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特開2023-127730プラスミドベクター、組換え放線菌、及び標的タンパク質の生産方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023127730
(43)【公開日】2023-09-14
(54)【発明の名称】プラスミドベクター、組換え放線菌、及び標的タンパク質の生産方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/74 20060101AFI20230907BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20230907BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20230907BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20230907BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20230907BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230907BHJP
【ＦＩ】
C12N15/74 Z
C12N15/113 Z ZNA
C12N15/11 Z
C12N15/31
C12P21/02 C
C12N1/21
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022031597
(22)【出願日】2022-03-02
(71)【出願人】
【識別番号】899000057
【氏名又は名称】学校法人日本大学
(74)【代理人】
【識別番号】100161207
【弁理士】
【氏名又は名称】西澤 和純
(74)【代理人】
【識別番号】100175824
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100126882
【弁理士】
【氏名又は名称】五十嵐 光永
(72)【発明者】
【氏名】▲高▼野 英晃
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA03
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA20
4B065AA50X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA27
4B065CA44
4B065CA60
(57)【要約】 （修正有）
【課題】生産コストを抑えながら、放線菌において標的タンパク質を効率良く製造することができるプラスミドベクターを提供する。
【解決手段】放線菌において標的タンパク質を発現するためのプラスミドベクターは、光センサー機能を有するタンパク質をコードする核酸（ａ）；プロモーター認識能を有するタンパク質をコードする核酸（ｂ）；前記核酸（ｂ）がコードするタンパク質に認識されるプロモーター活性を有する核酸（ｃ）；及び前記標的タンパク質をコードする遺伝子を挿入するためのクローニングサイト（ｄ）；をこの順に含む。
【選択図】なし
【解決手段】放線菌において標的タンパク質を発現するためのプラスミドベクターは、光センサー機能を有するタンパク質をコードする核酸（ａ）；プロモーター認識能を有するタンパク質をコードする核酸（ｂ）；前記核酸（ｂ）がコードするタンパク質に認識されるプロモーター活性を有する核酸（ｃ）；及び前記標的タンパク質をコードする遺伝子を挿入するためのクローニングサイト（ｄ）；をこの順に含む。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
放線菌において標的タンパク質を発現するためのプラスミドベクターであって、
以下の（ａ１）～（ａ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、光センサー機能を有するタンパク質をコードする核酸（ａ）；
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列；
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ａ４）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列；
以下の（ｂ１）～（ｂ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、プロモーター認識能を有するタンパク質をコードする核酸（ｂ）；
（ｂ１）配列番号２で表される塩基配列；
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｂ４）配列番号２で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列；
以下の（ｃ１）～（ｃ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、前記核酸（ｂ）がコードするタンパク質に認識されるプロモーター活性を有する核酸（ｃ）；
（ｃ１）配列番号３又は４で表される塩基配列；
（ｃ２）配列番号３又は４で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｃ３）配列番号３又は４で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｃ４）配列番号３又は４で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列；及び
前記標的タンパク質をコードする遺伝子を挿入するためのクローニングサイト（ｄ）；
をこの順に含む、プラスミドベクター。
以下の（ａ１）～（ａ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、光センサー機能を有するタンパク質をコードする核酸（ａ）；
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列；
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ａ４）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列；
以下の（ｂ１）～（ｂ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、プロモーター認識能を有するタンパク質をコードする核酸（ｂ）；
（ｂ１）配列番号２で表される塩基配列；
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｂ４）配列番号２で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列；
以下の（ｃ１）～（ｃ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、前記核酸（ｂ）がコードするタンパク質に認識されるプロモーター活性を有する核酸（ｃ）；
（ｃ１）配列番号３又は４で表される塩基配列；
（ｃ２）配列番号３又は４で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｃ３）配列番号３又は４で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｃ４）配列番号３又は４で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列；及び
前記標的タンパク質をコードする遺伝子を挿入するためのクローニングサイト（ｄ）；
をこの順に含む、プラスミドベクター。
【請求項2】
前記核酸（ｃ）の下流であって、前記クローニングサイト（ｄ）の上流に、
配列番号５～７のいずれかで表される塩基配列を含み、且つ、リボソーム結合部位として機能する核酸（ｅ）を更に含む、請求項１に記載のプラスミドベクター。
配列番号５～７のいずれかで表される塩基配列を含み、且つ、リボソーム結合部位として機能する核酸（ｅ）を更に含む、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項3】
前記核酸（ｅ）は、配列番号８～１４のいずれかで表される塩基配列からなる、請求項２に記載のプラスミドベクター。
【請求項4】
前記核酸（ｂ）の下流であって、前記核酸（ｃ）の上流に、
以下の（ｆ１）～（ｆ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、転写を終結させる活性を有する核酸（ｆ）を更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のプラスミドベクター。
（ｆ１）配列番号１５で表される塩基配列；
（ｆ２）配列番号１５で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｆ３）配列番号１５で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｆ４）配列番号１５で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
以下の（ｆ１）～（ｆ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、転写を終結させる活性を有する核酸（ｆ）を更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のプラスミドベクター。
（ｆ１）配列番号１５で表される塩基配列；
（ｆ２）配列番号１５で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｆ３）配列番号１５で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｆ４）配列番号１５で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
【請求項5】
前記核酸（ａ）の上流に、ｓｔｉ領域を含む核酸（ｇ）を更に含み、
前記核酸（ｇ）が、以下の（ｇ１）～（ｇ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、前記プラスミドベクターのコピー数を増大し得る、請求項１～４のいずれか一項に記載のプラスミドベクター。
（ｇ１）配列番号１６で表される塩基配列；
（ｇ２）配列番号１６で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｇ３）配列番号１６で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｇ４）配列番号１６で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
前記核酸（ｇ）が、以下の（ｇ１）～（ｇ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、前記プラスミドベクターのコピー数を増大し得る、請求項１～４のいずれか一項に記載のプラスミドベクター。
（ｇ１）配列番号１６で表される塩基配列；
（ｇ２）配列番号１６で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｇ３）配列番号１６で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｇ４）配列番号１６で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
【請求項6】
前記クローニングサイト（ｄ）に、前記標的タンパク質をコードする遺伝子が挿入されている、請求項１～５のいずれか一項に記載のプラスミドベクター。
【請求項7】
請求項６に記載のプラスミドベクターで形質転換された、組換え放線菌。
【請求項8】
請求項６に記載のプラスミドベクターで放線菌を形質転換する形質転換工程と、
形質転換された前記放線菌を４３０ｎｍ以上５５０ｎｍ以下の波長を含む光照射下で培養する培養工程と、
得られた培養物から前記標的タンパク質を回収する回収工程と、
をこの順に含む、標的タンパク質の生産方法。
形質転換された前記放線菌を４３０ｎｍ以上５５０ｎｍ以下の波長を含む光照射下で培養する培養工程と、
得られた培養物から前記標的タンパク質を回収する回収工程と、
をこの順に含む、標的タンパク質の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、プラスミドベクター、組換え放線菌、及び標的タンパク質の生産方法に関する。
【背景技術】
【0002】
遺伝子組換え技術を利用したタンパク質生産は、細菌、酵母、動物細胞等を宿主として、各種発現ベクターを利用して実用化されている。従来型のタンパク質生産系は、構成的タイプと誘導タイプに分けられ、前者は、常にタンパク質生産を行う系であり、後者は低分子誘導化合物によって発現を誘導することで生産を行う系である。
【0003】
従来型の構成的タイプのタンパク質生産系では、宿主に対して毒性のあるタンパク質を生産させる際には、増殖阻害が起こるため、該タンパク質を生産できない。従来型の誘導タイプのタンパク質生産系では、低分子誘導化合物が高価であり、再利用できず、また培地組成を変える必要がある。代表的な誘導化合物であるＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）は生産コストの最大４０％を占める。誘導化合物は、人工合成物、抗生物質、糖等が主に用いられており、いずれも人工的に製造されているものであることから、環境負荷も大きい。
【0004】
一方、発明者は、これまで、放線菌の一種に内在するカロテノイド合成遺伝子の調節領域（プロモーター領域）を単離して、発現ベクターを構築し、メラニン色素をコードする遺伝子を挿入することで、光刺激に応答してメラニン色素が産生されることを報告している（例えば、非特許文献１参照）。光誘導によるタンパク質生産系は、従来のタンパク質生産系よりもコストが低く、環境負荷も小さく、且つ、培地交換の必要もない。
【0005】
光誘導によるタンパク質生産系としては、大腸菌において、ｐＥＴ系に匹敵する収量のタンパク質が得られた例が報告されている（例えば、非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Takano H et al., “The CarA/LitR-Family Transcriptional Regulator: Its Possible Role as a Photosensor and Wide Distribution in Non-Phototrophic Bacteria.”, Biosci. Biotechnol. Biochem., Vol. 70, Issue 9, pp. 2320-2324, 2006.
【非特許文献2】Ohlendorf R et al., “From Dusk till Dawn: One-Plasmid Systems for Light-Regulated Gene Expression.”, J Mol Biol., Vol. 416, Isuue 4, pp. 534-542, 2012.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
しかしながら、非特許文献１に記載の光誘導によるタンパク質生産系では、標的タンパク質の種類によっては発現が弱く、改良の余地がある。
また、非特許文献２に記載の光誘導によるタンパク質生産系では、人工的に構築された異種生物由来の２成分制御系及びλファージリプレッサーの３遺伝子からなる複雑なシステムであるため、普及していない。
また、非特許文献２に記載の光誘導によるタンパク質生産系では、人工的に構築された異種生物由来の２成分制御系及びλファージリプレッサーの３遺伝子からなる複雑なシステムであるため、普及していない。
【0008】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、生産コストを抑えながら、放線菌において標的タンパク質を効率良く製造することができるプラスミドベクター、並びに、前記プラスミドベクターを用いた組換え放線菌及び標的タンパク質の生産方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、放線菌において標的タンパク質を発現するためのプラスミドベクターの光刺激に応答する調節領域の構成を見直すことで、標的タンパク質の生産効率が飛躍的に向上したタンパク質生産系を見出し、本発明を完成するに至った。
【0010】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
（１） 放線菌において標的タンパク質を発現するためのプラスミドベクターであって、
以下の（ａ１）～（ａ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、光センサー機能を有するタンパク質をコードする核酸（ａ）；
