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特開2023-134604ＦｃＲｎに対する増大した親和性および少なくとも１つのＦｃフラグメント受容体に対する増大した親和性を有するＦｃフラグメントを伴う変異体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2023134604
(43)【公開日】2023-09-27
(54)【発明の名称】ＦｃＲｎに対する増大した親和性および少なくとも１つのＦｃフラグメント受容体に対する増大した親和性を有するＦｃフラグメントを伴う変異体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/00 20060101AFI20230920BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20230920BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20230920BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20230920BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230920BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20230920BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230920BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230920BHJP
C07K 14/735 20060101ALN20230920BHJP
【ＦＩ】
C07K16/00 ZNA
C12N15/13
A61P7/00
A61P27/02
A61P25/00
A61P37/02
A61P29/00
A61K39/395 D
A61K39/395 N
C07K14/735
【審査請求】有
【請求項の数】21
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023113380
(22)【出願日】2023-07-11
(62)【分割の表示】P 2020532813の分割
【原出願日】2018-12-14
(31)【優先権主張番号】1762217
(32)【優先日】2017-12-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】504177572
【氏名又は名称】ラボラトワール フランセ デュ フラクシオヌマン エ デ ビオテクノロジ
【氏名又は名称原語表記】ＬＡＢＯＲＡＴＯＩＲＥ ＦＲＡＮＣＡＩＳ ＤＵ ＦＲＡＣＴＩＯＮＮＥＭＥＮＴ ＥＴ ＤＥＳ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ
(74)【代理人】
【識別番号】100080447
【弁理士】
【氏名又は名称】太田 恵一
(72)【発明者】
【氏名】ミード，ハリー
(72)【発明者】
【氏名】モネ，セリーヌ
(72)【発明者】
【氏名】モンドン，フィリップ
(57)【要約】 （修正有）
【課題】Ｆｃ領域により媒介される機能的活性に関して最適化された特性を有する親ポリペプチドの変異体を提供する。
【解決手段】Ｆｃフラグメントを含む親ポリペプチドの変異体において、親ポリペプチドの親和性と比べ、ＦｃＲｎ受容体に対する増大した親和性、ならびにＦｃγＲＩ受容体（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩａ受容体（ＣＤ３２ａ）の中から選択された少なくとも１つのＦｃフラグメントの受容体（ＦｃＲ）に対する増大した親和性を有する変異体であって、（ｉ）４つの突然変異３３４Ｎ、３５２Ｓ、３７８Ｖおよび３９７Ｍと、（ｉｉ）４３４Ｙ、４３４Ｓ、２２６Ｇ、Ｐ２２８Ｌ、Ｐ２２８Ｒ、２３０Ｓ、２３０Ｔ、２３０Ｌ、２４１Ｌ、２６４Ｅ、３０７Ｐ、３１５Ｄ、３３０Ｖ、３６２Ｒ、３８９Ｔおよび３８９Ｋの中から選択された少なくとも１つの突然変異を含む、変異体に関する。
【選択図】なし
【解決手段】Ｆｃフラグメントを含む親ポリペプチドの変異体において、親ポリペプチドの親和性と比べ、ＦｃＲｎ受容体に対する増大した親和性、ならびにＦｃγＲＩ受容体（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩａ受容体（ＣＤ３２ａ）の中から選択された少なくとも１つのＦｃフラグメントの受容体（ＦｃＲ）に対する増大した親和性を有する変異体であって、（ｉ）４つの突然変異３３４Ｎ、３５２Ｓ、３７８Ｖおよび３９７Ｍと、（ｉｉ）４３４Ｙ、４３４Ｓ、２２６Ｇ、Ｐ２２８Ｌ、Ｐ２２８Ｒ、２３０Ｓ、２３０Ｔ、２３０Ｌ、２４１Ｌ、２６４Ｅ、３０７Ｐ、３１５Ｄ、３３０Ｖ、３６２Ｒ、３８９Ｔおよび３８９Ｋの中から選択された少なくとも１つの突然変異を含む、変異体に関する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｆｃフラグメントを含む親ポリペプチドの変異体において、親ポリペプチドの親和性と比べ、ＦｃＲｎ受容体に対する増大した親和性、ならびにＦｃγＲＩ受容体（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩａ受容体（ＣＤ３２ａ）の中から選択された少なくとも１つのＦｃフラグメントの受容体（ＦｃＲ）に対する増大した親和性を有する変異体であって、
（ｉ）４つの突然変異３３４Ｎ、３５２Ｓ、３７８Ｖおよび３９７Ｍと、
（ｉｉ）４３４Ｙ ４３４Ｓ、２２６Ｇ、Ｐ２２８Ｌ、Ｐ２２８Ｒ、２３０Ｓ、２３０Ｔ、２３０Ｌ、２４１Ｌ、２６４Ｅ、３０７Ｐ、３１５Ｄ、３３０Ｖ、３６２Ｒ、３８９Ｔおよび３８９Ｋの中から選択された少なくとも１つの突然変異と
を含み、
付番がＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番であること、
を特徴とする変異体。
（ｉ）４つの突然変異３３４Ｎ、３５２Ｓ、３７８Ｖおよび３９７Ｍと、
（ｉｉ）４３４Ｙ ４３４Ｓ、２２６Ｇ、Ｐ２２８Ｌ、Ｐ２２８Ｒ、２３０Ｓ、２３０Ｔ、２３０Ｌ、２４１Ｌ、２６４Ｅ、３０７Ｐ、３１５Ｄ、３３０Ｖ、３６２Ｒ、３８９Ｔおよび３８９Ｋの中から選択された少なくとも１つの突然変異と
を含み、
付番がＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番であること、
を特徴とする変異体。
【請求項2】
Ｙ２９６Ｗ、Ｋ２９０Ｇ、Ｖ２４０Ｈ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２４０Ｍ、Ｖ２４０Ｎ、Ｖ２４０Ｓ、Ｆ２４１Ｈ、Ｆ２４１Ｙ、Ｌ２４２Ａ、Ｌ２４２Ｆ、Ｌ２４２Ｇ、Ｌ２４２Ｈ、Ｌ２４２Ｉ、Ｌ２４２Ｋ、Ｌ２４２Ｐ、Ｌ２４２Ｓ、Ｌ２４２Ｔ、Ｌ２４２Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｓ、Ｅ２５８Ｇ、Ｅ２５８Ｉ、Ｅ２５８Ｒ、Ｅ２５８Ｍ、Ｅ２５８Ｑ、Ｅ２５８Ｙ、Ｖ２５９Ｃ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ２５９Ｌ、Ｔ２６０Ａ、Ｔ２６０Ｈ、Ｔ２６０Ｉ、Ｔ２６０Ｍ、Ｔ２６０Ｎ、Ｔ２６０Ｒ、Ｔ２６０Ｓ、Ｔ２６０Ｗ、Ｖ２６２Ｓ、Ｖ２６３Ｔ、Ｖ２６４Ｌ、Ｖ２６４Ｓ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６６Ｌ、Ｓ２６７Ａ、Ｓ２６７Ｑ、Ｓ２６７Ｖ、Ｋ２９０Ｄ、Ｋ２９０Ｅ、Ｋ２９０Ｈ、Ｋ２９０Ｌ、Ｋ２９０Ｎ、Ｋ２９０Ｑ、Ｋ２９０Ｒ、Ｋ２９０Ｓ、Ｋ２９０Ｙ、Ｐ２９１Ｇ、Ｐ２９１Ｑ、Ｐ２９１Ｒ、Ｒ２９２Ｉ、Ｒ２９２Ｌ、Ｅ２９３Ａ、Ｅ２９３Ｄ、Ｅ２９３Ｇ、Ｅ２９３Ｍ、Ｅ２９３Ｑ、Ｅ２９３Ｓ、Ｅ２９３Ｔ、Ｅ２９４Ａ、Ｅ２９４Ｇ、Ｅ２９４Ｐ、Ｅ２９４Ｑ、Ｅ２９４Ｒ、Ｅ２９４Ｔ、Ｅ２９４Ｖ、Ｑ２９５Ｉ、Ｑ２９５Ｍ、Ｙ２９６Ｈ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｒ、Ｙ３００Ｉ、Ｙ３００Ｖ、Ｙ３００Ｗ、Ｒ３０１Ａ、Ｒ３０１Ｍ、Ｒ３０１Ｐ、Ｒ３０１Ｓ、Ｖ３０２Ｆ、Ｖ３０２Ｌ、Ｖ３０２Ｍ、Ｖ３０２Ｒ、Ｖ３０２Ｓ、Ｖ３０３Ｓ、Ｖ３０３Ｙ、Ｓ３０４Ｔ、Ｖ３０５Ａ、Ｖ３０５Ｆ、Ｖ３０５Ｉ、Ｖ３０５Ｌ、Ｖ３０５ＲおよびＶ３０５Ｓの中から選択されたＦｃフラグメント内の少なくとも１つの突然変異（ｉｉｉ）をさらに含み、
付番がＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番である、請求項１に記載の変異体。
付番がＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番である、請求項１に記載の変異体。
【請求項3】
（ｉ）４つの突然変異３３４Ｎ、３５２Ｓ、３７８Ｖおよび３９７Ｍと、
（ｉｉ）４３４Ｙ ４３４Ｓ、２２６Ｇ、Ｐ２２８Ｌ、Ｐ２２８Ｒ、２３０Ｓ、２３０Ｔ、２３０Ｌ、２４１Ｌ、２６４Ｅ、３０７Ｐ、３１５Ｄ、３３０Ｖ、３６２Ｒ、３８９Ｔおよび３８９Ｋの中から選択された少なくとも１つの突然変異と、
（ｉｉｉ）Ｋ２９０ＧおよびＹ２９６Ｗの中から選択された少なくとも１つの突然変異と
を含み、
付番がＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番であること、
を特徴とする、請求項１または２に記載の変異体。
（ｉｉ）４３４Ｙ ４３４Ｓ、２２６Ｇ、Ｐ２２８Ｌ、Ｐ２２８Ｒ、２３０Ｓ、２３０Ｔ、２３０Ｌ、２４１Ｌ、２６４Ｅ、３０７Ｐ、３１５Ｄ、３３０Ｖ、３６２Ｒ、３８９Ｔおよび３８９Ｋの中から選択された少なくとも１つの突然変異と、
（ｉｉｉ）Ｋ２９０ＧおよびＹ２９６Ｗの中から選択された少なくとも１つの突然変異と
を含み、
付番がＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番であること、
を特徴とする、請求項１または２に記載の変異体。
【請求項4】
親ポリペプチドの親和性に比べ、少なくとも２の比率に等しい、好ましくは５超、好ましくは１０超、好ましくは１５超、好ましくは２０超、好ましくは２５超、好ましくは３０超の比率で増大した、ＦｃＲｎ受容体に対する親和性を有する、請求項１から３のいずれか一つに記載の変異体。
【請求項5】
親ポリペプチドの親和性に比べ、少なくとも２の比率に等しい、好ましくは５超、好ましくは１０超、好ましくは１５超、好ましくは２０超、好ましくは２５超、好ましくは３０超の比率で増大した、ＦｃγＲＩ受容体（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩａ受容体（ＩＣ３２ａ）の中から選択された少なくとも１つのＦｃフラグメントの受容体（ＦｃＲ）に対する親和性を有する、請求項１から４のいずれか一つに記載の変異体。
【請求項6】
トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞内で産生されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一つに記載の変異体。
【請求項7】
非ヒトトランスジェニック動物において、好ましくは、トランスジェニック非ヒト哺乳動物において産生されることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一つに記載の変異体。
【請求項8】
非ヒトトランスジェニック動物がトランスジェニックヤギであることを特徴とする、請求項７に記載の変異体。
【請求項9】
親ポリペプチドが、ヒトＦｃフラグメント、好ましくはヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ２のＦｃフラグメントであるか、より優先的には配列番号１～１０および１４の配列の中から選択される親Ｆｃフラグメントを含むことを特徴とする、請求項１から８のいずれか一つに記載の変異体。
【請求項10】
単離Ｆｃフラグメント、単離Ｆｃフラグメントから誘導された配列、抗体、Ｆｃフラグメントを含む抗体フラグメント、およびＦｃフラグメントを含む融合タンパク質の中から選択されることを特徴とする、請求項１から９のいずれか一つに記載の変異体。
【請求項11】
腫瘍抗原、ウィルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、毒素、膜サイトカインまたは循環サイトカイン、膜受容体の中から選択された抗原に対して向けられた、請求項１から１０のいずれか一つに記載の変異体。
【請求項12】
薬剤として使用するための請求項１から１１のいずれか一つに記載の変異体。
【請求項13】
好ましくは、免疫性血小板減少性紫斑病、視神経脊髄炎またはデビック病および多発性硬化症の中から選択された、自己免疫性または炎症性病理の治療において使用するための、請求項１から１１のいずれか一つに記載の変異体。
【請求項14】
請求項１から１３のいずれか一つに記載の変異体、および医薬的に許容可能な少なくとも１つの賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項15】
Ｆｃフラグメントを含む親ポリペプチドの変異体の産生方法において、前記変異体が親ポリペプチドの親和性と比べ、ＦｃＲｎ受容体に対する増大した親和性、ならびにＦｃγＲＩ受容体（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩａ受容体（ＣＤ３２ａ）の中から選択された少なくとも１つのＦｃフラグメントの受容体（ＦｃＲ）に対する増大した親和性を有し、
（ｉ）４つの突然変異３３４Ｎ、３５２Ｓ、３７８Ｖおよび３９７Ｍと、
（ｉｉ）４３４Ｙ ４３４Ｓ、２２６Ｇ、Ｐ２２８Ｌ、Ｐ２２８Ｒ、２３０Ｓ、２３０Ｔ、２３０Ｌ、２４１Ｌ、２６４Ｅ、３０７Ｐ、３１５Ｄ、３３０Ｖ、３６２Ｒ、３８９Ｔおよび３８９Ｋの中から選択された少なくとも１つの突然変異と、
を含み、
付番がＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番であること、を特徴とし、
トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞内での前記変異体の発現を含むか、または
培養中の哺乳動物細胞内での前記変異体の発現を含む、
方法。
（ｉ）４つの突然変異３３４Ｎ、３５２Ｓ、３７８Ｖおよび３９７Ｍと、
（ｉｉ）４３４Ｙ ４３４Ｓ、２２６Ｇ、Ｐ２２８Ｌ、Ｐ２２８Ｒ、２３０Ｓ、２３０Ｔ、２３０Ｌ、２４１Ｌ、２６４Ｅ、３０７Ｐ、３１５Ｄ、３３０Ｖ、３６２Ｒ、３８９Ｔおよび３８９Ｋの中から選択された少なくとも１つの突然変異と、
を含み、
付番がＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番であること、を特徴とし、
トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞内での前記変異体の発現を含むか、または
培養中の哺乳動物細胞内での前記変異体の発現を含む、
方法。
【請求項16】
前記変異体が、Ｙ２９６Ｗ、Ｋ２９０Ｇ、Ｖ２４０Ｈ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２４０Ｍ、Ｖ２４０Ｎ、Ｖ２４０Ｓ、Ｆ２４１Ｈ、Ｆ２４１Ｙ、Ｌ２４２Ａ、Ｌ２４２Ｆ、Ｌ２４２Ｇ、Ｌ２４２Ｈ、Ｌ２４２Ｉ、Ｌ２４２Ｋ、Ｌ２４２Ｐ、Ｌ２４２Ｓ、Ｌ２４２Ｔ、Ｌ２４２Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｓ、Ｅ２５８Ｇ、Ｅ２５８Ｉ、Ｅ２５８Ｒ、Ｅ２５８Ｍ、Ｅ２５８Ｑ、Ｅ２５８Ｙ、Ｖ２５９Ｃ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ２５９Ｌ、Ｔ２６０Ａ、Ｔ２６０Ｈ、Ｔ２６０Ｉ、Ｔ２６０Ｍ、Ｔ２６０Ｎ、Ｔ２６０Ｒ、Ｔ２６０Ｓ、Ｔ２６０Ｗ、Ｖ２６２Ｓ、Ｖ２６３Ｔ、Ｖ２６４Ｌ、Ｖ２６４Ｓ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６６Ｌ、Ｓ２６７Ａ、Ｓ２６７Ｑ、Ｓ２６７Ｖ、Ｋ２９０Ｄ、Ｋ２９０Ｅ、Ｋ２９０Ｈ、Ｋ２９０Ｌ、Ｋ２９０Ｎ、Ｋ２９０Ｑ、Ｋ２９０Ｒ、Ｋ２９０Ｓ、Ｋ２９０Ｙ、Ｐ２９１Ｇ、Ｐ２９１Ｑ、Ｐ２９１Ｒ、Ｒ２９２Ｉ、Ｒ２９２Ｌ、Ｅ２９３Ａ、Ｅ２９３Ｄ、Ｅ２９３Ｇ、Ｅ２９３Ｍ、Ｅ２９３Ｑ、Ｅ２９３Ｓ、Ｅ２９３Ｔ、Ｅ２９４Ａ、Ｅ２９４Ｇ、Ｅ２９４Ｐ、Ｅ２９４Ｑ、Ｅ２９４Ｒ、Ｅ２９４Ｔ、Ｅ２９４Ｖ、Ｑ２９５Ｉ、Ｑ２９５Ｍ、Ｙ２９６Ｈ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｒ、Ｙ３００Ｉ、Ｙ３００Ｖ、Ｙ３００Ｗ、Ｒ３０１Ａ、Ｒ３０１Ｍ、Ｒ３０１Ｐ、Ｒ３０１Ｓ、Ｖ３０２Ｆ、Ｖ３０２Ｌ、Ｖ３０２Ｍ、Ｖ３０２Ｒ、Ｖ３０２Ｓ、Ｖ３０３Ｓ、Ｖ３０３Ｙ、Ｓ３０４Ｔ、Ｖ３０５Ａ、Ｖ３０５Ｆ、Ｖ３０５Ｉ、Ｖ３０５Ｌ、Ｖ３０５ＲおよびＶ３０５Ｓの中から選択されたＦｃフラグメント内の少なくとも１つの突然変異（ｉｉｉ）をさらに含み、
付番がＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番であること、
を特徴とする、請求項１５に記載のＦｃフラグメントを含む親ポリペプチドの変異体の産生方法。
付番がＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番であること、
を特徴とする、請求項１５に記載のＦｃフラグメントを含む親ポリペプチドの変異体の産生方法。
【請求項17】
ａ）変異体についてコードする配列、哺乳動物のカゼインプロモーターまたは哺乳動物の乳清プロモーターについてコードする配列、および前記変異体の分泌を可能にするシグナルペプチドについてコードする配列を含むＤＮＡ配列を調製するステップと、
ｂ）ａ）で得たＤＮＡ配列を非ヒト哺乳動物の胚中に導入して、乳腺内でａ）において得られた前記ＤＮＡ配列によりコードされた変異体を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得るステップと、および
ｃ）ｂ）で得られたトランスジェニック非ヒト哺乳動物によって産生された乳中の変異体を回収するステップと
を含む、請求項１５または１６に記載のＦｃフラグメントを含むポリペプチドの変異体の産生方法。
ｂ）ａ）で得たＤＮＡ配列を非ヒト哺乳動物の胚中に導入して、乳腺内でａ）において得られた前記ＤＮＡ配列によりコードされた変異体を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得るステップと、および
ｃ）ｂ）で得られたトランスジェニック非ヒト哺乳動物によって産生された乳中の変異体を回収するステップと
を含む、請求項１５または１６に記載のＦｃフラグメントを含むポリペプチドの変異体の産生方法。
【請求項18】
トランスジェニック非ヒト哺乳動物が、ウシ類、ブタ類、ヤギ類、ヒツジ類、およびゲッ歯類の中から、好ましくはヤギ、マウス、雌ブタ、雌ウサギ、雌ヒツジおよび雌ウシの中から選択される、請求項１５から１７のいずれか一つに記載のＦｃフラグメントを含むポリペプチドの変異体の産生方法。
【請求項19】
ａ）変異体についてコードするＤＮＡ配列を調製するステップと、
ｂ）過渡的または安定的に、培養中の哺乳動物細胞内にａ）で得たＤＮＡ配列を導入するステップと、
ｃ）ｂ）で得た細胞から変異体を発現するステップと、そして
ｄ）培地内で変異体を回収するステップと
を含む、請求項１５または１６に記載のＦｃフラグメントを含むポリペプチドの変異体の産生方法。
ｂ）過渡的または安定的に、培養中の哺乳動物細胞内にａ）で得たＤＮＡ配列を導入するステップと、
ｃ）ｂ）で得た細胞から変異体を発現するステップと、そして
ｄ）培地内で変異体を回収するステップと
を含む、請求項１５または１６に記載のＦｃフラグメントを含むポリペプチドの変異体の産生方法。
【請求項20】
Ｆｃフラグメントを含む親ポリペプチドの変異体をコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列において、前記変異体が、親ポリペプチドの親和性と比べ、ＦｃＲｎ受容体に対する増大した親和性、ならびにＦｃγＲＩ受容体（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩａ受容体（ＣＤ３２ａ）の中から選択された少なくとも１つのＦｃフラグメントの受容体（ＦｃＲ）に対する増大した親和性を有し、
（ｉ）４つの突然変異３３４Ｎ、３５２Ｓ、３７８Ｖおよび３９７Ｍと、
