特開 2023-138965 ヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子に特異性を有する最適化された操作されたヌクレアーゼ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2023138965

(43)【公開日】2023-10-03

(54)【発明の名称】ヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子に特異性を有する最適化された操作されたヌクレアーゼ

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/16 20060101AFI20230926BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20230926BHJP

【ＦＩ】

C12N9/16 Z ZNA

C12N15/55

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023104634

(22)【出願日】2023-06-27

(62)【分割の表示】P 2020555222の分割

【原出願日】2019-04-11

(31)【優先権主張番号】62/656,809

(32)【優先日】2018-04-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】508117721

【氏名又は名称】プレシジョン バイオサイエンシズ，インク．

(74)【代理人】

【識別番号】110000659

【氏名又は名称】弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】スミス，ジェームス，ジェファーソン

(72)【発明者】

【氏名】ラペ，ジャネル

(72)【発明者】

【氏名】リー，フゥイ

(72)【発明者】

【氏名】ゲンシェル，ヨッヘン

(57)【要約】      （修正有）

【課題】第１世代のＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼよりも予想外に優れている、新規の第２世代のＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼを提供する。
【解決手段】本発明は、ヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ定常領域遺伝子の第１エクソン内に存在する認識配列を認識かつ切断する、操作されたヌクレアーゼを包含する。操作されたメガヌクレアーゼは、第１世代のメガヌクレアーゼであるＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥと比較した場合、増強（すなわち増加）した特異性、または切断の効率などの少なくとも１つの最適化された特徴を示し得る。本発明はまた、遺伝子改変された細胞を作製するためのこうした操作されたヌクレアーゼを用いる方法、ならびに薬学的組成物において、および癌などの疾患を治療するための方法において、こうした細胞の使用を包含する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ定常領域遺伝子内の配列番号５を含む認識配列を認識かつ切断する、操作されたメガヌクレアーゼであって、
前記操作されたメガヌクレアーゼが、第１のサブユニットと第２のサブユニットを含み、前記第１のサブユニットは、前記認識配列の第１の認識ハーフサイトと結合し、かつ第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含み、前記第２のサブユニットは、前記認識配列の第２の認識ハーフサイトと結合し、かつ第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含み、
更に前記ＨＶＲ２は、
（ａ）配列番号７の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも８１％の配列相同性、または、
（ｂ）配列番号８の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも８６％の配列相同性、を有する、操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項2】

前記ＨＶＲ２領域が、配列番号７または配列番号８の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する残基を含む、請求項１に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項3】

前記ＨＶＲ２領域が、配列番号７の残基４８、５０、７１、７２、および７３に対応する残基を含む、請求項１または２に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項4】

前記ＨＶＲ２領域が、配列番号８の残基４８および５０に対応する残基を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項5】

前記ＨＶＲ２領域が、配列番号７または配列番号８の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、６８、７０、７１、７２、７３、７５、および７７に対応する残基を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項6】

前記ＨＶＲ２領域が、配列番号７または配列番号８の残基６６に対応する残基にて、Ｙ、Ｒ、Ｋ、またはＤを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項7】

前記ＨＶＲ２領域が、配列番号７または配列番号８の残基２４～７９を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項8】

前記第２のサブユニットが、配列番号７または配列番号８の残基７～１５３に対し、少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項9】

前記第２のサブユニットが、配列番号７または配列番号８の残基１９に対応する残基にて、Ｇ、Ｓ、またはＡを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項10】

前記第２のサブユニットが、配列番号７または配列番号８の残基８０に対応する残基にて、Ｅ、Ｑ、またはＫを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項11】

前記第２のサブユニットが、配列番号７または配列番号８の残基７～１５３に対し、少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか一
項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項12】

前記第１のサブユニットが、配列番号７または配列番号８の残基１９８～３４４に対し、少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のサブユニットが、配列番号７または配列番号８の残基７～１５３に対し、少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項13】

前記第２のサブユニットが、配列番号７または配列番号８の残基１９に対応する残基にて、Ｇ、Ｓ、またはＡを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項14】

前記第２のサブユニットが、配列番号７または配列番号８の残基８０に対応する残基にて、Ｅ、Ｑ、またはＫを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項15】

前記第２のサブユニットが、配列番号７または配列番号８の残基８０に対応する残基を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項16】

前記第２のサブユニットが、配列番号７または配列番号８の残基１３９に対応する残基を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項17】

前記第２のサブユニットが、配列番号７または配列番号８の残基７～１５３を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項18】

前記ＨＶＲ１領域が、配列番号７または配列番号８の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項19】

前記ＨＶＲ１領域が、配列番号７または配列番号８の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する残基を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項20】

前記ＨＶＲ１領域が、配列番号７または配列番号８の残基２５７に対応する残基にて、Ｙ、Ｒ、Ｋ、またはＤを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項21】

前記ＨＶＲ１領域が、配列番号７または配列番号８の残基２１５～２７０を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項22】

前記第１のサブユニットが、配列番号７または配列番号８の残基１９８～３４４に対し、少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項23】

前記第１のサブユニットが、配列番号７または配列番号８の残基２１０に対応する残基にて、Ｇ、Ｓ、またはＡを含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項24】

前記第１のサブユニットが、配列番号７または配列番号８の残基２７１に対応する残基
にて、Ｅ、Ｑ、またはＫを含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項25】

前記第１のサブユニットが、配列番号７または配列番号８の残基２７１に対応する残基を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項26】

前記第１のサブユニットが、配列番号７または配列番号８の残基１９８～３４４を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項27】

操作された前記メガヌクレアーゼがリンカーを含み、前記リンカーが、前記第１のサブユニットと前記第２のサブユニットを共有結合的につなぐ、請求項１～２６のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項28】

操作された前記メガヌクレアーゼが、配列番号７または配列番号８の前記アミノ酸配列を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項29】

配列番号９として規定されているＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼと比較した場合、操作された前記メガヌクレアーゼが、向上した特異性、細胞中の維持時間の減少、および前記ヒトＴＣＲアルファ定常領域遺伝子の改変の効率の増強といった、最適化された特徴のうち少なくとも１つを示す、請求項１～２８のいずれか一項に記載の操作されたメガヌクレアーゼ。

【請求項30】

請求項１～２９のいずれか一項に記載の操作された前記メガヌクレアーゼをコードしている核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。

【請求項31】

前記ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、請求項３０に記載のポリヌクレオチド。

【請求項32】

前記ｍＲＮＡが、請求項１～２９のいずれか一項に記載の操作された前記メガヌクレアーゼおよび少なくとも１つの追加のポリペプチドまたは核酸をコードしているポリシストロニックｍＲＮＡである、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項33】

請求項３０に記載の前記ポリヌクレオチドを含む、組換えＤＮＡ構築物。

【請求項34】

前記組換えＤＮＡ構築物がウイルスベクターをコードする、請求項３３に記載の組換えＤＮＡ構築物。

【請求項35】

前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項３４に記載の組換えＤＮＡ構築物。

【請求項36】

前記ウイルスベクターが組換えＡＡＶベクターである、請求項３４または請求項３５に記載の組換えＤＮＡ構築物。

【請求項37】

請求項３０に記載の前記ポリヌクレオチドを含む、ウイルスベクター。

【請求項38】

前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはＡＡＶベクターである、請求項３７に記載のウイルスベクター。

【請求項39】

前記ウイルスベクターが組換えＡＡＶベクターである、請求項３７または請求項３８に
記載のウイルスベクター。

【請求項40】

遺伝子改変された真核細胞の染色体中へと挿入される関心対象の外因性配列を含む、前記遺伝子改変された真核細胞を産生するための方法であって、前記方法が、
（ａ）請求項１～２９のいずれか一項に記載の前記操作されたメガヌクレアーゼをコードしており、前記操作されたメガヌクレアーゼが、前記真核細胞にて発現されている第１の核酸と、
（ｂ）関心対象の前記配列を含む、第２の核酸と、
を含む、１つまたは複数の核酸を、真核細胞中へと挿入することを含み、前記操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５を含む認識配列にて、前記染色体中に切断部位を作製し、
関心対象の前記配列は、前記切断部位にて前記染色体中へと挿入されている、方法。

【請求項41】

前記第２の核酸が、前記切断部位に隣接する配列に相同な配列を更に含み、関心対象の前記配列が、相同組換えによって前記切断部位に挿入されている、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現が、改変されていないコントロール細胞と比較した場合、遺伝子改変された前記細胞では低下している、請求項４０または請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記真核細胞がヒトＴ細胞、またはヒトＴ細胞から誘導された細胞、またはヒトＮＫ細胞、またはヒトＮＫ細胞から誘導された細胞である、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

関心対象の前記配列が、キメラ抗原受容体または外因性Ｔ細胞受容体のためのコード配列を含む、請求項４０～４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記キメラ抗原受容体または前記外因性Ｔ細胞受容体が、腫瘍特異抗原に対する特異性を有する細胞外リガンド結合ドメインを含む、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

少なくとも前記第１の核酸が、ｍＲＮＡによって前記真核細胞中へと導入される、請求項４０～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

少なくとも前記第２の核酸が、ウイルスベクターによって前記真核細胞中へと導入される、請求項４０～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはＡＡＶベクターである、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記ウイルスベクターが組換えＡＡＶベクターである、請求項４７または請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

遺伝子改変された真核細胞の染色体中へと挿入される関心対象の外因性配列を含む、遺伝子改変された前記真核細胞を産生するための方法であって、前記方法は、
（ａ）請求項１～２９のいずれか一項に記載の前記操作されたメガヌクレアーゼを、真核細胞に導入することと、
（ｂ）前記真核細胞へと関心対象の前記配列を含む核酸を導入することと、を含み、
前記操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５を含む認識配列にて、前記染色体中に切断部位を作製し、
関心対象の前記配列は、前記切断部位にて前記染色体中へと挿入されている、方法。

【請求項51】

前記核酸が、前記切断部位に隣接する配列に相同な配列を更に含み、関心対象の前記配列が、相同組換えによって前記切断部位に挿入されている、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現が、改変されていないコントロール細胞と比較した場合、前記遺伝子改変された細胞では低下している、請求項５０または請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記真核細胞がヒトＴ細胞、またはヒトＴ細胞から誘導された細胞、またはヒトＮＫ細胞、またはヒトＮＫ細胞から誘導された細胞である、請求項５０～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

前記関心対象の配列が、キメラ抗原受容体または外因性Ｔ細胞受容体のためのコード配列を含む、請求項５０～５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

前記キメラ抗原受容体または前記外因性Ｔ細胞受容体が、腫瘍特異抗原に対する特異性を有する、細胞外リガンド結合ドメインを含む、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

前記の核酸が、ウイルスベクターによって前記真核細胞中へと導入される、請求項５０～５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはＡＡＶベクターである、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

前記ウイルスベクターが、組換えＡＡＶベクターである、請求項５５または請求項５６に記載の方法。

【請求項59】

遺伝子改変された真核細胞の染色体のターゲット配列を破壊することによって遺伝子改変された前記真核細胞を産生するための方法であって、前記方法は、
請求項１～２９のいずれか一項に記載の前記操作されたメガヌクレアーゼをコードしている核酸配列を、真核細胞に導入することを含み、前記操作されたメガヌクレアーゼは前記真核細胞で発現されており、
前記操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５を含む認識配列にて前記染色体中に切断部位を作製し、前記ターゲット配列は、前記切断部位にて非相同末端結合することで破壊されている、方法。

【請求項60】

内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現が、改変されていないコントロール細胞と比較した場合、前記遺伝子改変された細胞では低下している、請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

前記真核細胞が、ヒトＴ細胞、またはヒトＴ細胞から誘導された細胞、またはヒトＮＫ細胞、またはヒトＮＫ細胞から誘導された細胞である、請求項５９または請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

前記核酸が、ｍＲＮＡによって前記真核細胞中へと導入される、請求項５９～６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

遺伝子改変された真核細胞の染色体のターゲット配列を破壊することによって遺伝子改変された前記真核細胞を産生するための方法であって、前記方法は、
請求項１～２９のいずれか一項に記載の前記操作されたメガヌクレアーゼを真核細胞に
導入することを含み、
前記操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号５を含む認識配列にて前記染色体中に切断部位を作製し、前記ターゲット配列は、前記切断部位にて非相同末端結合することで破壊されている、方法。

【請求項64】

内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現が、改変されていないコントロール細胞と比較した場合、前記遺伝子改変された細胞では低下している、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記真核細胞が、ヒトＴ細胞、またはヒトＴ細胞から誘導された細胞、またはヒトＮＫ細胞、またはヒトＮＫ細胞から誘導された細胞である、請求項６３または請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

請求項４０～５８のいずれか一項に記載の前記方法によって調製されている、遺伝子改変された真核細胞。

【請求項67】

前記細胞が、配列番号９として規定されているＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼと比較した場合、操作された前記メガヌクレアーゼによるオフターゲット効果の低下、前記真核細胞中の操作された前記メガヌクレアーゼの維持時間の減少、またはその両方を含む、請求項６６に記載の遺伝子改変された真核細胞。

【請求項68】

請求項５９～６５のいずれか一項に記載の前記方法によって調製された、遺伝子改変された真核細胞。

【請求項69】

前記細胞が、配列番号９として規定されているＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼと比較した場合、操作された前記メガヌクレアーゼによるオフターゲット効果の低下、前記真核細胞中の操作された前記メガヌクレアーゼの維持時間の減少、またはその両方を含む、請求項６８に記載の遺伝子改変された真核細胞。

【請求項70】

請求項６６または請求項６７に記載の、複数の遺伝子改変された前記真核細胞を含む、遺伝子改変された真核細胞の集団。

【請求項71】

少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または最大１００％の前記集団中の細胞が、請求項６６または請求項６７に記載の前記遺伝子改変された真核細胞である、請求項７０に記載の集団。

【請求項72】

前記遺伝子改変された真核細胞が、遺伝子改変されたヒトＴ細胞、または遺伝子改変されたヒトＴ細胞から誘導された細胞、または遺伝子改変されたＮＫ細胞、または遺伝子改変されたＮＫ細胞から誘導された細胞である、請求項７０または請求項７１に記載の集団。

【請求項73】

前記関心対象の配列が、キメラ抗原受容体または外因性Ｔ細胞受容体のためのコード配列を含む、請求項７０～７２のいずれか一項に記載の集団。

【請求項74】

前記キメラ抗原受容体または前記外因性Ｔ細胞受容体が、腫瘍特異抗原に対する特異性を有する細胞外リガンド結合ドメインを含む、請求項７３に記載の集団。

【請求項75】

内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現が、改変されていないコントロール細胞と比較した
場合、前記遺伝子改変された真核細胞では低下している、請求項７０～７４のいずれか一項に記載の集団。

【請求項76】

請求項６８または請求項６９に記載の、複数の前記遺伝子改変された真核細胞を含む、遺伝子改変された真核細胞の集団。

【請求項77】

少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または最大１００％の前記集団中の細胞が、請求項６８または請求項６９に記載の前記遺伝子改変された真核細胞である、請求項７６に記載の集団。

【請求項78】

前記遺伝子改変された真核細胞が、遺伝子改変されたヒトＴ細胞、または遺伝子改変されたヒトＴ細胞から誘導された細胞、または遺伝子改変されたＮＫ細胞、または遺伝子改変されたＮＫ細胞から誘導された細胞である、請求項７６または請求項７７に記載の集団。

【請求項79】

前記遺伝子改変された真核細胞が、細胞表面キメラ抗原受容体または外因性Ｔ細胞受容体を含む、請求項７６～７８のいずれか一項に記載の集団。

【請求項80】

前記キメラ抗原受容体または前記外因性Ｔ細胞受容体が、腫瘍特異抗原に対する特異性を有する細胞外リガンド結合ドメインを含む、請求項７９に記載の集団。

【請求項81】

内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現が、改変されていないコントロール細胞と比較した場合、前記遺伝子改変された真核細胞では低下している、請求項７６～８０のいずれか一項に記載の集団。

