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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023131092
(43)【公開日】2023-09-21
(54)【発明の名称】腸内短鎖脂肪酸生成促進剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7016 20060101AFI20230913BHJP
A23L 33/105 20160101ALI20230913BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230913BHJP
A61K 36/185 20060101ALI20230913BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7016
A23L33/105 ZNA
A61P43/00 105
A61K36/185
【審査請求】未請求
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022166329
(22)【出願日】2022-10-17
(31)【優先権主張番号】P 2022034991
(32)【優先日】2022-03-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】390037604
【氏名又は名称】カクイ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100087398
【弁理士】
【氏名又は名称】水野 勝文
(74)【代理人】
【識別番号】100128783
【弁理士】
【氏名又は名称】井出 真
(74)【代理人】
【識別番号】100128473
【弁理士】
【氏名又は名称】須澤 洋
(74)【代理人】
【識別番号】100160886
【弁理士】
【氏名又は名称】久松 洋輔
(74)【代理人】
【識別番号】100192603
【弁理士】
【氏名又は名称】網盛 俊
(72)【発明者】
【氏名】岩元 正孝
【テーマコード（参考）】
4B018
4C086
4C088
【Ｆターム（参考）】
4B018LB01
4B018LB07
4B018LB08
4B018LE01
4B018LE02
4B018LE03
4B018LE05
4B018MD31
4B018ME01
4B018ME11
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA01
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA66
4C086ZB21
4C088AB13
4C088AC03
4C088BA06
4C088CA25
4C088NA14
4C088ZA66
4C088ZB21
(57)【要約】
【課題】少なくとも酢酸、プロピオン酸及び酪酸の３種の短鎖脂肪酸の生成を促進するための腸内短鎖脂肪酸生成促進剤を提供することを目的とする。
【解決手段】少なくとも酢酸、プロピオン酸及び酪酸の３種の短鎖脂肪酸の生成を促進するための腸内短鎖脂肪酸生成促進剤であって、セロビオースを含有することを特徴とする腸内短鎖脂肪酸生成促進剤。
【選択図】 なし
【解決手段】少なくとも酢酸、プロピオン酸及び酪酸の３種の短鎖脂肪酸の生成を促進するための腸内短鎖脂肪酸生成促進剤であって、セロビオースを含有することを特徴とする腸内短鎖脂肪酸生成促進剤。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも酢酸、プロピオン酸及び酪酸の３種の短鎖脂肪酸の生成を促進するための腸内短鎖脂肪酸生成促進剤であって、
セロビオースを含有することを特徴とする腸内短鎖脂肪酸生成促進剤。
セロビオースを含有することを特徴とする腸内短鎖脂肪酸生成促進剤。
【請求項2】
前記セロビオースが、綿花の酵素分解物である請求項１に記載の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤。
【請求項3】
成人１人の１日あたりの前記セロビオースの摂取量が、１００～１５００ｍｇである請求項１に記載の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤。
【請求項4】
大腸内におけるＩｇＡ抗体の産生を促進するための請求項１から３のいずれか一つに記載の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、少なくとも酢酸、プロピオン酸及び酪酸の３種の短鎖脂肪酸の生成を促進するための腸内短鎖脂肪酸生成促進剤に関する。
【背景技術】
【0002】
腸内環境を整えることは疾病予防や健康維持の観点から重要なことであり、腸内環境には腸内細菌が影響を及ぼしていることが知られている。
【0003】
腸内細菌が生成する短鎖脂肪酸は、ＳＣＦＡ（Ｓｈｏｒｔ－Ｃｈａｉｎ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ）とも呼ばれ、上皮細胞のエネルギー源として利用されるのみならず、疾病予防や健康維持に重要な役割を果たしている。具体的には、腸内細菌が生成する短鎖脂肪酸は、炎症を抑制したり血糖の上昇を抑制したりすることが知られている。腸内細菌が生成する短鎖脂肪酸の中でも、疾病予防や健康維持には、酢酸、プロピオン酸及び酪酸の３つの短鎖脂肪酸が重要である。
【0004】