（ｉｉ）４３４Ｙ ４３４Ｓ、２２６Ｇ、Ｐ２２８Ｌ、Ｐ２２８Ｒ、２３０Ｓ、２３０Ｔ、２３０Ｌ、２４１Ｌ、２６４Ｅ、３０７Ｐ、３１５Ｄ、３３０Ｖ、３６２Ｒ、３８９Ｔおよび３８９Ｋの中から選択された少なくとも１つの突然変異と
を含み、
付番がＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番であること、を特徴とし、
任意には、前記変異体の分泌を可能にするシグナルペプチドについてコードする配列を含むＤＮＡ配列。
（ｉ）４つの突然変異３３４Ｎ、３５２Ｓ、３７８Ｖおよび３９７Ｍと、
（ｉｉ）４３４Ｙ ４３４Ｓ、２２６Ｇ、Ｐ２２８Ｌ、Ｐ２２８Ｒ、２３０Ｓ、２３０Ｔ、２３０Ｌ、２４１Ｌ、２６４Ｅ、３０７Ｐ、３１５Ｄ、３３０Ｖ、３６２Ｒ、３８９Ｔおよび３８９Ｋの中から選択された少なくとも１つの突然変異と
を含み、
付番がＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番であること、を特徴とし、
任意には、前記変異体の分泌を可能にするシグナルペプチドについてコードする配列を含むＤＮＡ配列。
【請求項21】
前記変異体がＹ２９６Ｗ、Ｋ２９０Ｇ、Ｖ２４０Ｈ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２４０Ｍ、Ｖ２４０Ｎ、Ｖ２４０Ｓ、Ｆ２４１Ｈ、Ｆ２４１Ｙ、Ｌ２４２Ａ、Ｌ２４２Ｆ、Ｌ２４２Ｇ、Ｌ２４２Ｈ、Ｌ２４２Ｉ、Ｌ２４２Ｋ、Ｌ２４２Ｐ、Ｌ２４２Ｓ、Ｌ２４２Ｔ、Ｌ２４２Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｓ、Ｅ２５８Ｇ、Ｅ２５８Ｉ、Ｅ２５８Ｒ、Ｅ２５８Ｍ、Ｅ２５８Ｑ、Ｅ２５８Ｙ、Ｖ２５９Ｃ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ２５９Ｌ、Ｔ２６０Ａ、Ｔ２６０Ｈ、Ｔ２６０Ｉ、Ｔ２６０Ｍ、Ｔ２６０Ｎ、Ｔ２６０Ｒ、Ｔ２６０Ｓ、Ｔ２６０Ｗ、Ｖ２６２Ｓ、Ｖ２６３Ｔ、Ｖ２６４Ｌ、Ｖ２６４Ｓ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６６Ｌ、Ｓ２６７Ａ、Ｓ２６７Ｑ、Ｓ２６７Ｖ、Ｋ２９０Ｄ、Ｋ２９０Ｅ、Ｋ２９０Ｈ、Ｋ２９０Ｌ、Ｋ２９０Ｎ、Ｋ２９０Ｑ、Ｋ２９０Ｒ、Ｋ２９０Ｓ、Ｋ２９０Ｙ、Ｐ２９１Ｇ、Ｐ２９１Ｑ、Ｐ２９１Ｒ、Ｒ２９２Ｉ、Ｒ２９２Ｌ、Ｅ２９３Ａ、Ｅ２９３Ｄ、Ｅ２９３Ｇ、Ｅ２９３Ｍ、Ｅ２９３Ｑ、Ｅ２９３Ｓ、Ｅ２９３Ｔ、Ｅ２９４Ａ、Ｅ２９４Ｇ、Ｅ２９４Ｐ、Ｅ２９４Ｑ、Ｅ２９４Ｒ、Ｅ２９４Ｔ、Ｅ２９４Ｖ、Ｑ２９５Ｉ、Ｑ２９５Ｍ、Ｙ２９６Ｈ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｒ、Ｙ３００Ｉ、Ｙ３００Ｖ、Ｙ３００Ｗ、Ｒ３０１Ａ、Ｒ３０１Ｍ、Ｒ３０１Ｐ、Ｒ３０１Ｓ、Ｖ３０２Ｆ、Ｖ３０２Ｌ、Ｖ３０２Ｍ、Ｖ３０２Ｒ、Ｖ３０２Ｓ、Ｖ３０３Ｓ、Ｖ３０３Ｙ、Ｓ３０４Ｔ、Ｖ３０５Ａ、Ｖ３０５Ｆ、Ｖ３０５Ｉ、Ｖ３０５Ｌ、Ｖ３０５ＲおよびＶ３０５Ｓの中から選択されたＦｃフラグメント内の少なくとも１つの突然変異（ｉｉｉ）をさらに含み、
付番がＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番である、請求項２０に記載のＦｃフラグメントを含む親ポリペプチドの変異体をコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列。
付番がＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番である、請求項２０に記載のＦｃフラグメントを含む親ポリペプチドの変異体をコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、親ポリペプチドと比べ、ＦｃＲｎ受容体に対する増大した親和性ならびに少なくとも１つのＦｃフラグメント受容体（ＦｃＲ）に対する増大した親和性を有する、突然変異したＦｃ領域を含むポリペプチド（変異体とも呼ばれる）に関する。
【背景技術】
【0002】
抗体は、重鎖と軽鎖の四量体で構成される。２つの軽鎖は互いに同一であり、２つの重鎖は同一で、ジスルフィド架橋により連結されている。免疫グロブリンクラス（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ）を決定する５タイプの重鎖（アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、ミュー）が存在する。軽鎖の群には、ラムダおよびカッパの２つのサブタイプが含まれる。
【0003】
ＩｇＧは、血液および他の体液中に見出すことのできる可溶性抗体である。ＩｇＧは、２つの重鎖と２つの軽鎖で構成された、１５０ｋＤａの近似的分子量を有するＹ字糖タンパク質である。各鎖は、定常領域と可変領域に区別される。重鎖の２つのカルボキシ末端ドメインはＦｃフラグメントを形成し、一方、重鎖および軽鎖のアミノ末端ドメインは抗原を認識し、Ｆａｂフラグメントと命名される。
【0004】
Ｆｃ融合タンパク質は、抗体のＦｃフラグメントと、所与の治療標的に対する特異性を提供するタンパク質ドメインとの組合せによって創出される。例としては、あらゆるタイプの治療用タンパク質またはそれらのフラグメントとＦｃフラグメントの組合せがある。
【0005】
Ｆｃポリペプチド、特にＦｃフラグメント、治療用抗体およびＦｃ融合タンパク質は、今日、リウマチ性多発性関節炎、乾癬、多発性硬化症および多くの形態の癌といったさまざまな疾病を治療するために使用されている。治療用抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体は、唯一の抗原に対して同一の特異性を示す、単一の抗体産生細胞系統から得られる。治療用Ｆｃ融合タンパク質は、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ ｄ’Ａｍｇｅｎ、これはＦｃフラグメントに結合されたＴＮＦ受容体である）またはアレファセプト（Ａｍｅｖｉｖｅ ｄｅ Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ、これはヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に結合されたＬＦＡ－３である）のように、炎症性要素を有しかつ／または自己免疫性の疾患に対する薬剤として使用または開発されている。
【0006】
Ｆｃフラグメント、Ｆｃ抗体および融合タンパク質などのＦｃポリペプチドは、特に、その受容体すなわちＦｃＲｎおよびＦｃフラグメント受容体（ＦｃＲ）、例えばＦｃγＲＩ受容体（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩａ受容体（ＣＤ３２ａ）などに対する、そのＦｃ部分の結合に依存する活性を有する。
【0007】
ＦｃポリペプチドとＦｃフラグメント受容体（ＦｃＲ）の相互作用を介入させる療法において求められる効果の１つは、エフェクター細胞の表面に存在するＦｃ受容体に対する結合による免疫系の活性化の阻害である。特に、自己抗体および／またはサイトカインが関与する炎症性および／または自己免疫性疾患の治療の一環として、Ｆｃフラグメントに基づく療法は、Ｆｃ受容体の遮断によって、したがってこれらの受容体へのアクセスのための自己抗体との競合によって作用し得る。これにより、通常自己抗体によって媒介される直接的活性（例えば抗体依存性細胞毒性、補体依存性細胞毒性または抗体依存性細胞食作用）の阻害、および免疫系の活性化、特にサイトカイン放出の減少がひき起こされる。その上、ＦｃＲｎ受容体は抗体のリサイクリングに関与することから、Ｆｃポリペプチドによるこれらの遮断は、自己抗体のより急速な除去を可能にし、こうしてその半減期の短縮がひき起こされる。このような理由から、Ｆｃフラグメントに基づく治療は、免疫系の細胞の無制御刺激によって、特に自己抗体および／またはサイトカインによってひき起こされた自己免疫および／または炎症性疾患にとりわけ適応している。
【0008】
これらの疾患の治療のために提案されている基本的療法は、ヒトの血漿の献血プールに由来する免疫グロブリン（最も多くはＩｇＧ）を静脈内投与により患者に投与することからなる静脈内免疫グロブリン（ＩｇＩＶ）に基づく療法である。これらのＩｇＩＶは特にＦｃ受容体を遮断し、こうしてこれらの受容体へのアクセスのために自己抗体との競合に入ることにより作用する、ということが一般に認められている。より最近では、Ｆｃフラグメントは、Ｆｃ受容体に対するその結合特性を修飾する目的で開発されてきた。しかしながら、その効能については、今後の実証が待たれる。
【0009】
特にその半減期時間および／またはその治療効能を増大させるように、これらのＦｃフラグメントを最適化する必要性が、なおも存在する。
【0010】
出願人は今や、特に、改善されたＦｃＲｎに対する結合親和性によって、改善された活性を有する特殊なＦｃフラグメントを開発した。これらのＦｃフラグメントは、療法において使用することができ、特に、それらを含有する製品に、より優れた効能をもたらす目的で、炎症性および／または自己免疫性の疾患の治療に特に適応している。
【0011】
詳細には、これらのフラグメントは、免疫系の細胞上に存在するＦｃ受容体のより効果的な遮断を提示することができ、このときこれらのＦｃ受容体は、その時点で活性が阻害されている自己抗体の結合のためのアクセス性が低くなっているか、またはもはやアクセス不可能である。
【0012】
その上、ＦｃフラグメントはＦｃＲｎ受容体をより効果的に遮断することができ、こうして自己抗体をより急速に除去することを可能にする。
【0013】
さらに、これらの特殊なＦｃフラグメントのいくつかは、実施例で実証される通り、ＩｇＩＶよりも優れた補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）の阻害を提示する。したがって、これらのＦｃフラグメントは、炎症性および／または自己免疫性の疾患に関与するものなどの病原性自己抗体の毒性を減少させることができると考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0014】
したがって本発明は、Ｆｃ領域により媒介される機能的活性に関して最適化された特性を有する親ポリペプチドの変異体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0015】
したがって本発明は、Ｆｃフラグメントを含む親ポリペプチドの変異体において、親ポリペプチドの親和性と比べ、ＦｃＲｎ受容体に対する増大した親和性、ならびにＦｃγＲＩ受容体（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩａ受容体（ＣＤ３２ａ）の中から選択された少なくとも１つのＦｃフラグメントの受容体（ＦｃＲ）に対する増大した親和性を有する変異体であって、
（ｉ）４つの突然変異３３４Ｎ、３５２Ｓ、３７８Ｖおよび３９７Ｍと、
（ｉｉ）４３４Ｙ、４３４Ｓ、２２６Ｇ、Ｐ２２８Ｌ、Ｐ２２８Ｒ、２３０Ｓ、２３０Ｔ、２３０Ｌ、２４１Ｌ、２６４Ｅ、３０７Ｐ、３１５Ｄ、３３０Ｖ、３６２Ｒ、３８９Ｔおよび３８９Ｋの中から選択された少なくとも１つの突然変異と、
を含み、
付番がＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番であること、を特徴とする変異体に関する。
（ｉ）４つの突然変異３３４Ｎ、３５２Ｓ、３７８Ｖおよび３９７Ｍと、
（ｉｉ）４３４Ｙ、４３４Ｓ、２２６Ｇ、Ｐ２２８Ｌ、Ｐ２２８Ｒ、２３０Ｓ、２３０Ｔ、２３０Ｌ、２４１Ｌ、２６４Ｅ、３０７Ｐ、３１５Ｄ、３３０Ｖ、３６２Ｒ、３８９Ｔおよび３８９Ｋの中から選択された少なくとも１つの突然変異と、
を含み、
付番がＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番であること、を特徴とする変異体に関する。
【0016】
一実施形態によると、本発明に係る変異体は、Ｙ２９６Ｗ、Ｋ２９０Ｇ、Ｖ２４０Ｈ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２４０Ｍ、Ｖ２４０Ｎ、Ｖ２４０Ｓ、Ｆ２４１Ｈ、Ｆ２４１Ｙ、Ｌ２４２Ａ、Ｌ２４２Ｆ、Ｌ２４２Ｇ、Ｌ２４２Ｈ、Ｌ２４２Ｉ、Ｌ２４２Ｋ、Ｌ２４２Ｐ、Ｌ２４２Ｓ、Ｌ２４２Ｔ、Ｌ２４２Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｓ、Ｅ２５８Ｇ、Ｅ２５８Ｉ、Ｅ２５８Ｒ、Ｅ２５８Ｍ、Ｅ２５８Ｑ、Ｅ２５８Ｙ、Ｖ２５９Ｃ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ２５９Ｌ、Ｔ２６０Ａ、Ｔ２６０Ｈ、Ｔ２６０Ｉ、Ｔ２６０Ｍ、Ｔ２６０Ｎ、Ｔ２６０Ｒ、Ｔ２６０Ｓ、Ｔ２６０Ｗ、Ｖ２６２Ｓ、Ｖ２６３Ｔ、Ｖ２６４Ｌ、Ｖ２６４Ｓ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６６Ｌ、Ｓ２６７Ａ、Ｓ２６７Ｑ、Ｓ２６７Ｖ、Ｋ２９０Ｄ、Ｋ２９０Ｅ、Ｋ２９０Ｈ、Ｋ２９０Ｌ、Ｋ２９０Ｎ、Ｋ２９０Ｑ、Ｋ２９０Ｒ、Ｋ２９０Ｓ、Ｋ２９０Ｙ、Ｐ２９１Ｇ、Ｐ２９１Ｑ、Ｐ２９１Ｒ、Ｒ２９２Ｉ、Ｒ２９２Ｌ、Ｅ２９３Ａ、Ｅ２９３Ｄ、Ｅ２９３Ｇ、Ｅ２９３Ｍ、Ｅ２９３Ｑ、Ｅ２９３Ｓ、Ｅ２９３Ｔ、Ｅ２９４Ａ、Ｅ２９４Ｇ、Ｅ２９４Ｐ、Ｅ２９４Ｑ、Ｅ２９４Ｒ、Ｅ２９４Ｔ、Ｅ２９４Ｖ、Ｑ２９５Ｉ、Ｑ２９５Ｍ、Ｙ２９６Ｈ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｒ、Ｙ３００Ｉ、Ｙ３００Ｖ、Ｙ３００Ｗ、Ｒ３０１Ａ、Ｒ３０１Ｍ、Ｒ３０１Ｐ、Ｒ３０１Ｓ、Ｖ３０２Ｆ、Ｖ３０２Ｌ、Ｖ３０２Ｍ、Ｖ３０２Ｒ、Ｖ３０２Ｓ、Ｖ３０３Ｓ、Ｖ３０３Ｙ、Ｓ３０４Ｔ、Ｖ３０５Ａ、Ｖ３０５Ｆ、Ｖ３０５Ｉ、Ｖ３０５Ｌ、Ｖ３０５ＲおよびＶ３０５Ｓの中から選択されたＦｃフラグメント内の少なくとも１つの突然変異（ｉｉｉ）をさらに含み、
付番はＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番である。
付番はＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番である。
【0017】
このような変異体は、「本発明に係る変異体」、「本発明に係る突然変異体」または「本発明に係るポリペプチド」と呼ばれる。
【0018】
好ましくは、本発明に係る変異体は、ＦｃＲｎ受容体に対する増大した親和性と、全てのＦｃγＲＩ受容体（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩａ受容体（ＣＤ３２ａ）に対する増大した親和性を同時に有する。
【0019】
好ましくは、さらに、本発明に係る変異体は、補体、特にＣ１ｑのタンパク質に対する結合の修飾のせいである補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を阻害する能力をもつ。この阻害は、ＩｇＩＶにより付与される阻害に比べ、著しく改善されている。
【0020】
好ましくは、本発明に係る変異体は、付番がＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番であるものとして、５つの突然変異Ｎ４３４Ｙ、Ｋ３３４Ｎ、Ｐ３５２Ｓ、Ｖ３９７ＭおよびＡ３７８Ｖを有し、ＨＥＫ２９３細胞で産生される、特にＩｇＧ１のＦｃフラグメントからなる変異体とは異なる。したがって、好ましくは、本発明に係る変異体は、付番がＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番であるものとして、細胞ＨＥＫ２９３で産生された、特にＩｇＧ１のＦｃフラグメント、Ｎ４３４Ｙ／Ｋ３３４Ｎ／Ｐ３５２Ｓ／Ｖ３９７Ｍ／Ａ３７８Ｖとは異なる。
【0021】
本出願全体にわたり、Ｆｃ領域内の残基の付番は、Ｋａｂａｔら、（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｅ ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ｄａｎｓ ｌｅ Ｍａｒｙｌａｎｄ、１９９１）中のＥＵインデックスまたは等価物にしたがった免疫グロブリンの重鎖の付番である。「Ｋａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物」なる表現は、ヒト抗体ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の残基のＥＵ付番を意味する。このことはＩＭＧＴのサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ ＩＧＨＧｎｂｅｒ．ｈｔｍｌ）で例示されている。
【0022】
「ポリペプチド」または「タンパク質」とは、共有結合によって結合された少なくとも１００個のアミノ酸を含む配列を意味する。
【0023】
「アミノ酸」とは、２０種の天然アミノ酸または非天然類似体のうちの１つを意味する。
【0024】
「位置」なる用語は、１つのポリペプチドの配列中の位置を意味する。Ｆｃ領域については、位置は、Ｋａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物にしたがって付番される。
【0025】
「抗体」なる用語は、一般的な意味で使用される。これは、少なくとも１つのＦｃ領域および２つの可変領域を含む四量体に対応する。抗体は特に、全長免疫グロブリン、モノクローナル抗体、多特異的抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体を含む。各重鎖のアミノ末端部分は、抗原の認識を担う約１００～１１０個のアミノ酸の可変領域を含む。各可変領域内で、３つの環が結集されて、抗原に対する結合部位を形成する。各々の環は、相補性決定領域（以下「ＣＤＲ」と呼称）と呼ばれる。各重鎖のカルボキシ末端部分は、主としてエフェクター機能を担う定常領域を画定する。
【0026】
ＩｇＧは、複数のサブクラス、特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を有する。ＩｇＭのサブクラスは、特にＩｇＭ１およびＩｇＭ２である。したがって、「アイソタイプ」とは、その定常領域の化学的および抗原的特性によって定義される免疫グロブリンのサブクラスの１つを意味する。ヒト免疫グロブリンの公知のアイソタイプは、ｌｇＧ１、ｌｇＧ２、ｌｇＧ３、ｌｇＧ４、ｌｇＡ１、ｌｇＡ２、ｌｇＭ１、ｌｇＭ２、ＩｇＤおよびＩｇＥである。
【0027】
全長ＩｇＧは四量体であり、２つの免疫グロブリン鎖の２つの同一対で構成されており、各対は１つの軽鎖と１つの重鎖を有し、各軽鎖はＶＬドメインおよびＣＬドメインを含み、各重鎖は、ＶＨドメイン、Ｃγ１（ＣＨ１とも呼ばれる）、Ｃｙ２（ＣＨ２とも呼ばれる）およびＣｙ３（ＣＨ３とも呼ばれる）を含む。ヒトＩｇＧ１の枠内で、「ＣＨ１」は、Ｋａｂａｔ中のＥｕインデックスまたは等価物にしたがって、位置１１８～２１５を意味し、「ＣＨ２」は、位置２３１～３４０を指し示し、「ＣＨ３」は位置３４１～４４７を意味する。ＩｇＧの重鎖は、同様に、ＩｇＧ１の場合位置２１６～２３０を意味するＮ末端フレキシブルヒンジドメインも含んでいる。下部ヒンジドメインは、Ｋａｂａｔ中のＥｕインデックスまたは等価物にしたがって位置２２６～２３０を意味する。
【0028】
「可変領域」とは、それぞれ免疫グロブリンのカッパ鎖、ラムダ鎖および重鎖を構成する遺伝子ＶＫ、Ｖλおよび／またはＶＨのいずれか１つにより実質的にコードされる単数または複数のＩｇドメインを含む免疫グロブリンの領域を意味する。可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。
【0029】
「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」なる用語は、免疫グロブリンの定常領域の最初のドメイン（ＣＨ１）を除く、抗体の定常領域を表わす。したがって、Ｆｃは、ＩｇＧ１の定常領域の最後の２つのドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）、およびこれらのドメインのＮ末端フレキシブルヒンジを意味する。ヒトＩｇＧ１について、Ｆｃ領域は、そのカルボキシ末端端部に至るまでの残基Ｃ２２６、つまり、付番がＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番であるものとして、位置２２６～４４７の残基に対応する。使用されるＦｃ領域は、さらに、Ｋａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物にしたがって位置２１６～２２６の間に位置する上部ヒンジ領域部分を含むことができる。この場合、使用されるＦｃ領域は、付番がＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番であるものとして、位置２１６～４４７、２１７～４４７、２１８～４４７、２１９～４４７、２２０～４４７、２２１～４４７、２２２～４４７、２２３～４４７、２２４～４４７または２２５～４４７の残基に対応する。好ましくはこの場合、使用されるＦｃ領域は、付番がＫａｂａｔ中のＥｕインデックスまたは等価物にしたがったものとして、位置２１６～４４７の残基に対応する。