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列；
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ａ４）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列；
以下の（ｂ１）～（ｂ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、プロモーター認識能を有するタンパク質をコードする核酸（ｂ）；
（ｂ１）配列番号２で表される塩基配列；
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｂ４）配列番号２で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列；
以下の（ｃ１）～（ｃ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、前記核酸（ｂ）がコードするタンパク質に認識されるプロモーター活性を有する核酸（ｃ）；
（ｃ１）配列番号３又は４で表される塩基配列；
（ｃ２）配列番号３又は４で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｃ３）配列番号３又は４で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｃ４）配列番号３又は４で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列；及び
前記標的タンパク質をコードする遺伝子を挿入するためのクローニングサイト（ｄ）；
をこの順に含む、プラスミドベクター。
（２） 前記核酸（ｃ）の下流であって、前記クローニングサイト（ｄ）の上流に、
配列番号５～７のいずれかで表される塩基配列を含み、且つ、リボソーム結合部位として機能する核酸（ｅ）を更に含む、（１）に記載のプラスミドベクター。
（３） 前記核酸（ｅ）は、配列番号８～１４のいずれかで表される塩基配列からなる、（２）に記載のプラスミドベクター。
（４） 前記核酸（ｂ）の下流であって、前記核酸（ｃ）の上流に、
以下の（ｆ１）～（ｆ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、転写を終結させる活性を有する核酸（ｆ）を更に含む、（１）～（３）のいずれか一つに記載のプラスミドベクター。
（ｆ１）配列番号１５で表される塩基配列；
（ｆ２）配列番号１５で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｆ３）配列番号１５で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｆ４）配列番号１５で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
（５） 前記核酸（ａ）の上流に、ｓｔｉ領域を含む核酸（ｇ）を更に含み、
前記核酸（ｇ）が、以下の（ｇ１）～（ｇ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、前記プラスミドベクターのコピー数を増大し得る、（１）～（４）のいずれか一つに記載のプラスミドベクター。
（ｇ１）配列番号１６で表される塩基配列；
（ｇ２）配列番号１６で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｇ３）配列番号１６で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｇ４）配列番号１６で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
（６） 前記クローニングサイト（ｄ）に、前記標的タンパク質をコードする遺伝子が挿入されている、（１）～（５）のいずれか一つに記載のプラスミドベクター。
（７） （６）に記載のプラスミドベクターで形質転換された、組換え放線菌。
（８） （６）に記載のプラスミドベクターで放線菌を形質転換する形質転換工程と、
形質転換された前記放線菌を４３０ｎｍ以上５５０ｎｍ以下の波長を含む光照射下で培養する培養工程と、
得られた培養物から前記標的タンパク質を回収する回収工程と、
をこの順に含む、標的タンパク質の生産方法。
（１） 放線菌において標的タンパク質を発現するためのプラスミドベクターであって、
以下の（ａ１）～（ａ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、光センサー機能を有するタンパク質をコードする核酸（ａ）；
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列；
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ａ４）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列；
以下の（ｂ１）～（ｂ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、プロモーター認識能を有するタンパク質をコードする核酸（ｂ）；
（ｂ１）配列番号２で表される塩基配列；
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｂ４）配列番号２で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列；
以下の（ｃ１）～（ｃ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、前記核酸（ｂ）がコードするタンパク質に認識されるプロモーター活性を有する核酸（ｃ）；
（ｃ１）配列番号３又は４で表される塩基配列；
（ｃ２）配列番号３又は４で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｃ３）配列番号３又は４で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｃ４）配列番号３又は４で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列；及び
前記標的タンパク質をコードする遺伝子を挿入するためのクローニングサイト（ｄ）；
をこの順に含む、プラスミドベクター。
（２） 前記核酸（ｃ）の下流であって、前記クローニングサイト（ｄ）の上流に、
配列番号５～７のいずれかで表される塩基配列を含み、且つ、リボソーム結合部位として機能する核酸（ｅ）を更に含む、（１）に記載のプラスミドベクター。
（３） 前記核酸（ｅ）は、配列番号８～１４のいずれかで表される塩基配列からなる、（２）に記載のプラスミドベクター。
（４） 前記核酸（ｂ）の下流であって、前記核酸（ｃ）の上流に、
以下の（ｆ１）～（ｆ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、転写を終結させる活性を有する核酸（ｆ）を更に含む、（１）～（３）のいずれか一つに記載のプラスミドベクター。
（ｆ１）配列番号１５で表される塩基配列；
（ｆ２）配列番号１５で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｆ３）配列番号１５で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｆ４）配列番号１５で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
（５） 前記核酸（ａ）の上流に、ｓｔｉ領域を含む核酸（ｇ）を更に含み、
前記核酸（ｇ）が、以下の（ｇ１）～（ｇ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、前記プラスミドベクターのコピー数を増大し得る、（１）～（４）のいずれか一つに記載のプラスミドベクター。
（ｇ１）配列番号１６で表される塩基配列；
（ｇ２）配列番号１６で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｇ３）配列番号１６で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｇ４）配列番号１６で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
（６） 前記クローニングサイト（ｄ）に、前記標的タンパク質をコードする遺伝子が挿入されている、（１）～（５）のいずれか一つに記載のプラスミドベクター。
（７） （６）に記載のプラスミドベクターで形質転換された、組換え放線菌。
（８） （６）に記載のプラスミドベクターで放線菌を形質転換する形質転換工程と、
形質転換された前記放線菌を４３０ｎｍ以上５５０ｎｍ以下の波長を含む光照射下で培養する培養工程と、
得られた培養物から前記標的タンパク質を回収する回収工程と、
をこの順に含む、標的タンパク質の生産方法。
【発明の効果】
【0011】
上記態様のプラスミドベクター、組換え放線菌及び標的タンパク質の生産方法によれば、生産コストを抑えながら、放線菌において標的タンパク質を効率良く製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】ｐＱＲＳの構造を示す模式図である。
【図2】ｐＬｉｔ１９の構造を示す模式図である。
【図3】本発明の一実施形態に係るプラスミドベクターの構造を示す模式図である。
【図4】本発明の他の実施形態に係るプラスミドベクターの構造を示す模式図である。
【図5】本発明の他の実施形態に係るプラスミドベクターの構造を示す模式図である。
【図6】本発明の他の実施形態に係るプラスミドベクターの構造を示す模式図である。
【図7】実施例１におけるクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色像である。
【図8】実施例１におけるＸｙｌＥの活性を示すグラフである。
【図9】実施例１におけるＸｙｌＥの活性を示すグラフである。
【図10】実施例１におけるＸｙｌＥの活性を示すグラフである。
【図11】実施例１におけるＣＢＢ染色像である。
【図12】実施例１におけるＣＢＢ染色像である。
【図13】実施例１におけるＣＢＢ染色像である。
【図14】実施例１におけるＣＢＢ染色像である。
【図15】実施例１におけるＣＢＢ染色像である。
【図16】実施例１におけるＣＢＢ染色像である。
【図17】実施例１におけるＣＢＢ染色像である。
【図18】実施例１におけるＣＢＢ染色像である。
【図19】実施例２における各プラスミドベクターの構造の一部を示す模式図（左）と、菌体の観察像（右）である。
【図20】実施例２におけるＣＢＢ染色像である。
【図21】実施例２におけるアガロースゲル電気泳動像である。
【図22】実施例２におけるＸｙｌＥの活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0013】
以下、必要に応じて図面を参照しながら、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一符号を付し、重複する説明は省略する。
【0014】
本明細書中において、「配列」とは、任意の長さのヌクレオチド配列を意味しており、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、線状、環状、又は分岐状であり、一本鎖又は二本鎖である。
【0015】
本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーを意味し、互換的に使用される。また、１つ若しくは複数のアミノ酸が、天然に存在する対応アミノ酸の化学的類似体、又は修飾誘導体である、アミノ酸ポリマーを意味する。
【0016】
本明細書において、「核酸」とは、線状又は環状配座であり、一本鎖又は二本鎖形態のいずれかである、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを意味し、ポリマーの長さに関して制限するものとして解釈されるものではない。また、天然ヌクレオチドの公知の類似体、並びに塩基部分、糖部分及びリン酸部分のうち少なくとも一つの部分において修飾されるヌクレオチド（例えば、ホスホロチエート骨格）を包含する。一般に、特定ヌクレオチドの類似体は、同一の塩基対合特異性を有し、例えば、Ａの類似体は、Ｔと塩基対合する。
【0017】
≪プラスミドベクター≫
本実施形態のプラスミドベクターは、放線菌において標的タンパク質を発現するためのプラスミドベクターである。
本実施形態のプラスミドベクターは、放線菌において標的タンパク質を発現するためのプラスミドベクターである。
【0018】
本実施形態のプラスミドベクターは、核酸（ａ）、核酸（ｂ）、核酸（ｃ）、及びクローニングサイト（ｄ）をこの順に含む。
【0019】
核酸（ａ）は、以下の（ａ１）～（ａ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、光センサー機能を有するタンパク質をコードする核酸である。
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列；
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ａ４）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列；
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ａ４）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
【0020】
核酸（ｂ）は、以下の（ｂ１）～（ｂ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、プロモーター認識能を有するタンパク質をコードする核酸である。
（ｂ１）配列番号２で表される塩基配列；
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｂ４）配列番号２で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
（ｂ１）配列番号２で表される塩基配列；
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｂ４）配列番号２で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
【0021】
核酸（ｃ）は、以下の（ｃ１）～（ｃ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、前記核酸（ｂ）がコードするタンパク質に認識されるプロモーター活性を有する。
（ｃ１）配列番号３又は４で表される塩基配列；
（ｃ２）配列番号３又は４で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｃ３）配列番号３又は４で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｃ４）配列番号３又は４で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
（ｃ１）配列番号３又は４で表される塩基配列；
（ｃ２）配列番号３又は４で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｃ３）配列番号３又は４で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｃ４）配列番号３又は４で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
【0022】
クローニングサイト（ｄ）は、標的タンパク質をコードする遺伝子を挿入するための領域である。
【0023】
図１は、発明者らが非特許文献１にて報告したプラスミドベクターｐＱＲＳである。ｐＱＲＳでは、光刺激に応答する調節領域として、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）株に由来する、ＬｉｔＱ、ＬｉｔＲ、ＬｉｔＳ、及びＬｉｔＡからなる遺伝子群を含む。さらに、ｐＱＲＳは、ＬｉｔＱの下流に、σＬｉｔＳ因子依存性プロモーターである、カロテノイドＹプロモーター（ＰｃｒｔＹ）、及びカロテノイドＹ遺伝子を含み、カロテノイドＹ遺伝子の下流に標的タンパク質をコードする遺伝子のためのクローニングサイトを有する。
【0024】
一方、発明者らは、上記ｐＱＲＳの構成を見直して、後述する実施例に示すように、プラスミドベクターｐＬｉｔ１９を構築した（図２参照）。発明者らは、光刺激に応答する調節領域のうち、ＬｉｔＲ及びＬｉｔＳの２遺伝子のみで、光誘導による転写を開始することができることを見出した。また、ＬｉｔＳの下流に、カロテノイドプロモーター及び標的タンパク質をコードする遺伝子のためのクローニングサイトをこの順で含むことで、後述する実施例に示すように、ｐＬｉｔ１９では、ｐＱＲＳよりもタンパク質の生産効率が格段に向上することを明らかにした。
