特開 2023-138948 Ｔ細胞依存性二重特異的抗体をアッセイするための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023138948

(43)【公開日】2023-10-03

(54)【発明の名称】Ｔ細胞依存性二重特異的抗体をアッセイするための方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20230926BHJP

   G01N 33/536 20060101ALI20230926BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20230926BHJP

   C12Q 1/6897 20180101ALI20230926BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20230926BHJP

【ＦＩ】

G01N33/53 N ZNA

G01N33/536 C

G01N33/536 D

G01N33/53 M

G01N33/53 Y

C12Q1/04

C12Q1/6897

C12N5/10

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023097744

(22)【出願日】2023-06-14

(62)【分割の表示】P 2021155968の分割

【原出願日】2017-01-25

(31)【優先権主張番号】62/286,862

(32)【優先日】2016-01-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】509012625

【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】リー， ホヨン

(72)【発明者】

【氏名】チアン， クオイン

(72)【発明者】

【氏名】ウォン， ピン イー

(72)【発明者】

【氏名】キャリー， ケンドール

(57)【要約】      （修正有）

【課題】本発明は、Ｔ細胞依存性二重特異性抗体（ＴＤＢ）によって媒介されるＴ細胞活性化を測定するための細胞系アッセイを提供する。
【解決手段】アッセイは、組成物中のＴＤＢを検出すること、組成物中のＴＤＢの量を定量化することと、ＴＤＢの効力及び／または特異性を決定すること、または細胞集団が標的抗原を発現するかどうかを決定することに有用である。組成物及びキットもまた、企図される。
【選択図】図８

【特許請求の範囲】

【請求項1】

組成物中のＴ細胞依存性二重特異性抗体（ＴＤＢ）を検出するための方法であって、前記二重特異性抗体が、標的抗原結合断片及びＣＤ３結合断片を含み、前記方法が、
Ｔ細胞及び標的細胞の集団を、前記組成物と接触させることを含み、前記Ｔ細胞が、Ｔ細胞活性化に応答する応答要素に作動可能に連結したレポーターをコードする核酸を含み、前記標的細胞が、前記標的抗原を発現し、
前記レポーターの発現が、ＴＤＢの存在を示す、前記方法。

【請求項2】

前記レポーターが、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ、またはベータガラクトシダーゼである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ルシフェラーゼが、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、またはナノシフェラーゼである、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記Ｔ細胞活性化に応答する応答要素が、ＮＦＡＴプロモーター、ＡＰ－１プロモーター、ＮＦκＢプロモーター、ＦＯＸＯプロモーター、ＳＴＡＴ３プロモーター、ＳＴＡＴ５プロモーター、またはＩＲＦプロモーターである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記Ｔ細胞活性化に応答する応答要素が、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１、ＮＦκＢ、ＦＯＸＯ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、及びＩＲＦのうちの任意の１つ以上からのＴ細胞活性化応答要素を含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記Ｔ細胞の集団が、ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ８^＋Ｔ細胞の集団である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記Ｔ細胞の集団が、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞またはＣＴＬＬ－２ Ｔ細胞の集団である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記標的抗原が、前記標的細胞の表面上に発現される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記標的抗原が、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９α（ＣＤ７９ａ）、ＣＤ７９β（ＣＤ７９ｂ）、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体、ＨＥＲ４受容体、ＦｃＲＨ５、ＣＬＬ１、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、αｖ／β３インテグリン、ＶＥＧＦ、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ－４；プロテインＣ、ＢＲ３、ｃ－ｍｅｔ、組織因子、β７、Ｔｅｎｂ２、ＳＴＥＡＰ、または膜貫通腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

ａ）前記標的抗原がＨＥＲ２受容体であり、前記標的細胞がＢＴ－４７４細胞であるか、
ｂ）前記標的抗原がＨＥＲ２受容体であり、前記標的細胞がＳＫＢＲ３細胞であるか、
ｃ）前記標的抗原がＣＤ２０であり、前記標的細胞がＷｉｌ２－Ｓ細胞であるか、または
ｄ）前記標的抗原がＣＤ７９ｂであり、前記標的細胞がＢＪＡＢ細胞である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記細胞集団におけるＴ細胞対標的細胞の比が、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、または約１：１０である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記細胞集団におけるＴ細胞対標的細胞の比が、約１：４である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記細胞集団が、約１×１０^３～約１×１０^６の範囲である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記細胞集団が、約１×１０^４～約５×１０^４である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

Ｔ細胞の集団を、０．０１ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で前記ＴＤＢを含む組成物と接触させる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記レポーターが、前記細胞を前記組成物と接触させた１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１６、２０、または２４時間後のうちの任意の１つ以上に検出される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

組成物中のＴＤＢの量を定量化するための方法であって、前記ＴＤＢが、標的抗原結合断片及びＣＤ３結合断片を含み、前記方法が、
Ｔ細胞及び標的細胞の集団を、前記組成物の１つ以上の濃度で、前記組成物と接触させることであって、前記Ｔ細胞が、Ｔ細胞活性化に応答する応答要素に作動可能に連結したレポーターをコードする核酸を含み、前記標的細胞が、前記標的抗原を発現する、前記接触させることと、
前記レポーターの発現を、前記Ｔ細胞及び標的細胞の集団を異なる濃度の精製したＴＤＢと接触させることにより生じる標準曲線と抗体濃度の関数として相関させることと、を含む、前記方法。

【請求項18】

前記レポーターが、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ、またはベータガラクトシダーゼである、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記ルシフェラーゼが、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、またはナノシフェラーゼである、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記Ｔ細胞活性化に応答する応答要素が、ＮＦＡＴプロモーター、ＡＰ－１プロモーター、ＮＦκＢプロモーター、ＦＯＸＯプロモーター、ＳＴＡＴ３プロモーター、ＳＴＡＴ５プロモーター、またはＩＲＦプロモーターである、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記Ｔ細胞活性化に応答する応答要素が、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１、ＮＦκＢ、ＦＯＸＯ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、及びＩＲＦのうちの任意の１つ以上からのＴ細胞活性化応答要素を含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記Ｔ細胞の集団が、ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ８^＋Ｔ細胞の集団である、請求項１７～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記Ｔ細胞の集団が、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞またはＣＴＬＬ－２ Ｔ細胞の集団である、請求項１７～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記標的抗原が、前記標的細胞の表面上に発現される、請求項１７～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記標的抗原が、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９α（ＣＤ７９ａ）、ＣＤ７９β（ＣＤ７９ｂ）、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体、ＨＥＲ４受容体、ＦｃＲＨ５、ＣＬＬ１、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、αｖ／β３インテグリン、ＶＥＧＦ、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ－４；プロテインＣ、ＢＲ３、ｃ－ｍｅｔ、組織因子、β７、Ｔｅｎｂ２、ＳＴＥＡＰ、または膜貫通腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である、請求項１７～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

ａ）前記標的抗原がＨＥＲ２受容体であり、前記標的細胞がＢＴ－４７４細胞であるか、
ｂ）前記標的抗原がＨＥＲ２受容体であり、前記標的細胞がＳＫＢＲ３細胞であるか、
ｃ）前記標的抗原がＣＤ２０であり、前記標的細胞がＷｉｌ２－Ｓ細胞であるか、または
ｄ）前記標的抗原がＣＤ７９ｂであり、前記標的細胞がＢＪＡＢ細胞である、請求項１７～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記細胞集団におけるＴ細胞対標的細胞の比が、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、または約１：１０である、請求項１７～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記細胞集団におけるＴ細胞対標的細胞の比が、約１：４である、請求項１７～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記細胞集団が、約１×１０^３～約１×１０^６の範囲である、請求項１７～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記細胞集団が、約１×１０^４～約５×１０^４である、請求項１７～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

Ｔ細胞の集団を、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で前記ＴＤＢを含む組成物と接触させる、請求項１７～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記標準曲線が、前記Ｔ細胞を、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬの範囲である異なる濃度の精製した抗ＣＤ３抗体と接触させることにより生じる、請求項１７～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記レポーターが、前記細胞を前記組成物と接触させた１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１６、２０、または２４時間後のうちの任意の１つ以上に検出される、請求項１７～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

ＴＤＢの特異性を決定するための方法であって、前記ＴＤＢが、標的抗原結合断片及びＣＤ３結合断片を含み、前記方法が、
ａ）Ｔ細胞及び試験細胞の集団を、前記ＴＤＢと接触させることであって、前記Ｔ細胞が、Ｔ細胞活性化に応答する応答要素に作動可能に連結したレポーターをコードする核酸を含み、前記試験細胞が、前記標的抗原を発現しない、前記接触させることと、
ｂ）Ｔ細胞及び試験細胞の集団を、前記ＴＤＢと接触させることであって、前記Ｔ細胞が、Ｔ細胞活性化に応答する応答要素に作動可能に連結したレポーターをコードする核酸を含み、前記試験細胞が、前記標的抗原を発現しない、前記接触させることと、
パートａ）中の前記試験細胞の存在下の前記レポーターの発現を、パートｂ）中の標的細胞の存在下の前記レポーターの発現と比較することと、を含み、前記試験細胞対前記標的細胞の前記レポーターの発現の比が、前記ＴＤＢの前記特異性を示す、前記方法。

【請求項35】

前記レポーターが、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ、またはベータガラクトシダーゼである、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記ルシフェラーゼが、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、またはナノシフェラーゼである、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記Ｔ細胞活性化に応答する応答要素が、ＮＦＡＴプロモーター、ＡＰ－１プロモーター、ＮＦκＢプロモーター、ＦＯＸＯプロモーター、ＳＴＡＴ３プロモーター、ＳＴＡＴ５プロモーター、またはＩＲＦプロモーターである、請求項３４に記載の方法。

【請求項38】

前記Ｔ細胞活性化に応答する応答要素が、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１、ＮＦκＢ、ＦＯＸＯ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、及びＩＲＦのうちの任意の１つ以上からのＴ細胞活性化応答要素を含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記Ｔ細胞の集団が、ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ８^＋Ｔ細胞の集団である、請求項３４～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記Ｔ細胞の集団が、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞またはＣＴＬＬ－２ Ｔ細胞の集団である、請求項３４～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記標的抗原が、前記標的細胞の表面上に発現される、請求項３４～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記標的抗原が、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９α（ＣＤ７９ａ）、ＣＤ７９β（ＣＤ７９ｂ）、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体、ＨＥＲ４受容体、ＦｃＲＨ５、ＣＬＬ１、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、αｖ／β３インテグリン、ＶＥＧＦ、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ－４；プロテインＣ、ＢＲ３、ｃ－ｍｅｔ、組織因子、β７、Ｔｅｎｂ２、ＳＴＥＡＰ、または膜貫通腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である、請求項３４～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

ａ）前記標的抗原がＨＥＲ２受容体であり、前記標的細胞がＢＴ－４７４細胞であるか、
ｂ）前記標的抗原がＨＥＲ２受容体であり、前記標的細胞がＳＫＢＲ３細胞であるか、
ｃ）前記標的抗原がＣＤ２０であり、前記標的細胞がＷｉｌ２－Ｓ細胞であるか、または
ｄ）前記標的抗原がＣＤ７９ｂであり、前記標的細胞がＢＪＡＢ細胞である、請求項３４～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

ステップａ）の前記細胞集団におけるＴ細胞対試験細胞の比、及び／またはステップｂ）の前記細胞集団におけるＴ細胞対標的細胞の比が、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、または約１：１０である、請求項３４～４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

ステップａ）の前記細胞集団におけるＴ細胞対試験細胞の比、及び／またはステップｂ）の前記細胞集団におけるＴ細胞対標的細胞の比が、約１：４である、請求項３４～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

ステップａ）及び／またはｂ）の前記細胞集団が、約１×１０^３～約１×１０^６の範囲である、請求項３４～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

ステップａ）及び／またはｂ）の前記細胞集団が、約１×１０^４～約５×１０^４の範囲である、請求項３４～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

ステップａ）のＴ細胞及び試験細胞の集団ならびにステップｂ）のＴ細胞及び標的細胞の集団を、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で前記ＴＤＢを含む組成物と接触させる、請求項３４～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記レポーターが、前記細胞を前記組成物と接触させた１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１６、２０、または２４時間後のうちの任意の１つ以上に検出される、請求項３４～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

二重特異性抗体を含む組成物中のＴＤＢの検出のためのキットであって、前記二重特異性抗体が、標的抗原結合断片及びＣＤ３結合断片を含み、Ｔ細胞活性化に応答する応答要素に作動可能に連結したレポーターを含む操作されたＴ細胞を含む、前記キット。

【請求項51】

ＴＤＢアッセイ標準物及び／またはＴＤＢ対照をさらに含む、請求項５０に記載のキット。

【請求項52】

前記標的抗原を発現する標的細胞をさらに含む、請求項５０または５１に記載のキット。

【請求項53】

前記レポーターが、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ、またはベータガラクトシダーゼである、請求項５０～５２のいずれか一項に記載のキット。

【請求項54】

前記ルシフェラーゼが、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、またはナノシフェラーゼである、請求項５３に記載のキット。

【請求項55】

前記Ｔ細胞活性化に応答する応答要素が、ＮＦＡＴプロモーター、ＡＰ－１プロモーター、ＮＦκＢプロモーター、ＦＯＸＯプロモーター、ＳＴＡＴ３プロモーター、ＳＴＡＴ５プロモーター、またはＩＲＦプロモーターである、請求項５０～５４のいずれか一項に記載のキット。

【請求項56】

前記Ｔ細胞活性化に応答する応答要素が、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１、ＮＦκＢ、ＦＯＸＯ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、またはＩＲＦのうちの任意の１つ以上からのＴ細胞活性化応答要素を含む、請求項５５に記載のキット。

【請求項57】

前記Ｔ細胞の集団が、ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ８^＋Ｔ細胞の集団である、請求項５０～５６のいずれか一項に記載のキット。

【請求項58】

前記Ｔ細胞の集団が、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞またはＣＴＬＬ－２ Ｔ細胞の集団である、請求項５０～５７のいずれか一項に記載のキット。

【請求項59】

前記標的抗原が、標的細胞の表面上に発現される、請求項５０～５８のいずれか一項に記載のキット。

【請求項60】

前記標的抗原が、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９α（ＣＤ７９ａ）、ＣＤ７９β（ＣＤ７９ｂ）、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体、ＨＥＲ４受容体、ＦｃＲＨ５、ＣＬＬ１、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、αｖ／β３インテグリン、ＶＥＧＦ、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ－４；プロテインＣ、ＢＲ３、ｃ－ｍｅｔ、組織因子、β７、Ｔｅｎｂ２、ＳＴＥＡＰ、または膜貫通腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である、請求項５０～５９のいずれか一項に記載のキット。

【請求項61】

ａ）前記標的抗原がＨＥＲ２受容体であり、前記標的細胞がＢＴ－４７４細胞であるか、
ｂ）前記標的抗原がＨＥＲ２受容体であり、前記標的細胞がＳＫＢＲ３細胞であるか、
ｃ）前記標的抗原がＣＤ２０であり、前記標的細胞がＷｉｌ２－Ｓ細胞であるか、または
ｄ）前記標的抗原がＣＤ７９ｂであり、前記標的細胞がＢＪＡＢ細胞である、請求項５２～６０のいずれか一項に記載のキット。

【請求項62】

請求項１～４９のいずれか一項に記載の方法で用いるためのキット。

【請求項63】

試験細胞の集団が標的抗原を発現するかどうかを決定するための方法であって、
ａ）前記試験細胞の集団をＴ細胞の集団と接触させることであって、前記Ｔ細胞が、Ｔ細胞活性化に応答する応答要素に作動可能に連結したレポーターをコードする核酸を含む、前記接触させることと、
ｂ）Ｔ細胞及び試験細胞の集団を前記ＴＤＢと接触させることであって、前記ＴＤＢが、標的抗原結合断片及びＣＤ３結合断片を含む、前記接触させることと、を含み、
前記レポーターの発現が、前記試験細胞によって発現される前記標的抗原の存在を示す、前記方法。

【請求項64】

前記レポーターが、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ、またはベータガラクトシダーゼである、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記ルシフェラーゼが、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、またはナノシフェラーゼである、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

前記Ｔ細胞活性化に応答する応答要素が、ＮＦＡＴプロモーター、ＡＰ－１プロモーター、ＮＦκＢプロモーター、ＦＯＸＯプロモーター、ＳＴＡＴ３プロモーター、ＳＴＡＴ５プロモーター、またはＩＲＦプロモーターである、請求項６５に記載の方法。

【請求項67】

前記Ｔ細胞活性化に応答する応答要素が、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１、ＮＦκＢ、ＦＯＸＯ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、及びＩＲＦのうちの任意の１つ以上からのＴ細胞活性化応答要素を含む、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

前記Ｔ細胞の集団が、ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ８^＋Ｔ細胞の集団である、請求項６３～６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項69】

前記Ｔ細胞の集団が、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞またはＣＴＬＬ－２ Ｔ細胞の集団である、請求項６３～６８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項70】

前記標的抗原が、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９α（ＣＤ７９ａ）、ＣＤ７９β（ＣＤ７９ｂ）、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体、ＨＥＲ４受容体、ＦｃＲＨ５、ＣＬＬ１、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、αｖ／β３インテグリン、ＶＥＧＦ、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ－４；プロテインＣ、ＢＲ３、ｃ－ｍｅｔ、組織因子、β７、Ｔｅｎｂ２、ＳＴＥＡＰ、または膜貫通腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である、請求項６３～６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

前記試験細胞が、腫瘍細胞、免疫細胞、または血管細胞である、請求項６３～７０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項72】

前記試験細胞が、Ｔ細胞を含まない、請求項６３～７１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項73】

Ｔ細胞対試験細胞の比が、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、または約１：１０である、請求項６３～７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項74】

Ｔ細胞対試験細胞の比が、約１：４である、請求項６３～７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項75】

試験細胞及びＴ細胞の集団が、約１×１０^３～約１×１０^６の範囲である、請求項６３～７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項76】

試験細胞及びＴ細胞の集団が、約１×１０^４～約５×１０^４である、請求項６３～７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項77】

試験細胞及びＴ細胞の集団が、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度でＴＤＢと接触される、請求項６３～７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項78】

前記レポーターが、前記細胞を前記組成物と接触させた１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１６、２０、または２４時間後のうちの任意の１つ以上に検出される、請求項６３～７７のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１月２５日に出願された特許仮出願第６２／２８６，８６２号の利益を主張するものであり、その内容物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：コンピュータ可読形態（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１４６３９２０３６２４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０１７年１月２０日、サイズ：１７ＫＢ）。

【0003】

本発明は、ＣＤ３サブユニット等のＴ細胞受容体複合体サブユニットに結合する抗原結合断片、及び標的抗原に結合する抗原結合断片を有する多特異性抗体の調製物を分析するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、組成物中のＴＤＢを検出する、組成物中のＴＤＢの量を定量化する、ＴＤＢの効力及び／または特異性を決定する、または細胞集団が標的抗原を発現するかどうかを決定するための方法を提供する。組成物及びキットもまた、企図される。

【背景技術】

【0004】

Ｔ細胞依存性二重特異性抗体（ＴＤＢ）は、標的細胞上に発現する標的抗原、及びＴ細胞上に発現するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体サブユニット（例えば、ＣＤ３ε等のＣＤ３サブユニット）に結合するように設計された二重特異的抗体である。標的抗原及びＴＣＲ複合体サブユニット（ＴＣＳ）の両方の細胞外ドメインへの二重特異性抗体の結合は、標的細胞に対するＴ細胞の動員をもたらし、Ｔ細胞活性化及び標的細胞枯渇をもたらす。標的抗原特異的及びＴＣＳ特異的（例えば、ＣＤ３特異的）抗原結合断片のある特定の組み合わせは、標的細胞の存在下でＴ細胞を特異的に活性化するためのものよりもさらに有効である。ＴＤＢの弱い活性化は、ほとんど治療的有用性を有しない。オフターゲット細胞の存在下でＴ細胞の非特異的活性化は、炎症性サイトカインの望ましくない放出をもたらし得る。したがって、安全かつ効果的な臨床薬物候補の開発を支援するために、様々なＴＤＢによって媒介されるＴ細胞活性化の程度及び特異性をアッセイすることが望ましい。

【0005】

最適なＴ細胞活性化アッセイは、正確、精密、かつ使いやすく、短い応答時間ならびに自動化及びハイスループットのスケーリングに対する適切性を有するべきである。いくつかの従来のバイオアッセイは、分泌型サイトカインに対しては、例えば、ＰＢＭＣ系の方法、ＦＡＣＳ系の方法、及びＥＬＩＳＡが利用可能である。残念ながら、これらのアッセイの多くは、極めて可変な結果をもたらし、及び／または時間を要す。本明細書に記載の新規のＴＤＢアッセイは、Ｔ細胞活性化を検出するために、標的細胞及びレポーターＴ細胞を用いた細胞系アプローチを使用し、ＴＤＢ抗原結合断片の両方のそれらの標的への同時結合を検出するためにＥＬＩＳＡ系架橋結合アッセイによって検証される。

【0006】

特許出願及び刊行物を含む、本明細書に引用される全ての参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。

【発明の概要】

【0007】

本発明は、Ｔ細胞依存性二重特異性抗体（ＴＤＢ）によって媒介されるＴ細胞活性化を検出するための方法であって、ＴＤＢは、標的抗原結合断片及びＴ細胞受容体複合体サブユニット（ＴＣＳ）結合断片を含む、方法、ならびにそれらの様々な使用を提供する。

【0008】

いくつかの実施形態では、組成物中のＴＤＢの検出方法が提供され、ＴＤＢは、標的抗原結合断片及びＴＣＳ結合断片（ＣＤ３結合断片等）を含み、本方法は、組成物を、ａ）Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーに作動可能に連結したレポーターをコードする核酸を含むＴ細胞、ならびにｂ）標的抗原を発現する標的細胞を含む、細胞集団と接触させることを含み、レポーターの発現は、組成物中のＴＤＢの存在を示す。いくつかの実施形態では、レポーターは、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ、またはベータガラクトシダーゼである。いくつかの実施形態では、ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、またはナノシフェラーゼである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーは、ＮＦＡＴプロモーター、ＡＰ－１プロモーター、ＮＦκＢプロモーター、ＦＯＸＯプロモーター、ＳＴＡＴ３プロモーター、ＳＴＡＴ５プロモーター、またはＩＲＦプロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーは、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１、ＮＦκＢ、ＦＯＸＯ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、及びＩＲＦのうちの任意の１つ以上からのＴ細胞活性化応答要素を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団におけるＴ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ８^＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞集団におけるＴ細胞は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞またはＣＴＬＬ－２ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＴＣＳ結合断片は、ＣＤ３結合断片である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合断片は、ＣＤ３ε結合断片である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、標的細胞の表面上に発現される。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９α（ＣＤ７９ａ）、ＣＤ７９β（ＣＤ７９ｂ）、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体、ＨＥＲ４受容体、ＦｃＲＨ５、ＣＬＬ１、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、αｖ／β３インテグリン、ＶＥＧＦ、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ－４；プロテインＣ、ＢＲ３、ｃ－ｍｅｔ、組織因子、β７、Ｔｅｎｂ２、ＳＴＥＡＰ、または膜貫通腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。いくつかの実施形態では、ａ）標的抗原はＨＥＲ２受容体であり、標的細胞はＢＴ－４７４細胞であるか、ｂ）標的抗原は、ＨＥＲ２受容体であり、標的細胞はＳＫＢＲ３細胞であるか、ｃ）標的抗原はＣＤ２０であり、標的細胞はＷｉｌ２－Ｓ細胞であるか、またはｄ）標的抗原はＣＤ７９ｂであり、標的細胞はＢＪＡＢ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞集団におけるＴ細胞対標的細胞の比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、または約１：１０である。いくつかの実施形態では、細胞集団におけるＴ細胞対標的細胞の比は、約１：４である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、約１×１０^３～約１×１０^６の範囲である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、約１×１０^４～約５×１０^４である。

【0009】

上述の組成物中のＴＤＢの検出方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、細胞集団を、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約４０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約３０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約２０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、または約５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬのうちのいずれかの濃度範囲でＴＤＢを含む組成物と接触させる。

【0010】

上述の組成物中のＴＤＢの検出方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、レポーターは、細胞を組成物と接触させたほぼ１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、または２４時間後のうちのいずれかよりも後に検出される。いくつかの実施形態では、レポーターは、細胞を組成物と接触させた約１時間～約２４時間、約１時間～約１２時間、約１時間～約８時間、約１時間～約６時間、約１時間～約４時間、約１時間～約２時間、約４時間～約２４時間、約４時間～約１２時間、約４時間～約８時間、約８時間～約２４時間、約８時間～約１２時間、約１６時間～約２４時間、約１６時間～約２０時間、または約２０時間～約２４時間後のうちのいずれかの間で検出される。

【0011】

いくつかの実施形態では、組成物中のＴＤＢの量の定量化方法が提供され、ＴＤＢは、標的抗原結合断片及びＴＣＳ結合断片（ＣＤ３結合断片等）を含み、本方法は、組成物を、ａ）Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーに作動可能に連結したレポーターをコードする核酸を含むＴ細胞、ならびにｂ）標的抗原を発現する標的細胞を含む細胞集団と接触させることと、レポーターの発現を、Ｔ細胞及び標的細胞の集団を異なる濃度の精製した参照ＴＤＢと接触させることにより生じる標準曲線と抗体濃度の関数として相関させることと、を含む。いくつかの実施形態では、レポーターは、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ、またはベータガラクトシダーゼである。いくつかの実施形態では、ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、またはナノシフェラーゼである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーは、ＮＦＡＴプロモーター、ＡＰ－１プロモーター、ＮＦκＢプロモーター、ＦＯＸＯプロモーター、ＳＴＡＴ３プロモーター、ＳＴＡＴ５プロモーター、またはＩＲＦプロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーは、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１、ＮＦκＢ、ＦＯＸＯ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、及びＩＲＦのうちの任意の１つ以上からのＴ細胞活性化応答要素を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団におけるＴ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ８^＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞集団におけるＴ細胞は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞またはＣＴＬＬ－２ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＴＣＳ結合断片は、ＣＤ３結合断片である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合断片は、ＣＤ３ε結合断片である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、標的細胞の表面上に発現される。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９α（ＣＤ７９ａ）、ＣＤ７９β（ＣＤ７９ｂ）、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体、ＨＥＲ４受容体、ＦｃＲＨ５、ＣＬＬ１、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、αｖ／β３インテグリン、ＶＥＧＦ、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ－４；プロテインＣ、ＢＲ３、ｃ－ｍｅｔ、組織因子、β７、Ｔｅｎｂ２、ＳＴＥＡＰ、または膜貫通腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。いくつかの実施形態では、ａ）標的抗原はＨＥＲ２受容体であり、標的細胞はＢＴ－４７４細胞であるか、ｂ）標的抗原は、ＨＥＲ２受容体であり、標的細胞はＳＫＢＲ３細胞であるか、ｃ）標的抗原はＣＤ２０であり、標的細胞はＷｉｌ２－Ｓ細胞であるか、またはｄ）標的抗原はＣＤ７９ｂであり、標的細胞はＢＪＡＢ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞集団におけるＴ細胞対標的細胞の比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、または約１：１０である。いくつかの実施形態では、細胞集団におけるＴ細胞対標的細胞の比は、約１：４である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、約１×１０^３～約１×１０^６の範囲である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、約１×１０^４～約５×１０^４である。

