特開 2023-137105 品質評価方法及び品質評価プログラム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023137105

(43)【公開日】2023-09-29

(54)【発明の名称】品質評価方法及び品質評価プログラム

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/04 20060101AFI20230922BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20230922BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20230922BHJP

   G01N 21/64 20060101ALN20230922BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/04

C12M1/00 A

C12M1/34 B

G01N21/64 E

【審査請求】未請求

【請求項の数】12

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022043135

(22)【出願日】2022-03-17

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和３年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、「戦略的創造研究推進事業」「光子スペクトルビッグデータから生機能情報抽出・分析技術の開発」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(71)【出願人】

【識別番号】504171134

【氏名又は名称】国立大学法人 筑波大学

(71)【出願人】

【識別番号】598096991

【氏名又は名称】学校法人東京農業大学

(74)【代理人】

【識別番号】110002147

【氏名又は名称】弁理士法人酒井国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】八幡 穣

(72)【発明者】

【氏名】野村 暢彦

(72)【発明者】

【氏名】高部 響介

(72)【発明者】

【氏名】大橋 千草

(72)【発明者】

【氏名】原 克樹

(72)【発明者】

【氏名】廣木 亜由美

(72)【発明者】

【氏名】松浦 鈴子

(72)【発明者】

【氏名】今村 明美

(72)【発明者】

【氏名】尾畑 やよい

【テーマコード（参考）】

2G043

4B029

4B063

【Ｆターム（参考）】

2G043AA04

2G043BA16

2G043CA04

2G043EA01

2G043FA02

2G043HA01

2G043HA09

2G043KA02

2G043KA09

2G043LA03

2G043NA01

2G043NA02

4B029AA07

4B029BB11

4B029FA02

4B029FA04

4B063QA18

4B063QQ02

4B063QQ08

4B063QR72

4B063QR77

4B063QX02

(57)【要約】

【課題】細胞に対して非侵襲であり、かつ高精度に受精能や発生能を評価することができる品質評価方法及び品質評価プログラムを提供すること。
【解決手段】品質評価方法は、卵細胞又は受精卵の品質を評価する品質評価方法であって、卵細胞又は受精卵に対して励起光を照射して得られる自家蛍光に基づいて生成される発光データを取得し、発光データと、該発光データに対応する卵細胞又は受精卵の品質が対応付いた対応付けデータと用いて生成される品質評価関数を用いて、品質評価データを生成する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

卵細胞又は受精卵の品質を評価する品質評価方法であって、
卵細胞又は受精卵に対して励起光を照射して得られる自家蛍光に基づいて生成される発光データを取得し、
前記発光データと、該発光データに対応する卵細胞又は受精卵の品質が対応付いた対応付けデータと用いて生成される品質評価関数を用いて、品質評価データを生成する、
品質評価方法。

【請求項2】

前記発光データと、該発光データに対応する卵細胞又は受精卵の品質が対応付いた対応付けデータと用いた教師あり学習によって生成される品質評価関数を用いて、品質評価データを生成する、
請求項１に記載の品質評価方法。

【請求項3】

前記発光データと、該発光データに対応する卵細胞又は受精卵の品質が対応付いた対応付けデータと用いた線形判別分析による教師あり学習によって生成され、自家蛍光強度分布を一次空間上にプロットしたヒストグラムであって、品質を評価する境界が付与されたヒストグラム上に、品質評価対象の卵細胞又は受精卵の発光データを前記一次空間上にプロットした前記品質評価データを生成する、
請求項２に記載の品質評価方法。

【請求項4】

前記発光データに基づいて生成される自家蛍光像の自家蛍光強度分布において、互いに異なる二つの領域の明るさの比と、該自家蛍光像に対応する卵細胞又は受精卵の品質が対応付いた対応付けデータと用いた学習によって生成された品質評価関数に基づいて、前記品質評価データを生成する、
請求項１に記載の品質評価方法。

【請求項5】

前記異なる二つの領域は、卵細胞又は受精卵の自家蛍光像の中央部と、該中央部の周囲に位置する外周部であり、
前記中央部の明るさと、前記外周部の明るさとの比と、前記品質評価関数とに基づいて、前記品質評価データを生成する、
請求項４に記載の品質評価方法。

【請求項6】

所定の複数の励起波長によって得られる自家蛍光の強度の合計値と、該合計値に対応する卵細胞又は受精卵の品質が対応付いた対応付けデータと用いた学習によって生成された品質評価関数に基づいて、前記品質評価データを生成する、
請求項１に記載の品質評価方法。

【請求項7】

前記品質評価関数は、前記卵細胞の受精能の有無、又は、前記受精卵の胚盤胞若しくは個体発生能の有無を評価する関数である、
請求項１～６のいずれか一つに記載の品質評価方法。

【請求項8】

評価対象の自家蛍光データと、前記品質評価データとを用いて、前記評価対象の前記受精能の有無、又は、前記胚盤胞若しくは個体発生能の有無を判定する、
請求項７に記載の品質評価方法。

【請求項9】

前記自家蛍光に基づいて生成される発光データは、複数の前記卵細胞又は複数の前記受精卵の画像を含むデータであり、
前記画像内の各卵細胞又は各受精卵の自家蛍光の強度を用いて、各卵細胞又は各受精卵の品質を評価する、
請求項１～８のいずれか一つに記載の品質評価方法。

【請求項10】

互いに異なる複数の焦点面において実施されるものである、
請求項１～９のいずれか一つに記載の品質評価方法。

【請求項11】

前記自家蛍光に基づいて生成される発光データは、波長帯域が互いに異なる複数の励起光を前記卵細胞又は受精卵に照射して得られる自家蛍光の強度データを含む、
請求項１～１０のいずれか一つに記載の品質評価方法。

【請求項12】

卵細胞又は受精卵の品質を評価する品質評価プログラムであって、
卵細胞又は受精卵に対して励起光を照射して得られる自家蛍光に基づいて生成される発光データを取得し、
前記発光データと、該発光データに対応する卵細胞又は受精卵の品質が対応付いた対応付けデータと用いて生成される品質評価関数を用いて、品質評価データを生成する、
ことをコンピュータに実行させる品質評価プログラム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、品質評価方法及び品質評価プログラムに関する。

【背景技術】

【0002】

従来、卵細胞や胚の質を評価するために、形態的な特徴による受精能、胚盤胞の発生能の予測や、組織の染色等による細胞内の生理状態観察、遺伝子改変動物を用いた動物実験系などが一般的であった（例えば、非特許文献１、２を参照）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【非特許文献1】Vol 12. No 5. 2006 608-615 Reproductive BioMedicine Online; www.rbmonline.com/Article/2133 on web 22 March 2006 - Vol 12. No 5. 2006 608-615 Reproductive BioMedicine Online; www.rbmonline.com/Article/ - Vol 12.

