重特異性抗体である、項目５２～５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記抗体は、二重特異性抗体である、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記抗体または抗体の組合せは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９からなる群から選択される１つまたは複数のリガンドにさらに結合する、項目５２～５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記抗体または抗体の組合せは、アクチビンに結合する、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記抗体または抗体の組合せは、アクチビンＡに結合する、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記抗体または抗体の組合せは、ｉ）ＡｃｔＲＩＩＡ、ｉｉ）ＡｃｔＲＩＩＢ、またはｉｉｉ）ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢにさらに結合する、項目５２～６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記抗体は、フレソリムマブである、項目５５に記載の方法。
（項目６３）
前記ＴＧＦβアンタゴニストは、ＴＧＦβＲＩＩポリペプチドである、項目１～５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記ＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、
ａ）配列番号３４のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記ＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃドメインをさらに含む融合タンパク質である、項目６３または６４に記載の方法。
（項目６６）
前記免疫グロブリンＦｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃ免疫グロブリンドメインである、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記融合タンパク質は、前記ＴＧＦβＲＩＩポリペプチドドメインと前記免疫グロブリンＦｃドメインとの間に位置するリンカードメインを含む、項目６５または６６に記載の方法。
（項目６８）
前記リンカーは、ＧＧＧ（配列番号２７）、ＧＧＧＧ（配列番号２８）、ＴＧＧＧＧ（配列番号２９）、ＳＧＧＧＧ（配列番号３０）、ＴＧＧＧ（配列番号３１）、ＳＧＧＧ（配列番号３２）、またはＧＧＧＧＳ（配列番号３３）からなる群から選択される、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
前記融合タンパク質は、
ａ．配列番号１４８のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
ｂ．配列番号１５０のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される、項目６５～６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目７０）
前記ポリペプチドまたは融合タンパク質は、グリコシル化アミノ酸、ペグ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、および脂質部分にコンジュゲートされたアミノ酸からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、項目６３～６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目７１）
前記ポリペプチドまたは融合タンパク質は、グリコシル化されており、哺乳動物グリコシル化パターンを有する、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
前記ポリペプチドまたは融合タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣細胞株から取得可能なグリコシル化パターンを有する、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記融合タンパク質のポリペプチドは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に結合する、項目６３～７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目７４）
前記ポリペプチドまたは融合タンパク質は、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３を阻害する、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９からなる群から選択される１つまたは複数のリガンドに結合する、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目７６）
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９からなる群から選択される１つまたは複数のリガンドを阻害する、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目７７）
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、アクチビンＡに結合する、項目７５に記載の方法。
（項目７８）
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、アクチビンＡを阻害する、項目７６に記載の方法。
（項目７９）
前記ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、抗体または抗体の組合せである、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目８０）
前記抗体または抗体の組合せは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９からなる群から選択される１つまたは複数のリガンドに結合する、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
前記抗体または抗体の組合せは、アクチビンＡに結合する、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
前記抗体は、多重特異性抗体である、項目７９～８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
前記抗体は、二重特異性抗体である、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
前記抗体または抗体の組合せは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３からなる群から選択される１つまたは複数のリガンドにさらに結合する、項目７９～８３のいずれか一項に記載の方法。
（項目８５）
前記抗体または抗体の組合せは、ＴＧＦβ２に結合する、項目８４に記載の方法。
（項目８６）
前記抗体または抗体の組合せは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に結合する、項目８４に記載の方法。
（項目８７）
前記抗体または抗体の組合せは、ｉ）ＡｃｔＲＩＩＡ、ｉｉ）ＡｃｔＲＩＩＢ、またはｉｉｉ）ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢにさらに結合する、項目７９～８６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８８）
前記抗体は、フレソリムマブである、項目８４に記載の方法。
（項目８９）
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドである、項目１～７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目９０）