【0012】

上述の組成物中のＴＤＢの量の定量化方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、標準曲線は、細胞集団を、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬの範囲である複数の濃度の精製した参照ＴＤＢと接触させることにより生じる。いくつかの実施形態では、複数の濃度の精製した参照ＴＤＢは、約０．０１ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、７５０ｎｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、または５００μｇ／ｍＬのうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、複数の濃度の精製した参照ＴＤＢは、約３、４、５、６、７、８、９、１０倍、または１０倍を超える濃度である。

【0013】

上述の組成物中のＴＤＢの量の定量化方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、レポーターは、細胞を組成物と接触させた約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、または２４時間後のうちのいずれかよりも後に検出される。いくつかの実施形態では、レポーターは、細胞を組成物と接触させた約１時間～約２４時間、約１時間～約１２時間、約１時間～約８時間、約１時間～約６時間、約１時間～約４時間、約１時間～約２時間、約４時間～約２４時間、約４時間～約１２時間、約４時間～約８時間、約８時間～約２４時間、約８時間～約１２時間、約１６時間～約２４時間、約１６時間～約２０時間、または約２０時間～約２４時間後のうちのいずれかの間で検出される。

【0014】

いくつかの実施形態では、ＴＤＢによって媒介されるＴ細胞活性化の特異性の決定方法が提供され、ＴＤＢは、標的抗原結合断片及びＴＣＳ結合断片（ＣＤ３結合断片等）を含み、本方法は、ａ）ＴＤＢを含む組成物を、ｉ）Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーに作動可能に連結したレポーターをコードする核酸を含むＴ細胞、ならびにｉｉ）標的抗原を発現しない試験細胞を含む細胞集団と接触させることと、ｂ）ＴＤＢを含む組成物を、ｉ）Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーに作動可能に連結したレポーターをコードする核酸を含むＴ細胞、ならびにｉｉ）標的抗原を発現する標的細胞を含む細胞集団と接触させることと、パートａ）中の試験細胞の存在下のレポーターの発現を、パートｂ）中の標的細胞の存在下のレポーターの発現と比較することと、を含み、試験細胞のレポーターの発現と標的細胞のレポーターの発現との比率は、標的細胞に対するＴＤＢの特異性を示す。いくつかの実施形態では、レポーターは、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ、またはベータガラクトシダーゼである。いくつかの実施形態では、ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、またはナノシフェラーゼである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーは、ＮＦＡＴプロモーター、ＡＰ－１プロモーター、ＮＦκＢプロモーター、ＦＯＸＯプロモーター、ＳＴＡＴ３プロモーター、ＳＴＡＴ５プロモーター、またはＩＲＦプロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーは、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１、ＮＦκＢ、ＦＯＸＯ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、及びＩＲＦのうちの任意の１つ以上からのＴ細胞活性化応答要素を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団におけるＴ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ８^＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞集団におけるＴ細胞は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞またはＣＴＬＬ－２ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＴＣＳ結合断片は、ＣＤ３結合断片である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合断片は、ＣＤ３ε結合断片である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、標的細胞の表面上に発現される。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９α（ＣＤ７９ａ）、ＣＤ７９β（ＣＤ７９ｂ）、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体、ＨＥＲ４受容体、ＦｃＲＨ５、ＣＬＬ１、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、αｖ／β３インテグリン、ＶＥＧＦ、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ－４；プロテインＣ、ＢＲ３、ｃ－ｍｅｔ、組織因子、β７、Ｔｅｎｂ２、ＳＴＥＡＰ、または膜貫通腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。いくつかの実施形態では、ａ）標的抗原はＨＥＲ２受容体であり、標的細胞はＢＴ－４７４細胞であるか、ｂ）標的抗原は、ＨＥＲ２受容体であり、標的細胞はＳＫＢＲ３細胞であるか、ｃ）標的抗原はＣＤ２０であり、標的細胞はＷｉｌ２－Ｓ細胞であるか、またはｄ）標的抗原はＣＤ７９ｂであり、標的細胞はＢＪＡＢ細胞である。いくつかの実施形態では、ステップａ）の細胞集団におけるＴ細胞対試験細胞の比、及び／またはステップｂ）の細胞集団におけるＴ細胞対標的細胞の比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、または約１：１０である。いくつかの実施形態では、ステップａ）の細胞集団におけるＴ細胞対試験細胞の比、及び／またはステップｂ）の細胞集団におけるＴ細胞対標的細胞の比は、約１：４である。いくつかの実施形態では、ステップａ）及び／またはｂ）の細胞集団は、約１×１０^３～約１×１０^６の範囲である。いくつかの実施形態では、ステップａ）及び／またはｂ）の細胞集団は、約１×１０^４～約５×１０^４の範囲である。

【0015】

上述のＴＤＢによって媒介されるＴ細胞活性化の特異性の決定方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ステップａ）のＴ細胞及び試験細胞の集団ならびにステップｂ）のＴ細胞及び標的細胞の集団を、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約４０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約３０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約２０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、または約５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬのうちのいずれかの濃度範囲でＴＤＢを含む組成物と接触させる。

【0016】

上述のＴＤＢによって媒介されるＴ細胞活性化の特異性の決定方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、レポーターは、細胞を組成物と接触させた約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、または２４時間後のうちのいずれかよりも後に検出される。いくつかの実施形態では、レポーターは、細胞を組成物と接触させた約１時間～約２４時間、約１時間～約１２時間、約１時間～約８時間、約１時間～約６時間、約１時間～約４時間、約１時間～約２時間、約４時間～約２４時間、約４時間～約１２時間、約４時間～約８時間、約８時間～約２４時間、約８時間～約１２時間、約１６時間～約２４時間、約１６時間～約２０時間、または約２０時間～約２４時間後のうちのいずれかの間で検出される。

【0017】

いくつかの実施形態では、標的抗原結合断片及びＴＣＳ結合断片を含む二重特異性抗体を含む組成物中のＴＤＢの検出用のキットが提供され、本キットは、Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーに作動可能に連結したレポーターを含む操作されたＴ細胞を含む。いくつかの実施形態では、キットは、参照ＴＤＢアッセイ標準物（既知の濃度の精製したＴＤＢ）及び／またはＴＤＢ対照をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、標的抗原を発現する標的細胞を含む組成物をさらに含む。いくつかの実施形態では、レポーターは、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ、またはベータガラクトシダーゼである。いくつかの実施形態では、ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、またはナノシフェラーゼである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーは、ＮＦＡＴプロモーター、ＡＰ－１プロモーター、ＮＦκＢプロモーター、ＦＯＸＯプロモーター、ＳＴＡＴ３プロモーター、ＳＴＡＴ５プロモーター、またはＩＲＦプロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーは、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１、ＮＦκＢ、ＦＯＸＯ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、及びＩＲＦのうちの任意の１つ以上からのＴ細胞活性化応答要素を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ８^＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞またはＣＴＬＬ－２ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＴＣＳ結合断片は、ＣＤ３結合断片である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合断片は、ＣＤ３ε結合断片である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、標的細胞の表面上に発現される。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９α（ＣＤ７９ａ）、ＣＤ７９β（ＣＤ７９ｂ）、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体、ＨＥＲ４受容体、ＦｃＲＨ５、ＣＬＬ１、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、αｖ／β３インテグリン、ＶＥＧＦ、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ－４；プロテインＣ、ＢＲ３、ｃ－ｍｅｔ、組織因子、β７、Ｔｅｎｂ２、ＳＴＥＡＰ、または膜貫通腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。いくつかの実施形態では、ａ）標的抗原はＨＥＲ２受容体であり、標的細胞はＢＴ－４７４細胞であるか、ｂ）標的抗原は、ＨＥＲ２受容体であり、標的細胞はＳＫＢＲ３細胞であるか、ｃ）標的抗原はＣＤ２０であり、標的細胞はＷｉｌ２－Ｓ細胞であるか、またはｄ）標的抗原はＣＤ７９ｂであり、標的細胞はＢＪＡＢ細胞である。いくつかの実施形態では、キットは、上述の方法のうちのいずれかにおいて使用される。

【0018】

いくつかの実施形態では、試験細胞の集団が標的抗原を発現するかどうかを決定する方法が提供され、本方法は、ａ）試験細胞の集団を、Ｔ細胞の集団と接触させることであって、Ｔ細胞がＴ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーに作動可能に連結したレポーターをコードする核酸を含む、接触させることと、ｂ）Ｔ細胞及び試験細胞の集団を、ＴＤＢと接触させることであって、ＴＤＢは、標的抗原結合断片及びＴＣＳ結合断片（ＣＤ３結合断片等）を含む、接触させることと、を含み、レポーターの発現は、試験細胞によって発現される標的抗原の存在を示す。いくつかの実施形態では、レポーターは、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ、またはベータガラクトシダーゼである。いくつかの実施形態では、ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、またはナノシフェラーゼである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーは、ＮＦＡＴプロモーター、ＡＰ－１プロモーター、ＮＦκＢプロモーター、ＦＯＸＯプロモーター、ＳＴＡＴ３プロモーター、ＳＴＡＴ５プロモーター、またはＩＲＦプロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーは、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１、ＮＦκＢ、ＦＯＸＯ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、及びＩＲＦのうちの任意の１つ以上からのＴ細胞活性化応答要素を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の集団は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ８^＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の集団は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞またはＣＴＬＬ－２ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＴＣＳ結合断片は、ＣＤ３結合断片である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合断片は、ＣＤ３ε結合断片である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、標的細胞の表面上に発現される。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９α（ＣＤ７９ａ）、ＣＤ７９β（ＣＤ７９ｂ）、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体、ＨＥＲ４受容体、ＦｃＲＨ５、ＣＬＬ１、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、αｖ／β３インテグリン、ＶＥＧＦ、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ－４；プロテインＣ、ＢＲ３、ｃ－ｍｅｔ、組織因子、β７、Ｔｅｎｂ２、ＳＴＥＡＰ、または膜貫通腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。いくつかの実施形態では、試験細胞の集団は、腫瘍細胞、免疫細胞、または血管細胞の集団である。いくつかの実施形態では、試験細胞の集団は、Ｔ細胞を含まない。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞対試験細胞の比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、または約１：１０である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞対試験細胞の比は、約１：４である。いくつかの実施形態では、試験細胞及びＴ細胞の集団は、約１×１０^３～約１×１０^６個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、試験細胞及びＴ細胞の集団は、約１×１０^４～約５×１０^４個の細胞を含む。

【0019】

試験細胞の集団が上述の標的抗原を発現するかどうかを決定する方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、試験細胞及びＴ細胞の集団を、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約４０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約３０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約２０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、または約５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬのうちのいずれかの濃度範囲でＴＤＢを含む組成物と接触させる。

【0020】

試験細胞の集団が上述の標的抗原を発現するかどうかを決定する方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、レポーターは、細胞を組成物に接触させた約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、または２４時間後のうちのいずれかよりも後に検出される。いくつかの実施形態では、レポーターは、細胞を組成物と接触させた約１時間～約２４時間、約１時間～約１２時間、約１時間～約８時間、約１時間～約６時間、約１時間～約４時間、約１時間～約２時間、約４時間～約２４時間、約４時間～約１２時間、約４時間～約８時間、約８時間～約２４時間、約８時間～約１２時間、約１６時間～約２４時間、約１６時間～約２０時間、または約２０時間～約２４時間後のうちのいずれかの間で検出される。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】標的抗原に対して結合特異性を有する第１のアームと、ＣＤ３サブユニットに対して特異性を有する第２のアームとを有する、例示的なＴ細胞依存性二重特異性抗体（ＴＤＢ）の概略図を示す。

【図2】例示的なＴＤＢによって媒介されるレポーターＴ細胞活性化の概略図を示す。レポーターＴ細胞は、ＮＦκＢ応答要素によって動かされるホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有し、ＴＤＢによってレポーターＴ細胞と標的腫瘍細胞とを架橋することによって媒介されるＴ細胞活性化後に発現される。

【図3A】図３Ａは、抗ＣＤ３ホモ二量体によるＴ細胞活性化が、レポーター遺伝子アッセイを用いてモニタリングされ得ることを示す。ヒトＪｕｒｋａｔ ＣＤ４^＋Ｔ細胞株は、様々なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に応答する転写応答要素（ＡＰ－１、ＮＦＡＴ、及びＮＦκＢ）によって駆動されるホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定的に発現するように遺伝子操作され、安定した細胞プールが選択され、プールが、１０μｇ／ｍＬの精製した抗ＣＤ３ホモ二量体による４時間の処理への応答に対して評価された。発光応答（ルシフェラーゼレポーター遺伝子活性）がプロット化され、最高応答が、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦκＢルシフェラーゼの安定したプールから観察された。

【図3B】図３Ｂは、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦκＢルシフェラーゼの安定したクローンを示す。

【図4A】図４Ａと図４Ｂは、精製した抗ＣＤ３ホモ二量体が、標的細胞の存在または不在下でＴ細胞を活性化し得ることを示す。図４Ａは、Ｔ細胞を活性化する可能性がある精製したＣＤ２０ ＴＤＢ及び精製した抗ＣＤ３ホモ二量体の比較を示す。ＮＦκＢルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、標的抗原を発現する細胞の存在下でＣＤ２０ ＴＤＢによって用量依存的に活性化される。ＣＤ２０ ＴＤＢは、標的抗原を発現する細胞株の存在下でＪｕｒｋａｔ／ＮＦκＢホタルルシフェラーゼ細胞を活性化する。精製したＣＤ２０ ＴＤＢは、共刺激標的抗原を発現する細胞の存在下で、精製した抗ＣＤ３ホモ二量体よりも１０００倍以上活性である。

【図4B】図４Ａと図４Ｂは、精製した抗ＣＤ３ホモ二量体が、標的細胞の存在または不在下でＴ細胞を活性化し得ることを示す。図４Ｂは、標的抗原を発現する細胞（四角）の不在下で、ＣＤ２０ ＴＤＢがＪｕｒｋａｔ／ＮＦκＢルシフェラーゼ細胞を活性化しないが、精製した抗ＣＤ３ホモ二量体がＮＦκＢ依存性ルシフェラーゼ活性（ひし形）を用量依存的に誘導することを示す。

【図5】適切な標的細胞（それぞれ、Ｗｉｌ２－Ｓ、ＢＴ－４７４、及びＢＪＡＢ細胞）の存在下で、αＣＤ２０／ＣＤ３、αＨＥＲ２／ＣＤ３、及びαＣＤ７９ｂ／ＣＤ３ ＴＤＢによるＴ細胞活性化が、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦκＢホタルルシフェラーゼ細胞を用いたレポーター遺伝子アッセイを用いてモニタリングされ得ることを示す。発光応答（ルシフェラーゼレポーター遺伝子活性）が、ＴＤＢ濃度の関数としてプロット化された。

【図6A】図６Ａと図６Ｂは、Ｔ細胞活性化のマーカーＣＤ６９及びＣＤ２５が、αＣＤ２０／αＣＤ３ ＴＤＢによるインキュベーションに応答して用量依存性様式において増加したことを示す。図６Ａは、様々な濃度で、例示的なαＣＤ２０／αＣＤ３ ＴＤＢ、ＢＣＴＣ４４６５ＡによってＴ細胞活性化のフローサイトメトリー分子を示す。

【図6B】図６Ａと図６Ｂは、Ｔ細胞活性化のマーカーＣＤ６９及びＣＤ２５が、αＣＤ２０／αＣＤ３ ＴＤＢによるインキュベーションに応答して用量依存性様式において増加したことを示す。図６Ｂは、フローサイトメトリーの結果の定量化を示す。

【図7】ＣＤ６９及びＣＤ２５の陽性表面発現に対してＪｕｒｋａｔ／ＮＦκＢホタルルシフェラーゼ系レポーターアッセイまたはフローサイトメトリーのいずれかを用いて測定された、αＣＤ２０／αＣＤ３ ＴＤＢ ＢＣＴＣ４４６５ＡによるＴ細胞活性化に対する用量反応曲線の比較を示す。

【図8】ＨＥＲ２エピトープに特異的なＴＤＢの第１のアームと、ＣＤ３εエピトープに特異的なＴＤＢの第２のアームとを有する、ＥＬＩＳＡ系架橋結合アッセイにおける例示的なＴＤＢの概略図を示す。ＨＥＲ２エピトープを含有するＨＥＲ２タンパク質の細胞外断片は、プレートの表面上にコーティングされ、抗ＨＥＲ２／ＣＤ３ε ＴＤＢによってＣＤ３εエピトープを含有するビオチン標識されたＣＤ３εペプチドで架橋され、結合は、ストレプトアビジン共役ＨＲＰによって検出される。

【図9】Ｔ細胞活性化に対する効力が、ＢＴ－４７４標的細胞の存在下で、異なるＣＤ３結合親和性を有する２つのαＨＥＲ２／ＣＤ３ ＴＤＢ（αＨＥＲ２／ＣＤ３ Ｖｘ及びαＨＥＲ２／ＣＤ３ ＷＴ）の間で異なり、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦκＢホタルルシフェラーゼ細胞系レポーターアッセイを用いてモニタリングされたことを示す。発光応答（ルシフェラーゼレポーター遺伝子活性）が、ＴＤＢ濃度の関数としてプロット化された。

【図10A】図１０Ａと図１０Ｂは、Ｔ細胞活性化に対する効力が、応力なし、４０℃で２週間、４０℃で４週間を含む、異なる熱応力条件に供されたαＨＥＲ２／ＣＤ３ ＴＤＢサンプルの間で異なり、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦκＢホタルルシフェラーゼ細胞系レポーターアッセイ及びＥＬＩＳＡ系架橋結合アッセイを用いてモニタリングされたことを示す。図１０Ａは、相対的な効力が各アッセイを用いて計算され、試験した各条件についてプロット化したことを示す。

【図10B】図１０Ａと図１０Ｂは、Ｔ細胞活性化に対する効力が、応力なし、４０℃で２週間、４０℃で４週間を含む、異なる熱応力条件に供されたαＨＥＲ２／ＣＤ３ ＴＤＢサンプルの間で異なり、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦκＢホタルルシフェラーゼ細胞系レポーターアッセイ及びＥＬＩＳＡ系架橋結合アッセイを用いてモニタリングされたことを示す。図１０Ｂは、各アッセイを用いて計算された相対的効力間の線状相関を示す。

【図11】ＦｃＲＨ５を発現するＥＪＭ標的細胞の存在下でαＦｃＲＨ５／ＣＤ３ ＴＤＢのＴ細胞活性化に対する効力が、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦκＢホタルルシフェラーゼ細胞系レポーターアッセイを用いてモニタリングされたことを示す。発光応答（ルシフェラーゼレポーター遺伝子活性）が、ＴＤＢ濃度の関数としてプロット化された。

【図12】ＥＬＩＳＡ系架橋アッセイを用いてαＦｃＲＨ５／ＣＤ３ ＴＤＢのＴ細胞活性化に対する効力を示す。

【発明を実施するための形態】

【0022】

本発明は、Ｔ細胞依存性二重特異性抗体（ＴＤＢ）によって媒介されるＴ細胞活性化を検出するための方法、及び／またはＴＤＢの効力を決定するための方法であって、ＴＤＢは、標的抗原に結合する抗原結合断片、及びＣＤ３サブユニット（例えばＴ細胞上に発現されたＣＤ３ε）等のＴ細胞受容体複合体サブユニット（ＴＣＳ）に結合する抗原結合断片を含む、方法、ならびにこれらの様々な使用を提供し、とりわけ、組成物中のＴＤＢを検出することと、組成物中のＴＤＢの量を定量化することと、ＴＤＢの特異性を決定することと、細胞集団が標的抗原を発現するかどうかを決定することと、を含む。

【0023】

他の態様では、本発明は、ＴＤＢによって媒介されるＴ細胞活性化を検出するためのキット、及び／またはＴＤＢの効力を決定するためのキットを提供し、本キットは、Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーに作動可能に連結したレポーターを含む操作されたＴ細胞を含み、任意に、ＴＤＢ、参照ＴＤＢ、対照ＴＤＢ、及び／または標的細胞を含む。

【0024】

Ｉ．定義
「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書で同義に使用される。ポリマーは、直鎖状であっても分岐状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。これらの用語はまた、天然にまたは介入によって、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾、例えば、標識成分もしくは毒素とのコンジュゲーション等によって修飾されているアミノ酸ポリマーを包含する。例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸等を含む）の１つ以上の類似体を含有するポリペプチド、及び当該技術分野で既知の他の修飾もこの定義に含まれる。本明細書で使用される「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、抗体を具体的に包含する。

【0025】

「精製された」ポリペプチド（例えば、抗体またはイムノアドヘシン）とは、ポリペプチドがその天然環境下で存在するよりもさらに純粋な形態で存在するように、及び／または実験室条件下で最初に合成及び／または増幅されたときにポリペプチドの純度が増加することを意味する。純度は、相対用語であり、必ずしも絶対純度を意味しない。

【0026】

「アンタゴニスト」という用語は、最も広義に使用され、天然ポリペプチドの生物学的活性を部分的または完全に遮断、阻害、または中和する任意の分子を含む。同様の様式で、「アゴニスト」という用語は、最も広義に使用され、天然ポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を含む。好適なアゴニストまたはアンタゴニストの分子としては、具体的には、アゴニストまたはアンタゴニストの抗体または抗体断片、天然ポリペプチドの断片またはアミノ酸配列変異形等が挙げられる。ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの特定方法は、ポリペプチドを候補アゴニストまたはアンタゴニスト分子と接触させることと、ポリペプチドに通常関連する１つ以上の生物学的活性の検出可能な変化を測定することとを含み得る。

【0027】

対象となる抗原、例えば、腫瘍関連ポリペプチド抗原標的「と結合する」ポリペプチドは、ポリペプチドが、抗原を発現する細胞または組織を標的とするのに診断及び／または治療剤として有用であり、他のポリペプチドと有意には交差反応しないように十分な親和性でその抗原と結合するものである。このような実施形態では、ポリペプチドの「非標的」ポリペプチドへの結合の程度は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析または放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）によって決定されるように、ポリペプチドのその特定の標的ポリペプチドへの結合の約１０％未満である。

【0028】

標的分子へのポリペプチドの結合に関して、特定のポリペプチド標的上の特定のポリペプチドまたはエピトープの「特異的結合」、またはそれに「特異的に結合する」、またはそれに「特異的な」という用語は、非特異的相互作用とは測定可能な程度に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に結合活性を有しない同様の構造の分子である対照分子の結合と比較して、分子の結合を決定することによって測定され得る。例えば、特異的結合は、標的、例えば、過剰な非標識標的に類似である対照分子との競合によって決定され得る。この場合、プローブへの標識した標的の結合が過剰な非標識標的によって競合的に阻害された場合に、特異的結合が示される。

【0029】

本明細書における「抗体」という用語は、最も広義に使用され、具体的にはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷抗体から形成された多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及びそれらが所望の生物学的活性を呈する場合に限りにおける抗体断片を包含する。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書で抗体と同義に使用される。

【0030】

抗体は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子であり、それらの構造は全て免疫グロブリン折り畳みに基づく。例えば、ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合して機能的抗体を形成する２つの「重」鎖及び２つの「軽」鎖を有する。各重鎖及び軽鎖はそれ自体、「定常」（Ｃ）領域及び「可変」（Ｖ）領域を含む。Ｖ領域が抗体の抗原結合特異性を決定する一方で、Ｃ領域は、構造的支持を提供し、免疫エフェクターとの非抗原特異的相互作用において機能する。抗体または抗体の抗原結合断片の抗原結合特異性は、特定の抗原に特異的に結合する抗体の能力である。

【0031】

抗体の抗原結合特異性は、Ｖ領域の構造的特徴によって決定される。可変性は、可変ドメインの１１０アミノ酸長にわたって均等に分布していない。代わりに、Ｖ領域は、各々９～１２アミノ酸長である「超可変領域」（ＨＶＲ）と呼ばれる極度の可変性のより短い領域によって分離した１５～３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる相対的に不変の伸長部からなる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、主にβシート構成を採用し、３つの超可変領域により連結され、βシート構造に連結し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する４つのＦＲを含む。各鎖における超可変領域は、ＦＲによって、他方の鎖の超可変領域と近接して保持されており、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．,Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ,５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ,Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ,Ｂｅｔｈｅｓｄａ,Ｍｄ．（１９９１）を参照のこと）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与していないが、抗体の抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）への関与等の様々なエフェクター機能を呈する。

【0032】

各Ｖ領域は、典型的には、３つのＨＶＲ、例えば、相補性決定領域（各々が「超可変ループ」を含有する「ＣＤＲ」）、及び４つのフレームワーク領域を含む。したがって、特定の所望の抗原に対して実質的な親和性で結合するために必要とされる最小の構造単位である抗体結合部位は、典型的には、３つのＣＤＲと、適切な立体配座でのＣＤＲを保持し提示するためにそれらの間に散在する少なくとも３つ、好ましくは４つのフレームワーク領域とを含む。古典的な４つの鎖抗体は、Ｖ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメインが協働して定義される抗原結合部位を有する。ラクダ及びサメ抗体等のある特定の抗体は、軽鎖を欠き、重鎖のみによって形成される結合部位に依存する。単一ドメインの操作された免疫グロブリンは、Ｖ_ＨとＶ_Ｌとの間に協働がない場合、結合部位が重鎖または軽鎖のみによって形成されるように調製され得る。

【0033】

「可変」という用語は、可変ドメインのある特定の部分が抗体の中で大きく異なり、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均等には分布していない。これは、軽鎖及び重鎖の両方の可変ドメイン中の超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、主にβシート構成を採用し、３つの超可変領域により連結され、βシート構造に連結し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する４つのＦＲを含む。各鎖における超可変領域は、ＦＲによって、他方の鎖の超可変領域と近接して保持されており、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．,Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ,５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ,Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ,Ｂｅｔｈｅｓｄａ,Ｍｄ．（１９９１）を参照のこと）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与していないが、抗体の抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）への関与等の様々なエフェクター機能を呈する。

