特開 2023-127076 ＣＤ８１結合性ペプチド及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023127076

(43)【公開日】2023-09-13

(54)【発明の名称】ＣＤ８１結合性ペプチド及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/06 20060101AFI20230906BHJP

   A61K 38/08 20190101ALI20230906BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230906BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20230906BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20230906BHJP

   C07K 14/705 20060101ALN20230906BHJP

【ＦＩ】

C07K7/06 ZNA

A61K38/08

A61P35/00

A61P29/00

A61P1/00

C07K14/705

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022030632

(22)【出願日】2022-03-01

(71)【出願人】

【識別番号】304021417

【氏名又は名称】国立大学法人東京工業大学

(74)【代理人】

【識別番号】100165179

【弁理士】

【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡

(74)【代理人】

【識別番号】100188558

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100175824

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100152272

【弁理士】

【氏名又は名称】川越 雄一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100181722

【弁理士】

【氏名又は名称】春田 洋孝

(72)【発明者】

【氏名】大河内 美奈

(72)【発明者】

【氏名】田中 祐圭

【テーマコード（参考）】

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084AA03

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA17

4C084BA23

4C084NA14

4C084ZA66

4C084ZB11

4C084ZB26

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA15

4H045CA40

4H045EA20

4H045EA25

4H045EA28

4H045FA33

(57)【要約】      （修正有）

【課題】ＣＤ８１結合性ペプチド、及び、癌細胞の遊走又は浸潤の抑制剤を提供する。
【解決手段】特定の4種類のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなるか、又は、前記特定の4種類のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、且つＣＤ８１に対する結合性を有するペプチドからなる、ＣＤ８１結合性ペプチド、及び、上記ＣＤ８１結合性ペプチドを有効成分とする、ＣＤ８１関連疾患の予防、改善又は治療剤。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１～４のいずれかのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなるか、又は、配列番号１～４のいずれかのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、且つＣＤ８１に対する結合性を有するペプチドからなる、ＣＤ８１結合性ペプチド。

【請求項2】

請求項１に記載のＣＤ８１結合性ペプチドを有効成分とする、ＣＤ８１関連疾患の予防、改善又は治療剤。

【請求項3】

前記ＣＤ８１関連疾患が、癌細胞の遊走若しくは浸潤、又は、炎症性腸疾患である、請求項２に記載の予防、改善又は治療剤。

【請求項4】

請求項１に記載のＣＤ８１結合性ペプチドを有効成分とする、癌細胞の遊走又は浸潤の抑制剤と、抗癌剤とを含む、癌治療用医薬組成物。

【請求項5】

請求項１に記載のＣＤ８１結合性ペプチドを有効成分とする、癌細胞の遊走又は浸潤の抑制剤と、抗癌剤とを含む、癌治療用キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＣＤ８１結合性ペプチド及びその使用に関する。より具体的には、本発明は、ＣＤ８１結合性ペプチド、ＣＤ８１関連疾患の予防、改善又は治療剤、炎症性腸疾患の予防、改善又は治療剤、癌細胞の遊走又は浸潤の抑制剤、癌治療用医薬組成物及び癌治療用キットに関する。

【背景技術】

【0002】

ＣＤ８１は、テトラスパニンと呼ばれる膜４回貫通型タンパク質スーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ８１は、４つの膜貫通領域、２つの細胞外ループ及び１つの短い細胞内ループを含み、他のテトラスパニンと同じ膜トポロジーを有している。テトラスパニンは他の膜タンパクと結合して、テトラスパニンウェブと呼ばれる複合体を形成し、様々な生物学的プロセスに関与することが知られている。

【0003】

ＣＤ８１は、膜タンパク質であるＥＷＩ－２、Ｂ細胞補助受容体ＣＤ１９等と結合することが知られている。ＣＤ８１は多くの癌細胞だけでなく、癌細胞が分泌する細胞外小胞にも高度に発現していることが知られている。

【0004】

癌は世界的に死因の上位を占める疾患であり、抗癌剤の開発は世界的に重要である。従来、癌細胞の増殖を阻害する抗癌剤が開発されてきた。これに対し、例えば非特許文献１に記載されているように、癌細胞の浸潤や転移を阻害する新しいタイプの医薬が注目されている。

【0005】

ところで、クローン病や潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ、ＩＢＤ）は、アンメット・メディカルニーズが高い疾患であり、炎症性腸疾患を予防、改善又は治療する技術が求められている。近年、大腸炎動物モデルの活性化Ｔ細胞においてＣＤ８１が発現していること、炎症性腸疾患にはＴ細胞の遊走が関連していること、抗ＣＤ８１抗体が炎症性腸疾患の治療に有用であること等が報告されている（例えば、非特許文献２を参照）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Gandalovicova A., et al., Migrastatics- Anti-metastatic and Anti-invasion Drugs: Promises and Challenges, Trends in Cancer, 3, (6), 391-406, 2017.

