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特開2023-128819サツマイモ病原体検出用プライマーセット及びサツマイモ病原体の検出方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023128819
(43)【公開日】2023-09-14
(54)【発明の名称】サツマイモ病原体検出用プライマーセット及びサツマイモ病原体の検出方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6888 20180101AFI20230907BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20230907BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20230907BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6888 Z ZNA
C12Q1/686 Z
C12N15/11 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022033440
(22)【出願日】2022-03-04
(71)【出願人】
【識別番号】504224153
【氏名又は名称】国立大学法人 宮崎大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000729
【氏名又は名称】弁理士法人ユニアス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】竹下 稔
(72)【発明者】
【氏名】小倉 李来
(72)【発明者】
【氏名】白石 麗依奈
(72)【発明者】
【氏名】青山 実樹
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ07
4B063QQ10
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS16
4B063QS25
4B063QX01
(57)【要約】 （修正有）
【課題】サツマイモ病原ウイルスの検出に使用できるサツマイモ病原体検出用プライマーセットを提供する。
【解決手段】特定の配列からなる塩基配列及び別の特定の配列からなる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成される４種のプライマーセットから選択される少なくとも１種以上のサツマイモ病原体検出用プライマーセットである。
【選択図】図１
【解決手段】特定の配列からなる塩基配列及び別の特定の配列からなる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成される４種のプライマーセットから選択される少なくとも１種以上のサツマイモ病原体検出用プライマーセットである。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の（１）～（４）からなる群より選択される少なくとも１種以上のサツマイモ病原体検出用プライマーセット：
（１）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；
（２）配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；
（３）配列表の配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；及び
（４）配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット。
（１）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；
（２）配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；
（３）配列表の配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；及び
（４）配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット。
【請求項2】
サツマイモ由来試料の核酸を鋳型とし、請求項１に記載のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原体を検出する方法。
【請求項3】
配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原体検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のつる割病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の存在を検出する方法。
【請求項4】
配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原体検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中の乾腐病菌（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｂａｔａｔａｓ）の存在を検出する方法。
【請求項5】
配列表の配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原体検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中の基腐病菌（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｄｅｓｔｒｕｅｎｓ）の存在を検出する方法；
【請求項6】
配列表の配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原体検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のウイルスＳＰＬＶＣの存在を検出する方法。
【請求項7】
以下の（１）～（５）からなる群より選択される２種又は３種以上のプライマーセットを用いて、ＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原体の存在を検出する方法：
（１）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；
（２）配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；
（３）配列表の配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；
（４）配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；及び
（５）配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット。
（１）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；
（２）配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；
（３）配列表の配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；
（４）配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；及び
（５）配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット。
