特開 2023-125973 測定試料の調製方法および試料調製装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023125973

(43)【公開日】2023-09-07

(54)【発明の名称】測定試料の調製方法および試料調製装置

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20230831BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20230831BHJP

【ＦＩ】

G01N33/53 Y

G01N33/543 541A

【審査請求】未請求

【請求項の数】20

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022030373

(22)【出願日】2022-02-28

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和元年度～令和５年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、「次世代治療・診断実現のための創薬基盤技術開発事業（患者層別化マーカー探索技術の開発）」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(71)【出願人】

【識別番号】390014960

【氏名又は名称】シスメックス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100111383

【弁理士】

【氏名又は名称】芝野 正雅

(72)【発明者】

【氏名】新 和之

(72)【発明者】

【氏名】マルリザ マドゥン

(72)【発明者】

【氏名】佐々木 悠人

(72)【発明者】

【氏名】正見 圭一郎

(72)【発明者】

【氏名】山口 美悠

(57)【要約】

【課題】自動化が容易であるとともに、測定対象細胞のシグナルへの影響の少ない、血液検体から試料を調製する測定試料の調製方法を提供する。
【解決手段】この測定試料の調製方法は、赤血球に結合可能な固相を用いて血液検体から赤血球を除去することと、赤血球が除去された血液検体と細胞を免疫染色する試薬とを反応させることと、を備える。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

赤血球に結合可能な固相を用いて血液検体から赤血球を除去することと、
赤血球が除去された前記血液検体と細胞を免疫染色する試薬とを反応させることと、を備える、測定試料の調製方法。

【請求項2】

前記血液検体から赤血球を除去することは、赤血球と前記固相とを含む複合体を形成し、形成した前記複合体と前記血液検体の上清とを分離することを含む、請求項１に記載の測定試料の調製方法。

【請求項3】

前記複合体は、赤血球と前記固相とが、赤血球および前記固相に対して結合能を有する結合物質を介して結合している、請求項２に記載の測定試料の調製方法。

【請求項4】

赤血球と前記固相とを含む前記複合体を形成することは、前記血液検体と、前記結合物質と、前記固相とを接触させることにより、前記複合体を形成することを含む、請求項３に記載の測定試料の調製方法。

【請求項5】

前記結合物質は、前記赤血球に結合可能な抗体を含む、請求項３または４に記載の測定試料の調製方法。

【請求項6】

前記固相は磁性粒子を有し、
前記血液検体から赤血球を除去することは、前記複合体を磁石により集磁しながら前記血液検体の上清を吸引することを含む、請求項２～５のいずれか１項に記載の測定試料の調製方法。

【請求項7】

前記血液検体から赤血球を除去することは、形成した前記複合体をフィルターにより濾別することにより前記血液検体の上清を分離することを含む、請求項２～５のいずれか１項に記載の測定試料の調製方法。

【請求項8】

前記血液検体から赤血球を除去することは、形成した前記複合体を遠心分離により沈降させて前記血液検体の上清を分離することを含む、請求項２～５のいずれか１項に記載の測定試料の調製方法。

【請求項9】

赤血球が除去された前記血液検体と細胞を免疫染色する試薬とを反応させることは、前記血液検体を遠心分離することを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の測定試料の調製方法。

【請求項10】

血液検体と試薬とを反応させて測定試料を調製する試料調製装置であって、
赤血球に結合可能な固相を用いて血液検体から赤血球を除去する第１処理部と、
赤血球が除去された前記血液検体と細胞を免疫染色する試薬とを反応させる第２処理部と、を備える、試料調製装置。

【請求項11】

前記第１処理部は、赤血球と前記固相とを含む複合体を形成し、形成した前記複合体と前記血液検体の上清とを分離する分離部を含む、請求項１０に記載の試料調製装置。

【請求項12】

前記複合体は、赤血球と前記固相とが、赤血球および前記固相に対して結合能を有する結合物質を介して結合している、請求項１１に記載の試料調製装置。

【請求項13】

前記第１処理部は、前記血液検体と、前記結合物質と、前記固相とを接触させることにより、前記複合体を形成する、請求項１２に記載の試料調製装置。

【請求項14】

前記結合物質は、前記赤血球に結合可能な抗体を含む、請求項１２または１３に記載の試料調製装置。

【請求項15】

前記固相は磁性粒子を有し、
前記第１処理部は、前記複合体を集磁する磁石を含み、前記複合体を前記磁石により集磁しながら前記血液検体の上清を吸引して前記複合体と前記血液検体の上清とを分離する、請求項１１～１４のいずれか１項に記載の試料調製装置。

【請求項16】

前記第１処理部は、形成した前記複合体を濾別して前記血液検体の上清を分離するフィルターを含む、請求項１１～１４のいずれか１項に記載の試料調製装置。

【請求項17】

前記第１処理部は、形成した前記複合体を遠心分離により沈降させて前記血液検体の上清を分離する第２遠心分離部を含む、請求項１１～１４のいずれか１項に記載の試料調製装置。

【請求項18】

前記第２処理部は、前記血液検体を遠心分離する第１遠心分離部を含む、請求項１０～１７のいずれか１項に記載の試料調製装置。

【請求項19】

前記血液検体が収容された検体容器が載置される検体セット部と、
前記第２処理部において反応させる前記血液検体が収容される反応容器が載置される反応容器供給部と、
前記反応容器供給部と前記第２処理部との間で前記反応容器を移送するための容器移送部と、
前記第１処理部において処理される前記血液検体が収容される処理容器に前記検体容器から前記血液検体を分注するための第１分注部と、
試薬設置部に設置される試薬を、前記第１処理部の前記処理容器、または、前記第２処理部内の前記反応容器に分注するための第２分注部と、をさらに備える、請求項１０～１８のいずれか１項に記載の試料調製装置。

【請求項20】

前記第２分注部は、前記処理容器から上清を吸引し、前記第２処理部内の前記反応容器に分注する、請求項１９に記載の試料調製装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、血液検体から試料を調製する測定試料の調製方法および試料調製装置に関する。

【背景技術】

【0002】

血液に含まれる白血球を分析するために、フローサイトメータを用いた分析が広く用いられている。例えば、血液に含まれる測定対象の細胞の細胞表面抗原や細胞内抗原が標識抗体によって免疫染色され、フローサイトメータによる光学的な測定によって免疫染色された細胞が検出される。このようなフローサイトメータ分析用の試料を血液検体から調製する場合、血液中の赤血球を除去する必要がある。特許文献１には、血液から密度勾配遠心分離によってＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を回収し、回収されたＰＢＭＣの細胞表面抗原と細胞内抗原とを染色し、染色された試料をフローサイトメータによって測定して調節性Ｔ細胞を同定することが開示されている。特許文献２には、フローサイトメータによる分析のための試料を調製する方法が開示されている。特許文献２には、血液細胞を染色する工程、赤血球を溶解剤により溶解する工程および染色された血液細胞を固定化する工程が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特表２０１４－５２８６９７号公報