前記ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、
ａ．配列番号１０のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｂ．配列番号１１のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
ｃ．配列番号９のアミノ酸３０～１１０の配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される、項目８９に記載の方法。
（項目９１）
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドである、項目１～７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目９２）
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、
ａ．配列番号１のアミノ酸２９～１０９と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｂ．配列番号１のアミノ酸２５～１３１と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｃ．配列番号２のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｄ．配列番号３のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｅ．配列番号５のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｆ．配列番号６のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｇ．配列番号６５のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｈ．配列番号６８のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｉ．配列番号６９のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
ｊ．配列番号１３３のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される、項目９１に記載の方法。
（項目９３）
前記ポリペプチドは、配列番号１を基準にして７９位に酸性アミノ酸を含まない、項目９２に記載の方法。
（項目９４）
前記ポリペプチドは、配列番号１を基準にして７９位にＤもＥも含まない、項目９３に記載の方法。
（項目９５）
前記ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃドメインをさらに含む融合タンパク質である、項目８９～９４のいずれか一項に記載の方法。
（項目９６）
前記免疫グロブリンＦｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃ免疫グロブリンドメインである、項目９５に記載の方法。
（項目９７）
前記融合タンパク質は、前記ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインと前記免疫グロブリンＦｃドメインとの間に位置するリンカードメインを含む、項目９５または９６に記載の方法。
（項目９８）
前記リンカーは、ＧＧＧ（配列番号２７）、ＧＧＧＧ（配列番号２８）、ＴＧＧＧＧ（配列番号２９）、ＳＧＧＧＧ（配列番号３０）、ＴＧＧＧ（配列番号３１）、ＳＧＧＧ（配列番号３２）、またはＧＧＧＧＳ（配列番号３３）からなる群から選択される、項目９７に記載の方法。
（項目９９）
前記融合タンパク質は、
ａ．配列番号５０のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｂ．配列番号５４のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
ｃ． ｃ）配列番号５７のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択されるＡｃｔＲＩＩＡ－Ｆｃ融合タンパク質である、項目９５～９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１００）
前記融合タンパク質は、
ａ．配列番号５８のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｂ．配列番号６０のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｃ．配列番号６３のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｄ．配列番号６４のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｅ．配列番号６６のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｆ．配列番号７０のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｇ．配列番号１２３のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｈ．配列番号１３１のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
ｉ．配列番号１３２のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択されるＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質である、項目９５～９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０１）
前記ポリペプチドまたは融合タンパク質は、グリコシル化アミノ酸、ペグ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、および脂質部分にコンジュゲートされたアミノ酸からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、項目８９～１００のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０２）
前記ポリペプチドまたは融合タンパク質は、グリコシル化されており、哺乳動物グリコシル化パターンを有する、項目１０１に記載の方法。
（項目１０３）
前記ポリペプチドまたは融合タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣細胞株から取得可能なグリコシル化パターンを有する、項目１０２に記載の方法。
（項目１０４）
前記融合タンパク質のポリペプチドは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９からなる群から選択される１つまたは複数のリガンドに結合する、項目８９～１０３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０５）
前記融合タンパク質のポリペプチドは、アクチビンＡに結合する、項目１０４に記載の方法。
（項目１０６）
前記ポリペプチドまたは融合タンパク質は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ９からなる群から選択される１つまたは複数のリガンドを阻害する、項目８９～１０５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０７）
前記ポリペプチドまたは融合タンパク質は、アクチビンＡを阻害する、項目１０６に記載の方法。
（項目１０８）
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、ＡＬＫ４ポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むヘテロ多量体である、項目１～７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０９）
前記ＡＬＫ４ポリペプチドは、
