特開 2023-125988 物質導入ユニット及び物質導入装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023125988

(43)【公開日】2023-09-07

(54)【発明の名称】物質導入ユニット及び物質導入装置

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20230831BHJP

   C12M 1/42 20060101ALI20230831BHJP

【ＦＩ】

C12M1/00 A

C12M1/42

【審査請求】未請求

【請求項の数】8

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022030394

(22)【出願日】2022-02-28

(71)【出願人】

【識別番号】000109543

【氏名又は名称】テルモ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】230118913

【弁護士】

【氏名又は名称】杉村 光嗣

(74)【代理人】

【識別番号】100186015

【弁理士】

【氏名又は名称】小松 靖之

(74)【代理人】

【識別番号】100211395

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 裕貴

(72)【発明者】

【氏名】樋口 洋一

(72)【発明者】

【氏名】中野 優

【テーマコード（参考）】

4B029

【Ｆターム（参考）】

4B029AA24

4B029BB02

4B029BB11

4B029DG10

4B029FA15

4B029GA08

4B029GB02

4B029GB10

(57)【要約】

【課題】エレクトロポレーションにより細胞に物質を導入する技術の有用性を向上させる、物質導入ユニット及び物質導入装置を提供する。
【解決手段】本開示に係る物質導入ユニットは、エレクトロポレーションによる細胞への物質の導入に用いられる物質導入ユニットであって、前記細胞及び前記物質を含む細胞懸濁液を収容するように構成された収容器と、前記収容器の内部空間に露出する電極面を有し前記収容器に収容された前記細胞懸濁液に電圧を印加するように構成された電極対と、を備え、前記収容器は、前記収容器の前記内部空間を区画するように構成された細胞不透過性部材を備える。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

エレクトロポレーションによる細胞への物質の導入に用いられる物質導入ユニットであって、
前記細胞及び前記物質を含む細胞懸濁液を収容するように構成された収容器と、
前記収容器の内部空間に露出する電極面を有し前記収容器に収容された前記細胞懸濁液に電圧を印加するように構成された電極対と、
を備え、
前記収容器は、前記収容器の前記内部空間を区画するように構成された細胞不透過性部材を備える、物質導入ユニット。

【請求項2】

前記細胞不透過性部材は、前記収容器の前記内部空間に露出する前記電極面よりも内側に位置している、請求項１に記載の物質導入ユニット。

【請求項3】

前記細胞不透過性部材は、細胞不透過性を有する多孔質膜である、請求項１又は２に記載の物質導入ユニット。

【請求項4】

前記細胞不透過性部材は、前記収容器の前記内部空間を、前記電極対の前記電極面が露出する内部空間と他の内部空間とに区画するように構成されている、請求項１から３のいずれか一項に記載の物質導入ユニット。

【請求項5】

前記細胞不透過性部材は、前記収容器の長手方向に延在する筒状とされている、請求項４に記載の物質導入ユニット。

【請求項6】

前記細胞不透過性部材は、前記収容器の前記内部空間を、前記電極対のうち陽極の前記電極面が露出する内部空間と他の内部空間とに区画するように構成されている、請求項１から３のいずれか一項に記載の物質導入ユニット。

【請求項7】

前記細胞不透過性部材は、前記電極面と接触しないように前記収容器に配置されている、請求項１から６のいずれか一項に記載の物質導入ユニット。

【請求項8】

エレクトロポレーションにより細胞に物質を導入する物質導入装置であって、
請求項１から７のいずれか一項に記載の物質導入ユニットを備える、物質導入装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、物質導入ユニット及び物質導入装置に関する。

【背景技術】

【0002】

従来、エレクトロポレーションにより細胞に物質を導入する技術が知られている。例えば、特許文献１には、同一の容器においてエレクトロポレーションを繰り返し実施可能なエレクトロポレーション装置が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】国際公開第２０２１／１７７１８５号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

一般に、エレクトロポレーションでは、処理対象とする細胞懸濁液の量、処理が行われる容器の容積、電圧を印加する電極対の距離等の環境要因によって、印加する電圧の電圧値又は印加する時間等、最適なエレクトロポレーションの実施条件が異なる。そのため、例えば、ある容器で小量の細胞を対象にしたエレクトロポレーションの実施条件が確立された場合であっても、処理対象とする細胞懸濁液の量を増やすために異なる容器でエレクトロポレーションを行う際には、異なる容器において、再度、実施条件を設定しなおす必要があった。

【0005】

これに対して、特許文献１に開示された装置では、エレクトロポレーションを実施するための容器を大きくするのではなく、同一の容器にてエレクトロポレーションを繰り返し実施可能とすることで、エレクトロポレーションの実施条件を変えずに、処理対象とする細胞懸濁液の総量を増やすことができる。

【0006】

しかしながら、エレクトロポレーションにより細胞に物質を導入する技術の更なる有用性の向上が求められている。例えば、同一の容器にて繰り返しエレクトロポレーションを実施する際に、エレクトロポレーションにおける物質導入効率を低下させないことが求められている。

【0007】

かかる事情に鑑みてなされた本開示の目的は、エレクトロポレーションにより細胞に物質を導入する技術の有用性を向上させる、物質導入ユニット及び物質導入装置を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本開示の一実施形態に係る物質導入ユニットは、エレクトロポレーションによる細胞への物質の導入に用いられる物質導入ユニットであって、前記細胞及び前記物質を含む細胞懸濁液を収容するように構成された収容器と、前記収容器の内部空間に露出する電極面を有し前記収容器に収容された前記細胞懸濁液に電圧を印加するように構成された電極対と、を備え、前記収容器は、前記収容器の前記内部空間を区画するように構成された細胞不透過性部材を備える。

