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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023132190
(43)【公開日】2023-09-22
(54)【発明の名称】ケモカインＣＣＬ５発現抑制剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/222 20060101AFI20230914BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230914BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20230914BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230914BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230914BHJP
A61K 31/27 20060101ALI20230914BHJP
A61K 31/223 20060101ALI20230914BHJP
A61K 31/455 20060101ALI20230914BHJP
A61K 31/225 20060101ALI20230914BHJP
C07C 271/22 20060101ALI20230914BHJP
C07C 229/12 20060101ALI20230914BHJP
C07C 229/28 20060101ALI20230914BHJP
C07C 69/40 20060101ALI20230914BHJP
C07C 69/42 20060101ALI20230914BHJP
A61K 31/215 20060101ALI20230914BHJP
C07D 213/80 20060101ALN20230914BHJP
【ＦＩ】
A61K31/222
A61P43/00 111
A61P35/04
A61P17/00
A61P29/00
A61K31/27
A61K31/223
A61K31/455
A61K31/225
C07C271/22
C07C229/12
C07C229/28
C07C69/40
C07C69/42
A61K31/215
C07D213/80 CSP
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022037369
(22)【出願日】2022-03-10
(71)【出願人】
【識別番号】598015084
【氏名又は名称】学校法人福岡大学
(74)【代理人】
【識別番号】100092901
【弁理士】
【氏名又は名称】岩橋 祐司
(74)【代理人】
【識別番号】100188260
【弁理士】
【氏名又は名称】加藤 愼二
(72)【発明者】
【氏名】高田 二郎
(72)【発明者】
【氏名】松永 和久
(72)【発明者】
【氏名】加留部 善晴
(72)【発明者】
【氏名】松尾 宏一
(72)【発明者】
【氏名】古賀 允久
(72)【発明者】
【氏名】瀬戸口 修一
(72)【発明者】
【氏名】後藤 将太朗
【テーマコード（参考）】
4C055
4C086
4C206
4H006
【Ｆターム（参考）】
4C055AA01
4C055BA01
4C055CA02
4C055CA57
4C055CB08
4C055DA01
4C055FA11
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC19
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA06
4C086NA07
4C086NA14
4C086ZA89
4C086ZB11
4C086ZB26
4C086ZC41
4C206AA01
4C206AA02
4C206DB29
4C206FA44
4C206FA53
4C206HA22
4C206KA04
4C206KA13
4C206MA01
4C206MA04
4C206NA06
4C206NA07
4C206NA14
4C206ZA89
4C206ZB11
4C206ZB26
4C206ZC41
4H006AA01
4H006AA03
4H006AB22
4H006BJ50
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ケモカインＣＣＬ５発現抑制剤を提供する。
【解決手段】下式（1）で示されるケモカインＣＣＬ５発現抑制剤。
（式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれＨ、又はグリシン、ジカルボン酸ヘミエステル等、Ｒ３は下式（3）で示される基等を示す。）
【選択図】図１０
【解決手段】下式（1）で示されるケモカインＣＣＬ５発現抑制剤。
（式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれＨ、又はグリシン、ジカルボン酸ヘミエステル等、Ｒ３は下式（3）で示される基等を示す。）
【選択図】図１０
【特許請求の範囲】
【請求項1】
メナキノン－４及び／または下記一般式（1）
（式中、R1およびR2はそれぞれ水素原子、またはグリシン、N－アシルグリシン、N－アルキルグリシン、N,N－ジアルキルグリシン、N,N,N－トリアルキルグリシン、アシル、ジカルボン酸ヘミエステル及びその塩、ジカルボン酸アルコールエステルから選ばれる置換基を意味する。R3は下記一般式（２）
もしくは下記一般式（３）
で示される基を表す。ｎ は１～７の整数を意味する。)で表される活性型ビタミンＫのカルボン酸エステル類またはその塩の少なくとも一種類からなる、ケモカインＣＣＬ５発現抑制剤。
【化1】
（式中、R1およびR2はそれぞれ水素原子、またはグリシン、N－アシルグリシン、N－アルキルグリシン、N,N－ジアルキルグリシン、N,N,N－トリアルキルグリシン、アシル、ジカルボン酸ヘミエステル及びその塩、ジカルボン酸アルコールエステルから選ばれる置換基を意味する。R3は下記一般式（２）
【化2】
もしくは下記一般式（３）
【化3】
で示される基を表す。ｎ は１～７の整数を意味する。)で表される活性型ビタミンＫのカルボン酸エステル類またはその塩の少なくとも一種類からなる、ケモカインＣＣＬ５発現抑制剤。
【請求項2】
メナキノン－４及び／または前記一般式（１）で表される化合物またはその塩を有効成分とする誘導性ＣＣＬ５発現抑制剤。
【請求項3】
メナキノン－４及び／または前記一般式（１）で表される化合物またはその塩を含有する、ＥＧＦＲ阻害剤投与時の副作用抑制剤。
【請求項4】
請求項３記載の副作用抑制剤において、副作用はケモカインＣＣＬ５過剰発現である副作用抑制剤。
【請求項5】
請求項４記載の副作用抑制剤において、副作用はヒト皮膚ケラチノサイトおいて生じる皮膚障害であることを特徴とする副作用抑制剤。
【請求項6】
メナキノン－４及び／または前記一般式（１）で表される化合物またはその塩を含有する恒常性ＣＣＬ５発現抑制剤。
【請求項7】
請求項６記載の抑制剤において、がん転移抑制を行うことを特徴とする恒常性ＣＣＬ５発現抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はケモカインＣＣＬ５発現抑制剤、特にビタミンＫ関連化合物を有効成分とする抑制剤に関する。
【背景技術】
【0002】
ケモカインCCL5は、炎症性疾患の制御と局所免疫細胞の維持に関与しているCCケモカインである。CCL5にはステージ特異性があり、炎症状態において炎症の後期に発現が誘導される誘導性CCL5と、非炎症状態において恒常的に発現している恒常性CCL5がある（非特許文献１）。誘導性CCL5の発現抑制は炎症抑制に重要であり、恒常性CCL5の発現制御は免疫細胞の制御に重要であることから（非特許文献１）、ステージ特異性に則したCCL5の発現制御により様々な有用性が期待できる。しかし、ステージ特異性に則したCCL5の制御方法はこれまでに実現されていない。
一方、EGFR(上皮成長因子受容体)阻害剤は、結腸癌、直腸癌ならびに頭頸部、肺、膵臓、乳房の悪性腫瘍に使用される効果的な分子標的薬である。EGFRは上皮成長因子（EGF）が細胞外ドメインに結合することで細胞内ドメインがコンフォメーション変化するためATPがチロシンキナーゼ（TK）ドメインに入り、チロシン残基がリン酸化され活性化される。活性化EGFRは下流のMAPK経路とAKT経路によって腫瘍細胞の増殖、転移、接着、血管新生、およびアポトーシスの阻害を増強する。多くの腫瘍は、正常組織に比較して、感受性が高い変異ＥＧＦＲを過剰に発現していることから、EGFR阻害剤によってEGFRの活性化を抑制することで腫瘍細胞の増殖、転移、接着、血管新生、およびアポトーシスの阻害が抑制されることになる。これが腫瘍細胞増殖機構の1つと考えられている。
EGFR阻害剤にはチロシンキナーゼ阻害薬(EGFR-TKI)（ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ)と細胞外ドメインのモノクローナル抗体薬(セツキシマブとパニツムマブ)の２つのカテゴリーがあり、いずれも皮膚障害の副作用の出現頻度が極めて高く、治療中断の大きな原因であり、患者のQOLやアドヒアランスの大きな障害となっている（非特許文献２）。
EGFRは正常皮膚組織においても上皮細胞などに分布しており、EGFR阻害剤によって皮膚のEGFR活性が著しく阻害されると、ケラチノサイトの角化異常が起こり、それに加えて上皮細胞から産生されるケモカインにより炎症が起こり、様々な皮膚障害が惹起されると考えられている。このEGFR阻害剤誘発性皮膚発疹の管理には抗生物質、外用ステロイド薬、保湿による対症療法が中心であり、効果は限定的である（非特許文献３）。依然として重度の皮膚障害に苦しむ患者がおり、より効果的な治療法が切望されている。
一方、EGFR(上皮成長因子受容体)阻害剤は、結腸癌、直腸癌ならびに頭頸部、肺、膵臓、乳房の悪性腫瘍に使用される効果的な分子標的薬である。EGFRは上皮成長因子（EGF）が細胞外ドメインに結合することで細胞内ドメインがコンフォメーション変化するためATPがチロシンキナーゼ（TK）ドメインに入り、チロシン残基がリン酸化され活性化される。活性化EGFRは下流のMAPK経路とAKT経路によって腫瘍細胞の増殖、転移、接着、血管新生、およびアポトーシスの阻害を増強する。多くの腫瘍は、正常組織に比較して、感受性が高い変異ＥＧＦＲを過剰に発現していることから、EGFR阻害剤によってEGFRの活性化を抑制することで腫瘍細胞の増殖、転移、接着、血管新生、およびアポトーシスの阻害が抑制されることになる。これが腫瘍細胞増殖機構の1つと考えられている。
EGFR阻害剤にはチロシンキナーゼ阻害薬(EGFR-TKI)（ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ)と細胞外ドメインのモノクローナル抗体薬(セツキシマブとパニツムマブ)の２つのカテゴリーがあり、いずれも皮膚障害の副作用の出現頻度が極めて高く、治療中断の大きな原因であり、患者のQOLやアドヒアランスの大きな障害となっている（非特許文献２）。
EGFRは正常皮膚組織においても上皮細胞などに分布しており、EGFR阻害剤によって皮膚のEGFR活性が著しく阻害されると、ケラチノサイトの角化異常が起こり、それに加えて上皮細胞から産生されるケモカインにより炎症が起こり、様々な皮膚障害が惹起されると考えられている。このEGFR阻害剤誘発性皮膚発疹の管理には抗生物質、外用ステロイド薬、保湿による対症療法が中心であり、効果は限定的である（非特許文献３）。依然として重度の皮膚障害に苦しむ患者がおり、より効果的な治療法が切望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】特表2008-536865
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Seo W., et al., Nature Communications (2020)11:1562.
