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特開2023-127868変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質、ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023127868
(43)【公開日】2023-09-14
(54)【発明の名称】変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質、ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 9/10 20060101AFI20230907BHJP
A01H 5/00 20180101ALI20230907BHJP
C12P 7/22 20060101ALI20230907BHJP
C08J 3/20 20060101ALI20230907BHJP
C08L 7/00 20060101ALI20230907BHJP
C08L 89/00 20060101ALI20230907BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20230907BHJP
C07K 14/415 20060101ALI20230907BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230907BHJP
C12N 15/82 20060101ALN20230907BHJP
【ＦＩ】
C12N9/10
A01H5/00 A ZNA
C12P7/22
C08J3/20 A CEQ
C08L7/00
C08L89/00
C12N15/54
C07K14/415
C12N15/63 Z
C12N15/82 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】16
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022031813
(22)【出願日】2022-03-02
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000183233
【氏名又は名称】住友ゴム工業株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】504157024
【氏名又は名称】国立大学法人東北大学
(71)【出願人】
【識別番号】504160781
【氏名又は名称】国立大学法人金沢大学
(71)【出願人】
【識別番号】504190548
【氏名又は名称】国立大学法人埼玉大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000914
【氏名又は名称】弁理士法人ＷｉｓｅＰｌｕｓ
(72)【発明者】
【氏名】山口 晴彦
(72)【発明者】
【氏名】井之上（宮城） ゆき乃
(72)【発明者】
【氏名】高橋 征司
(72)【発明者】
【氏名】中山 亨
(72)【発明者】
【氏名】山下 哲
(72)【発明者】
【氏名】戸澤 譲
【テーマコード（参考）】
2B030
4B050
4B064
4F070
4H045
4J002
【Ｆターム（参考）】
2B030AA03
2B030AB03
2B030AD08
2B030AD20
2B030CA14
2B030CA17
4B050CC03
4B050DD13
4B050EE10
4B050LL05
4B064AC17
4B064CA21
4B064CC24
4B064DA16
4F070AA05
4F070AC04
4F070AC05
4F070AC23
4F070AC40
4F070AE01
4F070AE02
4F070FB06
4F070FC03
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045CA30
4H045DA89
4H045EA61
4H045FA10
4H045FA74
4J002AC01W
4J002AD03X
4J002GN01
(57)【要約】
【課題】高分子量のポリイソプレノイドの製造を可能にする、変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質、ポリイソプレノイドの製造方法を提供する。
【解決手段】ゴム粒子上に存在しないシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列を、ゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列と同一に又は類似するように変異した変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質。
【選択図】図１
【解決手段】ゴム粒子上に存在しないシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列を、ゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列と同一に又は類似するように変異した変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ゴム粒子上に存在しないシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列を、ゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列と同一に又は類似するように変異した変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質。
【請求項2】
ゴム粒子上に存在しないシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列を、ゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列と同一の又は類似するアミノ酸配列に置換した請求項１記載の変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質。
【請求項3】
前記ゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質が、Ｈｅｖｅａ属又はＴａｒａｘａｃｕｍ属に属する植物由来のゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質である請求項１又は２記載の変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質。
【請求項4】
前記ゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質が、Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ又はＴａｒａｘａｃｕｍ ｋｏｋｓａｇｈｙｚ由来のゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質である請求項１又は２記載の変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質。
【請求項5】
前記ゴム粒子上に存在しないシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列が、該蛋白質のＣ末端から上流５０アミノ酸以内のＣ末端を含むアミノ酸配列である請求項１～４のいずれかに記載の変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質。
【請求項6】
請求項１～５のいずれかに記載の変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質を用いることを特徴とするポリイソプレノイドの製造方法。
【請求項7】
生体外で、請求項１～５のいずれかに記載の変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質を膜粒子に結合させる結合工程を含む請求項６記載のポリイソプレノイドの製造方法。
【請求項8】
請求項６又は７に記載のポリイソプレノイドの製造方法によりポリイソプレノイドを製造する工程と、得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法。
【請求項9】
請求項６又は７に記載のポリイソプレノイドの製造方法によりポリイソプレノイドを製造する工程と、得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法。
【請求項10】
請求項１～５のいずれかに記載の変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含むベクター。
【請求項11】
植物での蛋白質発現に用いられるプロモーター、及び、該プロモーターに機能的に連結された変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含む請求項１０記載のベクター。
【請求項12】
乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーター、及び、該プロモーターに機能的に連結された変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含む請求項１０記載のベクター。
【請求項13】
請求項１０～１２のいずれかに記載のベクターが導入された形質転換植物。
【請求項14】
請求項１０～１２のいずれかに記載のベクターを植物に導入することにより、該植物においてポリイソプレノイドを製造する方法。
【請求項15】
請求項１０～１２のいずれかに記載のベクターを植物に導入することにより得られる形質転換植物によりポリイソプレノイドを製造する工程、得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法。
【請求項16】
請求項１０～１２のいずれかに記載のベクターを植物に導入することにより得られる形質転換植物によりポリイソプレノイドを製造する工程、得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質、ポリイソプレノイドの製造方法、ベクター、形質転換植物、空気入りタイヤの製造方法、及びゴム製品の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ヒト由来のシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質においては、ＣＰＴファミリー蛋白質（以下では、単にＣＰＴとも記載する）のＮ末端と、Ｎｏｇｏ－Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質（ゴムノキ由来のＨＲＢＰに相当）の相互作用が、ＣＰＴの活性において重要であることが知られている。
【0003】
ゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質（以下では、単にゴム合成酵素とも記載する）においても、ゴム合成酵素のＮ末端欠損体では酵素活性が失われることが知られている。すなわち、ゴム合成酵素のＮ末端は酵素活性に重要な部位であることが知られている。しかしながら、従来の技術では、高分子量のポリイソプレノイドを製造するという点では、改善の余地がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本開示は、前記課題を解決し、高分子量のポリイソプレノイドの製造を可能にする、変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質、ポリイソプレノイドの製造方法を提供することを目的とする。
【0005】
本開示はまた、前記課題を解決し、遺伝子組換え技術により植物体に導入することで高分子量のポリイソプレノイドの製造を可能にする、ベクター、該ベクターが導入された形質転換植物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本開示者らは、Ｎｏｇｏ－Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｇＢＲ）ファミリー蛋白質は、ＣＰＴが正しい構造に折りたたまれることを補助する役割があると考えている。そのため、ＮｇＢＲとの相互作用が失われると、ＣＰＴは正しい構造で折りたたまれることが少なくなり、酵素活性が失われることとなる。
【0007】
本開示者らの検討の結果、以下のことが判明した。
（知見１）野生型のＣＰＴを使用したゴム粒子上でのゴム合成
ＣＰＴに変異導入を行わずにそのままゴム粒子に結合させて、ポリイソプレノイドを合成する場合、ＣＰＴの種類によっては、ゴム粒子上で高分子のポリイソプレノイドが合成されない場合があることが分かった。特に、もともと膜に結合しない短・中鎖のイソプレノイド合成する酵素を用いた場合はそもそも膜に結合しないという問題点があった。
（知見２）ＣＰＴに膜結合を補助するペプチド（又は酵素）を融合させた酵素を使用した膜粒子上でのポリイソプレノイド合成
前記知見１の課題を解決する方法の１つとして、ＣＰＴのＮ末端側又はＣ末端側に膜結合性を補助するペプチドや酵素（油滴結合蛋白質の膜結合部分やゴム粒子に結合するＳＲＰＰなど）と融合する方法も試みた。しかしながら、この方法により、酵素の膜結合性の問題は解決したものの、酵素が正しく膜に埋め込まれない可能性や融合蛋白質が酵素活性に重要とされているＮｇＢＲとの相互作用を阻害する可能性が残されていた。
（知見１）野生型のＣＰＴを使用したゴム粒子上でのゴム合成
ＣＰＴに変異導入を行わずにそのままゴム粒子に結合させて、ポリイソプレノイドを合成する場合、ＣＰＴの種類によっては、ゴム粒子上で高分子のポリイソプレノイドが合成されない場合があることが分かった。特に、もともと膜に結合しない短・中鎖のイソプレノイド合成する酵素を用いた場合はそもそも膜に結合しないという問題点があった。
（知見２）ＣＰＴに膜結合を補助するペプチド（又は酵素）を融合させた酵素を使用した膜粒子上でのポリイソプレノイド合成
前記知見１の課題を解決する方法の１つとして、ＣＰＴのＮ末端側又はＣ末端側に膜結合性を補助するペプチドや酵素（油滴結合蛋白質の膜結合部分やゴム粒子に結合するＳＲＰＰなど）と融合する方法も試みた。しかしながら、この方法により、酵素の膜結合性の問題は解決したものの、酵素が正しく膜に埋め込まれない可能性や融合蛋白質が酵素活性に重要とされているＮｇＢＲとの相互作用を阻害する可能性が残されていた。
【0008】
本開示者らは、鋭意検討した結果、ゴム粒子上で高分子のポリイソプレノイドを合成するためには、（指針ａ）ＣＰＴが正しく折りたたまれること、（指針ｂ）膜に結合すること、（指針ｃ）膜に正しく（深く）組み込まれることが必要であると考えるに至った。
【0009】
本開示者らは、鋭意検討した結果、前記（知見１）の手法では、もともとゴム粒子上に存在しないＣＰＴを用いた場合、（指針ｂ）と（指針ｃ）に課題を抱えることとなり、前記（知見２）の手法では、膜結合性ペプチドとの融合により（指針ｂ）は解決できるものの、ペプチド融合の弊害として（指針ａ）（Ｎ末端側に融合させ場合、酵素の折り畳みがうまくいかない）や（指針ｃ）（Ｃ末端側に融合させた場合、酵素が膜に正しく組み込まれない）に課題を抱えていることが判明した。
【0010】
本開示者らは、ＣＰＴの末端構造とＮｇＢＲの相互作用の関係性を調べていく中で、ＣＰＴのＣ末端構造が膜への結合性に影響を及ぼすことを見出した。そこで、本開示者らは、ＣＰＴの正しい折り畳みに関わるＮ末端側の構造を変えずに、Ｃ末端の構造を変えることで、酵素を膜に深く組み込む手法について検討した。そして、本開示者らは、酵素を膜に深く組み込む手法として、ゴム粒子上に存在するＣＰＴのＣ末端構造を利用することに想到した。ここで、ＣＰＴのＣ末端にゴム粒子上に存在するＣＰＴのＣ末端配列を融合させるのではなく、ゴム粒子上に存在しないＣＰＴのＣ末端配列を、ゴム粒子上に存在するＣＰＴのＣ末端配列と交換（スワップ）することで、ゴム粒子上に存在しないＣＰＴを膜に正しく組み込ませることができることを見出し、本開示を完成した。
【0011】
すなわち、本開示は、ゴム粒子上に存在しないシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列を、ゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列と同一に又は類似するように変異した変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質に関する。以降、この開示を本開示の第１の開示とし、第１の本開示とも称する。
【発明の効果】
【0012】
第１の本開示によれば、ゴム粒子上に存在しないシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列を、ゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列と同一に又は類似するように変異した変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質であるので、変異前のシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質よりも高分子量のポリイソプレノイドの製造が可能であり、変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質を用いたポリイソプレノイドの製造方法により、変異前のシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質を用いた場合よりも高分子量のポリイソプレノイドの製造が可能となる。
【0013】
第１の本開示の空気入りタイヤの製造方法は、第１の本開示のポリイソプレノイドの製造方法によりポリイソプレノイドを製造する工程と、得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法であるので、高分子量のポリイソプレノイドから空気入りタイヤを製造するため、植物資源を有効に利用でき、環境に配慮して性能に優れた空気入りタイヤを製造することができる。
【0014】
第１の本開示のゴム製品の製造方法は、第１の本開示のポリイソプレノイドの製造方法によりポリイソプレノイドを製造する工程と、得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法であるので、高分子量のポリイソプレノイドからゴム製品を製造するため、植物資源を有効に利用でき、環境に配慮して性能に優れたゴム製品を製造することができる。
【0015】
第２の本開示のベクターは、第１の本開示の変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターである。そして、該ベクターを植物に導入することにより、該ベクターに含まれる、第１の本開示の変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子が発現し、当該植物において、遺伝子組み換え前と比較して、高分子量のポリイソプレノイドの製造を可能にする。
【0016】
第２の本開示の空気入りタイヤの製造方法は、第２の本開示のベクターを植物に導入することにより得られる形質転換植物によりポリイソプレノイドを製造する工程、得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法であるので、遺伝子組み換え前と比較して、高分子量のポリイソプレノイドの製造を可能にした形質転換植物から得られる高分子量のポリイソプレノイドから空気入りタイヤを製造するため、植物資源を有効に利用でき、環境に配慮して性能に優れた空気入りタイヤを製造することができる。
【0017】
第２の本開示のゴム製品の製造方法は、第２の本開示のベクターを植物に導入することにより得られる形質転換植物によりポリイソプレノイドを製造する工程、得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法であるので、遺伝子組み換え前と比較して、高分子量のポリイソプレノイドの製造を可能にした形質転換植物から得られる高分子量のポリイソプレノイドからゴム製品を製造するため、植物資源を有効に利用でき、環境に配慮して性能に優れたゴム製品を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】予想される機構を示す概略図である。
【図2】実施例１、比較例１の酵素活性を測定した結果を表すグラフである。
【図3】実施例１、比較例１において合成されたポリイソプレノイドの分子量分布の測定結果を表すグラフである。
【図4】実施例２、比較例２の酵素活性を測定した結果を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本明細書においては、第１の本開示と第２の本開示を合わせて本開示ともいう。まず、第１の本開示について説明し、続いて第２の本開示について説明する。
（第１の本開示）
第１の本開示の変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質は、ゴム粒子上に存在しないシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列を、ゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列と同一に又は類似するように変異した変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質である。これにより、変異前のシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質よりも高分子量のポリイソプレノイドの製造が可能であり、変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質を用いたポリイソプレノイドの製造方法により、変異前のシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質を用いた場合よりも高分子量のポリイソプレノイドの製造が可能となる。
なお、本明細書において、蛋白質のＮ末端は、ポリペプチド鎖のアミノ末端、蛋白質のＣ末端は、ポリペプチド鎖のカルボキシ末端を意味する。
（第１の本開示）
第１の本開示の変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質は、ゴム粒子上に存在しないシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列を、ゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列と同一に又は類似するように変異した変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質である。これにより、変異前のシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質よりも高分子量のポリイソプレノイドの製造が可能であり、変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質を用いたポリイソプレノイドの製造方法により、変異前のシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質を用いた場合よりも高分子量のポリイソプレノイドの製造が可能となる。
なお、本明細書において、蛋白質のＮ末端は、ポリペプチド鎖のアミノ末端、蛋白質のＣ末端は、ポリペプチド鎖のカルボキシ末端を意味する。
【0020】
本開示で前述の効果が得られる理由は、以下のように推察される。
前記の通り、本開示者らは、ＣＰＴのＣ末端に着目した。ＣＰＴのＣ末端の重要度は、本来ゴム粒子上に存在しないＣＰＴの方が、ゴム粒子上に存在するＣＰＴよりも大きい。
前記の通り、本開示者らは、ＣＰＴのＣ末端に着目した。ＣＰＴのＣ末端の重要度は、本来ゴム粒子上に存在しないＣＰＴの方が、ゴム粒子上に存在するＣＰＴよりも大きい。
【0021】
ＣＰＴのＮ末端については、他の研究でも着目されてきたが、Ｃ末端の役割についてはホモダイマー型のＣＰＴでは、Ｃ末端側のＲＸＧモチーフの変異で活性が大きく低下することが示されている。構造的知見から、Ｃ末端側領域が別のサブユニットの基質結合部位に近づき、基質の結合を保持していることが示唆されている。一方で、ヘテロマー型のＣＰＴではｃＰＴＬのＣ末端がＲｘＧモチーフと同様の機能をしていることが示されているが、ｃＰＴＬと結合しているＣＰＴ側のＣ末端に関しての機能は未知であった。実際、ゴム合成酵素のＣ末端へ変異を導入しても、大きな変化はもたらされなかった。
（１）野生型のＨＲＴ１（パラゴムノキ由来のゴム粒子上に存在するＣＰＴファミリー蛋白質（ゴム合成酵素））は、ゴム粒子に結合した状態で、問題なく活性を示した。
（２）Ｎ末端欠損ＨＲＴ１は、ゴム粒子への結合は確認できたものの、酵素活性は確認できなかった。これは、従来の知見と一致する。
（３）Ｃ末端変異導入ＨＲＴ１は、ゴム粒子に結合した状態で、問題なく活性を示した。
以上の通り、ゴム粒子上に存在するＣＰＴファミリー蛋白質（ゴム合成酵素）においては、Ｃ末端の構造の重要性は低いことが分かった。
（１）野生型のＨＲＴ１（パラゴムノキ由来のゴム粒子上に存在するＣＰＴファミリー蛋白質（ゴム合成酵素））は、ゴム粒子に結合した状態で、問題なく活性を示した。
（２）Ｎ末端欠損ＨＲＴ１は、ゴム粒子への結合は確認できたものの、酵素活性は確認できなかった。これは、従来の知見と一致する。
（３）Ｃ末端変異導入ＨＲＴ１は、ゴム粒子に結合した状態で、問題なく活性を示した。
以上の通り、ゴム粒子上に存在するＣＰＴファミリー蛋白質（ゴム合成酵素）においては、Ｃ末端の構造の重要性は低いことが分かった。
【0022】
一方で、ゴム粒子上に存在しないＣＰＴのＣ末端への変異導入は大きな影響をもたらした。
（４）野生型のＨｂＣＰＴ５（パラゴムノキ由来のゴム粒子上に存在しないＣＰＴ）は、ゴム粒子に結合させても短鎖イソプレン鎖の合成が中心であった。
（５）Ｎ末端ＨＲＴ１化変異導入ＨｂＣＰＴ５（ＨｂＣＰＴ５のＮ末端をＨＲＴ１のＮ末端に置換）では、大きな変化は見られなかった。
（６）Ｃ末端ＨＲＴ１化変異導入ＨｂＣＰＴ５（ＨｂＣＰＴ５のＣ末端をＨＲＴ１のＣ末端に置換）では、ゴム粒子に結合させた場合、ゴム鎖長まで生成物鎖長が伸びる割合が増加し、高分子量のポリイソプレノイドの製造量の増大を確認できた。
（４）野生型のＨｂＣＰＴ５（パラゴムノキ由来のゴム粒子上に存在しないＣＰＴ）は、ゴム粒子に結合させても短鎖イソプレン鎖の合成が中心であった。
（５）Ｎ末端ＨＲＴ１化変異導入ＨｂＣＰＴ５（ＨｂＣＰＴ５のＮ末端をＨＲＴ１のＮ末端に置換）では、大きな変化は見られなかった。
（６）Ｃ末端ＨＲＴ１化変異導入ＨｂＣＰＴ５（ＨｂＣＰＴ５のＣ末端をＨＲＴ１のＣ末端に置換）では、ゴム粒子に結合させた場合、ゴム鎖長まで生成物鎖長が伸びる割合が増加し、高分子量のポリイソプレノイドの製造量の増大を確認できた。
【0023】
前記（３）と前記（６）の結果の比較から、ゴム粒子上に存在するＣＰＴであるＨＲＴ１のＣ末端様の構造を、ゴム粒子上に存在しないＣＰＴのＣ末端に持たせることは、本来ゴム粒子上に存在しないＣＰＴをゴム粒子に結合させ、高分子の生成物を作りたい場合に特に効果を発揮すると考えられる。この効果はＨｂＣＰＴ５以外のゴム粒子上に存在しないＣＰＴであるＡｔＣＰＴ５（シロイヌナズナ由来のゴム粒子上に存在しないＣＰＴ）でも類似の現象が確認された。
【0024】
ゴム粒子上に存在しないＣＰＴにおけるＣ末端の変異が、どのような作用で効果を発揮しているのかは明確には分かっていないが、以下の点から、ＣＰＴが膜に深く入り込むのを助ける機能を有していると推測される。
・Ｃ末端ＨＲＴ１化変異導入ＡｔＣＰＴ５（ＡｔＣＰＴ５のＣ末端をＨＲＴ１のＣ末端に置換）とＨＲＢＰ（パラゴムノキ由来のＮｇＢＲ）との相互作用試験では、相互作用は確認できなかった。
・Ｃ末端ＨＲＴ１化変異導入ＡｔＣＰＴ５（ＡｔＣＰＴ５のＣ末端をＨＲＴ１のＣ末端に置換）とＨＲＢＰ（パラゴムノキ由来のＮｇＢＲ）との相互作用試験では、相互作用は確認できなかった。
【0025】
・Ｃ末端ＨＲＴ１化変異導入ＡｔＣＰＴ５は、生成物の鎖長決定するＨｅｌｉｘ２及びＨｅｌｉｘ３に変異を加えていないにもかかわらず、鎖長制御機構がうまく働かなくなり、生成物の高分子量化が見られた。
・ＣＰＴのＣ末端構造は活性中心の近くに存在することが知られている。