【0009】

本開示の一実施形態に係る物質導入ユニットでは、前記細胞不透過性部材は、前記収容器の前記内部空間に露出する前記電極面よりも内側に位置していることが好ましい。

【0010】

本開示の一実施形態に係る物質導入ユニットでは、前記細胞不透過性部材は、細胞不透過性を有する多孔質膜であることが好ましい。

【0011】

本開示の一実施形態に係る物質導入ユニットでは、前記細胞不透過性部材は、前記収容器の前記内部空間を、前記電極対の前記電極面が露出する内部空間と他の内部空間とに区画するように構成されていることが好ましい。

【0012】

本開示の一実施形態に係る物質導入ユニットでは、前記細胞不透過性部材は、前記収容器の長手方向に延在する筒状とされていることが好ましい。

【0013】

本開示の一実施形態に係る物質導入ユニットでは、前記細胞不透過性部材は、前記収容器の前記内部空間を、前記電極対のうち陽極の前記電極面が露出する内部空間と他の内部空間とに区画するように構成されていることが好ましい

【0014】

本開示の一実施形態に係る物質導入ユニットでは、前記細胞不透過性部材は、前記電極面と接触しないように前記収容器に配置されていることが好ましい。

【0015】

本開示の一実施形態に係る物質導入装置は、エレクトロポレーションにより細胞に物質を導入する物質導入装置であって、上述した物質導入ユニットを備える。

【発明の効果】

【0016】

本開示に係る物質導入ユニット及び物質導入装置によれば、エレクトロポレーションにより細胞に物質を導入する技術の有用性を向上させることができる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】本開示の一実施形態に係る物質導入装置の概略構成を、一部断面図を用いて概略的に示す、概略図である。

【図2】図１に示される物質導入ユニットを概略的に示す、概略断面図である。

【図3】図２に示される物質導入ユニットの変形例を概略的に示す、概略断面図である。

【図4】図１に示される物質導入装置の動作を示すフローチャートである。

【発明を実施するための形態】

【0018】

以下、本開示の一実施形態に係る物質導入装置１について、図面を参照して説明する。

【0019】

各図中、同一又は相当する部分には、同一符号を付している。本実施形態の説明において、同一又は相当する部分については、説明を適宜省略又は簡略化する。

【0020】

本開示の一実施形態に係る物質導入装置１は、エレクトロポレーションにより細胞に物質を導入する。エレクトロポレーションは、細胞及び細胞に導入する物質を含む細胞懸濁液に電気パルス等を印加することにより、細胞の細胞膜に穴をあけ、物質を細胞内に導入する方法である。エレクトロポレーションは、電気穿孔法とも呼ばれる。本実施形態では、細胞懸濁液は、例えば、動物細胞又は大腸菌等の細胞と、遺伝子、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、核酸、タンパク質、低分子化合物、脂質分子、又はリポソーム等の物質とを、緩衝液（バッファ）に懸濁させたものである。

【0021】

図１、図２及び図３を参照して、本開示の一実施形態に係る物質導入装置１について説明する。図１は、本開示の一実施形態に係る物質導入装置１の概略構成を、一部断面図を用いて概略的に示す、概略図である。図２は、図１に示される物質導入ユニット２を概略的に示す、概略断面図である。図３は、図２に示される物質導入ユニット２の変形例（物質導入ユニット２’）を概略的に示す、概略断面図である。図１～図３において、物質導入ユニット２は、断面図で示されている。図１に示されるように、物質導入装置１は、物質導入ユニット２と、電圧印加部３と、送液部４と、細胞カウント部５と、フィルタリング部６と、バルブ部７と、制御部８と、を備えている。

【0022】

物質導入装置１には、後述するように、送液チューブ等の送液路９を介して、複数のバッグ１０が取り付けられている。本実施形態では、図１に示されるように、物質導入装置１には、細胞バッグ１０Ａ、導入物質バッグ１０Ｂ、導入前バッグ１０Ｃ、導入済バッグ１０Ｄ、洗浄前バッグ１０Ｅ、及び洗浄済バッグ１０Ｆが取り付けられている。細胞バッグ１０Ａには、細胞が緩衝液と共に収容される。導入物質バッグ１０Ｂには、細胞に導入する物質が緩衝液と共に収容される。導入前バッグ１０Ｃには、エレクトロポレーションによる物質導入前の細胞懸濁液が収容される。導入済バッグ１０Ｄには、エレクトロポレーションによる物質導入済の細胞懸濁液が収容される。洗浄前バッグ１０Ｅは、物質導入ユニット２の洗浄に用いられる洗浄液が収容される。洗浄済バッグ１０Ｆは、物質導入ユニット２の洗浄後の洗浄液が収容される。

【0023】

図１に示されるように、物質導入装置１において、細胞バッグ１０Ａ及び導入物質バッグ１０Ｂは、送液路９Ａにより、導入前バッグ１０Ｃに接続されている。導入前バッグ１０Ｃ及び洗浄済バッグ１０Ｆは、送液路９Ｂにより、物質導入ユニット２の第１開口２１Ｂに接続されている。導入済バッグ１０Ｄ及び洗浄前バッグ１０Ｅは、送液路９Ｃにより、物質導入ユニット２の第２開口２１Ｃに接続されている。