【非特許文献2】Z.P. Nagy et al. (eds.), Practical Manual of In Vitro Fertilization: Advanced Methods and Novel Devices, DOI 10.1007/978-1-4419-1780-5_13, (C) Springer Science+Business Media, LLC 2012

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

しかしながら、形態的な特徴だけでは受精能や発生能の正確な予測は難しい。一方、染色などの方法は細胞にダメージを与え、その後の受精能や発生能に影響を及ぼすおそれがあった。また、遺伝子改変動物を使用する場合には、動物を扱うのに労力を要し、また、倫理的な観点からヒトへの応用は難しい。

【0005】

本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、細胞に対して非侵襲であり、かつ高精度に受精能や発生能を評価することができる品質評価方法及び品質評価プログラムを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明に係る品質評価方法は、卵細胞又は受精卵の品質を評価する品質評価方法であって、卵細胞又は受精卵に対して励起光を照射して得られる自家蛍光に基づいて生成される発光データを取得し、前記発光データと、該発光データに対応する卵細胞又は受精卵の品質が対応付いた対応付けデータと用いて生成される品質評価関数を用いて、品質評価データを生成する。

【0007】

本発明に係る品質評価方法は、上記発明において、前記発光データと、該発光データに対応する卵細胞又は受精卵の品質が対応付いた対応付けデータと用いた教師あり学習によって生成される品質評価関数を用いて、品質評価データを生成する。

【0008】

本発明に係る品質評価方法は、上記発明において、前記発光データと、該発光データに対応する卵細胞又は受精卵の品質が対応付いた対応付けデータと用いた線形判別分析による教師あり学習によって生成され、自家蛍光強度分布を一次空間上にプロットしたヒストグラムであって、品質を評価する境界が付与されたヒストグラム上に、品質評価対象の卵細胞又は受精卵の発光データを前記一次空間上にプロットした前記品質評価データを生成する。

【0009】

本発明に係る品質評価方法は、上記発明において、前記発光データに基づいて生成される自家蛍光像の自家蛍光強度分布において、互いに異なる二つの領域の明るさの比と、該自家蛍光像に対応する卵細胞又は受精卵の品質が対応付いた対応付けデータと用いた学習によって生成された品質評価関数に基づいて、前記品質評価データを生成する。

【0010】

本発明に係る品質評価方法は、上記発明において、前記異なる二つの領域は、卵細胞又は受精卵の自家蛍光像の中央部と、該中央部の周囲に位置する外周部であり、前記中央部の明るさと、前記外周部の明るさとの比と、前記品質評価関数とに基づいて、前記品質評価データを生成する。

【0011】

本発明に係る品質評価方法は、上記発明において、所定の複数の励起波長によって得られる自家蛍光の強度の合計値と、該合計値に対応する卵細胞又は受精卵の品質が対応付いた対応付けデータと用いた学習によって生成された品質評価関数に基づいて、前記品質評価データを生成する。

【0012】

本発明に係る品質評価方法は、上記発明において、前記品質評価関数は、前記卵細胞の受精能の有無、又は、前記受精卵の胚盤胞若しくは個体発生能の有無を評価する関数である。

【0013】

本発明に係る品質評価方法は、上記発明において、評価対象の自家蛍光データと、前記品質評価データとを用いて、前記評価対象の前記受精能の有無または受精確率、又は、前記胚盤胞若しくは個体発生能の有無または発生確率を判定する。

【0014】

本発明に係る品質評価方法は、上記発明において、前記自家蛍光に基づいて生成される発光データは、複数の前記卵細胞又は複数の前記受精卵の画像を含むデータであり、前記画像内の各卵細胞又は各受精卵の自家蛍光の強度を用いて、各卵細胞又は各受精卵の品質を評価する。

【0015】

本発明に係る品質評価方法は、上記発明において、互いに異なる複数の焦点面において実施されるものである。

【0016】

本発明に係る品質評価方法は、上記発明において、前記自家蛍光に基づいて生成される発光データは、波長帯域が互いに異なる複数の励起光を前記卵細胞又は受精卵に照射して得られる自家蛍光の強度データを含む。

【0017】

本発明に係る品質評価プログラムは、卵細胞又は受精卵の品質を評価する品質評価プログラムであって、卵細胞又は受精卵に対して励起光を照射して得られる自家蛍光に基づいて生成される発光データを取得し、前記発光データと、該発光データに対応する卵細胞又は受精卵の品質が対応付いた対応付けデータと用いて生成される品質評価関数を用いて、品質評価データを生成することをコンピュータに実行させる。

【発明の効果】

【0018】

本発明によれば、細胞に対して非侵襲であり、かつ高精度に受精能や発生能を評価することができるという効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】図１は、本発明の実施の形態１に係る顕微鏡システムの概略構成を模式的に示す図である。

【図2】図２は、本発明の実施の形態１に係る油脂生産能予測方法を説明するフローチャートの一例である。

【図3】図３は、本発明の実施の形態１に係る顕微鏡システムの走査方法を説明する図である。

【図4】図４は、卵子及び受精卵の成長／発生について説明するための図である。

【図5】図５は、本発明の実施の形態１に係る顕微鏡システムの走査によって得られる画像の一例を示す図である。

【図6】図６は、受精卵（ｉｎ ｖｉｔｒｏ形成受精卵）の励起光に対する自家蛍光強度を示す図であって、胚盤胞までの発生の有無による自家蛍光強度の差異を示す図である。

【図7】図７は、受精卵（ｉｎ ｖｉｖｏ形成受精卵）の励起光に対する自家蛍光強度を示す図であって、胚盤胞までの発生の有無による自家蛍光強度の差異を示す図である。

【図8】図８は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ形成卵子及びｉｎ ｖｉｖｏ形成卵子由来の線形判別分析（ＬＤＡ）結果を示す図である。

【図9】図９は、図８に示す線形判別分析（ＬＤＡ）結果の蛍光強度の色温度分布を示す図である。

【図10】図１０は、線形判別分析（ＬＤＡ）結果に基づく品質評価の一例について説明するための図である。

【図11】図１１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ形成卵子であって、受精能を有する卵子に対して４８８ｎｍの励起光を照射した際に得られる５３０～５４０ｎｍの自家蛍光像（ａ）及び、蛍光強度分布（ｂ）を示す図である。

【図12】図１２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ形成卵子であって、受精能を有しない卵子に対して４８８ｎｍの励起光を照射した際に得られる５３０～５４０ｎｍの自家蛍光像（ａ）及び、蛍光強度分布（ｂ）を示す図である。

【図13】図１３は、ｉｎ ｖｉｖｏ形成卵子であって、受精能を有する卵子に対して４８８ｎｍの励起光を照射した際に得られる５３０～５４０ｎｍの自家蛍光像（ａ）及び、蛍光強度分布（ｂ）を示す図である。

【図14】図１４は、ｉｎ ｖｉｖｏ形成卵子であって、受精能を有しない卵子に対して４８８ｎｍの励起光を照射した際に得られる５３０～５４０ｎｍの自家蛍光像（ａ）及び、蛍光強度分布（ｂ）を示す図である。

【図15】図１５は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ形成卵子に対して４０５ｎｍの励起光を照射した際に得られる４８０～４９０ｎｍの自家蛍光像を示す図であって、受精能を有する卵子の自家蛍光像（ａ）及び受精能を有しない卵子の自家蛍光像（ｂ）を示す図である。

【図16】図１６は、ｉｎ ｖｉｖｏ形成卵子に対して４０５ｎｍの励起光を照射した際に得られる４８０～４９０ｎｍの自家蛍光像を示す図であって、受精能を有する卵子の自家蛍光像（ａ）及び受精能を有しない卵子の自家蛍光像（ｂ）を示す図である。

【図17】図１７は、自家蛍光像に基づく品質評価の一例について説明するための図である。

【図18】図１８は、４８８ｎｍの励起光を照射した際に得られる５３０～５４０ｎｍの自家蛍光像の、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの受精能ごとの比を示す図である。

【図19】図１９は、４０５ｎｍの励起光を照射した際に得られる４８０～４９０ｎｍの自家蛍光像の、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの受精能ごとの比を示す図である。

【図20】図２０は、４０５ｎｍおよび４８８ｎｍの励起光を照射した際に得られる自家蛍光の輝度の合計値の分布と、胚盤胞の発生率とを示す図である。

【図21】図２１は、グループＡおよびＣの合計値について学習させて得られる分類モデルについて説明する図である。

【図22】図２２は、励起光の波長帯域の予測への寄与率について説明するための図である。

【図23】図２３は、サンプルのＲＮＡ配列（ＲＮＡ－ｓｅｑ）に対して主成分分析（ＰＣＡ）を行った結果であり、サンプル間の配列の類似度の空間分布の一例を示す図である。

【図24】図２４は、図２３に示す各サンプルの自家蛍光の輝度の合計値と、サンプル数との関係を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態（以下、「実施の形態」という）を説明する。

