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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023127484
(43)【公開日】2023-09-13
(54)【発明の名称】塩基部修飾ヌクレオシドを含む新規アンチセンス核酸
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20230906BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230906BHJP
A61K 31/712 20060101ALI20230906BHJP
C07H 21/04 20060101ALI20230906BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
A61K48/00
A61K31/712
C07H21/04 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022031307
(22)【出願日】2022-03-01
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】304021417
【氏名又は名称】国立大学法人東京工業大学
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100150810
【弁理士】
【氏名又は名称】武居 良太郎
(72)【発明者】
【氏名】清尾 康志
(72)【発明者】
【氏名】正木 慶昭
(72)【発明者】
【氏名】金川 峻幸
(72)【発明者】
【氏名】小山 彩
【テーマコード（参考）】
4C057
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C057CC03
4C057DD03
4C057MM01
4C057MM09
4C084AA13
4C084NA05
4C084NA06
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086EA18
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA06
(57)【要約】
【課題】本発明は、標的核酸に対する選択性を向上させたアンチセンス分子及び該アンチセンス分子を含むアンチセンス核酸を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明によれば、塩基部がグアニンであって、グアニンのアミノ基に芳香族性置換基が導入されたアンチセンス分子及び該分子を含むアンチセンス核酸が提供される。
【選択図】なし
【解決手段】本発明によれば、塩基部がグアニンであって、グアニンのアミノ基に芳香族性置換基が導入されたアンチセンス分子及び該分子を含むアンチセンス核酸が提供される。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アンチセンス核酸に導入するための、下記の式：
〔式中、
Ｒ１は、水素原子、又は隣接する核酸との結合点であり；
Ｒ２は、水素原子、又は構造：
（式中、
は、隣接する核酸との結合点、又はＯＨであり；及び
Ｘは、Ｓ又はＯである）
であり；
Ｒ３は、水素、水酸基、又は置換基を有してもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ４は、カルバモイル基、又は置換若しくは未置換の芳香族基である〕
で表されるアンチセンス分子。
【化1】
Ｒ１は、水素原子、又は隣接する核酸との結合点であり；
Ｒ２は、水素原子、又は構造：
【化2】
【化3】
Ｘは、Ｓ又はＯである）
であり；
Ｒ３は、水素、水酸基、又は置換基を有してもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ４は、カルバモイル基、又は置換若しくは未置換の芳香族基である〕
で表されるアンチセンス分子。
【請求項2】
Ｒ４が、カルバモイル基である、請求項１に記載のアンチセンス分子。
【請求項3】
Ｒ４が、２－ピリジル、ピラジン－2－イル、ピリミジンー２－イル、ピリミジンー４―イル、及びピリミジンー５―イルからなる群から選択される芳香族基である、請求項１に記載のアンチセンス分子。
【請求項4】
ＸがＳである、請求項１～３のいずれか１項に記載のアンチセンス分子。
【請求項5】
５～１５塩基のデオキシリボ核酸からなるギャップ領域、ならびに該ギャップ領域の５’及び３’末端に各々、２～１０個の２’－修飾又は２’，４’－修飾された核酸からなるウイング領域を有する架橋型のアンチセンス核酸であって、前記ギャップ領域において、請求項１～４のいずれか１項に記載のアンチセンス分子が１個又は複数個が挿入され、及び／又は天然の塩基を有する核酸がそれにより置換されている、上記アンチセンス核酸。
【請求項6】
２’，４’－修飾された核酸が、下記：
Ｒ５は、各々独立して、水素原子、置換又は未置換のアルキル基、置換又は未置換のアラルキル基、置換又は未置換のアルケニル基、置換又は未置換のアルキニル基、及び置換又は未置換のアリール基からなる群から選択され；
Ｒ６は、水素原子、又は構造：
（式中、
は、隣接する核酸との結合点、又はＯＨであり；及び
Ｙは、Ｓ又はＯである）
であり；
Ｒ７は、水素原子、又は隣接する核酸との結合点であり；及び
Ｂは、保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基を表す］
からなる群から選択される、請求項５に記載のアンチセンス核酸。
【化4】
Ｒ６は、水素原子、又は構造：
【化5】
【化6】
Ｙは、Ｓ又はＯである）
であり；
Ｒ７は、水素原子、又は隣接する核酸との結合点であり；及び
Ｂは、保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基を表す］
からなる群から選択される、請求項５に記載のアンチセンス核酸。
【請求項7】
請求項５又は６に記載のアンチセンス核酸を含む、標的核酸に対する選択性を向上させたアンチセンス核酸治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、標的核酸に対する選択性を向上させた、塩基部修飾ヌクレオチドを含む新規アンチセンス分子、及び該アンチセンス分子を含むアンチセンス核酸に関する。より具体的は、塩基部がグアニンであって、グアニンのアミノ基に芳香族性置換基が導入されたアンチセンス分子及び該分子を含むアンチセンス核酸が提供される。
【背景技術】
【0002】
低分子医薬や抗体医薬に替わる新規医薬品として、標的ＲＮＡに結合しその働きを制御するアンチセンス核酸が注目されている。アンチセンス核酸を用いる核酸医薬品の開発においては、アンチセンス核酸の生体内安定性と標的選択性をそれぞれ調節することが必要である（非特許文献１）。これまでにも様々な疾患に対するアンチセンス核酸が開発されているが、なお克服すべき問題としてアンチセンス核酸が細胞内に存在する数千の標的外ＲＮＡに部分的に結合してその働きを阻害する現象（オフターゲット効果）あることが知られている。特に核酸塩基のうちグアニンはオフターゲット－ｔａｒｇｅｔ効果の原因となり得ると考えられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】Khvorova, A.; Watts, J. K. Nat. Biotechnol. 2017, 35 (3), 238-248
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
上記の通り、アンチセンス核酸を核酸医薬品として使用するためには、アンチセンス核酸の生体内安定性と標的選択性を調節する必要がある。本発明は、アンチセンス核酸の生体内安定性と標的選択性を向上させ、オフターゲット効果を抑制した新規アンチセンス核酸を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0005】
そこで、本発明者らは、上記のようなアンチセンス核酸を提供することを目的として研究を行った結果、アンチセンス核酸の配列に、グアニンにカルバモイル基や２－ピリジル基を加えた塩基部修飾ヌクレオシドを導入することにより、オフターゲット効果を抑制し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0006】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］アンチセンス核酸に導入するための、下記の式：
［１］アンチセンス核酸に導入するための、下記の式：
【0007】
【化1】
【0008】
〔式中、
Ｒ１は、水素原子、又は隣接する核酸との結合点であり；
Ｒ２は、水素原子、又は構造：
Ｒ１は、水素原子、又は隣接する核酸との結合点であり；
Ｒ２は、水素原子、又は構造：
【0009】
【化2】
【0010】
（式中、
【0011】
【化3】
【0012】
は、隣接する核酸との結合点、又はＯＨであり；及び
Ｘは、Ｓ又はＯである）
であり；
Ｒ３は、水素、水酸基、又は置換基を有してもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ４は、カルバモイル基、又は置換若しくは未置換の芳香族基である〕
で表されるアンチセンス分子。
Ｘは、Ｓ又はＯである）
であり；
Ｒ３は、水素、水酸基、又は置換基を有してもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ４は、カルバモイル基、又は置換若しくは未置換の芳香族基である〕
で表されるアンチセンス分子。
【0013】
［２］Ｒ４が、カルバモイル基である、［１］に記載のアンチセンス分子。
［３］Ｒ４が、２－ピリジル、ピラジン－2－イル、ピリミジンー２－イル、ピリミジンー４―イル、及びピリミジンー５―イルからなる群から選択される芳香族基である、［１］に記載のアンチセンス分子。
［４］ＸがＳである、［１］～［３］のいずれか１つに記載のアンチセンス分子。
［５］５～１５塩基のデオキシリボ核酸からなるギャップ領域、ならびに該ギャップ領域の５’及び３’末端に各々、２～１０個の２’－修飾又は２’，４’－修飾された核酸からなるウイング領域を有する架橋型のアンチセンス核酸であって、前記ギャップ領域において、［１］～［４］のいずれか１つに記載のアンチセンス分子が１個又は複数個が挿入され、及び／又は天然の塩基を有する核酸がそれにより置換されている、上記アンチセンス核酸。