ａ．配列番号１４のアミノ酸２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４のいずれか１つから開始し、配列番号１４のアミノ酸１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、または１２６のいずれか１つで終了するアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｂ．配列番号１４のアミノ酸３４～１０１と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｃ．配列番号１４のアミノ酸２４～１２６と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｄ．配列番号１５のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｅ．配列番号１９のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択されるポリペプチドを含む、項目１０８に記載の方法。
（項目１１０）
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、
ａ．配列番号１のアミノ酸２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９のいずれか１つから開始し、配列番号１のアミノ酸１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４のいずれか１つで終了するアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｂ．配列番号１のアミノ酸２９～１０９と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｃ．配列番号１のアミノ酸２５～１３１と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｄ．配列番号２のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｅ．配列番号３のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｆ．配列番号５のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
ｇ．配列番号６のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択されるポリペプチドを含む、項目１０８または１０９に記載の方法。
（項目１１１）
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のＬ７９に対応する位置に酸性アミノ酸を含まない、項目１０８～１１０のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
（項目１１２）
前記ＡＬＫ４ポリペプチドは、相互作用対の第１のまたは第２のメンバーを含む異種性ドメインをさらに含む融合タンパク質である、項目１０８～１１１のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
（項目１１３）
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、相互作用対の第１のまたは第２のメンバーを含む異種性ドメインをさらに含む融合タンパク質である、項目１０８～１１２のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
（項目１１４）
前記異種性ドメインは、Ｆｃ免疫グロブリンドメインである、項目１１２または１１３に記載のヘテロ多量体。
（項目１１５）
前記ＡＬＫ４ポリペプチドおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ヘテロ多量体形成を促進する１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、項目１０８～１１４のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
（項目１１６）
前記ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質は、前記ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢドメインと前記異種性ドメインとの間に位置するリンカードメインをさらに含む、項目１１２～１１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１７）
前記リンカードメインは、ＴＧＧＧ（配列番号３１）、ＴＧＧＧＧ（配列番号２９）、ＳＧＧＧＧ（配列番号３０）、ＧＧＧＧＳ（配列番号３３）、ＧＧＧ（配列番号２７）、ＧＧＧＧ（配列番号２８）、およびＳＧＧＧ（配列番号３２）からなる群から選択される、項目１１６に記載の方法。
（項目１１８）
前記ＡＬＫ４融合タンパク質は、
ａ．配列番号７４のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｂ．配列番号７６のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｃ．配列番号７９のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｄ．配列番号８０のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｅ．配列番号１４３のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
ｆ．配列番号１４５のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドを含む、項目１１２～１１７のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
（項目１１９）
前記ＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質は、
ａ．配列番号７１のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｂ．配列番号７３のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｃ．配列番号７７のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｄ．配列番号７８のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｅ．配列番号１３９のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
ｆ．配列番号１４１のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドを含む、項目１１２～１１８のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
（項目１２０）
前記ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは融合タンパク質は、グリコシル化アミノ酸、ペグ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、および脂質部分にコンジュゲートされたアミノ酸からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、項目１０８～１１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２１）
前記ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは融合タンパク質は、グリコシル化されており、哺乳動物グリコシル化パターンを有する、項目１２０に記載の方法。
（項目１２２）
前記ＡＬＫ４および／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは融合タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣細胞株から取得可能なグリコシル化パターンを有する、項目１２１に記載の方法。
（項目１２３）