【請求項82】

治療の必要がある対象において、疾患の治療に有用である薬学的組成物であって、前記薬学的組成物が、薬学的に許容される担体および治療有効量の請求項６６もしくは請求項６７に記載の前記遺伝子改変された真核細胞、または請求項７０～７５のいずれか一項に記載の前記遺伝子改変された真核細胞の集団を含む、薬学的組成物。

【請求項83】

遺伝子改変された前記真核細胞または前記集団が、遺伝子改変されたヒトＴ細胞、または遺伝子改変されたヒトＴ細胞から誘導された細胞、または遺伝子改変されたＮＫ細胞、または遺伝子改変されたＮＫ細胞から誘導された細胞から成る、請求項８２に記載の薬学的組成物。

【請求項84】

前記関心対象の配列が、キメラ抗原受容体または外因性Ｔ細胞受容体のためのコード配列を含む、請求項８２または請求項８３に記載の薬学的組成物。

【請求項85】

前記キメラ抗原受容体または前記外因性Ｔ細胞受容体が、腫瘍特異抗原に対する特異性を有する細胞外リガンド結合ドメインを含む、請求項８４に記載の薬学的組成物。

【請求項86】

内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現が、改変されていないコントロール細胞と比較した場合、前記遺伝子改変された真核細胞では低下している、請求項８２～８５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項87】

治療の必要がある対象において、疾患の治療に有用である薬学的組成物であって、前記薬学的組成物が、薬学的に許容される担体および治療有効量の請求項６８もしくは請求項
６９に記載の前記遺伝子改変された真核細胞、または請求項７６～８１のいずれか一項に記載の遺伝子改変された真核細胞の前記集団を含む、薬学的組成物。

【請求項88】

遺伝子改変された前記真核細胞または前記集団が、遺伝子改変されたヒトＴ細胞、または遺伝子改変されたヒトＴ細胞から誘導された細胞、または遺伝子改変されたＮＫ細胞、または遺伝子改変されたＮＫ細胞から誘導された細胞から成る、請求項８７に記載の薬学的組成物。

【請求項89】

前記遺伝子改変された真核細胞が、細胞表面キメラ抗原受容体または外因性Ｔ細胞受容体を含む、請求項８７または請求項８８に記載の薬学的組成物。

【請求項90】

前記キメラ抗原受容体または前記外因性Ｔ細胞受容体が、腫瘍特異抗原に対する特異性を有する細胞外リガンド結合ドメインを含む、請求項８９に記載の薬学的組成物。

【請求項91】

内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現が、改変されていないコントロール細胞と比較した場合、前記遺伝子改変された真核細胞では低下している、請求項８７～９０のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項92】

治療の必要がある対象において疾患を治療する方法であって、前記方法が、前記対象に、治療有効量の請求項６６～６９のいずれか一項に記載の前記遺伝子改変された真核細胞または請求項７０～８１のいずれか一項に記載の遺伝子改変された真核細胞の前記集団を投与することを含む、方法。

【請求項93】

前記方法が、前記対象に、請求項８２～９１のいずれか一項に記載の前記薬学的組成物を投与することを含む、請求項８０に記載の方法。

【請求項94】

前記方法が、治療の必要がある対象において癌を治療するための免疫療法であり、前記遺伝子改変された真核細胞は、遺伝子改変されたヒトＴ細胞、または遺伝子改変されたヒトＴ細胞から誘導された細胞、または遺伝子改変されたＮＫ細胞、または遺伝子改変されたＮＫ細胞から誘導された細胞であり、前記遺伝子改変された真核細胞が、腫瘍特異抗原に対する特異性を有する細胞外リガンド結合ドメインを含む、細胞表面キメラ抗原受容体または外因性Ｔ細胞受容体を含み、改変されていないコントロール細胞と比較した場合、内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現が、前記遺伝子改変された真核細胞で低下している、請求項９２または請求項９３に記載の方法。

【請求項95】

前記癌が、細胞腫、リンパ腫、肉腫、芽腫、および白血病といった癌から成る群から選択される、請求項９４に記載の方法。

【請求項96】

前記癌が、Ｂ細胞起源の癌、乳癌、胃癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、肺癌、黒色腫、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、およびホジキンリンパ腫から成る群から選択される、請求項９４または請求項９５に記載の方法。

【請求項97】

前記Ｂ細胞起源の癌が、Ｂ細胞系急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、および多発性骨髄腫から成る群から選択される、請求項９６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、腫瘍学、癌免疫療法、分子生物学および組換え核酸技術の分野に関する。特に、本発明は、ヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子における認識配列に対する特異性を有する、最適化された操作されたヌクレアーゼに関する。本発明は更に、遺伝子改変Ｔ細胞を産生するための方法、および対象において、癌を含む疾患を治療するためのかかる細胞を使用する方法における、かかる組換えメガヌクレアーゼの使用に関する。

【0002】

ＥＦＳ－ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表への参照
本出願は、ＥＦＳ－ＷＥＢを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。２０１９年４月１１日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、Ｐ１０９０７００２８ＷＯ００－ＳＥＱという名称であり、サイズは２７００バイトである。

【背景技術】

【0003】

Ｔ細胞養子免疫療法は、癌治療にとって有望なアプローチである。この戦略は、特定の腫瘍関連抗原に対する特異性を高めるために遺伝子改変された、単離されたヒトＴ細胞を利用する。遺伝子改変は、Ｔ細胞に抗原特異性を移植するためのキメラ抗原受容体または外因性Ｔ細胞受容体の発現を含み得る。外因性Ｔ細胞受容体とは対照的に、キメラ抗原受容体は、モノクローナル抗体の可変ドメインから特異性を引き出す。したがって、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）は、主要組織適合遺伝子複合体を制限しない方法で腫瘍免疫活性を誘導する。Ｔ細胞養子免疫療法は、Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、および慢性リンパ性白血病）、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、神経膠芽細胞腫、進行性神経膠腫、卵巣癌、中皮腫、黒色腫、前立腺癌、膵臓癌などを含む、多くの癌に対する臨床療法として利用されてきた。

【0004】

癌治療としてのその潜在的な有用性にもかかわらず、ＣＡＲ Ｔ細胞による養子免疫療法は、細胞表面上での内因性Ｔ細胞受容体の発現によって、部分的にではあるが制限されてきた。内因性Ｔ細胞受容体を発現するＣＡＲ Ｔ細胞は、同種異系患者への投与後に大多数のおよび微量の組織適合性抗原を認識する可能性がある。これは移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発症につながり得る。結果として、臨床試験は、患者のＴ細胞を分離し、キメラ抗原受容体を組み込むように遺伝子改変されてからその後に同じ患者に再注入するといった、主に自家ＣＡＲ Ｔ細胞の使用に焦点を合わせている。自家アプローチは、投与されたＣＡＲ Ｔ細胞に免疫寛容を提供する。ただし、このアプローチは、患者の癌が診断された後、患者固有のＣＡＲ Ｔ細胞を産生するために必要な時間と費用の両方によって制約される。

【0005】

したがって、内因性Ｔ細胞受容体の発現を低下させ、投与時にＧＶＨＤを発症しない、第三者の健康なドナーからのＴ細胞を使用して調製された「既製の」ＣＡＲ Ｔ細胞を開発することは有利であろう。かかる産物は、診断に先立っての生成および検証が可能であり、必要に応じてすぐに患者の利用が可能である。したがって、ＧＶＨＤの発生を防ぐために、内因性Ｔ細胞受容体を欠く同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞の開発が必要である。

【0006】

ゲノムＤＮＡの遺伝子改変は、目的の遺伝子座のＤＮＡ配列を認識するように操作された、部位特異的でレアカッティングであるエンドヌクレアーゼを使用して行うことができる。ホーミングエンドヌクレアーゼは、植物や真菌のゲノムに一般的に見られる１５～４
０塩基対の切断部位を認識する、天然に存在するヌクレアーゼのグループである。それらは、グループ１の自己スプライシングイントロンやインテインなどの寄生ＤＮＡ因子に関連していることが多い。それらは、染色体に二本鎖切断を生じさせることにより、宿主ゲノムの特定の位置での相同組換えまたは遺伝子挿入を自然に促進し、細胞のＤＮＡ修復機構を動員する（非特許文献１）。ホーミングエンドヌクレアーゼは、一般に、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）ファミリー、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ－Ｃｙｓボックスファミリー、およびＨＮＨファミリーの４つのファミリーに分類されている。これらのファミリーは、触媒活性と認識配列に影響を与える構造モチーフによって特徴付けられている。例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）ファミリーのメンバーは、保存されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）モチーフの１つまたは２つのコピーを有することを特徴としている（非特許文献２を参照されたい）。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）モチーフの単一コピーを有するＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）ホーミングエンドヌクレアーゼはホモ二量体を形成するが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）モチーフの２つのコピーを有するメンバーは単量体として確認される。

【0007】

Ｉ－Ｃｒｅｌ（配列番号１）は、藻類であるクラミドモナス・レインハルディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）の葉緑体染色体における２２塩基対の認識配列を認識しかつ切断する、ホーミングエンドヌクレアーゼのＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）ファミリーのメンバーである。野生型Ｉ－Ｃｒｅｌ切断部位の優先性を改変するため、遺伝子セレクション技術が用いられている（非特許文献３～６）。
より最近では、Ｉ－Ｃｒｅｌおよび他のホーミングエンドヌクレアーゼを包括的に再設計し、哺乳動物、酵母、植物、細菌、およびウイルスのゲノム中の部位を含む、幅広く多岐にわたるＤＮＡ部位を標的とすることができる、モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）ホーミングエンドヌクレアーゼを合理的に設計する方法が記載されている（特許文献１）。

【0008】

特許文献２に最初に記載されているように、Ｉ－Ｃｒｅｌおよびその操作された誘導体は通常二量体であるが、第１のサブユニットのＣ末端を第２のサブユニットのＮ末端に結合する短いペプチドリンカーを使用して、単一のポリペプチドに融合することができる（非特許文献７～８）。したがって、機能的な「一本鎖」メガヌクレアーゼは、単一の転写物から発現させることができる。

【0009】

小ヘアピンＲＮＡ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガＴＡＬ、およびＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、非特許文献９～１０、特許文献３～４）の使用を含む、内因性ＴＣＲの発現を破壊するためのヌクレアーゼの使用が開示されている。

【0010】

ヒトＴＣＲアルファ定常領域遺伝子のＤＮＡ標的を切断するための、操作されたメガヌクレアーゼの特定の使用もこれまでに開示されている。例えば、特許文献５は、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子のエクソン１内の認識配列（特許文献５の配列番号３）を標的とするように操作された、Ｉ－Ｏｎｕｌメガヌクレアーゼのバリアントを開示していた。特許文献５は、キメラ抗原受容体がＴＣＲノックアウト細胞で発現され得ることを論じているが、著者らは、メガヌクレアーゼ切断部位へのＣＡＲコード配列の挿入を開示していない。

【0011】

更に、特許文献６および特許文献７において、出願人は、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子のエクソン１の認識配列に特異性を有する、操作されたメガヌクレアーゼを開示した。これらには、エクソン１のＴＲＣ１－２認識配列（配列番号５）に特異性を有する、「ＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼ」が含まれていた。特許文献６および特許文献７の出版物は、ＣＡＲコード配列または外因性ＴＣＲコード配列を、ＴＣＲ１～２メガヌクレアーゼの
切断部位に標的挿入する方法も開示した。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】国際公開第２００７／０４７８５９号公報

【特許文献2】国際公開第２００９／０５９１９５号公報

【特許文献3】米国特許第８，９５６，８２８号公報

【特許文献4】米国特許公開公報第２０１２／０３２１６６７号公報

【特許文献5】国際公開第２０１４／１９１５２７号公報

【特許文献6】国際公開公報第２０１７／０６２４３９号公報

【特許文献7】国際公開公報第２０１７／０６２４５１号公報

【非特許文献】

【0013】

【非特許文献1】Ｓｔｏｄｄａｒｄ（２００６），Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８：４９－９５

【非特許文献2】Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９（１８）：３７５７－３７７４

【非特許文献3】Ｓｕｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３１－４１

【非特許文献4】Ｃｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：ｅ１７８

【非特許文献5】Ｓｅｌｉｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：３８７０－９

【非特許文献6】Ａｒｎｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５：４４３－５８

【非特許文献7】Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７：１６５０－６２

【非特許文献8】Ｇｒｉｚｏｔ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７：５４０５－１９

【非特許文献9】Ｏｓｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２４（３）：５７０－５８１

【非特許文献10】Ｅｙｑｕｅｍ ｅｔ ａｌ．（２０１７），Ｎａｔｕｒｅ５４３：１１３－１１７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

本発明において、出願人は、先行技術で教示されたヌクレアーゼおよび方法を改良した。広範囲の実験を通じて、出願人は、残基のユニークで予測不可能な組合せを含み、特許文献６および特許文献７で教示された第１世代のＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼよりも予想外に優れている、新規の第２世代のＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼを生成した。例えば、本発明の第２世代のＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼは、向上した（すなわち増加した）特異性および低下したオフターゲット切断を有し、ｍＲＮＡからの発現後、細胞における維持時間の減少を示し、ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、増強／増加したＴＣＲノックアウト、増強／増加したＣＡＲノックイン、増強／増加したＣＡＲ Ｔの増殖、向上したＣＡＲ Ｔ細胞表現型など）を生成するのに使用される場合、およびインビトロにて機能的に優れ、かつ実物大のＣＡＲ Ｔ細胞製造プロセスにて使用される場合、向上したＣＡＲ Ｔ細胞集団を産生する。

【課題を解決するための手段】

【0015】

発明の概要
本発明は、ヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ定常領域遺伝子（配列番号３）の第１エクソン内に存在する認識配列を認識かつ切断する、操作されたメガヌクレアーゼを提供する。かかるメガヌクレアーゼは、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子を破壊し、結果的に細胞表面ＴＣＲの発現および／または機能を破壊するのに有用である。メガヌクレアーゼ切断は、非相同末端結合の変異原性活性によって、または相同組換えによる遺伝子中への外因性ポリヌクレオチドの導入を促進することのいずれかによって、遺伝子機能を破壊することができる。一部の実施形態では、メガヌクレアーゼは内因性ＴＣＲを欠く同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞を生成するのに有用であるため、導入された外因性ポリヌクレオチドはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の操作されたメガヌクレアーゼは、第１世代のメガヌクレアーゼであるＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥと比較して、少なくとも１つの最適化された特徴を示す。かかる最適化された特徴には、オフターゲット切断を低下させ、細胞中の維持時間（例えばｍＲＮＡ由来の発現後）を低下させ、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子の改変の効率を増強（すなわち増加）させる原因となる、向上（すなわち増加）した特異性が挙げられる。更に、本開示の操作されたメガヌクレアーゼで遺伝子改変された細胞は、向上した特徴を示す。この特徴は、オフターゲット切断およびその効果を低下させ、細胞中のメガヌクレアーゼの維持時間を減少させ、ＣＡＲ Ｔの増殖を増強（すなわち増加）させることを含む。更に、該細胞は、ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼで遺伝子改変された細胞と比較した場合、分化程度が低い。加えて、本開示のメガヌクレアーゼ（またはこれをコードする核酸）が中に導入された細胞集団は、ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼ（またはこれをコードする核酸）が中に導入された細胞集団と比較した場合、より多い比率にて、改変された細胞、およびより大きい比率にて分化程度の低い細胞を有する。

【0016】

本発明は更に、遺伝子改変された真核細胞を産生するため、操作されたメガヌクレアーゼタンパク質、すなわち操作されたメガヌクレアーゼをコードしている遺伝子を真核細胞へ輸送することを含む方法を提供する。したがって、遺伝子改変された真核細胞およびその集団、ならびに遺伝子改変された真核細胞およびその集団を含む薬学的組成物を更に提供する。遺伝子改変されたＴ細胞またはその集団を投与することで癌を治療する免疫療法の方法であり、該Ｔ細胞が腫瘍特異抗原（例えばＣＡＲまたは外因性ＴＣＲ）のための受容体を発現する方法もまた提供する。