【0021】

（実施の形態１）
図１は、本発明の実施の形態１に係る顕微鏡システムの概略構成を模式的に示す図である。同図に示す顕微鏡システム１は、共焦点レーザスキャン顕微鏡１００により取得された画像データに基づいて、画像中に写り込んだ細胞の物質生産能の予測を行って、その予測結果や取得した画像の表示を行うシステムである。この顕微鏡システム１は、図１に示すように、レーザ光を照射して試料（以下、検体ということもある）の自家蛍光、又は、透過／反射光を取得する共焦点レーザスキャン顕微鏡１００と、顕微鏡システム１を統括的に制御する制御装置２００と、共焦点レーザスキャン顕微鏡１００が取得した光に基づく画像データ等の各種データを生成する画像処理装置３００と、画像処理装置３００が生成した表示用の画像データに基づく画像を表示する表示装置４００とを備える。本実施の形態において、撮像対象となる試料は、卵子（卵細胞）又は受精卵である。卵子又は受精卵は、ヒト等の哺乳類のものが適用できる。なお、卵子としては、例えば、始原生殖細胞、卵原細胞、一次卵母細胞、二次卵母細胞、並びに、これらの細胞及び受精卵が発生した２細胞期胚、４細胞期胚、８細胞期胚、桑実胚、胚盤胞期胚等が挙げられる。

【0022】

共焦点レーザスキャン顕微鏡１００は、ステージ１０１と、対物レンズ１０２と、レーザ光源１０３と、レンズ１０４と、コリメートレンズ１０５、１１２と、ビームスプリッター１０６と、結像レンズ１０７、１１４と、コンフォーカルピンホール１０８と、検出器１０９と、走査ミラー１１０、１１３と、透過用光源１１１とを備える。以下、ステージ１０１の検体載置面と平行な平面上の直交する二つの軸をＸ軸、Ｙ軸とし、この平面に直交する軸をＺ軸とする。なお、Ｚ軸は、対物レンズ１０２の光軸と平行であるものとして説明する。

【0023】

ステージ１０１は、検体を載置する。ステージ１０１は、制御装置２００の制御のもと、例えばモータ等の駆動源を用いてＺ軸方向に移動可能に構成される。検体は、微生物を含む溶液や培地であり、例えばシャーレやスライドガラス等の保持部材によって保持された状態でステージ１０１に載置されている。

【0024】

対物レンズ１０２は、ビームスプリッター１０６が反射したレーザ光をステージ１０１に向けて集光するとともに、ステージ１０１上の検体からの光を平行光にしてビームスプリッター１０６に入射させる。

【0025】

レーザ光源１０３は、所定の波長を有するレーザ光を出射する。具体的に、レーザ光源１０３は、検体を励起するための励起波長に応じた波長のレーザ光を出射する。レーザ光源１０３は、使用する波長のレーザ光をそれぞれ出射可能な複数の光源を有するものであってもよいし、白色のレーザ光を照射して、フィルタによって出射する光の波長を選択できるようにしてもよい。

【0026】

レンズ１０４は、レーザ光源１０３が発したレーザ光を放射状のレーザ光として出射する。

【0027】

コリメートレンズ１０５は、レンズ１０４を通過した放射状のレーザ光を平行光に変換して、ビームスプリッター１０６に出射する。

【0028】

ビームスプリッター１０６は、入射する光の一部を通過させ、残りの光を反射する。具体的に、ビームスプリッター１０６は、レーザ光源１０３から出射された光の一部を対物レンズ１０２側に折り曲げるとともに、対物レンズ１０２から入射した光の一部を通過させることによって結像レンズ１０７に入射させる。ビームスプリッター１０６は、例えばハーフミラーを用いて構成され、入射したレーザ光のうち、半分のレーザ光を通過させるとともに、残りの半分のレーザ光を反射する。

【0029】

結像レンズ１０７は、ビームスプリッター１０６を通過した光を結像する。

【0030】

コンフォーカルピンホール１０８は、結像レンズ１０７によって結像された光の少なくとも一部を通過させる。コンフォーカルピンホール１０８には、光が通過可能な孔であるピンホール１０８ａが形成されている。また、コンフォーカルピンホール１０８は、対物レンズ１０２と共役な位置に設けられる。このため、コンフォーカルピンホール１０８では、対物レンズ１０２の焦点面からの光がピンホール１０８ａを通過し、合焦していない位置からの光が遮断される。例えば、結像レンズ１０７により結像されるレーザ光のスポット径が０．２μｍである場合、結像位置において、約０．０３μｍ²の範囲からの光がピンホール１０８ａを通過する。なお、ピンホール１０８ａの径と、焦点空間の大きさは設定の変更が可能である。

【0031】

検出器１０９は、入射した光を設定された波長帯域に分離する反射型回折格子と、得られた光を光電変換するとともに、変換した電気信号の電流増幅を行う複数の光電子増倍管（PhotoMultiplier Tube：PMT、以下、チャンネルということもある）とを用いて構成される。検出器１０９は、例えば反射型回折格子によって互いに波長帯域の異なる３２個の光に分離し、分離した光が、３２個の光電子増倍管にそれぞれ入射する。各光電子増倍管は、入射した光をそれぞれ光電変換して電気信号を出力する。なお、光電子増倍管の数はこれに限らない。例えば、３２個の光電子増倍管を有する場合、検出器１０９は、１～３２チャンネルからそれぞれ電気信号が出力される。この際、チャンネルに付される数が小さいほど、短い波長範囲の光が入射する。

【0032】

走査ミラー１１０は、制御装置２００による制御のもと、検体の焦点面Ｐ_F上におけるレーザ光の照射位置を制御する。走査ミラー１１０は、例えばＸ位置制御ミラーと、Ｙ位置制御ミラーとを用いて構成され、ＸＹ平面上の所定の位置にレーザ光を導光する。走査ミラー１１０は、制御装置２００による制御のもと、各位置制御ミラーの角度を変化させることによってレーザ光の照射位置を予め設定された走査経路に沿って移動させる。

【0033】

透過用光源１１１は、制御装置２００の制御のもと、ステージ１０１を透過させる透過光を出射する。透過用光源１１１は、例えば、ハロゲンランプ、レーザ光源等を用いて構成される。

【0034】

コリメートレンズ１１２は、透過用光源１１１が出射した放射状の光を平行光に変換して、走査ミラー１１３に出射する。

【0035】

走査ミラー１１３は、制御装置２００による制御のもと、検体の焦点面Ｐ_F上における透過用の光の照射位置を制御する。走査ミラー１１３は、走査ミラー１１０と同様に、例えばＸ位置制御ミラーと、Ｙ位置制御ミラーとを用いて構成される。

【0036】

結像レンズ１１４は、走査ミラー１１３を通過した光を結像する。

【0037】

次に、制御装置２００の構成について説明する。制御装置２００は、制御部２０１と、入力部２０２とを備える。なお、制御装置２００は、当該制御装置２００の動作に必要な各種情報を記録する記録部（図示せず）を備えている。

【0038】

制御部２０１は、演算及び制御機能を有するＣＰＵ（Central Processing Unit）や各種演算回路等を用いて構成される。制御部２０１は、記録部が格納する情報を読み出して各種演算処理を実行することによって顕微鏡システム１を統括して制御する。制御部２０１は、レーザ制御部２０３と、走査制御部２０４と、透過光制御部２０５とを有する。

【0039】

レーザ制御部２０３は、制御プログラムや、入力部２０２が受け付けた指示情報に基づいて、レーザ光源１０３によるレーザ光の出射を制御する。具体的に、レーザ制御部２０３は、レーザ光の出射タイミングの制御や、出射するレーザ光の波長の制御を行う。レーザ制御部２０３は、例えば、パルス制御によってレーザ光を間欠的に出射する制御を行う。

【0040】

走査制御部２０４は、制御プログラムや、入力部２０２が受け付けた指示情報に基づいて、ステージ１０１のＺ方向の位置の制御や、走査ミラー１１０によるレーザ光の照射位置の制御を行う。