【0034】

「超可変領域」（ＨＶＲ）という用語は、本明細書で使用されるとき、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」（例えば、Ｖ_Ｌでは、ほぼ、残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、及び８９～９７（Ｌ３）、ならびにＶ_Ｈでは、ほぼ、３１～３５Ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、及び９５～１０２（Ｈ３）からのアミノ酸残基（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．,Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ,５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ,Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ,Ｂｅｔｈｅｓｄａ,Ｍｄ．（１９９１））、及び／または「超可変ル－プ」からのこれらの残基（例えば、Ｖ_Ｌでは、残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、及び９１～９６（Ｌ３）、ならびにＶ_Ｈでは、２６～３２（Ｈ１）、５２Ａ～５５（Ｈ２）、及び９６～１０１（Ｈ３）（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ.Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））を含み得る。

【0035】

「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書に定義されるような超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。

【0036】

本明細書で使用される、「Ｔ細胞依存性二重特異性」抗体または「ＴＤＢ」は、細胞上に発現する標的抗原に結合する、及び例えば、Ｔ細胞上に発現するＴ細胞受容体複合体サブユニット（例えば、ＣＤ３ε）への結合によってＴ細胞に結合するように設計された二重特異性抗体である。

【0037】

「抗体断片」は、無傷抗体の一部分を含み、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；タンデムダイアボディ（ｔａＤｂ）、線状抗体（例えば、米国特許第５，６４１，８７０号の実施例２；Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．,Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ.８（１０）：１０５７－１０６２（１９９５））；一アーム抗体、単一可変ドメイン抗体、ミニボディ、一本鎖抗体分子；抗体断片から形成される多重特異性抗体（例えば、Ｄｂ－Ｆｃ、ｔａＤｂ－Ｆｃ、ｔａＤｂ－ＣＨ３、（ｓｃＦＶ）４－Ｆｃ、ジ－ｓｃＦｖ、バイ－ｓｃＦｖ、またはタンデム（ジ、トリ）－ｓｃＦｖが挙げられるが、これらに限定されない）；及び二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥｓ）が挙げられる。

【0038】

抗体のパパイン消化は、各々、単一の抗原結合部位を持つ、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片、及び容易に結晶化する能力を反映する名称を持つ、残った「Ｆｃ」断片を産生する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有して、依然として抗原と交差結合することが可能であるＦ（ａｂ’）_２断片を生じる。

【0039】

「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、緊密な非共有結合性会合にある１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この構成において、各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用して、Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ二量体の表面上に抗原結合部位を画定する。集合的に、６つの超可変領域は、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一可変ドメイン（または抗原に特異的な超可変領域を３つのみ含むＦｖの半分）でさえも、抗原を認識してそれに結合する能力を有するが、全結合部位よりも親和性が低い。

【0040】

Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端への数個の残基の付加によって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、本明細書において、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が少なくとも１つの遊離チオール基を有するＦａｂ’の表記である。Ｆ（ａｂ’）_２抗体断片は、元来、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生された。抗体断片の他の化学的結合もまた知られている。

【0041】

任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明らかに異なる種類のうちの１つに割り当てられ得る。

【0042】

抗体は、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスに割り当てられ得る。無傷抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２にさらに分割され得る。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元構成は、周知である。

【0043】

「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。いくつかの実施形態では、Ｆｖポリペプチドは、Ｖ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これは、ｓｃＦｖが抗原結合に所望の構造を形成することを可能にする。ｓｃＦｖに関する概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ,ｖｏｌ.１１３,Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．,Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ,Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ,ｐｐ.２６９－３１５（１９９４）を参照のこと。

【0044】

「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小抗体断片を指し、これらの断片は、同じポリペプチド鎖内（Ｖ_Ｈ～Ｖ_Ｌ）で軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）に接続した重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間での対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を生成することができる。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号、ＷＯ ９３／１１１６１、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．,Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ,９０：６４４４－６４４８（１９９３）にさらに詳述されている。

【0045】

「多重特異性抗体」という用語は、最も広義に使用され、ポリエピトープ特異性を有する抗体を具体的に包含する。かかる多重特異性抗体としては、重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含む抗体（Ｖ_ＨＶ_Ｌ単位がポリエピトープ特異性を有する）、２つ以上のＶ_Ｌ及びＶ_Ｈドメインを有する抗体（各Ｖ_ＨＶ_Ｌ単位が異なるエピトープに結合する）、２つ以上の単一可変ドメインを有する抗体（各単一可変ドメインが異なるエピトープに結合する）、完全長抗体、抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、トリアボディ、三重機能性抗体、共有結合している抗体断片または共有結合していない抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。「ポリエピトープ特異性」とは、同じまたは異なる標的（複数可）上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。「単一特異性」とは、１つのエピトープにのみ結合する能力を指す。一実施形態によれば、多重特異性抗体は、５μＭ～０．００１ｐＭ、３μＭ～０．００１ｐＭ、１μＭ～０．００１ｐＭ、０．５μＭ～０．００１ｐＭ、または０．１μＭ～０．００１ｐＭの親和性で各エピトープに結合するＩｇＧ抗体である。

【0046】

「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）または「単一可変ドメイン（ＳＶＤ）抗体」という表現は、一般に、単一可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）が抗原結合を付与し得る抗体を指す。言い換えれば、単一可変ドメインは、標的抗原を認識するために別の可変ドメインと相互作用する必要はない。単一ドメイン抗体の例としては、ラクダ科動物（ラマ及びラクダ）ならびに軟骨魚類（例えば、テンジクザメ）由来の抗体、ならびにヒト及びマウス抗体からの組換え方法から得られる抗体が挙げられる（Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１：５４４－５４６、Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００６）３０：４３－５６、Ｔｒｅｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ（２００１）２６：２３０－２３５、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００３）：２１：４８４－４９０、ＷＯ２００５／０３５５７２、ＷＯ０３／０３５６９４、Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔ（１９９４）３３９：２８５－２９０、ＷＯ００／２９００４、ＷＯ０２／０５１８７０）。

【0047】

「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団を含む個々の抗体は、モノクローナル抗体の産生中に生じ得る想定される変異体を除いて、同一であり、及び／または同じエピトープに結合し、かかる変異体は、一般に、少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されない点でも有利である。「モノクローナル」という修飾語句は、実質的に同種の抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本明細書に提供される方法に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．,Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって記載されたハイブリドーマ法によって作製されても、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）によって作製されてもよい。モノクローナル抗体はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．,Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．,Ｊ.Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９１）に記載される技法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離され得る。

【0048】

本明細書におけるモノクローナル抗体には、具体的には、重鎖及び／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一または相同である一方で、鎖（複数可）の残りが、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体、ならびにそれらが所望される生物学的活性を呈する限りはそのような抗体の断片を含む（米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．,Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１－６８５５（１９８４））。本明細書において対象となるキメラ抗体としては、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、アカゲザル、またはカニクイザル等の旧世界ザル）に由来する可変ドメイン抗原結合配列と、ヒト定常領域配列とを含む、「霊長類化」抗体が挙げられる（米国特許第５，６９３，７８０号）。

【0049】

非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類等の非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基によって置き換えられる、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに改良するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、上述のＦＲ置換（複数可）を除いて、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、かつＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体はまた、任意に、免疫グロブリン定常領域、典型的には、ヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分を含む。さらなる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．,Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．,Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）、及びＰｒｅｓｔａ,Ｃｕｒｒ.Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－５９６（１９９２）を参照のこと。

【0050】

本明細書では、「無傷抗体」は、重及び軽可変ドメイン、ならびにＦｃ領域を含むものである。定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列の定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体であり得る。好ましくは、無傷抗体は、１つ以上のエフェクター機能を有する。

【0051】

「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖が１つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合している一方で、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖及び軽鎖はまた、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の端に可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を有し、続いて、いくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の端に可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を有し、その他方の端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間に界面を形成すると考えられている。

【0052】

「裸抗体」は、細胞毒性部分等の異種分子または放射標識に複合されない（本明細書に定義される）抗体である。

【0053】

いくつかの実施形態では、抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因する生物学的活性を指し、抗体アイソタイプによって異なる。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞毒性、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体の下方調節が挙げられる。

【0054】

「抗体依存性細胞媒介細胞毒性」及び「ＡＤＣＣ」とは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性反応を指す。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞がＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ.Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７－９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。対象となる分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載されるようなインビトロＡＤＣＣアッセイを行ってもよい。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、または加えて、対象となる分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．,Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ） ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルにおいて評価してもよい。

【0055】

「ヒトエフェクター細胞」は、１つ以上のＦｃＲを発現し、かつエフェクター機能を実行する白血球である。いくつかの実施形態では、これらの細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞毒性Ｔ細胞、及び好中球を含み、ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞が好ましい。

【0056】

「補体依存性細胞毒性」または「ＣＤＣ」とは、補体の存在下で標的を溶解させる分子の能力を指す。補体活性化経路は、補体系（Ｃ１ｑ）の第１の成分の、同種抗原と複合した分子（例えば、ポリペプチド（例えば、抗体））への結合によって開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．,Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ.Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）に記載されるようなＣＤＣアッセイが行われ得る。

【0057】

「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明するために使用される。いくつかの実施形態では、ＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するものであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、これらの受容体の対立遺伝子変異体及び代替的にスプライシングされた形態も含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含み、これらは、主にその細胞質ドメインが異なる同様のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３－２３４（１９９７）を参照のこと）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７－９２（１９９１）、Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５－３４（１９９４）、及びｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ.Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０－４１（１９９５）に概説されている。将来的に特定されるものも含む他のＦｃＲは、本明細書における「ＦｃＲ」という用語に包含される。この用語は、母体ＩｇＧｓの胎児への移行に関与している新生児受容体ＦｃＲｎも含む（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））。

【0058】

「混入物」とは、所望のポリペプチド生成物とは異なる物質を指す。本発明のいくつかの実施形態では、混入物は、ポリペプチドの荷電変異体を含む。本発明のいくつかの実施形態では、混入物は、抗体または抗体断片の荷電変異体を含む。本発明の他の実施形態では、混入物としては、宿主細胞物質、例えばＣＨＯＰ；浸出されたタンパク質Ａ；核酸；所望のポリペプチドの変異体、断片、凝集体、または誘導体；別のポリペプチド；エンドトキシン；ウイルス性混入物；細胞培養培地成分等が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、混入物は、例えば限定されるものではないが、細菌性細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ細胞、昆虫細胞、原核細胞、真核細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、真菌細胞からの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）であってもよい。

【0059】

本明細書に使用される場合、「イムノアドヘシン」という用語は、異種ポリペプチドの結合特異性と、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを組み合わせた、抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識及び結合部位以外である所望の結合特異性を有する（すなわち、「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドヘシン部分は、典型的に、少なくとも受容体またはリガンドの結合部位を含む連続したアミノ酸配列である。イムノアドヘシンにおける免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ－１、ＩｇＧ－２、ＩｇＧ－３、またはＩｇＧ－４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ－１及びＩｇＡ－２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭ等の任意の免疫グロブリンから得られ得る。

【0060】

「レポーター分子」とは、本明細書で使用される場合、その化学的性質により、抗原結合抗体の検出を可能にする分析によって特定可能なシグナルを提供する分子を意味する。この種のアッセイにおいて最も一般的に使用されるレポーター分子は、酵素、フルオロフォア、または放射性核種を含有する分子（すなわち、放射性同位体）、及び化学発光分子のいずれかである。

【0061】

本明細書で使用される場合、「本質的に同じ」は、値またはパラメータが、著しい影響により変更されていないことを示す。例えば、カラム出口のクロマトグラフィー移動相のイオン強度は、イオン強度が著しく変化していない場合、移動相の最初のイオン強度と本質的に同じである。例えば、初期イオン強度の１０％、５％、または１％以内であるカラム出口のイオン強度は、初期イオン強度と本質的に同じである。

【0062】

本明細書において「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする変動を含む（かつ記述する）。例えば、「約Ｘ」を言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。

【0063】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「または」、及び「ｔｈｅ」は、別途文脈が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。本明細書に記載の本発明の態様及び変形は、態様及び変形「からなる」及び／または「本質的にからなる」を含むことが理解される。

【0064】

ＩＩ．細胞系レポーターアッセイ
本発明は、標的細胞の存在下のＴＤＢ媒介性Ｔ細胞活性化を検出する、及び／またはＴＤＢの効力を決定するための細胞系アッセイを提供し、ＴＤＢの１つの抗原結合断片は、ＴＣＲ複合体サブユニット（例えば、ＣＤ３サブユニット、例えばＣＤ３ε）に結合し、Ｔ細胞を活性化し、他の抗原結合断片は、標的細胞上の標的抗原に結合する。細胞系アッセイは、とりわけ、組成物中のＴＤＢを検出する、組成物中のＴＤＢの量を定量化する、ＴＤＢの特異性を決定する、及び細胞集団が標的抗原を発現するかどうかを決定するのに有用である。

【0065】

Ａ.Ｔ細胞活性化
ＴＤＢの作用の機序は、標的抗原発現細胞を特異的に減損することである。ＴＤＢの、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体サブユニット、またはＴＣＳ、（ＣＤ３ε等）、及び標的細胞の表面上に発現した標的抗原への同時結合は、ＴＣＲのクラスタリングをもたらし、Ｔ細胞活性化及び標的細胞の細胞毒性の減損をもたらす。診療所に多くのＴＤＢが存在しており（αＣＤ３／αＣＤ１９、αＣＤ３／αＣＤ２０、αＣＤ３／αＨＥＲ２；ｄｅ Ｇａｓｔ ＧＣ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４０（６）：３９０－３９６、Ｂｕｈｍａｎｎ Ｒ，ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．４３（５）：３８３－３９７、Ｃｈａｎ ＪＫ，ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１２（６）：１８５９－１８６７）、新しいバージョンのＴＤＢ様二重特異性が、臨床的有効性を改善するために評価されている（Ｃｈａｍｅｓ,Ｐ.ａｎｄ Ｂａｔｙ，Ｄ．２００９，ＭＡｂｓ １（６）：５３９－５４７、Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｐ．ａｎｄ Ｓｃｈｉｒｒｍａｃｈｅｒ，Ｖ．，２０１３，ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２７（１）：３５－５３）。ＴＤＢの二重特異性は、正しい標的発現細胞が存在するという条件で、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞系統の両方を活性化することができる。ＣＤ４^＋Ｔ細胞の活性化は、サイトカイン遺伝子発現（ＩＬ－２等）の誘導をもたらし、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の拡張及び増殖を含む他の免疫細胞の動員及び活性化を引き起こす。ＣＤ８^＋ＣＴＬの活性化は、ＴＤＢ媒介性細胞架橋を介して標的細胞を用いた免疫学的シナプス様構造の形成をもたらし、パーフォリン及びグランザイム（Ａ、Ｂ、Ｃ；ＣＴＬサブタイプに応じて）の転写の誘導、脱顆粒、及び標的細胞とエフェクター細胞との間の「免疫学的シナプス」様の界面にわたるパーフォリン及びグランザイムの局在的な放出を引き起こし、標的細胞の死滅をもたらす（Ｐｏｒｅｓ－Ｆｅｒｎａｎｄｏ，Ｐｏｒｅｓ－Ｆｅｒｎａｎｄｏ ＡＴ，Ｚｗｅｉｆａｃｈ Ａ，２００９，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．，２３１（１）：１６０－１７３、Ｐｉｐｋｉｎ，ＭＥ,ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．，２３５（１）：５５－７２）。エフェクター細胞媒介性細胞死滅は、数時間シナプスの安定化を必要とする比較的遅いプロセスであり、完全な細胞死滅を確実にするためにｐｒｆ１遺伝子及びグランザイム遺伝子の転写依存性活性化を必要とする。あるいは、標的細胞のＣＴＬ媒介性死滅はまた、Ｆａｓ媒介性アポトーシスによって生じることも示されている（Ｐａｒｄｏ，Ｊ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５（１２）：１４４１－１４５０）。ｐｒｆ１、ｇｒＢ、及びＦａｓ媒介性細胞死滅機構の転写調節は、Ｂ細胞枯渇を媒介するのに必要とされる遺伝子のプロモーター内に位置するＮＦＡＴ、ＮＦκＢ、及びＳＴＡＴエンハンサー要素に依存する（Ｐｉｐｋｉｎ，ＭＥ，ｅｔ ａｌ．，２０１０,Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．，２３５（１）：５５－７２、Ｐａｒｄｏ，Ｊ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５（１２）：１４４１－１４５０）。標的細胞とエフェクター細胞との間の相互作用の強度（免疫学的シナプス）は、シグナル伝達が、標的細胞とエフェクター細胞との間の相互作用を安定化及び維持するためにも必要とされる他の共刺激性分子に依存している（Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５（６）：３０７－３１５、Ｐａｔｔｕ Ｖ，ｅｔ ａｌ．，２０１３,Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４：４１１、Ｋｌｉｅｇｅｒ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４（１）：５８－６８、Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＪＣ，ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３（５）：４２７－４３４）。レポーター遺伝子アッセイを用いて、標的遺伝子の転写誘導のモニタリングは、したがって、ＴＤＢによってＴ細胞の活性化を観察するために、作用機序（ＭｏＡ）に反映する代替のアッセイシステムである。

【0066】

Ｔ細胞活性化は、免疫学的シナプスを形成するための抗原提示細胞の接触部位での細胞表面タンパク質及びシグナル伝達分子の空間的及び動力学的再構築を必要とする。ＴＣＲ及び共刺激受容体（ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ等）及びリガンドの活性化及びシグナル伝達の協調は、Ｔ細胞活性化に必要とされる期間及びシグナル伝達の両方を調節する。ＭＨＣ／ペプチド複合体として抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に提示された抗原は、Ｔ細胞の表面上にＴＣＲによって認識され得る。ＭＨＣ及びＴＣＲのクラスタリングは、Ｔ細胞活性化の調節において重要な役割を果たす、共刺激及び免疫調節性受容体の発現に応じて、Ｔ細胞活性化をもたらし得るシグナル伝達経路の動員及び活性化を開始する。ＣＤ３ε等のＴＣＲ複合体のサブユニットに結合する抗体（ＯＫＴ３；Ｂｒｏｗｎ，ＷＭ，２００６，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ ７：３８１－３８８、Ｆｅｒｒａｎ，Ｃ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｅｘｐ Ｎｅｐｈｒｏｌ １：８３－８９）は、ＴＣＲを架橋結合し、それによって、免疫学的シナプスでＴＣＲのクラスタリングを模倣することによってＴ細胞活性化を誘導し、インビトロでＴＣＲシグナル伝達を研究するために、臨床的に、及び長年代理活性剤として使用することができる。共刺激を有しない抗ＣＤ３抗体によるＴＣＲクラスタリングは、Ｔ細胞を弱く活性化するが、依然として、Ｔ細胞活性化及び制限されたサイトカイン転写及び放出を引き起こす。抗ＣＤ３媒介性シグナル伝達は、ＮＦＡＴ、ＡＰ１、及びＮＦκＢを含む、いくつかの転写因子を活性化することが示されている（ＭＦ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．５７：７６７－７７３、Ｓｈａｐｉｒｏ ＶＳ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（１２）６４５５－６４５８、Ｐａｒｄｏ，Ｊ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５（１２）：１４４１－１４５０）。共刺激は、シグナル伝達の調節を介してサイトカイン放出のレベル及び種類を調節し、サイトカイン発現の転写調節、及びＴ細胞活性化反応の性質に影響を及ぼす（Ｓｈａｎｎｏｎ，ＭＦ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．５７：７６７－７７３）。ＴＤＢは、Ｔ細胞と標的抗原発現細胞との間に形成された架橋の結果としてＴ細胞の細胞表面上にＴＣＲをクラスター化する。Ｔ細胞活性化によって転写誘導され得るレポーター遺伝子の発現を推進する転写調節要素は、どの事象が標的細胞の存在及び不在下でＴＤＢによって活性化されるかを決定するためにＴ細胞株において試験された。

【0067】

Ｂ．レポーター分子
レポーターアッセイは、細胞中のレポーターの発現の誘導をモニタリングすることにより、刺激の生物学的特徴を可能にする分析方法である。刺激は、典型的には遺伝子転写の調節を含む細胞応答をもたらす細胞内シグナル伝達経路の誘導をもたらす。いくつかの例では、細胞シグナル伝達経路の刺激は、タンパク質産生をもたらすＲＮＡ転写の開始に必要であるＤＮＡの上流非コード領域への転写因子の調節及び動員による遺伝子発現の調節をもたらす。刺激に応答する遺伝子転写及び翻訳の制御は、細胞増殖、分化、生存、及び免疫応答等の生物学的応答の大部分を誘発するために必要とされる。エンハンサーとも呼ばれる、ＤＮＡのこれらの非コード領域は、遺伝子転写の効率を調節する転写因子のための認識要素、ひいては、刺激に応答する細胞により生じるタンパク質の量及び種類である特定の配列を含有する。レポーターアッセイにおいて、刺激に応答するエンハンサー要素及び最小プロモーターは、標準分子生物学方法を使用してレポーター遺伝子の発現を促進するように操作される。次いで、ＤＮＡは、刺激に特異的に応答する全ての機序を含有する細胞にトランスフェクトされ、レポーター遺伝子の転写、翻訳、または活性のレベルは、生物学的応答の代替的測定値として測定される。

【0068】

いくつかの態様では、本発明は、ＴＣＳ特異的（例えば、ＣＤ３サブユニット特異的、例えば、ＣＤ３ε特異的）抗原結合断片及び標的抗原特異的抗原結合断片を含むＴＤＢを、ａ）Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーに作動可能に連結したレポーターをコードする核酸を含むＴ細胞、ならびにｂ）それらの表面上で標的抗原を提示する標的細胞を含む細胞集団と接触させることによってＴＤＢ媒介性Ｔ細胞活性化の検出方法を提供し、そのため、レポーターの発現は、Ｔ細胞活性化を示す。レポーター分子は、任意の分子であり得、そのため、アッセイが、刺激に応答する細胞によって産生されるその分子の量を測定するために開発され得る。例えば、レポーター分子は、刺激（例えば、Ｔ細胞活性化）に応答するレポーター遺伝子によってコードされるレポータータンパク質であり得る。レポーター分子の一般的に使用された例としては、基質の触媒作用の副生成物として実験的に測定され得る光を発する、ルシフェラーゼ等の発光タンパク質が挙げられるが、これに限定されない。ルシフェラーゼは、多くの供給源に由来する発光タンパク質のクラスであり、これには、ホタルルシフェラーゼ（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ種から）、ｓｅａ ｐａｎｓｙからのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（例えば、Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ｃｌｉｃｋ ｂｅｅｔｌｅルシフェラーゼ（例えば、Ｐｙｒｅａｒｉｎｕｓ ｔｅｒｍｉｔｉｌｌｕｍｉｎａｎｓから）、ｍａｒｉｎｅ ｃｏｐｅｐｏｄ Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（例えば、Ｇａｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓから）、及びｄｅｅｐ ｓｅａ ｓｈｒｉｍｐナノルシフェラーゼ（例えば、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓから）が含まれる。ホタルルシフェラーゼは、ルシフェリンのオキシルシフェリンへの酸化を触媒し、光の光子の放出をもたらす一方、Ｒｅｎｉｌｌａ等の他のルシフェラーゼは、セレンテラジンの酸化を触媒することによって発光する。異なるルシフェラーゼ形態及び変異体から放出された光の波長は、異なるフィルター系を用いて読み取り可能であり、これにより多重化を容易にする。発光の量は、細胞内で発現するルシフェラーゼの量に比例し、ルシフェラーゼ遺伝子は、生物学的応答を引き起こすための刺激の効力を定量的に評価するために感受性レポーターとして使用されている。レポーター遺伝子アッセイは、基本的な研究、ＨＴＳ選別を含む広範囲の目的及び有効性のために長年の間使用されている（Ｂｒｏｇａｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｒａｄｉａｔ Ｒｅｓ．１７７（４）：５０８－５１３、Ｍｉｒａｇｌｉａ ＬＪ，ｅｔ ａｌ．，２０１１,Ｃｏｍｂ Ｃｈｅｍ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ．１４（８）：６４８－６５７、Ｎａｋａｊｉｍａ Ｙ，ａｎｄ Ｏｈｍｉｙａ Ｙ．２０１０，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，５（９）：８３５－８４９、Ｐａｒｅｋｈ ＢＳ，ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｍａｂｓ，４（３）：３１０－３１８、Ｓｖｏｂｏｄｏｖａ Ｋ，ａｎｄ Ｃａｊｔｈａｍ Ｌ Ｔ．，２０１０，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８８（４）：８３９－８４７）。

【0069】

いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーに作動可能に連結したレポーターをコードする核酸を含むＴ細胞中のＴＤＢ媒介性Ｔ細胞活性化を検出するための細胞系アッセイを提供する。いくつかの実施形態では、レポーター構築体は、ルシフェラーゼを含む。いくつかの実施形態では、ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ（例えば、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ種から）、ｓｅａ ｐａｎｓｙからのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（例えば、Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ種から）、ｃｌｉｃｋ ｂｅｅｔｌｅルシフェラーゼ（例えば、Ｐｙｒｅａｒｉｎｕｓ ｔｅｒｍｉｔｉｌｌｕｍｉｎａｎｓ種から）、ｍａｒｉｎｅ ｃｏｐｅｐｏｄ Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（例えば、Ｇａｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓ種から）、またはｄｅｅｐ ｓｅａ ｓｈｒｉｍｐ ナノルシフェラーゼ（例えば、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓ種から）である。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞中のルシフェラーゼの発現は、ＴＤＢによるＴ細胞の活性化を示す。他の態様では、レポーター構築体は、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）；蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、もしくはこれらの変異体；クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）；β－ガラクトシダーゼ；β－ラクタマーゼ；または分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードする。

【0070】

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーを含む制御配列に動作可能に連結したレポーター分子（例えば、ルシフェラーゼ等のレポータータンパク質）をコードする核酸を含む操作されたＴ細胞が提供される。プロモーター及び／またはエンハンサー配列は、Ｔ細胞活性化に応答するために、当技術分野で既知のもののうちのいずれかの中から選択され得る。いくつかの実施形態では、核酸は、Ｔ細胞ゲノムに安定的に組み込まれる。

【0071】

いくつかの実施形態では、１つ以上のＴ細胞活性化応答エンハンサー要素に動作可能に連結した最小プロモーターの制御下のレポーター分子をコードする核酸を含む操作されたＴ細胞が提供される。いくつかの実施形態では、最小プロモーターは、チミジンキナーゼ（ＴＫ）最小プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）からの最小プロモーター、ＳＶ４０由来の最小プロモーター、または最小伸長因子１アルファ（ＥＦ１α）プロモーターである。いくつかの実施形態では、最小プロモーターは、最小ＴＫプロモーターである。いくつかの実施形態では、最小プロモーターは、最小ＣＭＶプロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化応答エンハンサー要素は、ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核因子）エンハンサー、ＡＰ－１（Ｆｏｓ／Ｊｕｎ）エンハンサー、ＮＦＡＴ／ＡＰ１エンハンサー、ＮＦκＢエンハンサー、ＦＯＸＯエンハンサー、ＳＴＡＴ３エンハンサー、ＳＴＡＴ５エンハンサー、またはＩＲＦエンハンサーである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化応答エンハンサー要素は、タンデム反復（例えば、ほぼ２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上のタンデム反復のうちのいずれか）として配置される。Ｔ細胞活性化応答エンハンサー要素は、レポーターをコードする配列に対して５’または３’に位置決めされ得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化応答エンハンサー要素は、最小プロモーターからの５’部位に位置する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化応答エンハンサー要素は、ＮＦκＢエンハンサーである。いくつかの実施形態では、レポーター分子は、ホタルまたはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ等のルシフェラーゼである。いくつかの実施形態では、核酸は、Ｔ細胞ゲノムに安定的に組み込まれる。