【請求項8】
請求項１に記載のいずれかのプライマーセットを含むサツマイモ病原体検出用キット。
【請求項9】
以下の（１）～（５）からなる群より選択されるプライマーセットのいずれか２種以上を含むサツマイモ病原体検出用キット：
（１）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；
（２）配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；
（３）配列表の配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；
（４）配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；及び
（５）配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット。
（１）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；
（２）配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；
（３）配列表の配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；
（４）配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；及び
（５）配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、サツマイモ病原体検出用プライマーセット及びサツマイモ病原体の検出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
自然界には、多種多様な植物ウイルスや糸状菌などの病原体が存在しており、我が国における主要農作物の１つであるサツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ（Ｌ．Ｌａｍ）にも甚大な被害を引き起こしている。
【0003】
これまでにサツマイモ斑紋モザイクウイルス（Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｆｅａｔｈｅｒｙ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ、（ＳＰＦＭＶ））、サツマイモ潜在ウイルス（Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓ、（ＳＰＬＶ））、サツマイモシンプトムレスウイルス（Ｓｗｅｅｔｐｏｔａｔｏ ｓｙｍｐｔｏｍｌｅｓｓ ｖｉｒｕｓ－１、（ＳＰＳＭＶ－１））、サツマイモ葉巻ウイルス（Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ ｖｉｒｕｓ、（ＳＰＬＣＶ））、Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｇ（ＳＰＶＧ）などが報告されている。さらに、諸外国では、これらの他に、Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ （ＳＰＣＳＶ）など多数の種類が報告されている（非特許文献１）。
【0004】
上記の他に、サツマイモに被害を及ぼす病原糸状菌として、基腐病菌（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｄｅｓｔｒｕｅｎｓ）、乾腐病菌（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｂａｔａｔａｓ）、又はつる割病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）などがある。
【0005】
これまでは、サツマイモに感染する個々の糸状菌やウイルスをそれぞれ検出する方法が提案されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】ＹＡＭＡＳＡＫＩ、Ｓら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．７５：１０２‐１０８（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
しかしながら、ウイルス種に感染しているサツマイモは、ほぼ他のウイルス種と重複感染していたり、糸状菌などの病原体にも同時に汚染されていたりする場合も多い。このような病原体を同時かつ高感度に検出することは、既存の方法では限度がある。
【0008】
本発明は、高精度でかつ迅速に、複数のサツマイモ病原ウイルス及び病原菌を同時に検出できる手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、上記課題を解決するために、サツマイモウイルスに共通する遺伝子情報、及び基腐病菌、乾腐病菌、及びつる割病菌等の共通遺伝子領域に着目し、プライマーを複数検討し、その中から、網羅的な検出率と特異性を比較して好適なプライマーセットを選抜し、さらに網羅的検出と特異性を向上させるための改良を行った。なお、ウイルスや糸状菌などの病原体を選択する際には、日本を中心とした中国、韓国などの近隣アジア諸国に加えて、北南米、アフリカ諸国由来の分離株も評価対象に加えた。この結果、複数種の病原体を効率的に正しく検出することのできるプライマーセットを確立すること、及び同種系統のウイルスや糸状菌の把握が可能なプライマーセットを確立することに成功し、本発明を完成させるに至った。
【0010】
すなわち、本発明は、下記に掲げるサツマイモ病原体検出用プライマーセットを提供する。
項１．以下の（１）～（４）からなる群より選択される少なくとも１種以上のサツマイモ病原体検出用プライマーセット：
（１）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；
（２）配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；
（３）配列表の配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；及び
（４）配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット。
項１．以下の（１）～（４）からなる群より選択される少なくとも１種以上のサツマイモ病原体検出用プライマーセット：
（１）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；
（２）配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；
（３）配列表の配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；及び
（４）配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット。
【0011】
本発明はまた、
項２．
サツマイモ由来試料の核酸を鋳型とし、項１に記載のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原体を検出する方法；
項３．
配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原体検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のつる割病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の存在を検出する方法；
項４．
