特開 2023-130972 黄ぐすみ抑制方法、黄ぐすみ抑制剤のスクリーニング方法、及び黄ぐすみ感受性の評価方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023130972

(43)【公開日】2023-09-21

(54)【発明の名称】黄ぐすみ抑制方法、黄ぐすみ抑制剤のスクリーニング方法、及び黄ぐすみ感受性の評価方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/50 20060101AFI20230913BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20230913BHJP

【ＦＩ】

G01N33/50 Z

G01N33/15 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】11

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022035595

(22)【出願日】2022-03-08

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】000001959

【氏名又は名称】株式会社 資生堂

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100196977

【弁理士】

【氏名又は名称】上原 路子

(72)【発明者】

【氏名】飛田 亮三

(72)【発明者】

【氏名】堀場 聡

【テーマコード（参考）】

2G045

【Ｆターム（参考）】

2G045AA40

2G045CB09

2G045DA20

2G045FB02

2G045FB03

(57)【要約】

【課題】新たな黄ぐすみ抑制方法、黄ぐすみ抑制剤のスクリーニング方法、及び黄ぐすみ感受性の評価方法を提供する。
【解決手段】ＰＲＤＸ４を増加させることにより黄ぐすみを抑制するための方法、ＰＲＤＸ４を指標とする黄ぐすみ抑制剤のスクリーニング方法、及び黄ぐすみ感受性の評価方法を提供する。
【選択図】図５

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象の黄ぐすみを抑制するための美容目的の方法であって、
対象のＰＲＤＸ４の発現又は活性を増加することを含む、前記方法。

【請求項2】

黄ぐすみ抑制剤のスクリーニング方法であって、
皮膚試料におけるＰＲＤＸ４の発現又は活性を指標とする、前記方法。

【請求項3】

黄ぐすみ抑制剤のスクリーニング方法であって、
皮膚試料に候補薬剤を施すこと；
候補薬剤を施した前後の皮膚試料におけるＰＲＤＸ４の発現又は活性を測定すること；及び
前記候補薬剤を施した皮膚試料におけるＰＲＤＸ４の発現又は活性が該薬剤を施す前と比較して増加する場合、前記薬剤に黄ぐすみ抑制剤作用があると評価すること；
を含む、前記方法。

【請求項4】

前記黄ぐすみの抑制は、ＰＲＤＸ４によりコラーゲンのカルボニル化を阻害することを介して達成される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

黄ぐすみ感受性を評価するための美容目的の方法であって、
対象から採取された皮膚試料におけるＰＲＤＸ４の発現又は活性の測定値を指標として該対象の皮膚の黄ぐすみ感受性を評価することを含む、前記方法。

【請求項6】

前記測定値が低いほど前記対象の皮膚の黄ぐすみ感受性が高いと評価する、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記黄ぐすみはコラーゲンのカルボニル化に起因する、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

ＰＲＤＸ４の発現又は活性はＭ２マクロファージの誘導又は活性化により促進される、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

黄ぐすみ感受性を評価するシステムであって、
あらかじめ設定したＰＲＤＸ４の発現又は活性の基準値に関するデータを記憶するデータベース部と、
対象のＰＲＤＸ４の発現又は活性に関するデータを入力するデータ入力部と、
前記データベース部で記憶されているＰＲＤＸ４の発現又は活性の基準値を参照して、前記データ入力部に入力された対象のＰＲＤＸ４の発現又は活性に関するデータと比較して計算する、計算部と、
前記計算部による計算結果に基づいて黄ぐすみ感受性を評価する評価部と、
前記評価部により評価した結果を表示する表示部を有する、前記システム。

【請求項10】

前記表示部は、前記評価部により対象の黄ぐすみ感受性が高いと評価された場合、黄ぐすみ抑制のための提案を更に表示する、請求項９に記載のシステム。

【請求項11】

前記提案は、ＰＲＤＸ４の発現又は活性を増加させることである、請求項１０に記載のシステム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＰＲＤＸ４を増加させることにより黄ぐすみを抑制するための方法、ＰＲＤＸ４を指標とする黄ぐすみ抑制剤のスクリーニング方法、及び黄ぐすみ感受性の評価方法に関する。

【背景技術】

【0002】

皮膚の黄色化、いわゆる黄ぐすみは、紫外線や加齢に伴い顕著となり、これは皮膚タンパク質の糖化、カルボニル化、ニトロ化等に起因することが報告されている（特許文献１～６、非特許文献１）。