よって、これらの知見より、Ｃ末端は活性中心の近くに存在するため、その構造（例えば、疎水性度）を変化させることで、活性中心近くまでＣＰＴが膜に深く入り込んでいると推測される。
・ＣＰＴのＣ末端構造は活性中心の近くに存在することが知られている。
よって、これらの知見より、Ｃ末端は活性中心の近くに存在するため、その構造（例えば、疎水性度）を変化させることで、活性中心近くまでＣＰＴが膜に深く入り込んでいると推測される。
【0026】
以上の、予想される機構を図１を用いて説明する。
図１（ａ）は、ゴム粒子上に存在しないＣＰＴがゴム粒子に結合していない状態で反応する際の概略図である。この場合には、ストッパーの存在により、鎖長制御機構が機能し、所定の分子量のポリイソプレノイドが製造されることとなる。
図１（ｂ）は、ゴム粒子上に存在しないＣＰＴがゴム粒子に結合した状態で反応する際の概略図である。この場合には、ストッパーがわずかにゴム粒子（膜）に埋まるため、ゴム粒子に結合していない状態に比べて、多少高分子量化したポリイソプレノイドが製造されることとなる。
図１（ｃ）は、「ゴム粒子上に存在しないＣＰＴのＣ末端領域を、ゴム粒子上に存在するＣＰＴのＣ末端領域に置換した変異ＣＰＴ」がゴム粒子に結合した状態で反応する際の概略図である。この場合には、変異ＣＰＴのＣ末端が、ゴム粒子（膜）と相互作用するようになるため、ＣＰＴがより深くゴム粒子（膜）に入り込み、本来のストッパーが機能しなくなり、生成物が高分子量化することとなる。なお、本開示では、ゴム粒子上に存在しないＣＰＴのＣ末端領域に更にアミノ酸配列を付加する融合ではなく、ゴム粒子上に存在しないＣＰＴのＣ末端領域の置換を行っているため、前記機構がより好適に発揮されるものと推測される。
図１（ａ）は、ゴム粒子上に存在しないＣＰＴがゴム粒子に結合していない状態で反応する際の概略図である。この場合には、ストッパーの存在により、鎖長制御機構が機能し、所定の分子量のポリイソプレノイドが製造されることとなる。
図１（ｂ）は、ゴム粒子上に存在しないＣＰＴがゴム粒子に結合した状態で反応する際の概略図である。この場合には、ストッパーがわずかにゴム粒子（膜）に埋まるため、ゴム粒子に結合していない状態に比べて、多少高分子量化したポリイソプレノイドが製造されることとなる。
図１（ｃ）は、「ゴム粒子上に存在しないＣＰＴのＣ末端領域を、ゴム粒子上に存在するＣＰＴのＣ末端領域に置換した変異ＣＰＴ」がゴム粒子に結合した状態で反応する際の概略図である。この場合には、変異ＣＰＴのＣ末端が、ゴム粒子（膜）と相互作用するようになるため、ＣＰＴがより深くゴム粒子（膜）に入り込み、本来のストッパーが機能しなくなり、生成物が高分子量化することとなる。なお、本開示では、ゴム粒子上に存在しないＣＰＴのＣ末端領域に更にアミノ酸配列を付加する融合ではなく、ゴム粒子上に存在しないＣＰＴのＣ末端領域の置換を行っているため、前記機構がより好適に発揮されるものと推測される。
【0027】
ゴム粒子上に存在するＣＰＴにおいて、Ｃ末端の重要性が低いのは、ゴム粒子上に存在するＣＰＴはもともとゴム粒子に結合する酵素であるため、Ｃ末端以外の部分においても、ゴム粒子（膜）と結合する部分を有していると考えられる。そのため、ゴム粒子上に存在するＣＰＴにおいて、Ｃ末端がうまく機能しなくなったとしても他の部分がゴム粒子（膜）との結合を補助していると推測される。
また、ゴム粒子上に存在するＣＰＴには、生成物鎖長を制御するストッパーが存在しないため、ゴム粒子（膜）への結合が多少浅くなったとしても影響は少ないものと推測される。
また、ゴム粒子上に存在するＣＰＴには、生成物鎖長を制御するストッパーが存在しないため、ゴム粒子（膜）への結合が多少浅くなったとしても影響は少ないものと推測される。
【0028】
以上の通り、ゴム粒子上に存在しないＣＰＴファミリー蛋白質のＣ末端領域を、ゴム粒子上に存在するＣＰＴファミリー蛋白質のＣ末端領域と同一に又は類似するように変異（置換）した変異ＣＰＴファミリー蛋白質であれば、変異ＣＰＴのＣ末端が、ゴム粒子（膜）と相互作用するようになるため、ＣＰＴがより深くゴム粒子（膜）に入り込み、本来のストッパーが機能しなくなり、生成物が高分子量化することとなる。
【0029】
よって、第１の本開示によれば、ゴム粒子上に存在しないＣＰＴファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列を、ゴム粒子上に存在するＣＰＴファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列と同一に又は類似するように変異した変異ＣＰＴファミリー蛋白質であるので、変異前のＣＰＴファミリー蛋白質よりも高分子量のポリイソプレノイドの製造が可能であり、変異ＣＰＴファミリー蛋白質を用いたポリイソプレノイドの製造方法により、変異前のＣＰＴファミリー蛋白質を用いた場合よりも高分子量のポリイソプレノイドの製造が可能となる。
【0030】
＜変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質＞
本開示の変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質は、ゴム粒子上に存在しないシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列を、ゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列と同一に又は類似するように変異した変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質である。
本開示の変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質は、ゴム粒子上に存在しないシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列を、ゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列と同一に又は類似するように変異した変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質である。
【0031】
本開示の変異ＣＰＴファミリー蛋白質は、より具体的には、ゴム粒子上に存在しないシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列を、ゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列と同一の又は類似するアミノ酸配列に置換した変異ＣＰＴファミリー蛋白質である。
【0032】
ゴム粒子上に存在しないシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列は、該蛋白質のＣ末端から上流５０アミノ酸以内のＣ末端を含むアミノ酸配列であることが好ましく、該蛋白質のＣ末端から上流４５アミノ酸以内のＣ末端を含むアミノ酸配列であることがより好ましく、該蛋白質のＣ末端から上流４０アミノ酸以内のＣ末端を含むアミノ酸配列であることが更に好ましく、該蛋白質のＣ末端から上流３５アミノ酸以内のＣ末端を含むアミノ酸配列であることが特に好ましく、該蛋白質のＣ末端から上流３０アミノ酸以内のＣ末端を含むアミノ酸配列であることが最も好ましい。
なお、本明細書において、Ｃ末端領域のアミノ酸配列は、連続するアミノ酸配列である。
なお、本明細書において、Ｃ末端領域のアミノ酸配列は、連続するアミノ酸配列である。
【0033】
ゴム粒子上に存在しないシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列は、例えば、配列番号３で示されるシロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ５のアミノ酸配列では、２７８位から３０２位までのアミノ酸配列、配列番号４で示されるパラゴムノキ由来のＨｂＣＰＴ５のアミノ酸配列では、３４２位から３６８位までのアミノ酸配列に相当する。
【0034】
ゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列も、同様に、該蛋白質のＣ末端から上流５０アミノ酸以内のＣ末端を含むアミノ酸配列であることが好ましく、該蛋白質のＣ末端から上流４５アミノ酸以内のＣ末端を含むアミノ酸配列であることがより好ましく、該蛋白質のＣ末端から上流４０アミノ酸以内のＣ末端を含むアミノ酸配列であることが更に好ましく、該蛋白質のＣ末端から上流３５アミノ酸以内のＣ末端を含むアミノ酸配列であることが特に好ましく、該蛋白質のＣ末端から上流３０アミノ酸以内のＣ末端を含むアミノ酸配列であることが最も好ましい。
【0035】
ゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列は、例えば、配列番号１で示されるパラゴムノキ由来のＨＲＴ１のアミノ酸配列では、２６３位から２９０位までのアミノ酸配列に相当する。
【0036】
ゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列と類似するアミノ酸配列は、ゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列と、好ましくは８０％以上の配列同一性、より好ましくは８５％以上の配列同一性、更に好ましくは９０％以上の配列同一性、特に好ましくは９５％以上の配列同一性、最も好ましくは９８％以上の配列同一性、より最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列である。
【0037】
アミノ酸配列の変異（置換）は、公知の手法に従って行うことができる。例えば、相同組換え、Ｏｖｅｒｌａｐ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニングや制限酵素を用いたＰＣＲ産物の融合などが挙げられる。
【0038】
前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質のＮ末端領域のアミノ酸配列は、ゴム粒子上に存在しないＣＰＴファミリー蛋白質のＮ末端領域のアミノ酸配列と、好ましくは８０％以上の配列同一性、より好ましくは８５％以上の配列同一性、更に好ましくは９０％以上の配列同一性、特に好ましくは９５％以上の配列同一性、最も好ましくは９８％以上の配列同一性、より最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、更に最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列（Ｎ末端側の構造に変化なし）である。
【0039】
＜＜ゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質＞＞
ゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質としては、ゴム粒子上に存在するＣＰＴファミリー蛋白質であれば特に限定されず、例えば、植物由来のゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質であればよい。なかでも、Ｈｅｖｅａ属又はＴａｒａｘａｃｕｍ属（なかでも、Ｈｅｖｅａ属）に属する植物由来のゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質であることが好ましく、Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ又はＴａｒａｘａｃｕｍ ｋｏｋｓａｇｈｙｚ（なかでも、Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）由来のゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質であることがより好ましい。
ゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質としては、ゴム粒子上に存在するＣＰＴファミリー蛋白質であれば特に限定されず、例えば、植物由来のゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質であればよい。なかでも、Ｈｅｖｅａ属又はＴａｒａｘａｃｕｍ属（なかでも、Ｈｅｖｅａ属）に属する植物由来のゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質であることが好ましく、Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ又はＴａｒａｘａｃｕｍ ｋｏｋｓａｇｈｙｚ（なかでも、Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）由来のゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質であることがより好ましい。
【0040】
前記植物としては、特に限定されず、例えば、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のＨｅｖｅａ属；ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、オニノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ａｓｐｅｒ）、ハチジョウナ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ｂｒａｃｈｙｏｔｕｓ）等のＳｏｎｃｈｕｓ属；セイタカアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、アキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ａｓｉａｔｉｃａ）、ミヤマアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ｌｅｉｐｃａｒｐａ）、キリガミネアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ｌｅｉｐｃａｒｐａ ｆ． ｐａｌｕｄｏｓａ）、オオアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ｇｉｇａｎｔｅａ）、オオアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｇｉｇａｎｔｅａ Ａｉｔ． ｖａｒ． ｌｅｉｏｐｈｙｌｌａ Ｆｅｒｎａｌｄ）等のＳｏｌｉｄａｇｏ属；ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、シロタエヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｒｇｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ヘリアンサス・アトロルベンス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｔｒｏｒｕｂｅｎｓ）、ヒメヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｄｅｂｉｌｉｓ）、コヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｄｅｃａｐｅｔａｌｕｓ）、ジャイアントサンフラワー（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）等のＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ属；タンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）、エゾタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｖｅｎｕｓｔｕｍ Ｈ．Ｋｏｉｄｚ）、シナノタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｈｏｎｄｏｅｎｓｅ Ｎａｋａｉ）、カントウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｐｌａｔｙｃａｒｐｕｍ Ｄａｈｌｓｔ）、カンサイタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、セイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ Ｗｅｂｅｒ）、ロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｋｏｋｓａｇｈｙｚ）等のＴａｒａｘａｃｕｍ属；イチジク（Ｆｉｃｕｓ ｃａｒｉｃａ）、インドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｅｌａｓｔｉｃａ）、オオイタビ（Ｆｉｃｕｓ ｐｕｍｉｌａ Ｌ．）、イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｍｂ．）、ホソバムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ａｍｐｅｌａｓ Ｂｕｒｍ．ｆ．）、コウトウイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｂｅｎｇｕｅｔｅｎｓｉｓ Ｍｅｒｒ．）、ムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｉｒｉｓａｎａ Ｅｌｍ．）、ガジュマル（Ｆｉｃｕｓ ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ Ｌ．ｆ．）、オオバイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｓｅｐｔｉｃａ Ｂｕｒｍ．ｆ．）、ベンガルボダイジュ（Ｆｉｃｕｓ ｂｅｎｇｈａｌｅｎｓｉｓ）等のＦｉｃｕｓ属；グアユール（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、アメリカブクリョウサイ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ｈｙｓｔｅｒｏｐｈｏｒｕｓ）、ブタクサ等のＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属；レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）等が挙げられる。
【0041】
前記ゴム粒子上に存在するＣＰＴファミリー蛋白質の具体例は、例えば、パラゴムノキ由来のゴム粒子上に存在するＣＰＴファミリー蛋白質であるＨＲＴ１、ＨＲＴ２、ロシアタンポポ由来のゴム粒子上に存在するＣＰＴファミリー蛋白質であるＣＰＴ１、グアユール由来のゴム粒子上に存在するＣＰＴファミリー蛋白質であるＣＰＴ３等が挙げられる。なかでも、ＨＲＴ１が好ましい。
【0042】
前記ゴム粒子上に存在するＣＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［１］が挙げられる。
［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
【0043】
また、蛋白質は、元のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含む場合であっても本来持つ機能を有する場合があることが知られている。従って、前記ＣＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［２］も挙げられる。
［２］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［２］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
【0044】
なお、前記ＣＰＴファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１～５８個のアミノ酸、更に好ましくは１～４４個のアミノ酸、更により好ましくは１～２９個のアミノ酸、特に好ましくは１～１５個のアミノ酸、最も好ましくは１～６個のアミノ酸、より最も好ましくは１～３個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
【0045】
アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のカッコ内のグループ内での置換が挙げられる。例えば、（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）である。
【0046】
また、蛋白質は、元のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列を有する蛋白質も同様の機能を有する場合があることが知られている。従って、前記ＣＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［３］も挙げられる。
［３］配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［３］配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
【0047】
なお、前記ＣＰＴファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号１で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
【0048】
アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０， ５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １８３， ６３ （１９９０）］を用いて決定することができる。
【0049】
前記酵素活性を有する蛋白質であることを確認する方法としては、例えば、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、目的蛋白質の機能の有無をそれぞれの活性測定法により、活性測定等を行う方法が挙げられる。
【0050】
前記ゴム粒子上に存在するＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子としては、具体的には、下記［１］又は［２］が挙げられる。
［１］配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［２］配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［１］配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［２］配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【0051】
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザン又はサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、又はＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡであってもよい。
【0052】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｍａｎｕａｌ， Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
【0053】
前記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェントな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度及び温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば６×ＳＳＣＥ（２０×ＳＳＣＥは、３ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、０．２ｍｏｌ／ｌのリン酸二水素ナトリウム、０．０２ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベートした後、５０℃の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、更に低いストリンジェントな条件としては、前記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば５×ＳＳＣ）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
【0054】
前記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、又は変更することにより設定することもできる。前記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
【0055】
前記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、前記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号２で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。
【0056】
前記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、所定の酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることを確認する方法としては、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、目的蛋白質の機能の有無をそれぞれの活性測定法により、活性測定等を行う方法が挙げられる。
【0057】
また、前記蛋白質のアミノ酸配列及び塩基配列を同定する方法は、従来公知の方法を用いることができ、例えば、生育する植物から、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、必要に応じてｍＲＮＡを精製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する。次に目的蛋白質に相当する既知の蛋白質のアミノ酸配列をもとに、縮重プライマーを設計し、ＲＴ－ＰＣＲを行い、部分的にＤＮＡ断片の増幅を行い、部分的に配列を同定する。次いで、ＲＡＣＥ法などを行い、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定する。ＲＡＣＥ法（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ法）とは、ｃＤＮＡの塩基配列が部分的に把握されているときに、その既知領域の塩基配列情報を基にＰＣＲを行って、ｃＤＮＡ末端までの未知領域をクローニングする方法で、ｃＤＮＡライブラリーの作製を経ずに、ＰＣＲ法によって全長のｃＤＮＡをクローニングすることができる方法である。
なお、縮重プライマーは、前記目的蛋白質と共通性の高い配列部位を有する植物由来の配列から作製することが好ましい。
また、前記蛋白質をコードする塩基配列が既知の場合には、その知られている塩基配列から開始コドンを含むプライマー及び終止コドンを含むプライマーを設計し、合成したｃＤＮＡを鋳型にしてＲＴ－ＰＣＲを行うことで全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定することができる。
なお、縮重プライマーは、前記目的蛋白質と共通性の高い配列部位を有する植物由来の配列から作製することが好ましい。
また、前記蛋白質をコードする塩基配列が既知の場合には、その知られている塩基配列から開始コドンを含むプライマー及び終止コドンを含むプライマーを設計し、合成したｃＤＮＡを鋳型にしてＲＴ－ＰＣＲを行うことで全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定することができる。
【0058】
＜＜ゴム粒子上に存在しないシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質＞＞