近年、腸内細菌による短鎖脂肪酸の生成を促進することを目的として、様々な技術が開発されている。例えば、特許文献１には、フコースを有効成分として含有する腸内短鎖脂肪酸生成促進組成物が記載されている。また、例えば、特許文献２には、大麦の穀粒又はその粉砕物と、イヌリンとを含む腸内短鎖脂肪酸産生促進用組成物が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開２０１９－１７０３３５号公報
【特許文献2】特開２０２１－１０３４８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、少なくとも酢酸、プロピオン酸及び酪酸の３種の短鎖脂肪酸の生成を促進するための腸内短鎖脂肪酸生成促進剤を提供すること目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者は、セロビオースを含有する物質が、腸内細菌による短鎖脂肪酸（少なくとも、酢酸、プロピオン酸及び酪酸の３種の短鎖脂肪酸）の生成を促進することを見出し、本発明を完成するに至った。
【0008】
本発明の要旨は以下のとおりである。
［１］ 少なくとも酢酸、プロピオン酸及び酪酸の３種の短鎖脂肪酸の生成を促進するための腸内短鎖脂肪酸生成促進剤であって、セロビオースを含有することを特徴とする腸内短鎖脂肪酸生成促進剤。
［２］ 前記セロビオースが、綿花の酵素分解物である［１］に記載の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤。
［３］ 成人１人の１日あたりの前記セロビオースの摂取量が、１００～１５００ｍｇである［１］に記載の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤。
［４］ 大腸内におけるＩｇＡ抗体の産生を促進するための［１］から［３］のいずれか一つに記載の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤。
［１］ 少なくとも酢酸、プロピオン酸及び酪酸の３種の短鎖脂肪酸の生成を促進するための腸内短鎖脂肪酸生成促進剤であって、セロビオースを含有することを特徴とする腸内短鎖脂肪酸生成促進剤。
［２］ 前記セロビオースが、綿花の酵素分解物である［１］に記載の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤。
［３］ 成人１人の１日あたりの前記セロビオースの摂取量が、１００～１５００ｍｇである［１］に記載の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤。
［４］ 大腸内におけるＩｇＡ抗体の産生を促進するための［１］から［３］のいずれか一つに記載の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、少なくとも酢酸、プロピオン酸及び酪酸の３種の短鎖脂肪酸の生成を促進するための腸内短鎖脂肪酸生成促進剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、本発明の一実施形態について説明する。
【0012】
本実施形態は、少なくとも酢酸、プロピオン酸及び酪酸の３種の短鎖脂肪酸の生成を促進するための腸内短鎖脂肪酸生成促進剤に関する。
【0013】
本明細書において、腸内短鎖脂肪酸生成促進とは、腸内細菌による短鎖脂肪酸の生成が促進されることを指す。腸内細菌による短鎖脂肪酸の生成が促進されると、腸内細菌による短鎖脂肪酸の生成量が増加する。なお、腸内細菌が生成する短鎖脂肪酸は、食物繊維などの難消化性の多糖類を腸内細菌が発酵することで生成される、腸内細菌の代謝産物（発酵産物）であると考えられている。
【0014】
本実施形態の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤による腸内短鎖脂肪酸生成促進効果は、酢酸やプロピオン酸や酪酸を生成する腸内細菌が増殖することによる短鎖脂肪酸の生成促進効果と、酢酸やプロピオン酸や酪酸を生成する腸内細菌の短鎖脂肪酸生成能力が向上することによる短鎖脂肪酸の生成促進効果の両方を含む概念である。後述する実施例からすると、本実施形態による腸内短鎖脂肪酸生成促進効果は、腸内細菌の増殖による生成促進効果と、腸内細菌の短鎖脂肪酸生成能力の向上による生成促進効果の両方に起因する効果であると推察される。
【0015】
短鎖脂肪酸の生成を促進する腸内細菌は、腸内に存在する細菌である。
【0016】
腸内細菌のうち、酢酸を生成する細菌としては、バクテロイデス（Bacteroides）属菌や、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属菌や、プレボテーラ（Prevotella）属菌や、ルミノコッカス属菌や、アッカーマンシア（Akkermansia）属菌が知られている。
【0017】
腸内細菌のうち、プロピオン酸を生成する細菌としては、バクテロイデス（Bacteroides）属菌や、ファスコラークトバクテリウム（Phascolarctobacterium）属菌や、ベイロネラ（Veillonella）属菌や、ディアリスター（Dialister）属菌や、メガスファエラ（Megasphaera）属菌や、コプロコッカス（Coprococcus）属菌や、サルモネラ（Salmonella）属菌や、ロゼブリア属（Roseburia）菌や、ルミノコッカス属（Ruminococcus）菌が知られ
ている。
ている。
【0018】
