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特開2023-127794植物の改変方法及び植物のゲノム編集方法、並びに植物の作製方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023127794
(43)【公開日】2023-09-14
(54)【発明の名称】植物の改変方法及び植物のゲノム編集方法、並びに植物の作製方法
(51)【国際特許分類】
A01H 1/00 20060101AFI20230907BHJP
A01H 6/46 20180101ALI20230907BHJP
A01H 6/54 20180101ALI20230907BHJP
A01H 6/82 20180101ALI20230907BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20230907BHJP
A01H 6/74 20180101ALI20230907BHJP
C12N 15/87 20060101ALI20230907BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20230907BHJP
【ＦＩ】
A01H1/00 A ZNA
A01H6/46
A01H6/54
A01H6/82
C12N15/09 100
A01H6/74
C12N15/87 Z
C12N15/11 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】11
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022031698
(22)【出願日】2022-03-02
(71)【出願人】
【識別番号】000000941
【氏名又は名称】株式会社カネカ
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(74)【代理人】
【識別番号】100107515
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100107733
【弁理士】
【氏名又は名称】流 良広
(74)【代理人】
【識別番号】100115347
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 奈緒子
(72)【発明者】
【氏名】遠藤 亮
(72)【発明者】
【氏名】柳楽 洋三
(72)【発明者】
【氏名】濱田 晴康
(72)【発明者】
【氏名】三木 隆二
(72)【発明者】
【氏名】吉積 毅
(72)【発明者】
【氏名】木村 光宏
【テーマコード（参考）】
2B030
【Ｆターム（参考）】
2B030AA02
2B030AB03
2B030AD07
2B030CA16
2B030CB01
2B030CG05
(57)【要約】
【課題】短期間で効率良くミトコンドリア遺伝子を改変することのできる、植物の改変方法及び植物のゲノム編集方法並びに植物の作製方法を提供すること。
【解決手段】ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドと相互作用させた核酸で被覆した微粒子を植物に撃ち込む工程を含むことを特徴とする植物の改変方法、ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドと相互作用させた核酸で被覆した微粒子を植物に撃ち込む工程を含むことを特徴とする植物のゲノム編集方法、及びミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドと相互作用させた核酸で被覆した微粒子を植物に撃ち込む工程と、前記微粒子を撃ち込んだ植物を生育し、植物体を得る工程と、を含むことを特徴とする植物の作製方法である。
【選択図】なし
【解決手段】ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドと相互作用させた核酸で被覆した微粒子を植物に撃ち込む工程を含むことを特徴とする植物の改変方法、ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドと相互作用させた核酸で被覆した微粒子を植物に撃ち込む工程を含むことを特徴とする植物のゲノム編集方法、及びミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドと相互作用させた核酸で被覆した微粒子を植物に撃ち込む工程と、前記微粒子を撃ち込んだ植物を生育し、植物体を得る工程と、を含むことを特徴とする植物の作製方法である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドと相互作用させた核酸で被覆した微粒子を植物に撃ち込む工程を含むことを特徴とする植物の改変方法。
【請求項2】
前記ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドが、ミトコンドリア輸送シグナル配列及びポリカチオン配列を含むペプチドである、請求項１に記載の植物の改変方法。
【請求項3】
前記植物が、コムギ、オオムギ、イネ、トウモロコシ、ダイズ、ジャガイモ及びリンゴからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の植物の改変方法。
【請求項4】
前記微粒子を撃ち込んだ植物を生育し、植物体を得る工程を含む、請求項１から３のいずれかに記載の植物の改変方法。
【請求項5】
ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドと相互作用させた核酸で被覆した微粒子を植物に撃ち込む工程を含むことを特徴とする植物のゲノム編集方法。
【請求項6】
前記ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドが、ミトコンドリア輸送シグナル配列及びポリカチオン配列を含むペプチドである、請求項５に記載の植物のゲノム編集方法。
【請求項7】
前記植物が、コムギ、オオムギ、イネ、トウモロコシ、ダイズ、ジャガイモ及びリンゴからなる群から選択される、請求項５又は６に記載の植物のゲノム編集方法。
【請求項8】
前記微粒子を撃ち込んだ植物を生育し、植物体を得る工程を含む、請求項５から７のいずれかに記載の植物のゲノム編集方法。
【請求項9】
ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドと相互作用させた核酸で被覆した微粒子を植物に撃ち込む工程と、
前記微粒子を撃ち込んだ植物を生育し、植物体を得る工程と、を含むことを特徴とする植物の作製方法。
前記微粒子を撃ち込んだ植物を生育し、植物体を得る工程と、を含むことを特徴とする植物の作製方法。
【請求項10】
前記ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドが、ミトコンドリア輸送シグナル配列及びポリカチオン配列を含むペプチドである、請求項９に記載の植物の作製方法。
【請求項11】
前記植物が、コムギ、オオムギ、イネ、トウモロコシ、ダイズ、ジャガイモ及びリンゴからなる群から選択される、請求項９又は１０に記載の植物の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、植物の改変方法及び植物のゲノム編集方法、並びに植物の作製方法に関する。
【背景技術】
【0002】
細胞小器官であるミトコンドリアは、核と相互に情報交換することにより細胞の恒常性維持に寄与している。植物において、ミトコンドリアと核が拒絶しあうと花粉が不稔化する現象が知られており、これを細胞質雄性不稔（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｍａｌｅ ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ：ＣＭＳ）という。
前記現象は、作物の高収量化をもたらすＦ１ハイブリッド育種に応用されており、主要穀物でＣＭＳ系統が作出されている。ＣＭＳ形質は、ミトコンドリアゲノムに存在する機能未知遺伝子に起因し、イネやコムギでは古典的交配による細胞質置換法により導入される。
前記現象は、作物の高収量化をもたらすＦ１ハイブリッド育種に応用されており、主要穀物でＣＭＳ系統が作出されている。ＣＭＳ形質は、ミトコンドリアゲノムに存在する機能未知遺伝子に起因し、イネやコムギでは古典的交配による細胞質置換法により導入される。
【0003】
しかしながら、細胞質置換系統の作出には連続交配を要し、８年前後を必要とすることから、汎用的な遺伝子組換え技術によるＣＭＳ形質導入法、すなわちミトコンドリア遺伝子改変法の開発が必要とされている。
【0004】
ミトコンドリア遺伝子改変法を確立する為には、１．ＤＮＡ断片の細胞導入効率、２．ＤＮＡ断片のミトコンドリア輸送効率、３．ミトコンドリアゲノム標的部位へのＤＮＡ導入効率、の３点が解決すべき課題となるが、これらの課題を解決した技術は今のところ報告されていない。
【0005】
これまでに、ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドを用いた、ミトコンドリア遺伝子改変法が報告されているが（特許文献１、非特許文献１）、これらの方法では、ＤＮＡ断片を、直接浸透法、又は真空及び圧縮処理により、細胞へ導入しており、ＤＮＡ断片の細胞導入効率が十分ではない。
したがって、短期間で効率良くミトコンドリア遺伝子を改変することのできる、植物の改変方法及び植物のゲノム編集方法、並びに植物の作製方法は未だ提供されておらず、その速やかな提供が強く求められている。
したがって、短期間で効率良くミトコンドリア遺伝子を改変することのできる、植物の改変方法及び植物のゲノム編集方法、並びに植物の作製方法は未だ提供されておらず、その速やかな提供が強く求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】国際公開第２０１３／１２９６９８号パンフレット
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１８:１５８２－１５９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、短期間で効率良くミトコンドリア遺伝子を改変することのできる、植物の改変方法及び植物のゲノム編集方法、並びに植物の作製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らが、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドと相互作用させた核酸で被覆した微粒子を植物に撃ち込む工程を含むことを特徴とする植物の改変方法、ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドと相互作用させた核酸で被覆した微粒子を植物に撃ち込む工程を含むことを特徴とする植物のゲノム編集方法、又はミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドと相互作用させた核酸で被覆した微粒子を植物に撃ち込む工程と、前記微粒子を撃ち込んだ植物を生育し、植物体を得る工程と、を含むことを特徴とする植物の作製方法により、短期間で効率良くミトコンドリア遺伝子を改変することのできる、植物の改変方法及び植物のゲノム編集方法、並びに植物の作製方法が提供できることを知見した。
【0010】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては以下のとおりである。即ち、
＜１＞ ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドと相互作用させた核酸で被覆した微粒子を植物に撃ち込む工程を含むことを特徴とする植物の改変方法である。