ゴム粒子上に存在しないシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質としては、ゴム粒子上に存在しないＣＰＴファミリー蛋白質であれば特に限定されず、例えば、植物由来のゴム粒子上に存在しないシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質であればよい。ここで、植物としては、前述の植物と同様の植物である。なかでも、Ｈｅｖｅａ属又はＴａｒａｘａｃｕｍ属（なかでも、Ｈｅｖｅａ属）に属する植物由来のゴム粒子上に存在しないシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質であることが好ましく、Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ又はＴａｒａｘａｃｕｍ ｋｏｋｓａｇｈｙｚ（なかでも、Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）由来のゴム粒子上に存在しないシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質であることがより好ましい。また、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来のゴム粒子上に存在しないシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質であることも好ましい。
ゴム粒子上に存在しないシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質としては、ゴム粒子上に存在しないＣＰＴファミリー蛋白質であれば特に限定されず、例えば、植物由来のゴム粒子上に存在しないシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質であればよい。ここで、植物としては、前述の植物と同様の植物である。なかでも、Ｈｅｖｅａ属又はＴａｒａｘａｃｕｍ属（なかでも、Ｈｅｖｅａ属）に属する植物由来のゴム粒子上に存在しないシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質であることが好ましく、Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ又はＴａｒａｘａｃｕｍ ｋｏｋｓａｇｈｙｚ（なかでも、Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）由来のゴム粒子上に存在しないシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質であることがより好ましい。また、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来のゴム粒子上に存在しないシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質であることも好ましい。
【0059】
前記ゴム粒子上に存在しないＣＰＴファミリー蛋白質の具体例は、例えば、シロイヌナズナ由来のゴム粒子上に存在しないＣＰＴであるＡｔＣＰＴ４、ＡｔＣＰＴ５、パラゴムノキ由来のゴム粒子上に存在しないＣＰＴであるＨｂＣＰＴ４、ＨｂＣＰＴ５、トマト由来のゴム粒子上に存在しないＣＰＴであるＮＤＰＳ１等が挙げられる。なかでも、ＡｔＣＰＴ５、ＨｂＣＰＴ５が好ましい。
【0060】
前記ゴム粒子上に存在しないＣＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［４］が挙げられる。
［４］配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［４］配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
【0061】
また、蛋白質は、元のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含む場合であっても本来持つ機能を有する場合があることが知られている。従って、前記ＣＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［５］も挙げられる。
［５］配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［５］配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
【0062】
なお、前記ＣＰＴファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号３で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１～６０個のアミノ酸、更に好ましくは１～４５個のアミノ酸、更により好ましくは１～３０個のアミノ酸、特に好ましくは１～１５個のアミノ酸、最も好ましくは１～６個のアミノ酸、より最も好ましくは１～３個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
【0063】
アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のカッコ内のグループ内での置換が挙げられる。例えば、（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）である。
【0064】
また、蛋白質は、元のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列を有する蛋白質も同様の機能を有する場合があることが知られている。従って、前記ＣＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［６］も挙げられる。
［６］配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［６］配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
【0065】
なお、前記ＣＰＴファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号３で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
【0066】
アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０， ５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １８３， ６３ （１９９０）］を用いて決定することができる。
【0067】
前記酵素活性を有する蛋白質であることを確認する方法としては、例えば、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、目的蛋白質の機能の有無をそれぞれの活性測定法により、活性測定等を行う方法が挙げられる。
【0068】
前記ゴム粒子上に存在しないＣＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、また下記［７］が挙げられる。
［７］配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［７］配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
【0069】
また、蛋白質は、元のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含む場合であっても本来持つ機能を有する場合があることが知られている。従って、前記ＣＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［８］も挙げられる。
［８］配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［８］配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
【0070】
なお、前記ＣＰＴファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号４で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１～７３個のアミノ酸、更に好ましくは１～５５個のアミノ酸、更により好ましくは１～３７個のアミノ酸、特に好ましくは１～１８個のアミノ酸、最も好ましくは１～７個のアミノ酸、より最も好ましくは１～４個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
【0071】
アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のカッコ内のグループ内での置換が挙げられる。例えば、（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）である。
【0072】
また、蛋白質は、元のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列を有する蛋白質も同様の機能を有する場合があることが知られている。従って、前記ＣＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［９］も挙げられる。
［９］配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［９］配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
【0073】
なお、前記ＣＰＴファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号４で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
【0074】
アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０， ５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １８３， ６３ （１９９０）］を用いて決定することができる。
【0075】
前記酵素活性を有する蛋白質であることを確認する方法としては、例えば、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、目的蛋白質の機能の有無をそれぞれの活性測定法により、活性測定等を行う方法が挙げられる。
【0076】
前記ゴム粒子上に存在しないＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子としては、具体的には、下記［３］又は［４］が挙げられる。
［３］配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［４］配列番号５で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［３］配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［４］配列番号５で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【0077】
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザン又はサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、又はＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡであってもよい。
【0078】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｍａｎｕａｌ， Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
【0079】
前記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェントな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度及び温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば６×ＳＳＣＥ（２０×ＳＳＣＥは、３ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、０．２ｍｏｌ／ｌのリン酸二水素ナトリウム、０．０２ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベートした後、５０℃の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、更に低いストリンジェントな条件としては、前記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば５×ＳＳＣ）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
【0080】
前記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、又は変更することにより設定することもできる。前記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
【0081】
前記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、前記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号５で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。
【0082】
前記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、所定の酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることを確認する方法としては、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、目的蛋白質の機能の有無をそれぞれの活性測定法により、活性測定等を行う方法が挙げられる。
【0083】
また、前記蛋白質のアミノ酸配列及び塩基配列を同定する方法は、従来公知の方法を用いることができ、例えば、生育する植物から、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、必要に応じてｍＲＮＡを精製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する。次に目的蛋白質に相当する既知の蛋白質のアミノ酸配列をもとに、縮重プライマーを設計し、ＲＴ－ＰＣＲを行い、部分的にＤＮＡ断片の増幅を行い、部分的に配列を同定する。次いで、ＲＡＣＥ法などを行い、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定する。ＲＡＣＥ法（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ法）とは、ｃＤＮＡの塩基配列が部分的に把握されているときに、その既知領域の塩基配列情報を基にＰＣＲを行って、ｃＤＮＡ末端までの未知領域をクローニングする方法で、ｃＤＮＡライブラリーの作製を経ずに、ＰＣＲ法によって全長のｃＤＮＡをクローニングすることができる方法である。
なお、縮重プライマーは、前記目的蛋白質と共通性の高い配列部位を有する植物由来の配列から作製することが好ましい。
また、前記蛋白質をコードする塩基配列が既知の場合には、その知られている塩基配列から開始コドンを含むプライマー及び終止コドンを含むプライマーを設計し、合成したｃＤＮＡを鋳型にしてＲＴ－ＰＣＲを行うことで全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定することができる。
なお、縮重プライマーは、前記目的蛋白質と共通性の高い配列部位を有する植物由来の配列から作製することが好ましい。
また、前記蛋白質をコードする塩基配列が既知の場合には、その知られている塩基配列から開始コドンを含むプライマー及び終止コドンを含むプライマーを設計し、合成したｃＤＮＡを鋳型にしてＲＴ－ＰＣＲを行うことで全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定することができる。
【0084】
前記ゴム粒子上に存在しないＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子としては、具体的には、また下記［５］又は［６］が挙げられる。
［５］配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［６］配列番号６で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［５］配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［６］配列番号６で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【0085】
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザン又はサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、又はＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡであってもよい。
【0086】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｍａｎｕａｌ， Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
【0087】
前記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェントな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度及び温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば６×ＳＳＣＥ（２０×ＳＳＣＥは、３ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、０．２ｍｏｌ／ｌのリン酸二水素ナトリウム、０．０２ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベートした後、５０℃の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、更に低いストリンジェントな条件としては、前記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば５×ＳＳＣ）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
【0088】
前記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、又は変更することにより設定することもできる。前記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
【0089】
前記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、前記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号６で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。
【0090】
前記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、所定の酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることを確認する方法としては、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、目的蛋白質の機能の有無をそれぞれの活性測定法により、活性測定等を行う方法が挙げられる。
【0091】
また、前記蛋白質のアミノ酸配列及び塩基配列を同定する方法は、従来公知の方法を用いることができ、例えば、生育する植物から、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、必要に応じてｍＲＮＡを精製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する。次に目的蛋白質に相当する既知の蛋白質のアミノ酸配列をもとに、縮重プライマーを設計し、ＲＴ－ＰＣＲを行い、部分的にＤＮＡ断片の増幅を行い、部分的に配列を同定する。次いで、ＲＡＣＥ法などを行い、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定する。ＲＡＣＥ法（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ法）とは、ｃＤＮＡの塩基配列が部分的に把握されているときに、その既知領域の塩基配列情報を基にＰＣＲを行って、ｃＤＮＡ末端までの未知領域をクローニングする方法で、ｃＤＮＡライブラリーの作製を経ずに、ＰＣＲ法によって全長のｃＤＮＡをクローニングすることができる方法である。
なお、縮重プライマーは、前記目的蛋白質と共通性の高い配列部位を有する植物由来の配列から作製することが好ましい。
また、前記蛋白質をコードする塩基配列が既知の場合には、その知られている塩基配列から開始コドンを含むプライマー及び終止コドンを含むプライマーを設計し、合成したｃＤＮＡを鋳型にしてＲＴ－ＰＣＲを行うことで全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定することができる。
なお、縮重プライマーは、前記目的蛋白質と共通性の高い配列部位を有する植物由来の配列から作製することが好ましい。
また、前記蛋白質をコードする塩基配列が既知の場合には、その知られている塩基配列から開始コドンを含むプライマー及び終止コドンを含むプライマーを設計し、合成したｃＤＮＡを鋳型にしてＲＴ－ＰＣＲを行うことで全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定することができる。
【0092】
＜＜変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質の具体例＞＞
前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［Ａ－１］が挙げられる。
［Ａ－１］配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［Ａ－１］が挙げられる。
［Ａ－１］配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
【0093】
また、蛋白質は、元のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含む場合であっても本来持つ機能を有する場合があることが知られている。従って、前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［Ａ－２］も挙げられる。
［Ａ－２］配列番号７で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［Ａ－２］配列番号７で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
【0094】
なお、前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号７で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１～６１個のアミノ酸、更に好ましくは１～４６個のアミノ酸、更により好ましくは１～３１個のアミノ酸、特に好ましくは１～１５個のアミノ酸、最も好ましくは１～６個のアミノ酸、より最も好ましくは１～３個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
【0095】
アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のカッコ内のグループ内での置換が挙げられる。例えば、（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）である。
【0096】
また、蛋白質は、元のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列を有する蛋白質も同様の機能を有する場合があることが知られている。従って、前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［Ａ－３］も挙げられる。
［Ａ－３］配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［Ａ－３］配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
【0097】
なお、前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号７で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
【0098】
アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０， ５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １８３， ６３ （１９９０）］を用いて決定することができる。
【0099】
前記酵素活性を有する蛋白質であることを確認する方法としては、例えば、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、目的蛋白質の機能の有無をそれぞれの活性測定法により、活性測定等を行う方法が挙げられる。
【0100】
前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、また下記［Ｂ－１］が挙げられる。
［Ｂ－１］配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［Ｂ－１］配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
【0101】
また、蛋白質は、元のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含む場合であっても本来持つ機能を有する場合があることが知られている。従って、前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［Ｂ－２］も挙げられる。
［Ｂ－２］配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［Ｂ－２］配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含む配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
【0102】
なお、前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号８で表されるアミノ酸配列において、好ましくは１若しくは複数個のアミノ酸、より好ましくは１～７４個のアミノ酸、更に好ましくは１～５５個のアミノ酸、更により好ましくは１～３７個のアミノ酸、特に好ましくは１～１８個のアミノ酸、最も好ましくは１～７個のアミノ酸、より最も好ましくは１～４個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を含むアミノ酸配列であることが好ましい。
【0103】
アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のカッコ内のグループ内での置換が挙げられる。例えば、（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）である。