【非特許文献2】Hasezaki T., et al., Anti-CD81 antibodies reduce migration of activated T lymphocytes and attenuate mouse experimental colitis, Scientific Reports, 10:6969, 2020.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、ＣＤ８１結合性ペプチド、及び、ＣＤ８１関連疾患の予防、改善又は治療剤を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、以下の態様を含む。
［１］配列番号１～４のいずれかのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなるか、又は、配列番号１～４のいずれかのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、且つＣＤ８１に対する結合性を有するペプチドからなる、ＣＤ８１結合性ペプチド。
［２］［１］に記載のＣＤ８１結合性ペプチドを有効成分とする、ＣＤ８１関連疾患の予防、改善又は治療剤。
［３］前記ＣＤ８１関連疾患が、癌細胞の遊走若しくは浸潤、又は、炎症性腸疾患である、［２］に記載の予防、改善又は治療剤。
［４］［１］に記載のＣＤ８１結合性ペプチドを有効成分とする、癌細胞の遊走又は浸潤の抑制剤と、抗癌剤とを含む、癌治療用医薬組成物。
［５］［１］に記載のＣＤ８１結合性ペプチドを有効成分とする、癌細胞の遊走又は浸潤の抑制剤と、抗癌剤とを含む、癌治療用キット。

【発明の効果】

【0009】

本発明によれば、ＣＤ８１結合性ペプチド、及び、ＣＤ８１関連疾患の予防、改善又は治療剤を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】図１は、実験例２におけるペプチドアレイの蛍光画像を示す写真である。

【図2】図２は、図１に基づいて作成したグラフである。

【図3】図３は、実験例３におけるペプチドアレイの蛍光画像を示す写真である。

【図4】図４は、図３に基づいて作成したグラフである。

【図5】図５は、実験例４において予測した、配列番号１のペプチドとＣＤ８１タンパク質の配置を示す図及びその部分拡大図である。

【図6】図６は、実験例４において予測した、配列番号２のペプチドとＣＤ８１タンパク質の配置を示す図及びその部分拡大図である。

【図7】図７は、実験例４において予測した、配列番号３のペプチドとＣＤ８１タンパク質の配置を示す図及びその部分拡大図である。

【図8】図８は、実験例４において予測した、配列番号４のペプチドとＣＤ８１タンパク質の配置を示す図及びその部分拡大図である。

【図9】図９は、実験例５における細胞浸潤アッセイの結果を示すグラフである。

【図10】図１０は、実験例６における細胞遊走アッセイの結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0011】

［ＣＤ８１結合性ペプチド］
一実施形態において、本発明は、配列番号１～４のいずれかのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなるか、又は、配列番号１～４のいずれかのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、且つＣＤ８１に対する結合性を有するペプチドからなる、ＣＤ８１結合性ペプチドを提供する。ＣＤ８１結合性ペプチドとは、ＣＤ８１タンパク質に対する結合性を有するペプチドである。

【0012】

本実施形態のＣＤ８１結合性ペプチドは、配列番号１～４のいずれかのアミノ酸配列からなるか、又は、配列番号１～４のいずれかのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つＣＤ８１に対する結合性を有するペプチドからなるものであってもよい。

【0013】

本実施形態のＣＤ８１結合性ペプチドが結合対象とするＣＤ８１タンパク質はヒトＣＤ８１タンパク質であることが好ましい。ヒトＣＤ８１タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿００１２８４５７８．１、ＮＰ＿００４３４７．１等である。

【0014】

本実施形態のＣＤ８１結合性ペプチドは、ＣＤ８１に対する結合性を有している限り、配列番号１～４のいずれかのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有していてもよい。

【0015】

本明細書において、１若しくは数個とは、例えば１～３個であってもよく、例えば１～２個であってもよい。以下、あるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列のことを「変異配列」という場合がある。また、あるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドのことを「変異ペプチド」等という場合がある。

【0016】

本実施形態のＣＤ８１結合性ペプチドは、その部分ペプチドが、配列番号１～４のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド又はその変異ペプチドであってもよい。いい換えると、本実施形態のＣＤ８１結合性ペプチドは、配列番号１～４のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド又はその変異ペプチドを部分ペプチドとし、そのＮ末端側又はＣ末端側に、更に他のアミノ酸配列からなるペプチドが連結されていてもよい。このようなペプチドであっても、ＣＤ８１に結合することができる。