【0017】

したがって一態様では、本発明は、ヒトＴＣＲアルファ定常領域遺伝子（配列番号３）のエクソン１中のＴＲＣ１－２認識配列（配列番号５）を認識かつ切断する操作されたメガヌクレアーゼを提供する。操作されたメガヌクレアーゼは、第１のサブユニットおよび第２のサブユニットを含み、このうち第１のサブユニットは、認識配列の第１の認識ハーフサイトと結合し、かつ第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含み、第２のサブユニットは、認識配列の第２の認識ハーフサイトと結合し、本開示のＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２（配列番号７として規定されているアミノ酸配列）の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列相同性を有するか、本開示のＴＲＣ１－２Ｌ．１７７５メガヌクレアーゼ（配列番号８として規定されているアミノ酸配列）の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列相同性を有する、第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含む。

【0018】

ある特定の実施形態では、ＨＶＲ２領域は、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１箇所のアミノ酸置換を伴う、配列番号７または配列番号８の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列を含む。

【0019】

一部の実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号７の残基２４、２６、４２、４４、４６、４８、５０、７０、７１、７２および７３に対応する残基を含む。

【0020】

一部の実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号８の残基２４、２６、３８、４２、４６、４８、５０、および７０に対応する残基を含む。

【0021】

一部の実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号７または配列番号８の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４，４６、６８、７０、７５および７７に対応する残基を含む。

【0022】

一部の実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号７の残基４８、５０、７１、７２および７３に対応する残基を含む。

【0023】

一部の実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号８の残基４８および５０に対応する残基を含む。

【0024】

一部の実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号７または配列番号８の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、６８、７０、７１、７２、７３、７５および７７に対応する残基を含む。

【0025】

一部の実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号７または配列番号８の残基６６に対応する残基にて、Ｙ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。

【0026】

ある特定の実施形態では、ＨＶＲ２領域は配列番号７または配列番号８の残基２４～７９を含む。

【0027】

特定の実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号７または配列番号８の残基７～１５３に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれ以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号７の残基７～１５３に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも９３％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号８の残基７～１５３に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも９４％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。

【0028】

一部の実施形態では、第２のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５，１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０箇所のアミノ酸置換を伴う、配列番号７または配列番号８の残基７～１５３に対応するアミノ酸配列を含む。

【0029】

ある特定の実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号７または配列番号８の残基１９に対応する残基にて、Ｇ、ＳまたはＡを含む。

【0030】

ある特定の実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号７または配列番号８の残基８０に対応する残基にＥ、Ｑ、またはＫを含む。

【0031】

一部の実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号７または配列番号８の残基８０に対応する残基を含む。

【0032】

ある特定の実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号７または配列番号８の残基１３９に対応する残基を含む。

【0033】

特定の実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号７または配列番号８の残基７～１５３を含む。

【0034】

一部のかかる実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号７または配列番号８の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれ以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＨＶＲ１領域は、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１箇所のアミノ酸置換を伴う、配列番号７または配列番号８の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列を含む。

【0035】

一部の実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号７の残基２１９および２３１に対応する残基を含む。

【0036】

ある特定の実施形態では、ＨＶＲ１領域は配列番号７または配列番号８の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する残基を含む。

【0037】

一部の実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号７または配列番号８の残基２５７に対応する残基にて、Ｙ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。

【0038】

特定の実施形態では、ＨＶＲ１領域は配列番号７または配列番号８の残基２１５～２７０を含む。

【0039】

一部の実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号７または配列番号８の残基１９８～３４４に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれ以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号７または配列番号８の残基１９８～３４４に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第１のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５，１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０箇所のアミノ酸置換を伴う、配列番号７または配列番号８の残基１９８～３４４に対応するアミノ酸配列を含む。

【0040】

ある特定の実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号７または配列番号８の残基２１０に対応する残基にて、Ｇ、ＳまたはＡを含む。

【0041】

ある特定の実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号７または配列番号８の残基
２７１に対応する残基にて、Ｅ、ＱまたはＫを含む。

【0042】

ある特定の実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号７または配列番号８の残基２７１に対応する残基を含む。

【0043】

特定の実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号７または配列番号８の残基１９８～３４４を含む。

【0044】

一部の実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼの第１のサブユニットは、配列番号７または配列番号８の残基１９８～３４４に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列相同性を有し、第２のサブユニットは、配列番号７または配列番号８の残基７～１５３に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼの第１のサブユニットは、配列番号７または配列番号８の残基１９８～３４４に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも９９％の配列相同性を有し、第２のサブユニットは、配列番号７または配列番号８の残基７～１５３に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも９３％を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のサブユニットおよび／または第２のサブユニットは、それぞれ配列番号７または配列番号８の残基１９８～３４４および残基７～１５３に対し、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５，１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０箇所のアミノ酸置換を含むことができる。

【0045】

ある特定の実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼはリンカーを含む。このリンカーは第１のサブユニットと第２のサブユニットを共有結合的につなぐ。

【0046】

一部の実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列に対し、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７のアミノ酸配列に対し、少なくとも９７％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号８のアミノ酸配列に対し、少なくとも９８％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。

【0047】

特定の実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列を含む。

【0048】

ある特定の実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号９として規定されているＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥであるメガヌクレアーゼと比較した場合、向上（すなわち増加）した特異性、細胞中の維持時間の減少、およびヒトＴＣＲアルファ定常領域遺伝子の改変の効率を増強（すなわち増加）といった、最適化された特徴のうち少なくとも１つを示す。

【0049】

特定の実施形態では、ヒトＴＣＲアルファ定常領域遺伝子中の配列番号５を含む認識配列を認識かつ切断する操作されたメガヌクレアーゼは、第１のサブユニットおよび第２の
サブユニットを含み、第１のサブユニットは、（ａ）配列番号７または配列番号８の残基１９８～３４４に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上の配列相同性を有するアミノ酸配列、および（ｂ）配列番号７または配列番号８の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上の配列相同性を有する、ＨＶＲ１領域を含み、第２のサブユニットは、（ａ）配列番号７または配列番号８の残基７～１５３に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上の配列相同性を有するアミノ酸配列、および（ｂ）配列番号７または配列番号８の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上の配列相同性を有する、ＨＶＲ２領域を含む。

【0050】

特定の実施形態では、ヒトＴＣＲアルファ定常領域遺伝子中の配列番号５を含む認識配列を認識かつ切断する操作されたメガヌクレアーゼは、第１のサブユニットおよび第２のサブユニットを含み、第１のサブユニットは、（ａ）配列番号７または配列番号８の残基１９８～３４４に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上の配列相同性を有するアミノ酸配列、および（ｂ）配列番号７または配列番号８の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上の配列相同性を有し、かつ配列番号７または配列番号８の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する残基を含む、ＨＶＲ１領域を含み、第２のサブユニットは、（ａ）配列番号７または配列番号８の残基７～１５３に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上の配列相同性を有するアミノ酸配列、および（ｂ）配列番号７または配列番号８の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上の配列相同性を有し、かつ配列番号７または配列番号８の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５および７７に対応する残基を含む、ＨＶＲ２領域を含む。かかる実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号７の残基４８、５０、７１、７２および７３に対応する残基ならびに／または配列番号８の残基４８および５０に対応する残基を更に含むことができる。

【0051】

特定の実施形態では、ヒトＴＣＲアルファ定常領域遺伝子中の配列番号５を含む認識配列を認識かつ切断する操作されたメガヌクレアーゼは、第１のサブユニットおよび第２のサブユニットを含み、第１のサブユニットは、（ａ）配列番号７または配列番号８の残基１９８～３４４に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上の配列相同性を有するアミノ酸配列、および（ｂ）配列番号７または配列番号８の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上の配列相同性を有し、かつ配列番号７または配列番号８の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する残基を含む、ＨＶＲ１領域を含み、第２のサブユニットは、（ａ）配列番号７または配列番号８の残基７～１５３に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上の配列相同性を有するアミノ酸配列、および（ｂ）配列番号７または配列番号８の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上の配列相同性を有し、かつ配列番号７または配列番号８の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、６８、７０、７１、７２、７３、７５および７７に対応する残基を含む、ＨＶＲ２領域を含む。

【0052】

更に他の実施形態では、ヒトＴＣＲアルファ定常領域遺伝子中の配列番号５を含む認識配列を認識かつ切断する操作されたメガヌクレアーゼは、第１のサブユニットおよび第２のサブユニットを含み、第１のサブユニットは、（ａ）配列番号７または配列番号８の残基１９８～３４４に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上の配列相同性を有するアミノ酸配列、および（ｂ）配列番号７または配列番号８の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列を有するＨＶＲ１領域を含み、第２のサブユニットは、（ａ）配列番号７または配列番号８の残基７～１５３に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上の配列相同性を有するアミノ酸配列、および（ｂ）配列番号７または配列番号８の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列を有するＨＶＲ２領域を含む。

【0053】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載された操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。

【0054】

ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。

【0055】

更なる実施形態では、ｍＲＮＡは本明細書に記載された操作されたメガヌクレアーゼおよび少なくとも１つの追加のポリペプチドまたは核酸をコードするポリシストロニックｍＲＮＡである。

【0056】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載されたポリヌクレオチドを含む、組換えＤＮＡ構築物を提供する。

【0057】

ある特定の実施形態では、組換えＤＮＡ構築物はウイルスベクターをコードする。特定の実施形態では、ウイルスベクターはアデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。具体的な実施形態では、ウイルスベクターは組換えＡＡＶベクターである。

【0058】

別の態様では、本発明は本明細書に記載されたポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを提供する。

【0059】

ある特定の実施形態では、ウイルスベクターはアデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはＡＡＶベクターである。特定の実施形態では、ウイルスベクターは組換えＡＡＶベクターである。

【0060】

別の態様では、本発明は、真核細胞の染色体へと挿入される目的の外因性配列を含む、遺伝子改変された真核細胞を産生するための方法を提供する。該方法は、（ａ）本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼをコードし、操作されたメガヌクレアーゼが真核細胞内で発現されている第１の核酸と、（ｂ）目的の配列を含み、操作されたメガヌクレアーゼが、配列番号５を含む認識配列にて染色体中に切断部位を作製し、かつ目的の配列が、切断部位にて染色体中へと挿入される第２の核酸と、を含む１種以上の核酸を、真核細胞へと導入することを含む。

【0061】

該方法のある特定の実施形態では、第２の核酸は、切断部位に隣接する配列に相同な配列を更に含み、目的の配列が、相同組換えによって切断部位にて挿入されている。

【0062】

該方法のある特定の実施形態では、第２の核酸は、切断部位に隣接する配列に相同な配列を含まず、目的の配列が、非相同挿入によって切断部位にて挿入されている。

【0063】

該方法のある特定の実施形態では、内因性Ｔ細胞受容体（例えば、アルファ／ベータＴ細胞受容体）の細胞表面発現は、改変されていないコントロール細胞と比較した場合、低下している。

【0064】

方法の一部の実施形態では、真核細胞はヒトＴ細胞、またはヒトＴ細胞から誘導された細胞、またはヒトＮＫ細胞、またはヒトＮＫ細胞から誘導された細胞である。

【0065】

方法の一部の実施形態では、目的の配列は、キメラ抗原受容体または外因性Ｔ細胞受容体のためのコード配列を含む。方法の特定の実施形態では、キメラ抗原受容体または外因性Ｔ細胞受容体は、腫瘍特異抗原に対する特異性を有する、細胞外リガンド結合ドメインを含む。

【0066】

方法の一部の実施形態では、少なくとも第１の核酸は、ｍＲＮＡによって真核細胞へと導入される。

【0067】

該方法のある特定の実施形態では、少なくとも第２の核酸は、ウイルスベクターによって真核細胞へと導入される。方法の特定の実施形態では、ウイルスベクターはアデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはＡＡＶベクターである。方法の特定の実施形態では、ウイルスベクターは組換えＡＡＶベクターである。

【0068】

別の態様では、本発明は、真核細胞の染色体へと挿入される目的の外因性配列を含む、遺伝子改変された真核細胞を産生するための方法を提供する。該方法は、（ａ）本明細書に記載された操作されたメガヌクレアーゼを真核細胞内へと導入することと、（ｂ）目的の配列を含む核酸を真核細胞内へと導入することであって、操作されたメガヌクレアーゼが、配列番号５を含む認識配列にて染色体中に切断部位を作製し、かつ目的の配列が、切断部位にて染色体中へと挿入されることと、を含む。

【0069】

該方法のある特定の実施形態では、核酸は、切断部位に隣接する配列に相同な配列を更に含み、目的の配列が、相同組換えによって切断部位にて挿入されている。

【0070】

該方法のある特定の実施形態では、核酸は、切断部位に隣接する配列に相同な配列を含まず、目的の配列が、非相同的な導入によって切断部位にて挿入されている。

【0071】

該方法のある特定の実施形態では、内因性Ｔ細胞受容体（例えば、アルファ／ベータＴ細胞受容体）の細胞表面発現は、改変されていないコントロール細胞と比較した場合、低下している。

【0072】

方法の一部の実施形態では、真核細胞はヒトＴ細胞、またはヒトＴ細胞から誘導された細胞、またはヒトＮＫ細胞、またはヒトＮＫ細胞から誘導された細胞である。

【0073】

方法の一部の実施形態では、目的の配列は、キメラ抗原受容体または外因性Ｔ細胞受容体のためのコード配列を含む。方法の特定の実施形態では、キメラ抗原受容体または外因性Ｔ細胞受容体は、腫瘍特異抗原に対する特異性を有する、細胞外リガンド結合ドメインを含む。

【0074】

該方法のある特定の実施形態では、核酸はウイルスベクターによって真核細胞へと導入される。方法の特定の実施形態では、ウイルスベクターはアデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはＡＡＶベクターである。方法の特定の実施形態では、ウイルスベクターは組換えＡＡＶベクターである。

【0075】

別の態様では、本発明は、真核細胞の染色体のターゲット配列を破壊することで、遺伝子改変された真核細胞を産生するための方法を提供する。該方法は、本明細書に記載された操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸を真核細胞へと導入することを含み、操作されたメガヌクレアーゼが真核細胞内で発現され、かつ操作されたメガヌクレアーゼは配列番号５を含む認識配列にて染色体中に切断部位を作製し、非相同末端結合により切断部位にてターゲット配列を破壊する。

【0076】

該方法のある特定の実施形態では、内因性Ｔ細胞受容体（例えば、アルファ／ベータＴ細胞受容体）の細胞表面発現は、改変されていないコントロール細胞と比較した場合、低下している。

【0077】

方法の一部の実施形態では、真核細胞はヒトＴ細胞、またはヒトＴ細胞から誘導された細胞、またはヒトＮＫ細胞、またはヒトＮＫ細胞から誘導された細胞である。

【0078】

方法の一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡによって真核細胞へと導入される。

【0079】

別の態様では、本発明は、真核細胞の染色体のターゲット配列を破壊することで、遺伝子改変された真核細胞を産生するための方法を提供する。該方法は、本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼを真核細胞へと導入することを含み、操作されたメガヌクレアーゼが配列番号５を含む認識配列にて染色体中に切断部位を作製し、非相同末端結合により切断部位にてターゲット配列を破壊する。

【0080】

該方法のある特定の実施形態では、内因性Ｔ細胞受容体（例えば、アルファ／ベータＴ細胞受容体）の細胞表面発現は、改変されていないコントロール細胞と比較した場合、低下している。

【0081】

方法の一部の実施形態では、真核細胞はヒトＴ細胞、またはヒトＴ細胞から誘導された細胞、またはヒトＮＫ細胞、またはヒトＮＫ細胞から誘導された細胞である。

【0082】

別の態様では、本発明は、ゲノムにて改変ヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子を含む、遺伝子改変された真核細胞を提供し、改変ヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子は、Ｔ細胞受容体アルファ定常領域内の配列番号５内のエクソン１中へと挿入されている目的の外因性配列を含み、遺伝子改変された真核細胞は、本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼを用いる本明細書に記載の方法によって調製される。

【0083】

ある特定の実施形態では、遺伝子改変された真核細胞は、遺伝子改変されたヒトＴ細胞、またはヒトＴ細胞から誘導された細胞、またはヒトＮＫ細胞、またはヒトＮＫ細胞から誘導された細胞である。