【0003】

黄ぐすみの程度は、例えば、色相、明度、彩度、ニトロ化タンパク、カルボニル化タンパク、外観目視検査、特定の評価装置等によって評価することが可能である（特許文献１～６、非特許文献１）。特許文献１は、グルコシノレートを含むカルボニル化抑制剤を有効成分とする黄ぐすみ抑制剤を開示する。特許文献２はヘスペレチン及び／又はグリコシルヘスペレチンを有効成分とする肌の黄ぐすみを低減するための皮膚外用剤を開示する。特許文献３は、リンゴポリフェノールを有効成分とする黄ぐすみ発生抑制剤を開示する。特許文献４は、ハイビスカス抽出物を含有する黄ぐすみ抑制剤を開示する。特許文献５は、ニトロ化タンパクを指標とする黄ぐすみ度の測定・判定法及び黄ぐすみ改善素材のスクリーニング法を開示する。特許文献６は、黄ぐすみを含むいきいきとした顔の度合いを推定する方法を開示する。特許文献７は、ショウガ抽出物等を含む顔色改善剤を開示する。更なる黄ぐすみ抑制剤及びそのスクリーニング方法の探索が求められる。

【0004】

また、紫外線や加齢といった要因によりどの程度黄ぐすみが起こりやすいかという感受性については、現在の肌色からは予測できないことが多い。このような傾向は、個人により異なり、客観的に判断する術も乏しいのが現状であるため、黄ぐすみを防ぐための対策を事前に講じることは困難である。事前に黄ぐすみ感受性が評価できれば、黄ぐすみの予防が行いやすくなる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特許第６９０２３９２号公報

【特許文献2】特開２０２１－７３３２０号公報

【特許文献3】特許第６６８１０６４号公報

【特許文献4】特開２０２１－１４７３３５号公報

【特許文献5】特許第６４７４７５２号公報

【特許文献6】特開２０２１－１２９９７７号公報

【特許文献7】特許第３１８３７４１号公報

【特許文献8】国際公開２０２０／２１３７４３号

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】資生堂ニュースリリース「資生堂、肌の「黄ぐすみ」の新メカニズムを解明」 2010年8月31日 https://corp.shiseido.com/jp/newsimg/archive/00000000001187/1187_y7i15_jp.pdf

【非特許文献2】岩井ら、「角層タンパク質のカルボニル化による肌透明感の低下」J. Soc. Cosmet. Chem. Jpn. 42 (1) 16-21 (2008)

【非特許文献3】舛田ら、「化粧品および肌色の計測技術」 色材, 76[2],78-83 (2003)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、新たな黄ぐすみ抑制方法、黄ぐすみ抑制剤のスクリーニング方法、及び黄ぐすみ感受性の評価方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らによる鋭意研究の結果、黄ぐすみ感受性はＰＲＤＸ４に関与し、黄ぐすみはＰＲＤＸ４により抑制できることが新たに発見された。

【0009】

ＰＲＤＸ４（Peroxiredoxin 4、ペルオキシレドキシン４）とは、抗酸化酵素のペルオキシレドキシンファミリーのメンバーであり、癌、動脈硬化、糖尿病などに対する抑制効果、創傷治療促進効果等が報告されている。しかしながら、ＰＲＤＸ４が皮膚の黄ぐすみと関連することは知られていなかった。