【0072】

Ｃ．細胞
いくつかの実施形態では、ＴＣＳ特異的（例えば、ＣＤ３特異的、例えば、ＣＤ３ε特異的）抗原結合断片及び標的抗原特異的抗原結合断片を含むＴＤＢを、ａ）Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーに作動可能に連結したレポーターをコードする核酸を含むＴ細胞、及びｂ）それらの表面上で標的抗原を提示する標的細胞を含む細胞集団と接触させることによってＴＤＢによって媒介されるＴ細胞活性化の検出方法が提供され、そのため、レポーターの発現が、Ｔ細胞活性化を示す。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞である。さらに他の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋／ＣＤ８^＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ４^＋及び／またはＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、及びインターロイキンからなる群から選択されるサイトカインの放出の増加を呈する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の集団は、不死化Ｔ細胞の集団（例えば、不死化Ｔ細胞株）である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の集団は、ＴＣＲ／ＣＤ３εを発現した、不死化ＣＤ４^＋及び／またはＣＤ８^＋細胞の集団である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、Ｊｕｒｋａｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＴＬＬ－２ Ｔ細胞である。

【0073】

いくつかの実施形態では、本発明のＴ細胞は、Ｔ細胞受容体を含む。Ｔ細胞受容体は、いくつかのタンパク質の複合体として存在する。Ｔ細胞受容体はそれ自体、独立したＴ細胞受容体アルファ及びベータ（ＴＣＲα及びＴＣＲβ）遺伝子によりコードされた２つの別個のペプチド鎖からなる。複合体中の他のタンパク質は、ＣＤ３タンパク質：ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３ζを含む。ＣＤ３タンパク質は、ＣＤ３εγ及びＣＤ３εδヘテロ二量体、ならびにＣＤ３ζホモ二量体として見出される。ＣＤ３ζホモ二量体により、これらのタンパク質の周囲でのシグナル伝達複合体の凝集が可能になる。いくつかの実施形態では、ＴＤＢの１つのアームが、Ｔ細胞受容体複合体に結合する。いくつかの実施形態では、ＴＤＢは、ＣＤ３に結合する。いくつかの実施形態では、ＴＤＢは、ＣＤ３εサブユニットに結合する。

【0074】

いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＤＢ媒介性Ｔ細胞活性化を検出及び／または定量化するために細胞系アッセイにおいて使用するためのＴ細胞を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物のＴ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、組成物のＴ細胞は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞である。さらに他の実施形態では、組成物のＴ細胞は、ＣＤ４^＋／ＣＤ８^＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、組成物のＴ細胞は、不死化Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、組成物のＴ細胞は、Ｊｕｒｋａｔ細胞である。いくつかの実施形態では、組成物のＴ細胞は、ＣＴＬＬ－２ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、組成物のＴ細胞は、Ｔ細胞活性化に応答するレポーター構築物を含む。いくつかの実施形態では、レポーター構築体は、ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、またはナノシフェラーゼである。いくつかの実施形態では、レポーター（例えば、ルシフェラーゼ）をコードするポリヌクレオチドは、Ｔ細胞活性化応答調節要素（例えば、Ｔ細胞活性化応答プロモーター及び／またはエンハンサー）に作動可能に連結させる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーは、ＮＦＡＴプロモーター、ＡＰ－１プロモーター、ＮＦκＢプロモーター、ＦＯＸＯプロモーター、ＳＴＡＴ３プロモーター、ＳＴＡＴ５プロモーター、またはＩＲＦプロモーターである。

【0075】

いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーを含む制御配列に作動可能に連結したレポーター分子をコードするＴ細胞活性化レポーター構築体で操作されたＴ細胞の組成物を提供する。いくつかの実施形態では、レポーター分子は、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ等）、アルカリホスファターゼ、またはベータガラクトシダーゼである。いくつかの実施形態では、ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、またはナノシフェラーゼである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーは、ＮＦＡＴプロモーター、ＡＰ－１プロモーター、ＮＦκＢプロモーター、ＦＯＸＯプロモーター、ＳＴＡＴ３プロモーター、ＳＴＡＴ５プロモーター、またはＩＲＦプロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化に応答するエンハンサーは、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１、ＮＦκＢ、ＦＯＸＯ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、及びＩＲＦのうちの任意の１つ以上からのＴ細胞活性化応答エンハンサー要素を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の組成物は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び／またはＣＤ８^＋Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、Ｊｕｒｋａｔ細胞またはＣＴＬＬ－２細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＮＦκＢプロモーターに作動可能に連結したルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むＪｕｒｋａｔ細胞である。

【0076】

いくつかの実施形態では、レポーターエフェクター細胞はＪｕｒｋａｔ－Ｄｕａｌ（商標）細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）である。Ｊｕｒｋａｔ－Ｄｕａｌ（商標）細胞は、５個のコンセンサスＮＦ－κＢ転写応答要素及び３個のｃ－Ｒｅｌ結合部位の制御下のＬｕｃｉａ（商標）分泌ルシフィルーゼ遺伝子を含む。細胞はまた、ＩＳＧ５４最小プロモーター及び５つのインターフェロン刺激応答要素の制御下の分泌胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子も含む。

【0077】

Ｄ．ＴＤＢ媒介性Ｔ細胞活性化アッセイ及びその使用
いくつかの態様では、本発明は、ＴＤＢによって媒介されるＴ細胞活性化を検出するための方法を提供し、ＴＤＢは、標的抗原結合断片及びＴＣＳ結合断片（ＣＤ３結合断片等）を含み、本方法は、ＴＤＢを含む組成物を、ａ）Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーに作動可能に連結したレポーターをコードする核酸を含むＴ細胞、及びｂ）標的抗原を発現する標的細胞を含む細胞集団と接触させることを含み、レポーターの発現は、ＴＤＢ媒介性Ｔ細胞活性化の存在を示す。いくつかの実施形態では、レポーターは、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ、またはベータガラクトシダーゼである。いくつかの実施形態では、ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、またはナノシフェラーゼである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーは、ＮＦＡＴプロモーター、ＡＰ－１プロモーター、ＮＦκＢプロモーター、ＦＯＸＯプロモーター、ＳＴＡＴ３プロモーター、ＳＴＡＴ５プロモーター、またはＩＲＦプロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーは、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１、ＮＦκＢ、ＦＯＸＯ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、及びＩＲＦのうちの任意の１つ以上からのＴ細胞活性化応答要素を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団におけるＴ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ８^＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞集団におけるＴ細胞は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞またはＣＴＬＬ－２ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＴＣＳ結合断片は、ＣＤ３結合断片である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合断片は、ＣＤ３ε結合断片である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、標的細胞の表面上に発現される。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９α（ＣＤ７９ａ）、ＣＤ７９β（ＣＤ７９ｂ）、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体、ＨＥＲ４受容体、ＦｃＲＨ５、ＣＬＬ１、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、αｖ／β３インテグリン、ＶＥＧＦ、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ－４；プロテインＣ、ＢＲ３、ｃ－ｍｅｔ、組織因子、β７、Ｔｅｎｂ２、ＳＴＥＡＰ、または膜貫通腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。いくつかの実施形態では、ａ）標的抗原はＨＥＲ２受容体であり、標的細胞はＢＴ－４７４細胞であるか、ｂ）標的抗原は、ＨＥＲ２受容体であり、標的細胞はＳＫＢＲ３細胞であるか、ｃ）標的抗原はＣＤ２０であり、標的細胞はＷｉｌ２－Ｓ細胞であるか、またはｄ）標的抗原はＣＤ７９ｂであり、標的細胞はＢＪＡＢ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞集団におけるＴ細胞対標的細胞の比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、または約１：１０である。いくつかの実施形態では、細胞集団におけるＴ細胞対標的細胞の比は、約１：４である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、約１×１０^３～約１×１０^６の範囲である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、約１×１０^４～約５×１０^４である。

【0078】

いくつかの実施形態では、細胞集団を、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約４０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約３０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約２０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、または約５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬのうちの任意の濃度範囲でＴＤＢを含む組成物と接触させる。

【0079】

いくつかの実施形態では、レポーターは、細胞を組成物と接触させた約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、または２４時間後のうちのいずれかよりも後に検出される。いくつかの実施形態では、レポーターは、細胞を組成物と接触させた約１時間～約２４時間、約１時間～約１２時間、約１時間～約８時間、約１時間～約６時間、約１時間～約４時間、約１時間～約２時間、約４時間～約２４時間、約４時間～約１２時間、約４時間～約８時間、約８時間～約２４時間、約８時間～約１２時間、約１６時間～約２４時間、約１６時間～約２０時間、または約２０時間～約２４時間後のうちのいずれかの間で検出される。

【0080】

いくつかの態様では、本発明は、組成物中のＴＤＢを検出するための方法を提供し、ＴＤＢは、標的抗原結合断片及びＴＣＳ結合断片（ＣＤ３結合断片等）を含み、本方法は、組成物を、ａ）Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーに作動可能に連結したレポーターをコードする核酸を含むＴ細胞、ならびにｂ）標的抗原を発現する標的細胞を含む細胞集団と接触させることを含み、レポーターの発現は、組成物中のＴＤＢの存在を示す。いくつかの実施形態では、レポーターは、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ、またはベータガラクトシダーゼである。いくつかの実施形態では、ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、またはナノシフェラーゼである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーは、ＮＦＡＴプロモーター、ＡＰ－１プロモーター、ＮＦκＢプロモーター、ＦＯＸＯプロモーター、ＳＴＡＴ３プロモーター、ＳＴＡＴ５プロモーター、またはＩＲＦプロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーは、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１、ＮＦκＢ、ＦＯＸＯ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、及びＩＲＦのうちの任意の１つ以上からのＴ細胞活性化応答要素を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団におけるＴ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ８^＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞集団におけるＴ細胞は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞またはＣＴＬＬ－２ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＴＣＳ結合断片は、ＣＤ３結合断片である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合断片は、ＣＤ３ε結合断片である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、標的細胞の表面上に発現される。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９α（ＣＤ７９ａ）、ＣＤ７９β（ＣＤ７９ｂ）、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体、ＨＥＲ４受容体、ＦｃＲＨ５、ＣＬＬ１、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、αｖ／β３インテグリン、ＶＥＧＦ、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ－４；プロテインＣ、ＢＲ３、ｃ－ｍｅｔ、組織因子、β７、Ｔｅｎｂ２、ＳＴＥＡＰ、または膜貫通腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。いくつかの実施形態では、ａ）標的抗原はＨＥＲ２受容体であり、標的細胞はＢＴ－４７４細胞であるか、ｂ）標的抗原は、ＨＥＲ２受容体であり、標的細胞はＳＫＢＲ３細胞であるか、ｃ）標的抗原はＣＤ２０であり、標的細胞はＷｉｌ２－Ｓ細胞であるか、またはｄ）標的抗原はＣＤ７９ｂであり、標的細胞はＢＪＡＢ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞集団におけるＴ細胞対標的細胞の比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、または約１：１０である。いくつかの実施形態では、細胞集団におけるＴ細胞対標的細胞の比は、約１：４である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、約１×１０^３～約１×１０^６の範囲である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、約１×１０^４～約５×１０^４である。

【0081】

いくつかの実施形態では、細胞集団を、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約４０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約３０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約２０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、または約５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬのうちの任意の濃度範囲でＴＤＢを含む組成物と接触させる。

【0082】

いくつかの実施形態では、レポーターは、細胞を組成物と接触させた約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、または２４時間後のうちのいずれかよりも後に検出される。いくつかの実施形態では、レポーターは、細胞を組成物と接触させた約１時間～約２４時間、約１時間～約１２時間、約１時間～約８時間、約１時間～約６時間、約１時間～約４時間、約１時間～約２時間、約４時間～約２４時間、約４時間～約１２時間、約４時間～約８時間、約８時間～約２４時間、約８時間～約１２時間、約１６時間～約２４時間、約１６時間～約２０時間、または約２０時間～約２４時間後のうちのいずれかの間で検出される。

【0083】

いくつかの態様では、本発明は、組成物中のＴＤＢの量を定量化するための方法を提供し、ＴＤＢは、標的抗原結合断片及びＴＣＳ結合断片（ＣＤ３結合断片等）を含み、本方法は、組成物を、ａ）Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーに作動可能に連結したレポーターをコードする核酸を含むＴ細胞、ならびにｂ）標的抗原を発現する標的細胞を含む細胞集団と接触させることと、レポーターの発現を、Ｔ細胞及び標的細胞の集団を異なる濃度の精製した参照ＴＤＢと接触させることにより生じる標準曲線と抗体濃度の関数として相関させることと、を含む。いくつかの実施形態では、レポーターは、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ、またはベータガラクトシダーゼである。いくつかの実施形態では、ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、またはナノシフェラーゼである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーは、ＮＦＡＴプロモーター、ＡＰ－１プロモーター、ＮＦκＢプロモーター、ＦＯＸＯプロモーター、ＳＴＡＴ３プロモーター、ＳＴＡＴ５プロモーター、またはＩＲＦプロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーは、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１、ＮＦκＢ、ＦＯＸＯ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、及びＩＲＦのうちの任意の１つ以上からのＴ細胞活性化応答要素を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団におけるＴ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ８^＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞集団におけるＴ細胞は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞またはＣＴＬＬ－２ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＴＣＳ結合断片は、ＣＤ３結合断片である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合断片は、ＣＤ３ε結合断片である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、標的細胞の表面上に発現される。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９α（ＣＤ７９ａ）、ＣＤ７９β（ＣＤ７９ｂ）、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体、ＨＥＲ４受容体、ＦｃＲＨ５、ＣＬＬ１、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、αｖ／β３インテグリン、ＶＥＧＦ、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ－４；プロテインＣ、ＢＲ３、ｃ－ｍｅｔ、組織因子、β７、Ｔｅｎｂ２、ＳＴＥＡＰ、または膜貫通腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。いくつかの実施形態では、ａ）標的抗原はＨＥＲ２受容体であり、標的細胞はＢＴ－４７４細胞であるか、ｂ）標的抗原は、ＨＥＲ２受容体であり、標的細胞はＳＫＢＲ３細胞であるか、ｃ）標的抗原はＣＤ２０であり、標的細胞はＷｉｌ２－Ｓ細胞であるか、またはｄ）標的抗原はＣＤ７９ｂであり、標的細胞はＢＪＡＢ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞集団におけるＴ細胞対標的細胞の比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、または約１：１０である。いくつかの実施形態では、細胞集団におけるＴ細胞対標的細胞の比は、約１：４である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、約１×１０^３～約１×１０^６の範囲である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、約１×１０^４～約５×１０^４である。

【0084】

いくつかの実施形態では、標準曲線は、細胞集団を、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬの範囲の複数の濃度の精製した参照ＴＤＢと接触させることにより生じる。いくつかの実施形態では、複数の濃度の精製した参照ＴＤＢは、約０．０１ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、７５０ｎｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、または５００μｇ／ｍＬのうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、複数の濃度の精製した参照ＴＤＢは、約３、４、５、６、７、８、９、１０倍、または１０倍を超える濃度である。

【0085】

いくつかの実施形態では、レポーターは、細胞を組成物と接触させた約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、または２４時間後のうちのいずれかよりも後に検出される。いくつかの実施形態では、レポーターは、細胞を組成物と接触させた約１時間～約２４時間、約１時間～約１２時間、約１時間～約８時間、約１時間～約６時間、約１時間～約４時間、約１時間～約２時間、約４時間～約２４時間、約４時間～約１２時間、約４時間～約８時間、約８時間～約２４時間、約８時間～約１２時間、約１６時間～約２４時間、約１６時間～約２０時間、または約２０時間～約２４時間後のうちのいずれかの間で検出される。

【0086】

いくつかの態様では、本発明は、ＴＤＢによって媒介されるＴ細胞活性化の効力を決定するための方法を提供し、ＴＤＢは、標的抗原結合断片及びＴＣＳ結合断片（ＣＤ３結合断片等）を含み、本方法は、ＴＤＢを含む組成物を、ａ）Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーに作動可能に連結したレポーターをコードする核酸を含むＴ細胞、ならびにｂ）標的抗原を発現する標的細胞を含む細胞集団と接触させることと、レポーターの発現を、細胞集団を異なる濃度の参照ＴＤＢと接触させることにより生じる標準曲線と抗体濃度の関数として相関させ、それにより、ＴＤＢによって媒介されるＴ細胞活性化の効力の相対的測定値を得ることと、を含む。いくつかの実施形態では、レポーターは、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ、またはベータガラクトシダーゼである。いくつかの実施形態では、ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、またはナノシフェラーゼである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーは、ＮＦＡＴプロモーター、ＡＰ－１プロモーター、ＮＦκＢプロモーター、ＦＯＸＯプロモーター、ＳＴＡＴ３プロモーター、ＳＴＡＴ５プロモーター、またはＩＲＦプロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーは、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１、ＮＦκＢ、ＦＯＸＯ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、及びＩＲＦのうちの任意の１つ以上からのＴ細胞活性化応答要素を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団におけるＴ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ８^＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞集団におけるＴ細胞は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞またはＣＴＬＬ－２ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＴＣＳ結合断片は、ＣＤ３結合断片である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合断片は、ＣＤ３ε結合断片である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、標的細胞の表面上に発現される。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９α（ＣＤ７９ａ）、ＣＤ７９β（ＣＤ７９ｂ）、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体、ＨＥＲ４受容体、ＦｃＲＨ５、ＣＬＬ１、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、αｖ／β３インテグリン、ＶＥＧＦ、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ－４；プロテインＣ、ＢＲ３、ｃ－ｍｅｔ、組織因子、β７、Ｔｅｎｂ２、ＳＴＥＡＰ、または膜貫通腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。いくつかの実施形態では、ａ）標的抗原はＨＥＲ２受容体であり、標的細胞はＢＴ－４７４細胞であるか、ｂ）標的抗原は、ＨＥＲ２受容体であり、標的細胞はＳＫＢＲ３細胞であるか、ｃ）標的抗原はＣＤ２０であり、標的細胞はＷｉｌ２－Ｓ細胞であるか、またはｄ）標的抗原はＣＤ７９ｂであり、標的細胞はＢＪＡＢ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞集団におけるＴ細胞対標的細胞の比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、または約１：１０である。いくつかの実施形態では、細胞集団におけるＴ細胞対標的細胞の比は、約１：４である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、約１×１０^３～約１×１０^６の範囲である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、約１×１０^４～約５×１０^４である。

【0087】

いくつかの実施形態では、細胞集団を、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約４０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約３０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約２０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、または約５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬのうちの任意の濃度範囲でＴＤＢを含む組成物と接触させる。

【0088】

いくつかの実施形態では、標準曲線は、細胞集団を、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬの範囲の複数の濃度の精製した参照ＴＤＢと接触させることにより生じる。いくつかの実施形態では、複数の濃度の精製した参照ＴＤＢは、約０．０１ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、７５０ｎｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、または５００μｇ／ｍＬのうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、複数の濃度の精製した参照ＴＤＢは、約３、４、５、６、７、８、９、１０倍、または１０倍を超える濃度である。

【0089】

いくつかの実施形態では、レポーターは、細胞を組成物と接触させた約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、または２４時間後のうちのいずれかよりも後に検出される。いくつかの実施形態では、レポーターは、細胞を組成物と接触させた約１時間～約２４時間、約１時間～約１２時間、約１時間～約８時間、約１時間～約６時間、約１時間～約４時間、約１時間～約２時間、約４時間～約２４時間、約４時間～約１２時間、約４時間～約８時間、約８時間～約２４時間、約８時間～約１２時間、約１６時間～約２４時間、約１６時間～約２０時間、または約２０時間～約２４時間後のうちのいずれかの間で検出される。

【0090】

いくつかの態様では、本発明は、ＴＤＢによって媒介されるＴ細胞活性化の特異性を決定するための方法を提供し、ＴＤＢは、標的抗原結合断片及びＴＣＳ結合断片（ＣＤ３結合断片等）を含み、本方法は、ａ）ＴＤＢを含む組成物を、ｉ）Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーに作動可能に連結したレポーターをコードする核酸を含むＴ細胞、ならびにｉｉ）標的抗原を発現しない試験細胞を含む細胞集団と接触させることと、ｂ）ＴＤＢを含む組成物を、ｉ）Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーに作動可能に連結したレポーターをコードする核酸を含むＴ細胞、ならびにｉｉ）標的抗原を発現する標的細胞を含む細胞集団と接触させることと、パートａ）中の試験細胞の存在下のレポーターの発現を、パートｂ）中の標的細胞の存在下のレポーターの発現と比較することと、を含み、試験細胞のレポーターの発現対標的細胞のレポーターの発現の比は、標的細胞に対するＴＤＢの特異性を示す。いくつかの実施形態では、レポーターは、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ、またはベータガラクトシダーゼである。いくつかの実施形態では、ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、またはナノシフェラーゼである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーは、ＮＦＡＴプロモーター、ＡＰ－１プロモーター、ＮＦκＢプロモーター、ＦＯＸＯプロモーター、ＳＴＡＴ３プロモーター、ＳＴＡＴ５プロモーター、またはＩＲＦプロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーは、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１、ＮＦκＢ、ＦＯＸＯ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、及びＩＲＦのうちの任意の１つ以上からのＴ細胞活性化応答要素を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団におけるＴ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ８^＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞集団におけるＴ細胞は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞またはＣＴＬＬ－２ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＴＣＳ結合断片は、ＣＤ３結合断片である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合断片は、ＣＤ３ε結合断片である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、標的細胞の表面上に発現される。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９α（ＣＤ７９ａ）、ＣＤ７９β（ＣＤ７９ｂ）、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体、ＨＥＲ４受容体、ＦｃＲＨ５、ＣＬＬ１、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、αｖ／β３インテグリン、ＶＥＧＦ、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ－４；プロテインＣ、ＢＲ３、ｃ－ｍｅｔ、組織因子、β７、Ｔｅｎｂ２、ＳＴＥＡＰ、または膜貫通腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。いくつかの実施形態では、ａ）標的抗原はＨＥＲ２受容体であり、標的細胞はＢＴ－４７４細胞であるか、ｂ）標的抗原は、ＨＥＲ２受容体であり、標的細胞はＳＫＢＲ３細胞であるか、ｃ）標的抗原はＣＤ２０であり、標的細胞はＷｉｌ２－Ｓ細胞であるか、またはｄ）標的抗原はＣＤ７９ｂであり、標的細胞はＢＪＡＢ細胞である。いくつかの実施形態では、ステップａ）の細胞集団におけるＴ細胞対試験細胞の比、及び／またはステップｂ）の細胞集団におけるＴ細胞対標的細胞の比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、または約１：１０である。いくつかの実施形態では、ステップａ）の細胞集団におけるＴ細胞対試験細胞の比、及び／またはステップｂ）の細胞集団におけるＴ細胞対標的細胞の比は、約１：４である。いくつかの実施形態では、ステップａ）及び／またはｂ）の細胞集団は、約１×１０^３～約１×１０^６の範囲である。いくつかの実施形態では、ステップａ）及び／またはｂ）の細胞集団は、約１×１０^４～約５×１０^４の範囲である。

【0091】

いくつかの実施形態では、ステップａ）のＴ細胞及び試験細胞ならびにステップｂ）のＴ細胞及び標的細胞の集団を、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約４０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約３０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約２０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、または約５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬのうちのいずれかの濃度範囲でＴＤＢを含む組成物と接触させる。

【0092】

いくつかの実施形態では、レポーターは、細胞を組成物と接触させた約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、または２４時間後のうちのいずれかよりも後に検出される。いくつかの実施形態では、レポーターは、細胞を組成物と接触させた約１時間～約２４時間、約１時間～約１２時間、約１時間～約８時間、約１時間～約６時間、約１時間～約４時間、約１時間～約２時間、約４時間～約２４時間、約４時間～約１２時間、約４時間～約８時間、約８時間～約２４時間、約８時間～約１２時間、約１６時間～約２４時間、約１６時間～約２０時間、または約２０時間～約２４時間後のうちのいずれかの間で検出される。

【0093】

いくつかの態様では、本発明は、試験細胞の集団が標的抗原を発現するかどうかを決定するための方法を提供し、本方法は、ａ）試験細胞の集団をＴ細胞の集団と接触させることであって、Ｔ細胞は、Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーに作動可能に連結したレポーターをコードする核酸を含む、接触させることと、ｂ）Ｔ細胞及び試験細胞の集団をＴＤＢと接触させることであって、ＴＤＢは、標的抗原結合断片及びＴＣＳ結合断片（ＣＤ３結合断片等）を含む、接触させることと、を含み、レポーターの発現は、試験細胞によって発現される標的抗原の存在を示す。いくつかの実施形態では、レポーターは、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ、またはベータガラクトシダーゼである。いくつかの実施形態では、ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、またはナノシフェラーゼである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーは、ＮＦＡＴプロモーター、ＡＰ－１プロモーター、ＮＦκＢプロモーター、ＦＯＸＯプロモーター、ＳＴＡＴ３プロモーター、ＳＴＡＴ５プロモーター、またはＩＲＦプロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーは、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１、ＮＦκＢ、ＦＯＸＯ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、及びＩＲＦのうちの任意の１つ以上からのＴ細胞活性化応答要素を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の集団は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ８^＋Ｔ細胞の集団である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の集団は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞またはＣＴＬＬ－２ Ｔ細胞の集団である。いくつかの実施形態では、ＴＣＳ結合断片は、ＣＤ３結合断片である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合断片は、ＣＤ３ε結合断片である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、標的細胞の表面上に発現される。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９α（ＣＤ７９ａ）、ＣＤ７９β（ＣＤ７９ｂ）、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体、ＨＥＲ４受容体、ＦｃＲＨ５、ＣＬＬ１、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、αｖ／β３インテグリン、ＶＥＧＦ、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ－４；プロテインＣ、ＢＲ３、ｃ－ｍｅｔ、組織因子、β７、Ｔｅｎｂ２、ＳＴＥＡＰ、または膜貫通腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。いくつかの実施形態では、試験細胞の集団は、腫瘍細胞、免疫細胞、または血管細胞の集団である。いくつかの実施形態では、試験細胞の集団は、Ｔ細胞を含まない。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞対試験細胞の比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、または約１：１０である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞対試験細胞の比は、約１：４である。いくつかの実施形態では、試験細胞及びＴ細胞の集団は、約１×１０^３～約１×１０^６個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、試験細胞及びＴ細胞の集団は、約１×１０^４～約５×１０^４個の細胞を含む。

