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特開2023-133440葉酸受容体に標的化されたナノ粒子薬物コンジュゲートおよびその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023133440
(43)【公開日】2023-09-22
(54)【発明の名称】葉酸受容体に標的化されたナノ粒子薬物コンジュゲートおよびその使用
(51)【国際特許分類】
A61K 31/4745 20060101AFI20230914BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20230914BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20230914BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20230914BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20230914BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230914BHJP
A61K 47/04 20060101ALI20230914BHJP
C07K 4/00 20060101ALN20230914BHJP
【ＦＩ】
A61K31/4745
A61K9/51
A61K47/54
A61K49/00
A61P35/02
A61P35/00
A61K47/04
C07K4/00 ZNA
【審査請求】未請求
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023123242
(22)【出願日】2023-07-28
(62)【分割の表示】P 2022545820の分割
【原出願日】2021-10-26
(31)【優先権主張番号】63/222,181
(32)【優先日】2021-07-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/117,110
(32)【優先日】2020-11-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/155,043
(32)【優先日】2021-03-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/105,995
(32)【優先日】2020-10-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/116,393
(32)【優先日】2020-11-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/254,837
(32)【優先日】2021-10-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/242,201
(32)【優先日】2021-09-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】522298163
【氏名又は名称】エルシダ オンコロジー， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】カイ マ
(72)【発明者】
【氏名】アラナパカム エム． ヴェンカテサン
(72)【発明者】
【氏名】フェン チェン
(72)【発明者】
【氏名】フェイ ウー
(72)【発明者】
【氏名】ミリク ジヤ ターカー
(72)【発明者】
【氏名】トーマス コートニー ガーディニアー ザ セカンド
(72)【発明者】
【氏名】ジェノ ジェイ． ジェルマーノ ジュニア
(72)【発明者】
【氏名】グレゴリー ポール アダムス
(72)【発明者】
【氏名】フランシス ワイ．エフ． リー
(57)【要約】
【課題】がんなどの疾患の検出、予防、モニタリング、および／または処置のためのナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）を提供すること。
【解決手段】本開示は、超小型ナノ粒子、葉酸受容体（ＦＲ）標的化リガンド、およびリンカー－薬物コンジュゲートを含むナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）と、がんを処置するためのそれらの作製および使用方法に関する。本明細書には、がんなどの疾患の検出、予防、モニタリング、および／または処置のための、標的化リガンドとのおよび細胞毒性ペイロードとのコンジュゲーションを可能にする、ナノ粒子（例えば、多様式（ｍｕｌｔｉ－ｍｏｄａｌ）シリカ系ナノ粒子などのシリカナノ粒子）を含むナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）について記述される。
【選択図】なし
【解決手段】本開示は、超小型ナノ粒子、葉酸受容体（ＦＲ）標的化リガンド、およびリンカー－薬物コンジュゲートを含むナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）と、がんを処置するためのそれらの作製および使用方法に関する。本明細書には、がんなどの疾患の検出、予防、モニタリング、および／または処置のための、標的化リガンドとのおよび細胞毒性ペイロードとのコンジュゲーションを可能にする、ナノ粒子（例えば、多様式（ｍｕｌｔｉ－ｍｏｄａｌ）シリカ系ナノ粒子などのシリカナノ粒子）を含むナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）について記述される。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、参照によりその内容がそれぞれ全体として本明細書に組み込まれる２０２０年１０月２７日に出願された米国仮出願第６３／１０５，９９５号、２０２０年１１月２０日に出願された米国仮出願第６３／１１６，３９３号、２０２０年１１月２３日に出願された米国仮出願第６３／１１７，１１０号、２０２１年３月１日に出願された米国仮出願第６３／１５５，０４３号、２０２１年７月１５日に出願された米国仮出願第６３／２２２，１８１号、２０２１年９月９日に出願された米国仮出願第６３／２４２，２０１号、および２０２１年１０月１２日に出願された米国仮出願第６３／２５４，８３７号の利益を主張する。
本出願は、参照によりその内容がそれぞれ全体として本明細書に組み込まれる２０２０年１０月２７日に出願された米国仮出願第６３／１０５，９９５号、２０２０年１１月２０日に出願された米国仮出願第６３／１１６，３９３号、２０２０年１１月２３日に出願された米国仮出願第６３／１１７，１１０号、２０２１年３月１日に出願された米国仮出願第６３／１５５，０４３号、２０２１年７月１５日に出願された米国仮出願第６３／２２２，１８１号、２０２１年９月９日に出願された米国仮出願第６３／２４２，２０１号、および２０２１年１０月１２日に出願された米国仮出願第６３／２５４，８３７号の利益を主張する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
がん細胞への治療薬（例えば、細胞毒性薬）の標的化された送達は、がん処置に関する新たなアプローチである。対象の健康な組織または臓器に対する送達された治療薬の毒性は、標的化された疾患領域への薬物の選択的送達によって大きく低減させることができ、改善された治療成績をもたらす。抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、標的化された薬物送達に関する一般的なプラットフォームであり、典型的には、がんを標的にすることができるモノクローナル抗体に共有結合した毒性の高い薬物物質を特徴とし、この毒性薬物物質は、がんの標的化の際に放出されるものである。しかしながら、生成の難しさ、薬物負荷容量の制限、不十分な腫瘍浸透、および腫瘍不均質性を克服する能力の欠如も含め、ＡＤＣなどの従来の標的化された薬物送達プラットフォームに関する多くの難題が残されている。
がん細胞への治療薬（例えば、細胞毒性薬）の標的化された送達は、がん処置に関する新たなアプローチである。対象の健康な組織または臓器に対する送達された治療薬の毒性は、標的化された疾患領域への薬物の選択的送達によって大きく低減させることができ、改善された治療成績をもたらす。抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、標的化された薬物送達に関する一般的なプラットフォームであり、典型的には、がんを標的にすることができるモノクローナル抗体に共有結合した毒性の高い薬物物質を特徴とし、この毒性薬物物質は、がんの標的化の際に放出されるものである。しかしながら、生成の難しさ、薬物負荷容量の制限、不十分な腫瘍浸透、および腫瘍不均質性を克服する能力の欠如も含め、ＡＤＣなどの従来の標的化された薬物送達プラットフォームに関する多くの難題が残されている。
【0003】
Ｃｏｒｎｅｌｌ大学およびＭｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒは、診断および治療の適用例で有意な潜在能力を有するＣｏｒｎｅｌｌプライムドット（Ｃ’ドット）と呼ばれる超小型の１０ｎｍ未満のシリカ－有機物ハイブリッドナノ粒子を開発した。例えばＣ’ドットは、がん成長を阻害するがんに標的化された薬剤である上皮成長因子受容体阻害剤、例えばゲフィチニブとコンジュゲートすることができる（ＷＯ ２０１５／１８３８８２ Ａ１）。しかしながらＥＧＦＲ阻害剤の作用機序（ＭＯＡ）は、上皮成長因子受容体との能動的な結合を必要とし、したがって標的化されたがん細胞でのペイロードの連続的な高濃度が、がん細胞増殖を効果的に阻害するのに必要とされる。このタイプのＭＯＡは、一般に、Ｃ’ドットの速い血液循環半減期に適合しない。
【0004】
ＦＯＬＲ１としても公知の葉酸受容体アルファ（ＦＲα）は、がん治療の潜在的な標的として科学界からかなりの注目を浴びており、ＦＲのその他のアイソフォームも潜在的な生物学的標的として明らかにされている。例えば、参照によりそのそれぞれの全体が本明細書に組み込まれるＴａｒｇｅｔｉｎｇ Ｆｏｌａｔｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｌｐｈａ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ， Ｃｈｅｕｎｇ， Ａ．， ｅｔ ａｌ． Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ （２０１６） ７ （３２）：５２５５３； Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ： ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ， Ｌｅｄｅｒｍａｎｎ， Ｊ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ （２０１５）， ２６：２０３４－２０４３を参照されたい。葉酸受容体（ＦＲ）は、卵巣、子宮内膜、乳房、結腸、および肺などの腫瘍内で過剰発現され得るのでがん治療の理想的な標的であるが、その正常組織における分布は低くかつ制限される。ＦＲは、葉酸受容体およびトランスポーターとして働くことに加えて細胞成長調節およびシグナル伝達機能も示し得るという、新たな洞察が示唆されている。これらの特徴は一緒になって、ＦＲを魅力的な治療標的にする。
【0005】
葉酸は、様々なメカニズムによって細胞に輸送され、最も普及しているメカニズムは、４種の糖ペプチドのメンバー（ＦＲアルファ［ＦＯＬＲ１］、ＦＲベータ［ＦＯＬＲ２］、ＦＲガンマ［ＦＯＬＲ３］、およびＦＲデルタ［ＦＯＬＲ４］）である葉酸受容体を経た媒介である。これら４種のメンバーの中で、アルファアイソフォーム（ＦＲアルファまたはＦＲα）は、活性形態のフォレート、５－メチルテトラヒドロフォレート（５ＭＴＦ）の結合および輸送に関して高い親和性を持つグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）係留膜タンパク質である。アルファアイソフォームは、ある特定の固形腫瘍において、例えば卵巣がん、卵管がん、原発性腹膜がん、子宮がん、腎臓がん、肺がん、脳がん、胃腸がん、および乳癌において過剰発現することが報告されている。アルファアイソフォームは、ある特定の血液学的悪性疾患でも過剰発現し、これらの悪性疾患の処置に、例えば小児ＡＭＬを含む急性骨髄性リンパ腫（ＡＭＬ）の処置に利用することができる。この正常な組織または細胞における低く制限された分布は、腫瘍促進機能ならびに患者の予後と発現との関連の、新たな洞察と一緒になって、ＦＲαを魅力ある治療標的にする。さらに、ベータアイソフォーム（ＦＲβ）は、ある特定のがん、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）などの血液学的悪性疾患で過剰発現し、これらのがんに向けた標的化された療法を開発する機会を与える。
［０００６］
多くのＦＲに標的化された薬物送達プラットフォームが、例えばＡＤＣおよび小分子薬物コンジュゲートの両方を使用してこれまでがん処置のために開発され試験されてきたが、それらの中には、それらの限られた治療成績に起因して、臨床使用のために首尾良く認められたものはない（ＥＰ ０６２４３７７ Ａ２、ＵＳ ９１９２６８２ Ｂ２、Ｌｅａｍｏｎ， ｅｔ ａｌ．， “Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｌａｔｅ－ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｖｉｎｃａ ａｌｋａｌｏｉｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ＥＣ１４０ ａｎｄ ＥＣ１４５， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ （２００７） １２１：１５８５－１５９２； Ｌｅａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， “Ｆｏｌａｔｅ－Ｖｉｎｃａ Ａｌｋａｌｏｉｄ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ａ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （２０１４） ２５：５６０－５６８； Ｓｃａｒａｎｔｉ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． （２０２０） １７： ３４９－３５９）。
［０００７］
したがって、ＦＲに標的化された薬物送達プラットフォームの首尾良くなされる開発が、依然として非常に望まれている。
［０００６］
多くのＦＲに標的化された薬物送達プラットフォームが、例えばＡＤＣおよび小分子薬物コンジュゲートの両方を使用してこれまでがん処置のために開発され試験されてきたが、それらの中には、それらの限られた治療成績に起因して、臨床使用のために首尾良く認められたものはない（ＥＰ ０６２４３７７ Ａ２、ＵＳ ９１９２６８２ Ｂ２、Ｌｅａｍｏｎ， ｅｔ ａｌ．， “Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｌａｔｅ－ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｖｉｎｃａ ａｌｋａｌｏｉｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ＥＣ１４０ ａｎｄ ＥＣ１４５， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ （２００７） １２１：１５８５－１５９２； Ｌｅａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， “Ｆｏｌａｔｅ－Ｖｉｎｃａ Ａｌｋａｌｏｉｄ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ａ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （２０１４） ２５：５６０－５６８； Ｓｃａｒａｎｔｉ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． （２０２０） １７： ３４９－３５９）。
［０００７］
したがって、ＦＲに標的化された薬物送達プラットフォームの首尾良くなされる開発が、依然として非常に望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】国際公開第２０１５／１８３８８２号
【特許文献2】欧州特許出願公開第０６２４３７７号明細書
【特許文献3】米国特許第９，１９２，６８２号明細書
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｆｏｌａｔｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｌｐｈａ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ， Ｃｈｅｕｎｇ， Ａ．， ｅｔ ａｌ． Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ （２０１６） ７ （３２）：５２５５３
【非特許文献2】Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ： ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ， Ｌｅｄｅｒｍａｎｎ， Ｊ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ （２０１５）， ２６：２０３４－２０４３
【非特許文献3】Ｌｅａｍｏｎ， ｅｔ ａｌ．， “Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｌａｔｅ－ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｖｉｎｃａ ａｌｋａｌｏｉｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ＥＣ１４０ ａｎｄ ＥＣ１４５， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ （２００７） １２１：１５８５－１５９２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0008】
発明の概要
本開示は：（ａ）シリカナノ粒子、およびこのナノ粒子の表面に共有結合されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；（ｂ）葉酸またはその誘導体もしくは塩を含み、直接またはスペーサー基を介して間接的にナノ粒子に付着された、標的化リガンド；および（ｃ）リンカー－ペイロードコンジュゲートを含み：（ｉ）ペイロードがエキサテカンであり；（ｉｉ）リンカー－ペイロードコンジュゲートが、直接またはスペーサー基を介して間接的にナノ粒子に付着され；（ｉｉｉ）リンカーが、プロテアーゼ－切断可能リンカーであり；および（ｉｖ）エキサテカンが、リンカーの切断の際に放出される、ナノ粒子－薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）を提供する。
本開示は：（ａ）シリカナノ粒子、およびこのナノ粒子の表面に共有結合されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；（ｂ）葉酸またはその誘導体もしくは塩を含み、直接またはスペーサー基を介して間接的にナノ粒子に付着された、標的化リガンド；および（ｃ）リンカー－ペイロードコンジュゲートを含み：（ｉ）ペイロードがエキサテカンであり；（ｉｉ）リンカー－ペイロードコンジュゲートが、直接またはスペーサー基を介して間接的にナノ粒子に付着され；（ｉｉｉ）リンカーが、プロテアーゼ－切断可能リンカーであり；および（ｉｖ）エキサテカンが、リンカーの切断の際に放出される、ナノ粒子－薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）を提供する。
【0009】
本開示は：（ａ）シリカ系コアおよびこのコアの少なくとも一部分を取り囲むシリカシェルを含むナノ粒子；このナノ粒子の表面に共有結合されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；およびこのナノ粒子のコア内に共有結合により被包された蛍光化合物；（ｂ）葉酸受容体（ＦＲ）に結合し、葉酸またはその葉酸受容体結合誘導体を含み、かつ直接またはスペーサー基を介して間接的にナノ粒子に付着された、標的化リガンド；（ｃ）ペイロードが細胞毒性剤である、リンカー－ペイロードコンジュゲートであって；このリンカー－ペイロードコンジュゲートが、直接またはスペーサー基を介して間接的にナノ粒子に付着され；この細胞毒性剤が、リンカーの切断の際に放出され；リンカー－ペイロードコンジュゲート中のリンカーが、プロテアーゼ切断可能リンカーであり；ＮＤＣが約１ｎｍから約１０ｎｍの間、例えば約３ｎｍから約８ｎｍの間、または約３ｎｍから約６ｎｍの間の平均直径を有する、リンカー－ペイロードコンジュゲートを含む、ナノ粒子－薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）にも関する。細胞毒性剤は、エキサテカンであってもよい。
【0010】
本開示のＮＤＣにおいて、ナノ粒子のペイロードに対する平均比は、１から８０に及んでもよく、例えば１から２１（例えば、１から１３、または１から１２）であり、ナノ粒子の標的化リガンドに対する平均比は、１から５０に及んでもよく、例えば１から２５（例えば、１から１１）である。
【0011】
本開示のＮＤＣは、約１ｎｍから約１０ｎｍの間、例えば約５ｎｍから約８ｎｍの間、約３ｎｍから約８ｎｍの間、または約３ｎｍから約６ｎｍの間の平均直径を有していてもよい。
【0012】
本開示のＮＤＣは、任意の適切な色素または検出可能な化合物、例えば蛍光化合物を含んでいてもよい。例えば、本開示のＮＤＣにおいて、蛍光化合物はＣｙ５であってもよい。蛍光化合物は、ナノ粒子内に被包されてもよい（例えば、シリカコアに共有結合により連結される）。本開示のＮＤＣは、葉酸受容体（ＦＲ）に結合する標的化リガンドを含むことができる。標的化リガンドは、葉酸またはその誘導体を含んでいてもよい。「葉酸」は、葉酸のアミドまたはエステルを包含してもよく、例えば葉酸は、アミドまたはエステル結合を介してそのカルボキシル末端でナノ粒子（またはスペーサー基）にコンジュゲートされてもよいことを、理解すべきである。例えば「葉酸」は、図１に示される例示的なＮＤＣに存在する葉酸アミドを指してもよい。
【0013】
本開示のＮＤＣは、構造（Ｓ－１）：
を含んでいてもよく、ペイロードはエキサテカンを含み；リンカーは、プロテアーゼ－切断可能リンカーを含み；かつケイ素原子はナノ粒子の部分である。
【化1】
を含んでいてもよく、ペイロードはエキサテカンを含み；リンカーは、プロテアーゼ－切断可能リンカーを含み；かつケイ素原子はナノ粒子の部分である。
【0014】
例えば、本開示のＮＤＣは、構造（Ｓ－１ａ）：
を含んでいてもよく、ケイ素原子は、ナノ粒子の部分である。
【化2】
を含んでいてもよく、ケイ素原子は、ナノ粒子の部分である。
【0015】
本開示のＮＤＣは、構造（Ｓ－２）：
を含んでいてもよく、標的化リガンドは、葉酸またはその葉酸受容体結合誘導体であり、ケイ素原子はナノ粒子の部分である。
【化3】
を含んでいてもよく、標的化リガンドは、葉酸またはその葉酸受容体結合誘導体であり、ケイ素原子はナノ粒子の部分である。
【0016】
例えば、本開示のＮＤＣは、構造（Ｓ－２ａ）：
を含んでいてもよく、ケイ素原子はナノ粒子の部分である。
【化4】
を含んでいてもよく、ケイ素原子はナノ粒子の部分である。
【0017】
本開示のＮＤＣは、構造（Ｓ－１）および（Ｓ－２）の組合せを含んでいてもよい。例えばＮＤＣは、例えば図１に示されるように、構造（Ｓ－１ａ）および構造（Ｓ－２ａ）の両方を含んでいてもよい。構造Ｓ－１、Ｓ－１ａ、Ｓ－２、またはＳ－２ａは、任意の所望の比で、例えば本明細書に開示される比で、ＮＤＣ中に存在していてもよい。
【0018】
本開示は、シリカ系コアおよびこのコアの少なくとも一部分を取り囲むシリカシェルを含むナノ粒子；ナノ粒子の表面に共有結合されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ナノ粒子のコア内に共有結合により被包された蛍光化合物；葉酸である標的化リガンド；リンカー－ペイロードコンジュゲートであって、プロテアーゼ結合の際にＣ末端で加水分解を受けることが可能でありそれによってナノ粒子からペイロードを放出するプロテアーゼ切断可能リンカーであり、このプロテアーゼがセリンプロテアーゼまたはシステインプロテアーゼを含み、リンカー－ペイロードコンジュゲート内のペイロードがエキサテカンまたはエキサテカンの類似体である、リンカー－ペイロードコンジュゲートを含み；蛍光化合物がＣｙ５である、ＮＤＣにも関する。
【0019】
本開示は、シリカ系コアおよびコアの少なくとも一部分を取り囲むシリカシェルを含むナノ粒子；ナノ粒子の表面に共有結合されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ナノ粒子のコア内部に共有結合により被包されたＣｙ５色素；葉酸受容体に結合する、葉酸である標的化リガンドであって、スペーサー基を経て間接的にナノ粒子に付着される標的化リガンド；スペーサー基を経て間接的にナノ粒子に付着され、構造
を含む化合物を含む、リンカー－ペイロードコンジュゲートを含み；約１ｎｍから約１０ｎｍの間（例えば、約１から約６ｎｍの間）の平均直径を有する、ＮＤＣにも関する。
【化5】
を含む化合物を含む、リンカー－ペイロードコンジュゲートを含み；約１ｎｍから約１０ｎｍの間（例えば、約１から約６ｎｍの間）の平均直径を有する、ＮＤＣにも関する。
【0020】
本開示は：（ａ）シリカ系コアおよびコアの少なくとも一部分を取り囲むシリカシェルを含むシリカナノ粒子；およびナノ粒子の表面に共有結合されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；（ｂ）式（ＮＰ－３）：
の構造を含み、式中、ｘが４であり、ｙが９である、エキサテカン－リンカー部分；および（ｃ）式（ＮＰ－２）
の構造を含み、式中、ｘが４であり、ｙが３である、標的化リガンド部分を含み、エキサテカン－リンカー部分および標的化リガンド部分がそれぞれナノ粒子の表面にコンジュゲートされる、ナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）にも関する。ＮＤＣは、ナノ粒子のコア内に共有結合により被包された蛍光色素（例えば、Ｃｙ５）を含んでいてもよい。
【化6】
の構造を含み、式中、ｘが４であり、ｙが９である、エキサテカン－リンカー部分；および（ｃ）式（ＮＰ－２）
【化7】
の構造を含み、式中、ｘが４であり、ｙが３である、標的化リガンド部分を含み、エキサテカン－リンカー部分および標的化リガンド部分がそれぞれナノ粒子の表面にコンジュゲートされる、ナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）にも関する。ＮＤＣは、ナノ粒子のコア内に共有結合により被包された蛍光色素（例えば、Ｃｙ５）を含んでいてもよい。
【0021】
本開示は、有効量の本明細書に記述されるＮＤＣを、それを必要とする対象に投与することを含む、葉酸受容体（ＦＲ）発現がん（例えば、葉酸受容体（ＦＲ）発現腫瘍）を処置する方法も提供する。方法は、ＮＤＣを、それを必要とする対象に静脈内投与することを含んでいてもよい。本開示の方法において、対象は、卵巣がん、子宮内膜がん、卵管がん、子宮頸がん、乳がん（例えば、ＨＥＲ２＋乳がん、ＨＲ＋乳がん、ＨＲ－乳がん、およびトリプルネガティブ乳がんを含む）、肺がん（例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、子宮がん、胃腸がん（例えば、食道がん、結腸がん、直腸がん、および胃がん）、膵臓がん、膀胱がん、腎臓がん、肝臓がん、頭頸部がん、脳がん、甲状腺がん、皮膚がん、前立腺がん、精巣がん、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ、例えば、小児ＡＭＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）からなる群より選択されるがんを有していてもよい。本開示のＮＤＣは、対象の腫瘍の免疫状態を修正する手段として使用され得る、腫瘍関連マクロファージを標的とするのに使用されてもよい。本開示のＮＤＣは、進行、再発、または難治性固形腫瘍を処置する方法で使用されてもよい。
【0022】
本開示は、葉酸受容体（ＦＲ）発現がん（例えば、葉酸受容体（ＦＲ）発現腫瘍）を処置するためのＮＤＣの使用を提供する。使用は、それを必要とする対象へのＮＤＣの静脈内投与を含んでいてもよい。ＮＤＣの使用において、対象は、卵巣がん、子宮内膜がん、卵管がん、子宮頸がん、乳がん（例えば、ＨＥＲ２＋乳がん、ＨＲ＋乳がん、ＨＲ－乳がん、およびトリプルネガティブ乳がんを含む）、肺がん（例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、子宮がん、胃腸がん（例えば、食道がん、結腸がん、直腸がん、および胃がん）、膵臓がん、膀胱がん、腎臓がん、肝臓がん、頭頸部がん、脳がん、甲状腺がん、皮膚がん、前立腺がん、精巣がん、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ、例えば、小児ＡＭＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）からなる群より選択されるがんを有していてもよい。ＮＤＣの使用において、がんは、進行、再発、または難治性固形腫瘍であってもよい。
【0023】
本開示は、葉酸受容体（ＦＲ）発現がん（例えば、葉酸受容体（ＦＲ）発現腫瘍）を処置するための医薬の製造における使用のための、ＮＤＣを提供する。医薬の製造での使用は、それを必要とする対象へのＮＤＣの静脈内投与を含んでいてもよい。医薬の製造での使用は、卵巣がん、子宮内膜がん、卵管がん、子宮頸がん、乳がん（例えば、ＨＥＲ２＋乳がん、ＨＲ＋乳がん、ＨＲ－乳がん、およびトリプルネガティブ乳がんを含む）、肺がん（例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、子宮がん、胃腸がん（例えば、食道がん、結腸がん、直腸がん、および胃がん）、膵臓がん、膀胱がん、腎臓がん、肝臓がん、頭頸部がん、脳がん、甲状腺がん、皮膚がん、前立腺がん、精巣がん、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ、例えば、小児ＡＭＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）からなる群より選択されるがんを有する対象への、ＮＤＣの投与を含んでいてもよい。本開示のＮＤＣは、進行、再発、または難治性固形腫瘍を処置するための医薬の製造で使用されてもよい。
【0024】
本開示は、ＮＤＣおよび薬学的に受容可能な賦形剤を含む、医薬組成物にも関する。本明細書に開示される医薬組成物は、葉酸受容体（ＦＲ）発現がん（例えば、葉酸受容体（ＦＲ）発現腫瘍）を処置するのに使用されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【0026】
【0027】
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
【0032】
【0033】
【0034】
【図10】図１０Ａ～１０Ｂは、標的化リガンドとして葉酸とおよびペイロードとしてエキサテカンとコンジュゲートされた、実施例３により調製された例示的なＮＤＣ（実施例１からの、エキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体２０２を使用して調製されたＮＤＣ）の分析を提供する、代表的なＨＰＬＣクロマトグラフを示す。図１０Ａは、ＮＤＣ上に保持された放出されていないペイロードに対応する約６．３分の溶出時間で単一ピークを示す、切断されていないＮＤＣの３６０ｎｍでの代表的なＨＰＬＣクロマトグラフを示す。図１０Ｂは、放出されたエキサテカンペイロードに対応する約３から４分の溶出時間で追加のピークを示す、切断されたＮＤＣの３６０ｎｍでの代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを示す。放出されたペイロードおよび保持されたペイロードの曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して、放出されたペイロードのパーセンテージを計算した。
【0035】
【図11】図１１Ａ～１１Ｃは、カテプシン－Ｂと共にインキュベートした後の種々の時点での、標的化リガンドとして葉酸およびプロテアーゼ（カテプシン－Ｂ）切断可能エキサテカン－リンカーコンジュゲートが負荷された例示的なＮＤＣの薬物放出分析を示すプロットである。図１１Ａは、カテプシン－Ｂと共にインキュベートした後の種々の時点でのＮＤＣ Ｂの逆相ＨＰＬＣクロマトグラフを示す。図１１Ｂは、カテプシン－Ｂと共にインキュベートした後の種々の時点での、ＮＤＣ Ｃの逆相ＨＰＬＣクロマトグラフを示す。図１１Ｃは、カテプシン－Ｂと共にインキュベートした後の種々の時点での、ＮＤＣ Ｄ（実施例１からの、エキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体２０２を使用して調製された）の逆相ＨＰＬＣクロマトグラフを示す。
【0036】
【0037】
【0038】
【図14-1】図１４は、様々な葉酸リガンド密度を持つ（ナノ粒子当たり、平均して０、１２、または２５個のいずれかの葉酸分子）ＫＢ細胞系における代表的なＮＤＣ（２種の葉酸（ＦＡ）官能化薬物－リンカーコンジュゲートＣ’ドット（ＦＡ－ＣＤＣ））のフローサイトメトリーを示す。研究において使用された各ＮＤＣを調製するのに使用されるエキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体を、実施例１で記述する（化合物２０２）。遮断基における遮断は、１ｍＭの遊離葉酸を使用して達成された。葉酸がないが同量のエキサテカン－リンカーコンジュゲートを持つＣＤＣを、陰性対照基として使用した。
【図14-2】同上。
【0039】
【図15-1】図１５は、代表的なＮＤＣ（様々な粒子当たりの薬物の比（ＤＰＲ）を持つＫＢ細胞系における３種の葉酸（ＦＡ）官能化薬物－リンカーコンジュゲートＣ’ドット（ＦＡ－ＣＤＣ））のフローサイトメトリーを示す。研究で使用されるＮＤＣを調製するのに使用されるエキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体を、実施例１に記載する（化合物２０２）。遮断基における遮断は、１ｍＭの遊離葉酸を使用して達成した。全てのＦＡ－ＣＤＣは、１２から２２個の間の葉酸部分を含む。高い薬物－粒子比（ＤＰＲ）を持つＦＡ－ＣＤＣは、３５から５０個の間のエキサテカン－リンカーコンジュゲート基を含む。中間のＤＰＲを持つＦＡ－ＣＤＣは、１７から２５個の間のエキサテカン－リンカーコンジュゲート基を含む。低ＤＰＲを持つＦＡ－ＣＤＣは、５から１０個の間のエキサテカン－リンカーコンジュゲート基を有する。葉酸を持たず１７から２５個の薬物リンカーを持つＣＤＣを、陰性対照基として使用した。
【図15-2】同上。
【0040】
【図16-1】図１６は、２４時間、様々な量のヒト血漿と共に事前にインキュベートされた、１ｎＭでの代表的なＮＤＣ（葉酸（ＦＡ）官能化薬物－リンカーコンジュゲートＣ’ドット（ＦＡ－ＣＤＣ））のフローサイトメトリーを示す。遮断基における遮断は、１ｍＭの遊離葉酸で達成された。研究で使用されるＮＤＣを調製するのに使用される、エキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体は、実施例１において（化合物２０２）、ナノ粒子当たり平均２５個のエキサテカン分子を提供することが記述される。ナノ粒子当たりの葉酸リガンドの平均数は、１５であった。葉酸を持たずに同量の薬物リンカーを持つＣＤＣを、陰性対照基として使用した。
【図16-2】同上。
【0041】
【図17】図１７は、１時間および２４時間での、ＫＢ（＋＋＋＋）およびＴＯＶ－１１２Ｄ（－）細胞系における、例示的なＮＤＣ（ＮＤＣ Ｂとして実施例で示される、葉酸（ＦＡ）官能化薬物－リンカーコンジュゲートＣ’ドット（ＦＡ－ＣＤＣ））の共焦点顕微鏡画像を示す。遮断基における遮断は、０．１ｍＭの遊離葉酸を使用して達成された。ＦＡ－ＣＤＣ（ＮＤＣ Ｂ）上の葉酸リガンドの平均数は１２であり、エキサテカン－リンカーコンジュゲートの数は４０である）。リソソームを、生細胞内の酸性オルガネラを標識し追跡するための緑色蛍光色素であるＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）グリーンを使用することにより染色した。カラー画像により（図示せず）、蛍光に起因してＣＤＣは赤色に見え、リソソームは緑色に見え、核は青色に見える。
【0042】
【0043】
【0044】
【0045】
【図20-1】図２０Ａ～２０Ｆは、ＫＢ腫瘍保持マウス（ｎ＝７）における６種の例示的な葉酸受容体標的化ＮＤＣ（ＮＤＣ Ａ～Ｆ）のｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍成長阻害研究を示す。ＮＤＣ－Ａは、ナノ粒子当たり約１９個の薬物－リンカーコンジュゲート基と約１８個の葉酸リガンドとを含む。ＮＤＣ Ｂは、ナノ粒子当たり約２５個の薬物－リンカー基と約１５個の葉酸リガンドとを含む。ＮＤＣ Ｃは、ナノ粒子当たり約１９個の薬物－リンカーコンジュゲート基と約１３個の葉酸リガンドとを含む。ＮＤＣ Ｄは、ナノ粒子当たり約２５個の薬物－リンカーコンジュゲート基と約１２個の葉酸リガンドとを含む。ＮＤＣ Ｅは、ナノ粒子当たり約１７個の薬物－リンカーコンジュゲート基と約１７個の葉酸リガンドとを含む。ＮＤＣ Ｆは、ナノ粒子当たり約２３個の薬物－リンカーコンジュゲート基と約２０個の葉酸リガンドとを含む。
【図20-2】同上。
【0046】
【0047】
【図22】図２２Ａ～２２Ｂは、コンジュゲートされていないエキサテカンと比較した、エキサテカン耐性およびナイーブＫＢ細胞における例示的なＮＤＣのＩＣ５０曲線を示す。図２１Ａは、通常のＫＢ細胞（ナイーブ細胞）におけるおよびエキサテカンで４回または７回処置されたＫＢ細胞（エキサテカン耐性細胞）におけるエキサテカンのＩＣ５０曲線を示す。図２２Ａは、ナイーブ細胞におけるおよびエキサテカン耐性細胞（４サイクルおよび７サイクルの前処置）における例示的なＮＤＣのＩＣ５０曲線を示す。この研究の例示的なＮＤＣを調製するのに使用されるエキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体を、実施例１に記載する（化合物２０２）。
【0048】
【0049】
【0050】
【図25】図２５Ａ～２５Ｄは、ＩＧＲＯＶ－１（ＦＲアルファ陽性ヒト卵巣がん）および操作されたＡＭＬ ＭＶ４；１１細胞系（ＦＲアルファを過剰発現する）の両方に対する、例示的なＦＲ標的化ＮＤＣ（実施例１のエキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体２０２を使用して、実施例３に従い調製された）の特異的な葉酸受容体（ＦＲ）アルファ標的化能力を実証する、フローサイトメトリーヒストグラムを提供する。図２５Ａは、ＩＧＲＯＶ－１細胞系におけるＦＲ標的化ＮＤＣ（１０ｎＭ）および非標的化ＮＤＣ（陰性対照；１０ｎＭ）のフローサイトメトリーヒストグラムである。図２５Ｂは、ＩＧＲＯＶ－１細胞系における抗ＦＲアルファ抗体－ＰＥおよびアイソタイプ抗体－ＰＥ（陰性対照）の、フローサイトメトリーヒストグラムである。図２５Ｃは、操作されたＡＭＬ ＭＶ４；１１細胞系（ＦＲアルファを過剰発現する）の、ＦＲ標的化ＮＤＣ（１０ｎＭ）および非標的化ＮＤＣ（陰性対照；１０ｎＭ）のフローサイトメトリーヒストグラムである。図２５Ｄは、操作されたＡＭＬ ＭＶ４；１１細胞系（ＦＲアルファを過剰発現する）における抗ＦＲアルファ抗体－ＰＥおよびアイソタイプ抗体－ＰＥ（陰性対照）のフローサイトメトリーヒストグラムである。
【0051】
【0052】
【0053】
【0054】
【0055】
【0056】
【0057】
【図32】図３２は、１時間および２４時間後の、ＫＢ（＋＋＋＋）およびＴＯＶ－１１２Ｄ（－）細胞系での、例示的なＮＤＣ（葉酸（ＦＡ）官能化薬物－リンカーコンジュゲートＣ’ドット（ＦＡ－ＣＤＣ）、実施例ではＮＤＣ Ｄと示され、エキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体２０２を使用して調製される）の共焦点顕微鏡画像を示す。遮断基における遮断は、０．１ｍＭの遊離葉酸を使用して達成された。リソソームを、生細胞内の酸性オルガネラを標識し追跡するための緑色蛍光色素である、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）グリーンを使用することによって染色した。カラー画像では（図示せず）、蛍光に起因して、ＣＤＣが赤色に見え、リソソームが緑色に見え、核が青色に見える。
【0058】
【発明を実施するための形態】
【0059】
発明の詳細な説明
本明細書には、がんなどの疾患の検出、予防、モニタリング、および／または処置のための、標的化リガンドとのおよび細胞毒性ペイロードとのコンジュゲーションを可能にする、ナノ粒子（例えば、多様式（ｍｕｌｔｉ－ｍｏｄａｌ）シリカ系ナノ粒子などのシリカナノ粒子）を含むナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）について記述される。
本明細書には、がんなどの疾患の検出、予防、モニタリング、および／または処置のための、標的化リガンドとのおよび細胞毒性ペイロードとのコンジュゲーションを可能にする、ナノ粒子（例えば、多様式（ｍｕｌｔｉ－ｍｏｄａｌ）シリカ系ナノ粒子などのシリカナノ粒子）を含むナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）について記述される。
【0060】
本開示は：ナノ粒子；葉酸受容体に結合する標的化リガンド（例えば、葉酸またはその誘導体もしくは塩）、およびエキサテカンおよびプロテアーゼ切断可能リンカーを含み得るリンカー－ペイロードコンジュゲートを含む、ナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）を使用する組成物および方法を提供する。
【0061】
標的化リガンドおよびリンカー－薬物コンジュゲートの両方の、ナノ粒子に対するコンジュゲーションは、高速で簡単に行われ、多用途であり、高い生成物収率をもたらす、高度に効率的な「クリックケミストリー」反応を介して達成することができる。ペイロードは、切断可能なリンカー基を介してナノ粒子に付着される、エキサテカンまたはその塩もしくは類似体を含む細胞毒性剤であってもよい。切断可能なリンカー基は、細胞のエンドソームまたはリソソーム区画など、ＮＤＣががん細胞内（例えば、腫瘍細胞内）に内部移行するときに、切断することができ、ＮＤＣからの活性細胞毒性剤の放出を引き起こす。切断は、プロテアーゼ（例えば、カテプシンＢ）によって触媒されてもよい。
【0062】
本明細書に開示されるＮＤＣは、部分的にはその物理的性質に起因して、薬物送達に最適なプラットフォームを提供する。例えば、ＮＤＣは、直径が極端に小さい（例えば、平均直径が約１ｎｍから約１０ｎｍの間、例えば約５ｎｍから約８ｎｍの間）ナノ粒子を含み、腫瘍微小環境において増強された透過性および貯留（ＥＰＲ）効果の利益を受けると共に、所望のクリアランスおよび薬物動態特性を保持する。
【0063】