＜２＞ ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドと相互作用させた核酸で被覆した微粒子を植物に撃ち込む工程を含むことを特徴とする植物のゲノム編集方法である。
＜３＞ ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドと相互作用させた核酸で被覆した微粒子を植物に撃ち込む工程と、前記微粒子を撃ち込んだ植物を生育し、植物体を得る工程と、を含むことを特徴とする植物の作製方法である。
＜１＞ ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドと相互作用させた核酸で被覆した微粒子を植物に撃ち込む工程を含むことを特徴とする植物の改変方法である。
＜２＞ ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドと相互作用させた核酸で被覆した微粒子を植物に撃ち込む工程を含むことを特徴とする植物のゲノム編集方法である。
＜３＞ ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドと相互作用させた核酸で被覆した微粒子を植物に撃ち込む工程と、前記微粒子を撃ち込んだ植物を生育し、植物体を得る工程と、を含むことを特徴とする植物の作製方法である。
【発明の効果】
【0011】
本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、短期間で効率良くミトコンドリア遺伝子を改変することのできる、植物の改変方法及び植物のゲノム編集方法、並びに植物の作製方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【発明を実施するための形態】
【0013】
（植物の改変方法）
前記植物の改変方法は、相互作用工程と、被覆工程と、撃ち込み工程と、を含み、さらにその他の工程を含むことができる。
前記植物の改変方法は、相互作用工程と、被覆工程と、撃ち込み工程と、を含み、さらにその他の工程を含むことができる。
【0014】
＜相互作用工程＞
前記相互作用は、核酸と、ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドと、を相互作用させる工程である。
前記相互作用は、核酸と、ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドと、を相互作用させる工程である。
【0015】
－核酸－
前記核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが挙げられる。
前記核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが挙げられる。
【0016】
前記核酸は、ミトコンドリアに輸送させる核酸であり、ミトコンドリアに輸送させることを目的とする遺伝子（目的配列）などを含むことができる。
前記核酸は、ゲノム編集手段であってもよい。
前記核酸は、ゲノム編集手段であってもよい。
【0017】
前記ミトコンドリアに輸送させることを目的とする遺伝子（目的配列）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、雄性不稔に関連する遺伝子、又はその断片などが挙げられる。
【0018】
前記核酸は、ベクターに組み込まれたものを使用することができる。
【0019】
前記ベクターの種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、環状プラスミド、線状プラスミド、プラスミドを制限酵素等で切断した線状ＤＮＡ、導入するＤＮＡ断片のみを切り出した核酸カセット断片、カセット断片の一方もしくは両方の端に０．８ｋｂ以上、１．２ｋｂ以下の核酸が付加されたＤＮＡ断片、コスミド、人工染色体、などが挙げられる。
【0020】
前記ＤＮＡ断片は、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ断片であってもよい。この場合、付加される核酸としては、特に制限されず、ベクター由来の配列であってもよいが、導入の標的部位の配列が好ましい。
【0021】
前記カセット断片の端に付加される核酸の長さの下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．５ｋｂ以上が好ましく、０．８ｋｂ以上がより好ましく、１．０ｋｂ以上がさらに好ましい。
前記カセット断片の端に付加される核酸の長さの上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３．０ｋｂ以下が好ましく、２．０ｋｂ以下がより好ましく、１．５ｋｂ以下がさらに好ましい。
前記カセット断片の端に付加される核酸の長さの上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３．０ｋｂ以下が好ましく、２．０ｋｂ以下がより好ましく、１．５ｋｂ以下がさらに好ましい。
【0022】
前記ベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｐＡＬ５１、ｐＡＬ１５６等のｐＡＬ系、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ９等のｐＵＣ系、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ２１１３、ｐＢＩ１０１．２等のｐＢＩ系、ｐＰＺＰ系、ｐＳＭＡ系、ｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴ等の中間ベクター系、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、インゲンマメモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）などが挙げられる。
【0023】
前記ベクターに目的配列を挿入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製された核酸を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトなどに挿入してベクターに連結する方法などが挙げられる。
また、二重交叉組換え（ｄｏｕｂｌｅ ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ）により中間ベクターに目的配列を挿入してもよく、ＴＡクローニング、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニングなどを用いてもよい。
また、二重交叉組換え（ｄｏｕｂｌｅ ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ）により中間ベクターに目的配列を挿入してもよく、ＴＡクローニング、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニングなどを用いてもよい。
【0024】
前記ベクターには、さらに、プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、イントロン、ターミネーター、ポリＡ付加シグナル、選抜マーカー遺伝子などを連結することができる。
【0025】
前記プロモーターとしては、植物体内、又は植物細胞において機能し、構成的に発現するか、植物の特定の組織内あるいは特定の発育段階において発現を導くことのできるＤＮＡであれば、植物由来のものでなくてもよい。
【0026】
前記プロモーターの具体例としては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、Ｅｌ２―３５Ｓオメガプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｐｎｏｓ）、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来ＰＲタンパク質プロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＲｕＢｉｓｃｏプロモーターなどが挙げられる。
【0027】
翻訳活性を高める配列、例えば、タバコモザイクウイルスのオメガ配列を用いて翻訳効率を上げることができる。
翻訳開始領域としてＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）をプロモーターの３’－下流側で、翻訳開始コドンの５’－上流側に挿入することで複数のコーディング領域からタンパク質を翻訳させることもできる。
翻訳開始領域としてＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）をプロモーターの３’－下流側で、翻訳開始コドンの５’－上流側に挿入することで複数のコーディング領域からタンパク質を翻訳させることもできる。
【0028】
前記ターミネーターとしては、前記プロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結でき、ポリＡ付加シグナルを有する配列であればよく、例えば、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素（ＯＣＳ）遺伝子のターミネーター、ＣａＭＶ ３５Ｓ ターミネーター、シクロオキシゲナーゼ２（ｃｏｘ２）遺伝子のターミネーターなどが挙げられる。
【0029】
前記選抜マーカー遺伝子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ビアラホス耐性遺伝子、グリフォセート耐性遺伝子（ＥＰＳＰＳ）、スルホニル尿素系耐性遺伝子（ＡＬＳ）等の除草剤耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、蛍光、又はルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニターゼ（ＧＵＳ）、グリーンフルオレッセンスプロテイン（ＧＦＰ）等の発光レポーター遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴ ＩＩ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ等の酵素遺伝子などが挙げられる。
ただし、本発明によれば選抜マーカー遺伝子を導入しなくても形質転換体の作製は可能である。
ただし、本発明によれば選抜マーカー遺伝子を導入しなくても形質転換体の作製は可能である。
【0030】
－－ゲノム編集手段－－
前記ゲノム編集手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ガイドＲＮＡ、ガイドＲＮＡをコードする核酸、核酸代謝酵素をコードする核酸、遺伝子結合タンパク質をコードする核酸などが挙げられる。
前記ゲノム編集手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ガイドＲＮＡ、ガイドＲＮＡをコードする核酸、核酸代謝酵素をコードする核酸、遺伝子結合タンパク質をコードする核酸などが挙げられる。
【0031】
前記ガイドＲＮＡの長さの下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１５ヌクレオチド以上が好ましく、１６ヌクレオチド以上がより好ましく、１７ヌクレオチド以上がさらに好ましく、１８ヌクレオチド以上がよりさらに好ましく、１９ヌクレオチド以上が特に好ましく、２０ヌクレオチド以上が最も好ましい。
前記ガイドＲＮＡの長さの上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３０ヌクレオチド以下が好ましく、２５ヌクレオチド以下がより好ましく、２２ヌクレオチド以下がさらに好ましく、２０ヌクレオチド以下が特に好ましい。