【0030】
好ましくは、使用されるＦｃ領域は、配列番号１～１０および１４の配列の中から選択される。
【0031】
「親ポリペプチド」とは、基準の親ポリペプチドを意味する。この親ポリペプチドは、天然または合成由来のものであり得る。本発明に関連して、親ポリペプチドは、「親Ｆｃ領域」と呼ばれるＦｃ領域を含む。このＦｃ領域は、野生型Ｆｃ領域、それらのフラグメントおよびそれらの突然変異体の群から選択され得る。好ましくは、親ポリペプチドは、ヒトＦｃフラグメント、好ましくはヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ２のＦｃフラグメントを含む。親ポリペプチドは、野生型のＦｃ領域との関係におけるＦｃ領域内に予め存在するアミノ酸の修飾（例えばＦｃ突然変異体）を含むことができる。
【0032】
有利には、親ポリペプチドは、単離Ｆｃ領域（すなわちそのままのＦｃフラグメント）、単離Ｆｃ領域から誘導された配列、抗体、Ｆｃ領域を含む抗体フラグメント、Ｆｃ領域を含む融合タンパク質またはＦｃコンジュゲートであるが、このリストは限定的ではない。
【0033】
「単離Ｆｃ領域から誘導された配列」とは、ｓｃＦｃ（単鎖Ｆｃ）またはＦｃ多量体などの、互いに結合した少なくとも２つの単離Ｆｃ領域を含む配列を意味する。「Ｆｃ領域を含む融合タンパク質」とは、Ｆｃ領域に融合したポリペプチド配列を意味し、このポリペプチド配列は、好ましくは、あらゆる抗体の可変領域、受容体とそのリガンドの結合配列、接着分子、リガンド、酵素、サイトカインおよびケモカインの中から選択される。「Ｆｃコンジュゲート」とは、Ｆｃ領域とコンジュゲーションパートナーの化学的カップリングの結果である化合物を意味する。コンジュゲーションパートナーは、タンパク質または非タンパク質であり得る。カップリング反応は概して、Ｆｃ領域上の官能基およびコンジュゲーションパートナーを使用する。先行技術においては、さまざまな結合基が、コンジュゲートの合成にとって適切なものとして知られている。例えば、ホモまたはヘテロ２官能性結合基が周知である（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙカタログ、２００５～２００６、架橋化剤についての技術的セクション、Ｐ３２１～３５０を参照のこと）。適切なコンジュゲーションパートナーとしては、治療用タンパク質、標識、細胞毒性薬、例えば化学療法薬、毒素およびそれらの活性フラグメントを挙げることができる。適切な毒素およびそれらのフラグメントには特に、ジフテリア毒素、外毒素Ａ、リシン、アブリン、サポリン、ゲロニン、カリケオリン、アウリスタチンＥおよびＦ、およびメルタンシンが含まれる。
【0034】
有利には、親ポリペプチド、したがって本発明に係るポリペプチドは、Ｆｃ領域からなる。
【0035】
有利には、親ポリペプチド、したがって本発明に係るポリペプチドは、抗体である。
【0036】
「突然変異」とは、１つのポリペプチドの配列の少なくとも１つのアミノ酸の変化、特に親ポリペプチドのＦｃ領域の少なくとも１つのアミノ酸の変化を意味する。こうして得られた突然変異したポリペプチドは、変異体ポリペプチドであり、これが本発明に係るポリペプチドである。このようなポリペプチドは、親ポリペプチドに比較して突然変異したＦｃ領域を含む。好ましくは、突然変異は、少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入または欠失である。
【0037】
「置換」とは、親ポリペプチド配列内の特定の位置にあるアミノ酸を他のアミノ酸で置き換えることを意味する。例えば、置換Ｎ４３４Ｓは、変異体ポリペプチド、この場合、位置４３４にあるアスパラギンがセリンによって置き換えられている変異体を意味する。
【0038】
「アミノ酸の挿入」または「挿入」とは、親ポリペプチド配列内の特定の位置におけるアミノ酸の追加を意味する。例えば、挿入Ｇ＞２３５～２３６は、位置２３５と２３６の間のグリシンの挿入を表わす。
【0039】
「アミノ酸の欠失」または「欠失」とは、親ポリペプチド配列内の特定の位置におけるアミノ酸の除去を意味する。例えばＥ２９４ｄｅｌは、位置２９４におけるグルタミン酸の除去を表わす。
【0040】
好ましくは、「４３４Ｓ」または「Ｎ４３４Ｓ」という突然変異ラベルが使用され、親ポリペプチドが位置４３４にアスパラギンを含み、これは変異体においてはセリンにより置き換えられる、ということを意味している。置換の組合せの場合、好ましいフォーマットは以下のものである：「２５９Ｉ／３１５Ｄ／４３４Ｙ」または「Ｖ２５９Ｉ／Ｎ３１５Ｄ／Ｎ４３４Ｙ」。このことは、変異体の中には位置２５９、３１５および４３４に３つの置換が存在すること、そして親ポリペプチドの位置２５９のアミノ酸、つまりバリンがイソロイシンによって置き換えられていること、親ポリペプチドの位置３１５のアミノ酸、つまりアスパラギンがアスパラギン酸によって置き換えられていること、そして親ポリペプチドの位置４３４のアミノ酸、つまりアスパラギンがチロシンによって置き換えられていることを意味している。
【0041】
ここで使用されている「ＦｃＲｎ」または「新生児Ｆｃ受容体」とは、ＩｇＧのＦｃ領域に結合し、少なくとも部分的にＦｃＲｎ遺伝子によってコードされるタンパク質を意味する。当該技術分野において公知である通り、機能性ＦｃＲｎタンパク質は、多くの場合重鎖および軽鎖の名前で呼称される２つのポリペプチドを含む。軽鎖はベータ－２－マイクログロブリンであり、重鎖はＦｃＲｎ遺伝子によりコードされる。ここで相反する指示のないかぎり、ＦｃＲｎまたはＦｃＲｎタンパク質は、ベータ－２－マイクログロブリンとα鎖の複合体を意味する。ヒトの場合、ＦｃＲｎについてコードする遺伝子はＦＣＧＲＴと呼ばれる。
【0042】
好ましくは、本発明に係る変異体は、親ポリペプチドの親和性に比べ、少なくとも２の比率に等しい、好ましくは５超、好ましくは１０超、好ましくは１５超、好ましくは２０超、好ましくは２５超、好ましくは３０超の比率で増大した、ＦｃＲｎ受容体に対する親和性を有する。
【0043】
好ましくは、本発明に係る変異体は、親ポリペプチドの半減期に比べて増大した半減期を有する。好ましくは、本発明に係る変異体は、親ポリペプチドの半減期に比べ、少なくとも２の比率に等しい、好ましくは５超、好ましくは１０超、好ましくは１５超、好ましくは２０超、好ましくは２５超、好ましくは３０超の比率で増大した半減期を有する。
【0044】
ＦｃＲｎの主要な機能の１つは、ＩｇＧのリサイクリングという名前で知られている。これは、血漿タンパク質の内皮異化作用の経路からＩｇＧを抽出して、これらのＩｇＧをインタクトの状態で循環内に復元することからなる。血漿濃度を高く維持することを可能にしながら、通常の生理学的条件下でのこれらのＩｇＧの半減期が長いこと（ＩｇＧについては３週間）は、このリサイクリングにより説明される。上皮または内皮の一方の極から他方の極へのＩｇＧのトランスサイトーシスは、ＦｃＲｎの第２の主要な機能であり、生命体におけるそれらの生体内分布を可能にしている。
【0045】
好ましくは、本発明に係る変異体は、親ポリペプチドの親和性に比べ、少なくとも２の比率に等しい、好ましくは５超、好ましくは１０超、好ましくは１５超、好ましくは２０超、好ましくは２５超、好ましくは３０超の比率で増大した、ＦｃγＲＩ受容体（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩａ受容体（ＩＣ３２ａ）の中から選択された少なくとも１つのＦｃフラグメントの受容体（ＦｃＲ）に対する親和性を有する。
【0046】
ＦｃγＲＩ受容体（ＣＤ６４）は、食作用および細胞活性化に関与する。ＦｃγＲＩＩＩａ受容体（ＣＤ１６ａ）は、同様に、Ｆｃフラグメントに依存する活性、特にＡＤＣＣおよび食作用に関与する。この受容体は、位置１５８に多型性Ｖ/Ｆを有する。ＦｃγＲＩＩａ受容体（ＣＤ３２ａ）はというと、これは血小板活性および食作用に関与する。この受容体は位置１３１に多型性Ｈ/Ｒを有する。
【0047】
好ましくは、本発明に係る変異体は、ＦｃＲｎ受容体に対する増大した親和性と、ＦｃγＲＩ受容体（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩａ受容体（ＣＤ３２ａ）全てに対する増大した親和性を同時に有する。
【0048】
ＦｃＲに対するＦｃ領域を含むポリペプチドの親和性は、先行技術の周知の方法によって評価され得る。例えば、当業者であれば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、親和性（Ｋｄ）を決定することができる。代替的には、当業者であれば、適切なＥＬＩＳＡ試験を行なうことができる。適切なＥＬＩＳＡ検定により、親Ｆｃおよび突然変異したＦｃの結合力を比較することが可能になる。突然変異したＦｃおよび親Ｆｃに特異的な検出されたシグナルが比較される。結合親和性は、全ポリペプチドを評価することによってか、または全ポリペプチドから単離されたＦｃ領域を評価することによって、無差別に決定され得る。代替的には、当業者は、適切な競合試験を実施することができる。適切な競合試験により、それらが受容体を発現する細胞と同時にインキュベートされた場合に、ＦｃＲ標識リガンドの結合を阻害する突然変異したＦｃの能力を決定することが可能になる。ＦｃＲに対する標識リガンドの結合は、例えば、フローサイトメトリーにより評価される。ＦｃＲに対する突然変異したＦｃの結合親和性はこのとき、ＦｃＲに結合した標識リガンドが発出する蛍光の平均強度の可変性を評価することによって決定される。
【0049】
好ましくは、本発明に係るポリペプチドの突然変異したＦｃ領域は、親ポリペプチドに比べ３～２０個の突然変異、好ましくは４～２０個の突然変異を含む。「３～２０個のアミノ酸修飾」には、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０個のアミノ酸突然変異が包含される。好ましくは、この領域は、親ポリペプチドに比べて４～１５個の突然変異、好ましくは４～１０個の突然変異を含む。
【0050】
より優先的には、本発明に係るポリペプチドの突然変異したＦｃ領域は、５個の突然変異の組合せを少なくとも１つ含み、前記組合せは、上述の通りの４つの突然変異（ｉ）、および上述の通りの少なくとも１つの突然変異（ｉｉ）を含み、ここで付番はＫａｂａｔ中のＥｕインデックスまたは等価物の付番である。
【0051】
より優先的には、本発明に係るポリペプチドの突然変異したＦｃ領域は、６個の突然変異の組合せ１つを含み、この組合せは、上述の通りの４つの突然変異（ｉ）、上述の通りの少なくとも１つの突然変異（ｉｉ）、および上述の通りの少なくとも１つの突然変異（ｉｉｉ）を含み、ここで付番はＫａｂａｔ中のＥｕインデックスまたは等価物の付番である。
【0052】
好ましくは、本発明に係るポリペプチドの突然変異したＦｃ領域は、
（ｉ）４つの突然変異３３４Ｎ、３５２Ｓ、３７８Ｖおよび３９７Ｍと、
（ｉｉ）４３４Ｙ ４３４Ｓ、２２６Ｇ、Ｐ２２８Ｌ、Ｐ２２８Ｒ、２３０Ｓ、２３０Ｔ、２３０Ｌ、２４１Ｌ、２６４Ｅ、３０７Ｐ、３１５Ｄ、３３０Ｖ、３６２Ｒ、３８９Ｔおよび３８９Ｋの中から選択された少なくとも１つの突然変異と、
を含み、
突然変異（ｉｉｉ）が存在する場合には、この突然変異は、Ｋ２９０ＧおよびＹ２９６Ｗの中から選択され、
ここで付番はＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番である。
（ｉ）４つの突然変異３３４Ｎ、３５２Ｓ、３７８Ｖおよび３９７Ｍと、
（ｉｉ）４３４Ｙ ４３４Ｓ、２２６Ｇ、Ｐ２２８Ｌ、Ｐ２２８Ｒ、２３０Ｓ、２３０Ｔ、２３０Ｌ、２４１Ｌ、２６４Ｅ、３０７Ｐ、３１５Ｄ、３３０Ｖ、３６２Ｒ、３８９Ｔおよび３８９Ｋの中から選択された少なくとも１つの突然変異と、
を含み、
突然変異（ｉｉｉ）が存在する場合には、この突然変異は、Ｋ２９０ＧおよびＹ２９６Ｗの中から選択され、
ここで付番はＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番である。
【0053】
好ましくは、本発明に係るポリペプチドの突然変異したＦｃ領域は、
（ｉ）４つの突然変異３３４Ｎ、３５２Ｓ、３７８Ｖおよび３９７Ｍと、
（ｉｉ）４３４Ｙ ４３４Ｓ、２２６Ｇ、Ｐ２２８Ｌ、Ｐ２２８Ｒ、２３０Ｓ、２３０Ｔ、２３０Ｌ、２４１Ｌ、２６４Ｅ、３０７Ｐ、３１５Ｄ、３３０Ｖ、３６２Ｒ、３８９Ｔおよび３８９Ｋの中から選択された少なくとも１つの突然変異と、
（ｉｉｉ）Ｋ２９０ＧおよびＹ２９６Ｗの中から選択された少なくとも１つの突然変異と、
を含み、
ここで付番はＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番である。
（ｉ）４つの突然変異３３４Ｎ、３５２Ｓ、３７８Ｖおよび３９７Ｍと、
（ｉｉ）４３４Ｙ ４３４Ｓ、２２６Ｇ、Ｐ２２８Ｌ、Ｐ２２８Ｒ、２３０Ｓ、２３０Ｔ、２３０Ｌ、２４１Ｌ、２６４Ｅ、３０７Ｐ、３１５Ｄ、３３０Ｖ、３６２Ｒ、３８９Ｔおよび３８９Ｋの中から選択された少なくとも１つの突然変異と、
（ｉｉｉ）Ｋ２９０ＧおよびＹ２９６Ｗの中から選択された少なくとも１つの突然変異と、
を含み、
ここで付番はＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番である。
【0054】
好ましくは、本発明に係るポリペプチドの突然変異したＦｃ領域は、Ｎ４３４Ｙ／Ｋ３３４Ｎ／Ｐ３５２Ｓ／Ｖ３９７Ｍ／Ａ３７８ＶおよびＮ４３４Ｙ／Ｋ３３４Ｎ／Ｐ３５２Ｓ／Ｖ３９７Ｍ／Ａ３７８Ｖ／Ｙ２９６Ｗという組合せの中から選択された突然変異の組合せを含む。
【0055】
好ましくは、本発明に係るポリペプチドは、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞内で産生される。
【0056】
好ましくは、本発明に係るポリペプチドは、非ヒトトランスジェニック動物において、好ましくはトランスジェニック非ヒト哺乳動物において、より優先的にはそれらの乳房上皮細胞内で産生される。
【0057】
「トランスジェニック非ヒト哺乳動物」とは、特にウシ類、ブタ類、ヤギ類、ヒツジ類、およびゲッ歯類の中から、好ましくは、ヤギ、マウス、雌ブタ、雌ウサギ、雌ヒツジおよび雌ウシの中から選択される哺乳動物を意味する。好ましくは、非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、トランスジェニックヤギである。
【0058】
好ましくは、本発明に係る変異体は、そのＦｃフラグメント内に少なくとも５つの突然変異Ｎ４３４Ｙ、Ｋ３３４Ｎ、Ｐ３５２Ｓ、Ｖ３９７ＭおよびＡ３７８Ｖを含み、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞内、または非ヒトトランスジェニック動物において、好ましくは、ヤギなどのトランスジェニック非ヒト哺乳動物において産生される。このような変異体は、ＦｃＲｎ受容体に対する増大した親和性、およびＦｃγＲＩ受容体（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩａ受容体（ＣＤ３２ａ）全てに対する増大した親和性を同時に有する。
【0059】
したがって、好ましくは、本発明に係る変異体は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞内で産生されるＦｃ変異体Ｎ４３４Ｙ／Ｋ３３４Ｎ／Ｐ３５２Ｓ／Ｖ３９７Ｍ／Ａ３７８Ｖである。代替的には、好ましくは、本発明に係る変異体は、非ヒトトランスジェニック動物において、好ましくはヤギなどのトランスジェニック非ヒト哺乳動物において産生されるＦｃ変異体Ｎ４３４Ｙ／Ｋ３３４Ｎ／Ｐ３５２Ｓ／Ｖ３９７Ｍ／Ａ３７８Ｖである。このような変異体は、ＦｃＲｎ受容体に対する増大した親和性、およびＦｃγＲＩ受容体（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体（ＣＤ１６ａ）および、ＦｃγＲＩＩａ受容体（ＣＤ３２ａ）全てに対する増大した親和性を同時に有する。好ましくは、本発明に係る変異体は、配列番号１１の配列、または配列番号１５の配列を含む。
【0060】
代替的には、好ましくは、本発明に係る変異体は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞内で産生されるＦｃ変異体Ｎ４３４Ｙ／Ｋ３３４Ｎ／Ｐ３５２Ｓ／Ｖ３９７Ｍ／Ａ３７８Ｖ／Ｙ２９６Ｗである。代替的には、好ましくは、本発明に係る変異体は、非ヒトトランスジェニック動物において、好ましくはヤギなどのトランスジェニック非ヒト哺乳動物において産生されるＦｃ変異体Ｎ４３４Ｙ／Ｋ３３４Ｎ／Ｐ３５２Ｓ／Ｖ３９７Ｍ／Ａ３７８Ｖ／Ｙ２９６Ｗである。このような変異体は、ＦｃＲｎ受容体に対する増大した親和性、およびＦｃγＲＩ受容体（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体（ＣＤ１６ａ）および、ＦｃγＲＩＩａ受容体（ＣＤ３２ａ）全てに対する増大した親和性を同時に有する。
【0061】
好ましくは、本発明に係る変異体の産生方法は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞内での前記変異体の発現を含む。
【0062】
したがって、本発明は同様に、Ｆｃフラグメントを含む親ポリペプチドの変異体の産生方法において、前記変異体が親ポリペプチドの親和性と比べ、ＦｃＲｎ受容体に対する増大した親和性、ならびにＦｃγＲＩ受容体（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩａ受容体（ＣＤ３２ａ）の中から選択された少なくとも１つのＦｃフラグメントの受容体（ＦｃＲ）に対する増大した親和性を有し、前記変異体が、
（ｉ）４つの突然変異３３４Ｎ、３５２Ｓ、３７８Ｖおよび３９７Ｍと、
（ｉｉ）４３４Ｙ、４３４Ｓ、２２６Ｇ、Ｐ２２８Ｌ、Ｐ２２８Ｒ、２３０Ｓ、２３０Ｔ、２３０Ｌ、２４１Ｌ、２６４Ｅ、３０７Ｐ、３１５Ｄ、３３０Ｖ、３６２Ｒ、３８９Ｔおよび３８９Ｋの中から選択された少なくとも１つの突然変異と
を含み、
ここで付番はＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番であり、
トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞内での前記変異体の発現を含む方法も、本発明の対象としている。
（ｉ）４つの突然変異３３４Ｎ、３５２Ｓ、３７８Ｖおよび３９７Ｍと、
（ｉｉ）４３４Ｙ、４３４Ｓ、２２６Ｇ、Ｐ２２８Ｌ、Ｐ２２８Ｒ、２３０Ｓ、２３０Ｔ、２３０Ｌ、２４１Ｌ、２６４Ｅ、３０７Ｐ、３１５Ｄ、３３０Ｖ、３６２Ｒ、３８９Ｔおよび３８９Ｋの中から選択された少なくとも１つの突然変異と
を含み、
ここで付番はＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番であり、
トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞内での前記変異体の発現を含む方法も、本発明の対象としている。
【0063】
好ましくは、前記変異体は、Ｙ２９６Ｗ、Ｋ２９０Ｇ、Ｖ２４０Ｈ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２４０Ｍ、Ｖ２４０Ｎ、Ｖ２４０Ｓ、Ｆ２４１Ｈ、Ｆ２４１Ｙ、Ｌ２４２Ａ、Ｌ２４２Ｆ、Ｌ２４２Ｇ、Ｌ２４２Ｈ、Ｌ２４２Ｉ、Ｌ２４２Ｋ、Ｌ２４２Ｐ、Ｌ２４２Ｓ、Ｌ２４２Ｔ、Ｌ２４２Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｓ、Ｅ２５８Ｇ、Ｅ２５８Ｉ、Ｅ２５８Ｒ、Ｅ２５８Ｍ、Ｅ２５８Ｑ、Ｅ２５８Ｙ、Ｖ２５９Ｃ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ２５９Ｌ、Ｔ２６０Ａ、Ｔ２６０Ｈ、Ｔ２６０Ｉ、Ｔ２６０Ｍ、Ｔ２６０Ｎ、Ｔ２６０Ｒ、Ｔ２６０Ｓ、Ｔ２６０Ｗ、Ｖ２６２Ｓ、Ｖ２６３Ｔ、Ｖ２６４Ｌ、Ｖ２６４Ｓ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６６Ｌ、Ｓ２６７Ａ、Ｓ２６７Ｑ、Ｓ２６７Ｖ、Ｋ２９０Ｄ、Ｋ２９０Ｅ、Ｋ２９０Ｈ、Ｋ２９０Ｌ、Ｋ２９０Ｎ、Ｋ２９０Ｑ、Ｋ２９０Ｒ、Ｋ２９０Ｓ、Ｋ２９０Ｙ、Ｐ２９１Ｇ、Ｐ２９１Ｑ、Ｐ２９１Ｒ、Ｒ２９２Ｉ、Ｒ２９２Ｌ、Ｅ２９３Ａ、Ｅ２９３Ｄ、Ｅ２９３Ｇ、Ｅ２９３Ｍ、Ｅ２９３Ｑ、Ｅ２９３Ｓ、Ｅ２９３Ｔ、Ｅ２９４Ａ、Ｅ２９４Ｇ、Ｅ２９４Ｐ、Ｅ２９４Ｑ、Ｅ２９４Ｒ、Ｅ２９４Ｔ、Ｅ２９４Ｖ、Ｑ２９５Ｉ、Ｑ２９５Ｍ、Ｙ２９６Ｈ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｒ、Ｙ３００Ｉ、Ｙ３００Ｖ、Ｙ３００Ｗ、Ｒ３０１Ａ、Ｒ３０１Ｍ、Ｒ３０１Ｐ、Ｒ３０１Ｓ、Ｖ３０２Ｆ、Ｖ３０２Ｌ、Ｖ３０２Ｍ、Ｖ３０２Ｒ、Ｖ３０２Ｓ、Ｖ３０３Ｓ、Ｖ３０３Ｙ、Ｓ３０４Ｔ、Ｖ３０５Ａ、Ｖ３０５Ｆ、Ｖ３０５Ｉ、Ｖ３０５Ｌ、Ｖ３０５ＲおよびＶ３０５Ｓの中から選択されたＦｃフラグメント内の少なくとも１つの突然変異（ｉｉｉ）をさらに含み、