【0104】
また、蛋白質は、元のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列を有する蛋白質も同様の機能を有する場合があることが知られている。従って、前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質の具体例としては、下記［Ｂ－３］も挙げられる。
［Ｂ－３］配列番号８で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
［Ｂ－３］配列番号８で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質
【0105】
なお、前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質としての機能を維持するためには、配列番号８で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
【0106】
アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０， ５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １８３， ６３ （１９９０）］を用いて決定することができる。
【0107】
前記酵素活性を有する蛋白質であることを確認する方法としては、例えば、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、目的蛋白質の機能の有無をそれぞれの活性測定法により、活性測定等を行う方法が挙げられる。
【0108】
前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子としては、具体的には、下記［Ｃ－１］又は［Ｃ－２］が挙げられる。
［Ｃ－１］配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｃ－２］配列番号９で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｃ－１］配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｃ－２］配列番号９で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【0109】
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザン又はサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、又はＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡであってもよい。
【0110】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｍａｎｕａｌ， Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
【0111】
前記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェントな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度及び温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば６×ＳＳＣＥ（２０×ＳＳＣＥは、３ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、０．２ｍｏｌ／ｌのリン酸二水素ナトリウム、０．０２ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベートした後、５０℃の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、更に低いストリンジェントな条件としては、前記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば５×ＳＳＣ）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
【0112】
前記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、又は変更することにより設定することもできる。前記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
【0113】
前記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、前記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号９で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。
【0114】
前記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、所定の酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることを確認する方法としては、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、目的蛋白質の機能の有無をそれぞれの活性測定法により、活性測定等を行う方法が挙げられる。
【0115】
また、前記蛋白質のアミノ酸配列及び塩基配列を同定する方法は、従来公知の方法を用いることができ、例えば、生育する植物から、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、必要に応じてｍＲＮＡを精製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する。次に目的蛋白質に相当する既知の蛋白質のアミノ酸配列をもとに、縮重プライマーを設計し、ＲＴ－ＰＣＲを行い、部分的にＤＮＡ断片の増幅を行い、部分的に配列を同定する。次いで、ＲＡＣＥ法などを行い、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定する。ＲＡＣＥ法（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ法）とは、ｃＤＮＡの塩基配列が部分的に把握されているときに、その既知領域の塩基配列情報を基にＰＣＲを行って、ｃＤＮＡ末端までの未知領域をクローニングする方法で、ｃＤＮＡライブラリーの作製を経ずに、ＰＣＲ法によって全長のｃＤＮＡをクローニングすることができる方法である。
なお、縮重プライマーは、前記目的蛋白質と共通性の高い配列部位を有する植物由来の配列から作製することが好ましい。
また、前記蛋白質をコードする塩基配列が既知の場合には、その知られている塩基配列から開始コドンを含むプライマー及び終止コドンを含むプライマーを設計し、合成したｃＤＮＡを鋳型にしてＲＴ－ＰＣＲを行うことで全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定することができる。
なお、縮重プライマーは、前記目的蛋白質と共通性の高い配列部位を有する植物由来の配列から作製することが好ましい。
また、前記蛋白質をコードする塩基配列が既知の場合には、その知られている塩基配列から開始コドンを含むプライマー及び終止コドンを含むプライマーを設計し、合成したｃＤＮＡを鋳型にしてＲＴ－ＰＣＲを行うことで全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定することができる。
【0116】
前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子としては、具体的には、下記［Ｄ－１］又は［Ｄ－２］が挙げられる。
［Ｄ－１］配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｄ－２］配列番号１０で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［Ｄ－１］配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［Ｄ－２］配列番号１０で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイソプレノイド化合物の鎖長をｃｉｓ型に延長する反応を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【0117】
ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザン又はサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、又はＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡであってもよい。
【0118】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｍａｎｕａｌ， Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
【0119】
前記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件をあげることができるが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェントな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度及び温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば６×ＳＳＣＥ（２０×ＳＳＣＥは、３ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、０．２ｍｏｌ／ｌのリン酸二水素ナトリウム、０．０２ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベートした後、５０℃の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、更に低いストリンジェントな条件としては、前記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば５×ＳＳＣ）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
【0120】
前記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、又は変更することにより設定することもできる。前記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
【0121】
前記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、前記パラメータに基づいて計算したときに、配列番号１０で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡをあげることができる。
【0122】
前記したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、所定の酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることを確認する方法としては、従来公知の方法を用いることができ、例えば、大腸菌などを用いて、目的の蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体により、目的蛋白質を発現させ、目的蛋白質の機能の有無をそれぞれの活性測定法により、活性測定等を行う方法が挙げられる。
【0123】
また、前記蛋白質のアミノ酸配列及び塩基配列を同定する方法は、従来公知の方法を用いることができ、例えば、生育する植物から、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、必要に応じてｍＲＮＡを精製し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する。次に目的蛋白質に相当する既知の蛋白質のアミノ酸配列をもとに、縮重プライマーを設計し、ＲＴ－ＰＣＲを行い、部分的にＤＮＡ断片の増幅を行い、部分的に配列を同定する。次いで、ＲＡＣＥ法などを行い、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定する。ＲＡＣＥ法（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ法）とは、ｃＤＮＡの塩基配列が部分的に把握されているときに、その既知領域の塩基配列情報を基にＰＣＲを行って、ｃＤＮＡ末端までの未知領域をクローニングする方法で、ｃＤＮＡライブラリーの作製を経ずに、ＰＣＲ法によって全長のｃＤＮＡをクローニングすることができる方法である。
なお、縮重プライマーは、前記目的蛋白質と共通性の高い配列部位を有する植物由来の配列から作製することが好ましい。
また、前記蛋白質をコードする塩基配列が既知の場合には、その知られている塩基配列から開始コドンを含むプライマー及び終止コドンを含むプライマーを設計し、合成したｃＤＮＡを鋳型にしてＲＴ－ＰＣＲを行うことで全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定することができる。
なお、縮重プライマーは、前記目的蛋白質と共通性の高い配列部位を有する植物由来の配列から作製することが好ましい。
また、前記蛋白質をコードする塩基配列が既知の場合には、その知られている塩基配列から開始コドンを含むプライマー及び終止コドンを含むプライマーを設計し、合成したｃＤＮＡを鋳型にしてＲＴ－ＰＣＲを行うことで全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定することができる。
【0124】
＜ポリイソプレノイドの製造方法＞
本開示のポリイソプレノイドの製造方法は、本開示の変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質を用いることを特徴とする。
本開示のポリイソプレノイドの製造方法は、本開示の変異ＣＰＴファミリー蛋白質を用いる限り特に限定されないが、生体外で、本開示の変異ＣＰＴファミリー蛋白質を膜粒子（好ましくはゴム粒子）に結合させる結合工程を含むことが好ましい。生体外で、膜粒子（好ましくはゴム粒子）に変異ＣＰＴファミリー蛋白質を結合させることで、膜粒子（好ましくはゴム粒子）中にポリイソプレノイドを合成することができるため、より高分子量のポリイソプレノイドの製造が可能となる。これは、膜粒子（好ましくはゴム粒子）の内部に生成されたポリイソプレノイドが蓄積されることとなるため、膜粒子（好ましくはゴム粒子）に結合しない場合に比べて、より鎖長の長い生成物を生成可能となるためである。
本開示のポリイソプレノイドの製造方法は、本開示の変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質を用いることを特徴とする。
本開示のポリイソプレノイドの製造方法は、本開示の変異ＣＰＴファミリー蛋白質を用いる限り特に限定されないが、生体外で、本開示の変異ＣＰＴファミリー蛋白質を膜粒子（好ましくはゴム粒子）に結合させる結合工程を含むことが好ましい。生体外で、膜粒子（好ましくはゴム粒子）に変異ＣＰＴファミリー蛋白質を結合させることで、膜粒子（好ましくはゴム粒子）中にポリイソプレノイドを合成することができるため、より高分子量のポリイソプレノイドの製造が可能となる。これは、膜粒子（好ましくはゴム粒子）の内部に生成されたポリイソプレノイドが蓄積されることとなるため、膜粒子（好ましくはゴム粒子）に結合しない場合に比べて、より鎖長の長い生成物を生成可能となるためである。
【0125】
ここで、本明細書において、ポリイソプレノイドとは、イソプレン単位（Ｃ５Ｈ８）で構成された重合体（ｃｉｓ―１，４―ポリイソプレンまたはｔｒａｎｓ―１，４―ポリイソプレン）を基本炭素骨格とする天然物）の総称である。ポリイソプレノイドとしては、例えばソラネソール（Ｃ４５） 、ウンデカプレニルリン酸（Ｃ５５）、グッタペルカ、ゴムなどの重合体が挙げられる。ポリイソプレノイドは、イソプレン単位がシス型に結合したシス型ポリイソプレノイドであることが好ましい。また、本明細書において、イソプレノイドは、イソプレン単位（Ｃ５Ｈ８）を有する化合物を意味し、ポリイソプレノイドをも含む概念である。
【0126】
膜粒子としては、膜構造を有する粒子であれば特に限定されず、例えば、ゴム粒子、油滴（ｌｉｐｉｄ ｄｒｏｐｌｅｔ）等の生体膜；ナノディスク、リポソーム等の人工膜；等が挙げられる。これらは単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。なかでも、ゴム粒子が好ましい。以下においては、膜粒子がゴム粒子である場合について説明するが、他の膜粒子の場合も同様である。
【0127】
なお、本開示の製造方法は、前記結合工程以外の他の工程を含んでいてもよく、また、各工程は１回行われてもよいし、複数回繰り返し行われてもよい。
また、ゴム粒子に結合する変異ＣＰＴファミリー蛋白質の量は特に限定されない。
また、ゴム粒子に結合する変異ＣＰＴファミリー蛋白質の量は特に限定されない。
【0128】
本明細書において、ゴム粒子に変異ＣＰＴファミリー蛋白質が結合するとは、変異ＣＰＴファミリー蛋白質の全部又は一部がゴム粒子中に取り込まれる又はゴム粒子の膜構造に挿入される、といったことを意味するが、これに限らず、ゴム粒子表面又は内部に局在する等の場合をも意味する。また更には、ゴム粒子に結合している蛋白質と変異ＣＰＴファミリー蛋白質が複合体を形成し、複合体としてゴム粒子上に存在する場合もゴム粒子に結合しているとの概念範囲に含まれる。他の膜粒子の場合も同様である。
【0129】
前記ゴム粒子の由来は特に限定されず、例えば、パラゴムノキ、ロシアンタンポポ、グアユール、ノゲシなどのゴム産生植物のラテックス由来であればよい。
【0130】
また、前記ゴム粒子の粒子径も特に限定されず、所定の粒子径のものを分取して用いてもよいし、様々な粒子径のものが含まれた状態のものを使用してもよく、所定の粒子径のものを分取して用いる場合であっても、用いられるゴム粒子としては、粒子径の小さいＳｍａｌｌ Ｒｕｂｂｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＳＲＰ）を用いてもよいし、粒子径の大きいＬａｒｇｅ Ｒｕｂｂｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＬＲＰ）を用いてもよい。
【0131】
前記所定の粒子径のゴム粒子を分取する方法としては、通常行われる方法を採用することができるが、例えば、遠心分離処理、より好ましくは多段階の遠心分離処理、を行う方法などが挙げられる。具体的には、５００～１５００×ｇでの遠心分離処理、１７００～２５００×ｇでの遠心分離処理、７０００～９０００×ｇでの遠心分離処理、１５０００～２５０００×ｇでの遠心分離処理、４００００～６００００×ｇでの遠心分離処理を順に行う方法が挙げられる。なお、各遠心分離処理の処理時間としては、２０分以上が好ましく、３０分以上がより好ましく、４０分以上が更に好ましい。一方、１２０分以下が好ましく、９０分以下がより好ましい。また、各遠心分離処理の処理温度としては、０～１０℃が好ましく、２～８℃がより好ましく、４℃が特に好ましい。
【0132】
前記結合工程においては、生体外で、前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質がゴム粒子に結合される。
【0133】
前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子は、前述の通りである。
【0134】
また、前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質は、ゴム粒子上に存在しないＣＰＴファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列を、ゴム粒子上に存在するＣＰＴファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列と同一に又は類似するように変異した蛋白質であるが、当該ゴム粒子上に存在するＣＰＴファミリー蛋白質の由来を、前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質と結合させるゴム粒子の由来と同一とすると、前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列の由来と、前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質と結合させるゴム粒子の由来とが同一となり、前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質とゴム粒子との結合能を更に高めることができる。
【0135】
例えば、パラゴムノキ由来のゴム粒子を用いる場合には、前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質のＣ末端領域を、パラゴムノキ由来のゴム粒子上に存在するＣＰＴファミリー蛋白質（ＨＲＴ１）のＣ末端領域に置換した変異蛋白質を用いるのが好ましく、又は、ロシアンタンポポ由来のゴム粒子を用いる場合には、前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質のＣ末端領域を、ロシアンタンポポ由来のゴム粒子上に存在するＣＰＴファミリー蛋白質のＣ末端領域に置換した変異蛋白質を用いることが好ましい。
【0136】
なお、前記結合工程においては、生体外で、前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質がゴム粒子に結合される限り、更にその他の蛋白質が結合されてもよい。
【0137】
前記その他の蛋白質の由来は特に制限されないが、植物由来であることが好ましく、ゴム産生植物由来であることがより好ましく、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、及びＰａｒｔｈｅｎｉｕｍ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物由来であることが更に好ましい。中でも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種の植物由来であることがより更に好ましく、特に好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。
【0138】
前記その他の蛋白質としては、何ら制限されずいかなる蛋白質であってもよいが、ゴム粒子のゴム合成能力の観点からは、ゴム産生植物体内でもともとゴム粒子上に存在する蛋白質であることが好ましい。なお、ゴム粒子上に存在する蛋白質は、大きくゴム粒子の膜表面に結合する蛋白質であってもよいし、ゴム粒子の膜に挿入されるように結合する蛋白質であってもよいし、前記膜に結合している蛋白質と複合体を形成して膜表面上に存在することになる蛋白質であってもよい。
【0139】
前記ゴム産生植物体内でもともとゴム粒子上に存在する蛋白質としては、例えば、ＨＲＴ１―ＲＥＦ―ＢＲＩＤＧＩＮＧ ＰＲＯＴＥＩＮ（ＨＲＢＰ）、Ｒｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）、Ｓｍａｌｌ Ｒｕｂｂｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）、β－１，３－グルカナーゼ、Ｈｅｖｅｉｎなどが挙げられる。なかでも、ＨＲＴ１―ＲＥＦ―ＢＲＩＤＧＩＮＧ ＰＲＯＴＥＩＮ（ＨＲＢＰ）、Ｒｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）が好ましい。
【0140】
前記結合工程は、生体外で、ゴム粒子に前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質を結合させることができればその手段は特に制限されず、例えば、前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行い、ゴム粒子に前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質を結合させる方法などが挙げられる。
【0141】
前記結合工程としては、中でも、前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行い、ゴム粒子に前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質を結合させる工程であることが好ましい。
すなわち、変異ＣＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて（より具体的には、変異ＣＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを混合して）蛋白質合成を行うことで、変異ＣＰＴファミリー蛋白質の結合したゴム粒子を得ることが好ましい。
すなわち、変異ＣＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて（より具体的には、変異ＣＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを混合して）蛋白質合成を行うことで、変異ＣＰＴファミリー蛋白質の結合したゴム粒子を得ることが好ましい。
【0142】
前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて行われる蛋白質合成は、いわゆる、無細胞蛋白合成法を用いた変異ＣＰＴファミリー蛋白質の合成であり、生物学的機能を担持した（ｎａｔｉｖｅ状態の）変異ＣＰＴファミリー蛋白質を合成でき、当該無細胞蛋白合成法をゴム粒子の共存下で行うことにより、合成される変異ＣＰＴファミリー蛋白質をｎａｔｉｖｅ状態でゴム粒子に結合することが可能となる。
【0143】
ここで、前記無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子との共存下、蛋白質合成を行うことで、ゴム粒子に変異ＣＰＴファミリー蛋白質が結合するとは、当該蛋白質合成により合成された変異ＣＰＴファミリー蛋白質の各蛋白質の全部又は一部がゴム粒子中に取り込まれる又はゴム粒子の膜構造に挿入される、といったことを意味するが、これに限らず、ゴム粒子表面又は内部に局在する等の場合をも意味する。また更には、上述のようにゴム粒子に結合している蛋白質と複合体を形成し、複合体としてゴム粒子上に存在する場合もゴム粒子に結合しているとの概念範囲に含まれる。
【0144】
前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡはそれぞれ、翻訳されて変異ＣＰＴファミリー蛋白質を合成しうる翻訳鋳型である。
【0145】
前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡはそれぞれ、翻訳されて変異ＣＰＴファミリー蛋白質を合成しうる翻訳鋳型であればその調製方法は特に制限されない。
【0146】
前記無細胞蛋白合成溶液は、前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む限り、その他の蛋白質をコードするｍＲＮＡを含んでいてもよい。
前記その他の蛋白質をコードするｍＲＮＡとしては、翻訳されてその他の蛋白質を発現することができるものを用いることができる。なお、その他の蛋白質としては、上述したものと同様のものを挙げることができる。
前記その他の蛋白質をコードするｍＲＮＡとしては、翻訳されてその他の蛋白質を発現することができるものを用いることができる。なお、その他の蛋白質としては、上述したものと同様のものを挙げることができる。
【0147】