前記ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒ配列に融合しているガイド配列を含んでいてもよい。
前記ガイドＲＮＡの長さの上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３０ヌクレオチド以下が好ましく、２５ヌクレオチド以下がより好ましく、２２ヌクレオチド以下がさらに好ましく、２０ヌクレオチド以下が特に好ましい。
前記ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒ配列に融合しているガイド配列を含んでいてもよい。
【0032】
前記核酸代謝酵素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、ヌクレアーゼ、又はデアミナーゼなどが挙げられる。
【0033】
前記ヌクレアーゼとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムのＣＡＳヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ活性を発現するタンパク質、ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＲＧＥＴ ＡＩＤ、メガヌクレアーゼなどが挙げられる。
前記ヌクレアーゼは、由来する生物種が異なるものであってもよく、例えば、動物、植物、微生物、ウイルスなどの遺伝子や、人工合成遺伝子を用いることができる。
前記ヌクレアーゼは、由来する生物種が異なるものであってもよく、例えば、動物、植物、微生物、ウイルスなどの遺伝子や、人工合成遺伝子を用いることができる。
【0034】
前記ＣＡＳヌクレアーゼとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素などが挙げられるが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素であるＣａｓ９が好ましい。
前記ＣＡＳヌクレアーゼは、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されていてもよい。前記ＣＡＳヌクレアーゼは、標的配列の局在における１つ、又は２つの鎖の開裂を指向し得る。
前記ＣＡＳヌクレアーゼは、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されていてもよい。前記ＣＡＳヌクレアーゼは、標的配列の局在における１つ、又は２つの鎖の開裂を指向し得る。
【0035】
前記Ｃａｓ９としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のＣａｓ９、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９、Ｓ．サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９などが挙げられるが、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９が好ましい。また、これらの生物に由来する突然変異Ｃａｓ９であってもよく、ニッカーゼ（一方のＤＮＡ鎖のみにｎｉｃｋを入れるＤＮＡ切断酵素）として機能することが知られているＣａｓ９のＤ１０Ａ変異体であってもよく、Ｃａｓ９ホモログ、又はオルソログであってもよい。
【0036】
前記デアミナーゼとしては、脱アミノ化酵素活性を有するものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムから、ヌクレアーゼ活性を除去したものに付加して使用することができる。
【0037】
前記ガイドＲＮＡをコードする核酸、前記核酸代謝酵素をコードする核酸、前記遺伝子結合タンパク質をコードする核酸は、ベクターに組み込まれたものを使用することができる。
前記ベクターは、前述のとおりである。
前記ベクターは、前述のとおりである。
【0038】
－ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチド－
前記ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドは、ミトコンドリア輸送シグナル配列を含み、さらに、その他の配列を含むことができる。
前記ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドは、ミトコンドリア輸送シグナル配列を含み、さらに、その他の配列を含むことができる。
【0039】
前記ミトコンドリア輸送シグナル配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ミトコンドリアマトリックス標的シグナルペプチド（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １９９６ ２２６：５６１－５６５）、ＳＳ０１、ＳＳ０２、ＳＳ３１、ＳＳ２０等のミトコンドリア内膜標的シグナルペプチド（Ｔｈｅ ＡＡＰＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ２００６ ８：Ｅ２７７－Ｅ２８３）、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ＩＶなどが挙げられる。
これらの中でも、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ＩＶが好ましく、酵母由来のＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ＩＶがより好ましい。
これらの中でも、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ＩＶが好ましく、酵母由来のＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ＩＶがより好ましい。
【0040】
前記ミトコンドリア輸送シグナル配列の具体例としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＭＬＳＬＲＱＳＩＲＦＦＫ（配列番号１）などが挙げられる。
【0041】
前記その他の配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリカチオン配列などが挙げられる。
前記ポリカチオン配列は、核酸結合能を有する。
前記ポリカチオン配列は、核酸結合能を有する。
【0042】
前記ポリカチオン配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、正に荷電したアミノ酸残基（カチオン性アミノ酸残基）の、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）から選ばれる少なくとも３個のアミノ酸残基を有する配列などが挙げられる。
前記ポリカチオン配列は、前記リシン、アルギニン及びヒスチジンのほかに、その全体的な性質が十分にカチオン性を保持して生理学的条件下で核酸と安定した結合を形成するという条件で、中性アミノ酸を含むこともできる。
前記ポリカチオン配列は、前記リシン、アルギニン及びヒスチジンのほかに、その全体的な性質が十分にカチオン性を保持して生理学的条件下で核酸と安定した結合を形成するという条件で、中性アミノ酸を含むこともできる。
【0043】
前記ポリカチオン配列の長さ（アミノ酸残基）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５以上１００以下が好ましく、５以上５０以下がより好ましく、７以上２０以下がさらに好ましい。
【0044】
前記ポリカチオン配列の具体例としては、リシン（Ｋ）の連続配列、アルギニン（Ｒ）の連続配列、ヒスチジン（Ｈ）の連続配列、リシン（Ｋ）とヒスチジン（Ｈ）の繰り返し連続配列などが挙げられる。
前記連続配列の連続数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３以上２０以下が好ましく、５以上１５以下がより好ましく、７以上１２以下がさらに好ましい。
これらの中でも、ＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨ（配列番号２）、又はＲＲＲＲＲＲ（配列番号３）が好ましく、ＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨ（配列番号２）がより好ましい。
前記連続配列の連続数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３以上２０以下が好ましく、５以上１５以下がより好ましく、７以上１２以下がさらに好ましい。
これらの中でも、ＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨ（配列番号２）、又はＲＲＲＲＲＲ（配列番号３）が好ましく、ＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨ（配列番号２）がより好ましい。
【0045】
前記ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドが、前記ミトコンドリア輸送シグナル配列と前記ポリカチオン配列を含む場合における、前記ミトコンドリア輸送シグナル配列と前記ポリカチオン配列の前記ペプチドの１次構造における相対位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記ペプチドのＮ末側に前記ミトコンドリア輸送シグナル配列が位置し、前記ペプチドのＣ末側に前記ポリカチオン配列が位置することが好ましい。
【0046】
－相互作用－
前記相互作用としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ファンデルワールス力などの分子間力結合、水素結合、共有結合、イオン結合等の化学結合などによる、前記核酸と前記ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドとの結合が挙げられる。
これらの中でも、イオン結合が好ましい。
前記相互作用により、前記核酸と前記ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドとは、複合体を形成することができる。
前記相互作用としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ファンデルワールス力などの分子間力結合、水素結合、共有結合、イオン結合等の化学結合などによる、前記核酸と前記ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドとの結合が挙げられる。
これらの中でも、イオン結合が好ましい。
前記相互作用により、前記核酸と前記ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドとは、複合体を形成することができる。
【0047】
前記相互作用の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記核酸と前記ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドとを混合及び静置する方法などが挙げられる。
【0048】
前記混合及び静置の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０℃以上４０℃以下が好ましく、５℃以上３５℃以下がより好ましく、１０℃以上３０℃以下がさらに好ましい。
【0049】