【0010】

本願は以下の発明を提供する。
（１） 対象の黄ぐすみを抑制するための美容目的の方法であって、
対象のＰＲＤＸ４の発現又は活性を増加することを含む、前記方法。
（２） 黄ぐすみ抑制剤のスクリーニング方法であって、
皮膚試料におけるＰＲＤＸ４の発現又は活性を指標とする、前記方法。
（３） 黄ぐすみ抑制剤のスクリーニング方法であって、
皮膚試料に候補薬剤を施すこと；
候補薬剤を施した前後の皮膚試料におけるＰＲＤＸ４の発現又は活性を測定すること；及び
前記候補薬剤を施した皮膚試料におけるＰＲＤＸ４の発現又は活性が該薬剤を施す前と比較して増加する場合、前記薬剤に黄ぐすみ抑制剤作用があると評価すること；
を含む、前記方法。
（４） 前記黄ぐすみの抑制は、ＰＲＤＸ４によりコラーゲンのカルボニル化を阻害することを介して達成される、（１）～（３）のいずれか１項に記載の方法。
（５） 黄ぐすみ感受性を評価するための美容目的の方法であって、
対象から採取された皮膚試料におけるＰＲＤＸ４の発現又は活性の測定値を指標として該対象の皮膚の黄ぐすみ感受性を評価することを含む、前記方法。
（６） 前記測定値が低いほど前記対象の皮膚の黄ぐすみ感受性が高いと評価する、（５）に記載の方法。
（７） 前記黄ぐすみはコラーゲンのカルボニル化に起因する、（１）～（６）のいずれか１項に記載の方法。
（８） ＰＲＤＸ４の発現又は活性はＭ２マクロファージの誘導又は活性化により促進される、（１）～（７）のいずれか１項に記載の方法。
（９）黄ぐすみ感受性を評価するシステムであって、
あらかじめ設定したＰＲＤＸ４の発現又は活性の基準値に関するデータを記憶するデータベース部と、
対象のＰＲＤＸ４の発現又は活性に関するデータを入力するデータ入力部と、
前記データベース部で記憶されているＰＲＤＸ４の発現又は活性の基準値を参照して、前記データ入力部に入力された対象のＰＲＤＸ４の発現又は活性に関するデータと比較して計算する、計算部と、
前記計算部による計算結果に基づいて黄ぐすみ感受性を評価する評価部と、
前記評価部により評価した結果を表示する表示部を有する、前記システム。
（１０）前記表示部は、前記評価部により対象の黄ぐすみ感受性が高いと評価された場合、黄ぐすみ抑制のための提案を更に表示する、（９）に記載のシステム。
（１１）前記提案は、ＰＲＤＸ４の発現又は活性を増加させることである、（１０）に記載のシステム。

【発明の効果】

【0011】

本発明により、対象のＰＲＤＸ４の発現または活性に基づいて、簡便かつ客観的に黄ぐすみ感受性が評価することが可能になる。また、ＰＲＤＸ４の発現または活性を増加することによって黄ぐすみを抑制することができる。更に、ＰＲＤＸ４を指標とすることで黄ぐすみを抑制するための化合物や組成物を探索するスクリーニングを行うことが可能になる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】図１は、実験３の結果であり、Ｍ１又はＭ２マクロファージ培養上清液を添加した場合の線維芽細胞におけるＰＲＤＸ４発現量（ｌｏｇ２（ＣＰＭ））を示す。

【図2】図２は、実験４の結果であり、線維芽細胞にＭ１又は及びＭ２マクロファージ培養上清液を加えた場合のＰＲＤＸ４の免疫染色像を示す。

【図3】図３は、図２の免疫染色像に対し画像解析ソフトImageJを用いて細胞あたりのＰＲＤＸ４の輝度値（ＰＲＤＸ４／細胞）を定量した結果を示す。**p < 0.01, *p < 0.05 (Tukey-Kramer検定)

【図4】図４は、実験５の結果であり、アクロレインによりカルボニル化を誘導させたコラーゲンスポンジの黄色化をＰＲＤＸ４が抑制する様子を示す。

【図5】図５は、実験５のコラーゲンスポンジについて分光測色計CM-2600dを用いてb*値を定量した結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0013】

紫外線を浴びた皮膚や老化した皮膚では黄ぐすみが目立ち、とりわけ光老化した皮膚では顕著となる。一方、Ｍ１マクロファージに対するＭ２マクロファージの比率の上昇といったＭ１／Ｍ２バランスの調整により光老化を予防・改善できることが知られている。マクロファージは、体内の様々な組織に局在し、異物や病原体に対する免疫応答を惹起する細胞であり、未分化状態のＭ０マクロファージからＭ１タイプとＭ２タイプに分化する。Ｍ１マクロファージは炎症型として、Ｍ２マクロファージはリペア型（抗炎症型）として知られている（特許文献８）。しかしながら、黄ぐすみとＭ１マクロファージやＭ２マクロファージとの詳細なメカニズムについては不明な点が多い。