【特許文献2】特許第６１７０５１１号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

特許文献１に開示されるように遠心分離によってＰＢＭＣを回収する方法は、赤血球を除去する方法として一般的に用いられているが、遠心分離後に遠心管の中間にできるＰＢＭＣの層だけを取り出す操作は、ピペットの先端をＰＢＭＣの層まで挿入し、ＰＢＭＣ以外の層を吸わないようにＰＢＭＣだけをピペットで吸引する手技が必要であり、自動化が難しい。また、特許文献２の溶解剤を用いる方法は、自動化が容易である一方、溶解剤が直接的または間接的にタンパク発現量に影響し、細胞から得られるシグナルが変化するおそれがある。そのため、たとえば、特許文献１に開示される調節性Ｔ細胞のような希少細胞においては検出性能が低下するおそれがある。このため、自動化が容易であるとともに、シグナルへの影響（測定結果の変動）の少ない、血液検体から試料を調製する測定試料の調製方法および試料調製装置が望まれている。

【0005】

この発明は、自動化が容易であるとともに、測定対象細胞のシグナルへの影響の少ない、血液検体から試料を調製する測定試料の調製方法および試料調製装置を実現することに向けたものである。

【課題を解決するための手段】

【0006】

上記目的を達成するため、第１の発明による測定試料の調製方法は、赤血球に結合可能な固相を用いて血液検体から赤血球を除去することと、赤血球が除去された血液検体と細胞を免疫染色する試薬とを反応させることと、を備える。

【0007】

第１の発明による測定試料の調製方法は、上記のように、赤血球に結合可能な固相を用いて血液検体から赤血球を除去する。これにより、赤血球に結合した固相とともに赤血球を除去することができるので、赤血球を除去する処理の自動化が容易である。また、溶解剤により赤血球を溶解して除去する場合と異なり、測定対象細胞のシグナルへの影響（測定結果の変動）を低減することができる。

【0008】

第２の発明による試料調製装置は、図２に示すように、血液検体と試薬とを反応させて測定試料を調製する試料調製装置（１００）であって、赤血球に結合可能な固相を用いて血液検体から赤血球を除去する第１処理部（２０）と、赤血球が除去された血液検体と細胞を免疫染色する試薬とを反応させる第２処理部（３０）と、を備える。

【0009】

第２の発明による試料調製装置は、上記のように、赤血球に結合可能な固相を用いて血液検体から赤血球を除去する第１処理部（２０）を備える。これにより、赤血球に結合した固相とともに赤血球を除去することができるので、赤血球を除去する処理の自動化が容易である。また、溶解剤により赤血球を溶解して除去する場合と異なり、測定対象細胞のシグナルへの影響（測定結果の変動）を低減することができる。

【発明の効果】

【0010】

本発明によれば、自動化が容易であるとともに、測定対象細胞のシグナルへの影響の少ない、測定試料の調製方法および試料調製装置を実現することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】試料調製装置による血液検体から赤血球を除去する第１例～第３例の概略を示した図である。

【図2】試料調製装置の構成例の概要を示した模式図である。

【図3】試料調製装置による処理フローの概略を示した図である。

【図4】試料調製処理の具体例を説明するための図である。

【図5】試料調製装置による反応容器を移送する際のラックの移動を示した図である。

【図6】試料調製装置による検体を分注する際のラックの移動を示した図である。

【図7】試料調製装置による第１処理部により処理する際のラックの移動を示した図である。

【図8】試料調製装置による第１処理部により処理した後のラックの移動を示した図である。

【図9】実施例および比較例のＴｅｆｆ細胞の検出結果を示した図である。

【図10】実施例および比較例のＴｒｅｇ細胞の検出結果を示した図である。

【図11】実施例のリンパ球に分画された細胞のうちＣＤ４の発現量の大きいＴ細胞を分画したスキャッタグラムである。

【図12】比較例のリンパ球に分画された細胞のうちＣＤ４の発現量の大きいＴ細胞を分画したスキャッタグラムである。

【図13】実施例のＣＤ４＋Ｔ細胞のうちＣＤ６２Ｌの発現量の低い細胞（CD4+/CD62L^Low T細胞）を分画したヒストグラムである。

【図14】比較例のＣＤ４＋Ｔ細胞のうちＣＤ６２Ｌの発現量の低い細胞（CD4+/CD62L^Low T細胞）を分画したヒストグラムである。

【図15】実施例のＣＤ４＋Ｔ細胞のうちＣＤ２５およびＦＯＸＰ３の発現量の高いＴ細胞（CD4+/CD25+/FOXP3＋T細胞）を分画したスキャッタグラムである。

【図16】比較例のＣＤ４＋Ｔ細胞のうちＣＤ２５およびＦＯＸＰ３の発現量の高いＴ細胞（CD4+/CD25+/FOXP3＋T細胞）を分画したスキャッタグラムである。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本実施形態の測定試料の調製方法（以下、「本実施形態の調製方法」ともいう）は、赤血球に結合可能な固相を用いて血液検体から赤血球を除去することと、赤血球が除去された前記血液検体と細胞を免疫染色する試薬とを反応させることと、を含む。本実施形態の調製方法によれば、赤血球が除去され、かつ特定の細胞が免疫染色された測定試料が調製される。

【0013】

本実施形態の方法によって調製される測定試料は、血液検体に含まれる細胞が免疫染色された測定試料であり、特にフローサイトメータによる測定に適した測定試料である。血液検体は、例えば、生体由来の検体であり、たとえば、被検体から採取された全血である。被検体は、主としてヒトであるが、ヒト以外の他の動物であってもよい。

【0014】

血液検体は、少なくとも測定対象の細胞と赤血球とを含む。測定対象の細胞とは、例えば白血球であり、より具体的には、リンパ球である。さらに具体的にはＴ細胞である。さらに具体的には、測定対象の細胞は、Ｔ細胞のうちの制御性Ｔ細胞（以下、Ｔｒｅｇ細胞ともいう）およびエフェクターＴ細胞 (以下、Ｔｅｆｆ細胞ともいう)である。これらＴｒｅｇ細胞およびＴｅｆｆ細胞は、後述するようにＴｒｅｇ細胞およびＴｅｆｆ細胞に特異的に発現する細胞表面抗原および細胞内抗原を免疫染色し、フローサイトメトリー法によって得られる蛍光シグナルを取得することにより、互いに区別されて計数される。

【0015】

Ｔｒｅｇ細胞およびＴｅｆｆ細胞以外の細胞から発せられるシグナルは、正確な分類計数を阻害するノイズとなる。特に、血液検体に大量に含まれる赤血球のノイズは大きいため、フローサイトメトリー法による測定前に赤血球を除去する必要がある。

【0016】

従来、血液検体に含まれる赤血球を除去するために、溶解剤が広く用いられている。溶解剤としては、例えば、塩化アンモニウムや界面活性剤が一般的である。これらの溶解剤は安価であり、血液検体と混合するだけで赤血球を除去できる点で調製が容易であることから、ＣＤ４やＣＤ２５のような一般的な抗原マーカーを測定するための測定試料の調製においても広く用いられている。しかしながら、発明者らが検討したところ、特定の細胞表面抗原および細胞内抗原の測定にあたって、従来の溶解剤を用いた赤血球除去の方法では、測定対象とする細胞、特に後述の実施例で述べるＴｒｅｇ細胞およびＴｅｆｆ細胞の測定にあたって、蛍光シグナルに影響があることがわかった。また、発明者らがさらに研究を進めたところ、溶解剤による赤血球除去に代えて、赤血球に結合可能な固相を用いて赤血球を除去することにより、蛍光シグナルへの影響を低減できることがわかった。以下、本実施形態による測定試料の調製方法について、詳述する。