【0025】
したがって、本実施形態のプラスミドベクターは、上記構成を有することで、生産コストを抑えながら、放線菌において標的タンパク質を効率良く製造することができる。
【0026】
また、本実施形態のプラスミドベクター及び該プラスミドベクターを用いた標的タンパク質の生産は、オプトジェネティクス（光遺伝学）を利用した技術であり、オプトジェネティクス（光遺伝学）における以下に示す利点を有する。
１）光照射は非侵襲的な手法であり、低分子誘導物質の添加等、放線菌の培養培地の組成を変えることなく、標的タンパク質を発現させることができる。
２）光の照射及び非照射によって、可逆的且つ迅速に標的タンパク質の発現の開始及び停止を行うことができる。
３）光の照射箇所においてのみ、局所的に標的タンパク質の発現を誘導することができる。
４）高価な低分子誘導物質と比較して、光は安価であるため、生産コストを抑えることができる。
１）光照射は非侵襲的な手法であり、低分子誘導物質の添加等、放線菌の培養培地の組成を変えることなく、標的タンパク質を発現させることができる。
２）光の照射及び非照射によって、可逆的且つ迅速に標的タンパク質の発現の開始及び停止を行うことができる。
３）光の照射箇所においてのみ、局所的に標的タンパク質の発現を誘導することができる。
４）高価な低分子誘導物質と比較して、光は安価であるため、生産コストを抑えることができる。
【0027】
【0028】
＜核酸（ａ）＞
図３に示すように、核酸（ａ）は、核酸（ｂ）に対して逆の方向でベクター内に含まれる。
図３に示すように、核酸（ａ）は、核酸（ｂ）に対して逆の方向でベクター内に含まれる。
【0029】
核酸（ａ）は、以下の（ａ１）～（ａ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、光センサー機能を有するタンパク質をコードする核酸である。
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列；
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ａ４）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列；
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ａ４）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
【0030】
配列番号１は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）株由来のＭｅｒＲ型転写調節タンパク質ＬｉｔＲ（Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）をコードする遺伝子の塩基配列である。
図２に示すように、暗条件下では、ＬｉｔＲ－ビタミン１２（Ｂ１２）複合体タンパク質が形成されており、ＬｉｔＳからの転写開始を抑制している。一方で、光が照射されることで、Ｂ１２が光分解されて、ＬｉｔＲは不活性化される。その結果、ＲＮＡポリメラーゼがリクルートされて、ＬｉｔＳタンパク質が発現される。発現されたＬｉｔＳタンパク質は、ＲＮＡポリメラーゼと共に、カロテノイドＥ又はＹプロモーターからの転写を誘導し、カロテノイドＥ（又はＹ）プロモーターの下流に導入された標的タンパク質をコードする遺伝子が発現する。
図２に示すように、暗条件下では、ＬｉｔＲ－ビタミン１２（Ｂ１２）複合体タンパク質が形成されており、ＬｉｔＳからの転写開始を抑制している。一方で、光が照射されることで、Ｂ１２が光分解されて、ＬｉｔＲは不活性化される。その結果、ＲＮＡポリメラーゼがリクルートされて、ＬｉｔＳタンパク質が発現される。発現されたＬｉｔＳタンパク質は、ＲＮＡポリメラーゼと共に、カロテノイドＥ又はＹプロモーターからの転写を誘導し、カロテノイドＥ（又はＹ）プロモーターの下流に導入された標的タンパク質をコードする遺伝子が発現する。
【0031】
ＬｉｔＲに相同な遺伝子はグラム陽性及び陰性を問わず、一般細菌に広く分布している。よって、上記配列番号１で表される塩基配列からなるＳ． ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）株由来のＬｉｔＲ以外のＬｉｔＲ相同遺伝子も同様に光センサー機能を有し得る。ＬｉｔＲと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸としては、下記（ａ２）～（ａ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、光センサー機能を有するタンパク質をコードする核酸が挙げられる。
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ａ４）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ａ４）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
【0032】
なお、ここでいう「光センサー機能」とは、上述したＬｉｔＲのように、暗条件（光非照射）下では、Ｂ１２と複合体タンパク質を形成してＬｉｔＳの発現を抑制し、一方、光照射下では、Ｂ１２が光分解されることで不活性化して、ＬｉｔＳの発現抑制を解除する機能を示す。
【0033】
上記（ａ２）の塩基配列について、配列番号１で表される塩基配列において、欠失、置換、及び／又は付加されてもよい塩基の数としては、１個以上１００個以下が好ましく、１個以上５０個以下がより好ましく、１個以上３０個以下がさらにより好ましく、１個以上１０個以下がさらに好ましく、１個以上５個以下が特に好ましく、１個以上２個以下が最も好ましい。
【0034】
上記（ａ３）の塩基配列について、配列番号１で表される塩基配列との同一性は、９０％以上１００％未満であり、９５％以上１００％未満であることが好ましく、９７％以上１００％未満であることがより好ましく、９９％以上１００％未満であることがさらに好ましく、９９．５％以上１００％未満であることが特に好ましく、９９．９％以上１００％未満であることが最も好ましい。
塩基配列同士の同一性は、公知の各種相同性検索プログラムを用いて求めることができる。例えば、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴにより得られた値を採用できる。
塩基配列同士の同一性は、公知の各種相同性検索プログラムを用いて求めることができる。例えば、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴにより得られた値を採用できる。
【0035】
本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の条件が挙げられる。例えば、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍの塩化ナトリウム，０．３Ｍのクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、０．１質量％のＮ－ラウロイルサルコシン、０．０２質量％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、２質量％の核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬、及び５０質量％のホルムアミドからなるハイブリダイゼーションバッファー中で、５５℃以上７０℃以下の温度下で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件が挙げられる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１質量％のＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１質量％のＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
【0036】
＜核酸（ｂ）＞
図３に示すように、核酸（ｂ）は、核酸（ａ）に対して逆の方向でベクター内に含まれる。
図３に示すように、核酸（ｂ）は、核酸（ａ）に対して逆の方向でベクター内に含まれる。
【0037】
核酸（ｂ）は、以下の（ｂ１）～（ｂ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、プロモーター認識能を有するタンパク質をコードする核酸である。
（ｂ１）配列番号２で表される塩基配列；
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｂ４）配列番号２で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
（ｂ１）配列番号２で表される塩基配列；
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｂ４）配列番号２で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
【0038】
配列番号２は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）株由来の、ＥＣＦファミリーのσ因子をコードするＬｉｔＳ遺伝子の塩基配列である。上述したように、ＬｉｔＳタンパク質は、カロテノイドＥ又はＹプロモーターに特異的に結合して、カロテノイドＥ又はＹプロモーターからの転写を誘導する。
【0039】
ＬｉｔＳに相同な遺伝子はグラム陽性及び陰性を問わず、一般細菌に広く分布している。よって、上記配列番号２で表される塩基配列からなるＳ． ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）株由来のＬｉｔＳ以外のＬｉｔＳ相同遺伝子も同様にプロモーター認識能を有する。ＬｉｔＳと機能的に同等なタンパク質をコードする核酸としては、下記（ｂ２）～（ｂ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、プロモーター認識能を有するタンパク質をコードする核酸が挙げられる。
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｂ４）配列番号２で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｂ４）配列番号２で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
【0040】
なお、ここでいう「プロモーター認識能」とは、上述したＬｉｔＳタンパク質のように、カロテノイドＥ又はＹプロモーターを特異的に認識して結合する機能を示す。
【0041】
上記（ｂ２）の塩基配列について、配列番号２で表される塩基配列において、欠失、置換、及び／又は付加されてもよい塩基の数としては、１個以上６０個以下が好ましく、１個以上５０個以下がより好ましく、１個以上３０個以下がさらにより好ましく、１個以上１０個以下がさらに好ましく、１個以上５個以下が特に好ましく、１個以上２個以下が最も好ましい。
【0042】
上記（ｂ３）の塩基配列について、配列番号２で表される塩基配列との同一性は、９０％以上１００％未満であり、９１％以上１００％未満であることが好ましく、９５％以上１００％未満であることがより好ましく、９８％以上１００％未満であることがさらに好ましく、９９％以上１００％未満であることが特に好ましく、９９．５％以上１００％未満であることが最も好ましい。
【0043】
＜核酸（ｃ）＞
図３に示すように、核酸（ｃ）は、核酸（ｂ）に対して同じ方向でベクター内に含まれる。
図３に示すように、核酸（ｃ）は、核酸（ｂ）に対して同じ方向でベクター内に含まれる。
【0044】
核酸（ｃ）は、以下の（ｃ１）～（ｃ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、前記核酸（ｂ）がコードするタンパク質に認識されるプロモーター活性を有する。
（ｃ１）配列番号３又は４で表される塩基配列；
（ｃ２）配列番号３又は４で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｃ３）配列番号３又は４で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｃ４）配列番号３又は４で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
（ｃ１）配列番号３又は４で表される塩基配列；
（ｃ２）配列番号３又は４で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｃ３）配列番号３又は４で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｃ４）配列番号３又は４で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
【0045】
配列番号３は、Ｓ． ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）株由来のカロテノイド合成遺伝子ｃｒｔＥのプロモーターであり、配列番号４は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）株由来のカロテノイド合成遺伝子ｃｒｔＹのプロモーターである。これらカロテノイドプロモーターは、上述したＬｉｔＳタンパク質によって特異的に認識され、カロテノイドプロモーター下流に挿入された標的タンパク質をコードする遺伝子の転写が誘導される。
【0046】
カロテノイドＥ又はＹプロモーターに相同な配列は主に放線菌群に広く分布している。よって、上記配列番号３で表される塩基配列からなるＳ． ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）株由来のカロテノイドＥプロモーター、及び、上記配列番号４で表される塩基配列からなるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）株由来のカロテノイドＹプロモーター以外のカロテノイドプロモーターも同様にＬｉｔＳタンパク質に認識されるプロモーター活性を有する。カロテノイドＥ又はＹプロモーターと機能的に同等な核酸としては、下記（ｃ２）～（ｃ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、核酸（ｂ）がコードするタンパク質に認識されるプロモーター活性を有する核酸が挙げられる。
（ｃ２）配列番号３又は４で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｃ３）配列番号３又は４で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｃ４）配列番号３又は４で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
（ｃ２）配列番号３又は４で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｃ３）配列番号３又は４で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｃ４）配列番号３又は４で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
【0047】
なお、ここでいう「核酸（ｂ）がコードするタンパク質に認識されるプロモーター活性」とは、上述したカロテノイドＥ又はＹプロモーターのように、ＬｉｔＳ又はＬｉｔＳ相同タンパク質に特異的に認識され、且つ、ＬｉｔＳ又はＬｉｔＳ相同タンパク質が結合した場合にのみ転写を惹起する活性を意味する。
【0048】
上記（ｃ２）の塩基配列について、配列番号３又は４で表される塩基配列において、欠失、置換、及び／又は付加されてもよい塩基の数としては、１個以上３個以下が好ましく、１個以上２個以下がより好ましく、１個がさらに好ましい。
【0049】
上記（ｃ３）の塩基配列について、配列番号３又は４で表される塩基配列との同一性は、９０％以上１００％未満であり、９４％以上１００％未満であることが好ましく、９７％以上１００％未満であることがより好ましい。
【0050】
また、上記配列番号３で表される塩基配列からなるＳ． ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）株由来のカロテノイドＥプロモーター、及び、上記配列番号４で表される塩基配列からなるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）株由来のカロテノイドＥプロモーター以外のカロテノイドプロモーターとしては、以下の表に示すものも用いることができる。これらカロテノイドプロモーターは、カロテノイドＥ又はＹプロモーターに相同な配列として発明者らが設計し、また、ＬｉｔＳに認識されるプロモーター活性を有するものであることを確認したものである。
【0051】
【表1】
【0052】