【非特許文献2】Lacouture ME. Mechanisms of cutaneous toxicities to EGFR inhibitors. Nat Rev Cancer, 2006;6:803-812.
【非特許文献3】Papoui E., et al. The extent to which the last decade has yielded additional treatment options for EGFR-associated rash besides classic treatment with antibiotics and corticosteroids - A systematic review, Europ J Oncol Nurs, 50 (2021) 101896.
【非特許文献4】Beier JI, von Montfort C, Sies H, Klotz LO. Activation of ErbB2 by 2-methyl-1,4-naphthoquinone (menadione) in human keratinocytes: Role of EGFR and protein tyrosine phosphatases. Febs Letters 2006; 580:1859-1864.
【非特許文献5】Perez-Soler R, Zou YY, Li TH, Ling YH. RETRACTED: The Phosphatase Inhibitor Menadione (Vitamin K3) Protects Cells from EGFR Inhibition by Erlotinib and Cetuximab (Retracted article. See vol. 19, pg. 4901, 2013). Clinical Cancer Research 2011; 17(21):6766-6777.
【非特許文献6】Eriksen JG, et al., Placebo-controlled phase II study of vitamin K3 cream for the treatment of cetuximab-induced rash. Supportive Care in Cancer, 2017; 25:2179-2185.
【非特許文献7】Tomkov´a, H., et al., Phytomenadione pre-treatment in EGFR inhibitor-induced folliculitis. J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 2013;27 (4):514-519.
【非特許文献8】Gaiser MR., et al., Evaluation of EGFR inhibitor‐mediated acneiform skin toxicity within the double‐blind randomized EVITA trial: A thorough gender‐specific analysis using the WoMo scoreCancer Medicine. 2019;8:4169-4175.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明者らは、抗癌効果を有するＥＧＦＲ阻害剤で処理されたヒト皮膚ケラチノサイトでは、ケモカインＣＣＬ５発現が誘導され、同時にＵＢＩＡＤ１（活性型ビタミンＫ２（ＭＫＨ）生合成酵素）の発現が低下することを見出した。
また、ヒト皮膚ケラチノサイトにおいてUBIAD1の欠損だけでなく、ビタミンK依存性タンパク質(VKDP)のグルタミン酸残基(Glu VKDP)をγ－カルボキシグルタミン酸残基(Gla VKDP)に翻訳後修飾する酵素γ－グルタミルカルボキシラーゼ(GGCX)の欠損においてもCCL５発現が亢進することを見出した。
そして、ケモカインＣＣＬ５発現とビタミンＫの関係に注目し、炎症性の誘導性ＣＣＬ５の発現抑制に対し、ＭＫＨ誘導体、ビタミンK１ヒドロキノン誘導体(PKH誘導体)及びキノン型ビタミンＫ２（メナキノン－４、ＭＫ－４）の投与を行い、ＣＣＬ５発現に伴う障害の改善を図ることを試みた。
本発明は、ケモカインＣＣＬ５発現と活性型ビタミンK（ＭＫＨとPKH）の相関に関する新規な知見に基づきなされたものであり、その解決すべき課題は新規なケモカインＣＣＬ５発現抑制剤を提供することにある。
また、ヒト皮膚ケラチノサイトにおいてUBIAD1の欠損だけでなく、ビタミンK依存性タンパク質(VKDP)のグルタミン酸残基(Glu VKDP)をγ－カルボキシグルタミン酸残基(Gla VKDP)に翻訳後修飾する酵素γ－グルタミルカルボキシラーゼ(GGCX)の欠損においてもCCL５発現が亢進することを見出した。
そして、ケモカインＣＣＬ５発現とビタミンＫの関係に注目し、炎症性の誘導性ＣＣＬ５の発現抑制に対し、ＭＫＨ誘導体、ビタミンK１ヒドロキノン誘導体(PKH誘導体)及びキノン型ビタミンＫ２（メナキノン－４、ＭＫ－４）の投与を行い、ＣＣＬ５発現に伴う障害の改善を図ることを試みた。
本発明は、ケモカインＣＣＬ５発現と活性型ビタミンK（ＭＫＨとPKH）の相関に関する新規な知見に基づきなされたものであり、その解決すべき課題は新規なケモカインＣＣＬ５発現抑制剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0006】
前述のとおり、本発明者等はメナキノン－４及び特定の構造を有するビタミンＫヒドロキノン誘導体が、ＣＣＬ５発現の抑制機能に優れることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0007】
すなわち、本発明にかかるケモカインＣＣＬ５発現抑制剤は、メナキノン－４及び／または下記一般式（１）で表される。
一般式（１）
一般式（１）
【0008】
【化1】
（式中、R1およびR2はそれぞれ水素原子、またはグリシン、N－アシルグリシン、N－アルキルグリシン、N,N－ジアルキルグリシン、N,N,N－トリアルキルグリシン、アシル、ジカルボン酸ヘミエステル及びその塩、ジカルボン酸アルコールエステルから選ばれる置換基を意味する。R3は下記一般式（２）
【0009】
【化2】
もしくは下記一般式（３）
【0010】
【化3】
で示される基を表す。n は１～７の整数を意味する。)で表される活性型ビタミンＫのカルボン酸エステル類またはその塩を有効成分とすることを特徴とする。
なお、ビタミンＫと皮膚の相関に関しては、Beierらは、ビタミンK3によってHaCaT細胞を100μＭ, 15min間処理処理することで、ホスファターゼ阻害作用によりErbB (EGFRを含む受容体チロシンキナーゼファミリー)を活性化することを報告している（非特許文献４）。
Perez-Soler とLingは、ビタミンK類による皮膚局所治療により皮膚のEGFRを活性化することでEGFR阻害剤の全身作用から皮膚を保護し、EGFR阻害剤による皮膚障害を予防・治療する方法を開示している[特許文献1]。 A431ヒト扁平上皮癌細胞におけるE G F Rの活性化作用は、ビタミンK3(メナジオン)が最も強く(100μＭ)、ビタミンK1(フィロキノン)がその1/10（1000μＭ）であり、ビタミンK2(メナキノン－４)には活性化作用が無いと記されている。この時、ビタミンK3はフォスファターゼ阻害作用を示しEGFR活性体の分解（脱リン酸化）を抑制することでEGFR活性を確保し皮膚障害を予防・治療する。この発明者らは、2011年に特許内容を元にClinical Cancer Researchに研究論文を発表した（非特許文献５）。しかしながら、2013年に公表されたデータへの疑義により、掲載は撤回されている。
この内容をもとに、ビタミンK3とビタミンK1の皮膚外用によるEGFRモノクローナル抗体（セツキシマブ）による皮膚障害の予防・治療の臨床試験が行われている。ビタミンK3を用いたセツキシマブ投与患者における臨床試験では効果がないと判定された（非特許文献６）。また、ビタミンK3は毒性が高く試験が中断されている。
ビタミンK1の臨床試験では、効果がないとするものと有効とするものが混在しており（非特許文献７）、最近の臨床試験(EVITA)では、女性に有効であることが示されている（非特許文献８）。しかし、EGFR-TKI関連皮膚発疹に対するビタミンK3とビタミンK1の有効性に関する報告はない。
【0011】
本発明は、メナキノン－４、ないし前記一般式（１）で表されるビタミンＫヒドロキノンのカルボン酸エステルまたはその塩の少なくとも一種類を有効成分としたケモカインＣＣＬ５発現抑制剤であり、活性型ビタミンＫをケモカイン発現細胞に送達させ、誘導性ＣＣＬ５の発現を抑制して皮膚障害の発生などを抑制し、また恒常性ＣＣＬ５の発現を抑制してがん転移を予防し、しかもビタミンＫ類は安全性が高い。
【0012】
前記一般式（１）で表される化合物は、単独で製剤に含有させることもできるし、その塩として製剤に配合することもできる。本発明において、カルボン酸残基Ｒ１、Ｒ２としては、窒素置換基を有するカルボン酸残基またはジカルボン酸残基が例示される。
窒素置換基を有するカルボン酸残基としては、窒素原子に対し水素原子ないし、１または２のアルキル基、アシル基が結合したものが挙げられる。
前記アルキル基としては、炭素数１～６の直鎖、もしくは分枝のアルキル基であり次のものが例示される。メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、イソプロピル基、イソブチル基、１－メチルプロピル基、tert－ブチル基、１－エチルプロピル基、イソアミル基。上記アルキル基としてはメチル基、エチル基が好ましい。また、アシル基を有する場合の炭化水素鎖も同様に定義可能である。
窒素置換基を有するカルボン酸残基としては、窒素原子に対し水素原子ないし、１または２のアルキル基、アシル基が結合したものが挙げられる。
前記アルキル基としては、炭素数１～６の直鎖、もしくは分枝のアルキル基であり次のものが例示される。メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、イソプロピル基、イソブチル基、１－メチルプロピル基、tert－ブチル基、１－エチルプロピル基、イソアミル基。上記アルキル基としてはメチル基、エチル基が好ましい。また、アシル基を有する場合の炭化水素鎖も同様に定義可能である。