［６］２’，４’－修飾された核酸が、下記：
［３］Ｒ４が、２－ピリジル、ピラジン－2－イル、ピリミジンー２－イル、ピリミジンー４―イル、及びピリミジンー５―イルからなる群から選択される芳香族基である、［１］に記載のアンチセンス分子。
［４］ＸがＳである、［１］～［３］のいずれか１つに記載のアンチセンス分子。
［５］５～１５塩基のデオキシリボ核酸からなるギャップ領域、ならびに該ギャップ領域の５’及び３’末端に各々、２～１０個の２’－修飾又は２’，４’－修飾された核酸からなるウイング領域を有する架橋型のアンチセンス核酸であって、前記ギャップ領域において、［１］～［４］のいずれか１つに記載のアンチセンス分子が１個又は複数個が挿入され、及び／又は天然の塩基を有する核酸がそれにより置換されている、上記アンチセンス核酸。
［６］２’，４’－修飾された核酸が、下記：
【0014】
【化4】
【0015】
Ｒ５は、各々独立して、水素原子、置換又は未置換のアルキル基、置換又は未置換のアラルキル基、置換又は未置換のアルケニル基、置換又は未置換のアルキニル基、及び置換又は未置換のアリール基からなる群から選択され；
Ｒ６は、水素原子、又は構造：
Ｒ６は、水素原子、又は構造：
【0016】
【化5】
【0017】
（式中、
【0018】
【化6】
【0019】
は、隣接する核酸との結合点、又はＯＨであり；及び
Ｙは、Ｓ又はＯである）
であり；
Ｒ７は、水素原子、又は隣接する核酸との結合点であり；及び
Ｂは、保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基を表す］
からなる群から選択される、［５］に記載のアンチセンス核酸。
Ｙは、Ｓ又はＯである）
であり；
Ｒ７は、水素原子、又は隣接する核酸との結合点であり；及び
Ｂは、保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基を表す］
からなる群から選択される、［５］に記載のアンチセンス核酸。
【0020】
［７］［５］又は［６］に記載のアンチセンス核酸を含む、標的核酸に対する選択性を向上させたアンチセンス核酸治療薬。
【発明の効果】
【0021】
本発明によれば、標的核酸（特に、ＲＮＡ）に対する選択性を向上させた新規アンチセンス分子、及び該アンチセンス分子を含むアンチセンス核酸を提供することにより、主作用である核酸（特に、ＲＮＡ）切断能を維持しつつ、副作用である非標的核酸（特に、ＲＮＡ）の切断（オフターゲット効果）を阻害又は軽減することができる。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】各修飾塩基の導入によるアンチセンス活性の変化を示す。
【図2】各アンチセンス核酸の二重鎖融解温度（Ｔｍ）の測定結果を示す。横軸のＣ、Ｕ、Ａ、Ｇはそれぞれ相補鎖ＲＮＡのＮの塩基を表している。
【図3】各アンチセンス核酸のＲＮａｓｅＨ切断活性のゲルシフトアッセイ結果を示す。Ｌａｄｄｅｒ：１００ｎＭ ５’－ＦＡＭ－ｒ（ａｇｃａｕｕｇｇｃａｇｃｕ）－３’、１００ｎＭ ５’－ＦＡＭ－ｒ（ａｇｃａｕｕｇｇｃａｇ）－３’、１００ｎＭ ５’－ＦＡＭ－ｒ（ａｇｃａｕｕｇｇｃ）－３’；ｒ＝ＲＮＡ。
【図4】想定される二重鎖の切断箇所を示す。
【発明を実施するための形態】
【0023】
本発明は、標的核酸に対する選択性を向上させた、塩基部修飾ヌクレオチドを含む新規アンチセンス分子、及び該アンチセンス分子を含むアンチセンス核酸に関する。
【0024】
核酸医薬品の開発においては、アンチセンス核酸の生体内安定性と標的選択性をそれぞれ調節することが必要である。標的選択性が低い核酸を生体内に導入されると、アンチセンス核酸が非標的ＲＮＡと結合することによる副作用（本明細書では「オフターゲット効果」ともいう）が生じてしまう恐れがある。アンチセンス核酸が非標的ＲＮＡと結合する仕組みとして、ミスマッチ塩基対の形成が考えられる。核酸はワトソンクリック型やフーグスティーン型の塩基対を形成するほか、完全に相補的でない配列とも塩基対を形成することが知られており、Ｗｏｂｂｌｅ塩基対であるＧ－Ｕ、Ｇ－Ａ、Ｇ－Ｇミスマッチ塩基対がその例である。そこで、アンチセンスの標的選択性を高めるため、ミスマッチ塩基対の形成を選択的に阻害できるような、ミスマッチ塩基識別能の高い化学修飾を核酸に導入することが効果的な戦略として考えられる。
【0025】
ミスマッチ塩基識別能の向上を目指した化学修飾の例として、２－Ｎ－アセチル－３－デアザグアニン（ａ２ｃ３Ｇ）が報告されている。ａ２ｃ３Ｇは、下記に示すようなｏｐｅｎ－ｃｌｏｓｅｄの構造をとり、塩基対形成を阻害するｃｌｏｓｅｄ型の方が安定して存在する。
【0026】
【化7】
【0027】
一方で、カルボニル基の酸素と３位の水素が分子内水素結合を形成することにより、＋２．３ｋｃａｌ／ｍｏｌでｏｐｅｎ型の構造になることができ、ｏｐｅｎ型になることによって塩基対を形成する。この際、ａ２ｃ３Ｇ－Ｃ塩基対とａ２ｃ３Ｇ－Ｕミスマッチ塩基対を形成するためのエネルギー差を算出した結果、Ｇ－Ｃ塩基対とＧ－Ｕミスマッチ塩基対を形成するためのエネルギー差よりも１．６ｋｃａｌ大きくなることが示された。したがって、ａ２ｃ３Ｇはミスマッチ塩基対の識別能を向上させることが示唆され、これはａ２ｃ３Ｇを導入したオリゴヌクレオチドと相補鎖ＲＮＡとの二重鎖融解温度（Ｔｍ）測定の結果とも一致した（Seio, K.; Sasami, T.; Ohkubo, A.; Ando, K.; Sekine, M. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 1026-1027）。
【0028】
さらに、ａ２ｃ３Ｇと同様にｏｐｅｎ－ｃｌｏｓｅｄ型の構造をとることで塩基対形成するような化学修飾核酸として、２－Ｎ－カルバモイルデオキシグアノシン（Ｇｃｍ）が合成された（Sasami, T.; Odawara, Y.; Ohkubo, A.; Sekine, M.; Seio, K. Tetrahedron Lett. 2007, 48 (30), 5325-5329）。下記にその構造を示す。
【0029】
【化8】
【0030】
Ｇｃｍは塩基対形成を阻害するｃｌｏｓｅｄ型の構造の方がやや安定であると示され、これはａ２ｃ３Ｇの特徴と一致していた。本発明者らは、Ｇｃｍをオリゴデオキシヌクレオチドや２’－ＯＭｅ修飾配列に導入し、二重鎖安定性（Ｔｍ）を評価した。その結果、Ｇｃｍは非修飾のグアニンと比べて、ミスマッチ塩基対を含む相補鎖ＤＮＡとのＴｍをより不安定化させることを明らかにした。さらに、２’－ＯＭｅ修飾のＲＮＡにＧｃｍを導入した配列においても、ミスマッチ塩基対を含む相補鎖ＤＮＡや相補鎖ＲＮＡとのＴｍ測定をおこなった結果、Ｇｃｍによってミスマッチ塩基対の識別能が向上することが報告されている（佐々見武志 博士論文 東京工業大学 2008）。したがって、カルバモイル基による修飾はミスマッチ塩基対の識別能を高めることにより、アンチセンスの標的選択性を向上させると考えられる。
【0031】
本研究では、ａ２ｃ３ＧやＧｃｍと同様にｏｐｅｎ－ｃｌｏｓｅｄ型の構造をとることで塩基対形成する化学修飾核酸として、２－Ｎ－（ピリジン－２－イル）－グアニン（ＧＰｙ）に着目した。下記にその構造変化を示す。
【0032】
【化9】
【0033】
Ｇｐｙはオリゴデオキシヌクレオチドに導入した場合、相補鎖ＤＮＡ二重鎖との結合親和性（Ｔｍ）と塩基識別能を予想外に低下させていた（Inde, T.; Masaki, Y.; Maruyama, A.; Ito, Y.; Makio, N.; Miyatake, Y.; Tomori, T.; Sekine, M.; Seio, K. Org. Biomol. Chem. 2017, 15, 8371-8383）。ＧＰｙがミスマッチ塩基対の形成を安定化した要因として、ピリジル基が持つ芳香族環によるスタッキング相互作用が指摘されていた（Inde,T、前掲）が、これは配列依存的な相互作用である可能性もあり、アンチセンス核酸に導入し、相補鎖ＲＮＡを標的にした場合には塩基識別能が向上する可能性もある。そこで、後述する実施例１に示されるように、Ｇｐｙをアンチセンス核酸に導入した場合の特性を評価するため、ＬＮＡギャップマー型のアンチセンス核酸にＧＰｙを導入し、その特性評価をおこなった。さらに、比較対象としてＧｃｍを導入したアンチセンス核酸や、Ｇを欠損させたアンチセンス核酸についても初めて特性評価をおこなった。
【0034】
ＧｃｍおよびＧＰｙの合成をそれぞれスキーム１及び２に示す。
【0035】
【化10】
【0036】
Ｇｃｍの合成では、まず２’－デオキシグアノシン（化合物２－１）の３’，５’水酸基を、ＴＢＳＣｌを用いてＴＢＳ基で保護することにより化合物２－２を得る。ＴＭＳＣｌを用いて６位のカルボニル基を保護した後に、クロロギ酸フェニルでアシル化して得られたフェノキシカルボニル中間体（化合物２－３）を、つづけて２８％アンモニア水と反応させることにより化合物２－４を得る。その後、グアニン６位のカルボニル基をジフェニルカルバモイル（ＤＰＣ）基で保護して化合物２－５を得る。そして、トリエチルアミン三フッ化水素を用いて３’水酸基と５’水酸基の脱保護をおこなうことで化合物２－６を収率４５％で得る。最後に、定法にしたがい５’位のＤＭＴｒ化と３’位のホスフィチル化をおこなうことによって化合物２－７を収率４６％、化合物２－８を収率１７％で得る。
【0037】
【化11】
【0038】
ＧＰｙの合成では、まず３’，５’位をＴＢＳ保護したグアノシン（化合物２－２）に、パラジウム試薬、塩基、ホスフィンリガンドとして酢酸パラジウム、Ｃｓ２ＣＯ３、（±）－ＢＩＮＡＰを用いることで、２－クロロピリジンとのＢｕｃｈｗａｌｄ－Ｈａｒｔｗｉｇ反応をおこない、化合物２－９を収率４１％で得る。そして、トリエチルアミン三フッ化水素を用いて３’水酸基と５’水酸基の脱保護をおこなうことで化合物２－１０を収率８５％で得る。最後に、定法にしたがい５’位のＤＭＴｒ化と３’位のホスフィチル化をおこなうことによって化合物２－１１を収率６８％、化合物２－１２を収率８３％で得る。
【0039】
上記では、本発明によるアンチセンス核酸に使用され得るアンチセンス分子として、典型例として、２－Ｎ－（ピリジン－２－イル）－グアニン（ＧＰｙ）又は２－Ｎ－カルバモイルデオキシグアノシン（Ｇｃｍ）を有する核酸について説明したが、本発明は、これらのアンチセンス分子に限定されず、下記の通り、一般式（Ｉ）で表されるアンチセンス分子を提供することができる。本明細書では、「アンチセンス分子」とは、一般式（Ｉ）で表される分子を指し、例えば、ＧＰｙ又はＧｃｍを有する核酸分子が該当する。また、「アンチセンス核酸」とは、その構造に上記アンチセンス分子を含む核酸を指す。