【0014】

そこで、本発明者らは、Ｍ１又はＭ２マクロファージ培養上清液添加によりその発現量が変化する数多くの因子から黄ぐすみ抑制に関与する因子を網羅解析により探索した。かかる鋭意研究の結果、Ｍ２マクロファージ培養上清液添加により発現が上昇するＰＲＤＸ４が顕著な黄ぐすみ抑制効果を奏することを発見した。本願発明は、黄ぐすみがＰＲＤＸ４に関連するという本願発明者らによる新たな発見に基づく。

【0015】

黄ぐすみは、皮膚の色が黄色化することを言う。黄ぐすみは、皮膚タンパク質の糖化、カルボニル化、ニトロ化によるもの等がある。カルボニル化は、皮膚タンパク質に、過酸化脂質の代謝物であるアクロレイン等のカルボニル化合物が付加することにより皮膚タンパク質がカルボニル化することを指す。皮膚タンパク質がカルボニル化することにより変性し、かかる変性によりこれらの皮膚タンパク質が黄色く変色することが知られている。とりわけ、紫外線や活性酸素により角層及び真皮におけるタンパク質がカルボニル化することが報告されており、また、脂質の過剰摂取、乾燥等の要因も黄ぐすみを促進する（非特許文献１、２、特許文献１～６）。本発明のある態様では、黄ぐすみはコラーゲンやエラスチンといった皮膚タンパク質のカルボニル化に起因する。本発明のある態様では、皮膚タンパク質のカルボニル化は、過酸化水素などの酸化物質、アクロレインなどのカルボニル化合物により引き起こされる。

【0016】

黄ぐすみの程度は、例えば、対象の皮膚又は取得した皮膚画像に対し、黄みの指標であるb*値、色相、明度、彩度、カルボニル化タンパク、波長、蛍光輝度、ＲＢＧカラーチャネルデータ等から得られる特定の指標や、分光測色計、色差計、画像解析装置といった装置より測定することができ、あるいは、訓練された評価者による外観目視検査等により評価することもできる（非特許文献１～３特許文献１～６）。

【0017】

本発明は、対象のＰＲＤＸ４の発現又は活性を増加することを含む、対象の黄ぐすみを抑制するための方法を提供する。

【0018】

本発明者らにより、ＰＲＤＸ４は、Ｍ２マクロファージ培養上清液により発現が増加することが発見された。よって、対象のＰＲＤＸ４の発現又は活性を増加することは、Ｍ２マクロファージを増加させること、Ｍ１マクロファージに対するＭ２マクロファージの比率の上昇させること等によるＭ１／Ｍ２バランスの調整により達成してもよい。Ｍ１／Ｍ２バランスの調整は、特許文献８に記載のような成分や方法より達成可能であるため、これらを用いてもよい。更に、本発明者らにより、後述するスクリーニング方法によりZingiber aromaticum、Zingiber purpureum Roscoe.等の生薬が線維芽細胞といった皮膚細胞におけるＰＲＤＸ４を増加させることが発見されたため、これらの生薬を用いることもできる。なお、Zingiber aromaticum、Zingiber purpureum Roscoe.等の生薬は老齢皮膚において物理刺激により減少する核局在YAP（Yes-associated protein）を有する細胞を増加させる効果があることも確認している。また、ＰＲＤＸ４を適切な濃度、例えば約0.1μg/ml～約1000μg/ml、約1μg/ml～約100μg/ml、約10μg/ml等で含む組成物を使用することによっても達成できる。その他ＰＲＤＸ４の発現や活性と関連があると認められる手段を講じること、後述するスクリーニング方法により得られる黄ぐすみ抑制剤を摂取すること等によるものであってもよいがこれらに限定されない。

【0019】

また、本願は、皮膚試料におけるＰＲＤＸ４の発現又は活性を指標とする黄ぐすみ抑制剤のスクリーニング方法を提供する。黄ぐすみ抑制剤のスクリーニング方法は、皮膚試料に候補薬剤を施すこと；候補薬剤を施した前後の皮膚試料におけるＰＲＤＸ４の発現又は活性を測定すること；及び前記候補薬剤を施した皮膚試料におけるＰＲＤＸ４の発現又は活性が該薬剤を施す前と比較して増加する場合、前記薬剤に黄ぐすみ抑制剤作用があると評価することを含んでもよい。