【0013】
アミノ基とカルボニル基の間は、好ましくは炭素数１～７の直鎖、分枝または環状のアルキレン基で結合される。分枝状のアルキレン基としては、次のものが例示される。イソプロピル、イソブチル、tert－ブチル、１－エチルプロピルなどのアルキル基から誘導されたもの。
前記環状アルキレン基としては、次のものが例示される。
シクロペンタン環、シクロヘキサン環、あるいはメチルシクロヘキサン環などを構造中に含むもの。上記アルキレン基としては、メチレン基あるいはエチレン基が特に好ましい。
前記環状アルキレン基としては、次のものが例示される。
シクロペンタン環、シクロヘキサン環、あるいはメチルシクロヘキサン環などを構造中に含むもの。上記アルキレン基としては、メチレン基あるいはエチレン基が特に好ましい。
【0014】
ハロゲン化水素酸塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩などが好ましい。本発明において、ハロゲン化水素酸塩は結晶化ないし固形化する場合が多く、製剤にあたっての取り扱いが容易になるという利点がある。その他の塩としては次のものが例示される。アルキルスルホン酸塩としてはメタンスルホン酸塩等、糖酸塩としてはグルコン酸塩、グルコヘプタン酸塩、ラクトビオン酸塩等。
【0015】
本発明において、ジカルボン酸残基Ｒ１、Ｒ２は、ジカルボン酸及びそのアルカリ金属塩またはメグルミン塩の残基から選ばれる。ジカルボン酸残基のカルボニル基間は炭素数２～４の直鎖のアルキレン基で結合される。アルキレン基としては、エチレン基またはプロピレン基が特に好ましい。アルカリ金属塩としてナトリウム塩、カリウム塩が好ましい。
【0016】
本発明において、ジカルボン酸ダブルエステルはジカルボン酸残基のカルボニル基間は炭素数２～４の直鎖のアルキレン基で結合される。アルキレン基としては、エチレン基またはプロピレン基が特に好ましい。ダブルエステルのアルコール残基は炭素１～３のアルキル基が好ましく特にエチル基が好ましい。
【0017】
また、本発明において、一般式（１）で表される化合物の製造方法は種々考えられるが，代表的な方法を述べれば以下の通りである。
【0018】
【化4】
【0019】
一般式（５）で表されるビタミンＫ類を還元剤で還元し、一般式（６）で表されるビタミンＫヒドロキノンとし、この ビタミンＫヒドロキノンと、窒素置換基を有するカルボン酸、若しくはその反応性酸誘導体またはこれらのハロゲン化水素酸塩、または酸無水物とを常法によりエステル化反応を行なうことにより、本発明の目的物質（１）を得ることができる。ここで用いられる還元剤はビタミンＫ類のナフトキノン骨格をナフトヒドロキノン骨格に還元するものであり、水素化ホウ素ナトリウム、ハイドロサルファイトナトリウム、トリ－ｎ－ブチルホスフィン、塩化亜鉛、塩化第一スズ、亜鉛末などを挙げることができる。
【0020】
ビタミンＫヒドロキノンのエステル化反応は常法に従うが、１級、２級アミノ基あるいは側鎖に水酸基、チオール基を有するアミノ酸のエステル化を行なう際は、tert－ブトキシカルボニル基（以下 t－BOC 基と略記） 、ベンジルオキシカルボニル基（以下Ｚ基と略記）、９－フルオレニルメトキシカルボニル基（以下ＦＭＯＣ基と略記）などの適切な保護基で保護して用い、N,N－ジアルキルアミノ酸はハロゲン化水素酸塩を用いて、ジシクロヘキシルカルボジイミド（以下DCC と略記） 、N,N－ジサクシニミドオキザレート（以下DSO と略記） などの活性エステル化試薬の存在下に反応を行なうことが好ましい結果を与える。この際溶媒としては無水ピリジンが好ましい。また、反応性酸誘導体を用いる方法では、酸ハロゲナイトとりわけ、酸クロリドを用いる方法が好ましい結果を与える。この際溶媒としては無水ベンゼン－無水ピリジン混合物が好ましい。ハロゲン化水素酸塩、アルキルスルホン酸塩、糖酸塩は常法により遊離のビタミンＫヒドロキノン窒素含有カルボン酸エステルとハロゲン化水素酸、アルキルスルホン酸、酸性糖のラクトン体を反応させて製造する。また、 N－アシルアミノ酸エステルを製造した後、常法によりハロゲン化水素酸で脱保護基化することによってハロゲン化水素酸塩を製造することができる。
【0021】
なお、ジカルボン酸ヘミエステルは、一般式（５）で表されるビタミンＫ類を酢酸酸性下、亜鉛末、酸無水物と触媒（酢酸ナトリウムあるいは４ジメチルアミノピリジン）を加熱下反応させビタミンKヒドロキノンカルボン酸ヘミエステル化させて製造することができる。
【0022】
なお、ジカルボン酸ダブルエステルは、一般式（５）で表されるビタミンＫ類を酢酸酸性下、亜鉛末、酸無水物と触媒（酢酸ナトリウムあるいは４ジメチルアミノピリジン）を加熱下反応させビタミンKヒドロキノンカルボン酸ヘミエステルとし、さらに酸性触媒下、アルコールでエステル化させて得る。また、上記一般式（１）で得られたビタミンKヒドロキノンカルボン酸ヘミエステルを酸性触媒下、アルコールでエステル化させて得る。
【0023】
本発明のビタミンＫヒドロキノン誘導体は投与剤型の自由度が高く、経口投与、経皮投与、経鼻投与、注射投与などが採用できる。添加剤として、等張化剤、緩衝剤、ｐＨ調節剤、可溶化剤、増粘剤（分散剤）、粘膜付着剤、安定化剤（抗酸化剤）、保存剤（防腐剤）、吸収促進剤等を適宜配合することにより、周知の方法で製剤化することができる。また、ｐＨ調節剤、増粘剤、分散剤等を添加し、薬物を懸濁化させることによって、安定な点眼剤や点鼻液剤を得ることもできる。
【0024】
等張化剤としては、医薬上、薬理学的に（製薬上）又は生理学的に許容されるものであれば特に制限されず、例えば、イオン性等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等が挙げられ、非イオン性等張化剤としてはグリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール、マンニトール等が挙げられる。
【0025】
緩衝剤としては、医薬上、薬理学的に（製薬上）又は生理学的に許容されるものであれば特に制限されず、例えば、リン酸、リン酸塩、クエン酸、酢酸若しくはε－アミノカプロン酸等を挙げることができる。
【0026】
ｐＨ調節剤としては、医薬上、薬理学的に（製薬上）又は生理学的に許容されるものであれば特に制限されず、例えば、塩酸、リン酸、クエン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ホウ酸、ホウ砂、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等が挙げられる。点眼剤のｐＨは眼科製剤に許容される範囲内にあればよいが、４．０～９．０であり、より好ましくは５．５～８．５となる範囲が挙げられる。
【0027】
可溶化剤としては、医薬上、薬理学的に（製薬上）又は生理学的に許容されるものであれば特に制限されず、例えば、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ビタミンＥ ＴＰＧＳ、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。
【0028】
増粘剤、分散剤及び粘膜付着剤としては、医薬上、薬理学的に（製薬上）又は生理学的に許容されるものであれば特に制限されず、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース若しくはヒドロキシプロピルセルロース等のセルロース系高分子；ポリビニルアルコール；又はポリビニルピロリドン等を挙げることができる。
【0029】
安定化剤としては、医薬上、薬理学的に（製薬上）又は生理学的に許容されるものであれば特に制限されず、例えば、エデト酸、エデト酸一ナトリウム、エデト酸二ナトリウム、エデト酸四ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられ、エデト酸ナトリウムは水和物であってもよい。
【0030】
抗酸化剤としては、医薬上、薬理学的に（製薬上）又は生理学的に許容されるものであれば特に制限されず、例えば、アスコルビン酸、ビタミンＥ、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、エリソルビン酸ナトリウム、没食子酸プロピル、亜硫酸ナトリウム等が挙げられる。
【0031】
保存剤（防腐剤）としては、医薬上、薬理学的に（製薬上）又は生理学的に許容されるものであれば特に制限されず、例えば、ベンザルコニウム塩化物、ベンザルコニウム臭化物、ベンゼトニウム塩化物、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル、クロロブタノール等が挙げられ、これらの保存剤を組み合わせて使用することもできる。
なお、本発明にかかるケモカインＣＣＬ５発現抑制剤をＥＧＦＲ阻害剤による皮膚障害の支持療法として用いる場合、クリーム、軟膏、スプレー剤などの皮膚外用剤として用いることが好適である。
また、恒常性ＣＣＬ５発現抑制に用いる場合には、肺をターゲットとする吸引剤として用いることが好適である。
さらにアレルギー性炎症においてもＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）が高く発現することが示されており、その抑制に本発明のケモカインＣＣＬ５発現抑制剤を用いる場合には、皮膚外用剤または吸引剤として用いることが好適である。
なお、本発明にかかるケモカインＣＣＬ５発現抑制剤をＥＧＦＲ阻害剤による皮膚障害の支持療法として用いる場合、クリーム、軟膏、スプレー剤などの皮膚外用剤として用いることが好適である。
また、恒常性ＣＣＬ５発現抑制に用いる場合には、肺をターゲットとする吸引剤として用いることが好適である。
さらにアレルギー性炎症においてもＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）が高く発現することが示されており、その抑制に本発明のケモカインＣＣＬ５発現抑制剤を用いる場合には、皮膚外用剤または吸引剤として用いることが好適である。
【発明の効果】