相互作用させる核酸溶液の濃度（相互作用前）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬ以下が好ましく、０．１ｍｇ／ｍＬ以上１０ｍｇ／ｍＬ以下がより好ましく、０．１ｍｇ／ｍＬ以上５ｍｇ／ｍＬ以下がさらに好ましく、０．５ｍｇ／ｍＬ以上２．５ｍｇ／ｍＬ以下が特に好ましい。
前記核酸溶液の溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、滅菌した超純水やＴＥバッファーなどが挙げられる。
前記核酸溶液の溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、滅菌した超純水やＴＥバッファーなどが挙げられる。
【0050】
相互作用させるミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチド溶液の濃度（相互作用前）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬ以下が好ましく、０．１ｍｇ／ｍＬ以上１０ｍｇ／ｍＬ以下がより好ましく、０．１ｍｇ／ｍＬ以上５ｍｇ／ｍＬ以下がさらに好ましく、０．５ｍｇ／ｍＬ以上２．５ｍｇ／ｍＬ以下が特に好ましい。
前記ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチド溶液の溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、滅菌した超純水などが挙げられる。
前記ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチド溶液の溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、滅菌した超純水などが挙げられる。
【0051】
前記相互作用させるときの、前記核酸溶液と前記ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチド溶液との体積比（前記ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチド溶液の体積：前記核酸溶液の体積）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１：９～９：１が好ましく、１：５～１：１がより好ましく、１：４～１：２がさらに好ましい。
【0052】
＜被覆工程＞
前記被覆工程は、微粒子を、前記ペプチドと相互作用させた核酸で被覆する工程である。
前記被覆工程は、微粒子を、前記ペプチドと相互作用させた核酸で被覆する工程である。
【0053】
－微粒子－
前記微粒子（マイクロキャリア）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、撃ち込み時における細胞内への貫通力を高める点から、高比重で、かつ、化学的に不活性であり生体に害を及ぼしにくいものが好ましく、例えば、金属微粒子、セラミック微粒子、ガラス微粒子などが挙げられる。
前記金属微粒子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、金属単体微粒子、合金微粒子などが挙げられる。
前記金属単体微粒子としては、金粒子、タングステン粒子などが好ましい。
前記微粒子（マイクロキャリア）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、撃ち込み時における細胞内への貫通力を高める点から、高比重で、かつ、化学的に不活性であり生体に害を及ぼしにくいものが好ましく、例えば、金属微粒子、セラミック微粒子、ガラス微粒子などが挙げられる。
前記金属微粒子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、金属単体微粒子、合金微粒子などが挙げられる。
前記金属単体微粒子としては、金粒子、タングステン粒子などが好ましい。
【0054】
前記微粒子の平均粒径の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．３μｍ以上が好ましく、０．４μｍ以上がより好ましく、０．５μｍ以上がさらに好ましく、０．６μｍが特に好ましい。
前記微粒子の平均粒径の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２．０μｍ以下が好ましく、１．４μｍ以下がより好ましく、１．３μｍ以下がさらに好ましく、１．２μｍ以下がよりさらに好ましく、１．１μｍ以下が特に好ましく、１．０μｍ以下が最も好ましい。
前記微粒子の平均粒径の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２．０μｍ以下が好ましく、１．４μｍ以下がより好ましく、１．３μｍ以下がさらに好ましく、１．２μｍ以下がよりさらに好ましく、１．１μｍ以下が特に好ましく、１．０μｍ以下が最も好ましい。
【0055】
前記平均粒径としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、個数平均粒径などが挙げられる。
【0056】
前記微粒子の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、球形、立方体、ロッド状、板状などが挙げられるが、これらの中でも球形が好ましい。
【0057】
－被覆－
前記被覆の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記微粒子を、洗浄滅菌し、該微粒子、前記ペプチドと相互作用させた核酸、ＣａＣｌ２、スペルミジン等をボルテックスミキサーなどで攪拌しながら加えて、前記ペプチドと相互作用させた核酸を微粒子にコーティング（被覆）し、エタノール、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳなど）で洗浄する方法などが挙げられる。
前記被覆において、さらに、タンパク質をコーティング（被覆）することができる。
前記被覆の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記微粒子を、洗浄滅菌し、該微粒子、前記ペプチドと相互作用させた核酸、ＣａＣｌ２、スペルミジン等をボルテックスミキサーなどで攪拌しながら加えて、前記ペプチドと相互作用させた核酸を微粒子にコーティング（被覆）し、エタノール、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳなど）で洗浄する方法などが挙げられる。
前記被覆において、さらに、タンパク質をコーティング（被覆）することができる。
【0058】
前記ペプチドと相互作用させた核酸の前記微粒子に対する被覆量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．６ｍｇの微粒子に対して、０．１μｇ以上１００μｇ以下の核酸に相当する量が好ましく、１μｇ以上１０μｇ以下の核酸に相当する量がより好ましく、４μｇ以上６μｇ以下の核酸に相当する量がさらに好ましい。
【0059】
前記微粒子は、ピペットマンなどを用いてマクロキャリアフィルムに可能な限り均一に塗布した後、クリーンベンチなどの無菌環境中で乾燥させることができる。
タンパク質をコートした微粒子の場合は、親水性のマクロキャリアフィルムを用いることが好ましい。
タンパク質をコートした微粒子の場合は、親水性のマクロキャリアフィルムを用いることが好ましい。
【0060】
前記親水性のマクロキャリアフィルムは、マクロキャリアフィルムに親水性フィルムを貼付してもよいし、親水性コーティングを施してもよい。
フィルムを親水化する手法としては、界面活性剤や光触媒、親水性ポリマーを利用する手法などが挙げられる。
フィルムを親水化する手法としては、界面活性剤や光触媒、親水性ポリマーを利用する手法などが挙げられる。
【0061】
前記親水性ポリマーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、ジヒドロキシエチルメタクリレート、ジエチレングリコールメタクリレート、トリエチレングリコールメタクリレート、ポリエチレングリコールメタクリレート、ビニルピロリドン、アクリル酸、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、グルコキシオキシエチルメタクリレート、３－スルホプロピルメタクリルオキシエチルジメチルアンモニウムベタイン、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、１－カルボキシジメチルメタクリロイルオキシエチルメタンアンモニウム等の親水性モノマーの重合体などが挙げられる。
【0062】
前記微粒子の被覆率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記微粒子の全表面であってもよいし、一部であってもよい。
【0063】
＜撃ち込み工程＞
前記撃ち込み工程は、被覆された微粒子を植物に撃ち込む工程である。
前記撃ち込み工程は、被覆された微粒子を植物に撃ち込む工程である。
【0064】
－植物－
前記植物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ナス、トマト、ジャガイモ、ピーマン、トウガラシ、タバコ等のナス科植物、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、ペレニアルライグラス、イタリアンライグラス、メドウフェスク、トールフェスク、オーチャードグラス、チモシー等のイネ科植物、シロイヌナズナ、アブラナ、ハクサイ、キャベツ、ダイコン、ナタネ、ハナナ等の、アブラナ科植物、ダイズ、アズキ、インゲン、ソラマメ等のマメ科植物、キュウリ、メロン、スイカ、カボチャ等のウリ科植物、サツマイモ等のヒルガオ科植物、ネギ、タマネギ、ニラ、ニンニク、アスパラガス等のユリ科植物、シソ等のシソ科植物、キク、シュンギク、レタス等のキク科植物、リンゴ、バラ、イチゴ等のバラ科植物、ミカン、サンショウ等のミカン科植物、ユーカリ等のフトモモ科植物、ポプラ等のヤナギ科植物、ホウレンソウ、テンサイ等のアカザ科植物、リンドウ等のリンドウ科植物、カーネーション等のナデシコ科植物などが挙げられる。
前記植物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ナス、トマト、ジャガイモ、ピーマン、トウガラシ、タバコ等のナス科植物、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、ペレニアルライグラス、イタリアンライグラス、メドウフェスク、トールフェスク、オーチャードグラス、チモシー等のイネ科植物、シロイヌナズナ、アブラナ、ハクサイ、キャベツ、ダイコン、ナタネ、ハナナ等の、アブラナ科植物、ダイズ、アズキ、インゲン、ソラマメ等のマメ科植物、キュウリ、メロン、スイカ、カボチャ等のウリ科植物、サツマイモ等のヒルガオ科植物、ネギ、タマネギ、ニラ、ニンニク、アスパラガス等のユリ科植物、シソ等のシソ科植物、キク、シュンギク、レタス等のキク科植物、リンゴ、バラ、イチゴ等のバラ科植物、ミカン、サンショウ等のミカン科植物、ユーカリ等のフトモモ科植物、ポプラ等のヤナギ科植物、ホウレンソウ、テンサイ等のアカザ科植物、リンドウ等のリンドウ科植物、カーネーション等のナデシコ科植物などが挙げられる。
【0065】
－撃ち込み－
前記撃ち込みの方法としては、特に制限はなく、公知の遺伝子工学的手法を用いることができ、例えば、種子胚の子葉、茎頂、又は表皮細胞を標的に、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ＰＥＧ－リン酸カルシウム法、リポソーム法、マイクロインジェクション法、ウィスカー法、プラズマ法、レーザーインジェクション法などにより、撃ち込むことができる。