【0040】
（１）アンチセンス分子
本発明によれば、アンチセンス核酸（以下、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、「ＡＳＯ」と称することもある）に使用される核酸分子が提供され、下記の式：
本発明によれば、アンチセンス核酸（以下、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、「ＡＳＯ」と称することもある）に使用される核酸分子が提供され、下記の式：
【0041】
【化12】
【0042】
〔式中、
Ｒ１は、水素原子、又は隣接する核酸との結合点であり；
Ｒ２は、水素原子、又は構造：
（式中、
は、隣接する核酸との結合点、又はＯＨであり；及び
Ｘは、Ｓ又はＯである）
であり；
Ｒ３は、水素、水酸基、又は置換基を有してもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ４は、カルバモイル基、又は置換若しくは未置換の芳香族基である〕
で表すことができる。
Ｒ１は、水素原子、又は隣接する核酸との結合点であり；
Ｒ２は、水素原子、又は構造：
【化13】
【化14】
Ｘは、Ｓ又はＯである）
であり；
Ｒ３は、水素、水酸基、又は置換基を有してもよい炭素数１～６のアルキル基であり；
Ｒ４は、カルバモイル基、又は置換若しくは未置換の芳香族基である〕
で表すことができる。
【0043】
「アルキル基」とは、直鎖、分枝鎖又は環状の１価の脂肪族飽和炭化水素基を指し、好ましくは炭素数１～６のアルキル基、より好ましは炭素数１～４のアルキル基、さらにより好ましくは炭素数１～３のアルキル基である。「アルキル基」としては、例えば、メチル基、エチル基、メトキシエチル基、アルキルカルバモイルエチル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。
【0044】
「カルバモイル基」とは、一般的には－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２で表される基であるが、本明細書で使用する場合、「カルバモイル基」には、限定されないが、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、及び窒素上に炭素数１～６の直鎖または分岐鎖または環状のアルキル基を有するもの、例えば、カルバモイル基（、Ｎ－メチルカルバモイル基、Ｎ－エチルカルバモイル基、Ｎ，Ｎ－ジメチルカルバモイル基、Ｎ，Ｎ－ジエチルカルバモイル基、Ｎ－ピロリジルカルボニル基、Ｎ－ピペリジルカルボニル基、Ｎ－モルホリニルカルボニル基などが含まれる。
【0045】
本明細書で使用する場合、「芳香族基」とは、芳香族化合物から一個の水素原子を除いた単環式環状構造又は縮合二環式環状構造を有する一価の基を意味する。単環式芳香族基は、環に５～１０個、好ましくは５～７個、更に好ましくは５～６個の炭素原子を有する。二環式芳香族基は、環に８～１２個、好ましくは９又は１０個の炭素原子を有する。芳香族基は未置換型であってもよく、又は置換基で置換された置換型であってもよい。二環式芳香族基には、構造内の環の１つが芳香族である環構造が含まれる。好ましい二環式芳香族基は、構造内の環が２つとも芳香族である環構造である。
【0046】
より具体的には、「芳香族基」としては、限定されないが、フェニル基、１－ナフチル基、２－ナフチル基、ピリジン－２－イル基、ピリジン－３－イル基、ピリジン－４－イル基、ピリミジン－２－イル基、ピリミジン－４－イル基、ピリミジン－５－イル基、ピラジン－２－イル基、ピリダジン－３－イル基、ピリダジン－４－イル基、フラン－２－イル基、フラン－３－イル基、チオフェン－２－イル基、チオフェン－３－イル基、ピロール－１－イル基、ピロール－２－イル基、ピロール－３－イル基、ピラゾール－１－イル基、ピラゾール－３－イル基、ピラゾール－４－イル基、ピラゾール－５－イル基、イミダゾール－１－イル基、イミダゾール－２－イル基、イミダゾール－４－イル基、イミダゾール－５－イル基などである。
【0047】
「芳香族基」に適用可能な置換基としては、限定されないが、アミノ基、ハロゲン基、アシル基、シアノ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アシルアミノ基、カルバモイル基、カルボキシ基、アシルオキシ基などが例示される。
【0048】
（２）アンチセンス核酸
本発明のアンチセンス核酸は、デオキシリボ核酸からなるギャップ領域、ならびに該ギャップ領域の５’及び３’末端に各々、２～１０個の２’－修飾又は２’，４’－修飾された核酸からなるウイング領域を有する架橋型のアンチセンス核酸であって、該ギャップ領域に本発明の上記アンチセンス分子を有することを特徴とする。
本発明のアンチセンス核酸は、デオキシリボ核酸からなるギャップ領域、ならびに該ギャップ領域の５’及び３’末端に各々、２～１０個の２’－修飾又は２’，４’－修飾された核酸からなるウイング領域を有する架橋型のアンチセンス核酸であって、該ギャップ領域に本発明の上記アンチセンス分子を有することを特徴とする。
【0049】
より具体的には、本発明のアンチセンス核酸は、標的とする核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるギャップ領域（「ＤＮＡ」からなる領域であって、各核酸同士を連結する結合様式は限定されないが、ホスホロチオエート結合又はホスホジエステル結合であり得、好ましくはホスホロチオエート結合である）（長さは任意であり得、好ましくは５～１５塩基）と、そのギャップ領域の両端にそれぞれ位置するウイング領域とからなる構造を有する従来のアンチセンス核酸に対して、該ギャップ領域において、該ギャップ領域において、本発明の上記アンチセンス分子が１個又は複数個が挿入され、及び／又は天然の塩基を有する核酸がそれにより置換されている。
【0050】
本発明のアンチセンス核酸を構成するウイング領域は、２’－修飾又は２’，４’－修飾された核酸を含む又はそれからなる（例えば、W. Brad Wan and Punit P. Seth, J. Med. Chem. 2016, 59, 9645-9667を参照されたい）。ウイング領域に含まれる２’，４’－修飾された核酸は好ましくは２～１０個である。また、各核酸同士を連結する結合様式もまた限定されないが、ホスホロチオエート結合又はホスホジエステル結合であり得、好ましくはホスホロチオエート結合である。なお、「ホスホロチオエート結合」は、天然の核酸間結合であるホスホジエステル結合のリン酸基の酸素原子の１つを硫黄原子に置換しホスホロチオエート化（ＰＳ化）したものである。
【0051】
本発明によれば、２’，４’－修飾された核酸は、限定されないが、下記の構造式：
【0052】
【化15】
【0053】
［式中、
Ｒ５は、各々独立して、水素原子、置換又は未置換のアルキル基、置換又は未置換のアラルキル基、置換又は未置換のアルケニル基、置換又は未置換のアルキニル基、及び置換又は未置換のアリール基からなる群から選択され；
Ｒ６は、Ｈ、又は構造：
Ｒ５は、各々独立して、水素原子、置換又は未置換のアルキル基、置換又は未置換のアラルキル基、置換又は未置換のアルケニル基、置換又は未置換のアルキニル基、及び置換又は未置換のアリール基からなる群から選択され；
Ｒ６は、Ｈ、又は構造：
【0054】
【化16】
【0055】
（式中、
【0056】
【化17】
【0057】
は、隣接する核酸との結合点、又はＯＨであり；及び
Ｙは、Ｓ又はＯである）
であり；
Ｒ7は、Ｈ、又は隣接する核酸との結合点であり；並びに
Ｂは、保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基を表す］
を有するものであってもよい。上記、Ｂは保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基を表す。核酸塩基としては、例えば、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、チミン、５－メチルシトシンなどの天然型核酸塩基の他、２－チオウラシル、２－チオチミン、２－チオシトシン、２－チオ－５－メチルシトシン、２，４－ジアミノプリン、６－チオグアニン、ウラシル－５－イル、７－デアザグアニン、７－デアザアデニン、３－デアザグアニン、３－デアザアデニンなどの非天然型核酸塩基、を挙げることができる。核酸塩基上に導入される保護基又は修飾基としては、アミノ基が１つ又は２つのアシル基で保護されるか、アミジン型保護基でもよい。ケト基の酸素原子が水酸基に互変異性化し、シアノエチル基、２－（４－ニトロフェニル）エチル基、２－ニトロベンジル基、アシルオキシメチル基などのアルキル基や、ジフェニルカルバモイル基などのアシル基などで保護されてもよい。ウラシル塩基及びチミン塩基にあっては、Ｎ３位がアルキル基、アシル基で保護されてもよい。また、上記天然型核酸塩基及び非天然型核酸塩基の炭素原子上にアミノ基、ハロゲン基、アシル基、シアノ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アシルアミノ基、カルバモイル基、カルボキシ基、アシルオキシ基など、あるいはそれらに蛍光性官能基、ビオチニル基、アミノ基、スピンラベルなどの置換基が含まれていてもよい。
Ｙは、Ｓ又はＯである）
であり；
Ｒ7は、Ｈ、又は隣接する核酸との結合点であり；並びに
Ｂは、保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基を表す］
を有するものであってもよい。上記、Ｂは保護基又は修飾基を有していてもよい核酸塩基の残基を表す。核酸塩基としては、例えば、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、チミン、５－メチルシトシンなどの天然型核酸塩基の他、２－チオウラシル、２－チオチミン、２－チオシトシン、２－チオ－５－メチルシトシン、２，４－ジアミノプリン、６－チオグアニン、ウラシル－５－イル、７－デアザグアニン、７－デアザアデニン、３－デアザグアニン、３－デアザアデニンなどの非天然型核酸塩基、を挙げることができる。核酸塩基上に導入される保護基又は修飾基としては、アミノ基が１つ又は２つのアシル基で保護されるか、アミジン型保護基でもよい。ケト基の酸素原子が水酸基に互変異性化し、シアノエチル基、２－（４－ニトロフェニル）エチル基、２－ニトロベンジル基、アシルオキシメチル基などのアルキル基や、ジフェニルカルバモイル基などのアシル基などで保護されてもよい。ウラシル塩基及びチミン塩基にあっては、Ｎ３位がアルキル基、アシル基で保護されてもよい。また、上記天然型核酸塩基及び非天然型核酸塩基の炭素原子上にアミノ基、ハロゲン基、アシル基、シアノ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アシルアミノ基、カルバモイル基、カルボキシ基、アシルオキシ基など、あるいはそれらに蛍光性官能基、ビオチニル基、アミノ基、スピンラベルなどの置換基が含まれていてもよい。