付番はＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番である。
付番はＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番である。
【0064】
詳細には、このような方法は、以下のステップを含む。
ａ）変異体についてコードする配列、哺乳動物のカゼインプロモーターまたは哺乳動物の乳清プロモーターについてコードする配列、および前記変異体の分泌を可能にするシグナルペプチドについてコードする配列を含むＤＮＡ配列を調製するステップ、
ｂ）ａ）で得たＤＮＡ配列を非ヒト哺乳動物の胚中に導入して、乳腺内でａ）において得られた前記ＤＮＡ配列によりコードされた変異体を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得るステップ、および
ｃ）ｂ）で得られたトランスジェニック非ヒト哺乳動物によって産生された乳中の変異体を回収するステップ。
ａ）変異体についてコードする配列、哺乳動物のカゼインプロモーターまたは哺乳動物の乳清プロモーターについてコードする配列、および前記変異体の分泌を可能にするシグナルペプチドについてコードする配列を含むＤＮＡ配列を調製するステップ、
ｂ）ａ）で得たＤＮＡ配列を非ヒト哺乳動物の胚中に導入して、乳腺内でａ）において得られた前記ＤＮＡ配列によりコードされた変異体を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得るステップ、および
ｃ）ｂ）で得られたトランスジェニック非ヒト哺乳動物によって産生された乳中の変異体を回収するステップ。
【0065】
したがって、ステップａ）は、変異体についてコードする配列、哺乳動物のカゼインプロモーターまたは哺乳動物の乳清プロモーターについてコードする配列、および前記変異体の分泌を可能にするシグナルペプチドについてコードする配列を含むＤＮＡ配列の調製を含む。このようなステップが図１に例示されている。
【0066】
変異体をコードする配列は、本発明に係る変異体についてコードするＤＮＡ配列である。
【0067】
例えば、この変異体は、配列番号１１を配列として有する。シグナルペプチドと共に、対応する配列は、配列番号１３の配列である。
【0068】
別の例によると、この変異体は、配列番号１５を配列として有する。シグナルペプチドと共に、対応する配列は、配列番号１６の配列である。
【0069】
哺乳動物のカゼインプロモーター、または哺乳動物の乳清プロモーターについてコードする配列は、乳中の変異体発現を可能にする。当業者であれば、このようなプロモーターを選択できる。
【0070】
本出願の枠内で、シグナルペプチドは、哺乳類宿主の乳中にＦｃポリペプチド変異体を差し向けるのに役立つ、Ｆｃポリペプチド変異体のＮ末端端部に位置する、好ましくは２～３０個のアミノ酸のアミノ酸配列である。好ましくはシグナルペプチドについてコードする配列は、変異体についてコードする配列とプロモーターの間に配置される。このような配列が無いと、変異体は乳房組織内にとどまり、精製は困難になり、哺乳類宿主の犠牲が求められることになると思われる。シグナルペプチドは、分泌の際に開裂され得る。シグナルペプチドについてコードする配列は、本発明に係る親ポリペプチドに天然に会合する配列であり得る。代替的に、シグナルペプチドについてコードする配列は、プロモーターが由来する乳タンパク質の配列であり得、つまり、プロモーターを単離する目的で乳タンパク質の遺伝子が消化される場合、プロモーターおよびこのプロモーターの直ぐ下流側でシグナルペプチドをコードする配列を同時に含むＤＮＡフラグメントが選択される。別の選択肢は、プロモーターから通常発現される乳タンパク質でもなく、本発明に係るポリペプチドでもない、別の分泌されたタンパク質から誘導されたシグナル配列を使用することからなる。
【0071】
好ましくは、シグナルペプチドは、配列番号１２を配列として有する。
【0072】
使用されるＤＮＡ配列は、最適化されたコドンを含むことができる。
【0073】
コドン最適化の目的は、天然コドンを、アミノ酸を担持するトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）が、対象の細胞型において最も頻度の高いものであるコドンで置き換えることにある。頻繁に遭遇するｔＲＮＡを動員することのもつ主要な利点は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳速度を加速し、したがって最終力価を増大させることにある（Ｃａｒｔｏｎ ＪＭら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ、２００７年）。配列の最適化は同様に、リボソーム複合体による読取りを減速させ得ると考えられるｍＲＮＡの二次構造の予測にも作用する。配列の最適化は同様に、ｍＲＮＡの半減期、したがってその翻訳される可能性に直接関係するＧ／Ｃ百分率に対しても影響を及ぼす（Ｃｈｅｃｈｅｔｋｉｎ、Ｊ．ｏｆ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ２４２、２００６年 ９２２～９３４）。
【0074】
コドンの最適化は、哺乳動物そしてより詳細にはホモサピエンスについてのコドン使用頻度テーブル（ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｔａｂｌｅ）を使用することによる天然コドンの置換によって行なうことができる。インターネット上にあり、合成遺伝子の供給業者（ＤＮＡ２．０、ＧｅｎｅＡｒｔ，ＭＷＧ，Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）によって提供されている、この配列最適化を可能にするアルゴリズムが存在する。
【0075】
好ましくは、ステップａ）は以下のステップを含む。
（ａ１）本発明に係る変異体の分泌を可能にするシグナルペプチドについてコードする配列にＮ末端端部において直接融合された、本発明に係る変異体についてコードする配列を含むＤＮＡ配列を調製するステップ、
（ａ２）哺乳動物カゼインプロモーターまたは哺乳動物乳清プロモーターについてコードする配列を含むベクター内に、（ａ１）で得たＤＮＡ配列を導入するステップ、および
（ａ３）哺乳動物カゼインプロモーターまたは哺乳動物乳清プロモーターについてコードする配列、および、シグナルペプチドについてコードする配列にＮ末端端部において直接融合された本発明に係る変異体についてコードする配列を含むＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列を得るために、（ａ２）で得た前記ベクターを消化するステップ。
（ａ１）本発明に係る変異体の分泌を可能にするシグナルペプチドについてコードする配列にＮ末端端部において直接融合された、本発明に係る変異体についてコードする配列を含むＤＮＡ配列を調製するステップ、
（ａ２）哺乳動物カゼインプロモーターまたは哺乳動物乳清プロモーターについてコードする配列を含むベクター内に、（ａ１）で得たＤＮＡ配列を導入するステップ、および
（ａ３）哺乳動物カゼインプロモーターまたは哺乳動物乳清プロモーターについてコードする配列、および、シグナルペプチドについてコードする配列にＮ末端端部において直接融合された本発明に係る変異体についてコードする配列を含むＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列を得るために、（ａ２）で得た前記ベクターを消化するステップ。
【0076】
換言すると、好ましくは、ステップａ）の終りで、それ自体本発明に係る変異体についてコードする配列に融合されている、シグナルペプチドについてコードする配列に融合された、哺乳動物カゼインプロモーターまたは哺乳動物乳清プロモーターについてコードする配列をＮ末端端部からＣ末端端部まで含む、ＤＮＡ配列が得られる。
【0077】
次に、本発明に係る方法は、乳腺内でａ）で得たＤＮＡ配列によりコードされた変異体を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得るために、非ヒト哺乳動物の胚中に、ａ）で得た前記ＤＮＡ配列を導入するステップｂ）を含む。
【0078】
最後に、本発明に係る方法は、ｂ）で得たトランスジェニック非ヒト哺乳動物により産生された乳中の変異体を回収するステップｃ）を含む。
【0079】
ステップｂ）およびｃ）は、先行技術、特に欧州特許第０２６４１６６号明細書から公知である。
【0080】
好ましくは、このような方法は、ステップｃ）の後に、回収された乳を精製するステップｄ）を含む。精製ステップｄ）は、先行技術の既知のあらゆる方法、特にプロテインＡ上での精製によって実現可能である。ここでもまた、このようなステップは特に、欧州特許第０２６４１６６号明細書中に記載されている。
【0081】
本発明は同様に、Ｆｃフラグメントを含む親ポリペプチドの変異体をコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列において、前記変異体が、親ポリペプチドの親和性と比べ、ＦｃＲｎ受容体に対する増大した親和性、ならびにＦｃγＲＩ受容体（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩａ受容体（ＣＤ３２ａ）の中から選択された少なくとも１つのＦｃフラグメントの受容体（ＦｃＲ）に対する増大した親和性を有し、前記変異体が、
（ｉ）４つの突然変異３３４Ｎ、３５２Ｓ、３７８Ｖおよび３９７Ｍと、
（ｉｉ）４３４Ｙ ４３４Ｓ、２２６Ｇ、Ｐ２２８Ｌ、Ｐ２２８Ｒ、２３０Ｓ、２３０Ｔ、２３０Ｌ、２４１Ｌ、２６４Ｅ、３０７Ｐ、３１５Ｄ、３３０Ｖ、３６２Ｒ、３８９Ｔおよび３８９Ｋの中から選択された少なくとも１つの突然変異と、
を含み、
付番がＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番であり、
前記遺伝子が、この遺伝子の転写を自然に制御しない哺乳動物の乳清またはカゼインの転写プロモーターの制御下にあり、
変異体についてコードする配列とプロモーターの間に配置されて、前記変異体の分泌を可能にするシグナルペプチドについてコードする配列をさらに含む、
ＤＮＡ配列をも本発明の対象とする。
（ｉ）４つの突然変異３３４Ｎ、３５２Ｓ、３７８Ｖおよび３９７Ｍと、
（ｉｉ）４３４Ｙ ４３４Ｓ、２２６Ｇ、Ｐ２２８Ｌ、Ｐ２２８Ｒ、２３０Ｓ、２３０Ｔ、２３０Ｌ、２４１Ｌ、２６４Ｅ、３０７Ｐ、３１５Ｄ、３３０Ｖ、３６２Ｒ、３８９Ｔおよび３８９Ｋの中から選択された少なくとも１つの突然変異と、
を含み、
付番がＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番であり、
前記遺伝子が、この遺伝子の転写を自然に制御しない哺乳動物の乳清またはカゼインの転写プロモーターの制御下にあり、
変異体についてコードする配列とプロモーターの間に配置されて、前記変異体の分泌を可能にするシグナルペプチドについてコードする配列をさらに含む、
ＤＮＡ配列をも本発明の対象とする。
【0082】
特定の一実施形態において、前記変異体はＹ２９６Ｗ、Ｋ２９０Ｇ、Ｖ２４０Ｈ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２４０Ｍ、Ｖ２４０Ｎ、Ｖ２４０Ｓ、Ｆ２４１Ｈ、Ｆ２４１Ｙ、Ｌ２４２Ａ、Ｌ２４２Ｆ、Ｌ２４２Ｇ、Ｌ２４２Ｈ、Ｌ２４２Ｉ、Ｌ２４２Ｋ、Ｌ２４２Ｐ、Ｌ２４２Ｓ、Ｌ２４２Ｔ、Ｌ２４２Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｓ、Ｅ２５８Ｇ、Ｅ２５８Ｉ、Ｅ２５８Ｒ、Ｅ２５８Ｍ、Ｅ２５８Ｑ、Ｅ２５８Ｙ、Ｖ２５９Ｃ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ２５９Ｌ、Ｔ２６０Ａ、Ｔ２６０Ｈ、Ｔ２６０Ｉ、Ｔ２６０Ｍ、Ｔ２６０Ｎ、Ｔ２６０Ｒ、Ｔ２６０Ｓ、Ｔ２６０Ｗ、Ｖ２６２Ｓ、Ｖ２６３Ｔ、Ｖ２６４Ｌ、Ｖ２６４Ｓ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６６Ｌ、Ｓ２６７Ａ、Ｓ２６７Ｑ、Ｓ２６７Ｖ、Ｋ２９０Ｄ、Ｋ２９０Ｅ、Ｋ２９０Ｈ、Ｋ２９０Ｌ、Ｋ２９０Ｎ、Ｋ２９０Ｑ、Ｋ２９０Ｒ、Ｋ２９０Ｓ、Ｋ２９０Ｙ、Ｐ２９１Ｇ、Ｐ２９１Ｑ、Ｐ２９１Ｒ、Ｒ２９２Ｉ、Ｒ２９２Ｌ、Ｅ２９３Ａ、Ｅ２９３Ｄ、Ｅ２９３Ｇ、Ｅ２９３Ｍ、Ｅ２９３Ｑ、Ｅ２９３Ｓ、Ｅ２９３Ｔ、Ｅ２９４Ａ、Ｅ２９４Ｇ、Ｅ２９４Ｐ、Ｅ２９４Ｑ、Ｅ２９４Ｒ、Ｅ２９４Ｔ、Ｅ２９４Ｖ、Ｑ２９５Ｉ、Ｑ２９５Ｍ、Ｙ２９６Ｈ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｒ、Ｙ３００Ｉ、Ｙ３００Ｖ、Ｙ３００Ｗ、Ｒ３０１Ａ、Ｒ３０１Ｍ、Ｒ３０１Ｐ、Ｒ３０１Ｓ、Ｖ３０２Ｆ、Ｖ３０２Ｌ、Ｖ３０２Ｍ、Ｖ３０２Ｒ、Ｖ３０２Ｓ、Ｖ３０３Ｓ、Ｖ３０３Ｙ、Ｓ３０４Ｔ、Ｖ３０５Ａ、Ｖ３０５Ｆ、Ｖ３０５Ｉ、Ｖ３０５Ｌ、Ｖ３０５ＲおよびＶ３０５Ｓの中から選択されたＦｃフラグメント内の少なくとも１つの突然変異（ｉｉｉ）をさらに含み、付番はＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番である。
【0083】
本発明は同様に、Ｆｃフラグメントを含む親ポリペプチドの変異体をコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列において、前記変異体が、親ポリペプチドの親和性と比べ、ＦｃＲｎ受容体に対する増大した親和性、ならびにＦｃγＲＩ受容体（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩａ受容体（ＣＤ３２ａ）の中から選択された少なくとも１つのＦｃフラグメントの受容体（ＦｃＲ）に対する増大した親和性を有し、前記変異体が、
（ｉ）４つの突然変異３３４Ｎ、３５２Ｓ、３７８Ｖおよび３９７Ｍと、
（ｉｉ）４３４Ｙ、４３４Ｓ、２２６Ｇ、Ｐ２２８Ｌ、Ｐ２２８Ｒ、２３０Ｓ、２３０Ｔ、２３０Ｌ、２４１Ｌ、２６４Ｅ、３０７Ｐ、３１５Ｄ、３３０Ｖ、３６２Ｒ、３８９Ｔおよび３８９Ｋの中から選択された少なくとも１つの突然変異と、
を含み、
付番がＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番であり、
任意には、前記変異体の分泌を可能にするシグナルペプチドについてコードする配列を含む、
ＤＮＡ配列をも本発明の対象とする。
（ｉ）４つの突然変異３３４Ｎ、３５２Ｓ、３７８Ｖおよび３９７Ｍと、
（ｉｉ）４３４Ｙ、４３４Ｓ、２２６Ｇ、Ｐ２２８Ｌ、Ｐ２２８Ｒ、２３０Ｓ、２３０Ｔ、２３０Ｌ、２４１Ｌ、２６４Ｅ、３０７Ｐ、３１５Ｄ、３３０Ｖ、３６２Ｒ、３８９Ｔおよび３８９Ｋの中から選択された少なくとも１つの突然変異と、
を含み、
付番がＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番であり、
任意には、前記変異体の分泌を可能にするシグナルペプチドについてコードする配列を含む、
ＤＮＡ配列をも本発明の対象とする。
【0084】
特定の一実施形態において、前記変異体はＹ２９６Ｗ、Ｋ２９０Ｇ、Ｖ２４０Ｈ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２４０Ｍ、Ｖ２４０Ｎ、Ｖ２４０Ｓ、Ｆ２４１Ｈ、Ｆ２４１Ｙ、Ｌ２４２Ａ、Ｌ２４２Ｆ、Ｌ２４２Ｇ、Ｌ２４２Ｈ、Ｌ２４２Ｉ、Ｌ２４２Ｋ、Ｌ２４２Ｐ、Ｌ２４２Ｓ、Ｌ２４２Ｔ、Ｌ２４２Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｓ、Ｅ２５８Ｇ、Ｅ２５８Ｉ、Ｅ２５８Ｒ、Ｅ２５８Ｍ、Ｅ２５８Ｑ、Ｅ２５８Ｙ、Ｖ２５９Ｃ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ２５９Ｌ、Ｔ２６０Ａ、Ｔ２６０Ｈ、Ｔ２６０Ｉ、Ｔ２６０Ｍ、Ｔ２６０Ｎ、Ｔ２６０Ｒ、Ｔ２６０Ｓ、Ｔ２６０Ｗ、Ｖ２６２Ｓ、Ｖ２６３Ｔ、Ｖ２６４Ｌ、Ｖ２６４Ｓ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６６Ｌ、Ｓ２６７Ａ、Ｓ２６７Ｑ、Ｓ２６７Ｖ、Ｋ２９０Ｄ、Ｋ２９０Ｅ、Ｋ２９０Ｈ、Ｋ２９０Ｌ、Ｋ２９０Ｎ、Ｋ２９０Ｑ、Ｋ２９０Ｒ、Ｋ２９０Ｓ、Ｋ２９０Ｙ、Ｐ２９１Ｇ、Ｐ２９１Ｑ、Ｐ２９１Ｒ、Ｒ２９２Ｉ、Ｒ２９２Ｌ、Ｅ２９３Ａ、Ｅ２９３Ｄ、Ｅ２９３Ｇ、Ｅ２９３Ｍ、Ｅ２９３Ｑ、Ｅ２９３Ｓ、Ｅ２９３Ｔ、Ｅ２９４Ａ、Ｅ２９４Ｇ、Ｅ２９４Ｐ、Ｅ２９４Ｑ、Ｅ２９４Ｒ、Ｅ２９４Ｔ、Ｅ２９４Ｖ、Ｑ２９５Ｉ、Ｑ２９５Ｍ、Ｙ２９６Ｈ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｒ、Ｙ３００Ｉ、Ｙ３００Ｖ、Ｙ３００Ｗ、Ｒ３０１Ａ、Ｒ３０１Ｍ、Ｒ３０１Ｐ、Ｒ３０１Ｓ、Ｖ３０２Ｆ、Ｖ３０２Ｌ、Ｖ３０２Ｍ、Ｖ３０２Ｒ、Ｖ３０２Ｓ、Ｖ３０３Ｓ、Ｖ３０３Ｙ、Ｓ３０４Ｔ、Ｖ３０５Ａ、Ｖ３０５Ｆ、Ｖ３０５Ｉ、Ｖ３０５Ｌ、Ｖ３０５ＲおよびＶ３０５Ｓの中から選択されたＦｃフラグメント内の少なくとも１つの突然変異（ｉｉｉ）をさらに含み、付番はＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番である。
【0085】
代替的には、本発明に係るポリペプチドは、培養中の哺乳動物の細胞内で産生され得る。好ましい細胞は、ラット系統ＹＢ２／０、ハムスター系統ＣＨＯ、詳細にはＣＨＯ ｄｈｆｒ－およびＣＨＯ Ｌｅｃ１３系統、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌ）、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ＨｅＬａ、ＢＨＫまたはＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞である。好ましくは、ハムスター系統ＣＨＯが使用される。
【0086】
したがって、本発明は同様に、Ｆｃフラグメントを含む親ポリペプチドの変異体の産生方法において、前記変異体が親ポリペプチドの親和性と比べ、ＦｃＲｎ受容体に対する増大した親和性、ならびにＦｃγＲＩ受容体（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩａ受容体（ＣＤ３２ａ）の中から選択された少なくとも１つのＦｃフラグメントの受容体（ＦｃＲ）に対する増大した親和性を有し、
（ｉ）４つの突然変異３３４Ｎ、３５２Ｓ、３７８Ｖおよび３９７Ｍと、
（ｉｉ）４３４Ｙ ４３４Ｓ、２２６Ｇ、Ｐ２２８Ｌ、Ｐ２２８Ｒ、２３０Ｓ、２３０Ｔ、２３０Ｌ、２４１Ｌ、２６４Ｅ、３０７Ｐ、３１５Ｄ、３３０Ｖ、３６２Ｒ、３８９Ｔおよび３８９Ｋの中から選択された少なくとも１つの突然変異と、
を含み、
付番がＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番であり、
培養中の哺乳動物細胞内での前記変異体の発現を含む、
方法を対象とする。
（ｉ）４つの突然変異３３４Ｎ、３５２Ｓ、３７８Ｖおよび３９７Ｍと、
（ｉｉ）４３４Ｙ ４３４Ｓ、２２６Ｇ、Ｐ２２８Ｌ、Ｐ２２８Ｒ、２３０Ｓ、２３０Ｔ、２３０Ｌ、２４１Ｌ、２６４Ｅ、３０７Ｐ、３１５Ｄ、３３０Ｖ、３６２Ｒ、３８９Ｔおよび３８９Ｋの中から選択された少なくとも１つの突然変異と、
を含み、
付番がＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番であり、
培養中の哺乳動物細胞内での前記変異体の発現を含む、
方法を対象とする。
【0087】