【0041】

透過光制御部２０５は、制御プログラムや、入力部２０２が受け付けた指示情報に基づいて、透過用光源１１１の駆動制御を行う。

【0042】

入力部２０２は、各種情報の入力を受け付ける。入力部２０２は、キーボード、マウス、タッチパネル等のユーザインタフェースを用いて構成される。

【0043】

次に、画像処理装置３００の構成について説明する。画像処理装置３００は、検出信号受信部３０１と、データ生成部３０２と、画像生成部３０３と、予測部３０４と、記録部３０５とを有する。

【0044】

検出信号受信部３０１は、検出器１０９から、各チャンネルの電気信号を受信する。検出信号受信部３０１は、受信した各チャンネルの電気信号と、走査面上の位置情報（例えばレーザ光照射位置）とを対応付けてデータ生成部３０２に出力する。なお、検出信号受信部３０１は、透過／反射光検出用と、自家蛍光検出用とを個別に設けるようしてもよい。

【0045】

データ生成部３０２は、検出信号受信部３０１から受信した電気信号に基づく光の強度と、走査面上の位置情報とを対応付けたデータを生成する。データ生成部３０２は、自家蛍光データ生成部３０２ａと、透過／反射光データ生成部３０２ｂと、対応データ生成部３０２ｃとを有する。

【0046】

自家蛍光データ生成部３０２ａは、検出信号受信部３０１が受信した自家蛍光に係る電気信号であって、各チャンネルの電気信号を取得して、所定の焦点面上の１つの座標ごとに強度データ及び／又は蛍光スペクトル（スペクトルデータ）を生成する。自家蛍光データ生成部３０２ａは、走査面上の一つの位置について、照射された励起光が一つの場合は、一つの蛍光スペクトルを生成し、互いに異なる複数の波長の励起光が異なるタイミングで照射された場合には、励起光に応じて複数の蛍光スペクトルを生成する。ここでいう「蛍光スペクトル」とは、励起光として所定の波長のレーザ光を照射した際に生じた自家蛍光の「波長に対する強度分布」を意味する。また、ここでいう「強度」とは、例えば得られた自家蛍光を光電変換した信号値を指す。蛍光スペクトルは、例えばプロット間を補完して平滑化処理等が施されている波形からなる。なお、本発明では複数の蛍光スペクトルからなるデータをスペクトルプロファイルデータと呼ぶことがある。本明細書において、「自家蛍光データ」とは、自家蛍光の強度データ、スペクトルデータ及びスペクトルプロファイルデータのいずれか又はすべてを含む。自家蛍光データ生成部３０２ａは、走査面上の各位置（所定の焦点面上の複数の座標）について、励起波長に応じて生成される蛍光スペクトルを対応付けた自家蛍光データを生成する。

【0047】

透過／反射光データ生成部３０２ｂは、検出信号受信部３０１が受信した、検体を透過した透過光、又は、検体が反射した反射光に係る検出信号を取得して、この取得した検出信号に基づく光の強度と、走査面上の位置情報とを対応付けた透過／反射光データを生成する。透過／反射光データ生成部３０２ｂは、例えば、各チャンネルの電気信号に基づく光の強度を合算して、その走査面上の位置における光の強度とする。

【0048】

対応データ生成部３０２ｃは、所定の焦点面上の１つの座標における自家蛍光データ、及び、透過／反射光データからなる対応データ、又は、自家蛍光データ及び品質データからなる学習用の対応データを生成する。ここで、本実施の形態における品質データは、卵子の受精能の有無、又は、受精卵の胚盤胞発生能若しくは個体発生能の有無である。対応データ生成部３０２ｃは、複数の座標において自家蛍光データ、反射光データ及び品質データが生成されていれば、各座標について、対応データや学習用対応データを生成する。また、同一の座標において複数の励起光による自家蛍光データが生成されていれば、その座標に各自家蛍光データを対応付ける。

【0049】

ここで、所定の焦点面上の１つの座標において透過／反射光データと自家蛍光データとを対応付けることの意義について述べる。透過／反射光の強度は、所定の焦点面上の１つの座標における、細胞等の検体の存在を反映する。反射光の場合、当該座標に検体（細胞）が存在しなければ光の強度は低く、検体（細胞）が存在すれば高い強度の光が得られる。これに対し、透過光は、当該座標に検体（細胞）が存在しなければ光の強度は高く、検体（細胞）が存在すれば低い強度の光が得られる。高倍率での反射光を取得すれば、細胞の輪郭部分からの光、細胞内部からの光、さらには核など内部の細胞内小器官からの光を得ることもできる。このようにして、ある座標における検体（細胞）の有無、或いは、ある座標が検体（細胞）のどの部位に相当するかの情報を取得し、これと当該座標における自家蛍光データを用いることにより、これまで不可能であった個々の細胞レベル、さらには細胞内小器官レベルでの解析を行うことが可能となる。

【0050】

画像生成部３０３は、データ生成部３０２が生成した各種データに基づいて、１フレームの表示用画像に対応する二次元又は三次元の画像データを生成する。画像生成部３０３は、例えば、透過光に基づく合焦画像データを生成する場合、透過／反射光データ生成部３０２ｂが生成した透過光データに基づいて、画素位置ごとに輝度情報を付与した合焦画像データを、走査した走査面の数に応じて一つ又は複数生成する。また、画像生成部３０３は、照射した励起光により生じた自家蛍光による蛍光画像データを生成する場合、対応データ生成部３０２ｃが生成した対応データのうちの蛍光スペクトルに基づいて、画素位置ごとに輝度情報を付与した蛍光画像データを、走査した走査面の数に応じて一つ又は複数生成する。画像生成部３０３は、生成された１フレームの二次元画像データに対してゲイン処理、コントラスト処理、γ補正処理等の公知の技術を用いた画像処理を行うとともに、表示装置４００の表示仕様に応じた処理を施すことによって表示用の画像データを生成する。

【0051】

ここで、レーザ光照射位置は、画像生成部３０３が生成する画像データの空間情報と対応付いている。空間位置は、二次元であればＸ軸上の画素の位置（Ｘ位置）及びＹ軸上の画素の位置（Ｙ位置）からなる位置情報であり、三次元であればＸ位置、Ｙ位置、及びＺ軸上の画素の位置（Ｚ位置）からなる位置情報である。例えば、走査面は、Ｚ軸と直交する平面に対応し、走査面上の位置は、その走査面におけるＸ位置とＹ位置とによって表現される。

【0052】

予測部３０４は、学習装置５００において算出された品質評価関数を用いて、卵子の受精能、又は、受精卵の胚盤胞発生能若しくは個体発生能を予測する。具体的には、予測部３０４は、品質が不明の未知の自家蛍光スペクトルを有する卵子の受精能、又は、受精卵の胚盤胞の発生能若しくは個体発生能を予測する。予測部３０４は、予測結果を品質評価データとして記憶部３０５や表示装置４００等に出力する。

【0053】

記録部３０５は、画像処理装置３００の動作を実行するためのプログラムを含む各種プログラムを記録する。記録部３０５は、各種プログラム等が予めインストールされたＲＯＭ（Read Only Memory）や、演算パラメータ等を記録するＲＡＭ（Random Access Memory）等を用いて構成される。記録部３０５は、予測部３０４により生成された予測結果や、学習装置５００から取得した品質評価関数等を記録してもよい。

【0054】

表示装置４００は、液晶又は有機ＥＬ（Electro Luminescence）を用いて構成され、画像処理装置３００にて生成された画像等を表示する。表示装置４００は、制御装置２００にて生成された各種情報を表示するようにしてもよい。