【0017】

＜赤血球除去＞
赤血球に結合可能な固相は、例えば、血液検体と接触することで、血液検体中に浮遊する赤血球を捕捉、吸着することが可能な固相である。赤血球に結合可能な固相は、赤血球に特異的に結合し、測定対象とする細胞、例えば白血球、には結合しない。赤血球に特異的に結合するために、固相の表面には赤血球と結合可能な抗体が固定化されていることが好ましい。赤血球に結合可能な抗体は、例えば、赤血球の表面抗原に抗原抗体反応によって結合可能な抗体（以下、赤血球捕捉抗体ともいう）であることが好ましく、例えば、ＣＤ２３５ａ抗体、ＣＤ５５抗体などが挙げられる。赤血球に特異的に結合可能な抗体としてはＣＤ２３５ａ抗体が特に好ましい。また、マウス由来の血液に含まれる赤血球を除去する場合であれば、ＴＥＲ―１１９抗体を用いてもよい。

【0018】

赤血球捕捉抗体を固相の表面に固定化する方法としては、例えば、アビジン又はストレプトアビジンとビオチンの相互作用を用いることが好ましい。例えば、ビオチン化した赤血球捕捉抗体と、ストレプトアビジンが結合した固相とを反応させることで、固相の表面に赤血球捕捉抗体を固定化することができる。赤血球捕捉抗体は予め固相に固定化された状態で血液検体と混合されてもよいし、赤血球捕捉抗体と固相がそれぞれ別に血液検体と混合され、血液検体中で赤血球捕捉抗体が固相に固定化されてもよい。

【0019】

固相は、粒子であることが好ましい。固相として粒子を用いることで、粒子を血液検体に添加することで、粒子の表面に赤血球を吸着することができる。粒子は血液検体中に分散するため、効率的に赤血球を吸着することができる点で有利である。以下、固相としての粒子を固相粒子という。

【0020】

固相粒子を用いる場合の赤血球除去の例について、図１を参照して説明する。固相粒子を用いる場合の赤血球除去方法の例としては、（Ａ）ＢＦ（Ｂｏｕｎｄ Ｆｒｅｅ）分離法、（Ｂ）濾過法および（Ｃ）凝集法が挙げられる。

【0021】

ＢＦ分離法について説明する。ＢＦ分離法では、固相粒子として磁性粒子が用いられる。図１に示すように、第１の工程において、赤血球捕捉抗体が表面に固定化された磁性粒子が血液検体に添加される。血液検体と磁性粒子の混合物は、好ましくは撹拌され、血液検体中に磁性粒子が分散する。第２の工程において、血液検体中の赤血球が磁性粒子の表面に吸着される。第３の工程において、磁性粒子が磁石によって集磁される。例えば、図１に示すよう、血液検体と磁性粒子の混合物を収容した容器の近傍（図１の例では側面）に磁石Ｍを配置し、容器内に分散していた磁性粒子を容器の内側面に局在化する。これにより容器内で赤血球を分離する。第４の工程において、磁性粒子を集磁した状態の容器内の液体のうち赤血球を含まない部分、例えば上清を分取する。これにより、血液検体から赤血球が分離される。

【0022】

磁性粒子を集磁するために磁石Ｍを容器の側面に配置する時間は、好ましくは１分以上であり、より好ましくは５分以上である。磁石Ｍを配置する位置は、容器の近傍であって、容器内の磁性粒子を局在化させるのに十分な磁力を与えつつ、局在化された磁性粒子を含む複合体を避けてピペッティングにより上清を吸引できる位置であればよく、例えば容器側面又は底面である。磁石Ｍを容器近傍に配置する第３工程は、磁石Ｍと容器を相対的に移動することによって実現できる。例えば、磁性粒子を含む容器を磁石Ｍに近づけてもよいし、容器に対して磁石Ｍを近づけてもよい。

【0023】

ＢＦ分離法では、磁性粒子を容器の側面に集磁することで液相内で赤血球を分離することができるため、操作が容易である利点がある。

【0024】

次に濾過法について説明する。濾過法では、ＢＦ分離法の第１および第２工程と同様に、固相粒子が血液検体に添加され、赤血球が固相粒子の表面に吸着される。第３工程において、赤血球を吸着した固相粒子を含む血液検体が、フィルタＦを備えるカラムに分注される。フィルタＦは、対象細胞、例えば白血球が通過することを許容するが、固相粒子は通過できない大きさのポアサイズを有する多孔質部材からなる。血液検体がフィルタの上面に分注されると、血液検体がフィルタＦによって濾過され、対象細胞がフィルタＦを通過し、赤血球を吸着した固相粒子がフィルタＦにトラップされる。これにより、対象細胞を含む血液検体から赤血球が分離される。

【0025】

なお、濾過法では、フィルタＦを用いた例を図示ししているが、フィルタに代えてビーズカラムを用いてもよい。ビーズカラムを用いる場合、赤血球捕捉抗体を表面に固定化した固相粒子をカラムに充填し、カラムに血液検体が注入される。固相粒子の間の間隙を血液検体が通過するときに、血液検体に含まれる赤血球が固相粒子表面に吸着される。

【0026】

次に凝集法について説明する。凝集法では、ＢＦ分離法の第１および第２工程と同様に、固相粒子が血液検体に添加される。赤血球が固相粒子の表面に吸着されることで、赤血球と固相粒子とが凝集塊を形成する。第３工程において、赤血球を吸着した固相粒子を含む血液検体が所定時間静置される。赤血球と固相粒子とにより形成される凝集塊は、自重によって容器の底部に沈降する。この状態で、対象細胞を含む上清を分取することで、血液検体から赤血球が分離される。

【0027】

凝集法では、赤血球と凝集塊を形成しやすい固相粒子を選択することが好ましく、例えばラテックス粒子を用いることが好ましい。

【0028】

＜免疫染色＞
上記のようにして赤血球が除去された血液検体に含まれる細胞が免疫染色される。免疫染色では、例えば、対象細胞の目的となる抗原に結合可能な標識抗体を含む抗体試薬と、血液検体とが混合されることにより、目的となる抗原が標識される。

【0029】

標識抗体は、例えば、特定の中心波長を有する励起光が照射されたことに応じて、特定の波長の蛍光シグナルを生じる標識分子によって修飾された抗体である。

【0030】

免疫染色によって標識される抗原の数は特に限定されず、１種類であってもよいし、複数種類であってもよい。複数種類の抗原を同時に染色する場合は、互いに異なる蛍光シグナルを発するように標識された複数の標識抗体を含むカクテル試薬と血液検体とを混合することで、複数の目的とする抗原を染色することができる。

【0031】

抗原の種類は、細胞表面に発現する抗原であってもよいし、細胞内に発現する抗原であってもよいし、それらの組み合わせであってもよい。組み合わせる抗原の種類は、目的とする抗原に応じて変更することができる。例えば、後述する実施例では、Ｔｒｅｇ細胞およびＴｅｆｆ細胞を目的の細胞としている。Ｔｅｆｆ細胞は、ＣＤ４抗原陽性のＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）のうち、ＣＤ６２Ｌ抗原が低発現の細胞として同定できる。また、Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞のうち、ＣＤ２５抗原陽性かつＦＯＸＰ３抗原陽性の細胞として同定できる。この例では、細胞表面抗原としてＣＤ４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２５を免疫染色し、かつ、細胞内抗原としてＦＯＸＰ３を免疫染色することができる。