配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原体検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中の乾腐病菌（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｂａｔａｔａｓ）の存在を検出する方法；
項５．
配列表の配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原体検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中の基腐病菌（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｄｅｓｔｒｕｅｎｓ）の存在を検出する方法；
項６．
配列表の配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原体検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のウイルスＳＰＬＣＶの存在を検出する方法；
に関する。
項７．
以下の（１）～（５）からなる群より選択される２種又は３種以上のプライマーセットを用いて、ＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原体の存在を検出する方法：
（１）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；
（２）配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；
（３）配列表の配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；
（４）配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；及び
（５）配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット。
項２．
サツマイモ由来試料の核酸を鋳型とし、項１に記載のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原体を検出する方法；
項３．
配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原体検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のつる割病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の存在を検出する方法；
項４．
配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原体検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中の乾腐病菌（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｂａｔａｔａｓ）の存在を検出する方法；
項５．
配列表の配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原体検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中の基腐病菌（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｄｅｓｔｒｕｅｎｓ）の存在を検出する方法；
項６．
配列表の配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原体検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のウイルスＳＰＬＣＶの存在を検出する方法；
に関する。
項７．
以下の（１）～（５）からなる群より選択される２種又は３種以上のプライマーセットを用いて、ＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原体の存在を検出する方法：
（１）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；
（２）配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；
（３）配列表の配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；
（４）配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；及び
（５）配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット。
【0012】
本発明はまた、項１に記載のプライマーセットを含むサツマイモ病原体検出用キットに関する。
本発明はまた、以下の（１）～（５）からなる群より選択されるプライマーセットのいずれか２種以上を含むサツマイモ病原体検出用キット：
（１）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；
（２）配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；
（３）配列表の配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；
（４）配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；及び
（５）配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット
に関する。
本発明はまた、以下の（１）～（５）からなる群より選択されるプライマーセットのいずれか２種以上を含むサツマイモ病原体検出用キット：
（１）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；
（２）配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；
（３）配列表の配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原菌検出用プライマーセット；
（４）配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット；及び
（５）配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドで構成されるサツマイモ病原ウイルス検出用プライマーセット
に関する。
【発明の効果】
【0013】
本発明のプライマーセットによれば、サツマイモ病原ウイルスや糸状菌などの病原体の複数種を同時に検知することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】実施例のプライマーセットを用いた場合のサツマイモ病原菌の遺伝子のＰＣＲ増幅産物の電気泳動図を示す。
【図2】実施例のプライマーセットを単独で用いた場合のサツマイモ病原体の遺伝子のＰＣＲ増幅産物の電気泳動図を示す。
【図3】実施例のプライマーセットを複数組み合わせて用いた場合のサツマイモ病原体の遺伝子のＰＣＲ増幅産物の電気泳動図を示す。
【発明を実施するための形態】
【0015】
［サツマイモ病原体検出用プライマーセット］
本発明のプライマーセットは、サツマイモ病原体遺伝子を効率よく増幅することのできるオリゴヌクレオチドの対から構成されるプライマーセットであって、サツマイモ病原ウイルス及び／又はサツマイモ病原糸状菌の検出を行うことができる。