【0020】

また、本発明のスクリーニング方法においては、皮膚試料に候補薬剤を添加し、また対照として候補薬剤を加えずに、一定時間培養し、候補薬剤を添加した場合のＰＲＤＸ４の発現または活性と候補薬剤を加えない場合のＰＲＤＸ４の発現または活性を比較し、前記候補薬剤を施した皮膚試料におけるＰＲＤＸ４の発現又は活性が対照のものより増加する場合、前記薬剤に黄ぐすみ抑制剤作用があると評価することを含んでもよい。

【0021】

本発明のスクリーニング方法において使用する皮膚試料は、採取後の皮膚試料、例えば、ヒト等の動物から採取された後のｅｘ ｖｉｖｏの状態の皮膚試料であってもよいし、ヒト等の動物から採取された皮膚細胞を培養した、例えば、単層又は重層培養細胞、培養角化細胞又は培養線維芽細胞といったｉｎ ｖｉｔｒｏの状態であってもよい。あるいは、３Ｄ皮膚モデルなどの人工皮膚試料等であってもよい。皮膚試料は、ＰＲＤＸ４の発現又は活性を測定することができれば限定されない。

【0022】

ＰＲＤＸ４の発現または活性の増加は、例えば、候補薬剤を添加する前または候補薬剤を添加しない対照に比べて、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上、２００％以上、３００％以上、４００％以上、又は５００％以上高いＰＲＤＸ４遺伝子発現量またはタンパク質産生量を示すことであってもよい。

【0023】

また、本発明は、対象の皮膚試料におけるＰＲＤＸ４の発現又は活性の測定値を指標として対象の皮膚の黄ぐすみ感受性を評価する方法及び／又はシステムも提供する。

【0024】

黄ぐすみ感受性とは、紫外線、ストレス等の刺激により活性酸素が多くなる環境や、脂質の過剰摂取等により過酸化脂質が多くなりがちな環境に置かれた場合、黄ぐすみが起こりやすい傾向を指す。将来どの程度黄ぐすみが起こりやすいかの感受性については現在の肌色からは予測できないことが多いが、本発明者らによりＰＲＤＸ４がコラーゲンといった皮膚タンパクのカルボニル化を抑制することが発見され、ＰＲＤＸ４の発現又は活性が低い場合黄ぐすみ感受性が高く、同等の環境でもＰＲＤＸ４の発現又は活性が高い者よりも皮膚が黄色化しやすいことが導かれた。黄ぐすみ感受性が客観的に判断できれば、カウンセラーの技量や経験によらず一定のレベルでカウンセリングを行い肌色の悪化を予防または肌色を改善するための生活習慣などのアドバイスや化粧品を事前に提案することが可能になり、黄ぐすみを防ぐための対策を事前に講じることが可能になる。よって、本発明の方法及び／又はシステムは、黄ぐすみ感受性が高いと評価された対象に上述のような助言を提示するものであってもよい。

【0025】

評価は、対象のＰＲＤＸ４の発現又は活性の測定値が低いほど対象の皮膚の黄ぐすみ感受性が高いと評価するものであってもよい。あるいは、対象の測定値が特定の値より低い場合にその対象の皮膚の黄ぐすみ感受性が高いと評価するものであってもよい。また、対象のＰＲＤＸ４の発現又は活性の測定値を、あらかじめ設定したＰＲＤＸ４の発現又は活性の基準値と比較し、対象の測定値が基準値よりも低い場合に対象の皮膚の黄ぐすみ感受性が高いと評価することであってもよい。基準値は、対象を含む又は含まない複数の対象から採取した皮膚試料のＰＲＤＸ４の発現又は活性のデータに基づく値であってもよい。また、基準値は、対象の皮膚試料の採取時とは異なる時期に同じ対象から採取した皮膚試料のＰＲＤＸ４の発現又は活性のデータに基づく値であってもよい。

【0026】

対象の測定値が基準値よりも低いとは、例えば、対象のＰＲＤＸ４の発現又は活性の測定値が基準値よりも１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上低いことを意味するものであってもよい。