【0094】

いくつかの実施形態では、試験細胞及びＴ細胞の集団を、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約４０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約３０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約２０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０００ｎｇ／ｍＬ、または約５ｎｇ／ｍＬ～約５０００ｎｇ／ｍＬのうちのいずれかの濃度範囲でＴＤＢを含む組成物と接触させる。

【0095】

いくつかの実施形態では、レポーターは、細胞を組成物と接触させた約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、または２４時間後のうちのいずれかよりも後に検出される。いくつかの実施形態では、レポーターは、細胞を組成物と接触させた約１時間～約２４時間、約１時間～約１２時間、約１時間～約８時間、約１時間～約６時間、約１時間～約４時間、約１時間～約２時間、約４時間～約２４時間、約４時間～約１２時間、約４時間～約８時間、約８時間～約２４時間、約８時間～約１２時間、約１６時間～約２４時間、約１６時間～約２０時間、または約２０時間～約２４時間後のうちのいずれかの間で検出される。

【0096】

Ｅ．アッセイ開発
以下は、ＴＤＢ媒介性Ｔ細胞活性を検出するための、例示的ではあるが、非限定的な細胞系アッセイの開発方法である。

【0097】

ＤＮＡ構築体：レンチウイルスは、ＴＤＢ二重特異性抗体の効力を評価するために使用された安定したレポーターＴ細胞株を生成するために使用される。ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核因子）、ＡＰ－１（Ｆｏｓ／Ｊｕｎ）、ＮＦＡＴ／ＡＰ１、ＮＦκＢ、ＦＯＸＯ、ＳＴＡＴ３／５、またはＩＲＦのためのＤＮＡ認識要素によって調節される最小のＴＫプロモーターの制御下でレポーター遺伝子ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、またはナノルシフェラーゼを発現するレンチウイルスベクターが、構築される。安定したレポーター細胞株の作製に使用されるレンチウイルス発現カセットは、安定した細胞株の作製を可能にするための構成的プロモーター／エンハンサー（ＥＦ１アルファまたはＳＶ４０）の制御下で様々な抗生物質選択マーカーを発現する第３世代の自己不活性化二シストロン性ベクターであり得る。使用されるレポーターレンチウイルスベクターは、ｐＣＤＨ．ＭＣＳ．ＥＦ１ａ．Ｐｕｒｏ市販のベクター（ＳＢＩ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号ＣＤ５１０Ｂ－１）から修飾される。プロモーター修飾には、ＣＭＶ最小プロモーターの除去、様々なエンハンサー要素（ＮＦＡＴ、ＮＦκＢ等）による置換、ｐＲＫ５．ＣＭＶ．ルシフェラーゼ（Ｏｓａｋａ,Ｇ ｅｔ ａｌ．,１９９６ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．１９９６,８５：６１２－６１８）からの最小コアＲＮＡポリメラーゼプロモーター（ＴＡＴＡ ｂｏｘ）の添加、ならびに内部ＤＮＡ（ｐＲＫ５．ｔｋ．ｎｅｏからのネオマイシン耐性遺伝子、ｐＲＫ５．ｔｋ．ｈｙｇｒｏからのハイグロマイシン、及びｐＲＫ５．ｔｋ．ブラストシジンからのブラストサイジン耐性遺伝子）からの異なる選択カセットの置換が含まれる。エンハンサー要素の活性化に対する選択に使用される構成的プロモーターの影響は、プロモーター／エンハンサーのクロストークを最小限に抑えるように設計されたＤＮＡのノンコーディング伸長の組み込みのために最小である。ｐＲＫ５．ＣＭＶ．ルシフェラーゼ（Ｏｓａｋａ,１９９６）からのホタルルシフェラーゼは、修飾レンチウイルス親ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ－ＮｏｔＩ部位にクローニングされる。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ及びナノルシフェラーゼを含む他の発光性タンパク質もまた、ＨｉｎｄＩＩＩ－ＮｏｔＩ部位にサブクローニングされ得る。２９３ｓ（２９３懸濁液適合細胞株）細胞の一過性トランスフェクションからのウイルスストックを作製するために使用されたレンチウイルスパッケージング構築体（ｐＣＭＶ．ＨＩＶデルタ、ｐＣＭＣ．ＶＳＶ－Ｇ、及びｐＣＭＶ．Ｒｅｖ）は、得られても（ｐＣＭＶ．ＶＳＶ－Ｇ）、作製されてもよい（ｐＣＭＶ．ＨＩＶデルタ、ｐＣＭＶ．ＲＥＶ）。ＨＩＶ株ＭＮ（Ｎａｋａｍｕｒａ,ＧＲ ｅｔ ａｌ．,１９９３,Ｊ.Ｖｉｒｏｌ.６７（１０）：６１７９－６１９１）は、ｐＣＭＶ．ＨＩＶデルタパッケージングベクターを作製するために使用されてもよく、安全目的のために５’及び３’ＬＴＲに対するＨＩＶウイルスエンベロープ及び修飾の欠失によって不活性化するために内部ＥｃｏＲＩ部分消化欠失を含有する。ＨＩＶ Ｒｅｖは、ＲＴ－ＰＣＲによるｐＣＭＶ．ＨＩＶデルタトランスフェクト２９３ｓ細胞ＲＮＡからクローン化され、ｐＲＫ５．ｔｋ．ネオのＣｌａＩ－Ｘｈｏ部位中に導入される。レンチウイルスレポーターに偽型するためのＶＳＶ－Ｇの使用（ＨＩＶ ｅｎｖの代わりにＶＳＶ－Ｇを置換すること）は、任意の細胞型の感染を可能にする。レンチウイルス発現プラスミド及びパッケージング構築体は、Ｓｔｂｌ２コンピテント細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ 番号１０２６８－０１９）に増幅され、ＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐキット（カタログ番号１２６６２）を用いて精製される。全てのＤＮＡ構築体は、ＤＮＡ配列決定によって確認される。

【0098】

レポーター遺伝子アッセイ細胞株の開発：Ｊｕｒｋａｔ ＣＤ４＋Ｔ細胞株（ＤＳＭＺ、カタログ 番号ＡＣＣ ２８２）及びＣＴＬＬ－２ ＣＤ８^＋Ｔ細胞株（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ 番号Ｋ１６５３）は、ＴＤＢによってＴ細胞の活性化をモニタリングするためにレポーター遺伝子アッセイの実行可能性を評価するために使用される。ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核因子）、ＡＰ－１（Ｆｏｓ／Ｊｕｎ）、ＮＦＡＴ／ＡＰ１、ＮＦκＢ、ＦＯＸＯ、ＳＴＡＴ３，５、及びＩＲＦのためのＤＮＡ認識要素によって調節される最小のＴＫプロモーターの制御下でレポーター遺伝子ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、またはナノルシフェラーゼを発現するレンチウイルスベクターが、構築される。レポーター遺伝子ウイルスストックは、標準方法を使用して、２９３ｓ細胞の一過性トランスフェクションによって作製され、ＶＳＶ－Ｇを用いて偽型され、濃縮され、滴定される（Ｎａｌｄｉｎｉ,Ｌ．,ｅｔ ａｌ．,１９９６ Ｓｃｉｅｎｃｅ,２７２：２６３－２６７）。Ｊｕｒｋａｔ ＣＴＬＬ－２細胞は、スピノキュレーションにより１０のＭＯＩでレンチウイルスレポーターウイルスストックに感染し、３日後、感染した細胞は、抗生物質抵抗性に関して選択される。２週間後、安定したプールが作製され、精製されたＴＤＢへの応答に対して評価される。コピー数及び統合を評価するｑＰＣＲ方法が、全ての安定したプールがレポーター構築体に安定して感染することを示すために使用される。これらの実験に基づいて、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦκＢ－ルシフェラーゼ及びＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼの限定希釈液を組成し、単一細胞のクローニング及び単一の安定したレポーター細胞株の作製を可能にする。

【0099】

Ｔ細胞活性化アッセイの開発及び評価：ＴＤＢ媒介性Ｔ細胞活性化の効力を定量化するために、ルシフェラーゼ活性の量が、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦκＢホテルルシフェラーゼエフェクター細胞の集団と共にインキュベートされたＴＤＢ試験試料の複数の希釈液について観察され、標的細胞が、参照ＴＤＢについて観察されるルシフェラーゼ活性と比較される。試験ＴＤＢ試料の相対的効力は、参照ＴＤＢを使用することにより生じる標準曲線から決定される。

【0100】

ＩＩＩ.非細胞系レポーターアッセイ
いくつかの態様では、本発明は、標的抗原及びＴＣＳ（ＣＤ３サブユニット等）の同時ＴＤＢ結合を検出するための非細胞系アッセイを提供し、ＴＤＢの一方の抗原結合断片は、標的抗原に結合し、他方の抗原結合断片は、ＴＣＳに結合する。ＴＤＢの、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体サブユニット（例えば、ＣＤ３サブユニット、例えばＣＤ３ε）、及び標的細胞の表面上に発現した標的抗原への同時結合は、ＴＣＲのクラスタリングをもたらし、Ｔ細胞活性化及び標的細胞の細胞毒性の減損をもたらす。これらの非細胞系アッセイは、Ｔ細胞活性化の代替的測定として機能する。

【0101】

いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＤＢの、標的抗原及びＴＣＳ（ＣＤ３サブユニット等）への同時結合の検出方法を提供し、ＴＤＢの一方の抗原結合断片は、標的抗原上の第１のエピトープに結合し、もう一方の抗原結合断片は、ＴＣＳ上の第２のエピトープに結合し、本方法は、固定化された標的抗原または第１のエピトープを含むその断片、ならびにビオチン及びＴＣＳの複合体または第２のエピトープを含むその断片を使用してＥＬＩＳＡ系架橋結合アッセイを実施することを含む。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは、標的抗原の細胞外部分に局在され、及び／または第２のエピトープは、ＴＣＳの細胞外部分に局在される。

【0102】

いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＤＢの、標的抗原及びＴＣＳ（ＣＤ３サブユニット等）への同時結合の検出方法を提供し、ＴＤＢの一方の抗原結合断片は、標的抗原上の第１のエピトープに結合し、もう一方の抗原結合断片は、ＴＣＳ上の第２のエピトープに結合し、本方法は、ａ）標的抗原または第１のエピトープを含むその断片を固相に固定化することと、ｂ）ＴＤＢを、標的抗原または第１のエピトープを含むその断片とインキュベートし、固相に固定化することと、ｃ）ＴＤＢを、レポーター分子及びＴＣＳの複合体または第２のエピトープを含むその断片（ビオチン－ＴＣＳ複合体）とインキュベートすることと、ｄ）レポーター－ＴＣＳ複合体を、レポーター分子を検出するために必要とされるアクセサリー分子と任意にインキュベートすることと、ｅ）（例えば、洗浄することによって）固相に結合されない分子を除去することと、ｆ）検出剤を用いて固相に結合されるレポーター分子を検出し、それによって、ＴＤＢの、標的抗原及びＴＣＳへの同時結合を検出することと、を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＤＢの、標的抗原及びＴＣＳ（ＣＤ３サブユニット等）への同時結合の検出方法を提供し、ＴＤＢの一方の抗原結合断片は、標的抗原上の第１のエピトープに結合し、もう一方の抗原結合断片は、ＴＣＳ上の第２のエピトープに結合し、本方法は、ａ）標的抗原または第１のエピトープを含むその断片を固相に固定化することと、ｂ）ＴＤＢを、標的抗原または第１のエピトープを含むその断片とインキュベートし、固相に固定化することと、ｃ）ＴＤＢを、ビオチン及びＴＣＳの複合体または第２のエピトープを含むその断片（ビオチン－ＴＣＳ複合体）とインキュベートすることと、ｄ）ビオチン－ＴＣＳ複合体を、ストレプトアビジン－ＨＲＰ複合体とインキュベートすることと、ｅ）（例えば、洗浄することによって）固相に結合されない分子を除去することと、ｆ）検出剤を用いて固相に結合されるＨＲＰを検出し、それによって、ＴＤＢの、標的抗原及びＴＣＳへの同時結合を検出することと、を含む。洗浄ステップは、固体相に結合されない分子を除去するために、インキュベーションステップの間に含まれ得る。いくつかの実施形態では、インキュベーションステップは、独立して、約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、またはそれ以上のうちのいずれかで行われ、これには、これらの値の間の任意の範囲が含まれる。いくつかの実施形態では、ＴＣＳは、ＣＤ３サブユニットである。いくつかの実施形態では、ＣＤ３サブユニットは、ＣＤ３εである。いくつかの実施形態では、標的抗原は、細胞の表面上に発現される。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９α（ＣＤ７９ａ）、ＣＤ７９β（ＣＤ７９ｂ）、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体、ＨＥＲ４受容体、ＦｃＲＨ５、ＣＬＬ１、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、αｖ／β３インテグリン、ＶＥＧＦ、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ－４；プロテインＣ、ＢＲ３、ｃ－ｍｅｔ、組織因子、β７、Ｔｅｎｂ２、ＳＴＥＡＰ、または膜貫通腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは、標的抗原の細胞外部分に局在され、及び／または第２のエピトープは、ＴＣＳの細胞外部分に局在される。

【0103】

いくつかの実施形態では、インキュベーションステップにおいて含まれるＴＤＢは、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約０．０５ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約０．０５ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、または約５ｎｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬのうちの任意の濃度範囲である。

【0104】

いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＤＢの、標的抗原及びＴＣＳ（ＣＤ３サブユニット等）への同時結合の定量化方法を提供し、ＴＤＢの一方の抗原結合断片は、標的抗原上の第１のエピトープに結合し、もう一方の抗原結合断片は、ＴＣＳ上の第２のエピトープに結合し、本方法は、ａ）標的抗原または第１のエピトープを含むその断片を固相に固定化することと、ｂ）ＴＤＢを、標的抗原または第１のエピトープを含むその断片とインキュベートし、固相に固定化することと、ｃ）ＴＤＢを、レポーター及びＴＣＳの複合体または第２のエピトープを含むその断片（例えば、ビオチン－ＴＣＳ複合体）とインキュベートすることと、ｄ）レポーター－ＴＣＳ複合体を、アクセサリーレポーター分子と任意にインキュベートすることと、ｅ）（例えば、洗浄することによって）固相に結合されない分子を除去することと、ｆ）検出剤を用いて固相に結合されるレポーターを検出することと、ｇ）参照ＴＤＢを用いて作製される標準物と検出剤のシグナル強度を比較することによって、ＴＤＢの相対的効力を決定することと、を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＤＢの、標的抗原及びＴＣＳ（ＣＤ３サブユニット等）への同時結合の定量化方法を提供し、ＴＤＢの一方の抗原結合断片は、標的抗原上の第１のエピトープに結合し、もう一方の抗原結合断片は、ＴＣＳ上の第２のエピトープに結合し、本方法は、ａ）標的抗原または第１のエピトープを含むその断片を固相に固定化することと、ｂ）ＴＤＢを、標的抗原または第１のエピトープを含むその断片とインキュベートし、固相に固定化することと、ｃ）ＴＤＢを、ＴＣＳまたは第２のエピトープを含むその断片（ビオチン－ＴＣＳ複合体）とインキュベートすることと、ｄ）ビオチン－ＴＣＳ複合体を、ストレプトアビジン－ＨＲＰ複合体とインキュベートすることと、ｅ）（例えば、洗浄することによって）固相に結合されない分子を除去することと、ｆ）検出剤を用いて固相に結合されるＨＲＰを検出することと、ｇ）参照ＴＤＢを用いて作製される標準物と検出剤のシグナル強度を比較することによって、ＴＤＢの相対的効力を決定することと、を含む。いくつかの実施形態では、シグナル強度の比較は、ＴＤＢ及び参照ＴＤＢのそれぞれについて用量応答曲線を作製することと、曲線から生じるＥＣ_５０値の間の比を決定することと、を含む。洗浄ステップは、固体相に結合されない分子を除去するために、インキュベーションステップの間に含まれ得る。いくつかの実施形態では、インキュベーションステップは、独立して、約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、またはそれ以上のうちのいずれかで行われ、これには、これらの値の間の任意の範囲が含まれる。いくつかの実施形態では、ＴＣＳは、ＣＤ３サブユニットである。いくつかの実施形態では、ＣＤ３サブユニットは、ＣＤ３εである。いくつかの実施形態では、標的抗原は、細胞の表面上に発現される。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９α（ＣＤ７９ａ）、ＣＤ７９β（ＣＤ７９ｂ）、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体、ＨＥＲ４受容体、ＦｃＲＨ５、ＣＬＬ１、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、αｖ／β３インテグリン、ＶＥＧＦ、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ－４；プロテインＣ、ＢＲ３、ｃ－ｍｅｔ、組織因子、β７、Ｔｅｎｂ２、ＳＴＥＡＰ、または膜貫通腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。いくつかの実施形態では、第１のエピトープは、標的抗原の細胞外部分に局在され、及び／または第２のエピトープは、ＴＣＳの細胞外部分に局在される。

【0105】

いくつかの実施形態では、インキュベーションステップにおいて含まれるＴＤＢは、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約０．０５ｎｇ／ｍＬ、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約０．０５ｎｇ／ｍＬ、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、または約５ｎｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬのうちの任意の濃度範囲である。

【0106】

いくつかの実施形態では、参照ＴＤＢからの標準曲線は、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬの範囲の複数の濃度で参照ＴＤＢをインキュベーションすることにより生じる。いくつかの実施形態では、複数の濃度の参照ＴＤＢには、約０．０１ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、または５００μｇ／ｍＬのうちのいずれか１つが含まれる。いくつかの実施形態では、複数の濃度の精製した参照ＴＤＢは、約３、４、５、６、７、８、９、１０倍、または１０倍を超える濃度である。

【0107】

ＩＶ.キット
本発明のいくつかの態様では、キットまたは製品は、標的抗原結合断片及びＴＣＳ結合断片（ＣＤ３結合断片等）を含むＴＤＢを含む様々な方法で用いるために提供され、本明細書に記載のＴ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーに作動可能に連結したレポーターをコードする核酸を含む操作されたＴ細胞を含む組成物を保持する容器を備え、任意に、その使用のための取扱説明書を提供する。いくつかの実施形態では、キットは、参照ＴＤＢアッセイ標準物（既知の濃度の精製したＴＤＢ）を保持する容器、及び／またはＴＤＢ対照物を保持する容器をさらに備える。いくつかの実施形態では、キットは、標的抗原を発現する標的細胞を含む組成物を保持する容器をさらに備える。いくつかの実施形態では、レポーターは、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ、またはベータガラクトシダーゼである。いくつかの実施形態では、ルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、またはナノシフェラーゼである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーは、ＮＦＡＴプロモーター、ＡＰ－１プロモーター、ＮＦκＢプロモーター、ＦＯＸＯプロモーター、ＳＴＡＴ３プロモーター、ＳＴＡＴ５プロモーター、またはＩＲＦプロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化に応答するプロモーター及び／またはエンハンサーは、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１、ＮＦκＢ、ＦＯＸＯ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、及びＩＲＦのうちの任意の１つ以上からのＴ細胞活性化応答要素を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ８^＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞またはＣＴＬＬ－２ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＴＣＳ結合断片は、ＣＤ３結合断片である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合断片は、ＣＤ３ε結合断片である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、標的細胞の表面上に発現される。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９α（ＣＤ７９ａ）、ＣＤ７９β（ＣＤ７９ｂ）、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体、ＨＥＲ４受容体、ＦｃＲＨ５、ＣＬＬ１、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、αｖ／β３インテグリン、ＶＥＧＦ、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ－４；プロテインＣ、ＢＲ３、ｃ－ｍｅｔ、組織因子、β７、Ｔｅｎｂ２、ＳＴＥＡＰ、または膜貫通腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。いくつかの実施形態では、ａ）標的抗原はＨＥＲ２受容体であり、標的細胞はＢＴ－４７４細胞であるか、ｂ）標的抗原は、ＨＥＲ２受容体であり、標的細胞はＳＫＢＲ３細胞であるか、ｃ）標的抗原はＣＤ２０であり、標的細胞はＷｉｌ２－Ｓ細胞であるか、またはｄ）標的抗原はＣＤ７９ｂであり、標的細胞はＢＪＡＢ細胞である。容器は、製剤を保持し、容器上または容器と関連したラベルは、使用法を示し得る。製品は、他の緩衝液、希釈剤、培養容器、レポーター分子を検出するための試薬、及び使用説明書を含む添付文書含む、商業的及び使用者の視点から望ましい他の材料をさらに含み得る。

【0108】

本発明のいくつかの態様では、ＴＣＳ（ＣＤ３サブユニット等）を含む組成物またはその断片を含み、ビオチンと複合され、組成物を保持する容易器を含むキットまたは製品が、提供され、任意にその使用説明書を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＣＳは、ＣＤ３サブユニットである。いくつかの実施形態では、ＣＤ３サブユニットは、ＣＤ３εである。いくつかの実施形態では、キットは、標的抗原またはその断片をさらに提供する。いくつかの実施形態では、標的抗原は、細胞の表面上に発現される。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９α（ＣＤ７９ａ）、ＣＤ７９β（ＣＤ７９ｂ）、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体、ＨＥＲ４受容体、ＦｃＲＨ５、ＣＬＬ１、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、αｖ／β３インテグリン、ＶＥＧＦ、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ－４；プロテインＣ、ＢＲ３、ｃ－ｍｅｔ、組織因子、β７、Ｔｅｎｂ２、ＳＴＥＡＰ、または膜貫通腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。いくつかの実施形態では、キットは、参照ＴＤＢアッセイ標準物（既知の濃度の精製したＴＤＢ）及び／またはＴＤＢ対照をさらに提供する。容器は、製剤を保持し、容器上または容器と関連したラベルは、使用法を示し得る。製品は、他の緩衝液、希釈剤、培養容器、レポーター分子を検出するための試薬、及び使用説明書を含む添付文書含む、商業的及び使用者の視点から望ましい他の材料をさらに含み得る。

【0109】

ＶＩ．ポリペプチド
本明細書に記載の方法を使用して分析されるポリペプチドは、概して、組換え技法を使用して産生される。組換えタンパク質を産生するための方法が、例えば、米国特許第５，５３４，６１５号及び同第４，８１６，５６７号に記載され、具体的には、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、対象となるタンパク質は、ＣＨＯ細胞内に産生される（例えば、ＷＯ ９４／１１０２６を参照のこと）。いくつかの実施形態では、対象となるポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞内に産生される。例えば、発現及び分泌を最適化するための翻訳開始領域（ＴＩＲ）及びシグナル配列を説明している、米国特許第５，６４８，２３７号、米国特許第５，７８９，１９９号、及び米国特許第５，８４０，５２３号を参照のこと。また、Ｅ．ｃｏｌｉにおける抗体断片の発現を説明している、Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐｐ．２４５－２５４も参照のこと。組換え技法を使用する場合、ポリペプチドは、細胞内に、ペリプラズム空間に産生され得るか、または培地に直接分泌され得る。

【0110】

ポリペプチドは、培養培地または宿主細胞溶解物から回収され得る。ポリペプチドの発現に用いられる細胞は、様々な物理的または化学的手段、例えば、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤によって破壊され得る。ポリペプチドが細胞内に産生される場合、第１のステップとして、粒子状残屑、宿主細胞、または溶解された断片のいずれかが、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．,Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０： １６３－１６７（１９９２）は、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム空間に分泌されるポリペプチドを単離するための手順を説明している。簡潔には、細胞ペーストが、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で、約３０分にわたって解凍される。細胞残屑は、遠心分離により除去され得る。ポリペプチドが培地に分泌される場合、かかる発現系由来の上清は、一般に、市販のポリペプチド濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して最初に濃縮される。ＰＭＳＦ等のプロテアーゼ阻害剤を、タンパク質分解を阻害するために前述のステップのうちのいずれかに含まれてもよく、抗生物質を付随的混入物質の成長を阻止するために含まれてもよい。

【0111】

いくつかの実施形態では、ポリペプチド及び１つ以上の混入物質を含む組成物中のポリペプチドは、本発明の方法により分析前に精製または部分的に精製されている。例えば、方法のポリペプチドは、親和性クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーからの溶離液中にある。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、プロテインＡクロマトグラフィーからの溶離液中にある。

【0112】

本発明の方法によって分析され得るポリペプチドの例としては、免疫グロブリン、イムノアドヘシン、抗体、酵素、ホルモン、融合タンパク質、Ｆｃ含有タンパク質、免疫複合体、サイトカイン、及びインターロイキンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0113】

（Ａ）抗体
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドを分析する方法のうちのいずれかで使用するためのポリペプチド及び本明細書に記載される方法によってポリペプチドを含む製剤は、抗体である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｔ細胞依存性二重特異性（ＴＤＢ）抗体である。

【0114】

抗体の分子標的としては、ＣＤタンパク質及びそれらのリガンドが挙げられ、例えば、（ｉ）ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９α（ＣＤ７９ａ）、及びＣＤ７９β（ＣＤ７９ｂ）、（ｉｉ）ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４受容体等のＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバー、（ｉｉｉ）細胞接着分子、例えばＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０，９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、及びαｖ／β３インテグリン（それらのアルファもしくはベータサブユニット（例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、もしくは抗ＣＤ１１ｂ抗体）のいずれかを含む）、（ｉｖ）ＶＥＧＦ、ＩｇＥ、血液型抗原、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体、肥満（ＯＢ）受容体、ｍｐｌ受容体、ＣＴＬＡ－４、プロテインＣ、ＢＲ３、ｃ－ｍｅｔ、組織因子、β７等の成長因子、（ｖ）米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるもの等の細胞表面及び膜貫通腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、ならびに（ｖｉ）ＦｃＲＨ５、ＬｙＰＤ１、ＴｅｎＢ２、及びＳＴＥＡＰ等の他の標的等であるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗体は、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３抗体である。例示的な二重特異性抗体を、表１に提供する。
表１．例示的な抗体

