特開 2023-126977 ポンペ病のｍＲＮＡ治療

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023126977

(43)【公開日】2023-09-12

(54)【発明の名称】ポンペ病のｍＲＮＡ治療

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/47 20060101AFI20230905BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230905BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20230905BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20230905BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20230905BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20230905BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20230905BHJP

   A61K 47/22 20060101ALI20230905BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20230905BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20230905BHJP

   A61K 31/7115 20060101ALI20230905BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20230905BHJP

   A61P 39/02 20060101ALI20230905BHJP

   C12N 15/56 20060101ALI20230905BHJP

   C12N 15/88 20060101ALN20230905BHJP

【ＦＩ】

A61K38/47

A61K48/00 ZNA

A61K31/7088

A61K9/127

A61K47/28

A61P21/00

A61P9/00

A61K47/22

A61K47/24

A61K47/34

A61K31/7115

A61P1/16

A61P39/02

C12N15/56

C12N15/88 Z

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023113052

(22)【出願日】2023-07-10

(62)【分割の表示】P 2021095880の分割

【原出願日】2016-03-17

(31)【優先権主張番号】62/135,338

(32)【優先日】2015-03-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】517316797

【氏名又は名称】トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】フランク デローサ

(72)【発明者】

【氏名】マイケル ハートレイン

(57)【要約】

【課題】ポンペ病のｍＲＮＡ治療の提供。
【解決手段】本発明は、とりわけ、治療を必要とする被験体に、酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）をコードするｍＲＮＡを含む組成物を、有効な用量及び投与間隔で投与し、それによってポンペ病の少なくとも１つの症状または特徴の強度、重症度、または頻度を低減するか、または発症を遅らせることを含む、ポンペ病の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上の非カチオン性脂質、１つ以上のコレステロール系脂質及び１つ以上のＰＥＧ修飾脂質を含むリポソームに封入する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

図面に記載の発明。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本願は、２０１５年３月１９日に出願された米国仮出願第６２／１３５，３３８号の優
先権を主張し、その開示内容を参照として本明細書に援用する。

【0002】

配列表
本明細書は、配列表（２０１６年３月１７日に「ＳＨＲ＿１１８５ＷＯ＿ＳＬ」という
名称の．ｔｘｔファイルとして電子提出した）を参照する。．ｔｘｔファイルは２０１６
年３月１７日に生成したものであって、そのサイズは２８，２８４バイトである。配列表
の内容全体を、参照として本明細書に援用する。

【背景技術】

【0003】

ポンペ病（糖原病ＩＩ型；酸性αグルコシダーゼ欠乏症；酸マルターゼ欠乏症；ＧＡＡ
欠乏症；ＧＳＤ ＩＩ；全身性グリコーゲン症ＩＩ型の心型；びまん性糖原性心肥大；酸
マルターゼ欠損症；ＡＭＤ；またはα‐１，４‐グルコシダーゼ欠損症）は、リソムソー
マル（ｌｙｓｏｍｓｏｍａｌ）酵素である酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）（酸性マルタ
ーゼとしても知られる）の遺伝子の突然変異を特徴とする常染色体劣性代謝遺伝子障害で
ある。ＧＡＡ遺伝子の突然変異は、ＧＡＡ酵素がグリコーゲン、マルトース及びイソマル
トースのα‐１，４及びα‐１，６結合を加水分解する能力を排除または低下させる。結
果として、グリコーゲンは体内の細胞中のリソソーム及び細胞質に蓄積し、細胞及び組織
の破壊をもたらす。特に影響を受ける組織として、骨格筋及び心筋が挙げられる。蓄積し
たグリコーゲンは、進行性筋力低下を引き起こし、心肥大、歩行困難及び呼吸不全をもた
らす。

【0004】

古典的な乳児発症型疾患、非古典的な乳児発症型疾患及び遅発型疾患を含む、３つの形
態のポンペ病が同定されている。古典的な乳児発症型は、筋力の低下、筋緊張の低下、肝
腫大、及び心臓欠陥を特徴とする。この疾患の発生率は、およそ１４万人に１人である。
この種の疾患を有する患者は、生後１年以内に心不全で死亡することが多い。この疾患の
非古典的な乳児発症型は、運動習熟の遅延、進行性筋力低下、及び場合によっては心肥大
を特徴とする。この種の疾患を有する患者は、呼吸不全のため、その生存が早期幼児期の
みに限られることが多い。遅発型の疾患は、若年期、青年期または成人期に発症する場合
があり、脚及び胴体の進行性筋力低下が特徴である。

【0005】

現在のところ、ポンペ病の治療法はなく、標準治療は、心筋症に対する支持療法を伴う
酵素補充療法（ＥＲＴ）ならびに筋力低下及び呼吸器症状に対する理学療法である。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

発明の概要
本発明は、とりわけ、ｍＲＮＡ療法に基づく改良型のポンペ病治療方法及び組成物を提
供する。本発明は、ヒトＧＡＡタンパク質をコードするｍＲＮＡをリポソーム内に封入し
て投与すると、ｉｎ ｖｉｖｏでの高効率かつ持続的なタンパク質産生が得られ、例えば
、臨床上、関連性の高い疾患マーカーである肝臓及び筋肉におけるグリコーゲンレベルが
効果的に低減するという観察を含む。

【0007】

一態様では、本発明は、治療を必要とする被験体に、酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）
をコードするｍＲＮＡを含む組成物を、有効な用量及び投与間隔で投与し、それによって
、ポンペ病の少なくとも１つの症状または特徴の、強度、重症度、または頻度を低減する
か、または発症を遅らせることを含む、ポンペ病の治療方法を提供する。いくつかの実施
形態では、ｍＲＮＡをリポソーム内に封入する。

【0008】

別の態様では、本発明は、治療を必要とする被験体に、酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ
）をコードするｍＲＮＡを含む治療有効量の組成物を投与し、それによって被験体の肥大
性心筋症を治療することを含む、ポンペ病の治療方法を提供する。いくつかの実施形態で
は、ｍＲＮＡをリポソーム内に封入する。

【0009】

別の態様では、本発明は、ＧＡＡをコードする有効量のｍＲＮＡをリポソーム内に封入
して含むポンペ病の治療用組成物を提供する。

【0010】

いくつかの実施形態では、適切なリポソームは、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上
の非カチオン性脂質、１つ以上のコレステロール系脂質及び１つ以上のＰＥＧ修飾脂質を
含む。

【0011】

いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、Ｃ１２‐２００、ＭＣ３、Ｄ
ＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ｃＫＫ‐Ｅ１２、ＩＣＥ（イミダゾール系）、Ｈ
ＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯ
ＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ及びＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩ
Ｅ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤ
ＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ‐Ｋ‐ＤＭＡ、ＤＬｉｎ‐
Ｋ‐ＸＴＣ２‐ＤＭＡ、ＨＧＴ４００３、ならびにその組合せからなる群から選択される
。

【0012】

いくつかの実施形態において、１つ以上のカチオン性脂質は、式Ｉ‐ｃ１‐ａの化合物
：

【化1】

、またはその薬学的に許容可能な塩を含み、式中：
各Ｒ^２は、独立して水素またはＣ_１‐３アルキルであり；
各ｑは、独立して２～６であり；
各Ｒ’は、独立して水素またはＣ_１‐３アルキルであり；
各Ｒ^Ｌは、独立してＣ_８‐１２アルキルである。

【0013】

いくつかの実施形態において、１つ以上のカチオン性脂質は、ｃＫＫ‐Ｅ１２：

【化2】

を含む。

【0014】

いくつかの実施形態では、本発明に適した１つ以上の非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣ（
１，２‐ジステアロイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２‐ジ
パルミトイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２‐ジオレイル‐
ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２‐ジオレイル‐ｓｎ
‐グリセロ‐３‐ホスフォチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ））
、ＤＰＰＥ（１，２‐ジパルミトイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスホエタノールアミン）
、ＤＭＰＥ（１，２‐ジミリストイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスホエタノールアミン）
、ＤＯＰＧ（，２‐ジオレオイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスホ‐（１’‐ｒａｃ‐グリ
セロール））、及びそれらの組合せから選択される。

【0015】

いくつかの実施形態において、１つ以上のコレステロール系脂質は、コレステロール、
ＰＥＧ化コレステロール及びＤＣ‐Ｃｈｏｌ（Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐Ｎ‐エチルカルボキサ
ミドコレステロール）、１，４‐ビス（３‐Ｎ‐オレイルアミノ‐プロピル）ピペラジン
ならびにそれらの組合せから選択される。

【0016】

いくつかの実施形態では、リポソームは、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質をさらに含む。い
くつかの実施形態では、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質は、鎖長Ｃ_６～Ｃ_２０のアルキル鎖（
複数可）を有する脂質に共有結合した最大鎖長５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖
を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、Ｎ‐オクタノイル‐スフィンゴシ
ン‐１‐［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）‐２０００］のような誘導体
化セラミドである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾またはＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ
化コレステロールまたはジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ）‐ＰＥＧ‐２Ｋである。

【0017】

いくつかの実施形態では、適切なリポソームは、ｃＫＫ‐Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステ
ロール及びＤＭＧ‐ＰＥＧ２Ｋ；Ｃ１２‐２００、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ
‐ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ４００３、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ‐ＰＥＧ２Ｋ；ま
たはＩＣＥ、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ‐ＰＥＧ２Ｋから選択される組合せを
含む。

【0018】

いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ‐Ｅ１２、Ｃ１２‐２００
、ＩＣＥ及び／またはＨＧＴ４００３）は、リポソームの約３０～６０％（例えば、約３
０～５５％、約３０～５０％、約３０～４５％、約３０～４０％、約３５～５０％、約３
５～４５％、または約３５～４０％）のモル比を占める。いくつかの実施形態では、カチ
オン性脂質（例えば、ｃＫＫ‐Ｅ１２、Ｃ１２‐２００、ＩＣＥ及び／またはＨＧＴ４０
０３）は、リポソームの約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％
、または約６０％のモル比を占める。

【0019】

いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（複数可）（例えば、ｃＫＫ‐Ｅ１２、Ｃ１
２‐２００、ＩＣＥ及び／またはＨＧＴ４００３）と、非カチオン性脂質（複数可）（例
えば、ＤＯＰＥ）と、コレステロール系脂質（複数可）（例えば、コレステロール）と、
ＰＥＧ化脂質（複数可）（例えば、ＤＭＧ‐ＰＥＧ２Ｋ）との比は、それぞれ約３０～６
０：２５～３５：２０～３０：１～１５の間であってもよい。いくつかの実施形態では、
カチオン性脂質（複数可）（例えば、ｃＫＫ‐Ｅ１２、Ｃ１２‐２００、ＩＣＥ及び／ま
たはＨＧＴ４００３）と、非カチオン性脂質（複数可）（例えば、ＤＯＰＥ）と、コレス
テロール系脂質（複数可）（例えば、コレステロール）と、ＰＥＧ化脂質（複数可）（例
えば、ＤＭＧ‐ＰＥＧ２Ｋ）との比は、それぞれおよそ４０：３０：２０：１０である。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（複数可）（例えば、ｃＫＫ‐Ｅ１２、Ｃ１２
‐２００、ＩＣＥ及び／またはＨＧＴ４００３）と、非カチオン性脂質（複数可）（例え
ば、ＤＯＰＥ）と、コレステロール系脂質（複数可）（例えば、コレステロール）と、Ｐ
ＥＧ化脂質（複数可）（例えば、ＤＭＧ‐ＰＥＧ２Ｋ）との比は、それぞれおよそ４０：
３０：２５：５である。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（複数可）（例えば、
ｃＫＫ‐Ｅ１２、Ｃ１２‐２００、ＩＣＥ及び／またはＨＧＴ４００３）と、非カチオン
性脂質（複数可）（例えば、ＤＯＰＥ）と、コレステロール系脂質（複数可）（例えば、
コレステロール）と、ＰＥＧ化脂質（複数可）（例えば、ＤＭＧ‐ＰＥＧ２Ｋ）との比は
、それぞれおよそ４０：３２：２５：３である。いくつかの実施形態では、カチオン性脂
質（複数可）（例えば、ｃＫＫ‐Ｅ１２、Ｃ１２‐２００、ＩＣＥ及び／またはＨＧＴ４
００３）と、非カチオン性脂質（複数可）（例えば、ＤＯＰＥ）と、コレステロール系脂
質（複数可）（例えば、コレステロール）と、ＰＥＧ化脂質（複数可）（例えば、ＤＭＧ
‐ＰＥＧ２Ｋ）との比は、およそ５０：２５：２０：５である。

【0020】

いくつかの実施形態では、リポソームのサイズは、リポソーム粒子の最大直径の長さに
よって決定される。いくつかの実施形態では、適切なリポソームは、約５００ｎｍ、４０
０ｎｍ、３００ｎｍ、２５０ｎｍ、２００ｎｍ、１５０ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、ま
たは５０ｎｍ未満のサイズを有する。いくつかの実施形態では、適切なリポソームは、約
１００ｎｍ、９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、または６０ｎｍ未満のサイズを有する。特
定の実施形態では、リポソームは、約１００ｎｍ未満のサイズを有する。

【0021】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを、約０．１～５．０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば約０
．１～４．５、０．１～４．０、０．１～３．５、０．１～３．０、０．１～２．５、０
．１～２．０、０．１～１．５、０．１～１．０、０．１～０．５、０．１～０．３、０
．３～５．０、０．３～４．５、０．３～４．０、０．３～３．５、０．３～３．０、０
．３～２．５、０．３～２．０、０．３～１．５、０．３～１．０、０．３～０．５、０
．５～５．０、０．５～４．５、０．５～４．０、０．５～３．５、０．５～３．０、０
．５～２．５、０．５～２．０、０．５～１．５、または０．５～１．０ｍｇ／ｋｇ体重
の範囲の用量で投与する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを、約５．０、４．５、４
．０、３．５、３．０、２．５、２．０、１．５、１．０、０．８、０．６、０．５、０
．４、０．３、０．２、または０．１ｍｇ／ｋｇ体重以下の用量で投与する。特定の実施
形態では、ｍＲＮＡを、約１．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。

【0022】

いくつかの実施形態では、提供組成物を静脈内投与する。いくつかの実施形態では、提
供組成物を筋肉内投与する。特定の実施形態では、筋肉内投与は、骨格筋、平滑筋及び心
筋からなる群から選択される筋肉に対して行う。いくつかの実施形態では、提供組成物を
、肺送達を介して投与する。特定の実施形態では、肺送達を、エアロゾル化、吸入、噴霧
または点滴注入によって実施する。いくつかの実施形態では、提供組成物を、呼吸可能な
粒子、噴霧可能な脂質、または吸入可能な乾燥粉末として製剤化する。

【0023】

いくつかの実施形態では、提供組成物を、１日１回、週１回、週２回、月２回、月１回
、投与する。いくつかの実施形態では、提供組成物を、７日に１回、１０日に１回、１４
日に１回、２８日に１回、または３０日に１回投与する。

【0024】

いくつかの実施形態では、治療有効量の定期的な投与の結果、肝臓内にＧＡＡタンパク
質が発現する。いくつかの実施形態では、治療有効量の定期的な投与の結果、筋肉組織ま
たは筋肉細胞内にＧＡＡタンパク質が発現する。筋肉組織は、例えば、骨格筋、平滑筋、
心筋及びそれらの組合せであり得る。筋肉細胞は、例えば、筋細胞、筋管、筋芽細胞、心
筋細胞、心筋芽細胞及びそれらの組合せであり得る。いくつかの実施形態では、治療有効
量の定期的な投与の結果、血清中にＧＡＡタンパク質が見出されるようになる。

【0025】

いくつかの実施形態では、提供組成物の治療有効量の定期的な投与の結果、被験体の肝
ＧＡＡタンパク質レベルが、治療前のベースラインの肝ＧＡＡタンパク質レベルに比べて
上昇する。いくつかの実施形態では、提供組成物の治療有効量の定期的な投与の結果、被
験体の筋ＧＡＡタンパク質レベルが、治療前のベースラインの筋ＧＡＡタンパク質レベル
に比べて上昇する。いくつかの実施形態では、筋肉は、骨格筋（例えば、横紋筋、随意筋
）、平滑筋（例えば、内臓筋、不随意筋）または心筋である。いくつかの実施形態では、
提供組成物の治療有効量の定期的な投与の結果、被験体の筋グリコーゲンレベルが、治療
前のベースラインの筋グリコーゲンレベルに比べて低下する。いくつかの実施形態では、
提供組成物の治療有効量の定期的な投与の結果、被験体の肝グリコーゲンレベルが、治療
前のベースラインの肝グリコーゲンレベルに比べて低下する。いくつかの実施形態では、
提供組成物の治療有効量の定期的な投与の結果、被験体の血清クレアチンキナーゼレベル
が、治療前のベースラインの血清クレアチンキナーゼレベルに比べて低下する。いくつか
の実施形態では、提供組成物の治療有効量の定期的な投与の結果、被験体の尿グルコース
四糖（Ｇｌｃα１‐６Ｇｌｃα１‐４Ｇｌｃα１‐４Ｇｌｃ（Ｇｌｃ_４）レベルが、治療
前のベースラインのＧｌｃ_４レベルに比べて低下する。いくつかの実施形態では、提供組
成物の治療有効量の定期的な投与の結果、被験体の血清アスパラギン酸トランスアミナー
ゼ（例えば、ＡＳＴ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、血清、グルタミン酸オ
キザロ酢酸トランスアミナーゼ）レベルが、治療前のベースラインのＡＳＴレベルに比べ
て低下する。いくつかの実施形態では、提供組成物の治療有効量の定期的な投与の結果、
被験体の血清アラニントランスアミナーゼ（例えば、ＡＬＴ、アラニンアミノトランスフ
ェラーゼ、血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ）レベルが、治療前のベース
ラインのＡＬＴレベルに比べて低下する。いくつかの実施形態では、提供組成物の治療有
効量の定期的な投与の結果、被験体の血清乳酸デヒドロゲナーゼ（例えば、ＬＤＨ、乳酸
デヒドロゲナーゼ）レベルが、治療前のベースラインのＬＤＨレベルに比べて低下する。
いくつかの実施形態では、提供組成物の治療有効量の定期的な投与の結果、生物学的試料
中のＧＡＡ酵素活性レベルが、治療前のベースラインのＧＡＡ酵素活性レベルに比べて上
昇する。

【0026】

いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、被験体の肝ＧＡＡタンパク質レベ
ルが、治療前のベースラインレベルに比べて上昇する。通常、ベースラインレベルは治療
の直前に測定する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、肝ＧＡＡタンパ
ク質レベルが、治療前のベースラインレベルに比べて少なくとも約１０％、２０％、３０
％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％上昇する。いくつ
かの実施形態では、提供組成物の投与の結果、肝ＧＡＡタンパク質レベルが、未治療の被
験体の肝ＧＡＡタンパク質レベルに比べて上昇する。

【0027】

いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、被験体の骨格筋のＧＡＡタンパク
質レベルが、治療前のベースラインレベルに比べて上昇する。通常、ベースラインレベル
は治療の直前に測定する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、骨格筋の
ＧＡＡタンパク質レベルが、治療前のベースラインレベルに比べて少なくとも約１０％、
２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％上昇
する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、骨格筋のＧＡＡタンパク質レ
ベルが、未治療の被験体の骨格筋のＧＡＡタンパク質レベルに比べて上昇する。

【0028】

いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、被験体の心筋のＧＡＡタンパク質
レベルが、治療前のベースラインレベルに比べて上昇する。通常、ベースラインレベルは
治療の直前に測定する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、心筋のＧＡ
Ａタンパク質レベルが、治療前のベースラインレベルに比べて少なくとも約１０％、２０
％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％上昇する
。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、心筋のＧＡＡタンパク質レベルが
、未治療の被験体の心筋のＧＡＡタンパク質レベルに比べて上昇する。

【0029】

いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、被験体の平滑筋のＧＡＡタンパク
質レベルが、治療前のベースラインレベルに比べて上昇する。通常、ベースラインレベル
は治療の直前に測定する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、平滑筋の
ＧＡＡタンパク質レベルが、治療前のベースラインレベルに比べて少なくとも約１０％、
２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％上昇
する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、平滑筋のＧＡＡタンパク質レ
ベルが、未治療の被験体の平滑筋のＧＡＡタンパク質レベルに比べて上昇する。

【0030】

いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、被験体の筋肉細胞のＧＡＡタンパ
ク質レベルが、治療前のベースラインレベルに比べて上昇する。通常、ベースラインレベ
ルは治療の直前に測定する。いくつかの実施形態では、筋肉細胞は、筋細胞、筋管、筋芽
細胞、心筋細胞または心筋芽細胞である。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の
結果、筋肉細胞のＧＡＡタンパク質レベルが、治療前のベースラインレベルに比べて少な
くとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、
または９５％上昇する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、筋肉細胞の
ＧＡＡタンパク質レベルが、未治療の被験体の筋肉細胞のＧＡＡタンパク質レベルに比べ
て上昇する。

【0031】

いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、被験体の肝臓細胞（例えば、肝細
胞、類洞壁細胞）のＧＡＡタンパク質レベルが、治療前のベースラインレベルに比べて上
昇する。通常、ベースラインレベルは治療の直前に測定する。いくつかの実施形態では、
提供組成物の投与の結果、肝臓細胞のＧＡＡタンパク質レベルが、治療前のベースライン
レベルに比べて少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％
、８０％、９０％、または９５％上昇する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与
の結果、肝臓細胞のＧＡＡタンパク質レベルが、未治療の被験体の肝臓細胞のＧＡＡタン
パク質レベルに比べて上昇する。

【0032】

いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、被験体の血漿または血清中のＧＡ
Ａタンパク質レベルが、治療前のベースラインレベルに比べて上昇する。通常、ベースラ
インレベルは治療の直前に測定する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果
、血漿または血清中のＧＡＡタンパク質レベルが、治療前のベースラインレベルに比べて
少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０
％、または９５％上昇する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、血漿ま
たは血清中のＧＡＡタンパク質レベルが、未治療の被験体の血漿または血清中のＧＡＡタ
ンパク質レベルに比べて上昇する。