腸内細菌のうち、酪酸を生成する細菌としては、フィーカリバクテリウム（Faecalibacterium）属菌や、エリシペラトクロストリジウム（Erysipelatoclostridium）属菌や、アナエロスティペス（Anaerostipes）属菌や、コプロコッカス（Coprococcus）属菌や、ユーバクテリウム（Eubacterium）属菌や、ロゼブリア属（Roseburia）菌が知られている。
【0019】
本実施形態の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤によって生成が促進される短鎖脂肪酸には、少なくとも酢酸、プロピオン酸及び酪酸の３種の短鎖脂肪酸（以下、単に「３種の短鎖脂肪酸」ともいう）が含まれる。本実施形態の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤によって生成が促進される短鎖脂肪酸は、３種の短鎖脂肪酸のみに限定されるものではなく、これら以外の他の短鎖脂肪酸を含んでいてもよい。３種の短鎖脂肪酸以外の他の短鎖脂肪酸としては、例えば、イソ酪酸を挙げることができる。なお、本明細書において、短鎖脂肪酸とは、炭素の数が２～４個の脂肪酸を指す。
【0020】
本実施形態の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤には、セロビオースが含有されている。セロビオースは、２つのグルコース分子がβ１、４結合でつながった二糖であり、Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１で表される物質である。
【0021】
本実施形態の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤に含有されるセロビオースは、その製造方法について特に限定されるものではなく、例えば、セルロース系物質をセルラーゼで分解する方法や、グルコース糖の単糖類又はその誘導体を縮合もしくは糖転移させる方法や、スクロースから合成する方法で得られたセロビオースを用いることができる。
【0022】
セルロース系物質をセルラーゼで分解する方法において、セルロース系物質は、特に限定されるものではなく、植物性及び動物性のいずれも適用可能である。具体的には、コットン、木材、竹、ケナフ、ムギ、イネ、バクテリアセルロース等に含有される天然物由来の繊維質物質や、それらを一旦溶剤に溶解させ再生させた再生セルロース、又はそれらに化学処理を施してセルロース誘導体としたもの等を用いることができる。これらのセルロース系物質は、いずれか１種を用いても良いし、２種以上を併用してもよい。特に、溶解や化学処理を経ない天然のセルロース系物質は、得られるセロビオースに人体に有害な溶剤や化学物質が含まれないため好ましい。
【0023】
セルロース系物質をセルラーゼで分解する方法において、セルラーゼは、セルロースに対する分解活性を有するものであれば特に限定されるものではない。セルラーゼは、セルラーゼ以外の物質を含むものであってもよく、セルラーゼ産生菌体そのものや、セルラーゼ産生菌が分泌する酵素を精製したものや、精製酵素を賦形剤、安定化剤等の添加剤とともに製剤化したものを用いてもよい。
【0024】
セルロース系物質をセルラーゼで分解する方法において、その方法は、セルロース系物質をセルラーゼで分解することができれば特に限定されるものではないが、例えば、セルロース系物質を水性媒体中に懸濁させ、その懸濁液にセルラーゼを添加し、攪拌又は振とうしながら、加温して糖化反応を行う方法等を挙げることができる。その際の懸濁方法、攪拌方法、セルロース系物質及びセルラーゼの添加方法及び添加順序、それらの濃度等の反応条件は、セロビオースの収率等の観点から適宜設定することができる。また、反応液のｐＨ及び温度等の条件は、セルラーゼが失活しない条件であれば良く、例えば、常圧で反応を行う場合、温度は５～９５℃、ｐＨは１～１１の範囲とすることができる。
【0025】
本実施形態の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤に含有されるセロビオースは、腸内細菌による短鎖脂肪酸（少なくとも、３種の短鎖脂肪酸）の生成をより促進する観点から、綿花（脱脂綿）の酵素分解物であることが好ましく、綿花（脱脂綿）のセルラーゼ分解物であることがより好ましい。
【0026】
上述した方法で製造したセロビオースは、必要に応じて、酵素除去、脱塩、脱色等の精製処理を施すことができる。精製方法は、公知の方法を用いることができ、特に制限されるものでない。精製方法の具体例としては、クロマトグラフィー処理、精密濾過、限外濾過、逆浸透膜濾過等の濾過処理、晶析処理、イオン交換樹脂による処理、活性炭処理等を挙げることができ、これらの処理のいずれかを単独で、または複数の処理を組み合わせて行うことができる。
【0027】
本実施形態の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤において、セロビオースの含有量は、特に限定されるものでない。セロビオースの含有量は、高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ法）によって測定することができる。高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ法）の測定条件は例えば以下のようにすることができる。
ＨＰＬＣ装置：ウォーターズ社製 Ａｌｌｉａｎｃｅ高速液体クロマトグラフ
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ ＳＵＧＡＲ ＫＳ―８０１内径８．０ｍｍ×長さ３００ｍｍ