【0055】

学習装置５００は、入力された学習用対応データの特徴を学習し、品質予測のための品質評価関数を生成する。学習装置５００は、自家蛍光データ及び品質データからなる学習用の対応データを用いて線形判別分析（Linear Discriminant Analysis：ＬＤＡ）による教師あり学習を行って生成され、分類クラス数に対して次元を削減した空間に自家蛍光強度分布をプロットしたヒストグラムであって、品質を評価する境界線が付与されたヒストグラムを生成する。例えば、受精能の有無を分類クラスとすると、「あり」及び「なし」の２クラスとなり、この２クラスを一次元空間に次元を削減したヒストグラムが生成される。学習装置５００では、対応データが更新されるたびにＬＤＡを繰り返すことによって、予測精度の高い境界線が与えられたヒストグラムが構築される。学習装置５００は、演算及び制御機能を有するＣＰＵや各種演算回路や、各種プログラム等が予めインストールされたＲＯＭや、演算パラメータ等を記録するＲＡＭ等のメモリ等を用いて構成される。

【0056】

次に、顕微鏡システム１による品質評価方法について、図２を参照して説明する。図２は、本発明の実施の形態１に係る品質評価方法を説明するフローチャートの一例である。以下、得られた自家蛍光や品質評価関数（ここではヒストグラム）に基づいて、卵子又は受精卵の品質能予測を行う流れを説明する。

【0057】

例えば、ディッシュに載置した検体（ここでは卵子又は受精卵）をステージ１０１に載置した後、制御部２０１の制御のもと、検体に対し、透過／反射光を取得するために予め設定された光を照射する（ステップＳ１）。検出信号受信部３０１は、検体を透過した透過光、又は、検体が反射する反射光に応じた検出信号を取得する。本実施の形態では、走査ミラー１１０又は１１３を制御して、透過／反射光取得用の光の焦点位置を三次元的に走査して透過／反射光を取得し、三次元空間のデータを生成するものとして説明する。

【0058】

ここで、顕微鏡システム１による走査方法について、図３を参照して説明する。図３は、本発明の実施の形態１に係る顕微鏡システムの走査方法を説明する図である。共焦点レーザスキャン顕微鏡１００では、あるＺ位置の焦点面において、ＸＹ平面上を走査して検体からの光を受光した後、Ｚ位置を変更して、変更後のＺ位置におけるＸＹ平面上を走査する。例えば、図１に示すＺ走査範囲Ｒ_Zにおいて設定されたＺ位置ごとに走査を行って、各Ｚ位置において焦点面上の複数の位置から光（反射光又は自家蛍光）を得る。共焦点レーザスキャン顕微鏡１００では、生成する画像に応じて、ビームスプリッター１０６や、検出器１０９の構成を適宜変更可能である。

【0059】

例えば、図３に示すように、焦点面Ｐ_F１におけるレーザ光の走査を行った後、ステージ１０１をＺ軸方向に移動して、移動後にレーザ光の焦点が配置される焦点面Ｐ_F２におけるレーザ光の走査を行う。これを、予め設定されているＺ走査範囲Ｒ_Zにおける焦点面Ｐ_F３、Ｐ_F４、Ｐ_F５、Ｐ_F６、Ｐ_F７、・・・と順次走査を行う。

【0060】

ＸＹ平面における走査方法について、例えば、図３に示すように、矩形をなす焦点面（図３では焦点面Ｐ_F７）の一つの角部からレーザ光を照射して、照射領域であるスポットＳＰからの光を受光する。このスポットＳＰをジグザグに走査することによって、焦点面Ｐ_F７において、１枚の二次元画像（合焦画像）を生成するためのデータ数に対応する光を取得することができる。このスポットＳＰの径を、例えば一つの画素（モニタに表示される１つのドットに相当）のサイズと略同等とすれば、二次元画像及び三次元画像の色を画素単位で表現することができ、さらには卵子または受精卵の品質等の情報に対応する視覚情報を画素単位で配色することが可能である。「画素のサイズと略同等」とは、例えば、スポットＳＰを円とした場合、画素に内接する大きさとほぼ同じサイズのことをいう。なお、上述した走査経路は一例であり、焦点面を走査できれば、この経路に限らない。なお、スポットＳＰの径は、光学顕微鏡の分解能の限界である約０．２μｍを下限として、コンフォーカルピンホールの径を変更することにより適宜調節しうる。

【0061】

透過／反射光データ生成部３０２ｂは、検出信号受信部３０１が受信した光に係る検出信号を取得し、取得した検出信号に基づいて透過／反射光データを生成する（ステップＳ２：透過／反射光データ生成ステップ）。

【0062】

ここで、卵子及び受精卵の成長について、図４を参照して説明する。まず、受精前の卵子は、未熟卵の状態を経て成熟卵へと成長する。具体的には、ＧＶ核Ｎ₁を有するＧＶ期の卵子Ｅ₁（図４の（ａ）参照）、ＭＩ期の卵子Ｅ₂（図４の（ｂ）参照）を経て、極体Ｐ₁を有するＭＩＩ期の卵子Ｅ₃（図４の（ｃ）参照）へと成長する。この際、卵子Ｅ₁、Ｅ₂は、受精能を有する未熟卵であり、卵子Ｅ₃は、受精能を有する成熟卵である。

【0063】

ＭＩＩ期の卵子Ｅ₃と精子Ｓ₁（図４の（ｃ）参照）とが受精すると、受精卵Ｆ₁（胚）が２～４つの細胞（受精卵Ｆ₂、Ｆ₃）に分割し（図４の（ｄ）～（ｆ）参照）、その後さらに分割した後、胚盤胞（受精卵Ｆ₄：図４の（ｇ）参照）へと成長する。胚盤胞である受精卵Ｆ₄へと成長した後、この受精卵Ｆ₄を取り囲む殻を破って孵化胚盤胞となる。この孵化胚盤胞を経て新たな個体が発生する。

【0064】

ステップＳ２に続くステップＳ３において、制御部２０１の制御のもと、検体に対し、自家蛍光を取得するために予め設定された波長又は波長帯域の光（励起光）を照射する。なお、本実施の形態では、自家蛍光を取得するための励起光と、透過／反射光を取得するための照射光とを異なるタイミングで照射して取得するものとして説明するが、例えば同じ波長の光を、透過／反射光、及び自家蛍光を取得するための光として用いる場合には、試料に対して光を一回のみ照射し、検出時間に差を設けることによって、透過／反射光、及び、自家蛍光を取得するようにしてもよい。

【0065】

その後、自家蛍光データ生成部３０２ａは、検出信号受信部３０１が受信した自家蛍光に係る検出信号を取得し、取得した検出信号に基づいて自家蛍光データを生成する（ステップＳ４）。この自家蛍光データは、ステップＳ１において検体に照射された励起光によって生じた自家蛍光の蛍光スペクトルを含んでもよい。また、必要に応じて各細胞の自家蛍光の経時変化を含む。

【0066】

なお、ステップＳ１、２及びステップＳ３、４の各データ生成処理は、ステップＳ３、４を先に行ってもよいし、並行して処理を実行するようにしてもよい。

【0067】

ステップＳ４に続くステップＳ５において、制御部２０１は、ステップＳ３で照射した自家蛍光取得用の励起光の波長（又は波長帯域）とは異なる波長（又は波長帯域）の励起光を照射するか否かを判断する。制御部２０１は、予め設定されている走査条件や、入力部２０２を介して設定された走査条件を参照し、さらに照射すべき励起光があるか否かを判断する。

【0068】

ステップＳ２、Ｓ４では、１スポット、すなわち、あるＺ位置の焦点面における一点について、ある一つの励起波長のレーザ光を照射した際に取得される自家蛍光の蛍光スペクトル、又は、透過／反射光強度が生成される。予め設定されている励起波長が複数の場合は、各励起波長のレーザ光の走査を繰り返すことによって、同じ位置において異なる励起波長の蛍光スペクトルを生成する。この繰り返しにより、複数の焦点面における各位置の、励起波長に応じた蛍光スペクトルが生成される。ここでいう「焦点面」とは、レーザ光の光軸と直交する面であって、レーザ光の焦点が配置されている面のことをさす。