【0033】

いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、被験体の血清クレアチンキナーゼ
レベルが、治療前のベースラインレベルに比べて低下する。通常、ベースラインレベルは
治療の直前に測定する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、血清クレア
チンキナーゼレベルが、治療直前のベースラインの血清クレアチンキナーゼレベルに比べ
て少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９
０％、または９５％低下する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、血清
クレアチンキナーゼレベルが、約２０００ＩＵ／Ｌ、１５００ＩＵ／Ｌ、１０００ＩＵ／
Ｌ、７５０ＩＵ／Ｌ、５００ＩＵ／Ｌ、２５０ＩＵ／Ｌ、１００ＩＵ／Ｌ、９０ＩＵ／Ｌ
、８０ＩＵ／Ｌ、７０ＩＵ／Ｌまたは６０ＩＵ／Ｌ未満にまで低下する。いくつかの実施
形態では、提供組成物の投与の結果、血清クレアチンキナーゼレベルが、未治療の被験体
の血清クレアチンキナーゼレベルに比べて低下する。

【0034】

いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、被験体の尿中Ｇｌｃ_４レベルが、
治療前のベースラインレベルに比べて低下する。通常、ベースラインレベルは治療の直前
に測定する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、尿中Ｇｌｃ_４レベルが
、治療直前のベースラインレベルに比べて少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％
、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％低下する。いくつかの実施形
態では、提供組成物の投与の結果、尿中Ｇｌｃ_４レベルが、約１００ｍｍｏｌ Ｇｌｃ_４
／ｍｏｌクレアチニン、９０ｍｍｏｌ Ｇｌｃ_４／ｍｏｌクレアチニン、８０ｍｍｏｌ
Ｇｌｃ_４／ｍｏｌクレアチニン、７０ｍｍｏｌ Ｇｌｃ_４／ｍｏｌクレアチニン、６０ｍ
ｍｏｌ Ｇｌｃ_４／ｍｏｌクレアチニン、５０ｍｍｏｌ Ｇｌｃ_４／ｍｏｌクレアチニン
、４０ｍｍｏｌ Ｇｌｃ_４／ｍｏｌクレアチニン、３０ｍｍｏｌ Ｇｌｃ_４／ｍｏｌクレ
アチニンまたは２０ｍｍｏｌ Ｇｌｃ_４／ｍｏｌクレアチニン未満にまで低下する。いく
つかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、尿中Ｇｌｃ_４レベルが、未治療の被験体
の尿中Ｇｌｃ_４レベルに比べて低下する。

【0035】

いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、被験体の筋グリコーゲンレベルが
、治療前のベースラインレベルに比べて低下する。通常、ベースラインレベルは治療の直
前に測定する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、筋グリコーゲンレベ
ルが、治療直前のベースラインレベルに比べて少なくとも約１０％、２０％、３０％、４
０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％低下する。いくつかの実
施形態では、提供組成物の投与の結果、筋グリコーゲンレベルが、未治療の被験体の筋グ
リコーゲンレベルに比べて低下する。特定の実施形態では、筋肉は、骨格筋、平滑筋また
は心筋である。

【0036】

いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、被験体の肝グリコーゲンレベルが
、治療前のベースラインレベルに比べて低下する。通常、ベースラインレベルは治療の直
前に測定する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、肝グリコーゲンレベ
ルが、治療直前のベースラインレベルに比べて少なくとも約１０％、２０％、３０％、４
０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％低下する。いくつかの実
施形態では、提供組成物の投与の結果、肝グリコーゲンレベルが、未治療の被験体の肝グ
リコーゲンレベルに比べて低下する。

【0037】

いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、被験体の血清アスパラギン酸トラ
ンスアミナーゼ（ＡＳＴ）レベルが、治療前のベースラインレベルに比べて低下する。通
常、ベースラインレベルは治療の直前に測定する。いくつかの実施形態では、提供組成物
の投与の結果、血清ＡＳＴレベルが、治療直前のベースラインレベルに比べて少なくとも
約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または
９５％低下する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、血清ＡＳＴレベル
が、約６００ＩＵ／Ｌ、５００ＩＵ／Ｌ、４００ＩＵ／Ｌ、３００ＩＵ／Ｌ、２００ＩＵ
／Ｌ、１００ＩＵ／Ｌ、５０ＩＵ／Ｌ、２５ＩＵ／Ｌ、２０ＩＵ／Ｌまたは１０ＩＵ／Ｌ
未満にまで低下する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、血清ＡＳＴレ
ベルが、未治療の被験体の血清ＡＳＴレベルに比べて低下する。

【0038】

いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、被験体の血清アラニントランスア
ミナーゼ（ＡＬＴ）レベルが、治療前のベースラインレベルに比べて低下する。通常、ベ
ースラインレベルは治療の直前に測定する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与
の結果、血清ＡＬＴレベルが、治療直前のベースラインレベルに比べて少なくとも約１０
％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％
低下する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、血清ＡＬＴレベルが、約
１０００ＩＵ／Ｌ、９００ＩＵ／Ｌ、８００ＩＵ／Ｌ、７００ＩＵ／Ｌ、６００ＩＵ／Ｌ
、５００ＩＵ／Ｌ、４００ＩＵ／Ｌ、３００ＩＵ／Ｌ、２００ＩＵ／Ｌ、１００ＩＵ／Ｌ
、５０ＩＵ／Ｌ、２５ＩＵ／Ｌ、２０ＩＵ／Ｌまたは１０ＩＵ／Ｌ未満にまで低下する。
いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、血清ＡＬＴレベルが、未治療の被験
体の血清ＡＬＴレベルに比べて低下する。

【0039】

いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、被験体の血清乳酸デヒドロゲナー
ゼ（ＬＤＨ）レベルが、治療前のベースラインレベルに比べて低下する。通常、ベースラ
インレベルは治療の直前に測定する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果
、血清乳酸デヒドロゲナーゼＬＤＨレベルが、治療直前のベースラインレベルに比べて少
なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％
、または９５％低下する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、血清ＬＤ
Ｈレベルが、約２０００ＩＵ／Ｌ、１５００ＩＵ／Ｌ、１０００ＩＵ／Ｌ、９００ＩＵ／
Ｌ、８００ＩＵ／Ｌ、７００ＩＵ／Ｌ、６００ＩＵ／Ｌ、５００ＩＵ／Ｌ、４００ＩＵ／
Ｌ、３００ＩＵ／Ｌ、２００ＩＵ／Ｌまたは１００ＩＵ／Ｌ未満にまで低下する。いくつ
かの実施形態では、提供組成物の投与の結果、血清ＬＤＨレベルが、未治療の被験体の血
清ＬＤＨレベルに比べて低下する。

【0040】

いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、被験体由来の生物学的試料中のＧ
ＡＡ酵素活性が、治療前のベースラインレベルに比べて上昇する。通常、ベースラインレ
ベルは治療の直前に測定する。生物学的試料として、例えば、全血、血清、血漿、尿及び
組織試料（例えば、筋肉、肝臓、皮膚線維芽細胞）が挙げられる。いくつかの実施形態で
は、提供組成物の投与の結果、ＧＡＡ酵素活性が、治療直前のベースラインレベルに比べ
て少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９
０％、または９５％上昇する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、ＧＡ
Ａ酵素活性が、未治療の被験体のＧＡＡ酵素活性に比べて上昇する。

【0041】

いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、被験体由来の生物学的試料中のＧ
ＡＡ ｍＲＮＡ発現レベルが、治療前のベースライン発現レベルに比べて上昇する。通常
、ベースラインレベルは治療の直前に測定する。生物学的試料として、例えば、全血、血
清、血漿、尿及び組織試料（例えば、筋肉、肝臓、皮膚線維芽細胞）が挙げられる。いく
つかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、ＧＡＡ ｍＲＮＡ発現レベルが、治療直
前のベースラインレベルに比べて少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％
、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％上昇する。いくつかの実施形態では、
提供組成物の投与の結果、ＧＡＡ ｍＲＮＡ発現レベルが、未治療の被験体のＧＡＡ ｍ
ＲＮＡ発現レベルに比べて上昇する。

【0042】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはコドン最適化されている。いくつかの実施形態で
は、コドン最適化ｍＲＮＡは、配列番号３（コドン最適化ヒトＧＡＡ ｍＲＮＡ配列に相
当）を有する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号８の５’ＵＴＲ配列（５
’ＵＴＲ配列Ｘに相当）を有する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号９の
３’ＵＴＲ配列（３’ＵＴＲ配列Ｙに相当）を有する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮ
Ａは、配列番号１０の３’ＵＴＲ配列（３’ＵＴＲ配列Ｙに相当）を有する。いくつかの
実施形態では、コドン最適化ｍＲＮＡは、配列番号１１または配列番号１２（５’ＵＴＲ
及び３’ＵＴＲ配列を有するコドン最適化ヒトＧＡＡ ｍＲＮＡ配列に相当）を有する。

【0043】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの
実施形態では、１つ以上の修飾ヌクレオチドは、プソイドウリジン、Ｎ‐１‐メチル‐プ
ソイドウリジン、２‐アミノアデノシン、２‐チオチミジン、イノシン、ピロロ‐ピリミ
ジン、３‐メチルアデノシン、５‐メチルシチジン、Ｃ‐５プロピニルシチジン、Ｃ５‐
プロピニルウリジン、２‐アミノアデノシン、Ｃ５‐ブロモウリジン、Ｃ５‐フルオロウ
リジン、Ｃ５‐ヨードウリジン、Ｃ５‐プロピニル‐ウリジン、Ｃ５‐プロピニル‐シチ
ジン、Ｃ５‐メチルシチジン、２‐アミノアデノシン、７‐デアザアデノシン、７‐デア
ザグアノシン、８‐オキソアデノシン、８‐オキソグアノシン、Ｏ（６）‐メチルグアニ
ン、及び／または２‐チオシチジンを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは未修飾
である。

【0044】

一態様では、本発明は、酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）をコードする有効量のｍＲＮ
Ａをリポソーム内に封入して含む、ポンペ病の治療用組成物を提供し、ここでリポソーム
は、カチオン性脂質ｃＫＫ‐Ｅ１２：

【化3】

を含む。

【0045】

一実施形態では、リポソームは、１つ以上の非カチオン性脂質、１つ以上のコレステロ
ール系脂質、及び１つ以上のＰＥＧ修飾脂質をさらに含む。いくつかの実施形態では、１
つ以上の非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣ（１，２‐ジステアロイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３
‐ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２‐ジパルミトイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスホコ
リン）、ＤＯＰＥ（１，２‐ジオレイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスホエタノールアミン
）、ＤＯＰＣ（１，２‐ジオレイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスフォチジルコリン（ｐｈ
ｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）） ＤＰＰＥ（１，２‐ジパルミトイル‐ｓｎ‐
グリセロ‐３‐ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２‐ジミリストイル‐ｓｎ‐
グリセロ‐３‐ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（，２‐ジオレオイル‐ｓｎ‐グリ
セロ‐３‐ホスホ‐（１’‐ｒａｃ‐グリセロール））からなる群から選択される。

【0046】

別の実施形態では、１つ以上のコレステロール系脂質は、コレステロール及び／または
ＰＥＧ化コレステロールから選択される。さらなる実施形態では、１つ以上のＰＥＧ修飾
脂質は、鎖長Ｃ_６～Ｃ_２０のアルキル鎖（複数可）を有する脂質に共有結合した最大鎖長
５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖を含む。

【0047】

別の実施形態では、リポソームは、ｃＫＫ‐Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤ
ＭＧ‐ＰＥＧ２Ｋを含む。特定の実施形態では、カチオン性脂質は、リポソームに対して
約３０～５０％のモル比を占める。別の実施形態では、カチオン性脂質は、リポソームに
対して約４０％のモル比を占める。

【0048】

別の実施形態では、ｃＫＫ‐Ｅ１２：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ‐ＰＥＧ２Ｋ
のモル比は、およそ４０：３０：２０：１０である。特定の実施形態では、ｃＫＫ‐Ｅ１
２：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ‐ＰＥＧ２Ｋのモル比は、およそ４０：３０：２
５：５である。さらに別の実施形態では、ｃＫＫ‐Ｅ１２：ＤＯＰＥ：コレステロール：
ＤＭＧ‐ＰＥＧ２Ｋのモル比は、およそ４０：３２：２５：３である。一実施形態では、
リポソームは、およそ１００ｎｍ未満のサイズを有する。

【0049】

一実施形態では、組成物を静脈内投与用に製剤化する。別の実施形態では、組成物を筋
肉内投与用に製剤化する。別の実施形態では、ｍＲＮＡは配列番号３を有する。さらなる
実施形態では、ｍＲＮＡはさらに配列番号８の５’ＵＴＲ配列を含む。さらに別の実施形
態では、ｍＲＮＡはさらに配列番号９または配列番号１０の３’ＵＴＲ配列を含む。特定
の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１１または配列番号１２を有する。

【0050】

一態様では、本発明は、酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）をコードする有効量のｍＲＮ
Ａをリポソーム内に封入して含む、ポンペ病の治療用組成物を提供し、ここでｍＲＮＡは
配列番号３を有し、さらに、リポソームは、カチオン性または非カチオン性脂質、コレス
テロール系脂質及びＰＥＧ修飾脂質を含む。

【0051】

一態様では、本発明は、酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）をコードする有効量のｍＲＮ
Ａをリポソーム内に封入して含む、ポンペ病の治療用組成物を提供し、ここでｍＲＮＡは
配列番号１１または配列番号１２を有し、さらに、リポソームは、カチオン性または非カ
チオン性脂質、コレステロール系脂質及びＰＥＧ修飾脂質を含む。

【0052】

本発明の他の特徴、目的、及び利点は、以下に記載する発明を実施するための形態、添
付の図面及び特許請求の範囲において明らかである。しかしながら、発明を実施するため
の形態、図面、及び特許請求の範囲は、本発明の実施形態を示してはいるが、これらは単
なる例示に過ぎず、限定するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内の様
々な変更及び修正は、当業者にとって明らかなものとなるであろう。
特定の実施形態において、例えば、以下が提供される：
（項目１）
ポンペ病の治療方法であって、治療を必要とする被験体に、酸性αグルコシダーゼ（Ｇ
ＡＡ）をコードするｍＲＮＡを含む組成物を、有効な用量及び投与間隔で投与し、ポンペ
病の少なくとも１つの症状または特徴の強度、重症度、または頻度を低減するか、または
発症を遅らせることを含む、前記治療方法。
（項目２）
ポンペ病の治療方法であって、治療を必要とする被験体に、酸性αグルコシダーゼ（Ｇ
ＡＡ）をコードするｍＲＮＡを含む組成物の治療有効量を投与し、被験体の肥大性心筋症
を治療することを含む、前記治療方法。
（項目３）
前記ｍＲＮＡをリポソーム内に封入する、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記リポソームが、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上の非カチオン性脂質、１つ以
上のコレステロール系脂質及び１つ以上のＰＥＧ修飾脂質を含む、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記１つ以上のカチオン性脂質が、Ｃ１２‐２００、ＭＣ３、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉ
ｎｋＣ２ＤＭＡ、ｃＫＫ‐Ｅ１２、ＩＣＥ（イミダゾール系）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ
５００１、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、Ｄ
ＯＤＭＡ及びＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、
ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒ
ｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ‐Ｋ‐ＤＭＡ、ＤＬｉｎ‐Ｋ‐ＸＴＣ２‐ＤＭＡ
、ＨＧＴ４００３、ならびにそれらの混合物からなる群から選択されるカチオン性脂質を
含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記１つ以上のカチオン性脂質が、ｃＫＫ‐Ｅ１２：

【化7】

を含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記１つ以上の非カチオン性脂質が、ＤＳＰＣ（１，２‐ジステアロイル‐ｓｎ‐グリ
セロ‐３‐ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２‐ジパルミトイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐
ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２‐ジオレイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスホエタノー
ルアミン）、ＤＯＰＣ（１，２‐ジオレイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスフォチジルコリ
ン） ＤＰＰＥ（１，２‐ジパルミトイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスホエタノールアミ
ン）、ＤＭＰＥ（１，２‐ジミリストイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスホエタノールアミ
ン）、ＤＯＰＧ（，２‐ジオレオイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスホ‐（１’‐ｒａｃ‐
グリセロール））及びそれらの組合せからなる群から選択される、項目４～６のいずれか
一項に記載の方法。
（項目８）
前記１つ以上のコレステロール系脂質が、コレステロール及び／またはＰＥＧ化コレス
テロールである、項目４～７に記載の方法。
（項目９）
前記１つ以上のＰＥＧ修飾脂質が、鎖長Ｃ_６～Ｃ_２０のアルキル鎖（複数可）を有する
脂質に共有結合した最大鎖長５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖を含む、項目４～
８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記カチオン性脂質が、前記リポソームの約３０～５０重量％を占める、先行項目のい
ずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
カチオン性脂質が、リポソームの約４０重量％を占める、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール：ＰＥＧ化脂質の比が、モル比で
およそ４０：３０：２０：１０である、項目４～１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール：ＰＥＧ化脂質の比が、重量比で
およそ４０：３０：２５：５である、項目４～１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール：ＰＥＧ化脂質の比が、重量比で
およそ４０：３２：２５：３である、項目４～１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記リポソームが：
ｃＫＫ‐Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ‐ＰＥＧ２Ｋ；
Ｃ１２‐２００、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ‐ＰＥＧ２Ｋ；
ＨＧＴ４００３、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ‐ＰＥＧ２Ｋ；または、
ＩＣＥ、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ‐ＰＥＧ２Ｋから選択される組み合わせ
を含む、項目３～１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記リポソームが約１００ｎｍ未満のサイズを有する、項目３～１５のいずれか一項に
記載の方法。
（項目１７）
前記ｍＲＮＡを、約０．１～５．０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の有効用量で投与する、先行
項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記ｍＲＮＡを、約０．１～３．０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の有効用量で投与する、先行
項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記ｍＲＮＡを、約０．１～１．０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の有効用量で投与する、先行
項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記ｍＲＮＡを、約１．０ｍｇ／ｋｇ体重の有効用量で投与する、先行項目のいずれか
一項に記載の方法。
（項目２１）
前記組成物を静脈内に投与する、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記組成物を筋肉内に投与する、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記筋肉内投与を、骨格筋、平滑筋、心筋及びそれらの組合せからなる群から選択され
る筋肉に対して行う、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記組成物を週１回投与する、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記組成物を週２回投与する、項目１～２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記組成物を月２回投与する、項目１～２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記組成物を月１回投与する、項目１～２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記組成物を１４日に１回投与する、項目１～２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記組成物の前記投与が、肝臓内でのＧＡＡタンパク質の発現をもたらす、先行項目の
いずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記組成物の前記投与が、筋肉組織または筋肉細胞内でのＧＡＡタンパク質の発現をも
たらす、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記筋肉組織が、骨格筋、平滑筋、心筋及びそれらの組合せから選択される、項目３０
に記載の方法。
（項目３２）
前記筋肉細胞が、筋細胞、筋管、筋芽細胞、心筋細胞、心筋芽細胞及びそれらの組合せ
からなる群より選択される、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記組成物の投与が、血清中でのＧＡＡタンパク質発現をもたらす、先行項目のいずれ
か一項に記載の方法。
（項目３４）
前記組成物の前記投与の結果、前記被験体の尿中Ｇｌｃ４レベルが、治療前のベースラ
インの尿中Ｇｌｃ４レベルに比べて低下する、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記組成物の前記投与の結果、前記被験体の筋グリコーゲンレベルが、治療前のベース
ラインの筋グリコーゲンレベルに比べて低下する、先行項目のいずれか一項に記載の方法
。
（項目３６）
前記組成物の前記投与の結果、前記被験体の肝グリコーゲンレベルが、治療前のベース
ラインの肝グリコーゲンレベルに比べて低下する、先行項目のいずれか一項に記載の方法
。
（項目３７）
前記組成物の前記投与の結果、前記被験体の血清アスパラギン酸トランスアミナーゼレ
ベルが、治療前のベースラインの血清アスパラギン酸トランスアミナーゼレベルに比べて
低下する、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記組成物の前記投与の結果、前記被験体の血清アラニントランスアミナーゼレベルが
、治療前のベースラインの血清アラニントランスアミナーゼレベルに比べて低下する、先
行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記組成物の前記投与の結果、前記被験体の血清クレアチンキナーゼレベルが、治療前
のベースラインの血清クレアチンキナーゼレベルに比べて低下する、先行項目のいずれか
一項に記載の方法。
（項目４０）
前記組成物の前記投与の結果、前記被験体の血清乳酸デヒドロゲナーゼレベルが、治療
前のベースラインの血清乳酸デヒドロゲナーゼレベルに比べて低下する、先行項目のいず
れか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記組成物の前記投与の結果、前記被験体由来の生物学的試料中のＧＡＡ酵素活性レベ
ルが、治療前の生物学的試料中のベースラインのＧＡＡ酵素活性レベルに比べて上昇する
、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記ｍＲＮＡがコドン最適化されている、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記コドン最適化ｍＲＮＡが配列番号３を有する、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記ｍＲＮＡが、配列番号８の５’ＵＴＲ配列をさらに含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記ｍＲＮＡが、配列番号９または配列番号１０の３’ＵＴＲ配列をさらに含む、項目
４３に記載の方法。
（項目４６）
前記ｍＲＮＡが、配列番号１１または配列番号１２を有する、先行項目のいずれか一項
に記載の方法。
（項目４７）
前記ｍＲＮＡが、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、先行項目のいずれか一項に記載
の方法。
（項目４８）
前記１つ以上の修飾ヌクレオチドが、プソイドウリジン、Ｎ‐１‐メチル‐プソイドウ
リジン、２‐アミノアデノシン、２‐チオチミジン、イノシン、ピロロ‐ピリミジン、３
‐メチルアデノシン、５‐メチルシチジン、Ｃ‐５プロピニル‐シチジン、Ｃ‐５プロピ
ニル‐ウリジン、２‐アミノアデノシン、Ｃ５‐ブロモウリジン、Ｃ５‐フルオロウリジ
ン、Ｃ５‐ヨードウリジン、Ｃ５‐プロピニル‐ウリジン、Ｃ５‐プロピニル‐シチジン
、Ｃ５‐メチルシチジン、２‐アミノアデノシン、７‐デアザアデノシン、７‐デアザグ
アノシン、８‐オキソアデノシン、８‐オキソグアノシン、Ｏ（６）‐メチルグアニン及
び／または２‐チオシチジンを含む、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記ｍＲＮＡが未修飾である、項目１～４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）をコードする有効量のｍＲＮＡをリポソーム内に封入
して含むポンペ病の治療用組成物であって、前記リポソームが、カチオン性脂質ｃＫＫ‐
Ｅ１２：