移動相：超純水
試料注入量：１０μｌ
送液量：１．０ｍＬ／分
カラムオーブン温度：５０℃
検出器：示差屈折検出器
ＨＰＬＣ装置：ウォーターズ社製 Ａｌｌｉａｎｃｅ高速液体クロマトグラフ
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ ＳＵＧＡＲ ＫＳ―８０１内径８．０ｍｍ×長さ３００ｍｍ
移動相：超純水
試料注入量：１０μｌ
送液量：１．０ｍＬ／分
カラムオーブン温度：５０℃
検出器：示差屈折検出器
【0028】
本実施形態の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤の摂取量は、特に限定されるものではないが、例えば、成人の１日あたりのセロビオースの摂取量が１００～２０００ｍｇとなる量とすることができる。腸内細菌による短鎖脂肪酸（少なくとも、３種の短鎖脂肪酸）の生成をより促進する観点からは、本実施形態の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤の摂取量は、成人の１日あたりのセロビオースの摂取量が１００～１５００ｍｇとなる量であることが好ましく、成人の１日あたりのセロビオースの摂取量が２００～１０００ｍｇとなる量であることがより好ましい。
【0029】
本実施形態の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤の摂取頻度は、特に限定されるものではないが、例えば、１日に１～２回とすることができる。本実施形態の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤の摂取期間は、例えば、３週間以上とすることができ、４週間以上とすることが好ましい。
【0030】
本実施形態の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤の使用形態は、特に限定されるものではなく、医薬品、医薬部外品、飲食品、添加剤などのあらゆる使用形態とすることができる。また、本実施形態の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤の状態は、特に限定されるものではなく、液体、固体、半固体、ゲル体などのあらゆる状態とすることができる。なお、本実施形態の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤の摂取方法は、使用形態や状態に応じて適宜設定することができ、例えば、経口により摂取することができる。
【0031】
本実施形態の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤は、セロビオースに加えて、セロビオース以外の他の成分が含有されていてもよい。例えば、本実施形態の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤を医薬品や医薬部外品や飲食品とする場合、本実施形態の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤には、セロビオースに加えて、賦型剤、結合剤、安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、懸濁剤、コーティング剤、溶媒（例えば、エタノールなど）や、食品又は飲料中に含まれる成分が含有されていてもよい。
【0032】
特に、本実施形態の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤を飲食品とする場合、通常の飲食品としてもよいが、特定保健用食品等の特別用途食品や、栄養機能食品や、機能性表示食品としてもよい。飲食品としては、例えば、栄養補助食品（サプリメント）、牛乳、乳飲料、清涼飲料（例えば、炭酸飲料、ノンアルコール飲料、ジュース、コーヒー飲料、茶系飲料、ミネラルウォーター、スポーツ飲料など）、豆乳飲料、乳酸菌飲料、ココア、アルコール飲料（例えば、ビール、発泡酒、その他の醸造酒、リキュール、日本酒、甘酒、ワイン、焼酎など）、加工乳、発酵乳、調製粉乳、インスタント粉末から調製される飲料及びその他の飲料、シリアル、ヨーグルト、チーズ、パン、ピッツァクラスト、アイスクリーム、ビスケット、クラッカー、キャンディ、グミ、ガム及びその他の菓子類、流動食、病者用食品、幼児用粉乳等食品、授乳婦用粉乳等食品、飼料などを挙げることができる。
【0033】
本実施形態の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤の剤形は、特に限定されるものではなく、使用形態や使用状態に応じて適宜設定できる。例えば、本実施形態の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤を医薬品や医薬部外品やサプリメントなどの飲食品とする場合、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、シロップ剤等の剤形とすることができる。
【0034】
本実施形態の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤を摂取する摂取者は、ヒトに限定されるものではなく、ヒト以外の動物であってもよい。ヒト以外の動物としては、ヒト以外の哺乳類を挙げることができ、より具体的にはイヌ、ネコ等の愛玩動物、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ等の家畜を例示することができる。