【0032】
以上説明したように本発明にかかるケモカインＣＣＬ５発現抑制剤は、メナキノン－４ないし特定のビタミンＫ誘導体によりＣＣＬ５発現を抑制し、ＣＣＬ５発現に伴う各種障害の改善を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【図1】EGFR阻害剤の抗腫瘍作用と副作用の説明図である。
【図2】EGFR阻害剤によるヒト皮膚ケラチノサイトにおけるCCL5発現状態の説明図である。
【図3】EGFR阻害剤 (EGFR-TKI) による、ヒト皮膚ケラチノサイトにおけるUBIAD1（活性型ビタミンＫ２合成酵素）発現状態の説明図である。
【図4】EGFR阻害剤（モノクローナル抗体）による、ヒト皮膚ケラチノサイトにおけるUBIAD1発現状態の説明図である。
【図5】ヒト皮膚ケラチノサイトにおける、CCL5発現に及ぼすUBIAD1ノックダウンの影響の説明図である。
【図6】ヒト皮膚ケラチノサイトにおける、CCL5発現に及ぼすGGCX(γ-glutamyl carboxylase)ノックダウンの影響の説明図である。
【図7】ヒト皮膚ケラチノサイトにおける、GGCX発現に及ぼすEGFR阻害剤の影響の説明図である。
【図8】EGFR阻害剤を処理したヒト皮膚ケラチノサイトにおける、MK-4,MKH誘導体のMKH送達性の説明図である。
【図9】EGFR阻害剤による、誘導性CCL5に対するMKH誘導体およびMK-4の効果の説明図である。
【図10】EGFR阻害剤による誘導性CCL5発現と、MKHによる発現抑制の説明図である。
【図11】非炎症性細胞への活性型ビタミンK(VKH)送達性の説明図である。
【図12】CCL5 タンパク発現に対するVKH誘導体の効果の説明図である。
【発明を実施するための形態】
【0034】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細な説明を行う。
本発明者らは、ＥＧＦＲ阻害剤の抗腫瘍作用とその副作用に関し検討を行う過程で、ＣＣＬ５発現とビタミンＫ誘導体の関係について知見を得た。
すなわち、図１に示すように、ＥＧＦ（上皮成長因子）が細胞膜上にある上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合すると、細胞を分化、増殖させる。正常組織において、細胞の分化、発達、増殖等に重要な役割を果たしているが、このＥＧＦＲに異常を生じると、発癌、癌の増殖、浸潤、転移などに関与する。
このため、癌細胞のＥＧＦＲを阻害することで抗癌効果を期待することができる。
ＥＧＦＲ阻害剤は優れた分子標的薬であるが、副作用である皮膚障害の発症率が高く、治療の中断や患者のＱＯＬあるいはアドヒアランスの大きな障害となっている。
本発明者らは、ＥＧＦＲ阻害剤の抗腫瘍作用とその副作用に関し検討を行う過程で、ＣＣＬ５発現とビタミンＫ誘導体の関係について知見を得た。
すなわち、図１に示すように、ＥＧＦ（上皮成長因子）が細胞膜上にある上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合すると、細胞を分化、増殖させる。正常組織において、細胞の分化、発達、増殖等に重要な役割を果たしているが、このＥＧＦＲに異常を生じると、発癌、癌の増殖、浸潤、転移などに関与する。
このため、癌細胞のＥＧＦＲを阻害することで抗癌効果を期待することができる。
ＥＧＦＲ阻害剤は優れた分子標的薬であるが、副作用である皮膚障害の発症率が高く、治療の中断や患者のＱＯＬあるいはアドヒアランスの大きな障害となっている。
【0035】
［ＥＧＦＲ阻害剤による、ヒト皮膚ケラチノサイトにおけるＣＣＬ５の発現惹起］
本発明者らは、ヒト皮膚ケラチノサイト（ＨａＣａＴ細胞）にＥＧＦＲ阻害剤（Ｇｅfｉｔｉｎｉｂ，Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ，Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）を添加し、２４時間培養した。２４時間後の細胞を回収し、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲを用いてＣＣＬ５のｍＲＮＡ発現を評価した。
結果を図２に示す。
図２に示す結果より、ＥＧＦＲ阻害剤はＨａＣａＴ細胞において、ＣＣＬ５ ｍＲＮＡ発現を濃度依存的に増加させていることが理解され、ＥＧＦＲ阻害剤が炎症性の誘導性ＣＣＬ５の発現を亢進することが示された。
したがって、ＥＧＦＲ阻害剤による副作用、特に皮膚障害は誘導性ＣＣＬ５の過剰発現に起因すると考えられる。
本発明者らは、ヒト皮膚ケラチノサイト（ＨａＣａＴ細胞）にＥＧＦＲ阻害剤（Ｇｅfｉｔｉｎｉｂ，Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ，Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）を添加し、２４時間培養した。２４時間後の細胞を回収し、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲを用いてＣＣＬ５のｍＲＮＡ発現を評価した。
結果を図２に示す。
図２に示す結果より、ＥＧＦＲ阻害剤はＨａＣａＴ細胞において、ＣＣＬ５ ｍＲＮＡ発現を濃度依存的に増加させていることが理解され、ＥＧＦＲ阻害剤が炎症性の誘導性ＣＣＬ５の発現を亢進することが示された。
したがって、ＥＧＦＲ阻害剤による副作用、特に皮膚障害は誘導性ＣＣＬ５の過剰発現に起因すると考えられる。
【0036】
［ＥＧＦＲ阻害剤によるヒト皮膚ケラチノサイトにおけるＵＢＩＡＤ１発現抑制］
本発明者らは、ＨａＣａＴ細胞にＥＧＦＲ阻害剤（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ，Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）を添加し、２４時間培養した。２４時間後の細胞のＵＢＩＡＤ１タンパク発現及びｍＲＮＡ発現を評価した。
結果を図３に示す。
図３より明らかなように、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬は、ＨａＣａＴ細胞のＵＢＩＡＤ１のｍＲＮＡ発現とタンパク発現を濃度依存的に抑制し、ＵＢＩＡＤ１の発現減少により、ＭＫＨの生成低下が生じている可能性が示唆された。
本発明者らは、ＨａＣａＴ細胞にＥＧＦＲ阻害剤（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ，Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）を添加し、２４時間培養した。２４時間後の細胞のＵＢＩＡＤ１タンパク発現及びｍＲＮＡ発現を評価した。
結果を図３に示す。
図３より明らかなように、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬は、ＨａＣａＴ細胞のＵＢＩＡＤ１のｍＲＮＡ発現とタンパク発現を濃度依存的に抑制し、ＵＢＩＡＤ１の発現減少により、ＭＫＨの生成低下が生じている可能性が示唆された。
【0037】
［ＥＧＦＲ阻害剤によるヒト皮膚ケラチノサイトにおけるＵＢＩＡＤ１発現抑制２］
本発明者らは、ＨａＣａＴ細胞にＥＧＦＲ阻害剤（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）を添加し、２４時間培養した。２４時間後の細胞のＵＢＩＡＤ１タンパク発現及びｍＲＮＡ発現を評価した。
結果を図４に示す。
図４に示す結果より、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）は、ＨａＣａＴ細胞のＵＢＩＡＤ１のｍＲＮＡ発現とタンパク発現を濃度依存的に抑制し、ＵＢＩＡＤ１の発現減少により、ＭＫＨの生成低下が生じている可能性が示唆された。
本発明者らは、ＨａＣａＴ細胞にＥＧＦＲ阻害剤（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）を添加し、２４時間培養した。２４時間後の細胞のＵＢＩＡＤ１タンパク発現及びｍＲＮＡ発現を評価した。
結果を図４に示す。
図４に示す結果より、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）は、ＨａＣａＴ細胞のＵＢＩＡＤ１のｍＲＮＡ発現とタンパク発現を濃度依存的に抑制し、ＵＢＩＡＤ１の発現減少により、ＭＫＨの生成低下が生じている可能性が示唆された。
【0038】
［ＣＣＬ５発現に及ぼすＵＢＩＡＤ１ノックダウンの影響］
本発明者らは、ヒト皮膚ケラチノサイトにおけるＣＣＬ５発現に及ぼすＵＢＩＡＤ１ノックダウンの影響について検討を行った。
ｓｉＵＢＩＡＤ１処理２４時間後のＨａＣａＴ細胞におけるＵＢＩＡＤ１のタンパク及びｍＲＮＡ発現と、ＣＣＬ５ ｍＲＮＡ発現について評価した。
結果を図５に示す。
図５より明らかなように、ＵＢＩＤ１のノックダウン処理により、ＣＣＬ５のｍＲＮＡ発現が増加し、ＵＢＩＡＤ１によるＭＫＨの生合成量の低下がＣＣＬ５の発現抑制に関与していることが示唆された。
このように、ヒト皮膚ケラチノサイト(HaCaT)をEGFR阻害剤（EGFR-TKIとEGFRモノクローナル抗体薬の両方）で処理することで炎症性ケモカインCCL5（誘導性CCL5）の発現が惹起され(図２)、同時にメナキノン-4(MK-4, ビタミンK2)の２電子還元体である活性型ビタミンK２(メナヒドロキノン-4、M K H)の生体内合成酵素であるUBIAD1の発現が有意に低下することを見出した（図３、４）。
本発明者らは、ヒト皮膚ケラチノサイトにおけるＣＣＬ５発現に及ぼすＵＢＩＡＤ１ノックダウンの影響について検討を行った。
ｓｉＵＢＩＡＤ１処理２４時間後のＨａＣａＴ細胞におけるＵＢＩＡＤ１のタンパク及びｍＲＮＡ発現と、ＣＣＬ５ ｍＲＮＡ発現について評価した。
結果を図５に示す。
図５より明らかなように、ＵＢＩＤ１のノックダウン処理により、ＣＣＬ５のｍＲＮＡ発現が増加し、ＵＢＩＡＤ１によるＭＫＨの生合成量の低下がＣＣＬ５の発現抑制に関与していることが示唆された。