なお、上記表に示すプロモーター配列は、次の方法を用いて設計したものである。フォワードプライマーとしてｐＬｉｔ１９－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｆ－ＳＥＱ（５’－ＴＴＣＴＡＣＧＡＧＧＡＣＣＴＧＡＣＧＣＡＧ－３’；配列番号５２）と、リバースプライマーとしてｃｒｔＥｐ－ＲＶ３（５’－ＣＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＴＴＧＡＴＣＴＡＣＧＮＮＮＮＴＳＣＴＴＣＣＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＹＧＧＡＴＧＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＣＣＣＧＴＴＣＣＧＧＣＡＣＧＧＧＧＴＧ－３’（Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｃ、又はＧのうちの任意の塩基である。）；配列番号５３）により、ｐＬｉｔ１９－ｍＣｈｅｒｒｙ（後述する図１９のＮｏ．２；配列番号７９）を鋳型として、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製)を用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲプログラムは、「９８℃ １０秒間；５５℃ １５秒間；６８℃ １分間」を３０サイクルである。増幅ＤＮＡ断片（４１７ｂｐ）を制限酵素ＳｐｈＩとＨｉｎｄＩＩＩ間で切断後、同制限酵素で切断したｐＬｉｔ１９－ｍＣｈｅｒｒｙ（後述する図１９のＮｏ．２；配列番号７９）の同サイトに挿入する。各菌体において、ｍＣｈｅｒｒｙの発現によって呈する赤色を指標として、プロモーター配列を探索する。
【0053】
＜クローニングサイト（ｄ）＞
図３に示すように、クローニングサイト（ｄ）は、核酸（ｂ）及び核酸（ｃ）に対して同じ方向でベクター内に含まれる。
図３に示すように、クローニングサイト（ｄ）は、核酸（ｂ）及び核酸（ｃ）に対して同じ方向でベクター内に含まれる。
【0054】
クローニングサイト（ｄ）は、標的タンパク質をコードする遺伝子を挿入するための領域である。クローニングサイトは、プロモーターの下流に設けられている。このクローニングサイトは、特定の種類の制限酵素（又はその組合せ）によって、ユニークに切断されるサイトである。その特定の種類の制限酵素（又はその組合せ）で切断した箇所に、標的タンパク質をコードする遺伝子を挿入することができる。
【0055】
クローニングサイトは、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）としてもよい。ＭＣＳは、複数種類の制限酵素部位を有する核酸であり、標的タンパク質をコードする遺伝子をＭＣＳに連結してベクターに挿入するために使用される。例えば、ＭＣＳは、ＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢａｍＨＩ等の制限酵素部位（これらのうち１個以上）を有する。クローニングサイトは、例えば、配列番号５４で表される塩基配列からなる。
【0056】
図４は、本発明の他の実施形態に係るプラスミドベクターの構造を示す模式図である。
図４に示すプラスミドベクターは、核酸（ｅ）を更に含む点で、図３に示すプラスミドベクターと相違しており、その他は図３に示すプラスミドベクターと同じである。
図４に示すプラスミドベクターは、核酸（ｅ）を更に含むことで、後述する実施例に示すように、標的タンパク質の生産効率をより向上させることができる。
図４に示すプラスミドベクターは、核酸（ｅ）を更に含む点で、図３に示すプラスミドベクターと相違しており、その他は図３に示すプラスミドベクターと同じである。
図４に示すプラスミドベクターは、核酸（ｅ）を更に含むことで、後述する実施例に示すように、標的タンパク質の生産効率をより向上させることができる。
【0057】
＜核酸（ｅ）＞
核酸（ｅ）は、核酸（ｃ）の下流であって、クローニングサイト（ｄ）の上流に、設けられている。図４に示すように、核酸（ｅ）は、核酸（ｃ）及びクローニングサイト（ｄ）に対して同じ方向でベクター内に含まれる。
核酸（ｅ）は、核酸（ｃ）の下流であって、クローニングサイト（ｄ）の上流に、設けられている。図４に示すように、核酸（ｅ）は、核酸（ｃ）及びクローニングサイト（ｄ）に対して同じ方向でベクター内に含まれる。
【0058】
核酸（ｅ）は、配列番号５～７のいずれかで表される塩基配列を含み、且つ、リボソーム結合部位として機能する。リボソーム結合部位は、翻訳開始の目印となり得る。
【0059】
配列番号５～７は、それぞれ放線菌においてこれまでに知られているリボソーム結合部位の塩基配列である。
【0060】
核酸（ｅ）は、配列番号８～１４のいずれかで表される塩基配列からなることが好ましい。これらの塩基配列は、リボソーム結合部位とその周辺配列からなるものであり、参考文献１（Horbal L et al., “A set of synthetic versatile genetic control elements for the efficient expression of genes in Actinobacteria.”, Scientific Reports, Vol. 8, No. 491, 2018; DOI:10.1038/s41598-017-18846-1.）の記載を参照して、発明者らが独自で検討を行った配列である。
核酸（ｅ）が上記いずれかの塩基配列からなることで、後述する実施例に示すように、標的タンパク質の生産効率をより向上させることができる。
中でも、核酸（ｅ）は、配列番号１３又は１４で表される塩基配列からなることがより好ましい。
核酸（ｅ）が上記いずれかの塩基配列からなることで、後述する実施例に示すように、標的タンパク質の生産効率をより向上させることができる。
中でも、核酸（ｅ）は、配列番号１３又は１４で表される塩基配列からなることがより好ましい。
【0061】
図５は、本発明の他の実施形態に係るプラスミドベクターの構造を示す模式図である。
図５に示すプラスミドベクターは、核酸（ｆ）を更に含む点で、図３に示すプラスミドベクターと相違しており、その他は図３に示すプラスミドベクターと同じである。
図５に示すプラスミドベクターは、核酸（ｆ）を更に含むことで、後述する実施例に示すように、標的タンパク質の生産効率をより向上させることができる。
図５に示すプラスミドベクターは、核酸（ｆ）を更に含む点で、図３に示すプラスミドベクターと相違しており、その他は図３に示すプラスミドベクターと同じである。
図５に示すプラスミドベクターは、核酸（ｆ）を更に含むことで、後述する実施例に示すように、標的タンパク質の生産効率をより向上させることができる。
【0062】
＜核酸（ｆ）＞
核酸（ｆ）は、核酸（ｂ）の下流であって、核酸（ｃ）の上流に、設けられている。図５に示すように、核酸（ｆ）は、核酸（ｂ）及び核酸（ｃ）に対して同じ方向でベクター内に含まれる。
核酸（ｆ）は、核酸（ｂ）の下流であって、核酸（ｃ）の上流に、設けられている。図５に示すように、核酸（ｆ）は、核酸（ｂ）及び核酸（ｃ）に対して同じ方向でベクター内に含まれる。
【0063】
核酸（ｆ）は、以下の（ｆ１）～（ｆ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、転写を終結させる活性を有する。
（ｆ１）配列番号１５で表される塩基配列；
（ｆ２）配列番号１５で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｆ３）配列番号１５で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｆ４）配列番号１５で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
（ｆ１）配列番号１５で表される塩基配列；
（ｆ２）配列番号１５で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｆ３）配列番号１５で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｆ４）配列番号１５で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
【0064】
配列番号１５は、人工合成されたターミネーター配列（ｔｔｓｂｉＢ）である（参考文献２：de Hoon M. J. L. et al., “Prediction of Transcriptional Terminators in Bacillus subtilis and Related Species.”, PLoS Comput Biol., Vol. 1, Issue 3, e25, 2005.）。
【0065】
配列番号１５で表される塩基配列を含む配列からなる核酸と機能的に同等な核酸としては、下記（ｆ２）～（ｂ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、転写を終結させる活性を有する核酸が挙げられる。
（ｆ２）配列番号１５で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｆ３）配列番号１５で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｆ４）配列番号１５で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
（ｆ２）配列番号１５で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｆ３）配列番号１５で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｆ４）配列番号１５で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
【0066】
上記（ｆ２）の塩基配列について、配列番号１５で表される塩基配列において、欠失、置換、及び／又は付加されてもよい塩基の数としては、１個以上３個以下が好ましく、１個以上２個以下がより好ましく、１個がさらにより好ましい。
【0067】
上記（ｆ３）の塩基配列について、配列番号１５で表される塩基配列との同一性は、９０％以上１００％未満であり、９４％以上１００％未満であることが好ましく、９７％以上１００％未満であることがより好ましい。
【0068】
図６は、本発明の他の実施形態に係るプラスミドベクターの構造を示す模式図である。
図６に示すプラスミドベクターは、核酸（ｇ）を更に含む点で、図３に示すプラスミドベクターと相違しており、その他は図３に示すプラスミドベクターと同じである。
図６に示すプラスミドベクターは、核酸（ｇ）を更に含むことで、後述する実施例に示すように、プラスミドベクターのＤＮＡ収量をより向上させることができ、その結果、標的タンパク質の生産効率をより向上させることができる。
図６に示すプラスミドベクターは、核酸（ｇ）を更に含む点で、図３に示すプラスミドベクターと相違しており、その他は図３に示すプラスミドベクターと同じである。
図６に示すプラスミドベクターは、核酸（ｇ）を更に含むことで、後述する実施例に示すように、プラスミドベクターのＤＮＡ収量をより向上させることができ、その結果、標的タンパク質の生産効率をより向上させることができる。
【0069】
核酸（ｇ）は、ｓｔｉ領域を含み、核酸（ａ）の上流に、設けられている。核酸（ｇ）は、後述する自律複製可能な領域に対して特定方向でベクター内に含まれる。
【0070】
「ｓｔｉ」とは、「強い不和合性（ｓｔｒｏｎｇ ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）」を引き起こすことから命名された遺伝子の名称である。ｓｔｉは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属細菌の内因性の野生型プラスミドであるｐＩＪ１０１の必須複製領域部分ではない約２００ｂｐのＤＮＡ断片としてそもそも見出されたものである。
【0071】
核酸（ｇ）は、以下の（ｇ１）～（ｇ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、前記プラスミドベクターのコピー数を増大し得る。
（ｇ１）配列番号１６で表される塩基配列；
（ｇ２）配列番号１６で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｇ３）配列番号１６で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｇ４）配列番号１６で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
（ｇ１）配列番号１６で表される塩基配列；
（ｇ２）配列番号１６で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｇ３）配列番号１６で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｇ４）配列番号１６で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
【0072】
配列番号１６は、放線菌プラスミドであるｐＶＪ１由来のｓｔｉ領域の塩基配列である。後述する実施例に示すように、本実施形態のプラスミドベクターは、ｐＶＪ１由来のｓｔｉ領域を含むことで、プラスミドベクターのＤＮＡ収量をより向上させることができ、その結果、標的タンパク質の生産効率をより向上させることができる。
【0073】
配列番号１６で表される塩基配列を含む配列からなる核酸と機能的に同等な核酸としては、下記（ｇ２）～（ｇ４）のいずれかの塩基配列を含み、且つ、プラスミドベクターのコピー数を増大し得る核酸が挙げられる。
（ｇ２）配列番号１６で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｇ３）配列番号１６で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｇ４）配列番号１６で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
（ｇ２）配列番号１６で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基を欠損、置換、及び／又は付加された塩基配列；
（ｇ３）配列番号１６で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
（ｇ４）配列番号１６で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸の塩基配列
【0074】
上記（ｇ２）の塩基配列について、配列番号１６で表される塩基配列において、欠失、置換、及び／又は付加されてもよい塩基の数としては、１個以上６６個以下が好ましく、１個以上４６個以下がより好ましく、１個以上３３個以下がさらにより好ましく、１個以上１９個以下がさらに好ましく、１個以上６個以下が特に好ましく、１個以上３個以下が最も好ましい。
【0075】
上記（ｇ３）の塩基配列について、配列番号１６で表される塩基配列との同一性は、９０％以上１００％未満であり、９３％以上１００％未満であることが好ましく、９２％以上１００％未満であることがより好ましく、９５％以上１００％未満であることがさらにより好ましく、９７％以上１００％未満であることがさらに好ましく、９９％以上１００％未満であることが特に好ましく、９９．５％以上１００％未満であることが最も好ましい。
【0076】
本実施形態のプラスミドベクターは、図３～図６に示す構造からなるものに限定されず、本実施形態のプラスミドベクターが奏する効果を損なわない範囲内において、図３～図６に示すものの一部の構成が変更又は削除されたものや、これまでに説明したものにさらに他の構成が追加されたものであってもよい。
【0077】
例えば、図３に示すプラスミドベクターにおいて、上記核酸（ｅ）、上記核酸（ｆ）、及び上記核酸（ｇ）の全てが追加されたものであってもよい。
【0078】
＜その他構成＞
本実施形態のプラスミドベクターは、放線菌の宿主において自律複製可能な領域を含み得る。放線菌の宿主において自律複製可能な領域は、該領域を含むプラスミドを宿主に導入したときに、プラスミドが複製できる最小限の領域を含みさえすればよく、特に制限されない。自律複製可能な領域としては、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属細菌の内因性の野生型プラスミドであるｐＩＪ１０１又はｐＩＪ１０１から改良されたプラスミドベクターに由来する自律複製領域（複製起点（「ｏｒｉ」）及び複製タンパク質「ｒｅｐ」を含む領域）が挙げられる。ｒｅｐを含む領域は、例えば、配列番号５６で表される塩基配列からなる。