【0024】

本実施形態では、エレクトロポレーションの実施後に、洗浄液による物質導入ユニット２内部の洗浄が行われる。これは、物質導入ユニット２内部、特に、電極対２２の電極面２２Ｓに付着した細胞残渣物又は気泡等の汚れを取り除くためである。細胞残渣物には、例えば、死滅した細胞、破損した細胞（フラクチャー）、タンパク質、又は核酸等が含まれる。このように、エレクトロポレーションの実施後に、物質導入ユニット２内部の洗浄を行うことで、同一の容器にて繰り返しエレクトロポレーションを実施する際に、エレクトロポレーションにおける物質導入効率が低下しにくくなる。洗浄液は、例えば、緩衝液であるが、これに限られない。

【0025】

物質導入ユニット２は、エレクトロポレーションによる細胞への物質の導入に用いられる器具である。図２に示されるように、物質導入ユニット２は、収容器２１と、電極対２２と、開閉部２３と、を備えている。

【0026】

収容器２１は、細胞と細胞に導入する物質とを含む細胞懸濁液を収容するように構成されている。収容器２１は、例えば、キュベットである。収容器２１は、例えば、ガラス、プラスチック、シリコン、又はクォーツ等により形成されていてもよい。収容器２１は、細胞懸濁系を収容可能な細長い内部空間２１Ａを内部に区画している。内部空間２１Ａの大きさは、１回のエレクトロポレーションで処理される細胞懸濁液の量に応じて任意に定められるが、例えば、１０マイクロリットルから１０ミリリットルであり、望ましくは４０マイクロリットルから４００マイクロリットルである。

【0027】

収容器２１は、第１開口２１Ｂ及び第２開口２１Ｃを有する、筒状の容器である。収容器２１の内部に区画された内部空間２１Ａは、それぞれ第１開口２１Ｂ及び第２開口２１Ｃを介して収容器２１の外部に連通している。本実施形態では、収容器２１は、収容器２１の長手方向における一端側に、第１開口２１Ｂを有する第１平板部２１Ｄを備え、収容器２１の長手方向における第１開口２１Ｂとは他端側に、第２開口２１Ｃを有する第２平板部２１Ｅを備えている。これにより、収容器２１は、第１開口２１Ｂ及び第２開口２１Ｃの一方から内部空間２１Ａに充填された液体が、第１開口２１Ｂ及び第２開口２１Ｃの他方から外部に排出可能とされている。

【0028】

電極対２２は、収容器２１に収容された細胞懸濁液に電圧を印加するように構成されている。本実施形態では、電極対２２は第１電極２２Ａ及び第２電極２２Ｂで構成されている。第１電極２２Ａ及び第２電極２２Ｂは、いずれも板状の電極であり、例えば、金属又は導電性ポリマー等、通電可能な材料で形成されている。本実施形態では、第１電極２２Ａが陽極とされ、第２電極２２Ｂが陰極とされるものとする。第１電極２２Ａ及び第２電極２２Ｂは、収容器２１の内部空間２１Ａを挟んで対向するように収容器２１に取り付けられている。電極対２２は、収容器２１に細胞懸濁液が収容された状態で、電圧印加部３から電力が印加されることで、電極対２２に挟まれた収容器２１の内部空間２１Ａに電気パルスを発生させる。これにより、収容器２１内で、エレクトロポレーションが実施され、細胞懸濁液に含まれる細胞に物質が導入される。電極対２２を構成する電極間の距離は、エレクトロポレーションを行うために適当な距離とされ、例えば０．１ミリメートルから１センチメートルであるが、望ましくは１ミリメートルから５ミリメートルの範囲とされる。

【0029】

電極対２２は、収容器２１の長手方向において、第１開口２１Ｂと第２開口２１Ｃとの間に挟まれた収容器２１の側面に設けられている。そして、電極対２２は、収容器２１の内部空間２１Ａに露出する電極面２２Ｓを有する。具体的には、第１電極２２Ａは、電極面２２ＳＡが収容器２１の内部空間２１Ａに露出するように、収容器２１に取り付けられている。そして、第２電極２２Ｂは、電極面２２ＳＢが収容器２１の内部空間２１Ａに露出するように、収容器２１に取り付けられている。本開示において、第１電極２２Ａの電極面２２ＳＡと第２電極２２Ｂの電極面２２ＳＢとを特に区別しない場合、単に「電極面２２Ｓ」と総称する。

【0030】

収容器２１の内部空間２１Ａに露出する電極対２２の電極面２２Ｓには、ポリマーコーティングが施されていてもよい。ポリマーコーティングは、例えば、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）コーティングである。ただし、コーティングは、ＰＥＧコーティングに限られず、細胞非接着性ポリマーコーティング、超親水性ポリマーコーティング、或いは、細胞非接着性又は超親水性を有する任意のコーティングであってもよい。これにより、収容器２１の内部空間２１Ａに露出する電極対２２の電極面２２Ｓに細胞残渣物又は気泡等の汚れが付着しにくくなり、エレクトロポレーションにおける物質導入効率が低下しにくくなる。

【0031】

電極対２２は、収容器２１から取り外し可能に構成されていてもよい。或いは、収容器２１及び電極対２２は、キュベット電極として、一体に構成されていてもよい。

【0032】

開閉部２３は、収容器２１の開口を開閉可能に構成されている。本実施形態では、開閉部２３は、収容器２１の第２開口２１Ｃ側の端部を覆うように収容器２１に取り付けられている。これにより、開閉部２３は、収容器２１の第２開口２１Ｃを開閉可能に構成されている。例えば、開閉部２３は、図２に示されるように、貫通孔２３Ａを有し、収容器２１に対して開閉方向にスライド可能な、板状の部材である。開閉部２３の貫通孔２３Ａに、送液路９Ｃが嵌め込み等により取り付けられていてもよい。開閉部２３をスライドさせて、貫通孔２３Ａの位置を収容器２１の第２開口２１Ｃの位置に合わせることにより、開閉部２３が、収容器２１の第２開口２１Ｃを開く。一方で、開閉部２３をスライドさせて、貫通孔２３Ａの位置を収容器２１の第２開口２１Ｃの位置から外すことにより、開閉部２３が、収容器２１の第２開口２１Ｃを閉じる。