【0035】
本実施形態の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤は、セロビオースと必要に応じて含有される上述した成分とを適宜混合し、常法により製造することができ、その製造方法や製造条件について、特に限定されるものではない。
【0036】
以上説明した本実施形態の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤によれば、腸内細菌による短鎖脂肪酸（少なくとも、３種の短鎖脂肪酸）の生成を促進することができる。その結果、腸内短鎖脂肪酸生成促進剤を摂取していない場合と比較して、腸内における短鎖脂肪酸量（少なくとも、３種の短鎖脂肪酸量）を増加させることができる。
【0037】
特に、本実施形態の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤に含有されるセロビオースは、消化酵素で分解されにくい難消化性の物質であり、大腸にまで到達することができる。このため、本実施形態の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤によれば、大腸内の細菌による短鎖脂肪酸（少なくとも、３種の短鎖脂肪酸）の生成を促進することができる。その結果、大腸内における短鎖脂肪酸量（少なくとも、３種の短鎖脂肪酸量）を増加させることができる。
【0038】
ここで、大腸内で産生される短鎖脂肪酸は、大腸のリンパ濾胞において免疫細胞に作用し、大腸内でのＩｇＡ産生を促進することが知られている（Kang Chen et al., “Rethinking mucosal antibody responses: IgM, IgG and IgD join IgA” Nature Reviews Immunology, 2020 July, 20(7), pages 427-441）。このため、大腸内における短鎖脂肪酸量（少なくとも、３種の短鎖脂肪酸量）を増加させることができる本実施形態の腸内短鎖脂肪酸生成促進剤によれば、大腸内でのＩｇＡ産生を促進することもできる。つまり、本発明の一実施形態には、大腸内でのＩｇＡ産生を促進するための腸内短鎖脂肪酸生成促進剤が含まれる。
【実施例0039】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【0040】
<評価１>
［試験品（サンプル）の準備］
試験品（サンプル）として、下記表１に示す物質を用意した。
［試験品（サンプル）の準備］
試験品（サンプル）として、下記表１に示す物質を用意した。
【表1】
【0041】
なお、上記表１に示すＣｅｌ（セロビオース）は、綿花（脱脂綿）をセルラーゼで分解し、その後、精製処理をして得られたセロビオースである。具体的には、脱脂綿を適宜粉砕した後、水と共に磨砕したものに、固形分の１％相当のセルラーゼを添加し、４０℃で３～２４時間程度反応させることによって、セルラーゼによる綿花（脱脂綿）の分解を行った。その後、反応生成物をろ過した後、脱塩、濃縮して粉末の分解物を得た。また、２００ｇの分解物を温水に溶解して、０．２μｍのフィルターでろ過した溶液を加熱濃縮し、析出した結晶を集めて純水で洗浄した。この精製操作により、Ｃｅｌ（セロビオース）を得た。なお、ＨＰＬＣ分析の結果、Ｃｅｌにおけるセロビオースの純度は９９．７％であり、０．３％以下のグルコースとセロトリオースがＣｅｌに含まれていた。
【0042】
ＨＰＬＣの測定条件には以下の条件を用いた。
ＨＰＬＣ装置：ウォーターズ社製 Ａｌｌｉａｎｃｅ高速液体クロマトグラフ
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ ＳＵＧＡＲ ＫＳ―８０１内径８．０ｍｍ×長さ３００ｍｍ
移動相：超純水
試料注入量：１０μｌ
送液量：１．０ｍＬ／分
カラムオーブン温度：５０℃
検出器：示差屈折検出器
ＨＰＬＣ装置：ウォーターズ社製 Ａｌｌｉａｎｃｅ高速液体クロマトグラフ
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ ＳＵＧＡＲ ＫＳ―８０１内径８．０ｍｍ×長さ３００ｍｍ
移動相：超純水
試料注入量：１０μｌ
送液量：１．０ｍＬ／分
カラムオーブン温度：５０℃
検出器：示差屈折検出器
【0043】
［便培養液の調製及び培養］
６名の健康な日本人の成人男女（以下、それぞれ「被験者ＫI１～ＫI６」という。）から便を採取した。文献１（「Dynamic Omics Approach Identifies Nutrition-Mediated Microbial Interactions」、Journal of Proteome Research、Volume 10、Issue 2、2011年、824-836頁）に記載される方法で調製したＭｏｄｉｆｉｅｄ ＹＣＦＡ培地に、採取した便をそれぞれ懸濁させ、便を同濃度（０．１ｗ/ｖ％）で含む便懸濁液を取得した。炭酸ガスをバブリングすることで酸素を除去した超純水に、上記表１に示す試験品を各々溶解させ、これを便懸濁液に添加することで便培養液を得た。便培養液における試験品の濃度は、いずれも０．３ｗ/ｖ％に統一した。取得した便培養液を９６穴プレートに分注し、嫌気条件下において３７℃で１６時間培養した。１６時間の培養後、便培養液を回収し、遠心分離した。遠心分離後、ペレット（固形分）及び上澄みを回収し、ペレットを腸内細菌の特定のために使用し、上澄みを短鎖脂肪酸濃度の特定のために使用した。