前記撃ち込みの方法としては、特に制限はなく、公知の遺伝子工学的手法を用いることができ、例えば、種子胚の子葉、茎頂、又は表皮細胞を標的に、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ＰＥＧ－リン酸カルシウム法、リポソーム法、マイクロインジェクション法、ウィスカー法、プラズマ法、レーザーインジェクション法などにより、撃ち込むことができる。
【0066】
前記撃ち込みの手段としては、前記微粒子を植物細胞に撃ち込むことができるものであれば特に制限はなく、パーティクルガン法におけるパーティクルガン（遺伝子銃）などが挙げられる。植物体への導入効率から、パーティクルガン法を用いて導入する方法が好ましい。パーティクルガン法は、単子葉植物のようにアグロバクテリウムの感染効率が低い場合に有効である。
【0067】
前記パーティクルガン法を用いた方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記微粒子が塗布されたマクロキャリアフィルム、ターゲットを置床したプレートをパーティクルガン装置に設置し、ガス加速管から高圧ガスをマクロキャリアフィルムに向かって発射する方法が挙げられる。マクロキャリアフィルムはストッピングプレートで止まるが、マクロキャリアフィルムに塗布されていた微粒子はストッピングプレートを通過して、ストッピングプレートの下に設置したターゲットに貫入する。
【0068】
前記高圧ガスとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヘリウムなどが挙げられる。
【0069】
前記パーティクルガン装置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ（登録商標） ＰＤＳ－１０００／Ｈｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）、パーティクルインフローガン（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ， １９９２ １１：３２３－３２８）などが挙げられる。
【0070】
前記ＰＤＳ－１０００では、Ｇａｓ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ ｔｕｂｅにガスを流し込み、一定の圧力（１１００～１６００ｐｓｉ）になるとラプチャーディスクが割れ、流れ出たガスにより微粒子を塗布したマクロキャリアフィルムをストッピングプレートに押し当て、微粒子が試料に撃ち込まれる。よって、ガスは試料に直接当たらない。
前記パーティクルインフローガンでは、ガスボンベに取り付けた圧力調節器により一定の圧力のガスを噴出し、電磁弁により噴出時間を調節して、シリンジホルダー内にガスを噴射し、ホルダーに付着させた金粒子を試料に直接撃ち込む。よって、ガスは金粒子とともに試料に当たる。噴出ガス圧力としては、例えば、０．２ＭＰａが挙げられ、電磁弁により調整されたガス噴出時間としては、例えば、０．０５秒が挙げられる。
前記パーティクルインフローガンでは、ガスボンベに取り付けた圧力調節器により一定の圧力のガスを噴出し、電磁弁により噴出時間を調節して、シリンジホルダー内にガスを噴射し、ホルダーに付着させた金粒子を試料に直接撃ち込む。よって、ガスは金粒子とともに試料に当たる。噴出ガス圧力としては、例えば、０．２ＭＰａが挙げられ、電磁弁により調整されたガス噴出時間としては、例えば、０．０５秒が挙げられる。
【0071】
前記ストッピングプレートとターゲットとの距離の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２ｃｍ以上が好ましく、３ｃｍ以上がより好ましく、４ｃｍ以上がさらに好ましい。
前記ストッピングプレートとターゲットとの距離の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、９ｃｍ以下が好ましく、８ｃｍ以下がより好ましく、７ｃｍ以下がさらに好ましく、６ｃｍ以下が特に好ましい。
前記ストッピングプレートとターゲットとの距離の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、９ｃｍ以下が好ましく、８ｃｍ以下がより好ましく、７ｃｍ以下がさらに好ましく、６ｃｍ以下が特に好ましい。
【0072】
前記パーティクルガン装置のガス圧としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１，１００～１，６００ｐｓｉが好ましく、１，２００～１，５００ｐｓｉがより好ましい。
【0073】
前記微粒子を撃ち込む回数の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２回以上が好ましく、３回以上がより好ましく、４回以上がさらに好ましい。
前記微粒子を撃ち込む回数の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２０回以下が好ましく、１５回以下がより好ましく、１０回以下がさらに好ましい。
前記微粒子を撃ち込む回数の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２０回以下が好ましく、１５回以下がより好ましく、１０回以下がさらに好ましい。
【0074】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、被覆された微粒子を撃ち込んだ植物を生育し、植物体を得る工程、などが挙げられる。
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、被覆された微粒子を撃ち込んだ植物を生育し、植物体を得る工程、などが挙げられる。
【0075】
－被覆された微粒子を撃ち込んだ植物を生育し、植物体を得る工程－
前記生育方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、撃ち込み処理した植物を寒天培地上で１ヶ月程度生育させた後、土へ移植する方法が挙げられる。
茎頂への撃ち込みの場合、薬剤などによる選択圧をかけずに（抗生物質、植物ホルモンなどを含まない）通常の培地で生育させることによっても形質転換体を得ることができるが、薬剤耐性遺伝子をさらに導入してもよい。
薬剤耐性遺伝子を同時に導入することで個体を選択することもできる。薬剤耐性遺伝子を導入した場合は、薬剤により形質転換細胞を選択的に培養することができる。
前記生育方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、撃ち込み処理した植物を寒天培地上で１ヶ月程度生育させた後、土へ移植する方法が挙げられる。
茎頂への撃ち込みの場合、薬剤などによる選択圧をかけずに（抗生物質、植物ホルモンなどを含まない）通常の培地で生育させることによっても形質転換体を得ることができるが、薬剤耐性遺伝子をさらに導入してもよい。
薬剤耐性遺伝子を同時に導入することで個体を選択することもできる。薬剤耐性遺伝子を導入した場合は、薬剤により形質転換細胞を選択的に培養することができる。
【0076】
（植物のゲノム編集方法）
前記植物のゲノム編集方法は、相互作用工程と、被覆工程と、撃ち込み工程と、を含み、さらにその他の工程を含むことができる。
前記相互作用工程、前記被覆工程、前記撃ち込み工程、及び前記その他の工程は、前述のとおりである。
前記植物のゲノム編集方法は、相互作用工程と、被覆工程と、撃ち込み工程と、を含み、さらにその他の工程を含むことができる。
前記相互作用工程、前記被覆工程、前記撃ち込み工程、及び前記その他の工程は、前述のとおりである。
【0077】
（植物の作製方法）
前記植物の作製方法は、相互作用工程と、被覆工程と、撃ち込み工程と、被覆された微粒子を撃ち込んだ植物を生育し、植物体を得る工程と、を含み、さらにその他の工程を含むことができる。
前記相互作用工程、前記被覆工程、前記撃ち込み工程、前記被覆された微粒子を撃ち込んだ植物を生育し、植物体を得る工程、及び前記その他の工程は、前述のとおりである。
前記植物の作製方法は、相互作用工程と、被覆工程と、撃ち込み工程と、被覆された微粒子を撃ち込んだ植物を生育し、植物体を得る工程と、を含み、さらにその他の工程を含むことができる。
前記相互作用工程、前記被覆工程、前記撃ち込み工程、前記被覆された微粒子を撃ち込んだ植物を生育し、植物体を得る工程、及び前記その他の工程は、前述のとおりである。
【実施例0078】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【0079】
＜実施例１：ハナナの改変方法＞
（１） 植物材料及び生育条件
ハナナ種子（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、品種名 京都伏見寒咲花菜、タキイ種苗、日本）は、７０％エタノールで１分間、２０％ブリーチ（次亜塩素酸ナトリウム６％溶液）で１５分間、滅菌処理を行い、滅菌水で３回リンスした。
前記滅菌種子を発芽用培地に置床し、３０℃、７日間、連続光で生育させた。
前記発芽用培地は、１Ｌの超純水に、２．３ｇ／Ｌ ムラシゲ・スクーグ培養用混合塩類（富士フイルム和光純薬、日本）及び１０ｇ／Ｌ ショ糖、２．５ｇ／Ｌ Ｐｈｙｔａｇｅｌ（メルク、ドイツ）を添加し、ｐＨ５．８に調整した後、オートクレーブにより１２１℃、２０分間滅菌処理を行い、９ｃｍ滅菌シャーレに注いで固めたものを使用した。
（１） 植物材料及び生育条件
ハナナ種子（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、品種名 京都伏見寒咲花菜、タキイ種苗、日本）は、７０％エタノールで１分間、２０％ブリーチ（次亜塩素酸ナトリウム６％溶液）で１５分間、滅菌処理を行い、滅菌水で３回リンスした。
前記滅菌種子を発芽用培地に置床し、３０℃、７日間、連続光で生育させた。
前記発芽用培地は、１Ｌの超純水に、２．３ｇ／Ｌ ムラシゲ・スクーグ培養用混合塩類（富士フイルム和光純薬、日本）及び１０ｇ／Ｌ ショ糖、２．５ｇ／Ｌ Ｐｈｙｔａｇｅｌ（メルク、ドイツ）を添加し、ｐＨ５．８に調整した後、オートクレーブにより１２１℃、２０分間滅菌処理を行い、９ｃｍ滅菌シャーレに注いで固めたものを使用した。
【0080】
（２） プラスミドＤＮＡ作製
プラスミドＤＮＡ ｐＰｒｒｎ１８：：Ｎｌｕｃ（図１Ａ）は、ｐＧＷＴ３５Ｓ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２０１８ ６４：１５３－１６１）にＧａｔｅｗａｙクローニング法（サーモフィッシャー、アメリカ）によりＮｌｕｃを挿入したプラスミド（Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１９ ３６：４９－５２）のＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター配列をＳａｃＩ－ＫｐｎＩにより切り出し、タバコｒｒｎ１８遺伝子のプロモーター領域をＰＣＲ法により増幅してＳａｃＩ－ＫｐｎＩ部位に導入することにより作製した。
プラスミドＤＮＡ ｐＰｒｒｎ１８：：Ｎｌｕｃ（図１Ａ）は、ｐＧＷＴ３５Ｓ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２０１８ ６４：１５３－１６１）にＧａｔｅｗａｙクローニング法（サーモフィッシャー、アメリカ）によりＮｌｕｃを挿入したプラスミド（Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１９ ３６：４９－５２）のＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター配列をＳａｃＩ－ＫｐｎＩにより切り出し、タバコｒｒｎ１８遺伝子のプロモーター領域をＰＣＲ法により増幅してＳａｃＩ－ＫｐｎＩ部位に導入することにより作製した。
【0081】
前記タバコｒｒｎ１８遺伝子のプロモーター領域は、タバコの全ゲノムをテンプレートにして、ＳａｃＩ－ｒｒｎ１８ ｐｒｏｍ Ｆ（配列番号４）及びＫｐｎＩ－ｒｒｎ１８ ｐｒｏｍ Ｒ（配列番号５）の両プライマーを用いてＰＣＲ法により増幅した。