【0032】

発明者らが検討した結果、上記で例示した抗原のうち、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２５、ＦＯＸＰ３は、血液検体に含まれる赤血球を除去するために溶解剤によって処理した場合に、蛍光シグナルが低下することを見出した。これは、溶解剤が細胞に影響を与えることにより、細胞表面および細胞内の抗原が刺激を受け、又はダメージを受けることによるものと考えられる。これに対して、溶解剤に代えて、赤血球に結合可能な固相を用いて赤血球を除去する方法を採用したところ、上述の抗原のシグナルに及ぼす影響を低減できることが確認できた。

【0033】

免疫染色によって細胞表面抗原（例えばＣＤ４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２５）と、細胞内抗原（例えばＦＯＸＰ３）とを染色する場合、細胞表面抗原に特異的に結合する標識抗体を含む第１抗体試薬と、細胞内抗原に特異的に結合する標識抗体を含む第２抗体試薬とを、血液検体と混合する工程を含むことが好ましい。さらに、血液検体と混合する順序は、第１抗体試薬、第２抗体試薬の順であることが好ましい。血液検体は、第１抗体試薬によって細胞表面抗原が染色されたのち、第２抗体試薬の添加前に、固定化剤および膜透過剤と混合されることが好ましい。標識抗体のような大きな分子は細胞膜を通過して細胞内部に入ることができないため、膜透過剤は、標識抗体が細胞膜を通って細胞内に進入することを許容する。固定化剤は、膜透過剤によって処理された細胞膜を通じて、細胞内抗原、つまりタンパク質が拡散しないように固定化する。

【0034】

＜フローサイトメータによる測定＞
免疫染色された測定試料は、フローサイトメータによる測定に供される。フローサイトメータは、フローサイトメトリー法により、免疫染色された細胞から光学的なシグナル、例えば蛍光シグナルを取得し、蛍光シグナルに基づいて細胞を分析する。

【0035】

上記の方法によって赤血球が除去され、かつ細胞が免疫染色された測定試料をフローサイトメータによって測定した場合のＴｒｅｇ細胞およびＴｅｆｆ細胞の分類計数の方法について、以下に説明する。

【0036】

まず、血液検体に含まれる白血球からリンパ球が分類される。リンパ球は、例えば前方散乱光強度および側方散乱光強度に基づくパラメータに基づいて分類される。

【0037】

次に、リンパ球のうち、所定値以上のＣＤ４＋シグナルをもつ細胞が分類される。具体的には、ＣＤ４抗原に結合する標識抗体から発せられる蛍光シグナルが所定値以上である細胞を特定される。分類性能を高めるために、ＣＤ４に対応する蛍光シグナルに加えて、例えば散乱光強度、より好ましくは側方散乱光強度をパラメータとして組み合わせてもよい。

【0038】

ＣＤ４＋細胞のうち、ＣＤ６２Ｌが低発現である細胞（ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗ）が分類される。具体的には、ＣＤ６２Ｌ抗原に結合する標識抗体から発せられる蛍光シグナルが所定値以下である細胞が特定される。ＣＤ６２Ｌ抗原に結合する標識抗体から発せられる蛍光シグナルの強度を横軸、強度に対応する細胞のカウント数を縦軸とするヒストグラムを作成すると、蛍光シグナルの高値側にＣＤ６２Ｌ高発現の細胞のピークが現れ、低値側にＣＤ６２Ｌ低発現の細胞のピークが現れる、いわゆる二峰性のヒストグラムが描かれる。これら２つのピークの間の谷にあたる部分より蛍光シグナルの低値側にプロットされる細胞がＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗとして特定される。

【0039】

ＣＤ４＋細胞のうち、ＦＯＸＰ３＋かつＣＤ２５＋の細胞が分類される。具体的には、ＦＯＸＰ３抗原に結合する標識抗体から発せられる蛍光シグナル（ＦＯＸＰ３シグナル）が所定値以上であり、かつ、ＣＤ２５抗原に結合する標識抗体から発せられる蛍光シグナル（ＣＤ２５シグナル）が所定値以上である細胞が特定される。ＦＯＸＰ３シグナルの強度を第１軸とし、ＣＤ２５シグナルの強度を第２軸とする二次元分布図を作成した場合、２つのシグナルのそれぞれについて所定値以上の領域と所定値未満の領域とが分けられた４つの象限が得られる。このうち、ＦＯＸＰ３シグナルが所定値以上であり、かつＣＤ２５シグナルが所定値以上である象限にプロットされる細胞がＦＯＸＰ３＋かつＣＤ２５＋の細胞として特定される。これにより血液中のＴｒｅｇ細胞及びＴｅｆｆ細胞の数および割合が求められる。血液中のＴｒｅｇ細胞の割合及びＴｅｆｆ細胞の割合は、免疫チェックポイント阻害剤（ニボルマブ）の薬効予測に有効であることがわかっている。

【0040】

具体的に、ＣＤ４＋かつＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗの細胞のリンパ球に対する割合を％Ｔｅｆｆ、ＣＤ４＋かつＦＯＸＰ３＋かつＣＤ２５＋の細胞のリンパ球に対する割合を％Ｔｒｅｇとして求め、以下の式（１）に代入することにより、薬効予測の指標を求めることができる。
指標＝［％Ｔｅｆｆ］^２／［％Ｔｒｅｇ］ ・・・（１）
例えば、この指標を経験的に設定したカットオフと比較することにより、患者をニボルマブの奏功群と非奏功群とに層別化することが可能である。本発明による試料調製方法によれば、Ｔｒｅｇ細胞及びＴｅｆｆ細胞からの蛍光シグナルを精度よく検出でき、正確な計数結果を得ることが可能となる。

【0041】

＜前処理装置による自動化＞
本実施形態の測定試料の調製方法は、対象細胞に対する蛍光シグナルの影響を低減できる利点を有し、かつ、自動化が容易である利点をさらに有する。以下、赤血球に結合可能な固相として磁性粒子を用いた場合の測定試料の調製の自動化の例について説明する。

【0042】

［試料調製装置の概要］
図２を参照して、一実施形態による試料調製装置１００の概要について説明する。

【0043】

図２に示すように、試料調製装置１００は、第１処理部２０と、第２処理部３０とを備える。第１処理部２０は、赤血球に結合可能な固相を用いて血液検体から赤血球を除去する処理を行う。第２処理部３０は、赤血球が除去された血液検体と細胞を免疫染色する試薬とを反応させる処理を行う。

【0044】

第１処理部２０は、処理容器１１を保持するラック１０ａと、反応容器１２を保持するラック１０ｂと、血液検体が収容された検体容器１３を保持するラック１０ｃと、を備える。第１処理部２０は、ラック１０ａ、１０ｂ、１０ｃをそれぞれ横方向（Ｘ１及びＸ２方向）に移動させる第１移動部１５、第２移動部１６、及び第３移動部１７を備える。

【0045】

試料調製装置１００は、第１分注部４１と、容器移送部４２とを備える。第１分注部４１および容器移送部４２は、共通の移送軸４３にＹ方向に移動可能に支持されている。第１分注部４１は、ピペット４１ａを備える。第１分注部４１は、ピペット４１ａを用いて、検体容器１３に収容された血液検体を処理容器１１に分注する。容器移送部４２は、互いに近接及び離間可能な一対のハンド部４２ａを備える。容器移送部４２は、ハンド部４２ａによって反応容器１２を把持し、ラック１０ｂと第２処理部３０との間で反応容器１２を移送する。