本実施形態のプラスミドベクターは、放線菌の宿主において自律複製可能な領域を含み得る。放線菌の宿主において自律複製可能な領域は、該領域を含むプラスミドを宿主に導入したときに、プラスミドが複製できる最小限の領域を含みさえすればよく、特に制限されない。自律複製可能な領域としては、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属細菌の内因性の野生型プラスミドであるｐＩＪ１０１又はｐＩＪ１０１から改良されたプラスミドベクターに由来する自律複製領域（複製起点（「ｏｒｉ」）及び複製タンパク質「ｒｅｐ」を含む領域）が挙げられる。ｒｅｐを含む領域は、例えば、配列番号５６で表される塩基配列からなる。
【0079】
本実施形態のプラスミドベクターは、放線菌の菌体内でプラスミドベクターの複製が可能であり、放線菌の増殖によってプラスミドベクターが落ちてしまうことを抑制することができる。また、放線菌の菌体内でのプラスミドベクターのコピー数を増加させることができる。
【0080】
本実施形態のプラスミドベクターは、これを保持した宿主を選択できるように、適切な薬剤耐性遺伝子又は代謝酵素等の選択用マーカー遺伝子を含むことが好ましい。
選択用マーカー遺伝子としては、チオストレプトン耐性遺伝子、アプラマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。薬剤マーカーが抗生物質耐性遺伝子である場合には、対応する抗生物質を含む培地で放線菌を培養することにより、放線菌の菌体内からプラスミドベクターが落ちてしまうことを抑制することができる。好ましくは、チオストレプトン耐性遺伝子が用いられる。チオストレプトン耐性遺伝子は、例えば、配列番号５５で表される塩基配列からなる。
ｐＩＪ１０１に由来する汎用プラスミドベクターのｐＩＪ３５０、ｐＩＪ７０２はチオストレプトン耐性遺伝子を有するので、骨格プラスミドとして好適に用いられる。
選択用マーカー遺伝子としては、チオストレプトン耐性遺伝子、アプラマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。薬剤マーカーが抗生物質耐性遺伝子である場合には、対応する抗生物質を含む培地で放線菌を培養することにより、放線菌の菌体内からプラスミドベクターが落ちてしまうことを抑制することができる。好ましくは、チオストレプトン耐性遺伝子が用いられる。チオストレプトン耐性遺伝子は、例えば、配列番号５５で表される塩基配列からなる。
ｐＩＪ１０１に由来する汎用プラスミドベクターのｐＩＪ３５０、ｐＩＪ７０２はチオストレプトン耐性遺伝子を有するので、骨格プラスミドとして好適に用いられる。
【0081】
本実施形態のプラスミドベクターは、必要に応じて他のエレメント（例えば、転写活性化配列、発現調節配列（オペレーター、エンハンサー等）を更に含んでいてもよい。
【0082】
本実施形態のプラスミドベクターの骨格として、放線菌宿主に対して通常用いられるプラスミドを使用することができる。例えば、ｐＩＪ１０１に由来する汎用プラスミドベクター及び他の放線菌に適した公知のプラスミドベクターを用いることができる。このようなプラスミドベクターとしては、例えば、ｐＩＪ３５０、ｐＩＪ７０２、ｐＩＪ４８７等が挙げられる。ｐＩＪ３５０、ｐＩＪ７０２はチオストレプトン耐性遺伝子及びｐＩＪ１０１に由来する自律複製領域（複製起点（「ｏｒｉ」）及び複製タンパク質「ｒｅｐ」を含む領域）を有するので、骨格プラスミドとして好適に用いられる。
【0083】
本実施形態のプラスミドベクターを構成する各要素の連結は、当業者が通常用いる技術を適宜採用することができる。結合は、適切な制限酵素、リンカー、ＤＮＡリガーゼ等を用いて行うことができる。
【0084】
本実施形態のプラスミドベクターのクローニングサイトに標的タンパク質をコードする遺伝子を組み込んで用いることができる。標的タンパク質をコードする遺伝子は、本実施形態のプラスミドベクターにおいて核酸（ｃ）の下流に設けられたクローニングサイト（ｄ）に挿入される。
【0085】
標的タンパク質としては、宿主菌で発現可能なタンパク質であれば特に制限されず、後述する実施例に示すように、あらゆるタンパク質を十分に発現させることができる。
【0086】
標的タンパク質としては、所望の酵素、構造タンパク質、調節因子等であってよく、天然のタンパク質、変異タンパク質、人工的に作り出したタンパク質等であってもよい。
【0087】
標的タンパク質をコードする遺伝子の由来は、例えば、動物由来遺伝子、植物由来遺伝子、微生物由来遺伝子、ウイルス由来遺伝子及び化学合成した遺伝子から任意に選択することができ、限定されない。所望の構造遺伝子保有生物からの遺伝子のクローニングは、公知の任意の手法により行われ得る。必要に応じて制限酵素認識部位を設けたプライマーを用い、ＰＣＲで増幅することにより、構造遺伝子を得ることができる。
【0088】
≪組換え放線菌≫
本実施形態の組換え放線菌は、クローニングサイト（ｄ）に、標的タンパク質をコードする遺伝子が挿入されている、上記プラスミドベクターで形質転換されている。
本実施形態の組換え放線菌は、クローニングサイト（ｄ）に、標的タンパク質をコードする遺伝子が挿入されている、上記プラスミドベクターで形質転換されている。
【0089】
なお、一般に、「形質転換」とは、菌体内に外から核酸が導入されて、該菌体の性質が変わることをいう。本実施形態の組換え放線菌においてプラスミドベクターで形質転換されている状態は、プラスミドベクターが放線菌の染色体ＤＮＡにインテグレートしている状態、細胞質中に遊離のプラスミド状態で含まれている状態、及びその両方が併存している状態を含む。
【0090】
本実施形態の組換え放線菌によれば、生産コストを抑えながら、放線菌において標的タンパク質を効率良く製造することができる。
【0091】
本明細書において、放線菌とは、放線菌目（ｏｒｄｅｒ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）に属する菌をいう。
【0092】
放線菌は、グラム陽性細菌に所属する一分類群であり、主に土壌等に生息する。原核生物であるが、多くの放線菌は分岐を伴う糸状の生育を示し、多様な形態を呈する。また、一般的に胞子を形成し、中には胞子嚢や運動性胞子を形成する種も存在する。また、放線菌からは種々の抗生物質及び他の生物学的に重要な化合物が発見されている。
【0093】
放線菌目には、フランキア科（Ｆｒａｎｋｉａｃｅａｅ）、ミクロモノスポラ科（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）、プロピオニバクトリウム科（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、シウドノカルジア科（Ｐｓｕｏｄｏｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）、ストレプトマイセス科（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅａｅ）、ストレプトスポランギウム科（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｕａｃｅａｅ）、テルモモノスポラ科（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）、コリネバクテリウム科（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、マイコバクテリウム科（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ノカジア科（Ｎｏｃａｕｄｉａｃｅａｅ）が含まれる。好ましくは、ストレプトマイセス科、より好ましくはストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する菌である。
【0094】
ストレプトマイセス属に属する菌としては、例えば、ストレプトマイセス・セプタタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｅｐｔｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・ラベンデュラエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）、ストレプトマイセス・バージニア（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｇｉｎｉａ）、ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）が挙げられる。本実施形態の組換え放線菌においては、宿主菌体として、ストレプトマイセス・グリセウス又はストレプトマイセス・コエリカラーが好適に用いられる。
【0095】
このようなストレプトマイセス属に属する放線菌やその他の放線菌は、ＮＢＲＣカタログ、ＡＴＣＣカタログ、ＪＣＭカタログ等の種々のカタログに記載されており、例えば、微生物寄託分譲機関から分譲を受けることによって当業者であれば容易に入手可能である。
【0096】
宿主放線菌について、突然変異を導入するように処理を行うこともできる。このような処理としては、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）による変異株の作製が挙げられる。
【0097】
≪標的タンパク質の生産方法≫
本実施形態の標的タンパク質の生産方法は、以下の工程を含む。
クローニングサイト（ｄ）に、標的タンパク質をコードする遺伝子が挿入されている、上記プラスミドベクターで放線菌を形質転換する形質転換工程；
形質転換された前記放線菌を４３０ｎｍ以上５５０ｎｍ以下の波長を含む光照射下で培養する培養工程；及び
得られた培養物から前記標的タンパク質を回収する回収工程。
本実施形態の標的タンパク質の生産方法は、以下の工程を含む。
クローニングサイト（ｄ）に、標的タンパク質をコードする遺伝子が挿入されている、上記プラスミドベクターで放線菌を形質転換する形質転換工程；
形質転換された前記放線菌を４３０ｎｍ以上５５０ｎｍ以下の波長を含む光照射下で培養する培養工程；及び
得られた培養物から前記標的タンパク質を回収する回収工程。
【0098】
本実施形態の標的タンパク質の生産方法によれば、生産コストを抑えながら、放線菌において標的タンパク質を効率良く製造することができる。
【0099】
次いで、本実施形態の標的タンパク質の生産方法の各工程について以下に詳細に説明する。
【0100】
＜形質転換工程＞
形質転換工程では、標的タンパク質をコードする遺伝子が挿入されている、上記プラスミドベクターで放線菌を形質転換する。
形質転換工程では、標的タンパク質をコードする遺伝子が挿入されている、上記プラスミドベクターで放線菌を形質転換する。
【0101】
宿主である放線菌へのプラスミドベクターの導入（形質転換）は、公知の方法により行うことができる。具体的な放線菌宿主の形質転換法としては、プロトプラスト／ＰＥＧ法が挙げられるが、これに限定されない。宿主にプラスミドベクターが導入されたことの確認は、選択用マーカー遺伝子（例えば、チオストレプトン耐性遺伝子）を用いて行うことができる。
【0102】
＜培養工程＞
培養工程では、形質転換された放線菌を４３０ｎｍ以上５５０ｎｍ以下の波長を含む光照射下で培養する。
培養工程では、形質転換された放線菌を４３０ｎｍ以上５５０ｎｍ以下の波長を含む光照射下で培養する。
【0103】
照射する光としては、青色又は緑色の光である４３０ｎｍ以上５５０ｎｍ以下の波長を含む光であり、緑色又は青色の光を含む可視光線（波長４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下）を用いることができ、青色の光（波長４３０ｎｍ以上４９０ｎｍ以下）を含む光がより好ましい。
また、より少ない波長強度で標的タンパク質を生産できることから、青色の光（波長４３０ｎｍ以上４９０ｎｍ以下）又は緑色の光（波長４９０ｎｍ以上５５０ｎｍ以下）のみからなる光を用いてもよい。或いは、青色の光又は緑色の光のみからなる光源は高価であり、設備コストを抑える観点からは、白色又は電球色の市販の発光ダイオード（ＬＥＤ）も好適に用いることができる。
また、より少ない波長強度で標的タンパク質を生産できることから、青色の光（波長４３０ｎｍ以上４９０ｎｍ以下）又は緑色の光（波長４９０ｎｍ以上５５０ｎｍ以下）のみからなる光を用いてもよい。或いは、青色の光又は緑色の光のみからなる光源は高価であり、設備コストを抑える観点からは、白色又は電球色の市販の発光ダイオード（ＬＥＤ）も好適に用いることができる。
【0104】
照射する光の波長強度は、例えば、０．１μｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２以上１０．０μｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２未満とすることができ、０．５μｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２以上５．０μｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２以下であることが好ましく、１．０μｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２以上３．０μｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２以下であることがより好ましい。
波長強度が上記下限値以上であることで、ＬｉｔＲ－Ｂ１２複合体タンパク質のＢ１２を光分解することができ、ＬｉｔＲを不活性化することで、ＬｉｔＳタンパク質を発現させて、標的タンパク質の発現をより効率的に誘導することができる。一方で、波長強度が上記上限値以下であることで、光強度の高さに起因する細胞内で活性酸素の発生を抑制することができ、活性酸素が生体分子（例えば、ＤＮＡ、タンパク質、脂質等）と非特異的に反応して細胞機能を阻害することをより抑制することができる。その結果、タンパク質の発現が低下することを効果的に抑制することができる。
波長強度が上記下限値以上であることで、ＬｉｔＲ－Ｂ１２複合体タンパク質のＢ１２を光分解することができ、ＬｉｔＲを不活性化することで、ＬｉｔＳタンパク質を発現させて、標的タンパク質の発現をより効率的に誘導することができる。一方で、波長強度が上記上限値以下であることで、光強度の高さに起因する細胞内で活性酸素の発生を抑制することができ、活性酸素が生体分子（例えば、ＤＮＡ、タンパク質、脂質等）と非特異的に反応して細胞機能を阻害することをより抑制することができる。その結果、タンパク質の発現が低下することを効果的に抑制することができる。
【0105】
光を照射するタイミングとしては、培養初期から光を照射するか、一定程度増殖してから光を照射して発現を誘導する、又は、遮光性の培養容器で培養して集菌した後、光透過性の培養容器に移して遺伝子発現を誘導する方法等を選択することができる。毒性を有するタンパク質を発現させる場合等には、光非照射下で培養後、培養途中から光を照射して誘導する条件が好ましく用いられる。
【0106】
光照射以外の培養条件としては、宿主菌が増殖し、標的タンパク質を産生できる条件であれば特に制限はない。通常、液体培地中で振盪培養又は通気攪拌培養等の好気的条件下で、通常１０℃以上４０℃以下、好ましくは２８℃で、１２時間以上１２０時間行われる。ｐＨは、４以上１０以下、好ましくは６以上８以下に調節される。ｐＨの調整は、無機酸または有機酸、アルカリ溶液等を用いて行うことができる。
【0107】
培地は、宿主菌が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【0108】
炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、キシロース、スクロース、ラフィノース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。
【0109】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物が挙げられる。その他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、各種アミノ酸等を用いてもよい。
【0110】
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。
【0111】
また、必要に応じて植物油、界面活性剤、シリコン等の消泡剤を添加してもよい。
【0112】
＜回収工程＞
回収工程では、得られた培養物から標的タンパク質を回収する。
回収工程では、得られた培養物から標的タンパク質を回収する。
【0113】
本明細書において、「培養物」には、培養上清、培養細胞、培養菌体、及び細胞若しくは菌体の破砕物が包含される。
【0114】
標的タンパク質が宿主菌体内に蓄積する場合には、培養終了後、遠心分離によって形質転換細胞を回収し、得られた菌体を超音波処理等によって破砕した後、遠心分離等によって無細胞抽出液を得ることで、標的タンパク質を回収することができる。
【0115】
標的タンパク質が細胞外に分泌される場合には、培養上清を回収することで、標的タンパク質を回収することができる。
【0116】
＜その他工程＞
本実施形態の標的タンパク質の生産方法は、例えば、形質転換工程の前に、挿入工程を、回収工程の後に、精製工程を、更に含むことができる。
本実施形態の標的タンパク質の生産方法は、例えば、形質転換工程の前に、挿入工程を、回収工程の後に、精製工程を、更に含むことができる。