前記結合工程においては、ゴム粒子の共存下で変異ＣＰＴファミリー蛋白質の無細胞蛋白合成が行われることが好ましいが、当該無細胞蛋白合成は、前記無細胞蛋白合成溶液を用いて、従来と同様の方法で行うことができる。用いられる無細胞蛋白合成系としては、通常用いられる無細胞蛋白質合成手段を採用することができる。例えば、Ｒａｐｉｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ＲＴＳ５００（Ｒｏｓｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）やＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：５５９－５６４（２０００）、特開２０００－２３６８９６号公報、特開２００２－１２５６９３号公報、特開２００２－２０４６８９号公報に従って調製された小麦胚芽抽出液及びその無細胞蛋白質合成系（特開２００２－２０４６８９号公報、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１４６５２－１４６５７（２００２））を使用することができる。中でも、胚芽抽出物を用いる系が好ましい。
【0148】
前記胚芽抽出物の由来は特に限定されないが、翻訳効率の観点からは、植物の蛋白質を無細胞蛋白合成法で合成する場合には植物由来の胚芽抽出物を用いることが好ましい。特に好ましくは小麦由来の胚芽抽出物を用いることである。
【0149】
前記胚芽抽出物の調製方法としては特に制限されず、通常の胚芽抽出物調製方法を採用することができるが、例えば、特開２００５－２１８３５７号公報に記載された方法を採用すればよい。
【0150】
前記無細胞蛋白合成溶液は、更にサイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体又はその塩（以降、単に「活性増強物質」とも称する。）を含むことが好ましい。該活性増強物質を含有することにより、蛋白質合成活性を更に増強させることができる。
【0151】
前記サイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体又はその塩としては、無細胞蛋白合成活性を増強しうるものであれば特に制限されず、例えば、アデノシン－３’，５’サイクリック一リン酸及びその塩、アデノシン－３’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｓｐアイソマー）及びその塩、アデノシン－３’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｒｐアイソマー）及びその塩、グアノシン－３’，５’サイクリック一リン酸及びその塩、グアノシン－３’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｓｐアイソマー）及びその塩、グアノシン－３’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｒｐアイソマー）及びその塩、８－ブロモアデノシン－３’，５’－サイクリック一リン酸（ブロモｃＡＭＰ）及びその塩、８－（４－クロロフェニルチオ）アデノシン－３’，５’－サイクリック一リン酸（クロロフェニルチオｃＡＭＰ）及びその塩、５，６－ジクロロ－１－β－Ｄ－リボフラノシルべンジミダゾルアデノシン－３’，５’－サイクリック一リン酸（ジクロロリボフラノシルべンジミダゾルｃＡＭＰ）及びその塩、アデノシン－２’，５’サイクリック一リン酸及びその塩、アデノシン－２’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｓｐアイソマー）及びその塩、アデノシン－２’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｒｐアイソマー）及びその塩、グアノシン－２’，５’サイクリック一リン酸及びその塩、グアノシン－２’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｓｐアイソマー）及びその塩、グアノシン－２’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｒｐアイソマー）及びその塩等が挙げられる。
【0152】
前記サイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体との塩を形成する塩基としては、生化学的に許容しうるもので、当該誘導体と塩を形成するものであれば特に制限されないが、中でも好ましいものとしては、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属原子、トリスヒドロキシアミノメタン等の有機塩基が挙げられる。
【0153】
前記活性増強物質としては、中でも、アデノシン－３’，５’サイクリック一リン酸、アデノシン－３’，５’サイクリック一リン酸ナトリウムが特に好ましい。また、これら活性増強物質は、単独で用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
【0154】
前記活性増強物質は、あらかじめ前記無細胞蛋白合成溶液に加えておいてもよいが、当該溶液中で不安定である場合には、無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成反応を行う際に加えるのが好ましい。
【0155】
前記活性増強物質の添加量としては、前記無細胞蛋白合成溶液による蛋白質合成反応が活性化（増加）しうる濃度であれば特に制限されない。具体的には、反応系中の最終濃度として、通常０．１ミリモル／リットル以上であればよい。濃度の下限は、好ましくは０．２ミリモル／リットル、より好ましくは０．４ミリモル／リットル、特に好ましくは０．８ミリモル／リットルである。他方、濃度の上限は、好ましくは２４ミリモル／リットル、より好ましくは６．４ミリモル／リットル、特に好ましくは３．２ミリモル／リットルである。
【0156】
前記活性増強物質を前記無細胞蛋白合成溶液に加える際の無細胞蛋白合成溶液の温度としては特に限定されないが、０～３０℃が好ましく、１０～２６℃がより好ましい。
【0157】
前記無細胞蛋白合成溶液は、変異ＣＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡ（翻訳鋳型）に加え、蛋白質合成に必須の成分であるＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、Ｌ型アミノ酸、カリウムイオン及びマグネシウムイオン等を含有し、更には必要に応じて活性増強物質を含むものであり、このような無細胞蛋白合成溶液を用いることにより無細胞蛋白合成反応系とすることができる。
なお、前記特開２００５－２１８３５７号公報に記載された方法で調製された胚芽抽出物には蛋白質合成反応に必要とされる量のｔＲＮＡが含まれているため、当該方法により調製された胚芽抽出物を無細胞蛋白合成溶液に用いる場合には、別途調製したｔＲＮＡを追加することは必須要件ではない。すなわち、無細胞蛋白合成溶液には、必要に応じてｔＲＮＡを追加すればよい。
なお、前記特開２００５－２１８３５７号公報に記載された方法で調製された胚芽抽出物には蛋白質合成反応に必要とされる量のｔＲＮＡが含まれているため、当該方法により調製された胚芽抽出物を無細胞蛋白合成溶液に用いる場合には、別途調製したｔＲＮＡを追加することは必須要件ではない。すなわち、無細胞蛋白合成溶液には、必要に応じてｔＲＮＡを追加すればよい。
【0158】
前記結合工程は、変異ＣＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行うことが好ましいものであるが、具体的には蛋白質の合成前又は合成後の適当な時期に、好ましくは蛋白質合成前に、前記無細胞蛋白合成溶液にゴム粒子を加えることにより行うことができる。
また、無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度は、５～５０ｇ／Ｌであることが好ましい。すなわち、無細胞蛋白合成溶液１Ｌに対してゴム粒子を５～５０ｇ共存させることが好ましい。無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度が５ｇ／Ｌ未満であると、合成された変異ＣＰＴファミリー蛋白質が結合したゴム粒子を回収するために、超遠心分離等による分離処理を行った際に、ゴム層が形成されず、合成された変異ＣＰＴファミリー蛋白質が結合したゴム粒子を回収することが困難になる場合がある。一方、無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度が５０ｇ／Ｌを超えると、ゴム粒子同士が凝集し、合成された変異ＣＰＴファミリー蛋白質がうまくゴム粒子に結合できなくなるおそれがある。前記ゴム粒子の濃度としてより好ましくは１０～４０ｇ／Ｌ、更に好ましくは１５～３５ｇ／Ｌ、特に好ましくは１５～３０ｇ／Ｌである。
また、無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度は、５～５０ｇ／Ｌであることが好ましい。すなわち、無細胞蛋白合成溶液１Ｌに対してゴム粒子を５～５０ｇ共存させることが好ましい。無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度が５ｇ／Ｌ未満であると、合成された変異ＣＰＴファミリー蛋白質が結合したゴム粒子を回収するために、超遠心分離等による分離処理を行った際に、ゴム層が形成されず、合成された変異ＣＰＴファミリー蛋白質が結合したゴム粒子を回収することが困難になる場合がある。一方、無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度が５０ｇ／Ｌを超えると、ゴム粒子同士が凝集し、合成された変異ＣＰＴファミリー蛋白質がうまくゴム粒子に結合できなくなるおそれがある。前記ゴム粒子の濃度としてより好ましくは１０～４０ｇ／Ｌ、更に好ましくは１５～３５ｇ／Ｌ、特に好ましくは１５～３０ｇ／Ｌである。
【0159】
また、前記無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子との共存下での蛋白質合成は、その反応の進展に伴い、適宜ゴム粒子を追加していってもよい。ゴム粒子を前記無細胞蛋白合成溶液に加えてから例えば３～４８時間（好ましくは３～３０時間、より好ましくは３～２４時間）など無細胞蛋白合成系が活性な間、前記無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とが共存するようにしておくことが好ましい。
【0160】
前記ゴム粒子は、前記結合工程に用いる前に（より好ましくは前記無細胞蛋白合成溶液と共存させる前に）前処理等の特段の処理を行う必要はない。ただし、ゴム粒子上に存在する蛋白質のうち、結合させたい変異ＣＰＴファミリー蛋白質の割合を高めるために、予め界面活性剤によりゴム粒子からある程度蛋白質を除去してもよい。その際、除去後のゴム粒子のゴム合成活性が除去前の５０％以上残っていることが好ましい。
【0161】
前記界面活性剤としては特に限定されず、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤などが挙げられる。これらの中でも、膜上の蛋白質の変性作用が小さい点で、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤が好適に用いられ、両性界面活性剤が特に好適に用いられる。すなわち、前記界面活性剤が、両性界面活性剤であることもまた、第１の本開示の好適な実施形態の１つである。
これら界面活性剤は、単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
これら界面活性剤は、単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
【0162】
前記非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシアルキレンエーテル系、ポリオキシアルキレンエステル系、多価アルコール脂肪酸エステル系、糖脂肪酸エステル系、アルキルポリグリコシド系、ポリオキシアルキレンポリグルコシド系の非イオン性界面活性剤や、ポリオキシアルキレンアルキルアミン、アルキルアルカノールアミド等が挙げられる。
これらの中でも、ポリオキシアルキレンエーテル系の非イオン性界面活性剤、多価アルコール脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤が好ましい。
これらの中でも、ポリオキシアルキレンエーテル系の非イオン性界面活性剤、多価アルコール脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤が好ましい。
【0163】
前記ポリオキシアルキレンエーテル系の非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシアルキレンポリオールアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンモノ、ジ、又はトリスチリルフェニルエーテル等が挙げられる。これらの中でも、ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテルが好適に使用される。なお、前記ポリオールとしては、炭素数２～１２の多価アルコールが好ましく、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、グルコース、スクロース、ペンタエリトリトール、ソルビタン等が挙げられる。
【0164】
前記ポリオキシアルキレンエステル系の非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシアルキレン脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレンアルキルロジン酸エステル等が挙げられる。
前記多価アルコール脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤としては、例えば、炭素数２～１２の多価アルコールの脂肪酸エステル又はポリオキシアルキレン多価アルコールの脂肪酸エステル等が挙げられる。より具体的には、例えば、ソルビトール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ペンタエリトリトール脂肪酸エステル等が挙げられる。また、これらのポリアルキレンオキサイド付加物（例えば、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレングリセリン脂肪酸エステル等）も使用可能である。これらの中でも、ソルビタン脂肪酸エステルが好適に使用される。
前記糖脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤としては、例えば、ショ糖、グルコース、マルトース、フルクトース、多糖類の脂肪酸エステル等が挙げられ、これらのポリアルキレンオキサイド付加物も使用可能である。
前記アルキルポリグリコシド系の非イオン性界面活性剤としては、グリコシドとしてグルコース、マルトース、フルクトース、ショ糖などが挙げられ、例えば、アルキルグルコシド、アルキルポリグルコシド、ポリオキシアルキレンアルキルグルコシド、ポリオキシアルキレンアルキルポリグルコシドなどが挙げられ、これらの脂肪酸エステル類も挙げられる。また、これらすべてのポリアルキレンオキサイド付加物も使用可能である。
前記多価アルコール脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤としては、例えば、炭素数２～１２の多価アルコールの脂肪酸エステル又はポリオキシアルキレン多価アルコールの脂肪酸エステル等が挙げられる。より具体的には、例えば、ソルビトール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ペンタエリトリトール脂肪酸エステル等が挙げられる。また、これらのポリアルキレンオキサイド付加物（例えば、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレングリセリン脂肪酸エステル等）も使用可能である。これらの中でも、ソルビタン脂肪酸エステルが好適に使用される。
前記糖脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤としては、例えば、ショ糖、グルコース、マルトース、フルクトース、多糖類の脂肪酸エステル等が挙げられ、これらのポリアルキレンオキサイド付加物も使用可能である。
前記アルキルポリグリコシド系の非イオン性界面活性剤としては、グリコシドとしてグルコース、マルトース、フルクトース、ショ糖などが挙げられ、例えば、アルキルグルコシド、アルキルポリグルコシド、ポリオキシアルキレンアルキルグルコシド、ポリオキシアルキレンアルキルポリグルコシドなどが挙げられ、これらの脂肪酸エステル類も挙げられる。また、これらすべてのポリアルキレンオキサイド付加物も使用可能である。
【0165】
これら非イオン性界面活性剤におけるアルキル基としては、例えば、炭素数４～３０の直鎖又は分岐した飽和若しくは不飽和のアルキル基が挙げられる。また、ポリオキシアルキレン基としては、炭素数２～４のアルキレン基を有するものが挙げられ、例えば、酸化エチレンの付加モル数が１～５０モル程度のものが挙げられる。また、前記脂肪酸としては、例えば、炭素数４～３０の直鎖又は分岐した飽和若しくは不飽和の脂肪酸が挙げられる。
【0166】
前記非イオン性界面活性剤としては、中でも、ゴム粒子の膜を安定化させた状態で、かつ蛋白質の変性作用が小さい状態で、適度に膜結合蛋白質を除去できるという理由から、ポリオキシエチレンエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）、ソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ ２０）が特に好ましい。
【0167】
前記両性界面活性剤としては、例えば、四級アンモニウム塩基／スルホン酸基（－ＳＯ３Ｈ）タイプ、四級アンモニウム塩基／リン酸酸基タイプ（水に可溶）、四級アンモニウム塩基／リン酸酸基タイプ（水に不溶）、四級アンモニウム塩基／カルボキシル基タイプなどの両性イオン界面活性剤が挙げられる。なお、前記の酸基は塩であってもよい。
特に、前記の両性イオン界面活性剤が一分子中に＋と－の両電荷を有することが好ましく、前記の酸基の酸解離定数（ｐＫａ）が、５以下であることが好ましく、４以下であることがより好ましく、３以下であることが更に好ましい。
特に、前記の両性イオン界面活性剤が一分子中に＋と－の両電荷を有することが好ましく、前記の酸基の酸解離定数（ｐＫａ）が、５以下であることが好ましく、４以下であることがより好ましく、３以下であることが更に好ましい。
【0168】
前記両性界面活性剤としては、具体的には、３－[（３－コラミドプロピル）ジメチルアミノ]－２－ヒドロキシ－１－プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、３－[（３－コラミドプロピル）ジメチルアミノ]－プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、Ｎ，Ｎ－ビス（３－Ｄ－グルコナミドプロピル）－コラミド、ｎ－オクタデシル－Ｎ，Ｎ’－ジメチル－３－アミノ－１－プロパンスルホン酸、ｎ－デシル－Ｎ，Ｎ’－ジメチル－３－アミノ－１－プロパンスルホン酸、ｎ－ドデシル－Ｎ，Ｎ’－ジメチル－３－アミノ－１－プロパンスルホン酸、ｎ－テトラデシル－Ｎ，Ｎ’－ジメチル－３－アミノ－１－プロパンスルホン酸｛Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（商標）－３－１４｝、ｎ－ヘキサデシル－Ｎ，Ｎ’－ジメチル－３－アミノ－１－プロパンスルホン酸、ｎ－オクタデシル－Ｎ，Ｎ’－ジメチル－３－アミノ－１－プロパンスルホン酸等のアンモニウムスルホベタイン類、ｎ－オクチルホスホコリン、ｎ－ノニルホスホコリン、ｎ－デシルホスホコリン、ｎ－ドデシルホスホコリン、ｎ－テトラデシルホスホコリン、ｎ－ヘキサデシルホスホコリン等のホスホコリン類、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン類が挙げられる。これらの中でも、ゴム粒子の膜を安定化させた状態で適度に蛋白質を除去できるという理由から、３－[（３－コラミドプロピル）ジメチルアミノ]－プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）が特に好ましい。
【0169】
前記界面活性剤の処理濃度は、使用する界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の３倍以内であることが好ましい。臨界ミセル濃度の３倍を超える濃度の界面活性剤で処理するとゴム粒子の膜安定性が低下するおそれがある。より好ましくは２．５倍以内であり、更に好ましくは２．０倍以内である。また下限としては、０．０５倍以上であることが好ましく、０．１倍以上であることがより好ましく、０．３倍以上であることが更に好ましい。
【0170】
前記無細胞蛋白合成における蛋白質合成のための反応システム又は装置としては、バッチ（回分）法（Ｐｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ，１７９－２０９，Ｂ．Ｄ．＆Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４））や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞蛋白質合成システム（Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２－１１６４（１９８８））、透析法（木川等、第２１回日本分子生物学会、ＷＩＤ６）、重層法（ＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ Ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｃｏｒｅ ｋｉｔ取扱説明書：ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。その他、蛋白質合成反応系に、鋳型のＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法等も用いることができる。
【0171】
中でも、重層法は操作が簡便であるという利点はあるものの反応溶液中でゴム粒子が分散してしまい、合成される変異ＣＰＴファミリー蛋白質をゴム粒子に効率よく結合させることが困難であるのに対して、透析法では、合成される変異ＣＰＴファミリー蛋白質の原料となるアミノ酸は透析膜を透過できるがゴム粒子は透過しないため、ゴム粒子の分散を防ぐことができ、効率的にゴム粒子に合成される変異ＣＰＴファミリー蛋白質を結合させることができることから、透析法が好ましい。
【0172】
なお、前記透析法とは、前記無細胞蛋白合成における蛋白質合成の合成反応液を透析内液とし、透析外液と物質移動が可能な透析膜によって隔離される装置を用いて、蛋白質合成を行う方法である。具体的には、例えば、翻訳鋳型を除いた前記合成反応液を必要に応じて適当時間プレインキュベートした後、翻訳鋳型を添加して、適当な透析容器に入れ反応内液とする。透析容器としては、底部に透析膜が付加されている容器（第一化学社製の透析カップ１２，０００等）や、透析用チューブ（三光純薬社製の１２，０００等）が挙げられる。透析膜は、１０，０００ダルトン以上の分子量限界を有するものが用いられるが、１２，０００ダルトン程度の分子量限界を有するものが好ましい。
【0173】
前記透析外液としては、アミノ酸を含む緩衝液が用いられる。透析外液は反応速度が低下した時点で、新鮮なものと交換することにより透析効率を上昇させることができる。反応温度及び時間は用いる蛋白質合成系において適宜選択されるが、例えば、小麦由来の胚芽抽出物を用いた系においては、通常１０～４０℃、好ましくは１８～３０℃、より好ましくは２０～２６℃で、１０分～４８時間（好ましくは１０分～３０時間、より好ましくは１０分～２４時間）行うことができる。
【0174】
また、前記無細胞蛋白合成溶液に含まれる変異ＣＰＴファミリー蛋白質をコードするｍＲＮＡは、分解されやすいことから、前記蛋白質合成反応中に適宜当該ｍＲＮＡを追加することで、蛋白質の合成をより効率的に行うことができる。なお、前記ｍＲＮＡの添加時間、添加回数、添加量等は特に制限されず、適宜設定することができる。
【0175】
第１の本開示の製造方法においては、生体外で、変異ＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質をゴム粒子に結合させる結合工程を行った後、必要に応じてゴム粒子を回収する工程を行ってもよい。
【0176】
前記ゴム粒子回収工程は、ゴム粒子を回収することができればその手法は特に制限されず、ゴム粒子を回収する通常行われる方法により行うことができる。具体的には、例えば、遠心分離により行う方法などが挙げられる。当該遠心分離によりゴム粒子を回収する場合、その遠心力や、遠心分離処理時間、遠心分離処理温度はゴム粒子を回収できるよう適宜設定することができるが、例えば、遠心分離処理の遠心力としては、１５０００×ｇ以上が好ましく、２００００×ｇ以上がより好ましく、２５０００×ｇ以上が更に好ましい。一方、遠心力は大きくしすぎてもそれに見合うだけの分離効果が望めないことから、遠心力の上限としては、５００００×ｇ以下が好ましく、４５０００×ｇ以下がより好ましい。遠心分離処理時間としては、２０分以上が好ましく、３０分以上がより好ましく、４０分以上が更に好ましい。一方、遠心分離処理時間を長くしすぎてもそれに見合うだけの分離効果が望めないことから、遠心分離処理時間の上限としては、１２０分以下が好ましく、９０分以下がより好ましい。
また、遠心分離処理温度としては、ゴム粒子に結合した変異ＣＰＴファミリー蛋白質の蛋白活性を維持するという観点から、０～１０℃が好ましく、２～８℃がより好ましく、４℃が特に好ましい。
また、遠心分離処理温度としては、ゴム粒子に結合した変異ＣＰＴファミリー蛋白質の蛋白活性を維持するという観点から、０～１０℃が好ましく、２～８℃がより好ましく、４℃が特に好ましい。
【0177】
例えば、前記無細胞蛋白合成を行った場合には、前記遠心分離処理を行うと、ゴム粒子が上層に、無細胞蛋白合成溶液が下層に分離される。その後、下層の無細胞蛋白合成溶液を除去することで、変異ＣＰＴファミリー蛋白質を結合させたゴム粒子を回収することができる。回収したゴム粒子はｐＨが中性の適当な緩衝液に再懸濁することで保存することができる。
【0178】
なお、前記ゴム粒子回収工程を行った後に回収されたゴム粒子は更なる特別な処理を経ずに通常の天然ゴムと同様に用いることができる。
【0179】
更に、第１の本開示のポリイソプレノイドの製造方法により得られたポリイソプレノイドは、前記ゴム粒子を以下の固化工程に供することで回収することができる。
【0180】
前記固化工程において、固化する方法としては、特に限定されず、エタノール、メタノール、アセトン等のポリイソプレノイドを溶解しない溶媒にゴム粒子を添加する方法やゴム粒子に酸を添加する方法等が挙げられる。固化工程を行うことにより、ゴム粒子からゴム（ポリイソプレノイドの１種）を固形分として回収できる。得られたゴムは、必要に応じて乾燥してから使用すればよい。
【0181】
このように、第１の本開示によれば、生体外で、変異ＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現させた蛋白質をゴム粒子に結合させることで、ゴム粒子中にポリイソプレノイドを合成することができ、効率的に反応槽（試験管、プラントなど）内で高分子量のポリイソプレノイドを生産することが可能となる。
【0182】
（ゴム製品の製造方法）
第１の本開示のゴム製品の製造方法は、前記第１の本開示のポリイソプレノイドの製造方法によりポリイソプレノイドを製造する工程と、得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法である。
第１の本開示のゴム製品の製造方法は、前記第１の本開示のポリイソプレノイドの製造方法によりポリイソプレノイドを製造する工程と、得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法である。
【0183】
ゴム製品としては、ゴム（好ましくは天然ゴム）を使用して製造できるゴム製品であれば特に限定されず、例えば、空気入りタイヤ、ゴムローラ、ゴム防舷材、手袋、医療用ゴムチューブ等が挙げられる。
【0184】