【0069】

制御部２０１は、ステップＳ３で照射した波長とは異なる波長の励起光の照射をする必要があると判断した場合（ステップＳ５：Ｙｅｓ）、ステップＳ３に戻り、設定される励起光を用いた走査を繰り返す。これに対し、制御部２０１は、さらなる励起光の照射を行う必要がないと判断した場合（ステップＳ５：Ｎｏ）、ステップＳ６に移行する。

【0070】

ここで、ステップＳ３～Ｓ５の処理によって得られる自家蛍光データについて、図５～図７を参照して説明する。図５は、本発明の一実施の形態に係る顕微鏡システムの走査によって得られる画像の一例を示す図である。図５において、（ａ）は４０５ｎｍの光を励起光として照射した場合に得られる自家蛍光像であり、（ｂ）は４８８ｎｍの光を励起光として照射した場合に得られる自家蛍光像であり、（ｃ）は５６１ｎｍの光を励起光として照射した場合に得られる自家蛍光像であり、（ｄ）は６４０ｎｍの光を励起光として照射した場合に得られる自家蛍光像である。

【0071】

また、図６は、受精卵（ｉｎ ｖｉｔｒｏ形成受精卵）の励起光に対する自家蛍光強度を示す図であって、胚盤胞までの発生の有無による自家蛍光強度の差異を示す図である。図７は、受精卵（ｉｎ ｖｉｖｏ形成受精卵）の励起光に対する自家蛍光強度を示す図であって、胚盤胞までの発生の有無による自家蛍光強度の差異を示す図である。図６及び図７は、励起光の照射によって検出器１０９の各チャンネルが取得した自家蛍光の強度に応じた色相で示すヒートマップである。図６及び図７では、各励起光において、上に位置するほど、自家蛍光の波長が大きくなる。図６及び図７から、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのそれぞれにおいて、胚盤胞まで発生する受精卵と、胚盤胞が発生しなかった受精卵とでヒートマップのパターンが異なることが分かる。各励起光に対する自家蛍光の波長や光強度は、卵子の受精能や、受精卵の胚盤胞発生能、個体発生能に応じて特有のパターンを有するといえる。

【0072】

図２に戻り、ステップＳ６において、対応データ生成部３０２ｃは、ステップＳ２で生成された透過／反射光の強度データと、ステップＳ３で生成された自家蛍光データとを対応付けた対応データを生成する（対応データ作成ステップ）。この際、複数の励起光の照射により複数の蛍光スペクトルが生成されている場合は、一つのレーザ光照射位置について、複数の蛍光スペクトルと、透過／反射光の強度とが対応付けられる。また、透過／反射光の強度は、一つのレーザ光照射位置について、波長（又は波長帯域）が異なるすべての励起光について取得した透過／反射光の強度を合算した合算値として用いてもよいし、予め設定されている波長の励起光により取得された透過／反射光の強度を用いてもよい。

【0073】

画像処理装置３００は、学習装置５００から、品質評価関数として、ヒストグラムを取得する（ステップＳ７）。このヒストグラムには、ＬＤＡによって品質を評価するための境界線が付与されている。

【0074】

図８は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ形成卵子及びｉｎ ｖｉｖｏ形成卵子由来の線形判別分析（ＬＤＡ）結果を示す図である。図８に示すヒストグラムは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ形成卵子及びｉｎ ｖｉｖｏ形成卵子に由来する自家蛍光は、ＬＤＡにおける一次元空間において、卵子の種別で分類できることが分かる。このヒストグラムによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ形成卵子及びｉｎ ｖｉｖｏ形成卵子を判別するための境界線Ｄ₁を付与することができる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ形成卵子及びｉｎ ｖｉｖｏ形成卵子が不明な卵子を評価する場合、自家蛍光データに基づいてＬＤＡによりヒストグラムにプロットすることによって、いずれの形成卵子であるかを評価することができる。

【0075】

図９は、図８に示す線形判別分析（ＬＤＡ）結果の因子負荷量を示す図（ヒートマップ）である。図９の色温度は、因子負荷量に応じた色が付与される。なお、横軸は検出器１０９のチャンネルに対応し、縦軸は励起光に付与されるラベルに対応する。図９に示すヒートマップは、励起光と自家蛍光とが対応する位置において因子負荷量強度分布が描出される。図９から、因子負荷量が、励起光及び自家蛍光の組み合わせによって変化していることが分かる。ヒートマップでは、ＬＤＡによる判別に寄与している放出波長、すなわち分類しようとするグループ間でどのように自家蛍光の発光態様が異なっているのかが分かる。このヒートマップによって、発光態様の違いの原因となる物質の推定に寄与する情報を得ることができる。

【0076】

また、品質評価を行うためのヒストグラムについて、図１０を参照して説明する。図１０は、線形判別分析（ＬＤＡ）結果に基づく品質評価の一例について説明するための図である。図１０は、ｉｎ ｖｉｖｏ形成卵子の受精能の有無を示すヒストグラムである。ヒストグラムにおいて、受精能ありのデータ数は５６であり、受精能なしのデータ数は６９である。このヒストグラムによって、ｉｎ ｖｉｖｏ形成卵子の受精能を評価するための境界線Ｄ₂を付与することができる。
このように、受精能や発生能の有無によって自家蛍光の空間分布が異なる特性を利用して、品質が未知の検体の自家蛍光から、受精能や発生能の有無を評価することができる。

【0077】

ステップＳ７に続くステップＳ８において、予測部３０４は、ステップＳ６において生成された対応データと、ステップＳ７において取得した品質評価関数とを用いて、検体の品質評価処理を行う。ここで、予測部３０４は、例えばｉｎ ｖｉｖｏ形成卵子の受精能の有無を評価する場合、図１０に示すヒストグラムに、検体から取得した自家蛍光データのＬＤＡ結果をプロットする。予測部３０４は、プロットした位置が、境界Ｄ₂に対して受精能あり側であるか、受精能なし側であるかを判断する。

【0078】

予測部３０４は、予測対象の検体の品質評価を出力する。なお、例えば一つの画像内に複数の検体が存在する場合は、各検体の代表座標と対応付けて品質評価結果を出力する。

【0079】

画像生成部３０３は、品質評価結果を含む表示用の画像データを生成する（ステップＳ９）。画像処理装置３００は、生成した表示用の画像データを、表示装置４００に出力し、当該画像データに対応する画像を表示させる（ステップＳ１０）。

【0080】

以上説明した本発明の実施の形態１では、自家蛍光データと品質（ここでは、卵子の受精能又は受精卵の胚盤胞発生能）とが対応付いたデータを学習用データとして、ＬＤＡによる教師あり学習を行って品質を評価する境界線が付与されたヒストグラムを用いて、検体の自家蛍光強度分布から、当該検体の品質を評価する。本実施の形態１によれば、励起光の照射によって得られる自家蛍光の強度データを用いて品質を評価するため、細胞に対して非侵襲であり、かつ高精度に受精能や発生能を評価することができる。

【0081】

（実施の形態２）
次に、本発明の実施の形態２について、図１１～図１９を参照して説明する。実施の形態１では、自家蛍光の強度データをＬＤＡによって学習したヒストグラムを用いて品質を評価する例について説明したが、本実施の形態２では、自家蛍光の画像から、その強度の分布を用いて品質を評価する。なお、本実施の形態２に係る顕微鏡システムの構成は、顕微鏡システム１の構成と同じであるため、説明を省略する。

【0082】

図１１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ形成卵子であって、受精能を有する卵子に対して４８８ｎｍの励起光を照射した際に得られる５３０～５４０ｎｍの自家蛍光像（ａ）及び、蛍光強度分布（ｂ）を示す図である。図１２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ形成卵子であって、受精能を有しない卵子に対して４８８ｎｍの励起光を照射した際に得られる５３０～５４０ｎｍの自家蛍光像（ａ）及び、蛍光強度分布（ｂ）を示す図である。図１３は、ｉｎ ｖｉｖｏ形成卵子であって、受精能を有する卵子に対して４８８ｎｍの励起光を照射した際に得られる５３０～５４０ｎｍの自家蛍光像（ａ）及び、蛍光強度分布（ｂ）を示す図である。図１４は、ｉｎ ｖｉｖｏ形成卵子であって、受精能を有しない卵子に対して４８８ｎｍの励起光を照射した際に得られる５３０～５４０ｎｍの自家蛍光像（ａ）及び、蛍光強度分布（ｂ）を示す図である。