【0117】
［挿入工程］
上記プラスミドベクターに標的タンパク質をコードする遺伝子が挿入されていない場合には、挿入工程では、上記プラスミドベクターのクローニングサイトに標的タンパク質をコードする遺伝子を挿入する。
上記プラスミドベクターに標的タンパク質をコードする遺伝子が挿入されていない場合には、挿入工程では、上記プラスミドベクターのクローニングサイトに標的タンパク質をコードする遺伝子を挿入する。
【0118】
遺伝子の挿入方法としては、当業者が通常用いる技術を適宜採用することができる。具体的には、適切な制限酵素、リンカー、ＤＮＡリガーゼ等を用いて行うことができる。
【0119】
［精製工程］
精製工程では、回収工程から得られた標的タンパク質を含む溶液（無細胞抽出液や培養上清）から、標的タンパク質を精製する。
精製工程では、回収工程から得られた標的タンパク質を含む溶液（無細胞抽出液や培養上清）から、標的タンパク質を精製する。
【0120】
標的タンパク質の精製は、公知の方法により行うことができる。具体的には、塩析法や、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーの各種クロマトグラフィーなどの一般的なタンパク質精製法により精製することができる。
【0121】
≪用途≫
本実施形態のプラスミドベクター、組換え放線菌、及び標的タンパク質の生産方法は、生産コストを抑えながら、放線菌において標的タンパク質を効率良く製造することができる。また、後述する実施例に示すように、１ｇ以上１０ｇ／Ｌ以下の高濃度で、大量に標的タンパク質を発現させることができる。よって、食品用酵素や抗生物質の製造等に利用することができ、工業的に有用な技術である。
本実施形態のプラスミドベクター、組換え放線菌、及び標的タンパク質の生産方法は、生産コストを抑えながら、放線菌において標的タンパク質を効率良く製造することができる。また、後述する実施例に示すように、１ｇ以上１０ｇ／Ｌ以下の高濃度で、大量に標的タンパク質を発現させることができる。よって、食品用酵素や抗生物質の製造等に利用することができ、工業的に有用な技術である。
【実施例0122】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0123】
［実施例１］
非特許文献１に記載のプラスミドベクターｐＱＲＳを改良して、タンパク質の発現を向上させたプラスミドベクターｐＬｉｔ１９を用いて、各種検討を行った。
非特許文献１に記載のプラスミドベクターｐＱＲＳを改良して、タンパク質の発現を向上させたプラスミドベクターｐＬｉｔ１９を用いて、各種検討を行った。
【0124】
（プラスミドベクターｐＬｉｔ１９の構築）
プラスミドｐＩＪ７０２（５６５０ｂｐ）に、Ｓ． ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）株に由来する、ＬｉｔＲ（配列番号１）及びＬｉｔＳ（配列番号２）、Ｓ． ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）に由来するプロモーター領域ＰｃｒｔＥ（配列番号３）、並びに、ｐＵＣ１９に由来する、マルチクローニングサイト（配列番号５４）をクローニングして、プラスミドベクターｐＬｉｔ１９を構築した。得られたｐＬｉｔ１９の構造を図２に示す。図２に示すように、ｐＬｉｔ１９は、ＬｉｔＲ（配列番号１）、ＬｉｔＳ（配列番号２）、ＰｃｒｔＥ（配列番号３）、及びマルチクローニングサイト（配列番号５４）をこの順で含む。また、図２において、図示を省略しているが、マルチクローニングサイト（配列番号５４）の下流に、チオストレプトン耐性遺伝子（配列番号５５）、及び複製タンパク質ｒｅｐ遺伝子（配列番号５６）を更に含む。ｐＬｉｔ１９の全長の塩基配列は、配列番号５７に示すとおりである。
プラスミドｐＩＪ７０２（５６５０ｂｐ）に、Ｓ． ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）株に由来する、ＬｉｔＲ（配列番号１）及びＬｉｔＳ（配列番号２）、Ｓ． ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）に由来するプロモーター領域ＰｃｒｔＥ（配列番号３）、並びに、ｐＵＣ１９に由来する、マルチクローニングサイト（配列番号５４）をクローニングして、プラスミドベクターｐＬｉｔ１９を構築した。得られたｐＬｉｔ１９の構造を図２に示す。図２に示すように、ｐＬｉｔ１９は、ＬｉｔＲ（配列番号１）、ＬｉｔＳ（配列番号２）、ＰｃｒｔＥ（配列番号３）、及びマルチクローニングサイト（配列番号５４）をこの順で含む。また、図２において、図示を省略しているが、マルチクローニングサイト（配列番号５４）の下流に、チオストレプトン耐性遺伝子（配列番号５５）、及び複製タンパク質ｒｅｐ遺伝子（配列番号５６）を更に含む。ｐＬｉｔ１９の全長の塩基配列は、配列番号５７に示すとおりである。
【0125】
（カテコール２，３ジオキシゲナーゼ遺伝子（ＸｙｌＥ）の生産試験）
上記ｐＬｉｔ１９のマルチクローニングサイトのＨｉｎｄＩＩＩサイトとＸｂａＩサイト間に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来のカテコール２，３ジオキシゲナーゼ遺伝子（ＸｙｌＥ）遺伝子（配列番号５８）を挿入して、プラスミドベクターｐＬｉｔ１９－ＸｙｌＥを構築した。次いで、ｐＬｉｔ１９－ＸｙｌＥをＳ． ｇｒｉｓｅｕｓ（ＮＢＲＣ １３３５０）に形質転換（プロトプラスト／ＰＥＧ法；参考文献３：D.A. Hopwood et al., PRACTICAL STREPTOMYCES GENETICS (Streptomyces Manual), John Innes Centre Ltd, Chapter 2、10）して、青色の光（中心波長：４７０ｎｍ（半減値幅±１０ｎｍ）、波長強度：３．０μｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２）の照射下で、２８℃、２日間攪拌培養（攪拌速度：１３５ｒｐｍ、ＴＡＩＴＥＣ社製大型高温振とう培養機バイオシェーカー（登録商標） ＢＲ－１８０ＬＦ）した。培地としては、ＹＭＰＤ培地（組成：イーストエキストラクト（Difco製）０．２質量％、魚エキス（極東製薬工業製）０．２質量％、バクトペプトン（Difco製）０．４質量％、塩化マグネシウム０．２質量％、塩化ナトリウム０．５質量％、グルコース１．０質量％、ｐＨ７．２）を用いた。
また、対照として、非特許文献１に記載のプラスミドベクターｐＱＲＳ（全長配列：配列番号５９）のマルチクローニングサイトのＳｐｈＩサイトとＢｇｌＩＩサイトの間にＸｙｌＥ遺伝子（配列番号５８）を挿入して構築した、プラスミドベクターｐＱＲＳ－ＸｙｌＥも同様にＳ． ｇｒｉｓｅｕｓ（ＮＢＲＣ １３３５０）に形質転換（プロトプラスト／ＰＥＧ法）して、上記条件下で２日間攪拌培養（攪拌速度：１３５ｒｐｍ、ＴＡＩＴＥＣ社製大型高温振とう培養機バイオシェーカー（登録商標） ＢＲ－１８０ＬＦ）した。
上記ｐＬｉｔ１９のマルチクローニングサイトのＨｉｎｄＩＩＩサイトとＸｂａＩサイト間に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来のカテコール２，３ジオキシゲナーゼ遺伝子（ＸｙｌＥ）遺伝子（配列番号５８）を挿入して、プラスミドベクターｐＬｉｔ１９－ＸｙｌＥを構築した。次いで、ｐＬｉｔ１９－ＸｙｌＥをＳ． ｇｒｉｓｅｕｓ（ＮＢＲＣ １３３５０）に形質転換（プロトプラスト／ＰＥＧ法；参考文献３：D.A. Hopwood et al., PRACTICAL STREPTOMYCES GENETICS (Streptomyces Manual), John Innes Centre Ltd, Chapter 2、10）して、青色の光（中心波長：４７０ｎｍ（半減値幅±１０ｎｍ）、波長強度：３．０μｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２）の照射下で、２８℃、２日間攪拌培養（攪拌速度：１３５ｒｐｍ、ＴＡＩＴＥＣ社製大型高温振とう培養機バイオシェーカー（登録商標） ＢＲ－１８０ＬＦ）した。培地としては、ＹＭＰＤ培地（組成：イーストエキストラクト（Difco製）０．２質量％、魚エキス（極東製薬工業製）０．２質量％、バクトペプトン（Difco製）０．４質量％、塩化マグネシウム０．２質量％、塩化ナトリウム０．５質量％、グルコース１．０質量％、ｐＨ７．２）を用いた。
また、対照として、非特許文献１に記載のプラスミドベクターｐＱＲＳ（全長配列：配列番号５９）のマルチクローニングサイトのＳｐｈＩサイトとＢｇｌＩＩサイトの間にＸｙｌＥ遺伝子（配列番号５８）を挿入して構築した、プラスミドベクターｐＱＲＳ－ＸｙｌＥも同様にＳ． ｇｒｉｓｅｕｓ（ＮＢＲＣ １３３５０）に形質転換（プロトプラスト／ＰＥＧ法）して、上記条件下で２日間攪拌培養（攪拌速度：１３５ｒｐｍ、ＴＡＩＴＥＣ社製大型高温振とう培養機バイオシェーカー（登録商標） ＢＲ－１８０ＬＦ）した。
【0126】
培養後、各菌体を回収して、１×ＴＥバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁後、Ｍｉｓｏｎｉｘ社製Ａｓｔｒａｓｏｎ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ ＸＬを用いて、Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ３０のパルス強度で、パルスオン１秒とパルスオフ１秒を３０回繰り返すことにより、細胞溶解物を得た。細胞溶解物を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ゲル濃度：１２．５質量％）を行い、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色により発現タンパク質を検出した。結果を図７に示す。図７において、「Ｄａｒｋ」は光非照射下で培養した試料であり、「ＢＬ」は青色の光照射下で培養した試料である。「Ｍ」は、分子量マーカー（アンテグラル社製、ＸＬ－Ｌａｄｄｅｒ Ｂｒｏａｄ）である。以降、同様である。
また、上記細胞溶解物を用いて、発現したＸｙｌＥの活性を０.２ｍＭ カテコールが含まれる１０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー中におけるタンパク質１ｍｇあたり、１分間における吸光度３７５ｎｍの変化をもとに算出した。結果を図８に示す。図８において、「Ｎ．Ｄ．」はＮｏｔ Ｄｅｔｅｃｔｅｄの略であり、検出されなかったことを示す。以降、同様である。
また、上記細胞溶解物を用いて、発現したＸｙｌＥの活性を０.２ｍＭ カテコールが含まれる１０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー中におけるタンパク質１ｍｇあたり、１分間における吸光度３７５ｎｍの変化をもとに算出した。結果を図８に示す。図８において、「Ｎ．Ｄ．」はＮｏｔ Ｄｅｔｅｃｔｅｄの略であり、検出されなかったことを示す。以降、同様である。
【0127】
図７に示すように、ｐＬｉｔ１９－ＸｙｌＥを形質転換し、青色の光照射下で培養した試料では、大量のＸｙｌＥの発現が確認されたが、その他の試料では、ＸｙｌＥの発現が確認されなかった。
【0128】
図８に示すように、ｐＬｉｔ１９－ＸｙｌＥを形質転換し、青色の光照射下で培養した試料では、ＸｙｌＥの活性が認められたが、その他の試料では、ＸｙｌＥの活性は認められなかった。
【0129】
（光の波長の検討）
上記ｐＬｉｔ１９－ＸｙｌＥをＳ． ｇｒｉｓｅｕｓ（ＮＢＲＣ １３３５０）に形質転換（プロトプラスト／ＰＥＧ法）して、青色の光（中心波長：４７０ｎｍ（半減値幅±１０ｎｍ）、波長強度：３．０μｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２）、緑色の光（ピーク波長：波長５０５ｎｍ以上５１０ｎｍ以下、波長強度：１．０μｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２）、又は、赤色の光（中心波長：６６０ｎｍ（半減値幅±１５ｎｍ）、波長強度：３．０μｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２）の照射下で、２８℃、２日間攪拌培養（攪拌速度：１３５ｒｐｍ、ＴＡＩＴＥＣ社製大型高温振とう培養機バイオシェーカー（登録商標） ＢＲ－１８０ＬＦ）した。培地としては、ＹＭＰＤ培地を用いた。
上記ｐＬｉｔ１９－ＸｙｌＥをＳ． ｇｒｉｓｅｕｓ（ＮＢＲＣ １３３５０）に形質転換（プロトプラスト／ＰＥＧ法）して、青色の光（中心波長：４７０ｎｍ（半減値幅±１０ｎｍ）、波長強度：３．０μｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２）、緑色の光（ピーク波長：波長５０５ｎｍ以上５１０ｎｍ以下、波長強度：１．０μｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２）、又は、赤色の光（中心波長：６６０ｎｍ（半減値幅±１５ｎｍ）、波長強度：３．０μｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２）の照射下で、２８℃、２日間攪拌培養（攪拌速度：１３５ｒｐｍ、ＴＡＩＴＥＣ社製大型高温振とう培養機バイオシェーカー（登録商標） ＢＲ－１８０ＬＦ）した。培地としては、ＹＭＰＤ培地を用いた。
【0130】
培養後、各菌体を回収して、１×ＴＥバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁後、Ｍｉｓｏｎｉｘ社製Ａｓｔｒａｓｏｎ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ ＸＬを用いて、Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ３０のパルス強度で、パルスオン１秒とパルスオフ１秒を３０回繰り返すことにより、細胞溶解物を得た。細胞溶解物を用いて、発現したＸｙｌＥの活性を０.２ｍＭ カテコールが含まれる１０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー中におけるタンパク質１ｍｇあたり、１分間における吸光度３７５ｎｍの変化をもとに算出した。結果を図９に示す。
【0131】
図９に示すように、青色又は緑色の光照射下で培養した試料では、ＸｙｌＥの活性が認められたが、光非照射下又は赤色の光照射下で培養した試料では、ＸｙｌＥの活性がほとんど認められなかった。
また、青色の光照射下で培養した試料では、ＸｙｌＥの活性が顕著に高かった。
また、青色の光照射下で培養した試料では、ＸｙｌＥの活性が顕著に高かった。
【0132】
（波長強度の検討）
上記ｐＬｉｔ１９－ＸｙｌＥをＳ． ｇｒｉｓｅｕｓ（ＮＢＲＣ １３３５０）に形質転換（プロトプラスト／ＰＥＧ法）して、青色の光（中心波長：４７０ｎｍ（半減値幅±１０ｎｍ）、波長強度：２．５、５．０、又は１０．０μｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２）の照射下で、２８℃、２日間攪拌培養（攪拌速度：１３５ｒｐｍ）した。培地としては、ＹＭＰＤ培地を用いた。
対照として、ＸｙｌＥを挿入していないプラスミドベクターｐＬｉｔ１９も同様にＳ． ｇｒｉｓｅｕｓ（ＮＢＲＣ １３３５０）に形質転換（プロトプラスト／ＰＥＧ法）して、上記条件下で２日間攪拌培養（攪拌速度：１３５ｒｐｍ、ＴＡＩＴＥＣ社製大型高温振とう培養機バイオシェーカー（登録商標） ＢＲ－１８０ＬＦ）した。
上記ｐＬｉｔ１９－ＸｙｌＥをＳ． ｇｒｉｓｅｕｓ（ＮＢＲＣ １３３５０）に形質転換（プロトプラスト／ＰＥＧ法）して、青色の光（中心波長：４７０ｎｍ（半減値幅±１０ｎｍ）、波長強度：２．５、５．０、又は１０．０μｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２）の照射下で、２８℃、２日間攪拌培養（攪拌速度：１３５ｒｐｍ）した。培地としては、ＹＭＰＤ培地を用いた。
対照として、ＸｙｌＥを挿入していないプラスミドベクターｐＬｉｔ１９も同様にＳ． ｇｒｉｓｅｕｓ（ＮＢＲＣ １３３５０）に形質転換（プロトプラスト／ＰＥＧ法）して、上記条件下で２日間攪拌培養（攪拌速度：１３５ｒｐｍ、ＴＡＩＴＥＣ社製大型高温振とう培養機バイオシェーカー（登録商標） ＢＲ－１８０ＬＦ）した。
【0133】
培養後、各菌体を回収して、１×ＴＥバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁後、Ｍｉｓｏｎｉｘ社製Ａｓｔｒａｓｏｎ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ ＸＬを用いて、Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ３０のパルス強度で、パルスオン１秒とパルスオフ１秒を３０回繰り返すことにより、細胞溶解物を得た。細胞溶解物を用いて、発現したＸｙｌＥの活性を０.２ｍＭ カテコールが含まれる１０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー中におけるタンパク質１ｍｇあたり、１分間における吸光度３７５ｎｍの変化をもとに算出した。結果を図１０に示す。なお、図１０において、「ｅｍｐｔｙ」はＸｙｌＥを挿入していないプラスミドベクターｐＬｉｔ１９を用いた試料であり、「ＸｙｌＥ」はｐＬｉｔ１９－ＸｙｌＥを用いた試料である。