【0058】
公知の通り、天然核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）の糖部分は４つの炭素原子と１つの酸素原子とからなる５員環を有し、その糖部分はＮ型とＳ型の２種類のコンホメーションを取る。前述のＡＳＯの標的となるｍＲＮＡは主に糖鎖がＮ型でＡ型のらせん構造をとっているため、ＲＮＡに対する親和性を高めるという観点から、ＡＳＯの糖鎖もＮ型をとることが重要になる。このコンセプトのもとに開発されたのがＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ；２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン－架橋化核酸（２’，４’－ＢＮＡ／ＬＮＡ））の修飾核酸である。例えば、ＬＮＡにおいては、２’位の酸素と４’位の炭素とをメチレン基によって架橋することにより、そのコンホメーションはＮ型に固定され、コンホメーション間のゆらぎは生じない。そのため、ＬＮＡを数ユニット組み込んで合成されたオリゴヌクレオチドは、従来の天然の核酸で合成されたオリゴヌクレオチドに比べて、ＲＮＡに対する結合力や配列特異性が極めて高く、かつ、優れた耐熱性とヌクレアーゼ耐性とを示す。他の人工核酸もかかる特性を有していることから、本発明において利用可能である。本発明によれば、２’，４’－修飾された核酸は、ＬＮＡであることが好ましい。なお、本発明のアンチセンス核酸は、固相合成の周知技術を通して簡便にかつルーチンに製造することができる。
【0059】
（２）アンチ核酸治療薬
本発明のアンチセンス核酸は、標的核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくはＲＮＡ）に対して選択性が向上しており、さらに、アンチセンス核酸として活性化が維持されたものである。本発明によれば、一般的に使用されるアンチセンス核酸と同様に治療薬（医薬、製剤、又は医薬組成物）として提供することができる。本発明のアンチセンス核酸を治療薬として使用する場合、遺伝子疾患の種類は特に限定されない。アンチセンス核酸に組み込まれるギャップ領域を構成する「デオキシリボ核酸」は、生体内に存在するノンコーディングＲＮＡ（マイクロＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ等）、ｍＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ等を標的とすることができるため、これらの全配列又は一部配列を「標的核酸」として、標的核酸の塩基配列に完全に又は十分に相補的な塩基配列からなる一本鎖核酸を含むアンチセンス核酸を標的核酸に対応した遺伝子疾患を治療及び／又は予防するための治療薬として用いることができる。また、デオキシリボ核酸の長さは、一般的に、１０塩基程度が適切であるが、５～１５塩基の範囲であれば特に限定されない。好ましくは８～１０塩基、より好ましくは１０塩基である。
本発明のアンチセンス核酸は、標的核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくはＲＮＡ）に対して選択性が向上しており、さらに、アンチセンス核酸として活性化が維持されたものである。本発明によれば、一般的に使用されるアンチセンス核酸と同様に治療薬（医薬、製剤、又は医薬組成物）として提供することができる。本発明のアンチセンス核酸を治療薬として使用する場合、遺伝子疾患の種類は特に限定されない。アンチセンス核酸に組み込まれるギャップ領域を構成する「デオキシリボ核酸」は、生体内に存在するノンコーディングＲＮＡ（マイクロＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ等）、ｍＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ等を標的とすることができるため、これらの全配列又は一部配列を「標的核酸」として、標的核酸の塩基配列に完全に又は十分に相補的な塩基配列からなる一本鎖核酸を含むアンチセンス核酸を標的核酸に対応した遺伝子疾患を治療及び／又は予防するための治療薬として用いることができる。また、デオキシリボ核酸の長さは、一般的に、１０塩基程度が適切であるが、５～１５塩基の範囲であれば特に限定されない。好ましくは８～１０塩基、より好ましくは１０塩基である。
【0060】
本明細書において、「（標的核酸の塩基配列に対して）十分に相補的な塩基配列からなる（一本鎖核酸）」とは、標的核酸の塩基配列の５０％以上１００％未満、好ましくは６０％以上１００％未満、より好ましくは７０％以上１００％未満、さらに好ましくは８０％以上１００％未満、さらにより好ましくは９０％以上１００％未満の塩基と対合し得る塩基配列からなるものであり得る。より具体的には、標的核酸の塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列からなる核酸鎖において、例えば、１又は２～４の塩基を他の塩基に置換した結果、その置換した位置におけるヌクレオチド残基が対合できなくなった場合（この場合、他の塩基に置換した位置を「ミスマッチ部位」という）；標的核酸の塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列からなる核酸鎖において、例えば、１又は２～４の塩基を欠失した結果、その欠失した位置におけるヌクレオチド残基が対合できなくなった場合等を挙げることができる。
【0061】
本発明のアンチセンス核酸を医薬組成物として使用する場合、有効成分としてのアンチセンス核酸の他、医薬として許容される担体、希釈剤、又は賦形剤等を含めることができる。用語「医薬として許容される」とは、患者に投与したとき、生理学的に忍容性であり、かつ一般的に急性胃蠕動等のアレルギー性反応又は類似の有害な反応を生じさせない分子実体及び組成物を指す。用語「担体」は、化合物とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。かかる医薬用担体は、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等の石油、動物、植物、又は合成起源の油を含む油及び水等の不活性液体であってよい。水又は生理食塩水、並びに水性デキストロース及びグリセロール水溶液は、担体として、特に注射液として使用されることが好ましい。
【0062】
本発明のより具体的な実施形態では、医薬として許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、及び／又は担体とともに治療有効量のアンチセンス核酸を含む医薬組成物が提供される。かかる組成物は、様々な緩衝物（例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ及びイオン強度の希釈剤、洗剤及び可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ポリソルベート８０）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）、及びバルク物質（例えば、ラクトース、マンニトール）等の添加剤を含む。また、医薬組成物は、液体形態で調製されてもよく、凍結乾燥形態等の乾燥粉末であってもよい。
【0063】
本発明に従って提供される医薬組成物は、限定されないが、注入、経口、肺、又は鼻経路によって投与されることが好ましい。さらには、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、又は皮下投与経路によって送達されることがより好ましい。
【0064】
（４）キット
本発明は、遺伝子疾患を有する患者を治療及び／又は予防するためのキットであって、好適な容器に包装されている少なくとも１つのアンチセンス核酸と、その使用説明書とを含むキットを提供する。
本発明は、遺伝子疾患を有する患者を治療及び／又は予防するためのキットであって、好適な容器に包装されている少なくとも１つのアンチセンス核酸と、その使用説明書とを含むキットを提供する。
【0065】
キットの内容物は、凍結乾燥されていてもよく、また、キットは、凍結乾燥されている成分を再構成するための好適な溶媒をさらに含んでいてもよい。キットの個々の成分は、別々の容器に包装され、かかる容器とともに、医薬品又は生物学的製品の製造、使用、又は販売を規制する政府機関によって定められている形態の通知であって、ヒトへの投与についての製造、使用、又は販売を規制する機関による認可を反映している通知を添付してもよい。
【0066】
キットの成分が１つ以上の液体溶液で提供される場合、前記液体溶液は、水溶液、例えば無菌水溶液であってよい。インビボで使用する場合、発現構築物を医薬として許容される注射用組成物に製剤化してもよい。この場合、容器手段は、単体で吸入器、注射器、ピペット、点眼器、又は他の同様の装置であってよく、これらから、動物の罹患領域に製剤を適用したり、動物に注射したり、更にはキットの他の成分に適用し、それと混合したりすることができる。
【0067】
また、キットの成分は、乾燥形態又は凍結乾燥形態で提供されてもよい。試薬又は成分が乾燥形態として提供されるとき、一般的に、好適な溶媒の添加によって再構成が行われる。また、溶媒は、別の容器手段で提供されてもよいことが想到される。容器の数又は種類にかかわらず、本発明のキットは、動物の体内に最終的な複雑な組成物を注射／投与又は配置するのを補助するための機器を含むか、又はこれらと共に包装されてもよい。かかる機器は、吸入器、注射器、ピペット、ピンセット、計量スプーン、点眼器、又は任意の医学的に認められている送達ビヒクルであってもよい。