本明細書に記述されるＮＤＣには、他の薬物送達プラットフォームに勝る、ある特定の利点がある（例えば、ＦＲ標的化ＡＤＣなどのＡＤＣ、およびＦＲ標的小分子薬物（例えば、化学療法薬））。例えば、本開示の単一のＮＤＣは、各ナノ粒子上に最大約８０個の薬物分子（例えば、８０個のエキサテカン分子）を、含んでいてもよい。対照的に、従来のＡＤＣでは、わずかに約４から８個の治療／薬物分子を抗体に付着することができ、従来のＦＲ標的小分子薬物は、単一の治療／薬物分子にのみ限定される。このように、本明細書に記述されるＮＤＣは、従来の薬物送達プラットフォームに対して少なくとも１０倍の薬物分子ＮＤＣを運ぶことができ、比較的、より高い薬物負荷を、細胞に送達する。
【0064】
ＡＤＣおよびＦＲ標的化小分子化学療法薬などの従来の葉酸受容体（ＦＲ）標的化薬物送達プラットフォームは、通常、高い受容体発現レベルを持つがん細胞において高い効力を示すが、中程度のまたは低いＦＲ発現レベルを持つそのがん細胞における効力は、限定される。対照的に、本開示のＮＤＣは、高いおよび低いＦＲ発現レベルの両方を持つがん細胞を効果的に標的とすることができ、低いＦＲ発現を持つがんに強力な治療を提供することができる（例えば、図２３および実施例に記述される関連あるアッセイ参照）。
【0065】
メカニズムのいかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、本明細書に開示されるＮＤＣが多数のＦＲ標的化リガンドを単一ナノ粒子上に含むことができるので、細胞表面でのいくつかのＦＲとの結合に対して多価またはアビディティ効果があると考えられる。対照的に、単一ＡＤＣは一般に、細胞表面の最大２個のＦＲに結合できるだけであり、単一ＦＲ標的化化学療法薬は、細胞表面の１つのＦＲに結合できるだけである。このように、本開示のＦＲ標的化ＮＤＣの多価効果は、ＦＲを発現する細胞に対するＮＤＣの結合を著しく高めることができ、改善された標的化効率および治療成績をもたらす。この多価効果は、ＡＤＣまたはＦＲ標的化化学療法薬など、従来のＦＲに標的化された薬物送達プラットフォームを使用して効果的に処置できない低いＦＲ発現を有するがんの処置に対し、本開示のＮＤＣを適切なものにすることもできる。
【0066】
固形腫瘍処置におけるＡＤＣの効力は、通常、その不十分な腫瘍透過によって大きく制限される。対照的に、本明細書に開示されるＦＲ標的化ＮＤＣは、高度に有効な腫瘍透過性を示し、投与後に腫瘍全体にわたる治療薬の送達を可能にし、ＡＤＣの使用に対して固形腫瘍の処置における治療成績を改善する。
【0067】
本開示のＮＤＣは、ＡＤＣなどの従来の薬物送達プラットフォームよりも小さいサイズを有する。特に、本開示のＮＤＣは、腎クリアランスに関する粒度カットオフよりも小さく、ＮＤＣを腎臓から除去可能にし得る。その結果、対象に投与されるががん細胞に進入しないＮＤＣ（即ち、非標的化ＮＤＣ）は、腎排出を介して身体から急速に除去することができる。この標的および／または除去手法は、ＡＤＣなどの従来の薬物送達プラットフォームと比較してＮＤＣの毒性を低減させ、健康な組織または臓器におけるＮＤＣ（またはそのペイロード）の望ましくない蓄積を防止する。本開示のＮＤＣは、ＡＤＣなどの従来の薬物送達プラットフォームよりも改善された生体内分布を示し、低減された副作用および毒性をもたらす。
【0068】
ナノ粒子
本開示は、シリカナノ粒子など、ナノ粒子を含むＮＤＣに関する。ナノ粒子は、シリカ系コアおよびコアの少なくとも一部分を取り囲むシリカシェルを含んでいてもよい。あるいは、ナノ粒子はコアのみ有しシェルがなくてもよい。ナノ粒子のコアは、反応性蛍光化合物および共反応性有機シラン化合物の反応生成物を含有していてもよい。例えば、ナノ粒子のコアは、反応性蛍光化合物と共反応性有機シラン化合物の反応生成物、およびシリカを含有していてもよい。本開示の好ましい態様では、ナノ粒子は、コア－シェル粒子である。
本開示は、シリカナノ粒子など、ナノ粒子を含むＮＤＣに関する。ナノ粒子は、シリカ系コアおよびコアの少なくとも一部分を取り囲むシリカシェルを含んでいてもよい。あるいは、ナノ粒子はコアのみ有しシェルがなくてもよい。ナノ粒子のコアは、反応性蛍光化合物および共反応性有機シラン化合物の反応生成物を含有していてもよい。例えば、ナノ粒子のコアは、反応性蛍光化合物と共反応性有機シラン化合物の反応生成物、およびシリカを含有していてもよい。本開示の好ましい態様では、ナノ粒子は、コア－シェル粒子である。
【0069】
コアの直径は、約０．５ｎｍから約１００ｎｍ、約０．１ｎｍから約５０ｎｍ、約０．５ｎｍから約２５ｎｍ、約０．８ｎｍから約１５ｎｍ、または約１ｎｍから約８ｎｍであってもよい。例えば、コアの直径は、約３ｎｍから約８ｎｍ、または３ｎｍから約６ｎｍであってもよく、例えばコアの直径は、約３ｎｍから約４ｎｍ、約４ｎｍから約５ｎｍ、約５ｎｍから約６ｎｍ、約６ｎｍから約７ｎｍ、または約７ｎｍから約８ｎｍであってもよい。
【0070】
ナノ粒子のシェルは、テトラアルキルオルトシリケートなどのシリカ形成化合物、例えばテトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）の反応生成物とすることができる。ナノ粒子のシェルは、ある範囲の層を有していてもよい。例えば、シリカシェルは、約１から約２０層、約１から約１５層、約１から約１０層、または約１から約５層であってもよい。例えばシリカシェルは、約１から約３層を含んでいてもよい。シェルの厚さは、約０．５ｎｍから約９０ｎｍ、約０．５ｎｍから約４０ｎｍ、約０．５ｎｍから約２０ｎｍ、約０．５ｎｍから約１０ｎｍ、または約０．５ｎｍから約５ｎｍに及んでもよく、例えば約１ｎｍ、約２ｎｍ、約３ｎｍ、約４ｎｍ、または約５ｎｍである。例えば、シリカシェルの厚さは、約０．５ｎｍから約２ｎｍであってもよい。ナノ粒子のシリカシェルは、ナノ粒子の一部分のみまたは粒子全体を覆ってもよい。例えばシリカシェルは、ナノ粒子の約１から約１００パーセント、約１０から約８０パーセント、約２０から約６０パーセント、または約３０から約５０パーセントを覆ってもよい。例えばシリカシェルは、約５０から約１００パーセントを覆ってもよい。シリカシェルは、固体、即ち実質的に非多孔質、メソポーラス、半多孔質のいずれかにすることができ、またはシリカシェルは、多孔質であってもよい。シリカナノ粒子は、固体、即ち実質的に非多孔質、メソポーラス、半多孔質のいずれかにすることができ、またはシリカナノ粒子は、多孔質であってもよい。一部の実施形態では、ナノ粒子は、非メソポーラスナノ粒子、例えば非メソポーラスシリカナノ粒子、例えば非メソポーラスシリカコア－シェルナノ粒子である。
【0071】
ナノ粒子の表面は、少なくとも１個の官能基を組み込むように修飾されてもよい。有機ポリマーは、ナノ粒子に付着されてもよく、当技術分野での任意の公知の技法によって少なくとも１個の官能基を組み込むように修飾することができる。官能基は、限定するものではないがジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、ジエン（例えば、シクロペンタジエン）、アミン、またはチオールを含むことができる。例えば、一方の末端にシランを含み、他方の末端にＤＢＣＯ、マレイミド、ＮＨＳエステル、ジエン（例えば、シクロペンダジエン）、アミン、またはチオールを含む二官能性基は、シラン基を介してシリカナノ粒子の表面に縮合されてもよい。官能基の組込みは、「クリックケミストリー」、アミドカップリング反応、１，２－付加、例えばＭｉｃｈａｅｌ付加、またはＤｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ（２＋４）付加環化反応を使用するなど、当技術分野で公知の技法を経て達成することもできる。この組込みは、様々な標的化リガンド、造影剤、および／または治療剤の、ナノ粒子への付着を可能にする。
【0072】
ナノ粒子に付着され得る有機ポリマーは、限定するものではないが、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリラクテート、ポリ乳酸、糖、脂質、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリグリコール酸、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡ）、およびこれらの組合せを含む。本開示の好ましい態様では、有機ポリマーがポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）である。
【0073】
本開示の好ましい態様では、ナノ粒子の表面が官能化される。例えば、ナノ粒子の表面は、ナノ粒子の合成から得られるもの以外の官能基を有することができる（例えば、－ＯＨ基（ナノ粒子表面の末端Ｓｉ－ＯＨ基から得られる）およびＰＥＧ基（ナノ粒子表面のＳｉ－ＰＥＧ基から得られる））。そのような官能化および官能化法は、当技術分野で公知である。
【0074】
ナノ粒子は、非細孔表面（ｎｏｎ－ｐｏｒｅ ｓｕｒｆａｃｅ）および細孔表面（ｐｏｒｅ ｓｕｒｆａｃｅ）を含んでいてもよい。実施形態では、個々のナノ粒子非細孔表面の少なくとも一部分および個々のナノ粒子細孔表面の少なくとも一部分が官能化される。実施形態では、ナノ粒子非細孔表面の少なくとも一部分および細孔表面の少なくとも一部分が、異なる官能化を有する。細孔表面は、本明細書では、内面とも呼ばれる。ナノ粒子は、非細孔表面（または非多孔質表面）を有していてもよい。非細孔表面は、本明細書では、外側ナノ粒子表面とも呼ばれる。
【0075】
ナノ粒子の細孔表面（例えば、細孔表面の少なくとも一部分）および／または非細孔表面（例えば、非細孔表面の少なくとも一部分）は、官能化することができる。例えばナノ粒子は、化合物の官能基がナノ粒子の表面に存在する（例えば、共有結合する）ように、化合物と反応することができる。表面は、親水性特性を有する表面を提供する親水性基（例えば、ケトン基、カルボン酸、カルボキシレート基、およびエステル基などの極性基）または疎水性特性を有する表面を提供する疎水性基（例えば、アルキル、アリール、およびアルキルアリール基などの非極性基）で官能化することができる。そのような官能化は、当技術分野で公知である。例えば、ジエトキシジメチルシラン（ＤＥＤＭＳ）は、細孔表面の少なくとも一部分で縮合して、細孔表面が疎水性特性を有するようにすることができ、そのように官能化されていないナノ粒子に対して、疎水性細胞毒性ペイロードの増大した負荷性能が可能になる。
【0076】
本開示の好ましい態様では、ナノ粒子の表面は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基で少なくとも部分的に官能化される。ナノ粒子に対するＰＥＧの付着は、共有結合または非共有結合によって、例えばイオン結合、水素結合、疎水性結合、配位、接着、および物理吸収によって達成されてもよい。
【0077】
ある特定の態様では、ＰＥＧ基は、ナノ粒子の表面に付着される（例えば、共有結合により付着される）。コア－シェルナノ粒子において、ＰＥＧ基は、Ｓｉ－Ｏ－Ｃ結合を介してシェルの表面でシリカに、またはコア内のシリカに共有結合される。コアナノ粒子では、ＰＥＧ基は、コア内のシリカに共有結合される。
【0078】
好ましい態様では、ナノ粒子はコア－シェルナノ粒子であり、ＰＥＧ基は、Ｓｉ－Ｏ－Ｃ結合を介してシェルの表面でシリカに共有結合される。ナノ粒子表面上のＰＥＧ基は、生理学的環境において（例えば、対象において）ナノ粒子への血清タンパク質の吸着を防止することができ、効率的な尿排泄を容易にしかつナノ粒子の凝集を低下し得る（例えば、Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ． “Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｉｌｉｃａ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｉｔｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｕｒｉｎａｒｙ ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ
ｆｏｒ ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ”， Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ （２００９） ９（１）：４４２－４４８参照）。
ｆｏｒ ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ”， Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ （２００９） ９（１）：４４２－４４８参照）。
【0079】
ＰＥＧ基は、全ての整数ｇ／ｍｏｌ値およびそれらの間の範囲を含む４００ｇ／ｍｏｌから２０００ｇ／ｍｏｌの分子量（Ｍｗ）を有するＰＥＧポリマーに由来してもよい。実施形態では、ＰＥＧ基は、４６０ｇ／ｍｏｌから５９０ｇ／ｍｏｌのＭｗを有するＰＥＧポリマーに由来し、６から９個のエチレングリコール単位を含有する。様々な実施形態において、ナノ粒子は、ＰＥＧ基で少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％官能化されている。実施形態では、ナノ粒子は、細孔がアクセス可能のままであるような（例えば、細孔を官能化することができる）最大数のＰＥＧ基によりＰＥＧ基で官能化される。実施形態では、細孔表面は、末端シラノール（Ｓｉ－ＯＨ）基を有するシリカ表面である。
【0080】
本明細書に開示されるポリエチレングリコール単位は、官能基、例えば「クリックケミストリー」基、例えばジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）またはアジド、ジエン（例えば、シクロペンタジエン）、マレイミド、ＮＨＳエステル、アミン、チオール、または活性化アセチレン部分、例えば
で官能化されてもよい。ＤＢＣＯを使用できるが、官能基は別のアルキン、例えば別の歪んだアルキン（例えば、ＤＩＢＯまたはその誘導体、またはＤＢＣＯの誘導体）であってもよい。また、官能基は、ニトロンまたはニトリルオキシドであってもよい。
【化8】
で官能化されてもよい。ＤＢＣＯを使用できるが、官能基は別のアルキン、例えば別の歪んだアルキン（例えば、ＤＩＢＯまたはその誘導体、またはＤＢＣＯの誘導体）であってもよい。また、官能基は、ニトロンまたはニトリルオキシドであってもよい。
【0081】
あるいは、または前述に加え、官能基は、ＰＥＧ基を必ずしも必要とせずにＮＤＣに導入することができる。例えばＮＤＣは、「クリックケミストリー」基などの官能基、例えばジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）またはアジド；ジエン（例えば、シクロペンタジエン）；マレイミド；ＮＨＳエステル；アミン；チオール；または活性化アセチレン部分、例えば
であって、任意の適切なリンカーを含み得るまたはリンカーを持たなくてもよいもので官能化されてもよい。ＤＢＣＯは、ナノ粒子を官能化するのに使用できるが、官能基は、別のアルキン、例えば別の歪んだアルキン（ｓｔｒａｉｎｅｄ ａｌｋｙｎｅ）（例えば、ＤＩＢＯまたはその誘導体、またはＤＢＣＯの誘導体）であってもよい。また、官能基は、ニトロンまたはニトリルオキシドであってもよい。
【化9】
であって、任意の適切なリンカーを含み得るまたはリンカーを持たなくてもよいもので官能化されてもよい。ＤＢＣＯは、ナノ粒子を官能化するのに使用できるが、官能基は、別のアルキン、例えば別の歪んだアルキン（ｓｔｒａｉｎｅｄ ａｌｋｙｎｅ）（例えば、ＤＩＢＯまたはその誘導体、またはＤＢＣＯの誘導体）であってもよい。また、官能基は、ニトロンまたはニトリルオキシドであってもよい。
【0082】
例えば、ＤＢＣＯ官能化リンカーは、ＤＢＣＯ－リンカー－シラン化合物上のシラン基を、ナノ粒子の表面のシラノール基（例えば、Ｃ’ドット表面のＰＥＧ層の下）と反応させることにより、ナノ粒子（例えば、ＰＥＧ化Ｃ’ドット）に導入されてもよい。同様に、ジエン官能化前駆体（例えば、シクロペンタジエン官能化前駆体）は、ジエン－リンカー－シランまたはジエン－シラン前駆体化合物上のシラン基を、ナノ粒子の表面（例えば、Ｃ’ドット表面のＰＥＧ層の下）のシラノール基と反応させ、その後、ナノ粒子上のジエンを、ジエノフィルを介して反応性基（例えば、ＤＢＣＯ）を含む第２の前駆体で官能化することによって、ナノ粒子（例えば、ＰＥＧ化Ｃ’ドット）に導入されてもよい。ＤＢＣＯ－リンカー－シランまたはジエン－リンカー－シランのリンカー基は、ＰＥＧ、炭素鎖（例えば、アルキレン）、ヘテロアルキレン基、または同様のものを含むがこれらに限定されない、任意の構造（または部分構造）を含むことができる。ナノ粒子に共有結合により付着されたジエン官能化リンカーは、例えばＤＢＣＯ官能化基との反応によってさらに修飾されてもよい。例えば、ナノ粒子に共有結合により付着されたジエン官能化リンカーは、ＤＢＣＯ－リンカー－マレイミド化合物（またはその他の適切なＤＢＣＯ－リンカー－ジエノフィル）に接触させて、ジエンとマレイミドとの間に付加環化物を形成してもよく、その結果、例えばＤｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ付加環化などの付加環化化学を使用して、その表面に付着されたＤＢＣＯ基を含むＮＤＣが得られる。
【0083】
官能化（例えば、ＤＢＣＯまたはシクロペンタジエンなど、前述の官能基の１つによる）は、適切に官能化されたＦＲ標的化リガンドおよび／または官能化薬物ペイロード（アジド官能化ＦＲ標的化リガンドおよび／またはアジド官能化薬物ペイロードなど）とナノ粒子とのコンジュゲーションを、カップリング反応によって、例えばクリックケミストリー、（３＋２）付加環化反応、アミドカップリング、またはＤｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ反応を介して容易にする。この官能化手法は、製剤化学の多用途性およびＦＲ標的化ＮＤＣ構築物の安全性も改善する。
【0084】
本明細書に開示されるＮＤＣの利点は、比較的安定なリンカーまたはスペーサー基、またはそれらの前駆体を使用して調製できることである。リンカーまたはスペーサー基、またはそれらの前駆体は、その他のリンカーまたは前駆体を使用して生じる可能性のある早期のまたは望ましくない切断を回避することができる。例えば、ナノ粒子を官能化するある特定の方法は、ナノ粒子にその他の部分をコンジュゲートするためにアミン基で修飾される、アミン－シラン前駆体（アミン官能化ナノ粒子を提供するため）を用いる。しかしながらアミン－シラン前駆体は、不安定になる可能性があり、反応中に自己縮合する可能性があり、望ましくない凝集を引き起こす。凝集体は、官能化ナノ粒子が分離するのが非常に難しくなる可能性がある。さらに、ナノ粒子の表面のアミン基は、望ましくない反応性を促進させる可能性があり、ペイロードの早期の放出または標的化リガンドの望ましくない放出をもたらし得る。
【0085】
本明細書に開示されるＮＤＣは、比較的安定な前駆体を使用して生成することができ、ＮＤＣは、安定で高度に純粋である。例えば、本発明のＮＤＣのナノ粒子は、シラン－ジエン前駆体（シラン－シクロペンタジエン前駆体など）を用いて調製して、１個または複数のジエン基で官能化されたナノ粒子を得ることができる。次いでジエン基は、ジエノフィル含有前駆体（例えば、ＰＥＧ－マレイミド誘導体、例えばＤＢＣＯ－ＰＥＧ－マレイミド）などの第２の前駆体と反応させてもよく、安定な付加環化物が形成される。付加環化物を含む、得られた官能化ナノ粒子は、必要に応じて１種または複数の後続の前駆体（本明細書に記述される標的化リガンド前駆体および／またはペイロード－リンカーコンジュゲート前駆体など）と反応させて、ナノ粒子をさらに官能化してもよい。ジエン－シラン前駆体、および生成される付加環化物は、他の官能化ナノ粒子の望ましくない品質を示さず、例えば比較的高い血清安定性を有し、高い収率および純度で生成することができる（例えば、凝集した前駆体がない）。例えば、図３３Ａ～３３Ｂを参照されたい。さらに、このナノ粒子官能化手法は高度にモジュール式であるので、任意の所望の比のペイロード、標的化リガンド、またはその他のものをナノ粒子に導入することができる。これらの方法およびそれらの利益を使用してナノ粒子を調製する例を、実施例で提供する。
【0086】
本開示のＮＤＣは、式（ＮＰ）：
の構造を含んでいてもよく、
式中、ｘは０から２０の整数、例えば４であり；ケイ素原子はナノ粒子の一部であり；トリアゾール部分に隣接する
は、標的化リガンドまたはペイロード－リンカーコンジュゲートとの直接的または間接的な、例えばリンカーまたはスペーサー基、例えばＰＥＧ部分を介した付着点を示す。例えば付着は、リンカーもしくはスペーサー基、例えばリンカー－ペイロードコンジュゲートのリンカー、または葉酸受容体標的化リガンドのリンカーもしくはスペーサー基に対するもの、例えばＰＥＧ部分であってもよい。本開示のＮＤＣは、ジエン（例えば、シクロペンタジエン）官能化ナノ粒子から、例えばリンカー部分（例えば、マレイミドなどのジエノフィルを含むリンカー）をジエンに付加環化反応によりコンジュゲートすることによって、調製されてもよい。
【化10】
の構造を含んでいてもよく、
式中、ｘは０から２０の整数、例えば４であり；ケイ素原子はナノ粒子の一部であり；トリアゾール部分に隣接する
【化11】
は、標的化リガンドまたはペイロード－リンカーコンジュゲートとの直接的または間接的な、例えばリンカーまたはスペーサー基、例えばＰＥＧ部分を介した付着点を示す。例えば付着は、リンカーもしくはスペーサー基、例えばリンカー－ペイロードコンジュゲートのリンカー、または葉酸受容体標的化リガンドのリンカーもしくはスペーサー基に対するもの、例えばＰＥＧ部分であってもよい。本開示のＮＤＣは、ジエン（例えば、シクロペンタジエン）官能化ナノ粒子から、例えばリンカー部分（例えば、マレイミドなどのジエノフィルを含むリンカー）をジエンに付加環化反応によりコンジュゲートすることによって、調製されてもよい。
【0087】
ナノ粒子のシリカシェル表面は、表面官能基を導入する公知の架橋剤を使用することによって、修飾することができる。架橋剤には、限定するものではないが、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、Ｎ，Ｎ’－メチレン－ビス－アクリルアミド、アルキルエーテル、糖、ペプチド、ＤＮＡ断片、またはその他の公知の官能的に等価な作用物質が含まれる。
【0088】
光学撮像（蛍光撮像など）だけでなく、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、および磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）などのその他の撮像技法によってナノ粒子を検出可能にさせるために、ナノ粒子は、放射性核種などの造影剤とコンジュゲートされてもよい。
【0089】
ナノ粒子は、任意の適切な蛍光化合物、例えば蛍光有機化合物、色素、顔料、またはこれらの組合せを組み込んでもよい。そのような蛍光化合物は、ナノ粒子のコアのシリカマトリクス中に組み込むことができる。広く様々な適切な化学反応性蛍光色素／フルオロフォアが公知であり、例えば、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳ ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ ＰＲＯＢＥＳ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ， ６ｔｈ ｅｄ．， Ｒ． Ｐ． Ｈａｕｇｌａｎｄ， ｅｄ． （１９９６）を参照されたい。本開示の好ましい態様では、蛍光化合物は、ナノ粒子のコア内部に共有結合により被包される。
【0090】
一部の態様では、蛍光化合物は、限定するものではないが、遊離蛍光色素に対してより大きい輝度および蛍光量子収量を提供することができるナノ粒子のシリカコア内に位置決めされる近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）色素とすることができる。近赤外放出プローブは、低下した組織減衰および自己蛍光を示すことが周知である（Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ． “Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｉｌｉｃａ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｉｔｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｕｒｉｎａｒｙ ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ ｆｏｒ ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ”， Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ （２００９） ９（１）：４４２－４４８）。
【0091】
本開示で使用され得る蛍光化合物（例えば、ＮＤＣによって被包される）には、限定するものではないが、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５（Ｃｙ５＋＋としても公知である）、Ｃｙ２、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、フィコエリスリン、Ｃｙ７、フルオレセイン（ＦＡＭ）、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５（Ｃｙ３＋＋としても公知である）、Ｔｅｘａｓレッド（スルホローダミン１０１酸塩化物）、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）－レッド ６４０、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）－レッド ７０５、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、ローダミン、ローダミン誘導体（ＲＯＸ）、ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、ローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）、ローダミン誘導体ＪＡ１３３、Ａｌｅｘａ蛍光色素（ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）５４６、ＡＬＥＸＡ
ＦＬＵＯＲ（登録商標）６３３、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）５５５、およびＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７など）、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ヨウ化プロピジウム、アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）、スペクトラムグリーン、スペクトラムオレンジ、スペクトラムアクア、ＬＩＳＳＡＭＩＮＥ（商標）、および蛍光遷移金属錯体、例えばユーロピウムが含まれる。
ＦＬＵＯＲ（登録商標）６３３、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）５５５、およびＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７など）、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ヨウ化プロピジウム、アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）、スペクトラムグリーン、スペクトラムオレンジ、スペクトラムアクア、ＬＩＳＳＡＭＩＮＥ（商標）、および蛍光遷移金属錯体、例えばユーロピウムが含まれる。
【0092】
使用することができる蛍光化合物は、蛍光タンパク質、例えばＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、増強型ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質および誘導体（ＢＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、アズライト、ｍＫａｌａｍａ１）、シアン蛍光タンパク質および誘導体（ＣＦＰ、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ）、ならびに黄色蛍光タンパク質および誘導体（ＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ）（ＷＯ ２００８／１４２５７１、ＷＯ ２００９／０５６２８２、ＷＯ １９９９／２２０２６）も含む。
【0093】
本開示の好ましい態様では、蛍光化合物は、Ｃｙ５およびＣｙ５．５からなる群より選択される。好ましい態様では、蛍光化合物はＣｙ５である。
【0094】
蛍光ナノ粒子は：（１）マレイミド、ヨードアセトアミド、チオスルフェート、アミン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｍｉｄｅ）エステル、４－スルホ－２，３，５，６－テトラフルオロフェニル（ＳＴＰ）エステル、スルホスクシンイミジルエステル、スルホジクロロフェノールエステル、塩化スルホニル、ヒドロキシル、イソチオシアネート、カルボキシルを含むがこれらに限定されない反応性部分を持つ反応性蛍光色素（例えば、Ｃｙ５）などの蛍光化合物を、共反応性有機シラン化合物などの有機シラン化合物と共有結合によりコンジュゲートして、蛍光シリカ前駆体を形成し、蛍光シリカ前駆体を反応させて蛍光コアを形成するステップ；または（２）蛍光シリカ前駆体と、テトラアルコキシシランなどのシリカ形成化合物とを反応させて、蛍光コアを形成するステップによって合成されてもよい。次いで蛍光コアは、テトラアルコキシシランなどのシリカ形成化合物と反応させて、コア上にシリカシェルを形成することにより、蛍光ナノ粒子を提供してもよい。
【0095】
蛍光シリカ系ナノ粒子は、当技術分野で公知であり、参照によりその内容の全体が本明細書にそれぞれ組み込まれるＵＳ ８２９８６７７ Ｂ２、ＵＳ ９６２５４５６ Ｂ２、ＵＳ １０５４８９９７ Ｂ２、ＵＳ ９９９９６９４ Ｂ２、ＵＳ １００３９８４７ Ｂ２、およびＵＳ １０５４８９９８ Ｂ２により記述される。
【0096】
本開示の好ましい態様では、ＮＤＣは、シリカ系コアとコアの少なくとも一部分を取り囲むシリカシェルとを含むナノ粒子を含み、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がナノ粒子の表面に共有結合され、蛍光化合物は、ナノ粒子のコア内に共有結合により被包される。
【0097】
標的化リガンド
本開示のＮＤＣは、直接またはスペーサー基を通して間接的にナノ粒子に付着された標的化リガンドを含んでいてもよい。標的化リガンドを持つＮＤＣは、増大した透過性ならびにＮＤＣの標的化能力に起因して、腫瘍細胞でのペイロード／薬物の内部移行を高めることができ、および／または腫瘍細胞内への薬物を送達することができる。標的化リガンドによれば、ナノ粒子は、リガンドと細胞成分との間の特異的結合を経て特定の細胞型を標的とすることが可能になる。標的化リガンドは、例えば細胞内環境をアッセイするために、細胞または障壁輸送へのナノ粒子の進入も容易にし得る。
本開示のＮＤＣは、直接またはスペーサー基を通して間接的にナノ粒子に付着された標的化リガンドを含んでいてもよい。標的化リガンドを持つＮＤＣは、増大した透過性ならびにＮＤＣの標的化能力に起因して、腫瘍細胞でのペイロード／薬物の内部移行を高めることができ、および／または腫瘍細胞内への薬物を送達することができる。標的化リガンドによれば、ナノ粒子は、リガンドと細胞成分との間の特異的結合を経て特定の細胞型を標的とすることが可能になる。標的化リガンドは、例えば細胞内環境をアッセイするために、細胞または障壁輸送へのナノ粒子の進入も容易にし得る。
【0098】
本開示の標的化リガンドは、腫瘍細胞上の受容体に結合することが可能である。特に、標的化リガンドは、ＦＲアルファ（ＦＲα、ＦＯＬＲ１としても公知である）、ＦＲベータ（ＦＲβ、ＦＯＬＲ２としても公知である）、ＦＲガンマ（ＦＲγ、ＦＯＬＲ３としても公知である）、およびＦＲデルタ（ＦＲδ、ＦＯＬＲ４としても公知である）を含む、ＦＲの４種のヒトアイソフォーム全てを含む葉酸受容体（ＦＲ）に結合することができる。本開示のナノ粒子の表面に対するＦＲ標的化リガンドのコンジュゲーションは、ＦＲ過剰発現がん性細胞、組織、および腫瘍の標的化治療を可能にする。例えば、葉酸などの葉酸受容体アルファ（ＦＲα）に結合することができる標的化リガンドを含む本開示のＮＤＣは、卵巣がん、子宮内膜がん、卵管がん、腹膜がん、子宮頸がん、乳がん、肺がん、中皮腫、子宮がん、胃腸がん（例えば、食道がん、結腸がん、直腸がん、および胃がん）、膵臓がん、膀胱がん、腎臓がん、肝臓がん、頭頸部がん、脳がん、甲状腺がん、皮膚がん、前立腺がん、および精巣がん、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ、例えば、小児ＡＭＬ）を標的とするのに使用されてもよい。葉酸受容体ベータ（ＦＲβ）に結合することができる標的化リガンドを含む、本開示のＮＤＣは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ、例えば、小児ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、および腫瘍関連マクロファージを標的とするのに使用されてもよい。腫瘍関連マクロファージは、腫瘍の免疫状態を修飾する手段として、標的とすることができる。理論に拘束されることを望まないが、葉酸受容体に対するＦＲ標的化ＮＤＣの結合親和性は、多価効果に起因して高めることができる。
【0099】
葉酸受容体は、卵巣、腎臓、肺、脳、子宮内膜、結腸直腸、膵臓、胃、前立腺、乳房、および非小細胞肺がんを含む固形腫瘍細胞において高度に発現することができる。ＦＲは、卵管がん、子宮頸がん、中皮腫、子宮がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、肝臓がん、頭頸部がん、甲状腺がん、皮膚がん、および精巣がんを含むその他のがんで過剰発現される。ＦＲは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）などの血液悪性疾患においても過剰発現される。
【0100】
本開示の好ましい態様では、標的化リガンドは、葉酸受容体アルファ（ＦＲα）、葉酸受容体ベータ（ＦＲβ）、または両方に結合する。
【0101】
本開示は、子宮、卵巣、乳房、子宮頸部（ｃｅｒｖｉｘ）、腎臓、結腸、精巣（例えば、精巣絨毛癌）、脳（例えば、上衣脳腫瘍）のがん（例えば、腺癌）、悪性胸膜中皮腫、および非機能性下垂体腺癌などであるがこれらに限定されない高レベルのＦＲαを有する特定の細胞型に結合することが可能なＦＲ標的化リガンドを提供する。本開示は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ、例えば、小児ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、および腫瘍関連マクロファージを標的とすることが可能なＦＲ標的化リガンドも提供する。標的化リガンドは、ＦＲ、例えばＦＲαを結合することができる、任意の適切な分子、例えば小さな有機分子（例えば、葉酸塩または葉酸塩類似体）、抗体の抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、または単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域）、抗体模倣物（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｉｍｅｔｉｃ）（例えば、アプタマー、アフィボディ（ａｆｆｉｌｉｎ）、アフィリン（ａｆｆｉｍｅｒ）、アフィマー（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、アンチカリン（ａｖｉｍｅｒ）、アビマー、Ｄａｒｐｉｎ、および同様のもの）、核酸、脂質、および同様のものであり得る。
【0102】
本開示の態様では、標的化リガンドは、葉酸またはその葉酸受容体結合誘導体である。「葉酸」は、葉酸の任意のアミドまたはエステル誘導体を包含することができることが、理解されよう。例えば、遊離葉酸は、ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体などのスペーサー基を介してナノ粒子にコンジュゲートするように修飾されてもよい（例えば、アミド結合を、葉酸の末端カルボン酸とスペーサー基の窒素原子との間に形成することによって）。
【0103】
ＦＲ標的化ＮＤＣは、がん細胞または腫瘍内で蓄積し得るだけでなく、腫瘍組織に浸透し、最適な処置有効性のためにペイロードを腫瘍組織全体に送達し得る。いかなる特定の理論にもメカニズムにも拘束されることを望まないが、標的化リガンドは、がん細胞の表面の特定の受容体基に結合し、その結果、ＮＤＣの受容体媒介型細胞取込みをもたらすと考えられる。ＮＤＣのこの受容体媒介型細胞取込みは、エンドサイトーシスプロセスを介して生じ、最終的にはＮＤＣをがん細胞内のエンドソームおよびリソソームに移送する。
【0104】
本開示の態様では、ＮＤＣは、直接またはスペーサー基を介して間接的にナノ粒子に付着される標的化リガンドを含む。例えば、標的化リガンドは、ナノ粒子のシリカを介して直接ナノ粒子に付着することができる（即ち、共有結合された）。好ましい態様では、標的化リガンドは、適切なスペーサー基を経て間接的にナノ粒子に付着される。
【0105】
スペーサー基は、スペーサーとして、例えば標的化リガンドとナノ粒子との間のスペーサーとして働くことができる、任意の基とすることができ、標的化リガンドをナノ粒子に付着することができる。スペーサー基は、２価のリンカー、例えば約５から約２００原子（例えば、炭素原子、ヘテロ原子、またはこれらの組合せ）の間、例えば約５から約１００原子の間、約５から約８０原子の間、約１０から約８０原子の間、約１０から約７０原子の間、約１０から約３０原子の間、約２０から約３０原子の間、約３０から約８０原子の間、または約３０から約６０原子の間の鎖長を含む２価のリンカーであってもよい。適切なスペーサー基は、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン（例えば、ＰＥＧ）、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、またはこれらの組合せを含んでいてもよい。例えば、スペーサー基は、ＰＥＧ基、アルキレン基、またはこれらの組合せを含んでいてもよい。スペーサー基は、置換されても置換されていなくてもよく、例えばスペーサー基は、置換アルキレン、置換ヘテロアルキレン、またはこれらの組合せを含んでいてもよい。例えばスペーサー基は、ＰＥＧ基（または、ＰＥＧスペーサー）、アルキレン基（または、アルキレンスペーサー）、１個または複数のヘテロ原子、および／または１個または複数の環式基（例えば、ピペラジンなどのヘテロシクリレン基）を含んでいてもよい。
【0106】
葉酸などの標的化リガンドは、ＰＥＧスペーサー基を経て間接的に、ナノ粒子に付着されてもよい。葉酸は、例えば図１に示されるように、例えばＰＥＧスペーサー基またはその他の２価のリンカーとのコンジュゲーションを容易にするために、アミドとしてＮＤＣ内に存在してもよい。ＰＥＧスペーサーにおけるＰＥＧモノマーの数は、２から２０個、２から１０個、２から８個、または２から５個に及んでもよい。好ましい態様では、官能化ＦＲ標的化リガンドにおけるスペーサーとしてのＰＥＧ基の数は、３個である。
【0107】
ナノ粒子の、標的化リガンド（例えば、葉酸）に対する平均比は、約１から約５０、約１から約４０、約１から約３０、または約１から約２０に及んでもよい。例えば、ナノ粒子の、標的化リガンド（例えば、葉酸）に対する平均比は、約１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、１：４０、または１：５０であってもよい。例えば、ナノ粒子の、標的化リガンドに対する平均比は、約１から約２０に及んでもよく、例えば各ナノ粒子上の葉酸分子の平均数は、約５から約１０個の間、約１０から約１５個の間、または約１５から約２０個の間、例えばナノ粒子当たり約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、または約１５個の葉酸分子である。本明細書に開示されるＮＤＣは、約１０個の葉酸分子を含んでいてもよい。本明細書に開示されるＮＤＣは、約１１個の葉酸分子を含んでいてもよい。本明細書に開示されるＮＤＣは、約１２個の葉酸分子を含んでいてもよい。本明細書に開示されるＮＤＣは、約１３個の葉酸分子を含んでいてもよい。本明細書に開示されるＮＤＣは、約１４個の葉酸分子を含んでいてもよい。本明細書に開示されるＮＤＣは、約１５個の葉酸分子を含んでいてもよい。
【0108】
ナノ粒子に付着される、より小さい数の標的化リガンドは、例えば腎クリアランスのカットオフサイズ範囲を満たすようナノ粒子の流体力学直径を維持するのを助けることができる（Ｈｉｌｄｅｒｂｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅａｒ－ｉｎｆｒａｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ： Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍａｇｉｎｇ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．， （２０１０） １４：７１－７９）。測定された標的化リガンドの数は、１個より多いナノ粒子に付着された標的化リガンドの平均数であってもよい。あるいは、１個のナノ粒子は、付着される標的化リガンドの数を決定するように測定されてもよい。
【0109】
ナノ粒子に付着される標的化リガンドの数は、光学撮像、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、ＵＶ－Ｖｉｓ、クロマトグラフィー、質量分光法、または間接酵素分析などであるがこれらに限定されない任意の適切な方法によって測定することができる。
【0110】
標的化リガンドは、ナノ粒子のシリカとの共有結合を介してナノ粒子に付着することができる（例えば、スペーサー基を経て間接的に）。リガンドは、例えば、カップリング反応、クリックケミストリー（例えば、３＋２クリックケミストリー反応）、付加環化（例えば、３＋２または２＋４付加環化反応、適切な官能基を使用する）、またはカルボキシレート、エステル、アルコール、カルバミド、アルデヒド、アミン、酸化硫黄、ニトリルオキシド、ニトロン、酸化窒素、ハロゲン化物、または当技術分野で公知の任意のその他の適切な化合物を介したコンジュゲーションを使用して、本明細書に記述されるナノ粒子にコンジュゲートされてもよい（例えば、ナノ粒子表面の官能基を介して）。
【0111】
本開示の好ましい態様では、ＦＲ標的化リガンドのコンジュゲーションは、ジアリールシクロオクチン（ＤＢＣＯ）基を使用する「クリックケミストリー」反応によって達成することができる。任意の適切な反応メカニズムは、標的化リガンドとナノ粒子との容易で制御された付着を達成することができる限り、「クリックケミストリー」に関して本開示で適合されてもよい。
【0112】
一部の態様では、三重結合（例えばアルキン、例えば末端アルキン）が、ナノ粒子の表面に導入される（例えば、ナノ粒子のシェルに共有結合によりコンジュゲートされたＰＥＧを介して、または別の適切なリンカーもしくはスペーサー基を経て）。別に、アジド結合または三重結合に対して反応性のあるその他の基が、所望の標的化リガンド上に導入され得る。例えば、葉酸は、葉酸の末端カルボン酸と、アジドを一端に含むスペーサー基（例えば、ＰＥＧ部分）とをコンジュゲートすることによって修飾されてもよい。遊離三重結合を含むナノ粒子（例えば、ＰＥＧ化ナノ粒子）および標的化リガンド（三重結合に対して反応性のある基を含む）を混合して（銅またはその他の金属触媒と共にまたは無しで）、三重結合に対して反応性のある基（例えば、アジド）と三重結合との付加環化を行うことができ、その結果、標的化リガンドとナノ粒子とのコンジュゲーションがもたらされる（例えば、「クリックケミストリー」）。この手法の多くの変形例も、当業者に容易に明らかにされることになるので使用することができる。