前記タバコの全ゲノムは、核、葉緑体、ミトコンドリアゲノムの混合物であり、ＣＴＡＢ法（Ｍｕｒｒａｙ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９８０ ８：４３２１－５）により抽出した。
前記タバコの全ゲノムは、核、葉緑体、ミトコンドリアゲノムの混合物であり、ＣＴＡＢ法（Ｍｕｒｒａｙ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９８０ ８：４３２１－５）により抽出した。
【0082】
（３） ペプチド－ＤＮＡ複合体作製
ペプチド－ＤＮＡ複合体は、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ２０１３ １４：１０－１６）に記載の方法に従い、以下のとおり作製した。
ミトコンドリア移行シグナル配列とポリカチオン配列とを有するペプチド ｃｙｔｏｃｏｘ－ＫＨ（ＭＬＳＬＲＱＳＩＲＦＦＫＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨ 配列番号６、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ２０１８ １９：１５８２－１５９１）と前記プラスミドＤＮＡ ｐＰｒｒｎ１８：：Ｎｌｕｃは、それぞれ、１ｍｇ／ｍＬの水溶液に調整し、１ショットにつき、２μＬのペプチド溶液と６μＬのＤＮＡ溶液を、プラスチックチューブ内にて、ペプチド：ＤＮＡ＝１：３（体積比）で混合し、室温で２０分間静置した。
ペプチド－ＤＮＡ複合体は、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ２０１３ １４：１０－１６）に記載の方法に従い、以下のとおり作製した。
ミトコンドリア移行シグナル配列とポリカチオン配列とを有するペプチド ｃｙｔｏｃｏｘ－ＫＨ（ＭＬＳＬＲＱＳＩＲＦＦＫＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨＫＨ 配列番号６、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ２０１８ １９：１５８２－１５９１）と前記プラスミドＤＮＡ ｐＰｒｒｎ１８：：Ｎｌｕｃは、それぞれ、１ｍｇ／ｍＬの水溶液に調整し、１ショットにつき、２μＬのペプチド溶液と６μＬのＤＮＡ溶液を、プラスチックチューブ内にて、ペプチド：ＤＮＡ＝１：３（体積比）で混合し、室温で２０分間静置した。
【0083】
（４） パーティクルボンバード法による植物細胞へのペプチド－ＤＮＡ複合体導入
直径０．３～２．０μｍの金粒子（田中貴金属、日本）は、７０％エタノールで６０ｍｇ／ｍＬに調整し、１ショットにつき、０．６ｍｇの金粒子と５μｇのＤＮＡに相当する複合体溶液を混合した。
１０μＬの２．５Ｍ 塩化カルシウム溶液と４μＬの０．１Ｍ スペルミジンをボルテックスしながら添加し、室温で６０分間放置した。２０００×ｇで５秒間遠心分離し、上清を捨て、７０％エタノールでリンスした。１５μＬの１００％エタノールを添加し、数秒間、ソニケーションを行った。
直径０．３～２．０μｍの金粒子（田中貴金属、日本）は、７０％エタノールで６０ｍｇ／ｍＬに調整し、１ショットにつき、０．６ｍｇの金粒子と５μｇのＤＮＡに相当する複合体溶液を混合した。
１０μＬの２．５Ｍ 塩化カルシウム溶液と４μＬの０．１Ｍ スペルミジンをボルテックスしながら添加し、室温で６０分間放置した。２０００×ｇで５秒間遠心分離し、上清を捨て、７０％エタノールでリンスした。１５μＬの１００％エタノールを添加し、数秒間、ソニケーションを行った。
【0084】
パーティクルボンバードメント法に用いる装置はパーティクルインフローガンを用いた（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ， １９９２ １１：３２３－３２８）。
シリンジホルダーにペプチド－ＤＮＡ複合体を付着させた金粒子を添加して乾燥させ、真空容器内に接続した。０．８％アガロース培地上に置床した播種後７日目のハナナ子葉（１ショットで８枚の子葉に撃ち込んだ：子葉２枚を１サンプルとし、合計４０サンプルとした）、を真空容器内に移し、シリンジホルダーと試料の距離を１２．５ｃｍとし、真空状態で窒素ガスによる金粒子の撃ち込みを行った（噴出ガス圧０．２ＭＰａ、噴射時間０．０５秒）。撃ち込んだ前記ハナナ子葉は上記ハナナ滅菌種子の発芽に用いた培地に移植した。
シリンジホルダーにペプチド－ＤＮＡ複合体を付着させた金粒子を添加して乾燥させ、真空容器内に接続した。０．８％アガロース培地上に置床した播種後７日目のハナナ子葉（１ショットで８枚の子葉に撃ち込んだ：子葉２枚を１サンプルとし、合計４０サンプルとした）、を真空容器内に移し、シリンジホルダーと試料の距離を１２．５ｃｍとし、真空状態で窒素ガスによる金粒子の撃ち込みを行った（噴出ガス圧０．２ＭＰａ、噴射時間０．０５秒）。撃ち込んだ前記ハナナ子葉は上記ハナナ滅菌種子の発芽に用いた培地に移植した。
【0085】
（５） ルシフェラーゼ活性測定
ｐＰｒｒｎ１８：：Ｎｌｕｃを導入した前記ハナナ子葉は、３０℃、暗所に置いて１日後、子葉２枚当たり２００μＬのタンパク質抽出バッファー（０．１Ｍ リン酸カリウム、２ｍＭ エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、５％グリセロール、２０ｍＭ ジチオトレイトール、ｐＨ７．８、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９９８ １５：２１７－２２０）を加え、シェイクマスターオート（バイオメディカルサイエンス、日本）により子葉をビーズ破砕した。２００００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離し、上清をサンプルとして用いた。
ｐＰｒｒｎ１８：：Ｎｌｕｃを導入した前記ハナナ子葉は、３０℃、暗所に置いて１日後、子葉２枚当たり２００μＬのタンパク質抽出バッファー（０．１Ｍ リン酸カリウム、２ｍＭ エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、５％グリセロール、２０ｍＭ ジチオトレイトール、ｐＨ７．８、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９９８ １５：２１７－２２０）を加え、シェイクマスターオート（バイオメディカルサイエンス、日本）により子葉をビーズ破砕した。２００００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離し、上清をサンプルとして用いた。
【0086】
ルシフェラーゼ活性は、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ、アメリカ）を用いて測定した。
タンパク質量はＸＬ－Ｂｒａｄｆｏｒｄ（アプロサイエンス、日本）を用いて５９５ｎｍで測定した。
測定結果（ＲＬＵ ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ：箱ひげ図）を図２（右）に示した。図２の＊は、ウィルコクソン検定におけるＰ＜０．０５を表し、＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す。
箱ひげ図の箱中の仕切りは、中央値を示す。
タンパク質量はＸＬ－Ｂｒａｄｆｏｒｄ（アプロサイエンス、日本）を用いて５９５ｎｍで測定した。
測定結果（ＲＬＵ ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ：箱ひげ図）を図２（右）に示した。図２の＊は、ウィルコクソン検定におけるＰ＜０．０５を表し、＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す。
箱ひげ図の箱中の仕切りは、中央値を示す。
【0087】
＜比較例１：ハナナの改変方法＞
ペプチド－ＤＮＡ複合体作製において、ミトコンドリア移行シグナル配列とポリカチオン配列とを有するペプチド ｃｙｔｏｃｏｘ－ＫＨを使用しなかった以外は実施例１と同様にしてルシフェラーゼ活性を測定し、測定結果を図２（中央）に示した。
ペプチド－ＤＮＡ複合体作製において、ミトコンドリア移行シグナル配列とポリカチオン配列とを有するペプチド ｃｙｔｏｃｏｘ－ＫＨを使用しなかった以外は実施例１と同様にしてルシフェラーゼ活性を測定し、測定結果を図２（中央）に示した。
【0088】
＜比較例２：ハナナの改変方法＞
ペプチド－ＤＮＡ複合体作製において、プラスミドＤＮＡ ｐＰｒｒｎ１８：：Ｎｌｕｃを使用しなかった以外は実施例１と同様にしてルシフェラーゼ活性を測定し、測定結果を図２（左）に示した。
ペプチド－ＤＮＡ複合体作製において、プラスミドＤＮＡ ｐＰｒｒｎ１８：：Ｎｌｕｃを使用しなかった以外は実施例１と同様にしてルシフェラーゼ活性を測定し、測定結果を図２（左）に示した。
【0089】
複合体を導入した実施例１のサンプル（ＲＬＵ ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ：２６２３８．２１±１１１８８．０６（平均値±標準誤差））はＤＮＡのみを導入した比較例１のサンプル（ＲＬＵ ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ：２３４３．４４±１５０８．０３（平均値±標準誤差））に比べて約１１倍、遺伝子導入効率が向上した。また、ペプチドのみを導入した比較例２のサンプル（ＲＬＵ ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ：９０．７３±７．０２（平均値±標準誤差））ではルシフェラーゼ活性は確認されなかった。
以上から、ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドと相互作用させた核酸で被覆された微粒子を植物に撃ち込む工程を含む方法を採用することにより、効率良くミトコンドリア遺伝子を改変することができることが示された。
以上から、ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドと相互作用させた核酸で被覆された微粒子を植物に撃ち込む工程を含む方法を採用することにより、効率良くミトコンドリア遺伝子を改変することができることが示された。
【0090】
＜実施例２：タマネギの改変方法＞
（１） プラスミドＤＮＡ作製
プラスミドＤＮＡ ｐＰｒｒｎ１８：：ｓｆＧＦＰ：：Ｔｃｏｘ２（図１ｂ）は、タバコｒｒｎ１８遺伝子のプロモーター領域、ｓｆＧＦＰ遺伝子（Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００６ ２４：７９－８８）、酵母ｃｏｘ２遺伝子のターミネーター領域をそれぞれＰＣＲ法により増幅、連結し、そのカセットをｐＣＲ２．１－ＴＯＰＯ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、アメリカ）に導入することにより作製した。
（１） プラスミドＤＮＡ作製
プラスミドＤＮＡ ｐＰｒｒｎ１８：：ｓｆＧＦＰ：：Ｔｃｏｘ２（図１ｂ）は、タバコｒｒｎ１８遺伝子のプロモーター領域、ｓｆＧＦＰ遺伝子（Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００６ ２４：７９－８８）、酵母ｃｏｘ２遺伝子のターミネーター領域をそれぞれＰＣＲ法により増幅、連結し、そのカセットをｐＣＲ２．１－ＴＯＰＯ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、アメリカ）に導入することにより作製した。
【0091】
前記タバコｒｒｎ１８遺伝子のプロモーター領域は、タバコの全ゲノムをテンプレートにして、ＳａｃＩ－ｒｒｎ１８ ｐｒｏｍ Ｆ（配列番号４）及びＰｒｒｎ１８－ａｔｔＢ１ ｓｆＧＦＰ Ｒ（配列番号７）を用いてＰＣＲ法により増幅した。