【0027】

対象の皮膚の黄ぐすみ感受性を評価する方法及び／又はシステムにおいて使用する皮膚試料は、採取後の皮膚試料、例えば、ヒト等の動物対象から採取された後のｅｘ ｖｉｖｏの状態の皮膚試料であってもよいし、非特許文献２に記載のような方法により非侵襲的に採取された皮膚試料であってもよいし、対象由来の皮膚細胞培養物、例えば、単層又は重層培養細胞、培養角化細胞又は培養線維芽細胞といったｉｎ ｖｉｔｒｏの状態であってもよい。あるいは、対象由来の皮膚細胞などを用い作成した３Ｄ皮膚モデルなどの人工皮膚試料であってもよい。生体試料は、対象のＰＲＤＸ４の発現又は活性が測定できれば限定されない。ＰＲＤＸ４の発現又は活性は上記のような皮膚試料を用い、ＰＣＲ等によりＰＲＤＸ４遺伝子の発現量を測定してもよく、免疫染色、ＥＬＩＳＡ等によりＰＲＤＸ４タンパク量を測定してもよい。

【0028】

例えば、本願の方法は、１又は複数のコンピュータにより実行される黄ぐすみ感受性を評価する方法であって、統計的手法によりあらかじめ求めた黄ぐすみの程度とＰＲＤＸ４の発現又は活性の値と関連付ける関数を取得する手順と、対象のＰＲＤＸ４の発現又は活性に関するデータを取得する手順と、前記対象のＰＲＤＸ４の発現又は活性に関するデータを前記関数に当てはめて計算する手順と、前記計算手順により計算された結果に基づいて皮膚の黄ぐすみ感受性の評価を統計的に行う手順と、前記評価手順により評価された結果を表示する手順を有する方法であってもよい。

【0029】

本願にかかる方法は、美容目的であり、医師や医療従事者が行う医療行為は除かれることがある。また、本願にかかる方法は、対象の美容行為を支援する方法であってもよい。

【実施例0030】

次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。

【0031】

実験１：ヒト単球由来細胞株ＴＨＰ－１の培養とＭ１／Ｍ２培養上清液の回収
Journal of the American College of Cardiology, Vol. 62, No. 20, 2013, November 12, 2013:1890-901に記載の方法に従い，ヒト由来の株化細胞であるTHP-1を用いて、M1、M2マクロファージへ分化誘導した。THP-1を10%FBS-RPMI（ナカライテスク、30263-95）でT175 flaskにて培養した。サブコンフルエントにまで増殖したことを確認後に細胞を回収し、PMA(100nM)を添加した10%FBS-RPMI 4ml/well、 2×10⁶cells/wellの濃度で6well plateに播種した。24時間後にIFN-γ(20ng/mL)、LPS(100ng/mL)を添加した10%FBS-RPMIを1ml/well追加添加しＭ１マクロファージへの分化刺激を、IL-4(20ng/mL)、IL-13(20ng/mL)を添加した10%FBS-RPMIを1ml/well追加添加しＭ２マクロファージへの分化刺激を行った。24時間後に各ウェルの培地をアスピレートしPBSで洗浄後、0.5%FBS-RPMI 5ml/wellに置換した。0.5%FBS-RPMI 5ml/wellで48時間培養した後、培養上清液を全量回収しＭ１及びＭ２マクロファージ培養上清液として回収し、下記実験３に用いた。対照ではマクロファージの培養以外は同じ組成の培地（マクロファージの培養をしていない0.5% FBS-RPMI)を回収した。

【0032】

実験２：ヒト新生児由来線維芽細胞の培養
ヒト新生児由来線維芽細胞を10%FBS-DMEM(Thermo Fisher Science、11885084)でT175 flaskにて培養した。サブコンフルエントにまで増殖したことを確認後に、0.025%トリプシンを加え、３７℃、３分間インキュベートして細胞を剥がし、10%FBS-DMEMで反応を止めた後、細胞を回収した。遠心後、細胞数をカウントし適切な細胞濃度で下記実験３に用いた。

【0033】

実験３：Ｍ１／Ｍ２マクロファージ培養上清液添加により発現が変化する遺伝子の網羅解析
実験１で得たＭ１及びＭ２マクロファージ培養上清液を実験２で培養した線維芽細胞に添加し、Ｍ１またはＭ２マクロファージ培養上清液添加により発現が変化する遺伝子を以下の網羅解析により探索した。具体的には、RNA-seqのリードをSTARを使用してヒトゲノム(hg19)にマッピングした。得られたカウントデータについて、低発現遺伝子のフィルタリング後にそれぞれのサンプル間のサイズ補正およびlog2変換を行なった。以上の方法でサンプル毎に算出したlog2(CPM)について、RパッケージのedgeRの機能であるglmQLFitとglmQLFTestを用いて、quasi-likelihood F-testで2群間比較を行った後Benjamini-Hochberg法で多重比較検定補正を行なってq-valueを算出した。