【0113】
アジド官能化ＦＲ－リガンド（ＦＲ－リガンドはスペーサー基を含んでいてもよく、スペーサー基はアジド基を保有していてもよい）は、直接またはアルキン（例えば、ＤＢＣＯ基）を介して間接的にナノ粒子に付着することができる。ＰＥＧ基などであるがこれらに限定されないスペーサー基は、ＦＲ標的化リガンド前駆体に存在することができ、ナノ粒子とのコンジュゲーションが容易になるように末端基（例えば、アジド）を保有していてもよく、コンジュゲーション後は、スペーサー基が標的化リガンドとナノ粒子との間に配置されてもよい。例えば、ＦＲ標的化リガンド前駆体は、式（Ｄ－１）：
の構造を含んでいてもよく、式中、ｙは０から２０の整数（例えば、３）である。例えば、ｙは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０、例えば２、３、または４であってもよい。
【化12】
の構造を含んでいてもよく、式中、ｙは０から２０の整数（例えば、３）である。例えば、ｙは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０、例えば２、３、または４であってもよい。
【0114】
一部の態様では、ＦＲ標的化リガンドは、アジド基などであるがこれらに限定されない適切な末端基で官能化されてもよい。アジド官能化ＦＲリガンドは、直接またはＤＢＣＯ基を介して間接的にナノ粒子に付着することができる。ＰＥＧ基などであるがこれらに限定されないスペーサー基を、アジド官能化ＦＲリガンドとナノ粒子との間に存在させることができる。好ましい態様では、ＦＲ標的化リガンドは、ナノ粒子の表面でＤＢＣＯ基と反応するアジド基で終端するＰＥＧ基などであるがこれらに限定されないスペーサー基を含むように官能化される。
【0115】
ＦＲ標的化リガンドの官能化は、スペーサーとして親水性ＰＥＧ基を含んでいてもよく、これにより水中の溶解度を高めることができ、ナノ粒子の凝集および沈殿を低減させまたは無くすことができる。
【0116】
本開示の態様では、官能化ＦＲ標的化リガンドに存在することができるスペーサーとしてのＰＥＧ基の数は、２から２０、２から１０、２から８、または２から５個の範囲であってもよい。好ましい態様では、官能化ＦＲ標的化リガンドにおけるスペーサーとしてのＰＥＧ基の数は、３個である。
【0117】
標的化リガンドを含む本開示のＮＤＣは、式（ＮＰ－２）：
の構造を含んでいてもよく、式中、ｘは０から１０の整数であり（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、例えば４）、ｙは、０から２０の整数であり（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０、例えば３）、ケイ素原子は、ナノ粒子の一部である（例えば、コア－シェルシリカナノ粒子のシリカシェルと結合する）。例えば、ｘは４であってもよく、ｙは３であってもよい。本明細書に開示されるＮＤＣの各ナノ粒子は、式（ＮＰ－２）の１個より多い分子を含んでいてもよく、例えば、ナノ粒子は、式（ＮＰ－２）の約１から約２０個の間の分子、例えば式（ＮＰ－２）の約５から約２０個の間の分子、式（ＮＰ－２）の約８から約１５個の間の分子、式（ＮＰ－２）の約１０から約１５個の間の分子、例えば式（ＮＰ－２）の約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、または約２０個の分子を含んでいてもよい。本明細書に開示されるＮＤＣは、式（ＮＰ－２）の約１２個の分子を含んでいてもよい。本明細書に開示されるＮＤＣは、式（ＮＰ－２）の約１３個の分子を含んでいてもよい。
【化13】
の構造を含んでいてもよく、式中、ｘは０から１０の整数であり（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、例えば４）、ｙは、０から２０の整数であり（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０、例えば３）、ケイ素原子は、ナノ粒子の一部である（例えば、コア－シェルシリカナノ粒子のシリカシェルと結合する）。例えば、ｘは４であってもよく、ｙは３であってもよい。本明細書に開示されるＮＤＣの各ナノ粒子は、式（ＮＰ－２）の１個より多い分子を含んでいてもよく、例えば、ナノ粒子は、式（ＮＰ－２）の約１から約２０個の間の分子、例えば式（ＮＰ－２）の約５から約２０個の間の分子、式（ＮＰ－２）の約８から約１５個の間の分子、式（ＮＰ－２）の約１０から約１５個の間の分子、例えば式（ＮＰ－２）の約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、または約２０個の分子を含んでいてもよい。本明細書に開示されるＮＤＣは、式（ＮＰ－２）の約１２個の分子を含んでいてもよい。本明細書に開示されるＮＤＣは、式（ＮＰ－２）の約１３個の分子を含んでいてもよい。
【0118】
リンカー－ペイロードコンジュゲート
本開示のＮＤＣは、直接またはスペーサー基を介して間接的にナノ粒子に付着されるリンカー－ペイロードコンジュゲートを含むこともできる。好ましい態様では、リンカー－ペイロードコンジュゲートは、スペーサー基を経てナノ粒子に付着される。ペイロードは、エキサテカン、またはその塩もしくは類似体であってもよい。
本開示のＮＤＣは、直接またはスペーサー基を介して間接的にナノ粒子に付着されるリンカー－ペイロードコンジュゲートを含むこともできる。好ましい態様では、リンカー－ペイロードコンジュゲートは、スペーサー基を経てナノ粒子に付着される。ペイロードは、エキサテカン、またはその塩もしくは類似体であってもよい。
【0119】
スペーサー基は、スペーサーとして、例えばペイロード／リンカーコンジュゲートとナノ粒子との間のスペーサーとして働くことができる任意の基とすることができ、リンカー－ペイロードコンジュゲートをナノ粒子に付着することができる。スペーサー基は、２価のリンカー、例えば約５から約２００原子（例えば、炭素原子、ヘテロ原子、またはこれらの組合せ）の間、例えば約５から約１００原子の間、約５から約８０原子の間、約１０から約８０原子の間、約１０から約７０原子の間、約１０から約３０原子の間、約２０から約３０原子の間、約３０から約８０原子の間、または約３０から約６０原子の間の鎖長を含む２価のリンカーであってもよい。適切なスペーサー基は、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン（例えば、ＰＥＧ）、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、またはこれらの組合せを含んでいてもよい。例えば、スペーサー基は、ＰＥＧ基、アルキレン基、またはこれらの組合せを含んでいてもよい。スペーサー基は、置換されても置換されていなくてもよく、例えばスペーサー基は、置換アルキレン、置換ヘテロアルキレン、またはこれらの組合せを含んでいてもよい。例えば、スペーサー基は、ＰＥＧ基（またはＰＥＧスペーサー）、アルキレン基（またはアルキレンスペーサー）、１個または複数のヘテロ原子、および／または１個または複数の環式基を含んでいてもよい。
【0120】
化学修飾は、本開示のコンジュゲートを調製する目的で、ペイロードとリンカーとの反応をより便利に行うために、ペイロードに対して行われてもよいことが理解されよう。例えば、官能基、例えばアミン、ヒドロキシル、またはスルフヒドリルは、ペイロード（例えば、エキサテカン）の活性またはその他の性質に対して最小限のまたは許容される効果をもたらす位置で、ペイロード（例えば、エキサテカン）に付加されてもよい。あるいは、ペイロード（例えば、ペンダントアミン基）上の既存の官能基は、リンカーへの付着点であってもよい。例えば、エキサテカンは、リンカー部分にカップリングするのに適したアミン官能基を含有する。
【0121】
ペイロード（例えば、エキサテカンペイロード、またはその塩もしくは類似体）は、細胞または細胞オルガネラの内部のナノ粒子から、例えば酵素によって切断することができ、それによってエキサテカンが、例えば細胞または細胞オルガネラ内に放出される。エキサテカンは、ＤＮＡとＴｏｐｏ－１酵素との複合体を安定化させることができるトポイソメラーゼ１（Ｔｏｐｏ－１）阻害剤であり、ＤＮＡの追放（ｒｅｌｅｇａｔｉｏｎ）を防止し、致命的なＤＮＡ鎖の破壊を誘発させる。これらのＤＮＡ病変の発生は、がん細胞の死滅に有効であり、本開示のＮＤＣで所望の治療効果を達成することが可能になる。
【0122】
本開示の好ましい態様では、ペイロードはエキサテカンまたはその塩である。本開示のその他の好ましい態様では、ペイロードはエキサテカンの類似体またはその塩である。
【0123】
本開示の態様では、ナノ粒子のペイロードに対する平均比は、１から８０、１から７０、１から６０、１から５０、１から４０、１から３０、１から２０、１から１５、１から１２、および好ましくは１から１０に及ぶ。例えばナノ粒子のペイロード（例えば、エキサテカンまたはその塩もしくは類似体）に対する平均比は、約１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９、１：３０、１：３２、１：３４、１：３６、１：３８、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、または１：８０であってもよい。例えば、各ナノ粒子上のエキサテカン分子の平均数は、ナノ粒子当たり約５から約１０個の間、約１０から約１５個の間、約１５から約２０個の間、約２０から約２５個の間、または約２５から約３０個の間、例えば約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、または約３０個のエキサテカン分子であってもよい。本明細書に開示されるＮＤＣは、約１８個のエキサテカン分子を含んでいてもよい。本明細書に開示されるＮＤＣは、約１９個のエキサテカン分子を含んでいてもよい。本明細書に開示されるＮＤＣは、約２０個のエキサテカン分子を含んでいてもよい。本明細書に開示されるＮＤＣは、約２１個のエキサテカン分子を含んでいてもよい。本明細書に開示されるＮＤＣは、約２２個のエキサテカン分子を含んでいてもよい。本明細書に開示されるＮＤＣは、約２３個のエキサテカン分子を含んでいてもよい。本明細書に開示されるＮＤＣは、約２４個のエキサテカン分子を含んでいてもよい。本明細書に開示されるＮＤＣは、約２５個のエキサテカン分子を含んでいてもよい。本明細書に開示されるＮＤＣは、約２６個のエキサテカン分子を含んでいてもよい。本明細書に開示されるＮＤＣは、約２７個のエキサテカン分子を含んでいてもよい。
【0124】
ＥｎｄｏｃｙｔｅおよびＭｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．により開発されたビンタフォリドは、卵巣がんなどのある特定のがんで過剰発現する葉酸受容体を標的とする小分子、および化学療法薬、ビンブラスチンからなる小分子薬物コンジュゲートである（ＵＳ ７６０１３３２ Ｂ２およびＵＳ １００２９４２ Ｂ２）。しかしながらビンタフォリドは、ｐＨ切断可能リンカーによって標的部分に付着される、ペイロードの単一分子のみ運ぶことが可能である。それとは対照的に、本開示では、数個の細胞毒性ペイロード（例えば、エキサテカン分子）を単一ナノ粒子の表面に組み込むことができる。
【0125】
リンカー－ペイロードコンジュゲートのリンカーは、活性ペイロードの酵素による放出に十分な条件下（例えば、放出を触媒することが可能な酵素を提示する条件）、ｉｎ ｖｉｔｒｏならびにｉｎ ｖｉｖｏで活性ペイロードを放出することが可能な自己犠牲リンカー（ｓｅｌｆ－ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ ｌｉｎｋｅｒ）とすることができる。
【0126】
本明細書に記述されるリンカーは、例えば、細胞毒性薬物ペイロード（例えば、エキサテカン）を、がん細胞に結合し（例えば、がん細胞の表面の受容体に結合する）かつ細胞内に（例えば、エンドソームおよびリソソーム区画を経て）内部移行される担体および／または標的部分（例えば、ナノ粒子）に付着するのに使用することができる。内部移行すると、リンカーは切断または分解されて、活性細胞毒性薬を放出することができる。特にプロテアーゼ切断可能リンカーは、そのペイロードを、細胞のリソソーム区画のカテプシン、トリプシン、またはその他のプロテアーゼなどのプロテアーゼの作用の下で放出することができる。
【0127】
本明細書に記述される切断可能リンカーは、式（Ｆ）：
の構造を含んでいてもよく、［ＡＡ］のそれぞれの場合は、天然または非天然アミノ酸残基であり；ｚは１から５の整数であり；ｗは１から４（例えば、２または３）の整数であり；および各
は、例えばスペーサー基（例えば、ＰＥＧ）またはリンカーの別の部分との、あるいはエキサテカン分子との付着点を示す。例えば、－［ＡＡ］ｗ－は、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｔｒｐ－Ｌｙｓ、Ａｓｐ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ａｒｇ、またはＶａｌ－Ａｌａを含んでいてもよく、ｚは２であってもよく、１つの
は、ＰＥＧ基の酸素原子との付着を示し、その他の
は、エキサテカンの窒素原子との付着を示す。例えば、－［ＡＡ］ｗ－はＶａｌ－Ｌｙｓを含んでいてもよい。
【化14】
の構造を含んでいてもよく、［ＡＡ］のそれぞれの場合は、天然または非天然アミノ酸残基であり；ｚは１から５の整数であり；ｗは１から４（例えば、２または３）の整数であり；および各
【化15】
は、例えばスペーサー基（例えば、ＰＥＧ）またはリンカーの別の部分との、あるいはエキサテカン分子との付着点を示す。例えば、－［ＡＡ］ｗ－は、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｔｒｐ－Ｌｙｓ、Ａｓｐ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ａｒｇ、またはＶａｌ－Ａｌａを含んでいてもよく、ｚは２であってもよく、１つの
【化16】
は、ＰＥＧ基の酸素原子との付着を示し、その他の
【化17】
は、エキサテカンの窒素原子との付着を示す。例えば、－［ＡＡ］ｗ－はＶａｌ－Ｌｙｓを含んでいてもよい。
【0128】
本明細書に記述される切断可能リンカーは、式（Ｆ－１）：
の構造を含んでいてもよく、１つの
は、ＰＥＧ基の酸素原子との付着点を示し、その他の
は、エキサテカンの窒素原子との付着点を示す。
【化18】
の構造を含んでいてもよく、１つの
【化19】
は、ＰＥＧ基の酸素原子との付着点を示し、その他の
【化20】
は、エキサテカンの窒素原子との付着点を示す。
【0129】
本開示のリンカーは、分子の一端または両端に反応性基を含有するリンカー前駆体から調製することができる。反応性基は、一端でのエキサテカンまたはその類似体とのコンジュゲーションが可能になるように、また他端でのナノ粒子とのコンジュゲーションが容易になるように、選択することができる。ペイロードは、リンカーとのコンジュゲーションを容易にするために、アミン、ヒドロキシル、ヒドラゾン、ヒドラジド、またはスルフヒドリル基を含有することが望ましい。例えば、エキサテカンは、リンカーとのそのコンジュゲーションを容易にすることができる第一級アミン基を含む。
【0130】
リンカー－ペイロードコンジュゲート前駆体は、任意の適切な技法および方法を使用してナノ粒子に付着することができ、多くのそのような技法が当技術分野で周知である。例えば、標的化ナノ粒子をベースにした薬物送達系を調製するのに使用することができるシリカ系コア－シェルまたはシリカ系コアナノ粒子について記述している、参照によりそのそれぞれの全体が本明細書に組み込まれるＷＯ ２０１７／１８９９６１、ＷＯ ２０１５／１８３８８２、ＷＯ ２０１３／１９２６０９、ＷＯ ２０１６／１７９２６０、およびＷＯ ２０１８／２１３８５１を参照されたい。さらに、リンカー－ペイロードコンジュゲート前駆体、またはリガンド－リンカー前駆体は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＫｏｌｂ ｅｔ ａｌ． Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ．
（２００１） ４０：２００４－２０２１に記載された反応または方法を使用して、ナノ粒子に付着することができる。
（２００１） ４０：２００４－２０２１に記載された反応または方法を使用して、ナノ粒子に付着することができる。
【0131】
リンカー－ペイロードコンジュゲートは、直接または本明細書に記述されるスペーサー基などのスペーサー基を介して間接的にナノ粒子に付着されてもよい。適切なスペーサー基には、限定するものではないが２価のリンカー（例えば、本明細書に記述される２価のリンカー）、例えばＰＥＧスペーサー、またはアルキレンスペーサー（例えば、メチレンスペーサー）であって、ヘテロ原子または環式基（例えば、ヘテロシクリレン基）をさらに含み得るものを含む。リンカー－ペイロードコンジュゲートは、シリカシェルの間隙または細孔内に吸収されることができ、または蛍光ナノ粒子などのナノ粒子のシリカシェル上にコーティングすることができる（例えば、ナノ粒子の表面に共有結合により付着される）。シリカシェルがナノ粒子の表面全てを覆わないその他の態様では、リンカー－ペイロードコンジュゲートを、例えば物理吸収によってまたは結合相互作用によって、蛍光コアに関連付けることができる。
【0132】
一部の態様では、リンカー－ペイロードコンジュゲートは、ナノ粒子の表面に共有結合されたＰＥＧ基に関連付けられてもよい。例えば、リンカー－ペイロードコンジュゲートは、ＰＥＧを経てナノ粒子に付着されてもよい。ＰＥＧは、ナノ粒子におよびリンカー－ペイロードコンジュゲートに付着するための、複数の官能基を有することができる。
【0133】
本開示の特定の態様では、リンカー－ペイロードコンジュゲート（またはリンカー－ペイロードコンジュゲート前駆体）を、親水性ＰＥＧスペーサーで官能化してもよい。リンカー－ペイロードコンジュゲート前駆体は、例えばナノ粒子表面のＤＢＣＯ基との反応を介してナノ粒子の表面にリンカー－ペイロードコンジュゲートを共有結合により付着するのを容易にするために（例えば、スペーサー基を介して）、アジド基などであるがこれらに限定されない親水性ＰＥＧスペーサーおよび／または適切な末端基で官能化されてもよい。その他の末端基は、ナノ粒子（例えば、ジエン部分）上の適切な基に対する、例えば３＋２付加環化反応を介したコンジュゲーションのために、ニトリルオキシドまたはニトロンを含むことができる。
【0134】
官能化リンカー－ペイロードコンジュゲート（またはその前駆体）に存在することができるスペーサーとしてのＰＥＧ基の数は、０から２０個、例えば２から２０個、２から１０個、または５から８個に及んでもよく、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個である。好ましい態様では、官能化リンカー－ペイロードコンジュゲートにおけるスペーサーとしてのＰＥＧ基の数は、９個である。
【0135】
例えば、エキサテカンは、プロテアーゼ切断可能リンカーにコンジュゲートして、リンカー－ペイロードコンジュゲートを形成することができる。このリンカーコンジュゲートは、例えばＤＢＣＯ基を介したナノ粒子の表面とのさらなるコンジュゲーションのため、アジドなどの末端反応性基を有するＰＥＧスペーサーで官能化された前駆体から調製することができる。
【0136】
プロテアーゼ切断可能リンカーは、悪性腫瘍で過剰発現する酵素であるカテプシンＢ（Ｃａｔ－Ｂ）に対して不安定になるように設計することができ、それによって、自己犠牲プロセスによりエキサテカンなどの細胞毒性剤の放出が行われる。
【0137】
リンカーペイロードコンジュゲート前駆体は、式（Ｅ－１）：
の構造を含むことができ、式中、ｙは０から２０、例えば５から１５の整数であり、例えば９である。
【化21】
の構造を含むことができ、式中、ｙは０から２０、例えば５から１５の整数であり、例えば９である。
【0138】
本開示に記述されるリンカーおよびリンカー－ペイロードコンジュゲートには、従来の薬物送達プラットフォーム、リンカー、またはリンカー－ペイロードコンジュゲートと比較して、優れた血清安定性からより速い放出動態メカニズムまでいくつかの利点がある。また、これらのリンカーと様々な化学基とを対合させる能力は、これは著しい利点であるが最小限に抑えられた誘導体化と共に遊離ペイロード／薬物の選択的放出の機会を提供する。
【0139】
本開示の好ましい態様では、リンカー－ペイロードコンジュゲートにおけるリンカーは、プロテアーゼ切断可能リンカーである。
【0140】
ペイロード－リンカー部分を含む本開示のＮＤＣは、式（ＮＰ－３）：
の構造を含んでいてもよく、式中、ｘは０から１０の整数（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、例えば４）であり、ｙは、０から２０の整数（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０、例えば９）であり、ケイ素原子はナノ粒子の一部である（例えば、コア－シェルシリカナノ粒子のシリカシェルに結合される）。例えばｘは４であってもよく、ｙは９であってもよい。本明細書に開示されるＮＤＣは、式（ＮＰ－３）の１個より多い分子を含んでいてもよく、例えば、ナノ粒子は、式（ＮＰ－３）の約１から約８０個の間の分子、例えば式（ＮＰ－３）の約１から約６０個の間の分子、式（ＮＰ－３）の約１から約４０個の間の分子、式（ＮＰ－３）の約１から約３０個の間の分子、式（ＮＰ－３）の約１０から約３０個の間の分子、式（ＮＰ－３）の約１５から約２５個の間の分子、例えば式（ＮＰ－３）の約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、または約３０個の分子を含んでいてもよい。
【化22】
の構造を含んでいてもよく、式中、ｘは０から１０の整数（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、例えば４）であり、ｙは、０から２０の整数（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０、例えば９）であり、ケイ素原子はナノ粒子の一部である（例えば、コア－シェルシリカナノ粒子のシリカシェルに結合される）。例えばｘは４であってもよく、ｙは９であってもよい。本明細書に開示されるＮＤＣは、式（ＮＰ－３）の１個より多い分子を含んでいてもよく、例えば、ナノ粒子は、式（ＮＰ－３）の約１から約８０個の間の分子、例えば式（ＮＰ－３）の約１から約６０個の間の分子、式（ＮＰ－３）の約１から約４０個の間の分子、式（ＮＰ－３）の約１から約３０個の間の分子、式（ＮＰ－３）の約１０から約３０個の間の分子、式（ＮＰ－３）の約１５から約２５個の間の分子、例えば式（ＮＰ－３）の約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、または約３０個の分子を含んでいてもよい。
【0141】
プロテアーゼと接触すると（例えば、がん細胞のリソソーム内など、がん細胞内で）、本開示のＮＤＣは切断を受けて遊離エキサテカンを放出し得る。本明細書に開示されるＮＤＣの切断は、エキサテカン、二酸化炭素、および４－アミノベンジルアルコールをＮＤＣから同時に放出し得る。例えば、本明細書に開示される例示的なＮＤＣの切断は、以下のスキーム１に提示される。
【化23】
【0142】
スキーム１． 本明細書に開示されるＮＤＣの例示的な切断メカニズム。
本明細書に開示されるＮＤＣは、式（ＮＰ－２）の分子および式（ＮＰ－３）の分子の両方を含んでいてもよく、例えば各ＮＤＣは、式（ＮＰ－２）の約１から約２０個の分子と、式（ＮＰ－３）の約１から約３０個の分子とを含んでいてもよい。例えば、各ＮＤＣは、式（ＮＰ－２）の約１０から約１５個の分子と式（ＮＰ－３）の約１５から約２５個の分子とを含んでいてもよい。本明細書に開示されるＮＤＣは、式（ＮＰ－２）の平均１３個の分子と式（ＮＰ－３）の平均２１個の分子；式（ＮＰ－２）の平均１２個の分子と式（ＮＰ－３）の平均２５個の分子；式（ＮＰ－２）の平均１２個の分子と式（ＮＰ－３）の平均２０個の分子を含んでいてもよい。
本明細書に開示されるＮＤＣは、式（ＮＰ－２）の分子および式（ＮＰ－３）の分子の両方を含んでいてもよく、例えば各ＮＤＣは、式（ＮＰ－２）の約１から約２０個の分子と、式（ＮＰ－３）の約１から約３０個の分子とを含んでいてもよい。例えば、各ＮＤＣは、式（ＮＰ－２）の約１０から約１５個の分子と式（ＮＰ－３）の約１５から約２５個の分子とを含んでいてもよい。本明細書に開示されるＮＤＣは、式（ＮＰ－２）の平均１３個の分子と式（ＮＰ－３）の平均２１個の分子；式（ＮＰ－２）の平均１２個の分子と式（ＮＰ－３）の平均２５個の分子；式（ＮＰ－２）の平均１２個の分子と式（ＮＰ－３）の平均２０個の分子を含んでいてもよい。
【0143】
本開示は：ナノ粒子；葉酸受容体に結合する標的化リガンド；およびリンカー－ペイロードコンジュゲートを含む、ナノ粒子－薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）であって、平均直径が約１ｎｍから約１０ｎｍの間であるものを対象とする組成物および方法を提供する。例えば、ナノ粒子は標的化リガンドとして葉酸を含み、リンカー－ペイロードコンジュゲートはプロテアーゼ切断可能リンカーを介してコンジュゲートされたエキサテカンを含み、ＮＤＣは、約１ｎｍから約１０ｎｍの間の平均直径を有する。
【0144】
図１は、約６ｎｍの平均直径を有する代表的なナノ粒子－薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）を示し、これは、シリカ系コアおよびこのコアの少なくとも一部分を取り囲むシリカシェル、ナノ粒子の表面に共有結合されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびナノ粒子のコア内に共有結合により被包された蛍光化合物（Ｃｙ５）を含むナノ粒子、、葉酸受容体に結合できる標的化リガンドとしての葉酸（ＦＡ）、ならびにプロテアーゼ切断可能リンカー－エキサテカンコンジュゲートを含むリンカー－ペイロードコンジュゲートを含む。「葉酸」は、例えば葉酸がアミド基を介してスペーサー基（ＰＥＧ）に共有結合により付着される図１に示されるように、葉酸の任意のアミドまたはエステル誘導体を包含するものであることが理解されよう。
【0145】
ＮＤＣは、約５ｎｍから約８ｎｍの間または約６ｎｍから約７ｎｍの間の平均直径を有していてもよい。ＮＤＣの平均直径は、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）（例えば、図６参照）およびゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）（図７）などであるがこれらに限定されない任意の適切な方法によって測定することができる。
【0146】
本開示のＮＤＣは、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）、および光学撮像（近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）撮像、生物発光撮像、またはこれらの組合せを含む蛍光撮像など）のための造影剤で官能化することができるナノ粒子を含むことができる。
【0147】
８９Ｚｒ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、１２４Ｉ、および１７７Ｌｕを含むがこれらに限定されない放射性核種（放射性標識）などの造影剤を、ナノ粒子に付着してもよい。あるいはナノ粒子は、放射性核種に結合するよう適合されたキレーター部分、例えばＤＦＯ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、およびＤＴＰＡに付着することができる。そのようなナノ粒子は、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、ＣＴ、ＭＲＩ、または光学撮像（近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）撮像、生物発光撮像、またはこれらの組合せを含む蛍光撮像など）によって検出され得る。
【0148】
放射性核種はさらに、多重治療プラットフォームを創出するための治療剤として働くことができる。このカップリングによれば、治療剤は、標的化リガンドと細胞成分との間の特異的結合を経て特定の細胞型に送達されることが可能になる。
【0149】
プロテアーゼ切断可能リンカー－ペイロードコンジュゲート
リンカー－ペイロードコンジュゲートは、式（Ｉ）
の化合物またはその塩を含んでいてもよく、
リンカー－ペイロードコンジュゲートは、式（Ｉ）
【化24】
の化合物またはその塩を含んでいてもよく、
【0150】
式中、
線は、スペーサー基を経たナノ粒子との付着を表し；Ａは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｔｒｐ－Ｌｙｓ、Ａｓｐ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ａｒｇ、およびＶａｌ－Ａｌａからなる群より選択されるジペプチドであり、またはＡは、Ｖａｌ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｓａｒ、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－Ｇｌｙ－Ｓａｒ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓａｒ、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｓａｒ、Ｖａｌ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－Ｇｌｙ－任意の天然または非天然Ｎ－アルキル置換アルファアミノ酸、Ｖａｌ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－任意の天然または非天然Ｎ－アルキル置換アルファアミノ酸、Ｖａｌ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－任意の天然または非天然Ｎ－アルキル置換アルファアミノ酸、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－任意の天然または非天然Ｎ－アルキル置換アルファアミノ酸、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－任意の天然または非天然Ｎ－アルキル置換アルファアミノ酸、およびＴｒｐ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－任意の天然または非天然Ｎ－アルキル置換アルファアミノ酸からなる群より選択されるテトラペプチドであり；ペイロードはエキサテカンであり、エキサテカンの第一級アミン基はＺによって表され；Ｒ１およびＲ２は出現するごとに独立して、水素、置換もしくは非置換Ｃ１～６アルキル、または置換もしくは非置換Ｃ１～６アルコキシ、またはヒドロキシルであり；Ｒ３およびＲ４は、出現するごとに独立して、水素、ハロ、置換もしくは非置換Ｃ１～６アルキル、または置換もしくは非置換Ｃ１～６アルコキシであり；Ｒ５は、水素、置換または非置換Ｃ１～６アルキル；置換または非置換Ｃ３～７シクロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、および置換または非置換Ｃ５～６ヘテロシクロアルキルからなる群より選択され；但し、Ａがジペプチドである場合、Ｒ５はＨであり；Ｒａ、Ｒｂ、およびＲｃは出現するごとに独立して、水素、または置換もしくは非置換Ｃ１～６アルキルであり；Ｘは、不在、－Ｏ－、－ＣＯ－、または－ＮＲａ－であり；Ｙは、不在、
であり、ここで
中のカルボニルは、Ｚに結合され；
但し、Ｙが
である場合、Ｘは不在であり、ｎは１であり；Ｙが
である場合、Ｘは不在であり、ｎは０であり；Ｙが
である場合、Ｘは不在であり、ｎは０であり；および／またはＸが－ＣＯ－である場合、Ｙが不在であり、ｎは０であり；Ｘ１およびＸ２は独立して、－ＣＨ－または－Ｎ－であり；Ｘ３は－ＣＨ－であり；Ｘ４は－ＣＨ－であり；Ｚは－ＮＲｃ－または－Ｏ－であり；ｎは、０または１であり；ｑは、１から３である。
【化25】
線は、スペーサー基を経たナノ粒子との付着を表し；Ａは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｔｒｐ－Ｌｙｓ、Ａｓｐ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ａｒｇ、およびＶａｌ－Ａｌａからなる群より選択されるジペプチドであり、またはＡは、Ｖａｌ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｓａｒ、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－Ｇｌｙ－Ｓａｒ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓａｒ、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｓａｒ、Ｖａｌ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－Ｇｌｙ－任意の天然または非天然Ｎ－アルキル置換アルファアミノ酸、Ｖａｌ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－任意の天然または非天然Ｎ－アルキル置換アルファアミノ酸、Ｖａｌ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－任意の天然または非天然Ｎ－アルキル置換アルファアミノ酸、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－任意の天然または非天然Ｎ－アルキル置換アルファアミノ酸、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－任意の天然または非天然Ｎ－アルキル置換アルファアミノ酸、およびＴｒｐ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－任意の天然または非天然Ｎ－アルキル置換アルファアミノ酸からなる群より選択されるテトラペプチドであり；ペイロードはエキサテカンであり、エキサテカンの第一級アミン基はＺによって表され；Ｒ１およびＲ２は出現するごとに独立して、水素、置換もしくは非置換Ｃ１～６アルキル、または置換もしくは非置換Ｃ１～６アルコキシ、またはヒドロキシルであり；Ｒ３およびＲ４は、出現するごとに独立して、水素、ハロ、置換もしくは非置換Ｃ１～６アルキル、または置換もしくは非置換Ｃ１～６アルコキシであり；Ｒ５は、水素、置換または非置換Ｃ１～６アルキル；置換または非置換Ｃ３～７シクロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、および置換または非置換Ｃ５～６ヘテロシクロアルキルからなる群より選択され；但し、Ａがジペプチドである場合、Ｒ５はＨであり；Ｒａ、Ｒｂ、およびＲｃは出現するごとに独立して、水素、または置換もしくは非置換Ｃ１～６アルキルであり；Ｘは、不在、－Ｏ－、－ＣＯ－、または－ＮＲａ－であり；Ｙは、不在、
【化26】
であり、ここで
【化27】
中のカルボニルは、Ｚに結合され；
但し、Ｙが
【化28】
である場合、Ｘは不在であり、ｎは１であり；Ｙが
【化29】
である場合、Ｘは不在であり、ｎは０であり；Ｙが
【化30】
である場合、Ｘは不在であり、ｎは０であり；および／またはＸが－ＣＯ－である場合、Ｙが不在であり、ｎは０であり；Ｘ１およびＸ２は独立して、－ＣＨ－または－Ｎ－であり；Ｘ３は－ＣＨ－であり；Ｘ４は－ＣＨ－であり；Ｚは－ＮＲｃ－または－Ｏ－であり；ｎは、０または１であり；ｑは、１から３である。
【0151】
式（Ｉ）の好ましい態様では、ＡはＶａｌ－Ｌｙｓであり；Ｒ１～Ｒ５はそれぞれ独立して水素であり；Ｘは不在であり；Ｙが
であり、式中、
中のカルボニルはＺに結合し；ｎは１であり；Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４はそれぞれ独立して－ＣＨ－であり；Ｚは－ＮＲｃ－であり、ここでＲｃは水素であり、Ｎは、エキサテカンペイロード中に存在する窒素原子である。
【化31】
であり、式中、
【化32】
中のカルボニルはＺに結合し；ｎは１であり；Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４はそれぞれ独立して－ＣＨ－であり；Ｚは－ＮＲｃ－であり、ここでＲｃは水素であり、Ｎは、エキサテカンペイロード中に存在する窒素原子である。
【0152】
式（Ｉ）のリンカー－ペイロードコンジュゲートにおいて、ペイロードは、リンカーに結合された官能基を有するエキサテカンであってもよく、この官能基はアミンである（エキサテカンがリンカーに結合された場合は第二級アミンであり、放出されると（またはコンジュゲーションの前）、即ち別個の分子実体として、エキサテカンのアミンは第一級アミンである）。
【0153】
例示的なリンカー－ペイロードコンジュゲート： 本開示の代表的なリンカー－ペイロードコンジュゲートには、限定するものではないが下記の部分構造が含まれ、ここで
線は、ナノ粒子との直接結合、またはスペーサー基を経たナノ粒子との間接結合を表す。適切なスペーサー基には、限定するものではないがＰＥＧスペーサーまたはアルキレンスペーサー（例えば、メチレンスペーサー）が含まれ、これはさらに、ヘテロ原子または環式基（例えば、ヘテロシクリレン基）を含んでいてもよい。好ましい態様では、スペーサー基がＰＥＧスペーサーである。
【化33】
線は、ナノ粒子との直接結合、またはスペーサー基を経たナノ粒子との間接結合を表す。適切なスペーサー基には、限定するものではないがＰＥＧスペーサーまたはアルキレンスペーサー（例えば、メチレンスペーサー）が含まれ、これはさらに、ヘテロ原子または環式基（例えば、ヘテロシクリレン基）を含んでいてもよい。好ましい態様では、スペーサー基がＰＥＧスペーサーである。
【0154】
本開示の式（Ｉ）の例示的なリンカー－ペイロードコンジュゲートは、下記の部分構造：
を含む。
【化34】
を含む。
【0155】
リンカーおよびその前駆体： 本開示のリンカー、および／またはその前駆体は、分子の両端に反応性基を含有することができる。反応性基は、エキサテカンまたはその塩もしくは類似体とのコンジュゲーションが、一端で可能になるように、および他端でナノ粒子とのコンジュゲーション（例えば、スペーサー基を介して）も容易になるように、選択することができる。例えば、リンカーは、エキサテカンの第一級アミンなど（リンカーとのコンジュゲーションにより第二級アミンになる）、エキサテカンの一部である化学的に反応性の官能基を介してエキサテカンに接続することができる。
【0156】
リンカーは、第一級または第二級アミンまたはカルボキシル基などのリンカーの一部である化学的に反応性の官能基を介して官能化ポリエチレングリコールまたはＣ５～Ｃ６アルキル鎖にコンジュゲートすることができる。
【0157】
プロテアーゼ切断可能リンカー： プロテアーゼは、腫瘍細胞成長および生存から血管新生および侵襲までのがん疾患の全ての段階に関わる。したがって、リンカー／ペイロード系の活性化に向けての選択的誘発因子として、がんを処置するのに利用することができる。本開示は、プロテアーゼの作用により切断可能であり、それによって遊離ペイロード（例えば、エキサテカン）を放出する、リンカーに関する。カテプシンＢなどのリソソームプロテアーゼおよびカテプシンＡなどのセリンプロテアーゼ、またはトリペプチジル－ペプチダーゼＩは、プロドラッグ開発の文脈において大々的に研究されてきた。カスパーゼなどのタンパク質分解酵素も、ペイロードの選択的活性化のためのまたはがん細胞などの標的細胞への特異的カーゴ送達のための生物学的誘発因子として利用されることが周知である。
【0158】
リンカー（またはその前駆体）は、式（Ｉ－Ａ）
の化合物を含むことができ、
式中：Ａは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｔｒｐ－Ｌｙｓ、Ａｓｐ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ａｒｇ、およびＶａｌ－Ａｌａからなる群より選択されるジペプチドであり、またはＡは、Ｖａｌ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｓａｒ、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－Ｇｌｙ－Ｓａｒ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓａｒ、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｓａｒ、Ｖａｌ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－Ｇｌｙ－任意の天然または非天然Ｎ－アルキル置換アルファアミノ酸、Ｖａｌ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－任意の天然または非天然Ｎ－アルキル置換アルファアミノ酸、Ｖａｌ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－任意の天然または非天然Ｎ－アルキル置換アルファアミノ酸、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－任意の天然または非天然Ｎ－アルキル置換アルファアミノ酸、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－任意の天然または非天然Ｎ－アルキル置換アルファアミノ酸、およびＴｒｐ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－任意の天然または非天然Ｎ－アルキル置換アルファアミノ酸からなる群より選択されるテトラペプチドであり；Ｒ１およびＲ２は出現するごとに独立して、水素、置換もしくは非置換Ｃ１～６アルキル、または置換もしくは非置換Ｃ１～６アルコキシ、またはヒドロキシであり；Ｒ３およびＲ４は、出現するごとに独立して、水素、ハロ、置換もしくは非置換Ｃ１～６アルキル、または置換もしくは非置換Ｃ１～６アルコキシであり；Ｒ５は、水素、置換または非置換Ｃ１～６アルキル；置換または非置換Ｃ３～７シクロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、および置換または非置換Ｃ５～６ヘテロシクロアルキルからなる群より選択され；但し、Ａがジペプチドである場合、Ｒ５はＨであり；Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｒ４’、およびＲ５’は出現するごとに独立して、水素、置換もしくは非置換Ｃ１～６アルキル、または置換もしくは非置換Ｃ１～６シクロアルキルであり；Ｘは、不在、－Ｏ－、－ＣＯ－、または－ＮＲａ－であり；Ｙは、不在、
であり、ここで
中のカルボニルは、Ｚ１に結合され、但し、Ｙが
である場合、Ｘは不在であり、ｎは１であり；但し、Ｙが
である場合、Ｘは不在であり、ｎは０であり；但し、Ｙが
である場合、Ｘは不在であり、ｎは０または１であり；但し、Ｘが－ＣＯ－である場合、Ｙが不在であり、ｎは０であり；Ｘ３は－ＣＨ－であり；Ｘ４は－ＣＨ－であり；Ｚ１は、ハロ、ヒドロキシ、－ＯＳＯ２－ＣＨ３、－ＯＳＯ２ＣＦ３、４－ニトロフェノキシ、－ＣＯＣｌ、および－ＣＯＯＨからなる群より選択され；Ｚ２は、－ＮＨ２、－ＮＨＲｃ、および－ＣＯＯＨからなる群より選択される官能基であり；またはＺ２は、－Ｃ（Ｏ）－Ｔ１であり；Ｔ１は、官能化ポリエチレングリコール、またはＣ５～Ｃ６アルキル鎖であって、アジド、