【0033】

物質導入ユニット２の収容器２１において、第１開口２１Ｂは、鉛直方向において、第２開口２１Ｃよりも上方に位置するように構成されていてもよい。これにより、細胞懸濁液が重力により移動することを利用して、第２開口２１Ｃの開閉によって、細胞懸濁液を収容器２１の内部空間２１Ａに収容し、或いは、内部空間２１Ａから排出することができる。

【0034】

本実施形態では、開閉部２３は、制御部８の制御により自動で収容器２１の開口を開閉可能に構成されている。例えば、開閉部２３は、開閉部２３自身を収容器２１に対してスライドさせるためのモーターを備えていてもよい。ただし、開閉部２３は、手動により収容器２１の開口を開閉可能に構成されていてもよい。また、開閉部２３は、上述した構成に限られず、開閉式のバルブ、蓋、又は扉等、収容器２１の開口を自動又は手動により開閉可能な任意の器具であってよい。また、物質導入ユニット２は、収容器２１の第２開口２１Ｃを開閉可能に構成された開閉部２３に加え、第１開口２１Ｂを開閉可能に構成された開閉部２３を備えていてもよい。

【0035】

本実施形態に係る物質導入ユニット２において、収容器２１は、収容器２１の内部空間２１Ａを区画するように構成された細胞不透過性部材２４を備えている。細胞不透過性部材２４は、例えば、細胞不透過性を有する多孔質膜である。多孔質膜の孔の直径は、エレクトロポレーションの対象となる細胞の直径より小さくされている。多孔質膜の孔の直径は、例えば、５μｍ～５０μｍとされるが、これに限られず、エレクトロポレーションの対象となる細胞に応じて定められてもよい。また、細胞不透過性部材２４は、望ましくは通電性を有するカーボン又はポリマー等の材料で構成されている。ただし、細胞不透過性部材２４は、細胞を透過させない部材であれば、その構造及び材料は特に限定されない。このように、収容器２１の内部空間２１Ａが細胞不透過性部材２４によって複数の空間に区画されることにより、収容器２１の内部空間２１Ａにおいて細胞が移動可能な空間を限定することができる。これにより、物質導入ユニット２において、死滅した細胞又は破損した細胞等を含む細胞が付着して汚れうる範囲を限定することができ、同一の容器にて繰り返しエレクトロポレーションを実施する際に、エレクトロポレーションにおける物質導入効率が低下しにくくなる。

【0036】

細胞不透過性部材２４は、収容器２１の内部空間２１Ａにおいて、収容器２１の内部空間２１Ａに露出する電極対２２の電極面２２Ｓよりも内側に位置している。これにより、細胞不透過性部材２４は、収容器２１の内部空間２１Ａを、電極対２２の電極面２２Ｓが露出する内部空間と他の内部空間とに区画するように構成されている。本実施形態では、収容器２１の内部空間２１Ａのうち他の内部空間が、第１開口２１Ｂ及び第２開口２１Ｃを介して収容器２１の外部に連通している。収容器２１の内部空間２１Ａのうち他の内部空間のみを細胞が移動するように、収容器２１に細胞懸濁液を充填することで、電極対２２の電極面２２Ｓに、死滅した細胞又は破損した細胞等を含む細胞が付着しにくくなり、エレクトロポレーションにおける物質導入効率が低下しにくくなる。

【0037】

本実施形態では、図２に示されるように、細胞不透過性部材２４は、収容器２１の長手方向に延在する筒状とされており、その両端がそれぞれ第１開口２１Ｂ及び第２開口２１Ｃの周囲を囲うように第１平板部２１Ｄ及び第２平板部２１Ｅに固定されている。これにより、筒状の細胞不透過性部材２４の外側に位置する電極対２２の電極面２２Ｓ及び収容器２１の側面に、死滅した細胞又は破損した細胞等を含む細胞が付着しにくくなり、エレクトロポレーションにおける物質導入効率が低下しにくくなる。

【0038】

ただし、細胞不透過性部材２４の形状は筒状に限られない。例えば、細胞不透過性部材２４は、２枚の板状とされてもよい。かかる場合、細胞不透過性部材２４は、収容器２１の内部空間２１Ａを、第１電極２２Ａの電極面２２ＳＡが露出する内部空間、第１開口２１Ｂ及び第２開口２１Ｃを介して収容器２１の外部に連通している内部空間、及び第２電極２２Ｂの電極面２２ＳＢが露出する内部空間に区画するように、収容器２１に配置されていてもよい。

【0039】

さらに、細胞不透過性部材２４は、収容器２１の内部空間２１Ａを、電極対２２のうち陽極である第１電極２２Ａの電極面２２ＳＡが露出する内部空間と他の内部空間とに区画するように構成されていてもよい。具体的には、図３に物質導入ユニット２’として示されるように、細胞不透過性部材２４は、１枚の板状とされ、収容器２１の内部空間２１Ａを、電極対２２のうち陽極である第１電極２２Ａの電極面２２ＳＡが露出する内部空間と、第１開口２１Ｂ及び第２開口２１Ｃを介して収容器２１の外部に連通している内部空間と、に区画するように、収容器２１に配置されていてもよい。これにより、電極対２２の間に電圧を印加した際に、死滅した細胞又は破損した細胞等を含む細胞が付着しやすい陽極の電極面２２ＳＡのみを細胞不透過性部材２４により覆うことで、物質導入ユニット２’を構成する材料の増加を抑制し、物質導入ユニット２’の製造コストの増加を抑制することが可能になる。