【0017】

ＣＤ８１結合性ペプチドがＮ末端側又はＣ末端側に付加的なアミノ酸配列を有している場合、付加的なアミノ酸配列の長さは、例えば５～１００アミノ酸であってもよく、例えば５～５０アミノ酸であってもよく、例えば５～４０アミノ酸であってもよく、例えば５～３０アミノ酸であってもよく、例えば５～２０アミノ酸であってもよく、例えば５～１０アミノ酸であってもよい。

【0018】

本明細書において、「ペプチドがＣＤ８１と結合する」とは、「ペプチドがＣＤ８１と反応する」、「ペプチドがＣＤ８１を認識する」、「ペプチドがＣＤ８１を結合対象とする」等といい換えることもできる。

【0019】

［ＣＤ８１関連疾患の予防、改善又は治療剤］
一実施形態において、本発明は、上述したＣＤ８１結合性ペプチドを有効成分とする、ＣＤ８１関連疾患の予防、改善又は治療剤を提供する。

【0020】

ＣＤ８１関連疾患とは、ＣＤ８１がその発症に関連する疾患を意味する。ＣＤ８１関連疾患としては、癌細胞の遊走若しくは浸潤、炎症性腸疾患等が挙げられる。

【0021】

したがって、一態様において、本実施形態の予防、改善又は治療剤は、癌細胞の遊走又は浸潤の抑制剤であるということができる。また、別の一態様において、本実施形態の予防、改善又は治療剤は、炎症性腸疾患の予防、改善又は治療剤であるということができる。炎症性腸疾患としては、潰瘍性大腸炎、クローン病等が挙げられる。

【0022】

実施例において後述するように、ＣＤ８１結合性ペプチドを、癌細胞の遊走又は浸潤を抑制する用途に使用することができる。したがって、ＣＤ８１結合性ペプチドを、癌細胞の遊走又は浸潤を抑制する新たなタイプの医薬等として利用することができる。癌細胞の遊走又は浸潤の抑制剤は、癌細胞の転移抑制剤等といい換えることができる。

【0023】

本実施形態の癌細胞の遊走又は浸潤の抑制剤が対象とする癌細胞としては、ＣＤ８１の発現量が正常細胞と比較して増加した癌細胞であれば特に限定されず、乳癌、肺癌、胃癌、大腸癌、前立腺癌、メラノーマ、脳腫瘍、リンパ腫、子宮癌、卵巣癌、頭頸部の癌（喉頭癌、咽頭癌、舌癌等）、骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、線維肉腫、脂肪肉腫、血管肉腫等が挙げられる。また、ここで、正常細胞としては、例えば正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）が挙げられる。

【0024】

また、上述したように、抗ＣＤ８１抗体が炎症性腸疾患に対する予防、改善、治療効果を有することが報告されている。したがって、ＣＤ８１結合性ペプチドを、炎症性腸疾患の予防、改善又は治療剤として利用することができる。

【0025】

配列番号１～４のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド又はその変異ペプチドは、通常の方法により化学合成することができる。

【0026】

本実施形態の癌細胞の遊走又は浸潤の抑制剤、又は、炎症性腸疾患の予防、改善又は治療剤は、常法にしたがって、薬学的に許容される担体を混合した医薬組成物として製剤化されていることが好ましい。医薬組成物は、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤等の形態で経口的に、あるいは、注射剤、点滴静注剤等の形態で非経口的に投与することができる。

【0027】

薬学的に許容される担体（添加剤）としては、安定剤、希釈剤、増粘剤、ｐＨ調整剤、注射剤用溶剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、乳化剤、湿潤剤、油剤等が挙げられる。

【0028】

安定剤としては、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラヒドロキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール等のアルコール類；フェノール、クレゾール等のフェノール類が挙げられる。

【0029】

希釈剤としては、水、エタノール、プロピレングリコール等が挙げられる。

【0030】

増粘剤としては、キサンタンガム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸ナトリウム、カラギナン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。

【0031】

ｐＨ調整剤としては、フタル酸、リン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、フマル酸、リンゴ酸、炭酸やそれらのカリウム塩、ナトリウム塩又はアンモニウム塩、水酸化ナトリウム等が挙げられる。

【0032】

注射剤用溶剤としては、水、エタノール、グリセリン等が挙げられる。

【0033】

賦形剤としては、有機系賦形剤、無機系賦形剤等が挙げられる。有機系賦形剤としては、乳糖、白糖等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース等のセルロース誘導体；アラビアゴム等が挙げられる。無機系賦形剤としては、硫酸カルシウム等の硫酸塩が挙げられる。

【0034】

結合剤としては、上記の賦形剤、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール等が挙げられる。

【0035】

崩壊剤としては、上記の賦形剤；クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム等のデンプン又はセルロースの誘導体；架橋ポリビニルピロリドン等が挙げられる。