【化8】

を含む、前記治療用組成物。
（項目５１）
前記リポソームが、１つ以上の非カチオン性脂質、１つ以上のコレステロール系脂質、
及び１つ以上のＰＥＧ修飾脂質をさらに含む、項目５０に記載の組成物。
（項目５２）
前記１つ以上の非カチオン性脂質が、ＤＳＰＣ（１，２‐ジステアロイル‐ｓｎ‐グリ
セロ‐３‐ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２‐ジパルミトイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐
ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２‐ジオレイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスホエタノー
ルアミン）、ＤＯＰＣ（１，２‐ジオレイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスフォチジルコリ
ン（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）） ＤＰＰＥ（１，２‐ジパルミトイル
‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２‐ジミリストイル
‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（，２‐ジオレオイル‐ｓ
ｎ‐グリセロ‐３‐ホスホ‐（１’‐ｒａｃ‐グリセロール））及びそれらの組合せから
なる群から選択される、項目５１に記載の組成物。
（項目５３）
前記１つ以上のコレステロール系脂質が、コレステロール及び／またはＰＥＧ化コレス
テロールから選択される、項目５１または５２に記載の組成物。
（項目５４）
前記１つ以上のＰＥＧ修飾脂質が、鎖長Ｃ_６～Ｃ_２０のアルキル鎖（複数可）を有する
脂質に共有結合している最大鎖長５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖を含む、項目
５１～５３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５５）
前記リポソームが、ｃＫＫ‐Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ‐ＰＥＧ２
Ｋを含む、項目５０～５４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５６）
前記カチオン性脂質が、リポソームの約３０～５０ｍｏｌ％を占める、項目５０～５５
のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５７）
前記カチオン性脂質が、リポソームの約４０ｍｏｌ％を占める、項目５６に記載の組成
物。
（項目５８）
ｃＫＫ‐Ｅ１２：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ‐ＰＥＧ２Ｋの比が、モル比でお
よそ４０：３０：２０：１０である、項目５５～５７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５９）
ｃＫＫ‐Ｅ１２：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ‐ＰＥＧ２Ｋの比が、モル比でお
よそ４０：３０：２５：５である、項目５５～５７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６０）
ｃＫＫ‐Ｅ１２：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ‐ＰＥＧ２Ｋの比が、モル比でお
よそ４０：３２：２５：３である、項目５５～５７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６１）
前記リポソームが約１００ｎｍ未満のサイズを有する、項目５０～６０のいずれか一項
に記載の組成物。
（項目６２）
前記組成物を静脈内投与用に製剤化する、項目５０～６１のいずれか一項に記載の組成
物。
（項目６３）
前記組成物を筋肉内投与用に製剤化する、項目５０～６１のいずれか一項に記載の組成
物。
（項目６４）
前記ｍＲＮＡが配列番号３を有する、項目５０～６３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６５）
前記ｍＲＮＡが、配列番号８の５’ＵＴＲ配列をさらに含む、項目６４に記載の組成物。
（項目６６）
前記ｍＲＮＡが、配列番号９または配列番号１０の３’ＵＴＲ配列をさらに含む、項目
６４に記載の組成物。
（項目６７）
前記ｍＲＮＡが、配列番号１１または配列番号１２を有する、項目５０～６６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６８）
ポンペ病の治療用組成物であって、酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）をコードする有効量のｍＲＮＡをリポソーム内に封入して含み、前記ｍＲＮＡが配列番号３を有し、及び、
前記リポソームが、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール系脂質及びＰ
ＥＧ修飾脂質をさらに含む、前記治療用組成物。
（項目６９）
ポンペ病の治療用組成物であって、酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）をコードする有効量のｍＲＮＡをリポソーム内に封入して含み、前記ｍＲＮＡが配列番号１１または配列番号１２を有し、及び、
前記リポソームが、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール系脂質及びＰ
ＥＧ修飾脂質をさらに含む、前記治療用組成物。

【0053】

図面は説明を目的としたものに過ぎず、限定するものではない。

【図面の簡単な説明】

【0054】

【図1A】ＧＡＡ ｍＲＮＡカプセル化脂質ナノ粒子の１．０ｍｇ／ｋｇ静脈内単回投与による治療の６時間後に、マウス由来筋組織に対して実施したｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるＧＡＡ ｍＲＮＡ検出の一例を示す。

【図1B】ＧＡＡ ｍＲＮＡカプセル化脂質ナノ粒子の１．０ｍｇ／ｋｇ静脈内単回投与による治療の１２時間後に、マウス由来筋組織に対して実施したｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるＧＡＡ ｍＲＮＡ検出の一例を示す。

【図2A】ＧＡＡ ｍＲＮＡカプセル化脂質ナノ粒子の１．０ｍｇ／ｋｇ静脈内単回投与による治療の２４時間後における、ＧＡＡノックアウトマウスの肝臓内でのグリコーゲン低下の一例を示す。

【図2B】ＧＡＡ ｍＲＮＡカプセル化脂質ナノ粒子による治療を実施しなかったＧＡＡノックアウトマウスの肝臓内でのグリコーゲン蓄積の一例を示す。

【図3】ＧＡＡ ｍＲＮＡカプセル化脂質ナノ粒子の１．０ｍｇ／ｋｇ筋肉内単回投与による治療の２４時間後に、マウス由来筋組織に対して実施したｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるＧＡＡ ｍＲＮＡ検出の一例を示す。

【図4A】ＧＡＡ ｍＲＮＡカプセル化脂質ナノ粒子の１．０ｍｇ／ｋｇ筋肉内単回投与による治療の２４時間後における、ＧＡＡノックアウトマウスの四頭筋内でのグリコーゲン低下の一例を示す。

【図4B】ＧＡＡ ｍＲＮＡカプセル化脂質ナノ粒子の１．０ｍｇ／ｋｇ筋肉内単回投与による治療の２４時間後における、ＧＡＡノックアウトマウスの四頭筋内でのグリコーゲン低下の一例を示す。

【図4C】ＧＡＡ ｍＲＮＡカプセル化脂質ナノ粒子による治療を実施しなかったＧＡＡノックアウトマウスの四頭筋内でのグリコーゲンレベルの一例を示す。

【図4D】ＧＡＡ ｍＲＮＡカプセル化脂質ナノ粒子による治療を実施しなかったＧＡＡノックアウトマウスの四頭筋内でのグリコーゲンレベルの一例を示す。

【発明を実施するための形態】

【0055】

定義
本発明がより容易に理解されるように、初めにいくつかの用語を以下に定義する。以下
の用語及び他の用語の追加の定義を、本明細書全体の随所において記載する。本明細書中
で参照し、本発明の背景を説明するとともに、その実施に関するさらなる詳細を提供する
刊行物及び他の参考資料を、参照として本明細書に援用する。

【0056】

アルキル：本明細書中で使用する場合、「アルキル」とは、１～１５個の炭素原子を有
する直鎖または分枝鎖飽和炭化水素基（「Ｃ_１‐１５アルキル」）のラジカルを指す。い
くつかの実施形態では、アルキル基は１～３個の炭素原子を有する（「Ｃ_１‐３アルキル
」）。Ｃ_１‐３アルキル基の例として、メチル（Ｃ_１）、エチル（Ｃ_２）、ｎ‐プロピル
（Ｃ_３）、及びイソプロピル（Ｃ_３）が挙げられる。いくつかの実施形態では、アルキル
基は８～１２個の炭素原子（「Ｃ_８‐１２アルキル」）を有する。Ｃ_８‐１２アルキルの
例として、ｎ‐オクチル（Ｃ_８）、ｎ‐ノニル（Ｃ_９）、ｎ‐デシル（Ｃ_１０）、ｎ‐ウ
ンデシル（Ｃ_１１）、ｎ‐ドデシル（Ｃ_１２）などが挙げられるが、必ずしもこれらに限
定するものではない。接頭語「ｎ‐」（ｎｏｒｍａｌ）は、非分枝アルキル基を指す。例
えば、ｎ‐Ｃ_８アルキルは‐（ＣＨ_２）_７ＣＨ_３を指し、ｎ‐Ｃ_１０アルキルは‐（ＣＨ
_２）_９ＣＨ_３を指す、などである。

【0057】

アミノ酸：本明細書中で使用する場合、用語「アミノ酸」とは、その最も広い意味で、
ポリペプチド鎖に取り込み可能な任意の化合物及び／または物質を指す。いくつかの実施
形態では、アミノ酸は一般構造Ｈ_２Ｎ―Ｃ（Ｈ）（Ｒ）―ＣＯＯＨを有する。いくつかの
実施形態では、アミノ酸は天然に存在するアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ア
ミノ酸は合成アミノ酸であり；いくつかの実施形態では、アミノ酸は、ｄ‐アミノ酸であ
り；いくつかの実施形態では、アミノ酸はｌ‐アミノ酸である。「標準アミノ酸」とは、
天然に存在するペプチドに共通して見出される２０種類の標準的なｌ‐アミノ酸のいずれ
かを指す。「非標準アミノ酸」とは、合成的に調製したものか、または天然源から得たも
のかどうかに関わらず、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を意味する。本明細書中で使
用する場合、「合成アミノ酸」は、化学的に修飾したアミノ酸を包含し、これには塩類、
アミノ酸誘導体（アミド類など）、及び／または置換が含まれるが、必ずしもこれらに限
定するものではない。ペプチド内のカルボキシ末端及び／またはアミノ末端のアミノ酸を
含むアミノ酸はそれらの活性に悪影響を及ぼすことなくペプチドの循環半減期を変化させ
ることが可能な、メチル化、アミド化、アセチル化、保護基及び／または他の化学基との
置換によって修飾することができる。アミノ酸はジスルフィド結合に関与していてもよい
。アミノ酸は、１つ以上の化学的実体（例えば、メチル基、アセテート基、アセチル基、
リン酸基、ホルミル部分、イソプレノイド基、硫酸基、ポリエチレングリコール部分、脂
質部分、炭水化物部分、ビオチン部分など）との会合のような１つまたは翻訳後修飾を含
んでいてもよい。用語「アミノ酸」は、「アミノ酸残基」と同じ意味で用いており、さら
には遊離アミノ酸及び／またはペプチドのアミノ酸残基を指すことがある。用語が遊離ア
ミノ酸を指すのか、またはペプチドの残基を指すのかは、その用語を用いている文脈から
明らかであろう。

【0058】

動物：本明細書中で使用する場合、用語「動物」とは、動物界の任意のメンバーを指す
。いくつかの実施形態では、「動物」は、任意の発達段階のヒトを指す。いくつかの実施
形態では、「動物」は、任意の発達段階の非ヒト動物を指す。特定の実施形態では、非ヒ
ト動物は哺乳類（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツ
ジ、ウシ、霊長類、及び／またはブタ）である。いくつかの実施形態において、動物には
、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類、及び／または虫類が含まれるが、必ず
しもこれらに限定するものではない。いくつかの実施形態では、動物は、トランスジェニ
ック動物、遺伝子改変動物、及び／またはクローンであってもよい。

【0059】

およそ（Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）または約（ａｂｏｕｔ）：本明細書中で使用す
る場合、用語「およそ」または「約」は、それを関心のある１つ以上の値に適用する場合
、記載する基準値に類似する値を指す。特定の実施形態において、用語「およそ（ａｐｐ
ｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」は、特段の記載がない限り、また
は文脈から明らかな場合を除き、記載する値のいずれかの方向（より大きいまたはより小
さい）に対して、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、
１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、
１％、またはそれ未満に収まる数値範囲を指す（そのような数値が可能値の１００％を超
える場合を除く）。

【0060】

生物学的に活性：本明細書中で使用する場合、語句「生物学的に活性」とは、生物学的
系内で、特に生物内で活性を有する任意の薬剤の特性を指す。例えば、生物に投与した場
合に、その生物に対して生物学的効果を有する薬剤は、生物学的に活性であると考えられ
る。

【0061】

送達：本明細書中で使用する場合、用語「送達」は、局所送達及び全身送達の両方を包
含する。例えば、ｍＲＮＡの送達は、ｍＲＮＡを標的組織に送達し、コードするタンパク
質が標的組織内で発現し、及び保持される状況（「局所分配」または「局所送達」とも呼
ぶ）、ならびにｍＲＮＡを標的組織に送達し、コードするタンパク質が発現し、及び患者
の循環系（例えば血清）に分泌されて全身に分配され、他の組織によって取り込まれる（
「全身分配」または「全身送達」とも呼ぶ）状況を包含する。

【0062】

発現：本明細書中で使用する場合、核酸配列の「発現」とは、ｍＲＮＡのポリペプチド
への翻訳、複数のポリペプチドからのインタクトなタンパク質（例えば、酵素）への組立
て、及び／またはポリペプチドもしくは完全に組み立てられたタンパク質（例えば、酵素
）の翻訳後修飾を指す。本願では、用語「発現」及び「産生」、ならびに文法上の同等表
現を、同じ意味で用いる。

【0063】

機能性：本明細書中で使用する場合、「機能性」生体分子とは、それを特徴付ける特性
及び／または活性を示す形態の生体分子である。

【0064】

半減期：本明細書中で使用する場合、用語「半減期」とは、核酸またはタンパク質の濃
度または活性などの量が、ある期間の開始時に測定したその値の半分に低下するのに要す
る時間のことである。

【0065】

向上する、上昇する、または低下する：本明細書中で使用する場合、用語「向上する」
、「上昇する」もしくは「低下する」、または文法上の同等表現は、本明細書に記載の治
療の開始前の同じ個体における測定値などのベースライン測定値、または本明細書に記載
の治療の非存在下での対照被験体（または複数の対照被験体）における測定値と比較した
値を示す。「対照被験体」とは、治療対象の被験体と同じ型の疾患に罹患する、治療対象
とほぼ同じ年齢の被験体である。

【0066】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ：本明細書中で使用する場合、用語「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」とは、多細
胞生物内ではなく、人工環境、例えば、試験管または反応容器内、細胞培養物中などで生
じる事象を指す。

【0067】

ｉｎ ｖｉｖｏ：本明細書中で使用する場合、用語「ｉｎ ｖｉｖｏ」とは、ヒト及び
非ヒト動物のような多細胞生物内で起こる事象を指す。細胞ベースのシステムの文脈にお
いて、本用語は、（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系とは対照的に）生細胞内で起こる事象を
指すために使用してもよい。

【0068】

単離した：本明細書中で使用する場合、用語「単離した」とは、（１）最初に産生した
際に（自然状態で及び／または実験上の設定の下で）、関連する成分の少なくともいくつ
かから分離した物質及び／または実体、及び／または（２）人の手によって生産、調製、
及び／または製造したものを指す。単離した物質及び／または実体は、最初の時点でそれ
らと関連していた他の成分の、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約
６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約
９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超から分離され得る
。いくつかの実施形態において、単離した薬剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９
１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９
９％、または約９９％超の水準において純粋である。本明細書中で使用する場合、物質が
実質的に他の成分を含まない場合、それは「純粋」である。本明細書中で使用する場合、
単離した物質及び／または実体のパーセント純度の計算には、賦形剤（例えば、緩衝剤、
溶媒、水など）を含めるべきではない。

【0069】

局所分配または送達：本明細書で使用する場合、用語「局所分配」、「局所送達」また
は文法上の同等表現は、組織特異的送達または分配を指す。一般的には、局所的な分配ま
たは送達には、ｍＲＮＡがコードするタンパク質（例えば、酵素）を、細胞内において翻
訳及び発現させるか、または分泌を限定的にとどめて患者の循環器系に入ることを避ける
ことが必要である。

【0070】

メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：本明細書中で使用する場合、用語「メッセンジャ
ーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドを指す。本明細書中で用いるｍＲＮＡは、修飾ＲＮＡ及び非修飾ＲＮＡの両方を包含
する。ｍＲＮＡは、１つ以上のコード領域及び非コード領域を含み得る。ｍＲＮＡは、天
然資源から精製したり、組換え発現系を用いて産生し、さらに必要に応じて精製したり、
化学的に合成したりすることができる。適切には、例えば、化学合成した分子の場合、ｍ
ＲＮＡに、例えば化学修飾した塩基または糖、骨格修飾などを備えたアナログなどのヌク
レオシドアナログを含ませることができる。他に特段の指定がない限り、ｍＲＮＡ配列は
５’から３’の方向に提示する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、天然ヌクレオシ
ド（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）；ヌクレオシドアナログ（
例えば、２‐アミノアデノシン、２‐チオチミジン、イノシン、ピロロピリミジン、３‐
メチルアデノシン、５‐メチルシチジン、Ｃ‐５プロピニル‐シチジン、Ｃ‐５プロピニ
ル‐ウリジン、２‐アミノアデノシン、Ｃ５‐ブロモウリジン、Ｃ５‐フルオロウリジン
、Ｃ５‐ヨードウリジン、Ｃ５‐プロピニル‐ウリジン、Ｃ５‐プロピニル‐シチジン、
Ｃ５‐メチルシチジン、２‐アミノアデノシン、７‐デアザアデノシン、７‐デアザグア
ノシン、８‐オキソアデノシン、８‐オキソグアノシン、Ｏ（６）‐メチルグアニン、及
び２‐チオシチジン）；化学的修飾塩基；生物学的修飾塩基（例えば、メチル化塩基）；
インターカレート塩基；修飾糖類（例えば、２’‐フルオロリボース、リボース、２’‐
デオキシリボース、アラビノース、及び六炭糖）；及び／または修飾リン酸基（例えば、
ホスホロチオエート及び５’‐Ｎ‐ホスホラミダイト結合）であるか、またはそれらを含
む。

【0071】

筋肉細胞または筋肉組織：本明細書中で使用する場合、用語「筋肉細胞」または「筋肉
組織」とは、その最も広い意味で、筋肉に由来する細胞または細胞群を指し、必ずしも限
定するものではないが、骨格筋（例えば、横紋筋、随意筋）に由来する細胞及び組織；消
化管、膀胱及び血管由来の平滑筋（例えば、内臓筋、不随意筋）；及び心筋を含む。本用
語は、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの筋肉細胞を指す。本用語には、筋細胞、
筋管、筋芽細胞、心筋細胞及び心筋芽細胞などの、分化及び未分化の、または非分化の筋
細胞も含まれる。

【0072】

核酸：本明細書中で使用する場合、用語「核酸」とは、その最も広い意味において、ポ
リヌクレオチド鎖に組み込まれているか、または組み込まれ得る任意の化合物及び／また
は物質を指す。いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合を介してポリヌ
クレオチド鎖に組み込まれているか、または組み込まれ得る化合物及び／または物質であ
る。いくつかの実施形態では、「核酸」とは、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチド及
び／またはヌクレオシド）を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残
基を含むポリヌクレオチド鎖を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡなら
びに一本鎖及び／または二本鎖ＤＮＡ及び／またはｃＤＮＡを包含する。

【0073】

患者：本明細書中で使用する場合、用語「患者」または「被験体」は、例えば実験、診
断、予防、美容、及び／または治療を目的として、提供組成物を投与し得る任意の生物を
指す。一般的な患者として、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及
び／またはヒトなどの哺乳類）が挙げられる。いくつかの実施形態では、患者はヒトであ
る。ヒトは、出生前及び出生後の形態を含む。

【0074】

薬学的に許容可能な：本明細書中で使用する用語「薬学的に許容可能な」とは、正常な
医学的判断の範囲内で、ヒト及び動物の組織に接触させて使用するのに適した物質であっ
て、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を呈することが
なく、合理的なリスク対効果比に見合った物質を指す。

【0075】

薬学的に許容可能な塩：薬学的に許容可能な塩は、当該技術分野で周知である。例えば
、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅらは、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１
９７７）６６：１‐１９において、薬学的に許容可能な塩を詳細に記載している。本発明
の化合物の薬学的に許容可能な塩は、適切な無機及び有機の酸及び塩基に由来するものを
含む。薬学的に許容可能な非毒性の酸付加塩の例として、以下のような無機酸、例えば塩
酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸及び過塩素酸、または以下のような有機酸、例えば酢酸、
シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸もしくはルナロニック酸（ｒｎａｌ
ｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を用いて、またはイオン交換のような当該技術分野で用いられる他
の方法を用いて形成したアミノ基の塩が挙げられる。他の薬学的に許容可能な塩の例とし
て、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスル
ホン酸塩、安息香酸塩、硫酸水素塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、
クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタン
スルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン
酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２‐ヒドロキシ‐エ
タンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ
酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２‐ナフタレンスルホン酸塩、
ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチ
ン酸塩、過硫酸塩、３‐フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸
塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩
、ｐ‐トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。適切な塩基
から誘導される塩として、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム及びＮ^＋（Ｃ
_１‐４アルキル）_４塩が挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩として
、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが挙げられる。適切
な場合には、さらなる薬学的に許容可能な塩として、無毒性のアンモニウム、第四級アン
モニウム、ならびにハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩
、スルホン酸塩、及びアリールスルホン酸塩などの対イオンを用いて形成したアミンカチ
オンが挙げられる。さらなる薬学的に許容可能な塩として、例えばハロゲン化アルキルな
どの適切な求電子剤を用いてアミンを四級化して第四級アルキル化アミノ塩を形成する塩
が挙げられる。

【0076】

全身分配または送達：本明細書中で使用する場合、用語「全身分配」、「全身送達」ま
たは文法上の同等表現は、身体全体または生物全体に影響を及ぼす送達または分配の機構
またはアプローチを指す。通常、全身分配または送達は、体の循環系、例えば血流を介し
て達成される。「局所分配または送達」の定義と比較されたい。

【0077】

被験体：本明細書中で使用する場合、用語「被験体」とは、ヒトまたは任意の非ヒト動
物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは霊
長類）を指す。ヒトには、出生前と出生後の両方の形態が含まれる。多くの実施形態では
、被験体はヒトである。被験体は、患者であることができ、すなわち、疾患の診断または
治療のために医療提供者を訪れるヒトを指す。用語「被験体」は、本明細書では「個体」
または「患者」と同じ意味で用いる。被験体は、疾患または障害に罹患しているかまたは
罹患しやすい状況にある可能性が高いが、疾患または障害の症状を示していても、示して
いなくてもよい。