前記ｓｆＧＦＰ遺伝子は、３５Ｓ－ｓｆＧＦＰ－ｎｏｓＴ（Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２０１５ ３２：８１－８７）をテンプレートにして、Ｐｒｒｎ１８－ａｔｔＢ１ ｓｆＧＦＰ Ｆ（配列番号８）及びｓｆＧＦＰ－Ｓｃｃｏｘ２ ３’ＵＴＲ Ｒ１（配列番号９）を用いてＰＣＲ法により増幅した。
前記酵母ｃｏｘ２遺伝子のターミネーター領域は、人工合成した酵母ｃｏｘ２遺伝子のターミネーター領域をテンプレートにして、ｓｆＧＦＰ－Ｓｃｃｏｘ２ ３’ＵＴＲ Ｆ１（配列番号１０）及びＳｃｃｏｘ２ ｔｅｒｍ Ｒ１（配列番号１１）を用いてＰＣＲ法により増幅した。
前記タバコの全ゲノムは、核、葉緑体、ミトコンドリアゲノムの混合物であり、ＣＴＡＢ法（Ｍｕｒｒａｙ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９８０ ８：４３２１－５）により抽出した。
前記ｓｆＧＦＰ遺伝子は、３５Ｓ－ｓｆＧＦＰ－ｎｏｓＴ（Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２０１５ ３２：８１－８７）をテンプレートにして、Ｐｒｒｎ１８－ａｔｔＢ１ ｓｆＧＦＰ Ｆ（配列番号８）及びｓｆＧＦＰ－Ｓｃｃｏｘ２ ３’ＵＴＲ Ｒ１（配列番号９）を用いてＰＣＲ法により増幅した。
前記酵母ｃｏｘ２遺伝子のターミネーター領域は、人工合成した酵母ｃｏｘ２遺伝子のターミネーター領域をテンプレートにして、ｓｆＧＦＰ－Ｓｃｃｏｘ２ ３’ＵＴＲ Ｆ１（配列番号１０）及びＳｃｃｏｘ２ ｔｅｒｍ Ｒ１（配列番号１１）を用いてＰＣＲ法により増幅した。
前記タバコの全ゲノムは、核、葉緑体、ミトコンドリアゲノムの混合物であり、ＣＴＡＢ法（Ｍｕｒｒａｙ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９８０ ８：４３２１－５）により抽出した。
【0092】
（２） ペプチド－ＤＮＡ複合体作製
プラスミドＤＮＡ ｐＰｒｒｎ１８：：Ｎｌｕｃに代えて、プラスミドＤＮＡ ｐＰｒｒｎ１８：：ｓｆＧＦＰ：：Ｔｃｏｘ２を使用した以外は実施例１と同様にして作製した。
プラスミドＤＮＡ ｐＰｒｒｎ１８：：Ｎｌｕｃに代えて、プラスミドＤＮＡ ｐＰｒｒｎ１８：：ｓｆＧＦＰ：：Ｔｃｏｘ２を使用した以外は実施例１と同様にして作製した。
【0093】
（３） パーティクルボンバード法による植物細胞へのペプチド－ＤＮＡ複合体導入
０．８％アガロース培地上に置床した播種後７日目のハナナ子葉に代えて、タマネギ表皮細胞（１ｃｍ角、４枚／ショット）を使用した以外は実施例１と同様にして導入した。
０．８％アガロース培地上に置床した播種後７日目のハナナ子葉に代えて、タマネギ表皮細胞（１ｃｍ角、４枚／ショット）を使用した以外は実施例１と同様にして導入した。
【0094】
（４） 蛍光観察
ｐＰｒｒｎ１８：：ｓｆＧＦＰ：：Ｔｃｏｘ２を導入したタマネギ表皮細胞は、室温、暗所において１日後、５０μＭ Ｎ－エチルマレイミドにより１時間処理し、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、アメリカ）により室温で１０分間染色し、蛍光顕微鏡（ＩＸ８３、オリンパス、日本）によりＧＦＰ蛍光及びＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ染色像を観察した。
結果を図３Ａ及び図３Ｂに示した。図３ＡはＧＦＰ蛍光像を示し、図３ＢはＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ染色像を示し、白矢尻はＧＦＰ蛍光を発するミトコンドリアを示す。
ｐＰｒｒｎ１８：：ｓｆＧＦＰ：：Ｔｃｏｘ２を導入したタマネギ表皮細胞は、室温、暗所において１日後、５０μＭ Ｎ－エチルマレイミドにより１時間処理し、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、アメリカ）により室温で１０分間染色し、蛍光顕微鏡（ＩＸ８３、オリンパス、日本）によりＧＦＰ蛍光及びＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ染色像を観察した。
結果を図３Ａ及び図３Ｂに示した。図３ＡはＧＦＰ蛍光像を示し、図３ＢはＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ染色像を示し、白矢尻はＧＦＰ蛍光を発するミトコンドリアを示す。
【0095】
図３の結果より、前記プラスミドＤＮＡがミトコンドリアへ輸送されたことが示された。
【0096】
＜実施例３：コムギの改変方法＞
（１） コムギミトコンドリアＡＴＰ９ ｋｎｏｃｋ－ｉｎ断片の作成
コムギミトコンドリアＡＴＰ９標的配列（配列番号１２）を図４に示した。
前記コムギミトコンドリアＡＴＰ９標的配列（配列番号１２）は、構造遺伝子配列（配列番号１３：図４の灰色の網掛部分）、ｋｎｏｃｋ－ｉｎ断片作成に用いたオリゴのＡＴＰ特異配列１（配列番号１４：図４の太字の下線部分）、ｋｎｏｃｋ－ｉｎ断片作成に用いたオリゴのＡＴＰ特異配列２（配列番号１５：図４の太字の下線部分）、挿入確認用のリバースプライマー配列１（配列番号１６：図４のＲ１）、及び挿入確認用のリバースプライマー配列２（配列番号１７：図４のＲ２）を含む。
（１） コムギミトコンドリアＡＴＰ９ ｋｎｏｃｋ－ｉｎ断片の作成
コムギミトコンドリアＡＴＰ９標的配列（配列番号１２）を図４に示した。
前記コムギミトコンドリアＡＴＰ９標的配列（配列番号１２）は、構造遺伝子配列（配列番号１３：図４の灰色の網掛部分）、ｋｎｏｃｋ－ｉｎ断片作成に用いたオリゴのＡＴＰ特異配列１（配列番号１４：図４の太字の下線部分）、ｋｎｏｃｋ－ｉｎ断片作成に用いたオリゴのＡＴＰ特異配列２（配列番号１５：図４の太字の下線部分）、挿入確認用のリバースプライマー配列１（配列番号１６：図４のＲ１）、及び挿入確認用のリバースプライマー配列２（配列番号１７：図４のＲ２）を含む。
【0097】
（１－１） ロングオリゴの準備
ＴｓＡＴＰｆｒａｇ１（配列番号１８）及びＴｓＡＴＰｆｒａｇ２（配列番号１９）をアニールさせた。
前記ＴｓＡＴＰｆｒａｇ１（配列番号１８）は、前記ＡＴＰ９特異配列１（配列番号１４：７４塩基）及びＧＵＳ遺伝子の開始コドンから２１塩基を含み、前記ＴｓＡＴＰｆｒａｇ２（配列番号１９）は、前記ＡＴＰ特異配列２（配列番号１５：７４塩基）の相補鎖及びＧＵＳ遺伝子の開始コドンから２１塩基の相補鎖を含む。
前記ＴｓＡＴＰｆｒａｇ１（配列番号１８）及び前記ＴｓＡＴＰｆｒａｇ２（配列番号１９）は、ＧＵＳ遺伝子配列が互いに相補配列となるため、アニールする。
ＴｓＡＴＰｆｒａｇ１（配列番号１８）及びＴｓＡＴＰｆｒａｇ２（配列番号１９）をアニールさせた。
前記ＴｓＡＴＰｆｒａｇ１（配列番号１８）は、前記ＡＴＰ９特異配列１（配列番号１４：７４塩基）及びＧＵＳ遺伝子の開始コドンから２１塩基を含み、前記ＴｓＡＴＰｆｒａｇ２（配列番号１９）は、前記ＡＴＰ特異配列２（配列番号１５：７４塩基）の相補鎖及びＧＵＳ遺伝子の開始コドンから２１塩基の相補鎖を含む。
前記ＴｓＡＴＰｆｒａｇ１（配列番号１８）及び前記ＴｓＡＴＰｆｒａｇ２（配列番号１９）は、ＧＵＳ遺伝子配列が互いに相補配列となるため、アニールする。
【0098】
（１－２） ロングオリゴのアニール
ロングオリゴのアニールは、９４℃５分間及び室温３０分間（アニール反応ａ）、又は９４℃５分間及び５５℃１０分間（アニール反応ｂ）の条件で行った。
ロングオリゴのアニールは、９４℃５分間及び室温３０分間（アニール反応ａ）、又は９４℃５分間及び５５℃１０分間（アニール反応ｂ）の条件で行った。
【0099】
（１－３） ロングオリゴの伸長反応
アニール後のロングオリゴの伸長はｑｕｉｃｋ ｔａｑ （Ｔｏｙｏｂｏ）（伸長反応ｃ）、又は Ｐｒｉｍｅｓｔａｒ ＧＸＬ （Ｔａｋａｒａ）（伸長反応ｄ）を用いて、７２℃１５分間の条件で行った。
図５に、伸長反応後のロングオリゴを電気泳動した結果を示した。
図５のレーン１はＴｓＡＴＰ９ｆｒａｇ１のサンプルであり、レーン２はＴｓＡＴＰ９ｆｒａｇ２であり、レーン３はアニール反応ａ及び伸長反応ｃを行ったサンプルであり、レーン４はアニール反応ｂ及び伸長反応ｃを行ったサンプルであり、レーン５はアニール反応ａ及び伸長反応ｄを行ったサンプルであり、レーン６はアニール反応ｂ及び伸長反応ｄを行ったサンプルである。
伸長産物は、２００ｂｐ付近（矢印）のバンドとして現れる。
伸長産物はカラムにより精製し、オリゴを除いた。
アニール後のロングオリゴの伸長はｑｕｉｃｋ ｔａｑ （Ｔｏｙｏｂｏ）（伸長反応ｃ）、又は Ｐｒｉｍｅｓｔａｒ ＧＸＬ （Ｔａｋａｒａ）（伸長反応ｄ）を用いて、７２℃１５分間の条件で行った。
図５に、伸長反応後のロングオリゴを電気泳動した結果を示した。
図５のレーン１はＴｓＡＴＰ９ｆｒａｇ１のサンプルであり、レーン２はＴｓＡＴＰ９ｆｒａｇ２であり、レーン３はアニール反応ａ及び伸長反応ｃを行ったサンプルであり、レーン４はアニール反応ｂ及び伸長反応ｃを行ったサンプルであり、レーン５はアニール反応ａ及び伸長反応ｄを行ったサンプルであり、レーン６はアニール反応ｂ及び伸長反応ｄを行ったサンプルである。
伸長産物は、２００ｂｐ付近（矢印）のバンドとして現れる。
伸長産物はカラムにより精製し、オリゴを除いた。
【0100】
（２） ペプチド－ＤＮＡ複合体作製
プラスミドＤＮＡ ｐＰｒｒｎ１８：：Ｎｌｕｃに代えて、前記伸長産物を使用した以外は実施例１と同様にして作製した。
プラスミドＤＮＡ ｐＰｒｒｎ１８：：Ｎｌｕｃに代えて、前記伸長産物を使用した以外は実施例１と同様にして作製した。
【0101】
（３） パーティクルボンバード法による植物細胞へのペプチド－ＤＮＡ複合体導入
０．８％アガロース培地上に置床した播種後７日目のハナナ子葉に代えて、下記のとおり調製したコムギ胚を使用した以外は実施例１と同様にして導入した。
０．８％アガロース培地上に置床した播種後７日目のハナナ子葉に代えて、下記のとおり調製したコムギ胚を使用した以外は実施例１と同様にして導入した。
【0102】
－コムギ胚の調製－
コムギ乾燥種子１００粒を５％次亜塩素酸５０ｍＬに３０分間浸漬し、表面殺菌し、殺菌種子を得た。５００ｍＬ滅菌水に前記殺菌種子を加えて５分間攪拌し、水を除去する操作を４回繰り返し、前記殺菌種子を洗浄した。その後、９ｃｍ滅菌シャーレに濾紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ，円形定性濾紙Ｎｏ．２）を一枚敷き、１０ｍＬ滅菌水を加え、前記洗浄後の殺菌種子を濾紙上に置き、シャーレのフタを閉めて、暗所２５℃で一晩発芽させた。発芽種子胚を切除し、種子胚を得た。前記種子胚から子葉、第１、２葉を切除し、茎頂を露出させた。さらにそれらの種子胚の茎頂が０．８％アガロース培地上で上を向くように培地に５ｍｍほど埋め込んだ。
コムギ乾燥種子１００粒を５％次亜塩素酸５０ｍＬに３０分間浸漬し、表面殺菌し、殺菌種子を得た。５００ｍＬ滅菌水に前記殺菌種子を加えて５分間攪拌し、水を除去する操作を４回繰り返し、前記殺菌種子を洗浄した。その後、９ｃｍ滅菌シャーレに濾紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ，円形定性濾紙Ｎｏ．２）を一枚敷き、１０ｍＬ滅菌水を加え、前記洗浄後の殺菌種子を濾紙上に置き、シャーレのフタを閉めて、暗所２５℃で一晩発芽させた。発芽種子胚を切除し、種子胚を得た。前記種子胚から子葉、第１、２葉を切除し、茎頂を露出させた。さらにそれらの種子胚の茎頂が０．８％アガロース培地上で上を向くように培地に５ｍｍほど埋め込んだ。
【0103】
（４） 外来遺伝子の挿入の確認
（４－１） ゲノムＤＮＡの抽出
遺伝子導入２日後に、コムギ胚から、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ ｅａｓｙ Ｋｉｔを用いてゲノムＤＮＡを抽出した。
（４－１） ゲノムＤＮＡの抽出