【0036】

滑沢剤としては、タルク；ステアリン酸；コロイドシリカ；ビーズワックス、ゲイロウ等のワックス類；硫酸ナトリウム等の硫酸塩；ラウリル硫酸ナトリウム等のラウリル硫酸塩；上記の賦形剤におけるデンプン誘導体等が挙げられる。

【0037】

乳化剤としては、ベントナイト、ビーガム等のコロイド性粘土；ラウリル硫酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウム等の陽イオン界面活性剤；ポリオキシエチレンアルキルエーテル等の非イオン界面活性剤；ステアリン酸ポリグリセリル－１０、ジステアリン酸ポリグリセリル－１０、トリステアリン酸ポリグリセリル－１０、ペンタステアリン酸ポリグリセリル－１０等の（ポリ）グリセリル脂肪酸エステル界面活性剤等が挙げられる。

【0038】

湿潤剤としては、ソルビット、グリセリン、濃グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等が挙げられる。

【0039】

油剤としては、流動パラフィン、スクワラン、ポリイソブテン等の炭化水素油；オレイルアルコール、ミリスチルアルコール、セタノール、ステアリルアルコール、イソステアリルアルコール、セトステアリルアルコール、オクチルドデカノール、アラキルアルコール、水添ナタネ油アルコール、ベヘニルアルコール、デシルテトラデカノール等の高級アルコール類；パルミチン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸等の高級脂肪酸；オリーブ油、ホホバ種子油、イソノナン酸エチルヘキシル、イソノナン酸イソノニル、イソノナン酸イソトリデシル、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル、エチルヘキサン酸セチル、エチルヘキサン酸ヘキシルデシル、ジエチルヘキサン酸ネオペンチグリコール、トリエチルヘキサン酸トリメチロールプロパン、トリエチルヘキサノイン、テトラエチルヘキサン酸ペンタエリスリチル、ラウリン酸ヘキシル、アジピン酸ジイソブチル、コハク酸ジエチルヘキシル、コハク酸ビスエトキシジグリコール、パルミチン酸エチルヘキシル、パルミチン酸セチル、イソステアリン酸イソプロピル、イソステアリン酸ヘキシルデシル、イソステアリン酸イソステアリル、トリイソステアリン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、テトライソステアリン酸ペンタエリスリチル、イソステアリン酸水添ヒマシ油、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、オレイン酸オレイル、エルカ酸オレイル、エルカ酸オクチルドデシル、ヒドロキシステアリン酸エチルヘキシル、ステアロイルオキシステアリン酸オクチルドデシル、ネオペンタン酸イソステアリル、ネオペンタン酸オクチルドデシル、ネオデカン酸オクチルドデシル、リンゴ酸ジイソステアリル、テトライソステアリン酸ポリグリセリル－２、ダイマージリノール酸ダイマージリノレイル、ダイマージリノール酸水添ヒマシ油、（イソステアリン酸ポリグリセリル－２／ダイマージリノール酸）コポリマー、ヘキサ（ヒドロキシステアリン酸／ステアリン酸／ロジン酸）ジペンタエリスリチル、（ジグリセリン／ジリノール酸／ヒドロキシステアリン酸）コポリマー等のエステル油；シクロメチコン、フェニルトリメチコン、ジメチコン等のシリコーン油等が挙げられる。

【0040】

癌細胞の遊走又は浸潤の抑制剤の投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、例えば、成人に対し、投与単位形態あたり０．１～１，０００ｍｇの有効成分（ＣＤ８１結合性ペプチド）を投与すればよい。

【0041】

また、炎症性腸疾患の予防、改善又は治療剤の投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、例えば、成人に対し、投与単位形態あたり０．１～１，０００ｍｇの有効成分（ＣＤ８１結合性ペプチド）を投与すればよい。

【0042】

［癌治療用医薬組成物］
一実施形態において、本発明は、上述した癌細胞の遊走又は浸潤の抑制剤と、抗癌剤とを含む、癌治療用医薬組成物を提供する。

【0043】

本実施形態の医薬組成物によれば、癌細胞の遊走又は浸潤の抑制剤により癌の転移や浸潤を抑制しつつ、抗癌剤により癌細胞を殺傷又は細胞増殖抑制することにより、効果的に癌を治療することができる。

【0044】

抗癌剤としては、殺細胞性抗癌剤、分子標的薬等が挙げられる。殺細胞性抗癌剤としては、アルキル化薬、白金化合物、代謝拮抗薬、トポイソメラーゼ阻害薬、抗癌抗生物質、微小管作用抗癌剤等が挙げられる。