【0040】

再び図２を参照して、細胞不透過性部材２４は、電極対２２の電極面２２Ｓと接触しないように収容器２１に配置されている。これにより、細胞不透過性部材２４、及び、細胞不透過性部材２４に付着した細胞が、電極対２２の電極面２２Ｓに接触し、電極対２２が発生させるパルスの安定性及び均一性を損なうようなことが起こりにくくなる。ただし、細胞不透過性部材２４は、電極対２２の電極面２２Ｓと接触するように収容器２１に配置されていてもよい。

【0041】

細胞不透過性部材２４は、収容器２１から取り外し可能に構成されていてもよい。これにより、死滅した細胞又は破損した細胞等の細胞が付着して細胞不透過性部材２４が汚れた場合に細胞不透過性部材２４のみを交換することで、収容器２１を継続して使用することができる。ただし、細胞不透過性部材２４は、収容器２１と一体として構成されていてもよい。

【0042】

物質導入ユニット２は、物質導入装置１から取り外し可能とされている。これにより、物質導入ユニット２が破損又は劣化した場合等に、新しい物質導入ユニット２と交換することができる。或いは、１回のエレクトロポレーションで処理される細胞懸濁液の量に応じて、異なる容量の収容器２１を有する物質導入ユニット２を物質導入装置１に取り付けることができる。ただし、物質導入ユニット２は、物質導入装置１と一体として形成されていてもよく、物質導入装置１から取り外し可能でなくてもよい。

【0043】

再び図１を参照して、電圧印加部３は、電極対２２の間に電圧を印加する器具である。電圧印加部３は、電極対２２の間に電圧を印加可能であれば特に限定されない。電圧印加部３は、例えば、蓄電池又は乾電池等を備えていてもよい。また例えば、電圧印加部３は、外部電源より電力供給を受けるためのアダプタ等を備え、外部電源から電力供給を受け付ける構成であってよい。図１に実線で示されるように、電圧印加部３は、電極対２２のそれぞれと、導線等により電力供給可能に接続されている。これにより、電圧印加部３が電極対２２の間に所定の電圧を印加することで、収容器２１内でエレクトロポレーションが実施され、細胞懸濁液に含まれる細胞に物質が導入される。本実施形態では、電圧印加部３によって電圧が印加されることにより、第１電極２２Ａが陽極とされ、第２電極２２Ｂが陰極とされるものとする。

【0044】

電圧印加部３は、１つ以上のセンサを備えていてもよい。センサは、例えば、抵抗計、電圧計、又は電流計等である。これにより、電圧印加部３は、センサにより電極対２２の間の抵抗値、電圧値、又は電流値を計測し、電極対２２の間に印加する電圧を調節することができる。

【0045】

送液部４は、１つ以上の送液ポンプを備える。送液ポンプは、例えば、シリンジ式、吸引式、又は蠕動式のポンプであるが、これらに限られない。送液部４は、制御部８の制御により自動で動作可能に構成されているが、手動により動作可能に構成されていてもよい。本実施形態では、送液部４は、物質導入ユニット２の収容器２１の第１開口２１Ｂに接続された送液路９Ｂに設けられている。これにより、送液部４は、収容器２１の内部空間２１Ａに細胞懸濁液又は洗浄液等の液体を送液することができる。ただし、送液部４は、物質導入装置１に含まれる送液路９の任意の位置に設けられていてもよい。

【0046】

送液部４は、収容器２１の第１開口２１Ｂを介して電圧印加前の細胞懸濁液を収容器２１に充填し、第２開口２１Ｃを介して電圧印加後の細胞懸濁液を収容器２１から排出する。また、送液部４は、収容器２１の第２開口２１Ｃを介して洗浄液を収容器２１に充填し、第１開口２１Ｂを介して洗浄液を収容器２１から排出する。このように、洗浄液が物質導入ユニット２の収容器２１内を流れる方向を、細胞懸濁液が物質導入ユニット２の収容器２１内を流れる方向と逆方向とすることによって、細胞残渣物又は気泡等の汚れが収容器２１及び電極対２２から剥がれやすく、収容器２１及び電極対２２の洗浄効果を向上させることができる。特に、第１開口２１Ｂが第２開口２１Ｃよりも高くなるように物質導入ユニット２が配置されている場合において、重力によって、収容器２１の下側（すなわち、本実施形態では、第２開口２１Ｃ側）に細胞残渣等が付着しやすくなるため、第２開口２１Ｃ側から洗浄液を流すことは有効である。

【0047】

細胞カウント部５は、生細胞をカウントするように構成されている。生細胞は、死滅又は破損していない細胞であって、エレクトロポレーションにより物質を導入することが可能な細胞である。細胞カウント部５は、例えば、フローサイトメーター、粒度分布計及びマイクロポアデバイス等の機器を備えている。本実施形態では、物質導入装置１は、送液路９Ａに設けられた細胞カウント部５Ａと、送液路９Ｃに設けられた細胞カウント部５Ｂとを備えている。ただし、細胞カウント部５は、物質導入装置１に含まれる送液路９の任意の位置に設けられていてもよい。