【0046】

試料調製装置１００は、血液検体を撹拌する撹拌部５０を備える。撹拌部５０は、検体容器１３をラック１０ｃから取り出して転倒攪拌することにより、検体容器１３内の血液検体を撹拌する。

【0047】

試料調製装置１００は、第２分注部６０を備える。第２分注部６０は、移送軸６１に横方向（Ｘ１及びＸ２方向）に移動可能に支持されている。移送軸６１は、移送軸６２にＹ方向に移動可能に支持されている。これにより、第２分注部６０は、装置内において水平方向に移動可能である。第２分注部６０は、ピペット６０ａを備える。第２分注部６０は、ピペット６０ａを用いて、処理容器１１から上清を吸引し、反応容器１２に分注する。また、第２分注部６０は、後述する試薬設置部７０ａおよび７０ｂに設置される試薬を、第１処理部２０の処理容器１１または第２処理部３０内の反応容器１２に分注する。

【0048】

試料調製装置１００は、試薬設置部７０ａおよび試薬設置部７０ｂを備える。試薬設置部７０ａは、保冷庫を含み、試薬を冷却保持する。試薬設置部７０ｂは、試薬を常温の状態で保持する。

【0049】

試料調製装置１００は、ノズル洗浄部８０を備える。ノズル洗浄部８０は、第２分注部６０のノズルを洗浄する。

【0050】

試料調製装置１００は、装置の各部を制御する制御部９０を備える。制御部９０は、プロセッサおよび記憶部を備える。プロセッサは、たとえばＣＰＵにより構成される。記憶部は、メモリおよびストレージを含みうる。プロセッサは、記憶部に記憶されたプログラムを実行することにより試料調製装置１００の制御部９０として機能する。

【0051】

第１処理部２０は、第１移動部１５に隣接する位置に磁石２１を備える。より具体的には、磁石２１は、第１移動部１５によって、処理容器１１を保持したラック１０ａが原点（最も右側（Ｘ２側））に移動されたときに、ラック１０ａに保持された処理容器１１の側面に隣接する位置に設けられている。図２の例では磁石２１は永久磁石であるが、電磁石であってもよい。

【0052】

第２処理部３０は、遠心管である反応容器１２を周方向に複数保持可能であり、軸を中心に高速回転することで、保持された反応容器１２内の試料の遠心分離を行うことが可能な遠心分離部である。第２処理部３０は、高速で回転するロータ３１と、ロータ３１の外周部に複数設けられたホルダ部３２とを含む。ホルダ部３２は、たとえば筒状形状を有し、内部に反応容器１２を受け容れ可能である。また、ホルダ部３２は、ロータ３１の停止時に、反応容器１２を、その開口が上方に向いた姿勢で保持する。

【0053】

［測定試料の調製方法の概略］
図３を参照して、試料調製装置１００による測定試料の調製方法の概略について説明する。

【0054】

第１分注部４１が、ラック１０ｃに保持された検体容器１３に収容された血液検体の一部を、ラック１０ａに保持された処理容器１１に分注する。第２分注部６０が、血液検体が分注された処理容器１１に、ビオチン化された抗赤血球抗体を含む試薬を分注する。また、ラック１０ｂは、反応容器１２を容器移送部４２により第２処理部３０に移送する。

【0055】

第２分注部６０は、血液検体が分注された処理容器１１に、固相としてのストレプトアビジン結合磁性粒子を含む試薬を分注する。ストレプトアビジン結合磁性粒子とビオチン化された抗赤血球抗体とが反応し、結合することにより、赤血球と固相とを含む複合体が処理容器１１内に形成される。第１移動部１５が処理容器１１を磁石２１の側方に位置付けることにより、複合体が処理容器１１の側方に集められる。

【0056】

第２分注部６０が、複合体が側方に集められた処理容器１１から上清を吸引し、第２処理部３０の反応容器１２に分注する。これにより複合体に含まれる赤血球から、測定対象となる細胞を含む上清が分離される。

【0057】

第２分注部６０は、血液検体が分注された反応容器１２に、抗体試薬を分注する。抗体試薬は、白血球の細胞表面抗原に結合する標識抗体（例えば、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌに結合する標識抗体）を含む抗体カクテル試薬である。試料中の白血球と抗体試薬との反応後に、第２処理部３０は、反応容器１２内の試料に対して遠心分離を行う。遠心分離によって、白血球が反応容器１２の底部に沈降する。第２分注部６０は、遠心分離後の試料の上清を吸引して除去する。これにより、標識抗体と反応した白血球が反応容器１２内に残り、未反応の抗体成分を含む上清が除去される。

【0058】

第２分注部６０は、反応容器１２内に固定・透過剤を分注する。固定・透過剤により、細胞膜内のタンパク質が固定化され、かつ細胞膜内への標識抗体の進入を許容するように膜が透過される。固定・透過剤との反応後に、第２処理部３０は、反応容器１２内の試料の遠心分離を行う。遠心分離によって、白血球が反応容器１２の底部に沈降する。第２分注部６０は、遠心分離後の試料の上清を吸引して除去する。これにより、固定・透過剤によって処理された白血球が反応容器１２内に残り、固定・透過剤を含む上清が除去される。

【0059】

第２分注部６０は、反応容器１２内に抗体試薬を第２分注部６０により分注する。抗体試薬は、細胞内抗原に結合する標識抗体（例えばＦＯＸＰ３に結合する標識抗体）を含む試薬である。試料中の白血球と抗体試薬との反応後に、第２処理部３０は、反応容器１２内の試料に対して遠心分離を行う。遠心分離によって、白血球が反応容器１２の底部に沈降する。第２分注部６０は、遠心分離後の試料の上清を吸引して除去する。これにより、標識抗体と反応した白血球が反応容器１２内に残り、未反応の抗体成分を含む上清が除去される。

【0060】

第２分注部６０は、反応容器１２内にバッファ（例えばリン酸緩衝液）を分注する。これにより、測定試料が調製される。容器移送部４２は、測定試料が収容された反応容器１２をラック１０ｂに移送する。

【0061】

［試料調製装置の動作］
図４を参照して、試料調製装置１００による測定試料の動作について説明する。以下では、第１移動部１５、第２移動部１６および第３移動部１７によるラック１０ａ～１０ｃの移動について、さらに図５～図８も参照する。

【0062】

図５に示すように、ラック１０ａ、１０ｂ、１０ｃは、それぞれ、複数（たとえば、６つ）の容器を保持可能である。ラック１０ａ、１０ｂ、１０ｃは、第１移動部１５、第２移動部１６および第３移動部１７によって、Ｘ１方向及びＸ２方向に搬送される。なお、本実施形態では、第１移動部１５、第２移動部１６および第３移動部１７が一体的にＸ１方向及びＸ２方向にラックを移動する形態を説明するが、第１移動部１５、第２移動部１６および第３移動部１７がそれぞれ独立してラックを移動する形態であってもよい。第１移動部１５、第２移動部１６および第３移動部１７は、ラックに保持された容器の間隔に対応した距離ずつ、ラック１０ａ、１０ｂ、１０ｃをＸ１方向及びＸ２方向に搬送することが可能である。図５～図８では、それぞれの容器の位置をわかりやすく図示するため、容器の間隔に対応する大きさのマス目を図示している。