【0084】

ある特定の実施形態では、目的の配列は、キメラ抗原受容体または外因性Ｔ細胞受容体のためのコード配列を含む。特定の実施形態では、キメラ抗原受容体または外因性Ｔ細胞受容体は、腫瘍特異抗原に対する特異性を有する、細胞外リガンド結合ドメインを含む。

【0085】

特定の実施形態では、内因性Ｔ細胞受容体（例えば、アルファ／ベータＴ細胞受容体）の細胞表面発現は、改変されていないコントロール細胞と比較した場合、遺伝子改変された真核細胞上では低下している。

【0086】

特定の実施形態では、遺伝子改変された真核細胞は、配列番号９として規定されているＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥであるメガヌクレアーゼと比較した場合、操作されたメガヌク
レアーゼによるオフターゲット効果の低下、および／または細胞中の操作されたメガヌクレアーゼの維持時間の減少を含む。

【0087】

別の態様では、本発明は、配列番号５を含む認識配列にて破壊されたターゲット配列を有する染色体を含む、遺伝子改変された真核細胞を提供し、ターゲット配列は、切断部位にて非相同末端結合により破壊され、遺伝子改変された真核細胞は、本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼを用いる本明細書に記載の方法によって調製される。

【0088】

ある特定の実施形態では、遺伝子改変された真核細胞は、遺伝子改変されたヒトＴ細胞、またはヒトＴ細胞から誘導された細胞、またはヒトＮＫ細胞、またはヒトＮＫ細胞から誘導された細胞である。

【0089】

特定の実施形態では、内因性Ｔ細胞受容体（例えば、アルファ／ベータＴ細胞受容体）の細胞表面発現は、改変されていないコントロール細胞と比較した場合、遺伝子改変された真核細胞上では低下している。

【0090】

特定の実施形態では、遺伝子改変された真核細胞は、配列番号９として規定されているＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥであるメガヌクレアーゼと比較した場合、操作されたメガヌクレアーゼによるオフターゲット効果の低下、および／または細胞中の維持時間の減少を含む。

【0091】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載の遺伝子改変された複数の真核細胞を含む、遺伝子改変された真核細胞の集団を提供する。

【0092】

一部の実施形態では、該集団中、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または最大１００％の細胞は、本明細書に記載されているような遺伝子改変された真核細胞である。

【0093】

特定の実施形態では、集団の遺伝子改変された真核細胞は、遺伝子改変されたヒトＴ細胞、またはそのヒトＴ細胞から誘導された細胞、または遺伝子改変されたＮＫ細胞、またはそのＮＫ細胞から誘導された細胞である。

【0094】

ある特定の実施形態では、集団の遺伝子改変された真核細胞は、細胞表面キメラ抗原受容体または外因性Ｔ細胞受容体を含む。これらの実施形態のうち、一部では、キメラ抗原受容体または外因性Ｔ細胞受容体は、腫瘍特異抗原に対する特異性を有する細胞外リガンド結合ドメインを含む。

【0095】

特定の実施形態では、集団の遺伝子改変された真核細胞は、改変されていないコントロール細胞と比較した場合、内因性Ｔ細胞受容体（例えば、アルファ／ベータＴ細胞受容体）の細胞表面発現を低下させる。

【0096】

別の態様では、本発明は、治療の必要がある対象において、疾患の治療に有用である薬学的組成物を提供する。該薬学的組成物は、薬学的に許容される担体および治療有効量の本明細書に記載の遺伝子改変された真核細胞またはその集団を含む。

【0097】

ある特定の実施形態では、遺伝子改変された真核細胞またはその集団は、遺伝子改変さ
れたヒトＴ細胞、またはそのヒトＴ細胞から誘導された細胞、または遺伝子改変されたＮＫ細胞、またはそのＮＫ細胞から誘導された細胞から成る。

【0098】

一部の実施形態では、遺伝子改変されたＴ細胞またはその集団中に存在している目的の外因性配列は、キメラ抗原受容体または外因性Ｔ細胞受容体のためのコード配列を含む。ある特定の実施形態では、キメラ抗原受容体または外因性Ｔ細胞受容体は、腫瘍特異抗原に対する特異性を有する細胞外リガンド結合ドメインを含む。

【0099】

一部の実施形態では、内因性Ｔ細胞受容体（例えば、アルファ／ベータＴ細胞受容体）の細胞表面発現は、改変されていないコントロール細胞と比較した場合、遺伝子改変された真核細胞上では低下されている。

【0100】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載の少なくとも１種の操作されたメガヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡを含む、脂質ナノ粒子、または脂質ナノ粒子製剤を提供する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、Ｔ細胞による輸送および摂取を増加させた組成物を有する。

【0101】

別の態様では、本発明は、治療の必要がある対象における疾患の治療方法を提供し、該方法は、治療有効量の、本明細書に記載の遺伝子改変された真核細胞またはその集団を、対象に投与することを含む。

【0102】

一部の実施形態では、該方法は、本明細書に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む。

【0103】

ある特定の実施形態では、該方法は、治療の必要がある対象における、癌の治療のための免疫療法である。一部のかかる実施形態では、遺伝子改変された真核細胞は、遺伝子改変されたヒトＴ細胞、またはそのヒトＴ細胞から誘導された細胞、または遺伝子改変されたヒトＮＫ細胞、またはそのヒトＮＫ細胞から誘導された細胞であり、遺伝子改変された真核細胞中に存在している目的の外因性配列は、腫瘍特異抗原に対する特異性を有する細胞外リガンド結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体または外因性Ｔ細胞受容体のためのコード配列を含み、内因性Ｔ細胞受容体（例えば、アルファ／ベータＴ細胞受容体）の細胞表面発現は、改変されていないコントロール細胞と比較した場合、遺伝子改変された真核細胞上では低下されている。

【0104】

方法の一部の実施形態では、癌は、細胞腫、リンパ腫、肉腫、芽腫、および白血病といった癌から成る群から選択される。

【0105】

該方法のある特定の実施形態では、癌は、Ｂ細胞起源の癌、乳癌、胃癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、肺癌、黒色腫、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、およびホジキンリンパ腫から成る群から選択される。

【0106】

方法の特定の実施形態では、Ｂ細胞起源の癌は、Ｂ細胞系急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、および多発性骨髄腫から成る群から選択される。

【0107】

方法の特定の実施形態では、対象はヒトといった哺乳動物であり得る。

【0108】

別の態様では、本発明は、薬物として使用する目的で、本明細書に記載されたような遺伝子改変された細胞、またはその集団を提供する。本発明は、治療の必要がある対象において疾患を治療するための薬物を製造する際、本明細書に記載されたような遺伝子改変さ
れた細胞、またはその集団を更に提供する。かかる一態様では、薬物は癌の治療において有用である。

【0109】

別の態様では、本発明は、疾患の治療、好ましくは癌の治療において使用するための、本明細書に記載されたような遺伝子改変された細胞、またはその集団を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0110】

【図1】ヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子中のＴＲＣ１－２認識配列である。本発明の操作されたメガヌクレアーゼによって標的とされた、ＴＲＣ１－２認識配列は、２つの認識ハーフサイトを含む。各認識ハーフサイトは、９塩基対を含むが、これは４塩基対中央配列によって分離されている。ＴＲＣ１－２認識配列（配列番号５）は、ＴＲＣ１およびＴＲＣ２と呼ばれる２つの認識ハーフサイトを含む。

【図2】本発明の操作されたメガヌクレアーゼは２つのサブユニットを含み、ＨＶＲ１領域を含む第１のサブユニットは、第１の認識ハーフサイト（例えばＴＲＣ１）と結合しており、ＨＶＲ２領域を含む第２のサブユニットは、第２の認識ハーフサイト（例えばＴＲＣ２）と結合している。操作されたメガヌクレアーゼが一本鎖メガヌクレアーゼである場合の実施形態では、ＨＶＲ１領域を含む第１のサブユニットは、Ｎ末端ユニットまたはＣ末端サブユニットのどちらかとして位置づけられ得る。同様に、ＨＶＲ２領域を含む第２のサブユニットは、Ｎ末端ユニットまたはＣ末端サブユニットのどちらかとして位置づけられ得る。

【図3】本発明の操作されたメガヌクレアーゼを評価するためのＣＨＯ細胞における、レポータアッセイの概略である。中でレポータ活性が細胞のゲノム中へと安定して組み込まれる、ＣＨＯ細胞が産生された。レポータカセットは、５’から３’の順で、ＳＶ４０初期プロモータ、５’の２／３のＧＦＰ遺伝子、本発明の操作されたメガヌクレアーゼのための認識配列（例えばＴＲＣ１－２認識配列）、ＣＨＯ２３／２４メガヌクレアーゼのための認識配列（国際公開２０１２／１６７１９２号）、および３’の２／３のＧＦＰ遺伝子を含んでいた。このカセットを用いて安定して遺伝子導入された細胞は、ＤＮＡ切断誘導剤の不在下ではＧＦＰを発現しなかった。メガヌクレアーゼは、各メガヌクレアーゼをコードしているプラスミドＤＮＡまたはｍＲＮＡを形質導入することで導入された。ＤＮＡ切断がメガヌクレアーゼ認識配列のいずれかにて誘導された場合、ＧＦＰ遺伝子の重複領域は、機能的ＧＦＰ遺伝子を産生するために互いと組み換えた。次いで、ＧＦＰ発現細胞の比率は、メガヌクレアーゼによるゲノム切断頻度を間接的に測定するものであるフローサイトメトリによって決定可能であった。

【図4】ＣＨＯ細胞レポータアッセイ中のＴＲＣ１－２認識配列を認識かつ切断するための、操作されたメガヌクレアーゼの効率である。ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２、ＴＲＣ１－２Ｌ．１７７５およびＴＲＣ１－２Ｌ．１８４３メガヌクレアーゼは、ＴＲＣ１－２認識配列（配列番号５）を標的とするために操作され、ＣＨＯ細胞レポータアッセイ中の有効性についてスクリーニングされた。示された結果は、観察されたＧＦＰ発現細胞の比率を提供している。これは、ターゲット認識配列またはＣＨＯ２３／２４認識配列を切断するための各メガヌクレアーゼの有効性を示している。ネガティブコントロール（ｂｓ）および第１世代のＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥは、比較用アッセイ中に更に含まれた。Ａ）ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２を認識するためのＣＨＯレポータアッセイ。Ｂ）ＴＲＣ１－２Ｌ．１７７５を認識するためのＣＨＯレポータアッセイ。Ｃ）ＴＲＣ１－２Ｌ．１８４３を認識するためのＣＨＯレポータアッセイ。

【図5】ＣＨＯレポータアッセイにおける、ＴＲＣオフ１認識配列（配列番号１６）およびＴＲＣオフ２認識配列（配列番号１７）を認識かつ切断するための操作されたメガヌクレアーゼの効率である。本発明のＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡは、ＧＦＰ直列反復配列の間の対抗選択されたオフ１認識配列またはオフ２認識配列、およびＣＨＯ２３～２４認識配列を含む、ＣＨＯレポータ細胞中へと遺伝子導入された。第２世代のメガヌクレアーゼは、第１世代のＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥに対する各アッセイにて比較された。Ａ）ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２およびＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥによるオフターゲット認識配列の切断。Ｂ）ＴＲＣ１－２Ｌ．１７７５およびＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥによるオフターゲット認識配列の切断。Ｃ）ＴＲＣ１－２Ｌ．１８４３およびＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥによるオフターゲット認識配列の切断。

【図6】ＣＨＯ細胞レポータアッセイ中のＴＲＣ１－２認識配列を認識かつ切断するための、操作されたメガヌクレアーゼの効率である。ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥ（第１世代）、ＴＲＣ１－２Ｌ．１１０８（中間体）およびＴＲＣ１－２Ｌ．１４６９（中間体）メガヌクレアーゼは、ＴＲＣ１－２認識配列（配列番号５）を標的とするために操作され、毒性を測定するため、ヌクレオフェクションの２日後、５日後および７日後のＣＨＯ細胞レポータアッセイ中の有効性についてスクリーニングされた。示された結果は、７日間の解析期間にわたって観察されたＧＦＰ発現細胞の比率を提供している。これは、ターゲット認識配列またはＣＨＯ２３／２４認識配列を切断するための各メガヌクレアーゼの有効性を、時間の関数として示している。

【図7】ＣＨＯ細胞レポータアッセイ中のＴＲＣ１－２認識配列を認識かつ切断するための、操作されたメガヌクレアーゼの効率である。第２世代のＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２、ＴＲＣ１－２Ｌ．１７７５およびＴＲＣ１－２Ｌ．１８４３メガヌクレアーゼは、ＴＲＣ１－２認識配列（配列番号５）を標的とするために最適化され、毒性を測定するため、ヌクレオフェクションの２日後、５日後および７日後のＣＨＯ細胞レポータアッセイ中の有効性についてスクリーニングされた。第１世代のＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼ、および中間体ＴＲＣ１－２Ｌ．１４６９メガヌクレアーゼはまた、比較のためにこのアッセイ中に含まれていた。示された結果は、７日間の解析期間にわたって観察されたＧＦＰ発現細胞の比率を提供している。これは、ターゲット認識配列またはＣＨＯ２３／２４認識配列を切断するための各メガヌクレアーゼの有効性を、時間の関数として示している。

【図8】ＣＨＯ細胞レポータアッセイ中のＴＲＣオフ１～オフ２認識配列を認識かつ切断するための、操作されたメガヌクレアーゼの効率である。第１世代のＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼ、中間体ＴＲＣ１－２Ｌ．１４６９メガヌクレアーゼおよび第２世代のＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２、ＴＲＣ１－２Ｌ．１７７５およびＴＲＣ１－２Ｌ．１８４３メガヌクレアーゼは、毒性を測定するため、ヌクレオフェクションの２日後、５日後および７日後のＣＨＯ細胞レポータアッセイ中の有効性について、ＴＲＣオフ１（配列番号１６）またはオフ２（配列番号１７）認識配列を含むＣＨＯ ＧＦＦＰレポータ細胞にてスクリーニングされた。示された結果は、７日間の解析期間にわたって観察されたＧＦＰ発現細胞の比率を提供している。Ａ）オフ１認識配列の切断。Ｂ）オフ２認識配列の切断。

【図9】潜在的に妥当なオフターゲット部位の数の基準として、オリゴ捕獲データのグラフィカルな視覚化である。特定のヌクレアーゼによって生成された各オフターゲット切断は、その部位に捕捉されているプローブオリゴのための固有配列リードの数に基づいてプロットされている。目的部位（すなわち、ＴＲＣ１－２認識配列）は、検査された（丸で囲まれた）各メガヌクレアーゼのための最も高いリードの総計を有する。

【図10】オフターゲット部位が、Ｘ軸上に並べられたリード数、色によって示されている目的部位と比較した不適正塩基対の数に従ってプロットされているオリゴ捕獲データのグラフィカルな視覚化である。このうち、より黒い色はオフターゲット部位と目的の結合部位とのほとんど全ての一致を示している。ボックスは、最も高い信頼度領域を示している。

【図11】第１世代のＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼ、中間体であるＴＲＣ１－２Ｌ．１４６９メガヌクレアーゼ、または第２世代のＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２、ＴＲＣ１－２Ｌ．１７７５およびＴＲＣ１－２Ｌ．１８４３メガヌクレアーゼを用いて生成されたＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロ解析を要約した表である。メガヌクレアーゼは、遺伝子編集効率、編集後の増殖および分化可能性についてスクリーニングされた。ＣＡＲ Ｔ細胞は３人の異なる健常なヒトドナーから得られた細胞から調製され、実験は３人の異なるオペレータによって実施された。

【図12】３人の異なる健常なヒトドナーから得られたＴ細胞集団で生成されたオリゴ捕獲データの、グラフィカルな視覚化である。

【図13】第１世代のＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼ、または第２世代のＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２、ＴＲＣ１－２Ｌ．１７７５およびＴＲＣ１－２Ｌ．１８４３メガヌクレアーゼを用いて生成されたＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロ解析である。Ａ）０日目、４日目、および８日目の編集後における細胞の総数。Ｂ）０日目、４日目、および８日目の編集後における編集された細胞（すなわち、ＴＣＲネガティブ）の総数。Ｃ）０日目、４日目、および８日目の編集後におけるＴＣＲネガティブ／ＣＡＲ－ポジティブ細胞の総数。