【0083】

図１１～図１４に示すように、４８８ｎｍの励起光を照射した際に得られる５３０～５４０ｎｍの自家蛍光像において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、及び、受精能の有無によって、自家蛍光の強度分布が異なることが分かる。特に、ｉｎ ｖｉｖｏ形成卵子においては、受精能の有無によって、自家蛍光の強度分布が視覚的にも明確に異なっていることが分かる。また、各自家蛍光像は、中央に向かって光強度が大きくなる傾向があり、性能によってその強度の大きさが異なっている。

【0084】

図１５は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ形成卵子に対して４０５ｎｍの励起光を照射した際に得られる４８０～４９０ｎｍの自家蛍光像を示す図であって、受精能を有する卵子の自家蛍光像（ａ）及び受精能を有しない卵子の自家蛍光像（ｂ）を示す図である。図１６は、ｉｎ ｖｉｖｏ形成卵子に対して４０５ｎｍの励起光を照射した際に得られる４８０～４９０ｎｍの自家蛍光像を示す図であって、受精能を有する卵子の自家蛍光像（ａ）及び受精能を有しない卵子の自家蛍光像（ｂ）を示す図である。

【0085】

図１５及び図１６に示すように、４０５ｎｍの励起光を照射した際に得られる４８０～４９０ｎｍの自家蛍光像においては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏのどちらにおいても、受精能の有無によらず自家蛍光の強度分布が類似していることが分かる。

【0086】

図１１～図１６の自家蛍光像及び自家蛍光強度の傾向から、自家蛍光の強度分布に差異が見られる励起光及び自家蛍光波長を用いることによって、受精能や発生能を評価することができると考えられる。

【0087】

本実施の形態２では、４８８ｎｍの励起光を照射した際に得られる５３０～５４０ｎｍの自家蛍光像を用いて、受精能の有無を評価する例について説明する。図１７は、自家蛍光像に基づく品質評価の一例について説明するための図である。自家蛍光像において、外側領域Ｒ₁の明るさと、内側領域Ｒ₂の明るさとの比を、受精能ごとに比較する。

【0088】

図１８は、４８８ｎｍの励起光を照射した際に得られる５３０～５４０ｎｍの自家蛍光像の、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの受精能ごとの比を示す図である。図１９は、４０５ｎｍの励起光を照射した際に得られる４８０～４９０ｎｍの自家蛍光像の、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの受精能ごとの比を示す図である。なお、図１８及び図１９では、受精能を有するサンプルを＋、受精能を有しないサンプルを－で表示している。

【0089】

４８８ｎｍの励起光を照射した際に得られる５３０～５４０ｎｍの自家蛍光像では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのそれぞれにおいて、受精能の有無によって比に差異が見られた（図１８参照）。一方、４０５ｎｍの励起光を照射した際に得られる４８０～４９０ｎｍの自家蛍光像では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて、受精能の有無による比の差異は見られなかった（図１９参照）。

【0090】

学習装置５００では、自家蛍光の強度分布に差異が見られる励起光及び自家蛍光波長における自家蛍光像の外側と内側との比、及び、受精能の有無が対応付いた学習用データを用いてＬＤＡを行って、１次元空間に自家蛍光強度比の分布をプロットしたヒストグラムを、品質評価関数として生成する。予測部３０４は、このヒストグラムを用いて、自家蛍光の強度比から、受精能を評価する。なお、受精卵の胚盤胞発生能についても同様にヒストグラムを生成し、評価を行うことができる。

【0091】

以上説明した本発明の実施の形態２では、自家蛍光像における外側／内側の強度比と、品質（ここでは、卵子の受精能又は受精卵の胚盤胞発生能）とが対応付いたデータを学習用データとして、ＬＤＡによる教師あり学習を行って品質を評価するヒストグラムを用いて、検体の自家蛍光強度比から、当該検体の品質を評価する。本実施の形態２によれば、励起光の照射によって得られる自家蛍光の強度データを用いて品質を評価するため、細胞に対して非侵襲であり、かつ高精度に受精能や発生能を評価することができる。

【0092】

（実施の形態３）
次に、本発明の実施の形態３について、図２０～図２２を参照して説明する。実施の形態１では、自家蛍光の強度データをＬＤＡによって学習したヒストグラムを用いて品質を評価する例について説明したが、本実施の形態３では、所定の組をなす励起光と、その自家蛍光の輝度値の合計値から、その分布を用いて品質を評価する。なお、本実施の形態３に係る顕微鏡システムの構成は、顕微鏡システム１の構成と同じであるため、説明を省略する。本実施の形態３では、４０５ｎｍおよび４８８ｎｍの励起光を用いた際に得られる自家蛍光の輝度値の合計値を例に説明する。なお、励起光の組み合わせは、４０５ｎｍおよび４８８ｎｍの組み合わせに限らない。

【0093】

図２０は、４０５ｎｍおよび４８８ｎｍの励起光を照射した際に得られる自家蛍光の輝度の合計値の分布と、胚盤胞の発生率とを示す図である。図２０では、正常に受精し、かつ胚盤胞を発生したサンプルをグループＡ、正常に受精し、かつ胚盤胞を発生しなかったサンプルをグループＢ、受精しないサンプルをグループＣとして分類し、各グループの輝度値の合計値（以下、単に「合計値」という）の分布を示している。なお、図２０では、同一の合計値が同じサンプルについては、各グループの棒を重ねてサンプル数を示しており、棒の重複部分は混色によって色が変わって見えている。また、図２０には、胚盤胞の発生率を、黒丸（●）のプロットで示している。胚盤胞の発生率は、中央値に対して所定の範囲内の範囲の合計値における割合を示し、グループＡの割合に相当する。

【0094】

図２０から分かるように、グループＡに属するサンプルは、比較的合計値が小さい位置に分布している。換言すれば、輝度値の合計値が大きいほど、胚盤胞の発生率が低いといえる。

【0095】

学習装置５００では、例えば、胚盤胞発生能に有意な特性が見られる、組をなす励起波長と、その自家蛍光の合計値、及び、胚盤胞発生の有無が対応付いた学習用データを用いて、自家蛍光の合計値に対する胚盤胞発生の有無を評価するための境界線（基準値）を設定した品質評価関数を生成する、もしくは発生の確率を評価する予測スコアを出力する品質評価関数を生成する。予測部３０４は、この品質評価関数を用いて、自家蛍光の合計値から、例えば胚盤胞発生能を評価する。なお、受精能についても同様に品質評価関数を生成し、評価を行うことができる。

【0096】

ここで、品質評価関数として予測スコアを出力する分類モデルを用いる場合について、図２１を参照して説明する。図２１は、グループＡおよびＣの合計値について学習させて得られる分類モデルについて説明する図である。具体的には、図２１は、正常に受精し、かつ胚盤胞を発生したサンプルからなるグループＡの輝度値の合計値と、受精しないサンプルからなるグループＣの輝度値の合計値とを学習させて得られる分類モデルの予測スコアの関係を示す図である。図２１は、正常に受精し、かつ胚盤胞を発生した場合の予測スコアの分布、正常に受精し、かつ胚盤胞を発生しなかった（受精のみ）場合の予測スコアの分布、および、受精しなかった場合の予測スコアの分布を示す。この分類モデルは、ソフトマックス関数を用いるものであり、出力値が０～１．０となるように変換して出力する関数である。この分類モデルが出力する値は、グループＡにどれだけ近いかを示す、すなわち１．０に近いほどグループＡに近いことを示している。例えば、この予測スコアの出力結果から、胚盤胞がほぼ確実に発生するスコア領域Ｑ₁と、胚盤胞が確率的に発生するスコア領域Ｑ₂と、胚盤胞がほぼ発生しないスコア領域Ｑ₃とを設定することができる。これにより、検体の輝度値の合計値を品質評価関数に入力して出力される値をもとに、胚盤胞の発生の有無を予測することができる。