【0045】

アルキル化薬としては、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、チオテパ、ブスルファン、ダカルバジン、ニムスチン、ラニムスチン、テモゾロミド等が挙げられる。白金化合物としては、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン等が挙げられる。代謝拮抗薬としては、ピリミジン拮抗薬、プリン拮抗薬、葉酸拮抗薬等が挙げられる。ピリミジン拮抗薬としては、フルオロウラシル、カペシタビン、シタラビン、ゲムシタビン、エノシタビン、テガフール、カルモフール、ドキシフルリジン等が挙げられる。プリン拮抗薬としては、メルカプトプリン、フルダラビン、ペントスタチン、クラドリビン等が挙げられる。葉酸拮抗薬としては、ペメトレキセド、メトトレキサート等が挙げられる。トポイソメラーゼ阻害薬としては、イリノテカン、ノギテカン、エトポシド等が挙げられる。抗癌抗生物質としては、アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン、ドキソルビシンリポソーム、ダウノルビシン、ブレオマイシン、ペプロマイシン、マイトマイシンＣ、アクラルビシン、ピラルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アムルビシン、ジノスタチンスチマラマー等が挙げられる。微小管作用抗癌剤としては、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセル等が挙げられる。

【0046】

分子標的薬としては、ゲフィチニブ、エルロチニブ、オシメルチニブ等のチロシンキナーゼ阻害剤、トファシチニブ、バリシチニブ、ルキソリチニブ等のヤヌスキナーゼ阻害剤、オラパリブ等のＰＡＲＰ阻害剤、リツキシマブ、セツキシマブ、トラスツズマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ等の抗体医薬等が挙げられる。

【0047】

本実施形態の医薬組成物は、常法にしたがって、薬学的に許容される担体を混合した医薬組成物として製剤化されていることが好ましい。医薬組成物については上述したものと同様である。

【0048】

癌細胞の遊走又は浸潤の抑制剤、及び、抗癌剤の投与量は、抗癌剤の種類、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、例えば、成人に対し、投与単位形態あたり０．１～１，０００ｍｇの各有効成分（０．１～１，０００ｍｇのＣＤ８１結合性ペプチド、及び、０．１～１，０００ｍｇの抗癌剤）を投与すればよい。

【0049】

［癌治療用キット］
一実施形態において、本発明は、上述した癌細胞の遊走又は浸潤の抑制剤と、抗癌剤とを含む、癌治療用キットを提供する。

【0050】

本実施形態の癌治療用キットは、癌細胞の遊走又は浸潤の抑制剤と、抗癌剤とが、別々の容器に封入されており、単一の医薬組成物を構成していない点において、上述した癌治療用医薬組成物と主に異なる。

【0051】

抗癌剤については上述したものと同様である。抗癌剤は、常法にしたがって、薬学的に許容される担体を混合した癌治療用医薬組成物として、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤等の形態で経口的に、あるいは、注射剤、点滴静注剤等の形態で非経口的に投与することができる。薬学的に許容される担体（添加剤）については上述したものと同様である。

【0052】

癌細胞の遊走又は浸潤の抑制剤、及び、抗癌剤の投与量は、抗癌剤の種類、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、例えば、成人に対し、投与単位形態あたり０．１～１，０００ｍｇの各有効成分（０．１～１，０００ｍｇのＣＤ８１結合性ペプチド、及び、０．１～１，０００ｍｇの抗癌剤）を投与すればよい。

【0053】

［その他の実施形態］
一実施形態において、本発明は、ＣＤ８１結合性ペプチドの有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、癌細胞の遊走又は浸潤の抑制方法を提供する。本実施形態の方法は、癌の転移を抑制する方法であるということもできる。

【0054】

一実施形態において、本発明は、ＣＤ８１結合性ペプチドの有効量、及び、抗癌剤の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、癌の治療方法を提供する。

【0055】

本実施形態の癌の治療方法において、ＣＤ８１結合性ペプチド及び抗癌剤は、混合されて単一の医薬組成物を構成していてもよいし、別々の容器に封入されてキットを構成していてもよい。

【0056】

一実施形態において、本発明は、ＣＤ８１結合性ペプチドの有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、炎症性腸疾患の予防、改善又は治療方法を提供する。