特定の一実施形態において、前記変異体は、Ｙ２９６Ｗ、Ｋ２９０Ｇ、Ｖ２４０Ｈ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２４０Ｍ、Ｖ２４０Ｎ、Ｖ２４０Ｓ、Ｆ２４１Ｈ、Ｆ２４１Ｙ、Ｌ２４２Ａ、Ｌ２４２Ｆ、Ｌ２４２Ｇ、Ｌ２４２Ｈ、Ｌ２４２Ｉ、Ｌ２４２Ｋ、Ｌ２４２Ｐ、Ｌ２４２Ｓ、Ｌ２４２Ｔ、Ｌ２４２Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｓ、Ｅ２５８Ｇ、Ｅ２５８Ｉ、Ｅ２５８Ｒ、Ｅ２５８Ｍ、Ｅ２５８Ｑ、Ｅ２５８Ｙ、Ｖ２５９Ｃ、Ｖ２５９Ｉ、Ｖ２５９Ｌ、Ｔ２６０Ａ、Ｔ２６０Ｈ、Ｔ２６０Ｉ、Ｔ２６０Ｍ、Ｔ２６０Ｎ、Ｔ２６０Ｒ、Ｔ２６０Ｓ、Ｔ２６０Ｗ、Ｖ２６２Ｓ、Ｖ２６３Ｔ、Ｖ２６４Ｌ、Ｖ２６４Ｓ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６６Ｌ、Ｓ２６７Ａ、Ｓ２６７Ｑ、Ｓ２６７Ｖ、Ｋ２９０Ｄ、Ｋ２９０Ｅ、Ｋ２９０Ｈ、Ｋ２９０Ｌ、Ｋ２９０Ｎ、Ｋ２９０Ｑ、Ｋ２９０Ｒ、Ｋ２９０Ｓ、Ｋ２９０Ｙ、Ｐ２９１Ｇ、Ｐ２９１Ｑ、Ｐ２９１Ｒ、Ｒ２９２Ｉ、Ｒ２９２Ｌ、Ｅ２９３Ａ、Ｅ２９３Ｄ、Ｅ２９３Ｇ、Ｅ２９３Ｍ、Ｅ２９３Ｑ、Ｅ２９３Ｓ、Ｅ２９３Ｔ、Ｅ２９４Ａ、Ｅ２９４Ｇ、Ｅ２９４Ｐ、Ｅ２９４Ｑ、Ｅ２９４Ｒ、Ｅ２９４Ｔ、Ｅ２９４Ｖ、Ｑ２９５Ｉ、Ｑ２９５Ｍ、Ｙ２９６Ｈ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｒ、Ｙ３００Ｉ、Ｙ３００Ｖ、Ｙ３００Ｗ、Ｒ３０１Ａ、Ｒ３０１Ｍ、Ｒ３０１Ｐ、Ｒ３０１Ｓ、Ｖ３０２Ｆ、Ｖ３０２Ｌ、Ｖ３０２Ｍ、Ｖ３０２Ｒ、Ｖ３０２Ｓ、Ｖ３０３Ｓ、Ｖ３０３Ｙ、Ｓ３０４Ｔ、Ｖ３０５Ａ、Ｖ３０５Ｆ、Ｖ３０５Ｉ、Ｖ３０５Ｌ、Ｖ３０５ＲおよびＶ３０５Ｓの中から選択されたＦｃフラグメント内の少なくとも１つの突然変異（ｉｉｉ）をさらに含み、
付番はＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番である。
付番はＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番である。
【0088】
詳細には、このような方法は、以下のステップを含む。
ａ）変異体についてコードするＤＮＡ配列を調製するステップと、
ｂ）培養中の哺乳動物細胞内にａ）で得たＤＮＡ配列を導入するステップ（この導入は過渡的または安定的に実現可能である（すなわち細胞のゲノム内へのａ）で得たＤＮＡ配列の組込み））、および
ｃ）ｂ）で得た細胞から変異体を発現するステップ、そして
ｄ）任意には、培地内で変異体を回収するステップ。
ａ）変異体についてコードするＤＮＡ配列を調製するステップと、
ｂ）培養中の哺乳動物細胞内にａ）で得たＤＮＡ配列を導入するステップ（この導入は過渡的または安定的に実現可能である（すなわち細胞のゲノム内へのａ）で得たＤＮＡ配列の組込み））、および
ｃ）ｂ）で得た細胞から変異体を発現するステップ、そして
ｄ）任意には、培地内で変異体を回収するステップ。
【0089】
本発明は同様に、（ｉ）本発明に係るポリペプチド、および（ｉｉ）医薬的に許容可能な少なくとも１つの賦形剤を含む医薬組成物をも対象とする。
【0090】
本発明は同様に、（ｉ）付番がＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番であるものとして、５つの突然変異Ｎ４３４Ｙ、Ｋ３３４Ｎ、Ｐ３５２Ｓ、Ｖ３９７ＭおよびＡ３７８Ｖを有する特にＩｇＧ１のＦｃフラグメントからなる変異体、および（ｉｉ）医薬的に許容可能な少なくとも１つの賦形剤を含む医薬組成物をも対象とする。好ましくは、本発明の組成物は、（ｉ）付番がＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番であるものとして、６つの突然変異Ｎ４３４Ｙ、Ｋ３３４Ｎ、Ｐ３５２Ｓ、Ｖ３９７ＭおよびＡ３７８Ｖ、Ｙ２９６Ｗを有する特にＩｇＧ１のＦｃフラグメントからなる変異体、およびｉｉ）医薬的に許容可能な少なくとも１つの賦形剤を含む。
【0091】
本発明は同様に、薬剤として使用するための本発明に係るポリペプチドまたは上述の通りの組成物をも対象とする。
【0092】
本発明は同様に、付番がＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番であるものとして（すなわち変異体Ｎ４３４Ｙ／Ｋ３３４Ｎ／Ｐ３５２Ｓ／Ｖ３９７Ｍ／Ａ３７８Ｖ）５つの突然変異Ｎ４３４Ｙ、Ｋ３３４Ｎ、Ｐ３５２Ｓ、Ｖ３９７ＭおよびＡ３７８Ｖを有する特にＩｇＧ１のＦｃフラグメントからなる変異体の、薬剤としての使用をも対象とする。特定の一実施形態において、本発明は同様に、付番がＫａｂａｔ中のＥＵインデックスまたは等価物の付番であるものとして（すなわち変異体Ｎ４３４Ｙ／Ｋ３３４Ｎ／Ｐ３５２Ｓ／Ｖ３９７Ｍ／Ａ３７８Ｖ／Ｙ２９６Ｗ）６つの突然変異Ｎ４３４Ｙ、Ｙ２９６Ｗ、Ｋ３３４Ｎ、Ｐ３５２Ｓ、Ｖ３９７Ｍ、Ａ３７８ＶおよびＹ２９６Ｗを有する特にＩｇＧ１のＦｃフラグメントからなる変異体の、薬剤としての使用をも対象とする。
【0093】
前述の通り、有利には、親ポリペプチド、したがって本発明のポリペプチドは、抗体である。この場合、抗体は、腫瘍抗原、ウィルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、毒素、膜サイトカインまたは循環サイトカイン、膜受容体の中から選択された抗原に対して向けられ得る。
【0094】
抗体が腫瘍抗原に対して向けられる場合、その使用は、癌治療において特に適切である。「癌」とは、細胞の異常増殖により特徴付けられるあらゆる生理学的条件を意味する。癌の例には、特に上皮腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫（脂肪肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍、中皮腫、髄膜腫、腺癌、黒色腫、白血病、および悪性リンパ様病理が含まれるが、このリストは網羅的なものではない。
【0095】
抗体がウィルス抗原に対して向けられる場合、その使用は、ウィルス感染症の治療において特に適切である。ウィルス感染症は、特に、ＨＩＶ、レトロウィルス、コクサッキーウィルス、天然痘ウィルス、インフルエンザウィルス、黄熱病ウィルス、ウエストナイル熱ウィルス、サイトメガロウィルス、ロタウィルスまたはＢ型もしくはＣ型肝炎ウィルスに起因する感染症であるが、このリストは網羅的なものではない。
【0096】
抗体が毒素に対して向けられる場合、その使用は細菌感染症、例えば破傷風毒素、ジフテリア毒素、炭疽菌毒素による感染症の治療において、さらにはボツリヌス菌毒素、リシン毒素、志賀毒素による感染症の治療において特に適切であるが、このリストは網羅的なものではない。
【0097】
抗体がサイトカインに対して向けられる場合、その使用は、炎症性および／または自己免疫性疾患の治療において特に適切である。炎症性および／または自己免疫性疾患には特に、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、移植片または器官の拒絶反応、移植片対宿主病、リウマチ性多発性関節炎、全身性エリテマトーデス、さまざまなタイプの硬化症、初発性シェーグレン症候群（またはＧｏｕｇｅｒｏｔ－Ｓｊｏｇｒｅｎ症候群）、多発性硬化症などの自己免疫性多発ニューロパシー、Ｉ型糖尿病、自己免疫性肝炎、強直性脊椎関節炎、ライター症候群、痛風関節炎、腹腔疾患、クローン病、橋本慢性甲状腺炎（甲状腺機能低下症）、アジソン病、自己免疫性肝炎、バセドー氏病（甲状腺機能亢進症）、潰瘍性大腸炎、ＡＮＣＡ（好中球の抗細胞質抗体）に結び付けられる全身性血管炎のような血管炎、成人および小児の自己免疫性血球減少症および他の血液系の合併症、例えば、急性または慢性自己免疫性血小板減少症、自己免疫性溶血性貧血、新生児溶血性疾患（ＭＨＮ）、寒冷凝集素疾患、自己免疫性後天性血友病；グッドパスチャー症候群、膜外腎症、自己免疫性水疱性皮膚疾患、難治性筋無力症、混合性クリオグロブリン血症、乾癬、若年性慢性関節炎、炎症性筋炎、皮膚筋炎および抗リン脂質症候群を含めた小児の自己免疫性全身性疾患、結合組織疾患、自己免疫性肺炎、ギランバレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、自己免疫性甲状腺炎、糖尿病、重症筋無力症、自己免疫性炎症性眼疾患、視神経脊髄炎（デビック病）、強皮症、天疱瘡、インスリン抵抗性糖尿病、多発性筋炎、ボーマー貧血、糸球体腎炎、ウェゲナー病、ホートン病、結節性関節周囲炎およびチャーグ・ストラウス症候群、スティル病、萎縮性多発性軟骨炎、ベーチェット病、単クローン性免疫グロブリン血症、ウェグナー肉芽腫症、狼瘡、出血性直腸結腸炎、乾癬性関節炎、サルコイドーシス、膠原線維性大腸炎、疱疹状皮膚炎、家族性地中海熱、ＩｇＡ沈着性糸球体腎炎、ランバート・イートン型筋無力症候群、交感性眼炎、Ｆｉｅｓｓｉｎｇｅｒ－Ｌｅｒｏｙ－Ｒｅｉｔｅｒ症候群およびブドウ膜髄膜脳炎症候群が含まれる。
【0098】
例えば、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性敗血症性関節炎、アジュバント関節炎、アレルギー性脳脊髄炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性血管炎、アレルギー、ぜんそく、アテローム性動脈硬化症、慢性細菌またはウィルス感染症に起因する慢性炎症、慢性閉塞性気管支肺疾患（ＣＯＰＤ）、冠動脈疾患、脳炎、炎症性腸疾患、炎症性骨溶解、急性および遅発性感覚過敏反応関連炎症、腫瘍関連炎症、末梢神経病巣または脱髄性疾患、火傷および虚血などの組織の外傷性傷害に関連する炎症、髄膜炎に起因する炎症、多臓器機能不全症候群（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｏｒｇａｎ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＭＯＤＳ）、肺線維症、敗血症および敗血症性ショック、スティーブンス－ジョンソン症候群、未分化関節炎、および未分化脊椎関節症などの他の炎症性疾患も同様に含まれる。本発明の特定の実施形態において、自己免疫性疾患は、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）および慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）である。
【0099】
好ましくは、自己免疫性または炎症性病理は、免疫性血小板減少性紫斑病（特発性血小板減少性紫斑病、またはＩＴＰとも呼ばれる）、視神経脊髄炎またはデビック病（ＮＭＯ）および多発性硬化症の中から選択される。多発性硬化症は、特に、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルにより研究されている。
【0100】
本出願中に記載されている配列は、以下のように要約することができる。
【0101】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【0102】
本発明は、以下の実施例を読むことでより良く理解されるものである。
【0103】
図の凡例は以下の通りである。
【図面の簡単な説明】
【0104】
【図1】ベクターＢｃ４５１を用いた、ヤギおよびマウスの乳中における変異体Ａ３Ａ－１８４ＡＹの産生
【0105】
Ａ）ベータカゼインベクターＢｃ４５１をＸｈｏＩにより消化した。
ベクターＢｃ４５１中、ＮｏｔＩ－ＮｏｔＩフラグメントは原核生物フラグメントである。ＮｏｔＩ（１５３７０）－Ｘｈｏｌフラグメントは、ｐｏｌｙＡシグナルを含むゲノム配列３’である。ＢａｍＨＩ－Ｘｈｏｌフラグメントは、ベータカゼインのプロモーター領域である。
ベクターＢｃ４５１中、ＮｏｔＩ－ＮｏｔＩフラグメントは原核生物フラグメントである。ＮｏｔＩ（１５３７０）－Ｘｈｏｌフラグメントは、ｐｏｌｙＡシグナルを含むゲノム配列３’である。ＢａｍＨＩ－Ｘｈｏｌフラグメントは、ベータカゼインのプロモーター領域である。
【0106】
Ｂ）Ｆｃ変異体Ａ３Ａ－１８４ＡＹのコーディング領域（すなわちＦＣ３１７９ Ａ３Ａ－１８４ＡＹ ８８４ ｂｐ）を含むＳａｌｌフラグメントをベクター内に挿入して、遺伝的構造ＢＣ３１８０ ＦＣ Ａ３Ａ－１８４ＡＹ（Ｃ）を生成した。
【0107】
Ｄ）次に、原核生物ベクターから、マイクロインジェクション用のＤＮＡフラグメントを単離した。このために、ＮｏｔｌおよびＮｒｕ１によってＢＣ３１８０を消化した。ベータカゼインのプロモーターの制御下で（変異体Ａ３Ａ－１８４ＡＹをコードする）Ｆｃ遺伝子を含む１６．４ｋｂ遊離フラグメントを、その後ゲル溶出により精製した。
【0108】
【図2】Ｋ／ＢｘＮマウス血清のトランスファーにより誘発された関節炎の予防モデルにおける試験結果
【0109】
Ｃ５７／ＢＩ／６Ｊマウスに対して０日目に静脈内投与によりＫ／ＢｘＮマウス血清１０μｌをトランスファーすることによって、疾病を誘発した。０日目、Ｋ／ＢｘＮマウス血清の注射より２時間前に一回、被験分子を腹腔内投与した。
【0110】
４肢の指数を加算して、以下の臨床スコア（「ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｃｏｒｅ」）を得た。０＝正常、１＝１つの関節の膨れ、２＝２つ以上の関節の膨れ、および３＝全関節の重度の膨れ（任意単位）。
【0111】
【図3】Ｋ／ＢｘＮマウス血清のトランスファーにより誘発された関節炎の治療モデルにおける試験結果
【0112】
Ｃ５７／ＢＩ／６Ｊマウスに対して０日目に静脈内投与によりＫ／ＢｘＮマウス血清１０μｌをトランスファーすることによって、疾病を誘発した。０日目、Ｋ／ＢｘＮマウス血清の注射から７２時間後に、一回、被験分子を腹腔内投与した（点線で表示）。
【0113】
４肢の指数を加算して、以下の臨床スコア（「ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｃｏｒｅ」）を得た。０＝正常、１＝１つの関節の膨れ、２＝２つ以上の関節の膨れ、および３＝全関節の重度の膨れ（任意単位）。
【0114】
【図4】血液細胞に対するＦｃおよびＩｇＩＶの結合試験の結果
【0115】
Ａｌｅｘａで標識された本発明に係るＦｃ変異体またはＩｇＩＶを、氷上で２０分間、標的細胞と共に６５ｎＭ（ＣＳＦ２％のＰＢＳ中でＦｃについて１０μｇ／ｍｌ）でインキュベートした。ＣＳＦ２％のＰＢＳ中で２回洗浄した後、フローサイトメトリーによる分析の前に５００μｌのＩｓｏｆｌｏｗ中で細胞を懸濁させた。
【0116】
結果は以下の通りである。
Ａ）抗ＣＤ１９で標識されたＢ細胞（「％陽性Ｂ細胞」）、
Ｂ）抗ＣＤ５６で標識されたＮＫ細胞（「％陽性ＮＫ細胞」）、
Ｃ）ＩｇＩＶの存在下で、抗ＣＤ１４で標識された単球（「％陽性細胞＋ＩｇＩＶ」）、
Ｄ）ＩｇＩＶの存在下で、抗ＣＤ１４および抗ＣＤ１６抗体３Ｇ８で標識されたＣＤ１６＋単球（「％陽性細胞＋ＩｇＩＶ」）、
Ｅ）ＩｇＩＶの存在下で、抗ＣＤ１５で標識された好中球（「％陽性細胞＋ＩｇＩＶ」）、
Ｆ）ＩｇＩＶまたはＷＴ Ｆｃの存在下で、抗ＣＤ５６で標識されたＮＫ細胞（「％細胞陽性」）。
Ａ）抗ＣＤ１９で標識されたＢ細胞（「％陽性Ｂ細胞」）、
Ｂ）抗ＣＤ５６で標識されたＮＫ細胞（「％陽性ＮＫ細胞」）、
Ｃ）ＩｇＩＶの存在下で、抗ＣＤ１４で標識された単球（「％陽性細胞＋ＩｇＩＶ」）、
Ｄ）ＩｇＩＶの存在下で、抗ＣＤ１４および抗ＣＤ１６抗体３Ｇ８で標識されたＣＤ１６＋単球（「％陽性細胞＋ＩｇＩＶ」）、
Ｅ）ＩｇＩＶの存在下で、抗ＣＤ１５で標識された好中球（「％陽性細胞＋ＩｇＩＶ」）、
Ｆ）ＩｇＩＶまたはＷＴ Ｆｃの存在下で、抗ＣＤ５６で標識されたＮＫ細胞（「％細胞陽性」）。
【0117】
【図5】Ｊｕｒｋａｔ ＣＤ６４細胞およびＣＤＣの活性化の、ＡＤＣＣ試験結果
【0118】
Ａ）Ｊｕｒｋａｔ ＣＤ６４細胞の活性化の阻害
Ｒａｊｉ細胞（５×１０６細胞／ｍｌで５０μｌ）を、リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）（２μｇ／ｍｌで５０μｌ）、ヒトＣＤ６４を発現するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－Ｈ－ＣＤ６４）（５×１０６細胞／ｍｌで２５μｌ）、ＰＭＡ（４０ｎｇ／ｍｌで５０μｌ）と混合し、その後１９５０ｎＭで、本発明に係る変異体（ＲＦＣ Ａ３Ａ－１８４ＡＹ）またはＩｇＩＶと共にインキュベートした。
一晩インキュベートした後、プレートを遠心分離し（１分間１２５ｇ）、上清に含まれたＩＬ２をＥＬＩＳＡにより評価した。
結果は、以下の式により、ＩｇＩＶとの関係における百分率として表されている：（ＩＬ－２ ＩｇＩＶ／試料のＩＬ－２）×１００
Ｒａｊｉ細胞（５×１０６細胞／ｍｌで５０μｌ）を、リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）（２μｇ／ｍｌで５０μｌ）、ヒトＣＤ６４を発現するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－Ｈ－ＣＤ６４）（５×１０６細胞／ｍｌで２５μｌ）、ＰＭＡ（４０ｎｇ／ｍｌで５０μｌ）と混合し、その後１９５０ｎＭで、本発明に係る変異体（ＲＦＣ Ａ３Ａ－１８４ＡＹ）またはＩｇＩＶと共にインキュベートした。
一晩インキュベートした後、プレートを遠心分離し（１分間１２５ｇ）、上清に含まれたＩＬ２をＥＬＩＳＡにより評価した。
結果は、以下の式により、ＩｇＩＶとの関係における百分率として表されている：（ＩＬ－２ ＩｇＩＶ／試料のＩＬ－２）×１００
【0119】
Ｂ）ＡＤＣＣの阻害
エフェクター細胞（単核細胞）（８×１０７細胞／ｍｌで２５μｌ）およびＲｈ（Ｒｈｅｓｕｓ）陽性赤血球細胞（最終４×１０７細胞／ｍｌで２５μｌ）を、異なる濃度（０～７５ｎｇ／ｍｌ）の抗ＲｈＤ抗体と、２／１のエフェクター／標的比でインキュベートした。１６時間のインキュベーション後、特異的基質（ＤＡＦ）を用いて上清中に遊離したへモグロビンを定量することによって溶解を推定した。
結果は、抗体数量に応じた特異的溶解百分率で表されている。ＡＤＣＣの阻害は、３３ｎＭで添加した本発明に係るＦｃ変異体（ＲＦＣ Ａ３Ａ－１８４ＡＹ）またはＩｇＩＶによって誘発された。
結果を百分率で表し、１００％と０％は、以下の式によってそれぞれ６５０ｎＭおよび０ｎＭでＩｇＩＶを用いて得られた値である。
［（３３ｎＭで試料を伴うＡＤＣＣ－ＩＶＩｇ無しのＡＤＣＣ）／（３３ｎＭでＩｇＩＶを伴うＡＤＣＣ－ＩＶＩｇ無しのＡＤＣＣ）×１００］
エフェクター細胞（単核細胞）（８×１０７細胞／ｍｌで２５μｌ）およびＲｈ（Ｒｈｅｓｕｓ）陽性赤血球細胞（最終４×１０７細胞／ｍｌで２５μｌ）を、異なる濃度（０～７５ｎｇ／ｍｌ）の抗ＲｈＤ抗体と、２／１のエフェクター／標的比でインキュベートした。１６時間のインキュベーション後、特異的基質（ＤＡＦ）を用いて上清中に遊離したへモグロビンを定量することによって溶解を推定した。
結果は、抗体数量に応じた特異的溶解百分率で表されている。ＡＤＣＣの阻害は、３３ｎＭで添加した本発明に係るＦｃ変異体（ＲＦＣ Ａ３Ａ－１８４ＡＹ）またはＩｇＩＶによって誘発された。
結果を百分率で表し、１００％と０％は、以下の式によってそれぞれ６５０ｎＭおよび０ｎＭでＩｇＩＶを用いて得られた値である。
［（３３ｎＭで試料を伴うＡＤＣＣ－ＩＶＩｇ無しのＡＤＣＣ）／（３３ｎＭでＩｇＩＶを伴うＡＤＣＣ－ＩＶＩｇ無しのＡＤＣＣ）×１００］
【0120】
Ｃ）ＣＤＣの阻害活性：
Ｒａｊｉ細胞を３０分間、最終濃度５０ｎｇ／ｍｌのリツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）と共にインキュベートした。１／１０に希釈し、予め本発明のＦｃ変異体（ｒＦｃ Ａ３Ａ－１８４ＡＹ）またはＩｇＩＶ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）と共に３７℃で１時間インキュベートした子ウサギの血清溶液を添加した。３７℃で１時間のインキュベーションの後、プレートを遠心分離（１分間１２５ｇ）し、培地中に遊離した細胞内ＬＤＨを測定することによってＣＤＣを推定した。
結果を阻害百分率で表し、ＩｇＩＶおよび負の対照群（Ｆｃ機能の無いＦｃ、すなわちｒＦｃ ｎｅｇ）と比較し、１００％は溶解活性の完全な阻害に対応し、０％はＦｃまたはＩｇＩＶ無しで得た対照値に対応していた。
Ｒａｊｉ細胞を３０分間、最終濃度５０ｎｇ／ｍｌのリツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）と共にインキュベートした。１／１０に希釈し、予め本発明のＦｃ変異体（ｒＦｃ Ａ３Ａ－１８４ＡＹ）またはＩｇＩＶ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）と共に３７℃で１時間インキュベートした子ウサギの血清溶液を添加した。３７℃で１時間のインキュベーションの後、プレートを遠心分離（１分間１２５ｇ）し、培地中に遊離した細胞内ＬＤＨを測定することによってＣＤＣを推定した。
結果を阻害百分率で表し、ＩｇＩＶおよび負の対照群（Ｆｃ機能の無いＦｃ、すなわちｒＦｃ ｎｅｇ）と比較し、１００％は溶解活性の完全な阻害に対応し、０％はＦｃまたはＩｇＩＶ無しで得た対照値に対応していた。