【0048】

細胞カウント部５Ａは、収容器２１に充填される電圧印加前の細胞懸濁液中の生細胞をカウントするように構成されている。これにより、生細胞の数に応じて、細胞懸濁液に混入させる物質の数を調節することで、細胞懸濁液に含まれる細胞と細胞に導入する物質とを適切な数量又は割合とすることができ、エレクトロポレーションにおける物質導入効率を向上させることができる。

【0049】

細胞カウント部５Ｂは、収容器２１から排出された電圧印加後の細胞懸濁液中の生細胞をカウントするように構成されている。これにより、エレクトロポレーションにより死滅又は破損等せずに物質が導入された生細胞の数を把握することができる。さらに、生細胞の数に基づいて、物質導入ユニット２の収容器２１に残留している細胞残渣物の数を推定することができる。

【0050】

フィルタリング部６は、細胞残渣物を除去するように構成されている。細胞残渣物は、上述のとおり、死滅又は破損した細胞、タンパク質、又は核酸等が含まれる。フィルタリング部６は、例えば、磁気ビーズ、不織布、又はエレクトレットフィルター（静電ろ材）等を備えている。本実施形態では、物質導入装置１は、送液路９Ａに設けられたフィルタリング部６Ａと、送液路９Ｃに設けられたフィルタリング部６Ｂとを備えている。ただし、フィルタリング部６は、物質導入装置１に含まれる送液路９の任意の位置に設けられていてもよい。

【0051】

フィルタリング部６Ａは、収容器２１に充填される電圧印加前の細胞懸濁液から細胞残渣物を除去するように構成されている。これにより、細胞懸濁液に含まれる細胞残渣物が少なくなり、エレクトロポレーションにおける物質導入効率を向上させることができる。また、物質導入ユニット２の収容器２１に充填される細胞懸濁液から細胞残渣物が予め除去されることにより、収容器２１及び電極対２２が汚れにくくなり、エレクトロポレーションにおける物質導入効率を更に向上させることができる。

【0052】

フィルタリング部６Ｂは、収容器２１から排出された電圧印加後の細胞懸濁液から細胞残渣物を除去するように構成されている。これにより、エレクトロポレーションにより物質が導入された生細胞を回収しやすくなる。

【0053】

バルブ部７は、送液路９を開閉可能に、或いは、送液路９の流路を切替可能に構成されている。バルブ部７は、例えば、電磁弁等を含み、制御部８の制御により自動で動作可能に構成されている。ただし、バルブ部７は、手動により動作可能に構成されていてもよい。

【0054】

制御部８は、メモリ８１及びプロセッサ８２を備える。制御部８として、例えば、エレクトロポレータ、パーソナルコンピュータ、スマートフォン、又はタブレット端末等のコンピュータが使用されてもよい。

【0055】

メモリ８１は、例えば半導体メモリ、磁気メモリ、又は光メモリ等である。メモリ８１は、例えば主記憶装置、補助記憶装置、又はキャッシュメモリとして機能する。メモリ８１は、物質導入装置１の動作に用いられる任意の情報を記憶する。例えば、メモリ８１は、システムプログラム、アプリケーションプログラム、又は組み込みソフトウェア等を記憶する。

【0056】

プロセッサ８２は、例えば、ＣＰＵ（Central Processing Unit）等の汎用のプロセッサ、又は特定の処理に特化した専用のプロセッサ等であってもよい。プロセッサ８２は、例えば、ＦＰＧＡ（Field-Programmable Gate Array）、又はＡＳＩＣ（Application Specific Integrated Circuit）等の専用回路を含んでもよい。

【0057】

制御部８は、図１に破線で示されるように、物質導入ユニット２の開閉部２３、電圧印加部３、送液部４、細胞カウント部５、及びバルブ部７等の、物質導入装置１の構成要素のそれぞれと、有線又は無線により通信可能に接続されている。これによって、制御部８は、物質導入装置１の機能を実現させるために、これらの構成要素を制御する。

【0058】

図４を参照して、本開示の一実施形態に係る物質導入装置１の動作を説明する。図４は、図１に示される物質導入装置１の動作を示すフローチャートである。この動作は、本実施形態に係る物質導入装置１が実行する物質導入方法に相当する。本動作の実施にあたり、予め、上述した物質導入ユニット２が用意される。

【0059】

ステップＳ１０１～ステップＳ１０２において、制御部８は、エレクトロポレーションによる物質導入前の細胞懸濁液を用意する。

【0060】

ステップＳ１０１：制御部８は、細胞バッグ１０Ａから導入前バッグ１０Ｃに細胞入りの緩衝液を充填する。

【0061】

本実施形態では、制御部８は、バルブ部７Ａを制御して、送液路９Ａを介して、細胞バッグ１０Ａから導入前バッグ１０Ｃに所定量の細胞入りの緩衝液を充填する。このとき、送液路９Ａにフィルタリング部６Ａが設けられていることにより、フィルタリング部６Ａが、電圧印加前の細胞懸濁液から細胞残渣物を除去する。また、制御部８は、導入前バッグ１０Ｃに細胞入りの緩衝液を充填する際に、細胞カウント部５Ａを制御して、細胞入りの緩衝液の中に存在する生細胞の数をカウントする。制御部８は、細胞カウント部５Ａによりカウントされた生細胞の数に応じて、細胞バッグ１０Ａから導入前バッグ１０Ｃに充填する細胞入りの緩衝液の量を調節してもよい。