本発明のプライマーセットは、サツマイモ病原体遺伝子を効率よく増幅することのできるオリゴヌクレオチドの対から構成されるプライマーセットであって、サツマイモ病原ウイルス及び／又はサツマイモ病原糸状菌の検出を行うことができる。
【0016】
本発明のサツマイモ病原体検出用プライマーセットを構成するそれぞれのプライマーは、オリゴヌクレオチドであり、フォワードプライマーとリバースプライマーとして設計された２０～２５塩基の連続したヌクレオチオドである。
【0017】
プライマーの設計にあたり、サツマイモに感染する糸状菌及びウイルス遺伝子配列情報を糸状菌種別及びウイルス種別に入手した。塩基配列情報は、刊行物から得ることもできる。本発明者らは、最も登録データ数が多い糸状菌のリボソームＤＮＡ(ｒＤＮＡ)、ヒストンＨ３(Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３)遺伝子、及び翻訳促進因子－１α(ＴＥＦ-１α)遺伝子、ウイルスの外被タンパク質（ＣＰ）遺伝子、及び複製関連タンパク質遺伝子等を利用した。その後、糸状菌別、ウイルス種別に両遺伝子領域の核酸配列の比較表を作成した。この時、農産物輸出入の現状を踏まえ、日本を中心とした中国、韓国などの近隣アジア諸国での病原体に加えて、北南米、アフリカ諸国由来の病原体も比較対象とした。塩基配列のアラインメントには、アラインメントソフト（例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ ｖｅｒ．１４）を利用することができる。
【0018】
特定した塩基配列に基づき、プライマーを設計した。プライマーの設計にあたっては、従来の縮重プライマーで、同種内の複数系統間の塩基置換に十分な対応ができなかった点を踏まえ、従来の欠点を除くように、オリゴヌクレオチド間の相補性を考慮した。
【0019】
具体的には、特に、つる割病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、乾腐病菌（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｂａｔａｔａｓ）、基腐病菌（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｄｅｓｔｒｕｅｎｓ）、ＳＰＦＭＶ、ＳＰＬＣＶ、及びＳＰＶＧに着目して、塩基置換対応型の縮重プライマーを作成する点に留意した。
【0020】
このような着目点に基づき、本発明のサツマイモ病原体検出用プライマーセットとして次のプライマーセットを作成することができた。
（プライマーセット：つる割病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の検出用）フォワード：５’－ＧＧＴＴＧＴＧＧＧＡＴＴＴＴＴＧＡＴＧＴＧＴＣＧＴＣ－３’（配列表の配列番号１）リバース：５’－ＡＴＣＴＣＧＴＣＣＡＡＡＴＣＧＣＡＡＣＣＴＧ－３’（配列表の配列番号２）
（プライマーセット：つる割病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の検出用）フォワード：５’－ＧＧＴＴＧＴＧＧＧＡＴＴＴＴＴＧＡＴＧＴＧＴＣＧＴＣ－３’（配列表の配列番号１）リバース：５’－ＡＴＣＴＣＧＴＣＣＡＡＡＴＣＧＣＡＡＣＣＴＧ－３’（配列表の配列番号２）
【0021】
（プライマーセット：乾腐病菌（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｂａｔａｔａｓ）の検出用）フォワード：５’－ＣＴＧＧＴＡＴＧＴＴＴＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＡＣＣＣＡＣ－３’（配列表の配列番号３）リバース：５’－ＣＴＴＣＴＧＴＧＧＧＧＴＴＧＴＴＡＧＴＧＡＡＴＧＴＴＣ－３’（配列表の配列番号４）
【0022】
（プライマーセット：基腐病菌（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｄｅｓｔｒｕｅｎｓ）の検出用）フォワード：５’－ＣＴＣＴＡＣＧＴＣＣＣＴＡＣＡＴＡＴＧＣＣＣＡＣ－３’（配列表の配列番号５）リバース：５’－ＧＡＴＡＡＧＣＧＧＧＣＴＧＡＴＡＡＧＣＧＣＡＣ－３’（配列表の配列番号６）
【0023】
（プライマーセット：ＳＰＬＣＶの検出用）フォワード：５’－ＣＴＣＴＣＣＴＧＧＡＴＴＧＣＡＧＡＲＧＡＡＧＡＹＷＧＴＧ－３’（配列表の配列番号７）リバース：５’－ＡＧＡＹＣＴＧＣＴＡＧＡＧＧＡＧＧＹＣＡＧＣＡＧ－３’（配列表の配列番号８）
【0024】
（プライマーセット：ＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＧの検出用）フォワード：５’－ＤＴＧＧＴＧＹＡＴＨＧＡＲＡＡＴＧＧＭＡＣＡＴＣ－３’（配列表の配列番号９）リバース：５’－ＴＧＣＡＣＡＣＣＣＣＴＣＡＴＷＣＣＹＡＡＧＡＧ－３’（配列表の配列番号１０）
【0025】
ここで、配列表の配列番号１～１０に示される塩基配列中、ＢはＣ、Ｇ、又はＴのいずれかを示し；Ｄは、Ａ、Ｇ又はＴのいずれかを示し；Ｋは、Ｇ又はＴのいずれかを示し；Ｍは、Ａ又はＣのいずれかを示し；Ｒは、Ａ又はＧのいずれかを示し；Ｖは、Ａ、Ｃ、又はＧのいずれかを示し；Ｗは、Ａ又はＴのいずれかを示し；Ｙは、Ｃ又はＴのいずれかを示し；Ｓは、Ｃ又はＧのいずれかを示す。（配列表ではすべて小文字で示される。）
【0026】
配列表の配列番号１～１０に示す配列のＧＣ含量、Ｔｍ値はそれぞれ、以下の通りである。
配列番号１：ＧＣ含量４６％、 Ｔｍ値６０
配列番号２：ＧＣ含量５０％、 Ｔｍ値５９
配列番号３：ＧＣ含量５２％、 Ｔｍ値６４
配列番号４：ＧＣ含量４４％、 Ｔｍ値６０
配列番号５：ＧＣ含量５４％、 Ｔｍ値６０
配列番号６：ＧＣ含量５７％、 Ｔｍ値６２
配列番号７：ＧＣ含量５０％、 Ｔｍ値６２
配列番号８：ＧＣ含量５８％、 Ｔｍ値６３
配列番号９：ＧＣ含量４２％、 Ｔｍ値５９
配列番号１０：ＧＣ含量５２％、 Ｔｍ値６０
配列番号１：ＧＣ含量４６％、 Ｔｍ値６０
配列番号２：ＧＣ含量５０％、 Ｔｍ値５９
配列番号３：ＧＣ含量５２％、 Ｔｍ値６４
配列番号４：ＧＣ含量４４％、 Ｔｍ値６０
配列番号５：ＧＣ含量５４％、 Ｔｍ値６０
配列番号６：ＧＣ含量５７％、 Ｔｍ値６２
配列番号７：ＧＣ含量５０％、 Ｔｍ値６２
配列番号８：ＧＣ含量５８％、 Ｔｍ値６３
配列番号９：ＧＣ含量４２％、 Ｔｍ値５９
配列番号１０：ＧＣ含量５２％、 Ｔｍ値６０
【0027】
上記プライマーセット５種は、それぞれで使用することで、所望のサツマイモ病原体である、つる割病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、乾腐病菌（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｂａｔａｔａｓ）、基腐病菌（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｄｅｓｔｒｕｅｎｓ）、又はウイルスを検出することができる。さらには、２種以上を混合して、マルチプレックスＰＣＲ法に利用することで、ＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＧ、ＳＰＬＣＶ、つる割病菌、基腐病菌、及び乾腐病菌という病原体を、複数の組み合わせで同時かつ特異的に検出することも可能となる。
【0028】
具体的には、上記プライマーセットを構成する各フォワードプライマー及びリバースプライマーは、その塩基配列のＢ、Ｄ、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｓの位置にそれぞれ指定された２種または３種の塩基を同時に含んでいる縮重プライマーであり、縮重プライマー中の各プライマーの割合はいかなる割合でもよいが、等当量ずつであることが好ましい。
【0029】