【0121】
【図6】血液細胞に対する結合の試験結果
【0122】
Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ（登録商標）で標識されたＩｇＩＶ、Ｆｃ－Ｒｅｃ（野生Ｆｃ）、Ｆｃ ＭＳＴ－ＨＮまたは本発明に係るＦｃ変異体（Ａ３Ａ－１８４ＡＹ＿ＣＨＯ、Ａ３Ａ－１８４ＥＹ＿ＣＨＯ）を、氷上で２０分間、標的細胞と共に６５ｎＭ（ＣＳＦ（Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）２％のＰＢＳ中でＦｃについて１０μｇ／ｍｌ）でインキュベートした。ＣＳＦ２％のＰＢＳ中で２回洗浄した後、フローサイトメトリーによる分析の前に５００μｌのＩｓｏｆｌｏｗ中に細胞を懸濁させた。試験は、以下の標的細胞について実施される。
－ 抗ＣＤ５６で標識されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、
－ 抗ＣＤ１４で標識された単球、
－ 抗ＣＤ１４および抗ＣＤ１６ ３Ｇ８抗体で標識された単球ＣＤ１６＋、
－ 抗ＣＤ１５で標識された好中球。
－ 抗ＣＤ５６で標識されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、
－ 抗ＣＤ１４で標識された単球、
－ 抗ＣＤ１４および抗ＣＤ１６ ３Ｇ８抗体で標識された単球ＣＤ１６＋、
－ 抗ＣＤ１５で標識された好中球。
【0123】
【図7】特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）の生体モデルにおける試験結果
【0124】
マウスのスロンボサイト（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅ）とも呼ばれる血小板を枯渇させるために静脈内投与により抗血小板抗体６Ａ６－ｈｌｇＧ１（体重１ｇあたり０．３μｇ）を注射することによってヒト化されたＦｃＲｎを発現するマウスにおいて、疾病を誘発した。負の対照（「ＣＴＬ ＰＢＳ」）、ＩｇＩＶ（１０００ｍｇ／ｋｇ）、Ｆｃ－Ｒｅｃフラグメント（野生のＦｃ）（３８０および７５０ｍｇ／ｋｇ）、ＦｃフラグメントＭＳＴ－ＨＮ（１９０ｍｇ／ｋｇ）および本発明のＦｃ変異体Ａ３Ａ－１８４ＡＹ＿ＣＨＯ（１９０ｍｇ／ｋｇおよび３８０ｍｇ／ｋｇ）を、血小板枯渇の２時間前に腹腔内投与した。血小板数値表現は、Ａｄｖｉａ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｂａｙｅｒ）システムを用いて決定した。抗体注入前の血小板の数を１００％と定めた。
【発明を実施するための形態】
【実施例0125】
実施例１：トランスジェニック動物の乳中で産生された本発明に係る変異体（突然変異したＦｃフラグメント）の調製、およびこの変異体の特徴付け
Ｉ． 材料と方法
原理：
本発明に係るＦｃフラグメントは、乳の特異的発現ベクター内にＦｃフラグメントのコード配列を置くことによって、トランスジェニック動物の乳中で産生させることができる。ベクターは、マイクロインジェクションによりトランスジェニックヤギまたはマウスのゲノム内に導入可能である。トランス遺伝子を有する動物のスクリーニングおよび同定の後、雌を繁殖させる。分娩の後、雌を搾乳することで、乳の特異的プロモーターの発現後にＦｃが分泌された可能性のあるその乳を回収することができる。
Ｉ． 材料と方法
原理：
本発明に係るＦｃフラグメントは、乳の特異的発現ベクター内にＦｃフラグメントのコード配列を置くことによって、トランスジェニック動物の乳中で産生させることができる。ベクターは、マイクロインジェクションによりトランスジェニックヤギまたはマウスのゲノム内に導入可能である。トランス遺伝子を有する動物のスクリーニングおよび同定の後、雌を繁殖させる。分娩の後、雌を搾乳することで、乳の特異的プロモーターの発現後にＦｃが分泌された可能性のあるその乳を回収することができる。
【0126】
【表2】
【0127】
配列番号１３の配列を得る目的で、タンパク質配列のＮ末端端部にシグナルペプチド（ＭＲＷＳＷＩＦＬＬＬＬＳＩＴＳＡＮＡ、配列番号１２）を結合させる。これにより、ひとたび発現された時点で、乳中のタンパク質の分泌が可能になる。
【0128】
ヌクレオチド配列の最適化
ヤギの乳腺内での発現のために、ヌクレオチド配列を最適化した。そのために、合成遺伝子供給業者（ＧｅｎｅＡｒｔなど）のアルゴリズムによりＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ（ウシ）種について配列を最適化した。
ヤギの乳腺内での発現のために、ヌクレオチド配列を最適化した。そのために、合成遺伝子供給業者（ＧｅｎｅＡｒｔなど）のアルゴリズムによりＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ（ウシ）種について配列を最適化した。
【0129】
発現ベクター
マウスおよびヤギの乳中における変異体Ａ３Ａ－１８４ＡＹの産生のためには、ヤギのベータカゼイン（Ｂｃ４５１）の発現ベクターを使用した。(図１参照)
ベータカゼインベクターＢｃ４５１をＸｈｏｌで消化させた（図１Ａ）。Ｆｃ変異体Ａ３Ａ－１８４ＡＹのコード領域を含むＳａｌｌフラグメントを挿入して、遺伝構造ＢＣ３１８０ ＦＣ Ａ３Ａ－１８４ＡＹを生成した（図１Ｂおよび１Ｃ）。
マウスおよびヤギの乳中における変異体Ａ３Ａ－１８４ＡＹの産生のためには、ヤギのベータカゼイン（Ｂｃ４５１）の発現ベクターを使用した。(図１参照)
ベータカゼインベクターＢｃ４５１をＸｈｏｌで消化させた（図１Ａ）。Ｆｃ変異体Ａ３Ａ－１８４ＡＹのコード領域を含むＳａｌｌフラグメントを挿入して、遺伝構造ＢＣ３１８０ ＦＣ Ａ３Ａ－１８４ＡＹを生成した（図１Ｂおよび１Ｃ）。
【0130】
次に、マイクロインジェクション用のＤＮＡフラグメントを、原核生物ベクターから単離した。
【0131】
ＮｏｔＩおよびＮｒｕＩにより、ＢＣ３１８０を消化させた（図１Ｄ）。次に、ベータカゼインのプロモーターの制御下でＦｃ遺伝子を含む１６．４ｋｂの遊離フラグメントを、ゲル溶出によって精製した。このＤＮＡを次にマイクロインジェクションステップにおいて使用した。
【0132】
マウスにおける産生
着床前のマウスの胚中にマイクロインジェクションによりＤＮＡフラグメントを挿入した。次に、擬妊娠状態の雌の体内に、胚を移植した。生まれた後世代を、ＰＣＲ分析によってトランス遺伝子の存在についてスクリーニングした。
着床前のマウスの胚中にマイクロインジェクションによりＤＮＡフラグメントを挿入した。次に、擬妊娠状態の雌の体内に、胚を移植した。生まれた後世代を、ＰＣＲ分析によってトランス遺伝子の存在についてスクリーニングした。
【0133】
ヤギにおける発現
マイクロインジェクションのために調製したＤＮＡフラグメントは同様に、ヤギの乳中でのＦｃ変異体Ａ３Ａ－１８４ＡＹの産生のためにも使用することができる。
マイクロインジェクションのために調製したＤＮＡフラグメントは同様に、ヤギの乳中でのＦｃ変異体Ａ３Ａ－１８４ＡＹの産生のためにも使用することができる。
【0134】
実施例２：ＨＥＫ細胞内で産生された本発明に係る変異体（突然変異したＦｃフラグメント）の調製、およびこの変異体の特徴付け
Ｉ．産生のための材料および方法
所望のアミノ酸をコードするコドンで標的化された単数または複数の突然変異を組込むために適応された２つのプライマーセットを用いて、オーバーラップＰＣＲにより、配列番号１４の配列のＦｃフラグメント内の各々の対象突然変異を挿入した。有利には、挿入すべき突然変異がＦｃの配列上に近い場合、これらの突然変異は同じオリゴヌクレオチドを介して付加される。このようにしてＰＣＲによって得られたフラグメントを会合させ、結果として得たフラグメントを、標準的プロトコールを用いてＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ生成物を１％（ｗ／ｖ）のアガロースゲル上で精製し、適切な制限酵素を用いて消化させ、クローン化した。
Ｉ．産生のための材料および方法
所望のアミノ酸をコードするコドンで標的化された単数または複数の突然変異を組込むために適応された２つのプライマーセットを用いて、オーバーラップＰＣＲにより、配列番号１４の配列のＦｃフラグメント内の各々の対象突然変異を挿入した。有利には、挿入すべき突然変異がＦｃの配列上に近い場合、これらの突然変異は同じオリゴヌクレオチドを介して付加される。このようにしてＰＣＲによって得られたフラグメントを会合させ、結果として得たフラグメントを、標準的プロトコールを用いてＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ生成物を１％（ｗ／ｖ）のアガロースゲル上で精製し、適切な制限酵素を用いて消化させ、クローン化した。
【0135】
ベクターｐＣＥＰ４を使用することにより、Ｌ－グルタミンが追加されたＦ１７媒質中のＨＥＫ２９３細胞（２９３－Ｆ細胞、ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ＩｎｖｉｔｒｏＧｅｎ）中で、一過性トランスフェクション（リポフェクションによる）により、組換え型Ｆｃフラグメントを産生した。８日間培養した後、遠心分離によって上清を清澄化させ、０．２μｍのフィルター上で濾過する。その後、ＦｃフラグメントをプロテインＡ Ｈｉ－Ｔｒａｐ上で精製し、ｐＨ＝３．０の２５ｍＭのクエン酸塩緩衝液を用いて溶出を行ない、ＰＢＳ中での中和および透析の後に濾過（０．２μｍ）による滅菌を行なう。
【0136】
ＩＩ． Ｏｃｔｅｔ（登録商標）上の結合試験（ＢＬＩ「Ｂｉｏ－Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ」技術、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６機器、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ，Ｐａｌｌ）
プロトコール：
ヒトＦｃＲｎ（ｈＦｃＲｎ）に対する結合：
ビオチン化ｈＦｃＲｎ受容体を、ランニング緩衝液（０．１Ｍのリン酸緩衝液、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％、ｐＨ６）中０．７μｇ／ｍｌで希釈した状態で、ストレプトアビジンバイオセンサー上で固定化する。本発明に係る変異体、ＷＴおよびＩｇＩＶを、ランニング緩衝液中で２００、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５および０ｎＭ（２００ｎＭ＝Ｆｃについて１０μｇ／ｍｌ）で試験した。
プロトコール：
ヒトＦｃＲｎ（ｈＦｃＲｎ）に対する結合：
ビオチン化ｈＦｃＲｎ受容体を、ランニング緩衝液（０．１Ｍのリン酸緩衝液、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％、ｐＨ６）中０．７μｇ／ｍｌで希釈した状態で、ストレプトアビジンバイオセンサー上で固定化する。本発明に係る変異体、ＷＴおよびＩｇＩＶを、ランニング緩衝液中で２００、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５および０ｎＭ（２００ｎＭ＝Ｆｃについて１０μｇ／ｍｌ）で試験した。
【0137】
－試験の設計：
ベースライン１×１２０秒、ランニング緩衝液中、
ローディング３００秒：バイオセンサ上に受容体を投入する、
ベースライン２×６０秒、ランニング緩衝液中、
会合６０秒：ｈＦｃＲｎが投入されたバイオセンサに対して試料（ＦｃまたはＩＶＩｇ）を添加する、
解離３０秒、ランニング緩衝液中、
再生１２０秒、再生緩衝液中（リン酸緩衝液０．１Ｍ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％、ｐＨ７．８）。
ベースライン１×１２０秒、ランニング緩衝液中、
ローディング３００秒：バイオセンサ上に受容体を投入する、
ベースライン２×６０秒、ランニング緩衝液中、
会合６０秒：ｈＦｃＲｎが投入されたバイオセンサに対して試料（ＦｃまたはＩＶＩｇ）を添加する、
解離３０秒、ランニング緩衝液中、
再生１２０秒、再生緩衝液中（リン酸緩衝液０．１Ｍ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％、ｐＨ７．８）。
【0138】
－結果の解釈：
会合および解離曲線（最初の１０秒）を使用して、会合モデル１／１を用いて会合速度定数（ｋoｎ）および解離速度定数（ｋoｆｆ）を計算する。その後、ＫＤ（ｎＭ）を計算する（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）。
会合および解離曲線（最初の１０秒）を使用して、会合モデル１／１を用いて会合速度定数（ｋoｎ）および解離速度定数（ｋoｆｆ）を計算する。その後、ＫＤ（ｎＭ）を計算する（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）。
【0139】
ｈＣＤ１６ａＶおよびｈＣＤ３２ａＨ受容体に対する結合：
ｈＣＤ１６ａＶ受容体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）またはｈＣＤ３２ａＨ受容体（ＰＸ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）Ｈｉｓ Ｔａｇを、速度論的緩衝液（Ｐａｌｌ）中１μ／ｍｌに希釈された状態で、抗Ｐｅｎｔａ－ＨＩＳバイオセンサー（ＨＩＳ １Ｋ）上で固定化する。本発明に係るＦｃ変異体、ＷＴおよびＩｇＩＶを、速度論的緩衝液中で１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５および０ｎＭで試験した。
ｈＣＤ１６ａＶ受容体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）またはｈＣＤ３２ａＨ受容体（ＰＸ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）Ｈｉｓ Ｔａｇを、速度論的緩衝液（Ｐａｌｌ）中１μ／ｍｌに希釈された状態で、抗Ｐｅｎｔａ－ＨＩＳバイオセンサー（ＨＩＳ １Ｋ）上で固定化する。本発明に係るＦｃ変異体、ＷＴおよびＩｇＩＶを、速度論的緩衝液中で１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５および０ｎＭで試験した。
【0140】
－各試料の前のローディング、
－試験の設計：全ステップを、速度論的緩衝液（Ｐａｌｌ）中で実施する。
ベースライン １×６０秒
ローディング ４００秒
ベースライン ２×６０秒
会合 ６０秒
解離 ３０秒
再生 再生緩衝液（グリシン１０ｍＭ ｐＨ１．５／中和：ＰＢＳ）中で５秒。
－試験の設計：全ステップを、速度論的緩衝液（Ｐａｌｌ）中で実施する。
ベースライン １×６０秒
ローディング ４００秒
ベースライン ２×６０秒
会合 ６０秒
解離 ３０秒
再生 再生緩衝液（グリシン１０ｍＭ ｐＨ１．５／中和：ＰＢＳ）中で５秒。
【0141】
－結果の解釈：
会合および解離曲線（最初の５秒）を使用して、会合モデル１／１を用いて会合速度定数（ｋoｎ）および解離速度定数（ｋoｆｆ）を計算する。その後、ＫＤ（ｎＭ）を計算する（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）。
会合および解離曲線（最初の５秒）を使用して、会合モデル１／１を用いて会合速度定数（ｋoｎ）および解離速度定数（ｋoｆｆ）を計算する。その後、ＫＤ（ｎＭ）を計算する（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）。
【0142】
結果：
結果を、下表１で提示した：
結果を、下表１で提示した：
【0143】
【表3】
【0144】
結果は、本発明に係るＦｃ変異体Ａ３Ａ＿１８４ＡＹ（ＨＥＫ）が、突然変異していない親Ｆｃ（Ｆｃ－ＷＴ）のみならずＩｇＩＶと比べても、ｈＦｃＲｎ受容体に対する増大した親和性、ならびにＦｃγＲＩＩＩａ受容体（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩａ受容体（ＣＤ３２ａ）に対する増大した親和性を同時に示している、ということを明らかにしている。
【0145】
ＩＩＩ． Ｋ／ＢｘＮマウス血清のトランスファーによって誘発された関節炎モデルに対する試験
プロトコール：
Ｔ細胞受容体ＫＲＮについてのトランスジェニックマウスをＮＯＤマウス株に交雑させることによって、Ｋ／ＢｘＮモデルを生成した。Ｋ／ＢｘＮ Ｆ１マウスは、生後３～５週で自発的に疾病を発生させ、ヒトリウマチ性関節炎と多くの臨床的特徴を共有する。
プロトコール：
Ｔ細胞受容体ＫＲＮについてのトランスジェニックマウスをＮＯＤマウス株に交雑させることによって、Ｋ／ＢｘＮモデルを生成した。Ｋ／ＢｘＮ Ｆ１マウスは、生後３～５週で自発的に疾病を発生させ、ヒトリウマチ性関節炎と多くの臨床的特徴を共有する。
【0146】
Ｃ５７／ＢＩ／６Ｊマウスに対して０日目に静脈内投与によりＫ／ＢｘＮマウス血清１０μｌをトランスファーすることによって、疾病を誘発した。０日目、Ｋ／ＢｘＮマウス血清の注射より２時間前またはその７２時間後に、一回、被験分子を腹腔内投与した。
【0147】
４肢の指数を足して、罹患率及び重症度を評価する目的で関節炎の兆候を追求し同定するために、毎日マウスを監視した：０＝正常、１＝１つの関節の膨れ、２＝２つ以上の関節の膨れ、および３＝全関節の重度の膨れ。
【0148】
結果
Ｋ／ＢｘＮ血清を受けたマウスは、関節内部に関節炎を発生させた。疾病は、踝のサイズ増大によって特徴付けられ、臨床スコアの増加を誘発した。これらのマウスは、生理学的血清で治療された対照マウスに比べて、臨床スコアおよび踝の厚みの有意な増大を示した。
Ｋ／ＢｘＮ血清を受けたマウスは、関節内部に関節炎を発生させた。疾病は、踝のサイズ増大によって特徴付けられ、臨床スコアの増加を誘発した。これらのマウスは、生理学的血清で治療された対照マウスに比べて、臨床スコアおよび踝の厚みの有意な増大を示した。
【0149】
１－予防モデル
Ｋ／ＢｘＮマウス血清の注射の２時間前に投与された、野生型のＦｃフラグメント（Ｆｃ ＷＴ）７５０ｍｇ／ｋｇによる治療は、Ｋ／ＢｘＮマウス血清によって治療された群に比べて、臨床スコアを有意に低下させた。
Ｋ／ＢｘＮマウス血清の注射の２時間前に投与された、野生型のＦｃフラグメント（Ｆｃ ＷＴ）７５０ｍｇ／ｋｇによる治療は、Ｋ／ＢｘＮマウス血清によって治療された群に比べて、臨床スコアを有意に低下させた。
【0150】
本発明に係るＦｃ変異体Ａ３Ａ－１８４ＡＹ（ＨＥＫ）による治療は、Ｆｃ ＷＴに類似する形で臨床スコアを有意に低下させたが、この場合、用量は１５分の１（５０ｍｇ／ｋｇ）であった（図２）。
【0151】
２－治療モデル
Ｋ／ＢｘＮマウス血清注射の７２時間後、２ｇ／ｋｇで投与したＩｇＩＶは、Ｋ／ＢｘＮマウス血清により治療された群と比べて、臨床スコアを有意に低下させない。
Ｋ／ＢｘＮマウス血清注射の７２時間後、２ｇ／ｋｇで投与したＩｇＩＶは、Ｋ／ＢｘＮマウス血清により治療された群と比べて、臨床スコアを有意に低下させない。
【0152】
しかしながら、７５０ｍｇ／ｋｇ（２ｇ／ｋｇのＩＶＩｇと等価の分子用量）でのＦｃフラグメントＷＴによる治療は、Ｋ／ＢｘＮマウス血清により治療された群に比べ、臨床スコアを有意に低下させた。その上、本発明に係るＦｃ変異体Ａ３Ａ－１８４ＡＹ（ＨＥＫ）による治療は、Ｆｃ－ＷＴフラグメントに類似する形で臨床スコアを有意に低下させたが、この場合、用量は４分の１（１９０ｍｇ／ｋｇ）であった（図３）。
【0153】
ＩＶ． 細胞に対するインビトロ試験
プロトコール：
血液細胞に対するＦｃフラグメントおよびＩｇＩＶの結合の評価
Ａｌｅｘａで標識付された本発明に係るＦｃ変異体またはＩｇＩＶを、氷上で２０分間、標的細胞と共に６５ｎＭ（ＣＳＦ２％のＰＢＳ中でＦｃについて１０μｇ／ｍｌ）でインキュベートした。ＣＳＦ２％のＰＢＳ中で２回洗浄した後、フローサイトメトリーによる分析の前に５００μｌのＩｓｏｆｌｏｗ中で細胞を懸濁させた。Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球および好中球を、それぞれ抗ＣＤ１９、抗ＣＤ５６、抗ＣＤ１４および抗ＣＤ１５抗体で特異的に標識した。抗ＣＤ１６ ３Ｇ８抗体を用いて、ＦｃγＲＩＩＩ受容体（ＣＤ１６）を明らかにした。
プロトコール：
血液細胞に対するＦｃフラグメントおよびＩｇＩＶの結合の評価