６名の健康な日本人の成人男女（以下、それぞれ「被験者ＫI１～ＫI６」という。）から便を採取した。文献１（「Dynamic Omics Approach Identifies Nutrition-Mediated Microbial Interactions」、Journal of Proteome Research、Volume 10、Issue 2、2011年、824-836頁）に記載される方法で調製したＭｏｄｉｆｉｅｄ ＹＣＦＡ培地に、採取した便をそれぞれ懸濁させ、便を同濃度（０．１ｗ/ｖ％）で含む便懸濁液を取得した。炭酸ガスをバブリングすることで酸素を除去した超純水に、上記表１に示す試験品を各々溶解させ、これを便懸濁液に添加することで便培養液を得た。便培養液における試験品の濃度は、いずれも０．３ｗ/ｖ％に統一した。取得した便培養液を９６穴プレートに分注し、嫌気条件下において３７℃で１６時間培養した。１６時間の培養後、便培養液を回収し、遠心分離した。遠心分離後、ペレット（固形分）及び上澄みを回収し、ペレットを腸内細菌の特定のために使用し、上澄みを短鎖脂肪酸濃度の特定のために使用した。
【0044】
［腸内細菌の種類及び存在比の特定］
文献２（「The Effects of Enteral Nutrition on the Intestinal Environment in Patients in a Persistent Vegetative State」、Foods、Volume 11、Issue 4、2022年、549）の「2.2. 16S Amplicon Sequencing Analysis of Intestinal Microbiota」に記載される方法（及び条件）に従い、便培養液を遠心分離して得たペレットから腸内細菌のＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡを鋳型として、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１－Ｖ２領域のＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅した。なお、プライマーには、配列番号１で示される下記表２のフォワードプライマーと、配列番号２で示される下記表２のリバースプライマーを用いた。
文献２（「The Effects of Enteral Nutrition on the Intestinal Environment in Patients in a Persistent Vegetative State」、Foods、Volume 11、Issue 4、2022年、549）の「2.2. 16S Amplicon Sequencing Analysis of Intestinal Microbiota」に記載される方法（及び条件）に従い、便培養液を遠心分離して得たペレットから腸内細菌のＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡを鋳型として、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１－Ｖ２領域のＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅した。なお、プライマーには、配列番号１で示される下記表２のフォワードプライマーと、配列番号２で示される下記表２のリバースプライマーを用いた。
【表2】
【0045】
ＰＣＲにより得られた増幅産物の配列をＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ（イルミナ株式会社）を用いたペアエンド法により解析した。なお、配列の解析は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑのマニュアルに従って行った。
【0046】
解析により得られた塩基配列から、ＱＩＩＭＥ２ソフトウェア（ver.2019.10）（https://forum.qiime2.org/t/qiime-2-2019-10-is-now-available/12280）のワークフローに則って細菌系統組成を算出した。具体的には、まず、ｃｕｔａｄａｐｔ（Martin M (2011) Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet journal; Vol 17, No 1: Next Generation Sequencing Data Analysis）を使用し、プライマー配列を除外した。その後、ＤＡＤＡ２(https://benjjneb.github.io/dada2/index.html)を用いて、３’末端塩基削除、ＰｈｉＸ由来の塩基配列除去、及びクオリティーフィルタリングを行い、高品質の塩基配列を得た。さらに、ＤＡＤＡ２を用いて、ノイズ除去（シーケンスエラーの修正）、ペアエンド配列のマージ、及びキメラ配列除去を行い、ＡＳＶ（Amplicon Sequence Variant）代表配列を得た。次に、これら代表配列の細菌属をＱＩＩＭＥ２のナイーブベイズ分類器により同定した。なお、本解析ではＳｉｌｖａ（https://www.arb-silva.de）が提供するＳＩＬＶＡ ＳＳＵ Ｒｅｆを９９％の閾値でクラスタリングして得られた代表配列のうち、Ｖ１－Ｖ２領域を切り出した配列を教師データとして用いた。
【0047】
上述した方法で得られたＡＳＶ組成から属（ｇｅｎｕｓ）組成を作成した。結果を図１Ａ～図１Ｃに示す。なお、図１Ａ～図１Ｃに示す属組成では、相対存在比が合計で０．００１未満の細菌については、その他の細菌として取り扱った。