からなる群より選択される末端基を有するものであり；出現するごとにＲａ、Ｒｂ、およびＲｃは、独立して、水素、または置換もしくは非置換Ｃ１～６アルキルであり；ｎは０または１であり；およびｑは１から３である。式（Ｉ－Ａ）のある特定の態様では、Ａは、Ｖａｌ－Ｌｙｓであり；Ｒ１～Ｒ５はそれぞれ独立して、水素であり；Ｘは不在であり；Ｙは、
であり、ここで
中のカルボニルは、Ｚに結合され；ｎは、１であり；Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４はそれぞれ独立して、－ＣＨ－であり；Ｚ１は、ハロ、ヒドロキシ、－ＯＳＯ２－ＣＨ３、－ＯＳＯ２ＣＦ３、４－ニトロフェノキシ、－ＣＯＣｌ、および－ＣＯＯＨからなる群より選択される官能基であり；Ｚ２は、－ＮＨ２、－ＮＨＲｃ、および－ＣＯＯＨからなる群より選択される官能基であり、またはＺ２は、－Ｃ（Ｏ）－Ｔ１であり、ここでＴ１は、式（Ｉ－Ａ）に定められた通りである。
【化35】
の化合物を含むことができ、
式中：Ａは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｔｒｐ－Ｌｙｓ、Ａｓｐ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ａｒｇ、およびＶａｌ－Ａｌａからなる群より選択されるジペプチドであり、またはＡは、Ｖａｌ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｓａｒ、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－Ｇｌｙ－Ｓａｒ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓａｒ、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｓａｒ、Ｖａｌ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－Ｇｌｙ－任意の天然または非天然Ｎ－アルキル置換アルファアミノ酸、Ｖａｌ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－任意の天然または非天然Ｎ－アルキル置換アルファアミノ酸、Ｖａｌ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－任意の天然または非天然Ｎ－アルキル置換アルファアミノ酸、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－任意の天然または非天然Ｎ－アルキル置換アルファアミノ酸、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－任意の天然または非天然Ｎ－アルキル置換アルファアミノ酸、およびＴｒｐ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－任意の天然または非天然Ｎ－アルキル置換アルファアミノ酸からなる群より選択されるテトラペプチドであり；Ｒ１およびＲ２は出現するごとに独立して、水素、置換もしくは非置換Ｃ１～６アルキル、または置換もしくは非置換Ｃ１～６アルコキシ、またはヒドロキシであり；Ｒ３およびＲ４は、出現するごとに独立して、水素、ハロ、置換もしくは非置換Ｃ１～６アルキル、または置換もしくは非置換Ｃ１～６アルコキシであり；Ｒ５は、水素、置換または非置換Ｃ１～６アルキル；置換または非置換Ｃ３～７シクロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、および置換または非置換Ｃ５～６ヘテロシクロアルキルからなる群より選択され；但し、Ａがジペプチドである場合、Ｒ５はＨであり；Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｒ４’、およびＲ５’は出現するごとに独立して、水素、置換もしくは非置換Ｃ１～６アルキル、または置換もしくは非置換Ｃ１～６シクロアルキルであり；Ｘは、不在、－Ｏ－、－ＣＯ－、または－ＮＲａ－であり；Ｙは、不在、
【化36】
であり、ここで
【化37】
中のカルボニルは、Ｚ１に結合され、但し、Ｙが
【化38】
である場合、Ｘは不在であり、ｎは１であり；但し、Ｙが
【化39】
である場合、Ｘは不在であり、ｎは０であり；但し、Ｙが
【化40】
である場合、Ｘは不在であり、ｎは０または１であり；但し、Ｘが－ＣＯ－である場合、Ｙが不在であり、ｎは０であり；Ｘ３は－ＣＨ－であり；Ｘ４は－ＣＨ－であり；Ｚ１は、ハロ、ヒドロキシ、－ＯＳＯ２－ＣＨ３、－ＯＳＯ２ＣＦ３、４－ニトロフェノキシ、－ＣＯＣｌ、および－ＣＯＯＨからなる群より選択され；Ｚ２は、－ＮＨ２、－ＮＨＲｃ、および－ＣＯＯＨからなる群より選択される官能基であり；またはＺ２は、－Ｃ（Ｏ）－Ｔ１であり；Ｔ１は、官能化ポリエチレングリコール、またはＣ５～Ｃ６アルキル鎖であって、アジド、
【化41】
からなる群より選択される末端基を有するものであり；出現するごとにＲａ、Ｒｂ、およびＲｃは、独立して、水素、または置換もしくは非置換Ｃ１～６アルキルであり；ｎは０または１であり；およびｑは１から３である。式（Ｉ－Ａ）のある特定の態様では、Ａは、Ｖａｌ－Ｌｙｓであり；Ｒ１～Ｒ５はそれぞれ独立して、水素であり；Ｘは不在であり；Ｙは、
【化42】
であり、ここで
【化43】
中のカルボニルは、Ｚに結合され；ｎは、１であり；Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４はそれぞれ独立して、－ＣＨ－であり；Ｚ１は、ハロ、ヒドロキシ、－ＯＳＯ２－ＣＨ３、－ＯＳＯ２ＣＦ３、４－ニトロフェノキシ、－ＣＯＣｌ、および－ＣＯＯＨからなる群より選択される官能基であり；Ｚ２は、－ＮＨ２、－ＮＨＲｃ、および－ＣＯＯＨからなる群より選択される官能基であり、またはＺ２は、－Ｃ（Ｏ）－Ｔ１であり、ここでＴ１は、式（Ｉ－Ａ）に定められた通りである。
【0159】
医薬組成物
本開示はさらに、疾患（例えば、葉酸受容体発現腫瘍に関連したがんなどの、がん）を処置するための医薬組成物であって、本明細書に記述されるＮＤＣの有効量を含む医薬組成物を提供する。
本開示はさらに、疾患（例えば、葉酸受容体発現腫瘍に関連したがんなどの、がん）を処置するための医薬組成物であって、本明細書に記述されるＮＤＣの有効量を含む医薬組成物を提供する。
【0160】
本開示の特定の態様では、ＮＤＣを含む医薬組成物は、卵巣がん、子宮内膜がん、卵管がん、子宮頸がん、乳がん、肺がん、中皮腫、子宮がん、胃腸がん（例えば、食道がん、結腸がん、直腸がん、および胃がん）、膵臓がん、膀胱がん、腎臓がん、肝臓がん、頭頸部がん、脳がん、甲状腺がん、皮膚がん、前立腺がん、精巣がん、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ、例えば、小児ＡＭＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）からなる群より選択されるがんを処置するのに使用することができる。ＮＤＣを含む医薬組成物は、例えば対象の腫瘍の免疫状態を修正するために、マクロファージに関連した腫瘍を標的とするのに使用してもよい。
【0161】
本開示の医薬組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤、例えば無毒性担体、佐剤、希釈剤、またはビヒクルであって、それと共に製剤化されるＮＤＣの薬理学的活性に悪影響を及ぼさないものを含んでいてもよい。本開示の医薬組成物の製造に有用な、薬学的に受容可能な賦形剤は、医薬製剤の分野で周知のもののいずれかであり、不活性希釈剤、分散および／または造粒剤、表面活性剤および／または乳化剤、崩壊剤、結合剤、保存剤、緩衝化剤、滑沢剤（ｌｕｂｒｉｃａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、および／または油を含むことができる。本開示の医薬組成物の製造に有用な、薬学的に受容可能な賦形剤には、限定するものではないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）、緩衝物質（例えば、ホスフェート）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、グリセリド混合物（例えば、飽和植物脂肪酸の混合物）、水、塩、または電解質（例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩）、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレン－ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂が含まれる。
【0162】
本開示の医薬組成物は、適切な薬学的単位剤形の形で経口投与されてもよい。本開示の医薬組成物は、錠剤、硬質または軟質ゼラチンカプセル、水溶液、懸濁物、リポソーム、およびその他の緩徐放出製剤、例えば成形ポリマーゲルを含む多くの形で調製されてもよい。
【0163】
ＮＤＣまたは組成物の適切な投与様式には、限定するものではないが経口、静脈内、直腸、舌下、粘膜、鼻、眼科的、皮下、筋肉内、経皮、脊椎、髄腔内、関節内、動脈内、くも膜下、気管支、リンパ系投与、腫瘍内、および活性成分の全身送達に適切なその他の経路が含まれる。
【0164】
本発明の医薬組成物は、経皮（パッチ、ゲル、クリーム、軟膏、またはイオン導入を介して受動的に）；静脈内（ボーラス、輸液）；皮下（輸液、デポー）；経粘膜（頬側および舌下、例えば、口内分散性錠剤（ｏｒｏｄｉｓｐｅｒｓｉｂｌｅ ｔａｂｌｅｔ）、オブラート、フィルム、および発泡製剤）；結膜（点眼液）；直腸（坐薬、浣腸）；または皮内（ボーラス、輸液、デポー）を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の方法によって投与されてもよい。組成物は、局所的に送達されてもよい。
【0165】
経口液体医薬組成物は、例えば、水性または油性の懸濁物、溶液、エマルジョン、シロップ、またはエリキシルの形であり得、あるいは使用前に水またはその他の適切なビヒクルと共に構成するための乾燥生成物として提供されてもよい。そのような液体医薬組成物は、懸濁化剤、乳化剤、非水性ビヒクル（食用油を含んでいてもよい）、または保存剤などの、従来の添加剤を含有していてもよい。
【0166】
本開示の医薬組成物は、非経口投与用（例えば注射によって、例えば、ボーラス注射または連続輸液）に製剤化されてもよく、アンプル、プレフィルドシリンジ、輸液容器（例えば、小体積輸液容器）内の単位剤形として、または追加の保存剤を含有し得る複数回用量容器として、提供されてもよい。
【0167】
医薬組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁物、溶液、またはエマルジョンなどの形をとってもよく、懸濁化剤、安定化剤、および／または分散剤などの製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を含有してもよい。あるいは本開示の医薬組成物は、滅菌固体の無菌単離によって、または使用前に適切なビヒクル、例えば滅菌発熱物質不含水と共に構成するために溶液からの凍結乾燥によって、得られる粉末形態であり得る。
【0168】
局所投与（例えば、表皮への）では、医薬組成物は、軟膏、クリーム、またはローションとして、あるいは経皮パッチの活性成分として製剤化されてもよい。適切な経皮送達システムは、例えば、Ａ． Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（米国特許第４，７８８，６０３号）、およびＲ． Ｂａｗａ ｅｔ ａｌ．（米国特許第４，９３１，２７９号；第４，６６８，５０６号；および第４，７１３，２２４号）であって、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるものに、開示されている。軟膏およびクリームは、例えば、水性または油性基剤と共に、適切な増粘剤および／またはゲル化剤の添加と共に製剤化されてもよい。ローションは、水性または油性基剤と共に製剤化されてもよく、一般に、１種または複数の乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤、または着色剤も含有することになる。医薬組成物は、例えば参照によりそのそれぞれの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第４，１４０，１２２号；第４，３８３，５２９号；または第４，０５１，８４２号に開示されるように、イオン導入を介して送達することもできる。
【0169】
口内の局所投与に適した医薬組成物は、スクロースおよびアカシアまたはトラガカントなどの矯味矯臭された基剤において本開示の医薬組成物を含むロゼンジ；ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤中に医薬組成物を含むトローチ；粘膜接着ゲル（ｍｕｃｏａｄｈｅｒｅｎｔ ｇｅｌ）、および適切な液体担体中に医薬組成物を含むマウスウォッシュなどの単位剤形を含む。
【0170】
眼への局所投与では、医薬組成物は、参照によりそのそれぞれの全体が本明細書に組み込まれる、滴、ゲル（Ｓ． Ｃｈｒａｉ ｅｔ ａｌ， 米国特許第４，２５５，４１５号）、ガム（Ｓ． Ｌ． Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ， 米国特許第４，１３６，１７７号）として、または長期放出眼用インサートを介して（Ａ． Ｓ． Ｍｉｃｈａｅｌｓ， 米国特許第３，８６７，５１９号、およびＨ． Ｍ． Ｈａｄｄａｄ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第３，８７０，７９１号）投与することができる。
【0171】
望む場合には、上述の医薬組成物は、例えば天然ゲル、合成ポリマーゲル、またはこれらの混合物を含む、例えばある特定の親水性ポリマーマトリクスと組み合わせることによって用いられる治療化合物の持続放出を与えるように適合させることができる。
【0172】
担体が固体である、直腸投与に適した医薬組成物は、単位用量坐薬として最も好ましく提供される。適切な担体には、カカオ脂、および当技術分野で一般に使用されるその他の材料が含まれ、坐薬は、医薬組成物と軟化または融解された担体（複数可）とを混合し、その後、型内で冷却かつ成形することによって都合良く形成されてもよい。
【0173】
膣投与に適した医薬組成物は、ナノ粒子および治療剤に加えて担体を含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、またはスプレーとして提供されてもよい。そのような担体は、当技術分野で周知である。
【0174】
吸入による投与では、本開示による医薬組成物は、吹送器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）、ネブライザー、または加圧パック、またはエアロゾルスプレーを送達するその他の都合よい手段から、都合良く送達される。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、またはその他の適切な気体などの、適切な噴霧体を含んでいてもよい。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、計量された量を送達する弁を設けることによって決定されてもよい。
【0175】
あるいは、吸入または吹送による投与では、本開示の医薬組成物は、乾燥粉末組成物、例えば医薬組成物と、ラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との、粉末混合物の形をとってもよい。粉末組成物は、単位剤形で、例えば、カプセルまたはカートリッジ、または例えばゼラチンまたはブリスターパックで提供されてもよく、そこからは粉末が、吸入器または吹送器の補助とともに投与され得るものである。
【0176】
鼻内投与では、本開示の医薬組成物は、液体スプレーを介して、例えばプラスチックボトルアトマイザーを介して投与されてもよい。これらの典型例は、ＭＩＳＴＯＭＥＴＥＲ（登録商標）（イソプロテレノール吸入器－Ｗｉｎｔｒｏｐ）およびＭＥＤＩＨＡＬＥＲ（登録商標）（イソプロテレノール吸入器－Ｒｉｋｅｒ）である。
【0177】
本開示の医薬組成物は、矯味矯臭剤、着色剤、抗微生物剤、または保存剤などのその他の佐剤を含有してもよい。
【0178】
処置での使用に適した医薬組成物の量は、選択された治療剤とだけではなく、投与経路、処置される状態の性質、ならびに患者の年齢および状態によっても様々になり、最終的には主治医または臨床医の裁量によることが、さらに理解されよう。これらの要因の評価に関しては、参照によりそのそれぞれの全体が本明細書に組み込まれるＪ． Ｆ． Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒｏｐ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １４， １３３ （１９７８）； およびＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ， Ｃｈａｒｌｅｓ Ｅ． Ｂａｋｅｒ， Ｊｒ．， Ｐｕｂ．， Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｃｏ．， Ｏｒａｄｅｌｌ， Ｎ．Ｊ． （４１ｓｔ ｅｄ．， １９８７）を参照されたい。
【0179】
投与および処置の方法
本開示のＮＤＣは、対象に投与することができる。対象は、哺乳動物とすることができ、好ましくはヒトである。哺乳動物には、限定するものではないがネズミ、ラット、ウサギ、サル、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、家畜、競技用動物、ペット、ウマ、および霊長類が含まれる。
本開示のＮＤＣは、対象に投与することができる。対象は、哺乳動物とすることができ、好ましくはヒトである。哺乳動物には、限定するものではないがネズミ、ラット、ウサギ、サル、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、家畜、競技用動物、ペット、ウマ、および霊長類が含まれる。
【0180】
ＮＤＣは、限定するものではないが下記の経路：経口、静脈内、鼻、皮下、局所、筋肉内、または経皮によって対象に投与されてもよい。例えば、本開示のＮＤＣは、対象に静脈内投与されてもよい。
【0181】
本開示の方法および組成物は、医師または外科医が、ＦＲを過剰発現するがんを含むがこれらに限定されないがんなどの疾患領域を特定し特徴付け、例えば脳手術で通常の手術用顕微鏡を使用して検出するのが難しい腫瘍周縁部を検出するなどの患部組織および正常組織を区別し、例えば病変ががん性であるか否かおよび除去すべきかまたは非がん性であり放置するか否かを決定することにより、または疾患の外科的病期判定において治療または外科的介入を指示するのを助けるのに、使用することができる。
【0182】
本開示の方法および組成物は、限定するものではないが、転移性疾患検出、処置応答モニタリング、およびペイロードの標的化された送達であって、血液脳関門を通過することによるものも含めて、使用されてもよい。
【0183】
本開示の方法および組成物は、早期疾患を含めた疾患の検出、特徴付け、および／または疾患の局在化の決定、疾患または疾患関連状態の重症度、疾患の病期決定、および／または疾患のモニタリングに使用することもできる。放出されたシグナルの存在、不在、またはレベルは、疾患状態を示すことができる。
【0184】
本開示の方法および組成物は、外科手順およびカテーテルをベースにした手順などの様々な治療介入をモニタリングおよび／またはガイドし、細胞ベースの治療を含めた薬物治療をモニタリングするのに使用することもできる。本開示の方法は、疾患または疾患状態の予後で使用することもできる。疾患部位の内部または周辺に常在する細胞部分集団、例えば幹様細胞（「がん幹細胞」）および／または炎症／食細胞は、本開示の方法および組成物を使用して特定されかつ特徴付けられてもよい。
【0185】
前述のそれぞれに関し、検出またはモニタリングできる（治療の前、間、または後）そのような疾患または疾患状態の例には、がん（例えば、黒色腫、甲状腺、結腸直腸、卵巣、肺、乳房、前立腺、子宮頸部、皮膚、脳、胃腸、口、腎臓、食道、骨がん）が含まれ、がんおよび／または悪性疾患を発症する感受性が高い対象、即ち、がんおよび／または悪性疾患、炎症（例えば、がん性病変の存在により誘発された炎症状態）、心血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症および血管の炎症状態、虚血、卒中、血栓）、皮膚疾患（例えば、カポジ肉腫、乾癬）、眼科疾患（例えば、黄斑変性症、糖尿病性網膜症）、感染性疾患（例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を含む、細菌、ウイルス、真菌、および寄生生物感染）、免疫疾患（例えば、自己免疫障害、リンパ腫、多発性硬化症、関節リウマチ、糖尿病）、中枢神経系疾患（例えば、神経変性疾患、例えばパーキンソン病またはアルツハイマー病）、遺伝性疾患、代謝疾患、環境疾患（例えば、鉛、水銀、および放射性物質中毒、皮膚がん）、骨関連疾患（例えば、骨粗しょう症、原発性および転移性骨腫瘍、変形性関節症）、および神経変性疾患を発症する素因を有する対象を特定するのに使用できる。
【0186】
したがって本開示の方法および組成物は、例えば、腫瘍および／または共在幹様細胞（「がん幹細胞」）の存在および／または局在化、例えば腫瘍周辺領域における活性化マクロファージの存在を含む炎症細胞の存在および／または局在化、冠動脈および末梢動脈の急性閉塞（即ち、不安定プラーク）のリスクのある領域、拡張した動脈瘤の領域、頸動脈の不安定プラーク、および虚血領域を含む血管疾患の存在および局在化を決定するのに使用することができる。本開示の方法および組成物は、細胞死、損傷、アポトーシス、壊死、低酸素症、および血管新生の特定および評価で使用することもできる（ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４９２２２）。
【0187】
本開示の方法は、有効量の本明細書に記述されるＮＤＣを、それを必要とする対象に投与することを含む。例えば、ＮＤＣは、それを必要とする対象に静脈内投与することができる。「有効量」は、処置がなされる疾患または障害の徴候および／または症状を低減させる量、例えば腫瘍サイズまたは腫瘍負荷を低減させる量など、投与条件下で所望の生物学的または医学的応答を誘発するＮＤＣの量である。投与される実際の量は、例えば、対象の年齢、体重、性別、全身の健康および薬物に対する耐性、疾患の重症度、選択される剤形、投与経路、およびその他の要因に基づいて、通常の技量を有する臨床医により決定することができる。
【0188】
方法の特定の態様では、対象は、卵巣がん、子宮内膜がん、卵管がん、子宮頸がん、乳がん、肺がん、中皮腫、子宮がん、胃腸がん（例えば、食道がん、結腸がん、直腸がん、および胃がん）、膵臓がん、膀胱がん、腎臓がん、肝臓がん、頭頸部がん、脳がん、甲状腺がん、皮膚がん、前立腺がん、精巣がん、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ、例えば、小児ＡＭＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）からなる群より選択されるがんを有する。
【0189】
本開示は、葉酸受容体発現腫瘍を処置するためのＮＤＣの使用も含む。例えば、ＮＤＣの使用は、それを必要とする対象に静脈内投与することを含んでいてもよい。
【0190】
本開示は、卵巣がん、子宮内膜がん、卵管がん、子宮頸がん、乳がん、肺がん、中皮腫、子宮がん、胃腸がん（例えば、食道がん、結腸がん、直腸がん、および胃がん）、膵臓がん、膀胱がん、腎臓がん、肝臓がん、頭頸部がん、脳がん、甲状腺がん、皮膚がん、前立腺がん、精巣がん、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ、例えば、小児ＡＭＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）からなる群より選択されるがんを持つ対象でのＮＤＣの使用にも関する。
【0191】
本開示のＮＤＣは、葉酸受容体発現腫瘍を処置するための医薬の製造で使用されてもよく、このＮＤＣは、それを必要とする対象に静脈内投与されるものであり、この対象は、卵巣がん、子宮内膜がん、卵管がん、子宮頸がん、乳がん、肺がん、中皮腫、子宮がん、胃腸がん（例えば、食道がん、結腸がん、直腸がん、および胃がん）、膵臓がん、膀胱がん、腎臓がん、肝臓がん、頭頸部がん、脳がん、甲状腺がん、皮膚がん、前立腺がん、精巣がん、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ、例えば、小児ＡＭＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）からなる群より選択されるがんを有する。
【0192】
本明細書に開示される組成物および方法は、本明細書に開示されるＮＤＣを、１種または複数の追加の抗がん剤と組み合わせて投与することを含む、組成物および方法を含むことができる。そのような状況において、ＮＤＣは、追加の１種または複数の薬剤の前に、実質的に同時に、または後に、投与することができる。適切な追加の薬剤には、例えば化学療法剤、例えばメクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、イフォスファミド、ブスルファン、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチル尿素、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、フォテムスチン、ストレプトゾトシン、ダカルバジン、ミトゾロミド、テモゾロミド、チオテパ、ミトマイシン、ジアジクオン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、メトトレキセート、ペメトレキセド、フルオロウラシル（例えば、５－フルオロウラシル）、カペシタビン、シタラビン、ゲムシタビン、デシタビン、アザシチジン、フルダラビン、ネララビン、クラドリビン、クロファラビン、ペントスタチン、チオグアニン、メルカプトプリン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、ビンフルニン、パクリタキセル、ドセタキセル、イリノテカン、トポテカン、カムプトテシン、エトポシド、ミトキサントロン、テニポシド、ノボビオシン、メルバロン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ピラルビシン、アクラルビシン、ミトマイシンＣ、アクチノマイシン、ブレオマイシン、ビサントレン、ゲムシタビン、シタラビン、および同様のものが含まれる。本明細書に開示される組成物および方法でＮＤＣと共に使用することができるその他の抗がん剤には、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ４抗体）、ホルモン受容体アンタゴニスト、およびその他の化学療法コンジュゲート（例えば、抗体－薬物コンジュゲート、およびナノ粒子薬物コンジュゲートなど）などが含まれる。
【0193】
本明細書の本発明の記述で使用される専門用語は、単に特定の実施形態について記述する目的のためであり、本発明を限定しようとするものではない。本発明の実施形態の記述でおよび添付される特許請求の範囲で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の単数形は、文脈がその他を明示しない限り、複数形も同様に含むものとする。また、本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連ある列挙された項目の１つまたは複数のいずれかおよび全ての可能性ある組合せを指すおよび包含する。
【0194】
「約」という用語は、ある値を指すとき、±２０％または±１０％を意味する。さらに、「約」という用語は、１つまたは複数の数値または数値範囲に関連して使用されるとき、ある範囲内の全ての数値を含む、全てのそのような数値を指し、記述される数値の上および下の境界まで拡張することによってその範囲を修飾すると理解すべきである。端点による数値範囲の列挙は、全ての数値、例えばその範囲内に包含される、小数部を含む整数（例えば、１から５の列挙は、１、２、３、４、および５を含み、同様にその小数部、例えば１．５、２．２５、３．７５、４．１、および同様のものを含む）、およびその範囲内の任意の範囲を含む。
【0195】
本明細書および特許請求の範囲の全体にわたり、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、文脈がその他を必要とする場合を除き、非排他的意味で使用される。同様に、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語およびその文法上の変形例は非限定的であるとし、したがってリストにおける項目の列挙は、列挙された項目を置換しまたは付加することができるその他の同様の項目を排除するものではない。
【0196】
特定の用語が本明細書で用いられるが、それらは一般的なおよび記述的な意味でのみ使用され、限定を目的とするものではない。他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本明細書で記述される主題が属する分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【0197】
詳細な記述および添付される特許請求の範囲では、用いられる略称および命名法は、アミノ酸およびペプチド化学で標準的なものであることが理解されよう。
【0198】
略称
本開示で使用される略称は、他に指示されない限り、下記の通りである：
Ｆｍｏｃ： フルオレニルメトキシカルボニル
ＭｅＯＨ： メタノール
Ｃｉｔ－ＯＨ： Ｌ－シトルリン
ＤＣＭ： ジクロロメタン
ＥＥＤＱ： ２－エトキシ－１－（エトキシカルボニル）－１，２－ジヒドロキノリン
ＴＨＦ： テトラヒドロフラン
ＮＭＲ： 核磁気共鳴
ＤＭＳＯ： ジメチルスルホキシド
ＬＣＭＳ： 液体クロマトグラフィー－質量分光法
ＴＥＡ： トリエチルアミン
ＨＡＴＵ： （１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート
ＤＭＦ： ジメチルホルムアミド
ＤＩＰＥＡ： Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＴＭＳＣＮ： シアン化トリメチルシリル
ＲＰ ＨＰＬＣ： 逆相高圧液体クロマトグラフィー
ＳＦＣ： 超臨界流体クロマトグラフィー
ＣＡＮ： アセトニトリル
ＮＭＰ： Ｎ－メチルピロリドン
ｒ．ｔ： 室温
ＴＥＡ： トリエチルアミン
ＴＦＡ： トリフルオロ酢酸
ＭＴＢＥ： メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル
ＥｔＯＡＣ： 酢酸エチル
ＰｙＢＯＰ： （ベンゾトリアゾール（Ｂｅｎｚｏｔｒｉｚｏｌｅ）－１－イル－オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）
本開示で使用される略称は、他に指示されない限り、下記の通りである：
Ｆｍｏｃ： フルオレニルメトキシカルボニル
ＭｅＯＨ： メタノール
Ｃｉｔ－ＯＨ： Ｌ－シトルリン
ＤＣＭ： ジクロロメタン
ＥＥＤＱ： ２－エトキシ－１－（エトキシカルボニル）－１，２－ジヒドロキノリン
ＴＨＦ： テトラヒドロフラン
ＮＭＲ： 核磁気共鳴
ＤＭＳＯ： ジメチルスルホキシド
ＬＣＭＳ： 液体クロマトグラフィー－質量分光法
ＴＥＡ： トリエチルアミン
ＨＡＴＵ： （１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート
ＤＭＦ： ジメチルホルムアミド
ＤＩＰＥＡ： Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＴＭＳＣＮ： シアン化トリメチルシリル
ＲＰ ＨＰＬＣ： 逆相高圧液体クロマトグラフィー
ＳＦＣ： 超臨界流体クロマトグラフィー
ＣＡＮ： アセトニトリル
ＮＭＰ： Ｎ－メチルピロリドン
ｒ．ｔ： 室温
ＴＥＡ： トリエチルアミン
ＴＦＡ： トリフルオロ酢酸
ＭＴＢＥ： メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル
ＥｔＯＡＣ： 酢酸エチル
ＰｙＢＯＰ： （ベンゾトリアゾール（Ｂｅｎｚｏｔｒｉｚｏｌｅ）－１－イル－オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）
【0199】
定義
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、１から１８個の炭素原子、例えば１から約１２個の炭素原子、または１から約６個の炭素原子を含み得る（「Ｃ１～１８アルキル」）、１価の脂肪族炭化水素基を指す。アルキル基は、直鎖、分岐鎖、単環式部分、または多環式部分、またはこれらの組合せとすることができる。アルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、ヘキシル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、ノルボルニル、および同様のものが含まれる。アルキル基のそれぞれの場合は、独立して、必要に応じて置換されてもよく、即ち置換されない（「非置換アルキル」）かあるいは１個または複数の置換基、例えば１から５個の置換基、１から３個の置換基、または１個の置換基で置換される（「置換アルキル」）。
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、１から１８個の炭素原子、例えば１から約１２個の炭素原子、または１から約６個の炭素原子を含み得る（「Ｃ１～１８アルキル」）、１価の脂肪族炭化水素基を指す。アルキル基は、直鎖、分岐鎖、単環式部分、または多環式部分、またはこれらの組合せとすることができる。アルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、ヘキシル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、ノルボルニル、および同様のものが含まれる。アルキル基のそれぞれの場合は、独立して、必要に応じて置換されてもよく、即ち置換されない（「非置換アルキル」）かあるいは１個または複数の置換基、例えば１から５個の置換基、１から３個の置換基、または１個の置換基で置換される（「置換アルキル」）。
【0200】
本明細書で使用される場合、「アルケニル」という用語は、２から１８個の炭素原子、１つまたは複数の炭素－炭素二重結合を有し、三重結合を持たない１価の直鎖または分岐状炭化水素基を指す（「Ｃ２～１８アルケニル」）。アルケニル基は、２から８個の炭素原子、２から６個の炭素原子、２から５個の炭素原子、２から４個の炭素原子、または２から３個の炭素原子を有していてもよい。１つまたは複数の炭素－炭素二重結合は、内部（例えば、２－ブテニル内）または末端（例えば、１－ブテニル内）とすることができる。アルケニル基の例には、エテニル、１－プロペニル、２－プロペニル、１－ブテニル、２－ブテニル、ブタジエニル、ペンテニル、ペンタジエニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、オクタトリエニル、および同様のものが含まれる。アルケニル基のそれぞれの場合は、独立して、必要に応じて置換されてもよく、即ち、置換されない（「非置換アルケニル」）か、あるいは１個または複数の置換基、例えば１から５個の置換基、１から３個の置換基、または１個の置換基で置換される（「置換アルケニル」）。
【0201】
本明細書で使用される場合、「アルキニル」という用語は、２から１８個の炭素原子、１つまたは複数の炭素－炭素三重結合を有する１価の直鎖または分岐状炭化水素基を指す（「Ｃ２～１８アルキニル」）。アルキニル基は、２から８個の炭素原子、２から６個の炭素原子、２から５個の炭素原子、２から４個の炭素原子、または２から３個の炭素原子を有していてもよい。１つまたは複数の炭素－炭素三重結合は、内部（例えば、２－ブチニル内）または末端（例えば、１－ブチニル内）とすることができる。アルキニル基の例には、エチニル、１－プロピニル、２－プロピニル、１－ブチニル、２－ブチニル、および同様のものが含まれる。アルキニル基のそれぞれの場合は、独立して、必要に応じて置換されてもよく、即ち、置換されない（「非置換アルキニル」）かあるいは１個または複数の置換基、例えば１から５個の置換基、１から３個の置換基、または１個の置換基で置換される（「置換アルキニル」）。
【0202】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアルキル」という用語は、非環式の安定な直鎖または分岐鎖、またはその組合せであって、少なくとも１個の炭素原子と、Ｏ、Ｎ、Ｐ、Ｓｉ、およびＳからなる群より選択される少なくとも１個ヘテロ原子とを含むものを指し、窒素および硫黄原子は必要に応じて酸化されてもよく、窒素ヘテロ原子が必要に応じて四級化されてもよい。ヘテロ原子（複数可）Ｏ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、およびＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の位置に配置されてもよい。
【0203】
「アルキレン」、「アルケニレン」、「アルキニレン」、または「ヘテロアルキレン」という用語は、単独でまたは別の置換基の部分として、他に記述しない限りそれぞれアルキル、アルケニル、アルキニル、またはヘテロアルキルから誘導された２価のラジカルを意味する。「アルケニレン」という用語は、それ自体でまたは別の置換基の部分として、他に記述しない限りアルケンから誘導された２価のラジカルを意味する。アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、またはヘテロアルキレン基は、例えばＣ１～６員アルキレン、Ｃ１～６員アルケニレン、Ｃ１～６員アルキニレン、またはＣ１～６員ヘテロアルキレンと記述されてもよく、「員」という用語は、部分内の非水素原子を指す。ヘテロアルキレン基の場合、ヘテロ原子は、鎖末端のいずれかまたは両方を占有することもできる（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ、および同様のもの）。さらになお、アルキレンおよびヘテロアルキレン連結基では、連結基の式が書かれる方向によって、連結基の無配向が示唆される。例えば、式－Ｃ（Ｏ）２Ｒ’－は、－Ｃ（Ｏ）２Ｒ’－および－Ｒ’Ｃ（Ｏ）２－の両方を表してもよい。アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、またはヘテロアルキレン基のそれぞれの場合は、独立して、必要に応じて置換されてもよく、即ち、置換されない（「非置換アルキレン」）かまたは１個または複数の置換基で置換される（「置換ヘテロアルキレン」）。
【0204】
本明細書で使用される場合、「置換アルキル」、「置換アルケニル」、「置換アルキニル」、「置換ヘテロアルキル」、「置換ヘテロアルケニル」、「置換ヘテロアルキニル」、「置換シクロアルキル」、「置換ヘテロシクリル」、「置換アリール」、および「置換ヘテロアリール」という用語は、それぞれアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリール部分を指し、その部分の１個または複数の炭素またはヘテロ原子上の１個または複数の水素原子を置き換える置換基を有している。そのような置換基は、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル、およびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分を含むことができる。シクロアルキルは、例えば上述の置換基でさらに置換することができる。
【0205】
本明細書で使用される場合、「アルコキシ」という用語は、式－Ｏ－アルキルの基を指す。「アルコキシ」または「アルコキシル」という用語は、酸素原子に、共有結合により連結された、置換および非置換アルキル、アルケニル、およびアルキニル基を含む。アルコキシ基またはアルコキシルラジカルの例には、限定するものではないがメトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、プロポキシ、ブトキシ、およびペントキシ基が含まれる。置換アルコキシ基の例には、ハロゲン化アルコキシ基が含まれる。アルコキシ基は、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル、およびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分などの基で置換することができる。ハロゲン置換アルコキシ基の例には、限定するものではないがフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、クロロメトキシ、ジクロロメトキシ、およびトリクロロメトキシが含まれる。
【0206】
本明細書で使用される場合、「アリール」という用語は、単環式であっても多環式であってもよい安定な芳香環系であって、その全ての環原子が炭素でありかつ置換されても置換されなくてもよいものを指す。芳香環系は、例えば、３～７個の環原子を有していてもよい。その例には、フェニル、ベンジル、ナフチル、アントラシル、および同様のものが含まれる。アリール基のそれぞれの場合は、独立して、必要に応じて置換されてもよく、即ち、置換されない（「非置換アリール」）かあるいは１個または複数の置換基で置換される（「置換アリール」）。
【0207】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」という用語は、１個または複数の環ヘテロ原子を含むアリール基を指す。例えば、ヘテロアリールは、炭素原子ならびに窒素、酸素、および硫黄からなる群より独立して選択される１個または複数のヘテロ原子からなる安定な５－、６－、または７員単環式あるいは７－、８－または９員二環式芳香族複素環式環を含むことができる。窒素原子は、置換されても置換されなくてもよい（例えば、定義されるように、ＮまたはＮＲ４であり、ここでＲ４はＨまたはその他の置換基である）。ヘテロアリール基の例には、ピロール、フラン、インドール、チオフェン、チアゾール、イソチアゾール、イミダゾール、トリアゾール、テトラゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、ピリミジン、および同様のものが含まれる。
【0208】
本明細書で使用される場合、「シクロアルキレン」、「ヘテロシクリレン」、「アリーレン」、および「ヘテロアリーレン」という用語は、単独でまたは別の置換基の部分として、それぞれシクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールから誘導される２価のラジカルを意味する。シクロアルキレン、ヘテロシクリレン、アリーレン、またはヘテロアリーレンのそれぞれの場合は、独立して、必要に応じて置換されてもよく、即ち、置換されない（「非置換アリーレン」）かあるいは１個または複数の置換基で置換される（「置換ヘテロアリーレン」）。
【0209】
本明細書で使用される場合、「シクロアルキル」という用語は、非芳香族環式炭化水素環、例えばその環構造内に３から８個の炭素原子を有する炭化水素環を含むものとする。シクロアルキルは、シクロブチル、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、および同様のものを含むことができる。シクロアルキル基は、単環式（「単環式シクロアルキル」）とすることができ、または二環式系などの縮合、架橋、またはスピロ環系（「二環式シクロアルキル」）を含有することができ、飽和され得るか、または部分的に不飽和であり得る。「シクロアルキル」は、上記定義されたシクロアルキル環が１個または複数のアリール基と縮合する環系も含み、その付着点はシクロアルキル環上にあり、そのような場合には炭素の数は、シクロアルキル環系における炭素の数を示し続ける。シクロアルキル基のそれぞれの場合は、独立して、必要に応じて置換されてもよく、即ち、置換されない（「非置換シクロアルキル」）かあるいは１個または複数の置換基で置換される（「置換シクロアルキル」）。