【0078】

実質的に：本明細書中で使用する場合、用語「実質的に」とは、関心対象の特徴または
特性が、全体またはほぼ全体の範囲または程度にわたっていることを示す定性的状態を指
す。生物学的技術分野の当業者であれば、生物学的及び化学的現象が完了すること、及び
／または完全性を達成すること、または絶対的結果を達成もしくは回避することは、ある
にしても極めて稀であることを理解するだろう。したがって、本明細書中では、用語「実
質的に」を、多くの生物学的及び化学的現象に固有の完全性の潜在的な欠如を捕捉するた
めに用いる。

【0079】

標的組織：本明細書中で使用する場合、用語「標的組織」とは、治療しようとする疾患
が影響を及ぼしている任意の組織を指す。いくつかの実施形態では、標的組織には、疾患
に関連する病徴、症状または特徴を示す組織が含まれる。

【0080】

治療有効量：本明細書中で使用する場合、治療薬の「治療有効量」という用語は、疾患
、障害、及び／または病態に罹患しているかまたは罹患しやすい状態にある被験体に投与
した場合に、疾患、障害、及び／または病態の症状（複数可）を治療、診断、予防及び／
またはその発症を遅延させるのに十分な量を意味する。通常、治療有効量を、少なくとも
１つの単位用量を含む投与レジメンを介して投与することは、当業者であれば理解するで
あろう。

【0081】

治療：本明細書中で使用する場合、用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅ
ａｔｍｅｎｔ）」または「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、被験体の特定の疾
患、障害及び／または病態の１つ以上の症状または特徴を、部分的または完全に、緩和し
、寛解し、軽減し、阻害し、防止し、発症を遅延させ、重症度を低減し、及び／または発
症率を低下させるために用いる任意の方法を指す。疾患に関連する病徴の発症リスクを低
減するために、治療は、疾患の症状を示していない及び／または疾患の早期症状のみを示
す被験体に対して投与してもよい。

【0082】

詳細な説明
本発明は、とりわけ、ｍＲＮＡ療法に基づくポンペ病の治療方法及び組成物を提供する
。特に、本発明は、治療を必要とする被験体に、酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）をコー
ドするｍＲＮＡを含有する組成物を、有効な用量及び投与間隔で投与し、それによってポ
ンペ病の少なくとも１つの症状または特徴の、強度、重症度、もしくは頻度を低下させる
か、または発症を遅らせることによってポンペ病を治療する方法を提供する。本発明はさ
らに、治療を必要とする被験体に、酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）をコードするｍＲＮ
Ａを含有する組成物の治療有効量を投与し、それによって被験体の肥大性心筋症を治療す
ることを含む、ポンペ病の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを１
つ以上のリポソーム内に封入する。本明細書中で使用する場合、用語「リポソーム」とは
、任意の層状、多層状、または固体のナノ粒子小胞を指す。一般的には、本明細書中で使
用するリポソームは、１種以上の脂質を混合することによって、または１種以上の脂質と
１種以上のポリマー（複数可）とを混合することによって形成することができる。したが
って、本明細書で使用する用語「リポソーム」は、脂質系及びポリマー系ナノ粒子の両方
を包含する。いくつかの実施形態では、本発明に適したリポソームは、カチオン性または
非カチオン性脂質（複数可）、コレステロール系脂質（複数可）及びＰＥＧ修飾脂質（複
数可）を含有する。

【0083】

ポンペ病
本発明を、ポンペ病に罹患しているか、または罹患しやすい被験体を治療するために使
用してもよい。ポンペ病は、酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）酵素の遺伝子中の変異を特
徴とする常染色体劣性代謝遺伝性障害である。ＧＡＡ酵素は：酸性マルターゼ、マルター
ゼ、マルターゼ‐グルコアミラーゼ、グルオインベルターゼ（ｇｌｕｏｉｎｖｅｒｔａｓ
ｅ）、グルコシドスクラーゼ、アグルコシダーゼα、α‐１，４‐グルコシダーゼ、アミ
ログルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、ＬＹＡＧ、ＬＹＡＧ＿ＨＵＭＡＮ、リソソームα
グルコシダーゼ及びαグルコシダーゼ、酸としても知られている。ＧＡＡ遺伝子（グルコ
シダーゼα；酸）は：酸性マルターゼ、α‐１，４‐グルコシダーゼ及びαグルコシダー
ゼ、酸としても知られている。ポンペ病を引き起こす２００種以上の突然変異がＧＡＡ遺
伝子において同定されている。これらの突然変異のほとんどは、単一のアミノ酸置換及び
小さな挿入または欠失を含んでいる。ＧＡＡ遺伝子の突然変異の多くは、得られるタンパ
ク質の構造に影響を与え、その活性を低下させている可能性がある。ＧＡＡ遺伝子の突然
変異のうちのいくつかは、異常に短くなった酵素の産生をもたらし、そのような酵素はグ
リコーゲンの加水分解においてその役割を効果的に果たすことができない。

【0084】

酸性αグルコシダーゼ酵素の欠損は、グリコーゲンを加水分解する細胞の能力を低下さ
せ、その結果、細胞及び組織、特に肝臓及び筋肉にグリコーゲンが蓄積する。グリコーゲ
ンの蓄積は細胞死をもたらし、それは進行性筋力低下、心筋症及び呼吸不全として現れる
。

【0085】

本明細書に記載の組成物及び方法は、ポンペ病の少なくとも１つの症状または特徴を治
療するために使用し得る。特に、本明細書に記載の組成物及び方法は、肥大性心筋症を治
療するために使用し得る。

【0086】

酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）
いくつかの実施形態において、本発明は、ポンペ病の治療のための、ＧＡＡをコードす
るｍＲＮＡの被験体への送達方法及び組成物を提供する。適切なＧＡＡ ｍＲＮＡは、天
然のＧＡＡタンパク質の活性を置き換えることができ、及び／またはポンペ病に関連する
１つ以上の症状の強度、重症度、及び／または頻度を低下させることができるＧＡＡタン
パク質の全長、断片または部分のいずれかをコードしている。

【0087】

いくつかの実施形態では、適切なｍＲＮＡ配列は、ヒトＧＡＡタンパク質をコードする
ｍＲＮＡ配列である。天然に存在するヒトＧＡＡ ｍＲＮＡコード配列及び対応するアミ
ノ酸配列を表１に示す：

【表1-1】

【表1-2】

【0088】

いくつかの実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列の野生型ヒトＧＡＡ ｍＲＮＡ（配
列番号１）である。いくつかの実施形態では、適切なｍＲＮＡは、以下に示す配列のよう
なコドン最適化ｈＧＡＡ配列であってもよい：

【0089】

コドン最適化ヒトＧＡＡコード配列（配列番号３）：
ＡＵＧＧＧＡＧＵＣＡＧＡＣＡＣＣＣＧＣＣＧＵＧＣＵＣＧＣＡＣＡＧＧＣＵＵＣＵＧ
ＧＣＣＧＵＧＵＧＣＧＣＡＣＵＣＧＵＧＡＧＵＣＵＧＧＣＧＡＣＵＧＣＵＧＣＧＵＵＧＣ
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ＵＣＣＧＡＡＧＧＡＣＡＵＣＣＵＵＡＣＵＣＵＧＣＧＧＣＵＣＧＡＣＧＵＧＡＵＧＡＵＧ
ＧＡＧＡＣＡＧＡＡＡＡＵＡＧＧＣＵＧＣＡＵＵＵＣＡＣＧＡＵＣＡＡＡＧＡＣＣＣＧＧ
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ＵＣＡＣＵＣＵＣＧＵＧＣＧＣＣＵＵＣＡＣＣＣＵＵＧＵＡＣＵＣＣＧＵＧＧＡＧＵＵＣ
ＵＣＧＧＡＡＧＡＡＣＣＧＵＵＣＧＧＧＧＵＧＡＵＣＧＵＣＡＧＡＣＧＵＣＡＡＣＵＵＧ
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ＵＵＵＣＧＣＣＧＡＣＣＡＧＵＵＵＣＵＧＣＡＧＣＵＵＵＣＧＡＣＡＵＣＧＣＵＧＣＣＧ
ＵＣＣＣＡＧＵＡＵＡＵＣＡＣＡＧＧＧＣＵＣＧＣＧＧＡＧＣＡＵＣＵＵＵＣＡＣＣＣＣ
ＵＣＡＵＧＣＵＧＡＧＣＡＣＧＡＧＣＵＧＧＡＣＡＣＧＧＡＵＵＡＣＧＣＵＣＵＧＧＡＡ
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ＣＧＡＧＧＧＧＡＡＣＵＧＵＵＵＵＧＧＧＡＵＧＡＣＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＵＵＧＡＧＧ
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ＵＵＣＵＣＧＵＧＡＧＣＵＧＧＵＧＣＵＡＧ

【0090】

さらなるｍＲＮＡ配列の例を、以下の実施例のセクションに記載し、例えば、配列番号
１１及び配列番号１２は、コドン最適化ＧＡＡコードｍＲＮＡを囲む５’及び３’非翻訳
領域を含む。

【0091】

いくつかの実施形態において、適切なｍＲＮＡ配列は、ヒトＧＡＡタンパク質のホモロ
グまたはアナログのｍＲＮＡ配列であってもよい。例えば、ヒトＧＡＡタンパク質のホモ
ログまたはアナログは、野生型すなわち天然に存在するヒトＧＡＡタンパク質に比べて、
１つ以上のアミノ酸置換、欠失及び／または挿入を含むが、その一方でＧＡＡタンパク質
活性を実質的に保持している改変ヒトＧＡＡタンパク質であってもよい。いくつかの実施
形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７
０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９
６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の割合で配列番号２に相同であるアミノ酸
配列をコードする。いくつかの実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、ヒトＧＡＡタ
ンパク質に実質的に同一のタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、本発明に
適したｍＲＮＡは、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０
％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８
％、９９％またはそれ以上の割合で配列番号２と同一であるアミノ酸配列をコードする。
いくつかの実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、ヒトＧＡＡタンパク質の断片また
は部分をコードする。いくつかの実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、ヒトＧＡＡ
タンパク質の断片または部分をコードし、ここで、タンパク質の断片または部分は、野生
型タンパク質と同様のＧＡＡ活性をなお維持している。いくつかの実施形態では、本発明
に適したｍＲＮＡは、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８
０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％またはそれ以上の割合で、配列番号１、配列番号３、配列番号１１または配
列番号１２と同一のヌクレオチド配列を有する。

【0092】

いくつかの実施形態では、適切なｍＲＮＡは、別のタンパク質に融合させた（例えば、
ＮまたはＣ末端融合体）ＧＡＡタンパク質の全長、断片または部分を含む融合タンパク質
をコードする。いくつかの実施形態では、ＧＡＡタンパク質の全長、断片または一部をコ
ードするｍＲＮＡに融合させたタンパク質は、シグナル配列または細胞標的化配列をコー
ドする。

【0093】

送達媒体
本発明によれば、本明細書に記載のＧＡＡタンパク質（例えば、ＧＡＡタンパク質の全
長、断片または一部）をコードするｍＲＮＡは、裸のＲＮＡ（パッケージされていない）
として、または送達媒体を介して送達してもよい。本明細書中で使用する用語「送達媒体
」、「輸送媒体」、「ナノ粒子」または文法上の同等表現は、同じ意味で用いる。

【0094】

いくつかの実施形態において、ＧＡＡタンパク質をコードするｍＲＮＡを、単一の送達
媒体を介して送達してもよい。いくつかの実施形態では、ＧＡＡタンパク質をコードする
ｍＲＮＡを、それぞれ異なる組成の１つ以上の送達媒体を介して送達してもよい。様々な
実施形態によれば、適切な送達媒体として、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのポリマ
ー系担体、脂質ナノ粒子及びリポソーム、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム
、プロテオリポソーム、天然及び合成の両方に由来するエキソソーム、天然、合成及び半
合成ラメラ体、ナノ微粒子、リン酸カルシウム‐ケイ酸ナノ粒子、リン酸カルシウムナノ
粒子、二酸化ケイ素ナノ粒子、ナノ結晶微粒子、半導体ナノ微粒子、ポリ（Ｄ‐アルギニ
ン）、ゾル‐ゲル、ナノデンドリマー、デンプンベースの送達システム、ミセル、乳剤、
ニオソーム、マルチドメインブロックポリマー（ビニルポリマー、ポリプロピルアクリル
酸ポリマー、ｄｙｎａｍｉｃ ｐｏｌｙｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、乾燥粉末製剤、プラスミ
ド、ウイルス、リン酸カルシウムヌクレオチド、アプタマー、ペプチド及び他のベクター
タグが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。

【0095】

リポソーム送達媒体
いくつかの実施形態において、適切な送達媒体は、リポソーム送達媒体、例えば脂質ナ
ノ粒子である。本明細書中で使用する場合、脂質ナノ粒子などのリポソーム送達媒体は、
通常、１つ以上の二重層の膜によって外部媒質から隔離された内部水性空間を備えた極小
の小胞として特徴付けられる。リポソームの二重層膜は、通常、空間的に分離した親水性
及び疎水性ドメインを有する合成または天然起源の脂質などの両親媒性分子によって形成
される（Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：３０７‐３２１，
１９９８）。リポソームの二重層膜は、両親媒性ポリマー及び界面活性剤（例えば、ポリ
メロソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｏｓｏｍｅ）、ニオソームなど）によって形成することもで
きる。本発明の文脈において、リポソーム送達媒体は、一般的には、所望のｍＲＮＡを標
的細胞または組織に輸送するのに役立つ。

【0096】

カチオン性脂質
いくつかの実施形態において、リポソームは、１つ以上のカチオン性脂質を含み得る。
本明細書中で使用する語句「カチオン性脂質」とは、選択したｐＨ、例えば生理学的ｐＨ
などにおいて、正味の正電荷を有する多くの脂質種のいずれかを指す。いくつかのカチオ
ン性脂質が文献に記載されており、その多くは市販されている。本発明の組成物及び方法
における使用に特に適したカチオン性脂質として、国際特許公開ＷＯ２０１０／０５３５
７２（特に、段落［００２２５］に記載されているＣＩ２‐２００）及びＷＯ２０１２／
１７０９３０に記載されているものが挙げられ、これらの文献は、参照として本明細書に
援用する。特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、２０１２年３月２９日に出
願された米国仮特許出願第６１／６１７，４６８号（本明細書中に参照として援用する）
に記載のイオン化可能なカチオン性脂質、例えば（１５Ｚ，１８Ｚ）‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル
‐６‐（９Ｚ，１２Ｚ）‐オクタデカ‐９，１２‐ジエン‐１‐イル）テトラコサ‐１５
，１８‐ジエン‐１‐アミン（ＨＧＴ５０００）、（１５Ｚ，１８Ｚ）‐Ｎ，Ｎ‐ジメチ
ル‐６‐（（９Ｚ，１２Ｚ）‐オクタデカ‐９，１２‐ジエン‐１‐イル）テトラコサ‐
４，１５，１８‐トリエン‐１‐アミン（ＨＧＴ５００１）、及び（１５Ｚ，１８Ｚ）‐
Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐６‐（（９Ｚ，１２Ｚ）‐オクタデカ‐９，１２‐ジエン‐１‐イル
）テトラコサ‐５，１５，１８‐トリエン‐１‐アミン（ＨＧＴ５００２）などを含む脂
質ナノ粒子を利用する。

【0097】

いくつかの実施形態では、提供するリポソームは、ＷＯ２０１３／０６３４６８、及び
本出願と同時に出願された「メッセンジャーＲＮＡの送達のための脂質製剤」と題する米
国仮出願に記載されているカチオン性脂質を含み、これら両方の文献は、参照として本明
細書に援用する。

【0098】

いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、式Ｉ‐ｃ１‐ａ：

【化4】

、の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を含み、式中：
各Ｒ^２は独立して水素またはＣ_１‐３アルキルであり；
各ｑは独立して２～６であり；
各Ｒ’は独立して水素またはＣ_１‐３アルキルであり；
及び、各Ｒ^Ｌは独立してＣ_８‐１２アルキルである。

【0099】

いくつかの実施形態では、各Ｒ^２は独立して水素、メチルまたはエチルである。いくつ
かの実施形態では、各Ｒ^２は独立して水素またはメチルである。いくつかの実施形態では
、各Ｒ^２は水素である。

【0100】

いくつかの実施形態では、各ｑは独立して３～６である。いくつかの実施形態では、各
ｑは独立して３～５である。いくつかの実施形態では、各ｑは４である。

【0101】

いくつかの実施形態では、各Ｒ’は独立して水素、メチルまたはエチルである。いくつ
かの実施形態では、各Ｒ’は独立して水素またはメチルである。いくつかの実施形態では
、各Ｒ’は独立して水素である。

【0102】

いくつかの実施形態では、各Ｒ^Ｌは独立してＣ_８‐１２アルキルである。いくつかの実
施形態では、各Ｒ^Ｌは独立してｎ‐Ｃ_８‐１２アルキルである。いくつかの実施形態では
、各Ｒ^Ｌは独立してＣ_９‐１１アルキルである。いくつかの実施形態では、各Ｒ^Ｌは独立
してｎ‐Ｃ_９‐１１アルキルである。いくつかの実施形態では、各Ｒ^Ｌは独立してＣ_１０
アルキルである。いくつかの実施形態では、各Ｒ^Ｌは独立してｎ‐Ｃ_１０アルキルである
。

【0103】

いくつかの実施形態では、各Ｒ^２は、独立して水素またはメチルであり；各ｑは、独立
して３～５であり；各Ｒ’は、独立して水素またはメチルであり；各Ｒ^Ｌは、独立してＣ
_８‐１２アルキルである。

【0104】

いくつかの実施形態では、各Ｒ^２は水素であり；各ｑは独立して３～５であり；各Ｒ’
は水素であり；及び各Ｒ^Ｌは独立してＣ_８‐１２アルキルである。

【0105】

いくつかの実施形態では、各Ｒ^２は水素であり；各ｑは４であり；各Ｒ’は水素であり
；各Ｒ^Ｌは独立してＣ_８‐１２アルキルである。

【0106】

いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、式Ｉ‐ｇ：

【化5】

、の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含み、式中、各Ｒ^Ｌは独立してＣ_８‐１２
アルキルである。いくつかの実施形態では、各Ｒ^Ｌは独立してｎ‐Ｃ_８‐１２アルキルで
ある。いくつかの実施形態では、各Ｒ^Ｌは独立してＣ_９‐１１アルキルである。いくつか
の実施形態では、各Ｒ^Ｌは独立してｎ‐Ｃ_９‐１１アルキルである。いくつかの実施形態
では、各Ｒ^Ｌは独立してＣ_１０アルキルである。いくつかの実施形態では、各Ｒ^Ｌはｎ‐
Ｃ_１０アルキルである。

【0107】

特定の実施形態において、提供するリポソームは、カチオン性脂質ｃＫＫ‐Ｅ１２、す
なわち（３，６‐ビス（４‐（ビス（２‐ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラ
ジン‐２，５‐ジオン）を含む。ｃＫＫ‐Ｅ１２の構造を以下に示す：

【化6】

【0108】

いくつかの実施形態において、１つ以上のカチオン性脂質は、Ｎ‐［１‐（２，３‐ジ
オレイルオキシ）プロピル］‐Ｎ，Ｎ，Ｎ‐トリメチルアンモニウムクロライドすなわち
「ＤＯＴＭＡ」であり得る（Ｆｅｉｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，７４１３（１９８７）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８９７，３
５５）。ＤＯＴＭＡは、単独で製剤化することができるか、または中性脂質、ジオレオイ
ルホスファチジルエタノールアミンすなわち「ＤＯＰＥ」もしくは他のカチオン性もしく
は非カチオン性脂質と組み合わせて、リポソーム輸送小胞または脂質ナノ粒子内に入れる
ことができ、そのようなリポソームを用いて標的細胞への核酸の送達を増強することがで
きる。他の適切なカチオン性脂質として、例えば５‐カルボキシスペルミルグリシンジオ
クタデシルアミドすなわち「ＤＯＧＳ」、２，３‐ジオレイルオキシ‐Ｎ‐［２（スペル
ミン‐カルボキサミド）エチル］‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐１‐プロパンアミニウムすなわち
「ＤＯＳＰＡ」（Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．８６，６９８２（１９８９）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，１７１，６７８；Ｕ．Ｓ．
Ｐａｔ．Ｎｏ．５，３３４，７６１）、１，２‐ジオレオイル‐３‐ジメチルアンモニウ
ム‐プロパンすなわち「ＤＯＤＡＰ」、１，２‐ジオレオイル‐３‐トリメチルアンモニ
ウム‐プロパンすなわち「ＤＯＴＡＰ」が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するもの
ではない。