【図14】抗原関連ターゲット細胞を用いた共培養に続く、ＣＡＲ Ｔ細胞増殖である。５日間、１：１および１：２のＥ：Ｔの比にてＣＤ１９＋腫瘍株であるＲａｊｉまたはＮａｌｍ６を用いたＣＡＲ Ｔ細胞の共培養の後、増殖を評価した。細胞の投入数は、破線によって識別されている。

【図15】抗原関連ターゲット細胞を用いた共培養に続く、ＣＡＲ Ｔ細胞増殖である。５日間、１：２のＥ：Ｔの比にてＣＤ１９＋腫瘍株であるＲａｊｉを用いたＣＡＲ Ｔ細胞の共培養の後、増殖を評価した。Ａ）Ｒａｊｉ細胞を用いて共培養した後の、培養物中のＣＡＲ－ポジティブ細胞の総数。Ｂ）Ｒａｊｉ細胞を用いてＣＡＲ Ｔ細胞を共培養した後の、培養物中に残存するＣＤ１９－ポジティブ細胞の総数

【図16】２日間、抗原関連ターゲット細胞を用いて共培養した後の、培養物の上澄みへのＣＡＲ Ｔ細胞サイトカインの分泌である。１：１および１：２のＥ：Ｔの比にてＣＤ１９＋腫瘍株であるＲａｊｉまたはＮａｌｍ６を用いたＣＡＲ Ｔ細胞の共培養の後、サイトカインの分泌を評価した。ＣＤ１９－ネガティブのＫ５６２骨髄性白血病細胞は、コントロールとして用いられた。Ａ）ＩＬ－２分泌 Ｂ）ＴＮＦ－アルファ分泌Ｃ）ＩＮＦ－ガンマ分泌Ｄ）グランザイムＢ分泌 Ｅ）パーフォリン分泌

【図17】ＣＡＲ Ｔ細胞中におけるメガヌクレアーゼ発現のウェスタンブロット解析である。細胞は、ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥまたはＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２メガヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡを用いて電気穿孔され、その後、ＴＲＣ１－２部位にて挿入されるために設計された、抗－ＣＤ１９ＣＡＲをコードしているドナー鋳型を運搬する組換えＡＡＶ６ベクターによって形質導入された。６時間時点、２４時間時点、４８時間時点、９６時間時点および１６８時間時点の電気穿孔後、メガヌクレアーゼタンパク質の発現は、ウェスタンブロット解析によって測定された。同じドナーからの偽細胞は、ヌクレアーゼ治療群として活性化され、同じ培地にて培養された。また、この偽細胞は、ヌクレアーゼ治療群が事前に電気穿孔された後に２４時間時点にて収集された。

【図18】０日目、３日目、８日目（ＣＤ３－ポジティブ細胞ディプリーションの前後）時点およびＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥまたはＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２を用いた大規模ＣＡＲ Ｔ製造プロセス工程の１３日目時点での、生存細胞の総数である。

【図19】ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥまたはＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２を用いた大規模ＣＡＲ Ｔ製造プロセス工程の８日目時点での、生存ＣＤ３－ネガティブ細胞の総数である。

【図20】８日目（ＣＤ３－ポジティブ細胞のディプリーションの前後）時点およびＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥまたはＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２を用いた大規模ＣＡＲ Ｔ製造プロセス工程の１３日目時点での、ＣＡＲ－ポジティブであるＣＤ３－ネガティブ細胞の比率である。

【0111】

配列の簡単な説明
配列番号１は、クラミドモナス・レインハルディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）由来の野生型Ｉ－Ｃｒｅｌメガヌクレアーゼのアミノ酸配列を規定している。

【0112】

配列番号２は、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフのアミノ酸配列を規定している。

【0113】

配列番号３は、ヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子（ＮＣＢＩ遺伝子番号２８７５５）の核酸配列を規定している。

【0114】

配列番号４は、ヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子によってコードされたポリペプチドのアミノ酸配列を規定している。

【0115】

配列番号５は、ＴＲＣ１－２認識配列のセンス鎖の核酸配列を規定している。

【0116】

配列番号６は、ＴＲＣ１－２認識配列のアンチセンス鎖の核酸配列を規定している。

【0117】

配列番号７は、ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を規定している。

【0118】

配列番号８は、ＴＲＣ１－２Ｌ．１７７５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を規定している。

【0119】

配列番号９は、ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼのアミノ酸配列を規定している。

【0120】

配列番号１０は、ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２メガヌクレアーゼＴＲＣ１結合サブユニットのアミノ酸配列を規定している。

【0121】

配列番号１１は、ＴＲＣ１－２Ｌ．１７７５メガヌクレアーゼＴＲＣ１結合サブユニットのアミノ酸配列を規定している。

【0122】

配列番号１２は、ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼＴＲＣ１結合サブユニットのアミノ酸配列を規定している。

【0123】

配列番号１３は、ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２メガヌクレアーゼＴＲＣ２結合サブユニットのアミノ酸配列を規定している。

【0124】

配列番号１４は、ＴＲＣ１－２Ｌ．１７７５メガヌクレアーゼＴＲＣ２結合サブユニットのアミノ酸配列を規定している。

【0125】

配列番号１５は、ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼＴＲＣ２結合サブユニットのアミノ酸配列を規定している。

【0126】

配列番号１６は、オフ１認識配列の核酸配列を規定している。

【0127】

配列番号１７は、オフ２認識配列の核酸配列を規定している。

【0128】

配列番号１８は、ポリペプチドリンカーのアミノ酸配列を規定している。

【発明の詳細な説明】

【0129】

１．１ 参照と定義
本明細書で参照される特許および科学文献は、当業者が利用可能な知識を確立している。Ｇｅｎｂａｎｋデータベース配列、公開遺伝子データベースおよびタンパク質データベースアクセッション番号またはコード（ならびにそれに関連する核酸および／またはアミ
ノ酸配列）を含み、本明細書に引用されている、発行された米国および米国以外の特許、許可された出願、公開された米国出願、公開された非米国出願、およびＰＣＴ出願、共有および共同係属中の未公開の米国特許出願、公開された外国出願、ならびに科学、技術、および医学的な参照文献は、それぞれが参照により組み入れられるため、具体的かつ個別に示されている場合と同程度で参照により本明細書に組み入れられる。

【0130】

本発明は、異なる形態で具体化することができ、本明細書に記載の実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろこれらの実施形態は、本開示が完璧かつ完全であり、本発明の範囲を当業者に完全に伝えるように提供される。例えば、一実施形態に関して図示された特徴は、他の実施形態に組み込むことができ、特定の実施形態に関して図示された特徴は、その実施形態から削除することができる。更に、本明細書にて示唆された実施形態への多数の変形および追加は、本開示に照らして当業者には明らかであり、これらは本発明から逸脱するものではない。

【0131】

別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって、優先日の時点で一般的に理解されている意味と同様の意味を有する。本明細書において本発明の説明で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明を限定することを意図するものではない。

【0132】

本明細書で言及されている全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

【0133】

本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、または「この（ｔｈｅ）」は、１つまたは複数を意味することができる。例えば、「１つの（ａ）」セルは、単一の細胞または複数の細胞を意味することができる。

【0134】

本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、「または」という用語は、「どちらか／または」の排他的意味ではなく、「および／または」の包括的意味で使用される。

【0135】

本明細書で使用される場合、「エンドヌクレアーゼ」という用語は、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する酵素を指す。

【0136】

本明細書で使用される場合、二本鎖ＤＮＡに関して、「切断する」または「切断」という用語は、ターゲット配列内にて二本鎖切断をもたらし、本明細書では「切断部位」と呼ばれる、ターゲット配列内の認識配列の骨格内にて、エンドヌクレアーゼが介在するホスホジエステル結合の加水分解を指す。エンドヌクレアーゼによっては、切断によって平滑末端を有する二本鎖フラグメントまたは５’または３’塩基のオーバーハングを有するフラグメントが生じ得る。

【0137】

本明細書で使用される場合、「メガヌクレアーゼ」という用語は、１２塩基対を超える認識配列で二本鎖ＤＮＡに結合するエンドヌクレアーゼを指す。一部の実施形態では、本開示のメガヌクレアーゼの認識配列は、２２塩基対である。メガヌクレアーゼは、Ｉ－Ｃｒｅｌから誘導されているエンドヌクレアーゼであり得、例えば、ＤＮＡ結合特異性、ＤＮＡ切断活性、ＤＮＡ結合親和性または二量体化特性に関し、天然のＩ－Ｃｒｅｌと比較して改変されたＩ－Ｃｒｅｌの操作されたバリアントを指し得る。Ｉ－Ｃｒｅｌを改変したかかるバリアントを産生するための方法は、当技術分野で公知である（例えば、国際公開第２００７／０４７８５９号であり、参照によりその全体が組み入れられている）。本明細書で使用される場合のメガヌクレアーゼは、ヘテロ二量体として二本鎖ＤＮＡに結合する。メガヌクレアーゼはまた、ペプチドリンカーを用いて一対のＤＮＡ結合ドメインが単一のポリペプチドに結合されている「一本鎖メガヌクレアーゼ」であり得る。「ホーミ
ングエンドヌクレアーゼ」という用語は、「メガヌクレアーゼ」という用語と同義である。本開示のメガヌクレアーゼは、本明細書に記載の標的細胞、特にヒトＴ細胞にて発現された場合には実質的に非毒性であり、本明細書に記載の方法を用いて計測した場合、全体の細胞生存率に関する実質的な有害作用またはメガヌクレアーゼ切断活性における著しい低下を認めることなく、細胞は遺伝子導入され、かつ３７℃にて維持され得る。

【0138】

本明細書で使用される場合、「一本鎖メガヌクレアーゼ」という用語は、サブユニットがヘテロ二量体のように機能的に相互作用して二本鎖認識部位を切断するよう、リンカーによって結合されたヌクレアーゼサブユニットの一対を含むポリペプチドを指す。一本鎖メガヌクレアーゼは、Ｎ末端サブユニット－リンカー－Ｃ末端サブユニットという構成を有する。２つのメガヌクレアーゼサブユニットは、一般には、アミノ酸配列においては同一ではなく、認識配列内の同一でないＤＮＡハーフサイトを認識する。したがって、一本鎖メガヌクレアーゼは、典型的には、疑似パリンドロームまたは非パリンドローム認識配列を切断する。一本鎖メガヌクレアーゼは、実際には二量体ではないが、「一本鎖ヘテロ二量体」または「一本鎖ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ」と呼ばれることがある。明確にするため、特に明記しない限り「メガヌクレアーゼ」という用語は、二量体または一本鎖メガヌクレアーゼを指すことができる。

【0139】

本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、２つのメガヌクレアーゼサブユニットを単一のポリペプチドに結合するために使用される外因性ペプチド配列を指す。リンカーは、天然タンパク質に見られる配列を有する場合もあれば、どの天然タンパク質にも見られない人工配列であってもよい。リンカーは柔軟性があり、二次構造を欠いているか、または生理学的条件下で特定の三次元構造を形成する傾向を有してもよい。リンカーは、限定されないが、米国特許第８，４４５，２５１号、第９，３４０，７７７号、第９，４３４，９３１号、および第１０，０４１，０５３号によって包含されるもののいずれかを含むことができ、これらのそれぞれは参照によりその全体が組み入れられる。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列番号１８との配列相同性を有してよく、これは配列番号７または配列番号８の残基１５４～１９５を規定する。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号７または配列番号８の残基１５４～１９５を規定する、配列番号１８を含むアミノ酸配列を有してよい。

【0140】

本明細書で使用される場合、タンパク質に関し、「組換え」または「操作された」という用語は、タンパク質をコードする核酸、およびタンパク質を発現する細胞または生物に対し、遺伝子操作的な技術の適用結果として変更されたアミノ酸配列を有することを意味している。核酸に関して、「組換え」または「操作された」という用語は、遺伝子操作技術を適用した結果として変更された核酸配列を有することを意味する。遺伝子操作技術には、ＰＣＲおよびＤＮＡクローニング技術、遺伝子導入、形質転換および他の遺伝子導入技術、相同組換え、部位特異的変異誘発性、および遺伝子融合が挙げられるがこれに限定されない。この定義によれば、天然に存在するタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するが、異種宿主でのクローニングおよび発現によって産生されるタンパク質は、組換え体とは見なされない。

【0141】

本明細書で使用される場合、「野生型」という用語は、同種の遺伝子の対立遺伝子集団において最も一般的な天然に存在する対立遺伝子（すなわち、ポリヌクレオチド配列）を指し、野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチドは、その本来の機能を有する。「野生型」という用語はまた、野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチドも指す。野生型対立遺伝子（すなわち、ポリヌクレオチド）およびポリペプチドは、野生型
配列に対して１つまたは複数の突然変異および／もしくは置換を含む突然変異体または変異型対立遺伝子およびポリペプチドと区別することが可能である。野生型対立遺伝子またはポリペプチドは、生物に正常な表現型を与えることができるが、突然変異体または変異型対立遺伝子またはポリペプチドは、場合によっては、変化した表現型を与えることができる。野生型ヌクレアーゼは、組換えヌクレアーゼまたは非天然のヌクレアーゼと区別することが可能である。「野生型」という用語はまた、特定の遺伝子の野生型対立遺伝子を保有する細胞、生物、および／もしくは対象、または比較目的で使用される細胞、生物、および／もしくは対象を指すことができる。

【0142】

本明細書で使用される場合、「遺伝子改変」という用語は、ゲノムＤＮＡ配列が組換え技術によって故意に改変されている、またはその祖先における、細胞または生物を指す。本明細書で使用される場合、「遺伝子改変された」という用語は、「遺伝子組換え」という用語を包含する。

【0143】

組換えタンパク質に関して本明細書で使用される場合、「改変」という用語は、参照配列（例えば、野生型または天然配列）に対する組換え配列中のアミノ酸残基の任意の挿入、削除、または置換を意味する。

【0144】

本明細書で使用される場合、「認識配列」または「認識部位」という用語は、エンドヌクレアーゼによって結合および切断されるＤＮＡ配列を指す。メガヌクレアーゼの場合、認識配列は、４塩基対によって分離された１対の反転した９塩基対の「ハーフサイト」を含む。一本鎖メガヌクレアーゼの場合、タンパク質のＮ末端ドメインは第１のハーフサイトに接触し、タンパク質のＣ末端ドメインは第２のハーフサイトに接触する。メガヌクレアーゼによる切断は、４塩基対の３’「オーバーハング」を産生する。「オーバーハング」または「粘着末端」は、二本鎖ＤＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ切断によって産生され得る短い一本鎖ＤＮＡセグメントである。Ｉ－Ｃｒｅｌから誘導されたメガヌクレアーゼおよび一本鎖メガヌクレアーゼの場合、オーバーハングは、２２塩基対認識配列の１０～１３塩基を含む。

【0145】

本明細書で使用される場合、「ターゲット部位」または「ターゲット配列」という用語は、ヌクレアーゼの認識配列を含む細胞の染色体ＤＮＡの領域を指す。

【0146】

本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ結合親和性」または「結合親和性」という用語は、メガヌクレアーゼが参照ＤＮＡ分子（例えば、認識配列または任意の配列）と非共有結合的に結合する傾向を意味する。結合親和性は、解離定数Ｋｄによって測定される。本明細書で使用される場合、参照認識配列に対するヌクレアーゼのＫｄが、参照ヌクレアーゼに対し、統計的に有意なパーセント変化、または生物学的に有意な量（例えば、少なくとも２倍、または２倍～１０倍）たけ増加または減少する場合には、ヌクレアーゼは「変化した」結合親和性を有する。