【0134】
図１０に示すように、２．５μｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２以上５．０μｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２以下の波長強度で光照射した試料では、ＸｙｌＥの活性が認められた。また、２．５μｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２の波長強度で光照射した試料では、ＸｙｌＥの活性が顕著に高かった。
【0135】
（培養培地の検討）
上記ｐＬｉｔ１９－ＸｙｌＥをＳ． ｇｒｉｓｅｕｓ（ＮＢＲＣ １３３５０）に形質転換（プロトプラスト／ＰＥＧ法）して、青色の光（中心波長：４７０ｎｍ（半減値幅±１０ｎｍ）、波長強度：３．０μｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２）の照射下で、２８℃、２日間攪拌培養（攪拌速度：１３５ｒｐｍ）した。培地としては、以下の５種の培地を用いて、比較検討した。
対照として、ＸｙｌＥを挿入していないプラスミドベクターｐＬｉｔ１９も同様にＳ． ｇｒｉｓｅｕｓ（ＮＢＲＣ １３３５０）に形質転換（プロトプラスト／ＰＥＧ法）して、ＹＭＰＤ培地を用いて、上記条件下で２日間攪拌培養（攪拌速度：１３５ｒｐｍ、ＴＡＩＴＥＣ社製大型高温振とう培養機バイオシェーカー（登録商標） ＢＲ－１８０ＬＦ）した。
上記ｐＬｉｔ１９－ＸｙｌＥをＳ． ｇｒｉｓｅｕｓ（ＮＢＲＣ １３３５０）に形質転換（プロトプラスト／ＰＥＧ法）して、青色の光（中心波長：４７０ｎｍ（半減値幅±１０ｎｍ）、波長強度：３．０μｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２）の照射下で、２８℃、２日間攪拌培養（攪拌速度：１３５ｒｐｍ）した。培地としては、以下の５種の培地を用いて、比較検討した。
対照として、ＸｙｌＥを挿入していないプラスミドベクターｐＬｉｔ１９も同様にＳ． ｇｒｉｓｅｕｓ（ＮＢＲＣ １３３５０）に形質転換（プロトプラスト／ＰＥＧ法）して、ＹＭＰＤ培地を用いて、上記条件下で２日間攪拌培養（攪拌速度：１３５ｒｐｍ、ＴＡＩＴＥＣ社製大型高温振とう培養機バイオシェーカー（登録商標） ＢＲ－１８０ＬＦ）した。
【0136】
【表2】
【0137】
培養後、各菌体を回収して、１×ＴＥバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁後、Ｍｉｓｏｎｉｘ社製Ａｓｔｒａｓｏｎ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ ＸＬを用いて、Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ３０のパルス強度で、パルスオン１秒とパルスオフ１秒を３０回繰り返すことにより、細胞溶解物を得た。細胞溶解物を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ゲル濃度：１２．５質量％）を行い、ＣＢＢ染色により発現タンパク質を検出した。結果を図１１に示す。
【0138】
図１１に示すように、いずれの培地を用いた試料においても、同程度の量のＸｙｌＥが検出された。
よって、発明者らが開発した光誘導性のタンパク質生産系では、培地の種類に依存せずに、タンパク質を生産できることが明らかとなった。
よって、発明者らが開発した光誘導性のタンパク質生産系では、培地の種類に依存せずに、タンパク質を生産できることが明らかとなった。
【0139】
（細胞内タンパク質の生産試験）
上記ｐＬｉｔ１９のマルチクローニングサイトに、以下の表に示す、細胞内タンパク質をコードする遺伝子をそれぞれ挿入して、プラスミドベクターを構築した。なお、各遺伝子のマルチクローニングサイトの挿入位置は、ＸｙｌＥ、ＳＧＲ５４１２、ＥＧＦＰ、ＳａｓＡ－Ｈｉｓ、ＳａｓＡＢＣＤ、ＳＧＲ６１８６－６１８９、及びｓｒｃ４３２５５はＨｉｎｄＩＩＩ－ＸｂａＩサイト間に、ＧＵＳ、ｍＣｈｅｒｒｙ、２，６－ジヒドロキシピリジン－３－モノ－オキシゲナーゼはＨｉｎｄＩＩＩ－ＥｃｏＲＩサイト間とした。
上記ｐＬｉｔ１９のマルチクローニングサイトに、以下の表に示す、細胞内タンパク質をコードする遺伝子をそれぞれ挿入して、プラスミドベクターを構築した。なお、各遺伝子のマルチクローニングサイトの挿入位置は、ＸｙｌＥ、ＳＧＲ５４１２、ＥＧＦＰ、ＳａｓＡ－Ｈｉｓ、ＳａｓＡＢＣＤ、ＳＧＲ６１８６－６１８９、及びｓｒｃ４３２５５はＨｉｎｄＩＩＩ－ＸｂａＩサイト間に、ＧＵＳ、ｍＣｈｅｒｒｙ、２，６－ジヒドロキシピリジン－３－モノ－オキシゲナーゼはＨｉｎｄＩＩＩ－ＥｃｏＲＩサイト間とした。
【0140】
【表3】
【0141】
次いで、各プラスミドベクターをＳ． ｇｒｉｓｅｕｓ（ＮＢＲＣ １３３５０）に形質転換（プロトプラスト／ＰＥＧ法）して、青色の光（中心波長：４７０ｎｍ（半減値幅±１０ｎｍ）、波長強度：３．０μｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２）の照射下で、２８℃、２日間攪拌培養（攪拌速度：１３５ｒｐｍ、ＴＡＩＴＥＣ社製大型高温振とう培養機バイオシェーカー（登録商標） ＢＲ－１８０ＬＦ）した。培地としては、ＹＭＰＤ培地を用いた。培養後、各菌体を回収して、１×ＴＥバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁後、Ｍｉｓｏｎｉｘ社製Ａｓｔｒａｓｏｎ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ ＸＬを用いて、Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ３０のパルス強度で、パルスオン１秒とパルスオフ１秒を３０回繰り返すことにより、細胞溶解物を得た。細胞溶解物を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ゲル濃度：１２．５質量％）を行い、ＣＢＢ染色により発現タンパク質を検出した。結果を図１２に示す。
【0142】
図１２に示すように、いずれの細胞内タンパク質も検出された。
よって、発明者らが開発した光誘導性のタンパク質生産系を用いることで、種類に限定されず、細胞内タンパク質を生産できることが明らかとなった。
よって、発明者らが開発した光誘導性のタンパク質生産系を用いることで、種類に限定されず、細胞内タンパク質を生産できることが明らかとなった。
【0143】
（菌体外分泌酵素の生産試験）
上記ｐＬｉｔ１９のマルチクローニングサイトのＨｉｎｄＩＩＩ－ＸｂａＩサイト間に、以下の表に示す菌体外分泌酵素をコードする遺伝子をそれぞれ挿入して、プラスミドベクターを構築した。なお、表中のアスタリスクで示した分子量については、成熟型である分泌タンパク質の分子量を推定できなかったため、プロ体であるタンパク質全長のアミノ酸配列で推定された分子量を示した。
上記ｐＬｉｔ１９のマルチクローニングサイトのＨｉｎｄＩＩＩ－ＸｂａＩサイト間に、以下の表に示す菌体外分泌酵素をコードする遺伝子をそれぞれ挿入して、プラスミドベクターを構築した。なお、表中のアスタリスクで示した分子量については、成熟型である分泌タンパク質の分子量を推定できなかったため、プロ体であるタンパク質全長のアミノ酸配列で推定された分子量を示した。
【0144】
【表4】
【0145】
次いで、各プラスミドベクターを上記表に記載のホストにそれぞれ形質転換（プロトプラスト／ＰＥＧ法）して、暗所下、２８℃で４８時間前培養した。培地としては、ＴＳＢ培地（ＮＩＳＳＵＩ社製）を用いた。次いで、前培養液１ｍＬを１００ｍＬのＴＳＢ培地（ＮＩＳＳＵＩ社製）に添加し、青色の光（中心波長：４７０ｎｍ（半減値幅±１０ｎｍ）、波長強度：３．０μｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２）の照射下で、２８℃、２日間振盪培養（攪拌速度：１３５ｒｐｍ、ＴＡＩＴＥＣ社製大型高温振とう培養機バイオシェーカー（登録商標） ＢＲ－１８０ＬＦ）した。
【0146】
培養後、培養液を遠心分離（６，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）した。上清を回収し、そのうち１５ｍＬをファルコンチューブに分注し、３０ｍＬのエタノール（濃度９９．５質量％）を添加し、－８０℃で一晩インキュベートした。その後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）を行い、上清を除去して、ペレットに３００μＬの１×ＴＥバッファー（ｐＨ７．０）を添加して、懸濁した。懸濁液の内１０μＬを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ゲル濃度：１２．５質量％）を行い、ＣＢＢ染色により発現タンパク質を検出した。結果を図１３に示す。
【0147】
図１３に示すように、いずれの菌体外分泌酵素も検出された。
よって、発明者らが開発した光誘導性のタンパク質生産系を用いることで、種類に限定されず、菌体外分泌酵素を生産できることが明らかとなった。
よって、発明者らが開発した光誘導性のタンパク質生産系を用いることで、種類に限定されず、菌体外分泌酵素を生産できることが明らかとなった。
【0148】
（ＳＬＡＣ生産に対する光の波長の検討）
上記菌体外分泌酵素のうち、ＳＬＡＣをコードする遺伝子を挿入した、ｐＬｉｔ１９－ＳＬＡＣについて、光の波長の影響を検討した。
上記菌体外分泌酵素のうち、ＳＬＡＣをコードする遺伝子を挿入した、ｐＬｉｔ１９－ＳＬＡＣについて、光の波長の影響を検討した。
【0149】
まず、ｐＬｉｔ１９－ＳＬＡＣをＳ． ｇｒｉｓｅｕｓ（ＮＢＲＣ １３３５０）に形質転換（プロトプラスト／ＰＥＧ法）して、青色の光（中心波長：４７０ｎｍ（半減値幅±１０ｎｍ）、波長強度：３．０μｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２）、緑色の光（ピーク波長：波長５０５ｎｍ以上５１０ｎｍ以下、波長強度：１．０μｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２）、又は、赤色の光（中心波長：６６０ｎｍ（半減値幅±１５ｎｍ）、波長強度：３．０μｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２）の照射下で、２８℃、２４時間振盪培養（攪拌速度：１３５ｒｐｍ、ＴＡＩＴＥＣ社製大型高温振とう培養機バイオシェーカー（登録商標） ＢＲ－１８０ＬＦ）した。培地としては、ＹＭＰＤ培地、ＴＳＢ培地、又はＮＢＲＣ２２７培地を用いた。
【0150】
培養後、培養液を遠心分離（６，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）した。上清を回収し、そのうち１５ｍＬをファルコンチューブに分注し、３０ｍＬのエタノール（濃度９９．５質量％）を添加し、－８０℃で一晩インキュベートした。その後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）を行い、上清を除去して、ペレットに３００μＬの１×ＴＥバッファー（ｐＨ７．０）を添加して、懸濁した。懸濁液の内１０μＬを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ゲル濃度：１２．５質量％）を行い、ＣＢＢ染色により発現タンパク質を検出した。結果を図１４に示す。
【0151】
図１４に示すように、青色又は緑色の光照射下で培養した試料では、ＳＬＡＣが検出されたが、赤色の光照射下で培養した試料では、ＳＬＡＣが検出されなかった。
【0152】
（ＳＬＡＣ生産に対する培養日数の検討）
ｐＬｉｔ１９－ＳＬＡＣについて、培養日数のＳＬＡＣの生産への影響を検討した。
ｐＬｉｔ１９－ＳＬＡＣについて、培養日数のＳＬＡＣの生産への影響を検討した。
【0153】
まず、ｐＬｉｔ１９－ＳＬＡＣをＳ． ｇｒｉｓｅｕｓ（ＮＢＲＣ １３３５０）に形質転換（プロトプラスト／ＰＥＧ法）して、青色の光（中心波長：４７０ｎｍ（半減値幅±１０ｎｍ）、波長強度：３．０μｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２）の照射下で、２８℃、７日間振盪培養（攪拌速度：１３５ｒｐｍ、ＴＡＩＴＥＣ社製大型高温振とう培養機バイオシェーカー（登録商標） ＢＲ－１８０ＬＦ）した。培地としては、１００ｍＬのＹＭＰＤ培地、又はＴＳＢ培地を５００ｍＬバッフル付三角フラスコに入れて用いた。培養開始から、１、２、３、４、５、６、及び７日目に培養上清をそれぞれサンプリングした。
【0154】
次いで、サンプリングした培養上清のうち１０μＬを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ゲル濃度：１２．５質量％）を行い、ＣＢＢ染色により発現タンパク質を検出した。結果を図１５（ＹＭＰＤ培地）及び図１６（ＴＳＢ培地）に示す。
【0155】
図１５に示すように、ＹＭＰＤ培地を用いた試料では、培養日数が経過するのに伴って、ＳＬＡＣの生産量が増加し、培養開始から７日目には、１００ｍｇ／Ｌ以上５００ｍｇ／Ｌ以下程度のＳＬＡＣが検出された。
一方、図１６に示すように、ＴＳＢ培地を用いた試料では、培養日数が経過するのに伴って、ＳＬＡＣの生産量が減少しており、培養開始から１日目で５００ｍｇ／Ｌ以上１０００ｍｇ／Ｌ以下程度のＳＬＡＣが検出されていた。
一方、図１６に示すように、ＴＳＢ培地を用いた試料では、培養日数が経過するのに伴って、ＳＬＡＣの生産量が減少しており、培養開始から１日目で５００ｍｇ／Ｌ以上１０００ｍｇ／Ｌ以下程度のＳＬＡＣが検出されていた。
【0156】
（市販のＬＥＤライトによる光照射の検討）
培養機専用の青色の照明よりも安価な照明器具として、市販のＬＥＤライトの利用を検討した。
培養機専用の青色の照明よりも安価な照明器具として、市販のＬＥＤライトの利用を検討した。
【0157】
まず、ｐＬｉｔ１９－ＸｙｌＥをＳ． ｇｒｉｓｅｕｓ（ＮＢＲＣ １３３５０）に形質転換（プロトプラスト／ＰＥＧ法）して、市販のＬＥＤライト（Ｂｅｎａｔｕｒｅ ＬＥＤライト充電式 マグネット アウトドアライト、型番：Ｂ０７ＨＱＬ８６ＴＢ）を用いて、白色の光（波長：３８０ｎｍ以上７８０ｎｍ以下、波長強度：８．２ｍｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２）及び電球色の光（波長：３８０ｎｍ以上７８０ｎｍ以下、波長強度：８．２ｍｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２）の照射下で、２８℃、１日間振盪培養（攪拌速度：１３５ｒｐｍ、ＴＡＩＴＥＣ社製大型高温振とう培養機バイオシェーカー（登録商標） ＢＲ－１８０ＬＦ）した。培地としては、２０μｇ／ｍＬのチオストレプトン含有ＹＭＰＤ培地を用いた。
【0158】
培養後、菌体を回収して、１×ＴＥバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁後、Ｍｉｓｏｎｉｘ社製Ａｓｔｒａｓｏｎ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ ＸＬを用いて、Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ３０のパルス強度で、パルスオン１秒とパルスオフ１秒を３０回繰り返すことにより、細胞溶解物を得た。細胞溶解物を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ゲル濃度：１２．５質量％）を行い、ＣＢＢ染色により発現タンパク質を検出した。結果を図１７に示す。
【0159】
図１７に示すように、暗所（光非照射）下で培養した試料では、ＸｙｌＥは検出されなかったが、光照射下で培養した試料では、ＸｙｌＥが検出された。
よって、発明者らが開発した光誘導性のタンパク質生産系は、市販のＬＥＤライトを用いた場合でも、十分にタンパク質を生産できることが確かめられた。
よって、発明者らが開発した光誘導性のタンパク質生産系は、市販のＬＥＤライトを用いた場合でも、十分にタンパク質を生産できることが確かめられた。
【0160】
（遮光性バッフル付フラスコの検討）
遮光性バッフル付フラスコを用いた場合に、タンパク質生産が抑制されるかについて検討した。
遮光性バッフル付フラスコを用いた場合に、タンパク質生産が抑制されるかについて検討した。
【0161】
まず、ｐＬｉｔ１９－ＸｙｌＥをＳ． ｇｒｉｓｅｕｓ（ＮＢＲＣ １３３５０）に形質転換（プロトプラスト／ＰＥＧ法）して、青色の光（中心波長：４７０ｎｍ（半減値幅±１０ｎｍ）、波長強度：２．７５μｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２）の照射下で、２８℃、１日間又は２日間振盪培養（攪拌速度：１３５ｒｐｍ、ＴＡＩＴＥＣ社製大型高温振とう培養機バイオシェーカー（登録商標） ＢＲ－１８０ＬＦ）した。培地としては、ＹＭＰＤ培地を用いた。また、培養容器として、通常のバッフル付三角フラスコと、遮光性バッフル付フラスコを用いた。