このように、ヒト皮膚ケラチノサイト(HaCaT)をEGFR阻害剤（EGFR-TKIとEGFRモノクローナル抗体薬の両方）で処理することで炎症性ケモカインCCL5（誘導性CCL5）の発現が惹起され(図２)、同時にメナキノン-4(MK-4, ビタミンK2)の２電子還元体である活性型ビタミンK２(メナヒドロキノン-4、M K H)の生体内合成酵素であるUBIAD1の発現が有意に低下することを見出した（図３、４）。
【0039】
［ＣＣＬ５発現に及ぼすＧＧＣＸノックダウンの影響］
本発明者らは、ヒト皮膚ケラチノサイトにおけるＣＣＬ５発現に及ぼすＧＧＣＸノックダウンの影響について検討を行った。
ＨａＣａＴ細胞にｓｉＧＧＣＸ処理を行い、２４時間後のＧＧＣＸ，ＣＣＬ５のｍＲＮＡ発現量を測定した。
結果を図６に示す。
同図より、ＨａＣａＴ細胞において、ＧＧＣＸノックダウンにより、ＣＣＬ５ ｍＲＮＡ発現が増加していることが理解され、ＶＫ依存性Ｇｌａタンパク質はＣＣＬ５の発現を抑制していることが示唆される。
本発明者らは、ヒト皮膚ケラチノサイトにおけるＣＣＬ５発現に及ぼすＧＧＣＸノックダウンの影響について検討を行った。
ＨａＣａＴ細胞にｓｉＧＧＣＸ処理を行い、２４時間後のＧＧＣＸ，ＣＣＬ５のｍＲＮＡ発現量を測定した。
結果を図６に示す。
同図より、ＨａＣａＴ細胞において、ＧＧＣＸノックダウンにより、ＣＣＬ５ ｍＲＮＡ発現が増加していることが理解され、ＶＫ依存性Ｇｌａタンパク質はＣＣＬ５の発現を抑制していることが示唆される。
【0040】
また、前記図５及び図６に示すように、ＣＣＬ５の発現は、ＵＢＩＡＤ１とＧＧＣＸのいずれか一方が欠損することで誘導され、誘導性ＣＣＬ５の発現抑制にはＵＢＩＡＤ１とＧＧＣＸの両方の機能が必要であることが示唆される。すなわち、活性型ビタミンKがGGCXの補因子として機能しビタミンK依存性タンパク質翻訳後修飾されることでCCL5の発現が抑制されることが示唆されている。
【0041】
［ＧＧＣＸ発現に及ぼすＥＧＦＲ阻害剤の影響］
本発明者らは、ヒト皮膚ケラチノサイトにおけるＧＧＣＸ発現に及ぼすＥＧＦＲ阻害剤の影響について検討を行った。
すなわち、ＨａＣａＴ細胞にＧｅｆｉｔｉｎｉｂを添加し、２４時間培養した。２４時間後の細胞を回収し、非カルボキシル化マトリックスGlaタンパク質(ｕｃＭＧＰ)発現量（ＥＬＩＳＡ法）とＧＧＣＸ ｍＲＮＡ発現（リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法）を評価した。
結果を図７に示す。
同図より、ＥＧＦＲ阻害剤はＨａＣａＴ細胞のＧＧＣＸ ｍＲＮＡ発現には影響せず、一方、ucMGPの増加すなわちMGPの翻訳後修飾が低下したことから、ＥＧＦＲ阻害剤はMKHの生成低下によるＭＫＨ供給のみを低下させることが示唆された。
本発明者らは、ヒト皮膚ケラチノサイトにおけるＧＧＣＸ発現に及ぼすＥＧＦＲ阻害剤の影響について検討を行った。
すなわち、ＨａＣａＴ細胞にＧｅｆｉｔｉｎｉｂを添加し、２４時間培養した。２４時間後の細胞を回収し、非カルボキシル化マトリックスGlaタンパク質(ｕｃＭＧＰ)発現量（ＥＬＩＳＡ法）とＧＧＣＸ ｍＲＮＡ発現（リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法）を評価した。
結果を図７に示す。
同図より、ＥＧＦＲ阻害剤はＨａＣａＴ細胞のＧＧＣＸ ｍＲＮＡ発現には影響せず、一方、ucMGPの増加すなわちMGPの翻訳後修飾が低下したことから、ＥＧＦＲ阻害剤はMKHの生成低下によるＭＫＨ供給のみを低下させることが示唆された。
【0042】
［ＭＫ－４、ＭＫＨ誘導体のＭＫＨ送達性］
次に、本発明者らはＣＣＬ５抑制効果のメカニズムを解明するために、細胞内への活性型ビタミンK（MKHとPKH）送達性を評価した。
本発明において、活性型ビタミンK（MKHとPKH）の前駆体となりえる活性型ビタミンＫヒドロキノン誘導体として、下記のものを評価した。
次に、本発明者らはＣＣＬ５抑制効果のメカニズムを解明するために、細胞内への活性型ビタミンK（MKHとPKH）送達性を評価した。
本発明において、活性型ビタミンK（MKHとPKH）の前駆体となりえる活性型ビタミンＫヒドロキノン誘導体として、下記のものを評価した。
【0043】
【化5】
結果を図８に示す。
図８より明らかなように、ＭＫＨ誘導体及びＭＫ－４はいずれもＥＧＦＲ阻害剤処理ケラチノサイト中のＭＫＨレベルを高くできることが確認された。
【0044】
［誘導性ＣＣＬ５に対するＭＫＨ誘導体及びＭＫ－４の発現抑制効果］
本発明者らは、ＨａＣａＴ細胞にＭＫ－４、ＭＫＨ－ＤＭＧ、ＭＫＨ－ＳＵＣ、ＰＫ（各３μＭ）を添加後２４時間培養し、培地をＥＧＦＲ阻害剤（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ １μＭ、Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ １μＭ、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ １００μｇ／ｍｌ）添加培地に置換し、２４時間培養した。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲを用いて，ＣＣＬ５ ｍＲＮＡ発現をE L I S AによりCCL5タンパク質を評価した。
結果を図９に示す。
同図より明らかなように、ＭＫ－４、ＭＫＨ誘導体は、ＥＧＦＲ－ＴＫＩによる誘導性ＣＣＬ５を低減させ、また抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体による誘導性ＣＣＬ５を低下させた。
本発明者らは、ＨａＣａＴ細胞にＭＫ－４、ＭＫＨ－ＤＭＧ、ＭＫＨ－ＳＵＣ、ＰＫ（各３μＭ）を添加後２４時間培養し、培地をＥＧＦＲ阻害剤（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ １μＭ、Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ １μＭ、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ １００μｇ／ｍｌ）添加培地に置換し、２４時間培養した。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲを用いて，ＣＣＬ５ ｍＲＮＡ発現をE L I S AによりCCL5タンパク質を評価した。
結果を図９に示す。
同図より明らかなように、ＭＫ－４、ＭＫＨ誘導体は、ＥＧＦＲ－ＴＫＩによる誘導性ＣＣＬ５を低減させ、また抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体による誘導性ＣＣＬ５を低下させた。
【0045】
［EGFR阻害剤による誘導性CCL5発現に対する活性型ビタミンKヒドロキノン送達剤の効果］
以上の試験結果より、ＥＧＦＲ阻害剤による副作用に対する、ビタミンＫ投与による軽快について、図１０に示すスキームが立てられる。
すなわち、ＥＧＦＲ阻害剤非投与における正常な場合、還元型ビタミンＫ３とゲラニルゲラニルピロリン酸(ＧＧＰＰ)から、ＵＢＩＡＤ１の酵素作用によりＭＫＨが生合成され、MKHはGGCXの補因子としてGlu VKDPをGla VKDPに翻訳後修飾し、Gla VKDPがCCL5の生成を抑制している。この時、MKHは化学量論的にMKOに代謝される。
EGFR阻害剤未処理のヒト皮膚ケラチノサイトのUBIAD1をsiUBIAD1でノックダウンするとCCL5発現が有意に高くなり、UBIAD1の低下によってCCL5の発現が亢進されることが明らかになった（図５）。また、EGFR阻害剤未処理のヒト皮膚ケラチノサイトのGGCXをsiGGCXでノックダウンするとCCL5発現が有意に高くなり、GGCXの低下によってCCL5の発現が亢進されることが明らかになった（図６）。
以上の試験結果より、ＥＧＦＲ阻害剤による副作用に対する、ビタミンＫ投与による軽快について、図１０に示すスキームが立てられる。
すなわち、ＥＧＦＲ阻害剤非投与における正常な場合、還元型ビタミンＫ３とゲラニルゲラニルピロリン酸(ＧＧＰＰ)から、ＵＢＩＡＤ１の酵素作用によりＭＫＨが生合成され、MKHはGGCXの補因子としてGlu VKDPをGla VKDPに翻訳後修飾し、Gla VKDPがCCL5の生成を抑制している。この時、MKHは化学量論的にMKOに代謝される。
EGFR阻害剤未処理のヒト皮膚ケラチノサイトのUBIAD1をsiUBIAD1でノックダウンするとCCL5発現が有意に高くなり、UBIAD1の低下によってCCL5の発現が亢進されることが明らかになった（図５）。また、EGFR阻害剤未処理のヒト皮膚ケラチノサイトのGGCXをsiGGCXでノックダウンするとCCL5発現が有意に高くなり、GGCXの低下によってCCL5の発現が亢進されることが明らかになった（図６）。
【0046】
以上から、CCL5の発現は、UBIAD1とGGCXのどちらか一方が欠損することで誘導されることが明らかであり、誘導性CCL5の発現抑制にはUBIAD1とGGCXの機能が必要であることが明らかとなった。すなわちMKHとVK依存性Glaタンパク質の低下のどちらか一方あるいは両方の低下によって誘導性CCL5の発現が亢進され、MKHとVK依存性Glaタンパク質の両方の供給あるいはVK依存性Glaタンパク質の供給によって誘導性CCL5の発現が抑制できることが強く示唆された。
【0047】
EGFR阻害剤によってヒト皮膚ケラチノサイト中のGGCXの発現は変化せず、（図７）、EGFR阻害剤によってVK依存性タンパク質の翻訳後修飾は変化しないことが明らかである。従って、EGFR阻害剤投与した皮膚角化細胞では、主としてUBIAD1の低下によるMKH生合成の低下によってVK依存性Glaタンパク質が低下することで誘導性CCL5が高くなっており、細胞内MKHレベルを人工的に確保することでEGFR阻害剤による誘導性CCL5の抑制が可能であると考えられた。そこで、以下のMKH誘導体およびMK-4を用いてヒト皮膚ケラチノサイト中のMKHを高くし（図８）、EGFR阻害剤による誘導性CCL5に対するMKH誘導体およびMK-4の投与の影響を検討した。MKH誘導体およびMK-4は、明らかに誘導性CCL5の発現を有意に抑制できることを発見した（図９）。
【0048】