【0034】

実験３の結果、Ｍ１またはＭ２マクロファージ培養上清液添加により発現が変化する多くの遺伝子を発見したが、中でもＭ２マクロファージ培養上清液添加によるＰＲＤＸ４の発現増加が顕著に見られた（図１）。そこで、Ｍ２マクロファージ培養上清液添加によりＰＲＤＸ４タンパク量の増加が見られることを確認すべく下記の方法で免疫染色を行った。

【0035】

実験４：免疫染色

【0036】

実験２で培養した線維芽細胞を10%FBS-DMEM 1ml/well、0.8×10⁵cells/wellの濃度で4well chamberに播種した。２４時間後に0.5%FBSと500μMのアスコルビン酸を添加したＭ１／Ｍ２マクロファージ培養上清液を1ml/well添加した。対照ではマクロファージの上清液を含まないこと以外は同じ組成の培地を用いた。その後48時間後に0.5%FBS-DMEM 0.5ml/well に置換した。さらに24時間後に4%PFAに置換しオーバーナイトで固定処理を行った。続いて0.1% Triton X-100/PBSに3分間置換し透過処理を行った。さらにDAKO Protein Block Serum-Free Ready-To-Useを用いて室温で20分間ブロッキングした後ＰＲＤＸ４に対する抗体（Proteintech、10703-1-AP）を用いて蛍光免疫染色を行った。なお固定後の各ステップの間にPBSによる洗浄を行った。

【0037】

実験４の結果として得られた免疫染色像を図２に示す。また、この免疫染色像に対し、画像解析ソフトImageJを用いてＰＲＤＸ４の輝度値を定量した結果を図３に示す。線維芽細胞にＭ２マクロファージ培養上清液を添加するとＰＲＤＸ４タンパク量が対照やＭ１マクロファージ培養上清液の場合と比べ有意に増えることが確認された。

【0038】

実験５：コラーゲンスポンジにおける黄色化とＰＲＤＸ４による黄色化抑制効果
コラーゲンスポンジ マイティー（KOKEN, CSM-50)を96 well plateに置き、アクロレイン（AccuStandard、M-8015B-5031-03、終濃度5mM）、アクロレイン（終濃度5mM）とＰＲＤＸ４（Abcam、ab93947、終濃度10μg/ml）の同時添加、並びに対照群（MilliQ）の３群について、各200μl/wellで37℃、24時間インキュベートした後、白色校正版（コニカミノルタ社、CR-A44）上に乗せ、i phone 7の標準カメラアプリで写真を撮影した。また、これらのコラーゲンスポンジを、分光測色計CM-2600d（コニカミノルタ社）を用いて黄みの指標であるb*値を測定することにより黄色化の程度を定量化した。

【0039】

実験５の結果の画像を図４に示す。また、コラーゲンスポンジについて上記方法でb*値を測定した結果を図５に示す。アクロレインによりコラーゲンが黄色化するものの、ＰＲＤＸ４を投与した場合、黄色化が抑制されることがわかった。したがって、ＰＲＤＸ４は、皮膚タンパクのカルボニル化による黄ぐすみを抑制する効果があることがわかった。

【0040】

これらの実験により、Ｍ１／Ｍ２マクロファージ上清液添加により発現が変化する数多くの因子の中から、Ｍ２マクロファージ上清液添加により遺伝子発現が増加する（図１）とともにタンパク量も増加し（図２、３）、かつ、黄ぐすみ抑制効果（図４、５）がある因子としてＰＲＤＸ４を発見した。以上の結果から、ＰＲＤＸ４の低い対象ほど黄ぐすみ感受性が高く、過酸化脂質代謝物の増加、活性酸素の上昇といった黄ぐすみが起こりやすい環境に置かれると黄ぐすみを抑制しにくいことがわかった。よって、対象のＰＲＤＸ４を指標とすることで、簡便かつ客観的に黄ぐすみ感受性を予測できる。また、本発明により、ＰＲＤＸ４の発現または活性を増加する対策を採ることで黄ぐすみを抑制することが可能になる。この対策は、黄ぐすみ感受性が高いと対象にとりわけ有効である。また、ＰＲＤＸ４を指標とすることで黄ぐすみ抑制剤を探索するためのスクリーニングを簡便に行うことが可能になる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】