上記プライマーセットの各プライマーは、当業者に公知のオリゴヌクレオチドの合成法で作成することができる。例えば、ＤＮＡ自動合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製Ｍｏｄｅｌ ３９４など）を利用して合成することも可能である。
【0030】
本発明のプライマーセットを用いて試料中のサツマイモ病原体を検出する方法は、サツマイモ試料からＲＮＡを抽出し、逆転写反応により合成したｃＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーセットのいずれか又は２種以上又はそれらのすべてを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、遺伝子を増幅させる工程と、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析する工程を含む。
【0031】
サツマイモ試料としては、葉、茎、塊根、などのサツマイモの植物体のいずれの部位から調製しても良い。サツマイモ試料が、葉の場合、例えば、コルクポーラーでくり抜き、１個体から数１０ｍｇ（例えば５０ｍｇ程度）をサンプリングすることができる。この時、サンプリング部位は、葉脈間の葉肉部分で、斑点や葉巻などの症状を呈する部分がある場合には、そのような部位を選ぶことが好ましい。サツマイモ試料が、塊根の場合、カッターの刃などを使用し、表皮のみを数１０ｍｇ（例えば５０ｍｇ程度）切取って調製することができる。
【0032】
本発明のプライマーセットを用いたサツマイモ病原体の検出は、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスの両方をターゲットとすることもできる。そのため核酸抽出は、ＤＮＡ及びＲＮＡを同時に抽出しても良く、このような場合には、標準プロトコールを改変することで、ＤＮＡ及びＲＮＡの同時抽出を行う。
【0033】
サツマイモ試料の調製後、核酸を抽出する。核酸の抽出は、当業者に公知の方法で行うことができる他、植物組織からＲＮＡを抽出・精製するための市販のキットを使用することもできる。試料からＲＮＡを抽出し、ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する方法を採用することもできる。核酸の抽出には、限定はされないが、例えばＩＳＯＳＰＩＮ Ｐｌａｎｔ ＲＮＡ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ社製）のようなキットを使用することもできる。あるいは、まず、イソチオシアネート、フェノール及びクロロホルムを用いたＲＮＡ抽出法又は、市販のＲＮＡ抽出試薬（例えば、ＴＲＩＺＯＬ Ｒｅａｇｅｎｔキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製、１５５９６－０１８））を用いて、抽出し、その後、ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する。ここで、プライマーとしては市販のランダムプライマーを用い、ｄＮＴＰｓの存在下で、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。逆転写酵素としては、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ ＲＴ、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、等を用いることができる。
【0034】
次に、合成したｃＤＮＡを鋳型として、本発明のプライマーセットの１種又は２種以上を用いて、ＰＣＲ増幅反応を行う。ＰＣＲ増幅は本発明のプライマーセット又はそれらの組み合わせのいずれか又はすべてを用いることができる。それ以外の点については、常法に従って行うことができる。ＰＣＲは、ＰＣＲ法またはリアルタイムＰＣＲ法（ｑＰＣＲ）である。ＰＣＲでは、具体的には、鋳型ＤＮＡの変性、プライマーのアニーリング、及び耐熱性酵素を用いたプライマーの伸長反応を含むサイクルを繰り返すことにより、各外被タンパク質遺伝子領域の塩基配列を含む断片を増幅させる。ＰＣＲ反応液の組成、ＰＣＲ反応条件は、当業者に公知の物を適切に選択及び設定することができる。プライマーのＴｍに基づいて最適なＰＣＲ反応条件を選択する方法は、知られている。
【0035】
ＰＣＲ法の核酸増幅工程で使用されるＤＮＡポリメラーゼは特に限定されるものではないが、例えば、ＫＯＤ ＤＮＡ ポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡ ポリメラーゼ等のα型ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡ ポリメラーゼ等のＰｏｌ Ｉ型ＤＮＡポリメラーゼ等を用いることができる。特に限定はされないが、市販の、ＫＯＤ ＤＮＡ ポリメラーゼ（東洋紡製）、Ｐｆｕ ＤＮＡ ポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いることもできる。
【0036】
ＰＣＲの一連の操作は、市販のＰＣＲキットやＰＣＲ装置を利用して、その操作説明書に従って行うこともできる。例えば、ＰＣＲの反応液はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製、＃Ａ２５７４２）を用い、ＰＣＲ装置は７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いることもできる。
【0037】
ＰＣＲ反応は、鋳型の熱変性、プライマーのアニーリング、及び伸長反応を１サイクルとして、複数サイクル行うことで実施できる。通常の当業者に公知の条件のいずれを使用することもでき、限定はされないが、例えば、最初に９０℃～９６℃で２０秒～１分の熱変性、次いで、５０℃～５８℃程度の温度範囲で２０秒～１分程度のアニーリング、７０℃～７３℃で２０秒～１分程度の伸長反応を１サイクルとして、３０～４０サイクル程度を行うことが好ましい。特に、アニーリングの温度は、５４℃～６０℃程度がより好ましく、５６℃～５８℃程度がさらに好ましい。アニーリング温度を相対的に高く設定することで、非特異的増幅のリスクをより低くすることができる。
【0038】
また、ＰＣＲによって得られた増幅産物の検出は、特に限定されず、アガロースゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、ＲＦＬＰ法、インターカレーターを用いて増幅産物を検出する方法、増幅された産物の塩基配列に特異的に結合する核酸プローブを用いて増幅産物を検出する方法が挙げられる。より好ましくは核酸プローブを用いて増幅産物を検出する方法であり、当該核酸プローブとして、例えばＴａｑＭｑｎプローブや消光プローブ（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ Ｐｒｏｂｅ；ＱＰｒｏｂｅ）、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｅａｃｏｎが挙げられる。増幅及び検出におけるその他の条件は公知の核酸増幅及び核酸検出技術を考慮して適宜選択することができる。
【0039】
［サツマイモ病原体を検出する方法］
本発明はまた、本発明のプライマーセットの１種または複数種を用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原体を検出する方法に関する。
本発明はまた、本発明のプライマーセットの１種または複数種を用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析して、試料中のサツマイモ病原体を検出する方法に関する。
【0040】