【0063】

〈検体分注処理〉
検体分注処理に先立って、図５（Ａ）に示すように、作業者により、ラック１０ａに、空の処理容器１１がセットされる。また、作業者により、ラック１０ｂに、空の反応容器１２がセットされる。また、作業者により、ラック１０ｃに血液検体が収容された検体容器１３がセットされる。

【0064】

図４のステップＳ２０１において、反応容器１２としての遠心管がラック１０ｂから第２処理部３０に搬送される。図５（Ｂ）に示すように、位置Ｐ１に、最も左側の反応容器１２が位置するように、ラックがＸ１方向に移動される。位置Ｐ１は、最も右側の位置から１２マス目の位置である。位置Ｐ１において、反応容器１２が容器移送部４２により取り出され、第２処理部３０に移送される。図５（Ｃ）に示すように、位置Ｐ１に次の反応容器１２が位置するように、ラックがＸ１方向に移動される。そして、反応容器１２が、容器移送部４２により取り出され、第２処理部３０に順次移送される。最後の反応容器１２が位置Ｐ１に移動されて、容器移送部４２により第２処理部３０に移送されるまで、この処理が繰り返される。

【0065】

ステップＳ２０２において、検体容器１３内の血液検体が撹拌される。図６（Ａ）に示すように、位置Ｐ２に、最も左側の検体容器１３が位置するように、第３移動部１７によりラックがＸ２方向に移動される。位置Ｐ２は、最も右側の位置から８マス目の位置である。位置Ｐ２において、ラック１０ｃの検体容器１３が撹拌部５０により取り出され、転倒撹拌される。

【0066】

ステップＳ２０３において、検体容器１３から血液検体が吸引されて、ラック１０ａの処理容器１１に吐出されて、血液検体が分注される。図６（Ｂ）に示すように、ステップＳ２０２において撹拌された検体容器１３が位置Ｐ１に位置するように、ラックがＸ１方向に移動される。位置Ｐ１において、第１分注部４１が検体容器１３内の血液検体の一部を吸引し、ラック１０ａに保持された処理容器１１に吸引した血液検体を分注する。図６（Ｃ）に示すように、位置Ｐ２に次の検体容器１３が位置するように、ラックがＸ２方向に移動される。位置Ｐ２において検体容器１３が撹拌部５０により撹拌される。この位置Ｐ２における検体容器１３の撹拌と、それに続く位置Ｐ１における血液検体の分注が、すべての検体容器１３に対して行われるまで繰り返される。図６（Ｄ）は、すべての検体容器１３に対する撹拌と分注が完了した状態の図である。

【0067】

〈ＢＦ分離処理〉
ステップＳ２０４において、血液検体が吐出された処理容器１１に抗体が分注される。図７（Ａ）に示すように、位置Ｐ３に最も左側の処理容器１１が位置するように、ラックがＸ２方向に移動される。位置Ｐ３において、第２分注部６０が、ビオチン化された抗赤血球抗体を処理容器１１に分注する。図７（Ｂ）に示すように、位置Ｐ３に次の処理容器１１が位置するように、ラックがＸ１方向に移動される。そして、位置Ｐ３において、処理容器１１に第２分注部６０により抗赤血球抗体が分注される処理が繰り返される。

【0068】

すべての処理容器１１に分注が完了すると、ステップＳ２０５において、処理容器１１内の血液検体の撹拌が行われる。第１移動部１５により、ラックがＸ１方向およびＸ２方向に繰り返し往復移動されて、処理容器１１内の血液検体が撹拌される。処理容器１１を保持するラック１０ａは、その後、所定時間（例えば２０分）静置される。

【0069】

ステップＳ２０６において、処理容器１１に緩衝液が分注される。第１移動部１５がラック１０ａを移動させて、位置Ｐ３において、各処理容器１１内に第２分注部６０によりバッファが分注される。第１移動部１５によりラック１０ａが高速移動されて、処理容器１１内の血液検体が撹拌される。その後、静置される。たとえば、緩衝液として、ＢＳＡ溶液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が分注される。また、緩衝液が分注された血液検体が撹拌される。

【0070】

ステップＳ２０７において、処理容器１１に磁性粒子が分注される。たとえば、磁性粒子として、ストレプトアビジン結合磁性粒子が分注される。図７（Ｃ）に示すように、位置Ｐ３に最も左側の処理容器１１が位置するように、ラックがＸ１方向に移動される。位置Ｐ３において、処理容器１１に第２分注部６０により、固相としてのストレプトアビジン結合磁性粒子が分注される。図７（Ｄ）に示すように、位置Ｐ３に次の処理容器１１が位置するように、ラックがＸ１方向に移動される。そして、位置Ｐ３において、処理容器１１に第２分注部６０により磁性粒子を含む固相が分注される処理が繰り返される。

【0071】

ステップＳ２０８において、処理容器１１内の血液検体を撹拌して反応が行われる。所要時間はたとえば５分間である。移動部１５によりラックが高速移動されて、処理容器１１内の血液検体が撹拌される。その後、静置される。これにより、赤血球と固相とを含む複合体が処理容器１１内に形成される。

【0072】

ステップＳ２０９において、集磁が行われる。図７（Ｅ）に示すように、位置Ｐ４に各処理容器１１が位置するように、ラックがＸ２方向に移動される。位置Ｐ４は、最も右側のマスから６つ分のマスに対応する位置である。位置Ｐ４に隣接する位置に磁石２１が設けられている。磁石２１により、赤血球と固相とを含む複合体が処理容器１１の内側面に集磁される。所要時間はたとえば１０分間である。

【0073】

ステップＳ２１０において、集磁が行われている処理容器１１内の血液検体の上清（例えば７００μＬ）が吸引され、第２処理部３０の反応容器１２に吐出されて分注される。図８（Ａ）に示すように、位置Ｐ４において各処理容器１１から第２分注部６０により上清が吸引されて、第２処理部３０に移送された各反応容器１２に分注される。

【0074】

ステップＳ２１２において、反応容器１２内の試料が遠心分離される。第２処理部３０は、ロータ３１を高速回転することにより、反応容器１２の底部に白血球を沈降させる。

【0075】

ステップＳ２１３において、反応容器１２内の上清が除去される。第２分注部６０は、遠心分離によって白血球が沈降した反応容器１２の上清（例えば６００μＬ）を吸引して除去する。

【0076】

ステップＳ２１４において、反応容器１２内の試料が撹拌される。ステップＳ２１２およびＳ２１３により、反応容器１２の底部に白血球が沈降している。この沈降した白血球を分散させるため、反応容器１２が撹拌される。第２処理部３０は、ロータ３１を一方向に加減速を繰り返しながら回転させることにより、反応容器１２内の試料を撹拌する。

【0077】

〈第１の染色処理〉
ステップＳ２１５において、反応容器１２に、抗体試薬が分注される。第２分注部６０が、抗体試薬として、ＣＤ２５標識抗体、ＣＤ４標識抗体、ＣＤ６２Ｌ標識抗体を含むカクテル試薬を、第２処理部３０に保持された反応容器１２に分注する。