【0210】
本明細書で使用される場合、「ヘテロシクリル」という用語は、１つまたは複数の環内に少なくとも２個の異なる元素の原子を含む（即ち、複素環式環のラジカル）、１価の環式分子構造を指す。複素環式環が有機化学の分野で十分に確立された用語である証拠として、Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， １９９７をさらに参照されたい。
【0211】
本明細書で使用される場合、「ジペプチド」という用語は、－Ａ１－Ａ２－として本明細書で示され得る２個のアミノ酸残基から構成されるペプチドを指す。例えば、本開示のプロテアーゼ切断可能リンカー－ペイロードコンジュゲートの合成に用いられるジペプチドは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｔｒｐ－Ｌｙｓ、Ａｓｐ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、およびＶａｌ－Ａｌａからなる群より選択されてもよい。
【0212】
本明細書で使用される場合、「官能化ポリエチレングリコール」という用語は、官能基を含むポリエチレングリコールを指す。例えば、官能化ポリエチレングリコールは、アジド、
からなる群より選択される末端基で官能化されたポリエチレングリコールであってもよく、式中、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｒ４’、およびＲ５’は、出現するごとに独立して、水素、置換もしくは非置換Ｃ１～６アルキル、または置換もしくは非置換Ｃ１～６シクロアルキルである。好ましい態様では、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｒ４’、およびＲ５’は出現するごとに、水素である。好ましい態様では、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｒ４’、およびＲ５’は出現するごとにメチルである。
【化44】
からなる群より選択される末端基で官能化されたポリエチレングリコールであってもよく、式中、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｒ４’、およびＲ５’は、出現するごとに独立して、水素、置換もしくは非置換Ｃ１～６アルキル、または置換もしくは非置換Ｃ１～６シクロアルキルである。好ましい態様では、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｒ４’、およびＲ５’は出現するごとに、水素である。好ましい態様では、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｒ４’、およびＲ５’は出現するごとにメチルである。
【0213】
本開示の一部の態様では、「官能化ポリエチレングリコール」という用語は、限定するものではないが下記の構造を指す。
【0214】
【化45】
【0215】
本明細書で使用される場合、Ｔ１は、官能化ポリエチレングリコールまたはＣ５～Ｃ６アルキル鎖であって、アジド、
からなる群より選択される末端基を有するものを指してもよく、式中、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｒ４’、およびＲ５’は、出現するごとに、独立して水素、置換もしくは非置換Ｃ１～６アルキルまたは置換もしくは非置換Ｃ１～６シクロアルキルである。Ｔ１の好ましい態様において、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｒ４’、およびＲ５’は出現するごとに、水素である。Ｔ１の好ましい態様において、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｒ４’、およびＲ５’は出現するごとに、メチルである。好ましい態様において、Ｔ１は、アジド末端基を有する官能化ポリエチレングリコールである。好ましい態様では、Ｔ１は、アジド末端基を有するＣ５～Ｃ６アルキル鎖である。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の反復単位（－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－）は、５～２０単位に及ぶことができ、好ましくは５～１５単位、より好ましくは６～１２である。
【化46】
からなる群より選択される末端基を有するものを指してもよく、式中、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｒ４’、およびＲ５’は、出現するごとに、独立して水素、置換もしくは非置換Ｃ１～６アルキルまたは置換もしくは非置換Ｃ１～６シクロアルキルである。Ｔ１の好ましい態様において、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｒ４’、およびＲ５’は出現するごとに、水素である。Ｔ１の好ましい態様において、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｒ４’、およびＲ５’は出現するごとに、メチルである。好ましい態様において、Ｔ１は、アジド末端基を有する官能化ポリエチレングリコールである。好ましい態様では、Ｔ１は、アジド末端基を有するＣ５～Ｃ６アルキル鎖である。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の反復単位（－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－）は、５～２０単位に及ぶことができ、好ましくは５～１５単位、より好ましくは６～１２である。
【0216】
本明細書で使用される場合、Ｔ１は、アジド、
からなる群より選択される末端基を有するＣ５～Ｃ６アルキル鎖を指してもよく、式中、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｒ４’、およびＲ５’は、出現するごとに独立して、水素、置換もしくは非置換Ｃ１～６アルキル、または置換もしくは非置換Ｃ１～６シクロアルキルである。好ましい態様では、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｒ４’、およびＲ５’は出現するごとに、水素である。好ましい態様では、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｒ４’、およびＲ５’は、出現するごとにメチルである。
【化47】
からなる群より選択される末端基を有するＣ５～Ｃ６アルキル鎖を指してもよく、式中、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｒ４’、およびＲ５’は、出現するごとに独立して、水素、置換もしくは非置換Ｃ１～６アルキル、または置換もしくは非置換Ｃ１～６シクロアルキルである。好ましい態様では、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｒ４’、およびＲ５’は出現するごとに、水素である。好ましい態様では、Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｒ４’、およびＲ５’は、出現するごとにメチルである。
【0217】
一官能化アジド末端ＰＥＧおよび一官能化アジド末端Ｃ５～Ｃ６アルキル鎖を、公知の手順および適切な試薬、例えば本明細書に提供されるスキームに開示されるものを使用して、ＰＥＧから作製することができる。
【0218】
本明細書で使用される場合、「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩを指す。
【0219】
本明細書に記述されるアリールまたはヘテロアリール基は、１つまたは複数の環位置で、上述のような置換基で、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アラルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アラルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル、およびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分で置換することができる。
【0220】
本明細書で使用される場合、「ヒドロキシ」という用語は、式－ＯＨの基を指す。
【0221】
本明細書で使用される場合、「ヒドロキシル」という用語は、ヒドロキシルラジカル（．ＯＨ）を指す。
【0222】
本明細書で使用される場合、「必要に応じて置換された」という文言は、非置換または置換を意味する。一般に、「置換された」という用語は、基（例えば、炭素または窒素原子）上の少なくとも１つの水素が、許容される置換基、例えば置換によって安定な化合物をもたらす置換基で置き換えられることを意味する。「置換された」という用語は、安定な化合物の形成をもたらす本明細書に記述される置換基のいずれかなど、有機化合物の全ての許容される置換基での置換を含むことができる。本開示の目的で、窒素などのヘテロ原子は、水素置換基および／または本明細書に記述される任意の適切な置換基であってヘテロ原子の価数を満足させかつ安定な部分の形成をもたらすものを有していてもよい。
【0223】
本明細書で使用される場合、「テトラペプチド」という用語は、本明細書では－Ａ１－Ａ２－Ａ３－Ａ４－と記述され得る４個のアミノ酸残基から構成されるペプチドを指す。本開示のプロテアーゼ切断可能リンカー－ペイロードコンジュゲートの合成で用いられるテトラペプチドは、Ｖａｌ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｓａｒ、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－Ｇｌｙ－Ｓａｒ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓａｒ、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｓａｒ、Ｖａｌ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－Ｇｌｙ－任意の天然または非天然のＮ－アルキル置換アルファアミノ酸、Ｖａｌ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－任意の天然または非天然のＮ－アルキル置換アルファアミノ酸、Ｖａｌ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－任意の天然または非天然のＮ－アルキル置換アルファアミノ酸、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－任意の天然または非天然のＮ－アルキル置換アルファアミノ酸、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－任意の天然または非天然のＮ－アルキル置換アルファアミノ酸、およびＴｒｐ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－任意の天然または非天然のＮ－アルキル置換アルファアミノ酸からなる群より選択される。
【0224】
さらに、本明細書に記述される合成方法は様々な保護基を利用することが、当業者に理解されよう。本明細書で使用される場合、「保護基」という用語は、特定の官能部分、例えばＯ、Ｓ、またはＮであって、多官能性化合物中の別の反応性部位で反応を選択的に実施できるように一時的に遮断されるものを指す。保護基は、当業者に公知の方法を使用して、化合物の合成中の適切な段階で導入され除去されてもよい。保護基は、文献に記述される有機合成の標準的な方法に従い適用される（Ｔｈｅｏｄｏｒａ Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｇ． Ｍ． Ｗｕｔｓ （２００７） Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、保護基に関して参照により組み込まれる）。
【0225】
例示的な保護基には、限定するものではないが酸素、硫黄、窒素、および炭素保護基が含まれる。例えば、酸素保護基には、限定するものではないがメチルエーテル、置換メチルエーテル（例えば、ＭＯＭ（メトキシメチルエーテル）、ＭＴＭ（メチルチオメチルエーテル）、ＢＯＭ（ベンジルオキシメチルエーテル）、ＰＭＢＭ（ピメトキシベンジルオキシメチルエーテル）、必要に応じて置換されたエチルエーテル、必要に応じて置換されたベンジルエーテル、シリルエーテル（例えば、ＴＭＳ（トリメチルシリルエーテル）、ＴＥＳ（トリエチルシリルエーテル）、ＴＩＰＳ（トリイソプロピルシリルエーテル）、ＴＢＤＭＳ（ｔ－ブチルジメチルシリルエーテル）、トリベンジルシリルエーテル、ＴＢＤＰＳ（ｔ－ブチルジフェニルシリルエーテル）、エステル（例えば、ホルメート、アセテート、ベンゾエート（Ｂｚ）、トリフルオロアセテート、ジクロロアセテート）カーボネート、環式アセタール、およびケタールが含まれる。さらに窒素保護基には、限定するものではないがカルバメート（メチル、エチル、および置換エチルカルバメート（例えば、Ｔｒｏｃ）、アミド、環式イミド誘導体、Ｎ－アルキルおよびＮ－アリールアミン、イミン誘導体、およびエナミン誘導体などが含まれる。アミノ保護基には、限定するものではないがフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、カルボキシベンジル（Ｃｂｚ）、アセトアミド、トリフルオロアセトアミドなどが含まれる。ある特定のその他の例示的な保護基を本明細書に詳述するが、本開示はこれら保護基に限定しようとするものではなく；むしろ様々な追加の等価な保護基が、当業者に公知の方法に従い利用され得ることが、理解されよう。
【0226】
本開示の全体を通して、ナノ粒子－薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）は、時々、ＣＤＣ（Ｃ’ドット－薬物コンジュゲート）、例えばＦＡ－ＣＤＣと呼ばれてもよい。
【0227】
下記の実施例は、本発明の実施形態をさらに例示するために提供されるが、本発明の範囲を限定するものではない。それらは使用され得るものの典型例であるが、当業者に公知のその他の手順、方法、または技法が代わりに使用されてもよい。
【実施例0228】
本明細書に記述される本発明をより十分に理解し得るために、下記の実施例について述べる。これらの実施例は、ナノ粒子薬物コンジュゲート、使用方法、作製方法を示すのに提供され、その範囲を限定すると如何様にも解釈するものではない。
【0229】
本明細書に提供される化合物は、当業者に周知と考えられる、以下に述べる特定の合成プロトコールへの修正を使用して、容易に入手可能な出発材料から調製することができる。典型的なまたは好ましいプロセス条件（即ち、反応温度、時間、反応物のモル比、溶媒、圧力など）が与えられた場合、その他のプロセス条件も、他に記述されない限り使用できることが理解されよう。最適な反応条件は、使用される特定の反応物または溶媒と共に様々であり得るが、そのような条件は、慣例的な 最適化手順によって当業者が決定することができる。
【0230】
さらに、当業者に明らかにされるように、従来の保護基は、ある特定の官能基が望ましくない反応を受けないように必要と考えられる。特定の官能基に適切な保護基の選択、ならびに保護および脱保護に関する適切な条件は、当技術分野で周知である。例えば、数多くの保護基およびそれらの導入および除去は、Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１およびそこに引用される参考文献に記載されている。
【0231】
一般的な方法
本明細書で論じる化合物を作製するのに有用な方法を、下記の実施例で述べ、ここで一般化する。当業者なら、これらの実施例を、本開示に従いリンカー－ペイロードコンジュゲート、リンカー、およびペイロード、およびそれらの薬学的に受容可能な塩を調製するよう適合できることが理解されよう。記述される反応において、ヒドロキシ、アミノ、イミノ、チオ、またはカルボキシ基などの反応性官能基は、望む場合にはいつでも、例えば望ましくない反応を回避するように保護され得る。従来の保護基は、標準的な実施および合成技法に従い使用されてもよい。エキサテカンなどのペイロードを保持する新規なリンカーを合成するのに必要とされる材料は、商業的に得、それらの対応する類似体は、下記の実施例に開示されるように調製する。
本明細書で論じる化合物を作製するのに有用な方法を、下記の実施例で述べ、ここで一般化する。当業者なら、これらの実施例を、本開示に従いリンカー－ペイロードコンジュゲート、リンカー、およびペイロード、およびそれらの薬学的に受容可能な塩を調製するよう適合できることが理解されよう。記述される反応において、ヒドロキシ、アミノ、イミノ、チオ、またはカルボキシ基などの反応性官能基は、望む場合にはいつでも、例えば望ましくない反応を回避するように保護され得る。従来の保護基は、標準的な実施および合成技法に従い使用されてもよい。エキサテカンなどのペイロードを保持する新規なリンカーを合成するのに必要とされる材料は、商業的に得、それらの対応する類似体は、下記の実施例に開示されるように調製する。
【0232】
試薬は、商業上の供給元（Ｃｏｍｂｉ－Ｂｌｏｃｋｓ／ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ）から購入し、さらに精製することなく使用した。全ての非水性反応を、火炎乾燥したガラス容器で、アルゴンの陽圧下で実施した。無水溶媒は、商業上の供給元（ＲＡＮＫＥＭ）から購入した。全てのアミノ酸、例えばＣｉｔ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｓｐは、Ｓ配置を持つ天然に存在するアミノ酸である。いくつかの実施例において、テトラペプチドおよび非天然アミノ酸も使用することができる。フラッシュクロマトグラフィーを、示される溶媒系と共に２３０～４００メッシュのシリカゲルで行った。プロトン核磁気共鳴スペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ分光計で、溶媒としてＤＭＳＯを使用して４００ＭＨＺで記録した。ピーク位置は、内部標準としてのテトラメチルシランから百万分率単位で低磁場に与えられる。Ｊ値は、ヘルツを単位として表される。質量分析は、エレクトロスプレー（ＥＳ）技法を使用して、（Ａｇｉｌｅｎｔ／Ｓｈｉｍａｄｚｕ）分光計で行った。ＨＰＬＣ分析は、Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ－１８（１０００×４．６ｍｍ；５ｕ）を備えた（Ａｇｉｌｅｎｔ／Ｗａｔｅｒｓ）、ＰＤＡ－ＵＶ検出器で行い、試験した全ての化合物は、この方法を使用して＞９５％純粋であることが決定された。多くのプロテアーゼ切断可能リンカー－ペイロードコンジュゲートで見られるように、２つのピークが反応の終わりに単離された。ピーク－Ａ（またはピーク－１）は、図示される立体化学を持つ所望の化合物である。
【0233】
本明細書に記述される手順に従い調製した化合物は、分取ＨＰＬＣ法により単離されてもよい。代表的なＨＰＬＣ条件および方法を、以下に提示する：
【0234】
Ａｇｉｌｅｎｔ ＵＰＬＣ－ＭＳ；カラム：カラム－ＹＭＣ Ｔｒｉａｒｔ Ｃ１８（２．１×３３ｍｍ、３ｕ）
【0235】
勾配条件：流量：１．０ｍｌ／分：カラム温度：５０℃；溶媒Ａ：水中０．０１％ＨＣＯＯＨ、および溶媒Ｂ：ＣＨ３ＣＮ中０．０１％ＨＣＯＯＨ；移動相：９５％［水中０．０１％ＨＣＯＯＨ］および５％［ＣＨ３ＣＮ中０．０１％ＨＣＯＯＨ］、０．５０分間保持、次いで３．００分で１％［水中０．０１％ＨＣＯＯＨ］および９９％［ＣＨ３ＣＮ中０．０１％ＨＣＯＯＨ］、この条件を４．００分まで保持し、最終的に４．１０分で元の初期条件に戻り、４．５０分間保持した（表１）。
表１：ＨＰＬＣ勾配条件。
表１：ＨＰＬＣ勾配条件。
【表1】
【0236】
（実施例１）
エキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体の合成
本開示のＮＤＣを調製するのに適したエキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体を、下記のプロトコールに従い合成することができる。エキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体は末端アジド基を含むので、それらは、クリックケミストリーを使用してアルキン部分（例えば、ＤＢＣＯ）で官能化されたナノ粒子に付着するのに適している。
（Ｓ）－２－アミノ－Ｎ－（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）－６－（（ジフェニル（ｐトリル）メチル）アミノ）ヘキサンアミド（１６１）の合成
スキーム２：化合物（１６１）の合成。
エキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体の合成
本開示のＮＤＣを調製するのに適したエキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体を、下記のプロトコールに従い合成することができる。エキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体は末端アジド基を含むので、それらは、クリックケミストリーを使用してアルキン部分（例えば、ＤＢＣＯ）で官能化されたナノ粒子に付着するのに適している。
（Ｓ）－２－アミノ－Ｎ－（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）－６－（（ジフェニル（ｐトリル）メチル）アミノ）ヘキサンアミド（１６１）の合成
【化48】
スキーム２：化合物（１６１）の合成。
【0237】
４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）アニリン（１５９）の合成： イミダゾール（５．５４ｇ、８１．２２ｍｍｏｌ）を、（４－アミノフェニル）メタノール（７５）（５．０ｇ、４０．６１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２５ｍＬ）中の溶液に０℃で添加し、その後、ｔｅｒｔ－ブチル（クロロ）ジフェニルシラン（１３．３９ｇ、４８．７３ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応の進行を、ＴＬＣによりモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を水（２０ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（２×２００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、減圧下で濃縮し、シリカゲル（２３０～４００メッシュ）を使用して石油エーテル中１０％のＥｔＯＡｃで溶出するカラムクロマトグラフィーにより精製して、４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）アニリン（１５９；６．６ｇ）をゴム状物として得た。ＬＣＭＳ： ｍ／ｚ ３６２．３１［（Ｍ＋Ｈ）＋］；Ｒｔ：２．５８分；純度９３．６８％。
【0238】
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（Ｓ）－（１－（（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）－１－オキソヘキサン－２－イル）カルバメート（１６０）の合成： ジイソプロピルエチルアミン（４．１８ｍＬ、２４ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（６．０８ｇ、１６ｍｍｏｌ）、および４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）アニリン（１５９）（２．８９ｇ、８ｍｍｏｌ）を、Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）－Ｌ－リシン（１４９）（５．０ｇ、８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５０ｍＬ）中の溶液に０℃で添加し、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによりモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を氷水でクエンチした。沈殿した固体を濾過し、真空乾燥して、（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（Ｓ）－（１－（（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）－１－オキソヘキサン－２－イル）カルバメート（１６０；５．５ｇ）を固体として得た。ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ ９９０．３７［（Ｍ＋Ｈ）＋］；Ｒｔ：２．８４分、；純度９６．７９％。
【0239】
（Ｓ）－２－アミノ－Ｎ－（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）－６－（（ジフェニル（ｐトリル）メチル）アミノ）ヘキサンアミド（１６１）の合成： ピペリジン（１６．５ｍＬ）を、（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（Ｓ）－（１－（（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）－１－オキソヘキサン－２－イル）カルバメート（１６０）（５．５ｇ、５．６８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３８．５ｍＬ）中の溶液に、室温で添加し、反応混合物を室温で３時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによってモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を減圧下で濃縮し、１００％ＥｔＯＡｃで溶出するシリカゲル（２３０～４００メッシュ）を使用したカラムクロマトグラフィーにより精製して、（Ｓ）－２－アミノ－Ｎ－（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）ヘキサンアミド（１６０；３．５ｇ）をゴム状物として得た。ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ ７４４．２４［（Ｍ－Ｈ）－］；Ｒｔ：２．２０分；純度９０．１６％。
４－（（３２Ｓ，３５Ｓ）－１－アジド－３５－（４－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）ブチル）－３２－イソプロピル－３０，３３－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザヘキサトリアコンタン－３６－アミド）ベンジル（４－ニトロフェニル）カーボネート（１９１）の合成。
スキーム３： 化合物（１９１）の合成。
４－（（３２Ｓ，３５Ｓ）－１－アジド－３５－（４－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）ブチル）－３２－イソプロピル－３０，３３－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザヘキサトリアコンタン－３６－アミド）ベンジル（４－ニトロフェニル）カーボネート（１９１）の合成。
【化49】
スキーム３： 化合物（１９１）の合成。
【0240】
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）－１－オキソヘキサン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）カルバメート（１８７）の合成： ジイソプロピルエチルアミン（１．５４ｍＬ、８．８３ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（２．２４ｇ、５．８９ｍｍｏｌ）、および（Ｓ）－２－アミノ－Ｎ－（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）ヘキサンアミド（１６１）（２．１９ｇ、２．９４ｍｍｏｌ）を、（（（Ｎ－（９－フルオレニルメトキシカルボニル）－Ｌ－バリン（１ｇ、２．９４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２０ｍＬ）中の溶液に０℃で添加し、反応混合物を室温で３時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによりモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を氷水でクエンチした。沈殿した固体を濾過し、真空乾燥して、（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）－１－オキソヘキサン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）カルバメート（１８７；２．５ｇ）を固体として得た。ＬＣＭＳ：ＭＨ＋ １０６７、保持時間２．４２分。
【0241】
（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－アミノ－３－メチルブタンアミド）－Ｎ－（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）ヘキサンアミド（１８８）の合成： ピペリジンのＤＭＦ（４．５ｍＬ）中の３０％溶液を、（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）－１－オキソヘキサン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）カルバメート（１８７）（１．５ｇ、１．４０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（６ｍＬ）中の溶液に室温で添加し、反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによりモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を減圧下で濃縮し、１００％ＥｔＯＡｃで溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－アミノ－３－メチルブタンアミド）－Ｎ－（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）ヘキサンアミド（１８８；１．１ｇ）を固体として得た。
【化50】
【0242】
１－アジド－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）－１－オキソヘキサン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサトリアコンタン－３０－アミド（１８９）の合成： ジイソプロピルエチルアミン（０．４９ｍＬ、２．８３ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（７１９．４７ｍｇ、１．８９ｍｍｏｌ）および（Ｓ）－２－（（Ｓ）－２－アミノ－３－メチルブタンアミド）－Ｎ－（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）ヘキサンアミド（１８８）（８００ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を、１－アジド－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサトリアコンタン－３０－オイック酸（８６）（４８４ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（８ｍＬ）中の溶液に０℃で添加し、反応混合物を室温で６時間撹拌した。反応の進行を、ＴＬＣによりモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を水（１５ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（２×３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、減圧下で濃縮し、ＤＣＭ中３％のＭｅＯＨで溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、１－アジド－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）－１－オキソヘキサン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサトリアコンタン－３０－アミド（１８９；０．６０ｇ）をゴム状物として得た。
【化51】
【0243】
１－アジド－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）－１－（（４－（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）－１－オキソヘキサン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサトリアコンタン－３０－アミド（１９０）の合成： ＮＨ４Ｆ（１６６ｍｇ、４．４８ｍｍｏｌ）を、１－アジド－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－（（４－（（（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）－１－オキソヘキサン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサトリアコンタン－３０－アミド（１８９）（６００ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）のメタノール（１０ｍＬ）中の溶液に室温で添加し、反応混合物を室温で６時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによりモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を減圧下で濃縮し、得られた残留物を水（１５ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（２×２０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、減圧下で濃縮し、ＤＣＭ中５％のＭｅＯＨで溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、１－アジド－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）－１－（（４－（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）－１－オキソヘキサン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサトリアコンタン－３０－アミド（１９０；０．４０ｇ）をゴム状物として得た。
【化52】
【0244】
４－（（３２Ｓ，３５Ｓ）－１－アジド－３５－（４－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）ブチル）－３２－イソプロピル－３０，３３－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザヘキサトリアコンタン－３６－アミド）ベンジル（４－ニトロフェニル）カーボネート（１９１）の合成： ピリジン（０．１４ｍＬ、１．８０ｍｍｏｌ）および４－ニトロフェニルクロロホルメート（１４）（１４５ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）を、１－アジド－Ｎ－（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－６－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）－１－（（４－（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）－１－オキソヘキサン－２－イル）アミノ）－３－メチル－１－オキソブタン－２－イル）－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサトリアコンタン－３０－アミド（１９０）（４００ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１０ｍＬ）中の溶液に０℃で添加し、反応混合物を室温で６時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによりモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を減圧下で濃縮し、ＤＣＭ中３％のＭｅＯＨで溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、４－（（３２Ｓ，３５Ｓ）－１－アジド－３５－（４－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）ブチル）－３２－イソプロピル－３０，３３－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザヘキサトリアコンタン－３６－アミド）ベンジル（４－ニトロフェニル）カーボネート（１９１；０．３４ｇ）をゴム状物として得た。ＬＣＭＳ：ＭＨ＋ １２６５、保持時間１．３３分。４－（（３２Ｓ，３５Ｓ）－３５－（４－アミノブチル）－１－アジド－３２－イソプロピル－３０，３３－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザヘキサトリアコンタン－３６－アミド）ベンジル（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）カルバメート（２０２）の合成。
スキーム４： プロテアーゼ切断可能リンカー－ペイロードコンジュゲート前駆体（２０２）の合成。
【化53】
スキーム４： プロテアーゼ切断可能リンカー－ペイロードコンジュゲート前駆体（２０２）の合成。
【0245】
４－（（３２Ｓ，３５Ｓ）－１－アジド－３５－（４－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）ブチル）－３２－イソプロピル－３０，３３－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザヘキサトリアコンタン－３６－アミド）ベンジル（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）カルバメート（２０１）の合成： トリエチルアミン（０．０９ｍＬ、０．６２ｍｍｏｌ）および（１Ｒ，９Ｒ）－１－アミノ－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１，２，３，９，１２，１５－ヘキサヒドロ－１０Ｈ，１３Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１０，１３－ジオンメタンスルホネート（エキサテカンメシレート；１６；１３１ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を、４－（（３２Ｓ，３５Ｓ）－１－アジド－３５－（４－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）ブチル）－３２－イソプロピル－３０，３３－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザヘキサトリアコンタン－３６－アミド）ベンジル（４－ニトロフェニル）カーボネート（１９１；３１１ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（２．５ｍＬ）中の溶液に０℃で添加し、混合物を室温で８時間撹拌した。反応の進行をＬＣＭＳによりモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を水（１５ｍＬ）でクエンチし、クロロホルム中１０％のメタノール（２×２０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）上で乾燥し、減圧下で濃縮した。ジエチルエーテルを粗製材料に添加し、得られた沈殿物を濾過し、ＤＣＭ中５％のＭｅＯＨで溶出するカラムクロマトグラフィー（Ｃｏｍｂｉ－Ｆｌａｓｈ（登録商標））を使用して精製して、４－（（３２Ｓ，３５Ｓ）－１－アジド－３５－（４－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）ブチル）－３２－イソプロピル－３０，３３－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザヘキサトリアコンタン－３６－アミド）ベンジル（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）カルバメート（２０１）を固体（０．３ｇ）として得た。ＬＣＭＳ：ＭＨ＋ １５６１、保持時間２．１８分。
【0246】
４－（（３２Ｓ，３５Ｓ）－３５－（４－アミノブチル）－１－アジド－３２－イソプロピル－３０，３３－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザヘキサトリアコンタン－３６－アミド）ベンジル（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）カルバメート（２０２）の合成： トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）のＤＣＭ中の１％溶液を、４－（（３２Ｓ，３５Ｓ）－１－アジド－３５－（４－（（ジフェニル（ｐ－トリル）メチル）アミノ）ブチル）－３２－イソプロピル－３０，３３－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザヘキサトリアコンタン－３６－アミド）ベンジル（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）カルバメート（２０１；３００ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（５ｍＬ）中の溶液に０℃で添加し、反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応の進行をＬＣＭＳによりモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を減圧下で濃縮し、残留物をジエチルエーテルで粉砕し、ＲＰ分取ＨＰＬＣにより精製して、４－（（３２Ｓ，３５Ｓ）－３５－（４－アミノブチル）－１－アジド－３２－イソプロピル－３０，３３－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザヘキサトリアコンタン－３６－アミド）ベンジル（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシ－４－メチル－１０，１３－ジオキソ－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）カルバメート（２０２）（７０ｍｇ）を固体として得た。