【0057】

一実施形態において、本発明は、癌細胞の遊走又は浸潤の抑制における使用のための、ＣＤ８１結合性ペプチドを提供する。

【0058】

一実施形態において、本発明は、癌の治療における使用のための医薬組成物であって、ＣＤ８１結合性ペプチド、及び、抗癌剤を含む医薬組成物を提供する。

【0059】

一実施形態において、本発明は、癌の治療における使用のためのキットであって、ＣＤ８１結合性ペプチド、及び、抗癌剤を含むキットを提供する。

【0060】

一実施形態において、本発明は、炎症性腸疾患の予防、改善又は治療における使用のための、ＣＤ８１結合性ペプチドを提供する。

【0061】

一実施形態において、本発明は、癌細胞の遊走又は浸潤の抑制剤を製造するための、ＣＤ８１結合性ペプチドの使用を提供する。

【0062】

一実施形態において、本発明は、癌治療用医薬組成物を製造するための、ＣＤ８１結合性ペプチド、及び、抗癌剤の使用を提供する。

【0063】

一実施形態において、本発明は、癌治療用キットを製造するための、ＣＤ８１結合性ペプチド、及び、抗癌剤の使用を提供する。

【0064】

一実施形態において、本発明は、炎症性腸疾患の予防、改善又は治療剤を製造するための、ＣＤ８１結合性ペプチドの使用を提供する。

【0065】

これらの各実施形態において、ＣＤ８１結合性ペプチドについては上述したものと同様である。ＣＤ８１結合性ペプチドは、配列番号１～４のいずれかのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなるペプチドであってもよいし、配列番号１～４のいずれかのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなり、且つＣＤ８１に対する結合性を有するペプチドであってもよい。また、これらの各実施形態において、抗癌剤については上述したものと同様である。

【実施例0066】

次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。

【0067】

［実験例１］
（ペプチドアレイの作製）
上述したように、ＣＤ８１は、膜タンパク質であるＥＷＩ－２と結合することが知られている。そこで、ＥＷＩ－２のＩｇ３ドメイン以降のアミノ酸配列に基づいて、４残基ずつオーバーラップさせた８残基のペプチドライブラリーを構築し、セルロースメンブレン上にペプチドアレイを作製した。

【0068】

ヒトＥＷＩ－２のアミノ酸配列を配列番号６に示す。配列番号６の第３０３～４２４番目のアミノ酸からなる配列がＩｇ３ドメインのアミノ酸配列であり、第４３１～５６０番目のアミノ酸からなる配列がＩｇ４ドメインのアミノ酸配列である。

【0069】

配列番号６の第３０１～６１３番目のアミノ酸からなる配列において、Ｎ末端から８アミノ酸からなるペプチドを１ペプチドとし、そこから４残基ずつＣ末端方向にずらし、長さがそれぞれ８アミノ酸である全７８種類のペプチドから構成されるペプチドアレイを作製した。

【0070】

まず、活性化メンブレンを作製した。３７℃で１日乾燥させたセルロースメンブレン（フィルターペーパー５４２、ＧＥヘルスケア社）を、ジメチルホルムアミド（以下、「ＤＭＦ」という。）に１日浸漬した。続いて、メンブレンをメタノールで２回洗浄した後乾燥させた。続いて、ＤＭＦ ３００ｍＬ、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（以下、「Ｆｍｏｃ」という。）－β－アラニン２４ｍＬ（１．０Ｍ）、ジイソプロピルカルボジイミド（以下、「ＤＩＰＣＩ」という。）５００μＬ、１－メチルイミダゾール（以下、「ＮＭＩ」という。）４００μＬを混合して調製した活性化試薬に、上記のメンブレンを２日間浸漬した。最後に、メンブレンを、ＤＭＦ及びメタノールでそれぞれ３回ずつ洗浄し、冷風をあてて乾燥させた。完成した活性化メンブレンは－２０℃の冷凍庫中に保存した。

【0071】

続いて、ペプチドアレイを作製した。ペプチド合成機（型式「ＲｅｓＰｅｐ ＳＬ、ＫＩＦＵ２０１４００４７－００００」、Ｉｎｔａｖｉｓ社）を用いて、上述した活性化メンブレン上の決められた位置にアミノ酸のスポッティングを繰り返すことにより、Ｆｍｏｃ固相合成反応によるペプチドの伸長反応を行った。スポットするアミノ酸溶液としては、Ｎ－メチル－２－ピロリドン（以下、「ＮＭＰ」という。）に溶解した０．５Ｍ Ｆｍｏｃアミノ酸溶液、及び、ＤＩＰＣＩとヒドロキシベンゾトリアゾール（以下、「ＨｏＢｔ」という。）をモル比で１：４に混合して調製した活性化剤を、１７：１００の容量比で混合させたものを使用した。Ｆｍｏｃ基の脱保護には、２０％ピペリジン（渡辺化学社）を用いた。キャッピングには、無水酢酸とＤＭＦとを容量比で２：１００に混合した溶液を使用した。また、メンブレンの洗浄には、ＤＭＦ及びエタノールを使用した。

【0072】

［実験例２］
（ＣＤ８１結合性ペプチドのスクリーニング）
実験例１で作製したペプチドアレイとＣＤ８１タンパク質とを反応させ、ＣＤ８１結合性ペプチドをスクリーニングした。

【0073】

ペプチドアレイを３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）－Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファーに浸して室温で１５分間インキュベートし、ブロッキングした。続いて、ペプチドアレイを３回洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８で標識したＣＤ８１タンパク質を室温で３時間反応させた。