【0147】

本明細書で使用される場合、「特異性」という用語は、認識配列と呼ばれる塩基対の特定の配列でのみ、または認識配列の特定の組でのみ二本鎖ＤＮＡ分子を認識かつ切断する、ヌクレアーゼの能力を意味する。認識配列の組は、ある一定の保存された位置または配列モチーフを共有するが、１つまたは複数の位置では縮退していることがある。特異性の高いヌクレアーゼは、１つまたはごく少数の認識配列のみを切断することができる。特異性は、当技術分野で公知の任意の方法によって決定可能である。

【0148】

本明細書で使用される場合、ヌクレアーゼが、生理的条件下で参照ヌクレアーゼ（例えば野生型）によって結合かつ切断されていない認識配列に結合し、かつこれを切断する場合、または認識配列の切断速度が、参照ヌクレアーゼに対して生物学的な有意量（例えば
、少なくとも２倍、もしくは２倍～１０倍）だけ増加または減少する場合、ヌクレアーゼは特異性を「変化」させている。

【0149】

一部の実施形態では、本開示の操作されたメガヌクレアーゼは、ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼ（配列番号９として規定されているアミノ酸配列）と比較した場合、配列番号５（すなわちＴＲＣ１－２）を含むターゲット認識配列にとって、向上（すなわち増加）した特異性を有している。したがって、ある特定の実施形態では、本開示の操作されたメガヌクレアーゼは、ＴＲＣ１～２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼと比較した場合、オフターゲット切断が低下していることを示す。メガヌクレアーゼによるオフターゲット切断は、例えば本明細書に記載のオリゴ捕獲解析、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７Ｅ）アッセイ、デジタルＰＣＲ、特定のオフターゲット部位の標的化されたシーケンシング、エクソームシーケンシング、全ゲノムシーケンシング、ストレプトアビジン上にてラベリング濃縮をｉｎ ｓｉｔｕで直接破壊および次世代配列シーケンシング（ＢＬＥＳＳ）、配列決定によって可能となるＤＳＢの、ゲノムワイドで偏りのない識別（ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ）、および線形増幅を介したハイスループットゲノムワイドな転座配列決定（ＬＡＭ－ＨＴＧＴＳ）（例えば、Ｚｉｓｃｈｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ３５（１）：９５－１０４を参照されたい。これは参照によりその全体が組み入れられる）を含む、当技術分野で公知の任意の方法を使用して測定することができる。

【0150】

本明細書で使用される場合、「相同組換え」または「ＨＲ」という用語は、二本鎖ＤＮＡ切断が修復鋳型として相同ＤＮＡ配列を使用して修復される、自然の細胞プロセスを指す（例えば、Ｃａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８－１９７６を参照されたい）。相同ＤＮＡ配列は、細胞に輸送された内因性染色体配列または外因性核酸であり得る。

【0151】

本明細書で使用される場合、「非相同末端結合」または「ＮＨＥＪ」という用語は、２本の非相同ＤＮＡセグメントの直接結合によって二本鎖ＤＮＡ切断が修復される、自然の細胞プロセスを指す（例えば、Ｃａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８－１９７６を参照されたい）。非相同末端結合によるＤＮＡ修復はエラーが発生しやすく、修復部位でのＤＮＡ配列の非鋳型である追加または削除が頻繁に発生する。場合によっては、ターゲット認識配列での切断により、ターゲット認識部位でＮＨＥＪが生じる。遺伝子のコード配列におけるターゲット部位のヌクレアーゼ誘導性切断と、それに続くＮＨＥＪによるＤＮＡ修復は、遺伝子機能を破壊するようなフレームシフト突然変異などの突然変異をコード配列に導入する可能性がある。したがって、操作されたヌクレアーゼを使用し、細胞集団内の遺伝子を効果的にノックアウトすることができる。本明細書で使用される場合、「ターゲット配列の破壊」は、遺伝子機能を妨害し、それによってコードされるポリペプチド産物／発現産物の発現および／または機能を妨げる突然変異（例えば、フレームシフト突然変異）の導入を指す。

【0152】

本明細書で使用される場合、「相同アーム」または「メガヌクレアーゼ切断部位に隣接する配列に相同な配列」は、メガヌクレアーゼによって生成された切断部位への核酸分子の挿入を促進する、核酸の５’末端および３’末端に隣接する配列を指す。一般に、相同アームは、少なくとも５０塩基対、好ましくは少なくとも１００塩基対、および最大２０００塩基対以上の長さを有することができ、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、またはそれ以上である、ゲノム内の対応する配列に対する配列相同性を有し得る。

【0153】

本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、免疫エフェクタ細胞（例えば、ヒトＴ細胞）上に、抗原に対する特異性を付与または移植する操作された受容体を指す。キメラ抗原受容体は、典型的には、少なくとも細胞外リガンド結合ドメ
インまたは部分、ならびに１つまたは複数のシグナル伝達ドメインおよび／または共刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む。

【0154】

一部の実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインまたは部分は、モノクローナル抗体から誘導された一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の形態である。これは、特定のエピトープまたは抗原（例えば、癌細胞または他の疾患を引き起こす細胞もしくは粒子などの、細胞表面に優先的に存在する、エピトープまたは抗原）に対する特異性を提供する。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、リンカー配列を介して付着される。種々の実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、目的の任意の抗原またはエピトープに特異的である。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、マウス、ヒト化、または完全にヒトのｓｃＦｖである。

【0155】

キメラ抗原受容体の細胞外ドメインは、自己抗原を含むこともできる（Ｐａｙｎｅ ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３（６２９５）：１７９－１８４を参照されたい）。これは、Ｂリンパ球上の自己抗原特異的Ｂ細胞受容体によって認識されることができる。したがって、抗体介在自己免疫疾患において自己反応性Ｂリンパ球を特異的に標的として殺すようにＴ細胞を誘導する。かかるＣＡＲは、キメラ自己抗体受容体（ＣＡＡＲ）と呼ばれ得、それらの使用は、本発明に包含されている。

【0156】

キメラ抗原受容体の細胞外ドメインはまた、目的の抗原に対して天然に存在するリガンド、または目的の抗原に結合する能力を保持する、天然に存在するリガンドのフラグメントを含み得る。

【0157】

細胞内刺激ドメインは、抗原結合に続いて免疫エフェクタ細胞に活性化シグナルを伝達する、１つまたは複数の細胞質シグナル伝達ドメインを含み得る。かかる細胞質シグナル伝達ドメインには、ＣＤ３１が含まれるが、これに限定されない。細胞内刺激ドメインはまた、リガンド結合後に増殖性シグナルおよび／または細胞生存シグナルを伝達する、１つまたは複数の細胞内共刺激ドメインを含み得る。かかる細胞内共刺激ドメインは、当技術分野で公知なもののいずれかであり得、これは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能－関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＤ８３、Ｎ１、Ｎ６、またはそれらの任意の組合せと特異的に結合するリガンドを含み得るが、これに限定されない。

【0158】

キメラ抗原受容体は、ヒンジまたはスペーサ配列を介して細胞外リガンド結合ドメインに結合している膜貫通ドメインを含む、追加の構造要素を更に含むことができる。膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質から誘導されることがある。例えば、膜貫通ポリペプチドは、Ｔ細胞受容体のサブユニット（すなわち、α、β、γまたはζ、ＣＤ３複合体を構成するポリペプチド）、ＩＬ２受容体ｐ５５（鎖）、ｐ７５（β鎖）またはγ鎖、Ｆｃ受容体のサブユニット鎖（例えば、Ｆｃｙ受容体ＩＩＩ）またはＣＤ８アルファ鎖などのＣＤタンパク質であり得る。代替的には、膜貫通ドメインは合成的なものであり得、ロイシンおよびバリンなど、主に疎水性残基を含み得る。

【0159】

ヒンジ領域は、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するように機能する、任意のオリゴまたはポリペプチドを指す。例えば、ヒンジ領域は、最大３００アミノ酸、好ましくは１０～１００アミノ酸、最も好ましくは２５～５０アミノ酸を含むことができる。ヒンジ領域は、ＣＤ８、ＣＤ４もしくはＣＤ２８の細胞外領域の全部もしくは一部、または抗体定常領域の全部もしくは一部など、天然に存在する分子の全部または一部から誘導され得る。代替的には、ヒンジ領域は、天然に存在するヒンジ配列に対応する合成配列であり得るか、または完全合成ヒンジ配列であり得る。特定の例では、ヒンジドメ
インは、ヒトＣＤ８アルファ鎖、ＦｃｙＲｌｌｌａ受容体またはＩｇＧｌの一部を含むことができる。

【0160】

本明細書で使用される場合、「外因性Ｔ細胞受容体」または「外因性ＴＣＲ」は、ＴＣＲを内因的に発現する場合もあればしない場合もある、免疫エフェクタ細胞（例えば、ヒトＴ細胞）のゲノムへとその配列が導入されるＴＣＲを指す。免疫エフェクタ細胞での外因性ＴＣＲの発現は、特定のエピトープまたは抗原（例えば、癌細胞または他の疾患を引き起こす細胞もしくは粒子の表面に優先的に存在するエピトープまたは抗原）に対する特異性を与えることができる。かかる外因性Ｔ細胞受容体は、アルファ鎖およびベータ鎖を含み得るか、または代替的には、ガンマ鎖およびデルタ鎖を含み得る。本発明において有用な外因性ＴＣＲは、目的の任意の抗原またはエピトープに対して特異性を有し得る。

【0161】

本明細書で使用される場合、「発現低下」という用語は、コントロール細胞と比較した場合の、遺伝子改変Ｔ細胞の細胞表面での内因性Ｔ細胞受容体（例えば、アルファ／ベータＴ細胞受容体）の発現の低下を指す。低下という用語はまた、コントロール細胞の集団と比較した場合に、細胞表面で内因性ポリペプチド（すなわち、内因性Ｔ細胞受容体）を発現する、細胞の集団における細胞の比率の低下を指すことができる。かかる低下は、最大５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または最大１００％であり得る。したがって、「低下」という用語は、内因性Ｔ細胞受容体の部分的なノックダウンおよび完全なノックダウンの両方を包含する。内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現のノックアウト（すなわち、完全なノックダウン）は、本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼを用いたＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子の遺伝的不活性化から生じ得る。Ｔ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子によってコードされているアルファ定常ドメインは、細胞表面での内因性ＴＣＲ複合体の集合に必要である。したがって、本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼを用いたＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子のノックアウトにより、細胞表面Ｔ細胞受容体発現のノックアウトが生じる。

【0162】

アミノ酸配列および核酸配列の両方に関して本明細書で使用される場合、「パーセント相同性」、「配列相同性」、「比率類似性」、「配列類似性」などの用語は、２つの配列の類似程度の尺度を指す。またこの用語は、並べられたアミノ酸残基またはヌクレオチド間の類似性を最大化し、かつ同一または類似の残基またはヌクレオチドの数、総残基またはヌクレオチドの数、および配列アラインメント中でのギャップの存在および長さの関数である配列のアラインメントに基づく、２つの配列の類似程度の基準を指す。標準パラメータを用いて配列の類似性を測定するため、種々のアルゴリズムとコンピュータプログラムが利用可能である。本明細書で使用される場合、配列類似性は、アミノ酸配列用のＢＬＡＳＴｐプログラムおよび核酸配列用のＢＬＡＳＴｎプログラムを使用して測定される。これらは両方ともＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から入手可能であり、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、Ｇｉｓｈ ａｎｄ Ｓｔａｔｅｓ（１９９３），Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２、Ｍａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３ ８９－３４０２）、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．７（１－２）：２０３－１４に記載されている。本明細書で使用される場合、２つのアミノ酸配列のパーセント類似性は、ＢＬＡＳＴｐアルゴリズムの以下のパラメータに基づくスコアである：ワードサイズ＝３、ギャップオープニングペナルティ＝－１１、ギャップ拡張ペナルティ＝－１、スコア行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２。本明細書で使用される場合、２つの核酸配列のパーセント類似性は、ＢＬＡＳＴｎアルゴリズムの以下のパラメータに基づくスコアであ
る：文字サイズ＝１１、ギャップ開始ペナルティ＝－５、ギャップ拡張ペナルティ＝－２、マッチ報酬＝１、不一致ペナルティ＝－３。

【0163】

２つのタンパク質またはアミノ酸配列の改変に関して本明細書で使用される場合、「対応する」という用語は、第１のタンパク質の特定の改変が第２のタンパク質の改変と同じアミノ酸残基の置換であり、２つのタンパク質が標準的な配列アラインメントに供される場合（例えば、ＢＬＡＳＴｐプログラムを使用して）、第１のタンパク質の改変のアミノ酸位置が第２のタンパク質の改変のアミノ酸位置に対応するか、またはアラインメントすることを示すために用いられる。したがって、第１のタンパク質における残基「Ｘ」のアミノ酸「Ａ」への改変は、残基ＸおよびＹが配列アラインメントにおいて互いに対応する場合、ＸおよびＹが異なる数であり得るという事実にもかかわらず、第２のタンパク質における残基「Ｙ」のアミノ酸「Ａ」への改変に対応する。

【0164】

本明細書で使用される場合、「認識ハーフサイト」、「認識配列ハーフサイト」、または単に「ハーフサイト」という用語は、ホモ二量体もしくはヘテロ二量体メガヌクレアーゼの単量体によって、または一本鎖メガヌクレアーゼの１つのサブユニットによって認識される、二本鎖ＤＮＡ分子中の核酸配列を意味する。

【0165】

本明細書で使用される場合、「超可変領域」という用語は、比較的高い可変性を有するアミノ酸を含むメガヌクレアーゼ単量体またはサブユニット内の局在化配列を指す。超可変領域は、約５０～６０個の連続残基、約５３～５７個の連続残基、または好ましくは約５６個の残基を含むことができる。一部の実施形態では、超可変領域の残基は、配列番号７または配列番号８の、位置２４～７９または位置２１５～２７０に対応し得る。超可変領域は、認識配列のＤＮＡ塩基と接触する１つまたは複数の残基を含むことができ、単量体またはサブユニットの塩基優先性を変更するように改変することができる。超可変領域はまた、メガヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡ認識配列と結合する時、ＤＮＡ骨格に結合する１つまたは複数の残基を含み得る。かかる残基は、ＤＮＡ骨格およびターゲット認識配列に対するメガヌクレアーゼの結合親和性を変更するように改変することができる。本発明の異なる実施形態では、超可変領域は、可変性を示す１～２０個の残基を含み得、塩基優先性および／またはＤＮＡ結合親和性に影響を与えるように改変されることができる。特定の実施形態では、超可変領域は可変性を示す約１５～２０個の残基を含み、塩基優先性および／またはＤＮＡ結合親和性に影響を与えるように改変することができる。

【0166】

一部の実施形態では、超可変領域内の可変残基は、配列番号７または配列番号８の位置２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５および７７のうちの１つ以上に対応する。一部の実施形態では、超可変領域内の可変残基は、配列番号７の位置４８、５０、７１、７２、および７３のうちの１つまたは複数に更に対応する。一部の実施形態では、超可変領域内の可変残基は、配列番号８の位置４８および５０のうちの１つまたは複数に更に対応する。一部の実施形態では、超可変領域内の可変残基は、配列番号７または配列番号８の位置２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、６８、７０、７１、７２、７３、７５および７７のうちの１つ以上に対応する。

【0167】

他の実施形態では、超可変領域内の可変残基は、配列番号７または配列番号８の位置２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、および２６８の１つまたは複数に対応する。

【0168】

本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子」または「ＴＣＲアルファ遺伝子」という用語は互換可能なものであり、Ｔ細胞受容体アルファサブユニットをコードするＴ細胞内の遺伝子座を指す。Ｔ細胞受容体アルファは、再配列の前後に、ＮＣＢＩ
遺伝子番号６９５５を参照可能である。再配列に続いて、Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子は、内因性プロモータ、再配列されたＶおよびＪセグメント、内因性スプライスドナー部位、イントロン、内因性スプライスアクセプター部位、およびエクソンをコードしているサブユニットを含む、Ｔ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子座を含む。

【0169】

本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞受容体アルファ定常領域」または「ＴＣＲアルファ定常領域」という用語は、Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子のコード配列を指す。ＴＣＲアルファ定常領域には、ＮＣＢＩ Ｇｅｎ番号２８７５５によって識別される野生型配列およびその機能的バリアントが含まれる。