【0062】

ステップＳ１０２：制御部８は、導入物質バッグ１０Ｂから導入前バッグ１０Ｃに物質入りの緩衝液を充填する。

【0063】

本実施形態では、制御部８は、バルブ部７Ａを制御して、送液路９Ａを介して、導入物質バッグ１０Ｂから導入前バッグ１０Ｃに物質入りの緩衝液を充填する。このとき、制御部８は、ステップＳ１０１にてカウントされた生細胞の数に応じて、導入物質バッグ１０Ｂから導入前バッグ１０Ｃに充填する物質入りの緩衝液の量を調節する。ただし、制御部８は、導入物質バッグ１０Ｂから導入前バッグ１０Ｃに所定量の物質入りの緩衝液を充填してもよい。

【0064】

ステップＳ１０１～ステップＳ１０２により、導入前バッグ１０Ｃ内にて細胞入り緩衝液と物質入り緩衝液との懸濁が実施され、エレクトロポレーションによる物質導入前の細胞懸濁液が用意される。ただし、予めエレクトロポレーションによる物質導入前の細胞懸濁液が収容された導入前バッグ１０Ｃが用意されることで、ステップＳ１０１～ステップＳ１０２の処理が省略されてもよい。

【0065】

ステップＳ１０３～ステップＳ１０５において、制御部８は、エレクトロポレーションによる細胞への物質の導入を行う。

【0066】

ステップＳ１０３：制御部８は、物質導入ユニット２に電圧印加前の細胞懸濁液を充填する。

【0067】

具体的には、制御部８は、バルブ部７Ｂを制御して、送液路９Ｂにより、導入前バッグ１０Ｃと収容器２１の第１開口２１Ｂとを接続する。そして、制御部８は、物質導入ユニット２の開閉部２３を制御して、収容器２１の第２開口２１Ｃを閉じられた状態にする。その後、制御部８は、送液部４を制御して、収容器２１の第１開口２１Ｂを介して、電圧印加前の細胞懸濁液を、導入前バッグ１０から収容器２１に充填する。このとき、制御部８は、所定量の細胞懸濁液を収容器２１に充填するように、送液部４を制御してもよい。

【0068】

このとき、収容器２１に細胞不透過性部材２４が設けられていることにより、細胞懸濁液に含まれる細胞が電極対２２の電極面２２Ｓに付着しにくくなる。

【0069】

ステップＳ１０４：制御部８は、エレクトロポレーションを実行する。

【0070】

具体的には、制御部８は、電圧印加部３を制御して、電極対２２に電力を印加して、収容器２１の内部空間２１Ａに電気パルスを発生させる。これにより、制御部８は、電極対２２により、収容器２１に収容された細胞懸濁液に電圧を印加する。

【0071】

ステップＳ１０５：制御部８は、物質導入ユニット２から電圧印加後の細胞懸濁液を排出する。

【0072】

具体的には、制御部８は、バルブ部７Ｃを制御して、送液路９Ｃにより、収容器２１の第２開口２１Ｃと導入済バッグ１０Ｄとを接続する。そして、制御部８は、物質導入ユニット２の開閉部２３を制御して、収容器２１の第２開口２１Ｃを開かれた状態にする。その後、制御部８は、送液部４を制御して、収容器２１の第２開口２１Ｃを介して、電圧印加後の細胞懸濁液を、収容器２１から導入済バッグ１０Ｄに排出する。ただし、制御部８は、省エネルギーの観点から、送液部４を制御せずに、細胞懸濁液の自重により、収容器２１の第２開口２１Ｃを介して、電圧印加後の細胞懸濁液を、収容器２１から導入済バッグ１０Ｄに排出してもよい。

【0073】

このとき、送液路９Ｃにフィルタリング部６Ｂが設けられていることにより、フィルタリング部６Ｂが、電圧印加後の細胞懸濁液から細胞残渣物を除去する。また、制御部８は、導入済バッグ１０Ｄに電圧印加後の細胞懸濁液を排出する際に、細胞カウント部５Ｂを制御して、電圧印加後の細胞懸濁液の中に存在する生細胞の数をカウントする。

【0074】

ステップＳ１０６：制御部８は、物質導入ユニット２の洗浄を行う。

【0075】

具体的には、制御部８は、バルブ部７Ｂを制御して、送液路９Ｂにより、洗浄済バッグ１０Ｆと収容器２１の第１開口２１Ｂとを接続する。そして、制御部８は、バルブ部７Ｃを制御して、送液路９Ｃにより、洗浄前バッグ１０Ｅと収容器２１の第２開口２１Ｃとを接続する。さらに、制御部８は、物質導入ユニット２の開閉部２３を制御して、収容器２１の第２開口２１Ｃを開かれた状態にする。

【0076】

その後、制御部８は、送液部４を制御して、収容器２１の第２開口２１Ｃを介して、洗浄液を、洗浄前バッグ１０Ｅから収容器２１に充填する。そして、制御部８は、送液部４を制御して、第１開口２１Ｂを介して、洗浄液を、収容器２１から洗浄済バッグ１０Ｆに排出する。このとき、制御部８は、所定量の洗浄液を収容器２１に充填するように、送液部４を制御してもよい。

【0077】

ステップＳ１０７：制御部８は、本処理を終了するか否かを判定する。

【0078】

具体的には、制御部８は、所定の回数だけ本処理が繰り返されたか否かを判定する。所定の回数は、予め、メモリ８１に記憶されていてもよい。制御部８は、所定の回数だけ本処理が繰り返されていないと判定した場合（Ｓ１０７－Ｎｏ）、ステップＳ１０３からの処理を繰り返し実行する。一方で、制御部８は、所定の回数だけ本処理が繰り返されたと判定した場合（ステップＳ１０７－Ｙｅｓ）、本処理を終了する。制御部８は、所定の回数だけ本処理が繰り返されたか否かの判定に代えて、本処理が実施された細胞懸濁液の総量が所定量に達したか否かの判定を行ってもよい。