【0068】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。なお、本実施例で使用した試薬、合成及び精製装置、核酸オリゴマー、測定機器、培養細胞等については、実施例の最後にまとめて記載した。
【実施例0069】
実施例１：２－Ｎ－（ピリジン－２－イル）－グアニン（Ｇ
Ｐｙ
）および２－Ｎ－カルバモイルデオキシグアノシン（Ｇ
ｃｍ
）を導入したオリゴデオキシヌクレオチドの合成
スキーム１および２に従って合成されたホスホロアミダイトユニットを用いて、表１に示すような１６塩基のＬＮＡギャップマー型のアンチセンス核酸を合成した。このアンチセンス核酸の標的遺伝子はｈｕｍａｎ ｍａｌａｔ－１（以下、ｈＭＡＬＡＴ）である。３’末端から８塩基目のｄＧにＧＰｙとＧｃｍを導入したアンチセンス核酸、または３’末端から８塩基目のｄＧが欠損したアンチセンス核酸（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）をそれぞれ合成した。ここで下線部はＬＮＡを示し、ｄで示した部分はＤＮＡである。また配列中Ｃで示した塩基はＤＮＡの場合もＬＮＡの場合も５－メチルシトシンである。ＰＳはインターヌクレオチド結合がすべてホスホロチオエートであることを示している。
スキーム１および２に従って合成されたホスホロアミダイトユニットを用いて、表１に示すような１６塩基のＬＮＡギャップマー型のアンチセンス核酸を合成した。このアンチセンス核酸の標的遺伝子はｈｕｍａｎ ｍａｌａｔ－１（以下、ｈＭＡＬＡＴ）である。３’末端から８塩基目のｄＧにＧＰｙとＧｃｍを導入したアンチセンス核酸、または３’末端から８塩基目のｄＧが欠損したアンチセンス核酸（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）をそれぞれ合成した。ここで下線部はＬＮＡを示し、ｄで示した部分はＤＮＡである。また配列中Ｃで示した塩基はＤＮＡの場合もＬＮＡの場合も５－メチルシトシンである。ＰＳはインターヌクレオチド結合がすべてホスホロチオエートであることを示している。
【0070】
【表1】
【0071】
ｄＧおよびｄｅｌｅｔｉｏｎはＤＮＡ自動合成機を用いて、ホスホロアミダイト法に従い固相合成をおこなった。また、ＧｐｙおよびＧｃｍは自動合成機とマニュアル合成を併用し、ホスホロアミダイト法に従って固相合成をおこなった。まず、３’末端から修飾核酸（ＧＰｙ、Ｇｃｍ）の手前の塩基まで５’－ｄ（ＡＴＡＡ）ＴＧＴ－３’（配列番号５）の保護体を、自動合成機を用いて固相担体上に合成した。次に、ＧｐｙまたはＧｃｍをそれぞれマニュアル合成によってアンチセンス核酸に導入した（５’－ｄ（ＸＡＴＡＡ）ＴＧＴ－３’（配列番号６）；Ｘ＝ＧＰｙ、Ｇｃｍ）。マニュアル合成では、アルゴン風船をつけた三方コックで密封したガラスフィルター（以下、固相筒）に自動合成機で合成したオリゴヌクレオチドが担持された固相担体を移し、脱ＤＭＴｒ反応、カップリング反応、硫化の順で反応させ、乾燥させたのちに固相筒の中身を自動合成機用の空カラムに移した。そして、再び自動合成機を用いて目的のアンチセンス核酸をそれぞれ最後の５’末端まで合成した（５’－ＣＡＴｄ（ＡＴＧＣＡＸＡＴＡＡ）ＴＧＴ－３’（配列番号７）；Ｘ＝Ｇｐｙ、Ｇｃｍ）。
【0072】
その後、２８％アンモニア水を用いて固相担体から各アンチセンス核酸を切り出し、５５℃で１２時間または１６時間という条件で塩基部（Ａ、Ｇ、Ｃ）の脱保護を行った。その後、逆相カートリッジカラムＳｅｐ－Ｐａｋを用いて、ＤＮＡ鎖の簡易精製および５’末端ＤＭＴｒ基の脱保護を行い、逆相ＨＰＬＣでの精製を行った。合成したアンチセンス核酸はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによって質量分析を行い、目的物が合成できたことをそれぞれ確認した。
【0073】
実施例２：アンチセンス活性
実施例１で合成した各オリゴデオキシヌクレオチドについて、アンチセンス活性を測定した。ピリジル基は立体障壁により塩基対の結合を阻害することでミスマッチ塩基対の識別能が向上すると期待される一方で、標的遺伝子との結合を阻害してしまう可能性もあるため、アンチセンス活性の低下が危惧される。しかし、アンチセンス活性を維持することができれば、塩基部へのピリジル基修飾はアンチセンス核酸の開発においてより有用な選択肢となり得る。
実施例１で合成した各オリゴデオキシヌクレオチドについて、アンチセンス活性を測定した。ピリジル基は立体障壁により塩基対の結合を阻害することでミスマッチ塩基対の識別能が向上すると期待される一方で、標的遺伝子との結合を阻害してしまう可能性もあるため、アンチセンス活性の低下が危惧される。しかし、アンチセンス活性を維持することができれば、塩基部へのピリジル基修飾はアンチセンス核酸の開発においてより有用な選択肢となり得る。
【0074】
Ｈｅｌａ細胞を９６ウェルプレートに播種し（２０，０００細胞／１００μＬ／ウェル）、コンフルエンシーが６０％以上になるまで培養した。次に、それぞれのウェルに、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とともにアンチセンス核酸を添加し、２４時間培養することでトランスフェクションをおこなった。アンチセンス核酸は各ウェルにそれぞれ０．０１／０．１／１．０／２．５ｎＭとなるように添加した。そして、トランスフェクションの後、各ウェルの細胞をホモジナイズし、ＲＮＡ抽出を行った。最後に、ＲＮＡの変性、ゲノムＤＮＡ除去、逆転写反応をおこなった後に、リアルタイムＰＣＲを行うことで、アンチセンス核酸の標的遺伝子であるｈＭＡＬＡＴとハウスキーピング遺伝子の一種であるＧＡＰＤＨのＣｔ値をそれぞれ測定した。そして、Ｃｔ値からアンチセンス活性を評価する指標としてｈＭＡＬＡＴの発現量（％）を算出した。以上の手順にしたがい、各条件で３サンプルずつ測定をおこなった。その結果を図１に示す。また、ネガティブコントロール（ＮＣ）の＃３、ポジティブコントロール（ＰＣ）の＃１９を比較対象として用いた。＃３はｈＲｌｕｃを標的とした配列で５’－ＣＡＴｄ（ＡＴＧＣＡＧＡＴＡＡ）ＴＧＴ－３’（配列番号１）、＃１９はｈｕｍａｎ ｍａｌａｔ－１を標的としたｄＧと同様の配列５’－ＴＣＧｄ（ＧＡＡＴＣＡＴＡＧＴ）ＡＧＴ－３’（配列番号８）である。
【0075】
ＧＰｙの１ｎＭにおけるｈＭＡＬＡＴの発現量は５５％にまで減少しており、２．５ｎＭでは２５％にまで低減するほどのアンチセンス活性がみられた。２．５ｎＭでの活性の大きさはｄＧ（２３％）やポジティブコントロール（３０％）に匹敵する。したがって、塩基部へのピリジル基による修飾（ＧＰｙ）はアンチセンス活性を維持することができるといえる。Ｇｃｍの１ｎＭにおけるｈＭＡＬＡＴの発現量は４７％にまで減少し、この活性はＧＰｙよりも高いものであった。Ｇｃｍの２．５ｎＭでは３５％にまで発現量が減少しており、これはＧＰｙの活性には劣る結果であったが、ＰＣ（＃１９）の３０％という発現量の低下に匹敵する結果であるため、充分な活性があるといえる。したがって、塩基部へのカルバモイル基による修飾（Ｇｃｍ）もアンチセンス活性を維持することができるといえる。ｄｅｌｅｔｉｏｎはいずれの濃度においても１００％以上であったため、０．０１～２．５ｎＭではアンチセンス活性を持たないことが示唆された。
【0076】
さらに、ｈＭＡＬＡＴの発現量の結果を用いてＩＣ５０を算出した（表２）。ＩＣ５０とはｈＭＡＬＡＴの発現量が５０％となるとときのアンチセンス核酸の濃度を示す値であり、アンチセンス活性の大きさの指標となる。ｈＭＡＬＡＴ発現量が５０％となる前後のアンチセンス核酸の濃度の対数の値を取り、グラフ上で直線を引くことでＩＣ５０を求めた。ｄｅｌｅｔｉｏｎに関しては、発現量が５０％以下になる濃度がなかったため、ＩＣ５０は求められなかった。
【0077】
【表2】
【0078】
ＩＣ５０の結果より、ｄＧ（ＩＣ５０＝０．５５ｎＭ）は最もアンチセンス活性が大きく、それに次いでＧｃｍ（ＩＣ５０＝０．９１ｎＭ）、ＧＰｙ（ＩＣ５０＝１．１８ｎＭ）の順でアンチセンス活性が大きかった。ＩＣ５０を比較した結果、ｄｅｌｅｔｉｏｎを除くいずれのアンチセンス核酸も１．２ｎＭ以下であることから、ピリジル基およびカルバモイル基の導入はアンチセンス活性の高さに小さな影響しか及ぼさず、その活性を維持することができるといえる。
【0079】
実施例３：二重鎖融解温度測定
Ｇｃｍはｏｐｅｎ－ｃｌｏｓｅｄ型の構造をとることによって、ミスマッチ塩基対の識別能を高めることが知られている（Sasami, T.、前掲）。そこで、Ｇｃｍと同様のｏｐｅｎ－ｃｌｏｓｅｄ型の構造を持つＧＰｙも、ミスマッチ塩基対の識別能を向上させると期待される。これは核酸医薬品の開発において、アンチセンス核酸が非標的遺伝子に結合する可能性を減らし、オフターゲット効果や副作用を抑制するために必要な性質である。
Ｇｃｍはｏｐｅｎ－ｃｌｏｓｅｄ型の構造をとることによって、ミスマッチ塩基対の識別能を高めることが知られている（Sasami, T.、前掲）。そこで、Ｇｃｍと同様のｏｐｅｎ－ｃｌｏｓｅｄ型の構造を持つＧＰｙも、ミスマッチ塩基対の識別能を向上させると期待される。これは核酸医薬品の開発において、アンチセンス核酸が非標的遺伝子に結合する可能性を減らし、オフターゲット効果や副作用を抑制するために必要な性質である。
【0080】
そこで、実施例１で合成した各アンチセンス核酸について、標的配列（Ｐｅｒｆｅｃｔｍａｔｃｈ；ＰＭ）またはミスマッチ塩基を含む配列（Ｍｉｓｍａｔｃｈ；ＭＭ）をもつ相補鎖ＲＮＡとの二重鎖融解温度（Ｔｍ）を測定することで、それぞれの化学修飾が二重鎖安定性およびミスマッチ塩基対識別能に与える影響を評価した。
【0081】
本実験では、下記に示すように、Ｘの位置にｄＧ、Ｇｐｙ、Ｇｃｍを、Ｎの位置にＣ、Ｕ、Ａ、Ｇを導入し、それ以外は相補的な配列となるような１６種類の二重鎖を用意した。
【0082】
二重鎖融解温度（Ｔｍ）測定に用いたアンチセンス核酸（上）とＲＮＡ（下）
５’－ＣＡＴｄ（ＡＴＧＣＡＸＡＴＡＡ）ＴＧＴ－３’（Ｘ＝ｄＧ、ＧＰｙ、Ｇｃｍ、ｄｅｌｅｔｉｏｎ）（配列番号９）
５’－ｒ（ＧＵＡＵＡＣＧＵＮＵＡＵＵＡＣＡ）－５’（Ｎ＝Ｃ、Ｕ、Ａ、Ｇ）（配列番号１０）
５’－ＣＡＴｄ（ＡＴＧＣＡＸＡＴＡＡ）ＴＧＴ－３’（Ｘ＝ｄＧ、ＧＰｙ、Ｇｃｍ、ｄｅｌｅｔｉｏｎ）（配列番号９）
５’－ｒ（ＧＵＡＵＡＣＧＵＮＵＡＵＵＡＣＡ）－５’（Ｎ＝Ｃ、Ｕ、Ａ、Ｇ）（配列番号１０）
【0083】
ここで、Ｎ＝Ｃの二重鎖はＸ－Ｎがマッチ塩基対（Ｇ－Ｃ、ＧＰｙ－Ｃ、Ｇｃｍ－Ｃ）を形成しており、Ｎ＝Ｕ、Ａ、Ｇの二重鎖はミスマッチ塩基対（Ｇ－Ｕ、Ｇ－Ａ、Ｇ－Ｇなど）を形成する。また、アンチセンス核酸に含まれるＣは５－メチルシトシンを表し、ＲＮＡ中のＣはシトシンを表している。ｄで示した部分はＤＮＡであり、ｒで示した部分はＲＮＡである。また、下線部はＬＮＡを表す。