【0074】

続いて、ペプチドアレイを３回洗浄し、画像解析システム（型式「Ｔｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ９５００ＢＧＲ」、ＧＥヘルスケア社）を用いて蛍光画像を取得した。続いて、画像解析ソフトＩｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ（ＧＥヘルスケア社）を用い、測定された蛍光強度を数値化した。

【0075】

図１は、ペプチドアレイの蛍光画像を示す写真である。図１中、「ＣＤ８１－Ａｌｅｘａ４８８」はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８で標識したＣＤ８１タンパク質を反応させた結果であることを示し、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は対照であることを示す（Ｎ＝３）。後述するように、ペプチド番号９７、１３２、１５２、１５３のペプチドは、特にＣＤ８１タンパク質との結合性が高かった。

【0076】

図２は、図１に基づいて作成したグラフである。図２中、横軸はペプチド番号を示し、縦軸は蛍光強度（相対値）を示す。平均値＋２ＳＤ（標準偏差）を超える蛍光強度を示したペプチドのうち、ペプチド番号９７、１３２、１５２、１５３のペプチドに着目して以下の検討を行った。

【0077】

下記表１に、各ペプチドの特性を示す。表１中、ｐＩは（等電点ｐＨ）を示し、チャージは電荷を示し、ＧＲＡＶＹは疎水性度（ｇｒａｎｄ ａｖｅｒａｇｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）を示す。

【0078】

【表1】

【0079】

［実験例３］
（ＣＤ８１結合性ペプチドとＣＤ８１タンパク質との相互作用の評価）
実験例１と同様にして、配列番号１～４のアミノ酸配列からなるペプチド、及び、対照ペプチド（ＡＡＡＡ、配列番号５）をスポット合成したペプチドアレイを作製した。

【0080】

続いて、ペプチドアレイを３％ＢＳＡ－Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファーに浸して室温で１５分間インキュベートし、ブロッキングした。続いて、ペプチドアレイを３回洗浄し、５０ｎＭ、１２５ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１，０００ｎＭの、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８で標識したＣＤ８１タンパク質を室温で３時間反応させた。

【0081】

続いて、ペプチドアレイを３回洗浄し、画像解析システム（型式「Ｔｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ９５００ＢＧＲ」、ＧＥヘルスケア社）を用いて蛍光画像を取得した。続いて、画像解析ソフトＩｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ（ＧＥヘルスケア社）を用い、測定された蛍光強度を数値化した。

【0082】

図３は、ペプチドアレイの蛍光画像を示す写真である。図３中、「Ｐ９７」はペプチド番号９７（配列番号１）のペプチドを示し、「Ｐ１３２」はペプチド番号１３２（配列番号２）のペプチドを示し、「Ｐ１５２」はペプチド番号１５２（配列番号３）のペプチドを示し、「Ｐ１５３」はペプチド番号１５３（配列番号４）のペプチドを示し、「４Ａ」は配列番号５のペプチドを示す。

【0083】

図４は、図３に基づいて作成したグラフである。図４中、横軸はＣＤ８１タンパク質の濃度を示し、縦軸は蛍光強度（相対値）を示す。図４中、「Ｐ９７」、「Ｐ１３２」、「Ｐ１５２」、「Ｐ１５３」については図３と同様である。

【0084】

続いて、各ペプチドとＣＤ８１タンパク質との結合定数Ｋ_Ｄを算出した。下記表２に算出したＫ_Ｄを示す。その結果、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドが、ＣＤ８１タンパク質との結合親和性が最も高いことが明らかとなった。

【0085】

なお、図４に示すように、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド（ペプチド番号１５２）の飽和結合量は、配列番号１～４のアミノ酸配列からなるペプチドの中で最も高くはないが、Ｋ_Ｄは最も高い結果となった。

【0086】

【表2】

【0087】

［実験例４］
（分子ドッキングシミュレーション）
ＣＤ８１結合性ペプチドとＣＤ８１タンパク質の複合構造をＭＤｏｃｋＰｅＰソフトウエアを用いて予測した。

【0088】

図５～８は、ＣＤ８１結合性ペプチドとＣＤ８１タンパク質の配置を示す図及びその部分拡大図である。図５はペプチド番号９７（配列番号１）のペプチドの結果を示し、図６はペプチド番号１３２（配列番号２）のペプチドの結果を示し、図７はペプチド番号１５２（配列番号３）のペプチドの結果を示し、図８はペプチド番号１５３（配列番号４）のペプチドの結果を示す。

【0089】

図５～８中、「Ｎ－ｔｅｒ ＣＤ８１」はＣＤ８１のＮ末端を示し、「Ｃ－ｔｅｒ ＣＤ８１」はＣＤ８１のＣ末端を示し、「Ｉｎｔ」は細胞膜の細胞質側を示し、「Ｅｘｔ」は細胞膜の外側を示す。