【0115】

他の例示的な抗体としては、抗エストロゲン受容体抗体、抗プロゲステロン受容体抗体、抗ｐ５３抗体、抗ＨＥＲ－２／ｎｅｕ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗カテプシンＤ抗体、抗Ｂｃｌ－２抗体、抗Ｅ－カドヘリン抗体、抗ＣＡ１２５抗体、抗ＣＡ１５－３抗体、抗ＣＡ１９－９抗体、抗ｃ－ｅｒｂＢ－２抗体、抗Ｐ－糖タンパク質抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗網膜芽細胞腫タンパク質抗体、抗ｒａｓ癌タンパク質抗体、抗ルイスＸ抗体、抗Ｋｉ－６７抗体、抗ＰＣＮＡ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ５抗体、抗ＣＤ７抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ９／ｐ２４抗体、抗ＣＤ１０抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ＣＤ１３抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１５抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３５抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ４１抗体、抗ＬＣＡ／ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、抗ＣＤ３９抗体、抗ＣＤ１００抗体、抗ＣＤ９５／Ｆａｓ抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＣＤ１０６抗体、抗ユビキチン抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ｃ－ｍｙｃ抗体、抗サイトケラチン抗体、抗ビメンチン抗体、抗ＨＰＶタンパク質抗体、抗カッパ軽鎖抗体、抗ラムダ軽鎖抗体、抗メラノソーム抗体、抗前立腺特異抗原抗体、抗Ｓ－１００抗体、抗タウ抗原抗体、抗フィブリン抗体、抗ケラチン抗体、抗ＴｅｂＢ２抗体、抗ＳＴＥＡＰ抗体、及び抗Ｔｎ－抗原抗体から選択されるものが挙げられるが、これらに限定されない。

【0116】

（ｉ）モノクローナル抗体
いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、実質的に同種の抗体の集団から得られ、すなわち、その集団に含まれる個々の抗体は、同一であり、及び／または同じエピトープに結合するが、モノクローナル抗体の産生中に生じる想定される変異体は除外され、かかる変異体は、概して、少量で存在する。したがって「モノクローナル」という修飾語は、個別のまたはポリクローナル抗体の混合物ではないような抗体の特徴を示す。

【0117】

例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．,Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されるハイブリドーマ法により作製されてもよいし、組換えＤＮＡ法によって作製されてもよい（米国特許第４，８１６，５６７号）。

【0118】

ハイブリドーマ法において、マウス、またはハムスター等の他の適切な宿主動物が、本明細書に記載されるように免疫化されて、免疫化のために使用されるポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生するか、または産生することができるリンパ球が誘発される。代替として、リンパ球は、インビトロで免疫化され得る。次いで、ポリエチレングリコール等の適した融剤を用いてリンパ球を骨髄腫細胞と融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ,Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ,ｐｐ.５９－１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ,１９８６））。

【0119】

このように調製されたハイブリドーマ細胞は、播種され、非融合の親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を好ましくは含有する好適な培養培地で成長する。例えば、親骨髄腫細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻止する。

【0120】

いくつかの実施形態では、骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体産生を支援し、ＨＡＴ培地等の培地に感受性を示すものである。これらの中で、いくつかの実施形態では、骨髄腫細胞株は、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ－２１及びＭＰＣ－１１マウス腫瘍、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ＵＳＡから入手可能なＳＰ－２またはＸ６３－Ａｇ８－６５３細胞に由来するもの等のマウス骨髄腫株である。ヒト骨髄腫及びマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の産生について説明されている（Ｋｏｚｂｏｒ,Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.１３３：３００１ （１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．,Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｐｐ.５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ,Ｉｎｃ．,Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ,１９８７））。

【0121】

ハイブリドーマ細胞が成長する培養培地は、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。いくつかの実施形態では、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、または放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等のインビトロ結合アッセイによって測定される。

【0122】

モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．,Ａｎａｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０（１９８０）のスキャチャード分析によって測定され得る。

【0123】

所望の特異性、親和性、及び／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が特定された後、クローンは、限界希釈手順によってサブクローン化され、標準的な方法によって成長され得る（Ｇｏｄｉｎｇ,Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｐｐ.５９－１０３ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ,１９８６））。この目的に好適な培養培地には、例えば、Ｄ－ＭＥＭまたはＲＰＭＩ－１６４０培地が含まれる。加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物における腹水腫瘍としてインビボで成長し得る。

【0124】

サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、ポリペプチドＡ－セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または親和性クロマトグラフィー等によって、培養培地、腹水、または血清から好適に分離される。

【0125】

モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離及び配列決定される。いくつかの実施形態では、ハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの供給源としての機能を果たす。一旦単離されると、ＤＮＡは発現ベクター内に配置され得、次いで、宿主細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞等にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞内のモノクローナル抗体の合成体が得られる。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現に関する概説論文には、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．,Ｃｕｒｒ.Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ.５：２５６－２６２（１９９３）、及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ.Ｒｅｖｓ．,１３０：１５１－１８８（１９９２）が含まれる。

【0126】

さらなる一実施形態では、抗体または抗体断片は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．,Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４（１９９０）に記載される技法を使用して作製された抗体ファージライブラリーから単離され得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．,Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．,Ｊ.Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９１）は、それぞれ、ファージライブラリーを使用したマウス及びヒト抗体の単離を記載する。その後の刊行物は、非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略として、鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．,Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９－７８３ （１９９２））、ならびに組み合わせ感染及びインビボ組換えによる高い親和性（ｎＭ範囲）のヒト抗体の産生を記載する（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．,Ｎｕｃ.Ａｃｉｄｓ.Ｒｅｓ．２１：２２６５－２２６６（１９９３））。したがって、これらの技法は、モノクローナル抗体を単離するための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技法の実行可能な代替法である。

【0127】

ＤＮＡはまた、例えば、コード配列を、相同的なマウス配列の代わりに、ヒトの重及び軽鎖の定常ドメインに置換することによるか（米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．,Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１（１９８４））、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てもしくは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合することにより修飾されてもよい。

【0128】

典型的には、かかる非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインの代わりに置換されるか、またはそれらが、抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置換されて、抗原に対して特異性を有する１つの抗原結合部位、及び異なる抗原に対して特異性を有する別の抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作製する。

【0129】

本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭである。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧモノクローナル抗体である。

【0130】

（ｉｉ）ヒト化抗体
いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野で記載されている。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、非ヒトである源からそれに導入される１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は、本質的には、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者らの方法（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．,Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．,Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．,Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－１５３６（１９８８））に従って、超可変領域配列をヒト抗体の対応する配列に置換することによって行うことができる。したがって、このような「ヒト化」抗体は、実質的に無傷ヒト可変ドメインより少ない部分が、非ヒト種からの対応する配列により置換されているキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかの超可変領域残基、かつ場合によってはいくつかのＦＲ残基が、齧歯類抗体中の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。

【0131】

ヒト化抗体を作製するのに使用される軽及び重の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減するのに非常に重要である。いわゆる「最良適合」法に従って、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変－ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。次いで、齧歯類の配列に最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）として許容する（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．,Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.１５１：２２９６（１９９３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．,Ｊ.Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７））。別の方法は、軽または重鎖可変領域の特定の下位群の全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するの特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークが、いくつかの異なるヒト化抗体のために使用され得る（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．,Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５（１９９２）、Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．,Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.１５１：２６２３（１９９３））。

【0132】

抗体が、抗原に対する高親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持してヒト化されることがさらに重要である。この目標を達成するために、本方法のいくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用した、親配列及び様々な概念上のヒト化産生物の分析プロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に、利用可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定される三次元立体配座構造を例示及び表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらのディスプレイの精査は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性の高い役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響する残基の分析を可能にする。このように、標的抗原（複数可）に対する増加した親和性等の所望の抗体特徴が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わされ得る。概して、超可変領域残基は、抗原結合への影響に直接的に、かつ最も実質的に関与している。

【0133】

（ｉｉｉ）ヒト抗体
いくつかの実施形態では、抗体はヒト抗体である。ヒト化の代替物として、ヒト抗体が生成され得る。例えば、免疫化すると内因性免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体の完全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を産生することが現在では可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（Ｊ_Ｈ）遺伝子のホモ接合欠失が、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。かかる生殖系突然変異マウスにおけるヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子アレイの導入は、抗原攻撃に際してヒト抗体の産生をもたらす。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．,Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．,Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５－２５８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．,Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ.７：３３（１９９３）、ならびに米国特許第５，５９１，６６９号、同第５，５８９，３６９号、及び同第５，５４５，８０７号を参照のこと。

【0134】

あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．,Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５３（１９９０））は、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、ヒト抗体及び抗体断片をインビトロで産生するために使用することができる。この技法によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３またはｆｄ等の糸状バクテリオファージの主要または非主要なコートポリペプチド遺伝子中にインフレームでクローン化され、ファージ粒子の表面上に機能的抗体断片として提示させる。糸状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能的特性に基づく選択により、それらの特性を呈する抗体をコードする遺伝子の選択ももたらされる。したがって、ファージは、Ｂ細胞のいくつかの特性を模倣する。ファージディスプレイは、種々のフォーマットで行うことができる；それらの概説については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ,Ｋｅｖｉｎ Ｓ.ａｎｄ Ｃｈｉｓｗｅｌｌ,Ｄａｖｉｄ Ｊ．,Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：５６４－５７１（１９９３）を参照のこと。Ｖ－遺伝子セグメントのいくつかの源は、ファージディスプレイのために使用することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．,Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）は、免疫化マウスの膵臓に由来するＶ遺伝子の小規模なランダムコンビナトリアルライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の多種多様なアレイを単離した。非免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーは、構築され得、多種多様な抗原（自己抗原を含む）に対する抗体は、本質的には、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．,Ｊ.Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９１）、またはＧｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａｌ．,ＥＭＢＯ Ｊ.１２：７２５－７３４（１９９３）によって記載される技術に従って単離することができる。米国特許第５，５６５，３３２号及び同第５，５７３，９０５号も参照のこと。

【0135】

また、ヒト抗体は、インビトロ活性化Ｂ細胞により生じ得る（米国特許第５，５６７，６１０号及び同第５，２２９，２７５号を参照のこと）。

【0136】

（ｉｖ）抗体断片
いくつかの実施形態では、抗体は、抗体断片である。抗体断片を産生するための様々な技法が開発されている。従来、これらの断片は、無傷抗体のタンパク質分解消化により得られた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．,Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７－１１７（１９９２）及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．,Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１（１９８５）を参照のこと）。しかしながら、これらの断片は、現在、組換え宿主細胞により直接産生され得る。例えば、抗体断片は、上記で考察される抗体ファージライブラリーから単離され得る。あるいは、Ｆａｂ’－ＳＨ断片は、Ｅ.ｃｏｌｉから直接回収され、化学的にカップリングして、Ｆ（ａｂ’）_２断片を形成し得る（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．,Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３－１６７（１９９２））。別のアプローチによると、Ｆ（ａｂ’）_２断片は、組換え宿主細胞培養物から直接単離され得る。抗体断片を産生するための他の技法が、当業者に明らかである。他の実施形態では、最適な抗体は、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ ９３／１６１８５、米国特許第５，５７１，８９４号、及び米国特許第５，５８７，４５８号を参照のこと。抗体断片は、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されるように、「線状抗体」でもあり得る。かかる線状抗体断片は、単一特異性または二重特異性であり得る。

【0137】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体の断片が提供される。いくつかの実施形態では、抗体断片は、抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、及びダイアボディからなる群から選択される。

【0138】

（ｖ）二重特異性抗体
いくつかの実施形態では、抗体は二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、２つの異なるエピトープに結合し得る。あるいは、二重特異性抗体結合アームは、細胞に対する細胞防御機序に集中するために、白血球上のトリガリング分子、例えばＴ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２もしくはＣＤ３）、またはＩｇＧ（ＦｃγＲ）に対するＦｃ受容体、例えばＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に結合するアームと組合され得る。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）_２二重特異性抗体）として調製され得る。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｔ細胞依存性二重特異性（ＴＤＢ）抗体である。いくつかの実施形態では、ＴＤＢは、標的抗原結合断片及びＴ細胞受容体結合断片を含む。いくつかの実施形態では、ＴＤＢは、標的抗原結合断片及びＣＤ３結合断片を含む。いくつかの実施形態では、ＴＤＢは、標的抗原結合断片及びＣＤ３ε結合断片を含む。

【0139】

二重特異性抗体の作製方法が、当該技術分野で既知である。完全長二重特異性抗体の従来の産生は、２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の共発現に基づき、これらの２つの鎖は、異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．,Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７－５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな組み合わせのため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）が１０個の異なる抗体分子の混合物を産生する可能性があり、それらのうちの１つのみが正しい二重特異性構造を有する。通常は親和性クロマトグラフィーステップにより行われる正しい分子の精製は、やや煩雑であり、生成物収率は低い。同様の手順が、ＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５－３６５９（１９９１）に記載されている。

【0140】

異なるアプローチに従って、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体－抗原結合部位）が免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。いくつかの実施形態では、融合は、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。いくつかの実施形態では、軽鎖結合に必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）は、融合物のうちの少なくとも１つに存在する。免疫グロブリン重鎖融合物と、所望の場合、免疫グロブリン軽鎖とをコードするＤＮＡは、別個の発現ベクターに挿入され、好適な宿主生物に共トランスフェクトされる。これにより、構築に使用される３つのポリペプチド鎖の不等比が最適収率をもたらす実施形態では、３つのポリペプチド断片の相互比率の調整において優れた柔軟性が提供される。しかしながら、等比での少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現により高収率がもたらされる場合、またはそれらの比が特に重要ではない場合に、２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。

【0141】

このアプローチのいくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、一方のアームにある第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、及び他方のアームにある（第２の結合特異性を提供する）ハイブリッド免疫グロブリン重鎖－軽鎖対からなる。二重特異性分子の半分のみにおける免疫グロブリン軽鎖の存在が分離の容易な方法を提供するため、この非対称構造が、所望の二重特異性化合物の望ましくない免疫グロブリン鎖組み合わせからの分離を容易にすることが見出された。このアプローチは、ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体の生成のさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．,Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０（１９８６）を参照のこと。

【0142】

米国特許第５，７３１，１６８号に記載される別のアプローチに従って、一対の抗体分子間の界面が操作されて、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の割合を最大にすることができる。いくつかの実施形態では、界面は、抗体定常ドメインのＣ_Ｈ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面からの１つ以上の小さいアミノ酸側鎖は、より大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えられる。大型側鎖（単数または複数）と同一のまたは類似のサイズの代償性「キャビティ」が、大型アミノ酸側鎖をより小さなもの（例えばアラニンまたはトレオニン）に取り替えることにより、第２の抗体分子の界面上に作製される。これは、ホモ二量体等の他の望ましくない最終産物を上回るヘテロ二量体の収率を増大するための機序を提供する。

【0143】

二重特異性抗体としては、架橋または「ヘテロコンジュゲート」抗体が挙げられる。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体のうちの一方がアビジンにカップリングし得、他方がビオチンにカップリングし得る。かかる抗体は、例えば、望ましくない細胞に対して免疫系細胞の標的とするために（米国特許第４，６７６，９８０号）、かつＨＩＶ感染を治療するために（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、及びＥＰ０３０８９）提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋方法を使用して作製され得る。好適な架橋剤が当該技術分野で周知であり、いくつかの架橋技法とともに米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。

【0144】

抗体断片から二重特異性抗体を生成するための技法もこの文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を使用して調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．,Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１（１９８５）は、無傷抗体がタンパク質分解的に切断されてＦ（ａｂ’）_２断片が生成される手順を記載している。これらの断片は、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元されて、隣接ジチオールを安定させ、分子間ジスルフィド形成を阻止する。次いで、生成されたＦａｂ’断片は、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。Ｆａｂ’－ＴＮＢ誘導体のうちの１つが、メルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’－チオールに再変換され、等モル量の他のＦａｂ’－ＴＮＢ誘導体と混合されて、二重特異性抗体が形成される。産生された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用され得る。

【0145】

二重特異性抗体断片を組換え細胞培養物から直接作製及び単離するための様々な技法についても記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して産生されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．,Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.１４８（５）：１５４７－１５５３（１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドが、遺伝子融合により２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結された。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元して単量体を形成し、その後、再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法は、抗体ホモ二量体の産生にも利用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．,Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８（１９９３）により記載される「ダイアボディ」技法は、二重特異性抗体断片を作製するための代替的機序を提供している。断片は、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーにより軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）に接続した重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含む。したがって、１つの断片のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインは、別の断片の相補的なＶ_Ｌ及びＶ_Ｈドメインと対合させられ、それにより、２つの抗原結合部位が形成される。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用して二重特異性抗体断片を作製するための別の戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．,Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。

【0146】

２より大きい力価を有する抗体が企図される。例えば、三重特異性抗体が調製され得る。Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ.１４７：６０（１９９１）。

【0147】

（ｖ）多価抗体
いくつかの実施形態では、抗体は、多価抗体である。多価抗体は、その抗体が結合する抗原を発現する細胞によって、二価抗体よりも速く内部移行（及び／または異化）され得る。本明細書に提供される抗体は、３つ以上の抗原結合部位を有する（ＩｇＭクラス以外の）多価抗体（例えば、四価抗体）とすることができ、これは、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現によって容易に産生することができる。多価抗体は、二量体化ドメイン、及び３つ以上の抗原結合部位を含むことができる。好ましい二量体化ドメインは、Ｆｃ領域またはヒンジ領域を含む（またはそれらからなる）。このシナリオでは、抗体は、Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端側に３つ以上の抗原結合部位とを含む。本明細書において好ましい多価抗体は、３つ～約８つ、しかし好ましくは４つの抗原結合部位を含む（またはそれらからなる）。多価抗体は、少なくとも１つのポリペプチド鎖（好ましくは２つのポリペプチド鎖）を含み、このポリペプチド鎖（複数可）は、２つ以上の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖（複数可）は、ＶＤ１－（Ｘ１）ｎ－ＶＤ２－（Ｘ２）ｎ－Ｆｃを含み得、ここで、ＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域の１つのポリペプチド鎖であり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸またはポリペプチドを表し、ｎは０または１である。例えば、ポリペプチド鎖（複数可）は、ＶＨ－ＣＨ１－可動性リンカー－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ領域鎖、またはＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ領域鎖を含んでもよい。本明細書における多価抗体は、好ましくは少なくとも２つ（また好ましくは４つ）の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに含む。本明細書における多価抗体は、例えば、約２つ～約８つの軽鎖可変ドメインポリペプチドを含んでもよい。本明細書に企図される軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、任意に、ＣＬドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、多価抗体は、Ｔ細胞結合断片を含む。いくつかの実施形態では、多価抗体は、Ｔ細胞受容体結合断片を含む。いくつかの実施形態では、多価抗体は、ＣＤ３結合断片を含む。いくつかの実施形態では、多価抗体は、ＣＤ３ε結合断片を含む。

【0148】

いくつかの実施形態では、抗体は、多重特異性抗体である。多重特異性抗体の例としては、重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含みＶ_ＨＶ_Ｌ単位がポリエピトープ特異性を有する抗体、２つ以上のＶ_Ｌ及びＶ_Ｈドメインを有し各Ｖ_ＨＶ_Ｌ単位が異なるエピトープに結合する抗体、２つ以上の単一可変ドメインを有し各単一可変ドメインが異なるエピトープに結合する抗体、完全長抗体、抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、トリアボディ、三重機能性抗体、共有結合している抗体断片または共有結合していない抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、その抗体は、ポリエピトープ特異性、例えば、同じまたは異なる標的（複数可）上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を有する。いくつかの実施形態では、その抗体は、単一特異性、例えば、１つのエピトープにのみ結合する抗体である。一実施形態によれば、多重特異性抗体は、５μＭ～０．００１ｐＭ、３μＭ～０．００１ｐＭ、１μＭ～０．００１ｐＭ、０．５μＭ～０．００１ｐＭ、または０．１μＭ～０．００１ｐＭの親和性で各エピトープに結合するＩｇＧ抗体である。

【0149】

（ｖｉ）他の抗体修飾
例えば、抗体の抗原依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）及び／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を増強するために、エフェクター機能に関して本明細書に提供される抗体を修飾することが望ましい場合がある。これは、１つ以上のアミノ酸置換を抗体のＦｃ領域内に導入することによって達成され得る。あるいはまたは加えて、システイン残基（複数可）は、Ｆｃ領域内に導入され得、それにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にする。このように生成されたホモ二量体抗体は、改善された内部移行能力、ならびに／または増加した補体媒介性細胞殺滅及び抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．,Ｊ.Ｅｘｐ Ｍｅｄ.１７６：１１９１－１１９５（１９９２）及びＳｈｏｐｅｓ,Ｂ.Ｊ．,Ｉｍｍｕｎｏｌ.１４８：２９１８－２９２２（１９９２）を参照のこと。増強された抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体はまた、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．,Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：２５６０－２５６５（１９９３）に記載される、ヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製され得る。あるいは、二重Ｆｃ領域を有し、それにより、増強された補体溶解及びＡＤＣＣ能力を有し得る、抗体を操作することができる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．,Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ３：２１９－２３０（１９８９）を参照のこと。

【0150】

抗体の血清半減期を増大するために、アミノ酸代替物が、ＵＳ ２００６／００６７９３０に記載される抗体において作製され得、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0151】

（Ｂ）ポリペプチド変異体及び修飾
本明細書に記載の抗体を含むポリペプチドのアミノ酸配列修飾（複数可）が、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、抗体）を精製する方法で使用され得る。

【0152】

（ｉ）変異体ポリペプチド
「ポリペプチド変異体」とは、ポリペプチドの完全長天然配列、シグナルペプチドを欠くポリペプチド配列、シグナルペプチドを有するかまたは有しないポリペプチドの細胞外ドメインと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する本明細書に定義されるポリペプチド、好ましくは活性ポリペプチドを意味する。かかるポリペプチド変異体としては、例えば、１つ以上のアミノ酸残基が完全長天然アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に付加または欠失されたポリペプチドが挙げられる。通常、ＴＡＴポリペプチド変異体は、完全長天然配列ポリペプチド配列、シグナルペプチドを欠くポリペプチド配列、シグナルペプチドを有するかまたは有しないポリペプチドの細胞外ドメインと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％のうちの任意のアミノ酸配列同一性を有する。通常、変異体ポリペプチドは、天然ポリペプチド配列と比較して１つ以下の保存的アミノ酸置換を有し、あるいは天然ポリペプチド配列と比較して約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０個のうちの任意の以下の保存的アミノ酸置換を有する。

【0153】

変異体ポリペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端で切断され得るか、または例えば、全長天然ポリペプチドと比較して、内部残基を欠き得る。ある特定の変異体ポリペプチドは、所望の生物学的活性にとって不可欠ではないアミノ酸残基を欠き得る。切断、欠失、及び挿入を有するこれらの変異体ポリペプチドは、いくつかの従来の技法のうちのいずれかによって調製され得る。所望の変異体ポリペプチドは、化学的に合成されたものであり得る。別の好適な技法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって所望の変異体ポリペプチドをコードする核酸断片の単離及び増幅することを伴う。核酸断片の所望の末端を定義するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲにおいて５’プライマー及び３’プライマーで用いられる。好ましくは、変異体ポリペプチドは、本明細書に開示される天然ポリペプチドと少なくとも１つの生物学的及び／または免疫学的活性を共有する。

【0154】

アミノ酸配列挿入には、長さが１残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドの範囲であるアミノ末端及び／またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ－末端メチオニル残基を有する抗体、または細胞毒性ポリペプチドに融合した抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体としては、抗体の血清半減期を増大する酵素またはポリペプチドへの抗体のＮ末端またはＣ末端の融合が挙げられる。

【0155】

例えば、ポリペプチドの結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。ポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変化を抗体核酸に導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。かかる修飾としては、例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／またはそれへの挿入、及び／またはその置換が挙げられる。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、最終構築物に到達するためになされるが、但し、最終構築物が所望の特徴を有することを条件とする。アミノ酸変化は、ポリペプチド（例えば、抗体）の翻訳後プロセスも改変することができ、例えば、グリコシル化部位の数または位置を変化することができる。

【0156】

どのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を及ぼすことなく挿入、置換、または欠失され得るかを決定する際の手引きは、ポリペプチドの配列を同種の既知のポリペプチド分子の配列と比較し、かつ相同性の高い領域のアミノ酸配列変化の数を最小限に抑えることによって見出され得る。

【0157】

変異誘発の好ましい位置であるポリペプチド（例えば、抗体）のある特定の残基または領域の特定に有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１－１０８５（１９８９）によって説明される「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。ここで、残基または標的残基群（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕ等の荷電残基）が特定され、中性または負に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）に置き換えられて、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を及ぼす。次いで、置換に対する機能的感受性を実証するアミノ酸位置は、さらなるまたは他の変異体を置換部位に、またはそこの代わりに導入することにより洗練される。したがって、アミノ酸配列変異を導入するための部位が予め決定されている一方で、変異自体の性質は予め決定される必要はない。例えば、所与の部位での突然変異の性能を分析するために、ａｌａスキャニングまたはランダム突然変異生成が標的コドンまたは領域で実行され、発現された抗体変異体が所望の活性に関して選別される。

【0158】

別の種類の変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、異なる残基に置き換えられた抗体分子内に少なくとも１つのアミノ酸残基を有する。置換変異誘発に関する最も関心ある部位としては、超可変領域が挙げられるが、ＦＲ改変も企図される。保存的置換が、「例示的な置換」という見出しで以下の表２に示される。かかる置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表２に「置換」と表示されるか、またはアミノ酸クラスを参照して以下にさらに記載されるより実質的な変化が導入され、産物がスクリーニングされ得る。
表２．

【0159】

ポリペプチドの生物学的特性の実質的な修飾は、（ａ）置換領域中のポリペプチド骨格の構造、例えば、シートもしくは螺旋立体配座、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルク、を維持するそれらの効果において大いに異なる置換を選択することによって達成される。アミノ酸は、それらの側鎖の特性の類似性に従って群分けされ得る（Ａ.Ｌ.Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ,Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｓｅｃｏｎｄ ｅｄ．,ｐｐ.７３－７５,Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ,Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５））：
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）

【0160】

あるいは、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて群分けされ得る。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ

【0161】

非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。

【0162】

抗体の適切な立体配座の維持に関与しない任意のシステイン残基も概してセリンで置換されて、分子の酸化的安定性が改善され、異常な架橋が阻止され得る。逆に、システイン結合（複数可）がポリペプチドに付加されて、その安定性を改善することができる（具体的には、抗体がＦｖ断片等の抗体断片である場合）。

【0163】

特に好ましい型の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化抗体）の１つ以上の超可変領域残基の置換を伴う。概して、さらなる開発のために選択されて得られた変異体（複数可）は、それらが生成される親抗体に対して改善された生物学的特性を有する。かかる置換変異体を生成するための好都合な方法は、ファージディスプレイを使用した親和性成熟を伴う。簡潔には、いくつかの超可変領域部位（例えば、６～７つの部位）は、各部位に全ての可能なアミノ置換を生成するために突然変異される。このように生成された抗体変異体は、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として糸状ファージ粒子からの一価様式で表示される。その後、ファージディスプレイされた変異体は、本明細書に開示されるそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。修飾のための候補超可変領域部位を特定するために、アラニンスキャニング突然変異生成が行われ、抗原結合に著しく寄与する超可変領域残基が特定され得る。あるいは、または加えて、抗原－抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体と標的との間の接触点を特定することが有益であり得る。かかる接触残基及び隣接残基は、本明細書に詳述される技法に従う置換の候補である。かかる変異体が生成されると、変異体のパネルが本明細書に記載されるようにスクリーニングに供され、１つ以上の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体がさらなる開発のために選択され得る。