【0084】
まず、各二重鎖が２．０μＭになるようにリン酸バッファー（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）へと溶解し、９５℃で３分間加熱した後に室温で１時間静置した。次に、紫外可視光光度計（島津製作所）を用いて１５℃から＋０．５℃／分で９５℃まで上昇させたのち、９５℃から－０．５℃／分で１５℃まで下降させることで、その際のＵＶ吸収値の変化から二重鎖融解温度（Ｔｍ）を求めた。そして、以上の手順にしたがって３回のＴｍ測定をおこなった。その平均値を図２に示す。
【0085】
さらに、各化学修飾がＰＭの二重鎖安定性に与える影響を評価するために、ＰＭ（Ｎ＝Ｃ）における、ｄＧと各アンチセンス核酸（ＧＰｙ、Ｇｃｍ、ｄｅｌｅｔｉｏｎ）とのＴｍ値の差（ΔＴｍ
＊）を算出した。その結果を表３に示す。すなわちＸをＧｐｙ、Ｇｃｍ、ｄｅｌｅｔｉｏｎ ΔＴｍ
＊＝Ｔｍ（Ｘ－Ｃ）－Ｔｍ（ｄＧ－Ｃ）である。したがって、ΔＴｍ
＊がマイナスの値である場合は、ｄＧよりも二重鎖が不安定化したといえる。
【0086】
【表3】
【0087】
ＰＭ（Ｎ＝Ｃ）のＴｍを比較するとＧｃｍ（５２．０℃）＞ｄＧ（５１．３℃）＞ＧＰｙ（４６．８℃）＞ｄｅｌｅｔｉｏｎ（３０．５℃）となっている。表３からも分かるように、ＧＰｙのＴｍはｄＧと比べて－４．５℃と低下しており、ピリジル基はＰＭの二重鎖構造をやや不安定化する。この結果は先行研究（－２．４℃の不安定化）とも一致していた（Inde, T、前掲）。しかし、アンチセンス活性が最適化されるＴｍの至適範囲は約１０℃であることが知られており（Papargyri, N.; Pontoppidan, M.; Andersen, M. R.; Koch, T.; Hagedorn, P. H. Mol Ther Nucleic Acids. 2019, 19, 706-717）、ピリジル基による二重鎖構造の不安定化はアンチセンス活性に大きな影響を及ぼさないと期待される。これは、ピリジル基がアンチセンス活性に小さな影響しか及ぼさなかったという結果とも一致している。
【0088】
一方で、表３からも分かるように、ＧｃｍのＴｍ（５２．０℃）はｄＧのＴｍ（５１．３℃）と比べて＋０．７℃と向上しており、カルバモイル基の導入はＰＭの二重鎖構造をやや安定化する。この結果は、カルバモイル基がアンチセンス活性に小さな影響しか及ぼさないという結果を裏付ける。
【0089】
次に、各化学修飾がＭＭの二重鎖安定性に与える影響、すなわちミスマッチ塩基対の識別能を評価するために、ＰＭ（Ｎ＝Ｃ）とＭＭ（Ｎ＝Ｕ、Ａ、Ｇ）とのＴｍの差（ΔＴｍ
＊＊）をそれぞれのアンチセンス核酸ごとに算出した。その結果を表４に示す。すなわちＸをｄＧ、ＧＰｙ、Ｇｃｍ、ｄｅｌｅｔｉｏｎ、Ｎを相補鎖ＲＮＡ上の塩基とするとΔＴｍ
＊＊＝（Ｔｍ（Ｘ－Ｎ）－Ｔｍ（Ｘ－Ｃ）である。したがって、ΔＴｍ
＊＊がマイナスの値である場合は、ＰＭに比べてＭＭの二重鎖が不安定化したといえる。
【0090】
【表4】
【0091】
そして、ΔＴｍ
＊＊のマイナスの度合いが大きいほど、ＰＭに比べてＭＭの二重鎖が大きく不安定化したことを示しており、ミスマッチ塩基対の識別能が高いといえる。また、表４におけるＣ、Ｕ、Ａ、Ｇはそれぞれ相補鎖ＲＮＡのＮの塩基を表している。太字の数字は各アンチセンス核酸におけるΔＴｍ
＊＊の最大値、すなわち各アンチセンス核酸において最も安定なＭＭ二重鎖のΔＴｍ
＊＊値を示している。これは、ミスマッチ塩基識別能を比較する指標になると考えられるため、ｄＧ（ΔＴｍ
＊＊＝－１１．８℃）＞Ｇｃｍ（ΔＴｍ
＊＊＝－１０．１℃＞＞ＧＰｙ（ΔＴｍ
＊＊＝－３．５℃）＞＞ｄｅｌｅｔｉｏｎ（ΔＴｍ
＊＊＝７．６℃）の順で塩基識別能が高いといえる。これより、ＧＰｙはミスマッチ塩基対識別能がｄＧよりも低いことが明らかになった。一方で、Ｇｃｍはミスマッチ塩基識別能がｄＧと同程度であることが明らかになった。
【0092】
さらに、各化学修飾がミスマッチ塩基対の識別能に与える影響を詳しく評価するために、ｄＧと各アンチセンス核酸（ＧＰｙ、Ｇｃｍ、ｄｅｌｅｔｉｏｎ）とのΔＴｍ
＊＊の差（ΔΔＴｍ）を算出した。その結果を表５に示す。ΔΔＴｍ＝（Ｇｐｙ、Ｇｃｍ、ｄｅｌｅｔｉｏｎのΔＴｍ
＊＊値）－（ｄＧのΔＴｍ
＊＊値）である。したがって、ΔΔＴｍがマイナスの値である場合は、ｄＧに比べてミスマッチ塩基対の識別能が向上したといえる
【0093】
【表5】
【0094】
ΔΔＴｍがプラスの値である場合は、ｄＧに比べてミスマッチ塩基対の識別能が低下したといえる。そして、ΔΔＴｍのプラスの値が大きいほど、ミスマッチ塩基対の識別能が大きく低下していることを示す。また、Ｃ、Ｕ、Ａ、Ｇは相補鎖ＲＮＡのＮの塩基を示す。
【0095】
表５から分かるように、ＧｐｙのΔΔＴｍ
＊＊は全ての相補鎖ＲＮＡにおいてプラスの値（９．０、９．０、７．６）であり、ピリジル基による修飾がミスマッチ塩基対識別能を低下させるといえる。ＧｐｙがＧｃｍと同様のｏｐｅｎ－ｃｌｏｓｅｄ型構造をとるにも関わらず、ピリジル基修飾によって塩基識別能が低下する、という結果は予想と反する。しかし、この結果はピリジル基を導入したＤＮＡ二重鎖のＴｍ測定結果（Inde, T.、前掲）と一致している。ピリジル基による修飾がミスマッチ塩基対との二重鎖を安定化させた要因としては、芳香族環と相補鎖側塩基との非特異的なスタッキング相互作用などが考えられる。
【0096】
一方で、ＧｃｍのΔΔＴｍ
＊＊は－０．４℃（Ｎ＝Ｕ）、－０．１℃（Ｎ＝Ａ）、１．７℃（Ｎ＝Ｇ）であり、カルバモイル基による修飾がミスマッチ塩基識別能をやや向上させる、または維持させるといえる。この結果に対し先行研究では、ＧｃｍをＤＮＡ二重鎖に導入した場合のΔΔＴｍが－３．６℃になっており、２’－ＯＭｅ修飾に導入した場合には－４．２℃になったと報告されている（Papargyri, N.、前掲）。したがって、先行研究では、カルバモイル基の導入によって、本実験よりもミスマッチ塩基識別能が向上していたといえる。この少しの結果の不一致は、塩基配列の違いやＬＮＡおよび２－ＯＭｅ修飾（Papargyri, N.、前掲）の有無によって生じた、二重鎖安定性の違いがもたらしたものだと考えられる。先行研究と比較して、ＰＭにおけるＴｍに１．２℃（５２．０℃と５０．８℃（Papargyri, N.、前掲））の差があることからも、塩基配列の違いや各化学修飾の有無によって二重鎖安定性に違いが生じたといえる。そして、この二重鎖安定性の違いがΔＴｍ
＊＊やΔΔＴｍに影響が与えたのだと考えられる。
【0097】
また、表５から分かるように、Ｇ－Ｇミスマッチ塩基対配列におけるＧｃｍのΔΔＴｍ
＊＊は＋１．７℃であり、Ｇ－Ｕミスマッチ（ΔΔＴｍ
＊＊＝－０．４℃）やＧ－Ａミスマッチ（ΔΔＴｍ
＊＊＝－０．１℃）よりもミスマッチ塩基対識別能がｄＧに対してやや低下していた。したがって、カルバモイル基を導入した修飾核酸はＧ－Ｇミスマッチ塩基対を最も識別しづらいといえる。これはＧ－Ｇミスマッチ塩基対を形成するための水素結合がカルバモイル基と離れており（下記参照）、その水素結合を形成するためのエネルギーにカルバモイル基が関与しないためだと考えられる。
【0098】
【化18】
【0099】
本実施例験において、ｄｅｌｅｔｉｏｎを除くアンチセンス核酸のＴｍ値は、約４０～５０℃Ｃの範囲で算出されており、生体内に比べると高い温度での塩基対識別能を評価しているといえる。
【0100】
実施例４：ＲＮａｓｅＨによる切断活性評価
実施例１で合成した各アンチセンス核酸および５’末端に蛍光標識（ＦＡＭ）がついた相補鎖ＲＮＡ（３’－ＡＣＡＵＵＡＵＹＵＧＣＡＵＡＵＧ－５’（配列番号１１）；Ｙ＝Ｃ／Ｕ）を用いて、ＲＮａｓｅＨによる切断活性を評価した。Ｙはアンチセンス核酸に含まれる修飾核酸と塩基対を形成する位置である。
実施例１で合成した各アンチセンス核酸および５’末端に蛍光標識（ＦＡＭ）がついた相補鎖ＲＮＡ（３’－ＡＣＡＵＵＡＵＹＵＧＣＡＵＡＵＧ－５’（配列番号１１）；Ｙ＝Ｃ／Ｕ）を用いて、ＲＮａｓｅＨによる切断活性を評価した。Ｙはアンチセンス核酸に含まれる修飾核酸と塩基対を形成する位置である。
【0101】
まず、各アンチセンス核酸と相補鎖ＲＮＡを６０℃で２分間加熱した後に３７℃で３０分静置することでアニーリングをおこなった。次に、アニーリングさせた各サンプルにＲＮａｓｅＨを添加し、３７℃で反応を開始した。そして、反応開始から５分後にサンプリングし、ローディングバッファー（１０Ｍ尿素、５０ｍＭエチレンジアミン四酢酸・２Ｎａ、０．１ｗｔ％ブロモフェノールブルー）を加え－３０℃で保存することにより反応を停止させた。各アンチセンス核酸とＲＮＡは終濃度がそれぞれ２００ｎＭで、ＲＮａｓｅＨは０．５ｍＵ／μＬとなるように調製した。最後に、各サンプルをラダーとともにゲルシフトアッセイに供することで解析を行った。このゲルシフトアッセイ結果を図３に示す。Ｌａｄｄｅｒは９、１１、１３ｍｅｒのＲＮＡを混合し、それぞれ１００ｎＭとなるように調製した。左から２番目のレーンはコントロールであり、アンチセンス核酸を加えずに反応をおこなったサンプルである。コントロールのＲＮＡの終濃度は１００ｎＭとなるように調製した。また、左に示したａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆはＬａｄｄｅｒの鎖長から想定される二重鎖の切断箇所である。そして、想定される二重鎖の切断箇所は図４に示した。ＡＳＯはアンチセンス核酸を示しており、丸が一つ一つの核酸を示している。ＡＳＯの核酸を示す丸のうち、修飾核酸の導入位置はＧと示した。点線で囲んだ部分は、二重鎖の中でＲＮａｓｅＨが認識すると考えられる６塩基を示す。また、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆで示した６パターンの位置は、ＲＮａｓｅＨが相補鎖ＲＮＡの切断を引き起こすと想定される切断箇所である。
【0102】
図３でみられるように、Ｐｅｒｆｅｃｔｍａｔｃｈ（ＰＭ）において、ｄＧではｅの位置での切断が最も多くみられた。一方で、ＧＰｙやＧｃｍではｅでの切断が抑制されており、ａやｂでの切断が多くみられた。図４でみられるように、ｅは修飾塩基（ＧＰｙ、Ｇｃｍ）の導入位置に近い切断箇所であるため、修飾塩基のかさ高さによりＲＮａｓｅＨによる切断が起こりづらくなっている可能性が考えられる。そして、この結果より、ピリジル基およびカルバモイル基の導入によって、アンチセンス核酸の切断箇所が減少することが明らかになった。これにより、アンチセンス核酸の標的ＲＮＡに対する選択性が向上する可能性があると考えられる。