【化54-1】
【化54-2】
【0247】
（実施例２）
葉酸コンジュゲート前駆体の合成
本明細書に開示される葉酸受容体標的化ＮＤＣを調製するのに適した葉酸コンジュゲート前駆体を、下記の合成プロトコールの１つに従い調製することができる。葉酸コンジュゲート前駆体は末端アジド基を含むので、クリックケミストリーを使用してアルキン部分（例えば、ＤＢＣＯ）で官能化されたナノ粒子に付着するのに適している。
（Ｓ）－１６－（４－（（（２－アミノ－４－オキソ－３，４－ジヒドロプテリジン－６－イル）メチル）アミノ）ベンズアミド）－１－アジド－１３－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザヘプタデカン－１７－オイック酸（６０６）の合成
葉酸コンジュゲート前駆体の合成
本明細書に開示される葉酸受容体標的化ＮＤＣを調製するのに適した葉酸コンジュゲート前駆体を、下記の合成プロトコールの１つに従い調製することができる。葉酸コンジュゲート前駆体は末端アジド基を含むので、クリックケミストリーを使用してアルキン部分（例えば、ＤＢＣＯ）で官能化されたナノ粒子に付着するのに適している。
（Ｓ）－１６－（４－（（（２－アミノ－４－オキソ－３，４－ジヒドロプテリジン－６－イル）メチル）アミノ）ベンズアミド）－１－アジド－１３－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザヘプタデカン－１７－オイック酸（６０６）の合成
【化55】
【0248】
化合物６００の調製： 化合物５９９（１６０ｇ、５１２ｍｍｏｌ）をＴＦＡＡ（８００ｍＬ）に２５℃で溶解し、窒素雰囲気下、暗所で５時間撹拌した。次いで溶媒を５０℃で、真空中で除去して、粗製生成物を得た。粗製生成物をＭＴＢＥ（７５０ｍＬ）で６０分間粉砕し、次いで濾過して化合物６００（２０３ｇ、粗製）を固体として得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。
【化56】
【0249】
化合物６０２の調製： ＴＢＴＵ（２３８ｇ、７４０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（９５．７ｇ、７４０ｍｍｏｌ）を、化合物６０１（２２５ｇ、５２９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２．２５Ｌ）中の溶液に添加した。２０℃で３０分間撹拌した後、２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エタン－１－アミン（試薬Ａ；１２１ｇ、５５５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を５０℃で１２時間撹拌した。２種の反応混合物を合わせ、後処理し、残留物をＨ２Ｏ（３Ｌ）で希釈し、酢酸エチル（１５００ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をブライン（８００ｍＬ×３）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して、カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、石油エーテル／酢酸エチル＝１００／１から１／１）により精製することにより、化合物６０２（５９０ｇ）を油状物として得た。
【化57】
【0250】
化合物６０３の調製： Ｎ－エチルエタンアミン（１．２７ｋｇ、１７．４ｍｏｌ）を、化合物６０２（４３５ｇ、６９５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（４．３５Ｌ）中の溶液に添加し、混合物を２５℃で３時間撹拌した。次いで溶媒を室温で真空除去し、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝１００／１から１／１）により精製して、化合物６０３（２４５ｇ）を油状物として得た。
化合物６０４の調製： ＴＢＴＵ（１１９ｇ、３７２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１６０ｇ、１．２４ｍｏｌ）を、化合物６００（１０１ｇ、２４８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（９００ｍＬ）中の溶液に添加し、混合物を３０分間撹拌した。次いでＤＭＦ（１００ｍＬ）中の化合物６０３（１００ｇ、２４８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２５℃で１２時間撹拌した。２種の反応混合物を合わせ、濃縮し、残留物をＨ２Ｏ（２．５Ｌ）で希釈し、酢酸エチル（１Ｌ×５）で抽出した。合わせた有機層をブライン（６００ｍＬ×３）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して、化合物４（４２０ｇ、粗製）を固体として得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。
【化58】
化合物６０４の調製： ＴＢＴＵ（１１９ｇ、３７２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１６０ｇ、１．２４ｍｏｌ）を、化合物６００（１０１ｇ、２４８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（９００ｍＬ）中の溶液に添加し、混合物を３０分間撹拌した。次いでＤＭＦ（１００ｍＬ）中の化合物６０３（１００ｇ、２４８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２５℃で１２時間撹拌した。２種の反応混合物を合わせ、濃縮し、残留物をＨ２Ｏ（２．５Ｌ）で希釈し、酢酸エチル（１Ｌ×５）で抽出した。合わせた有機層をブライン（６００ｍＬ×３）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して、化合物４（４２０ｇ、粗製）を固体として得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。
【0251】
化合物６０５の調製： Ｋ２ＣＯ３（５８５ｇ、４．２３ｍｏｌ）を、化合物６０４（４２０ｇ、５２９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４．２ｍＬ）およびＨ２Ｏ（５００ｍＬ）中の溶液に添加し、混合物を６０℃で０．５時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮してＴＨＦを除去し、残留物をＨ２Ｏ（５００ｍＬ）で希釈し、ＨＣｌ（Ｍ＝１）でｐＨ３に調節し、濾過し、減圧下で濃縮して、化合物６０５（２６０ｇ、粗製）を固体として得、これをさらに精製することなく直接使用した。
【0252】
化合物６０６の調製： トリフルオロ酢酸（２．１２ｋｇ、１８．６ｍｏｌ）を一度に、ＣＨ２Ｃｌ２（２．６Ｌ）中の化合物６０５（２６０ｇ、３７３ｍｍｏｌ）の混合物に２０℃で、窒素下で添加し、混合物を２０℃で５時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、ＨＰＬＣ（カラム：Ａｇｅｌａ ＤｕｒａＳｈｅｌｌ Ｃ１８ ２５０×８０ｍｍ×１０ｕｍ；移動相：［水（１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３）－ＭｅＯＨ］；Ｂ％：５％～４０％、２０分）により精製して化合物６０６（５２．５ｇ、８１．８２ｍｍｏｌ、収率２１．９６％）を固体として得た。（Ｍ＋Ｈ）６４２．８０；ＩＲ：２１０７（Ｎ３結合）。
（Ｓ）－３８－（４－（（（２－アミノ－４－オキソ－３，４－ジヒドロプテリジン－６－イル）メチル）アミノ）ベンズアミド）－１－アジド－３０，３５－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザノナトリアコンタン－３９－オイック酸（４７２）の合成
スキーム５： 葉酸コンジュゲート前駆体（４７２）の合成。
（Ｓ）－３８－（４－（（（２－アミノ－４－オキソ－３，４－ジヒドロプテリジン－６－イル）メチル）アミノ）ベンズアミド）－１－アジド－３０，３５－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザノナトリアコンタン－３９－オイック酸（４７２）の合成
【化59】
スキーム５： 葉酸コンジュゲート前駆体（４７２）の合成。
【0253】
ｔｅｒｔ－ブチル（１－アジド－３０－オキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１－アザトリトリアコンタン－３３－イル）カルバメート（４６５）の合成： トリエチルアミン（０．３６ｍＬ、２．６４ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２１８ｍｇ、１．１４ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（１５４ｍｇ、１．１４ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ－ブチル（２－アミノエチル）カルバメート（４６４）（１２４ｍｇ、０．８８１ｍｍｏｌ）を、１－アジド－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサトリアコンタン－３０－オイック酸（８６；４５０ｍｇ、０．８８１ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２０ｍＬ）中の溶液に０℃で添加し、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによりモニタリングした。出発材料の消費後、反応混合物をＤＣＭおよび水で抽出し、有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空蒸発させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、真空下で乾燥して、ｔｅｒｔ－ブチル（１－アジド－３０－オキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１－アザトリトリアコンタン－３３－イル）カルバメート（４６５；０．４５ｇ）を液体として得た。
【化60】
【0254】
Ｎ－（２－アミノエチル）－１－アジド－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサトリアコンタン－３０－アミド（４６６）の合成： ｔｅｒｔ－ブチル（１－アジド－３０－オキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１－アザトリトリアコンタン－３３－イル）カルバメート（４６５）（３５０ｍｇ、０．４６２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ中の溶液を０℃に冷却し、そこにＴＦＡを滴下添加し、次いで反応混合物をＲＴで１６時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによりモニタリングした。出発材料の消費後、反応混合物を減圧下で濃縮し、ＤＣＭ（３回）で共沸させて、粗製物（４６６）を得、ＤＣＭ中５％のＭｅＯＨで溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、Ｎ－（２－アミノエチル）－１－アジド－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサトリアコンタン－３０－アミド（４６６；０．２５ｇ）を液体として得た。
【化61】
【0255】
ｔｅｒｔ－ブチル（Ｓ）－３８－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－１－アジド－３０，３５－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザノナトリアコンタン－３９－オエート（４６７）の合成： ジイソプロピルエチルアミン（０．１７４ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（４１６ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）、およびＮ－（２－アミノエチル）－１－アジド－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサトリアコンタン－３０－アミド（４６６）（３３１ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を、（Ｓ）－４－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－５－（ｔｅｒｔ－ブトキシ）－５－オキソペンタン酸（１７０ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍＬ）中の溶液に０℃で添加し、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによりモニタリングした。出発材料の消費後、反応混合物を低温で真空蒸発させ、ＤＣＭ中５％のＭｅＯＨで溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、ｔｅｒｔ－ブチル（Ｓ）－３８－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－１－アジド－３０，３５－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザノナトリアコンタン－３９－オエート（４６７；０．３５ｇ）を液体として得た。ＭＨ＋ ９６２、保持時間１．８１分。
【0256】
ｔｅｒｔ－ブチル（Ｓ）－３８－アミノ－１－アジド－３０，３５－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザノナトリアコンタン－３９－オエート（４６８）の合成： ピペリジンのＤＭＦ（１ｍｌ）中の３０％溶液を、ｔｅｒｔ－ブチル（Ｓ）－３８－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－１－アジド－３０，３５－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザノナトリアコンタン－３９－オエート（４６７；３５０ｍｇ、３．６５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍＬ）中の溶液に室温で添加し、反応混合物を室温で３時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによってモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を減圧下で濃縮して、ｔｅｒｔ－ブチル（Ｓ）－３８－アミノ－１－アジド－３０，３５－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザノナトリアコンタン－３９－オエート（４６８；２５０ｍｇ）を得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。ＭＨ＋ ７３９、保持時間１．５０分。
【0257】
ｔｅｒｔ－ブチル（Ｓ）－３８－（４－（Ｎ－（（２－アミノ－４－オキソ－３，４－ジヒドロプテリジン－６－イル）メチル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミド）ベンズアミド）－１－アジド－３０，３５－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザノナトリアコンタン－３９－オエート（４７０）の合成： ジイソプロピルエチルアミン（０．１０７ｍＬ、０．６１３ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（２５４ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ－ブチル（Ｓ）－３８－アミノ－１－アジド－３０，３５－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザノナトリアコンタン－３９－オエート（４６８）（２７１ｍｇ、０．３６８ｍｍｏｌ）を、４－（Ｎ－（（２－アミノ－４－オキソ－３，４－ジヒドロプテリジン－６－イル）メチル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミド）安息香酸（４６９；１００ｍｇ、０．２４５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍＬ）中の溶液に０℃で添加し、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによってモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を低温で真空濃縮し、次いでＤＣＭ中１０％のＭｅＯＨで溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、ｔｅｒｔ－ブチル（Ｓ）－３８－（４－（Ｎ－（（２－アミノ－４－オキソ－３，４－ジヒドロプテリジン－６－イル）メチル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミド）ベンズアミド）－１－アジド－３０，３５－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザノナトリアコンタン－３９－オエート（４７０；１８０ｍｇ）を固体として得た。ＭＨ＋ １１２９、保持時間２．６１分。
【0258】
（Ｓ）－３８－（４－（Ｎ－（（２－アミノ－４－オキソ－３，４－ジヒドロプテリジン－６－イル）メチル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミド）ベンズアミド）－１－アジド－３０，３５－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザノナトリアコンタン－３９－オイック酸（４７１）の合成： トリフルオロ酢酸（０．１２３ｍＬ、１．５９ｍｍｏｌ）を、ｔｅｒｔ－ブチル（Ｓ）－３８－（４－（Ｎ－（（２－アミノ－４－オキソ－３，４－ジヒドロプテリジン－６－イル）メチル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミド）ベンズアミド）－１－アジド－３０，３５－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザノナトリアコンタン－３９－オエート（４７０）（１８０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ中の溶液に室温で添加し、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによってモニタリングした。出発材料の完了後、反応混合物を減圧下で濃縮し、ＤＣＭ（３回）で共沸させて、粗製生成物（４７１；１００ｍｇ）を得、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。ＭＨ＋ １０７３、保持時間２．３４分。
【0259】
（Ｓ）－３８－（４－（（（２－アミノ－４－オキソ－３，４－ジヒドロプテリジン－６－イル）メチル）アミノ）ベンズアミド）－１－アジド－３０，３５－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザノナトリアコンタン－３９－オイック酸（４７２）の合成： 水性ＮＨ３（ＤＭＦに溶解）（０．０１ｍＬ、０．７１ｍｍｏｌ）を、（Ｓ）－３８－（４－（Ｎ－（（２－アミノ－４－オキソ－３，４－ジヒドロプテリジン－６－イル）メチル）－２，２，２－トリフルオロアセトアミド）ベンズアミド）－１－アジド－３０，３５－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザノナトリアコンタン－３９－オイック酸（４７１；８０ｍｇ、０．０７１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍＬ）中の溶液に０℃で添加し、反応混合物を室温で６時間撹拌した。出発材料の完了後、反応混合物を減圧下で濃縮し、残留物をＲＰ分取ＨＰＬＣにより精製して、（Ｓ）－３８－（４－（（（２－アミノ－４－オキソ－３，４－ジヒドロプテリジン－６－イル）メチル）アミノ）ベンズアミド）－１－アジド－３０，３５－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－３１，３４－ジアザノナトリアコンタン－３９－オイック酸（４７２；１５ｍｇ）を固体として得た。
【化62】
【0260】
ＬＣＭＳ法：カラム－ＹＭＣ ＴＲＩＡＲＴ Ｃ１８（３３×２．１ｍｍ、３ｕ）；（移動相：９５％［０．１％ＨＣＯＯＨ、水中］および５％［０．１％ＨＣＯＯＨ、ＣＨ３ＣＮ中］を０．５０分間保持、次いで３．０分で１％［０．１％ＨＣＯＯＨ、水中］および９９％［０．１％ＨＣＯＯＨ、ＣＨ３ＣＮ中］にし、この組成を最長４．００分間保持し、最終的に４．１０分で初期条件に戻し、４．５０分間保持）流量－１．０ｍｌ／分。
【0261】
（実施例３）
ナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）の合成
ナノ粒子の調製
水性合成法を使用して、本開示の超小型ナノ粒子を調製し官能化することができる。例えば、ＷＯ ２０１６／１７９２６０ Ａ１およびＷＯ ２０１８／２１３８５１ Ａ１（その内容の全体は、参照により本明細書に組み込まれる）に概説される手順に基づく方法が、使用され得る。
ナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）の合成
ナノ粒子の調製
水性合成法を使用して、本開示の超小型ナノ粒子を調製し官能化することができる。例えば、ＷＯ ２０１６／１７９２６０ Ａ１およびＷＯ ２０１８／２１３８５１ Ａ１（その内容の全体は、参照により本明細書に組み込まれる）に概説される手順に基づく方法が、使用され得る。
【0262】
例えば、限定するものではないがＣｙ５などの蛍光化合物を、マレイミド基で官能化して、正味の正電荷を有するマレイミド官能化蛍光化合物を提供することができる。これを、（３－メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（ＭＰＴＭＳ）などのチオール－シランとコンジュゲートさせて、Ｃｙ５－シランなどのシラン官能化蛍光化合物を生成することができる。コンジュゲーションは、不活性雰囲気下で一晩（１６～２４時間）、室温（１８～２５℃）で、グローブボックス内のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で行ってもよい。
【0263】
翌日、合成の次のステップを、ガラスフラスコ、容器、または反応器などの適切なチャンバー内で行うことができ、ｐＨが約８．５～１０．５の脱イオン水の撹拌を伴い得、これはｐＨ７．５～８．５の水酸化アンモニウムの水溶液を使用して達成することができる。次いでテトラアルキルオルトシリケートなどのシリカ前駆体、例えばテトラメチルオルトシリケート（ＴＭＯＳ）を、室温で激しく撹拌しながら反応チャンバーに添加し、その後、直ぐにシラン官能化蛍光化合物、例えば、Ｃｙ５－シランを添加することができる。反応を室温で一晩（１～４８時間）撹拌したままにして、蛍光化合物、例えばＣｙ５色素を被包するシリカコアを提供することができる。
【0264】
翌日、ＰＥＧ－シランを、反応中に撹拌しながら室温で添加して、シリカコアをＰＥＧ分子でコーティングすることができ、反応をそのまま１～４８時間撹拌させることができる。このステップの後、７５～８５℃で１～４８時間加熱してもよい。次いで反応を室温に冷却し、精製することができる（例えば、反応の副生成物として形成された凝集体、およびいくらか存在する場合には細菌を除去するために、滅菌濾過を含む）。次いでナノ粒子のさらなる官能化を行ってもよい。
【0265】
ナノ粒子の官能化
本明細書に開示される方法を使用して調製されたナノ粒子を、例えば図２または３であるいは下記のスキーム６で概説される方法を使用して、さらに官能化してもよい。例えば、（３－シクロペンタジエニルプロピル）トリエトキシシラン（「ジエン－シラン」）は、シクロペンタジエン基でナノ粒子（例えば、Ｃ’ドット）を官能化するのに使用することができ、次いでＤＢＣＯ－ＰＥＧ－マレイミドをジエン官能化ナノ粒子と反応させて、ＤＢＣＯ－官能化ナノ粒子を提供することができる。
スキーム６． ＤＢＣＯでナノ粒子を官能化する例示的な方法。
本明細書に開示される方法を使用して調製されたナノ粒子を、例えば図２または３であるいは下記のスキーム６で概説される方法を使用して、さらに官能化してもよい。例えば、（３－シクロペンタジエニルプロピル）トリエトキシシラン（「ジエン－シラン」）は、シクロペンタジエン基でナノ粒子（例えば、Ｃ’ドット）を官能化するのに使用することができ、次いでＤＢＣＯ－ＰＥＧ－マレイミドをジエン官能化ナノ粒子と反応させて、ＤＢＣＯ－官能化ナノ粒子を提供することができる。
【化63】
スキーム６． ＤＢＣＯでナノ粒子を官能化する例示的な方法。
【0266】
例えば、Ｃｙ５－Ｃ’ドット（本明細書に記述される方法を使用して調製され得る）を脱イオン水で希釈して、撹拌棒を備えた丸底フラスコ内で所望の濃度、典型的には１５から３０μＭの間にした。（３－シクロペンタジエニルプロピル）トリエトキシシラン（シクロペンタジエン）を最初にＤＭＳＯ中で１００×に希釈し、次いで撹拌しながら反応に添加して、粒子のシクロペンタジエンに対する所望のモル比に到達させた。一晩反応させた後、１０×ＰＢＳを反応に添加して１×ＰＢＳの最終濃度を達成した。次に、ＤＢＣＯ－マレイミド前駆体（例えば、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－マレイミド）をＤＭＳＯ中に溶解し、反応に添加して、粒子のＤＢＣＯに対する所望のモル比に到達させた。約３０分から１時間混合した後、一晩撹拌しながら反応混合物を８０℃に加熱した。次いで反応溶液を濃縮し、ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を使用して精製して、ジエン系ＤＢＣＯ－Ｃ’ドットを得た。
【0267】
精製は、サイズ分離の原理に基づき行ってもよい。凝集体と、ＰＥＧ化ナノ粒子の場合とは異なる分子量を有する遊離小分子とを、ゲル透過クロマトグラフィーカラム（ＧＰＣ）またはタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）システムを使用して分離した。２枚の異なる膜、３００ｋＤａおよび５０ｋＤａのカットオフサイズを用いて、それぞれ大きい凝集体および遊離小分子の除去を行った。ＧＰＣおよびＴＦＦの両方のシステムを使用して、水性媒体を水、食塩水などに移した。脱イオン水中の精製されたＤＢＣＯ－Ｃ’ドットは、再び滅菌濾過することができ、品質管理（ＱＣ）ステップを行い、その後、冷蔵庫内で２～８℃に保存することができる。
【0268】
理論に拘束されることを望まないが、シクロペンタジエン基の中性電荷は、他のタイプの前駆体により加速され得る（例えば、ジエン－シランの代わりにアミン－シランを使用するとき、第一級アミン基は加水分解を引き起こす可能性がある）連結中のアミド結合の加水分解を防ぐと考えられる。このように、この方法を使用して生成されたＮＤＣは、非常に安定である（例えば、図３３Ａ～３３Ｂの比較参照）。さらに、ジエン官能化ナノ粒子（例えば、シクロペンタジエン官能化ナノ粒子）をＮＤＣＳの調製で使用すると、反応中のシランの自己縮合が大幅に減じられ、その他の方法（例えば、アミン－シランを使用する）と比較して官能化ナノ粒子の安定性、サイズ均質性、反応収率、および純度が改善される。
【0269】
標的化ＮＤＣの調製
ナノ粒子（Ｃ’ドットとも呼ぶ）、標的化リガンド（葉酸）、およびリンカー－薬物コンジュゲートを含む本開示のＮＤＣを、図３に提示されるフローチャートおよび以下のスキーム７で概説されるように調製することができる。官能化ステップで使用される標的化リガンド前駆体の量を調節することにより、ナノ粒子当たり所望の数の標的化リガンドを達成することができる。例えば、本開示のナノ粒子は、約１０から約２０個の葉酸部分、例えば約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、または約１５個の葉酸部分を含有するように官能化され得る。同様に、官能化ステップで使用されるペイロード－リンカーコンジュゲート前駆体の量を調節することにより、ナノ粒子当たり所望の数のペイロード部分を達成することができる。例えば、本開示のナノ粒子は、約１０から約４０個のエキサテカン－リンカー部分、例えば約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、または約２５個のエキサテカン部分を含有するように、官能化されてもよい。
スキーム７． 葉酸部分およびエキサテカン－リンカー部分でナノ粒子を官能化する例示的な方法。
ナノ粒子（Ｃ’ドットとも呼ぶ）、標的化リガンド（葉酸）、およびリンカー－薬物コンジュゲートを含む本開示のＮＤＣを、図３に提示されるフローチャートおよび以下のスキーム７で概説されるように調製することができる。官能化ステップで使用される標的化リガンド前駆体の量を調節することにより、ナノ粒子当たり所望の数の標的化リガンドを達成することができる。例えば、本開示のナノ粒子は、約１０から約２０個の葉酸部分、例えば約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、または約１５個の葉酸部分を含有するように官能化され得る。同様に、官能化ステップで使用されるペイロード－リンカーコンジュゲート前駆体の量を調節することにより、ナノ粒子当たり所望の数のペイロード部分を達成することができる。例えば、本開示のナノ粒子は、約１０から約４０個のエキサテカン－リンカー部分、例えば約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、または約２５個のエキサテカン部分を含有するように、官能化されてもよい。
【化64】
スキーム７． 葉酸部分およびエキサテカン－リンカー部分でナノ粒子を官能化する例示的な方法。
【0270】
葉酸コンジュゲートナノ粒子の合成： ＤＢＣＯ－Ｃ’ドット（図３ではＣ’ドットと呼ぶ）を脱イオン水で希釈して、１５～４５μＭの濃度にした。ＤＢＣＯ－Ｃ’ドット溶液の温度が約１８～２５℃になった後、葉酸受容体（ＦＲ）－標的化リガンド前駆体、例えばアジドで官能化された葉酸（ＦＡ）（実施例２で調製された化合物６０６）をＤＭＳＯ（０．０２１Ｍ）に溶解し、次いで室温で撹拌しながら反応に添加し、表面のＤＢＣＯ基を介してＦＡで官能化されたＣ’ドットを提供する。ＤＢＣＯ－Ｃ’ドットとＦＡとの間の反応比を、１：５から１：３０に保ち、溶液を１８～２５℃の温度で１６～２４時間撹拌した。ＦＲ標的化リガンドの添加の後、滅菌濾過、精製、およびＱＣ試験を行って、ＦＡ－Ｃ’ドット（図３ではＣ’ドット中間体と呼ばれる）を得、２～８℃の冷蔵庫に保存することができる。ＦＡ－Ｃ’ドットは、例えばアジド官能基を持つ分子とのさらなるクリック反応で入手可能なＤＢＣＯ基の一部分を含む。葉酸塩標的化リガンド（例えば、葉酸）は、例えばペイロード－リンカーコンジュゲートとのコンジュゲーション後、ナノ粒子にコンジュゲートできることが理解されよう。
【0271】
ＦＲ標的化リガンドコンジュゲーション反応の体積は、５ｍＬから３０Ｌに及ぶことができ、ＤＢＣＯ－Ｃ’ドットの濃度は１５から４５μＭに及ぶことができる。下記のパラメーターは、６００ｍＬの典型的な反応体積および２５μＭのＤＢＣＯ－Ｃ’ドット濃度に関して与えられる。ＤＢＣＯ－Ｃ’ドットのＦＲ標的化リガンドに対する比は、粒子当たり所望の数のＦＲ標的化リガンドが得られるように正確に制御し、典型的には、１：５から１：３０に及ぶことができる。１：１２の典型的な比で、葉酸塩－ＰＥＧ－アジドをＤＭＳＯに溶解して０．０２１Ｍの濃度にし、葉酸塩－ＰＥＧ－アジド／ＤＭＳＯ溶液８．５７１ｍＬを反応に添加した。室温で一晩撹拌した後、反応混合物を、ＦＡ－Ｃ’ドットが得られるように精製し、またはＦＡ－Ｃ’ドットの純度が９５％以上である場合には次のコンジュゲーションステップに直接続くようにした。ＦＲ標的化リガンドの変換率は、典型的には９５％よりも高い。
【0272】
各ＦＡ－Ｃ’ドット上に付着される葉酸基の数は、ＵＶ－Ｖｉｓによって特徴付けられ、代表的なＵＶ－Ｖｉｓ吸光度スペクトルを図４に示す。各Ｃ’ドット上のＤＢＣＯ基の数は、Ｃ’ドットおよびＤＢＣＯ基の吸光係数を使用して計算することができる。
【0273】
エキサテカンを含むＦＡ標的化ＮＤＣ（またはＦＡ－ＣＤＣ）の合成： ＦＡ－Ｃ’ドットを脱イオン水で希釈して、１５～４５μＭの濃度にした。ＦＡ－Ｃ’ドット溶液温度が１８～２５℃に達した後、ＤＭＳＯ（０．０４Ｍ）に溶解したエキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体（例えば、実施例１に記載される化合物２０２）カテプシンを、室温で撹拌しながら反応に添加した。このステップは、表面の利用可能なＤＢＣＯ基を介してリンカー－薬物コンジュゲートでＦＡ－Ｃ’ドットを官能化した。ＦＡ－Ｃ’ドットとリンカー－薬物コンジュゲートとの間の反応比を、約１：１０～１：５０に保持し、溶液を１６～２４時間撹拌した。リンカー－薬物コンジュゲートの添加の後、滅菌濾過および精製を行った。脱イオン水中のＦＡ－ＣＤＣ（ＮＤＣとも呼ぶ）を、ＱＣ試験し、冷蔵庫で２～８℃で保存した。
【0274】
切断可能エキサテカンコンジュゲーション反応の体積は、５ｍＬから３０Ｌに及ぶことができ、ＦＡ－Ｃ’ドットの濃度は１５から４５μＭに及ぶことができる。下記のパラメーターは、典型的な反応体積６００ｍＬおよびＦＡ－Ｃ’ドット濃度２５μＭに関して与えられる。ＦＡ－Ｃ’ドットの切断可能エキサテカンに対する比を精密に制御して、粒子当たり所望の数の切断可能エキサテカンを得、典型的には１：１０から１：６０に及ぶことができる。１：４０の典型的な比では、切断可能エキサテカンをＤＭＳＯに溶解して０．０４Ｍの濃度にし、切断可能エキサテカン／ＤＭＳＯ溶液１５ｍＬを反応に添加した。室温で一晩撹拌後、反応混合物を精製してＦＡ－ＣＤＣを得た。
【0275】
各ＮＤＣ、例えば葉酸（ＦＡ）官能化薬物－リンカーコンジュゲートＣ’ドット（ＦＡ－ＣＤＣ）上に付着されたエキサテカンペイロードの数は、ＵＶ－Ｖｉｓによって特徴付けられてもよい。代表的なＵＶ－Ｖｉｓ吸光度スペクトルを図５に示す。各Ｃ’ドット上のエキサテカンペイロードの数は、同じ波長での葉酸の吸収を差し引いた後に３６０ｎｍでのＣ’ドットおよびエキサテカンの吸光係数を使用して、計算することができる。
【0276】
上述のように、ナノ粒子は、葉酸受容体標的化リガンドおよびペイロード－リンカーコンジュゲートで、任意の順序で官能化されてもよい（例えば、エキサテカンでナノ粒子を官能化するための上記概説されたプロトコールは、葉酸をコンジュゲートするためのプロトコールの前に実施されてもよい）。
【0277】
【0278】
ＦＣＳは、対物レンズの焦点を経た粒子拡散からもたらされた蛍光変動を検出する。次いで粒子拡散情報を、シグナル強度変動の自己相関から抽出し、そこからは単一モードＦＣＳ相関関数を使用して自己相関曲線を当て嵌めることにより平均流体力学的粒度を得ることができるものである。ＮＤＣの平均流体力学直径は、約６ｎｍから約７ｎｍ（図６）であった。
【0279】
ＧＰＣは、分子ふるいクロマトグラフィーの１つのタイプであり、分離メカニズムは分析物（ここでは、ＮＤＣ）のサイズに基づく。ＮＤＣの溶出時間を、様々な分子量を持つ一連のタンパク質と比較する。結果は、ＮＤＣの溶出時間が、１５８ｋＤａから４４ｋＤａの間の分子量を持つタンパク質標準の場合と同等であり、約６．４ｎｍの粒度平均流体力学的サイズと一致することを示唆する（図７）。
【0280】
純度分析： ＮＤＣの純度を、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）を使用して分析した。ＲＰ－ＨＰＬＣを、市販のＷａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ１８カラムを使用するフォトダイオードアレイ検出器に連結する。ＲＰ－ＨＰＬＣは、種々の極性を持つ分子を分離し、その超小型の１０ｎｍよりも小さい粒度のためＮＤＣの分析法として適している。ＲＰ－ＨＰＬＣを使用して、ナノ粒子を凝集体およびその他の化学的部分、例えばナノ粒子および分解生成物に非共有結合により関連付けられた標的化リガンドから十分に分離する。種々の化学的部分を、それらの溶出時間および固有のＵＶ／Ｖｉｓスペクトルに基づき特定する。フォトダイオードアレイ検出器は、２１０から８００ｎｍのＵＶ－Ｖｉｓスペクトルを収集し、問題の不純物は３３０ｎｍで測定される。図８のＮＤＣに関して示される代表的なクロマトグラムは、本開示のＮＤＣの純度が９９．０％よりも高いことを示唆する。
【0281】
（実施例４）
薬物放出アッセイ
本開示のＮＤＣは、リンカー－ペイロードコンジュゲート、例えばプロテアーゼ切断可能リンカー、例えばカテプシン－Ｂ（Ｃａｔ－Ｂ）切断可能リンカーを含む。プロテアーゼとの接触の際、ＮＤＣはペイロード（即ち、エキサテカン）を放出し得る。ナノ粒子上のリンカー－薬物コンジュゲートの薬物放出プロファイルおよび安定性を、下記のプロトコールに従い試験した。
薬物放出アッセイ
本開示のＮＤＣは、リンカー－ペイロードコンジュゲート、例えばプロテアーゼ切断可能リンカー、例えばカテプシン－Ｂ（Ｃａｔ－Ｂ）切断可能リンカーを含む。プロテアーゼとの接触の際、ＮＤＣはペイロード（即ち、エキサテカン）を放出し得る。ナノ粒子上のリンカー－薬物コンジュゲートの薬物放出プロファイルおよび安定性を、下記のプロトコールに従い試験した。
【0282】
ＮＤＣを、実施例３に記述される方法を使用して調製し、次いで放出動態試験に関する所望の放出条件下でインキュベートした。アッセイで試験したＮＤＣを、以下の表２に提示する。
表２：薬物放出アッセイで使用された例示的なＮＤＣ。
粒子当たりのＦＡリガンドの数は、１２から２２の間であり；粒子当たりのリンカー－薬物コンジュゲートの数は、１７から２５の間である。各ペイロード－リンカーは、ＤＢＣＯ部分を介してＮＤＣにコンジュゲートされる（実施例３で概説されたプロトコールに従い調製される）。
表２：薬物放出アッセイで使用された例示的なＮＤＣ。
【表2-1】
【表2-2】
粒子当たりのＦＡリガンドの数は、１２から２２の間であり；粒子当たりのリンカー－薬物コンジュゲートの数は、１７から２５の間である。各ペイロード－リンカーは、ＤＢＣＯ部分を介してＮＤＣにコンジュゲートされる（実施例３で概説されたプロトコールに従い調製される）。
【0283】
エキサテカンは、約３６０ｎｍの波長での吸収最大を示し（図９）、このシグナルは、放出および安定性研究に関して高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）でペイロードを追跡するのに使用することができる。放出された薬物 対 放出されていない薬物の量は、曲線下面積（ＡＵＣ）を分析することにより、逆相ＨＰＬＣを使用して測定した（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。
【0284】
一般的方法： ４．６ｍｍ×５０ｍｍの寸法、粒度５μｍ、および孔径３００ÅのＷａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ１８カラムを使用した（部品番号１８６００３６２２）。アセトニトリル（ＶＷＲ ＨｉＰｅｒＳｏｌｖ Ｃｈｒｏｍａｎｏｒｍ、ＵＨＰＬＣグレード）を、さらなる調製なしに受け取ったままの状態で使用し、脱イオン水中０．０１％のトリフルオロ酢酸は、トリフルオロ酢酸（ＨＰＬＣグレード、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ）１ｍＬを、ＩＱ７０００Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ脱イオン水システムを使用して発生させた９９９ｍＬの１８．２ＭΩ・ｃｍの脱イオン水中に添加することによって調製し、これを０．２μｍのフィルターに通した後に、使用した。システムに使用されるシール洗浄は、９０％の１８．２ＭΩ・ｃｍ脱イオン水と１０％のメタノール（ＨＰＬＣグレード、ＶＷＲ）とから構成された。注射針を、２５体積％の１８．２ＭΩ・ｃｍ脱イオン水、２５体積％のアセトニトリル、２５体積％のメタノール、および２５体積％の２－プロパノールの混合物を使用して洗浄した。試料は、それぞれ、０．２５から２μＭの濃度範囲に調製し、注入体積は、６０μＬから１０μＬに及ぶ。より高い試料濃度を、検出器のシグナルが低い場合に使用することができる。全ての注入に使用されるバイアルは、プレスリットＰＴＦＥ隔壁を有するスクリューキャップを持つ新鮮なＷａｔｅｒｓ Ｔｏｔａｌ Ｒｅｃｏｖｅｒｙバイアル（部品番号１８６０００３８５Ｃ）である。
【0285】
任意の試料注入が開始される前に、ＰＤＡランプを点け、少なくとも３０分間温めた。システムおよびカラムを、ＰＤＡランプが温まった後、９５％の、脱イオン水中０．０１％ＴＦＡ、５％のアセトニトリルで少なくとも１０分間、１．０ｍＬ／分の流量で平衡化した。１８．２ＭΩ・ｃｍの脱イオン水のみ含有する注入体積１０μＬの２回のブランク注入を、分析用の任意の試料の注入前に行った。使用した勾配は、９５％の、脱イオン水中０．０１％ＴＦＡ、および５％のアセトニトリルで開始し、１５％の、脱イオン水中０．０１％ＴＦＡ、８５％のアセトニトリルまで、８分間にわたり直線状に変化させた。アセトニトリルの組成は、さらに１分にわたり９５％まで増大させ、９５％でさらに２分間保持して、任意の強力に保持された化合物が溶出されるのを確実にした。次いで溶媒の組成を、さらに１分間にわたりその勾配で元の出発時の組成に変化させて戻し、３分間平衡化させ、その後、別の注入を開始した。試料注入の間に、ブランク注入を実行して、持ち越しが起こらないことを確実にした。
【0286】
典型的なカテプシンＢ（Ｃａｔ－Ｂ）プロテアーゼ切断研究では、２μＬ、０．３３μｇ／μＬのＣａｔ－Ｂ（ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に最初に３００μＬの活性化緩衝液（２５ｍＭ ＭＥＳ、５ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ５．０）を添加し、２．２μｇ／ｍＬのＣａｔ－Ｂを形成した。混合物を、使用前に室温で１５分間保持した。活性化後、２μＭの薬物－ナノ粒子コンジュゲート、１００μＬを、活性化Ｃａｔ－Ｂ １００μＬと混合した。次いで混合物を３７℃に移した。選択されたインキュベーション後の時点（例えば、２、４、２４時間）での切断動態をモニタリングするために、１０μＬの混合物を試料採取し、ＨＰＬＣ（ＴＦＡ／アセトニトリル）に注入した。切断データの分析では、Ｅｍｐｏｗｅｒ ３ ＡｐｅｘＴｒａｃｋ積分を使用して、全ての関連ある成分に関してピーク面積を決定した。
【0287】
カテプシン－Ｂとのインキュベーション後の種々の時点での３つの代表的なＮＤＣ（ＮＤＣ Ｂ、ＮＤＣ Ｃ、およびＮＤＣ Ｄ）のＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラフを、それぞれ図１１Ａ～１１Ｃに示す。ペイロードの半分が各ＮＤＣから放出されるのにかかる時間、即ち、Ｔ１／２は、特定の実験条件下、当て嵌めにより分析され、それぞれ図１２Ａ～１２Ｃに示される。図１２Ａは、ＮＤＣ Ｂに関してＴ１／２が２．９時間であることを示す。図１２Ｂは、ＮＤＣ Ｃに関してＴ１／２が２．６時間であることを示す。図１２Ｃは、ＮＤＣ Ｄに関してＴ１／２が１．４時間であることを示す。
【0288】
安定性試験： 非切断条件下でのリンカー－薬物コンジュゲートの薬物放出プロファイルおよび安定性を評価するため、例示的なＮＤＣを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）緩衝液または動物血清中で、３７℃でインキュベートした。ＮＤＣは、実施例１からのエキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体２０２を使用して、実施例３に従い調製した）。