【0109】

さらなるカチオン性脂質の例として、１，２‐ジステアリルオキシ‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル
‐３‐アミノプロパンすなわち「ＤＳＤＭＡ」、１，２‐ジオレイルオキシ‐Ｎ，Ｎ‐ジ
メチル‐３‐アミノプロパンすなわち「ＤＯＤＭＡ」、１，２‐ジリノレイオキシ‐Ｎ，
Ｎ‐ジメチル‐３‐アミノプロパンすなわち「ＤＬｉｎＤＭＡ」、１，２‐ジリノレニル
オキシ‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３‐アミノプロパンすなわち「ＤＬｅｎＤＭＡ」、Ｎ‐ジオ
レイル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアンモニウムクロライドすなわち「ＤＯＤＡＣ」、Ｎ，Ｎ‐ジ
ステアリル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアンモニウムブロマイドすなわち「ＤＤＡＢ」、Ｎ‐（１
，２‐ジミリスチルオキシプロパ‐３‐イル）‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐Ｎ‐ヒドロキシエチ
ルアンモニウムブロマイドすなわち「ＤＭＲＩＥ」、３‐ジメチルアミノ‐２‐（コレス
タ‐５‐エン‐３‐β‐オキシブタン‐４‐オキシ）‐１‐（ｃｉｓ，ｃｉｓ‐９，１２
‐オクタデカジエンオキシ）プロパンすなわち「ＣＬｉｎＤＭＡ」、２‐［５’‐（コレ
スタ‐５‐エン‐３‐β‐オキシ）‐３’‐オキサペントキシ）‐３‐ジメチル‐１‐１
‐（ｃｉｓ，ｃｉｓ‐９’，１‐２’‐オクタデカジエンオキシ）プロパンまたは「Ｃｐ
ＬｉｎＤＭＡ」、Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐３，４‐ジオレイルオキシベンジルアミンすなわち
「ＤＭＯＢＡ」、１，２‐Ｎ，Ｎ’‐ジオレイルカルバミル‐３‐ジメチルアミノプロパ
ンすなわち「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」、２，３‐ジリノレオイルオキシ‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル
プロピルアミンすなわち「ＤＬｉｎＤＡＰ」、１，２‐Ｎ，Ｎ’‐ジリノレイルカルバミ
ル‐３‐ジメチルアミノプロパンすなわち「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」、１，２‐ジリノ
レオイルカルバミル‐３‐ジメチルアミノプロパンすなわち「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」、２，
２‐ジリノレイル‐４‐ジメチルアミノメチル‐［１，３］‐ジオキソランすなわち「Ｄ
Ｌｉｎ‐‐ＤＭＡ」、２，２‐ジリノレイル‐４‐ジメチルアミノエチル‐［１，３］‐
ジオキソランすなわち「ＤＬｉｎ‐Ｋ‐ＸＴＣ２‐ＤＭＡ」、及び２‐（２，２‐ジ（（
９Ｚ，１２Ｚ）‐オクタデカ‐９，１１‐ジエン‐１‐イル）‐１，３‐ジオキソラン‐
４‐イル）‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルエタンアミン（ＤＬｉｎ‐ＫＣ２‐ＤＭＡ））（ＷＯ２０
１０／０４２８７７；Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２
８：１７２‐１７６（２０１０）参照）、またはそれらの混合物が挙げられる。（Ｈｅｙ
ｅｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０７：２７
６‐２８７（２００５）；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，ＤＶ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００３‐１００７（２００５）；ＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃ
ａｔｉｏｎ ＷＯ２００５／１２１３４８Ａ１）。いくつかの実施形態において、カチオ
ン性脂質の１つ以上は、イミダゾール、ジアルキルアミノ、またはグアニジニウム部分の
うちの少なくとも１つを含む。

【0110】

いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、ＸＴＣ（２，２‐ジリノレイ
（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙ）１‐４‐ジメチルアミノエチル‐１‐［１，３］‐ジオキソラン
）、ＭＣ３（（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）‐ヘプタトリアコンタ‐６，９，２８，
３１‐テトラエン‐１９‐イル ４‐（ジメチルアミノ）ブタノエート）、ＡＬＮＹ‐１
００（（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）‐Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐２，２‐ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）‐
オクタデカ‐９，１２‐ジエニル）テトラヒドロ‐３ａＨ‐シクロペンタ［ｄ］［１，３
］ジオキソール‐５‐アミン））、ＮＣ９８‐５（４，７，１３‐トリス（３‐オキソ‐
３‐（ウンデシルアミノ）プロピル）‐Ｎ１，Ｎ１６‐ジウンデシル‐４，７，１０，１
３‐テトラアザヘキサデカン‐１，１６‐ジアミド）、ＤＯＤＡＰ（１，２‐ジオイル‐
３‐ジメチルアンモニウムプロパン）、ＨＧＴ４００３（ＷＯ２０１２／１７０８８９、
この文献の内容は、その全体を参照として本明細書に援用する）、ＩＣＥ（ＷＯ２０１１
／０６８８１０、この文献の内容は、その全体を参照として本明細書に援用する）、ＨＧ
Ｔ５０００（米国仮特許出願第６１／６１７，４６８号、この文献の内容は、その全体を
参照として本明細書に援用する）またはＨＧＴ５００１（ｃｉｓまたはｔｒａｎｓ）（仮
特許出願第６１／６１７，４６８号）、ＷＯ２０１０／０５３５７２に開示されているよ
うなアミノアルコールリピドイド、ＤＯＴＡＰ（１，２‐ジオレイル‐３‐トリメチルア
ンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２‐ジ‐Ｏ‐オクタデセニル‐３‐トリメチル
アンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．；Ｐａｌｍｅｒ，Ｌ．；Ｂ
ｒｅｍｎｅｒ，Ｋ．；ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｉ．“Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ ｓ
ａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖ
ｅｒｙ ｏｆ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ”Ｊ．Ｃｏｎｔ
ｒ．Ｒｅｌ．２００５，１０７，２７６‐２８７）、ＤＬｉｎ‐ＫＣ２‐ＤＭＡ（Ｓｅｍ
ｐｌｅ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．“Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｃａｔｉｏｎ
ｉｃ Ｌｉｐｉｄｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ．２０１０，２８，１７２‐１７６）、Ｃ１２‐２００（Ｌｏｖｅ，Ｋ．Ｔ．ｅｔ
ａｌ．“Ｌｉｐｉｄ‐ｌｉｋｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｌｏｗ‐ｄｏｓｅ ｉ
ｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ”ＰＮＡＳ ２０１０，１０７，１８６４
‐１８６９）から選択してもよい。

【0111】

いくつかの実施形態では、リポソーム中のカチオン性脂質の割合は、１０％超、２０％
超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、または７０％超であってもよい。いくつ
かの実施形態では、カチオン性脂質（複数可）は、重量比でリポソームの約３０～５０％
（例えば、約３０～４５％、約３０～４０％、約３５～５０％、約３５～４５％、または
約３５～４０％）を占める。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ
‐Ｅ１２）は、モル比でリポソームの約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または
約５０％を占める。

【0112】

非カチオン性／ヘルパー脂質
いくつかの実施形態において、提供するリポソームは、１つ以上の非カチオン性（「ヘ
ルパー」）脂質を含有する。本明細書中で使用する場合、語句「非カチオン性脂質」とは
、任意の中性、双性イオン性または陰イオン性の脂質を指す。本明細書中で使用する場合
、語句「アニオン性脂質」とは、選択したＨ、例えば生理学的ｐＨなどにおいて正味の負
電荷を有する多数の脂質種のいずれかを指す。非カチオン性脂質として、ジステアロイル
ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、
ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセ
ロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレ
オイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファ
チジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル‐ホスファチジルエタノールアミン
（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル‐ホスファチジルエタノールアミン４‐（Ｎ‐マレイミドメ
チル）‐シクロヘキサン‐１‐カルボキシレート（ＤＯＰＥ‐ｍａｌ）、ジパルミトイル
ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン
（ＤＭＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６‐Ｏ
‐モノメチルＰＥ、１６‐Ｏ‐ジメチルＰＥ、１８‐１‐ｔｒａｎｓ‐ＰＥ、１‐ステア
ロイル‐２‐オレオイル‐ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、またはそれら
の混合物が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。

【0113】

いくつかの実施形態では、このような非カチオン性脂質は単独で使用し得るが、好まし
くは他の賦形剤、例えばカチオン性脂質と組み合わせて使用する。いくつかの実施形態で
は、非カチオン性脂質は、リポソーム中に存在する総脂質の約５％～約９０％、または約
１０％～約７０％のモル比を含み得る。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、
中性脂質、すなわち、組成物を製剤化及び／または投与する条件下で正味の電荷を有さな
い脂質である。いくつかの実施形態では、リポソーム中の非カチオン性脂質の割合は、５
％超、１０％超、２０％超、３０％超、または４０％超であってもよい。

【0114】

コレステロール系脂質
いくつかの実施形態では、提供するリポソームは、１つ以上のコレステロール系脂質を
含む。例えば、適切なコレステロール系カチオン性脂質として、例えばＤＣ‐Ｃｈｏｉ（
Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐Ｎ‐エチルカルボキシアミドコレステロール）、１，４‐ビス（３‐
Ｎ‐オレイルアミノ‐プロピル）ピペラジン（Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９，２８０（１９９１）；Ｗｏｌｆ ｅｔ ａ
ｌ． ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３，１３９（１９９７）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ
．５，７４４，３３５）、またはＩＣＥが挙げられる。いくつかの実施形態では、コレス
テロール系脂質は、リポソーム中に存在する全脂質の約２％～約３０％、または約５％～
約２０％のモル比を含み得る。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子中のコレステ
ロール系脂質の割合は、５，％超、１０％、２０％超、３０％超、または４０％超であっ
てもよい。

【0115】

ＰＥＧ化脂質
いくつかの実施形態において、提供するリポソームは、１種以上のＰＥＧ化脂質を含む
。例えば、Ｎ‐オクタノイル‐スフィンゴシン‐１‐［スクシニル（メトキシポリエチレ
ングリコール）‐２０００］（Ｃ８ ＰＥＧ‐２０００セラミド）をはじめとするポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質、及び誘導体化セラミド（ＰＥＧ‐ＣＥＲ）な
どの誘導体化脂質を、１種以上のカチオン性の脂質、及びいくつかの実施形態においては
他の脂質と組み合わせて用いて、共にリポソームを構成することも本発明は想定している
。想定されるＰＥＧ修飾脂質として、鎖長Ｃ_６～Ｃ_２０のアルキル鎖（複数可）を有し、
脂質に共有結合した最大鎖長５ｋＤａのポリエチレングリコール鎖が挙げられるが、必ず
しもこれに限定するものではない。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾またはＰＥＧ化
脂質は、ＰＥＧ化コレステロールまたはＰＥＧ‐２Ｋである。このような成分の添加は、
複雑な凝集を防止する可能性があり、循環寿命を引き延ばし、標的細胞への脂質‐核酸組
成物の送達を高める手段を提供し得るが（Ｋｌｉｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９０）
ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６８（１）：２３５‐２３７）、またはｉｎ ｖｉｖｏで
製剤から速やかに交換されるように成分を選択してもよい（米国特許第５，８８５，６１
３号参照）。

【0116】

いくつかの実施形態では、特に有用な交換可能な脂質は、より短いアシル鎖（例えば、
Ｃ_１４またはＣ_１８）を有するＰＥＧ‐セラミドである。本発明のＰＥＧ修飾リン脂質及
び誘導体化脂質は、リポソーム中に存在する全脂質の約０％～約１５％、約０．５％～約
１５％、約１％～約１５％、約４％～約１０％または約２％のモル比を有してもよい。

【0117】

様々な実施形態によれば、脂質ナノ粒子を含むカチオン性脂質、非カチオン性脂質及び
／またはＰＥＧ修飾脂質の選択ならびにこれらの脂質同士の相対モル比は、選択した脂質
（複数可）の特徴、目的の標的細胞の性質、送達しようとするｍＲＮＡの特徴に応じたも
のとなる。さらなる考慮事項として、例えば、アルキル鎖の飽和度、ならびに選択した脂
質（複数可）のサイズ、電荷、ｐＨ、ｐＫａ、膜融合性及び毒性が挙げられる。したがっ
て、これらに応じてモル比を調整してもよい。

【0118】

ポリマー
いくつかの実施形態において、ポリマーを担体として単独で、または本明細書に記載の
様々な脂質を含む他の担体と組み合わせて用いて、適切な送達媒体を製剤化する。したが
って、いくつかの実施形態では、本明細書中で用いるリポソーム送達媒体は、ポリマーを
含有するナノ粒子も包含する。適切なポリマーとして、例えば、ポリアクリレート、ポリ
アルキルシアノアクリレート、ポリラクチド、ポリラクチド‐ポリグリコリドコポリマー
、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギン酸、コラーゲン
、キトサン、シクロデキストリン、プロタミン、ＰＥＧ化プロタミン、ＰＬＬ、ＰＥＧ化
ＰＬＬ及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を挙げてもよい。ＰＥＩが存在する場合、それ
は１０～４０ｋＤａの範囲の分子量の分枝ＰＥＩ、例えば２５ｋＤａ分枝ＰＥＩ（シグマ
＃４０８７２７）などであってもよい。

【0119】

本発明に好適なリポソームには、本明細書に記載のカチオン性脂質、非カチオン性脂質
、コレステロール脂質、ＰＥＧ化脂質及び／またはポリマーのいずれか１つ以上を様々な
比率で含めてもよい。非限定的な例として、好適なリポソーム製剤には、ｃＫＫ‐Ｅ１２
、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ‐ＰＥＧ２Ｋ；Ｃ１２‐２００、ＤＯＰＥ、コレ
ステロール及びＤＭＧ‐ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ４００３、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤ
ＭＧ‐ＰＥＧ２Ｋ；またはＩＣＥ、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ‐ＰＥＧ２Ｋか
ら選択される組合せを含めてもよい。

【0120】

様々な実施形態において、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ‐Ｅ１２、Ｃ１２‐２００
、ＩＣＥ、及び／またはＨＧＴ４００３）は、リポソームの約３０～６０％（例えば、約
３０～５５％、約３０～５０％、約３０～約４５％、約３０～４０％、約３５～５０％、
約３５～４５％、または約３５～４０％）のモル比を占める。いくつかの実施形態では、
カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ‐Ｅ１２、Ｃ１２‐２００、ＩＣＥ、及び／またはＨＧ
Ｔ４００３）の割合は、リポソームの約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０
％、約５５％、または約６０％以上のモル比を占める。

【0121】

いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（複数可）と、非カチオン性脂質（複数可）
と、コレステロール系脂質（複数可）と、ＰＥＧ化脂質（複数可）との比は、それぞれ約
３０～６０：２５～３５：２０～３０：１～１５であってもよい。いくつかの実施形態で
は、カチオン性脂質（複数可）と、非カチオン性脂質（複数可）と、コレステロール系脂
質（複数可）と、ＰＥＧ化脂質（複数可）との比は、それぞれおよそ４０：３０：２０：
１０であってもよい。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（複数可）と、非カチオ
ン性脂質（複数可）と、コレステロール系脂質（複数可）と、ＰＥＧ化脂質（複数可）と
の比は、それぞれおよそ４０：３０：２５：５であってもよい。いくつかの実施形態では
、カチオン性脂質（複数可）と、非カチオン性脂質（複数可）と、コレステロール系脂質
（複数可）と、ＰＥＧ化脂質（複数可）との比は、それぞれおよそ４０：３２：２５：３
であってもよい。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（複数可）と、非カチオン性
脂質（複数可）と、コレステロール系脂質（複数可）と、ＰＥＧ化脂質（複数可）との比
は、それぞれおよそ５０：２５：２０：５であってもよい。

【0122】

ｍＲＮＡの合成
本発明によるｍＲＮＡは、様々な公知の方法のいずれかに従って合成してもよい。例え
ば、本発明によるｍＲＮＡを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写法（ＩＶＴ）によって合成してもよ
い。簡単に説明すると、ＩＶＴは通常、プロモーターを含む直鎖または環状ＤＮＡ鋳型、
リボヌクレオチド三リン酸のプール、ＤＴＴ及びマグネシウムイオンを含んでもよい緩衝
系、ならびに、適切な、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６ ＲＮＡ
ポリメラーゼ）、ＤＮＡｓｅＩ、ピロホスファターゼ、及び／またはＲＮＡｓｅ阻害剤を
用いて実施する。その正確な条件は、具体的用途に応じて異なる。

【0123】

いくつかの実施形態では、本発明によるｍＲＮＡの調製のために、ＤＮＡ鋳型をｉｎ
ｖｉｔｒｏで転写する。適切なＤＮＡ鋳型は通常、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写用のプロモータ
ー、例えばＴ３、Ｔ７またはＳＰ６プロモーターを備え、その下流に所望のｍＲＮＡの所
望のヌクレオチド配列、及び終止シグナルを有する。

【0124】

本発明による所望のｍＲＮＡ配列（複数可）は、標準的な方法を用いて決定し、ＤＮＡ
鋳型に組み込んでもよい。例えば、所望のアミノ酸配列（例えば、酵素配列）から開始し
、縮重遺伝暗号に基づいて仮想逆翻訳を実施する。次いで、最適化アルゴリズムを用いて
適切なコドンを選択してもよい。一般的には、Ｇ／Ｃ含量を最適化して、一方では可能な
限り高いＧ／Ｃ含量を達成し、他方ではコドン使用頻度に応じてｔＲＮＡの頻度を可能な
限り考慮することができる。最適化ＲＮＡ配列は、例えば、適切なディスプレイ装置を利
用して確立及び表示し、元の（野生型）配列と比較することができる。二次構造を解析し
て、ＲＮＡの安定化特性及び不安定化特性、またはそれぞれに該当する領域を計算するこ
ともできる。

【0125】

修飾ｍＲＮＡ
いくつかの実施形態では、本発明によるｍＲＮＡは、未修飾ｍＲＮＡまたは修飾ｍＲＮ
Ａとして合成してもよい。一般的には、ｍＲＮＡを修飾して安定性を高める。ｍＲＮＡの
修飾は、例えば、ＲＮＡのヌクレオチドの修飾を含み得る。したがって、本発明による修
飾ｍＲＮＡは、例えば、骨格修飾、糖修飾または塩基修飾を含み得る。いくつかの実施形
態では、ｍＲＮＡは、天然のヌクレオチド及び／またはヌクレオチドアナログ（修飾ヌク
レオチド）から合成してもよく、これらの一例として、プリン（アデニン（Ａ）、グアニ
ン（Ｇ））またはピリミジン（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ））、なら
びにプリン及びピリミジンの修飾ヌクレオチドアナログまたは誘導体として、例えば、１
‐メチルアデニン、２‐メチルアデニン、２‐メチルチオ‐Ｎ‐６‐イソペンテニルアデ
ニン、Ｎ６‐メチル‐アデニン、Ｎ６‐イソペンテニル‐アデニン、２‐チオ‐シトシン
、３‐メチル‐シトシン、４‐アセチル‐シトシン、５‐メチル‐シトシン、２，６‐ジ
アミノプリン、１‐メチル‐グアニン、２‐メチル‐グアニン、２，２‐ジメチル‐グア
ニン、７‐メチル‐グアニン、イノシン、１‐メチル‐イノシン、プソイドウラシル（５
‐ウラシル）、ジヒドロ‐ウラシル、２‐チオ‐ウラシル、４‐チオ‐ウラシル、５‐カ
ルボキシメチルアミノメチル‐２‐チオ‐ウラシル、５‐（カルボキシヒドロキシメチル
）‐ウラシル、５‐フルオロ‐ウラシル、５‐ブロモ‐ウラシル、５‐カルボキシメチル
アミノメチル‐ウラシル、５‐メチル‐２‐チオ‐ウラシル、５‐メチル‐ウラシル、Ｎ
‐ウラシル‐５‐オキシ酢酸メチルエステル、５‐メチルアミノメチル‐ウラシル、５‐
メトキシアミノメチル‐２‐チオ‐ウラシル、５’‐メトキシカルボニルメチル‐ウラシ
ル、５‐メトキシ‐ウラシル、ウラシル‐５‐オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル‐５
‐オキシ酢酸（ｖ）、１‐メチル‐プソイドウラシル、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ
）、．β．‐Ｄ‐マンノシルキューオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌ‐ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、ワ
イブトキソシン、及びホスホルアミド酸、チオリン酸エステル、ペプチド・ヌクレオチド
、メチルホスホン酸、７‐デアザグアノシン、５‐メチルシトシン並びにイノシンが挙げ
られるが、必ずしもこれらに限定するものではない。そのようなアナログの調製は、例え
ば、米国特許第４，３７３，０７１号、米国特許第４，４０１，７９６号、米国特許第４
，４１５，７３２号、米国特許第４，４５８，０６６号、米国特許第４，５００，７０７
号、米国特許第４，６６８，７７７号、米国特許第４，９７３，６７９号、米国特許第５
，０４７，５２４号、米国特許第５，１３２，４１８号、米国特許第５，１５３，３１９
号、米国特許第５，２６２，５３０号及び同第５，７００，６４２号の記載から、当業者
には公知であり、これらの開示内容は、参照としてその全体を本明細書に援用する。

【0126】

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ（例えば、ＧＡＡをコードするｍＲＮＡ）には
、ＲＮＡ骨格修飾を含めてもよい。一般的には、骨格修飾は、ＲＮＡに含まれるヌクレオ
チドの骨格のリン酸を化学的に修飾する改変である。一般的な骨格修飾として、以下に限
定するものではないが、メチルホスホン酸基、メチルホスホルアミド酸基、ホスホルアミ
ド酸基、ホスホロチオエート基（例えば、シチジン５’‐Ｏ‐（１‐チオホスフェート）
）、ボラノホスフェート、正に帯電したグアニジニウム基などからなる群からの修飾が挙
げられ、これはホスホジエステル結合を他のアニオン性基、カチオン性基または中性基で
置換することを意味する。

【0127】

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ（例えば、ＧＡＡをコードするｍＲＮＡ）には
、糖修飾を含めてもよい。一般的な糖修飾は、ヌクレオチドの糖の化学修飾であり、以下
に限定するものではないが、２’‐デオキシ‐２’‐フルオロ‐オリゴリボヌクレオチド
（２’‐フルオロ‐２’‐デオキシシチジン５’‐三リン酸、２’‐フルオロ‐２’‐デ
オキシウリジン５’‐三リン酸）、２’‐デオキシ‐２’‐デアミン（ｄｅａｍｉｎｅ）
‐オリゴリボヌクレオチド（２’‐アミノ‐２’‐デオキシシチジン５’‐三リン酸、２
’‐アミノ‐２’‐デオキシウリジン５’‐三リン酸）、２’‐Ｏ‐アルキルオリゴリボ
ヌクレオチド、２’‐デオキシ‐２’‐Ｃ‐アルキルオリゴリボヌクレオチド（２’‐Ｏ
‐メチルシチジン５’‐三リン酸、２’‐メチルウリジン５’‐三リン酸）、２’‐Ｃ‐
アルキルオリゴリボヌクレオチド、及びそれらの異性体（２’‐アラシチジン５’‐三リ
ン酸、２’‐アラウリジン５’‐三リン酸）、または三リン酸アジド（２’‐アジド‐２
’‐デオキシシチジン５’‐三リン酸、２’‐アジド‐２’‐デオキシウリジン５’‐三
リン酸）からなる群から選ばれる糖修飾を含む。