【0103】
Ｍｉｓｔｍａｔｃｈ（ＭＭ）においては、ｄＧにおいてＰＭでみられたｅの位置での切断が抑制されており、ａやｂでの切断が増加していた。ｅの切断箇所はミスマッチ塩基対と近いため、ミスマッチ塩基対による立体構造の変化によりＲＮａｓｅＨによる切断が起こりづらくなったと考えられる。
【0104】
次に、ゲルシフトアッセイの結果から、完全長ＲＮＡの存在比（％）についてｉｍａｇｅＪを用いて算出した。その結果を表６に示す。
【0105】
【表6】
【0106】
ＰＭにおいて、ＧＰｙでは反応時間５分における完全長ＲＮＡの存在比が１９．３％になっており、これはｄＧ（１９．０％）と同等である。さらに、Ｇｃｍも２２．２％となっており、ＧＰｙにはやや劣るがｄＧ（１９．０％）とほぼ同等であるといえる。したがって、ピリジル基およびカルバモイル基を導入したアンチセンス核酸はＲＮａｓｅＨ切断活性の高さを維持できるといえる。この結果は、ＧＰｙやＧｃｍがｄＧと同等のアンチセンス活性を維持したという結果を裏付ける。また、ｄｅｌｅｔｉｏｎに関して、完全長ＲＮＡの存在比が１７．９％になっており、ｄＧと同等の切断活性を持つことが明らかになった。しかし、図１に示すようにｄｅｌｅｔｉｏｎはｄＧに比べてアンチセンス活性がはるかに小さかった。したがって、ｄｅｌｅｔｉｏｎは一旦二重鎖を形成すれば効率よく標的ＲＮＡを切断できる一方、二重鎖安定性（Ｔｍ）が低いため細胞中でなおアンチセンス活性は低下したと考えられる。
【0107】
次に、各アンチセンス核酸のミスマッチ塩基対の識別能を評価するため、ＰＭとＭＭとの間における完全長ＲＮＡ存在比（％）の差を算出した（表７）。差の値が大きいほど、ミスマッチ塩基対の存在下（ＭＭ）で完全長ＲＮＡの存在比がＰＭに比べて増加したことを示しており、ミスマッチ塩基対の識別能が高いといえる。
【0108】
【表7】
【0109】
Ｇｐｙでは、完全長ＲＮＡ存在比の差が１０．９であり、ｄＧ（－１．７）やＧｃｍ（－０．７）よりも大きかった。さらに表６からも分かるように、ＭＭにおいてＧＰｙではＲＮａｓｅＨにより切断されずに残った完全長ＲＮＡが最も多かった。したがって、ＧＰｙにおけるＲＮａｓｅＨ切断活性はミスマッチ塩基対の影響を最も強く受け、ＲＮａｓｅＨによる切断に関してはピリジル基による修飾がミスマッチ塩基対識別能を向上させたと考えられる。しかし、この結果は、二重鎖安定性（Ｔｍ）の評価においてピリジル基がミスマッチ塩基対識別能を低減させたという結果とは一致しない。これは、ピリジル基によるかさ高さが、ミスマッチ塩基対を含む二重鎖の不安定化よりも、その二重鎖を形成した後のＲＮａｓｅＨの結合や切断の抑制に大きな影響を与える可能性を示唆している。
【0110】
実施例１～４では、芳香族環を持つピリジル基修飾されたグアニン（ＧＰｙ）を導入することによるアンチセンス活性およびミスマッチ塩基対の識別能への影響に着目し、アンチセンス活性、二重鎖安定性およびＲＮａｓｅＨ切断活性の評価をおこなった。また、比較としてミスマッチ塩基対の識別能が高まったと報告されている（Sasami, T.；佐々見武志、前掲）。カルバモイル基で修飾されたグアニン（Ｇｃｍ）を導入したアンチセンス核酸および、Ｇを１塩基欠損したアンチセンス核酸（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）についても同様の評価をおこない、ピリジル基による修飾がアンチセンス核酸の特性に与える影響を結論づけた（表８）。
【0111】
【表8】
【0112】
合成した各アンチセンス核酸の活性をリアルタイムＰＣＲで評価した結果、ＧＰｙやＧｃｍはｄＧやポジティブコントロールに匹敵するほど標的遺伝子ｈｕｍａｎ ｍａｌａｔ－１の発現を抑制した。したがって、ピリジル基およびカルバモイル基による修飾核酸はアンチセンス活性にほとんど影響を与えず、高い活性を維持できることが示唆された。この結果は、アンチセンス核酸の開発におけるピリジル基やカルバモイル基の有用性を示している。次に、二重鎖安定性の評価をおこなった結果、ＧＰｙはｄＧと比べてＴｍを１修飾あたり－４．５℃低下させることが明らかになった。また、ＧＰｙはミスマッチ塩基対を含む二重鎖を不安定化させたが、その不安定化の度合いはｄＧやＧｃｍの方が大きかった。したがって、ピリジル基による修飾はミスマッチ塩基識別能を低下させることが明らかになった。これは先行研究（Inde, T.、前掲）とも一致しており、ＧＰｙがｄＧやＧｃｍよりもミスマッチ塩基対の形成を安定化した要因として、ピリジル基が持つ芳香族環による相補鎖とのスタッキング相互作用が考えられる。最後に、ＲＮａｓｅＨによる切断活性および切断位置選択性の評価をおこなった。ＧＰｙやＧｃｍでは、ｄＧと同等の切断活性を維持したまま、修飾塩基に近い箇所での切断を抑制しており、切断箇所の選択性が向上した。したがって、ピリジル基やカルバモイル基の導入はアンチセンス核酸の配列選択性を高めるために有効な方法であると期待される。また、ミスマッチ塩基対を含む二重鎖において、ＧＰｙが最も大きくＲＮａｓｅＨ切断活性を低下させたことから、ピリジル基による修飾がミスマッチ塩基対識別能を向上させるといえる。したがって、ピリジル基によるかさ高さは、ミスマッチ塩基対を含む二重鎖の不安定化よりも、その二重鎖を形成した後ＲＮａｓｅＨによる切断の阻害に大きな影響を与えている可能性が示唆された。
【0113】
実施例において使用した試薬及び装置等
（１）ＤＮＡ自動合成機
ジーンデザイン社の自動オリゴヌクレオチド合成装置ｎＳ－ＩＩ８を使用した。各天然型デオキシホスホロアミダイトユニット（ｄＴホスホロアミダイト、ｄＧｉｂｕホスホロアミダイト、ｄＡＢｚホスホロアミダイト）、合成に用いる固相担体、活性化剤、酸化剤、キャップＡ溶液（５％脱水酢酸・テトラヒドロフラン溶液）、キャップＢ溶液（１０％ １－メチルイミダゾールテトラヒドロフラン・ピリジン溶液）、硫化剤はＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社より購入した。５－Ｍｅ－ｄＣＢｚホスホロアミダイトはＬｉｎｋ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社より購入した。また、各ＬＮＡホスホロアミダイトユニット（ＬＮＡ－Ｔホスホロアミダイト、ＬＮＡ－ＡＢｚホスホロアミダイト、ＬＮＡ－Ｇｄｍｆホスホロアミダイト、ＬＮＡ－５－Ｍｅ－ＣＢｚホスホロアミダイト）はＨｏｎｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ社より購入した。アセトニトリル（超脱水）およびデブロッキング溶液（３ｗ／ｖ％トリクロロ酢酸・ジクロロメタン溶液）、硫化剤を調製するための［（Ｎ、Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ］－３Ｈ－１、２、４－ジチアゾリン－３－チオン（ＤＤＴＴ）は富士フイルム和光純薬株式会社より購入した。
（１）ＤＮＡ自動合成機
ジーンデザイン社の自動オリゴヌクレオチド合成装置ｎＳ－ＩＩ８を使用した。各天然型デオキシホスホロアミダイトユニット（ｄＴホスホロアミダイト、ｄＧｉｂｕホスホロアミダイト、ｄＡＢｚホスホロアミダイト）、合成に用いる固相担体、活性化剤、酸化剤、キャップＡ溶液（５％脱水酢酸・テトラヒドロフラン溶液）、キャップＢ溶液（１０％ １－メチルイミダゾールテトラヒドロフラン・ピリジン溶液）、硫化剤はＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社より購入した。５－Ｍｅ－ｄＣＢｚホスホロアミダイトはＬｉｎｋ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社より購入した。また、各ＬＮＡホスホロアミダイトユニット（ＬＮＡ－Ｔホスホロアミダイト、ＬＮＡ－ＡＢｚホスホロアミダイト、ＬＮＡ－Ｇｄｍｆホスホロアミダイト、ＬＮＡ－５－Ｍｅ－ＣＢｚホスホロアミダイト）はＨｏｎｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ社より購入した。アセトニトリル（超脱水）およびデブロッキング溶液（３ｗ／ｖ％トリクロロ酢酸・ジクロロメタン溶液）、硫化剤を調製するための［（Ｎ、Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ］－３Ｈ－１、２、４－ジチアゾリン－３－チオン（ＤＤＴＴ）は富士フイルム和光純薬株式会社より購入した。
【0114】
本研究において用いた各修飾ホスホロアミダイトユニット、各ＬＮＡホスホロアミダイトユニットは脱水ピリジン、脱水トルエン、脱水ジクロロメタンで十分に共沸操作を行なった後、脱水アセトニトリルに０．１Ｍまたは０．１５Ｍになるよう溶解した。また、ＬＮＡ－５－メチル－ＣＢｚは脱水アセトニトリル／脱水ジクロロメタン（１：１、ｖ／ｖ）に０．１Ｍになるよう溶解し、ＤＮＡ自動合成機に適用した。活性化剤には０．２５Ｍ ５－ベンジルチオ－１Ｈ－テトラゾール・アセトニトリル溶液を用いた。硫化剤には０．０５Ｍ Ｓｕｌｆｕｒｉｚｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ ＩＩ・ピリジン／アセトニトリル溶液、または、アルゴンバックの中でＤＤＴＴを脱水ピリジン／脱水アセトニトリル（３：２、ｖ／ｖ）によく溶かした溶液を使用した。酸化剤には０．０２Ｍヨウ素溶液（０．０２Ｍヨウ素、テトラヒドロフラン／水／ピリジン中）を用いた。カップリング時間は各修飾核酸および各ＬＮＡホスホロアミダイトユニットでは１２分で、天然型のＤＮＡでは６分でおこない、全て２回ずつカップリング反応をおこなった。硫化時間は５分間を２回繰り返し、１塩基あたり合計１０分ずつおこなった。さらに、全ての合成が終了した後に５分間の硫化を４回繰り返して合計２０分間おこなった。合成したアンチセンス核酸は、２８％アンモニア水を用いて５５℃で１２時間または１６時間処理することで固相からの切り出しと塩基部の脱保護をおこなった。その後、遠心エバポレーターを用いてアンモニアを除去し、Ｓｅｐ－Ｐａｋ（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて簡易精製をおこなった後に、逆相ＨＰＬＣを用いて精製と純度の確認をおこなった。
【0115】
（２）ＤＮＡ／ＲＮＡオリゴマー、ＬＮＡギャップマー