【0079】

以上述べたように、本開示に係る物質導入ユニット２は、エレクトロポレーションによる細胞への物質の導入に用いられる物質導入ユニット２であって、細胞及び物質を含む細胞懸濁液を収容するように構成された収容器２１と、収容器２１の内部空間２１Ａに露出する電極面２２Ｓを有し収容器２１に収容された細胞懸濁液に電圧を印加するように構成された電極対２２と、を備え、収容器２１は、収容器２１の内部空間２１Ａを区画するように構成された細胞不透過性部材２４を備える。

【0080】

かかる構成を有する物質導入ユニット２によれば、エレクトロポレーションを実施するための容器を大きくするのではなく、同一の容器にてエレクトロポレーションを繰り返し実施可能とすることで、エレクトロポレーションの実施条件を変えずに、処理対象とする細胞懸濁液の総量を増やすことができる。そして、収容器２１の内部空間２１Ａを細胞不透過性部材２４により区画することにより、死滅した細胞又は破損した細胞等を含む細胞が付着して汚れうる範囲を限定することができる。したがって、本開示に係る物質導入ユニット２によれば、同一の容器にて繰り返しエレクトロポレーションを実施する際に、エレクトロポレーションにおける物質導入効率が低下しにくくなり、エレクトロポレーションにより細胞に物質を導入する技術の有用性を向上させることができる。

【0081】

本開示を諸図面及び実施例に基づき説明してきたが、当業者であれば本開示に基づき種々の変形及び修正を行うことが可能であることに注意されたい。したがって、これらの変形及び修正は本開示の範囲に含まれることに留意されたい。例えば、各手段又は各ステップ等に含まれる機能等は論理的に矛盾しないように再配置可能であり、複数の手段又はステップ等を１つに組み合わせたり、或いは分割したりすることが可能である。

【0082】

例えば、上述した実施形態において、細胞入り緩衝液と物質入り緩衝液との懸濁は、導入前バッグ１０Ｃ内にて実施されるものとして説明した。しかしながら、細胞入り緩衝液と物質入り緩衝液との懸濁は、送液路９Ａ内で、導入前バッグ１０Ｃへ流し込む際に実施されてもよい。これにより、細胞入り緩衝液と物質入り緩衝液との懸濁を効率的に実施することができる。

【0083】

また例えば、上述した実施形態において、エレクトロポレーションと物質導入ユニット２の洗浄は交互に同じ回数だけ実施されるものとして説明した。しかしながら、エレクトロポレーションと洗浄の回数は異なっていてもよい。例えば、エレクトロポレーションにおける細胞残渣物の発生しやすさに応じて、複数回のエレクトロポレーションが繰り返されるたびに、１回の洗浄が行われてもよい。これにより、エレクトロポレーションにおける物質導入効率と、エレクトロポレーションの処理速度との最適化を図ることができる。

【0084】

また例えば、上述した実施形態において、物質導入装置１の動作（物質導入方法）の全てが、制御部８の制御により自動で実施されるものとして説明した。しかしながら、物質導入装置１の動作の一部又は全部が手動により実施されてもよい。例えば、物質導入ユニット２の開閉部２３の開閉、電圧印加部３による電極対２２への電極の印加、送液部４による送液、細胞カウント部５による生細胞のカウント、又はバルブ部７による送液路９の流路の切替等の一部又は全部が手動により実施されてもよい。これにより、物質導入装置１の構造を簡素化することができ、物質導入装置１の製造コストの増加を抑制することが可能になる。

【0085】

また例えば、汎用のコンピュータを、上述した実施形態に係る制御部８として機能させる実施形態も可能である。具体的には、上述した実施形態に係る制御部８の各機能を実現する処理内容を記述したプログラムを、汎用のコンピュータのメモリに格納し、プロセッサによって当該プログラムを読み出して実行させる。したがって、本開示は、プロセッサが実行可能なプログラム、又は当該プログラムを記憶する非一時的なコンピュータ読取可能な媒体としても実現可能である。

【産業上の利用可能性】

【0086】

本開示は、物質導入ユニット及び物質導入装置に関する。

【符号の説明】

【0087】

１ 物質導入装置
２（２’） 物質導入ユニット
２１ 収容器
２１Ａ 内部空間
２１Ｂ 第１開口
２１Ｃ 第２開口
２１Ｄ 第１平板部
２１Ｅ 第２平板部
２２ 電極対
２２Ａ 第１電極
２２Ｂ 第２電極
２２Ｓ（２２ＳＡ、２２ＳＢ） 電極面
２３ 開閉部
２３Ａ 貫通孔
２４ 細胞不透過性部材
３ 電圧印加部
４ 送液部
５（５Ａ、５Ｂ） 細胞カウント部
６（６Ａ、６Ｂ） フィルタリング部
７（７Ａ、７Ｂ、７Ｃ） バルブ部
８ 制御部
９１ メモリ
９２ プロセッサ
９（９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、９Ｆ） 送液路
１１ バッグ
１１Ａ 細胞バッグ
１１Ｂ 導入物質バッグ
１１Ｃ 導入前バッグ
１１Ｄ 導入済バッグ
１１Ｅ 洗浄前バッグ
１１Ｆ 洗浄済バッグ

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】