【0048】
また、培地に添加した試験品毎、試験品無添加群（コントロール）と試験品添加群とを群間比較し、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの符号付順位検定での有意な増加・減少が認められた細菌（ｐ＜０．０５）の有無を確認した。結果を下記表３に示す。なお、下記表３において、「増」は有意差がある増加を意味し、「減」は有意差がある減少を意味する。
【表3】
【0049】
上記表３から明らかなとおり、Ｃｅｌ（セロビオース）を添加した便培養液では、コントロール（試験品無添加群）の便培養液と比較し、酪酸を生成することが知られているエリシペラトクロストリジウム属菌と、酢酸を生成することが知られているパラバクテロイデス属菌が優位に増加していた。一方で、いずれの試験品を添加した便培養液でも、プロピオン酸を生成する腸内細菌については、有意な増加は認められなかった。
【0050】
［短鎖脂肪酸濃度の特定］
便培養液を遠心分離して得た上清を、フィルターユニット付きチューブ（メルク / ウルトラフリー（Ultrafree）-MC, GV 0.22 μm / UFC30GVNB）でろ過し、試料溶液を得た。上記文献２の「2.3.2. Fecal Sample Pretreatment and Standard Preparation」に記載される方法（及び条件）に従い、得られた試料溶液を用いて誘導体化処理を施した。誘導体化処理後、上記文献２の「2.3.3. LC-TOFMS Condition」及び「2.3.4. LC-TOFMS Measurement」に記載される方法（及び条件）に従い、液体クロマトグラフ飛行時間型質量分析計（ＬＣ－ＴＯＦ／ＭＳ）を用いた測定を行い、検出されたピークのカラム保持時間、質量電荷比（ｍ／ｚ）、及びピーク面積を取得した。これらの情報を標準試料の測定結果と照合することで各ピークに対応する短鎖脂肪酸を同定した。なお、標準試料（内部標準物質）には、和光純薬工業社製の酢酸及び酪酸と、ナカライテスク社製のプロピオン酸及びイソ酪酸を用いた。
便培養液を遠心分離して得た上清を、フィルターユニット付きチューブ（メルク / ウルトラフリー（Ultrafree）-MC, GV 0.22 μm / UFC30GVNB）でろ過し、試料溶液を得た。上記文献２の「2.3.2. Fecal Sample Pretreatment and Standard Preparation」に記載される方法（及び条件）に従い、得られた試料溶液を用いて誘導体化処理を施した。誘導体化処理後、上記文献２の「2.3.3. LC-TOFMS Condition」及び「2.3.4. LC-TOFMS Measurement」に記載される方法（及び条件）に従い、液体クロマトグラフ飛行時間型質量分析計（ＬＣ－ＴＯＦ／ＭＳ）を用いた測定を行い、検出されたピークのカラム保持時間、質量電荷比（ｍ／ｚ）、及びピーク面積を取得した。これらの情報を標準試料の測定結果と照合することで各ピークに対応する短鎖脂肪酸を同定した。なお、標準試料（内部標準物質）には、和光純薬工業社製の酢酸及び酪酸と、ナカライテスク社製のプロピオン酸及びイソ酪酸を用いた。
【0051】
また、上述した液体クロマトグラフ飛行時間型質量分析により検出されたピークは、遠心分離して得た上清毎に内部標準物質との面積比が一定になるように補正し、上清間で相対定量が可能な値（相対面積比、relative area）に変換した。そして、濃度既知の標準試料を用いて作成した検量線と比較することにより、上清中の短鎖脂肪酸の絶対定量を行った。結果を図２Ａ～図２Ｃに示す。
【0052】
また、培地に添加した試験品毎、試験品無添加群（コントロール）と試験品添加群とを群間比較し、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの符号付順位検定での有意な増加・減少が認められた短鎖脂肪酸（ｐ＜０．０５）の有無を確認した。結果を下記表４に示す。なお、下記表４において、「増」は有意差がある増加を意味し、「減」は有意差がある減少を意味する。
【0053】
【表4】
【0054】
上記表４から明らかなとおり、Ｃｅｌ（セロビオース）を添加した便培養液中（便培養液を遠心分離して得た上清中）では、コントロールの便培養液と比較し、酪酸、プロピオン酸、及び酢酸の量が有意に増加していた。この結果から、Ｃｅｌ（セロビオース）は、腸内細菌による酢酸、プロピオン酸及び酪酸の３種の短鎖脂肪酸の生成を促進できることが理解できた。
【0055】
また、上記表４から明らかなとおり、Ｃｅｌ（セロビオース）を添加するとプロピオン酸が優位に増加するが、上記表３から明らかなとおり、Ｃｅｌ（セロビオース）を添加してもプロピオン酸を生成する腸内細菌の有意な増加は確認できなかった。これらの結果からすると、Ｃｅｌによる腸内細菌の短鎖脂肪酸生成促進効果は、酢酸やプロピオン酸や酪酸を生成する腸内細菌が増殖することによる短鎖脂肪酸の生成促進効果だけでなく、酢酸やプロピオン酸や酪酸を生成する腸内細菌の短鎖脂肪酸生成能力が向上することによる短鎖脂肪酸の生成促進効果に起因した効果であると推察された。
【0056】
<評価２>
［試験品（サンプル）の準備］
評価１と同様の方法でセロビオース（Ｃｅｌ）を取得した。ＨＰＬＣ分析の結果、得られたＣｅｌにおけるセロビオースの純度は９８．６％であり、１．０％のグルコースと０．４％のセロトリオースがＣｅｌに含まれていた。
［試験品（サンプル）の準備］