ゴム製品が空気入りタイヤの場合、すなわち、第１の本開示のゴム製品の製造方法が第１の本開示の空気入りタイヤの製造方法の場合、前記生ゴム製品成形工程は、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程に、前記加硫工程は、前記生タイヤを加硫する加硫工程に相当する。すなわち、第１の本開示の空気入りタイヤの製造方法は、前記ポリイソプレノイドの製造方法によりポリイソプレノイドを製造する工程と、得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法である。
【0185】
＜混練工程＞
混練工程では、前記ポリイソプレノイドの製造方法により得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る。
混練工程では、前記ポリイソプレノイドの製造方法により得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る。
【0186】
添加剤としては特に限定されず、ゴム製品の製造に用いられる添加剤を使用できる。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、例えば、前記ポリイソプレノイド以外のゴム成分、カーボンブラック、シリカ、炭酸カルシウム、アルミナ、クレー、タルクなどの補強用充填剤、シランカップリング剤、酸化亜鉛、ステアリン酸、加工助剤、各種老化防止剤、オイルなどの軟化剤、ワックス、硫黄などの加硫剤、加硫促進剤等が挙げられる。
【0187】
混練工程における混練は、オープンロール、バンバリーミキサー、密閉式混練機などのゴム混練装置を用いて行えばよい。
【0188】
＜生ゴム製品成形工程（タイヤの場合は生タイヤ成形工程）＞
生ゴム製品成形工程では、混練工程により得られた混練物から生ゴム製品（タイヤの場合は生タイヤ）を成形する。
生ゴム製品の成形方法としては特に限定されず、生ゴム製品の成形に用いられる方法を適宜適用すればよい。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、混練工程により得られた混練物を、各タイヤ部材の形状に合わせて押し出し加工し、タイヤ成型機上にて通常の方法にて成形し、各タイヤ部材を貼り合わせ、生タイヤ（未加硫タイヤ）を成形すればよい。
生ゴム製品成形工程では、混練工程により得られた混練物から生ゴム製品（タイヤの場合は生タイヤ）を成形する。
生ゴム製品の成形方法としては特に限定されず、生ゴム製品の成形に用いられる方法を適宜適用すればよい。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、混練工程により得られた混練物を、各タイヤ部材の形状に合わせて押し出し加工し、タイヤ成型機上にて通常の方法にて成形し、各タイヤ部材を貼り合わせ、生タイヤ（未加硫タイヤ）を成形すればよい。
【0189】
＜加硫工程＞
加硫工程では、生ゴム製品成形工程により得られた生ゴム製品を加硫することにより、ゴム製品が得られる。
生ゴム製品を加硫する方法としては特に限定されず、生ゴム製品の加硫に用いられる方法を適宜適用すればよい。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、生ゴム製品成形工程により得られた生タイヤ（未加硫タイヤ）を加硫機中で加熱加圧して加硫することにより空気入りタイヤが得られる。
加硫工程では、生ゴム製品成形工程により得られた生ゴム製品を加硫することにより、ゴム製品が得られる。
生ゴム製品を加硫する方法としては特に限定されず、生ゴム製品の加硫に用いられる方法を適宜適用すればよい。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、生ゴム製品成形工程により得られた生タイヤ（未加硫タイヤ）を加硫機中で加熱加圧して加硫することにより空気入りタイヤが得られる。
【0190】
（第２の本開示）
（ベクター）
第２の本開示のベクターは、本開示の変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターである。このようなベクターを植物に導入して形質転換を行うことにより、当該ベクターに含まれる、変異ＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子が発現し、当該植物において、遺伝子組み換え前と比較して、高分子量のポリイソプレノイドの製造を可能にする。
（ベクター）
第２の本開示のベクターは、本開示の変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターである。このようなベクターを植物に導入して形質転換を行うことにより、当該ベクターに含まれる、変異ＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子が発現し、当該植物において、遺伝子組み換え前と比較して、高分子量のポリイソプレノイドの製造を可能にする。
【0191】
前記ベクターは、植物での蛋白質発現に用いられるプロモーター、及び、該プロモーターに機能的に連結された前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含むことが好ましい。これにより、より好適に植物内において、変異ＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子を発現できる。
ここで、本明細書において、遺伝子をプロモーターと機能的に連結させるとは、当該プロモーターの制御を受けるように、当該プロモーターの下流に当該遺伝子配列を連結することを意味する。
ここで、本明細書において、遺伝子をプロモーターと機能的に連結させるとは、当該プロモーターの制御を受けるように、当該プロモーターの下流に当該遺伝子配列を連結することを意味する。
【0192】
前記植物での蛋白質発現に用いられるプロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであれば特に限定されず、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子プロモーター、タバコモザイクウィルスの３５Ｓプロモーター、イネ由来アクチン遺伝子プロモーター、ユビキチンプロモーター等が挙げられる。
【0193】
前記ベクターは、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーター、及び、該プロモーターに機能的に連結された前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含むことが更に好ましい。このようなベクターを植物に導入して形質転換を行うことにより、当該ベクターに含まれる、前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子が乳管特異的に発現し、当該植物において、遺伝子組み換え前と比較して、高分子量のポリイソプレノイドの製造をより好適に可能にする。
【0194】
なお、本明細書において、プロモーターが乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するとは、所望の遺伝子を当該プロモーターと機能的に連結させて植物に導入した場合に、当該所望の遺伝子が乳管で特異的に発現されるように遺伝子発現を制御する活性を有することを意味する。ここで、乳管特異的に遺伝子が発現するとは、当該遺伝子が植物中、乳管以外の部位では全く又はほとんど発現せず、当該遺伝子が実質的に乳管でのみ専ら発現しているといえる状態を意味する。
【0195】
第２の本開示のベクターは、例えば、一般的に植物の形質転換用ベクターとして知られているベクターに、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターの塩基配列、及び、変異ＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を従来公知の方法により挿入することで作製することができる。第２の本開示のベクターを作製するために使用することができるベクターとしては、例えば、ｐＢＩ系のベクターや、ｐＧＡ４８２、ｐＧＡＨ、ｐＢＩＧなどのバイナリーベクター、ｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴ、ｐＭＯＮ２００などの中間系プラスミド、ＧＡＴＥＷＡＹカセットを含むｐＨ３５ＧＳなどが挙げられる。
【0196】
第２の本開示のベクターは、前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を含む限り、プロモーターの塩基配列に加えて、その他の塩基配列を含んでいてもよい。通常、ベクターにはこれらの塩基配列に加えて、ベクター由来の配列が含まれており、更に、制限酵素認識配列、スペーサ―配列、マーカー遺伝子の配列、レポーター遺伝子の配列などが含まれる。
【0197】
前記マーカー遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。また、前記レポーター遺伝子は、植物体中での発現部位を確認するために導入するものであり、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＵＳ（βグルクロニダーゼ）遺伝子、ＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）、ＲＦＰ（赤色蛍光蛋白質）等が挙げられる。
【0198】
前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子は、前述の第１の本開示で述べたとおりである。
【0199】
前記乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーターとしては、Ｒｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）をコードする遺伝子のプロモーター、Ｓｍａｌｌ Ｒｕｂｂｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）をコードする遺伝子のプロモーター、Ｈｅｖｅｉｎ２．１（ＨＥＶ２．１）をコードする遺伝子のプロモーター、及び、ＭＹＣ１ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ（ＭＹＣ１）をコードする遺伝子のプロモーターからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。
【0200】
なお、本明細書において、Ｒｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＥＦ）は、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のゴム産生植物のラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質のことであり、ゴム粒子が安定化するのに寄与する。
Ｓｍａｌｌ Ｒｕｂｂｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）は、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のゴム産生植物のラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質のことである。
Ｈｅｖｅｉｎ２．１（ＨＥＶ２．１）は、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のゴム産生植物の乳管細胞に多く発現している蛋白質のことであり、ゴム粒子の凝集に関与し、抗真菌活性を有するものである。
また、ＭＹＣ１ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ（ＭＹＣ１）は、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のゴム産生植物のラテックスで多く発現している、ジャスモン酸シグナルに関わる転写因子のことである。ここで、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ（転写因子）とは、遺伝子の転写量を増加若しくは減少（好ましくは増加）させる活性を有する蛋白質を意味する。すなわち、本明細書において、ＭＹＣ１は、ジャスモン酸シグナルに関わる蛋白質のうち少なくとも１種の蛋白質をコードする遺伝子の転写量を増加若しくは減少（好ましくは増加）させる活性（転写因子活性）を有する蛋白質のことである。
Ｓｍａｌｌ Ｒｕｂｂｅｒ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＰＰ）は、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のゴム産生植物のラテックスに存在するゴム粒子に結合するゴム粒子結合蛋白質のことである。
Ｈｅｖｅｉｎ２．１（ＨＥＶ２．１）は、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のゴム産生植物の乳管細胞に多く発現している蛋白質のことであり、ゴム粒子の凝集に関与し、抗真菌活性を有するものである。
また、ＭＹＣ１ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ（ＭＹＣ１）は、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のゴム産生植物のラテックスで多く発現している、ジャスモン酸シグナルに関わる転写因子のことである。ここで、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ（転写因子）とは、遺伝子の転写量を増加若しくは減少（好ましくは増加）させる活性を有する蛋白質を意味する。すなわち、本明細書において、ＭＹＣ１は、ジャスモン酸シグナルに関わる蛋白質のうち少なくとも１種の蛋白質をコードする遺伝子の転写量を増加若しくは減少（好ましくは増加）させる活性（転写因子活性）を有する蛋白質のことである。
【0201】
第２の本開示のベクター（前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含むベクター）を植物に導入することにより、ポリイソプレノイド生合成に関わる前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質を発現するように形質転換された形質転換植物が得られる。そして、当該形質転換植物では、ポリイソプレノイド生合成に関わる前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質が発現することにより、第２の本開示のベクターが導入された植物体内で新たに該蛋白質が有する所定の酵素活性等の機能が増強され、結果的に当該植物において、遺伝子組み換え前と比較して、高分子量のポリイソプレノイドの製造をより好適に可能にする。
【0202】
次に、前記形質転換植物の作製方法について簡単に説明するが、このような形質転換植物は従来公知の方法により作製することができる。
【0203】
前記形質転換植物を作出するために、第２の本開示のベクターが導入される植物としては、特に限定されないが、中でも、ポリイソプレノイドを生合成できる植物で変異ＣＰＴファミリー蛋白質を発現させることにより、高分子量のポリイソプレノイドの製造が特に期待できることから、前記植物としては、ゴム産生植物が好ましい。なかでも、Ｈｅｖｅａ属又はＴａｒａｘａｃｕｍ属に属する植物が好ましく、Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ又はＴａｒａｘａｃｕｍ ｋｏｋｓａｇｈｙｚがより好ましい。
【0204】
第２の本開示のベクターを植物（カルスや、培養細胞、スフェロプラスト、プロトプラストといった植物細胞を含む）に導入する方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（特開昭５９－１４０８８５号公報、特開昭６０－７００８０号公報、国際公開第９４／００９７７号）、エレクトロポレーション法（特開昭６０－２５１８８７号公報）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６号、特許第２５１７８１３号）等を挙げることができる。中でも、アグロバクテリウムを用いる方法（アグロバクテリウム法）を用いて第２の本開示のベクターを植物に導入して形質転換植物（形質転換植物細胞）を作製するのが好ましい。
なお更には、第２の本開示のベクターを、前記ＤＮＡを導入する方法などにより、微生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞等の、生物体、生物体の一部、器官、組織や培養細胞、スフェロプラスト、プロトプラストなどに導入することによって、シス型イソプレノイド、ポリイソプレノイドを生産することも可能である。
なお更には、第２の本開示のベクターを、前記ＤＮＡを導入する方法などにより、微生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞等の、生物体、生物体の一部、器官、組織や培養細胞、スフェロプラスト、プロトプラストなどに導入することによって、シス型イソプレノイド、ポリイソプレノイドを生産することも可能である。
【0205】
以上の方法等により、前記形質転換植物（形質転換植物細胞）が得られる。なお、前記形質転換植物は、上述の方法で得られた形質転換植物細胞のみならず、その子孫又はクローン、更にそれらを継代させて得られる子孫植物の全てを含む概念である。一旦、第２の本開示のベクターが導入された形質転換植物細胞が得られれば、該形質転換植物細胞から有性生殖、無性生殖、組織培養、細胞培養、細胞融合等により子孫又はクローンを得ることが可能である。また、該形質転換植物細胞やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、不定芽、不定胚、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該形質転換植物を量産することも可能である。
【0206】
形質転換植物細胞から植物体（形質転換植物）を再生する方法としては、例えば、ユーカリでは土肥らの方法（特願平１１－１２７０２５号公報）、イネではＦｕｊｉｍｕｒａらの方法（Ｆｕｊｉｍｕｒａら（１９９５）， Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．２：ｐ７４－）、トウモロコシではＳｈｉｌｌｉｔｏらの方法（Ｓｈｉｌｌｉｔｏら（１９８９）， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．７：ｐ５８１－）、ジャガイモではＶｉｓｓｅｒらの方法（Ｖｉｓｓｅｒら（１９８９）， Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，ｖｏｌ．７８：ｐ５８９－）、シロイヌナズナではＡｋａｍａらの方法（Ａｋａｍａら（１９９２）， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，ｖｏｌ．１２：ｐ７－）が知られており、当業者であれば、これらを参照して形質転換植物細胞から植物体を再生できる。
【0207】
再生した植物体において、周知の手法を用いることで、目的の蛋白質遺伝子の発現を確認することが出来る。例えば、目的の蛋白質の発現をウエスタンブロット解析すればよい。
【0208】
前記形質転換植物から種子を得る方法としては、例えば、形質転換植物を適当な培地において発根させ、その発根体を水分含有の土を入れたポットに移植する。適当な栽培条件下で生育させ、最終的に種子を形成させて、該種子を得る。また、種子から植物体を得る方法としては、例えば、前記のようにして得られた形質転換植物由来の種子を、水分含有の土に播種し、適当な栽培条件下で生育させることにより植物体を得ることができる。
【0209】
第２の本開示では、第２の本開示のベクターを植物に導入することにより、該ベクターに含まれるポリイソプレノイド生合成に関わる前記変異ＣＰＴファミリー蛋白質をコードする遺伝子が発現し、当該植物において、遺伝子組み換え前と比較して、高分子量のポリイソプレノイドの製造を可能にする。具体的には、上述の方法で得られた形質転換植物細胞、形質転換植物細胞から得られたカルス、該カルスから再分化した細胞等を適当な培地で培養したり、形質転換植物細胞から再分化した形質転換植物、該形質転換植物から得られた種子から得られた植物体等を適当な栽培条件下で生育させたりすることにより、高分子量のシス型イソプレノイド、ポリイソプレノイドを製造することができる。
【0210】
（ゴム製品の製造方法）
第２の本開示のゴム製品の製造方法は、前記第２の本開示のベクターを植物に導入することにより得られる形質転換植物によりポリイソプレノイドを製造する工程、得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法である。
第２の本開示のゴム製品の製造方法は、前記第２の本開示のベクターを植物に導入することにより得られる形質転換植物によりポリイソプレノイドを製造する工程、得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法である。
【0211】
ゴム製品としては、第１の本開示において上述したものと同様である。
【0212】
ゴム製品が空気入りタイヤの場合、すなわち、第２の本開示のゴム製品の製造方法が第２の本開示の空気入りタイヤの製造方法の場合、前記生ゴム製品成形工程は、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程に、前記加硫工程は、前記生タイヤを加硫する加硫工程に相当する。すなわち、第２の本開示の空気入りタイヤの製造方法は、前記第２の本開示のベクターを植物に導入することにより得られる形質転換植物によりポリイソプレノイドを製造する工程、得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法である。
【0213】
＜混練工程＞
混練工程では、前記第２の本開示のベクターを植物に導入することにより得られる形質転換植物から得られるポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る。
混練工程では、前記第２の本開示のベクターを植物に導入することにより得られる形質転換植物から得られるポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る。
【0214】
前記第２の本開示のベクターを植物に導入することにより得られる形質転換植物から得られるポリイソプレノイドは、前記形質転換植物からラテックスを採取し、採取したラテックスを以下の固化工程に供することにより得られる。
なお、前記形質転換植物からのラテックスの採取方法は特に制限されず、通常行われる方法を採用することができるが、例えば、植物の幹を傷つけてにじみ出る乳液を回収したり（タッピング）、根など形質転換植物の一部を切断し、切断した部分からにじみ出る乳液を回収したり、切断した組織を粉砕し、有機溶媒を用いて抽出して採取したりすることができる。
なお、前記形質転換植物からのラテックスの採取方法は特に制限されず、通常行われる方法を採用することができるが、例えば、植物の幹を傷つけてにじみ出る乳液を回収したり（タッピング）、根など形質転換植物の一部を切断し、切断した部分からにじみ出る乳液を回収したり、切断した組織を粉砕し、有機溶媒を用いて抽出して採取したりすることができる。
【0215】
＜固化工程＞
前記採取されたラテックスは、固化工程に供される。固化する方法としては、特に限定されず、エタノール、メタノール、アセトン等のポリイソプレノイドを溶解しない溶媒にラテックスを添加する方法やラテックスに酸を添加する方法等が挙げられる。固化工程を行うことにより、ラテックスからゴム（ポリイソプレノイドの１種）を固形分として回収できる。得られたゴムは、必要に応じて乾燥してから使用すればよい。
前記採取されたラテックスは、固化工程に供される。固化する方法としては、特に限定されず、エタノール、メタノール、アセトン等のポリイソプレノイドを溶解しない溶媒にラテックスを添加する方法やラテックスに酸を添加する方法等が挙げられる。固化工程を行うことにより、ラテックスからゴム（ポリイソプレノイドの１種）を固形分として回収できる。得られたゴムは、必要に応じて乾燥してから使用すればよい。
【0216】
添加剤としては特に限定されず、ゴム製品の製造に用いられる添加剤を使用できる。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、例えば、前記ラテックスから得られたゴム以外のゴム成分、カーボンブラック、シリカ、炭酸カルシウム、アルミナ、クレー、タルクなどの補強用充填剤、シランカップリング剤、酸化亜鉛、ステアリン酸、加工助剤、各種老化防止剤、オイルなどの軟化剤、ワックス、硫黄などの加硫剤、加硫促進剤等が挙げられる。
【0217】
混練工程における混練は、オープンロール、バンバリーミキサー、密閉式混練機などのゴム混練装置を用いて行えばよい。
【0218】
＜生ゴム製品成形工程（タイヤの場合は生タイヤ成形工程）＞
生ゴム製品成形工程では、第１の本開示において上述した工程と同様である。
生ゴム製品成形工程では、第１の本開示において上述した工程と同様である。
【0219】
＜加硫工程＞
加硫工程は、第１の本開示において上述した工程と同様である。
加硫工程は、第１の本開示において上述した工程と同様である。
【実施例0220】
実施例に基づいて、本開示を具体的に説明するが、本開示はこれらのみに限定されるものではない。
【0221】
まず、実施例、比較例の概要について説明する。
実施例１：ＡｔＣＰＴ５－Ｃ末端ＨＲＴ１型を用いたゴム粒子上のアッセイ
比較例１：ＡｔＣＰＴ５を用いたゴム粒子上のアッセイ
実施例１、比較例１において、ＮｇＢＲファミリー蛋白質と相互作用しないＣＰＴのＣ末端変異体と通常型との生成物鎖長を比較した。ここで、ＡｔＣＰＴ５が、ゴム粒子上に存在しないＣＰＴファミリー蛋白質、ＨＲＴ１が、ゴム粒子上に存在するＣＰＴファミリー蛋白質に該当する。
実施例１：ＡｔＣＰＴ５－Ｃ末端ＨＲＴ１型を用いたゴム粒子上のアッセイ
比較例１：ＡｔＣＰＴ５を用いたゴム粒子上のアッセイ
実施例１、比較例１において、ＮｇＢＲファミリー蛋白質と相互作用しないＣＰＴのＣ末端変異体と通常型との生成物鎖長を比較した。ここで、ＡｔＣＰＴ５が、ゴム粒子上に存在しないＣＰＴファミリー蛋白質、ＨＲＴ１が、ゴム粒子上に存在するＣＰＴファミリー蛋白質に該当する。
【0222】
実施例２：ＨｂＣＰＴ５－Ｃ末端ＨＲＴ１型を用いたゴム粒子上のアッセイ
比較例２：ＨｂＣＰＴ５を用いたゴム粒子上のアッセイ
実施例２、比較例２において、ＮｇＢＲファミリー蛋白質と相互作用するＣＰＴのＣ末端変異体と通常型との生成物鎖長を比較した。ここで、ＨｂＣＰＴ５が、ゴム粒子上に存在しないＣＰＴファミリー蛋白質、ＨＲＴ１が、ゴム粒子上に存在するＣＰＴファミリー蛋白質に該当する。
比較例２：ＨｂＣＰＴ５を用いたゴム粒子上のアッセイ
実施例２、比較例２において、ＮｇＢＲファミリー蛋白質と相互作用するＣＰＴのＣ末端変異体と通常型との生成物鎖長を比較した。ここで、ＨｂＣＰＴ５が、ゴム粒子上に存在しないＣＰＴファミリー蛋白質、ＨＲＴ１が、ゴム粒子上に存在するＣＰＴファミリー蛋白質に該当する。
【0223】
（各遺伝子の獲得）
（１）ＨＲＴ１遺伝子
〔ＨｅｖｅａラテックスからのＴｏｔａｌ ＲＮＡ抽出〕
パラゴムノキのラテックスからホットフェノール法により、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。ラテックス６ｍＬに１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液６ｍＬ、１０％ＳＤＳ溶液１ｍＬを添加し、更に６５℃で予温しておいた水飽和フェノールを１２ｍＬ添加した。６５℃で５分間インキュベートしたのち、ボルテックスで撹拌し、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。遠心後、上清を新しいチューブに移し、フェノール：クロロホルム（１：１）溶液１２ｍＬを添加し、２分間振盪撹拌した。撹拌後、再度、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後、上清を新しいチューブに移し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）溶液１２ｍＬを添加し、２分間振盪撹拌した。撹拌後、再度、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後、上清を新しいチューブに移し、３Ｍ酢酸ナトリウム溶液１．２ｍＬとイソプロパノール１３ｍＬを添加し、ボルテックスで撹拌した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを沈殿させるために、－２０℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を取除くことでＴｏｔａｌ ＲＮＡの沈殿を回収した。回収したＴｏｔａｌ ＲＮＡは７０％エタノールで２度洗浄したのち、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅの水で溶解させた。