Ａｌｅｘａで標識付された本発明に係るＦｃ変異体またはＩｇＩＶを、氷上で２０分間、標的細胞と共に６５ｎＭ（ＣＳＦ２％のＰＢＳ中でＦｃについて１０μｇ／ｍｌ）でインキュベートした。ＣＳＦ２％のＰＢＳ中で２回洗浄した後、フローサイトメトリーによる分析の前に５００μｌのＩｓｏｆｌｏｗ中で細胞を懸濁させた。Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球および好中球を、それぞれ抗ＣＤ１９、抗ＣＤ５６、抗ＣＤ１４および抗ＣＤ１５抗体で特異的に標識した。抗ＣＤ１６ ３Ｇ８抗体を用いて、ＦｃγＲＩＩＩ受容体（ＣＤ１６）を明らかにした。
【0154】
ＡＤＣＣの阻害：
特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）に罹患した患者の自己抗体が関与する、ＩＴＰで見られる赤血球溶解状況を模倣するため、抗ＲｈｅｓｕｓＤ（ＲｈＤ）モノクローナル抗体の存在下でエフェクター細胞により媒介される赤血球溶解を行ない、例えばエフェクター細胞の表面におけるＦｃ受容体の固定のための抗ＲｈＤとの競合により、この溶解を阻害する異なる数量の多価免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）または突然変異したまたは突然変異していない組換え型Ｆｃフラグメントの能力を評価した。
特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）に罹患した患者の自己抗体が関与する、ＩＴＰで見られる赤血球溶解状況を模倣するため、抗ＲｈｅｓｕｓＤ（ＲｈＤ）モノクローナル抗体の存在下でエフェクター細胞により媒介される赤血球溶解を行ない、例えばエフェクター細胞の表面におけるＦｃ受容体の固定のための抗ＲｈＤとの競合により、この溶解を阻害する異なる数量の多価免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）または突然変異したまたは突然変異していない組換え型Ｆｃフラグメントの能力を評価した。
【0155】
ＡＤＣＣ技術によって、抗ＲｈＤ抗体の細胞毒性を研究した。簡単に言うと、異なる濃度（０～７５ｎｇ／ｍｌ）の抗ＲｈＤ抗体と共に、エフェクター細胞（単核細胞）（８×１０７細胞／ｍｌで２５μｌ）およびＲｈ陽性赤血球（最終４×１０７細胞／ｍｌで２５μｌ）を、２／１のエフェクター／標的比でインキュベートした。１６時間のインキュベーションの後、特異的気質（ＤＡＦ）を使用して上清中に遊離したヘモグロビンを定量することによって、溶解を推定した。
【0156】
結果を、抗体数量に応じた特異的溶解百分率の形で表した。３３ｎＭで添加された本発明に係るＦｃ変異体（ＲＦＣ Ａ３Ａ－１８４ＡＹ）またはＩｇＩＶによって誘発されたＡＤＣＣの阻害を評価した。
【0157】
結果を百分率で表し、１００％と０％は、以下の式によってそれぞれ６５０ｎＭおよび０ｎＭでＩｇＩＶを用いて得られた値である。
［（３３ｎＭで試料を伴うＡＤＣＣ－ＩＶＩｇ無しのＡＤＣＣ）／（３３ｎＭでＩｇＩＶを伴うＡＤＣＣ－ＩＶＩｇ無しのＡＤＣＣ）×１００］
［（３３ｎＭで試料を伴うＡＤＣＣ－ＩＶＩｇ無しのＡＤＣＣ）／（３３ｎＭでＩｇＩＶを伴うＡＤＣＣ－ＩＶＩｇ無しのＡＤＣＣ）×１００］
【0158】
Ｊｕｒｋａｔ細胞ＣＤ６４の活性化阻害：
この試験は、リツキサンを用いてＲａｊｉセルラインにより誘発されたヒトＣＤ６４を発現するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－Ｈ－ＣＤ６４）によるＩＬ２分泌を阻害する、本発明に係るＦｃ変異体またはＩｇＩＶの能力（合計ＩｇＧ）を推定する。
この試験は、リツキサンを用いてＲａｊｉセルラインにより誘発されたヒトＣＤ６４を発現するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－Ｈ－ＣＤ６４）によるＩＬ２分泌を阻害する、本発明に係るＦｃ変異体またはＩｇＩＶの能力（合計ＩｇＧ）を推定する。
【0159】
簡単に言うと、Ｒａｊｉ細胞（５×１０６細胞／ｍｌで５０μｌ）を、リツキサン（２μｇ／ｍｌで５０μｌ）、Ｊｕｒｋａｔ細胞Ｈ－ＣＤ６４（５×１０６細胞／ｍｌで２５μｌ）、ホルボールエステル（ＰＭＡ、４０ｎｇ／ｍｌで５０μｌ）と混合し、その後１９５０ｎＭで本発明に係るＦｃ変異体またはＩｇＩＶと共にインキュベートした。
【0160】
一晩のインキュベーションの後、プレートを遠心分離し（１分間１２５ｇ）、上清中に含まれているＩＬ２を、ＥＬＩＳＡにより評価した。
【0161】
結果を、以下の式により、ＩｇＩＶとの関係における百分率で表した：
（ＩＬ－２ＩｇＩＶ／試料のＩＬ－２）×１００
（ＩＬ－２ＩｇＩＶ／試料のＩＬ－２）×１００
【0162】
ＣＤＣの阻害活性：
この試験は、補体源としての子ウサギの血清の存在下でのＲａｊｉセルラインでリツキシマブにより媒介されるＣＤＣ活性を阻害する、本発明に係るＦｃ変異体またはＩｇＩＶの能力を推定する。簡単に言うと、Ｒａｊｉ細胞を、５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度のリツキシマブと共に３０分間インキュベートした。１／１０に希釈し、３７℃で１時間、本発明に係る変異体またはＩｇＩＶ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）と共に予めインキュベートした子ウサギの血清溶液を、添加した。３７℃で１時間のインキュベーションの後、プレートを遠心分離し（１分間１２５ｇ）、培地中に遊離した細胞内ＬＤＨを測定することによって、ＣＤＣを推定した。
この試験は、補体源としての子ウサギの血清の存在下でのＲａｊｉセルラインでリツキシマブにより媒介されるＣＤＣ活性を阻害する、本発明に係るＦｃ変異体またはＩｇＩＶの能力を推定する。簡単に言うと、Ｒａｊｉ細胞を、５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度のリツキシマブと共に３０分間インキュベートした。１／１０に希釈し、３７℃で１時間、本発明に係る変異体またはＩｇＩＶ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）と共に予めインキュベートした子ウサギの血清溶液を、添加した。３７℃で１時間のインキュベーションの後、プレートを遠心分離し（１分間１２５ｇ）、培地中に遊離した細胞内ＬＤＨを測定することによって、ＣＤＣを推定した。
【0163】
結果を阻害百分率で表し、ＩｇＩＶおよび負の対照群（Ｆｃ機能の無いＦｃ）と比較し、１００％は溶解活性の完全な阻害に対応し、０％はＩｇＩＶまたはＦｃ無しで得られた対照値に対応していた。
【0164】
結果：
結果を、図４および５で示している。
結果を、図４および５で示している。
【0165】
図５に示したように、本発明に係るＦｃ変異体（Ａ３Ａ－１８４ＡＹ（ＨＥＫ））は、ＩｇＩＶに比べて、ＣＤ６４を発現するＪｕｒｋａｔ細胞の、ＡＤＣＣおよびＣＤＣの活性のより優れた阻害を提示している。これらの結果は、Ａ３Ａ－１８４ＡＹなどの本発明に係る変異体が、特に患者のエフェクター細胞上でのＦｃ受容体の遮断によって、患者の自己抗体が関与する病理の治療に有効であり得る、ということを示している（図４参照）
【0166】
実施例３：ＣＨＯ細胞中で産生される本発明に係る変異体（突然変異したＦｃフラグメント）の調製
実施例２で説明したものと同じ要領で配列番号１４から、組換え型Ｆｃフラグメントを得ることができる。この突然変異したＦｃフラグメントは、ＣＨＯ－Ｓセルラインでの発現のために最適化されたベクターを使用して、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｍａｘ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）などのリポフェクション試薬を用いてこのＣＨＯ－Ｓ細胞内でトランスフェクションにより産生可能である。ＣＨＯ－Ｓ細胞を、３７℃で制御された雰囲気（ＣＯ２ ８％）中において１３５ｒｐｍで撹拌された条件の下で、ＣＤＦｏｒｔｉＣＨＯ＋８ｍＭのグルタミンの培地内で培養する。トランスフェクション日の前日に、６×１０５細胞／ｍｌの密度で細胞を播種する。
実施例２で説明したものと同じ要領で配列番号１４から、組換え型Ｆｃフラグメントを得ることができる。この突然変異したＦｃフラグメントは、ＣＨＯ－Ｓセルラインでの発現のために最適化されたベクターを使用して、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｍａｘ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）などのリポフェクション試薬を用いてこのＣＨＯ－Ｓ細胞内でトランスフェクションにより産生可能である。ＣＨＯ－Ｓ細胞を、３７℃で制御された雰囲気（ＣＯ２ ８％）中において１３５ｒｐｍで撹拌された条件の下で、ＣＤＦｏｒｔｉＣＨＯ＋８ｍＭのグルタミンの培地内で培養する。トランスフェクション日の前日に、６×１０５細胞／ｍｌの密度で細胞を播種する。
【0167】
トランスフェクションの当日、直線化ＤＮＡ（５０μｇ）およびトランスフェクション試薬（ＴＡ）５０μｌを、Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ ＳＦＭ培地内で別個に予備インキュベートし、その後混合し、２０分間インキュベートして、ＤＮＡ／ＡＴ複合体の形成を可能にする。次に、全体を、３０ｍｌの体積で１×１０６細胞／ｍｌの細胞調製物に添加する。４８時間のインキュベーションの後、トランスフェクション試薬（ネオマイシン１ｇ／Ｌ、およびメトトレキサート２００ｎＭ）を細胞に添加する。３～４日毎に細胞密度と生存率を決定し、細胞密度を６×１０５細胞／ｍｌ超に維持するために培養体積を適応させる。生存率が９０％を超えた場合、得られた安定プールを低温凍結により保存し、産生中４ｇ／Ｌまたは６ｇ／Ｌのグルコースを添加しながら１０日間「Ｆｅｄｂａｔｃｈ」モードで撹拌条件下の産生を実施する。産生の終了時点で、遠心分離により、細胞と上清を分離する。細胞を除去し、上清ａを収穫し、濃縮し、０．２２μｍで濾過する。
【0168】
その後、ＦｃフラグメントをプロテインＡ樹脂（ＨｉＴｒａｐプロテインＡ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で親和性クロマトグラフィーにより精製する。ＰＢＳ緩衝液中で平衡化された樹脂上に捕捉した後、Ｆｃフラグメントをクエン酸塩緩衝液２５ｍＭ ｐＨ＝３．０で溶出し、その後Ｔｒｉｓ １Ｍを用いてｐＨを急速に中和させ、次にＰＢＳ緩衝液中で透析してから、濾過（０．２μｍ）により滅菌する。
【0169】
実施例４：ＣＨＯ細胞中およびトランスジェニックヤギの乳中で産生された変異体の、ＦｃＲｎ、ＣＤ１６ａＨ、ＣＤ１６ａＶ、ＣＤ６４およびＣＤ３２ａ受容体に対する結合試験
Ｆｃ受容体に対する結合試験を、以下の分子を用いて実施する。
－本発明の変異体、実施例３に記された方法にしたがってＣＨＯ細胞内で産生されたＡ３Ａ－１８４ＡＹ＿ＣＨＯ（Ｋ３３４Ｎ／Ｐ３５２Ｓ／Ａ３７８Ｖ／Ｖ３９７Ｍ／Ｎ４３４Ｙ）、Ａ３Ａ－１８４ＥＹ＿ＣＨＯ（Ｙ２９６Ｗ／Ｋ３３４Ｎ／Ｐ３５２Ｓ／Ａ３７８Ｖ／Ｖ３９７Ｍ／Ｎ４３４Ｙ）、実施例１中で説明された方法にしたがってトランスジェニックヤギにおいて産生されたＡ３Ａ－１８４ＡＹ＿ＴＧｇ、
－ ＦｃＲｎ受容体に対してのみ最適化された結合を有するものとして文献中（Ｕｌｒｉｃｈｔｓら、ＪＣＩ、２０１８）に記載されている突然変異Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含むＦｃフラグメントＭＳＴ－ＨＮは、ＨＥＫ－２９３細胞（２９３－Ｆ細胞、ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｉｎｖｉｔｒｏ Ｇｅｎ）中で産生された、
－トランスジェニックヤギの乳中で産生されたＩｇＧ１をパパインで消化することによって得られる、野生Ｆｃフラグメント「Ｆｃ－ＷＴ」または「Ｆｃ－Ｒｅｃ」、
－ＩｇＩＶ。
Ｆｃ受容体に対する結合試験を、以下の分子を用いて実施する。
－本発明の変異体、実施例３に記された方法にしたがってＣＨＯ細胞内で産生されたＡ３Ａ－１８４ＡＹ＿ＣＨＯ（Ｋ３３４Ｎ／Ｐ３５２Ｓ／Ａ３７８Ｖ／Ｖ３９７Ｍ／Ｎ４３４Ｙ）、Ａ３Ａ－１８４ＥＹ＿ＣＨＯ（Ｙ２９６Ｗ／Ｋ３３４Ｎ／Ｐ３５２Ｓ／Ａ３７８Ｖ／Ｖ３９７Ｍ／Ｎ４３４Ｙ）、実施例１中で説明された方法にしたがってトランスジェニックヤギにおいて産生されたＡ３Ａ－１８４ＡＹ＿ＴＧｇ、
－ ＦｃＲｎ受容体に対してのみ最適化された結合を有するものとして文献中（Ｕｌｒｉｃｈｔｓら、ＪＣＩ、２０１８）に記載されている突然変異Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含むＦｃフラグメントＭＳＴ－ＨＮは、ＨＥＫ－２９３細胞（２９３－Ｆ細胞、ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｉｎｖｉｔｒｏ Ｇｅｎ）中で産生された、
－トランスジェニックヤギの乳中で産生されたＩｇＧ１をパパインで消化することによって得られる、野生Ｆｃフラグメント「Ｆｃ－ＷＴ」または「Ｆｃ－Ｒｅｃ」、
－ＩｇＩＶ。
【0170】
ヒトＦｃＲｎ（ｈＦｃＲｎ）に対する結合：
Ａ４８８マーカーで標識されたリツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ－Ａ４８８）およびＦｃＲｎ受容体を発現するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ＦｃＲｎ）を使用して、競合試験によりＦｃＲｎに対する結合を研究する。
Ａ４８８マーカーで標識されたリツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ－Ａ４８８）およびＦｃＲｎ受容体を発現するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ＦｃＲｎ）を使用して、競合試験によりＦｃＲｎに対する結合を研究する。
【0171】
１ウェルあたり２×１０５細胞の濃度で、９６ウェルプレート（Ｖ字形底面）中に、Ｊｕｒｋａｔ－ＦｃＲｎ細胞を播種する。その後、１６７μｇ／ｍｌ；８３μｇ／ｍｌ；４２μｇ／ｍｌ；２１μｇ／ｍｌ；１０μｇ／ｍｌ；５μｇ／ｍｌ；３μｇ／ｍｌ；１μｇ／ｍｌ；０μｇ／ｍｌという最終濃度で緩衝液内に希釈された被験分子と、同時に２５μｇ／ｍＬのＲｉｔｕｘａｎ－Ａ４８８と共に、４℃で２０分間、細胞をインキュベートする。
【0172】
その後、ｐＨ６のＰＢＳ１００μＬを添加して細胞を洗浄し、４℃で３分間１７００ｒｐｍで遠心分離する。その後、上清を取り出し、低温ＰＢＳ３００μＬをｐＨ６で添加する。
【0173】
Ｊｕｒｋａｔ－ＦｃＲｎ細胞により発現されたＦｃＲｎに対するＲｉｔｕｘａｎ－Ａ４８８の結合を、フローサイトメトリーによって評価する。観察された平均蛍光強度（ＭＦＩ）を百分率で表現し、ここで１００％は、Ｒｉｔｕｘａｎ－Ａ４８８単独で得た値であり、０％は、Ｒｉｔｕｘａｎ－Ａ４８８不在下での値である。Ｊｕｒｋａｔ－ＦｃＲｎ細胞のＦｃＲｎに対するＲｉｔｕｘａｎ－Ａ４８８の結合の５０％阻害を誘発するために必要とされる分子濃度は、ソフトウェア「Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ」を用いて計算される。
【0174】
結果は、下表２に記されている。
【0175】
【表4】
【0176】
結果は、Ｆｃ変異体Ａ３Ａ－１８４ＡＹ＿ＣＨＯ、Ｆｃ変異体Ａ３Ａ－１８４ＥＹ＿ＣＨＯおよびＡ３Ａ－１８４ＡＹ－ＴＧｇが、Ｒｉｔｕｘａｎ－Ａ４８８の結合の阻害の増大（ＩＶＩｇに比べて１００倍）を示すことを明らかにしている。本発明の変異体は、ＦｃＲｎについてのみ最適化されている結合親和性として文献中（Ｕｌｒｉｃｈｔｓら、ＪＣＩ、２０１８）に記載されているＦｃフラグメントＭＳＴ－ＨＮで観察される結合親和性と等価のＦｃＲｎに対する結合親和性を示す。
【0177】
ｈＣＤ６４およびｈＣＤ１６ａＨ、ｈＣＤ１６ａＶ、ｈＣＤ３２ａＨ、ｈＣＤ３２ａＲ受容体に対する結合：
ヒトＣＤ６４（ｈＣＤ６４）に対する結合
Ｒｉｔｕｘａｎ－Ａ４８８およびＣＤ６４受容体を発現するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ＣＤ６４）を使用して、競合試験によりヒトＣＤ６４に対する結合を研究する。
ヒトＣＤ６４（ｈＣＤ６４）に対する結合
Ｒｉｔｕｘａｎ－Ａ４８８およびＣＤ６４受容体を発現するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ＣＤ６４）を使用して、競合試験によりヒトＣＤ６４に対する結合を研究する。
【0178】
１ウェルあたり２×１０５細胞の濃度で、９６ウェルプレート（Ｖ字形底面）中に、Ｊｕｒｋａｔ－ＣＤ６４細胞を播種する。その後、１６７μｇ／ｍｌ；８３μｇ／ｍｌ；４２μｇ／ｍｌ；２１μｇ／ｍｌ；１０μｇ／ｍｌ；５μｇ／ｍｌ；３μｇ／ｍｌ；１μｇ／ｍｌ；０μｇ／ｍｌという最終濃度で緩衝液内に希釈された被験分子と、同時に２５μｇ／ｍＬのＲｉｔｕｘａｎ－Ａ４８８と共に、４℃で２０分間、細胞をインキュベートする。
【0179】
その後、ｐＨ６のＰＢＳ１００μＬを添加して細胞を洗浄し、４℃で３分間１７００ｒｐｍで遠心分離する。その後、上清を取り出し、低温ＰＢＳ３００μＬをｐＨ６で添加する。
【0180】
Ｊｕｒｋａｔ－ＣＤ６４細胞により発現されたＣＤ６４に対するＲｉｔｕｘａｎ－Ａ４８８の結合を、フローサイトメトリーによって評価する。観察された平均蛍光強度（ＭＦＩ）を百分率で表現し、ここで１００％は、Ｒｉｔｕｘａｎ－Ａ４８８単独で得た値であり、０％は、Ｒｉｔｕｘａｎ－Ａ４８８不在下での値である。Ｊｕｒｋａｔ－ＣＤ６４細胞のＣＤ６４に対するＲｉｔｕｘａｎ－Ａ４８８の結合の５０％阻害を誘発するために必要とされる分子濃度は、ソフトウェア「Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ」を用いて計算される。
【0181】
ＣＤ３２ａＨおよびＣＤ３２ａＲに対する結合
ＣＤ３２ａＨおよびＣＤ３２ａＲ受容体（ＨＥＫ－ＣＤ３２）を用いてトランスフェクトされたＨＥＫ細胞およびＲｉｔｕｘａｎ－Ａ４８８を使用して、競合試験によりヒトＣＤ３２受容体に対する結合を研究する。
ＣＤ３２ａＨおよびＣＤ３２ａＲ受容体（ＨＥＫ－ＣＤ３２）を用いてトランスフェクトされたＨＥＫ細胞およびＲｉｔｕｘａｎ－Ａ４８８を使用して、競合試験によりヒトＣＤ３２受容体に対する結合を研究する。
【0182】
１ウェルあたり２×１０５細胞の濃度で、９６ウェルプレート（Ｖ字形底面）中に、ＨＥＫ－ＣＤ３２細胞を播種する。その後、３３３μｇ／ｍｌ；１６７μｇ／ｍｌ；８３μｇ／ｍｌ；４２μｇ／ｍｌ；２１μｇ／ｍｌ；１０μｇ／ｍｌ；５μｇ／ｍｌ；３μｇ／ｍｌ；１μｇ／ｍｌ；０μｇ／ｍｌという最終濃度で緩衝液内に希釈された被験分子と、同時に３０μｇ／ｍＬのＲｉｔｕｘａｎ－Ａ４８８と共に、４℃で２０分間、細胞をインキュベートする。
【0183】
その後、ｐＨ６のＰＢＳ１００μＬを添加して細胞を洗浄し、４℃で３分間１７００ｒｐｍで遠心分離する。その後、上清を取り出し、低温ＰＢＳ３００μＬをｐＨ６で添加する。
【0184】
ＨＥＫ－ＣＤ３２細胞により発現されたＣＤ３２ａＨおよびＣＤ３２ａＲに対するＲｉｔｕｘａｎ－Ａ４８８＿の結合を、フローサイトメトリーによって評価する。観察された平均蛍光強度（ＭＦＩ）を百分率で表わし、ここで１００％は、Ｒｉｔｕｘａｎ－Ａ４８８単独で得た値であり、０％は、Ｒｉｔｕｘａｎ－Ａ４８８不在下での値である。ＨＥＫ－ＣＤ３２細胞のＣＤ３２ａＨおよびＣＤ３２ａＲに対するＲｉｔｕｘａｎ－Ａ４８８の結合の５０％阻害を誘発するために必要とされる分子濃度は、ソフトウェア「Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ」を用いて計算される。
【0185】
ｈＣＤ１６ａＨに対する結合
フィコエルスリン（３Ｇ８－ＰＥ）で標識されたマウス抗ＣＤ１６ ３Ｇ８抗体、およびヒトＣＤ１６ａＨ受容体を用いてトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ＣＤ１６ａＨ）を使用して、競合試験によりヒトＣＤ１６ａＨに対する結合を研究する。
フィコエルスリン（３Ｇ８－ＰＥ）で標識されたマウス抗ＣＤ１６ ３Ｇ８抗体、およびヒトＣＤ１６ａＨ受容体を用いてトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ＣＤ１６ａＨ）を使用して、競合試験によりヒトＣＤ１６ａＨに対する結合を研究する。
【0186】
１ウェルあたり２×１０５細胞の濃度で、９６ウェルプレート（Ｖ字形底面）中に、Ｊｕｒｋａｔ－ＣＤ１６ａＨ細胞を播種する。その後、８３μｇ／ｍｌ；４２μｇ／ｍｌ；２１μｇ／ｍｌ；１０μｇ／ｍｌ；５μｇ／ｍｌ；３μｇ／ｍｌ；１μｇ／ｍｌ；０μｇ／ｍｌという最終濃度で緩衝液内に希釈された被験分子と、同時に０．５μｇ／ｍＬのｍＡｂ ３Ｇ８－ＰＥと共に、４℃で２０分間、細胞をインキュベートする。