評価１と同様の方法でセロビオース（Ｃｅｌ）を取得した。ＨＰＬＣ分析の結果、得られたＣｅｌにおけるセロビオースの純度は９８．６％であり、１．０％のグルコースと０．４％のセロトリオースがＣｅｌに含まれていた。
【0057】
［被験者の選定］
被験者として、２０歳以上８０歳未満の日本人の成人男女から７名（以下、それぞれ「被験者Ｓ０１～Ｓ０７」という。）を選定した。なお、被験者からは、以下の（１）～（５）に該当するものは除外した。
（１）試験食品摂取開始の1ヶ月前よりセロビオースを摂取した者、また試験期間中に摂取する予定がある者。
（２）試験に影響を与える可能性のある特定保健用食品、機能性表示食品、健康食品（サプリメントを含む）を週３回以上常用しており、同意取得時から中止できない者。
（３）自己免疫疾患などの免疫関連、消化器等に重篤な疾患の現病歴がある者。
（４）妊娠中、授乳中、あるいは試験期間中に妊娠する意思のある者。
（５）試験品にアレルギーがある者。
被験者として、２０歳以上８０歳未満の日本人の成人男女から７名（以下、それぞれ「被験者Ｓ０１～Ｓ０７」という。）を選定した。なお、被験者からは、以下の（１）～（５）に該当するものは除外した。
（１）試験食品摂取開始の1ヶ月前よりセロビオースを摂取した者、また試験期間中に摂取する予定がある者。
（２）試験に影響を与える可能性のある特定保健用食品、機能性表示食品、健康食品（サプリメントを含む）を週３回以上常用しており、同意取得時から中止できない者。
（３）自己免疫疾患などの免疫関連、消化器等に重篤な疾患の現病歴がある者。
（４）妊娠中、授乳中、あるいは試験期間中に妊娠する意思のある者。
（５）試験品にアレルギーがある者。
【0058】
［検体の取得］
試験品の摂取を開始する日の前日に、各被験者から便（以下、「摂取前検体」ともいう）を採取した。摂取前検体を採取した日の翌日から、１ｇのＣｅｌを１日に１回各被験者に摂取させた。Ｃｅｌの摂取（１ｇ／１回／１日）を４週間継続させ、最後のＣｅｌを摂取した日の翌日の便（以下、「摂取後検体」ともいう）を各被験者から採取した。
試験品の摂取を開始する日の前日に、各被験者から便（以下、「摂取前検体」ともいう）を採取した。摂取前検体を採取した日の翌日から、１ｇのＣｅｌを１日に１回各被験者に摂取させた。Ｃｅｌの摂取（１ｇ／１回／１日）を４週間継続させ、最後のＣｅｌを摂取した日の翌日の便（以下、「摂取後検体」ともいう）を各被験者から採取した。
【0059】
［検体中のＩｇＡ濃度の測定］
摂取前検体及び摂取後検体を－８０℃で少なくとも１６時間凍結乾燥させ、凍結乾燥させた摂取前検体及び摂取後検体（以下、これらを「乾燥させた検体」ともいう）を得た。乾燥させた各検体を粉砕した後、乾燥させた検体１０ｍｇあたり１ｍＬとなる量のＰＢＳに懸濁して５分間攪拌した。各検体懸濁液を遠心分離により固液分離し、上澄み８００μｌをフィルター（メルク社製の０．２２μｍフィルター；ＳＬＧＶＲ３３ＲＢ）でろ過して検体抽出液を得た。この検体抽出液を、それぞれ、ＥＬＩＳＡ定量キット（Ａｂｃａｍ ＰＬＣ社製のＩｇＡ Ｈｕｍａｎ Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｔｅｐ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ；ａｂ１９６２６３）に含まれる試薬（Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔ ＮＳ）を用いて２０００倍希釈した後、前述したＥＬＩＳＡ定量キットを用いて乾燥させた検体１ｇにおけるＩｇＡ濃度を求めた。なお、ＥＬＩＳＡ定量キットよる測定は、メーカー推奨プロトコル（付属される説明書に記載のプロトコル）に従って行った。
摂取前検体及び摂取後検体を－８０℃で少なくとも１６時間凍結乾燥させ、凍結乾燥させた摂取前検体及び摂取後検体（以下、これらを「乾燥させた検体」ともいう）を得た。乾燥させた各検体を粉砕した後、乾燥させた検体１０ｍｇあたり１ｍＬとなる量のＰＢＳに懸濁して５分間攪拌した。各検体懸濁液を遠心分離により固液分離し、上澄み８００μｌをフィルター（メルク社製の０．２２μｍフィルター；ＳＬＧＶＲ３３ＲＢ）でろ過して検体抽出液を得た。この検体抽出液を、それぞれ、ＥＬＩＳＡ定量キット（Ａｂｃａｍ ＰＬＣ社製のＩｇＡ Ｈｕｍａｎ Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｔｅｐ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ；ａｂ１９６２６３）に含まれる試薬（Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔ ＮＳ）を用いて２０００倍希釈した後、前述したＥＬＩＳＡ定量キットを用いて乾燥させた検体１ｇにおけるＩｇＡ濃度を求めた。なお、ＥＬＩＳＡ定量キットよる測定は、メーカー推奨プロトコル（付属される説明書に記載のプロトコル）に従って行った。
【0060】
被験者Ｓ０１～Ｓ０７の摂取前検体中のＩｇＡ濃度の平均値及び、被験者Ｓ０１～Ｓ０７の摂取後検体中のＩｇＡ濃度の平均値を下記表５に示す。なお、下記表５では、乾燥させた検体１ｇにおけるＩｇＡ濃度を示している。
【0061】
【表5】
【0062】
上記表５に示す通り、セロビオース摂取後の検体は、セロビオース摂取前の検体と比較して、ＩｇＡ濃度の平均値が２倍以上も高かった。この結果から、Ｃｅｌ（セロビオース）は、大腸内でのＩｇＡ産生を促進することが理解できた。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【配列表】