遺伝子導入２日後に、コムギ胚から、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ ｅａｓｙ Ｋｉｔを用いてゲノムＤＮＡを抽出した。
【0104】
Ｋｎｏｃｋ－ｉｎ後のゲノム配列（配列番号２０）を図６に示した。
前記Ｋｎｏｃｋ－ｉｎ後のゲノム配列（配列番号２０）は、ｋｎｏｃｋ－ｉｎ断片作成に用いたオリゴのＡＴＰ特異配列１（配列番号１４：図６の灰色の網掛部分）、ＧＵＳ遺伝子の開始コドンから２１塩基、ｋｎｏｃｋ－ｉｎ断片作成に用いたオリゴのＡＴＰ特異配列２（配列番号１５：図６の灰色の網掛部分）、挿入確認用のフォワードプライマー配列（配列番号２１：図６の太字の下線部分）、挿入確認用のリバースプライマー配列１（配列番号１６：図６のＲ１）、及び挿入確認用のリバースプライマー配列２（配列番号１７：図６のＲ２）を含む。
前記Ｋｎｏｃｋ－ｉｎ後のゲノム配列（配列番号２０）は、ｋｎｏｃｋ－ｉｎ断片作成に用いたオリゴのＡＴＰ特異配列１（配列番号１４：図６の灰色の網掛部分）、ＧＵＳ遺伝子の開始コドンから２１塩基、ｋｎｏｃｋ－ｉｎ断片作成に用いたオリゴのＡＴＰ特異配列２（配列番号１５：図６の灰色の網掛部分）、挿入確認用のフォワードプライマー配列（配列番号２１：図６の太字の下線部分）、挿入確認用のリバースプライマー配列１（配列番号１６：図６のＲ１）、及び挿入確認用のリバースプライマー配列２（配列番号１７：図６のＲ２）を含む。
【0105】
（４－２） ＰＣＲの条件検討
ＰＣＲは、Ｐｒｉｍｅｓｔａｒ ＧＸＬ （Ｔａｋａｒａ）を用いて、９４℃２分間、その後、９８℃１０秒間、６８℃－５０℃３０秒間、及び６８℃４５秒間を４０サイクル、その後、６８℃５分間の条件で行った。
図７に、プライマーとして、挿入確認用のフォワードプライマー配列（配列番号２１）、及び挿入確認用のリバースプライマー配列１（配列番号１６）を用いた場合のサンプルについて、電気泳動した結果（Ｒ１：左側）、及びプライマーとして、挿入確認用のフォワードプライマー配列（配列番号２１）、及び挿入確認用のリバースプライマー配列２（配列番号１７）を用いた場合のサンプルについて、電気泳動した結果（Ｒ２：右側）を示した。
想定するＰＣＲ産物のサイズは１９９ｂｐ（Ｒ１）、又は３０９ｂｐ（Ｒ２）となる。
挿入確認用のリバースプライマー配列１（配列番号１６）を用いた場合（Ｒ１：左側）は、ラダー化が著しいことがわかった。
一方、挿入確認用のリバースプライマー配列２（配列番号１７）を用いた場合（Ｒ２：右側）は、アニーリング温度の高くする（Ｒ２：右側のレーン３（６５．５℃）、レーン４（６３．５℃））ことで、ラダー化を抑えることができることが分かった。
以降の解析はアニーリング温度を６４℃として設定した。
ＰＣＲは、Ｐｒｉｍｅｓｔａｒ ＧＸＬ （Ｔａｋａｒａ）を用いて、９４℃２分間、その後、９８℃１０秒間、６８℃－５０℃３０秒間、及び６８℃４５秒間を４０サイクル、その後、６８℃５分間の条件で行った。
図７に、プライマーとして、挿入確認用のフォワードプライマー配列（配列番号２１）、及び挿入確認用のリバースプライマー配列１（配列番号１６）を用いた場合のサンプルについて、電気泳動した結果（Ｒ１：左側）、及びプライマーとして、挿入確認用のフォワードプライマー配列（配列番号２１）、及び挿入確認用のリバースプライマー配列２（配列番号１７）を用いた場合のサンプルについて、電気泳動した結果（Ｒ２：右側）を示した。
想定するＰＣＲ産物のサイズは１９９ｂｐ（Ｒ１）、又は３０９ｂｐ（Ｒ２）となる。
挿入確認用のリバースプライマー配列１（配列番号１６）を用いた場合（Ｒ１：左側）は、ラダー化が著しいことがわかった。
一方、挿入確認用のリバースプライマー配列２（配列番号１７）を用いた場合（Ｒ２：右側）は、アニーリング温度の高くする（Ｒ２：右側のレーン３（６５．５℃）、レーン４（６３．５℃））ことで、ラダー化を抑えることができることが分かった。
以降の解析はアニーリング温度を６４℃として設定した。
【0106】
（４－３） ＰＣＲ
ＰＣＲは、Ｐｒｉｍｅｓｔａｒ ＧＸＬ （Ｔａｋａｒａ）を用いて、９４℃２分間、その後、９８℃１０秒間、６４℃３０秒間、及び６８℃４５秒間を４０サイクル、その後、６８℃５分間の条件で行った。
ＰＣＲの反応は２５μＬの容量で行い、鋳型を１０００ｎｇ（１０００ｎｇ／μＬを１μＬ）加えて反応させた。
ＰＣＲは、Ｐｒｉｍｅｓｔａｒ ＧＸＬ （Ｔａｋａｒａ）を用いて、９４℃２分間、その後、９８℃１０秒間、６４℃３０秒間、及び６８℃４５秒間を４０サイクル、その後、６８℃５分間の条件で行った。
ＰＣＲの反応は２５μＬの容量で行い、鋳型を１０００ｎｇ（１０００ｎｇ／μＬを１μＬ）加えて反応させた。
【0107】
プライマーとして、挿入確認用のフォワードプライマー配列（配列番号２１）、及び挿入確認用のリバースプライマー配列２（配列番号１７）を用いた場合のサンプルについて、電気泳動した結果を図８示した（レーンＣＰＸ：右）。
【0108】
＜比較例３：コムギの改変方法＞
無処理のコムギ胚について、実施例３と同様にしてゲノムＤＮＡを抽出してＰＣＲを行った結果を図８（レーン－：左）に示した。
無処理のコムギ胚について、実施例３と同様にしてゲノムＤＮＡを抽出してＰＣＲを行った結果を図８（レーン－：左）に示した。
【0109】
＜比較例４：コムギの改変方法＞
ペプチド－ＤＮＡ複合体作製において、ミトコンドリア移行シグナル配列とポリカチオン配列とを有するペプチド ｃｙｔｏｃｏｘ－ＫＨを使用しなかった以外は実施例３と同様にしてゲノムＤＮＡを抽出してＰＣＲを行った結果を図８（レーン＋：中央）に示した。
ペプチド－ＤＮＡ複合体作製において、ミトコンドリア移行シグナル配列とポリカチオン配列とを有するペプチド ｃｙｔｏｃｏｘ－ＫＨを使用しなかった以外は実施例３と同様にしてゲノムＤＮＡを抽出してＰＣＲを行った結果を図８（レーン＋：中央）に示した。
【0110】
図８の結果より、複合体を導入した実施例３のコムギ胚では、組換えが確認できるが（図８の矢印付近のバンド）、無処理の比較例３のコムギ胚（－）、及びＤＮＡのみを導入した比較例４のコムギ胚（＋）では組換えが確認できないことが示された。
以上から、ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドと相互作用させた核酸で被覆された微粒子を植物に撃ち込む工程を含む方法を採用することにより、効率良くミトコンドリア遺伝子を改変することができることが示された。
以上から、ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドと相互作用させた核酸で被覆された微粒子を植物に撃ち込む工程を含む方法を採用することにより、効率良くミトコンドリア遺伝子を改変することができることが示された。
【0111】
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞ ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドと相互作用させた核酸で被覆した微粒子を植物に撃ち込む工程を含むことを特徴とする植物の改変方法である。
＜２＞ 前記ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドが、ミトコンドリア輸送シグナル配列及びポリカチオン配列を含むペプチドである、前記＜１＞に記載の植物の改変方法である。
＜３＞ 前記植物が、コムギ、オオムギ、イネ、トウモロコシ、ダイズ、ジャガイモ及びリンゴからなる群から選択される、前記＜１＞又は＜２＞に記載の植物の改変方法である。
＜４＞ 前記微粒子を撃ち込んだ植物を生育し、植物体を得る工程を含む、前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の植物の改変方法である。
＜５＞ ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドと相互作用させた核酸で被覆した微粒子を植物に撃ち込む工程を含むことを特徴とする植物のゲノム編集方法である。
＜６＞ 前記ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドが、ミトコンドリア輸送シグナル配列及びポリカチオン配列を含むペプチドである、前記＜５＞に記載の植物のゲノム編集方法である。
＜７＞ 前記植物が、コムギ、オオムギ、イネ、トウモロコシ、ダイズ、ジャガイモ及びリンゴからなる群から選択される、前記＜５＞又は＜６＞に記載の植物のゲノム編集方法である。
＜８＞ 前記微粒子を撃ち込んだ植物を生育し、植物体を得る工程を含む、前記＜５＞から＜７＞のいずれかに記載の植物のゲノム編集方法である。
＜９＞ ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドと相互作用させた核酸で被覆した微粒子を植物に撃ち込む工程と、前記微粒子を撃ち込んだ植物を生育し、植物体を得る工程と、を含むことを特徴とする植物の作製方法である。
＜１０＞ 前記ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドが、ミトコンドリア輸送シグナル配列及びポリカチオン配列を含むペプチドである、前記＜９＞に記載の植物の作製方法である。
＜１１＞ 前記植物が、コムギ、オオムギ、イネ、トウモロコシ、ダイズ、ジャガイモ及びリンゴからなる群から選択される、前記＜９＞又は＜１０＞に記載の植物の作製方法である。
＜１＞ ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドと相互作用させた核酸で被覆した微粒子を植物に撃ち込む工程を含むことを特徴とする植物の改変方法である。
＜２＞ 前記ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドが、ミトコンドリア輸送シグナル配列及びポリカチオン配列を含むペプチドである、前記＜１＞に記載の植物の改変方法である。
＜３＞ 前記植物が、コムギ、オオムギ、イネ、トウモロコシ、ダイズ、ジャガイモ及びリンゴからなる群から選択される、前記＜１＞又は＜２＞に記載の植物の改変方法である。
＜４＞ 前記微粒子を撃ち込んだ植物を生育し、植物体を得る工程を含む、前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の植物の改変方法である。
＜５＞ ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドと相互作用させた核酸で被覆した微粒子を植物に撃ち込む工程を含むことを特徴とする植物のゲノム編集方法である。
＜６＞ 前記ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドが、ミトコンドリア輸送シグナル配列及びポリカチオン配列を含むペプチドである、前記＜５＞に記載の植物のゲノム編集方法である。
＜７＞ 前記植物が、コムギ、オオムギ、イネ、トウモロコシ、ダイズ、ジャガイモ及びリンゴからなる群から選択される、前記＜５＞又は＜６＞に記載の植物のゲノム編集方法である。
＜８＞ 前記微粒子を撃ち込んだ植物を生育し、植物体を得る工程を含む、前記＜５＞から＜７＞のいずれかに記載の植物のゲノム編集方法である。
＜９＞ ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドと相互作用させた核酸で被覆した微粒子を植物に撃ち込む工程と、前記微粒子を撃ち込んだ植物を生育し、植物体を得る工程と、を含むことを特徴とする植物の作製方法である。
＜１０＞ 前記ミトコンドリア輸送シグナル配列を含むペプチドが、ミトコンドリア輸送シグナル配列及びポリカチオン配列を含むペプチドである、前記＜９＞に記載の植物の作製方法である。
＜１１＞ 前記植物が、コムギ、オオムギ、イネ、トウモロコシ、ダイズ、ジャガイモ及びリンゴからなる群から選択される、前記＜９＞又は＜１０＞に記載の植物の作製方法である。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】