【0170】

「組換えＤＮＡ構築物」、「組換え構築物」、「発現カセット」、「発現構築物」、「キメラ構築物」、「構築物」、および「組換えＤＮＡフラグメント」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドである。組換え構築物は、自然界では一緒に見いだされない調節配列およびコード配列を含むがこれらに限定されない、核酸フラグメントの人工的な組合せを含む。例えば、組換えＤＮＡ構築物は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ供給源から誘導され、自然界に見られるものとは異なる方法で配列された調節配列およびコード配列を含み得る。このような構築物は、単独で使用してもよい。またはベクターと組み合わせて使用してもよい。

【0171】

本明細書で使用される場合、「ベクター」または「組換えＤＮＡベクター」は、所与の宿主細胞においてポリペプチドをコードしている配列の転写および翻訳が可能な複製システムおよび配列を含む構築物であり得る。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者に周知であるように、宿主細胞を形質転換するために使用される方法に依る。ベクターは、プラスミドベクターおよび組換えウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）、または本発明のメガヌクレアーゼをコードしている遺伝子をターゲット細胞に輸送するのに適した当技術分野で知られている任意の他のベクターを含み得るが、これに限定されない。当業者は、本発明の単離されたヌクレオチドまたは核酸配列のいずれかを含む宿主細胞を首尾よく形質転換、選択および増殖させるために、ベクター上に存在しなければならない遺伝的要素を十分認識している。

【0172】

本明細書で使用される場合、「ベクター」はまた、ウイルスベクターもまた指すことができる。ウイルスベクターには、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）が含まれ得るが、これらに限定されない。

【0173】

本明細書で使用される場合、「ポリシストロニック」ｍＲＮＡは、２つ以上のコード配列（すなわち、シストロン）を含み、２つ以上のタンパク質をコードする、単一のメッセンジャーＲＮＡを指す。ポリシストロニックｍＲＮＡは、ＩＲＥＳエレメント、Ｔ２Ａエレメント、Ｐ２Ａエレメント、Ｅ２Ａエレメント、およびＦ２Ａエレメントを含むがこれに限定されない、同様のｍＲＮＡ分子由来の２つ以上の遺伝子の翻訳を可能にする、当技術分野で公知の任意のエレメントを含むことができる。

【0174】

本明細書で使用される場合、「ヒトＴ細胞」または「Ｔ細胞」は、ドナー、特にヒトドナーから単離されたＴ細胞を指す。Ｔ細胞、およびそこから誘導された細胞には、継代培養されていない単離されたＴ細胞、不死化せずに細胞培養条件下で継代および維持されたＴ細胞、および不死化され、細胞培養条件下で無期限に維持され得るＴ細胞が含まれる。

【0175】

本明細書で使用される場合、「コントロール」または「コントロール細胞」は、遺伝子改変された細胞の遺伝子型または表現型の変化を測定するための基準点を提供する細胞を
指す。コントロール細胞は、例えば：（ａ）野生型細胞、すなわち遺伝子改変された細胞を生じた遺伝子変容の出発物質と同様の遺伝子型のもの、（ｂ）遺伝子改変された細胞と同じ遺伝子型であるが、ヌル構築物で形質転換された細胞（すなわち、目的の形質に公知の効果を有さない構築物）、または（ｃ）遺伝子改変された細胞と遺伝的に同一であるが、変性された遺伝子型もしくは表現型の発現を誘導する条件に曝されていない、もしくは刺激もしくは更なる遺伝的改変に曝されていない細胞、を含むことができる。

【0176】

本明細書で使用される場合、「治療」または「対象を治療する」という用語は、疾患を有する対象へ、本発明の遺伝子改変Ｔ細胞または遺伝子改変Ｔ細胞の集団の投与を指す。例えば、対象は癌などの疾患を有する可能性があり、治療は、疾患の治療のための免疫療法を表すことができる。治療の望ましい効果には、疾患の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的結果の低下、疾患の進行速度の低下、病状の改善または緩和、および寛解または予後の改善が含まれるが、これらに限定されない。一部の態様では、本明細書に記載の遺伝子改変された真核細胞または遺伝子改変された真核細胞の集団は、本発明の薬学的組成物の形態で治療中に投与される。

【0177】

「有効量」または「治療有効量」という用語は、有益なまたは望ましい生物学的および／または臨床的結果をもたらすのに十分な量を指す。治療有効量は、使用される製剤または組成物、疾患およびその重症度、ならびに治療される対象の年齢、体重、体調および応答性に応じて変化する。特定の実施形態では、有効量の本発明の遺伝子改変Ｔ細胞または遺伝子改変Ｔ細胞の集団、または本明細書に開示されている薬学的組成物は、対象における疾患の少なくとも１つの症状を軽減する。疾患が癌であるこれらの実施形態では、本明細書に開示されている有効量の操作されたメガヌクレアーゼまたは薬学的組成物は、癌の増殖または転移のレベルを低下させ、癌の部分的または完全な応答または寛解を引き起こし、または対象の癌の以下の少なくとも１つの症状を低下させる。

【0178】

本明細書で使用される場合、「癌」という用語は、悪性増殖または腫瘍を引き起こす、異常で制御されていない細胞分裂を特徴とする任意の腫瘍性疾患（浸潤性または転移性）を包含すると理解されるべきである。

【0179】

本明細書で使用される場合、「細胞腫」という用語は、上皮細胞から構成される悪性増殖を指す。

【0180】

本明細書で使用される場合、「白血病」という用語は、造血器官／系の悪性腫瘍を指し、一般には、血液および骨髄における白血球およびそれらの前駆体の異常な増殖および発達を特徴とする。

【0181】

本明細書で使用される場合、「肉腫」という用語は、胚性結合組織のような物質から構成され、一般には、原線維、不均一、または均一の物質に埋め込まれた密に詰まった細胞から構成される腫瘍を指す。

【0182】

本明細書で使用される場合、「黒色腫」という用語は、皮膚および他の器官のメラノサイト系から生じる腫瘍を指す。

【0183】

本明細書で使用される場合、「リンパ腫」という用語は、リンパ球から発生する血球腫瘍の群を指す。

【0184】

本明細書で使用される場合、「芽細胞腫」という用語は、前駆細胞または芽球（未成熟または胚組織）の悪性腫瘍によって引き起こされる癌の種類を指す。

【0185】

本明細書で使用される場合、変数の数値範囲の列挙は、本発明がその範囲内の値のいずれかに等しい変数で実施され得ることを伝えることを意図している。したがって、本質的に離散的である変数の場合、変数は、範囲の終点を含む数値範囲内の任意の整数値に等しくなり得る。同様に、本質的に連続している変数の場合、変数は、範囲の終点を含む数値範囲内の任意の実数値に等しくなる。一例として、０～２の間の値を持つと記述されている変数は、変数が本質的に離散的である場合では０、１、または２の値をとることができ、０．０、０．１、０．０１、０．００１、または変数が本質的に連続である場合では、≧０かつ≦２の任意の他の実数値をとることができる。

【0186】

２．１ 発明の原理
本発明は、向上（すなわち増加）された特異性およびオフターゲット切断の減少、ｍＲＮＡからの発現後の、細胞中の維持時間の減少、ヒトＴ細胞とインビトロで使用した場合の細胞特性の向上、および実物大のＣＡＲ Ｔ細胞製造プロセスにて使用される場合の細胞特性の向上など、親である第１世代のメガヌクレアーゼと比較して向上した特徴を有する最適化された第２世代のメガヌクレアーゼの発見に、部分的には基づいている。

【0187】

前述したＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼと同様に、これらの最適化された、第２世代のメガヌクレアーゼは、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子のエクソン１内のＴＲＣ１－２認識配列（配列番号５）を認識する。この認識配列における切断により、切断部位にてＮＨＥＪが可能となり得、かつヒトＴ細胞受容体アルファ鎖サブユニットの発現を破壊することができる。これは、細胞表面にてＴ細胞受容体の発現および／または機能を低下させる。追加で、この認識配列での切断は、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子に直接、外因性核酸配列の相同組換えを更に行うことが可能である。かかる外因性核酸配列は、キメラ抗原受容体、外因性ＴＣＲ受容体、または任意のその他の目的のポリペプチドをコードする配列など、目的の配列を含むことができる。したがって、本開示の組成物および方法により、内因性Ｔ細胞受容体（例えばアルファ／ベータＴ細胞受容体）のノックアウトおよび外因性核酸配列（例えばキメラ抗原受容体または外因性ＴＣＲ）の発現の両方が可能となる。かかる細胞は、同種異系対象に投与される場合、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）が低下した状態または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の誘発が見られない状態を示し得る。

【0188】

２．２ Ｔ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子内のＴＲＣ１－２認識配列を認識かつ切断する最適化されたメガヌクレアーゼ
生存している細胞のゲノムにてＤＮＡ切断を行うため、部位特異的ヌクレアーゼを使用することが可能であり、かかるＤＮＡ切断が、ゲノム内にて同一のまたは高度な相同ＤＮＡ配列を有する切断ターゲット部位の相同組換えを用いてゲノムの永続的な変更を生じることができるという点は、当技術分野で公知である。したがって、一部の実施形態では、本発明は操作された組換えメガヌクレアーゼを用いて実行され得る。

【0189】

特定の実施形態では、本発明を実行するために使用されているヌクレアーゼは一本鎖メガヌクレアーゼである。一本鎖メガヌクレアーゼは、リンカーペプチドによってつながれたＮ末端サブユニットおよびＣ末端サブユニットを含む。２つのドメインのそれぞれは、認識配列の半分（すなわち認識ハーフサイト）を認識し、ＤＮＡ切断の部位は、２つのサブユニットの表面近くの認識配列の中間に存在している。ＤＮＡ鎖の切断は、メガヌクレアーゼによるＤＮＡ切断が一対の４塩基対、３’一本鎖のオーバーハングを生成するよう、４塩基対によって埋め合わせされる。

【0190】

本発明の組換えメガヌクレアーゼは、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子（配列番号３）のエクソン１内のＴＲＣ１－２認識配列（配列番号５）を認識かつ切断するために操作されている。本発明の操作されたメガヌクレアーゼは、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含む、第１のサブユニットと、第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含む、第２のサブユニットと
、を含む。更に、第１のサブユニットは認識配列中の第１の認識ハーフサイト（すなわちＴＲＣ１ハーフサイト）に結合し、第２のサブユニットは認識配列中の第２の認識ハーフサイト（すなわちＴＲＣ２ハーフサイト）に結合する。組換えメガヌクレアーゼが一本鎖メガヌクレアーゼである場合の実施形態では、ＨＶＲ１領域を含み第１のハーフサイトに結合する第１のサブユニットがＮ末端サブユニットとして位置づけられ、ＨＶＲ２領域を含み第２のハーフサイトに結合する第２のサブユニットがＣ末端サブユニットとして位置づけられるように、第１のサブユニットおよび第２のサブユニットを方向付けることができる。代替的な実施形態では、ＨＶＲ１領域を含み第１のハーフサイトに結合する第１のサブユニットがＣ末端サブユニットとして位置づけられ、ＨＶＲ２領域を含み第２のハーフサイトに結合する第２のサブユニットがＮ末端サブユニットとして位置づけられるように、第１のサブユニットおよび第２のサブユニットを方向付けることができる。ＴＲＣ１－２認識配列を認識かつ切断する例示的な操作されたメガヌクレアーゼが表１に提供されている。

【0191】

【表1】

【0192】

一部の実施形態では、本開示の操作されたメガヌクレアーゼは、第１世代のメガヌクレアーゼであるＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥと比較して、少なくとも１つの最適化された特徴を示す。かかる最適化された特徴には、オフターゲット切断を低下させ、ｍＲＮＡからの発現後の細胞中の維持時間を減少させ、切断の効率を増強（すなわち増加）させ、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子の改変の原因となる、向上（すなわち増加）した特異性が挙げられる。したがって、特定の実施形態では、真核細胞の集団に輸送された場合の本開示の操作されたメガヌクレアーゼは、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子中で切断および／または改変された状態の、より多くの比率の細胞を生成することができる。これらの実施形態の一部では、真核細胞の集団は、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子にて切断および／または挿入／削除（「ｉｎｄｅｌ」）を含む、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の真核細胞を含む。メガヌクレアーゼによるＴＣＲアルファ定常領域遺伝子の切断および／または改変は、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩアッセイ、デジタルＰＣＲ、ミスマッチ検出アッセイ、ミスマッチ切断アッセイ、高解像度融解曲線分析法（ＨＲＭＡ）、ヘテロ二本鎖移動度分析、シーケンシングおよび蛍光ＰＣＲキャピラリーゲル電気泳動（例えば、Ｚｉｓｃｈｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａ
ｄｖａｎｃｅｓ ３５（１）：９５－１０４を参照されたい。これは参照によりその全体が組み入れられている）を含む、当技術分野で公知である任意の方法を用いて計測されることができる。

【0193】

ある特定の実施形態では、本開示の操作されたメガヌクレアーゼは、第１世代のＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼと比較した場合、特にｍＲＮＡとして導入された場合に細胞中の維持時間の減少を示す。細胞内のｍＲＮＡまたはタンパク質の持続は、ＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロット解析、ヌクレアーゼ保護アッセイ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、免疫細胞化学、イムノブロッティング、および免疫沈降法を含むがこれに限定されない、当技術分野で公知である任意の方法を用いて計測され得る。

【0194】

２．３ 最適化されたメガヌクレアーゼを輸送および発現するための方法
本発明は、ヒトＴＣＲアルファ定常領域遺伝子（配列番号３）内で見られる認識配列を認識かつ切断する操作されたメガヌクレアーゼを用いた、遺伝子改変されたＴ細胞およびその集団を製造するための方法を提供する。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺細胞、感染部位由来の細胞、腹水、胸腔浸出液、脾臓組織、および腫瘍を含む、大量の供給源から得られ得る。本開示のある特定の実施形態では、当技術分野にて利用可能な任意の数のＴ細胞株が使用され得る。本開示の一部の実施形態では、Ｔ細胞は当業者に公知である、任意の数の技術を用いて対象から収集した血液のユニットから得られる。一実施形態では、アフェレーシスによって固体の循環血から細胞が得られる。

【0195】

改変Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子は、本開示の操作されたメガヌクレアーゼによる二本鎖切断によってＴＣＲアルファ定常領域遺伝子の第１エクソン（すなわち標的とされたエクソン）へと挿入されている、目的の外因性配列を含む。かかるメガヌクレアーゼによって生成された切断部位により、標的とされたエクソンへと直接、目的の外因性配列の相同組換えを行うことが可能となり得る。

【0196】

本明細書で使用される場合、ヌクレオチド配列に関する「外因性」または「異種」という用語は、純粋に合成である配列、外来種を起源とする配列、または同種から発生する場合には、組成物および／または計画的なヒト治療介入によるゲノム座中のその天然形態から実質的に改変されている配列を意味すると意図されている。

【0197】

種々の実施形態では、目的の外因性配列は、目的のタンパク質に対するコード配列を含むことができる。該コード配列は、任意の目的のタンパク質向けであると考えられている。

【0198】

ある特定の実施形態では、目的の外因性配列は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードしている核酸配列を含む。一般的に、本開示のＣＡＲは、少なくとも細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、別名リガンド結合ドメインまたは部分と呼ばれるターゲット特異的結合エレメントを含む。一部の実施形態では、細胞内ドメイン、すなわち細胞質ドメインは、少なくとも１つの共刺激ドメインと、例えばＣＤ３ζなどの１つまたは複数のシグナル伝達ドメインを含む。

【0199】

一部の実施形態では、本発明で有用なＣＡＲは、別名リガンド結合ドメインまたは部分と呼ばれる、細胞外のターゲット特異的結合エレメントを含む。リガンド結合ドメインの選択は、ターゲット細胞の表面を規定するリガンドの種類およびリガンドの数によって変化する。例えばリガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連するターゲット細胞上の細胞表面マーカとして作用するリガンドを認識するために選択され得る。したがって、ＣＡＲ内のリガンド結合ドメインに対してリガンドとして作用し得る細胞表面マーカの例には、ウイルス感染症、細菌感染症および寄生虫感染症、自己免疫疾患、および癌細胞に関
連するものを含み得る。一部の実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍細胞上の抗原に特異的に結合する所望のリガンド結合部分を操作する方法を用いて、目的の腫瘍特異抗原を標的とするように操作されている。本開示の文脈においては、「腫瘍抗原」または「腫瘍特異抗原」は、癌などの特異的な過剰増殖障害に共通する抗原を指す。