【0187】
その後、ｐＨ６のＰＢＳ１００μＬを添加して細胞を洗浄し、４℃で３分間１７００ｒｐｍで遠心分離する。その後、上清を取り出し、低温ＰＢＳ３００μＬをｐＨ６で添加する。
【0188】
Ｊｕｒｋａｔ－ＣＤ１６ａＨ細胞により発現されたＣＤ１６ａＨに対するｍＡｂ ３Ｇ８－ＰＥの結合を、フローサイトメトリーによって評価する。観察された平均蛍光強度（ＭＦＩ）を百分率で表わし、ここで１００％は、ｍＡｂ ３Ｇ８－ＰＥ単独で得た値であり、０％はｍＡｂ ３Ｇ８－ＰＥ不在下での値である。Ｊｕｒｋａｔ－ＣＤ１６ａＨ細胞のＣＤ１６ａＨに対するｍＡｂ ３Ｇ８－ＰＥの結合の５０％阻害を誘発するために必要とされる分子濃度は、ソフトウェア「Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ」を用いて計算される。
【0189】
結果は、下表３に記されている。
【0190】
【表5】
【0191】
結果は、Ｆｃ変異体Ａ３Ａ－１８４ＡＹ＿ＣＨＯ、Ｆｃ変異体Ａ３Ａ－１８４ＥＹ＿ＣＨＯおよびＡ３Ａ－１８４ＡＹ＿ＴＧｇが、突然変異していないＦｃ（Ｆｃ－ＷＴ）のみならずＩｇＩＶと比較しても、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ受容体（ＣＤ６４）およびＦｃγＲＩＩａ受容体（ＣＤ３２ａ）に対する増大した親和性を有することを示している。
【0192】
本発明の突然変異体は、ＭＳＴ－ＨＮに比べてＦｃγＲＩＩＩａ受容体（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ受容体（ＣＤ６４）およびＦｃγＲＩＩａ受容体（ＣＤ３２ａ）に対し非常に増大した親和性を示している。
【0193】
ヒトＣＤ１６ａＶに対する結合：
ｈＣＤ１６ａＶ受容体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）Ｈｉｓ Ｔａｇを、速度論的緩衝液（Ｐａｌｌ）中１μ／ｍｌに希釈された状態で、抗Ｐｅｎｔａ－ＨＩＳバイオセンサ（ＨＩＳ １Ｋ）上で固定化させる。分子を、速度論的緩衝液中で１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５および０ｎＭの濃度で試験した。
ｈＣＤ１６ａＶ受容体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）Ｈｉｓ Ｔａｇを、速度論的緩衝液（Ｐａｌｌ）中１μ／ｍｌに希釈された状態で、抗Ｐｅｎｔａ－ＨＩＳバイオセンサ（ＨＩＳ １Ｋ）上で固定化させる。分子を、速度論的緩衝液中で１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５および０ｎＭの濃度で試験した。
【0194】
－各試料の前のローディング、
－試験の設計：全ステップを、速度論的緩衝液（Ｐａｌｌ）中で実施する。
ベースライン １×６０秒
ローディング ４００秒
ベースライン ２×６０秒
会合 ６０秒
解離 ３０秒
再生 再生緩衝液（グリシン１０ｍＭ ｐＨ１．５／中和：ＰＢＳ）中で５秒
－試験の設計：全ステップを、速度論的緩衝液（Ｐａｌｌ）中で実施する。
ベースライン １×６０秒
ローディング ４００秒
ベースライン ２×６０秒
会合 ６０秒
解離 ３０秒
再生 再生緩衝液（グリシン１０ｍＭ ｐＨ１．５／中和：ＰＢＳ）中で５秒
【0195】
－結果の解釈：
会合および解離曲線（最初の５秒）を使用して、会合モデル１／１を用いて会合速度定数（ｋｏｎ）および解離速度定数（ｋｏｆｆ）を計算する。その後、ＫＤ（ｎＭ）を計算する（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）。
会合および解離曲線（最初の５秒）を使用して、会合モデル１／１を用いて会合速度定数（ｋｏｎ）および解離速度定数（ｋｏｆｆ）を計算する。その後、ＫＤ（ｎＭ）を計算する（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）。
【0196】
結果は、下表４に記されている。
【0197】
【表6】
【0198】
結果は、Ｆｃ変異体Ａ３Ａ－１８４ＡＹ＿ＣＨＯ、Ｆｃ変異体Ａ３Ａ－１８４ＥＹ＿ＣＨＯおよびＡ３Ａ－１８４ＡＹ＿ＴＧｇが、突然変異していないＦｃ（Ｆｃ－ＷＴ）のみならずＩｇＩＶ、および突然変異Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含むＦｃフラグメントＭＳＴ－ＨＮと比較しても、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ－Ｖ受容体（ＣＤ１６ａ－Ｖ）に対する結合の増大を示すことを明らかにしている。
【0199】
実施例５：ＣＨＯ細胞中およびトランスジェニックヤギの乳中で産生された変異体のＡＤＣＣ阻害およびＪｕｒｋａｔ細胞活性化の試験
ＡＤＣＣ阻害およびＪｕｒｋａｔ細胞活性化試験を、以下の分子を用いて実施する：
－本発明の変異体、実施例３に記された方法にしたがってＣＨＯ細胞内で産生されたＡ３Ａ－１８４ＡＹ＿ＣＨＯ（Ｋ３３４Ｎ／Ｐ３５２Ｓ／Ａ３７８Ｖ／Ｖ３９７Ｍ／Ｎ４３４Ｙ）、Ａ３Ａ－１８４ＥＹ＿ＣＨＯ（Ｙ２９６Ｗ／Ｋ３３４Ｎ／Ｐ３５２Ｓ／Ａ３７８Ｖ／Ｖ３９７Ｍ／Ｎ４３４Ｙ）、
－ＦｃＲｎ受容体に対してのみ最適化された結合を有するものとして文献中（Ｕｌｒｉｃｈｔｓら、ＪＣＩ、２０１８）に記載されている突然変異Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含むＦｃフラグメントＭＳＴ－ＨＮは、ＨＥＫ－２９３細胞（２９３－Ｆ細胞、ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｉｎｖｉｔｒｏ Ｇｅｎ）中で産生された、
－トランスジェニックヤギの乳中で産生されたＩｇＧ１をパパインで消化することによって得られる、野生Ｆｃフラグメント「Ｆｃ－Ｒｅｃ」または「Ｆｃ－ＷＴ」、
－ＩｇＩＶ。
ＡＤＣＣ阻害およびＪｕｒｋａｔ細胞活性化試験を、以下の分子を用いて実施する：
－本発明の変異体、実施例３に記された方法にしたがってＣＨＯ細胞内で産生されたＡ３Ａ－１８４ＡＹ＿ＣＨＯ（Ｋ３３４Ｎ／Ｐ３５２Ｓ／Ａ３７８Ｖ／Ｖ３９７Ｍ／Ｎ４３４Ｙ）、Ａ３Ａ－１８４ＥＹ＿ＣＨＯ（Ｙ２９６Ｗ／Ｋ３３４Ｎ／Ｐ３５２Ｓ／Ａ３７８Ｖ／Ｖ３９７Ｍ／Ｎ４３４Ｙ）、
－ＦｃＲｎ受容体に対してのみ最適化された結合を有するものとして文献中（Ｕｌｒｉｃｈｔｓら、ＪＣＩ、２０１８）に記載されている突然変異Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含むＦｃフラグメントＭＳＴ－ＨＮは、ＨＥＫ－２９３細胞（２９３－Ｆ細胞、ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｉｎｖｉｔｒｏ Ｇｅｎ）中で産生された、
－トランスジェニックヤギの乳中で産生されたＩｇＧ１をパパインで消化することによって得られる、野生Ｆｃフラグメント「Ｆｃ－Ｒｅｃ」または「Ｆｃ－ＷＴ」、
－ＩｇＩＶ。
【0200】
ＡＤＣＣの阻害試験：
特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）に罹患した患者の自己抗体が関与する、ＩＴＰで見られる赤血球溶解状況を模倣するため、抗ＲｈｅｓｕｓＤ（ＲｈＤ）モノクローナル抗体の存在下でエフェクター細胞により媒介される赤血球溶解を行ない、例えばエフェクター細胞の表面におけるＦｃ受容体の固定のための抗ＲｈＤとの競合により、この溶解を阻害すべき異なる数量の多価免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）または突然変異したまたは突然変異していない組換え型Ｆｃフラグメントの能力を評価した。
特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）に罹患した患者の自己抗体が関与する、ＩＴＰで見られる赤血球溶解状況を模倣するため、抗ＲｈｅｓｕｓＤ（ＲｈＤ）モノクローナル抗体の存在下でエフェクター細胞により媒介される赤血球溶解を行ない、例えばエフェクター細胞の表面におけるＦｃ受容体の固定のための抗ＲｈＤとの競合により、この溶解を阻害すべき異なる数量の多価免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）または突然変異したまたは突然変異していない組換え型Ｆｃフラグメントの能力を評価した。
【0201】
ＡＤＣＣ技術によって、抗ＲｈＤ抗体の細胞毒性を研究した。簡単に言うと、異なる濃度（０～７５ｎｇ／ｍｌ）の抗ＲｈＤ抗体と共に、エフェクター細胞（単核細胞）（８×１０７細胞／ｍｌで２５μｌ）およびＲｈ陽性赤血球（最終４×１０７細胞／ｍｌで２５μｌ）を、２／１のエフェクター／標的比でインキュベートした。１６時間のインキュベーションの後、特異的気質（ＤＡＦ）を使用して上清中に遊離したヘモグロビンを定量することによって、溶解を推定した。
【0202】
結果を、抗体数量に応じた特異的溶解百分率の形で表した。ＡＤＣＣ阻害は、ＭＳＴ－ＨＮ、Ｆｃ－ＷＴ Ａ３Ａ－１８４ＡＹ＿ＣＨＯ、Ａ３Ａ－１８４ＥＹ＿ＣＨＯについては５００μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、そしてＩｇＩＶについては１５００μｇ／ｍｌ、１５０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌの濃度で、被験分子（ＩｇＩＶ、ＭＳＴ－ＨＮ、Ｆｃ－ＷＴ Ａ３Ａ－１８４ＡＹ＿ＣＨＯ、Ａ３Ａ－１８４ＥＹ＿ＣＨＯ）によって誘発される。２５％または５０％の阻害を誘発するための分子濃度を、ソフトウェア「Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ」を用いて計算した。
【0203】
結果は、下表５に記されている。
【0204】
【表7】
【0205】
結果は、Ｆｃ変異体Ａ３Ａ－１８４ＡＹ＿ＣＨＯおよびＡ３Ａ－１８４ＥＹ＿ＣＨＯが、突然変異していないＦｃ（Ｆｃ－ＷＴ）のみならずＩｇＩＶと比較しても増大した、抗ＲｈｅｓｕｓＤ抗体による赤血球溶解の阻害を示すことを明らかにしている。
【0206】
その上、Ａ３Ａ－１８４ＡＹ＿ＣＨＯまたはＡ３Ａ－１８４ＥＹ＿ＣＨＯの阻害は、突然変異Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含むＦｃフラグメントＭＳＴ－ＨＮに比較して、非常に増大している。
【0207】
Ｊｕｒｋａｔ細胞ＣＤ６４の活性化阻害：
この試験は、リツキサンを用いてＲａｊｉ細胞系統により誘発されたヒトＣＤ６４を発現するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－Ｈ－ＣＤ６４）によるＩＬ２分泌を阻害する、本発明に係るＦｃ変異体またはＩｇＩＶの能力（合計ＩｇＧ）を推定する。
この試験は、リツキサンを用いてＲａｊｉ細胞系統により誘発されたヒトＣＤ６４を発現するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－Ｈ－ＣＤ６４）によるＩＬ２分泌を阻害する、本発明に係るＦｃ変異体またはＩｇＩＶの能力（合計ＩｇＧ）を推定する。
【0208】
簡単に言うと、Ｒａｊｉ細胞（５×１０６細胞／ｍｌで５０μｌ）を、リツキサン（２μｇ／ｍｌで５０μｌ）、Ｊｕｒｋａｔ細胞Ｈ－ＣＤ６４（５×１０６細胞／ｍｌで２５μｌ）、ホルボールエステル（ＰＭＡ、４０ｎｇ／ｍｌで５０μｌ）と混合し、その後１９５０ｎＭで本発明に係るＦｃ変異体またはＩｇＩＶと共にインキュベートした。
【0209】
一晩のインキュベーションの後、プレートを遠心分離し（１分間１２５ｇ）、上清中に含まれているＩＬ２を、ＥＬＩＳＡにより評価した。
【0210】
ＩＬ２分泌の阻害は、フラグメントＦｃ－ＷＴ、ＭＳＴ－ＨＮまたは本発明に係るＦｃ変異体（Ａ３Ａ－１８４ＡＹ＿ＣＨＯまたはＡ３Ａ－１８４ＥＹ＿ＣＨＯ）については５０および１００μｇ／ｍｌ、そしてＩｇＶについては１５０および３００μｇ／ｍｌで添加されて、ＩｇＩＶ、Ｆｃ－ＷＴ、ＭＳＴ－ＨＮ、または本発明に係るＦｃ変異体（Ａ３Ａ－１８４ＡＹ＿ＣＨＯまたはＡ３Ａ－１８４ＥＹ＿ＣＨＯ）によって誘発された。
【0211】
２５％または５０％の阻害を誘発するための分子濃度を、ソフトウェア「ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ」を用いて計算した。
【0212】
結果は、下表６に記されている。
【0213】
【表8】
【0214】
結果は、Ｆｃ変異体Ａ３Ａ－１８４ＡＹ＿ＣＨＯおよびＡ３Ａ－１８４ＥＹ＿ＣＨＯが、突然変異していないＦｃ（Ｆｃ－ＷＴ）のみならずＩｇＩＶと比較しても増大した、ＩＬ２分泌の阻害を示すことを明らかにしている。
【0215】
その上、ＲＦＣ Ａ３Ａ－１８４ＡＹ＿ＣＨＯまたはＡ３Ａ－１８４ＥＹ＿ＣＨＯの阻害は、突然変異Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含むＦｃフラグメントＭＳＴ－ＨＮに比較して、非常に増大している。
【0216】
実施例６：血液細胞に対するＦｃ変異体の結合試験
血液細胞に対する結合試験を、以下の分子を用いて実施する：
－本発明の変異体、実施例３に記された方法にしたがってＣＨＯ細胞内で産生されたＡ３Ａ－１８４ＡＹ＿ＣＨＯ（Ｋ３３４Ｎ／Ｐ３５２Ｓ／Ａ３７８Ｖ／Ｖ３９７Ｍ／Ｎ４３４Ｙ）、Ａ３Ａ－１８４ＥＹ＿ＣＨＯ（Ｙ２９６Ｗ／Ｋ３３４Ｎ／Ｐ３５２Ｓ／Ａ３７８Ｖ／Ｖ３９７Ｍ／Ｎ４３４Ｙ）、実施例１中で説明された方法にしたがってトランスジェニックヤギにおいて産生されたＡ３Ａ－１８４ＡＹ＿ＴＧｇ、
－ＦｃＲｎ受容体に対してのみ最適化された結合を有するものとして文献中（Ｕｌｒｉｃｈｔｓら、ＪＣＩ、２０１８）に記載されている突然変異Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含むＦｃフラグメントＭＳＴ－ＨＮは、ＨＥＫ－２９３細胞（２９３－Ｆ細胞、ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｉｎｖｉｔｒｏ Ｇｅｎ）中で産生された、
－トランスジェニックヤギの乳中で産生されたＩｇＧ１をパパインで消化することによって得られる、野生Ｆｃフラグメント「Ｆｃ－Ｒｅｃ」または「Ｆｃ－ＷＴ」、
－ＩｇＩＶ。
血液細胞に対する結合試験を、以下の分子を用いて実施する：
－本発明の変異体、実施例３に記された方法にしたがってＣＨＯ細胞内で産生されたＡ３Ａ－１８４ＡＹ＿ＣＨＯ（Ｋ３３４Ｎ／Ｐ３５２Ｓ／Ａ３７８Ｖ／Ｖ３９７Ｍ／Ｎ４３４Ｙ）、Ａ３Ａ－１８４ＥＹ＿ＣＨＯ（Ｙ２９６Ｗ／Ｋ３３４Ｎ／Ｐ３５２Ｓ／Ａ３７８Ｖ／Ｖ３９７Ｍ／Ｎ４３４Ｙ）、実施例１中で説明された方法にしたがってトランスジェニックヤギにおいて産生されたＡ３Ａ－１８４ＡＹ＿ＴＧｇ、
－ＦｃＲｎ受容体に対してのみ最適化された結合を有するものとして文献中（Ｕｌｒｉｃｈｔｓら、ＪＣＩ、２０１８）に記載されている突然変異Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを含むＦｃフラグメントＭＳＴ－ＨＮは、ＨＥＫ－２９３細胞（２９３－Ｆ細胞、ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｉｎｖｉｔｒｏ Ｇｅｎ）中で産生された、
－トランスジェニックヤギの乳中で産生されたＩｇＧ１をパパインで消化することによって得られる、野生Ｆｃフラグメント「Ｆｃ－Ｒｅｃ」または「Ｆｃ－ＷＴ」、
－ＩｇＩＶ。
【0217】
マーカーＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（蛍光性の高いタンパク質マーカー）で標識された被験分子を、氷上で２０分間、標的細胞と共に６５ｎＭ（ＣＳＦ２％のＰＢＳ中でＦｃについて１０μｇ／ｍｌ）でインキュベートした。
【0218】
ＣＳＦ２％のＰＢＳ中で２回洗浄した後、フローサイトメトリーによる分析の前に５００μｌのＩｓｏｆｌｏｗ中に細胞を懸濁させた。試験は、以下の細胞について実施される。
－抗ＣＤ５６で標識されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（「％陽性ＮＫ細胞」）、
－抗ＣＤ１４で標識された単球（「％陽性細胞」）、
－抗ＣＤ１４および抗ＣＤ１６ ３Ｇ８抗体で標識された単球ＣＤ１６＋（「％陽性細胞」）、
－抗ＣＤ１５で標識された好中球（「％陽性細胞」）。
－抗ＣＤ５６で標識されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（「％陽性ＮＫ細胞」）、
－抗ＣＤ１４で標識された単球（「％陽性細胞」）、
－抗ＣＤ１４および抗ＣＤ１６ ３Ｇ８抗体で標識された単球ＣＤ１６＋（「％陽性細胞」）、
－抗ＣＤ１５で標識された好中球（「％陽性細胞」）。
【0219】
抗－ＣＤ１６ ３Ｇ８抗体を使用して、ＦｃγＲＩＩＩ受容体（ＣＤ１６）を明らかにした。
【0220】
結果は、Ｆｃ変異体Ａ３Ａ－１８４ＡＹ＿ＣＨＯ、Ａ３Ａ－１８４ＥＹ＿ＣＨＯおよびＡ３Ａ－１８４ＡＹ＿ＴＧｇが、産生様式の如何に関わらず、突然変異していないＦｃ（Ｆｃ－Ｒｅｃ）のみならずＩｇＩＶに比べても増大した結合を示すことを明らかにしている。その上、Ａ３Ａ－１８４ＡＹまたはＡ３Ａ－１８４ＥＹの結合は、ＮＫ細胞、単球ＣＤ１６＋および好中球について、フラグメントＭＳＴ－ＨＮに比べ非常に増大している（図６参照）
【0221】
実施例７：特発性血小板減少症紫斑病（ＩＴＰ）の生体モデルについての試験
マウスの血小板を枯渇させるために静脈内投与により抗血小板抗体６Ａ６－ｈｌｇＧ１（体重１ｇあたり０．３μｇ）を注射することによってヒト化されたＦｃＲｎ（遺伝子的背景Ｂ６のヘテロ接合体ｍＦｃＲｎ－／－ｈＦｃＲｎＴｇ ２７６、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を発現するマウスにおいて、疾病を誘発した。疾病の誘発から４時間後、６Ａ６－ｈｌｇＧ１の注入２４時間前に血液分析(血小板数)を実施した。ＩｇＩＶ（１０００ｍｇ／ｋｇ）、Ｆｃ－Ｒｅｃ（３８０および７５０ｍｇ／ｋｇ）、Ｆｃ ＭＳＴ－ＨＮ（１９０ｍｇ／ｋｇ）およびＦｃ Ａ３Ａ－１８４ＡＹ＿ＣＨＯ（１９０ｍｇ／ｋｇおよび３８０ｍｇ／ｋｇ）を、血小板の枯渇の２時間前に腹腔内投与した。
マウスの血小板を枯渇させるために静脈内投与により抗血小板抗体６Ａ６－ｈｌｇＧ１（体重１ｇあたり０．３μｇ）を注射することによってヒト化されたＦｃＲｎ（遺伝子的背景Ｂ６のヘテロ接合体ｍＦｃＲｎ－／－ｈＦｃＲｎＴｇ ２７６、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を発現するマウスにおいて、疾病を誘発した。疾病の誘発から４時間後、６Ａ６－ｈｌｇＧ１の注入２４時間前に血液分析(血小板数)を実施した。ＩｇＩＶ（１０００ｍｇ／ｋｇ）、Ｆｃ－Ｒｅｃ（３８０および７５０ｍｇ／ｋｇ）、Ｆｃ ＭＳＴ－ＨＮ（１９０ｍｇ／ｋｇ）およびＦｃ Ａ３Ａ－１８４ＡＹ＿ＣＨＯ（１９０ｍｇ／ｋｇおよび３８０ｍｇ／ｋｇ）を、血小板の枯渇の２時間前に腹腔内投与した。
【0222】
血小板数値表現は、Ａｄｖｉａ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｂａｙｅｒ）システムを用いて決定した。抗体注入前の血小板数を１００％と定めた。
【0223】
抗血小板抗体６Ａ６－ｈｌｇＧ１（０．３μｇ／ｇ）は、９０％の血小板を枯渇させることを可能にする。
【0224】
血小板の枯渇の２時間前に候補薬剤を投与することによって、以下の通りの回復が可能となる（図７）。
・３８０ｍｇ／ｋｇの用量のＡ３Ａ １８４ＡＹ＿ＣＨＯの場合１００％の血小板、
・１９０ｍｇ／ｋｇの用量のＡ３Ａ－１８４ＡＹ＿ＣＨＯの場合１０６％の血小板、
・１０００ｍｇ／ｋｇの用量のＩｇＩＶの場合９０％の血小板、
・７５０ｇ／ｋｇの用量のＦｃ－ＷＴの場合６４％の血小板、
・３８０ｍｇ／ｋｇの用量のＦｃ－ＷＴの場合７５％の血小板、
・１９０ｍｇ／ｋｇの用量の変異体ＭＳＴ－ＨＮの場合６１％の血小板。
・３８０ｍｇ／ｋｇの用量のＡ３Ａ １８４ＡＹ＿ＣＨＯの場合１００％の血小板、
・１９０ｍｇ／ｋｇの用量のＡ３Ａ－１８４ＡＹ＿ＣＨＯの場合１０６％の血小板、
・１０００ｍｇ／ｋｇの用量のＩｇＩＶの場合９０％の血小板、
・７５０ｇ／ｋｇの用量のＦｃ－ＷＴの場合６４％の血小板、
・３８０ｍｇ／ｋｇの用量のＦｃ－ＷＴの場合７５％の血小板、
・１９０ｍｇ／ｋｇの用量の変異体ＭＳＴ－ＨＮの場合６１％の血小板。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】