【0164】

ポリペプチドの別の種類のアミノ酸変異体は、抗体の元のグリコシル化パターンを改変する。ポリペプチドは、非アミノ酸部分を含み得る。例えば、ポリペプチドは、グリコシル化され得る。かかるグリコシル化は、宿主細胞または宿主生物でのポリペプチドの発現中に天然に生じ得るか、またはヒト介入に起因する計画的な修飾であり得る。改変とは、ポリペプチドに見られる１つ以上の炭水化物部分の欠失、及び／またはポリペプチド中に存在しない１つ以上のグリコシル化部位の付加を意味する。

【0165】

ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合またはＯ結合のいずれかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列であるアスパラギン－Ｘ－セリン及びアスパラギン－Ｘ－スレオニン（式中、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素結合の認識配列である。したがって、ポリペプチド内でのこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在により、潜在的なグリコシル化部位が作製される。Ｏ結合グリコシル化とは、糖類であるＮ－アセイルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの結合を指すが、５－ヒドロキシプロリンまたは５－ヒドロキシリジンも使用され得る。

【0166】

グリコシル化部位のポリペプチドへの付加は、（Ｎ結合グリコシル化部位のための）上述のトリペプチド配列のうちの１つ以上を含有するようにアミノ酸配列を改変することによって好都合に達成される。改変は、（Ｏ連結グリコシル化部位のための）元の抗体の配列への１つ以上のセリンまたはトレオニン残基の付加、またはそれによる置換によっても行われ得る。

【0167】

ポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的もしくは酵素的に、またはグリコシル化の標的としての機能を果たすアミノ酸残基をコードするコドンの変異置換によって達成され得る。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、様々なエンド－及びエキソ－グリコシダーゼの使用によって達成され得る。

【0168】

他の修飾としては、グルタミニル及びアスパラギニル残基のそれぞれ対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミド化、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα－アミノ基のメチル化、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。

【0169】

（ｉｉ）キメラポリペプチド
本明細書に記載のポリペプチドは、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合したポリペプチドを含むキメラ分子を形成するための方法で修飾され得る。いくつかの実施形態では、キメラ分子は、ポリペプチドと、抗タグ抗体が選択的に結合し得るエピトープを提供するタグポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般に、ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に位置する。かかるエピトープタグ形態のポリペプチドの存在は、タグポリペプチドに対する抗体を使用して検出され得る。エピトープタグの提供により、抗タグ抗体またはエピトープタグに結合する別の種類の親和性マトリックスを使用してポリペプチドが親和性精製によって容易に精製されることも可能になる。

【0170】

代替的な実施形態では、キメラ分子は、ポリペプチドと免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域との融合を含み得る。二価の形態のキメラ分子は、「イムノアドヘシン」と称される。

【0171】

本明細書に使用される場合、「イムノアドヘシン」という用語は、異種ポリペプチドの結合特異性と、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを組み合わせた、抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識及び結合部位以外である所望の結合特異性を有する（すなわち、「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドヘシン部分は、典型的に、少なくとも受容体またはリガンドの結合部位を含む連続したアミノ酸配列である。イムノアドヘシンにおける免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ－１、ＩｇＧ－２、ＩｇＧ－３、またはＩｇＧ－４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ－１及びＩｇＡ－２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭ等の任意の免疫グロブリンから得られ得る。

【0172】

Ｉｇ融合物は、好ましくは、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの可変領域の代わりに、可溶性の（膜貫通ドメインが欠失または不活性化されている）形態のポリペプチドの置換を含む。特定の好ましい実施形態では、免疫グロブリン融合体には、ヒンジ、ＣＨ_２、及びＣＨ_３、またはヒンジ、ＩｇＧ１分子の、ＣＨ_１、ＣＨ_２、及びＣＨ_３領域が含まれる。

【0173】

（ｉｉｉ）ポリペプチド複合体
ポリペプチド製剤において使用するためのポリペプチドは、細胞毒性剤、例えば化学療法剤、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素、またはそれらの断片）、または放射性同位体（すなわち、放射性複合体）と複合化され得る。

【0174】

かかる複合体の生成において有用な化学療法剤を使用することができる。さらに、使用することができる酵素的に活性な毒素及びそれらの断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａからの）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンが含まれる。多様な放射性同位体は、放射性複合ポリペプチドの産生のために利用可能である。例には、^２１２Ｂｉ,^１３１Ｉ、^１３１Ｉｎ、^９０Ｙ、及び^１８６Ｒｅが含まれる。ポリペプチドと細胞毒性剤とのコンジュゲートは、Ｎ－サクシニミジル－３－（２－ピリジルジチオール）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣＬ等）、活性エステル（スベリン酸ジサクシニミジル等）、アルデヒド（グルタレルデヒド等）、ビス－アジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン（ｔｏｌｙｅｎｅ）２，６－ジイソシアネート等）、及びビス－活性フッ素化合物（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン等）等の多様な二機能性タンパク質カップリング剤を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．,Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製することができる。炭素－１４－で標識された１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドのポリペプチドへの複合のための例示的なキレート剤である。

【0175】

ポリペプチドと、１つ以上の小分子毒素、例えば、カリケアマイシン、マイタンシノイド、トリコテセン、及びＣＣ１０６５、ならびに毒素活性を有する、これらの毒素の誘導体との複合体はまた、本明細書において企図される。

【0176】

マイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することによって作用する有糸分裂阻害剤である。マイタンシンは、東アフリカの低木であるＭａｙｔｅｎｕｓ ｓｅｒｒａｔａから最初に単離された。その後、特定の微生物もまた、マイタンシノール及びＣ－３マイタンシノールエステル等のマイタンシノイドを産生することが発見された。合成マイタンシノールならびにその誘導体及び類似体もまた、企図される。ポリペプチド－マイタンシノイド複合体を作製するための当該技術分野で既知の多くの連結基があり、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号に開示されているものを含む。連結基は、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸に不安定な基、光不安定性基、ペプチターゼに不安定な基、またはエステラーゼに不安定な基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。

【0177】

結合の種類に応じて、リンカーが様々な位置でマイタンシノイド分子に結合され得る。例えば、エステル結合は、従来のカップリング技法を使用してヒドロキシル基との反応によって形成され得る。反応は、ヒドロキシル基を有するＣ－３位、ヒドロキシメチルで修飾したＣ－１４位、ヒドロキシル基で修飾したＣ－１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ－２０位で生じ得る。好ましい実施形態では、結合は、マイタンシノールまたはマイタンシノール類似体のＣ－３位に形成される。

【0178】

対象となる別の複合体は、１つ以上のカリケアミシン分子に複合化されたポリペプチドを含む。カリケアマイシンファミリーの抗生物質は、サブピコモルの濃度で二本鎖ＤＮＡの切断を産生することができる。カリケアマイシンファミリーの複合体の調製については、例えば、米国特許第５，７１２，３７４号を参照のこと。使用され得るカリケアマイシンの構造類似体としては、γ_１ ^Ｉ、α_２ ^Ｉ、α_３ ^Ｉ、Ｎ－アセチル－γ_１ ^Ｉ、ＰＳＡＧ、及びθ_１ ^Ｉが挙げられるが、これらに限定されない。抗体が複合され得る別の抗腫瘍薬物は、抗葉酸剤であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡはともに、作用の細胞内部位を有し、原形質膜と容易に交差しない。したがって、ポリペプチド（例えば、抗体）媒介性内部移行を通したこれらの薬剤の細胞取り込みによって、それらの細胞毒性効果を大いに増強する。

【0179】

本明細書に記載されるポリペプチドに複合され得る他の抗腫瘍薬剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトズマイシン、ビンクリスチン、及び５－フルオロウラシル、集合的にＬＬ－Ｅ３３２８８複合体に既知の薬剤ファミリー、ならびにエスペラミシンが含まれる。

【0180】

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドと核酸分解活性を有する化合物（例えば、リボヌクレアーゼ、またはＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅ）との間の複合体であり得る。

【0181】

さらに別の実施形態では、ポリペプチド（例えば、抗体）は、腫瘍前標的化において利用するために「受容体」（ストレプトアビジン等）と複合させてもよく、この場合、ポリペプチド受容体複合体が患者に投与され、続いて除去剤を使用して血液循環から非結合複合体が除去された後、細胞毒性薬剤（例えば、放射性ヌクレオチド）と複合されている「リガンド」（例えば、アビジン）が投与される。

【0182】

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法剤）を活性抗癌剤に転化させるプロドラッグ活性化酵素に複合され得る。免疫複合体の酵素構成成分には、前駆薬物において、それをより活性な細胞毒性形態に変換するような方法で作用することができる任意の酵素が含まれる。

【0183】

有用である酵素としては、リン酸塩含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ；硫酸塩含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；無毒性５－フルオロシトシンを抗癌薬物、５－フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ、及びカテプシン（例えば、カテプシンＢ及びＬ）等のプロテアーゼ；Ｄ－アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを変換するのに有用なＤ－アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なβ－ガラクトシダーゼ及びノイラミニダーゼ等の炭水化物切断酵素、β－ラクタムで誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用なβ－ラクタマーゼ、ならびにアミン窒素において、フェノキシアセチル基またはフェニルアセチル基でそれぞれ誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用なペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼ等のペニシリンアミダーゼが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、「アブザイム」としても当技術分野で既知の酵素活性を有する抗体が、プロドラッグを遊離活性薬物に変換するために使用され得る。

【0184】

（ｉｖ）その他
ポリペプチドの別の種類の共有結合修飾は、ポリペプチドを様々な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールのコポリマーのうちの１つに連結することを含む。ポリペプチドはまた、例えば、コアセルベーション技法もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン－マイクロカプセル及びポリ－（メチルメタシレート）マイクロカプセル）によって、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）中、またはマイクロエマルジョン中に封入され得る。かかる技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ,１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ,Ｇｅｎｎａｒｏ,Ａ．Ｒ．,Ｅｄ．,（１９９０）において開示されている。

【0185】

ＶＩＩ.製剤及び方法における使用のためのポリペプチドの取得
本明細書に記載される分析方法で使用されるポリペプチドは、組換え方法を含む、当技術分野で周知の方法を使用して得られ得る。以下のセクションは、これらの方法に関する手引きを提供する。

【0186】

（Ａ）ポリヌクレオチド
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。

【0187】

ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ポリペプチドｍＲＮＡを保有し、検出可能なレベルでそれを発現すると考えられている組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーを含むが、これに限定されない、任意の供給源から得られ得る。したがって、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヒト組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に得ることができる。ポリペプチドをコードする遺伝子はまた、ゲノムライブラリーから、または既知の合成手順（例えば、自動核酸合成）によっても得られ得る。

【0188】

例えば、ポリヌクレオチドは、軽鎖または重鎖等の全体の免疫グロブリン分子鎖をコードし得る。完全な重鎖は、重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）だけでなく、重鎖定常領域（Ｃ_Ｈ）も含み、これは典型的には３つの定常ドメイン：Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、及びＣ_Ｈ３；及び「ヒンジ」領域を含む。場合によっては、定常領域の存在が望ましい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＴＤＢの１つ以上の免疫グロブリン分子鎖をコードする。

【0189】

ポリヌクレオチドによってコードされ得る他のポリペプチドには、抗原結合抗体断片、例えば、単一ドメイン抗体（「ｄＡｂ」）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）_２、及び「ミニボディ」が含まれる。ミニボディは、（典型的には）Ｃ_Ｈ１及びＣ_ＫまたはＣ_Ｌドメインが切除されている二価抗体断片である。ミニボディは、従来の抗体より小さいので、それらは臨床／診断用途では良好な組織浸透を達成するはずであるが、ｄＡｂのような一価抗体断片よりも高い結合親和性を保持しなければならない二価である。したがって、別途文脈が規定しない限り、「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、全ての抗体分子だけでなく、上記で考察される型の抗原結合抗体断片も包含する。好ましくは、コードされたポリペプチド中に存在する各フレームワーク領域は、対応するヒト受容体フレームワークに対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。したがって、例えば、フレームワーク領域は、受容体フレームワーク領域に対して、合計で３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸置換を含み得る。

【0190】

本明細書に開示される特徴は全て、任意の組み合わせで組み合わせられてもよい。本明細書に開示される各特徴は、同じ、同等、または同様の目的を果たす代替の特徴に置き換えられてもよい。したがって、別途明確に示されない限り、開示される各特徴は、一般的な一連の同等または同様の特徴の一例にすぎない。

【0191】

本発明のさらなる詳細が、以下の非限定的な実施例により例示されている。本明細書における全ての参考文献の開示は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

【実施例0192】

以下の実施例は、単に本発明の例示となるよう意図されており、それ故に、決して本発明を限定するものと解釈されるべきではない。以下の実施例及び詳細な説明は、限定するものではなく、例証として提供されている。

【0193】

実施例１.Ｔ細胞活性化アッセイ
Ｔ細胞活性化アッセイは、標的細胞の存在下でＴ細胞を活性化するためのＴ細胞依存性二重特異性（ＴＤＢ）抗体の効力及び特異性を決定するために開発されている。例示的な略図については図２を参照のこと。ＴＤＢが二価であり、二重特異性であるように、１つのアームがＴＣＲ複合体サブユニットに対して特異的であり、もう一方のアームが標的抗原に対して特異的であり、Ｔ細胞活性化をもたらすＴＣＲの架橋により、標的細胞及びＴ細胞はともに、ＴＤＢによって結合される場合にのみ生じ得る。抗ＣＤ３を含有するＴＤＢによるＴＣＲ媒介性架橋は、ＮＦＡＴ及びＮＦκＢを含む転写因子のリン酸化及び核局在化をもたらすＴ細胞シグナル伝達カスケードを活性化し、サイトカイン等の標的遺伝子または細胞死滅剤、例えば、Ｆａｓ、グランザイムＢ、及びパーフォリンの転写誘導をもたらす（Ｂｒｏｗｎ,ＷＭ,２００６,Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ ７：３８１－３８８、Ｆｅｒｒａｎ,Ｃ ｅｔ ａｌ．,１９９３ Ｅｘｐ Ｎｅｐｈｒｏｌ １：８３－８９、Ｓｈａｎｎｏｎ,ＭＦ ｅｔ ａｌ．,１９９５,Ｊ.Ｌｅｕｋｏｃ.Ｂｉｏｌ．５７：７６７－７７３、Ｓｈａｐｉｒｏ,１９９８、Ｐａｒｄｏ,Ｊ,ｅｔ ａｌ．,２００３,Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．,１５（１２）：１４４１－１４５０）。ＡＰ１、ＮＦＡＴ、またはＮＦκＢの転写制御下で、ホタルルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子は、シグナル伝達経路のＴＣＲ活性化及びＴ細胞活性化をモニタリングするために使用されている（Ｓｈａｎｎｏｎ,ＭＦ ｅｔ ａｌ．,１９９５,Ｊ.Ｌｅｕｋｏｃ.Ｂｉｏｌ．５７：７６７－７７３、Ｓｈａｐｉｒｏ,１９９８）。ＴＤＢがＴ細胞をインビトロで活性化することができるかどうか評価するために、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ＤＳＭＺ、ＡＣＣ ２８２）を、組換えＴＣＲ応答性レポーター遺伝子レンチウイルスストック（ＡＰ１－ルシフェラーゼ、ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼ、またはＮＦκＢ－ルシフェラーゼ）と感染させ、レポーターＴ細胞の安定したプールを単離した。活性化をアッセイするためのレポーターＴ細胞の適合性を最初に評価するために、それらは、標的細胞の不在下でＴＣＲ受容体を架橋することができる精製した抗ＣＤ３ホモ二量体で１０μｇ／ｍＬで４時間処理した。Ｊｕｒｋａｔ／ＡＰ１ルシフェラーゼ、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴルシフェラーゼ、及びＪｕｒｋａｔ／ＮＦκＢルシフェラーゼの安定したプールは、精製した抗ＣＤ３ホモ二量体による刺激時にルシフェラーゼの用量依存性誘導を示した。発光応答（ルシフェラーゼレポーター遺伝子活性）をプロットし、最高応答が、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦκＢルシフェラーゼの安定したプールから観察された（図３Ａ）。限定希釈液により単離されたＪｕｒｋａｔ／ＮＦκＢルシフェラーゼの安定したクローンは、１０μｇ／ｍＬの精製した抗ＣＤ３ホモ二量体に対するそれらの応答についてスクリーニングされた。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞ＮＦκＢルシフェラーゼプールは、他のＴＣＲ応答要素と比較して抗ＣＤ３ホモ二量体に対して最高応答を示し、さらなる調査のために選択された（図３Ｂ）。

【0194】

αＣＤ２０／αＣＤ３ ＴＤＢまたは抗ＣＤ３ホモ二量体のいずれかに、このクローンの相対的応答を決定するために、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦκＢルシフェラーゼクローン２細胞株を、標的細胞株を発現するＣＤ２０の存在下で、増加した濃度のαＣＤ２０／αＣＤ３ ＴＤＢまたは抗ＣＤ３ホモ二量体のいずれかで処置し、ルシフェラーゼ活性をプロットした（図４Ａ）。細胞を、１０％のウシ胎児血清で補充したＲＰＭＩ １６４０培地中で、αＣＤ２０／αＣＤ３ ＴＤＢまたはＣＤ３ホモ二量体で４時間刺激した。精製したαＣＤ２０／αＣＤ３ ＴＤＢは、共刺激標的細胞の存在下で、精製した抗ＣＤ３ホモ二量体よりも１０００倍以上活性であった。標的細胞の不在下でαＣＤ２０／αＣＤ３ ＴＤＢは、この細胞株におけるルシフェラーゼ転写のＮＦκＢ依存性活性化によって測定されるように、ＴＤＢのさらに高いレベルでＴ細胞活性化をもたらさず、標的及びエフェクター細胞へのＴＤＢの同時結合を検出するためのアッセイの特異性を示した（図４Ｂ）。操作されたＪｕｒｋａｔ／ＮＦκＢルシフェラーゼクローン２レポーター遺伝子細胞株について観察されるＴ細胞活性化応答は、Ｔ細胞活性化の他の測定を用いてドナー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたヒトＴ細胞を用いて観察されたものと同等であり、Ｔ細胞活性化応答をモニタリングするためのレポーター遺伝子の使用が同等であることを示す（表３）。Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦκＢルシフェラーゼクローン２細胞株（Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦκＢＬｕｃ）は、ＴＤＢ媒介性Ｔ細胞活性化の検出のための細胞系アッセイ方法を開発し、最適化するために使用された。
表３

【0195】

実施例２.ＴＤＢ媒介性Ｔ細胞活性化を検出するための定量化方法
標的細胞の存在下でＴ細胞活性化の誘導を測定することによる抗ＣＤ３を含有するＴＤＢの効力を決定するための感受性及び定量的プラットフォームＴＤＢ細胞系アッセイを開発した。ＴＤＢのＴ細胞活性化アッセイは、操作されたＴ細胞レポーター遺伝子細胞株、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦκＢＬｕｃを用いてＲｅｌ／ＮＦκＢシグナル伝達経路のＴＣＲ架橋誘導の活性化を測定することによって、標的細胞の存在下でのＴＤＢによるＴ細胞の活性化を検出する。活性化したＮＦκＢは、核に移行し、合成プロモーターの８つのＮＦκＢ応答要素に結合し、ルシフェラーゼの転写を駆動する。

【0196】

アッセイでは、抗ＣＤ２０／ＣＤ３（または抗ＨＥＲ２／ＣＤ３もしくは抗ＣＤ７９ｂ／ＣＤ３）のアッセイ標準物、対照、及び試験試料の希釈液を調製し、５０μＬを、９６ウェルアッセイプレートに添加した。次いで、標的細胞（それぞれ、αＣＤ２０／ＣＤ３、αＨＥＲ２／ＣＤ３、及びαＣＤ７９ｂ／ＣＤ３について、Ｗｉｌ２－Ｓ、ＢＴ－４７４またはＳＫＢＲ３、及びＢＪＡＢ細胞）及びＪｕｒｋａｔＮＦｋＢレポーター細胞を、凍結細胞が新鮮な培養細胞と同等であるという評価に従って、すぐに使用できる（Ｒ－ｔｏ－Ｕ）凍結細胞または培養細胞のいずれかを使用して調製した。等体積の４．０×１０^５細胞／ｍＬの標的細胞希釈液及び１．６×１０^６細胞／ｍＬのＪｕｒｋａｔＮＦｋＢ細胞希釈液を組み合わせて、標的：エフェクター（Ｔ：Ｅ）細胞比が１：４の細胞混合物を調製した。５０μＬの混合した標的及びＪｕｒｋａｔＮＦｋＢＬｕｃ細胞を、アッセイプレート中で各ＴＤＢ希釈液に添加した。αＨＥＲ２／ＣＤ３及びαＣＤ７９ｂ／ＣＤ３細胞系アッセイについても、これらのアッセイが参照及び対照ＴＤＢを含むため、同じＴ：Ｅ比を使用した。ＴＤＢによるＪｕｒｋａｔＮＦｋＢＬｕｃ Ｔ細胞レポーター細胞株への標的細胞の複合後、活性化したＮＦκＢは核に移行し、合成プロモーターの８つのＮＦκＢ応答要素に結合し、ルシフェラーゼの転写を駆動する。４～５時間のアッセイインキュベーション後に、各試料によって誘導されたルシフェラーゼ活性の量を、発光プレートリーダーを用いて測定した（図５）。対照及び試験試料の相対的効力は、以下のように、４Ｐ分析を用いてＴＤＢ参照標準物から生じた発光の標準曲線から決定された。
４パラメータロジスティック曲線フィッティングプログラムを使用して、標準物、対照、及び試料（複数可）に対する別個の曲線を生成する。
式は、
ｙ＝（（Ａ－Ｄ）／（１＋（ｘ／Ｃ）＾Ｂ））＋Ｄ
であり、式中、ｘ＝独立した変数
Ａ＝ゼロ用量応答（下漸近線＝ＬＡ）
Ｂ＝傾き
Ｃ＝ＥＣ５０、ｎｇ／ｍＬ
Ｄ＝最大用量応答（上漸近線＝ＵＡ）
以下のように、標準曲線（ＳＴ）及び各試験物質（ＴＡ）（対照または試料（複数可））曲線に対する応答倍率を決定する。
応答振幅＝ＵＡ／ＬＡ
値を報告する。
以下のように、ＳＴと各ＴＡ曲線との間の類似性を確認する。
並列化について試験する。以下の式を用いて傾きの比を決定する。

以下の式を用いて下漸近線パーセントの差（ＬＡＤ）を決定する。

以下の式を用いて上漸近線パーセントの差（ＵＡＤ）を決定する。

制約された４-Ｐ平行曲線を用いて試験物質の効力を決定する。
ＳＴ及びＴＡについては、以下の式を用いて制約された曲線を生成する。

ρ＝試験物質の相対的効力（相対的効力は、ＳＴのＥＣ５０のＴＡのＥＣ５０に対する比である）
対照及び試験（複数可）に対する、効力（相対的効力（％）として表される）を計算する。
効力＝ρ×参照材料の活性

【0197】

ＣＤ６９（Ｃ型レクチンタンパク質）及びＣＤ２５（ＩＬ－２受容体）は、Ｔ細胞活性化のマーカーであり（Ｓｈｉｐｋｏｖａ Ｍ,２０１２,Ｃｌｉｎ.Ｃｈｉｍ.Ａｃｔａ.４１３：１３３８－４９及びＺｉｅｇｌｅｒ ＳＦ,ｅｔ ａｌ．,１９９４,Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １２（５）：４６５－４６５）、αＣＤ２０／ＣＤ３ ＴＤＢの添加から２４時間後に、Ｔ細胞の表面上のそれらの誘導を、フローサイトメトリーにより評価した。ＣＤ６９及びＣＤ２５細胞表面発現は、αＣＤ２０／αＣＤ３ ＴＤＢとのインキュベーションに応答して用量依存性様式で増加し（図６Ａ及び６Ｂ）、用量反応曲線は、ＪｕｒｋａｔＮＦｋＢＬｕｃ Ｔ細胞レポーター細胞株からのルシフェラーゼシグナルを測定することによって得られたものとよく相関し（図７）、ルシフェラーゼ測定が、ＪｕｒｋａｔＮＦｋＢＬｕｃ細胞を用いたＴＤＢ細胞系アッセイにおけるＴ細胞活性化の妥当な読み出しであることを示した。

【0198】

ＴＤＢとその標的との同時結合の量は、ＥＬＩＳＡ系架橋結合アッセイを用いて評価された。例示的な略図については図８を参照のこと。ＴＤＢによる標的抗原の、ＴＣＲ複合体サブユニット及び細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の架橋は、ＴＤＢの作用の機序を表す不可欠な相互作用である。アッセイは、抗ＨＥＲ２／ＣＤ３ ＴＤＢ変異体の異なる親和性を検出するために使用され（図９）、抗ＨＥＲ２／ＣＤ３使用は、熱応力条件（４０℃で２週間及び４週間、図１０Ａを参照のこと）に供された。抗ＨＥＲ２／ＣＤ３についてのＴＤＢ架橋結合アッセイにおいて、ＨＥＲ２ ＥＣＤ（ＣＲ＃１５６）を、プレート上のコーティング材料として使用した。１６～７２時間後、プレートを洗浄し、次いでαＨＥＲ２／ＣＤ３ ＴＤＢをアッセイ希釈剤中で１～２時間インキュベートした。洗浄後、ビオチン化ＣＤ３εペプチドを１～２時間インキュベートし、続いてＳｔｒｅｐ－ＨＲＰインキュベーションした。最終洗浄後、プレートに複合されたＨＲＰの量を検出剤を使用して測定した。架橋結合アッセイとＴＤＢ細胞系アッセイとの間に強い相関関係（Ｒ^２＝０．９９７６）が観察され（図１０Ｂ）、これは、ＴＤＢ効力の尺度としてＴＤＢ細胞系アッセイの使用をさらに支援した。

【0199】

架橋アッセイ
材料
コート材料：ＨＥＲ２ ＥＣＤ（ＣＲ＃１５６）
コーティング緩衝液：ＣａＣｌ_２及びＭｇＣｌ_２を含まないダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、Ｇｉｂｃｏカタログ番号１４１９０
アッセイ希釈／検出希釈緩衝液：ＰＢＳ＋０．５％ ＢＳＡ＋０．０５％ ＰＳ２０
洗浄緩衝液：ＰＢＳ＋０．０５％ ＰＳ２０
検出：Ｓｔｒｅｐ－ＨＲＰ