本発明においては、配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成されるサツマイモ病原体検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析することで、試料中のサツマイモ病原体つる割病菌を特異的に検出することができる。
【0041】
本発明においては、配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成されるサツマイモ病原体検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析することで、試料中のサツマイモ病原体乾腐病菌を特異的に識別することができる。
【0042】
本発明においては、配列表の配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成されるサツマイモ病原体検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析することで、試料中のサツマイモ病原体基腐病菌を特異的に識別することができる。
【0043】
本発明においては、配列表の配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成されるサツマイモ病原体検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析することで、試料中のサツマイモ病原ウイルスであるＳＰＬＣＶを特異的に識別することができる。
【0044】
本発明においては、配列表の配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成されるサツマイモ病原体検出用プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析することで、試料中のサツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶ及びＳＰＶＧを網羅的に検出することができる。
【0045】
本発明においては、配列番号１、２、３、４、５、及び６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをサツマイモ病原体検出用プライマーとして用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析することで、試料中のサツマイモ病原体であるつる割病菌、乾腐病菌、及び基腐病菌の存在を一括かつ同時あるいは区別して検出することができる。
【0046】
本発明においては、配列番号３、４、５、６、７、８、９、及び１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをサツマイモ病原体検出用プライマーとして用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲにより得られた増幅断片を解析することで、試料中のサツマイモ病原体である乾腐病菌、基腐病菌、ＳＰＬＣＶ、及びＳＰＦＭＶの存在を一括かつ同時あるいは区別して検出することができる。
【0047】
本発明のこれらのプライマーセットは、マルチプレックスＲＴ－ＰＣＲに使用することも可能である。本発明のプライマーセットを用いて、マルチプレックスＲＴ－ＰＣＲ（リバーストランスクリプターゼＰＣＲ）を行うことで、病原体を直接識別することもでき、省力かつ迅速に検定することも可能となる。
【0048】
つる割病菌、乾腐病菌、及び基腐病菌を同時に検出する場合には、例えば、モル濃度比で、配列番号１及び２を１とした場合に、配列番号３及び４を２～８倍程度とし、配列番号５及び６を３～１２倍程度として用いることが望ましい。
【0049】
乾腐病菌、基腐病菌、ＳＰＬＣＶ、及びＳＰＦＭＶを同時に検出する場合には、例えば、モル濃度比で、配列番号３及び４を１とした場合に、配列番号５及び６を０．２～１倍程度とし、配列番号７及び８を１．５～５倍程度とし、配列番号９及び１０を１．５～５倍程度として用いることが望ましい。
【0050】
限定はされないが、本発明において、これらのオリゴヌクレオチドは、それぞれ、好ましくは、０．１μＭ～５０μＭ、より好ましくは、０．３μＭ～１５μＭの範囲、さらに好ましくは、０．５～１０μＭの範囲で用いられ得る。
【0051】
限定されない１つの例としては、つる割病菌、乾腐病菌、及び基腐病菌を同時に検出する場合に、モル濃度で、配列番号１及び２を０．５μＭ、配列番号３及び４を３μＭ、配列番号５及び６を５μＭとして用いることが望ましい。
【0052】
限定されない１つの例としては、乾腐病菌、基腐病菌、ＳＰＬＣＶ、及びＳＰＦＭＶを同時に検出する場合に、モル濃度で、配列番号３及び４を２μＭ、配列番号５及び６を１μＭ、配列番号７及び８を５μＭ、配列番号９及び１０を５μＭとして用いることが望ましい。
【0053】
［キット］
本発明のプライマーセットは、キット化することができる。本発明のキットは、［サツマイモ病原体検出用プライマーセット］の項で述べたプライマーセットのうち、少なくとも１つ又は２つ以上を含み、検出すべき対象ウイルスによって、適宜変更することができる。さらに、任意に、核酸増幅の検出を行う際に必要な各種の試薬類を一緒に含ませることもできる。具体的には、本発明のプライマー、核酸合成の基質となる４種類のｄＮＴＰ、鋳型依存性核酸合成酵素、緩衝液や塩類、又は指示書をキット化して提供することもできる。このようなキットは、例えば、サツマイモの苗が病原体に感染しているか否かを検定するのに好都合に使用することができる。
本発明のプライマーセットは、キット化することができる。本発明のキットは、［サツマイモ病原体検出用プライマーセット］の項で述べたプライマーセットのうち、少なくとも１つ又は２つ以上を含み、検出すべき対象ウイルスによって、適宜変更することができる。さらに、任意に、核酸増幅の検出を行う際に必要な各種の試薬類を一緒に含ませることもできる。具体的には、本発明のプライマー、核酸合成の基質となる４種類のｄＮＴＰ、鋳型依存性核酸合成酵素、緩衝液や塩類、又は指示書をキット化して提供することもできる。このようなキットは、例えば、サツマイモの苗が病原体に感染しているか否かを検定するのに好都合に使用することができる。
【実施例0054】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。また、実施例において、各配列番号でしめされるすべての縮重プライマーにおいて、同一配列番号内での各プライマーの割合は、等当量ずつであった。
【0055】
（実施例１）プライマーセットの設計
ＮＣＢＩサイトにて、糸状菌遺伝子のヌクレオチド配列の情報を収集した。それらのヌクレオチド配列について、ＧＥＮＥＴＹＸ ｖｅｒ．１４を使用して、マルチプルアライメントを作成した。この比較によれば、リボソームＤＮＡ(ｒＤＮＡ)、ヒストンＨ３(Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３)遺伝子、及び翻訳促進因子－１α(ＴＥＦ-１α)遺伝子領域の配列が保存されていた。従って、この保存性は異なる菌種を同時に検出することに利用できると考えた。特に、リボソームＤＮＡ(ｒＤＮＡ)、ヒストンＨ３(Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３)遺伝子、及び翻訳促進因子－１α(ＴＥＦ-１α)遺伝子に相補的であるフォワードプライマー、及びリバースプライマーを、候補プライマーとして複数設計した。