以上をまとめると、図１０に示すようにEGFR-TKIとモノクローナル抗体の両方のEGFR阻害剤によりヒト皮膚ケラチノサイト中のUBIAD1の発現が低下し、GGCXの補因子であるMKHの生合成が低下するためVK依存性タンパク質の翻訳後修飾が低下しVK依存性Glaタンパク質が低下することで誘導性CCL5の発現が高くなる。EGFR阻害剤皮膚障害モデルに対してMKH誘導体やMK-4の投与により低下したMKHを細胞に送達することで低下したVK依存性Glaタンパク質生成を亢進することにより誘導性CCL5の発現が抑制されることが明らかである。すなわち、MKH誘導体やMK-4によるケラチノサイトへのMKH送達することでVK依存性Glaタンパク質生成の亢進はEGFR-TKIとモノクローナル抗体の両方のEGFR阻害剤の皮膚障害を抑制する方法を提供することになる。また、VK依存性Glaタンパク質をケラチノサイトに直接供給することによってもEGFR-TKIとモノクローナル抗体の両方のEGFR阻害剤の皮膚障害を抑制する方法を提供することになる。これらの方法はこれまでに明らかにされず本研究で初めて明らかになった。
【0049】
ＥＧＦＲ阻害剤投与では、ＵＢＩＡＤ１の発現が抑制されるためMKHの生成が低下し、Gla VKDPの生成が減少する。Ｇｌａ ＶＫＤＰはＣＣＬ５の発現抑制を行っているため、Ｇｌａ ＶＫＤＰの減少によりＣＣＬ５の発現量が増加し、各種障害を誘発する。
GGCXの補因子としてMKH以外にビタミンK１ヒドロキノン(PKH)も補因子として機能できるので、活性型ビタミンK（MKHとPKH）を外部より供給し、ＭＫＨ量を増加させれば、ＧＧＣＸの作動によりＧｌａ ＶＫＤＰの生成量が増加し、ＣＣＬ５の発現を抑制することができる。活性型ビタミンK（MKHとPKH）は極めて酸化され易い為、投与することはできない。本発明者はMKH誘導体、PKH誘導体、キノン型MK-4の投与によってＣＣＬ５の発現抑制を可能にした。
GGCXの補因子としてMKH以外にビタミンK１ヒドロキノン(PKH)も補因子として機能できるので、活性型ビタミンK（MKHとPKH）を外部より供給し、ＭＫＨ量を増加させれば、ＧＧＣＸの作動によりＧｌａ ＶＫＤＰの生成量が増加し、ＣＣＬ５の発現を抑制することができる。活性型ビタミンK（MKHとPKH）は極めて酸化され易い為、投与することはできない。本発明者はMKH誘導体、PKH誘導体、キノン型MK-4の投与によってＣＣＬ５の発現抑制を可能にした。
【0050】
［恒常性ＣＣＬ５の発現抑制効果］
非炎症時の恒常性ＣＣＬ５に関して、非免疫組織における恒常性ＣＣＬ５の発現を低下させると、Ｔ細胞とナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）が活性化状態を獲得し、癌の転移や増殖を抑制することが知られている。
このため、恒常性ＣＣＬ５の発現抑制は、効果的な癌免疫療法を提供することになり、恒常性ＣＣＬ５発現抑制剤が望まれている。
本発明者らは以下に恒常性ＣＣＬ５の発現抑制効果について検討を行った。
非炎症時の恒常性ＣＣＬ５に関して、非免疫組織における恒常性ＣＣＬ５の発現を低下させると、Ｔ細胞とナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）が活性化状態を獲得し、癌の転移や増殖を抑制することが知られている。
このため、恒常性ＣＣＬ５の発現抑制は、効果的な癌免疫療法を提供することになり、恒常性ＣＣＬ５発現抑制剤が望まれている。
本発明者らは以下に恒常性ＣＣＬ５の発現抑制効果について検討を行った。
【0051】
［非炎症性細胞への活性型ビタミンＫ（ＶＫＨ）送達性］
本発明者らはＨａＣａＴ細胞にＭＫ－４、ＭＫＨ－ＤＭＧ、ＭＫＨ－ＳＵＣ、ＰＫ、ＰＫＨ－ＳＵＣ（５μＭ）を添加し、７２時間経過までの細胞内ビタミンKエポキシド(MKO, PKO)量を測定し、活性体(MKHとPKH)の送達性を評価した。
結果を図１１に示す。
同図より明らかなように、ＭＫ－４、ＭＫＨ誘導体はいずれも非炎症性細胞へ活性体MKHを送達されることが示された。PKH誘導体はPKH-SUCが効率的に活性体PKHを送達できることが示された。
本発明者らはＨａＣａＴ細胞にＭＫ－４、ＭＫＨ－ＤＭＧ、ＭＫＨ－ＳＵＣ、ＰＫ、ＰＫＨ－ＳＵＣ（５μＭ）を添加し、７２時間経過までの細胞内ビタミンKエポキシド(MKO, PKO)量を測定し、活性体(MKHとPKH)の送達性を評価した。
結果を図１１に示す。
同図より明らかなように、ＭＫ－４、ＭＫＨ誘導体はいずれも非炎症性細胞へ活性体MKHを送達されることが示された。PKH誘導体はPKH-SUCが効率的に活性体PKHを送達できることが示された。
【0052】
［恒常性ＣＣＬ５タンパク質発現に対するＶＫＨ誘導体の効果］
本発明者らはＨａＣａＴ細胞にＭＫ－４、ＭＫＨ－ＤＭＧ、ＭＫＨ－ＳＵＣ、ＰＫ、ＰＫＨ－ＳＵＣをそれぞれ１，３，１０μＭ添加し、２４時間培養した。培養後に細胞中のＣＣＬ５ ｍＲＮＡ発現及び上清中のＣＣＬ５タンパク質発現を評価した。
結果を図１２に示す。
同図より明らかなように、各ＶＫＨ誘導体は、おおよそ濃度依存的にＣＣＬ５タンパク質発現を抑制した。
本発明者らはＨａＣａＴ細胞にＭＫ－４、ＭＫＨ－ＤＭＧ、ＭＫＨ－ＳＵＣ、ＰＫ、ＰＫＨ－ＳＵＣをそれぞれ１，３，１０μＭ添加し、２４時間培養した。培養後に細胞中のＣＣＬ５ ｍＲＮＡ発現及び上清中のＣＣＬ５タンパク質発現を評価した。
結果を図１２に示す。
同図より明らかなように、各ＶＫＨ誘導体は、おおよそ濃度依存的にＣＣＬ５タンパク質発現を抑制した。
【0053】
［恒常性CCL5の発現抑制効果］
非炎症時の恒常性CCL5に関して、非免疫組織における恒常性CCL5の発現を低下するとT細胞とナチュラルキラー細胞(NK細胞)が活性化状態を獲得し、がんの転移や増殖を抑制することが明らかにされ、非免疫組織での抗腫瘍免疫細胞の機能特性の調整におけるCCL5の新たな役割が明らかにされた。すなわち、恒常性CCL5の発現抑制は、効果的ながん免疫療法を提供することになり、恒常性CCL5発現抑制剤が望まれている。[非特許論文１]
非炎症時の恒常性CCL5に関して、非免疫組織における恒常性CCL5の発現を低下するとT細胞とナチュラルキラー細胞(NK細胞)が活性化状態を獲得し、がんの転移や増殖を抑制することが明らかにされ、非免疫組織での抗腫瘍免疫細胞の機能特性の調整におけるCCL5の新たな役割が明らかにされた。すなわち、恒常性CCL5の発現抑制は、効果的ながん免疫療法を提供することになり、恒常性CCL5発現抑制剤が望まれている。[非特許論文１]
【0054】
そこで、図１１及び１２により、恒常性CCL5発現が有意に低下し、VKH送達剤には恒常性CCL5の低下作用を有することを明らかとした。また、VKHの細胞内送達によって細胞内VK依存性Glaタンパク質レベルを高くすることでCCL5が低下したことが明らかである。VK依存性Glaタンパク質の細胞内送達によりCCL5発現の抑制が可能であることが示された。
【0055】
以上の結果、VKH送達剤は非免疫細胞における恒常性CCL5の発現抑制を可能にできることから、非免疫組織におけるNK細胞の活性化をもたらすことで、新たながん免疫療法として機能できることが示された。
また、ＥＧＦＲ阻害剤を投与した際にも、ＥＧＦＲ阻害剤の抗癌作用には何ら影響を及ぼさずに副作用を軽減し、ビタミンＫ誘導体の安全性も極めて高い。
また、ＥＧＦＲ阻害剤を投与した際にも、ＥＧＦＲ阻害剤の抗癌作用には何ら影響を及ぼさずに副作用を軽減し、ビタミンＫ誘導体の安全性も極めて高い。
【実施例0056】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されるものではない。
実施例１～３４
下記の製造方法Ａ～Ｉに示す方法により表１～５に示すビタミンＫヒドロキノン誘導体を製造した。また、得られた物質の質量スペクトル（イオン化方法；ＦＤ法およびFAB法）、1H-NMR スペクトルを表６～８に示す。
実施例１～３４
下記の製造方法Ａ～Ｉに示す方法により表１～５に示すビタミンＫヒドロキノン誘導体を製造した。また、得られた物質の質量スペクトル（イオン化方法；ＦＤ法およびFAB法）、1H-NMR スペクトルを表６～８に示す。
【0057】
製造方法Ａ
アミノ酸0.1 molを蒸留水－ジオキサン（１：１、v／v） 100mlに溶解し、トリエチルアミン30 mlを加え、ジ－tert－ブチルジカルボネートを徐々に加え30分間室温で撹拌する。減圧下ジオキサンを留去し、炭酸水素ナトリウム水溶液（0.5M）50 mlを加え酢酸エチル100 mlで洗う。酢酸エチル層を50 mlの炭酸水素ナトリウム液で洗い、水層を合わせて氷冷下でクエン酸水溶液(0.5M)を加えて酸性（pH３）とし、塩化ナトリウムを飽和させた後、酢酸エチルで抽出する(100 ml×３回)、抽出液を無水硫酸ナトリウムで脱水後減圧下溶媒を留去し、油状残渣をイソプロピルエーテルを加えるか、または冷却にて結晶化させて、N－t－BOC－アミノ酸を得る。ビタミンＫ6.75 mmolをイソプロピルエーテル40 mlに溶解し、水素化ホウ素ナトリウム47 mmolをメタノール15 mlに溶解して加え、溶液の黄色が無色になるまで室温で撹拌する。反応液にイソプロピルエーテル60 mlと蒸留水100 mlを加え、イソプロピルエーテル層を分離し、更に水層にイソプロピルエーテル100 mlを加えて可溶画分を抽出し、イソプロピルエーテル層を合わせて無水硫酸ナトリウムで脱水後減圧下濃縮する。残渣に ｎ－ヘキサンを加えて白色沈殿を析出させてビタミンＫヒドロキノンを得る。
アミノ酸0.1 molを蒸留水－ジオキサン（１：１、v／v） 100mlに溶解し、トリエチルアミン30 mlを加え、ジ－tert－ブチルジカルボネートを徐々に加え30分間室温で撹拌する。減圧下ジオキサンを留去し、炭酸水素ナトリウム水溶液（0.5M）50 mlを加え酢酸エチル100 mlで洗う。酢酸エチル層を50 mlの炭酸水素ナトリウム液で洗い、水層を合わせて氷冷下でクエン酸水溶液(0.5M)を加えて酸性（pH３）とし、塩化ナトリウムを飽和させた後、酢酸エチルで抽出する(100 ml×３回)、抽出液を無水硫酸ナトリウムで脱水後減圧下溶媒を留去し、油状残渣をイソプロピルエーテルを加えるか、または冷却にて結晶化させて、N－t－BOC－アミノ酸を得る。ビタミンＫ6.75 mmolをイソプロピルエーテル40 mlに溶解し、水素化ホウ素ナトリウム47 mmolをメタノール15 mlに溶解して加え、溶液の黄色が無色になるまで室温で撹拌する。反応液にイソプロピルエーテル60 mlと蒸留水100 mlを加え、イソプロピルエーテル層を分離し、更に水層にイソプロピルエーテル100 mlを加えて可溶画分を抽出し、イソプロピルエーテル層を合わせて無水硫酸ナトリウムで脱水後減圧下濃縮する。残渣に ｎ－ヘキサンを加えて白色沈殿を析出させてビタミンＫヒドロキノンを得る。