【0289】
ＰＢＳ緩衝液中の典型的な安定性試験では、６００μＬのＰＢＳ混合物（薬物－ナノ粒子コンジュゲート濃度が２μＭに保持され、一方、ＰＢＳの体積パーセンテージは５０％として保持された）を調製し、３７℃で保持した。ナノ粒子に付着されたリンカー－薬物コンジュゲートの安定性をモニタリングするために、選択されたインキュベーション後の時点（例えば、４、２４、４８、および７２時間）で、１０μＬの混合物を試料採取し、ＨＰＬＣ（ＴＦＡ／アセトニトリル）に注入した。切断データの分析では、Ｅｍｐｏｗｅｒ ３ ＡｐｅｘＴｒａｃｋ積分を使用して、全ての関連ある成分に関するピーク面積を決定した。
【0290】
様々な種（例えば、マウス、ラット、イヌ、サル、およびヒト）からの血漿中の典型的な安定性試験では、６００μＬの血漿混合物（薬物－ナノ粒子コンジュゲート濃度を２μＭで保持し、一方、血漿の体積パーセンテージは６２．５％として保持した）を調製し、３７℃で保持した。リンカー－薬物コンジュゲートの安定性をモニタリングするために、選択されたインキュベーション後の時点（例えば、４、２４、４８、および７２時間）で、８０μＬの混合物を最初に８０μＬの冷アセトニトリルと混合し、次いで１０，０００ｒｐｍでの３０分間の遠心分離を行った。タンパク質の除去後、上澄み６０μＬを慎重に試料採取し、ＨＰＬＣに注入した。カテプシン－Ｂ－切断可能ＮＤＣでは、ＴＦＡ／アセトニトリルを使用した。安定性データの分析では、Ｅｍｐｏｗｅｒ ３ ＡｐｅｘＴｒａｃｋ積分を使用して全ての関連ある成分のピーク面積を決定した。
【0291】
ＮＤＣのリンカー－ペイロードコンジュゲート（実施例１からのエキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体２０２を使用して、実施例３で調製された）は安定であるが、それはエキサテカンの５％以下が２４時間後に非切断条件下で、即ちＰＢＳ、ヒト血清、またはマウス血清中で維持したとき、リンカー薬物コンジュゲートから放出されたからである。
【0292】
（実施例５）
ｉｎ ｖｉｔｒｏフローサイトメトリー細胞結合研究
本明細書に開示されるＮＤＣの細胞結合活性を、下記のプロトコールに従い試験した。使用されたＮＤＣは、実施例１のエキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体２０２を使用して、実施例３に従い調製した。ナノ粒子当たりの葉酸の量、およびナノ粒子当たりのエキサテカンの量は、実施例３で概説したプロトコールに従い調節することができた。
ｉｎ ｖｉｔｒｏフローサイトメトリー細胞結合研究
本明細書に開示されるＮＤＣの細胞結合活性を、下記のプロトコールに従い試験した。使用されたＮＤＣは、実施例１のエキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体２０２を使用して、実施例３に従い調製した。ナノ粒子当たりの葉酸の量、およびナノ粒子当たりのエキサテカンの量は、実施例３で概説したプロトコールに従い調節することができた。
【0293】
細胞および細胞培養物： ヒトＫＢ細胞系、ＳＫＯＶ－３細胞、およびＴＯＶ－１１２細胞系を、ＡＴＣＣから購入した。Ｉ－ＧＲＯＶ１、ヒト卵巣癌細胞系を、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入した。細胞を、他に指定しない限り、葉酸不含ＲＰＭＩ １６４０培地／１０％ ＦＢＳ、および１％のペニシリン／ストレプトマイシン中で維持した。がん細胞を葉酸不含培地（ＲＰＭＩ １６４０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＧＩＢＣＯ）中で、研究前に少なくとも１週間培養した。細胞結合研究は、４℃で６０分間（ｎ＝３）、実施例３で調製された（濃度：１ｎＭ）ＦＡ－ＣＤＣと共に冷ＰＢＳ（１％のＢＳＡを含む）中で５×１０５細胞（合計で５００ｕＬ、１００万／ｍＬ）をインキュベートすることによって行った。その後、細胞懸濁物を生存度キット（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で１０～１５分間染色した。次いで細胞を遠心分離し（２０００ｒｐｍ、５分）、冷ＰＢＳ（１％のＢＳＡを含む）を使用して洗浄し（２～３回）、その後、ＰＢＳ（１％のＢＳＡを含む）中に再懸濁した。三連の試料をＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した（Ｃｙ５チャネル、６３３ｎｍ／６４７ｎｍ、生／死細胞染料、４０５ｎｍ）。結果を、ＦｌｏｗＪｏ ａｎｄ Ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して処理した。
【0294】
競合結合研究（図１３）を、実施例３のＮＤＣを使用して行った。ＮＤＣの能動的な標的化は、１ｍＭの遊離葉酸の存在と共にインキュベートすることによって完全に遮断することができる。
【0295】
競合結合研究は、遊離葉酸と比較したときにＮＤＣの結合能力の＞４０倍の増強を示し、それぞれの超小型Ｃ’ドット上で複数の葉酸リガンドをコンジュゲートしたときの多価効果の存在を実証している（図１３）。
【0296】
これらの結果は、多価効果を使用して標的化能力を増強させるため、ナノ粒子（Ｃ’ドット）の表面の多数の小さい腫瘍指向性リガンドをコンジュゲートさせる利点を実証する。葉酸受容体の標的化は、１ｍＭの遊離葉酸の存在と共にインキュベートするなど、遊離葉酸の競合結合によって遮断することができる。
【0297】
フローサイトメトリーは、ＫＢ細胞系において様々な葉酸リガンド密度を有する２種のＮＤＣ製剤の同等の葉酸受容体標的化効力を示す。この研究でＮＤＣを調製するのに使用される、リンカー－エキサテカンコンジュゲート前駆体は、実施例１に記載される（化合物２０２）。遮断基は、１ｍＭの遊離葉酸を有する（図１４）。
【0298】
結果は、葉酸リガンド密度がゼロから１２に増大したとき（即ち、ナノ粒子当たり１２個の葉酸分子）、葉酸受容体アルファの能動的な標的化において劇的な増大（＞３００倍のＭＦＩ）を実証し、一方、その密度を、ナノ粒子当たり２５個の葉酸分子へさらに増大させても差はほとんど観察されなかった。
【0299】
フローサイトメトリーは、粒子当たり様々な薬物（ＤＰＲ）（即ち、ナノ粒子当たりのエキサテカン分子の数）を持つＫＢ細胞系における、３つのＮＤＣの同等の葉酸受容体標的化効力を示す。遮断基は、１ｍＭの遊離葉酸での受容体の遮断に関わった。ナノ粒子当たりのエキサテカンの種々の比を持つＮＤＣを、実施例１に記載される化合物２０２を使用して調製し、研究の結果を図１５に提示する。全てのＦＡ－ＣＤＣは、１２から２２個の葉酸部分を含む。高い薬物－粒子の比（ＤＰＲ）を含むＦＡ－ＣＤＣは、３５から５０個の間のエキサテカン－リンカーコンジュゲート基を含む。中程度のＤＰＲを含むＦＡ－ＣＤＣは、１７から２５個の間のエキサテカン－リンカーコンジュゲート基を含む。低いＤＰＲを含むＦＡ－ＣＤＣは、５から１０個の間のエキサテカン－リンカーコンジュゲート基を有する。
【0300】
これらの結果は、ほとんど変化しない３つのＮＤＣのＦＣＳサイジング変化と共に、本明細書に開示されるＮＤＣの堅牢な表面化学および維持された葉酸受容体標的化能力を実証し、これは意外にも、ペイロードの負荷能力を変えることによって乱されず、その他の薬物送達プラットフォームに勝る本明細書に開示されるＮＤＣの著しい利点を実証する。
【0301】
ヒト血漿中でＮＤＣを予備インキュベートすることは、葉酸受容体標的化能力に悪影響を与えなかった。この研究は、タンパク質コロナの形成など、ＮＤＣに対するヒト血漿の可能性のある悪影響を試験するために設計された。タンパク質コロナの形成、およびその薬物送達システムの設計された能動的な標的化能力に対する悪影響は、文献において十分実証されてきた。このフローサイトメトリー研究の結果を図１６に示し、この図は、２４時間にわたり、様々な量のヒト血漿を持つ予備インキュベーション後の、１ｎＭでＮＤＣのほぼ変化のない葉酸受容体標的化効力を示している。ＮＤＣは、実施例１のエキサテカン－ペイロードコンジュゲート前駆体を使用して（化合物２０２）、実施例３の方法に従い調製した。遮断基は、１ｍＭの遊離葉酸による遮断に関わった。この研究は、ＮＤＣ上のタンパク質コロナ（存在する場合）の形成が、ＮＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ標的化能力にほとんど悪影響を及ぼさないことを明らかに実証した。
【0302】
（実施例６）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞生存率アッセイ：
本明細書に開示されるＮＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を、がん細胞で試験した。がん細胞を、葉酸不含培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＧＩＢＣＯ）中で少なくとも１週間、研究前に培養した。細胞を、不透明な９６ウェルプレートに、ウェル当たり３×１０３細胞の密度（合計で９０ｍＬ）で播き、一晩付着させた。翌日、細胞をＮＤＣ（実施例３に従い調製した）で、０～５０ｎＭの濃度範囲（０、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、５０ｎＭ）で、１０×ストックＦＡ－ＣＤＣ溶液１０ｍＬを添加することによって処置した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞生存率アッセイ：
本明細書に開示されるＮＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を、がん細胞で試験した。がん細胞を、葉酸不含培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＧＩＢＣＯ）中で少なくとも１週間、研究前に培養した。細胞を、不透明な９６ウェルプレートに、ウェル当たり３×１０３細胞の密度（合計で９０ｍＬ）で播き、一晩付着させた。翌日、細胞をＮＤＣ（実施例３に従い調製した）で、０～５０ｎＭの濃度範囲（０、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、５０ｎＭ）で、１０×ストックＦＡ－ＣＤＣ溶液１０ｍＬを添加することによって処置した。
【0303】
細胞を、事前に定められた曝露時間にわたり処置した（研究設計に応じて、例えば４～６時間または７日間）。短い曝露時間での生存率研究の場合、各ウェル中のがん細胞を、１００ｍＬのＰＢＳで洗浄し、１００ｍＬの細胞培地でリフレッシュした。洗浄後、生存率アッセイ前の７日間にわたりプレートを３７℃のインキュベーターに戻した。７日間の曝露時間の生存率研究の場合、追加の洗浄ステップは行わなかった。７日後、細胞生存率を、製造業者の指示に従って、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ２．０アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して評価した。生存率および増殖の両方に関するデータを、Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してプロットした。葉酸標的化リガンドおよび薬物リンカーの類似の表面密度を持つ６つのＦＡ－ＣＤＣの代表的な細胞生存率の結果を、表３に提示する。
表３．葉酸標的化リガンドおよびリンカー－薬物コンジュゲートの類似の表面密度を持つＮＤＣの代表的な細胞生存率結果。
粒子当たりのＦＡリガンドの数は、１２から２２の間であり；粒子当たりのリンカー－薬物コンジュゲートの数は、１７から２５の間である。各ペイロード－リンカーは、ＤＢＣＯ部分を介してＮＤＣにコンジュゲートされる（実施例３で概説されたプロトコールに従い調製された）。
表３．葉酸標的化リガンドおよびリンカー－薬物コンジュゲートの類似の表面密度を持つＮＤＣの代表的な細胞生存率結果。
【表3-1】
【表3-2】
粒子当たりのＦＡリガンドの数は、１２から２２の間であり；粒子当たりのリンカー－薬物コンジュゲートの数は、１７から２５の間である。各ペイロード－リンカーは、ＤＢＣＯ部分を介してＮＤＣにコンジュゲートされる（実施例３で概説されたプロトコールに従い調製された）。
【0304】
（実施例７）
がん細胞内のＮＤＣの二次元（２Ｄ）共焦点撮像
２Ｄ共焦点撮像研究は、２つの例示的なＮＤＣを使用して、様々なレベルの葉酸受容体利用可能性を持つ細胞の標的化を決定するために実施した。高い葉酸受容体発現（＋＋＋＋で示される）を持つ細胞は、ＫＢ細胞であった。ＦＲ発現のない細胞（（－）で示される）はＴＯＶ－１１２Ｄ細胞系であった。ＦＲ遮断細胞も使用した。
がん細胞内のＮＤＣの二次元（２Ｄ）共焦点撮像
２Ｄ共焦点撮像研究は、２つの例示的なＮＤＣを使用して、様々なレベルの葉酸受容体利用可能性を持つ細胞の標的化を決定するために実施した。高い葉酸受容体発現（＋＋＋＋で示される）を持つ細胞は、ＫＢ細胞であった。ＦＲ発現のない細胞（（－）で示される）はＴＯＶ－１１２Ｄ細胞系であった。ＦＲ遮断細胞も使用した。
【0305】
ＫＢ細胞を、１０％のＦＢＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシンを含む葉酸不含ＲＰＭＩ １６４０培地中で維持した。ＴＯＶ－１１２Ｄ細胞を、１５％のＦＢＳおよび１％のペニシリン／ストレプトマイシンが追加補充された、最終濃度１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムを含有するＭＣＤＢ １０５培地と最終濃度２．２ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムを含有する培地１９９との１：１混合物中で維持した。細胞をトリプシン処理し、８ウェルＬａｂ－Ｔｅｋチャンバーカバーガラスに、ウェル当たり１．０×１０５細胞で播き、一晩培養して付着させた。
【0306】
ＮＤＣを実施例３に従い調製し、以下の表４に示す。ＮＤＣ Ｄは、実施例１に記載されるリンカー－ペイロードコンジュゲート（２０２）を使用して調製した。
表４．２Ｄ共焦点撮像アッセイで使用した例示的なＮＤＣ。
表４．２Ｄ共焦点撮像アッセイで使用した例示的なＮＤＣ。
【表4】
【0307】
ＮＤＣと共にインキュベーションする前に、細胞を葉酸不含ＲＰＭＩ １６４０培地で１回洗浄した。ＮＤＣを葉酸不含ＲＰＭＩ １６４０培地に添加して、最終濃度５０ｎＭにした。遮断条件では、葉酸（０．１Ｍ ＮａＯＨ中に溶解した２０ｍＭストック）を添加して最終濃度０．１ｍＭにし、ＮＤＣと同時にインキュベートした。細胞を、３７℃で１時間または２４時間のいずれかにわたりＮＤＣと共にインキュベートした。インキュベーション後、細胞を３回洗浄した。リソソームを染色するために、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＤＮＤ－２６（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔ．Ｌ７５２６、ｅｘ／ｅｍ５０４／５１１ｎｍ）を添加して、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓを含む葉酸不含ＲＰＭＩ １６４０培地中で最終濃度１００ｎＭにし、３７℃で４５分間インキュベートした。細胞を１回洗浄して、残りのｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ色素を除去した。核を染色するために、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔ．６２２４９、２０ｍＭ）を、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓを含む葉酸不含ＲＰＭＩ １６４０培地中で１：４０００に希釈し、３７℃で１０分間インキュベートした。細胞を１回洗浄し、培地を、Ｎｉｋｏｎスピニングディスク共焦点顕微鏡、６０×対物レンズ、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、６４０ｎｍレーザー線、４０５チャネルで曝露時間１００ｍｓ、４８８チャネルで５００ｍｓ、および６４０チャネルで６００ｍｓを使用する共焦点撮像のために、フェノールレッド不含ＲＰＭＩ １６４０培地と交換した。
【0308】
１時間の時点でのＫＢ（＋＋＋＋）およびＴＯＶ－１１２Ｄ（－）細胞系におけるＮＤＣの共焦点顕微鏡撮像からの結果は、ＮＤＣが、高レベルの葉酸受容体を発現するＫＢ細胞の細胞膜に主に存在するが、遮断条件または葉酸塩陰性細胞系ＴＯＶ－１１２Ｄにおいて存在しないことを示し、葉酸受容体に対するＮＤＣの特異的結合を示唆している。２４時間後、膜結合ＮＤＣを内部移行させ、内部移行したＮＤＣの量は、１時間の時点と比較して著しく増大した。内部移行したＮＤＣは、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒにより染色された酸性オルガネラ中に局在化し、これはＮＤＣの輸送がエンドリソソーム経路を経て起こることを示している。ＮＤＣの結合能力に対する血清の効果も、一晩、１０％のＦＢＳが追加補充された培地中でＮＤＣを予備インキュベートし、その後、それらを細胞と共にインキュベートすることによって調査したが、有意差は観察されず（データは図示せず）、血清の存在がＮＤＣの結合能力に影響を及ぼさなかったことを示唆している。
【0309】
ＮＤＣ Ｂの共焦点顕微鏡法の結果を図１７に提示し、ＮＤＣ Ｄの結果を図３２に提示する。これらの画像は、本開示のＮＤＣの高度に特異的な能動的標的化およびリソソーム輸送を実証し、ＦＡ標的化ＮＤＣが細胞に結合すると、葉酸受容体陽性細胞系内で内部移行するようになり、エキサテカンペイロードは切断されて（例えば、カテプシン－Ｂにより）、遊離エキサテカンをがん性細胞内に放出し得ることを示している。
【0310】
（実施例８）
ＫＢ細胞の３Ｄ腫瘍スフェロイドモデルにおけるＦＡ－ＣＤＣの共焦点撮像
３Ｄ腫瘍スフェロイドモデルアッセイを実行して、本明細書に開示されるＮＤＣの腫瘍浸透を決定した。アッセイは、例示的なＮＤＣ（実施例１のエキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体２０２を使用して、実施例３に従い調製された）を、ペイロードなしのＦＡ標的化ナノ粒子（やはり実施例３により調製され、ＦＡ前駆体のみ含み、エキサテカン－ペイロードコンジュゲート前駆体は含まない）；葉酸受容体（ＦＲ）標的化ＡＤＣ；および対応するペイロードなしのＦＲ標的化抗体と比較した。ＦＲ標的化抗体は、ミルベツキシマブの公開された配列に基づき調製した（ｈｕＭｏｖ１９として米国特許第９，６３７，５４７号で提供され；その内容の全体は参照により本明細書に組み込まれる）。ＡＤＣを同じ抗体を用いて調製し、４－（ピリジン－２－イルジスルファニル）－２－スルホ－酪酸（ｓＳＰＤＢ）リンカー（米国特許第９，６３７，５４７号で使用されるリンカーをベースにして）を介してメイタンシノイド薬ＤＭ４（Ｓｙｎｇｅｎｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ．により創出された）とコンジュゲートさせた。ＡＤＣおよび抗体をそれぞれ、Ｃｙ５－ＮＨＳエステルとの反応によってＣｙ５有機色素とコンジュゲートさせ、ＰＤ－１０カラムにより精製した。
ＫＢ細胞の３Ｄ腫瘍スフェロイドモデルにおけるＦＡ－ＣＤＣの共焦点撮像
３Ｄ腫瘍スフェロイドモデルアッセイを実行して、本明細書に開示されるＮＤＣの腫瘍浸透を決定した。アッセイは、例示的なＮＤＣ（実施例１のエキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体２０２を使用して、実施例３に従い調製された）を、ペイロードなしのＦＡ標的化ナノ粒子（やはり実施例３により調製され、ＦＡ前駆体のみ含み、エキサテカン－ペイロードコンジュゲート前駆体は含まない）；葉酸受容体（ＦＲ）標的化ＡＤＣ；および対応するペイロードなしのＦＲ標的化抗体と比較した。ＦＲ標的化抗体は、ミルベツキシマブの公開された配列に基づき調製した（ｈｕＭｏｖ１９として米国特許第９，６３７，５４７号で提供され；その内容の全体は参照により本明細書に組み込まれる）。ＡＤＣを同じ抗体を用いて調製し、４－（ピリジン－２－イルジスルファニル）－２－スルホ－酪酸（ｓＳＰＤＢ）リンカー（米国特許第９，６３７，５４７号で使用されるリンカーをベースにして）を介してメイタンシノイド薬ＤＭ４（Ｓｙｎｇｅｎｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ．により創出された）とコンジュゲートさせた。ＡＤＣおよび抗体をそれぞれ、Ｃｙ５－ＮＨＳエステルとの反応によってＣｙ５有機色素とコンジュゲートさせ、ＰＤ－１０カラムにより精製した。
【0311】
Ｃｏｒｎｉｎｇ超低付着表面９６ウェルスフェロイドマイクロプレートを、ＫＢ細胞を播く際に利用して、細胞密度１０，０００／ウェルを持つＫＢスフェロイドを有するようにした。単一細胞懸濁物を、トリプシン処理された単層から生成し、ＲＰＭＩ培地（葉酸不含）を使用して１００，０００細胞／ｍＬに希釈した。細胞懸濁物１００ｍＬを、マイクロプレートの各ウェル内に分配した。プレートを、インキュベーター内で２４時間保持して、細胞がスフェロイドを形成するようにした。ＫＢ細胞スフェロイドは、１０×対物レンズの顕微鏡により容易に観察することができる。
【0312】
３Ｄ ＫＢスフェロイドは、超低９６ウェルマイクロプレート内で一晩培養後に形成された。ＮＤＣ（実施例１のエキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体２０２を使用して、実施例３に従い調製した）、葉酸標的化ナノ粒子（「ＦＡ－Ｃ’ドット」）、ＦＲ標的化ＡＤＣ、またはペイロードなしのＦＲ標的化抗体を、５０ｎＭの最終濃度でウェル（ｎ＝３）に添加し、３７℃で４時間インキュベートした。それぞれ処置されたＫＢスフェロイドおよび対照スフェロイドを、ＰＢＳで３回洗浄し、次いで慎重にガラス底９６ウェルプレート（Ｃｅｌｌｖｉｓ）に移して、レーザー線６４０ｎｍ、２０×対物レンズを使用するＮｉｋｏｎ Ａ１Ｒ－ＳＴＥＤ共焦点顕微鏡により観察した。Ｚスタックは、Ｚ方向に１μｍそれぞれ離れている二次元画像を得ることによって獲得した。
【0313】
ＮＤＣ、ＦＡ－Ｃ’ドット、ＦＲ標的化ＡＤＣ、およびペイロードなしのＦＲ標的化抗体で処置されたＫＢ腫瘍スフェロイドのＺスタック共焦点顕微鏡撮像からの結果を、図１８に示す。結果は、全体で＞８００ｍｍの腫瘍スフェロイド全体にわたるＮＤＣおよびＦＡ－Ｃ’ドットの浸透および十分な拡散を示す。対照的に、標識された抗体およびＡＤＣは、腫瘍スフェロイド内部ではなく周囲にのみ蓄積された。効率的な腫瘍浸透を達成する、本明細書に開示されたＮＤＣの能力は、非常に有利であり、従来の薬物送達プラットフォームと比較して有意な改善を示す。
【0314】
（実施例９）
ＤＦＯ－ＦＡ－ＣＤＣの８９Ｚｒ放射標識およびｉｎ ｖｉｖｏ静止ＰＥＴ／ＣＴおよび生体内分布研究
放射標識アッセイを実行して、本開示の葉酸受容体標的化ＮＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ生体内分布を決定した。アッセイで使用されるＮＤＣを、キレーターデスフェリオキサミン（ＤＦＯ）とコンジュゲートさせ、次いで放射性核種（８９Ｚｒ）と結合させた。
ＤＦＯ－ＦＡ－ＣＤＣの８９Ｚｒ放射標識およびｉｎ ｖｉｖｏ静止ＰＥＴ／ＣＴおよび生体内分布研究
放射標識アッセイを実行して、本開示の葉酸受容体標的化ＮＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ生体内分布を決定した。アッセイで使用されるＮＤＣを、キレーターデスフェリオキサミン（ＤＦＯ）とコンジュゲートさせ、次いで放射性核種（８９Ｚｒ）と結合させた。
【0315】
典型的な８９Ｚｒ標識では、約１ｎｍｏｌのＤＦＯコンジュゲートＮＤＣを１ｍＣｉの８９Ｚｒ－オキサレート（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ－Ｍａｄｉｓｏｎ Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎグループにより生成され提供された）と、３７℃のＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８）中で６０分間混合し；最終標識ｐＨを７～７．５に保持した。標識収率は、ラジオインスタント薄層クロマトグラフィー（ｉＴＬＣ）を使用することによって、モニタリングすることができた。次いでエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）チャレンジ手順を導入して、任意の非特異的に結合された８９Ｚｒを粒子表面から除去した。次いで合成したままの標識ＮＤＣ（８９Ｚｒ－ＤＦＯ－ＦＡ－ＣＤＣ）を、ＰＤ－１０カラムを使用することにより精製した。最終放射化学純度を、ｉＴＬＣを使用することにより定量した。
【0316】
ＰＥＴ／ＣＴ撮像では、健康なヌードマウス（ｎ＝３）に２００～３００μＣｉ（７．４～１１．１ＭＢｑ）の８９Ｚｒ－ＤＦＯ－ＦＡ－ＣＤＣをｉ．ｖ．注射した。ＰＥＴ／ＣＴ画像を獲得する約５分前、マウスを、２％のイソフルラン／酸素ガス混合物の吸入によって麻酔をかけ、スキャナーベッド上に置き；麻酔は、１％イソフルラン／ガス混合物を使用して維持した。ＰＥＴ／ＣＴ撮像を、小動物ＰＥＴ／ＣＴスキャナー（Ｉｎｖｅｏｎ ｍｉｃｒｏＰＥＴ／ｍｉｃｒｏＣＴ）で、注射の１～２、２４、４８、および７２時間後に行った。３５０～７００ｋｅＶのエネルギーウインドウおよび６ｎｓの同時タイミングウインドウ（ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｔｉｍｉｎｇ ｗｉｎｄｏｗ）を使用した。データを、フーリエリビニング（Ｆｏｕｒｉｅｒ ｒｅｂｉｎｎｉｎｇ）により２Ｄヒストグラムに選別し、横断画像を、フィルター補正逆投影（ｆｉｌｔｅｒｅｄ ｂａｃｋ－ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）によって１２８×１２８×６３（０．７２×０．７２×１．３ｍｍ３）マトリクスに再構築した。ＰＥＴ／ＣＴ撮像データを正規化して、応答の不均一性、デッドタイムカウントロス（ｄｅａｄ－ｔｉｍｅ ｃｏｕｎｔ ｌｏｓｓ）、陽電子分岐比、および注射時間までの物理的減衰を補正し；無減衰、散乱、または部分体積平均補正を適用した。再構築された画像のカウント率は、８９Ｚｒを含有するマウスサイズの水等価ファントムの撮像から誘導されたシステム較正因子の使用により、放射能濃度（組織のグラム当たりの注射された線量パーセンテージ、％ＩＤ／ｇ）に変換された。ＰＥＴデータの関心領域（ＲＯＩ）分析を、ＩＲＷソフトウェアを使用して行った。注射後７２時間で、個々のマウスそれぞれからの臓器を収集し、湿式秤量しガンマカウントした（Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｗｉｚａｒｄ２ γ－Ｃｏｕｎｔｅｒ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）。８９Ｚｒ－ＤＦＯ－ＦＡ－ＣＤＣの取込みは、％ＩＤ／ｇ（平均±ＳＤ）と表された。
【0317】
本開示のＮＤＣは、正確な腫瘍標的化、深い腫瘍浸透、および高い腫瘍死滅効力を可能にした。ＮＤＣは、急速にかつ効率的に体内から除去され得、このことは、オフターゲット毒性の可能性を低減させ、改善された安全性プロファイルをもたらす。本明細書に開示されるＮＤＣ（標的化リガンド（葉酸）およびペイロード（エキサテカン）を含む）は、対象に投与することができ、血流中を循環することができ、がん（例えば、腫瘍）を標的とし、拡散し、浸透し、内部移行し、エキサテカンペイロードを切断し、がん細胞を死滅させることができる。
【0318】
この研究では、ＦＡ－ＣＤＣの腎クリアランスおよび生体内分布パターンを試験した。図１９Ａに示されるように、静脈内注射後、８９Ｚｒ－ＤＦＯ－ＦＡ－ＣＤＣは、心臓および動脈からの高い放射性シグナルによって示されるように、健康なヌードマウスの血流中を循環した。主要な放射性シグナルは、マウスの膀胱から見ることもでき、ＮＤＣの腎クリアランスが実証される。２４時間後、注射された８９Ｚｒ－ＤＦＯ－ＦＡ－ＣＤＣの大部分がマウスの体内から除去された。注射後２時間および２４時間での生体内分布パターンの変化も、図１９Ｂに示す。予測されるように、ＮＤＣは、主要な腎クリアランス経路で血流中を循環することができ、一方、単核食細胞系（ＭＰＳ）によるクリアランスが回避される（即ち、肝臓および脾臓）。
【0319】
（実施例１０）
ヒトＫＢ腫瘍モデルおよびｉｎ ｖｉｖｏ効力研究
ＮＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ効力は、ヒトＫＢ腫瘍マウスモデルを使用して実施した。アッセイは、エキサテカン－ペイロードコンジュゲート前駆体２０２（実施例１；ここではＤと標識し、図２０Ｄに示される）を使用して実施例３に従い調製されたＮＤＣを、以下の表５に示されるＮＤＣ（ＮＤＣ Ａ～ＣおよびＥ～Ｆ）と比較した。各ＮＤＣを、対照および遊離エキサテカンと比較し、ＮＤＣ ＥおよびＦを、遊離エキサテカンおよびイリノテカン（ＣＰＴ－１１）と比較した。
表５．ｉｎ ｖｉｖｏ効力研究で使用された例示的なＮＤＣ。
粒子当たりのＦＡリガンドの数は１２から２２の間であり；粒子当たりのリンカー－薬物コンジュゲートの数は１７から２５の間である。各ペイロード－リンカーは、ＤＢＣＯ部分を介してＮＤＣにコンジュゲートされる（実施例３で概説したプロトコールにより調製される）。
ヒトＫＢ腫瘍モデルおよびｉｎ ｖｉｖｏ効力研究
ＮＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ効力は、ヒトＫＢ腫瘍マウスモデルを使用して実施した。アッセイは、エキサテカン－ペイロードコンジュゲート前駆体２０２（実施例１；ここではＤと標識し、図２０Ｄに示される）を使用して実施例３に従い調製されたＮＤＣを、以下の表５に示されるＮＤＣ（ＮＤＣ Ａ～ＣおよびＥ～Ｆ）と比較した。各ＮＤＣを、対照および遊離エキサテカンと比較し、ＮＤＣ ＥおよびＦを、遊離エキサテカンおよびイリノテカン（ＣＰＴ－１１）と比較した。
表５．ｉｎ ｖｉｖｏ効力研究で使用された例示的なＮＤＣ。
【表5-1】
【表5-2】
粒子当たりのＦＡリガンドの数は１２から２２の間であり；粒子当たりのリンカー－薬物コンジュゲートの数は１７から２５の間である。各ペイロード－リンカーは、ＤＢＣＯ部分を介してＮＤＣにコンジュゲートされる（実施例３で概説したプロトコールにより調製される）。
【0320】
ヒトＫＢ細胞系をＡＴＣＣから購入し、他に指定されない限り、葉酸不含ＲＰＭＩ １６４０培地／１０％ＦＢＳ、および１％のペニシリン／ストレプトマイシン中で維持した。ＫＢ細胞を培養して適切な細胞カウントに達したら、細胞生存率を、血球計算盤およびトリパンブルー染色アッセイにより確認した。皮下移植では、各マウスにＫＢ細胞を、注射当たり０．１ｍＬのＭａｔｒｉｇｅｌ／細胞希釈体積で、２×１０６細胞／マウスの密度で、大腿の左下部側面に注射した。皮下腫瘍体積が、本研究で必要な数のマウスにおいて７５から１５０ｍｍ３の触知可能なサイズに達したら、マウスを無作為化して、同等の腫瘍体積統計量と共に得られた各処置コホートに割り当てた。無作為化および研究コホート割当ての後、各用量コホートを、投与経路、投薬量、およびスケジュールに従い処置した。
【0321】
ＮＤＣ Ｂ～Ｄのそれぞれの２つの用量レベルを、効力研究で使用した（ＮＤＣ Ａ、Ｅ、およびＦに関してただ１つの用量レベル）。腫瘍体積測定は、用量処置期間中は２日ごとに、較正されたキャリパーを使用して行い、その後、生存期間の回復期間中は週に２回の測定を行い、腫瘍体積を、長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）×幅（ｍｍ）×０．５０の式を使用して決定した。体重測定は、用量処置期間中は２日ごとに行い、その後、生存期間の回復期間中は週に２回、測定を行った。マウスを、研究のエンドポイントが１０００ｍｍ３に達したときに、安楽死させた。腫瘍を収集し、腫瘍サイズを測定した。腫瘍を外科的に切除し、瞬間凍結して、将来の分析まで－８０℃で保存した。
【0322】
図２０Ａ～２０Ｆは、ＫＢ腫瘍保持マウス（ｎ＝７）における６つの葉酸受容体標的化ＮＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍成長阻害研究を示す。ｉｎ ｖｉｖｏ効力研究に関して示された腫瘍成長チャートは、図２０Ｄに示される、エキサテカン－ペイロードコンジュゲート前駆体２０２（実施例１から）を使用して実施例３に従い調製されたＮＤＣで処置したマウスでの腫瘍成長阻害の明らかな応答を示す。同様に、成長阻害は、ＮＤＣ Ａ（図２０Ａ）、ＮＤＣ Ｂ（図２０Ｂ）、およびＮＤＣ Ｃ（図２０Ｃ）で観察された。対照的に、ＮＤＣ Ｅ（図２０Ｅ）およびＮＤＣ Ｆ（図２０Ｆ）で処置したマウスは、腫瘍成長の有意な阻害を示さなかった。ＮＤＣに関する用量を、図２０Ａ～２０Ｆに提示する。腫瘍成長阻害の明らかな応答が、ＮＤＣ Ａ～Ｄで処置したマウスで観察された。生理食塩水を受けた対照群のマウスは、同じＱ３ＤＸ３用量レジメンに従う。
【0323】
（実施例１１）
薬物耐性細胞系におけるＮＤＣの活性
アッセイは、薬物耐性がん細胞（特に、イリノテカン耐性ＫＢ細胞およびエキサテカン耐性ＫＢ細胞）でのその活性を決定するために、本明細書に開示されるＮＤＣを使用して実施した。このアッセイで使用したＮＤＣは、エキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体２０２（実施例１から）を使用して実施例３に従い調製された。
薬物耐性細胞系におけるＮＤＣの活性
アッセイは、薬物耐性がん細胞（特に、イリノテカン耐性ＫＢ細胞およびエキサテカン耐性ＫＢ細胞）でのその活性を決定するために、本明細書に開示されるＮＤＣを使用して実施した。このアッセイで使用したＮＤＣは、エキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体２０２（実施例１から）を使用して実施例３に従い調製された。
【0324】
ＴＯＰ１阻害剤耐性葉酸受容体アルファ陽性がん細胞の開発。
ナイーブのヒトＫＢ細胞系をＡＴＣＣから購入し、葉酸不含ＲＰＭＩ １６４０培地／１０％ＦＢＳおよび１％のペニシリン／ストレプトマイシン中で維持した。ＴＯＰ１阻害剤耐性ＫＢ細胞を開発するために、フラスコ内の細胞（５０～６０％コンフルエンス）を、増大する濃度のエキサテカン、トポテカン、ＳＮ－３８、またはイリノテカンで、４カ月間にわたり繰り返し処置した。出発ＴＯＰ１阻害剤処置濃度は、ＫＢ細胞のＩＣ９０値に近かった。各処置後、細胞を、新鮮なＲＰＭＩ １６４０培地で慎重に洗浄し、さらに２～３日間、５０～６０％コンフルエンスに達するまで増殖させた。ＴＯＰ１阻害剤処置の次のラウンドは、２～１０倍高いＴＯＰ１阻害剤濃度で開始した。
ナイーブのヒトＫＢ細胞系をＡＴＣＣから購入し、葉酸不含ＲＰＭＩ １６４０培地／１０％ＦＢＳおよび１％のペニシリン／ストレプトマイシン中で維持した。ＴＯＰ１阻害剤耐性ＫＢ細胞を開発するために、フラスコ内の細胞（５０～６０％コンフルエンス）を、増大する濃度のエキサテカン、トポテカン、ＳＮ－３８、またはイリノテカンで、４カ月間にわたり繰り返し処置した。出発ＴＯＰ１阻害剤処置濃度は、ＫＢ細胞のＩＣ９０値に近かった。各処置後、細胞を、新鮮なＲＰＭＩ １６４０培地で慎重に洗浄し、さらに２～３日間、５０～６０％コンフルエンスに達するまで増殖させた。ＴＯＰ１阻害剤処置の次のラウンドは、２～１０倍高いＴＯＰ１阻害剤濃度で開始した。
【0325】
耐性係数およびＩＣ５０アッセイ。
ナイーブのおよびＴＯＰ１阻害剤耐性ＫＢ細胞の両方を、葉酸不含培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＧＩＢＣＯ）で培養した。細胞を、不透明な９６ウェルプレートに、ウェル当たり３×１０３細胞（合計で９０μＬ）の密度で播き、一晩付着させた。翌日、細胞を、選択されたＴＯＰ１阻害剤（例えば、遊離エキサテカン）またはＮＤＣで、適切な濃度範囲で処置した。ＴＯＰ１阻害剤を両方のタイプの細胞に同じ期間にわたり曝露した後、細胞生存率を、製造業者の指示に従って、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ２．０アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して評価した。生存率および増殖の両方に関するデータを、Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してプロットした。耐性係数は、下記の方程式：
を使用することによって計算することができる。
ナイーブのおよびＴＯＰ１阻害剤耐性ＫＢ細胞の両方を、葉酸不含培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＧＩＢＣＯ）で培養した。細胞を、不透明な９６ウェルプレートに、ウェル当たり３×１０３細胞（合計で９０μＬ）の密度で播き、一晩付着させた。翌日、細胞を、選択されたＴＯＰ１阻害剤（例えば、遊離エキサテカン）またはＮＤＣで、適切な濃度範囲で処置した。ＴＯＰ１阻害剤を両方のタイプの細胞に同じ期間にわたり曝露した後、細胞生存率を、製造業者の指示に従って、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ２．０アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して評価した。生存率および増殖の両方に関するデータを、Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してプロットした。耐性係数は、下記の方程式：
【数1】
を使用することによって計算することができる。
【0326】
イリノテカン耐性ＫＢ細胞系およびＮＤＣの効力試験
図２１Ａは、ナイーブのおよび耐性ＫＢ細胞の両方での、イリノテカンのＩＣ５０曲線を示し、５×イリノテカン耐性ＫＢ細胞の首尾良くなされた開発を実証し、ここでイリノテカン耐性ＫＢ細胞におけるＩＣ５０遊離イリノテカンは、ナイーブ細胞での６６８ｎＭと比較して、３，６１８ｎＭであった。図２１Ｂは、ナイーブのＫＢ細胞（ＩＣ５０＝０．２７ｎＭ）および耐性ＫＢ細胞（ＩＣ５０＝０．２６ｎＭ）でのＮＤＣ（ＦＡ－ＣＤＣ）（実施例１のエキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体２０２を使用して、実施例３に従い調製した）のＩＣ５０曲線を提供し、ＮＤＣは、ナイーブのＫＢ細胞およびＴＯＰ１阻害剤耐性ＫＢ細胞の両方にわたって均一な高い効力を有することを示している。
図２１Ａは、ナイーブのおよび耐性ＫＢ細胞の両方での、イリノテカンのＩＣ５０曲線を示し、５×イリノテカン耐性ＫＢ細胞の首尾良くなされた開発を実証し、ここでイリノテカン耐性ＫＢ細胞におけるＩＣ５０遊離イリノテカンは、ナイーブ細胞での６６８ｎＭと比較して、３，６１８ｎＭであった。図２１Ｂは、ナイーブのＫＢ細胞（ＩＣ５０＝０．２７ｎＭ）および耐性ＫＢ細胞（ＩＣ５０＝０．２６ｎＭ）でのＮＤＣ（ＦＡ－ＣＤＣ）（実施例１のエキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体２０２を使用して、実施例３に従い調製した）のＩＣ５０曲線を提供し、ＮＤＣは、ナイーブのＫＢ細胞およびＴＯＰ１阻害剤耐性ＫＢ細胞の両方にわたって均一な高い効力を有することを示している。
【0327】
エキサテカン耐性ＫＢ細胞系およびＮＤＣの効力試験
図２２Ａは、ナイーブのおよび耐性ＫＢ細胞の両方におけるエキサテカンのＩＣ５０曲線を示し、＞８×のエキサテカン耐性ＫＢ細胞の首尾良くなされた開発を実証しており、ここで通常のＫＢ細胞におけるエキサテカンのＩＣ５０は、エキサテカンで４回前処置したＫＢ細胞において４ｎＭでありかつエキサテカンで７回前処置したＫＢ細胞において１６．９ｎＭであるのと比較して、２ｎＭであった。図２２Ｂは、ナイーブのおよび耐性ＫＢ細胞の両方（４×または７×前処置）におけるＮＤＣ（ＦＡ－ＣＤＣ）（実施例１のエキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体２０２を使用して、実施例３に従い調製された）のＩＣ５０曲線を示し、ここでＦＡ－ＣＤＣのＩＣ５０は、それぞれ０．２７ｎＭ、０．２８ｎＭ、および０．３０ｎＭであった。結果は、ＮＤＣが、ナイーブのおよび耐性ＫＢ細胞の両方において均一に高い効力を保有することを示した。
図２２Ａは、ナイーブのおよび耐性ＫＢ細胞の両方におけるエキサテカンのＩＣ５０曲線を示し、＞８×のエキサテカン耐性ＫＢ細胞の首尾良くなされた開発を実証しており、ここで通常のＫＢ細胞におけるエキサテカンのＩＣ５０は、エキサテカンで４回前処置したＫＢ細胞において４ｎＭでありかつエキサテカンで７回前処置したＫＢ細胞において１６．９ｎＭであるのと比較して、２ｎＭであった。図２２Ｂは、ナイーブのおよび耐性ＫＢ細胞の両方（４×または７×前処置）におけるＮＤＣ（ＦＡ－ＣＤＣ）（実施例１のエキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体２０２を使用して、実施例３に従い調製された）のＩＣ５０曲線を示し、ここでＦＡ－ＣＤＣのＩＣ５０は、それぞれ０．２７ｎＭ、０．２８ｎＭ、および０．３０ｎＭであった。結果は、ＮＤＣが、ナイーブのおよび耐性ＫＢ細胞の両方において均一に高い効力を保有することを示した。
【0328】
（実施例１２）
様々な葉酸受容体発現レベルを持つがん細胞でのＮＤＣの活性
アッセイは、コンジュゲートされていないエキサテカンと比較して、種々のＦＲアルファ過剰発現がん細胞系において様々なレベルの薬物対粒子比を持つ、例示的なＮＤＣ（ＦＡ－ＣＤＣ）の細胞毒性を決定するために実行した。ＮＤＣは、実施例１のペイロード－リンカーコンジュゲート前駆体２０２を使用して、実施例３により調製した。試験したＮＤＣ（ＦＡ－ＣＤＣ）は、４３、２０、８、および１の薬物対粒子比（ＤＰＲ）を有していた（即ち、ナノ粒子当たり４３、２０、８、および１個のエキサテカン－リンカー基）。
様々な葉酸受容体発現レベルを持つがん細胞でのＮＤＣの活性
アッセイは、コンジュゲートされていないエキサテカンと比較して、種々のＦＲアルファ過剰発現がん細胞系において様々なレベルの薬物対粒子比を持つ、例示的なＮＤＣ（ＦＡ－ＣＤＣ）の細胞毒性を決定するために実行した。ＮＤＣは、実施例１のペイロード－リンカーコンジュゲート前駆体２０２を使用して、実施例３により調製した。試験したＮＤＣ（ＦＡ－ＣＤＣ）は、４３、２０、８、および１の薬物対粒子比（ＤＰＲ）を有していた（即ち、ナノ粒子当たり４３、２０、８、および１個のエキサテカン－リンカー基）。
【0329】
様々なＦＲアルファ発現レベル（ＫＢ（＋＋＋＋）、ＩＧＲＯＶ－１（＋＋）、ＳＫ－ＯＶ－３（＋＋）、ＨＣＣ８２７（＋＋）、Ａ５４９（－）、およびＢＴ５４９（－））を持つがん細胞を、葉酸不含培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＧＩＢＣＯ）中で、研究前の少なくとも１週間培養した。７日間曝露および６時間曝露に関するアッセイを、共に実行した。
【0330】
細胞を、不透明な９６ウェルプレートに、ウェル当たり３×１０３細胞の密度（合計で９０μＬ）で播き、一晩付着させた。翌日、細胞を、様々な薬物対粒子比（ＤＰＲ）を持つＮＤＣで、０～５０ｎＭに及ぶ濃度（０、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、５０ｎＭ）で、１０μＬの１０×ストック化合物を添加することにより処置した。
【0331】
６時間曝露の生存率研究では、細胞を６時間処置し、１００μＬのＰＢＳで洗浄した（３×）。次いで１００μＬの新鮮な細胞培地を各ウェルに添加し、プレートをさらに７日間、３７℃でインキュベートし、その後、製造業者の指示に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を行った。７日間の曝露アッセイの結果を図２３に提示し、これはＮＤＣが、細胞におけるＦＲ発現のレベルが異なるにも関わらず全ての細胞系にわたって非常に強力であることを実証する。