【0097】

なお、図２１における予測スコア分布は、検出器１０９の各チャンネルにおいて、負の相関を有するチャンネルに基づいて生成される。図２２は、励起光の波長帯域の予測への寄与率について説明するための図である。図２２では、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５６１ｎｍ及び６４０ｎｍについて、各波長の下方のカラーバーに対する相関係数を示す。カラーバーは、左側から、例えば３００～９２０ｎｍを３２の波長域に分割した１～３２チャンネルの自家蛍光の波長範囲を連続的かつ模式的に示すものである。図２２では、励起光波長とカラーバーにおけるチャンネルとの組み合わせとして、４０５ｎｍと４８８ｎｍとの波長域が負の相関を示している（領域Ｑ₄参照）。ここで、４０５ｎｍの１～４チャンネル、及び、５６１ｎｍの全チャンネルは、正の相関を有するため、図２１の合計値からは除外している。すなわち、図２１に示す予測スコアの分布は、４０５ｎｍの５～３２チャンネル、４８８ｎｍの全チャンネル、及び、６４０ｎｍの全チャンネルの合計値に基づくものである。

【0098】

また、輝度値の合計値と、ＲＮＡ配列（ＲＮＡ－ｓｅｑ）とを用いて、正常受精の可否又は胚盤胞発生の有無を予測することも考えられる。図２３は、サンプルのＲＮＡ配列に対して主成分分析（ＰＣＡ）を行った結果であり、サンプル間の配列の類似度の空間分布の一例を示す図である。なお、各成分（Ｄｉｍ１、Ｄｉｍ２）に付している割合は、寄与率を示している。主成分分析により、空間分布において、配列をＮｏ．１～４のグループ（以下、単に「グループ１～４」とする）に分けることができる。

【0099】

図２４は、図２３に示す各サンプルの自家蛍光の輝度の合計値と、サンプル数との関係を示す図である。図２４では、グループ１～３とグループ４との輝度値の合計値が大きく乖離している。一方、グループ１、３は、空間分布では離れて位置しているが（図２３参照）、輝度値の合計値は近い位置に分布している。例えば、この空間分布と、図２０に示すような相関とに基づいて、正常受精の可否や、胚盤胞の発生の有無（発生確率）を予測することもできる。

【0100】

以上説明した本発明の実施の形態３では、発生率に有意な特性が見られる励起波長による自家蛍光の合計値と、品質（ここでは、卵子の受精能又は受精卵の胚盤胞発生能）とが対応付いたデータを学習用データとして、ＬＤＡによる教師あり学習を行って品質を評価するヒストグラムを用いて、検体の自家蛍光の合計値から、当該検体の品質を評価する。本実施の形態３によれば、励起光の照射によって得られる自家蛍光の強度データを用いて品質を評価するため、細胞に対して非侵襲であり、かつ高精度に受精能や発生能を評価することができる。

【0101】

ここまで、本発明を実施するための形態を説明してきたが、本発明は上述した実施の形態によってのみ限定されるべきものではない。上述した実施の形態では、卵子又は受精卵からの自家蛍光に基づいて自家蛍光データを生成し、卵子又は受精卵の品質を予測するものとして説明したが、この受精能や胚盤胞発生能に限らず、例えば自家蛍光データから評価可能な特性の予測に適用することが可能である。具体的には、未知試料又は既知試料の種々の代謝状態又は生理状態に関する検体の状態を評価したりすることができる。

【0102】

また、上述した実施の形態では、三次元空間を走査して、自家蛍光データ、反射光データ及び対応データを生成するものとして説明したが、二次元空間（図３に示すＸＹ平面、ＸＺ平面及びＹＺ平面のいずれか）を走査して自家蛍光データ、反射光データ及び対応データを生成してもよいし、図３に示すＸ方向、Ｙ方向及びＺ方向のうちのいずれか一つの方向に走査するようにしてもよいし、空間における、ある一点の自家蛍光、及び、透過／反射光を取得して自家蛍光データ、透過／反射光データを生成してもよい。

【0103】

また、上述した実施の形態では、学習装置５００が品質を評価するためのヒストグラムを生成する例について説明したが、学習装置５００の機能を、画像処理装置３００が実行するようにしてもよい。例えば、画像処理装置３００が、光データの取得から、ヒストグラムの生成、品質の予測までを実行する構成とすることができる。

【0104】

また、上述した実施の形態では、予測部３０４が受精能や発生能の有無を予測する例について説明したが、例えば、予測部３０４が、受精能や発生能の有無の予測は行わずに、表示装置４００に、ヒストグラム上のプロット位置のみを示す画像を品質評価データとして表示させ、使用者に受精能や発生能の有無を判断させるようにしてもよい。

【0105】

また、上述した実施の形態では、検出器１０９が、反射型回折格子及び光電子増倍管（PMT）を用いて構成されるものとして説明したが、この他、例えば、音響光学ビームスプリッター（例えば、ライカ社のＡＯＢＳ（登録商標））、高感度検出器（HyD検出器）、及び検出器の前段に設けられる可動スリット構造からなる検出器としてもよい。この検出器は、上述した構成により、例えば１ｎｍごとの波長に分離したデータを取得することが可能である。

【0106】

また、上述した実施の形態では、Ｚ方向に積層される複数のＸＹ平面を走査する顕微鏡システムを用いて自家蛍光像等を取得する例について説明したが、一つの卵子又は受精卵の自家蛍光像を取得できれば、撮像素子を用いて画像を撮像する顕微鏡を採用することができる。この際、撮像素子として、ハイパースペクトルカメラを採用してもよいし、顕微鏡として共焦点顕微鏡を採用することができる。

【0107】

また、上述した実施の形態では、レーザ光を用いて反射光又は自家蛍光を取得するようにしたが、レーザ光のような指向性の高い光に限らず、指向性の低い光（例えばハロゲンランプによる光）を集光して試料に照射することによって反射光又は自家蛍光を取得するようにしてもよい。例えば、レーザ光により自家蛍光を取得し、ハロゲンランプを用いて反射光を取得したり、ハロゲンランプを用いて自家蛍光を取得し、レーザ光により反射光を取得したり、ハロゲンランプを用いて自家蛍光及び反射光を取得したりしてもよい。また、光の波長は、フィルタを通過したものや、プリズムによって分光したものでもよい。また、検体からの反射光に限らず、透過光や蛍光等、細胞等の輪郭を抽出できる光検出データであれば適用できる。

【0108】

このように、本発明は、特許請求の範囲に記載した技術的思想を逸脱しない範囲内において、様々な実施の形態を含みうるものである。

【0109】

以上のように、本発明に係る品質評価方法及び品質評価プログラムは、細胞に対して非侵襲であり、かつ高精度に受精能や発生能を評価するのに有用である。

【符号の説明】

【0110】

１ 顕微鏡システム
１００ 共焦点レーザスキャン顕微鏡
１０１ ステージ
１０２ 対物レンズ
１０３ レーザ光源
１０４ レンズ
１０５、１１２ コリメートレンズ
１０６ ビームスプリッター
１０７、１１４ 結像レンズ
１０８ コンフォーカルピンホール
１０９ 検出器
１１０、１１３ 走査ミラー
１１１ 透過用光源
２００ 制御装置
２０２ 入力部
２０３ レーザ制御部
２０４ 走査制御部
２０５ 透過光制御部
３００ 画像処理装置
３０１ 検出信号受信部
３０２ データ生成部
３０２ａ 自家蛍光データ生成部
３０２ｂ 透過／反射光データ生成部
３０２ｃ 対応データ生成部
３０３ 画像生成部
３０４ 予測部
３０５ 記録部
４００ 表示装置
５００ 学習装置

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】