【0058】
ビタミンＫヒドロキノン、 N－t－BOC－アミノ酸13.55 mmol 、DCC 13.55 mmolを無水ピリジン50 mlに加え室温で20時間撹拌する。溶媒を減圧下留去し、残渣に酢酸エチルを加えて可溶画分を抽出する(100ml×２回)、抽出液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離溶媒； ｎ－ヘキサン－イソプロピルエーテル）で分離精製し、ビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－N－t－BOC－アミノ酸を得る。ビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－N－t－BOC－アミノ酸を少量のアセトンに溶解し、塩酸－ジオキサン(2.5～4.0N) をエステル量の約20倍モル量の塩酸量に相当する量加え１時間撹拌後、減圧下溶媒を留去する。残渣をアセトン－メタノール系で再結晶してビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－アミノ酸エステルの塩酸塩を得る。
【0059】
製造方法Ｂ
ビタミンＫ 6.75 mmolをイソプロピルエーテル40 mlに溶解し、水素化ホウ素ナトリウム47 mmolをメタノール15 mlに溶解して加え、溶液の黄色が無色になるまで室温で撹拌する。反応液にイソプロピルエーテル60mlと蒸留水100 mlを加え、イソプロピルエーテル層を分離し、更に水層にイソプロピルエーテル100 mlを加えて可溶画分を抽出、イソプロピルエーテル層を合わせて無水硫酸ナトリウムで脱水後減圧下濃縮する。残渣に ｎ－ヘキサンを加えて白色沈殿を析出させてビタミンＫヒドロキノンを得る。ビタミンＫヒドロキノン、塩酸N,N－ジアルキルアミノ酸13.55 mmolまたは塩酸N,N,N－トリアルキルアミノ酸13.55 mmol、DCC 13.55 mmol を無水ピリジン50mlに加え室温で20時間撹拌する。溶媒を減圧下留去し、残渣を、蒸留水に懸濁させ炭酸水素ナトリウムを加えて溶液のpHを７～８にした後に酢酸エチルで抽出する(100 ml×３回)、抽出液を無水硫酸ナトリウムで脱水後減圧下溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離溶媒；イソプロピルエーテル－酢酸エチル）で分離精製し、ビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－N,N－ジアルキルアミノ酸エステルまたはビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－N,N,N－トリアルキルアミノ酸エステルを得る。
ビタミンＫ 6.75 mmolをイソプロピルエーテル40 mlに溶解し、水素化ホウ素ナトリウム47 mmolをメタノール15 mlに溶解して加え、溶液の黄色が無色になるまで室温で撹拌する。反応液にイソプロピルエーテル60mlと蒸留水100 mlを加え、イソプロピルエーテル層を分離し、更に水層にイソプロピルエーテル100 mlを加えて可溶画分を抽出、イソプロピルエーテル層を合わせて無水硫酸ナトリウムで脱水後減圧下濃縮する。残渣に ｎ－ヘキサンを加えて白色沈殿を析出させてビタミンＫヒドロキノンを得る。ビタミンＫヒドロキノン、塩酸N,N－ジアルキルアミノ酸13.55 mmolまたは塩酸N,N,N－トリアルキルアミノ酸13.55 mmol、DCC 13.55 mmol を無水ピリジン50mlに加え室温で20時間撹拌する。溶媒を減圧下留去し、残渣を、蒸留水に懸濁させ炭酸水素ナトリウムを加えて溶液のpHを７～８にした後に酢酸エチルで抽出する(100 ml×３回)、抽出液を無水硫酸ナトリウムで脱水後減圧下溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離溶媒；イソプロピルエーテル－酢酸エチル）で分離精製し、ビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－N,N－ジアルキルアミノ酸エステルまたはビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－N,N,N－トリアルキルアミノ酸エステルを得る。
【0060】
製造方法Ｃ
ビタミンＫ 6.75 mmolをイソプロピルエーテル40mlに溶解し、ハイドロサルファイトナトリウム50 mmolを蒸留水50mlに溶解して加え、イソプロピルエーテルが褐色を呈し、さらに無色になるまで室温で撹拌する。イソプロピルエーテル層を分離し、更に水層にイソプロピルエーテル100 mlを加えて可溶画分を抽出、イソプロピルエーテル層を合わせて無水硫酸ナトリウムで脱水後減圧下濃縮する。残渣にｎ－ヘキサンを加えて白色沈殿を析出させてビタミンＫヒドロキノンを得る。ビタミンＫヒドロキノンに塩酸N,N－ジアルキルアミノ酸6.75 mmol、DCC 6.75 mmolを加え無水ピリジン50ml中で20時間撹拌する。溶媒を減圧下留去し、残渣を、蒸留水に懸濁させ炭酸水素ナトリウムを加えて溶液のpHを７～８にした後酢酸エチルで抽出する(100 ml×３回)、抽出液を無水硫酸ナトリウムで脱水後減圧下溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離溶媒；イソプロピルエーテル－酢酸エチル、３：２）で分離精製し、ビタミンＫヒドロキノン－1－N,N－ジアルキルアミノ酸エステルおよびビタミンＫヒドロキノン－4－N,N－ジアルキルアミノ酸エステルを得る。
ビタミンＫ 6.75 mmolをイソプロピルエーテル40mlに溶解し、ハイドロサルファイトナトリウム50 mmolを蒸留水50mlに溶解して加え、イソプロピルエーテルが褐色を呈し、さらに無色になるまで室温で撹拌する。イソプロピルエーテル層を分離し、更に水層にイソプロピルエーテル100 mlを加えて可溶画分を抽出、イソプロピルエーテル層を合わせて無水硫酸ナトリウムで脱水後減圧下濃縮する。残渣にｎ－ヘキサンを加えて白色沈殿を析出させてビタミンＫヒドロキノンを得る。ビタミンＫヒドロキノンに塩酸N,N－ジアルキルアミノ酸6.75 mmol、DCC 6.75 mmolを加え無水ピリジン50ml中で20時間撹拌する。溶媒を減圧下留去し、残渣を、蒸留水に懸濁させ炭酸水素ナトリウムを加えて溶液のpHを７～８にした後酢酸エチルで抽出する(100 ml×３回)、抽出液を無水硫酸ナトリウムで脱水後減圧下溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離溶媒；イソプロピルエーテル－酢酸エチル、３：２）で分離精製し、ビタミンＫヒドロキノン－1－N,N－ジアルキルアミノ酸エステルおよびビタミンＫヒドロキノン－4－N,N－ジアルキルアミノ酸エステルを得る。
【0061】
製造方法Ｄ
ビタミンＫ 6.75mmolをイソプロピルエーテル40 mlに溶解し、水素化ホウ素ナトリウム47 mmolをメタノール15 mlに溶解して加え、溶液の黄色が無色になるまで室温で撹拌する。反応液にイソプロピルエーテル60mlと蒸留水100 mlを加え、イソプロピルエーテル層を分離し、更に水層にイソプロピルエーテル100 mlを加えて可溶画分を抽出、イソプロピルエーテル層を合わせて無水硫酸ナトリウムで脱水後減圧下濃縮する。残渣に ｎ－ヘキサンを加えて白色沈殿を析出させてビタミンＫヒドロキノンを得る。ビタミンＫヒドロキノンを無水ベンゼン－無水ピリジン（１：１、 v／v）30 mlに溶解し、塩酸ピリジンカルボン酸クロリドを加え室温で３時間撹拌する。不溶物を濾過で取り除き、濾液を減圧下濃縮する。残渣を蒸留水100 mlに懸濁させ、炭酸水素ナトリウムを加え(pH７～８)、酢酸エチルに可溶分画を抽出する(100ml×３回) 、抽出液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離溶媒；イソプロピルエーテル－酢酸エチル、９：１）で分離精製し、ビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－ピリジンカルボン酸エステルを得る。
ビタミンＫ 6.75mmolをイソプロピルエーテル40 mlに溶解し、水素化ホウ素ナトリウム47 mmolをメタノール15 mlに溶解して加え、溶液の黄色が無色になるまで室温で撹拌する。反応液にイソプロピルエーテル60mlと蒸留水100 mlを加え、イソプロピルエーテル層を分離し、更に水層にイソプロピルエーテル100 mlを加えて可溶画分を抽出、イソプロピルエーテル層を合わせて無水硫酸ナトリウムで脱水後減圧下濃縮する。残渣に ｎ－ヘキサンを加えて白色沈殿を析出させてビタミンＫヒドロキノンを得る。ビタミンＫヒドロキノンを無水ベンゼン－無水ピリジン（１：１、 v／v）30 mlに溶解し、塩酸ピリジンカルボン酸クロリドを加え室温で３時間撹拌する。不溶物を濾過で取り除き、濾液を減圧下濃縮する。残渣を蒸留水100 mlに懸濁させ、炭酸水素ナトリウムを加え(pH７～８)、酢酸エチルに可溶分画を抽出する(100ml×３回) 、抽出液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離溶媒；イソプロピルエーテル－酢酸エチル、９：１）で分離精製し、ビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－ピリジンカルボン酸エステルを得る。
【0062】
製造方法Ｅ
ビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－N,N－ジアルキルアミノ酸エステル又はビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－ピリジンカルボン酸２mmolをアセトン20mlに溶解し、塩酸－ジオキサン(2.5～4.0 N)を塩酸量がエステルの10倍モル量に相当する量加え、溶媒を減圧下留去し、残渣をアセトン－メタノールで再結晶してビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－N,N－ジアルキルアミノ酸又はビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－ピリジンカルボン酸の塩酸塩を得る。
ビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－N,N－ジアルキルアミノ酸エステル又はビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－ピリジンカルボン酸２mmolをアセトン20mlに溶解し、塩酸－ジオキサン(2.5～4.0 N)を塩酸量がエステルの10倍モル量に相当する量加え、溶媒を減圧下留去し、残渣をアセトン－メタノールで再結晶してビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－N,N－ジアルキルアミノ酸又はビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－ピリジンカルボン酸の塩酸塩を得る。
【0063】
製造方法Ｆ
ビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－N,N－ジアルキルアミノ酸又はビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－ピリジンカルボン酸２mmolをジクロロメタン20mlに溶解し、アルキルスルホン酸２mmolを加え撹拌する。析出する結晶を濾取してビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－N,N－ジアルキルアミノ酸エステル又はビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－ピリジンカルボン酸エステルのアルキルスルホン酸塩を得る。
ビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－N,N－ジアルキルアミノ酸又はビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－ピリジンカルボン酸２mmolをジクロロメタン20mlに溶解し、アルキルスルホン酸２mmolを加え撹拌する。析出する結晶を濾取してビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－N,N－ジアルキルアミノ酸エステル又はビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－ピリジンカルボン酸エステルのアルキルスルホン酸塩を得る。
【0064】
製造方法Ｇ
ビタミンＫ 4.55 mmolをイソプロピルエーテル40mlに溶解し、水素化ホウ素ナトリウム31.5 mmolをメタノール15 mlに溶解して加え、溶液の黄色が無色になるまで室温で撹拌する。反応液にイソプロピルエーテル60mlと精製水100mlを加え、イソプロピルエーテル層を分離し、更に水層にイソプロピルエーテル100mlを加えて可溶画分を抽出、イソプロピルエーテル層を合わせて、無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧下溶媒を留去する。残渣にジメチルアミノピリジン8.97 mmol、ジカルボン酸無水物18.0 mmolを加え、イソプロピルエーテル-ジオキサン（6:4、v/v）100mlに溶解して、室温で３時間撹拌後、50～60℃に加熱しながら２時間反応させ、さらに室温で放冷しながら１０時間反応させる。反応液に精製水100mlを加え、イソプロピルエーテル層を分離し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧下溶媒を留去する。残渣をイソプロピルエーテルに懸濁し、遠心して得た沈殿物に酢酸エチル100mlと精製水100mlを加え酢酸エチル可溶画分を抽出し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧下溶媒を留去する。残渣をイソプロピルエーテルに懸濁し不溶物を酢酸エチルで再結晶して、ビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－ジカルボン酸ヘミエステルを得る。
ビタミンＫ 4.55 mmolをイソプロピルエーテル40mlに溶解し、水素化ホウ素ナトリウム31.5 mmolをメタノール15 mlに溶解して加え、溶液の黄色が無色になるまで室温で撹拌する。反応液にイソプロピルエーテル60mlと精製水100mlを加え、イソプロピルエーテル層を分離し、更に水層にイソプロピルエーテル100mlを加えて可溶画分を抽出、イソプロピルエーテル層を合わせて、無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧下溶媒を留去する。残渣にジメチルアミノピリジン8.97 mmol、ジカルボン酸無水物18.0 mmolを加え、イソプロピルエーテル-ジオキサン（6:4、v/v）100mlに溶解して、室温で３時間撹拌後、50～60℃に加熱しながら２時間反応させ、さらに室温で放冷しながら１０時間反応させる。反応液に精製水100mlを加え、イソプロピルエーテル層を分離し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧下溶媒を留去する。残渣をイソプロピルエーテルに懸濁し、遠心して得た沈殿物に酢酸エチル100mlと精製水100mlを加え酢酸エチル可溶画分を抽出し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧下溶媒を留去する。残渣をイソプロピルエーテルに懸濁し不溶物を酢酸エチルで再結晶して、ビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－ジカルボン酸ヘミエステルを得る。
【0065】
製造方法Ｈ
ビタミンＫ 6.75 mmol、亜鉛18.4 mmol、無水ジカルボン酸33.0 mmol、無水酢酸ナトリウム 13.8 mmol、酢酸161.5 mmolを100 mlのナスフラスコに入れ、ジムロートを取り付けよく撹拌しながら85℃で3時間加熱。室温冷却し生じた白い固形に酢酸エチル200 mlと精製水100mlを加え酢酸エチル可溶画分を抽出し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧下溶媒を留去する。残渣を酢酸エチルで再結晶して、ビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－ジカルボン酸ヘミエステルを得る。
ビタミンＫ 6.75 mmol、亜鉛18.4 mmol、無水ジカルボン酸33.0 mmol、無水酢酸ナトリウム 13.8 mmol、酢酸161.5 mmolを100 mlのナスフラスコに入れ、ジムロートを取り付けよく撹拌しながら85℃で3時間加熱。室温冷却し生じた白い固形に酢酸エチル200 mlと精製水100mlを加え酢酸エチル可溶画分を抽出し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧下溶媒を留去する。残渣を酢酸エチルで再結晶して、ビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－ジカルボン酸ヘミエステルを得る。
【0066】
製造方法Ｉ
ビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－ジカルボン酸ヘミエステル２mmolを２倍molの0.1N水酸化ナトリウム水溶液または２倍molのメグルミン水溶液を加え溶解させ凍結乾燥させる。メタノール－アセトニトリルで再結晶しビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－ジカルボン酸ヘミエステル－ビス-ナトリウム塩またはビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－ジカルボン酸ヘミエステル-ビス-メグルミン塩を得る。
ビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－ジカルボン酸ヘミエステル２mmolを２倍molの0.1N水酸化ナトリウム水溶液または２倍molのメグルミン水溶液を加え溶解させ凍結乾燥させる。メタノール－アセトニトリルで再結晶しビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－ジカルボン酸ヘミエステル－ビス-ナトリウム塩またはビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－ジカルボン酸ヘミエステル-ビス-メグルミン塩を得る。
【0067】
製造方法J
ビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－ジカルボン酸ヘミエステルを１級または２級アルコールに溶解し塩酸酸性下、撹拌する。減圧下溶媒を留去しビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－ジカルボン酸アルコールエステルを得る。
ビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－ジカルボン酸ヘミエステルを１級または２級アルコールに溶解し塩酸酸性下、撹拌する。減圧下溶媒を留去しビタミンＫヒドロキノン－1,4－ビス－ジカルボン酸アルコールエステルを得る。
【0068】
【表1】
【0069】
【表2】
【0070】
【表3】
【0071】
【表4】
【0072】
【表5】
【0073】
【表6】
【0074】
【表7】
【0075】
【表8】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