【0128】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＧＡＡをコードするｍＲＮＡ）には、ヌ
クレオチドの塩基の修飾（塩基修飾）を含めてもよい。塩基修飾を含む修飾ヌクレオチド
は、塩基修飾ヌクレオチドとも呼ばれる。そのような塩基修飾ヌクレオチドの例として、
２‐アミノ‐６‐クロロプリンリボシド５’‐三リン酸、２‐アミノアデノシン５’‐三
リン酸、２‐チオシチジン５’‐三リン酸、２‐チオウリジン５’‐三リン酸、４‐チオ
ウリジン５’‐三リン酸、５‐アミノアリルシチジン５’‐三リン酸、５‐アミノアリル
ウリジン５’‐三リン酸、５‐ブロモシチジン５’‐三リン酸、５‐ブロモウリジン５’
‐三リン酸、５‐ヨードシチジン５’‐三リン酸、５‐ヨードウリジン５’‐三リン酸、
５‐メチルシチジン５’‐三リン酸、５‐メチルウリジン５’‐三リン酸、６‐アザシチ
ジン５’‐三リン酸、６‐アザウリジン５’‐三リン酸、６‐クロロプリンリボシド５’
‐三リン酸、７‐デアザアデノシン５’‐三リン酸、７‐デアザグアノシン５’‐三リン
酸、８‐アザアデノシン５’‐三リン酸、８‐アジドアデノシン５’‐三リン酸、ベンゾ
イミダゾールリボシド５’‐三リン酸、Ｎ１‐メチルアデノシン５’‐三リン酸、Ｎ１‐
メチルグアノシン５’‐三リン酸、Ｎ６‐メチルアデノシン５’‐三リン酸、Ｏ６‐メチ
ルグアノシン５’‐三リン酸、プソイドウリジン５’‐三リン酸、ピューロマイシン５’
‐三リン酸またはキサントシン５’‐三リン酸が挙げられるが、必ずしもこれらに限定す
るものではない。

【0129】

一般的に、ｍＲＮＡ合成には、Ｎ末端（５’）への「キャップ」付加、及びＣ末端（３
’）への「テール」付加が含まれる。キャップの存在は、多くの真核細胞に認められるヌ
クレアーゼに対する耐性を与える上で重要である。「テール」の存在は、ｍＲＮＡをエキ
ソヌクレアーゼによる分解から保護するのに役立つ。

【0130】

したがって、いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＧＡＡをコードするｍＲＮ
Ａ）は５’末端キャップ構造を含む。５’末端キャップは一般的に、以下のように付加さ
れる：まず、ＲＮＡ末端ホスファターゼが、５’ヌクレオチドから末端リン酸基のうちの
１つを除去し、２つの末端リン酸基を残し；次いで、グアニリルトランスフェラーゼが、
グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）を末端リン酸基に付加し、５’５’５三リン酸エステル結
合を生成し；そして、グアニンの７位の窒素を、メチルトランスフェラーゼがメチル化す
る。キャップ構造の例として、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’（Ａ，Ｇ（５’）ｐｐｐ（５
’）Ａ及びＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するもの
ではない。

【0131】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＧＡＡをコードするｍＲＮＡ）は、３’
ポリ（Ａ）テール構造を含む。ｍＲＮＡの３’末端にあるポリＡテールは、一般的に、約
１０～３００アデノシンヌクレオチド（配列番号４）（例えば、約１０～２００アデノシ
ンヌクレオチド、約１０～１５０アデノシンヌクレオチド、約１０～１００アデノシンヌ
クレオチド、約２０～７０アデノシンヌクレオチド、または約２０～６０アデノシンヌク
レオチド）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、３’ポリ（Ｃ）テール構造を
含む。ｍＲＮＡの３’末端の好適なポリＣテールは、一般的に、約１０～２００シトシン
ヌクレオチド（配列番号５）（例えば、約１０～１５０シトシンヌクレオチド、約１０～
１００シトシンヌクレオチド、約２０～７０シトシンヌクレオチド、約２０～６０シトシ
ンヌクレオチド、または約１０～４０シトシンヌクレオチド）を含む。ポリＣテールを、
ポリＡテールに付加してもよく、または、ポリＡテールと置き換えてもよい。

【0132】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５’及び／または３’非翻訳領域を含む。いく
つかの実施形態では、５’非翻訳領域は、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を与える１
種以上のエレメント、例えば、鉄応答性エレメントを含む。いくつかの実施形態では、５
’非翻訳領域は、約５０～５００ヌクレオチドの鎖長であってもよい。

【0133】

いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域は、１つ以上のポリアデニル化シグナル、ｍ
ＲＮＡの細胞内位置安定性に影響を与えるタンパク質の結合部位、または１つ以上のｍｉ
ＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域は、５０～５００ヌク
レオチド以上の鎖長であってもよい。

【0134】

キャップ構造
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５’末端キャップ構造を含む。５’末端キャッ
プは、一般的に、以下のように付加される：まず、ＲＮＡ末端ホスファターゼが、５’ヌ
クレオチドから末端リン酸基の１つを除去し、２つの末端リン酸基を残す；次いで、グア
ニリルトランスフェラーゼが、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）を末端リン酸基に付加し、
５’５’５三リン酸エステル結合を生成する；そして、グアニンの７位の窒素を、メチル
トランスフェラーゼがメチル化する。キャップ構造の例として、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（
５’（Ａ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ及びＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが挙げられるが
、必ずしもこれらに限定するものではない。

【0135】

天然のキャップ構造は、一次転写ヌクレオチドの５’末端に三リン酸架橋により結合し
ている７‐メチルグアノシンを含み、これが、ｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ（Ｎは任
意のヌクレオシド）のジヌクレオチドキャップとなる。ｉｎ ｖｉｖｏでは、酵素がキャ
ップ付加を行う。キャップは、細胞核内で付加され、酵素グアニリルトランスフェラーゼ
が、これを触媒する。ＲＮＡの５’末端へのキャップ付加は、転写開始直後に起こる。末
端のヌクレオシドは通常、グアノシンであり、他の全ヌクレオチドに対し逆方向、すなわ
ち、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＧｐＮｐＮｐとなっている。

【0136】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写で生成する一般的なｍＲＮＡのキャップはｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐ
（５’）Ｇであり、これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラー
ゼによる転写において、５’末端にキャップ構造を有するＲＮＡを得るためにジヌクレオ
チドキャップとして用いられてきた。キャップ付加したｍＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで合
成する最も一般的な方法では、予め形成したｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（「ｍ^７Ｇ
ｐｐｐＧ」）型のジヌクレオチドを転写開始因子として使用する。

【0137】

これまで、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳実験で用いる合成ジヌクレオチドキャップの通常型は
、アンチリバースキャップアナログ（「ＡＲＣＡ」）または修飾ＡＲＣＡであり、一般的
に、２’位または３’位のＯＨ基が‐ＯＣＨ_３で置換されている修飾キャップアナログで
ある。

【0138】

さらなるキャップアナログとして、ｍ^７ＧｐｐｐＧ、ｍ^７ＧｐｐｐＡ、ｍ^７ＧｐｐｐＣ
からなる群から選択される化学構造；非メチル化キャップアナログ（例えば、ＧｐｐｐＧ
）；ジメチル化キャップアナログ（例えば、ｍ^２，７ＧｐｐｐＧ）、トリメチル化キャッ
プアナログ（例えば、ｍ^{２，２，７}ＧｐｐｐＧ）、左右対称ジメチル化キャップアナログ
（例えば、ｍ^７Ｇｐｐｐｍ^７Ｇ）、またはアンチリバースキャップアナログ（例えば、Ａ
ＲＣＡ；ｍ^{７，２’Ｏｍｅ}ＧｐｐｐＧ、ｍ^７２’ｄＧｐｐｐＧ、ｍ^{７，３’Ｏｍｅ}Ｇｐｐ
ｐＧ、ｍ^{７，３’ｄ}ＧｐｐｐＧ及びそれらの四リン酸誘導体）（例えば、Ｊｅｍｉｅｌｉ
ｔｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，“Ｎｏｖｅｌ ‘ａｎｔｉ‐ｒｅｖｅｒｓｅ’ ｃａｐ ａｎ
ａｌｏｇｓ ｗｉｔｈ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒ
ｔｉｅｓ”，ＲＮＡ，９：１１０８‐１１２２（２００３）参照）が挙げられるが、必ず
しもこれらに限定するものではない。

【0139】

いくつかの実施形態では、好適なキャップは、一次転写ヌクレオチドの５’末端に三リ
ン酸架橋により結合している７‐メチルグアニル酸（「ｍ^７Ｇ」）であり、これが、ｍ^７
Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ（Ｎは任意のヌクレオシド）となる。本発明の実施形態にお
いて用いるｍ^７Ｇキャップの好ましい実施形態はｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇである
。

【0140】

いくつかの実施形態では、キャップはＣａｐ０構造である。Ｃａｐ０構造には、塩基１
及び２に結合しているリボースの２’‐Ｏ‐メチル残基がない。いくつかの実施形態では
、キャップはＣａｐ１構造である。Ｃａｐ１構造は、塩基２に２’‐Ｏ‐メチル残基を有
する。いくつかの実施形態では、キャップはＣａｐ２構造である。Ｃａｐ２構造は、塩基
２と３の両方に結合した２’‐Ｏ‐メチル残基を有する。

【0141】

多種多様なｍ^７Ｇキャップアナログが当該技術分野で公知であり、その多くが市販され
ている。これらには、上記のｍ^７ＧｐｐｐＧ、ならびに、ＡＲＣＡ３’‐ＯＣＨ_３及び２
’‐ＯＣＨ_３キャップアナログが含まれる（Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｒ
ＮＡ，９：１１０８‐１１２２（２００３））。本発明の実施形態に用いるさらなるキャ
ップアナログとして、Ｎ７‐ベンジル化ジヌクレオシド四リン酸アナログ（Ｇｒｕｄｚｉ
ｅｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ，１０：１４７９‐１４８７（２００４）に記載）、チ
オリン酸エステルキャップアナログ（Ｇｒｕｄｚｉｅｎ‐Ｎｏｇａｌｓｋａ，Ｅ．，ｅｔ
ａｌ．，ＲＮＡ，１３：１７４５‐１７５５（２００７）に記載）、ならびに米国特許
第８，０９３，３６７号及び第８，３０４，５２９号に記載のキャップアナログ（ビオチ
ン化キャップアナログを含む）が挙げられ、これらの文献は参照として本明細書に援用す
る。

【0142】

テール構造
一般的に、「テール」の存在はｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼによる分解から保護する
のに役立つ。ポリＡテールは、天然のメッセンジャー及び合成のセンスＲＮＡを安定化さ
せると考えられている。したがって、ある実施形態では、長いポリＡテールをｍＲＮＡ分
子に付加し、それによりＲＮＡをより安定化することができる。ポリＡテールは、当該技
術分野で認められている多種多様な技術を用いて付加することができる。例えば、合成Ｒ
ＮＡまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写したＲＮＡに、ポリＡポリメラーゼを用いて長いポリＡ
テールを付加することができる（Ｙｏｋｏｅ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ．１９９６；１４：１２５２‐１２５６）。転写ベクターに長いポリＡテ
ールをコードすることもできる。さらに、ポリＡテールは、ＰＣＲ産物から直接転写する
ことによって付加することができる。ＲＮＡリガーゼを用いて、ポリＡをセンスＲＮＡの
３’末端に連結してもよい（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒ
ｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９９１ ｅｄｉｔｉｏｎ）参照）。

【0143】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、３’ポリ（Ａ）テール構造を含む。一般的に、
ポリＡテールの鎖長は、少なくとも約１０、５０、１００、２００、３００、４００、少
なくとも５００ヌクレオチドであり得る（配列番号６）。いくつかの実施形態では、ｍＲ
ＮＡの３’末端にあるポリＡテールは、一般的に、約１０～３００アデノシンヌクレオチ
ド（配列番号４）（例えば、約１０～２００アデノシンヌクレオチド、約１０～１５０ア
デノシンヌクレオチド、約１０～１００アデノシンヌクレオチド、約２０～７０アデノシ
ンヌクレオチド、または約２０～６０アデノシンヌクレオチド）を含む。いくつかの実施
形態では、ｍＲＮＡは、３’ポリ（Ｃ）テール構造を含む。ｍＲＮＡの３’末端にある好
適なポリＣテールは、一般的に、約１０～２００シトシンヌクレオチド（配列番号５）（
例えば、約１０～１５０シトシンヌクレオチド、約１０～１００シトシンヌクレオチド、
約２０～７０シトシンヌクレオチド、約２０～６０シトシンヌクレオチド、または約１０
～４０シトシンヌクレオチド）を含む。ポリＣテールは、ポリＡテールに付加してもよく
、または、ポリＡテールと置き換えてもよい。

【0144】

いくつかの実施形態では、ポリＡテールまたはポリＣテールの長さを調整して、本発明
の修飾センスｍＲＮＡ分子の安定性を制御し、これにより、タンパク質の転写を制御する
。例えば、ポリＡテールの鎖長はセンスｍＲＮＡ分子の半減期に影響を与えるため、ポリ
Ａテールの長さを調整してｍＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を改変し、それによって、標的細
胞におけるポリヌクレオチド発現及び／またはポリペプチド産生の経時変化を制御するこ
とができる。

【0145】

５’及び３’非翻訳領域
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５’及び／または３’の非翻訳領域を含む。い
くつかの実施形態では、５’非翻訳領域は、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を与える
１種以上のエレメント、例えば、鉄応答性エレメントを含む。いくつかの実施形態では、
５’非翻訳領域は、約５０～５００ヌクレオチドの鎖長であってもよい。

【0146】

いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域は、１つ以上のポリアデニル化シグナル、ｍ
ＲＮＡの細胞内位置安定性に影響を与えるタンパク質の結合部位、または１つ以上のｍｉ
ＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域は、５０～５００ヌク
レオチド以上の鎖長であってもよい。

【0147】

例示的な３’及び／または５’ＵＴＲ配列は、安定なｍＲＮＡ分子（例えば、グロビン
、アクチン、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ヒストン、またはクエン酸回路の酵素）に由来
し、センスｍＲＮＡ分子の安定性を高めることができる。例えば、ヌクレアーゼ耐性の向
上及び／またはポリヌクレオチドの半減期の改善のために、５’ＵＴＲ配列にＣＭＶ最初
期１（ＩＥ１）遺伝子の部分配列、またはその断片を含めてもよい。さらに意図するのは
、ポリヌクレオチドのさらなる安定化のために、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードす
る配列、またはその断片を、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の３’末端または非
翻訳領域に含めることである。一般的に、これらの修飾により、ポリヌクレオチドの安定
性及び／または薬物動態特性（例えば、半減期）は、非修飾ポリヌクレオチドに比べて向
上し、これらの修飾はまた、例えば、そのようなポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏヌク
レアーゼによる消化に対する耐性向上のためになされる修飾を含む。

【0148】

リポソームの形成
本発明の組成物に使用するためのリポソーム輸送媒体は、現在、当該技術分野で公知の
様々な技術により調製することができる。提供組成物に使用するためのリポソームは、現
在、当該技術分野で公知の様々な技術により調製することができる。例えば、適切な溶媒
に選択脂質を溶解させてその脂質を好適な容器または器の内壁に付着させ、その後、溶媒
を蒸発乾涸させて容器内側に薄膜を残すか、または噴霧乾燥させるなどの従来技術に従っ
て多重層リポソーム（ＭＬＶ）を調製してもよい。次いで、容器に、ボルテックス撹拌と
ともに水相を加えてもよく、これによってＭＬＶが形成する。その後、多重層リポソーム
を均質化、超音波処理または押出することによって、単層リポソーム（ＵＬＶ）を形成す
ることができる。さらに、界面活性剤除去法によって単層リポソームを形成することがで
きる。

【0149】

ある実施形態では、提供組成物はリポソームを含み、ここで、ｍＲＮＡはそのリポソー
ムの両面で会合するとともに、その同一リポソーム内に封入されている。例えば、本発明
の組成物の調製中に、カチオン性リポソームを静電相互作用によってｍＲＮＡと会合させ
てもよい。例えば、本発明の組成物の調製中に、カチオン性リポソームを静電相互作用に
よってｍＲＮＡと会合させてもよい。

【0150】

いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、ｍＲＮＡをリポソーム内に封入
して含む。いくつかの実施形態では、同一のリポソーム内に１種以上のｍＲＮＡ種を封入
してもよい。いくつかの実施形態では、異なる複数のリポソーム内に１種以上のｍＲＮＡ
種を封入してもよい。いくつかの実施形態では、脂質組成、脂質成分のモル比、サイズ、
電荷（ゼータ電位）、標的リガンド及び／またはこれらの組合せが異なる１個以上のリポ
ソーム内にｍＲＮＡを封入する。いくつかの実施形態では、１個以上のリポソームは、カ
チオン性脂質、中性脂質、ＰＥＧ修飾脂質及び／またはその組合せからなる組成が異なっ
ていてもよい。いくつかの実施形態では、１種以上のリポソームは、リポソーム作製に用
いるカチオン性脂質、中性脂質、コレステロール及びＰＥＧ修飾脂質のモル比が異なって
いてもよい。

【0151】

所望のｍＲＮＡをリポソームに組み込む方法はしばしば「充填」と呼ばれる。方法の一
例は、Ｌａｓｉｃ，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３１２：２５５‐２５８，１
９９２に記載されており、この文献は参照として本明細書に援用する。リポソームに組み
込んだ核酸は、完全または部分的に、リポソームの内部空間に位置するか、リポソーム二
重膜内に位置するか、またはリポソーム膜の外面に会合してもよい。核酸をリポソーム内
に組み込むことを本明細書中では「封入」とも呼び、ここで、核酸はその全体がリポソー
ムの内部空間内に含有されている。リポソームのような輸送媒体にｍＲＮＡを組み込む目
的は、核酸を分解する酵素もしくは化学薬品、及び／または核酸を短時間で排泄させる系
もしくは受容体を含有し得る環境から、しばしば核酸を保護するためである。したがって
、いくつかの実施形態では、好適な送達媒体は、自身が保有するｍＲＮＡの安定性を高め
、及び／または標的細胞または組織へのｍＲＮＡの送達を促進することができる。

【0152】

リポソームのサイズ
本発明の好適なリポソームは、様々なサイズで生成してもよい。いくつかの実施形態で
は、提供リポソームは、これまでに公知のｍＲＮＡ封入リポソームより小さい場合がある
。いくつかの実施形態では、リポソームのサイズ縮小は、ｍＲＮＡ送達の高効率性に関連
している。リポソームの適切なサイズの選択には、標的とする細胞または組織の部位、及
び、ある程度、リポソーム作製の用途を考慮に入れてもよい。

【0153】

いくつかの実施形態では、適切なサイズのリポソームを選択して、ｍＲＮＡがコードす
る抗体の全身分配を促進する。いくつかの実施形態では、特定の細胞または組織へのｍＲ
ＮＡの形質移入を制限することが望ましい場合がある。例えば、肝細胞を標的にするには
、リポソームを、その大きさが肝臓の肝類洞内膜の内皮細胞層の小孔より小さくなるよう
なサイズにすることがあるが、そのような場合には、リポソームは、このような内皮細胞
の小孔を容易に通り抜け、標的とする肝細胞に到達することができると考えられる。

【0154】

別法または追加として、リポソームを、特定の細胞または組織への分配を制限するかま
たは明白に回避するのに十分な直径を有する大きさのリポソームとなるようにサイズ調整
してもよい。例えば、リポソームの大きさを肝類洞内膜の内皮細胞層の小孔より大きくし
て、肝細胞へのリポソーム分配を制限するようなサイズにしてもよい。

【0155】

いくつかの実施形態では、リポソームのサイズはリポソーム粒子の最長直径によって決
定する。いくつかの実施形態では、好適なリポソームは、サイズが約２５０ｎｍ以下（例
えば、約２２５ｎｍ、２００ｎｍ、１７５ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、
７５ｎｍ、または５０ｎｍ以下）である。いくつかの実施形態では、好適なリポソームの
サイズは、約１０～２５０ｎｍの範囲（例えば、約１０～２２５ｎｍ、１０～２００ｎｍ
、１０～１７５ｎｍ、１０～１５０ｎｍ、１０～１２５ｎｍ、１０～１００ｎｍ、１０～
７５ｎｍ、または１０～５０ｎｍの範囲）である。いくつかの実施形態では、好適なリポ
ソームのサイズは、約１００～２５０ｎｍの範囲（例えば、約１００～２２５ｎｍ、１０
０～２００ｎｍ、１００～１７５ｎｍ、１００～１５０ｎｍの範囲）である。いくつかの
実施形態では、好適なリポソームのサイズは、約１０～１００ｎｍの範囲（例えば、約１
０～９０ｎｍ、１０～８０ｎｍ、１０～７０ｎｍ、１０～６０ｎｍ、または１０～５０ｎ
ｍの範囲）である。特定の実施形態では、好適なリポソームは、約１００ｎｍ未満のサイ
ズを有する。

【0156】

リポソーム集団のサイズ制御には当該技術分野で公知の様々な別法が利用可能である。
そのようなサイズの制御方法は、米国特許第４，７３７，３２３号に記載されており、前
記文献を参照として本明細書に援用する。リポソーム懸濁液をバス型またはプローブ型超
音波処理で超音波処理すると、段階的にサイズが縮小し、直径約０．０５μｍ未満の小さ
なＵＬＶを生成する。均一化法は、せん断エネルギーを利用して大きなリポソームを小さ
くするもう一つの方法である。一般的な均一化の手順では、ＭＬＶを標準的なエマルジョ
ン・ホモジナイザーに通し、選択したサイズ、一般的には、約０．１～０．５μｍのリポ
ソームが得られるまで再循環させる。リポソームのサイズは、Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ，Ａ
ｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０：４２１‐１５０（１９８１）に
記載のような準弾性光散乱法（ＱＥＬＳ）によって測定してもよく、前記文献を参照とし
て本明細書に援用する。形成したリポソームを超音波処理することによって平均リポソー
ム径は小さくなり得る。間欠的な超音波処理サイクルとＱＥＬＳ評価とを交互に行い、効
率的にリポソームを合成してもよい。

【0157】

医薬組成物
ｉｎ ｖｉｖｏでのｍＲＮＡの発現を促進するために、リポソームなどの送達媒体を、
１種以上の追加の核酸、担体、標的リガンドもしくは安定化剤と組み合わせて、または適
切な賦形剤とともに混合した医薬組成物中に製剤化することができる。薬物の製剤化及び
投与法についての手法は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，” Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ
．，ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎに記載されている。