（１）ＨＲＴ１遺伝子
〔ＨｅｖｅａラテックスからのＴｏｔａｌ ＲＮＡ抽出〕
パラゴムノキのラテックスからホットフェノール法により、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。ラテックス６ｍＬに１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液６ｍＬ、１０％ＳＤＳ溶液１ｍＬを添加し、更に６５℃で予温しておいた水飽和フェノールを１２ｍＬ添加した。６５℃で５分間インキュベートしたのち、ボルテックスで撹拌し、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。遠心後、上清を新しいチューブに移し、フェノール：クロロホルム（１：１）溶液１２ｍＬを添加し、２分間振盪撹拌した。撹拌後、再度、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後、上清を新しいチューブに移し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）溶液１２ｍＬを添加し、２分間振盪撹拌した。撹拌後、再度、室温、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後、上清を新しいチューブに移し、３Ｍ酢酸ナトリウム溶液１．２ｍＬとイソプロパノール１３ｍＬを添加し、ボルテックスで撹拌した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを沈殿させるために、－２０℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を取除くことでＴｏｔａｌ ＲＮＡの沈殿を回収した。回収したＴｏｔａｌ ＲＮＡは７０％エタノールで２度洗浄したのち、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅの水で溶解させた。
【0224】
〔Ｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡの合成〕
回収したＴｏｔａｌ ＲＮＡをもとに、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡの合成はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）の説明書に従って行った。
〔ｃＤＮＡからＨＲＴ１遺伝子の取得〕
作製した１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型にＨＲＴ１遺伝子の取得を行った。ＰＣＲはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用し、説明書に従って行った。ＰＣＲは、９８℃で１０秒、５８℃で３０秒、６８℃で１分を１サイクルとして、３５サイクル行った。
ＨＲＴ１遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー１：５’－ ｔｔｔｇｇａｔｃｃｇａｔｇｇａａｔｔａｔａｃａａｃｇｇｔｇａｇａｇｇ－３’
プライマー２：５’－ ｔｔｔｇｃｇｇｃｃｇｃｔｔａｔｔｔｔａａｇｔａｔｔｃｃｔｔａｔｇｔｔｔｃｔｃｃ－３’
を使用した。
上述の方法により、ＨＲＴ１遺伝子が得られた。得られた遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した。
回収したＴｏｔａｌ ＲＮＡをもとに、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡの合成はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）の説明書に従って行った。
〔ｃＤＮＡからＨＲＴ１遺伝子の取得〕
作製した１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型にＨＲＴ１遺伝子の取得を行った。ＰＣＲはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用し、説明書に従って行った。ＰＣＲは、９８℃で１０秒、５８℃で３０秒、６８℃で１分を１サイクルとして、３５サイクル行った。
ＨＲＴ１遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー１：５’－ ｔｔｔｇｇａｔｃｃｇａｔｇｇａａｔｔａｔａｃａａｃｇｇｔｇａｇａｇｇ－３’
プライマー２：５’－ ｔｔｔｇｃｇｇｃｃｇｃｔｔａｔｔｔｔａａｇｔａｔｔｃｃｔｔａｔｇｔｔｔｃｔｃｃ－３’
を使用した。
上述の方法により、ＨＲＴ１遺伝子が得られた。得られた遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した。
【0225】
〔ｃＤＮＡからＨＲＢＰ遺伝子の取得〕
プライマー３：５‘－ ｔｔｔｃｔｃｇａｇａｔｇｇａｔｔｔｇａａａｃｃｔｇｇａｇｃｔｇ －３’
プライマー４：５‘－ ｔｔｔｃｔｃｇａｇｔｃａｔｇｔａｃｃａｔａａｔｔｔｔｇｃｔｇｃａｃ －３’
を使用した。
上述の方法により、ＨＲＢＰ遺伝子が得られた。得られた遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した（配列番号１１、１２）。
プライマー３：５‘－ ｔｔｔｃｔｃｇａｇａｔｇｇａｔｔｔｇａａａｃｃｔｇｇａｇｃｔｇ －３’
プライマー４：５‘－ ｔｔｔｃｔｃｇａｇｔｃａｔｇｔａｃｃａｔａａｔｔｔｔｇｃｔｇｃａｃ －３’
を使用した。
上述の方法により、ＨＲＢＰ遺伝子が得られた。得られた遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した（配列番号１１、１２）。
【0226】
〔ｃＤＮＡからＲＥＦ遺伝子の取得〕
プライマー５：５‘－ ｔｔｔｃｔｃｇａｇａｔｇｇｃｔｇａａｇａｃｇａａｇａｃ －３’
プライマー６：５ ‘－ ｔｔｔｇｇａｔｃｃｔｃａａｔｔｃｔｃｔｃｃａｔａａａａｃ－３’
を使用した。
上述の方法により、ＲＥＦ遺伝子が得られた。得られた遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した（配列番号１３、１４）。
プライマー５：５‘－ ｔｔｔｃｔｃｇａｇａｔｇｇｃｔｇａａｇａｃｇａａｇａｃ －３’
プライマー６：５ ‘－ ｔｔｔｇｇａｔｃｃｔｃａａｔｔｃｔｃｔｃｃａｔａａａａｃ－３’
を使用した。
上述の方法により、ＲＥＦ遺伝子が得られた。得られた遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した（配列番号１３、１４）。
【0227】
〔ベクターの構築〕
前記取得したＤＮＡ断片にｄＡ付加を行った後、ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用してｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、ｐＧＥＭ－ＨＲＴ１、ｐＧＥＭ－ＨＲＢＰ、ｐＧＥＭ－ＲＥＦを作製した。
前記取得したＤＮＡ断片にｄＡ付加を行った後、ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用してｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、ｐＧＥＭ－ＨＲＴ１、ｐＧＥＭ－ＨＲＢＰ、ｐＧＥＭ－ＲＥＦを作製した。
【0228】
〔大腸菌の形質転換〕
前記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行い、形質転換体はアンピシリンとＸ－ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上で培養し、青／白スクリーニング法によって目的遺伝子を導入した大腸菌の選別を行った。
前記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行い、形質転換体はアンピシリンとＸ－ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上で培養し、青／白スクリーニング法によって目的遺伝子を導入した大腸菌の選別を行った。
【0229】
〔プラスミドの抽出〕
目的遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌は、ＬＢ液体培地上で３７℃で一晩培養したのち、菌体を回収し、プラスミドの回収を行った。プラスミドの回収はＦａｓｔ Ｇｅｎｅプラスミドミニキット（日本ジェネティクス）を使用した。回収したプラスミドに挿入された遺伝子の塩基配列に変異がないことをシークエンス解析により確認した。
目的遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌は、ＬＢ液体培地上で３７℃で一晩培養したのち、菌体を回収し、プラスミドの回収を行った。プラスミドの回収はＦａｓｔ Ｇｅｎｅプラスミドミニキット（日本ジェネティクス）を使用した。回収したプラスミドに挿入された遺伝子の塩基配列に変異がないことをシークエンス解析により確認した。
【0230】
（２）ＨｂＣＰＴ５遺伝子
ＨｂＣＰＴ５遺伝子はゴムノキゲノムを鋳型としたＰＣＲによって取得した。
〔Ｈｅｖｅａ葉からのゲノムDNA抽出〕
ゲノムＤＮＡはＨｅｖｅａ葉を材料にＣｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ（ＣＴＡＢ）法により取得した。
ＨｂＣＰＴ５遺伝子はゴムノキゲノムを鋳型としたＰＣＲによって取得した。
〔Ｈｅｖｅａ葉からのゲノムDNA抽出〕
ゲノムＤＮＡはＨｅｖｅａ葉を材料にＣｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ（ＣＴＡＢ）法により取得した。
【0231】
〔ゲノムＤＮＡからＨＲＢＰ遺伝子の取得〕
ＰＣＲはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用し、説明書に従って行った。ＰＣＲは、９８℃で１０秒、５８℃で３０秒、６８℃で２分を１サイクルとして、３５サイクル行った。
ＨｂＣＰＴ５遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー７：５’－ ＧＴＧＣＴＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＡＡＴＡＴＴＴＧＡＧＧＣＴＧＧ－３’
プライマー８：５’－ ＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣ ＣＧＧＴＡＣＧＣＡＡＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＴＴＣ－３’
を使用した。
上述の方法により、ＨｂＣＰＴ５遺伝子が得られた。得られた遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した。
ＰＣＲはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用し、説明書に従って行った。ＰＣＲは、９８℃で１０秒、５８℃で３０秒、６８℃で２分を１サイクルとして、３５サイクル行った。
ＨｂＣＰＴ５遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー７：５’－ ＧＴＧＣＴＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＡＡＴＡＴＴＴＧＡＧＧＣＴＧＧ－３’
プライマー８：５’－ ＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣ ＣＧＧＴＡＣＧＣＡＡＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＴＴＣ－３’
を使用した。
上述の方法により、ＨｂＣＰＴ５遺伝子が得られた。得られた遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した。
【0232】
〔ベクターの構築〕
前記取得したＰＣＲ断片にｄＡ付加を行った後、ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用してｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、ｐＧＥＭ－ＨｂＣＰＴ５を作製した。
前記取得したＰＣＲ断片にｄＡ付加を行った後、ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用してｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、ｐＧＥＭ－ＨｂＣＰＴ５を作製した。
【0233】
〔大腸菌の形質転換〕
前記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行い、形質転換体はアンピシリンとＸ－ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上で培養し、青／白スクリーニング法によって目的遺伝子を導入した大腸菌の選別を行った。
前記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行い、形質転換体はアンピシリンとＸ－ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上で培養し、青／白スクリーニング法によって目的遺伝子を導入した大腸菌の選別を行った。
【0234】
〔プラスミドの抽出〕
目的遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌は、ＬＢ液体培地上で３７℃で一晩培養したのち、菌体を回収し、プラスミドの回収を行った。プラスミドの回収はＦａｓｔ Ｇｅｎｅプラスミドミニキット（日本ジェネティクス）を使用した。回収したプラスミドに挿入された遺伝子の塩基配列に変異がないことをシークエンス解析により確認した。
目的遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌は、ＬＢ液体培地上で３７℃で一晩培養したのち、菌体を回収し、プラスミドの回収を行った。プラスミドの回収はＦａｓｔ Ｇｅｎｅプラスミドミニキット（日本ジェネティクス）を使用した。回収したプラスミドに挿入された遺伝子の塩基配列に変異がないことをシークエンス解析により確認した。
【0235】
（３）ＡｔＣＰＴ５遺伝子
ＡｔＣＰＴ５ （Ａｔ５ｇ５８７８０）の完全長ｃＤＮＡはＮａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏ－Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｐｒｏｊｅｃｔを通して理化学研究所バイオリソースセンターから提供された（リソース番号：ＲＡＦＬ０６－１６－Ｅ１６）。
ＡｔＣＰＴ５ （Ａｔ５ｇ５８７８０）の完全長ｃＤＮＡはＮａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏ－Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｐｒｏｊｅｃｔを通して理化学研究所バイオリソースセンターから提供された（リソース番号：ＲＡＦＬ０６－１６－Ｅ１６）。
【0236】
（変異体遺伝子の作製）
〔各断片の作製〕
変異体遺伝子作製のための、ＰＣＲ断片は以下のプライマーを使用したＰＣＲを行うことで作製した。ＰＣＲはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用し、説明書に従って行った。ＰＣＲは、９８℃で１０秒、５８℃で３０秒、６８℃で１分を１サイクルとして、３５サイクル行った。
〔各断片の作製〕
変異体遺伝子作製のための、ＰＣＲ断片は以下のプライマーを使用したＰＣＲを行うことで作製した。ＰＣＲはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用し、説明書に従って行った。ＰＣＲは、９８℃で１０秒、５８℃で３０秒、６８℃で１分を１サイクルとして、３５サイクル行った。
【0237】
ＡｔＣＰＴ５ Ｃ末端無し （１－８３４）
プライマー９：Ｆｗ ５’－ＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＴＴＧＴＣＴＡＴＴＣＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＴＡＴＣＴ－３’
プライマー１０：Ｒｖ ５’－ＧＴＣＧＡＡＧＡＣＣＡＡＴＡＴＣＡＧＧＣＣＡＡＡＧＧ－３’
プライマー９：Ｆｗ ５’－ＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＴＴＧＴＣＴＡＴＴＣＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＴＡＴＣＴ－３’
プライマー１０：Ｒｖ ５’－ＧＴＣＧＡＡＧＡＣＣＡＡＴＡＴＣＡＧＧＣＣＡＡＡＧＧ－３’
【0238】
ＨｂＣＰＴ５ Ｃ末端無し（１－１０２３）
プライマー１１：Ｆｗ ５’－ＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＧＡＡＡＴＡＴＴＴＧＡＧＧＣＴＧＧ－３’
プライマー１２：Ｒｖ ５’－ＧＡＡＧＡＣＣＡＡＴＣＴＣＣＧＧＣＣＡＣ－３’
プライマー１１：Ｆｗ ５’－ＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＧＡＡＡＴＡＴＴＴＧＡＧＧＣＴＧＧ－３’
プライマー１２：Ｒｖ ５’－ＧＡＡＧＡＣＣＡＡＴＣＴＣＣＧＧＣＣＡＣ－３’
【0239】
ＨＲＴ１ Ｃ末端のみ（７８７－８７３）ＡｔＣＰＴ５融合用
プライマー１３：Ｆｗ ５’－ＣＣＴＴＴＧＧＣＣＴＧＡＴＡＴＴＧＧＴＣＴＴＣＧＡＣ－３’
プライマー１４：Ｒｖ ５’－ＴＡＣＡＧＧＴＴＴＴＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＴＴＡＡＧ－３’
プライマー１３：Ｆｗ ５’－ＣＣＴＴＴＧＧＣＣＴＧＡＴＡＴＴＧＧＴＣＴＴＣＧＡＣ－３’
プライマー１４：Ｒｖ ５’－ＴＡＣＡＧＧＴＴＴＴＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＴＴＡＡＧ－３’
【0240】
ＨＲＴ１ Ｃ末端のみ（７８７－８７３）ＨｂＣＰＴ５融合用
プライマー１５：Ｆｗ ５’－ＧＴＧＧＣＣＧＧＡＧＡＴＴＧＧＴＣＴＴＣ－３’
プライマー１６：Ｒｖ ５’－ＴＡＣＡＧＧＴＴＴＴＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＴＴＡＡＧ－３’
プライマー１５：Ｆｗ ５’－ＧＴＧＧＣＣＧＧＡＧＡＴＴＧＧＴＣＴＴＣ－３’
プライマー１６：Ｒｖ ５’－ＴＡＣＡＧＧＴＴＴＴＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＴＴＡＡＧ－３’
【0241】
ＰＣＲ産物は２．０％アガロースゲルにより電気泳動し、ＦａｓｔＧｅｎｅＴＭＧｅｌ／ＰＣＲ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（日本ジェネティクス）により目的サイズのバンドをゲル回収した。得られたＰＣＲ産物を鋳型としてＯｖｅｒｌａｐ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲを行うことでキメラ配列を作製した。ＰＣＲは、９４℃ ２分後、９８℃ １０秒、５５℃ ３０秒、６８℃ ３０秒を１サイクルとし、３０サイクル行った。
【0242】
ＡｔＣＰＴ５ Ｃ末なし＋ＨＲＴ１Ｃ末のみ
プライマー１７：Ｆｗ ５’－ＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＴＴＧＴＣＴＡＴＴＣＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＴＡＴＣＴ－３’
プライマー１８：Ｒｖ ５’－ＴＧＡＴＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣ ＴＴＡＴＴＴＴＡＡＧ－３’
プライマー１７：Ｆｗ ５’－ＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＴＴＧＴＣＴＡＴＴＣＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＴＡＴＣＴ－３’
プライマー１８：Ｒｖ ５’－ＴＧＡＴＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣ ＴＴＡＴＴＴＴＡＡＧ－３’
【0243】
ＨｂＣＰＴ５ Ｃ末なし＋ＨＲＴ１Ｃ末のみ
プライマー１９：Ｆｗ ５’－ＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＧＡＡＡＴＡＴＴＴＧＡＧＧＣＴＧＧ－３’
プライマー２０：Ｒｖ ５’－ＴＧＡＴＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣ ＴＴＡＴＴＴＴＡＡＧ－３’
プライマー１９：Ｆｗ ５’－ＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＧＡＡＡＴＡＴＴＴＧＡＧＧＣＴＧＧ－３’
プライマー２０：Ｒｖ ５’－ＴＧＡＴＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣ ＴＴＡＴＴＴＴＡＡＧ－３’
【0244】
得られたＰＣＲ産物は０．８％アガロースゲルでゲル回収し、１０×Ａ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてｄＡ付加を行い、ｐＧＥＭ－Ｔ ＥＡＳＹ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ）へライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、ＬＢ寒天培地［＋５０ μｇ／ｍＬ Ａｍｐ、＋ ５％ （ｗ／ｖ） Ｘ－ｇａｌ ２０ μＬ、＋１００ ｍＭ ＩＰＴＧ ２５ μＬ］に塗布して３７℃で一晩培養し、青白判定を行った。白色コロニーを複数個選抜し、ＬＢ液体培地４ ｍＬ ［＋５０ μｇ／ｍＬ Ａｍｐ］において３７°Ｃで、一晩振とう培養した後、ＦａｓｔＧｅｎｅＴＭ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （日本ジェネティクス）を用いてプラスミドを回収し、ＥｃｏＲ Ｉ（ＮＥＢ）で２０ ｍｉｎ消化することでインサートの挿入を確認した。シーケンシングによりＰＣＲで増幅させた配列に変異が導入されていないことを確認した。
【0245】
（変異体発現用ベクターの作製）
無細胞発現用ベクターｐＥＵ－Ｅ０１－ＭＣＳ－ＴＥＶ－Ｈｉｓ－Ｃ１は制限酵素ＥｃｏＲＶとＫｐｎＩで処理し、ゲル回収によって精製した。ＳＬｉＣＥ反応に用いるＳＬｉＣＥ溶液は、以下のように作成した。
培養した大腸菌ＤＨ５α ０．３～０．４ｇを３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１．２ｍＬで穏やかに懸濁し、室温で１０分間インキュベートした。インキュベート後、４℃、２００００×ｇの条件下で２分間遠心し、上清を回収した。回収した上清に等量の８０％グリセロール溶液を添加し、ＳＬｉＣＥ溶液とした。ＳＬｉＣＥ溶液は一定量ごとに小分けし、使用するまで－８０℃で保管した。
無細胞発現用ベクターｐＥＵ－Ｅ０１－ＭＣＳ－ＴＥＶ－Ｈｉｓ－Ｃ１は制限酵素ＥｃｏＲＶとＫｐｎＩで処理し、ゲル回収によって精製した。ＳＬｉＣＥ反応に用いるＳＬｉＣＥ溶液は、以下のように作成した。
培養した大腸菌ＤＨ５α ０．３～０．４ｇを３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１．２ｍＬで穏やかに懸濁し、室温で１０分間インキュベートした。インキュベート後、４℃、２００００×ｇの条件下で２分間遠心し、上清を回収した。回収した上清に等量の８０％グリセロール溶液を添加し、ＳＬｉＣＥ溶液とした。ＳＬｉＣＥ溶液は一定量ごとに小分けし、使用するまで－８０℃で保管した。
【0246】
〔ＰＣＲ〕
ＡｔＣＰＴ５全長
プライマー２１：Ｆｗ ５’－ＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＴＴＧＴＣＴＡＴＴＣＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＴＡＴＣＴ－３’
プライマー２２：Ｒｖ ５’－ＴＧＡＴＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡＧＣＣＡＡ－３’
ＡｔＣＰＴ５全長
プライマー２１：Ｆｗ ５’－ＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＴＴＧＴＣＴＡＴＴＣＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＴＡＴＣＴ－３’
プライマー２２：Ｒｖ ５’－ＴＧＡＴＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡＧＣＣＡＡ－３’
【0247】
ＨｂＣＰＴ５全長
プライマー２３：Ｆｗ ５’－ＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＧＡＡＡＴＡＴＴＴＧＡＧＧＣＴＧＧ－３’
プライマー２４：Ｒｖ ５’－ＴＧＡＴＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＴＡＣＡＡＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＴＴＣ－３’
プライマー２３：Ｆｗ ５’－ＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＧＡＡＡＴＡＴＴＴＧＡＧＧＣＴＧＧ－３’
プライマー２４：Ｒｖ ５’－ＴＧＡＴＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＴＡＣＡＡＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＴＴＣ－３’
【0248】
ＡｔＣＰＴ５－Ｃ末端ＨＲＴ１
プライマー２５：Ｆｗ ５’－ＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＴＴＧＴＣＴＡＴＴＣＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＴＡＴＣＴ－３’
プライマー２６：Ｒｖ ５’－ＴＧＡＴＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＧ－３’
プライマー２５：Ｆｗ ５’－ＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＴＴＧＴＣＴＡＴＴＣＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＴＡＴＣＴ－３’
プライマー２６：Ｒｖ ５’－ＴＧＡＴＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＧ－３’
【0249】
ＨｂＣＰＴ５－Ｃ末端ＨＲＴ１
プライマー２７：Ｆｗ ５’－ＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＧＡＡＡＴＡＴＴＴＧＡＧＧＣＴＧＧ－３’
プライマー２８：Ｒｖ ５’－ＴＧＡＴＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＧ－３’