各ＤＮＡ／ＲＮＡオリゴマーおよびＬＮＡギャップマーはユーロフィンジェノミクス株式会社、ＩＤＴ株式会社、ジーンデザイン社、北海道システム・サイエンス株式会社からそれぞれ購入した。以下の表に各オリゴの配列と購入先をまとめた。ＮはＬＮＡを示しており、Ｃは全て５－メチルシトシンを示している。また、ｄはＤＮＡを示している。
各ＤＮＡ／ＲＮＡオリゴマーおよびＬＮＡギャップマーはユーロフィンジェノミクス株式会社、ＩＤＴ株式会社、ジーンデザイン社、北海道システム・サイエンス株式会社からそれぞれ購入した。以下の表に各オリゴの配列と購入先をまとめた。ＮはＬＮＡを示しており、Ｃは全て５－メチルシトシンを示している。また、ｄはＤＮＡを示している。
【表9】
【0116】
（３）オリゴマーの吸光係数
Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｇ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｚｅｒ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｏｌｉｇｏａｎａｌｙｚｅｒ／）にて計算した。また、修飾ヌクレオシドの吸光係数（２６０ｎｍ）は、未修飾のヌクレオシドと等しいと仮定した。
Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｇ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｚｅｒ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｏｌｉｇｏａｎａｌｙｚｅｒ／）にて計算した。また、修飾ヌクレオシドの吸光係数（２６０ｎｍ）は、未修飾のヌクレオシドと等しいと仮定した。
【0117】
（４）UV吸収スペクトル
Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ ＮＤ－１０００で測定した。
Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ ＮＤ－１０００で測定した。
【0118】
（５）逆相カラムカートリッジによる精製
ＢＩＯ－ＭＩＮＩ ＵＶ ＭＯＮＩＴＯＲ ＡＣ－５２００ Ｌ（ＡＴＴＯ）とＰｈａｒａｍａｃｉａのＬＫＢ Ｐｕｍｐ Ｐ－１を接続して吸光度を測定した。それらにＳｅｐ－Ｐａｋ Ｃ１８ Ｐｌｕｓ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｗａｔｅｒｓ）を接続し、オリゴマーの精製をおこなった。洗浄は１０％アセトニトリル水溶液、溶出は２０％アセトニトリル水溶液で行った。
ＢＩＯ－ＭＩＮＩ ＵＶ ＭＯＮＩＴＯＲ ＡＣ－５２００ Ｌ（ＡＴＴＯ）とＰｈａｒａｍａｃｉａのＬＫＢ Ｐｕｍｐ Ｐ－１を接続して吸光度を測定した。それらにＳｅｐ－Ｐａｋ Ｃ１８ Ｐｌｕｓ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｗａｔｅｒｓ）を接続し、オリゴマーの精製をおこなった。洗浄は１０％アセトニトリル水溶液、溶出は２０％アセトニトリル水溶液で行った。
【0119】
（６）逆相ＨＰＬＣによる分析と分取精製
分析では、ＪＡＳＳＯ Ｐｈｏｔｏ Ｄｉｏｄｅ Ａｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＭＤ４０１５）、Ｉｎｅｒｔ Ｐｕｍｐ（ＰＵ４０８０ｉ）、Ｃｏｌｕｍｎ Ｏｖｅｎ（ＣＯ４０６０、Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｂｏｘ（ＬＣＮＥＴＩＩ／ＡＤＣ）、Ｉｎｅｒｔ Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ（ＡＳ－４０５０ｉ）を接続し、逆相カラムにはＸＢｒｉｄｇｅ（商標）Ｓｈｅｉｌｄ ＲＰ１８（４．６×１５０ｍｍ）を用いた。カラム温度６５℃において流速１ｍｌ／分、溶出溶媒として８ｍＭトリエチルアミン、０．１Ｍ １，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノールの混合溶液にメタノールを加え濃度勾配をかけて流した。メタノールの比率として、０分ｍｉｎ、５％から４０分、４５％または６５％と線形に濃度勾配をかけ、流速１ｍＬ／分で分析をおこなった。
分析では、ＪＡＳＳＯ Ｐｈｏｔｏ Ｄｉｏｄｅ Ａｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＭＤ４０１５）、Ｉｎｅｒｔ Ｐｕｍｐ（ＰＵ４０８０ｉ）、Ｃｏｌｕｍｎ Ｏｖｅｎ（ＣＯ４０６０、Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｂｏｘ（ＬＣＮＥＴＩＩ／ＡＤＣ）、Ｉｎｅｒｔ Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ（ＡＳ－４０５０ｉ）を接続し、逆相カラムにはＸＢｒｉｄｇｅ（商標）Ｓｈｅｉｌｄ ＲＰ１８（４．６×１５０ｍｍ）を用いた。カラム温度６５℃において流速１ｍｌ／分、溶出溶媒として８ｍＭトリエチルアミン、０．１Ｍ １，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノールの混合溶液にメタノールを加え濃度勾配をかけて流した。メタノールの比率として、０分ｍｉｎ、５％から４０分、４５％または６５％と線形に濃度勾配をかけ、流速１ｍＬ／分で分析をおこなった。
【0120】
分取では、ＪＡＳＳＯ ＵＶ／Ｖｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＵＶ４０７０）、Ｉｎｅｒｔ Ｐｕｍｐ（ＰＵ－２０８６）、Ｃｏｌｕｍｎ Ｏｖｅｎ（ＣＯ４０６０）、Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｂｏｘ（ＬＣＮＥＴＩＩ／ＡＤＣ）を接続し、逆相カラムにはＸＢｒｉｄｇｅ（商標）ＢＥＨ Ｓｈｅｉｌｄ Ｃ１８（１０×２５０ｍｍ）を用いた。カラム温度６５℃において流速３ｍｌ／分、溶出溶媒として８ｍＭトリエチルアミン、０．１Ｍ １，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノールの混合溶液にメタノールを加え濃度勾配をかけて流した。メタノールの比率として、０分、５％から４０分または６０分、４５％と線形に濃度勾配をかけ、流速３ｍＬ／分で主生成物ピークを分取した。
【0121】
（７）細胞および培養液
ヒト子宮頸がん由来ＨｅＬａ細胞（ＪＣＲＢ９００４）はＪＣＲＢ細胞バンクより購入した。培養液ＤＭＥＭはナカライテスク株式会社、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入した。ＤＭＥＭ培地（１．０ｇ／Ｌグルコース）に、必要に応じて非動化したＦＢＳ（フナコシ株式会社）を１０％（ｖ／ｖ）と、ペニシリン－ストレプトマイシン溶液を１００ユニットおよび１００μｇ／ｍＬとなるように加えて使用した。
ヒト子宮頸がん由来ＨｅＬａ細胞（ＪＣＲＢ９００４）はＪＣＲＢ細胞バンクより購入した。培養液ＤＭＥＭはナカライテスク株式会社、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入した。ＤＭＥＭ培地（１．０ｇ／Ｌグルコース）に、必要に応じて非動化したＦＢＳ（フナコシ株式会社）を１０％（ｖ／ｖ）と、ペニシリン－ストレプトマイシン溶液を１００ユニットおよび１００μｇ／ｍＬとなるように加えて使用した。
【0122】
（８）継代培養
細胞株の培養は５％ＣＯ２の存在下、３７℃のインキュベーターでおこなった。培養には５５ｃｍ２の組織培養用ディッシュ（ＩＷＡＫＩ）または９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ）またはＩｓｏＰｌａｔｅ－９６ＴＣ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いた。Ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ６０％に増やす場合はＨｅｌａ細胞の倍化時間を２６時間と考え、ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ１００％が細胞８．８×１０４ｃｅｌｌ／ｍｌと仮定した。凍結保管していたＨｅＬａ細胞を３７℃で８割方解凍し、そこから必要量の細胞をＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、Ｐ／Ｓ＋）培地に懸濁し、組織培養用ディッシュまたは９６穴プレートに捲種した必要な細胞数となるまで培養した。
細胞株の培養は５％ＣＯ２の存在下、３７℃のインキュベーターでおこなった。培養には５５ｃｍ２の組織培養用ディッシュ（ＩＷＡＫＩ）または９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ）またはＩｓｏＰｌａｔｅ－９６ＴＣ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いた。Ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ６０％に増やす場合はＨｅｌａ細胞の倍化時間を２６時間と考え、ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ１００％が細胞８．８×１０４ｃｅｌｌ／ｍｌと仮定した。凍結保管していたＨｅＬａ細胞を３７℃で８割方解凍し、そこから必要量の細胞をＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、Ｐ／Ｓ＋）培地に懸濁し、組織培養用ディッシュまたは９６穴プレートに捲種した必要な細胞数となるまで培養した。
【産業上の利用可能性】
【0123】
本発明のアンチセンス分子及び該アンチセンス核酸は、その活性を維持しながら、オフターゲット効果を抑制することができるため、実用性の高いアンチセンス核酸医薬の開発に大きく貢献するものである。
【0124】
本明細書に引用する全ての刊行物及び特許文献は、参照により全体として本明細書中に援用される。なお、例示を目的として、本発明の特定の実施形態を本明細書において説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の改変が行われる場合があることは、当業者に容易に理解されるであろう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】