【0332】
７日間の曝露生存率研究では、細胞を、化合物と共に全７日間にわたりインキュベートし、その後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）細胞毒性アッセイを行った。半数阻害濃度（ＩＣ５０）に関するデータを、Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してプロットした。６時間曝露アッセイの結果を図２３に提示し、これはＮＤＣが、細胞内でのＦＲ発現の種々のレベルにも関わらず全ての細胞系にわたって非常に強力であることを実証している。
【0333】
（実施例１３）
患者由来のＰｔ耐性腫瘍細胞系におけるＮＤＣの細胞毒性
アッセイは、コンジュゲートされていないエキサテカンと比較して、Ｐｔ耐性である様々な患者由来の腫瘍細胞系における例示的なＮＤＣ（実施例１からのエキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体化合物２０２を使用して、実施例１に従い調製した）の細胞毒性を確立するために実行した。細胞系は、卵巣がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、乳がん（ＨＲ＋、ＨＥＲ２＋；およびＨＲ－、ＨＥＲ２＋の両方；およびトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ））、子宮内膜がん、および頭頸部（Ｈ＆Ｎ）がんから得た。アッセイの結果を図２４に提示する。
患者由来のＰｔ耐性腫瘍細胞系におけるＮＤＣの細胞毒性
アッセイは、コンジュゲートされていないエキサテカンと比較して、Ｐｔ耐性である様々な患者由来の腫瘍細胞系における例示的なＮＤＣ（実施例１からのエキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体化合物２０２を使用して、実施例１に従い調製した）の細胞毒性を確立するために実行した。細胞系は、卵巣がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、乳がん（ＨＲ＋、ＨＥＲ２＋；およびＨＲ－、ＨＥＲ２＋の両方；およびトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ））、子宮内膜がん、および頭頸部（Ｈ＆Ｎ）がんから得た。アッセイの結果を図２４に提示する。
【0334】
細胞毒性効力を、ＫＩＹＡ－ＰＲＥＤＩＣＴ（商標）アッセイを使用するＫＩＹＡＴＥＣにより決定した。白金耐性の卵巣がん患者、子宮内膜がん患者、非小細胞肺がん患者、乳がん患者、トリプルネガティブ乳がん患者、頭頸部がん患者からの腫瘍組織のＦＲα免疫組織化学（ＩＣＨ）スコアリングを、製造業者のプロトコールに従って、Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ ＦＲａ ＩＨＣアッセイキット（ｃａｔ＃ ＢＲＩ４００６ＫＡＡ）を使用することによるＸｅｎｏＳＴＡＲＴによって実行した。種々の適応症からの合計２８のＰＤＸモデルを、ＩＨＣスコアに基づき選択し、ＫＩＹＡ－ＰＲＥＤＩＣＴ（商標）アッセイのためにＫＩＹＡＴＥＣに提供した。簡単に言うと、凍結保存されたＰＤＸ腫瘍を解凍し、酵素で解離させて単一細胞にし、３８４ウェルスフェロイドマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播いた。フローサイトメトリーも行って、種々のＰＤＸモデルの中でのＦＲαレベルを評価した。スフェロイド形成の２４時間後、ＮＤＣまたは対照を、設計された濃度範囲で添加し、７日間インキュベートした。その後、細胞生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）３Ｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により測定した。データを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで分析した。
【0335】
（実施例１４）
小児急性骨髄性白血病モデルにおける例示的なＮＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ効力
アッセイは、葉酸受容体アルファ陽性小児急性骨髄性白血病モデルにおいて、例示的なＮＤＣ（実施例１からのエキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体２０２を使用して、実施例３のプロトコールに従い調製した）のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ効力を確立するために実施した。
小児急性骨髄性白血病モデルにおける例示的なＮＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ効力
アッセイは、葉酸受容体アルファ陽性小児急性骨髄性白血病モデルにおいて、例示的なＮＤＣ（実施例１からのエキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体２０２を使用して、実施例３のプロトコールに従い調製した）のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ効力を確立するために実施した。
【0336】
ｉｎ ｖｉｔｒｏフローサイトメトリー細胞結合研究
がん細胞（ＩＧＲＯＶ－１およびＡＭＬ ＭＶ４；１１細胞系）を、葉酸不含培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＧＩＢＣＯ）中で、研究前の少なくとも１週間、培養した。細胞結合研究は、４℃で６０分間（ｎ＝３）、例示的なＮＤＣを含むまたは抗ＦＲアルファフィコエリスリン（ＰＥ）コンジュゲート抗体（抗ＦＲアルファ抗体－ＰＥ）（濃度：１０ｎＭ）を含む冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む）中で、５×１０５細胞（合計で５００μＬ、１００万／ｍＬ）をインキュベートすることによって行った。非標的化ＣＤＣおよびアイソタイプ抗体－ＰＥを、それぞれ例示的なＮＤＣおよび抗ＦＲアルファ抗体－ＰＥに対する陰性対照として使用した。次いで細胞懸濁物を、生存度キット（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で１０～１５分間染色した。細胞を次に遠心分離し（毎分２０００回転、５分）、冷ＰＢＳ（１％のＢＳＡを含む）で洗浄し（２～３回）、その後、ＰＢＳ（１％のＢＳＡを含む）に再懸濁した。三連の試料をＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（Ｃｙ５チャネル、６３３ｎｍ／６４７ｎｍ、生／死細胞染料、４０５ｎｍ）で分析した。結果を、ＦｌｏｗＪｏ ａｎｄ Ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して処理した。
がん細胞（ＩＧＲＯＶ－１およびＡＭＬ ＭＶ４；１１細胞系）を、葉酸不含培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＧＩＢＣＯ）中で、研究前の少なくとも１週間、培養した。細胞結合研究は、４℃で６０分間（ｎ＝３）、例示的なＮＤＣを含むまたは抗ＦＲアルファフィコエリスリン（ＰＥ）コンジュゲート抗体（抗ＦＲアルファ抗体－ＰＥ）（濃度：１０ｎＭ）を含む冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む）中で、５×１０５細胞（合計で５００μＬ、１００万／ｍＬ）をインキュベートすることによって行った。非標的化ＣＤＣおよびアイソタイプ抗体－ＰＥを、それぞれ例示的なＮＤＣおよび抗ＦＲアルファ抗体－ＰＥに対する陰性対照として使用した。次いで細胞懸濁物を、生存度キット（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で１０～１５分間染色した。細胞を次に遠心分離し（毎分２０００回転、５分）、冷ＰＢＳ（１％のＢＳＡを含む）で洗浄し（２～３回）、その後、ＰＢＳ（１％のＢＳＡを含む）に再懸濁した。三連の試料をＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（Ｃｙ５チャネル、６３３ｎｍ／６４７ｎｍ、生／死細胞染料、４０５ｎｍ）で分析した。結果を、ＦｌｏｗＪｏ ａｎｄ Ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して処理した。
【0337】
例示的なＮＤＣおよび抗ＦＲアルファ抗体－ＰＥのフローサイトメトリーヒストグラムを、それぞれの陰性対照（非標的化ＮＤＣまたはアイソタイプ抗体－ＰＥ）と比較したものを、図２５Ａ～２５Ｄに示す。フロー研究は、ＩＧＲＯＶ－１（ＦＲアルファ陽性ヒト卵巣がん）およびＡＭＬ ＭＶ４；１１細胞系の両方に対する、例示的なＮＤＣの特異的なＦＲアルファ標的化能力を実証する。
【0338】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）細胞毒性アッセイ
がん細胞（ＩＧＲＯＶ－１およびＡＭＬ ＭＶ４；１１細胞系）を、葉酸不含培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＧＩＢＣＯ）中で、研究前の少なくとも１週間、培養した。細胞を、ウェル当たり３×１０３細胞の密度で（合計で９０μＬ）、不透明な９６ウェルプレートに播き、一晩付着させた。翌日、細胞を、１０μＬの１０×ストックＮＤＣ溶液を添加することにより、０～１００ｎＭに及ぶ濃度の例示的なＮＤＣで処置した。より短い曝露での生存率研究では、細胞を４時間処置し、１００μＬのＰＢＳで洗浄した（３×）。次いでＮＤＣを含まない、１００μＬの新鮮な細胞培地を各ウェルに添加し、プレートをさらに５日間、３７℃でインキュベートし、その後、製造業者の指示に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を行った。半数阻害濃度（ＩＣ５０）に関するデータを、Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してプロットした。
がん細胞（ＩＧＲＯＶ－１およびＡＭＬ ＭＶ４；１１細胞系）を、葉酸不含培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＧＩＢＣＯ）中で、研究前の少なくとも１週間、培養した。細胞を、ウェル当たり３×１０３細胞の密度で（合計で９０μＬ）、不透明な９６ウェルプレートに播き、一晩付着させた。翌日、細胞を、１０μＬの１０×ストックＮＤＣ溶液を添加することにより、０～１００ｎＭに及ぶ濃度の例示的なＮＤＣで処置した。より短い曝露での生存率研究では、細胞を４時間処置し、１００μＬのＰＢＳで洗浄した（３×）。次いでＮＤＣを含まない、１００μＬの新鮮な細胞培地を各ウェルに添加し、プレートをさらに５日間、３７℃でインキュベートし、その後、製造業者の指示に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を行った。半数阻害濃度（ＩＣ５０）に関するデータを、Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してプロットした。
【0339】
ＦＲアルファ陽性ヒト卵巣がんおよびＭＶ４；１１ ＡＭＬ細胞系における例示的なＮＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ特異的細胞毒性活性を、図２６Ａ～２６Ｂに示す。細胞を、指示される濃度の例示的なＮＤＣで処置し、３７℃で４時間インキュベートし、洗浄し、さらに５日間、インキュベーターに戻し、その後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）細胞毒性アッセイを行った。
【0340】
ＣＢＦＡ２Ｔ３－ＧＬＩＳ２融合陽性ＡＭＬ細胞系由来の異種移植モデル
例示的なＮＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍死滅活性を、細胞系由来異種移植（ＣＤＸ）モデルで評価した。ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウスに葉酸塩不含固形飼料を、ＡＭＬ細胞系を注射する前に１週間与えた。次いでルシフェラーゼレポーターが形質導入された１～５００万の融合陽性細胞系（Ｍ０７ｅ、ＷＳＵ－ＡＭＬ）および操作された細胞（ＭＶ４；１１ ＦＯＬＲ＋）を、尾部静脈注射を介してＮＳＧマウスに移植した。白血病の負荷および処置に対する応答を、非侵襲性生体発光撮像（マウスの正面および背面の両方から）を使用してモニタリングし、顎下部の出血により引き出したマウス末梢血のフローサイトメトリー分析を隔週で実施し、これはＣＤＣ処置の第１週から開始した。マウスを、疾患の症状（頻呼吸、ねこ背、永続的な体重減少、疲労、後肢の麻痺を含む）に関してモニタリングした。食塩水対照群（コホート１）からのマウスは、白血病注射後の４４日目の高いＡＭＬ負荷に起因して安楽死させた（血液、骨髄、胸腺、肝臓、肺、および脾臓を含む組織を剖検で収集し、白血病細胞の存在を分析した）。処置群（コホート２～４）からのマウスには、毎週、生体発光撮像を受け続けさせ、体重のモニタリングを行った。マウスの調製、処置、および撮像に関するタイムラインの図を、図３１に提示する。
例示的なＮＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍死滅活性を、細胞系由来異種移植（ＣＤＸ）モデルで評価した。ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウスに葉酸塩不含固形飼料を、ＡＭＬ細胞系を注射する前に１週間与えた。次いでルシフェラーゼレポーターが形質導入された１～５００万の融合陽性細胞系（Ｍ０７ｅ、ＷＳＵ－ＡＭＬ）および操作された細胞（ＭＶ４；１１ ＦＯＬＲ＋）を、尾部静脈注射を介してＮＳＧマウスに移植した。白血病の負荷および処置に対する応答を、非侵襲性生体発光撮像（マウスの正面および背面の両方から）を使用してモニタリングし、顎下部の出血により引き出したマウス末梢血のフローサイトメトリー分析を隔週で実施し、これはＣＤＣ処置の第１週から開始した。マウスを、疾患の症状（頻呼吸、ねこ背、永続的な体重減少、疲労、後肢の麻痺を含む）に関してモニタリングした。食塩水対照群（コホート１）からのマウスは、白血病注射後の４４日目の高いＡＭＬ負荷に起因して安楽死させた（血液、骨髄、胸腺、肝臓、肺、および脾臓を含む組織を剖検で収集し、白血病細胞の存在を分析した）。処置群（コホート２～４）からのマウスには、毎週、生体発光撮像を受け続けさせ、体重のモニタリングを行った。マウスの調製、処置、および撮像に関するタイムラインの図を、図３１に提示する。
【0341】
全てのマウスを無作為化し、その後、投薬および秤量を行って、以下の表６に基づき正しく設計された用量を提供した。白血病負荷および処置に対する応答を、非侵襲性生体発光撮像を使用して毎週モニタリングした。体重は、１日おきに測定した。マウスは、その体重損失が２０％を超えた場合に終了させた。
表６．用量設計（群当たりｎ＝５）
表６．用量設計（群当たりｎ＝５）
【表6】
【0342】
図２７は、表６に示される３つの用量レベルで、生理食塩水および例示的なＮＤＣで処置したＡＭＬマウスの体重変化を提供する。生理食塩水群（コホート１）は、主に白血病負荷に起因して２０％以内の体重損失を示した。０．３３ｍｇ／ｋｇ（Ｑ３Ｄ×６）用量群（コホート２）では、５匹中４匹のマウスがＮＤＣに十分耐容性を示し（＜２０％損失）、体重は６回の用量後に増加し；一方、残りのマウスは、５回目の用量後に＞２０％の体重損失を示し、６回目の用量後にはさらなる体重損失を示した。０．５０ｍｇ／ｋｇ（Ｑ３Ｄ×３）の用量群（コホート３）では、５匹全てのマウスがＮＤＣに十分耐容性を示し（＜２０％損失）、体重は３回の用量後に増加した。０．６５ｍｇ／ｋｇ（Ｑ３Ｄ×３）の群（コホート４）では、５匹のうち２匹のマウスがＮＤＣに十分耐容性を示し（＜２０％損失）、体重は３回の用量後に増加し、一方、５匹中３匹のマウスは、３回目の用量後に＞２０％の体重損失を示した。
【0343】
図２８は、それぞれの用量レジメン（即ち、表６からのコホート１～４）で生理食塩水または例示的なＮＤＣで処置したＡＭＬマウスから得られたｉｎ ｖｉｖｏ生体発光画像（ＢＬＩ）を提供する。コホート１～４の定量的ｉｎ ｖｉｖｏ生体発光撮像分析（即ち、表６に概説される各用量レジメンで、生理食塩水または例示的なＮＤＣで処置されたＡＭＬマウス）を、図２９に提示する。生理食塩水群（コホート１）では、白血病負荷が進行し続け、その平均全身ＢＬＩシグナルは、３４日間で＞９０倍に増大し、一方、白血病負荷の迅速な用量依存的抑制は、３つ全ての処置群（コホート２～４）で達成された。０．５ｍｇ／ｋｇ（Ｑ３Ｄ×３）用量群（コホート３）は、白血病注射後１日目の負荷と比較した場合、３４日目に１１分の１の白血病負荷を示した。０．３３ｍｇ／ｋｇ（Ｑ３Ｄ×６）用量群（コホート２）と０．６５ｍｇ／ｋｇ（Ｑ３Ｄ×３）用量群（コホート４）と比較した場合、０．３３ｍｇ／ｋｇは、僅かに良好な応答で、より良好に耐容性を示した。まとめると、これらのデータは、例示的なＮＤＣがＦＲアルファ陽性ＡＭＬマウスにおける白血病負荷を首尾良く抑制したことを示し、迅速で用量依存的な応答を示した。
【0344】
図３０は、白血病注射後４２日目の、コホート１～４（即ち、表６に示される各用量群で、生理食塩水または例示的なＮＤＣで処置したマウス）の骨髄吸引の結果を示すグラフを提供する。白血病は、生理食塩水で処置したマウスの群（コホート１）で検出され、一方、検出可能な白血病負荷は、処置群からのマウス（コホート２～４）のいずれにおいても観察されなかった。
【0345】
（実施例１５）
ジエン由来のリンカーの安定性
ジエン系官能化手法を使用して調製された、本明細書に開示されるＮＤＣの安定性を決定するために、ジエン系官能化手法を使用して調製されたＮＤＣの安定性を、アミン系官能化手法を使用して調製されたＮＤＣと比較した。
ジエン由来のリンカーの安定性
ジエン系官能化手法を使用して調製された、本明細書に開示されるＮＤＣの安定性を決定するために、ジエン系官能化手法を使用して調製されたＮＤＣの安定性を、アミン系官能化手法を使用して調製されたＮＤＣと比較した。
【0346】
ＮＤＣを、０．９％食塩水、ＰＢＳ、ヒト血漿（１０％）、およびマウス血漿（１０％）で、３７℃で、種々の期間にわたり振盪乾燥浴内でインキュベートした。分析前に、等体積の冷アセトニトリルの添加を通して、試料中の血漿タンパク質を沈殿によって除去し、その後、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４２５微量遠心分離機において１００００ｒｐｍで遠心分離した。遠心分離後、透明な上澄みを遠心分離管から透明な完全回収ＨＰＬＣバイアルに移した。目に見えるいかなる凝集もない上澄みを、等体積の脱イオン水で希釈して、ＨＰＬＣ分離の出発条件を満たすようにかつ感度の損失が回避されるように、試料マトリクスを調節した。次いで各試料の純度および不純物を、ＲＰ－ＨＰＬＣにより定量する。
【0347】
ジエン－シラン前駆体を使用して、実施例３に記述された方法を使用して生成された標的化ＮＤＣは、マウスおよびヒト血漿において高い安定性を示し、アミン－シラン前駆体を使用して生成された対応するＮＤＣに対して、安定性の有意な改善を示した（図３３Ａおよび３３Ｂ参照）。ジエン－シラン前駆体を使用して調製されたＮＤＣでは、エキサテカン薬物の９５％よりも多くが、マウスおよびヒト血漿中で最長７日間にわたりＮＤＣ上に残され、これはＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラムでのＮＤＣピークのＵＶ－Ｖｉｓスペクトルによって得られた。一方、遊離エキサテカンをモニタリングする独立したＲＰ－ＨＰＬＣアッセイは、放出されたエキサテカンがＲＰ－ＨＰＬＣの検出限界（即ち０．０２％）未満であることを示唆し、望ましくない遊離薬物の不在はさらに、それらの高い血漿安定性を実証した。標的化ＮＤＣは、０．９％の食塩水中、４℃での高い保存安定性も示した。それらの純度、サイズ分布、および流体力学直径は、ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＳＥＣ、およびＦＣＳによってそれぞれ特徴付けられ、保存条件下では６カ月間にわたり変化しないままであった。そのような高い保存安定性は、臨床への移行および商業的製造の両方に関して重要な、別の重要なパラメーターである。
【0348】
（実施例１６）
薬物動態および毒物学研究
例示的なＮＤＣの薬物動態および毒物学を、ラットモデルでおよびイヌモデルで評価した。この研究で使用したＮＤＣは、実施例１のエキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体化合物２０２を使用して、実施例３に従い調製した。上記実施例で実証されたように、この例示的なＮＤＣは血漿中で非常に安定であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で、様々な細胞系およびＰＤＸ由来の腫瘍モデルで抗腫瘍効力を誘発する。
薬物動態および毒物学研究
例示的なＮＤＣの薬物動態および毒物学を、ラットモデルでおよびイヌモデルで評価した。この研究で使用したＮＤＣは、実施例１のエキサテカン－リンカーコンジュゲート前駆体化合物２０２を使用して、実施例３に従い調製した。上記実施例で実証されたように、この例示的なＮＤＣは血漿中で非常に安定であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で、様々な細胞系およびＰＤＸ由来の腫瘍モデルで抗腫瘍効力を誘発する。
【0349】
Ｗｉｓｔａｒ ＨａｎラットおよびＢｅａｇｌｅ犬で行われた１５日間の反復用量毒物学および毒物動態（ＴＫ）研究では、ＮＤＣは、１時間の輸液を介してＱＷ×３のスケジュールで投与されるとき、コンジュゲートされたエキサテカンの濃度に基づいて、ラットにおいて最大０．８７ｍｇ／ｋｇ／日まで、およびイヌにおいて０．１７４ｍｇ／ｋｇ／日まで耐容性を示した。両方の種に関して観察された用量関連毒性は、骨髄および胃腸管に限定された。これらは、遊離ペイロード（エキサテカン）が投与されたときに観察されたものと同じ臓器であり、ＮＤＣにコンジュゲートされたエキサテカンの送達は、組織毒性プロファイルを広げないことを示唆している。観察された毒性は、２週間の回復期間の終わりまでに、回復されまたは実質的に低減された。薬物関連の肝臓、腎臓、肺、または眼の毒性は観察されず、また反復用量毒性研究において薬物関連死はなかった。
【0350】
１５日間のＧＬＰ研究で推定されるＴＫパラメーターは、ＮＤＣ、総エキサテカン（コンジュゲートされたおよび放出された）、および放出されたエキサテカンに関し、オスおよびメスでの類似の血漿曝露値を明らかにした。ＮＤＣは、ラットにおいて約１５から２０時間に及ぶ、およびイヌにおいて２４から２９時間に及ぶ平均循環半減期を示し、ＮＤＣ、総エキサテカン、または遊離エキサテカンの蓄積は、１日から１５日まで観察されなかった。ＡＵＣ０～ｌａｓｔ（時・ｎｇ／ｍＬ）に基づいて、循環内に放出されたペイロードのレベルは、ラットおよびイヌにおいてそれぞれ、全ペイロードレベルの約０．３％および０．１％未満であった。ＮＤＣ抗薬物抗体は、いずれの種においても誘発されなかった。まとめると、ＮＤＣは、好ましい非臨床的安全性／ＴＫプロファイルを有する。
【0351】
本発明を、特定の好ましい実施形態を参照しながら特に図示し記述してきたが、当業者なら、添付される特許請求の範囲により定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、その形態および詳細の様々な変更を行ってもよいことを理解すべきである。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目１)
（ａ）シリカナノ粒子、および前記ナノ粒子の表面に共有結合されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、
（ｂ）葉酸またはその誘導体もしくは塩を含み、直接またはスペーサー基を経て間接的に前記ナノ粒子に付着された、標的化リガンド、および
（ｃ）リンカー－ペイロードコンジュゲート
を含む、ナノ粒子－薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）であって、
（ｉ）前記ペイロードがエキサテカンであり、
（ｉｉ）前記リンカー－ペイロードコンジュゲートが、スペーサー基を経て前記ナノ粒子に付着され、
（ｉｉｉ）前記リンカーが、プロテアーゼ－切断可能リンカーであり、および
（ｉｖ）前記エキサテカンが、前記リンカーの切断の際に放出される、
ナノ粒子－薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）。
(項目２)
前記ナノ粒子が、シリカ系コアと、前記コアの少なくとも一部分を取り囲むシリカシェルとを含む、項目１に記載のＮＤＣ。
(項目３)
約１ｎｍから約１０ｎｍの間の平均直径を有する、項目１または２に記載のＮＤＣ。
(項目４)
約５ｎｍから約８ｎｍの間の平均直径を有する、前記項目のいずれか一項に記載のＮＤＣ。
(項目５)
前記ナノ粒子のペイロードに対する平均比が、約１：１から約１：８０、例えば約１：６０、約１：４０、約１：３０、約１：２８、約１：２６、約１：２５、約１：２４、約１：２３、約１：２２、約１：２１、約１：２０、約１：１９、または約１：１８である、前記項目のいずれか一項に記載のＮＤＣ。
(項目６)
前記ナノ粒子の標的化リガンドに対する平均比が、約１：１から約１：５０、例えば約１：４０、約１：３０、約１：２５、約１：２０、約１：１５、約１：１４、約１：１３、約１：１２、約１：１１、または約１：１０である、前記項目のいずれか一項に記載のＮＤＣ。
(項目７)
前記ナノ粒子：ペイロード：標的化リガンド（例えば、ナノ粒子：エキサテカン：葉酸）の平均比が、約１：２０：１０、１：２０：１１、１：２０：１２、１：２０：１３、１：２０：１４、１：２０：１５、１：２１：１０、１：２１：１１、１：２１：１２、１：２１：１３、１：２１：１４、１：２１：１５、１：２２：１０、１：２２：１１、１：２２：１２、１：２２：１３、１：２２：１４、１：２２：１５、１：２３：１０、１：２３：１１、１：２３：１２、１：２３：１３、１：２３：１４、１：２３：１５、１：２４：１０、１：２４：１１、１：２４：１２、１：２４：１３、１：２４：１４、１：２４：１５、１：２５：１０、１：２５：１１、１：２５：１２、１：２５：１３、１：２５：１４、または１：２５：１５である、前記項目のいずれか一項に記載のＮＤＣ。
(項目８)
前記ナノ粒子内（例えば、前記ナノ粒子の前記コア内）に共有結合により被包された蛍光化合物を含む、前記項目のいずれか一項に記載のＮＤＣ。
(項目９)
蛍光化合物が、Ｃｙ５およびＣｙ５．５からなる群より選択される、項目７に記載のＮＤＣ。
(項目１０)
式（ＮＰ）：
の構造を含み、
式中、
ｘは０から２０の整数（例えば、４）であり、
ケイ素原子は、前記ナノ粒子の一部であり、および
トリアゾール部分に隣接する
は、直接、あるいは例えばリンカーまたはスペーサー基、例えばＰＥＧ部分を介した間接的な、標的化リガンドまたはペイロード－リンカーコンジュゲートとの付着点を示す、
前記項目のいずれか一項に記載のＮＤＣ。
(項目１１)
式（Ｓ－１）：
の構造を含み、
式中、
ペイロードはエキサテカンであり、
リンカーは、プロテアーゼ切断可能リンカー（例えば、カテプシン－Ｂ切断可能リンカー）であり、および
ケイ素原子は、前記ナノ粒子の一部である、
前記項目のいずれか一項に記載のＮＤＣ。
(項目１２)
式（Ｓ－２）：
の構造を含み、
式中、
標的化リガンドは、葉酸またはその誘導体もしくは塩であり；および
ケイ素原子は、前記ナノ粒子の一部である、
前記項目のいずれか一項に記載のＮＤＣ。
(項目１３)
前記リンカー－ペイロードコンジュゲートが、式（Ｉ）：
の構造またはその塩を含み、
式中、
は、スペーサー基を経た前記ナノ粒子への結合を表し、
Ａは、Ｖａｌ－Ｌｙｓであり、
ペイロードはエキサテカンの残基であり、ここでＺは、エキサテカンの窒素原子であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、出現するごとに、独立して、水素であり、
Ｘは、不在であり、
Ｙは、
であり、ここで
中のカルボニルはＺに結合し、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、それぞれ独立して、－ＣＨ－であり、
Ｚは、－ＮＲｃ－であり、
Ｒｃは、水素であり、および
ｎは１である、
前記項目のいずれか一項に記載のＮＤＣ。
(項目１４)
前記リンカー－ペイロードコンジュゲートが、プロテアーゼ結合の際にＣ末端で加水分解を受けることが可能なプロテアーゼ切断可能リンカーであり、それによって前記ナノ粒子から前記ペイロードを放出する、前記項目のいずれか一項に記載のＮＤＣ。
(項目１５)
前記プロテアーゼが、セリンプロテアーゼまたはシステインプロテアーゼを含む、項目１４に記載のＮＤＣ。
(項目１６)
（ａ）シリカ系コアと、前記コアの少なくとも一部分を取り囲むシリカシェルとを含むナノ粒子；前記ナノ粒子の表面に共有結合されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、および前記ナノ粒子の前記コア内に共有結合により被包されたＣｙ５色素、
（ｂ）葉酸受容体に結合する標的化リガンドであって、前記標的化リガンドは、葉酸でありかつスペーサー基を経て前記ナノ粒子に間接的に付着される、標的化リガンド、
（ｃ）リンカー－ペイロードコンジュゲートであって、スペーサー基を経て間接的に前記ナノ粒子に付着され、
を含む、リンカー－ペイロードコンジュゲート
を含み、約１ｎｍから約６ｎｍの間の平均直径を有する、
ナノ粒子－薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）。
(項目１７)
（ａ）シリカ系コアと、前記コアの少なくとも一部分を取り囲むシリカシェルとを含むシリカナノ粒子；および前記ナノ粒子の表面に共有結合したポリレチレングリコール（ＰＥＧ）、
（ｂ）式（ＮＰ－３）：
の構造であって、
式中、ｘは４であり、ｙは９であり、ケイ素原子は前記ナノ粒子の一部である、構造、ならびに
（ｃ）式（ＮＰ－２）
の構造であって、
式中、ｘは４であり、ｙは３であり、ケイ素原子が前記ナノ粒子の一部である、構造
を含む、ナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）。
(項目１８)
前記ナノ粒子の前記コア内に、共有結合により被包された蛍光色素（例えば、Ｃｙ５）を含む、項目１７に記載のＮＤＣ。
(項目１９)
葉酸受容体発現がん（例えば、葉酸受容体発現腫瘍）を処置する方法であって、有効量の前記項目のいずれか一項に記載のＮＤＣを、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
(項目２０)
前記ＮＤＣが、それを必要とする前記対象に静脈内投与される、項目１９に記載の方法。
(項目２１)
前記対象が、卵巣がん、子宮内膜がん、卵管がん、子宮頸がん、乳がん、肺がん、中皮腫、子宮がん、胃腸がん（例えば、食道がん、結腸がん、直腸がん、および胃がん）、膵臓がん、膀胱がん、腎臓がん、肝臓がん、頭頸部がん、脳がん、甲状腺がん、皮膚がん、前立腺がん、精巣がん、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ、例えば、小児ＡＭＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）からなる群より選択されるがんを有する、項目１９または２０に記載の方法。
(項目２２)
葉酸受容体発現がん（例えば、葉酸受容体発現腫瘍）を処置するための、項目１から１８のいずれか一項に記載のＮＤＣの使用。
(項目２３)
前記ＮＤＣが、それを必要とする対象に静脈内投与される、項目２２に記載の使用。
(項目２４)
前記がんが、卵巣がん、子宮内膜がん、卵管がん、子宮頸がん、乳がん、肺がん、中皮腫、子宮がん、胃腸がん（例えば、食道がん、結腸がん、直腸がん、および胃がん）、膵臓がん、膀胱がん、腎臓がん、肝臓がん、頭頸部がん、脳がん、甲状腺がん、皮膚がん、前立腺がん、精巣がん、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ、例えば、小児ＡＭＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）からなる群より選択される、項目２２または２３に記載の使用。(項目２５)
葉酸受容体発現がん（例えば、葉酸受容体発現腫瘍）を処置するための医薬の製造における使用のための、項目１から１８のいずれか一項に記載のＮＤＣ。
(項目２６)
前記がんが、卵巣がん、子宮内膜がん、卵管がん、子宮頸がん、乳がん、肺がん、中皮腫、子宮がん、胃腸がん（例えば、食道がん、結腸がん、直腸がん、および胃がん）、膵臓がん、膀胱がん、腎臓がん、肝臓がん、頭頸部がん、脳がん、甲状腺がん、皮膚がん、前立腺がん、精巣がん、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ、例えば、小児ＡＭＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）からなる群より選択される、項目２５に記載のＮＤＣ。
(項目２７)
項目１から１８のいずれか一項のＮＤＣと、薬学的に受容可能な賦形剤とを含む、医薬組成物。
(項目２８)
静脈内投与に適している、項目２７に記載の医薬組成物。
(項目２９)
単位剤形にあり、例えばアンプル、プレフィルドシリンジ、輸液容器、または多用量容器内にある、項目２７または２８に記載の医薬組成物。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目１)
（ａ）シリカナノ粒子、および前記ナノ粒子の表面に共有結合されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、
（ｂ）葉酸またはその誘導体もしくは塩を含み、直接またはスペーサー基を経て間接的に前記ナノ粒子に付着された、標的化リガンド、および
（ｃ）リンカー－ペイロードコンジュゲート
を含む、ナノ粒子－薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）であって、
（ｉ）前記ペイロードがエキサテカンであり、
（ｉｉ）前記リンカー－ペイロードコンジュゲートが、スペーサー基を経て前記ナノ粒子に付着され、
（ｉｉｉ）前記リンカーが、プロテアーゼ－切断可能リンカーであり、および
（ｉｖ）前記エキサテカンが、前記リンカーの切断の際に放出される、
ナノ粒子－薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）。
(項目２)
前記ナノ粒子が、シリカ系コアと、前記コアの少なくとも一部分を取り囲むシリカシェルとを含む、項目１に記載のＮＤＣ。
(項目３)
約１ｎｍから約１０ｎｍの間の平均直径を有する、項目１または２に記載のＮＤＣ。
(項目４)
約５ｎｍから約８ｎｍの間の平均直径を有する、前記項目のいずれか一項に記載のＮＤＣ。
(項目５)
前記ナノ粒子のペイロードに対する平均比が、約１：１から約１：８０、例えば約１：６０、約１：４０、約１：３０、約１：２８、約１：２６、約１：２５、約１：２４、約１：２３、約１：２２、約１：２１、約１：２０、約１：１９、または約１：１８である、前記項目のいずれか一項に記載のＮＤＣ。
(項目６)
前記ナノ粒子の標的化リガンドに対する平均比が、約１：１から約１：５０、例えば約１：４０、約１：３０、約１：２５、約１：２０、約１：１５、約１：１４、約１：１３、約１：１２、約１：１１、または約１：１０である、前記項目のいずれか一項に記載のＮＤＣ。
(項目７)
前記ナノ粒子：ペイロード：標的化リガンド（例えば、ナノ粒子：エキサテカン：葉酸）の平均比が、約１：２０：１０、１：２０：１１、１：２０：１２、１：２０：１３、１：２０：１４、１：２０：１５、１：２１：１０、１：２１：１１、１：２１：１２、１：２１：１３、１：２１：１４、１：２１：１５、１：２２：１０、１：２２：１１、１：２２：１２、１：２２：１３、１：２２：１４、１：２２：１５、１：２３：１０、１：２３：１１、１：２３：１２、１：２３：１３、１：２３：１４、１：２３：１５、１：２４：１０、１：２４：１１、１：２４：１２、１：２４：１３、１：２４：１４、１：２４：１５、１：２５：１０、１：２５：１１、１：２５：１２、１：２５：１３、１：２５：１４、または１：２５：１５である、前記項目のいずれか一項に記載のＮＤＣ。
(項目８)
前記ナノ粒子内（例えば、前記ナノ粒子の前記コア内）に共有結合により被包された蛍光化合物を含む、前記項目のいずれか一項に記載のＮＤＣ。
(項目９)
蛍光化合物が、Ｃｙ５およびＣｙ５．５からなる群より選択される、項目７に記載のＮＤＣ。
(項目１０)
式（ＮＰ）：
【化65】
の構造を含み、
式中、
ｘは０から２０の整数（例えば、４）であり、
ケイ素原子は、前記ナノ粒子の一部であり、および
トリアゾール部分に隣接する
【化66】
は、直接、あるいは例えばリンカーまたはスペーサー基、例えばＰＥＧ部分を介した間接的な、標的化リガンドまたはペイロード－リンカーコンジュゲートとの付着点を示す、
前記項目のいずれか一項に記載のＮＤＣ。
(項目１１)
式（Ｓ－１）：
【化67】
の構造を含み、
式中、
ペイロードはエキサテカンであり、
リンカーは、プロテアーゼ切断可能リンカー（例えば、カテプシン－Ｂ切断可能リンカー）であり、および
ケイ素原子は、前記ナノ粒子の一部である、
前記項目のいずれか一項に記載のＮＤＣ。
(項目１２)
式（Ｓ－２）：
【化68】
の構造を含み、
式中、
標的化リガンドは、葉酸またはその誘導体もしくは塩であり；および
ケイ素原子は、前記ナノ粒子の一部である、
前記項目のいずれか一項に記載のＮＤＣ。
(項目１３)
前記リンカー－ペイロードコンジュゲートが、式（Ｉ）：
【化69】
の構造またはその塩を含み、
式中、
【化70】
は、スペーサー基を経た前記ナノ粒子への結合を表し、
Ａは、Ｖａｌ－Ｌｙｓであり、
ペイロードはエキサテカンの残基であり、ここでＺは、エキサテカンの窒素原子であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、出現するごとに、独立して、水素であり、
Ｘは、不在であり、
Ｙは、
【化71】
であり、ここで
【化72】
中のカルボニルはＺに結合し、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、それぞれ独立して、－ＣＨ－であり、
Ｚは、－ＮＲｃ－であり、
Ｒｃは、水素であり、および
ｎは１である、
前記項目のいずれか一項に記載のＮＤＣ。
(項目１４)
前記リンカー－ペイロードコンジュゲートが、プロテアーゼ結合の際にＣ末端で加水分解を受けることが可能なプロテアーゼ切断可能リンカーであり、それによって前記ナノ粒子から前記ペイロードを放出する、前記項目のいずれか一項に記載のＮＤＣ。
(項目１５)
前記プロテアーゼが、セリンプロテアーゼまたはシステインプロテアーゼを含む、項目１４に記載のＮＤＣ。
(項目１６)
（ａ）シリカ系コアと、前記コアの少なくとも一部分を取り囲むシリカシェルとを含むナノ粒子；前記ナノ粒子の表面に共有結合されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、および前記ナノ粒子の前記コア内に共有結合により被包されたＣｙ５色素、
（ｂ）葉酸受容体に結合する標的化リガンドであって、前記標的化リガンドは、葉酸でありかつスペーサー基を経て前記ナノ粒子に間接的に付着される、標的化リガンド、
（ｃ）リンカー－ペイロードコンジュゲートであって、スペーサー基を経て間接的に前記ナノ粒子に付着され、
【化73】
を含む、リンカー－ペイロードコンジュゲート
を含み、約１ｎｍから約６ｎｍの間の平均直径を有する、
ナノ粒子－薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）。
(項目１７)
（ａ）シリカ系コアと、前記コアの少なくとも一部分を取り囲むシリカシェルとを含むシリカナノ粒子；および前記ナノ粒子の表面に共有結合したポリレチレングリコール（ＰＥＧ）、
（ｂ）式（ＮＰ－３）：
【化74】
の構造であって、
式中、ｘは４であり、ｙは９であり、ケイ素原子は前記ナノ粒子の一部である、構造、ならびに
（ｃ）式（ＮＰ－２）
【化75】
の構造であって、
式中、ｘは４であり、ｙは３であり、ケイ素原子が前記ナノ粒子の一部である、構造
を含む、ナノ粒子薬物コンジュゲート（ＮＤＣ）。
(項目１８)
前記ナノ粒子の前記コア内に、共有結合により被包された蛍光色素（例えば、Ｃｙ５）を含む、項目１７に記載のＮＤＣ。
(項目１９)
葉酸受容体発現がん（例えば、葉酸受容体発現腫瘍）を処置する方法であって、有効量の前記項目のいずれか一項に記載のＮＤＣを、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
(項目２０)
前記ＮＤＣが、それを必要とする前記対象に静脈内投与される、項目１９に記載の方法。
(項目２１)
前記対象が、卵巣がん、子宮内膜がん、卵管がん、子宮頸がん、乳がん、肺がん、中皮腫、子宮がん、胃腸がん（例えば、食道がん、結腸がん、直腸がん、および胃がん）、膵臓がん、膀胱がん、腎臓がん、肝臓がん、頭頸部がん、脳がん、甲状腺がん、皮膚がん、前立腺がん、精巣がん、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ、例えば、小児ＡＭＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）からなる群より選択されるがんを有する、項目１９または２０に記載の方法。
(項目２２)
葉酸受容体発現がん（例えば、葉酸受容体発現腫瘍）を処置するための、項目１から１８のいずれか一項に記載のＮＤＣの使用。
(項目２３)
前記ＮＤＣが、それを必要とする対象に静脈内投与される、項目２２に記載の使用。
(項目２４)
前記がんが、卵巣がん、子宮内膜がん、卵管がん、子宮頸がん、乳がん、肺がん、中皮腫、子宮がん、胃腸がん（例えば、食道がん、結腸がん、直腸がん、および胃がん）、膵臓がん、膀胱がん、腎臓がん、肝臓がん、頭頸部がん、脳がん、甲状腺がん、皮膚がん、前立腺がん、精巣がん、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ、例えば、小児ＡＭＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）からなる群より選択される、項目２２または２３に記載の使用。(項目２５)
葉酸受容体発現がん（例えば、葉酸受容体発現腫瘍）を処置するための医薬の製造における使用のための、項目１から１８のいずれか一項に記載のＮＤＣ。
(項目２６)
前記がんが、卵巣がん、子宮内膜がん、卵管がん、子宮頸がん、乳がん、肺がん、中皮腫、子宮がん、胃腸がん（例えば、食道がん、結腸がん、直腸がん、および胃がん）、膵臓がん、膀胱がん、腎臓がん、肝臓がん、頭頸部がん、脳がん、甲状腺がん、皮膚がん、前立腺がん、精巣がん、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ、例えば、小児ＡＭＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）からなる群より選択される、項目２５に記載のＮＤＣ。
(項目２７)
項目１から１８のいずれか一項のＮＤＣと、薬学的に受容可能な賦形剤とを含む、医薬組成物。
(項目２８)
静脈内投与に適している、項目２７に記載の医薬組成物。
(項目２９)
単位剤形にあり、例えばアンプル、プレフィルドシリンジ、輸液容器、または多用量容器内にある、項目２７または２８に記載の医薬組成物。
【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14-1】
【図14-2】
【図15-1】
【図15-2】
【図16-1】
【図16-2】
【図17】
【図18】
【図19-1】
【図19-2】
【図20-1】
【図20-2】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【配列表】
【外国語明細書】