【0158】

提供するリポソームに封入または会合させたｍＲＮＡ、及びそれを含有する組成物は、
被験体の臨床状態、投与部位と投与方法、投与計画、被験体の年齢、性別、体重などの当
業臨床医に関連する要因を考慮に入れ、現在の医療に従って投与及び服用させてもよい。
本明細書の目的に対する「有効量」は、試験的臨床研究、薬理学、臨床及び医療分野の当
業者に周知の関連要因を考慮して決定してもよい。いくつかの実施形態では、投与量は、
疾患の進行、退縮または改善の適切な測定値として当業者が選択する症状及び他の指標に
対して、少なくとも何らかの安定化、改善または消失を達成するのに有効である。例えば
、好適な量及び投与レジメンは、少なくとも一過性にタンパク質（例えば、酵素）を産生
させるレジメンである。

【0159】

適切な投与経路として、例えば、経口、経腸、経膣、経粘膜、気管内もしくは吸入を含
む経肺、または経腸による投与；皮内、経皮（局所）、筋肉内、皮下、髄内注射による非
経口送達、ならびに、くも膜下腔内、脳室内直接、静脈内、腹腔内、または経鼻の非経口
送達が挙げられる。特定の実施形態では、筋肉内投与は、骨格筋、平滑筋及び心筋からな
る群から選択される筋肉に対して行われる。いくつかの実施形態では、投与は、筋肉細胞
へのｍＲＮＡの送達をもたらす。いくつかの実施形態では、投与は、肝細胞（すなわち、
肝臓細胞）へのｍＲＮＡの送達をもたらす。特定の実施形態では、筋肉内投与は、筋肉細
胞へのｍＲＮＡの送達をもたらす。

【0160】

別法または追加として、リポソームに封入したｍＲＮＡ及び本発明の組成物を、全身で
はなく局所的に、例えば、標的組織内へ医薬組成物を直接注入して、好ましくは徐放性製
剤として投与してもよい。局所送達は、その標的とする組織に応じて異なる様々な様式で
影響を受ける。例えば、本発明の組成物を含有するエアロゾルは、吸入可能であり（経鼻
、経気管、または気管支送達）；本発明の組成物は、例えば、損傷部位、疾患症状発現部
位、または疼痛部位に注入可能であり；組成物は、経口、気管、または食道への塗布に対
しては薬用ドロップで提供可能であり；組成物は、胃または腸への投与に対しては、液体
、錠剤またはカプセルの形態で供給可能であり、直腸または膣への塗布に対しては坐剤形
態で供給可能であり；または、組成物は、眼への送達さえも可能であり、この場合、クリ
ーム、点眼薬、もしくは注射の使用によっても送達できる。治療用分子またはリガンドと
複合体化させた提供組成物含有製剤は、外科的処置によっても投与可能であり、例えば、
組成物が移植部位から周辺細胞へ拡散することができるようにするポリマーまたは他の構
造体もしくは物質に会合させて投与することができる。あるいは、それらを、ポリマーま
たは支持体を使用せずに外科的処置で塗布することができる。

【0161】

本発明が提供する方法は、本明細書に記載する治療薬（例えば、ＧＡＡタンパク質をコ
ードするｍＲＮＡ）の治療有効量を単回ならびに複数回投与することを想定している。治
療薬は、被験体の病態（例えば、ポンペ病）の性質、重症度及び程度に応じて、一定の間
隔で投与可能である。いくつかの実施形態では、本発明の治療薬（例えば、ＧＡＡタンパ
ク質をコードするｍＲＮＡ）の治療有効量を、くも膜下腔内に一定の間隔で定期的に投与
してもよい（例えば、年１回、６か月に１回、５か月に１回、３か月に１回、隔月（２か
月に１回）、毎月（月１回）、隔週（２週間に１回）、月２回、３０日に１回、２８日に
１回、１４日に１回、１０日に１回、７日に１回、毎週、週２回、連日または継続的に）
。

【0162】

いくつかの実施形態では、提供するリポソーム及び／または組成物を、それが含有する
ｍＲＮＡの徐放性が好適となるように製剤化する。そのような徐放性組成物は、投与間隔
を引き延ばして、被験体への投与の利便性を高め得る。例えば、一実施形態では、本発明
の組成物を１日２回、連日または隔日で被験体に投与する。好ましい実施形態では、本発
明の組成物を、週２回、週１回、７日に１回、１０日に１回、１４日に１回、２８日に１
回、３０日に１回、２週間に１回、３週間に１回、または、さらに好ましくは、４週間に
１回、月１回、月２回、６週間に１回、８週間に１回、２か月に１回、３か月に１回、４
か月に１回、６か月に１回、８か月に１回、９か月に１回、もしくは毎年、被験体に投与
する。長期間にわたってｍＲＮＡを送達または放出させるためにデポー投与（例えば、筋
肉内、皮下、硝子体内）用に製剤化した組成物及びリポソームも意図される。好ましくは
、使用する徐放性手段を、ｍＲＮＡの安定性を高めるために行う修飾と組み合わせる。

【0163】

本明細書中で使用する場合、用語「治療有効量」は、主として、本発明の医薬組成物が
含有する治療薬の総量に基づいて決定する。一般的に、治療有効量は、被験体にとって意
義のある利益（例えば、ポンペ病の治療、調節、治癒、予防及び／または寛解）を達成す
るのに十分である。例えば、治療有効量は、所望の治療的及び／または予防的効果を達成
するのに十分な量であってもよい。一般的に、治療を必要とする被験体へ投与する治療薬
（例えば、ＧＡＡタンパク質をコードするｍＲＮＡ）の量は、その被験体の特徴に応じて
異なる。このような特徴として、被験体の病態、疾患の重症度、全体的健康状態、年齢、
性別及び体重が挙げられる。当業者であれば、これら及び他の関連要因に応じて適切な用
量を容易に決定できるであろう。さらに、客観的評価法及び主観的評価法を任意選択で用
いて至適用量範囲を同定してもよい。

【0164】

治療有効量は、一般的に、複数の単位用量を含み得る投与レジメンにおいて投与する。
任意の特定の治療タンパク質の場合、治療有効量（及び／または効果的投与レジメンの範
囲内の適切な単位用量）は、例えば、投与経路、他の医薬製剤との組合せに応じて様々に
異なる場合がある。また、任意の特定の患者に対する具体的な治療有効量（及び／または
単位用量）は、治療する障害及びその障害の重症度；使用する特定の製剤の活性；使用す
る特定の組成物；患者の年齢、体重、全体的健康状態、性別及び食事；使用する特定のタ
ンパク質の投与時間、投与経路、及び／または排泄速度もしくは代謝速度；治療期間；な
らびに、医療分野において周知の同様の要因を含む、様々な要因に応じたものとなる。

【0165】

いくつかの実施形態では、治療有効量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～５００ｍｇ／
ｋｇ体重の範囲、例えば、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～４００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．
００５ｍｇ／ｋｇ体重～３００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～２００ｍ
ｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ
／ｋｇ体重～９０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～８０ｍｇ／ｋｇ体重、
約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～７０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～６０
ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ
／ｋｇ体重～４０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～３０ｍｇ／ｋｇ体重、
約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～２０
ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～１５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ
／ｋｇ体重～１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。

【0166】

いくつかの実施形態では、治療有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重超、約０．５ｍｇ／
ｋｇ体重超、約１．０ｍｇ／ｋｇ体重超、約３ｍｇ／ｋｇ体重超、約５ｍｇ／ｋｇ体重超
、約１０ｍｇ／ｋｇ体重超、約１５ｍｇ／ｋｇ体重超、約２０ｍｇ／ｋｇ体重超、約３０
ｍｇ／ｋｇ体重超、約４０ｍｇ／ｋｇ体重超、約５０ｍｇ／ｋｇ体重超、約６０ｍｇ／ｋ
ｇ体重超、約７０ｍｇ／ｋｇ体重超、約８０ｍｇ／ｋｇ体重超、約９０ｍｇ／ｋｇ体重超
、約１００ｍｇ／ｋｇ体重超、約１５０ｍｇ／ｋｇ体重超、約２００ｍｇ／ｋｇ体重超、
約２５０ｍｇ／ｋｇ体重超、約３００ｍｇ／ｋｇ体重超、約３５０ｍｇ／ｋｇ体重超、約
４００ｍｇ／ｋｇ体重超、約４５０ｍｇ／ｋｇ体重超、約５００ｍｇ／ｋｇ体重超である
。特定の実施形態では、治療有効量は１．０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では
、治療有効量１．０ｍｇ／ｋｇを、筋肉内または静脈内に投与する。

【0167】

本明細書では、本明細書に開示する１種以上のリポソームを含む凍結乾燥医薬組成物、
及び、そのような組成物の使用に関連する、例えば、２０１１年６月８日出願の米国仮出
願第６１／４９４，８８２号に開示されているような方法も意図しており、前記文献の記
載は、その全体を参照として本明細書に援用する。例えば、本発明の凍結乾燥医薬組成物
は、投与前に再構成してもよく、またはｉｎ ｖｉｖｏで再構成することができる。例え
ば、凍結乾燥医薬組成物を適切な剤形（例えば、ディスク、ロッドまたは膜のような皮内
投与剤形）に製剤化して投与し、個人の体液によってその剤形をｉｎ ｖｉｖｏで経時的
に再水和させることができる。

【0168】

提供するリポソーム及び組成物は、任意の所望の組織に投与してもよい。いくつかの実
施形態では、提供するリポソームまたは組成物で送達したＧＡＡ ｍＲＮＡは、そのリポ
ソーム及び／または組成物を投与した組織において発現する。いくつかの実施形態では、
送達したｍＲＮＡは、リポソーム及び／または組成物を投与した組織とは異なる組織にお
いて発現する。送達対象のｍＲＮＡが送達及び／または発現し得る例示的な組織には、肝
臓、腎臓、心臓、脾臓、血清、脳、骨格筋、リンパ節、皮膚、及び／または脳脊髄液が挙
げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。

【0169】

いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、被験体由来の生物学的試料中のＧ
ＡＡ ｍＲＮＡ発現レベルは、治療前のベースラインの発現レベルに比べて上昇する。通
常、ベースラインレベルは治療の直前に測定する。生物学的試料の例として、全血、血清
、血漿、尿及び組織試料（例えば、筋肉、肝臓、皮膚線維芽細胞）が挙げられる。いくつ
かの実施形態では、提供組成物の投与の結果、ＧＡＡ ｍＲＮＡの発現レベルは、治療直
前のベースラインの発現レベルに比べて、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％
、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％上昇する。いくつかの実施形
態では、提供組成物の投与の結果、ＧＡＡ ｍＲＮＡの発現レベルは、未治療の被験体の
ＧＡＡ ｍＲＮＡ発現レベルに比べて上昇する。

【0170】

本発明によれば、提供組成物の治療有効量を定期的に投与した場合、被験体の肝ＧＡＡ
タンパク質レベルは、治療前のベースラインの肝ＧＡＡタンパク質レベルに比べて上昇す
る。いくつかの実施形態では、提供組成物の治療有効量を定期的に投与した場合、被験体
の筋ＧＡＡタンパク質レベルは、治療前のベースラインの筋ＧＡＡタンパク質レベルに比
べて上昇する。いくつかの実施形態では、筋肉は、骨格筋（例えば、横紋筋、随意筋）、
平滑筋（例えば、内臓筋、不随意筋）または心筋である。いくつかの実施形態では、提供
組成物の治療有効量を定期的に投与した場合、被験体の血清クレアチンキナーゼレベルは
、治療前のベースラインのクレアチンキナーゼレベルに比べて低下する。いくつかの実施
形態では、提供組成物の治療有効量を定期的に投与した場合、被験体の尿中グルコース四
糖（Ｇｌｃα１‐６Ｇｌｃα１‐４Ｇｌｃα１‐４ＧｌｃまたはＧｌｃ_４）レベルは、治
療前のベースラインのＧｌｃ_４レベルに比べて低下する。いくつかの実施形態では、提供
組成物の治療有効量を定期的に投与した場合、被験体の血清アスパラギン酸トランスアミ
ナーゼ（例えば、ＡＳＴ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、血清、グルタミン
酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ）レベルは、治療前のベースラインのＡＳＴレベルに
比べて低下する。いくつかの実施形態では、提供組成物の治療有効量を定期的に投与した
場合、被験体の血清アラニントランスアミナーゼ（例えば、ＡＬＴ、アラニンアミノトラ
ンスフェラーゼ、血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ）レベルは、治療前の
ベースラインのＡＬＴレベルに比べて低下する。いくつかの実施形態では、提供組成物の
治療有効量を定期的に投与した場合、被験体の血清乳酸デヒドロゲナーゼ（例えば、ＬＤ
Ｈ、乳酸デヒドロゲナーゼ）レベルは、治療前のベースラインのＬＤＨレベルに比べて低
下する。いくつかの実施形態では、提供組成物の治療有効量を定期的に投与した場合、被
験体由来の生物学的試料中のＧＡＡ酵素活性レベルは、治療前のベースラインのＧＡＡ酵
素活性レベルに比べて上昇する。

【0171】

いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、被験体の肝ＧＡＡタンパク質レベ
ルが、治療前のベースラインレベルに比べて上昇する。通常、ベースラインレベルは治療
の直前に測定する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、肝ＧＡＡタンパ
ク質レベルは、治療前のベースラインレベルに比べて、少なくとも約１０％、２０％、３
０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％上昇する。いく
つかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、肝ＧＡＡタンパク質レベルが、未治療の
被験体の肝ＧＡＡタンパク質レベルに比べて上昇する。

【0172】

いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、被験体の骨格筋ＧＡＡタンパク質
レベルが、治療前のベースラインレベルに比べて上昇する。通常、ベースラインレベルは
治療の直前に測定する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、骨格筋ＧＡ
Ａタンパク質レベルが、治療前のベースラインレベルに比べて、少なくとも約１０％、２
０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％上昇す
る。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、骨格筋ＧＡＡタンパク質レベル
が、未治療の被験体の骨格筋ＧＡＡタンパク質レベルに比べて上昇する。

【0173】

いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、被験体の心筋ＧＡＡタンパク質レ
ベルが、治療前のベースラインレベルに比べて上昇する。通常、ベースラインレベルは治
療の直前に測定する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、心筋ＧＡＡタ
ンパク質レベルが、治療前のベースラインレベルに比べて、少なくとも約１０％、２０％
、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％上昇する。
いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、心筋ＧＡＡタンパク質レベルが、未
治療の被験体の心筋ＧＡＡタンパク質レベルに比べて上昇する。

【0174】

いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、被験体の平滑筋ＧＡＡタンパク質
のレベルが、治療前のベースラインレベルに比べて上昇する。通常、ベースラインレベル
は治療の直前に測定する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、平滑筋Ｇ
ＡＡタンパク質レベルが、治療前のベースラインレベルに比べて、少なくとも約１０％、
２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％上昇
する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、平滑筋ＧＡＡタンパク質レベ
ルが、未治療の被験体の平滑筋ＧＡＡタンパク質レベルに比べて上昇する。

【0175】

いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、被験体の筋肉細胞内ＧＡＡタンパ
ク質レベルが、治療前のベースラインレベルに比べて上昇する。通常、ベースラインレベ
ルは治療の直前に測定する。いくつかの実施形態では、筋肉細胞は、筋細胞、筋管、筋芽
細胞、心筋細胞または心筋芽細胞である。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の
結果、筋肉細胞内ＧＡＡタンパク質レベルが、治療前のベースラインレベルに比べて、少
なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％
、または９５％上昇する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、筋肉細胞
内ＧＡＡタンパク質レベルが、未治療の被験体の筋肉細胞内ＧＡＡタンパク質レベルに比
べて上昇する。

【0176】

いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、被験体の肝臓細胞（例えば、肝細
胞）内ＧＡＡタンパク質レベルが、治療前のベースラインレベルに比べて上昇する。通常
、ベースラインレベルは治療の直前に測定する。いくつかの実施形態では、提供組成物の
投与の結果、肝細胞内ＧＡＡタンパク質レベルが、治療前のベースラインレベルに比べて
、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９
０％、または９５％上昇する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、肝臓
細胞内ＧＡＡタンパク質レベルが、未治療の被験体の肝臓細胞内ＧＡＡタンパク質レベル
に比べて上昇する。

【0177】

いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、被験体の血漿または血清中のＧＡ
Ａタンパク質レベルが、治療前のベースラインレベルに比べて上昇する。通常、ベースラ
インレベルは治療の直前に測定する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果
、血漿または血清中のＧＡＡタンパク質レベルが、治療前のベースラインレベルに比べて
、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９
０％、または９５％上昇する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、血漿
または血清中のＧＡＡタンパク質レベルが、未治療の被験体の血漿または血清中のＧＡＡ
タンパク質レベルに比べて上昇する。

【0178】

いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、被験体の血清クレアチンキナーゼ
レベルが、治療前のベースラインレベルに比べて低下する。通常、ベースラインレベルは
治療の直前に測定する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、血清クレア
チンキナーゼレベルが、治療直前のベースラインの血清クレアチンキナーゼレベルに比べ
て、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、
９０％、または９５％低下する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、血
清クレアチンキナーゼレベルが、約２０００ＩＵ／Ｌ、１５００ＩＵ／Ｌ、１０００ＩＵ
／Ｌ、７５０ＩＵ／Ｌ、５００ＩＵ／Ｌ、２５０ＩＵ／Ｌ、１００ＩＵ／Ｌ、９０ＩＵ／
Ｌ、８０ＩＵ／Ｌ、７０ＩＵ／Ｌ、または６０ＩＵ／Ｌ未満にまで低下する。いくつかの
実施形態では、提供組成物の投与の結果、血清クレアチンキナーゼレベルが、未治療の被
験体の血清クレアチンキナーゼレベルに比べて低下する。

【0179】

いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、被験体の尿中Ｇｌｃ_４レベルが、
治療前のベースラインレベルに比べて低下する。通常、ベースラインレベルは治療の直前
に測定する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、尿中Ｇｌｃ_４レベルが
、治療直前のベースラインレベルに比べて、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０
％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％低下する。いくつかの実施
形態では、提供組成物の投与の結果、尿中Ｇｌｃ_４レベルが、約１００ｍｍｏｌ Ｇｌｃ
_４／ｍｏｌクレアチニン、９０ｍｍｏｌ Ｇｌｃ_４／ｍｏｌクレアチニン、８０ｍｍｏｌ
Ｇｌｃ_４／ｍｏｌクレアチニン、７０ｍｍｏｌ Ｇｌｃ_４／ｍｏｌクレアチニン、６０
ｍｍｏｌ Ｇｌｃ_４／ｍｏｌクレアチニン、５０ｍｍｏｌ Ｇｌｃ_４／ｍｏｌクレアチニ
ン、４０ｍｍｏｌ Ｇｌｃ_４／ｍｏｌクレアチニン、３０ｍｍｏｌ Ｇｌｃ_４／ｍｏｌク
レアチニンまたは２０ｍｍｏｌ Ｇｌｃ_４／ｍｏｌクレアチニン未満にまで低下する。い
くつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、尿中Ｇｌｃ_４レベルが、未治療の被験
体の尿中Ｇｌｃ_４レベルに比べて低下する。

【0180】

いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、被験体の筋グリコーゲンレベルが
、治療前のベースラインレベルに比べて低下する。通常、治療の直前にベースラインレベ
ルを測定する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、筋グリコーゲンレベ
ルが、治療直前のベースラインレベルに比べて、少なくとも約１０％、２０％、３０％、
４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％低下する。いくつかの
実施形態では、提供組成物の投与の結果、筋グリコーゲンレベルが、未治療の被験体の筋
グリコーゲンレベルに比べて低下する。特定の実施形態では、筋肉は、骨格筋、平滑筋ま
たは心筋である。

【0181】

いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、被験体の肝グリコーゲンレベルが
、治療前のベースラインレベルに比べて低下する。通常、ベースラインレベルは治療の直
前に測定する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、肝グリコーゲンレベ
ルが、治療直前のベースラインレベルに比べて、少なくとも約１０％、２０％、３０％、
４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％低下する。いくつかの
実施形態では、提供組成物の投与の結果、肝グリコーゲンレベルが、未治療の被験体の肝
グリコーゲンレベルに比べて低下する。

【0182】

いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、被験体の血清アスパラギン酸トラ
ンスアミナーゼ（ＡＳＴ）レベルが、治療前のベースラインレベルに比べて低下する。通
常、ベースラインレベルは治療の直前に測定する。いくつかの実施形態では、提供組成物
の投与の結果、血清ＡＳＴレベルが、治療直前のベースラインレベルに比べて、少なくと
も約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、また
は９５％低下する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、血清ＡＳＴレベ
ルが、約６００ＩＵ／Ｌ、５００ＩＵ／Ｌ、４００ＩＵ／Ｌ、３００ＩＵ／Ｌ、２００Ｉ
Ｕ／Ｌ、１００ＩＵ／Ｌ、５０ＩＵ／Ｌ、２５ＩＵ／Ｌ、２０ＩＵ／Ｌまたは１０ＩＵ／
Ｌ未満にまで低下する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、血清ＡＳＴ
レベルが、未治療の被験体の血清ＡＳＴレベルに比べて低下する。

【0183】

いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、被験体の血清アラニントランスア
ミナーゼ（ＡＬＴ）レベルが、治療前のベースラインレベルに比べて低下する。通常、ベ
ースラインレベルは治療の直前に測定する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与
の結果、血清ＡＬＴレベルが、治療直前のベースラインレベルに比べて、少なくとも約１
０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５
％低下する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、血清ＡＬＴレベルが、
約１０００ＩＵ／Ｌ、９００ＩＵ／Ｌ、８００ＩＵ／Ｌ、７００ＩＵ／Ｌ、６００ＩＵ／
Ｌ、５００ＩＵ／Ｌ、４００ＩＵ／Ｌ、３００ＩＵ／Ｌ、２００ＩＵ／Ｌ、１００ＩＵ／
Ｌ、５０ＩＵ／Ｌ、２５ＩＵ／Ｌ、２０ＩＵ／Ｌまたは１０ＩＵ／Ｌ未満にまで低下する
。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、血清ＡＬＴレベルが、未治療の被
験体の血清ＡＬＴレベルに比べて低下する。