【0078】

ステップＳ２１６において、第２処理部３０は、ロータ３１を一方向に加減速を繰り返しながら回転させることにより、反応容器１２内の試料を撹拌する。所定時間はたとえば３０分間である。

【0079】

ステップＳ２１７において、反応容器１２に固定前検体用の洗浄液が分注される。第２分注部６０は、洗浄液としてのＰＢＳを反応容器１２内に分注する。

【0080】

ステップＳ２１８において、第２処理部３０は、ロータ３１を一方向に加減速を繰り返しながら回転させることにより、反応容器１２内の試料を撹拌する。

【0081】

ステップＳ２１９において、第２処理部３０は、ロータ３１を一方向に高速回転させることにより、反応容器１２内の試料を遠心分離する。これにより、抗体試薬と反応した白血球が沈降する。

【0082】

ステップＳ２２０において、第２分注部６０が、反応容器１２から上清を吸引して除去する。以上により、表面抗原ＣＤ２５、ＣＤ４、ＣＤ６２Ｌが、それぞれ対応する標識物質により染色される。

【0083】

〈細胞の固定および透過処理〉
ステップＳ２２１において、第２分注部６０が、反応容器１２に固定・透過剤を分注する。

【0084】

ステップＳ２２２において、第２処理部３０は、ロータ３１を一方向に加減速を繰り返しながら回転させることにより、反応容器１２内の試料を撹拌し、反応が行われる。所定時間はたとえば３０分間である。

【0085】

ステップＳ２２３において、第２分注部６０が、反応容器１２に固定後検体用の洗浄液を分注する。

【0086】

ステップＳ２２４において、第２処理部３０は、ロータ３１を一方向に加減速を繰り返しながら回転させることにより、反応容器１２内の試料を撹拌する。

【0087】

ステップＳ２２４において、第２処理部３０は、ロータ３１を高速回転させることにより、反応容器１２内の試料を遠心分離する。

【0088】

ステップＳ２２６において、第２分注部６０が、反応容器１２から上清を吸引して除去する。

【0089】

ステップＳ２２７～Ｓ２３０において、洗浄液の分注、撹拌、遠心分離および上清の除去が行われる。つまり、検体の洗浄処理が繰り返される。検体の洗浄処理は、１回、２回、３回以上でもよい。以上により、反応容器１２中の細胞に対する固定化処理および透過処理が行われる。

【0090】

〈第２の染色処理〉
ステップＳ２３１において、第２分注部６０が、反応容器１２に抗体試薬を分注する。たとえば、抗体試薬として、抗ＦＯＸＰ３標識抗体を含む試薬が分注される。

【0091】

ステップＳ２３２において、第２処理部３０は、ロータ３１を一方向に加減速を繰り返しながら回転させることにより、反応容器１２内の試料を撹拌して反応が行われる。所定時間はたとえば３０分間である。

【0092】

ステップＳ２３３において、第２分注部６０が、反応容器１２に固定後検体用の洗浄液を分注する。ステップＳ２３４～２３６において、上述と同様にして、撹拌、遠心分離、上清の除去が行われ、ステップＳ２３７～Ｓ２４０において、洗浄液の分注、撹拌、遠心分離および上清の除去を含む検体の洗浄処理が繰り返される。検体の洗浄処理は、１回、２回、３回以上でもよい。以上により、反応容器１２中のＦＯＸＰ３が、対応する標識物質により染色される。

【0093】

〈容器返却〉
ステップＳ２４１において、第２分注部６０が反応容器１２に緩衝液を分注する。分注により、測定装置への供給に適した所定の液量、所定のｐHになるように反応容器１２内の試料が調整される。たとえば、緩衝液として、ＢＳＡ溶液およびＰＢＳが分注される。

【0094】

ステップＳ２４２において、第２処理部３０は、上述と同様によりロータを回転して撹拌が行われる。

【0095】

ステップＳ２４３において、容器移送部４２が、第２処理部３０に保持された反応容器１２をロータ３１から取り出して、第２移動部１６に保持されたラック１０ｂにセットする。全ての反応容器１２がラック１０ｂに移送されると、図８（Ｄ）に示すように、移動部１５～１７によりラックがＸ２方向に移動されて、初期位置に戻る。これにより、作業者が反応容器１２を取り出すことが可能になる。

【0096】

以上により、試料調製装置１００による試料調製が完了する。

【0097】

＜分離法および溶血法の比較データ＞
以下の実験により、本願発明による分離法と、比較例による溶血法とで、Ｔｒｅｇ細胞及びＴｅｆｆ細胞の検出性能に及ぼす影響を比較した。

【0098】

（実施例（分離法による試料調製））
ヘパリン採血管に採取した全血検体を試験管に分注した。試験管に５０μＬのビオチン化したＣＤ２３５ａ抗体を加えて撹拌し、室温で２０分間静置した。０．６ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を試験管に加えた。２００μＬのストレプトアビジン結合磁性粒子の含有液（Ｍｏｊｏｓｏｒｔ（登録商標））を試験管に加えて撹拌し、室温で５分間静置した。永久磁石を試験管の側面に接するように配置し、室温で１０分間静置することで、赤血球－ビオチン化ＣＤ２３５a抗体－ストレプトアビジン結合磁性粒子の複合体を試験管の内壁に集めた。試験管内の溶液の上清０．７ｍＬをピペットで採取し、遠心管に分注した。遠心管を室温で５分間、３００Ｇで遠心分離し、上清６００μLを除去することにより、実施例の試料を得た。

【0099】

（細胞表面抗原の染色）
試料に、ＣＤ４／ＣＤ２５／ＣＤ６２Ｌの抗体カクテル試薬を５０μＬ添加し、撹拌したのち室温で３０分間静置した。抗体カクテル試薬は、ＦＩＴＣ標識したＣＤ４抗体と、ＰＥ－Ｃｙ７標識したＣＤ２５抗体と、ＡＰＣ標識したＣＤ６２Ｌ抗体を含んでいた。抗体カクテル試薬と反応済みの試料に１ｍＬのＰＢＳを添加し、撹拌した。試料を室温で５分間、３００Ｇで遠心分離し、上清を除去して撹拌した。

【0100】

（固定・膜透過）
遠心分離後の試料に０．５ｍＬの固定／膜透過剤（eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent、インビトロジェン社製）を加えて撹拌し、室温で３０分間静置した。試料に１ｍＬの洗浄液（eBioscience Permeabilization Buffer (10X)、インビトロジェン社製）を加えて撹拌した。試料を室温で５分間、４００Ｇで遠心分離し、上清を除去した。遠心分離後の試料に１ｍＬの洗浄液（同上）を加えて撹拌し、室温で５分間、４００Ｇで遠心分離し、上清を除去して撹拌した。

【0101】

（細胞内抗原の染色）
得られた試料に、ＰＥ標識されたＦＯＸＰ３抗体を含む抗体試薬を５０μＬ添加し、室温で３０分間静置した。試料に１ｍＬの洗浄液（eBioscience Permeabilization Buffer (10X)、インビトロジェン社製）を加えて撹拌した。試料を室温で５分間、４００Ｇで遠心分離し、上清を除去した。遠心分離後の試料に１ｍＬの洗浄液（同上）を加えて撹拌し、室温で５分間、４００Ｇで遠心分離し、上清を除去して撹拌した。