【0162】
培養後、各菌体を回収して、１×ＴＥバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁後、Ｍｉｓｏｎｉｘ社製Ａｓｔｒａｓｏｎ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ ＸＬを用いて、Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ３０のパルス強度で、パルスオン１秒とパルスオフ１秒を３０回繰り返すことにより、細胞溶解物を得た。細胞溶解物を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ゲル濃度：１２．５質量％）を行い、ＣＢＢ染色により発現タンパク質を検出した。結果を図１８に示す。図１８において、「Ｎｏｒｍａｌ」は、通常のバッフル付三角フラスコを用いた試料であり、「Ｓｈａｄｉｎｇ」は、遮光性バッフル付フラスコを用いた試料である。
【0163】
図１８に示すように、通常のバッフル付三角フラスコを用いた試料では、培養日数の経過と共に、ＸｙｌＥの生産量が増加する傾向がみられた。一方、遮光性バッフル付フラスコを用いた試料では、暗所（光非照射）下で培養した試料と同様に、いずれの培養日数においてもＸｙｌＥは検出されなかった。
【0164】
［実施例２］
標的タンパク質の発現を向上させることを目的として、プラスミドベクターｐＬｉｔ１９の構成を検討して、以下の改良を試みた。
１）ターミネーター配列の挿入；
２）リボソーム結合サイトの挿入；
３）複製に関わるｓｔｉ領域の挿入
標的タンパク質の発現を向上させることを目的として、プラスミドベクターｐＬｉｔ１９の構成を検討して、以下の改良を試みた。
１）ターミネーター配列の挿入；
２）リボソーム結合サイトの挿入；
３）複製に関わるｓｔｉ領域の挿入
【0165】
（ターミネーター配列の検討）
ｍＣｈｅｒｒｙをコードする遺伝子を挿入した、ｐＬｉｔ１９－ｍＣｈｅｒｒｙ（配列番号７７）について、図１９に示す構造となるように改良を行った。改良された各プラスミドベクターＮｏ．１～Ｎｏ．５の配列をそれぞれ配列番号７８～８２に示す。また、ターミネーター配列ｔｔｓｂｉＢ及びｆｄの配列は以下の表に示すとおりである。
ｍＣｈｅｒｒｙをコードする遺伝子を挿入した、ｐＬｉｔ１９－ｍＣｈｅｒｒｙ（配列番号７７）について、図１９に示す構造となるように改良を行った。改良された各プラスミドベクターＮｏ．１～Ｎｏ．５の配列をそれぞれ配列番号７８～８２に示す。また、ターミネーター配列ｔｔｓｂｉＢ及びｆｄの配列は以下の表に示すとおりである。
【0166】
【表5】
【0167】
次いで、各プラスミドベクターをＳ． ｇｒｉｓｅｕｓ（ＮＢＲＣ １３３５０）に形質転換（プロトプラスト／ＰＥＧ法）して、白色の光（波長：４５０ｎｍ以上７５０ｎｍ以下、波長強度：１．０μｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２）の照射下で、２８℃、３日間振盪培養（攪拌速度：１３５ｒｐｍ、ＴＡＩＴＥＣ社製大型高温振とう培養機バイオシェーカー（登録商標） ＢＲ－１８０ＬＦ）した。培地としては、２０μｇ／ｍＬのチオストレプトン含有ＹＭＰＤ培地を用いた。３日間培養後の各菌体の観察像を図１９に示す。図１９において、「Ｗｈｉｔｅ Ｌｉｇｈｔ」は、白色の光照射下で培養した試料である。
【0168】
図１９に示すように、ターミネーター配列ｔｔｓｂｉＢを挿入した試料では、ｍＣｈｅｒｒｙの産生量が顕著に高かった。
【0169】
（リボソーム結合サイトの検討）
参考文献１（Horbal L et al., “A set of synthetic versatile genetic control elements for the efficient expression of genes in Actinobacteria.”, Scientific Reports, Vol. 8, No. 491, 2018; DOI:10.1038/s41598-017-18846-1.）におけるリボソーム結合サイトの配列を基に、ｐＬｉｔ１９－ＸｙｌＥにおいて、クローニング用制限酵素サイト（配列番号８４）と開始コドン（配列番号８５）の間に、以下の表に示すリボソーム結合サイト及び周辺配列（配列番号８～１４及び８６）をそれぞれ挿入して、プラスミドベクターを改良した。
参考文献１（Horbal L et al., “A set of synthetic versatile genetic control elements for the efficient expression of genes in Actinobacteria.”, Scientific Reports, Vol. 8, No. 491, 2018; DOI:10.1038/s41598-017-18846-1.）におけるリボソーム結合サイトの配列を基に、ｐＬｉｔ１９－ＸｙｌＥにおいて、クローニング用制限酵素サイト（配列番号８４）と開始コドン（配列番号８５）の間に、以下の表に示すリボソーム結合サイト及び周辺配列（配列番号８～１４及び８６）をそれぞれ挿入して、プラスミドベクターを改良した。
【0170】
【表6】
【0171】
次いで、各プラスミドベクターをＳ． ｇｒｉｓｅｕｓ（ＮＢＲＣ １３３５０）に形質転換（プロトプラスト／ＰＥＧ法）して、青色の光（中心波長：４７０ｎｍ（半減値幅±１０ｎｍ）、波長強度：２．７５μｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２）の照射下で、２８℃、２日間振盪培養（攪拌速度：１３５ｒｐｍ、ＴＡＩＴＥＣ社製大型高温振とう培養機バイオシェーカー（登録商標） ＢＲ－１８０ＬＦ）した。培地としては、２０μｇ／ｍＬのチオストレプトン含有ＹＭＰＤ培地（１００ｍＬ）を用いた。
【0172】
培養後、各菌体を回収して、１×ＴＥバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁後、Ｍｉｓｏｎｉｘ社製Ａｓｔｒａｓｏｎ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ ＸＬを用いて、Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ３０のパルス強度で、パルスオン１秒とパルスオフ１秒を３０回繰り返すことにより、細胞溶解物を得た。細胞溶解物を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ゲル濃度：１２．５質量％）を行い、ＣＢＢ染色により発現タンパク質を検出した。結果を図２０に示す。
【0173】
図２０に示すように、Ｗ５以外のリボソーム結合サイト及びその周辺配列を挿入したプラスミドベクターを用いた試料では、ＸｙｌＥが検出された。
Ｗ５２及びＳＡＶ２７９４のリボソーム結合サイト及びその周辺配列を挿入したプラスミドベクターを用いた試料では、ＸｙｌＥの生産量が特に顕著であった。
Ｗ５２及びＳＡＶ２７９４のリボソーム結合サイト及びその周辺配列を挿入したプラスミドベクターを用いた試料では、ＸｙｌＥの生産量が特に顕著であった。
【0174】
（複製に関わるｓｔｉ領域の検討）
プラスミドベクターｐＬｉｔ１９－Ｂ（配列番号８７）のＫｐｎＩ－ＮｓｉＩサイト間に、放線菌プラスミドｐＩＪ１０１、ｐＪＶ１、又はｐＳＧ５由来のｓｔｉ領域を導入して、ｐＬｉｔ１９のＤＮＡ収量の変化を検討した。具体的には、以下の表に示すプラスミドを構築した。また、ｐＪＶ１由来のｓｔｉ領域（ΔＢａｍＨＩ ｓｉｔｅ）の塩基配列を配列番号９５に示す。
プラスミドベクターｐＬｉｔ１９－Ｂ（配列番号８７）のＫｐｎＩ－ＮｓｉＩサイト間に、放線菌プラスミドｐＩＪ１０１、ｐＪＶ１、又はｐＳＧ５由来のｓｔｉ領域を導入して、ｐＬｉｔ１９のＤＮＡ収量の変化を検討した。具体的には、以下の表に示すプラスミドを構築した。また、ｐＪＶ１由来のｓｔｉ領域（ΔＢａｍＨＩ ｓｉｔｅ）の塩基配列を配列番号９５に示す。
【0175】
【表7】
【0176】
上記各プラスミドベクターをＳ． ｇｒｉｓｅｕｓ（ＮＢＲＣ １３３５０）に形質転換（プロトプラスト／ＰＥＧ法）して、光非照射下で、２８℃、２日間又は３日間振盪培養（攪拌速度：１３５ｒｐｍ、ＴＡＩＴＥＣ社製大型高温振とう培養機バイオシェーカー（登録商標） ＢＲ－１８０ＬＦ）した。培地としては、２０μｇ／ｍＬのチオストレプトン含有ＹＭＰＤ培地（１０ｍＬ）、又は、２０μｇ／ｍＬのチオストレプトン含有ＮＢＲＣ２２７培地（１０ｍＬ）を用いた。
【0177】
培養後、各菌体を回収して、２ｍＬのＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（５０ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、及び２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を加え、菌体を完全に懸濁した。１ｍｇ／ｍＬになるようにリゾチームを加え、３７℃で撹拌しながら１時間インキュベートした。２ｍＬのＳｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩ（０．２Ｎ ＮａＯＨ、１質量％ＳＤＳ）を加え、よく攪拌した後、氷水上で５分間インキュベートした。２ｍＬのＳｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩＩ（３Ｍ 酢酸カリウム、２Ｍ 酢酸）を加え、素早くかつ激しく攪拌し、氷水上で３０分間インキュベートした。７，３００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心し、上清を１５ｍＬチューブに移した。６ｍＬの２－プロパノールを加え、攪拌した後、氷水で２時間インキュベートした。７，３００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心し、上清を除去した。沈殿に２５０μＬの１×ＴＥ（ｐＨ８．０）を加え、ピペッティングで沈殿を完全に溶解し、１．５ｍＬチューブに移した。１，２５０μＬのキアゲン社ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔに含まれるＰＢ溶液を加え、よく攪拌した。ＱＩＡｐｒｅｐ ２．０スピンカラムに、７５０μＬのサンプルを添加し、１０，０００ｒｐｍ、４℃で１分間遠心した。フロースルー液を捨て、残り７５０μＬのサンプルを添加し、再度１０，０００ｒｐｍ、４℃で１分間遠心した。フロースルー液を捨て、７５０μＬのＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔに含まれるＰＥ溶液を添加し、１０，０００ｒｐｍ、４℃で１分間遠心した。フロースルー液を捨て、１３，０００ｒｐｍ、４℃で１分間遠心した。１３５μＬのＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔに含まれるＥＢ溶液を加えて、１０，０００ｒｐｍ、４℃で１分間遠心し、粗ＤＮＡ精製溶液を得た。次いで、粗ＤＮＡ精製溶液から、Ｐｌａｓｍｉｄ－Ｓａｆｅ ＡＴＰ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＤＮａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）及びＲＮａｓｅを用いて染色体及びＲＮＡ除去して、ＤＮＡ含有液を得た。なお、「Ｐｌａｓｍｉｄ－Ｓａｆｅ ＡＴＰ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＤＮａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）」は、ｌｉｎｅａｒ－ｄｓＤＮＡやｃｌｏｓｅｄ環状ｓｓＤＮＡ、ｌｉｎｅａｒ－ｓｓＤＮＡを分解し、ｎｉｃｋｅｄ及びｃｌｏｓｅｄ環状ｄｓＤＮＡは分解しない酵素である。
次いで、得られたＤＮＡ含有液を用いて、アガロースゲル電気泳動を行った。結果を図２１に示す。図２１において、対照として、ｓｔｉ領域を含まないプラスミドベクターであるｐＩＪ７０２（配列番号９６）及びｐＬｉｔ１９もアガロースゲルにアプライして、電気泳動を行った。
次いで、得られたＤＮＡ含有液を用いて、アガロースゲル電気泳動を行った。結果を図２１に示す。図２１において、対照として、ｓｔｉ領域を含まないプラスミドベクターであるｐＩＪ７０２（配列番号９６）及びｐＬｉｔ１９もアガロースゲルにアプライして、電気泳動を行った。
【0178】
また、電気泳動で高純度プラスミドが取得できていることが確認されたため、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｌｉｔｅ分光光度計を用いて、ＤＮＡ濃度を測定した。結果を以下の表に示す。なお、表において、「＊」における培養条件は、２０μｇ／ｍＬのチオストレプトン含有ＹＭＰＤ培地（１０ｍＬ）を用いて、２８℃、３日間であり、「＊＊」における培養条件は、２０μｇ／ｍＬのチオストレプトン含有ＮＢＲＣ２２７培地（１０ｍＬ）を用いて、２８℃、２日間である。
【0179】
【表8】
【0180】
図２１及び上記表に示すように、ｓｔｉ領域をｎａｔｕｒａｌの向きで導入したプラスミドベクターは、ｓｔｉ領域を含まないプラスミドベクターよりもＤＮＡの収量が増加する傾向がみられた。
ｐＪＶ1由来のｓｔｉ領域をｎａｔｕｒａｌの向きで導入したプラスミドベクターは、ＤＮＡの収量が特に多かった。
ｐＪＶ1由来のｓｔｉ領域をｎａｔｕｒａｌの向きで導入したプラスミドベクターは、ＤＮＡの収量が特に多かった。
【0181】
次に、ｐＪＶ１由来のｓｔｉ領域をｎａｔｕｒａｌの向きで導入したプラスミドベクターｐＬｉｔ１９＋ｐＪＶ１ ｓｔｉのマルチクローニングサイトのＨｉｎｄＩＩＩ－ＸｂａＩサイト間に、ＸｙｌＥをコードする遺伝子を挿入して、プラスミドベクターｐＬｉｔ１９＋ｐＪＶ１ ｓｔｉ－ＸｙｌＥ（全長配列：配列番号９７）を構築した。
【0182】
プラスミドベクターｐＬｉｔ１９＋ｐＪＶ１ ｓｔｉ－ＸｙｌＥをＳ． ｇｒｉｓｅｕｓ（ＮＢＲＣ １３３５０）に形質転換（プロトプラスト／ＰＥＧ法）して、青色の光（中心波長：４７０ｎｍ（半減値幅±１０ｎｍ）、波長強度：１．０μｍｏｌ・ｓ－１・ｍ－２）の照射下で、２８℃、１日間又は２日間振盪培養（攪拌速度：１３５ｒｐｍ、ＴＡＩＴＥＣ社製大型高温振とう培養機バイオシェーカー（登録商標） ＢＲ－１８０ＬＦ）した。培地としては、ＹＭＰＤ培地を用いた。
また、対照として、ｓｔｉ領域を含まないプラスミドベクターｐＬｉｔ１９－ＸｙｌＥも同様にＳ． ｇｒｉｓｅｕｓ（ＮＢＲＣ １３３５０）に形質転換（プロトプラスト／ＰＥＧ法）して、上記条件下で１日間又は２日間振盪培養（攪拌速度：１３５ｒｐｍ、ＴＡＩＴＥＣ社製大型高温振とう培養機バイオシェーカー（登録商標） ＢＲ－１８０ＬＦ）した。
また、対照として、ｓｔｉ領域を含まないプラスミドベクターｐＬｉｔ１９－ＸｙｌＥも同様にＳ． ｇｒｉｓｅｕｓ（ＮＢＲＣ １３３５０）に形質転換（プロトプラスト／ＰＥＧ法）して、上記条件下で１日間又は２日間振盪培養（攪拌速度：１３５ｒｐｍ、ＴＡＩＴＥＣ社製大型高温振とう培養機バイオシェーカー（登録商標） ＢＲ－１８０ＬＦ）した。
【0183】
培養後、各菌体を回収して、１×ＴＥバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁後、Ｍｉｓｏｎｉｘ社製Ａｓｔｒａｓｏｎ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ ＸＬを用いて、Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ ３０のパルス強度で、パルスオン１秒とパルスオフ１秒を３０回繰り返すことにより、細胞溶解物を得た。細胞溶解物を用いて、発現したＸｙｌＥの活性を０.２ｍＭ カテコールが含まれる１０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー中におけるタンパク質１ｍｇあたり、１分間における吸光度３７５ｎｍの変化をもとに算出した。結果を図２２に示す。
【0184】
図２２に示すように、ｐＬｉｔ１９＋ｐＪＶ１ ｓｔｉ－ＸｙｌＥを用いた試料では、ｐＬｉｔ１９－ＸｙｌＥを用いた試料よりも、ＸｙｌＥの活性が高い傾向がみられた。
また、培養開始から２日目で、ｐＬｉｔ１９＋ｐＪＶ１ ｓｔｉ－ＸｙｌＥを用いた試料は、ｐＬｉｔ１９－ＸｙｌＥを用いた試料よりも、ＸｙｌＥの活性が顕著に高かった。
また、培養開始から２日目で、ｐＬｉｔ１９＋ｐＪＶ１ ｓｔｉ－ＸｙｌＥを用いた試料は、ｐＬｉｔ１９－ＸｙｌＥを用いた試料よりも、ＸｙｌＥの活性が顕著に高かった。
【産業上の利用可能性】
【0185】
本実施形態のプラスミドベクター、組換え放線菌及び標的タンパク質の生産方法によれば、生産コストを抑えながら、放線菌において標的タンパク質を効率良く製造することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【配列表】