前記ヘテロ多量体は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、およびＢＭＰ６からなる群から選択される１つまたは複数のリガンドに結合する、項目１０８～１２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２４）
前記ヘテロ多量体は、アクチビンＡに結合する、項目１２３に記載の方法。
（項目１２５）
前記ヘテロ多量体は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、およびＢＭＰ６からなる群から選択される１つまたは複数のＴＧＦβスーパーファミリーリガンドを阻害する、項目１０８～１２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２６）
前記ヘテロ多量体は、アクチビンＡを阻害する、項目１２５に記載の方法。
（項目１２７）
前記ヘテロ多量体は、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、およびＧＤＦ３からなる群から選択される１つまたは複数のリガンドに結合しないかまたは実質的に結合しない、項目１０８～１２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２８）
前記ヘテロ多量体は、対応するＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体と比較してより低い親和性で、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、またはＧＤＦ３の１つまたは複数に結合する、項目１０８～１２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２９）
前記ヘテロ多量体は、医薬調製物中にある、項目１０８～１２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３０）
前記医薬調製物は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満のＡＬＫ４ホモ多量体を含む、項目１２９に記載の方法。
（項目１３１）
前記医薬調製物は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満のＡｃｔＲＩＩＢホモ多量体を含む、項目１２９または１３０に記載の方法。
（項目１３２）
前記ヘテロ多量体は、ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢヘテロ二量体である、項目１０８～１３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３３）
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢに結合する、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目１３４）
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢを阻害する、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目１３５）
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、抗体または抗体の組合せである、項目１３３または１３４に記載の方法。
（項目１３６）
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢに結合する、項目１３５に記載の方法。
（項目１３７）
前記抗体は、多重特異性抗体である、項目１３３～１３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３８）
前記抗体は、二重特異性抗体である、項目１３７に記載の方法。
（項目１３９）
前記抗体または抗体の組合せは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３からなる群から選択される１つまたは複数のリガンドにさらに結合する、項目１３３～１３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４０）
前記抗体または抗体の組合せは、アクチビンＡに結合する、項目１３９に記載の方法。
（項目１４１）
前記抗体または抗体の組合せは、ＴＧＦβ２に結合する、項目１３９または１４０に記載の方法。
（項目１４２）
前記抗体または抗体の組合せは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に結合する、項目１３９または１４０に記載の方法。
（項目１４３）
前記抗体または抗体の組合せは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３に結合する、項目１３９または１４０に記載の方法。
（項目１４４）
前記抗体は、フレソリムマブである、項目１４３に記載の方法。
（項目１４５）
患者の免疫応答を誘導または強化するための方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＡｃｔＲＩＩ：ＴＧＦβアンタゴニストを投与することを含む方法。
（項目１４６）
患者のがんまたは腫瘍を処置するための方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＡｃｔＲＩＩ：ＴＧＦβアンタゴニストを投与することを含む方法。
（項目１４７）
患者の免疫疲弊を処置または予防するための方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＡｃｔＲＩＩ：ＴＧＦβアンタゴニストを投与することを含む方法。
（項目１４８）
抗原に対する患者の免疫応答を誘導または強化するための方法であって、それを必要とする患者に、ｉ）ＡｃｔＲＩＩ：ＴＧＦβアンタゴニストおよびｉｉ）前記抗原を投与することを含み、前記ＡｃｔＲＩＩ：ＴＧＦβアンタゴニストおよび前記抗原は、有効量で投与される方法。
（項目１４９）
病原体またはがんに対して患者にワクチン接種するための方法であって、それを必要とする患者に、ｉ）ＡｃｔＲＩＩ：ＴＧＦβアンタゴニストおよびｉｉ）病原体またはがん抗原を投与することを含み、前記ＡｃｔＲＩＩ：ＴＧＦβアンタゴニストおよび前記抗原は、前記患者のワクチン接種に有効な量で投与される方法。
（項目１５０）
ワクチンにより誘導された患者の免疫応答を強化するための方法であって、患者に、ＡｃｔＲＩＩ：ＴＧＦβアンタゴニストを、前記ワクチンにより誘導される前記患者の免疫応答を強化するために有効な量で投与することを含む方法。
（項目１５１）
項目１３～１４４のいずれか一項に記載のように実施される、項目１４５～１５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５２）
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢに結合する抗体であり、前記ＴＧＦβアンタゴニストは、ＴＧＦβ２に結合する抗体である、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目１５３）
前記ＴＧＦβ抗体は、ＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ３にさらに結合する、項目１５２に記載の方法。
（項目１５４）
前記ＴＧＦβアンタゴニストは、ベータ－グリカンポリペプチドである、いずれかの先行する項目に記載の方法。
（項目１５５）
前記ベータ－グリカンポリペプチドは、可溶性である、項目１５４に記載の方法。
（項目１５６）
前記ベータ－グリカンポリペプチドは、Ｆｃ融合タンパク質である、項目１５４または１５５に記載の方法。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図9-1】

【図9-2】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15-1】

【図15-2】

【図16-1】

【図16-2】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23A】

【図23B】

【図23C】

【図23D】

【図24】

【配列表】

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