ＮＣＢＩサイトにて、糸状菌遺伝子のヌクレオチド配列の情報を収集した。それらのヌクレオチド配列について、ＧＥＮＥＴＹＸ ｖｅｒ．１４を使用して、マルチプルアライメントを作成した。この比較によれば、リボソームＤＮＡ(ｒＤＮＡ)、ヒストンＨ３(Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３)遺伝子、及び翻訳促進因子－１α(ＴＥＦ-１α)遺伝子領域の配列が保存されていた。従って、この保存性は異なる菌種を同時に検出することに利用できると考えた。特に、リボソームＤＮＡ(ｒＤＮＡ)、ヒストンＨ３(Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３)遺伝子、及び翻訳促進因子－１α(ＴＥＦ-１α)遺伝子に相補的であるフォワードプライマー、及びリバースプライマーを、候補プライマーとして複数設計した。
【0056】
サツマイモ試料としては、葉と塊根を用いた。サツマイモ試料が、葉の場合、コルクポーラーでくり抜き、１個体から５０ｍｇをサンプリングした。サンプリング部位は、葉脈間の葉肉部分で、斑点や葉巻などの症状を呈する部分とした。サツマイモ試料が、塊根の場合、カッターの刃を使用し、表皮のみを５０ｍｇ切取って調製した。
【0057】
菌株からの核酸抽出、ＲＴ－ＰＣＲ増幅の手法及び条件は、以下の手順で行った。
【0058】
核酸抽出は、ＩＳＯＳＰＩＮ ＰＬＡＮＴ ＲＮＡ ｋｉｔ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ）あるいはＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いた。ここで、プライマーセットは、各病原菌の遺伝子をターゲットとして、ＤＮＡもしくはＤＮＡ及びＲＮＡ両核酸を抽出することとした。
【0059】
ＰＣＲ増幅は、ＰｒｉｍｅＴａｑ（Ｇｅｎｅｔｂｉｏ）を用いて行った。ＰＣＲ反応液組成及び条件は下記のとおりである。反応後、ＰＣＲ増幅産物３μｌを２．０％アガロースゲル電気泳動にて解析した。
【0060】
（ＰＣＲ反応液組成：１反応つき１０μｌ）核酸 １μｌ各プライマー １．０μｌ （各５ｐｍｏｌ）ＰｒｉｍｅＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２μｌ１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ Ｍｉｘｔｕｒｅ １μｌ１０× Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ５μｌＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ２Ｏ ｕｐ ｔｏ ５０μｌ
【0061】
（ＰＣＲ条件）
ＰＣＲ反応は、９５℃で５分の熱変性を1サイクル、次いで９５℃で３０秒の熱変性、６０℃で３０秒のアニーリング、７２℃で２０秒の伸長を１サイクルとして計３５サイクル、その後、７２℃で５分の最終伸長反応を行った。
ＰＣＲ反応は、９５℃で５分の熱変性を1サイクル、次いで９５℃で３０秒の熱変性、６０℃で３０秒のアニーリング、７２℃で２０秒の伸長を１サイクルとして計３５サイクル、その後、７２℃で５分の最終伸長反応を行った。
【0062】
ＰＣＲ解析結果から、下記表１に示す配列（各欄の上の配列はフォワードプライマー、下の配列はリバースプライマー）を有するプライマーセットを最終的に決定し、それらのプライマーセットから構成されるプライマーセットを設定した。
【0063】
【表1】
【0064】
（実施例２）プライマーセットの設計
ＮＣＢＩサイトにて、ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列の情報を収集した（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／）。それらのヌクレオチド配列について、ＧＥＮＥＴＹＸ ｖｅｒ．１４を使用して、マルチプルアライメントを作成した。この比較によれば、外被タンパク質遺伝子及び複製関連タンパク質遺伝子領域の配列が保存されていた。従って、この保存性は異なる株を同時に検出することに利用できると考えた。特に、ＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＧ、及びＳＰＬＣＶのウイルスに着目し、外被タンパク質遺伝子領域の一部及び複製関連タンパク質遺伝子に相補的であるフォワードプライマー、及びリバースプライマーを、候補プライマーとして複数設計した。
ＮＣＢＩサイトにて、ウイルス遺伝子のヌクレオチド配列の情報を収集した（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／）。それらのヌクレオチド配列について、ＧＥＮＥＴＹＸ ｖｅｒ．１４を使用して、マルチプルアライメントを作成した。この比較によれば、外被タンパク質遺伝子及び複製関連タンパク質遺伝子領域の配列が保存されていた。従って、この保存性は異なる株を同時に検出することに利用できると考えた。特に、ＳＰＦＭＶ、ＳＰＶＧ、及びＳＰＬＣＶのウイルスに着目し、外被タンパク質遺伝子領域の一部及び複製関連タンパク質遺伝子に相補的であるフォワードプライマー、及びリバースプライマーを、候補プライマーとして複数設計した。
【0065】
これまでに既知のサツマイモ病原ウイルスＳＰＦＭＶ－Ｓ株、ＳＰＦＭＶ－Ｏ株、ＳＰＦＭＶ－Ｂｕｎｇｏ株について、上記で設計した複数の候補プライマーを用いてウイルスの存在を検出し、プライマーを一次選抜した。さらに、標的とする３種ウイルスへの混合感染株を用いてさらにプライマーを改良した。
【0066】
上記サツマイモ病原ウイルス株は、日本ＳＰＦＭＶ－Ｓ株、日本ＳＰＦＭＶ－Ｏ株、日本ＳＰＦＭＶ－Ｂｕｎｇｏ株で構成されていた。
【0067】
サツマイモ試料としては、葉と塊根を用いた。サツマイモ試料が、葉の場合、コルクボーラーでくり抜き、１個体から５０ｍｇをサンプリングした。サンプリング部位は、葉脈間の葉肉部分で、斑点や葉巻などの症状を呈する部分とした。サツマイモ試料が、塊根の場合、カッターの刃を使用し、表皮のみを５０ｍｇ切取って調製した。
【0068】
ウイルス株からの核酸抽出、ＲＴ－ＰＣＲ増幅の手法及び条件は、以下の手順で行った。
【0069】
ウイルス株からの核酸抽出は、ＩＳＯＳＰＩＮ Ｐｌａｎｔ ＲＮＡ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ）を用いた。ここで、プライマーセットはＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスの両方をターゲットとして、両核酸を抽出することとした。そこで、標準プロトコールのＰＴ Ｗａｓｈ １ ＢｕｆｆｅｒとＤＮａｓｅ Ｉ 溶液による処理を省くことで、両核酸の同時抽出を行った。サンプルの破砕には、Ｍｉｃｒｏ ＳｍａｓｈＴＭ ＭＳ－１００Ｒ（トミー精工）を用い、４２００ｒｐｍで１６０秒、ステンレスビーズφ４．８を１サンプルにつき１個用いた条件下で実施した。
【0070】
逆転写反応及びＰＣＲ増幅は、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ ＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ （Ｔａｋａｒａ、 Ｊａｐａｎ）を用いて行った。ＰＣＲ反応液組成及び条件は下記のとおりである。反応後、ＰＣＲ増幅産物３μｌを２．０％アガロースゲル電気泳動にて解析した。
【0071】
（１－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ反応液組成：１反応つき１０μｌ）核酸 １μｌ各プライマー ０．２μｌ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ ＲＴ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ １μｌＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ｆｏｒ １Ｓｔｅｐ ＲＴ-ＰＣＲ ４．０μｌ２×１ ｓｔｅｐ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｂｕｆｆｅｒ ２５μｌＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ２Ｏ ｕｐ ｔｏ ５０μｌ。