【0090】

その結果、いずれのペプチドも、細胞膜の近傍で、ＬＥＬ（Ｌａｒｇｅ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｏｐ）ドメイン及びＳＥＬ（Ｓｍａｌｌ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｏｐ）ドメインに挟まれる形でＣＤ８１に結合していることが明らかとなった。

【0091】

［実験例５］
（細胞浸潤アッセイ）
ボイデンチャンバーを用いた細胞浸潤アッセイにより、ＣＤ８１結合性ペプチドが細胞の浸潤を抑制できるか否かを検討した。無血清培地に懸濁した細胞を、多孔質膜を有する上部チャンバーに配置し、血清含有培地を底部ウェルに配置した。細胞としては、ヒト乳腺癌細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を使用した。

【0092】

上部チャンバーの培地には、１００ｎＭの各ＣＤ８１結合性ペプチドをそれぞれ添加した。また、比較のために、ペプチド無添加群、１００ｎＭの配列番号５のペプチド添加群、１００ｎＭの抗ＣＤ８１抗体（クローン５Ａ６、サンタクルーズバイオテクノロジー）添加群も用意した。

【0093】

続いて２４時間細胞をインキュベートした後、多孔質膜の反対側に浸潤した細胞を回収して溶解し、蛍光色素（ＣｙＱｕａｎｔ ＧＲ Ｄｙｅ、サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて定量した。

【0094】

図９は、細胞浸潤アッセイの結果を示すグラフである。図９中、縦軸は蛍光強度（相対値）を示す。また、「Ｎｏ Ｐｅｐ」はペプチド無添加群の結果であることを示し、「４Ａ」は配列番号５のペプチドを添加した結果であることを示し、「９７」はペプチド番号９７（配列番号１）のペプチドを添加した結果であることを示し、「１３２」はペプチド番号１３２（配列番号２）のペプチドを添加した結果であることを示し、「１５２」はペプチド番号１５２（配列番号３）のペプチドを添加した結果であることを示し、「１５３」はペプチド番号１５３（配列番号４）のペプチドを添加した結果であることを示し、「５Ａ６」は抗ＣＤ８１抗体を添加した結果であることを示す。

【0095】

その結果、ペプチド番号１３２（配列番号２）、１５２（配列番号３）、１５３（配列番号４）のペプチドで処理することにより、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の浸潤が抑制されたことが明らかとなった。この結果は、ＣＤ８１結合性ペプチドが、癌細胞の遊走又は浸潤を抑制し、癌の治療に有用であることを示す。

【0096】

［実験例６］
（細胞遊走アッセイ）
単一細胞追跡遊走アッセイにより、ＣＤ８１結合性ペプチドが細胞の遊走を抑制できるか否かを検討した。１００ｎＭ及び１μＭの各ＣＤ８１結合性ペプチドの存在下で、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の移動を１２時間追跡した。また、比較のために、ペプチド無添加群、配列番号５のペプチド添加群、抗ＣＤ８１抗体（クローン５Ａ６、サンタクルーズバイオテクノロジー）添加群も用意した。

【0097】

図１０は、細胞遊走アッセイの結果を示すグラフである。また、下記表３に細胞遊走アッセイの結果を示す。図１０中、縦軸は細胞の遊走距離（μｍ）を示す。また、図１０及び下記表３中、「Ｎｏ Ｐｅｐ」はペプチド無添加群の結果であることを示し、「４Ａ」は配列番号５のペプチドを添加した結果であることを示し、「９７」はペプチド番号９７（配列番号１）のペプチドを添加した結果であることを示し、「１３２」はペプチド番号１３２（配列番号２）のペプチドを添加した結果であることを示し、「１５２」はペプチド番号１５２（配列番号３）のペプチドを添加した結果であることを示し、「１５３」はペプチド番号１５３（配列番号４）のペプチドを添加した結果であることを示し、「５Ａ６」は抗ＣＤ８１抗体を添加した結果であることを示す。

【0098】

【表3】

【0099】

その結果、ペプチド番号９７（配列番号１）、ペプチド番号１３２（配列番号２）、１５２（配列番号３）、１５３（配列番号４）のペプチドで処理することにより、単一細胞レベルでのＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の遊走距離が、ペプチド無添加群と比較して、１０～３０％程度減少したことが明らかとなった。この結果は、ＣＤ８１結合性ペプチドが、癌細胞の遊走又は浸潤を抑制し、癌の治療に有用であることを示す。

【産業上の利用可能性】

【0100】

本発明によれば、ＣＤ８１結合性ペプチド、及び、ＣＤ８１関連疾患の予防、改善又は治療剤を提供することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

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