【0102】

（フローサイトメータによる測定）
０．５％ＢＳＡを含む０．３ｍＬのＰＢＳを試料に添加し、撹拌した。得られた試料を市販のフローサイトメータ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ II（ベクトンディッキンソン社製）で測定し、Ｔｅｆｆ細胞（ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗかつＣＤ４＋のＴ細胞）と、Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ２５＋、Ｆｏｘｐ３＋、かつＣＤ４＋のＴ細胞）をそれぞれ計数した。

【0103】

（比較例（溶血法による試料調製））
ヘパリン採血管に採取した全血検体を遠心管に分注した。遠心管に２ｍＬの溶血剤（CyLyse；シスメックス株式会社製）を加えて室温で１０分間静置することにより、血液中の赤血球を溶血した。遠心管をボルテクスミキサーで攪拌したのち、２ｍＬのＰＢＳを遠心管に加えた。遠心管を室温で５分間、３００Ｇで遠心分離し、上清を除去した。遠心管に２ｍＬのＰＢＳを加え、再び遠心管を室温で５分間、３００Ｇで遠心分離して、上清を除去し、比較例の試料を得た。比較例の試料について、実施例と同様の操作を行い、フローサイトメータによる測定を実施した。

【0104】

（対照実験）
ヘパリン採血管に採取した５ｍｌの全血検体を、５ｍＬの液体培地（10mM HEPES/PRMI-1640）で希釈した。１０ｍＬのリンパ球分離用媒体（Ficoll-Paque Plus、Cytiva社製）を５０ｍＬチューブに入れた。このチューブに、希釈された全血検体を入れて重層した。Ficoll Paque Plusの添付文書に記載のインストラクションにしたがってチューブ内でＰＢＭＣの分離を行い、CELLBANKER2（日本全薬工業社製）を用いてＰＢＭＣを1x10^6 cells/mLとなるように懸濁し、ディープフリーザーで凍結した。凍結処理後、ＰＢＭＣを２４時間以降1週間以内に液体窒素（液相下）へ移管した。解凍した細胞を、10% FBS/RPMI1640で洗浄後、10% FBS/RPMI1640を1x10^6 cells/mLとなるように添加した。２ｍＬの細胞懸濁液を２４穴プレート(コーニング社製) に入れ、４８時間培養した。培養後、細胞培養液を１５ｍＬ チューブに移し、４００Ｇで５分間遠心分離して、対照例の試料を得た。対照例の試料について、実施例と同様の操作を行い、フローサイトメータによる測定を実施した。

【0105】

（測定結果）
測定した結果を図９および図１０に示す。

【0106】

図９に示すように、Ｔｅｆｆ細胞の検出性能においては、実施例の分離法によって調製した測定用試料は、対照実験の凍結ＰＢＭＣを用いた試料と良好な相関を示した（相関係数＝0.9419）。さらに、実施例は、比較例（相関係数＝0.7064）に比べて相関係数において優位に高い値を示した。

【0107】

図１０に示すように、Ｔｒｅｇ細胞の検出性能においては、実施例の分離法によって調製した測定用試料は、対照実験の凍結ＰＢＭＣを用いた場合の結果と良好な相関を示した（相関係数＝0.8679）。さらに、実施例は、比較例（相関係数＝0.0065）に比べて相関係数において優位に高い値を示した。

【0108】

これらの結果から、本発明による分離法は、Ｔｅｆｆ細胞およびＴｒｅｇ細胞の両者に対して溶血法に比べて高い測定精度を示すことがわかった。また、分離法は、凍結ＰＢＭＣを用いて試料調製する場合と同等の測定精度であることがわかった。

【0109】

（標識からのシグナルに関する考察）
図１１および図１２は、リンパ球に分画された細胞のうちＣＤ４の発現量の大きいＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）を分画したスキャッタグラムである。図１１は、実施例（分離法）のスキャッタグラムであり、図１２は、比較例（溶血法）のスキャッタグラムである。ＣＤ４＋Ｔ細胞の計数結果は、実施例（分離法）が４４．４％に対して比較例（溶血法）が４３．０％であり、有意な差はなかった。

【0110】

図１３および図１４は、ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちＣＤ６２Ｌの発現量の低い細胞（ＣＤ４+、ＣＤ６２Ｌ^ＬｏｗのＴ細胞）を分画した、同一の検体から得られたヒストグラムである。図１３は、実施例（分離法）のヒストグラムであり、図１４は、比較例（溶血法）のヒストグラムである。このヒストグラムでは、ＣＤ６２Ｌの蛍光シグナルが所定のカットオフ範囲内に入るものをＣＤ４＋、ＣＤ６２Ｌ^Low Ｔ細胞、つまりＴｅｆｆ細胞として計数した。実施例（分離法）では、Ｔｅｆｆ細胞が８．４８％であるのに対して、比較例（溶血法）では、Ｔｅｆｆ細胞が１５．６％であった。実施例（分離法）のヒストグラムでは、CD62L^Low T細胞のピークと、ＣＤ６２Ｌの発現量が高いＴ細胞（CD62L^High T細胞）のピークが明瞭に分かれており、ピーク間の谷間にプロットされる細胞が少ない。一方、比較例（溶血法）のヒストグラムは、実施例（分離法）のヒストグラムに比べるとＣＤ６２Ｌ^High Ｔ細胞のピークが下がっており、２つピークの谷間にプロットされた細胞の数が多くなっている。これは、溶血法ではＣＤ６２Ｌの染色が不十分となり、全体的に蛍光シグナル強度が低下した結果、ＣＤ６２Ｌの発現量の高い細胞（ＣＤ６２Ｌ^High Ｔ細胞）が低値側にスライドしたためと考えられる。このデータから、溶血法では、ＣＤ６２Ｌのシグナルが全体的に低下していることが示唆された。

【0111】

図１５および図１６は、ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちＣＤ２５およびＦＯＸＰ３の発現量の高いＴ細胞（CD4+/CD25+/FOXP3＋T細胞）を分画した、同一の検体から得られたスキャッタグラムである。図１５は、実施例（分離法）のスキャッタグラムであり、図１６は、比較例（溶血法）のスキャッタグラムである。ＣＤ２５に対応する蛍光シグナル強度（横軸）およびＦＯＸＰ３に対応する蛍光シグナル強度（縦軸）のそれぞれについて、所定のカットオフ値より高い値を示した細胞をCD25+/FOXP3＋T細胞、つまりＴｒｅｇ細胞として同定した（Ｑ２のゾーンに入った細胞）。実施例（分離法）では、Ｑ２に分画されたＴｒｅｇ細胞は３．８８％であるのに対して、比較例（溶血法）では１．９４％であった。比較例（溶血法）のスキャッタグラムは、実施例（分離法）のスキャッタグラムと比べてＱ３に含まれる細胞数が増加している。すなわち、溶血法では、縦軸方向に細胞のプロットが下がっていることから、ＦＯＸＰ３のシグナルが全体的に低下していることが示唆された。

【0112】

（変形例）
なお、今回開示された実施形態は、すべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は、上記した実施形態の説明ではなく特許請求の範囲によって示され、さらに特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれる。

【符号の説明】

【0113】

１０ａ：処理容器移送部、１０ｂ：反応容器供給部、１０ｃ検体セット部、１１：処理容器、１２：反応容器、１３：検体容器、２０：第１処理部、３０：第２処理部、４１：第１分注部、４２：容器移送部、６０：第２分注部、１００：試料調製装置

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】