【0072】
（１－ｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ条件）
ｃＤＮＡ合成は、４５℃で１０分、９８℃で２分間インキュベートし、続くＰＣＲ反応は、９８℃で１０秒の熱変性、５６℃で１０秒のアニーリング、６８℃で１０秒の伸長を１サイクルとして計４０サイクルを行った。
ｃＤＮＡ合成は、４５℃で１０分、９８℃で２分間インキュベートし、続くＰＣＲ反応は、９８℃で１０秒の熱変性、５６℃で１０秒のアニーリング、６８℃で１０秒の伸長を１サイクルとして計４０サイクルを行った。
【0073】
ＰＣＲ解析結果から、下記表２に示す配列（各欄の上の配列はフォワードプライマー、下の配列はリバースプライマー）を有するプライマーセットを決定し、それらのプライマーセットから構成されるプライマーセットを設定した。
【0074】
【表2】
【0075】
（実施例３）プライマーセットによるサツマイモ病原菌の検出
実施例１で確立したプライマーセットによるサツマイモ病原菌の検出を、サツマイモ病原菌つる割病菌、乾腐病菌、及び基腐病菌を用いて調べた。菌株の核酸の抽出は、実施例１と同様である。ＰＣＲ反応液組成及び条件は以下のとおりである。
実施例１で確立したプライマーセットによるサツマイモ病原菌の検出を、サツマイモ病原菌つる割病菌、乾腐病菌、及び基腐病菌を用いて調べた。菌株の核酸の抽出は、実施例１と同様である。ＰＣＲ反応液組成及び条件は以下のとおりである。
【0076】
プライマーは、以下の表３に示す量（ｐｍｏｌ／μＬ）を反応液１０μＬあたり１．０μＬ使用した。さらに、マルチプレックスＰＣＲを試みた。
【表3】
【0077】
鋳型核酸濃度
レーン１（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）：５．３（ｎｇ／μｌ）
レーン２（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｂａｔａｔａｓ）：３．２（ｎｇ／μｌ）
レーン３（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｄｅｓｔｒｕｅｎｓ）：２．７（ｎｇ／μｌ）
レーン４～７（全菌種のＭｉｘ）：８０．４（ｎｇ／μｌ）
レーン１（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）：５．３（ｎｇ／μｌ）
レーン２（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｂａｔａｔａｓ）：３．２（ｎｇ／μｌ）
レーン３（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｄｅｓｔｒｕｅｎｓ）：２．７（ｎｇ／μｌ）
レーン４～７（全菌種のＭｉｘ）：８０．４（ｎｇ／μｌ）
【0078】
ＰＣＲ反応は、９５℃で５分の熱変性を1サイクル、次いで９５℃で３０秒の熱変性、６０℃で３０秒のアニーリング、７２℃で２０秒の伸長を１サイクルとして計３５サイクル、その後、７２℃で５分の最終伸長反応を行った。
【0079】
アガロースゲルで電気泳動を行い、ＰＣＲ増幅産物を検証した。
その結果を図１に示す。
なお、図中、レーンは下記の通りである。
Ｍ：ＤＮＡマーカー
１：つる割病菌用の配列番号１及び２のプライマーを使用
２：乾腐病菌用の配列番号３及び４のプライマーを使用
３：基腐病菌用の配列番号５及び６のプライマーを使用
４：配列番号１、２、５、及び６のプライマーを使用
５：配列番号１、２、３、及び４のプライマーを使用
６：配列番号３、４、５、及び６のプライマーを使用
７：配列番号１～６のすべてのプライマーを使用。
その結果を図１に示す。
なお、図中、レーンは下記の通りである。
Ｍ：ＤＮＡマーカー
１：つる割病菌用の配列番号１及び２のプライマーを使用
２：乾腐病菌用の配列番号３及び４のプライマーを使用
３：基腐病菌用の配列番号５及び６のプライマーを使用
４：配列番号１、２、５、及び６のプライマーを使用
５：配列番号１、２、３、及び４のプライマーを使用
６：配列番号３、４、５、及び６のプライマーを使用
７：配列番号１～６のすべてのプライマーを使用。
【0080】
いずれも検証できるレベルではあり、単独のプライマーセットを使用した場合のみならず、複数のプライマーセットを同時に使用する条件下で、２種又は３種の病原菌を明確に判定することができ、良好な結果を示した。
【0081】
（実施例４）プライマーセットによる、サツマイモ病原体の検出
実施例１及び２で確立したプライマーセットによるサツマイモ病原体の検出を、行った。菌株の核酸の抽出は、実施例１と同様である。ＰＣＲ反応液組成及び条件は以下のとおりである。
実施例１及び２で確立したプライマーセットによるサツマイモ病原体の検出を、行った。菌株の核酸の抽出は、実施例１と同様である。ＰＣＲ反応液組成及び条件は以下のとおりである。
【0082】
プライマーは、以下の表４及び表５に示す量（ｐｍｏｌ／μＬ）を反応液１０μＬあたり０．２μＬ使用した。さらに、マルチプレックスＰＣＲを試みた。
【0083】
【表4】
【0084】
【表5】
【0085】
鋳型核酸濃度
図２レーン１（ＳＰＬＣＶ）：２２６．０（ｎｇ／μｌ）
図２レーン２（ＳＰＦＭＶ－Ｏ）：５９５．０（ｎｇ／μｌ）
図２レーン３（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｂａｔａｔａｓ）：３３．９（ｎｇ／μｌ）
図２レーン４（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｄｅｓｔｒｕｅｎｓ）：３０．８（ｎｇ／μｌ）
図３レーン１～４（4種病原体のＭｉｘ）：１７９．３（ｎｇ／μｌ）
図２レーン１（ＳＰＬＣＶ）：２２６．０（ｎｇ／μｌ）
図２レーン２（ＳＰＦＭＶ－Ｏ）：５９５．０（ｎｇ／μｌ）
図２レーン３（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｂａｔａｔａｓ）：３３．９（ｎｇ／μｌ）
図２レーン４（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｄｅｓｔｒｕｅｎｓ）：３０．８（ｎｇ／μｌ）
図３レーン１～４（4種病原体のＭｉｘ）：１７９．３（ｎｇ／μｌ）
【0086】
ＰＣＲ反応は、ｃＤＮＡ合成は、４５℃で１０分、９４℃で２分間インキュベートし、続くＰＣＲ反応は、９８℃で１０秒の熱変性、５６℃で１５秒のアニーリング、６８℃で１０秒の伸長を１サイクルとして計４０サイクルを行った。
【0087】
【0088】
図２
Ｍ：ＤＮＡマーカー
１：ＳＰＬＣＶ用の配列番号７及び８のプライマーを使用
２：ＳＰＦＭＶ及びＳＰＶＧ用の配列番号９及び１０のプライマーを使用
３：乾腐病菌用の配列番号３及び４のプライマーを使用
４：基腐病菌用の配列番号５及び６のプライマーを使用
Ｍ：ＤＮＡマーカー
１：ＳＰＬＣＶ用の配列番号７及び８のプライマーを使用
２：ＳＰＦＭＶ及びＳＰＶＧ用の配列番号９及び１０のプライマーを使用
３：乾腐病菌用の配列番号３及び４のプライマーを使用
４：基腐病菌用の配列番号５及び６のプライマーを使用
【0089】
【0090】
いずれも検証できるレベルであり、単独のプライマーセットを使用した場合のみならず、複数のプライマーセットを同時に使用する条件下で、４種の病原体を明確に判定することができ、良好な結果を示した。
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】