プライマー２７：Ｆｗ ５’－ＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＧＡＡＡＴＡＴＴＴＧＡＧＧＣＴＧＧ－３’
プライマー２８：Ｒｖ ５’－ＴＧＡＴＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＧ－３’
【0250】
得られたＰＣＲ断片、制限酵素処理したベクターを１：１～３：１の比率になるように混ぜ、１０×ＳＬｉＣＥ Ｂｕｆｆｅｒ（５００μＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴ）を反応系最終容量の１０分の１量、ＳＬｉＣＥ溶液を反応系最終容量の１０分の１量加え、３７℃で１５分反応させ、ｐＥＵ－ＡｔＣＰＴ５（比較例１）、ｐＥＵ－ＡｔＣＰＴ－Ｃ末ＨＲＴ１（実施例１）、ｐＥＵ－ＨｂＣＰＴ５（比較例２）、ｐＥＵ－ＨｂＣＰＴ５－Ｃ末ＨＲＴ１（実施例２）を作製した。
【0251】
〔大腸菌の形質転換〕
前記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行い、形質転換体はアンピシリンとＸ－ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上で培養し、コロニーＰＣＲによって目的遺伝子を導入した大腸菌の選別を行った。
前記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行い、形質転換体はアンピシリンとＸ－ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上で培養し、コロニーＰＣＲによって目的遺伝子を導入した大腸菌の選別を行った。
【0252】
〔プラスミドの抽出〕
目的遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌は、ＬＢ液体培地上で３７℃で一晩培養したのち、菌体を回収し、プラスミドの回収を行った。プラスミドの回収はＦａｓｔ Ｇｅｎｅプラスミドミニキット（日本ジェネティクス社製）を使用した。
目的遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌は、ＬＢ液体培地上で３７℃で一晩培養したのち、菌体を回収し、プラスミドの回収を行った。プラスミドの回収はＦａｓｔ Ｇｅｎｅプラスミドミニキット（日本ジェネティクス社製）を使用した。
【0253】
（ＨＲＢＰ、ＲＥＦ発現用ベクターの作製）
ｐＧＥＭ－ＨＲＢＰを制限酵素Ｘｈｏ Ｉで処理したのち、同様にＸｈｏ Ｉで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターｐＥＵ－Ｅ０１－ＭＣＳ－ＴＥＶ－Ｈｉｓ－Ｃ１に挿入し、ｐＥＵ－Ｃ１－ＨＲＢＰを作製した。
更に、ｐＧＥＭ－ＲＥＦを制限酵素Ｘｈｏ ＩとＢａｍ ＨＩで処理したのち、同様にＸｈｏ ＩとＢａｍ ＨＩで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターｐＥＵＥ０１－ＭＣＳ－ＴＥＶ－Ｈｉｓ－Ｃ１に挿入し、ｐＥＵ－Ｃ１－ＲＥＦを作製した。
ｐＧＥＭ－ＨＲＢＰを制限酵素Ｘｈｏ Ｉで処理したのち、同様にＸｈｏ Ｉで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターｐＥＵ－Ｅ０１－ＭＣＳ－ＴＥＶ－Ｈｉｓ－Ｃ１に挿入し、ｐＥＵ－Ｃ１－ＨＲＢＰを作製した。
更に、ｐＧＥＭ－ＲＥＦを制限酵素Ｘｈｏ ＩとＢａｍ ＨＩで処理したのち、同様にＸｈｏ ＩとＢａｍ ＨＩで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターｐＥＵＥ０１－ＭＣＳ－ＴＥＶ－Ｈｉｓ－Ｃ１に挿入し、ｐＥＵ－Ｃ１－ＲＥＦを作製した。
【0254】
〔大腸菌の形質転換〕
前記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行い、形質転換体はアンピシリンとＸ－ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上で培養し、コロニーＰＣＲによって目的遺伝子を導入した大腸菌の選別を行った。
前記作製したＶｅｃｔｏｒを用いて大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行い、形質転換体はアンピシリンとＸ－ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上で培養し、コロニーＰＣＲによって目的遺伝子を導入した大腸菌の選別を行った。
【0255】
〔プラスミドの抽出〕
目的遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌は、ＬＢ液体培地上で３７℃で一晩培養したのち、菌体を回収し、プラスミドの回収を行った。プラスミドの回収はＦａｓｔ Ｇｅｎｅプラスミドミニキット（日本ジェネティクス社製）を使用した。
目的遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌は、ＬＢ液体培地上で３７℃で一晩培養したのち、菌体を回収し、プラスミドの回収を行った。プラスミドの回収はＦａｓｔ Ｇｅｎｅプラスミドミニキット（日本ジェネティクス社製）を使用した。
【0256】
（酵素アッセイ）
〔ゴム粒子の調製〕
ゴム粒子は、５段階の遠心分離によってパラゴムノキのラテックス（Ｈｅｖｅａラテックス）から調製した。Ｈｅｖｅａラテックス９００ｍＬに、２０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）１００ｍＬを添加し、ラテックス溶液を調製した。得られたラテックス溶液を、１０００×ｇ、２０００×ｇ、８０００×ｇ、２００００×ｇ、５００００×ｇの異なる遠心速度で段階的に遠心分離した。遠心分離はいずれも４℃、４５分で行った。５００００×ｇでの遠心分離で残ったゴム粒子層に、３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアミノ］－プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）を終濃度０．１～２．０×ＣＭＣ（臨界ミセル濃度ＣＭＣの０．１～２．０倍）になるように加え、ゴム粒子を洗浄した。洗浄処理後、洗浄されたゴム粒子を超遠心分離（４００００×ｇ、４℃、４５分）によって回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。
〔ゴム粒子の調製〕
ゴム粒子は、５段階の遠心分離によってパラゴムノキのラテックス（Ｈｅｖｅａラテックス）から調製した。Ｈｅｖｅａラテックス９００ｍＬに、２０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）１００ｍＬを添加し、ラテックス溶液を調製した。得られたラテックス溶液を、１０００×ｇ、２０００×ｇ、８０００×ｇ、２００００×ｇ、５００００×ｇの異なる遠心速度で段階的に遠心分離した。遠心分離はいずれも４℃、４５分で行った。５００００×ｇでの遠心分離で残ったゴム粒子層に、３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアミノ］－プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）を終濃度０．１～２．０×ＣＭＣ（臨界ミセル濃度ＣＭＣの０．１～２．０倍）になるように加え、ゴム粒子を洗浄した。洗浄処理後、洗浄されたゴム粒子を超遠心分離（４００００×ｇ、４℃、４５分）によって回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。
【0257】
〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ１ ｍＲＮＡの転写反応）〕
無細胞蛋白合成は、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔ（（株）セルフリーサイエンス製）を使用して行った。前記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターを鋳型に、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔのプロトコルに従って、ｍＲＮＡの転写反応を行った。
無細胞蛋白合成は、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔ（（株）セルフリーサイエンス製）を使用して行った。前記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したベクターを鋳型に、ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔのプロトコルに従って、ｍＲＮＡの転写反応を行った。
【0258】
〔ｍＲＮＡの精製〕
転写反応後、得られたｍＲＮＡはエタノール沈殿により精製した。
転写反応後、得られたｍＲＮＡはエタノール沈殿により精製した。
【0259】
〔無細胞蛋白合成反応（ＳＴＥＰ２ 透析法による蛋白合成）〕
透析カップ（ＭＷＣＯ １２０００）（Ｂｉｏ－Ｔｅｃｋ社製）中に、以下の量をそれぞれ添加した。ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔのプロトコルに従って全量６０μＬで反応溶液を調整した。反応溶液にゴム粒子を１～２ｍｇ添加した。更に、ＰＰ容器Ｎｏ．２（マルエム容器）にＳＵＢ－ＡＭＩＸ ６５０μＬを添加した。
透析カップをＰＰ容器Ｎｏ．２にはめ、２６℃で蛋白合成反応を開始した。反応開始から２度のｍＲＮＡの追加と透析外液（ＳＵＢ－ＡＭＩＸ）の交換を行った。反応は２４時間行った。
透析カップ（ＭＷＣＯ １２０００）（Ｂｉｏ－Ｔｅｃｋ社製）中に、以下の量をそれぞれ添加した。ＷＥＰＲＯ７２４０Ｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｋｉｔのプロトコルに従って全量６０μＬで反応溶液を調整した。反応溶液にゴム粒子を１～２ｍｇ添加した。更に、ＰＰ容器Ｎｏ．２（マルエム容器）にＳＵＢ－ＡＭＩＸ ６５０μＬを添加した。
透析カップをＰＰ容器Ｎｏ．２にはめ、２６℃で蛋白合成反応を開始した。反応開始から２度のｍＲＮＡの追加と透析外液（ＳＵＢ－ＡＭＩＸ）の交換を行った。反応は２４時間行った。
【0260】
〔反応後のゴム粒子の回収〕
透析カップの溶液を新しい１．５μＬチューブに移し、反応後のゴム粒子を超遠心分離（４００００×ｇ、４℃、４５分）によって回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。
透析カップの溶液を新しい１．５μＬチューブに移し、反応後のゴム粒子を超遠心分離（４００００×ｇ、４℃、４５分）によって回収し、等量の２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１００Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。
【0261】
〔反応後のゴム粒子のゴム合成活性の測定〕
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を以下の方法により測定した。
まず、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５μＭ ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、１００μＭ １－１４Ｃイソペンテニル二リン酸（［１－１４Ｃ］ＩＰＰ）（比活性：５Ｃｉ／ｍｏｌ）、１０μＬ ゴム粒子溶液を混合した反応溶液（Ｔｏｔａｌ １００μＬ）を調製し、３０℃で１６時間反応させた。
反応後、飽和ＮａＣｌを２００μＬ加え、１ｍＬのジエチルエーテルでイソペンテノールなどを抽出した。次に、水相のポリプレニル二リン酸を１ｍＬの食塩水飽和ＢｕＯＨで抽出し、その後更に、水相の超長鎖ポリイソプレノイド（ゴム）を１ｍＬのトルエン／ヘキサン（１：１）で抽出し、放射活性を計測した。各層の放射活性は液体シンチレーションカウンターで１４Ｃのカウントを計測した。放射活性（ｄｐｍ）が高いほど、超長鎖ポリイソプレノイド（ゴム）が多く生産されており、ゴム合成活性が高いことを示す。
回収した反応後のゴム粒子のゴム合成活性を以下の方法により測定した。
まず、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５μＭ ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、１００μＭ １－１４Ｃイソペンテニル二リン酸（［１－１４Ｃ］ＩＰＰ）（比活性：５Ｃｉ／ｍｏｌ）、１０μＬ ゴム粒子溶液を混合した反応溶液（Ｔｏｔａｌ １００μＬ）を調製し、３０℃で１６時間反応させた。
反応後、飽和ＮａＣｌを２００μＬ加え、１ｍＬのジエチルエーテルでイソペンテノールなどを抽出した。次に、水相のポリプレニル二リン酸を１ｍＬの食塩水飽和ＢｕＯＨで抽出し、その後更に、水相の超長鎖ポリイソプレノイド（ゴム）を１ｍＬのトルエン／ヘキサン（１：１）で抽出し、放射活性を計測した。各層の放射活性は液体シンチレーションカウンターで１４Ｃのカウントを計測した。放射活性（ｄｐｍ）が高いほど、超長鎖ポリイソプレノイド（ゴム）が多く生産されており、ゴム合成活性が高いことを示す。
【0262】
〔合成した超長鎖ポリイソプレノイドの分子量分布測定〕
前記合成した超長鎖ポリイソプレノイド（ゴム）の分子量分布を下記の条件でＲａｄｉｏ ＨＰＬＣにより測定した。結果を図２に示す。
ＨＰＬＣシステム：ＧＩＬＳＯＮ社製
カラム：ＴＯＳＯＨ社製のＴＳＫｇｕａｒｄｃｏｌｕｍｎ ＭＰ（ＸＬ）、ＴＳＫｇｅｌ Ｍｕｌｔｉｐｏｒｅ ＨＸＬ－Ｍ（２本）
カラム温度：４０℃
溶媒：Ｍｅｒｃｋ社製のＴＨＦ
流速：１ｍｌ／分
ＵＶ検出：２１５ｎｍ
ＲＩ検出：Ｒａｍｏｎａ Ｓｔａｒ（Ｒａｙｔｅｓｔ ＧｍｂＨ）
前記合成した超長鎖ポリイソプレノイド（ゴム）の分子量分布を下記の条件でＲａｄｉｏ ＨＰＬＣにより測定した。結果を図２に示す。
ＨＰＬＣシステム：ＧＩＬＳＯＮ社製
カラム：ＴＯＳＯＨ社製のＴＳＫｇｕａｒｄｃｏｌｕｍｎ ＭＰ（ＸＬ）、ＴＳＫｇｅｌ Ｍｕｌｔｉｐｏｒｅ ＨＸＬ－Ｍ（２本）
カラム温度：４０℃
溶媒：Ｍｅｒｃｋ社製のＴＨＦ
流速：１ｍｌ／分
ＵＶ検出：２１５ｎｍ
ＲＩ検出：Ｒａｍｏｎａ Ｓｔａｒ（Ｒａｙｔｅｓｔ ＧｍｂＨ）
【0263】
（試験結果）
〔比較例１と実施例１〕
結果を図２、３に示した。図２、３より、比較例１では短・中鎖イソプレン鎖合成活性が高かった一方、実施例２では短・中鎖イソプレン鎖合成が約０．０１倍に減少していた。一見すると、長鎖イソプレン鎖合成活性は変わらないように見えるが、ＧＰＣによる分子量分布を確認したところ、生成物の分子量が高分子化していることが分かった。
〔比較例１と実施例１〕
結果を図２、３に示した。図２、３より、比較例１では短・中鎖イソプレン鎖合成活性が高かった一方、実施例２では短・中鎖イソプレン鎖合成が約０．０１倍に減少していた。一見すると、長鎖イソプレン鎖合成活性は変わらないように見えるが、ＧＰＣによる分子量分布を確認したところ、生成物の分子量が高分子化していることが分かった。
【0264】
〔比較例２と実施例２〕
結果を図４に示した。図４より、比較例２では短・中鎖イソプレン鎖合成活性が高かった一方、実施例２では短・中鎖イソプレン鎖合成が約０．３７倍に減少しており、代わりに長鎖イソプレン鎖合成活性が約３．１倍に増加していた。このことからＨｂＣＰＴ５においてもＣ末端をＨＲＴ１型にすることで生成物の鎖長の分子量を高分子化していることが分かった。
結果を図４に示した。図４より、比較例２では短・中鎖イソプレン鎖合成活性が高かった一方、実施例２では短・中鎖イソプレン鎖合成が約０．３７倍に減少しており、代わりに長鎖イソプレン鎖合成活性が約３．１倍に増加していた。このことからＨｂＣＰＴ５においてもＣ末端をＨＲＴ１型にすることで生成物の鎖長の分子量を高分子化していることが分かった。
【0265】
前記実験結果により、ゴム粒子上に存在しないシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列を、ゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列と同一に又は類似するように変異した変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質は、変異前のシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質よりも高分子量のポリイソプレノイドの製造が可能であり、変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質を用いたポリイソプレノイドの製造方法により、変異前のシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質を用いた場合よりも高分子量のポリイソプレノイドの製造が可能となることが分かった。
【0266】
従って、第１の本開示の変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターを植物に導入することにより、該ベクターに含まれる、第１の本開示の変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子が発現し、当該植物において、遺伝子組み換え前と比較して、高分子量のポリイソプレノイドの製造が可能となることも分かった。
【0267】
本開示（１）は、ゴム粒子上に存在しないシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列を、ゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列と同一に又は類似するように変異した変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質である。
【0268】
本開示（２）は、ゴム粒子上に存在しないシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列を、ゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列と同一の又は類似するアミノ酸配列に置換した本開示（１）記載の変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質である。
【0269】
本開示（３）は、前記ゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質が、Ｈｅｖｅａ属又はＴａｒａｘａｃｕｍ属に属する植物由来のゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質である本開示（１）又は（２）記載の変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質である。
【0270】
本開示（４）は、前記ゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質が、Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ又はＴａｒａｘａｃｕｍ ｋｏｋｓａｇｈｙｚ由来のゴム粒子上に存在するシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質である本開示（１）又は（２）記載の変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質である。
【0271】
本開示（５）は、前記ゴム粒子上に存在しないシス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質のＣ末端領域のアミノ酸配列が、該蛋白質のＣ末端から上流５０アミノ酸以内のＣ末端を含むアミノ酸配列である本開示（１）～（４）のいずれかに記載の変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質である。
【0272】
本開示（６）は、本開示（１）～（５）のいずれかに記載の変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質を用いることを特徴とするポリイソプレノイドの製造方法である。
【0273】
本開示（７）は、生体外で、本開示（１）～（５）のいずれかに記載の変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質を膜粒子に結合させる結合工程を含む本開示（６）記載のポリイソプレノイドの製造方法である。
【0274】
本開示（８）は、本開示（６）又は（７）に記載のポリイソプレノイドの製造方法によりポリイソプレノイドを製造する工程と、得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法である。
【0275】
本開示（９）は、本開示（６）又は（７）に記載のポリイソプレノイドの製造方法によりポリイソプレノイドを製造する工程と、得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法である。
【0276】
本開示（１０）は、本開示（１）～（５）のいずれかに記載の変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターである。
【0277】
本開示（１１）は、植物での蛋白質発現に用いられるプロモーター、及び、該プロモーターに機能的に連結された変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含む本開示（１０）記載のベクターである。
【0278】
本開示（１２）は、乳管特異的に遺伝子を発現させるプロモーター活性を有するプロモーター、及び、該プロモーターに機能的に連結された変異シス型プレニルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）ファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含む本開示（１０）記載のベクターである。
【0279】
本開示（１３）は、本開示（１０）～（１２）のいずれかに記載のベクターが導入された形質転換植物である。
【0280】
本開示（１４）は、本開示（１０）～（１２）のいずれかに記載のベクターを植物に導入することにより、該植物においてポリイソプレノイドを製造する方法である。
【0281】
本開示（１５）は、本開示（１０）～（１２）のいずれかに記載のベクターを植物に導入することにより得られる形質転換植物によりポリイソプレノイドを製造する工程、得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法である。
【0282】
本開示（１６）は、本開示（１０）～（１２）のいずれかに記載のベクターを植物に導入することにより得られる形質転換植物によりポリイソプレノイドを製造する工程、得られたポリイソプレノイドと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法である。
【0283】
（配列表フリーテキスト）
配列番号１：パラゴムノキ由来のＨＲＴ１のアミノ酸配列
配列番号２：パラゴムノキ由来のＨＲＴ１をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号３：シロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ５のアミノ酸配列
配列番号４：パラゴムノキ由来のＨｂＣＰＴ５のアミノ酸配列
配列番号５：シロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ５をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号６：パラゴムノキ由来のＨｂＣＰＴ５をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号７：ＡｔＣＰＴ５－Ｃ末端ＨＲＴ１のアミノ酸配列
配列番号８：ＨｂＣＰＴ５－Ｃ末端ＨＲＴ１のアミノ酸配列
配列番号９：ＡｔＣＰＴ５－Ｃ末端ＨＲＴ１をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１０：ＨｂＣＰＴ５－Ｃ末端ＨＲＴ１をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１１：パラゴムノキ由来のＨＲＢＰをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１２：パラゴムノキ由来のＨＲＢＰのアミノ酸配列
配列番号１３：パラゴムノキ由来のＲＥＦをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１４：パラゴムノキ由来のＲＥＦのアミノ酸配列
配列番号１５：プライマー１
配列番号１６：プライマー２
配列番号１７：プライマー３
配列番号１８：プライマー４
配列番号１９：プライマー５
配列番号２０：プライマー６
配列番号２１：プライマー７
配列番号２２：プライマー８
配列番号２３：プライマー９
配列番号２４：プライマー１０
配列番号２５：プライマー１１
配列番号２６：プライマー１２
配列番号２７：プライマー１３
配列番号２８：プライマー１４
配列番号２９：プライマー１５
配列番号３０：プライマー１６
配列番号３１：プライマー１７
配列番号３２：プライマー１８
配列番号３３：プライマー１９
配列番号３４：プライマー２０
配列番号３５：プライマー２１
配列番号３６：プライマー２２
配列番号３７：プライマー２３
配列番号３８：プライマー２４
配列番号３９：プライマー２５
配列番号４０：プライマー２６
配列番号４１：プライマー２７
配列番号４２：プライマー２８
配列番号１：パラゴムノキ由来のＨＲＴ１のアミノ酸配列
配列番号２：パラゴムノキ由来のＨＲＴ１をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号３：シロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ５のアミノ酸配列
配列番号４：パラゴムノキ由来のＨｂＣＰＴ５のアミノ酸配列
配列番号５：シロイヌナズナ由来のＡｔＣＰＴ５をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号６：パラゴムノキ由来のＨｂＣＰＴ５をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号７：ＡｔＣＰＴ５－Ｃ末端ＨＲＴ１のアミノ酸配列
配列番号８：ＨｂＣＰＴ５－Ｃ末端ＨＲＴ１のアミノ酸配列
配列番号９：ＡｔＣＰＴ５－Ｃ末端ＨＲＴ１をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１０：ＨｂＣＰＴ５－Ｃ末端ＨＲＴ１をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１１：パラゴムノキ由来のＨＲＢＰをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１２：パラゴムノキ由来のＨＲＢＰのアミノ酸配列
配列番号１３：パラゴムノキ由来のＲＥＦをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１４：パラゴムノキ由来のＲＥＦのアミノ酸配列
配列番号１５：プライマー１
配列番号１６：プライマー２
配列番号１７：プライマー３
配列番号１８：プライマー４
配列番号１９：プライマー５
配列番号２０：プライマー６
配列番号２１：プライマー７
配列番号２２：プライマー８
配列番号２３：プライマー９
配列番号２４：プライマー１０
配列番号２５：プライマー１１
配列番号２６：プライマー１２
配列番号２７：プライマー１３
配列番号２８：プライマー１４
配列番号２９：プライマー１５
配列番号３０：プライマー１６
配列番号３１：プライマー１７
配列番号３２：プライマー１８
配列番号３３：プライマー１９
配列番号３４：プライマー２０
配列番号３５：プライマー２１
配列番号３６：プライマー２２
配列番号３７：プライマー２３
配列番号３８：プライマー２４
配列番号３９：プライマー２５
配列番号４０：プライマー２６
配列番号４１：プライマー２７
配列番号４２：プライマー２８
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】