【0200】

コートプレート
１．コーティング緩衝液中で４μｇ／ｍＬになるまでコーティング試薬を希釈する。
２．全ての９６ウェルを、１００μＬをコーティングする。
３．プレートシーラーで密閉する。
４．２～８℃で１６～７２時間インキュベートする。

【0201】

アッセイ手順
１．洗浄プログラム「自動」を用いて洗浄緩衝液で６回プレートを洗浄する（すなわち、自動プログラムの２サイクルを実行する）。
２．１ウェル当たり２００μＬのＡＤを用いてプレートをブロックする。密閉し、２５℃で１～２時間振とうしながらインキュベートする。
３．ＡＤ中でａＨＥＲ２ ＴＤＢ Ａｂを調製する。
４．ブロック後、ステップ１としてプレートを６回洗浄する。
５．１００ｕＬの希釈ａＨＥＲ２ ＴＤＢを各ウェルに添加する。２５℃で１時間１０分振とうしながらインキュベートした。
６．ステップ１を繰り返す。
７．ＣＤ３ｅペプチド（１６ｍｅｒ）を最終濃度：１μｇ／ｍＬのＣＤ３ｅペプチドで調製する
８．１００μＬを各ウェルに添加する。１時間インキュベートする。
９．ステップ１を繰り返す。
１０．Ｓｔｒｅｐ－ＨＲＰを２ｎｇ／ｍＬの最終濃度で添加し、２５Ｃで１時間インキュベートする。
１１．ステップ１を繰り返す。
１２．１００μＬのＳｕｒｅ Ｂｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅをウェルに添加する。１００μＬの０．６Ｎ 硫酸で反応を停止する前に、最適な色現像まで現像する。
１５．ＯＤ ４５０／６５０を読み取る

【0202】

実施例３.抗ＦｃＲＨ５／抗ＣＤ３抗体の分析
実施例２に記載されるアッセイを使用して、抗ＦｃＲＨ５／抗ＣＤ３ ＴＢＤの効力を測定した。アッセイでは、抗ＦｃＲＨ５／ＣＤ３のアッセイ標準物、対照、及び試験試料の希釈液を調製し、５０μＬを、９６ウェルアッセイプレートに添加した。次いで、標的細胞（ＦｃＲＨ５を発現するＥＪＭ細胞）及びＪｕｒｋａｔＮＦｋＢレポーター細胞を、凍結細胞が新鮮な培養細胞と同等であるという評価に従って、すぐに使用できる（Ｒ－ｔｏ－Ｕ）凍結細胞または培養細胞のいずれかを使用して調製した。等体積の４．０×１０^５細胞／ｍＬの標的細胞希釈液及び１．６×１０^６細胞／ｍＬのＪｕｒｋａｔＮＦｋＢ細胞希釈液を組み合わせて、標的：エフェクター（Ｔ：Ｅ）細胞比が１：４の細胞混合物を調製した。５０μＬの混合した標的及びＪｕｒｋａｔＮＦｋＢＬｕｃ細胞を、アッセイプレート中で各ＴＤＢ希釈液に添加した。参照及び対照ＴＤＢについては、同じＴ：Ｅ比が、使用された。４～５時間のアッセイインキュベーション後に、各試料によって誘導されたルシフェラーゼ活性の量を、発光プレートリーダーを用いて測定した（図１１）。対照及び試験試料の相対的効力は、実施例２に記載されるように、４Ｐ分析を用いてＴＤＢ参照標準物から生じる発光の標準曲線から決定された。

【0203】

抗ＦｃＲＨ５／ＣＤ３ ＴＤＢとその標的との同時結合の量は、実施例２に記載されるように、ＥＬＩＳＡ系架橋結合アッセイを用いて評価された。抗ＦｃＲＨ５／ＣＤ３についてのＴＤＢ架橋結合アッセイにおいて、ドメイン９のＦｃＲＨ５ ＥＣＤをプレート上のコーティング材料として使用した。１６～７２時間後、プレートを洗浄し、次いでαＦｃＲＨ５／ＣＤ３ ＴＤＢをアッセイ希釈剤中で１～２時間インキュベートした。洗浄後、ビオチン化ＣＤ３εペプチドを１～２時間インキュベートし、続いてＳｔｒｅｐ－ＨＲＰインキュベーションした。最終洗浄後、プレートに複合されたＨＲＰの量を、検出剤を使用して測定した（図１２）。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【配列表】

2023138948000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2023-07-14

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

明細書に記載の一の発明。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２０３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0203】

抗ＦｃＲＨ５／ＣＤ３ ＴＤＢとその標的との同時結合の量は、実施例２に記載されるように、ＥＬＩＳＡ系架橋結合アッセイを用いて評価された。抗ＦｃＲＨ５／ＣＤ３についてのＴＤＢ架橋結合アッセイにおいて、ドメイン９のＦｃＲＨ５ ＥＣＤをプレート上のコーティング材料として使用した。１６～７２時間後、プレートを洗浄し、次いでαＦｃＲＨ５／ＣＤ３ ＴＤＢをアッセイ希釈剤中で１～２時間インキュベートした。洗浄後、ビオチン化ＣＤ３εペプチドを１～２時間インキュベートし、続いてＳｔｒｅｐ－ＨＲＰインキュベーションした。最終洗浄後、プレートに複合されたＨＲＰの量を、検出剤を使用して測定した（図１２）。
＜本開示の更なる実施態様＞
［実施態様１］
組成物中のＴ細胞依存性二重特異性抗体（ＴＤＢ）を検出するための方法であって、前記二重特異性抗体が、標的抗原結合断片及びＣＤ３結合断片を含み、前記方法が、
Ｔ細胞及び標的細胞の集団を、前記組成物と接触させることを含み、前記Ｔ細胞が、Ｔ細胞活性化に応答する応答要素に作動可能に連結したレポーターをコードする核酸を含み、前記標的細胞が、前記標的抗原を発現し、
前記レポーターの発現が、ＴＤＢの存在を示す、前記方法。
［実施態様２］
前記レポーターが、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ、またはベータガラクトシダーゼである、実施態様１に記載の方法。
［実施態様３］
前記ルシフェラーゼが、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、またはナノシフェラーゼである、実施態様２に記載の方法。
［実施態様４］
前記Ｔ細胞活性化に応答する応答要素が、ＮＦＡＴプロモーター、ＡＰ－１プロモーター、ＮＦκＢプロモーター、ＦＯＸＯプロモーター、ＳＴＡＴ３プロモーター、ＳＴＡＴ５プロモーター、またはＩＲＦプロモーターである、実施態様１～３のいずれか一に記載の方法。
［実施態様５］
前記Ｔ細胞活性化に応答する応答要素が、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１、ＮＦκＢ、ＦＯＸＯ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、及びＩＲＦのうちの任意の１つ以上からのＴ細胞活性化応答要素を含む、実施態様４に記載の方法。
［実施態様６］
前記Ｔ細胞の集団が、ＣＤ４ ^＋ Ｔ細胞またはＣＤ８ ^＋ Ｔ細胞の集団である、実施態様１～５のいずれか一に記載の方法。
［実施態様７］
前記Ｔ細胞の集団が、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞またはＣＴＬＬ－２ Ｔ細胞の集団である、実施態様１～５のいずれか一に記載の方法。
［実施態様８］
前記標的抗原が、前記標的細胞の表面上に発現される、実施態様１～７のいずれか一に記載の方法。
［実施態様９］
前記標的抗原が、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９α（ＣＤ７９ａ）、ＣＤ７９β（ＣＤ７９ｂ）、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体、ＨＥＲ４受容体、ＦｃＲＨ５、ＣＬＬ１、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、αｖ／β３インテグリン、ＶＥＧＦ、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ－４；プロテインＣ、ＢＲ３、ｃ－ｍｅｔ、組織因子、β７、Ｔｅｎｂ２、ＳＴＥＡＰ、または膜貫通腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である、実施態様１～８のいずれか一に記載の方法。
［実施態様１０］
ａ）前記標的抗原がＨＥＲ２受容体であり、前記標的細胞がＢＴ－４７４細胞であるか、
ｂ）前記標的抗原がＨＥＲ２受容体であり、前記標的細胞がＳＫＢＲ３細胞であるか、
ｃ）前記標的抗原がＣＤ２０であり、前記標的細胞がＷｉｌ２－Ｓ細胞であるか、または
ｄ）前記標的抗原がＣＤ７９ｂであり、前記標的細胞がＢＪＡＢ細胞である、実施態様１～９のいずれか一に記載の方法。
［実施態様１１］
前記細胞集団におけるＴ細胞対標的細胞の比が、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、または約１：１０である、実施態様１～１０のいずれか一に記載の方法。
［実施態様１２］
前記細胞集団におけるＴ細胞対標的細胞の比が、約１：４である、実施態様１～１１のいずれか一に記載の方法。
［実施態様１３］
前記細胞集団が、約１×１０ ^３ ～約１×１０ ^６ の範囲である、実施態様１～１２のいずれか一に記載の方法。
［実施態様１４］
前記細胞集団が、約１×１０ ^４ ～約５×１０ ^４ である、実施態様１～１２のいずれか一に記載の方法。
［実施態様１５］
Ｔ細胞の集団を、０．０１ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で前記ＴＤＢを含む組成物と接触させる、実施態様１～１４のいずれか一に記載の方法。
［実施態様１６］
前記レポーターが、前記細胞を前記組成物と接触させた１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１６、２０、または２４時間後のうちの任意の１つ以上に検出される、実施態様１～１５のいずれか一に記載の方法。
［実施態様１７］
組成物中のＴＤＢの量を定量化するための方法であって、前記ＴＤＢが、標的抗原結合断片及びＣＤ３結合断片を含み、前記方法が、
Ｔ細胞及び標的細胞の集団を、前記組成物の１つ以上の濃度で、前記組成物と接触させることであって、前記Ｔ細胞が、Ｔ細胞活性化に応答する応答要素に作動可能に連結したレポーターをコードする核酸を含み、前記標的細胞が、前記標的抗原を発現する、前記接触させることと、
前記レポーターの発現を、前記Ｔ細胞及び標的細胞の集団を異なる濃度の精製したＴＤＢと接触させることにより生じる標準曲線と抗体濃度の関数として相関させることと、を含む、前記方法。
［実施態様１８］
前記レポーターが、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ、またはベータガラクトシダーゼである、実施態様１７に記載の方法。
［実施態様１９］
前記ルシフェラーゼが、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、またはナノシフェラーゼである、実施態様１８に記載の方法。
［実施態様２０］
前記Ｔ細胞活性化に応答する応答要素が、ＮＦＡＴプロモーター、ＡＰ－１プロモーター、ＮＦκＢプロモーター、ＦＯＸＯプロモーター、ＳＴＡＴ３プロモーター、ＳＴＡＴ５プロモーター、またはＩＲＦプロモーターである、実施態様１７～１９のいずれか一に記載の方法。
［実施態様２１］
前記Ｔ細胞活性化に応答する応答要素が、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１、ＮＦκＢ、ＦＯＸＯ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、及びＩＲＦのうちの任意の１つ以上からのＴ細胞活性化応答要素を含む、実施態様２０に記載の方法。
［実施態様２２］
前記Ｔ細胞の集団が、ＣＤ４ ^＋ Ｔ細胞またはＣＤ８ ^＋ Ｔ細胞の集団である、実施態様１７～２１のいずれか一に記載の方法。
［実施態様２３］
前記Ｔ細胞の集団が、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞またはＣＴＬＬ－２ Ｔ細胞の集団である、実施態様１７～２２のいずれか一に記載の方法。
［実施態様２４］
前記標的抗原が、前記標的細胞の表面上に発現される、実施態様１７～２３のいずれか一に記載の方法。
［実施態様２５］
前記標的抗原が、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９α（ＣＤ７９ａ）、ＣＤ７９β（ＣＤ７９ｂ）、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体、ＨＥＲ４受容体、ＦｃＲＨ５、ＣＬＬ１、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、αｖ／β３インテグリン、ＶＥＧＦ、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ－４；プロテインＣ、ＢＲ３、ｃ－ｍｅｔ、組織因子、β７、Ｔｅｎｂ２、ＳＴＥＡＰ、または膜貫通腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である、実施態様１７～２４のいずれか一に記載の方法。
［実施態様２６］
ａ）前記標的抗原がＨＥＲ２受容体であり、前記標的細胞がＢＴ－４７４細胞であるか、
ｂ）前記標的抗原がＨＥＲ２受容体であり、前記標的細胞がＳＫＢＲ３細胞であるか、
ｃ）前記標的抗原がＣＤ２０であり、前記標的細胞がＷｉｌ２－Ｓ細胞であるか、または
ｄ）前記標的抗原がＣＤ７９ｂであり、前記標的細胞がＢＪＡＢ細胞である、実施態様１７～２５のいずれか一に記載の方法。
［実施態様２７］
前記細胞集団におけるＴ細胞対標的細胞の比が、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、または約１：１０である、実施態様１７～２６のいずれか一に記載の方法。
［実施態様２８］
前記細胞集団におけるＴ細胞対標的細胞の比が、約１：４である、実施態様１７～２７のいずれか一に記載の方法。
［実施態様２９］
前記細胞集団が、約１×１０ ^３ ～約１×１０ ^６ の範囲である、実施態様１７～２８のいずれか一に記載の方法。
［実施態様３０］
前記細胞集団が、約１×１０ ^４ ～約５×１０ ^４ である、実施態様１７～２９のいずれか一に記載の方法。
［実施態様３１］
Ｔ細胞の集団を、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で前記ＴＤＢを含む組成物と接触させる、実施態様１７～３０のいずれか一に記載の方法。
［実施態様３２］
前記標準曲線が、前記Ｔ細胞を、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬの範囲である異なる濃度の精製した抗ＣＤ３抗体と接触させることにより生じる、実施態様１７～３１のいずれか一に記載の方法。
［実施態様３３］
前記レポーターが、前記細胞を前記組成物と接触させた１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１６、２０、または２４時間後のうちの任意の１つ以上に検出される、実施態様１７～３２のいずれか一に記載の方法。
［実施態様３４］
ＴＤＢの特異性を決定するための方法であって、前記ＴＤＢが、標的抗原結合断片及びＣＤ３結合断片を含み、前記方法が、
ａ）Ｔ細胞及び試験細胞の集団を、前記ＴＤＢと接触させることであって、前記Ｔ細胞が、Ｔ細胞活性化に応答する応答要素に作動可能に連結したレポーターをコードする核酸を含み、前記試験細胞が、前記標的抗原を発現しない、前記接触させることと、
ｂ）Ｔ細胞及び試験細胞の集団を、前記ＴＤＢと接触させることであって、前記Ｔ細胞が、Ｔ細胞活性化に応答する応答要素に作動可能に連結したレポーターをコードする核酸を含み、前記試験細胞が、前記標的抗原を発現しない、前記接触させることと、
パートａ）中の前記試験細胞の存在下の前記レポーターの発現を、パートｂ）中の標的細胞の存在下の前記レポーターの発現と比較することと、を含み、前記試験細胞対前記標的細胞の前記レポーターの発現の比が、前記ＴＤＢの前記特異性を示す、前記方法。
［実施態様３５］
前記レポーターが、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ、またはベータガラクトシダーゼである、実施態様３４に記載の方法。
［実施態様３６］
前記ルシフェラーゼが、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、またはナノシフェラーゼである、実施態様３５に記載の方法。
［実施態様３７］
前記Ｔ細胞活性化に応答する応答要素が、ＮＦＡＴプロモーター、ＡＰ－１プロモーター、ＮＦκＢプロモーター、ＦＯＸＯプロモーター、ＳＴＡＴ３プロモーター、ＳＴＡＴ５プロモーター、またはＩＲＦプロモーターである、実施態様３４に記載の方法。
［実施態様３８］
前記Ｔ細胞活性化に応答する応答要素が、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１、ＮＦκＢ、ＦＯＸＯ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、及びＩＲＦのうちの任意の１つ以上からのＴ細胞活性化応答要素を含む、実施態様３７に記載の方法。
［実施態様３９］
前記Ｔ細胞の集団が、ＣＤ４ ^＋ Ｔ細胞またはＣＤ８ ^＋ Ｔ細胞の集団である、実施態様３４～３８のいずれか一に記載の方法。
［実施態様４０］
前記Ｔ細胞の集団が、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞またはＣＴＬＬ－２ Ｔ細胞の集団である、実施態様３４～３８のいずれか一に記載の方法。
［実施態様４１］
前記標的抗原が、前記標的細胞の表面上に発現される、実施態様３４～４０のいずれか一に記載の方法。
［実施態様４２］
前記標的抗原が、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９α（ＣＤ７９ａ）、ＣＤ７９β（ＣＤ７９ｂ）、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体、ＨＥＲ４受容体、ＦｃＲＨ５、ＣＬＬ１、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、αｖ／β３インテグリン、ＶＥＧＦ、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ－４；プロテインＣ、ＢＲ３、ｃ－ｍｅｔ、組織因子、β７、Ｔｅｎｂ２、ＳＴＥＡＰ、または膜貫通腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である、実施態様３４～４１のいずれか一に記載の方法。
［実施態様４３］
ａ）前記標的抗原がＨＥＲ２受容体であり、前記標的細胞がＢＴ－４７４細胞であるか、
ｂ）前記標的抗原がＨＥＲ２受容体であり、前記標的細胞がＳＫＢＲ３細胞であるか、
ｃ）前記標的抗原がＣＤ２０であり、前記標的細胞がＷｉｌ２－Ｓ細胞であるか、または
ｄ）前記標的抗原がＣＤ７９ｂであり、前記標的細胞がＢＪＡＢ細胞である、実施態様３４～４２のいずれか一に記載の方法。
［実施態様４４］
ステップａ）の前記細胞集団におけるＴ細胞対試験細胞の比、及び／またはステップｂ）の前記細胞集団におけるＴ細胞対標的細胞の比が、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、または約１：１０である、実施態様３４～４３のいずれか一に記載の方法。
［実施態様４５］
ステップａ）の前記細胞集団におけるＴ細胞対試験細胞の比、及び／またはステップｂ）の前記細胞集団におけるＴ細胞対標的細胞の比が、約１：４である、実施態様３４～４４のいずれか一に記載の方法。
［実施態様４６］
ステップａ）及び／またはｂ）の前記細胞集団が、約１×１０ ^３ ～約１×１０ ^６ の範囲である、実施態様３４～４５のいずれか一に記載の方法。
［実施態様４７］
ステップａ）及び／またはｂ）の前記細胞集団が、約１×１０ ^４ ～約５×１０ ^４ の範囲である、実施態様３４～４６のいずれか一に記載の方法。
［実施態様４８］
ステップａ）のＴ細胞及び試験細胞の集団ならびにステップｂ）のＴ細胞及び標的細胞の集団を、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で前記ＴＤＢを含む組成物と接触させる、実施態様３４～４７のいずれか一に記載の方法。
［実施態様４９］
前記レポーターが、前記細胞を前記組成物と接触させた１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１６、２０、または２４時間後のうちの任意の１つ以上に検出される、実施態様３４～４８のいずれか一に記載の方法。
［実施態様５０］
二重特異性抗体を含む組成物中のＴＤＢの検出のためのキットであって、前記二重特異性抗体が、標的抗原結合断片及びＣＤ３結合断片を含み、Ｔ細胞活性化に応答する応答要素に作動可能に連結したレポーターを含む操作されたＴ細胞を含む、前記キット。
［実施態様５１］
ＴＤＢアッセイ標準物及び／またはＴＤＢ対照をさらに含む、実施態様５０に記載のキット。
［実施態様５２］
前記標的抗原を発現する標的細胞をさらに含む、実施態様５０または５１に記載のキット。
［実施態様５３］
前記レポーターが、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ、またはベータガラクトシダーゼである、実施態様５０～５２のいずれか一に記載のキット。
［実施態様５４］
前記ルシフェラーゼが、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、またはナノシフェラーゼである、実施態様５３に記載のキット。
［実施態様５５］
前記Ｔ細胞活性化に応答する応答要素が、ＮＦＡＴプロモーター、ＡＰ－１プロモーター、ＮＦκＢプロモーター、ＦＯＸＯプロモーター、ＳＴＡＴ３プロモーター、ＳＴＡＴ５プロモーター、またはＩＲＦプロモーターである、実施態様５０～５４のいずれか一に記載のキット。
［実施態様５６］
前記Ｔ細胞活性化に応答する応答要素が、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１、ＮＦκＢ、ＦＯＸＯ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、またはＩＲＦのうちの任意の１つ以上からのＴ細胞活性化応答要素を含む、実施態様５５に記載のキット。
［実施態様５７］
前記Ｔ細胞の集団が、ＣＤ４ ^＋ Ｔ細胞またはＣＤ８ ^＋ Ｔ細胞の集団である、実施態様５０～５６のいずれか一に記載のキット。
［実施態様５８］
前記Ｔ細胞の集団が、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞またはＣＴＬＬ－２ Ｔ細胞の集団である、実施態様５０～５７のいずれか一に記載のキット。
［実施態様５９］
前記標的抗原が、標的細胞の表面上に発現される、実施態様５０～５８のいずれか一に記載のキット。
［実施態様６０］
前記標的抗原が、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９α（ＣＤ７９ａ）、ＣＤ７９β（ＣＤ７９ｂ）、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体、ＨＥＲ４受容体、ＦｃＲＨ５、ＣＬＬ１、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、αｖ／β３インテグリン、ＶＥＧＦ、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ－４；プロテインＣ、ＢＲ３、ｃ－ｍｅｔ、組織因子、β７、Ｔｅｎｂ２、ＳＴＥＡＰ、または膜貫通腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である、実施態様５０～５９のいずれか一に記載のキット。
［実施態様６１］
ａ）前記標的抗原がＨＥＲ２受容体であり、前記標的細胞がＢＴ－４７４細胞であるか、
ｂ）前記標的抗原がＨＥＲ２受容体であり、前記標的細胞がＳＫＢＲ３細胞であるか、
ｃ）前記標的抗原がＣＤ２０であり、前記標的細胞がＷｉｌ２－Ｓ細胞であるか、または
ｄ）前記標的抗原がＣＤ７９ｂであり、前記標的細胞がＢＪＡＢ細胞である、実施態様５２～６０のいずれか一に記載のキット。
［実施態様６２］
実施態様１～４９のいずれか一に記載の方法で用いるためのキット。
［実施態様６３］
試験細胞の集団が標的抗原を発現するかどうかを決定するための方法であって、
ａ）前記試験細胞の集団をＴ細胞の集団と接触させることであって、前記Ｔ細胞が、Ｔ細胞活性化に応答する応答要素に作動可能に連結したレポーターをコードする核酸を含む、前記接触させることと、
ｂ）Ｔ細胞及び試験細胞の集団を前記ＴＤＢと接触させることであって、前記ＴＤＢが、標的抗原結合断片及びＣＤ３結合断片を含む、前記接触させることと、を含み、
前記レポーターの発現が、前記試験細胞によって発現される前記標的抗原の存在を示す、前記方法。
［実施態様６４］
前記レポーターが、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ、またはベータガラクトシダーゼである、実施態様６３に記載の方法。
［実施態様６５］
前記ルシフェラーゼが、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、またはナノシフェラーゼである、実施態様６４に記載の方法。
［実施態様６６］
前記Ｔ細胞活性化に応答する応答要素が、ＮＦＡＴプロモーター、ＡＰ－１プロモーター、ＮＦκＢプロモーター、ＦＯＸＯプロモーター、ＳＴＡＴ３プロモーター、ＳＴＡＴ５プロモーター、またはＩＲＦプロモーターである、実施態様６５に記載の方法。
［実施態様６７］
前記Ｔ細胞活性化に応答する応答要素が、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１、ＮＦκＢ、ＦＯＸＯ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、及びＩＲＦのうちの任意の１つ以上からのＴ細胞活性化応答要素を含む、実施態様６６に記載の方法。
［実施態様６８］
前記Ｔ細胞の集団が、ＣＤ４ ^＋ Ｔ細胞またはＣＤ８ ^＋ Ｔ細胞の集団である、実施態様６３～６７のいずれか一に記載の方法。
［実施態様６９］
前記Ｔ細胞の集団が、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞またはＣＴＬＬ－２ Ｔ細胞の集団である、実施態様６３～６８のいずれか一に記載の方法。
［実施態様７０］
前記標的抗原が、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ７９α（ＣＤ７９ａ）、ＣＤ７９β（ＣＤ７９ｂ）、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体、ＨＥＲ４受容体、ＦｃＲＨ５、ＣＬＬ１、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、αｖ／β３インテグリン、ＶＥＧＦ、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ－４；プロテインＣ、ＢＲ３、ｃ－ｍｅｔ、組織因子、β７、Ｔｅｎｂ２、ＳＴＥＡＰ、または膜貫通腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である、実施態様６３～６９のいずれか一に記載の方法。
［実施態様７１］
前記試験細胞が、腫瘍細胞、免疫細胞、または血管細胞である、実施態様６３～７０のいずれか一に記載の方法。
［実施態様７２］
前記試験細胞が、Ｔ細胞を含まない、実施態様６３～７１のいずれか一に記載の方法。
［実施態様７３］
Ｔ細胞対試験細胞の比が、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、または約１：１０である、実施態様６３～７２のいずれか一に記載の方法。
［実施態様７４］
Ｔ細胞対試験細胞の比が、約１：４である、実施態様６３～７３のいずれか一に記載の方法。
［実施態様７５］
試験細胞及びＴ細胞の集団が、約１×１０ ^３ ～約１×１０ ^６ の範囲である、実施態様６３～７４のいずれか一に記載の方法。
［実施態様７６］
試験細胞及びＴ細胞の集団が、約１×１０ ^４ ～約５×１０ ^４ である、実施態様６３～７５のいずれか一に記載の方法。
［実施態様７７］
試験細胞及びＴ細胞の集団が、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度でＴＤＢと接触される、実施態様６３～７６のいずれか一に記載の方法。
［実施態様７８］
前記レポーターが、前記細胞を前記組成物と接触させた１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１６、２０、または２４時間後のうちの任意の１つ以上に検出される、実施態様６３～７７のいずれか一に記載の方法。
＜配列表＞

SEQUENCE LISTING

<110> LEE, Ho Young
JIANG, Guoying
WONG, Pin Yee
CAREY, Kendall

<120> METHODS FOR ASSAYING T-CELL DEPENDENT BISPECIFIC ANTIBODIES

<130> 146392036240

<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently Herewith

<150> 62/286,862
<151> 2016-01-25

<160> 40

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

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Asp



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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
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Gly



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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
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Gly



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<223> Synthetic Construct

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Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
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Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala
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Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
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Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic Construct

<400> 40
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105

【外国語明細書】