【0184】

いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、被験体の血清乳酸デヒドロゲナー
ゼ（ＬＤＨ）レベルが、治療前のベースラインレベルに比べて低下する。通常、ベースラ
インレベルは治療の直前に測定する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果
、血清乳酸デヒドロゲナーゼＬＤＨレベルが、治療直前のベースラインレベルに比べて、
少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０
％、または９５％低下する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、血清Ｌ
ＤＨレベルが、約２０００ＩＵ／Ｌ、１５００ＩＵ／Ｌ、１０００ＩＵ／Ｌ、９００ＩＵ
／Ｌ、８００ＩＵ／Ｌ、７００ＩＵ／Ｌ、６００ＩＵ／Ｌ、５００ＩＵ／Ｌ、４００ＩＵ
／Ｌ、３００ＩＵ／Ｌ、２００ＩＵ／Ｌまたは１００ＩＵ／Ｌ未満にまで低下する。いく
つかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、血清ＬＤＨレベルが、未治療の被験体の
血清ＬＤＨレベルに比べて低下する。

【0185】

いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果、被験体由来の生物学的試料中のＧ
ＡＡ酵素活性が、治療前のベースラインレベルに比べて上昇する。通常、ベースラインレ
ベルは治療の直前に測定する。生物学的試料の例として、例えば、全血、血清、血漿、尿
及び組織試料（例えば、筋肉、肝臓、皮膚線維芽細胞）が挙げられる。いくつかの実施形
態では、提供組成物の投与の結果、ＧＡＡ酵素活性が、治療直前のベースラインレベルに
比べて、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０
％、９０％、または９５％上昇する。いくつかの実施形態では、提供組成物の投与の結果
、ＧＡＡ酵素活性が、未治療の被験体のＧＡＡ酵素活性に比べて上昇する。

【0186】

様々な実施形態によれば、送達するｍＲＮＡの発現のタイミングは、特定の医学的必要
性に適合するように調整することができる。いくつかの実施形態において、提供するｍＲ
ＮＡがコードするタンパク質の発現は、提供するリポソーム及び／または組成物の投与の
１、２、３、６、１２、２４、４８、７２及び／または９６時間後に検出可能である。い
くつかの実施形態では、送達するｍＲＮＡがコードするタンパク質の発現は、投与の１週
間後、２週間後、及び／または１か月後に検出可能である。

【実施例0187】

本発明の特定の化合物、組成物及び方法を、特定の実施形態に従って具体的に記載して
きたが、以下の実施例は、本発明の化合物を例示するためにのみ機能し、それらを限定す
ることを意図するものではない。

【0188】

実施例１．ＧＡＡ ｍＲＮＡの送達及び発現のための例示的なリポソーム製剤
本実施例は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＧＡＡ ｍＲＮＡの効果的な送達及び発現のための例
示的なリポソーム製剤を提示する。
脂質材料
本明細書に記載の製剤は、ＧＡＡタンパク質をコードするｍＲＮＡをカプセル化するよ
うに設計され、１つ以上のカチオン性脂質、ヘルパー脂質（例えば、非カチオン性脂質及
び／またはコレステロール系脂質）及びＰＥＧ化脂質を様々な割合で用いる多成分脂質混
合物を含有する。カチオン性脂質として、ＤＯＴＡＰ（１，２‐ジオレイル‐３‐トリメ
チルアンモニウムプロパン）、ＤＯＤＡＰ（１，２‐ジオレイル‐３‐ジメチルアンモニ
ウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２‐ジ‐Ｏ‐オクタデセニル‐３‐トリメチルアンモ
ニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．；Ｐａｌｍｅｒ，Ｌ．；Ｂｒｅｍ
ｎｅｒ，Ｋ．；ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｉ．“Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ ｓａｔｕ
ｒａｔｉｏｎ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ
ｏｆ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ”Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒ
ｅｌ．２００５，１０７，２７６‐２８７）、ＤＬｉｎ‐ＫＣ２‐ＤＭＡ（Ｓｅｍｐｌｅ
，Ｓ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．“Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｃａｔｉｏｎｉｃ
Ｌｉｐｉｄｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ
．２０１０，２８，１７２‐１７６）、Ｃ１２‐２００（Ｌｏｖｅ，Ｋ．Ｔ．ｅｔ ａｌ
．“Ｌｉｐｉｄ‐ｌｉｋｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｌｏｗ‐ｄｏｓｅ ｉｎ ｖ
ｉｖｏ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ”ＰＮＡＳ ２０１０，１０７，１８６４‐１８
６９）、ｃＫＫ‐Ｅ１２（３，６‐ビス（４‐（ビス（２‐ヒドロキシドデシル）アミノ
）ブチル）ピペラジン‐２，５‐ジオン）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＨＧＴ４
００３、ＩＣＥ、ジアルキルアミノ系、イミダゾール系、グアニジニウム系などを挙げる
ことができる（しかし、これらだけに限るものではない）。ヘルパー脂質として、ＤＳＰ
Ｃ（１，２‐ジステアロイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２
‐ジパルミトイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２‐ジオレイ
ル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２‐ジオレイル‐
ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスフォチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ
）） ＤＰＰＥ（１，２‐ジパルミトイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスホエタノールアミ
ン）、ＤＭＰＥ（１，２‐ジミリストイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスホエタノールアミ
ン）、ＤＯＰＧ（，２‐ジオレオイル‐ｓｎ‐グリセロ‐３‐ホスホ‐（１’‐ｒａｃ‐
グリセロール））、コレステロールなどを挙げることができる（しかし、これらだけに限
るものではない）。ペグ化脂質として、鎖長Ｃ_６～Ｃ_２０のアルキル鎖（複数可）を有す
る脂質に共有結合した最大鎖長５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖を挙げることが
できる（しかし、これらだけに限るものではない）。

【0189】

遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡ鋳型からｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によってコドン最
適化ヒト酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）メッセンジャーＲＮＡを合成し、続いて５’キ
ャップ構造（Ｃａｐ１）（Ｆｅｃｈｔｅｒ，Ｐ．；Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，Ｇ．Ｇ．“Ｒｅｃ
ｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ ｃａｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｂｙ ｖｉｒａｌ
ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０
０５，８６，１２３９‐１２４９）、及びゲル電気泳動で測定した鎖長がおよそ２５０ヌ
クレオチドの３’ポリ（Ａ）テール（配列番号７）を付加した。各ｍＲＮＡ産物中に存在
する５’及び３’非翻訳領域を、それぞれＸ及びＹとして表すとともに、記載のように定
義する（下記参照）。
例示的なコドン最適化ヒト酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）ｍＲＮＡ
構築物の設計：
Ｘ‐配列番号３‐Ｙ
５’及び３’ＵＴＲ配列
Ｘ（５’ＵＴＲ配列）＝
ＧＧＡＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＧＣＵＧＵＵＵＵＧＡＣ
ＣＵＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＵＣＣＡＧＣＣＵＣＣＧＣＧＧＣＣ
ＧＧＧＡＡＣＧＧＵＧＣＡＵＵＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＵＵＣＣＣＣＧＵＧＣＣＡＡＧＡＧ
ＵＧＡＣＵＣＡＣＣＧＵＣＣＵＵＧＡＣＡＣＧ ［配列番号８］
Ｙ（３’ＵＴＲ配列）＝
ＣＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵ
ＧＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣ
ＣＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣＡＡＧＣＵ ［配列番号９］
または
ＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧ
ＧＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣ
ＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣＡＡＡＧＣＵ ［配列番号１０］

【0190】

例示的なコドン最適化ヒトＧＡＡ ｍＲＮＡ配列は、詳細な説明の節に記載した配列番
号３を有する。

【0191】

例示的な完全長コドン最適化ヒト酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）メッセンジャーＲＮ
Ａ配列を以下に示す：
ＧＧＡＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＧＣＵＧＵＵＵＵＧＡＣ
ＣＵＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＵＣＣＡＧＣＣＵＣＣＧＣＧＧＣＣ
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ＣＧＡＣＣＣＵＵＣＧＵＵＡＵＵＵＣＵＣＧＧＵＣＣＡＣＡＵＵＵＧＣＣＧＧＧＣＡＣＧ
ＧＵＣＧＧＵＡＵＧＣＣＧＧＡＣＡＣＵＧＧＡＣＧＧＧＡＧＡＵＧＵＣＵＧＧＵＣＵＡＧ
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ＡＣＵＧＣＡＧＡＡＧＧＵＣＡＣＧＧＵＣＣＵＣＧＧＡＧＵＧＧＣＧＡＣＡＧＣＡＣＣＣ
ＣＡＡＣＡＧＧＵＣＣＵＵＡＧＵＡＡＣＧＧＡＧＵＡＣＣＵＧＵＣＵＣＧＡＡＣＵＵＵＡ
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ＵＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣＡＡＧＣＵ ［配列番号１１］

【0192】

別の実施例における、完全長コドン最適化ヒト酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）メッセ
ンジャーＲＮＡ配列を以下に示す：
ＧＧＡＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＧＣＵＧＵＵＵＵＧＡＣ
ＣＵＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＵＣＣＡＧＣＣＵＣＣＧＣＧＧＣＣ
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ＧＡＣＵＵＵＣＵＣＵＵＧＧＵＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＵＵＧＵＣＧＧＧＣＵＣＧＵＣＧＣ
ＣＧＧＵＡＣＵＧＧＡＡＧＡＡＡＣＣＣＡＣＣＣＣＧＣＡＣＡＵＣＡＧＣＡＧＧＧＣＧＣ
ＧＵＣＧＣＧＧＣＣＵＧＧＵＣＣＧＡＧＧＧＡＵＧＣＣＣＡＧＧＣＡＣＡＵＣＣＣＧＧＡ
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ＡＡＧＣＡＧＧＧＡＣＵＵＣＡＧＧＧＡＧＣＣＣＡＧＡＵＧＧＧＧＣＡＧＣＣＣＵＧＧＵ
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ＵＧＡＣＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＵＵＧＡＧＧＵＧＣＵＧＧＡＡＣＧＧＧＧＡＧＣＧＵＡＣ
ＡＣＡＣＡＡＧＵＣＡＵＵＵＵＣＵＵＧＧＣＣＡＧＧＡＡＣＡＡＣＡＣＵＡＵＵＧＵＣＡ
ＡＣＧＡＧＵＵＧＧＵＧＣＧＣＧＵＧＡＣＣＵＣＵＧＡＧＧＧＵＧＣＣＧＧＡＣＵＧＣＡ
ＡＣＵＧＣＡＧＡＡＧＧＵＣＡＣＧＧＵＣＣＵＣＧＧＡＧＵＧＧＣＧＡＣＡＧＣＡＣＣＣ
ＣＡＡＣＡＧＧＵＣＣＵＵＡＧＵＡＡＣＧＧＡＧＵＡＣＣＵＧＵＣＵＣＧＡＡＣＵＵＵＡ
ＣＡＵＡＣＵＣＣＣＣＧＧＡＣＡＣＧＡＡＧＧＵＧＣＵＣＧＡＣＡＵＣＵＧＵＧＵＧＵＣ
ＧＣＵＧＣＵＵＡＵＧＧＧＧＧＡＡＣＡＧＵＵＵＣＵＣＧＵＧＡＧＣＵＧＧＵＧＣＵＡＧ
ＧＧＧＵＧＧＣＡＵＣＣＣＵＧＵＧＡＣＣＣＣＵＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＵＣＵＣＣＵＧＧ
ＣＣＣＵＧＧＡＡＧＵＵＧＣＣＡＣＵＣＣＡＧＵＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＵＵＧＵＣＣＵ
ＡＡＵＡＡＡＡＵＵＡＡＧＵＵＧＣＡＵＣＡＡＡＧＣＵ ［配列番号１２］

【0193】

例示的な製剤プロトコール
Ａ． ｃＫＫ‐Ｅ１２
ｃＫＫ‐Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ‐ＰＥＧ２Ｋの５０ｍｇ／ｍＬ
エタノール溶液のアリコートを混合し、最終体積３ｍＬまでエタノールで希釈した。これ
とは別に、ＧＡＡ ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭクエン酸／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、
ｐＨ４．５）を１ｍｇ／ｍＬのストックから調製した。脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液に急速
に注入し、振盪して２０％エタノール中の最終懸濁液を得た。得られたナノ粒子懸濁液を
濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でダイアフィルトレーションし、濃縮し、２～８℃で
保存した。最終濃度＝０．６４ｍｇ／ｍＬ ＧＡＡ ｍＲＮＡ（カプセル化）であった。
Ｚ_ａｖｅ＝８０ｎｍ；ＰＤＩ＝０．１７であった。封入率＝８５％；収率＝８９％であっ
た。

【0194】

Ｂ． Ｃ１２‐２００
Ｃ１２‐２００、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ‐ＰＥＧ２Ｋの５０ｍｇ／ｍＬ
エタノール溶液のアリコートを混合し、最終体積３ｍＬまでエタノールで希釈する。これ
とは別に、ＧＡＡ ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭクエン酸／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、
ｐＨ４．５）を１ｍｇ／ｍＬのストックから調製する。脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液に急速
に注入し、振盪して２０％エタノール中の最終懸濁液を得る。得られるナノ粒子懸濁液を
濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でダイアフィルトレーションし、濃縮し、２～８℃で
保存する。ＧＡＡカプセル化ｍＲＮＡの最終濃度、Ｚ_ａｖｅ、Ｄｖ_（５０）及びＤｖ_{（９
０）}を測定する。

【0195】

Ｃ． ＨＧＴ４００３
ＨＧＴ４００３、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ‐ＰＥＧ２Ｋの５０ｍｇ／ｍＬ
エタノール溶液のアリコートを混合し、最終体積３ｍＬまでエタノールで希釈する。これ
とは別に、ＧＡＡ ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭクエン酸／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、
ｐＨ４．５）を１ｍｇ／ｍＬのストックから調製する。脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液に急速
に注入し、振盪して２０％エタノール中の最終懸濁液を得る。得られるナノ粒子懸濁液を
濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でダイアフィルトレーションし、濃縮し、２～８℃で
保存する。ＧＡＡカプセル化ｍＲＮＡの最終濃度、Ｚ_ａｖｅ、Ｄｖ_（５０）及びＤｖ_{（９
０）}を測定する。

【0196】

Ｄ．ＩＣＥ
ＩＣＥ、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ‐ＰＥＧ２Ｋの５０ｍｇ／ｍＬエタノー
ル溶液のアリコートを混合し、最終体積３ｍＬまでエタノールで希釈する。これとは別に
、ＧＡＡ ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭクエン酸／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ４．
５）を１ｍｇ／ｍＬのストックから調製する。脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液に急速に注入し
、振盪して２０％エタノール中の最終懸濁液を得る。得られるナノ粒子懸濁液を濾過し、
１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でダイアフィルトレーションし、濃縮し、２～８℃で保存する
。ＧＡＡカプセル化ｍＲＮＡの最終濃度、Ｚ_ａｖｅ、Ｄｖ_（５０）及びＤｖ_（９０）を測
定する。

【0197】

Ｅ． ＨＧＴ５００１
ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ‐ＰＥＧ２Ｋの５０ｍｇ／ｍＬ
エタノール溶液のアリコートを混合し、最終体積３ｍＬまでエタノールで希釈する。これ
とは別に、ＧＡＡ ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭクエン酸／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、
ｐＨ４．５）を１ｍｇ／ｍＬのストックから調製する。脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液に急速
に注入し、振盪して２０％エタノール中の最終懸濁液を得る。得られるナノ粒子懸濁液を
濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でダイアフィルトレーションし、濃縮し、２～８℃で
保存する。ＧＡＡカプセル化ｍＲＮＡの最終濃度、Ｚ_ａｖｅ、Ｄｖ_（５０）及びＤｖ_{（９
０）}を測定する。

【0198】

Ｆ． ＨＧＴ５０００
ＨＧＴ５０００、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ‐ＰＥＧ２Ｋの５０ｍｇ／ｍＬ
エタノール溶液のアリコートを混合し、最終体積３ｍＬまでエタノールで希釈する。これ
とは別に、ＧＡＡ ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭクエン酸／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、
ｐＨ４．５）を１ｍｇ／ｍＬのストックから調製する。脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液に急速
に注入し、振盪して２０％エタノール中の最終懸濁液を得る。得られるナノ粒子懸濁液を
濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でダイアフィルトレーションし、濃縮し、２～８℃で
保存する。ＧＡＡカプセル化ｍＲＮＡの最終濃度、Ｚ_ａｖｅ、Ｄｖ_（５０）及びＤｖ_{（９
０）}を測定する。

【0199】

Ｇ． ＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡ
ＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡ、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ‐ＰＥＧ２Ｋの５０ｍｇ
／ｍＬエタノール溶液のアリコートを混合し、最終体積３ｍＬまでエタノールで希釈する
。これとは別に、ＧＡＡ ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭクエン酸／１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、ｐＨ４．５）を１ｍｇ／ｍＬのストックから調製する。脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液
に急速に注入し、振盪して２０％エタノール中の最終懸濁液を得る。得られるナノ粒子懸
濁液を濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でダイアフィルトレーションし、濃縮し、２～
８℃で保存する。ＧＡＡカプセル化ｍＲＮＡの最終濃度、Ｚ_ａｖｅ、Ｄｖ_（５０）及びＤ
ｖ_（９０）を測定する。

【0200】

Ｈ． ＤＯＤＡＰ
ＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ‐ＰＥＧ２Ｋの５０ｍｇ／ｍＬエタ
ノール溶液のアリコートを混合し、最終体積３ｍＬまでエタノールで希釈する。これとは
別に、ＧＡＡ ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭクエン酸／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ
４．５）を１ｍｇ／ｍＬのストックから調製する。脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液に急速に注
入し、振盪して２０％エタノール中の最終懸濁液を得る。得られるナノ粒子懸濁液を濾過
し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でダイアフィルトレーションし、濃縮し、２～８℃で保存
する。ＧＡＡカプセル化ｍＲＮＡの最終濃度、Ｚ_ａｖｅ、Ｄｖ_（５０）及びＤｖ_（９０）
を測定する。

【0201】

Ｉ． ＤＯＤＭＡ
ＤＯＤＭＡ、ＤＯＰＥ、コレステロール及びＤＭＧ‐ＰＥＧ２Ｋの５０ｍｇ／ｍＬエタ
ノール溶液のアリコートを混合し、最終体積３ｍＬまでエタノールで希釈する。これとは
別に、ＧＡＡ ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭクエン酸／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ
４．５）を１ｍｇ／ｍＬのストックから調製する。脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液に急速に注
入し、振盪して２０％エタノール中の最終懸濁液を得る。得られるナノ粒子懸濁液を濾過
し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でダイアフィルトレーションし、濃縮し、２～８℃で保存
する。ＧＡＡカプセル化ｍＲＮＡの最終濃度、Ｚ_ａｖｅ、Ｄｖ_（５０）及びＤｖ_（９０）
を測定する。

【0202】

実施例２． ＧＡＡ ｍＲＮＡを充填したリポソームナノ粒子の静脈内投与
本実施例は、ＧＡＡ ｍＲＮＡを充填したリポソームナノ粒子を投与する例示的な方法
、及びｉｎ ｖｉｖｏで様々な標的組織中のＧＡＡ ｍＲＮＡ及びグリコーゲンを分析す
る方法を説明する。

【0203】

全ての研究は、ＧＡＡノックアウトマウスを用いて行った。マウスを、１．０ｍｇ／ｋ
ｇ用量の単回ボーラス尾静脈注射により、ヒトＧＡＡ ｍＲＮＡを充填したｃＫＫ‐Ｅ１
２に基づく脂質ナノ粒子で処置した。マウスを殺処分し、３０分、３時間、６時間、１２
時間、２４時間、４８時間、７２時間及び７日目に生理食塩水で灌流した。

【0204】

各マウスの肝臓及び筋肉などの組織を採取し、別々の部分に配分し、１０％中性緩衝ホ
ルマリンまたは急速凍結保存し、分析のために－８０℃で保存した。

【0205】

処理したマウスの筋肉内での活性医薬成分（ＧＡＡ ｍＲＮＡ）の直接検出を、ｉｎ
ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）に基づく方法を用いて達成した。図１Ａ及び
１Ｂに示すように、６時間及び１２時間目に、外来性ヒトＧＡＡメッセンジャーＲＮＡを
検出した。

【0206】

ＧＡＡ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の投与後、肝グリコーゲンレベル（図２Ａ）は、未処理
ＧＡＡノックアウトマウスの肝グリコーゲンレベル（図２Ｂ）に比べて低下した。

【0207】

実施例３．ＧＡＡ ｍＲＮＡを充填したリポソームナノ粒子の筋肉内投与
本実施例は、ＧＡＡ ｍＲＮＡを充填したリポソームナノ粒子を投与する例示的な方法
、及びｉｎ ｖｉｖｏでの様々な標的組織におけるＧＡＡ ｍＲＮＡ及びグリコーゲンの
分析方法を例示する。

【0208】

全ての研究は、ＧＡＡノックアウトマウスを用いて行った。マウスを、１．０ｍｇ／ｋ
ｇ用量の単回筋肉内注射によって、ヒトＧＡＡ ｍＲＮＡを充填したｃＫＫ‐Ｅ１２に基
づく脂質ナノ粒子で処置した。マウスを殺処分し、２４時間目に生理食塩水で灌流した。

【0209】

各マウスの肝臓及び筋肉などの組織を採取し、別々の部分に配分し、１０％中性緩衝ホ
ルマリンまたは急速凍結保存して、分析のために－８０℃で保存した。

【0210】

処理したマウスの筋肉内での活性医薬成分（ＧＡＡ ｍＲＮＡ）の直接検出を、ｉｎ
ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）に基づく方法を用いて達成した。図３に示す
ように、２４時間目に、外来性ヒトＧＡＡメッセンジャーＲＮＡを高レベルで検出した。

【0211】

ＧＡＡ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の投与後に、四頭筋グリコーゲンレベル（図４Ａ及び４
Ｂ）は、未処理のＧＡＡノックアウトマウスの四頭筋グリコーゲンレベル（図４Ｃ及び４
Ｄ）に比べて低下していた。

【0212】

均等物
当業者であれば、本明細書に記載する本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を
認識し、または日常的な実験を用いて確認するであろう。本発明の範囲は、上記の説明に
限定することを意図するものではなく、添付の特許請求の範囲にこれを記載する。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【配列表】

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