【0200】

一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、目的の任意の抗原またはエピトープに対して特異的であり、特に目的の任意の腫瘍抗原またはエピトープに対して特異的である。非限定的な例としては、一部の実施形態ではそのターゲットの抗原は、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲバリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＬＬ－１、ジシアロガングリオシドＧＤ２、導管上皮ムチン、ｇｐ３６、ＴＡＧ－７２、グリコスフィンゴ脂質、グリオーマ関連抗原、Ｂ－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ、プロスターゼ特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＡ－ｌａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、残存およびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、インスリン増殖因子（ＩＧＦＩ）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦＩ受容体、メソテリン、腫瘍特異ペプチドエピトープを表す主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子などの腫瘍関連表面抗原、５Ｔ４、ＲＯＲ１、ＮＫｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、腫瘍間質抗原、フィブロネクチンのエクストラドメインＡ（ＥＤＡ）およびエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）ならびにテネイシンＣのＡｌドメイン（ＴｎＣ Ａｌ）ならびに線維芽細胞関連タンパク質（ｆａｐ）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＴＬＡ－４、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、エンドグリン、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９、ＴＮＦＲＳＦ１７）、ＣＳ１などの系譜特異または細胞特異抗原、またはＨＩＶ特異抗原（例えばＨＩＶ ｇｐｌ２０）などのウイルス特異表面抗原、ＥＢＶ－特異抗原、ＣＭＶ－特異抗原、Ｅ６またはＥ７腫瘍性タンパク質などのＨＰＶ－特異抗原、ラッサウイルス特異抗原、インフルエンザウイルス特異抗原、ならびにこれらの表面マーカの任意の誘導体またはバリアントである。本開示の特定の実施形態では、リガンド結合ドメインはＣＤ１９に対して特異的である。

【0201】

一部の実施形態では、キメラ抗原受容体の細胞外ドメインは自己抗原（Ｐａｙｎｅ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．３５３（６２９５）：１７９－１８４を参照されたい）を更に含む。これは、Ｂリンパ球上の自己抗原特異Ｂ細胞受容体によって認識することができ、こうすることでＴ細胞を特異的に標的として、抗体介在自己免疫疾患の自己反応性Ｂリンパ球を殺すように誘導する。かかるＣＡＲは、キメラ自己抗体受容体（ＣＡＡＲ）と呼ばれ得る。

【0202】

一部の実施形態では、キメラ抗原受容体の細胞外ドメインは、目的の抗原に対して天然起源のリガンド、または目的の抗原を結合する能力を保持する天然起源のリガンドのフラグメントを含むことができる。

【0203】

一部の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメインまたはヒンジまたはスペーサ配列を用いて細胞内シグナル伝達ドメインおよび共刺激ドメインを有する自己抗原をつなぐ、膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質から誘導されることがある。例えば、膜貫通ポリペプチドは、Ｔ細胞受容体のサブユニット（すなわち、α、β、γまたはζ、ＣＤ３複合体を構成するポリペプチド）、ＩＬ２受容体ｐ５５（鎖）、ｐ７５（β鎖）またはγ鎖、Ｆｃ受容体のサブユニット
鎖（例えば、Ｆｃｙ受容体ＩＩＩ）またはＣＤ８アルファ鎖などのＣＤタンパク質であり得る。代替的には、膜貫通ドメインは合成的なものであり得、ロイシンおよびバリンなど、主に疎水性残基を含み得る。特定の例では、膜貫通ドメインはＣＤ８α膜貫通ポリペプチドである。

【0204】

ヒンジ領域は、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するように機能する、任意のオリゴまたはポリペプチドを指す。例えば、ヒンジ領域は、最大３００アミノ酸、好ましくは１０～１００アミノ酸、最も好ましくは２５～５０アミノ酸を含むことができる。ヒンジ領域は、ＣＤ８、ＣＤ４もしくはＣＤ２８の細胞外領域の全部もしくは一部、または抗体定常領域の全部もしくは一部など、天然に存在する分子の全部または一部から誘導され得る。代替的には、ヒンジ領域は、天然に存在するヒンジ配列に対応する合成配列であり得るか、または完全合成ヒンジ配列であり得る。特定の例では、ヒンジドメインは、ヒトＣＤ８アルファ鎖、ＦｃｙＲｌｌｌａ受容体またはＩｇＧｌの一部を含むことができる。

【0205】

ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが配置されている細胞の少なくとも１つの正常なエフェクタ機能の活性化ならびに／または増殖性および細胞生存経路の活性化の要因となる。「エフェクタ機能」という用語は、細胞の特殊機能を指す。Ｔ細胞のエフェクタ機能は例えば、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性またはヘルパー活性であってよい。ＣＤ３ζなどの細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞外ドメインの結合に応答する細胞に対する活性化シグナルを提供することができる。議論されるように、活性化シグナルは、例えば細胞溶解活性またはサイトカイン分泌などの細胞のエフェクタ機能を誘発することができる。

【0206】

ＣＡＲの細胞内ドメインは、細胞増殖、細胞生存、および／または細胞外ドメインの結合後のサイトカイン分泌を促進する共刺激シグナルを伝達する、１つまたは複数の細胞内共刺激ドメインを含むことができる。かかる細胞内共刺激ドメインには、Ｎ１、Ｎ６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどの当技術分野で公知のものを含むが、これに限定されない。

【0207】

ＣＡＲは、任意の種類の癌細胞に対して特異的であり得る。かかる癌は、細胞腫、リンパ腫、肉腫、芽腫、白血病、Ｂ細胞起源の癌、乳癌、胃癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、肺癌、黒色腫、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、およびホジキンリンパ腫を含むことができるが、これに限定されない。ある特定の実施形態では、Ｂ細胞起源の癌は、Ｂ系統急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、および多発性骨髄腫を含むがこれに限定されない。

【0208】

目的の配列は、外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を更にコードすることができる。かかる外因性Ｔ細胞受容体は、アルファ鎖およびベータ鎖を含み得るか、または代替的には、ガンマ鎖およびデルタ鎖を含み得る。本発明において有用な外因性ＴＣＲは、目的の任意の抗原またはエピトープに対して特異性を有し得る。

【0209】

他の実施形態では、目的の配列は、野生型または改変されたバージョンである、目的の内因性遺伝子をコードすることができる。

【0210】

目的の配列は、Ｔ２Ａエレメント、Ｐ２Ａエレメント、Ｅ２Ａエレメント、およびＦ２ＡエレメントといったＩＲＥＳエレメントおよび２Ａエレメントを含むがこれに限定されない、同様のプロモータからの３つ以上の遺伝子を翻訳することが可能なように、当技術
分野で公知であるエレメントまたはペプチドを含むことができる。特異的な実施形態では、目的の外因性配列におけるかかる要素は、目的のタンパク質（例えばＣＡＲ）をコードしている核酸配列の５’上流または３’下流に位置することができる。

【0211】

本明細書に記載の目的の外因性配列は、追加の制御配列を更に含むことができる。例えば、目的の配列は、相同組換え転写促進因子配列、コザック配列、ポリアデニル化配列、転写終止配列、選択可能マーカ配列（例えば抗生物質耐性遺伝子）、複製の起点、およびそれと同様のものを含むことができる。本明細書に記載の目的の配列は、少なくとも１つの核局在化シグナルもまた含むことができる。核局在化シグナルの例は、当技術分野で公知である（例えば、Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００７，２８２：５１０１－５１０５を参照されたい）。

【0212】

本発明の操作されたメガヌクレアーゼは、タンパク質の形態で細胞へと輸送され得る。好ましくは、操作されたメガヌクレアーゼをコードしている核酸の形態で輸送され得る。かかる核酸はＤＮＡ（例えば、環状または直線状プラスミドＤＮＡまたはＰＣＲ産物）またはＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）であり得る。操作されたメガヌクレアーゼのコード配列がＤＮＡ形態で輸送される実施形態に関しては、この配列はメガヌクレアーゼ遺伝子の転写を促進するプロモータと、動作可能につなげられなければならない。本明細書に好適な哺乳動物のプロモータは、サイトメガロウイルス初期（ＣＭＶ）プロモータ（Ｔｈｏｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８１（３）：６５９－６３）またはＳＶ４０初期プロモータ（Ｂｅｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ（１９８１），Ｎａｔｕｒｅ．２９０（５８０４）：３０４－１０）などの常時発現プロモータおよびテトラサイクリン誘発性プロモータ（Ｄｉｎｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２（９）：４０３８－４５）などの誘発性プロモータを含む。本発明の操作されたメガヌクレアーゼは、合成プロモータに動作可能につなげることも可能である。合成プロモータは、ＪｅＴプロモータ（国際公開第２００２／０１２５１４号）を含むことができるが、これに限定されない。

【0213】

一部の実施形態では、操作されたメガヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡは細胞に輸送される。この理由は、このｍＲＮＡが、操作されたメガヌクレアーゼをコードしている遺伝子が細胞のゲノムへと組み込まれる可能性を低下させるからである。操作されたメガヌクレアーゼをコードしているこのようなｍＲＮＡは、インビトロ転写などの当技術分野で公知である方法を用いて産生され得る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、７－メチル－グアノシン、抗逆キャップアナログ（ＡＲＣＡ）（米国特許第７，０７４，５９６号）、Ｃａｐ１アナログなどのＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）アナログ（Ｔｒｉｌｉｎｋ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）またはワクシニアキャップ酵素もしくは類似物を用いた酵素的なキャップ化を用いて、５’キャップ化している。一部の実施形態では、ｍＲＮＡはポリアデニル化され得る。ｍＲＮＡ、コードされた操作されたメガヌクレアーゼの発現および／またはｍＲＮＡそれ自体の安定性を増強するための、種々の５’および３’非翻訳配列要素を含有し得る。かかる要素は例えば、ウッドチャック肝炎ウイルスの翻訳後制御因子配列など、翻訳後の制御因子エレメントを含むことができる。ｍＲＮＡは、プソイドウリジン、５－メチルシチジン、Ｎ６－メチルアデノシン、５－メチルウリジン、または２－チオウリジンなど、ヌクレオシドアナログまたは天然起源ヌクレオシドを含有し得る。追加のヌクレオシドアナログは、例えば米国特許第８，２７８，０３６号に記載のものを含む。

【0214】

特定の実施形態では、本発明の操作されたメガヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡは、細胞内で同時に発現している２つ以上のメガヌクレアーゼをコードしている、ポリシストロニックｍＲＮＡであり得る。ポリシストロニックｍＲＮＡは、同様のターゲット遺伝子内の異なる認識配列を標的とする２つ以上のメガヌクレアーゼをコードすることがで
きる。代替的には、ポリシストロニックｍＲＮＡは、切断部位が両方の遺伝子内で産生されるように、本明細書に記載の少なくとも１つのメガヌクレアーゼおよび同様の遺伝子中に位置している別々の認識配列を標的にする、または第２の遺伝子に位置している第２の認識配列を標的にしている、少なくとも１つの追加のヌクレアーゼをコードすることができる。ポリシストロニックｍＲＮＡは、ＩＲＥＳエレメント、Ｔ２Ａエレメント、Ｐ２Ａエレメント、Ｅ２Ａエレメント、およびＦ２Ａエレメントを含むがこれに限定されない、同様のｍＲＮＡ分子からの３つ以上の遺伝子（すなわちシストロン）を翻訳することが可能なように、当技術分野で公知である任意のエレメントまたはペプチドを含むことができる。

【0215】

別の特定の実施形態では、本発明の操作されたメガヌクレアーゼをコードしている核酸は、一本鎖ＤＮＡ鋳型を用いて細胞内へと導入され得る。一本鎖ＤＮＡは、操作されたメガヌクレアーゼをコードしている配列の上流および／または下流である、５’および／または３’ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）を更に含む。他の実施形態では、一本鎖ＤＮＡは操作されたメガヌクレアーゼをコードしている配列の５’および／または３’相同アーム上流および／または下流を更に含むことができる。

【0216】

別の特定の実施形態では、本発明のメガヌクレアーゼをコードしている遺伝子は、直線状ＤＮＡ鋳型を用いて細胞内へと導入され得る。一部の例では、メガヌクレアーゼをコードしているプラスミドＤＮＡは、細胞内へと導入される前に環状プラスミドＤＮＡが直線化されるように、１つまたは複数の制限酵素によって消化され得る。

【0217】

精製されたメガヌクレアーゼタンパク質は、ゲノムＤＮＡを切断するために細胞内へと輸送され得る。これは、以下、本明細書に更に詳細に記載のものを含む、当技術分野で公知の種々の異なる機構により、目的の配列を有する切断部位にて相同組換えまたは非相同末端結合を行うことができる。

【0218】

一部の実施形態では、メガヌクレアーゼタンパク質、またはメガヌクレアーゼをコードしているＤＮＡ／ｍＲＮＡはターゲットリガンドと結合され、細胞透過性ペプチドまたは細胞への取込みを促進する。当技術分野で公知である細胞透過性ペプチドの例は、ポリ－アルギニン（Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ
Ｔｈｅｒ．１６：１６２４－９）、ＨＩＶウイルス由来のＴＡＴペプチド（Ｈｕｄｅｃｚ，ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２５：６７９－７３６）、ＭＰＧ（Ｓｉｍｅｏｎｉ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７－２７２４）、Ｐｅｐ－１（Ｄｅｓｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４３：７６９８－７７０６）、およびＨＳＶ－１ ＶＰ－２２（Ｄｅｓｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６２：１８３９－４９）を含む。代替的な実施形態では、メガヌクレアーゼタンパク質、またはメガヌクレアーゼをコードしているＤＮＡ／ｍＲＮＡは、メガヌクレアーゼタンパク質／ＤＮＡ／ｍＲＮＡが結合し、かつターゲット細胞によって内部移行されるように、ターゲット細胞に発現している特異細胞表面受容体を認識する抗体に共有結合的にまたは非共有結合的に結合されている。代替的には、メガヌクレアーゼタンパク質／ＤＮＡ／ｍＲＮＡは、かかる細胞表面受容体に対する天然リガンド（または天然リガンドの一部）と共有結合的または非共有結合的に結合され得る。（ＭｃＣａｌｌ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｒｒｉｅｒｓ．２（４）：ｅ９４４４４９；Ｄｉｎｄａ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１２６４－７４；Ｋａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（３）：２２０－３０；Ｑｉａｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｔｏｘｉｃｏｌ．１０（１１）：１４９１－５０８）。

【0219】

一部の実施形態では、メガヌクレアーゼタンパク質、またはメガヌクレアーゼをコードしているＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ナノ粒子に共有結合的にまたは非共有結合的に結合または当技術分野で公知である方法を用いてかかるナノ粒子内に被包されている（Ｓｈａｒｍａ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２０１４）。ナノ粒子は、その長さスケールが１Ｄｍ未満であり、好ましくは１００ｎｍ未満であるナノスケールの輸送系である。かかるナノ粒子は、金属、脂質、ポリマー、もしくは生物学的な巨大分子、組換えメガヌクレアーゼタンパク質の複数の複製、ｍＲＮＡで構成されているコアを用いて設計され得、またはＤＮＡはナノ粒子コアに付着または被包され得る。これは、各細胞に輸送されるメガヌクレアーゼタンパク質／ｍＲＮＡ／ＤＮＡの複製数を増加させ、そのため、各操作されたメガヌクレアーゼの細胞内発現を増加させ、ターゲット認識配列を切断する可能性を最大化させる。かかるナノ粒子の表面は、ポリマーまたは脂質（例えばキトサン、カチオン性ポリマー、またはカチオン性脂質）を用いて更に修飾され得、細胞輸送および低分子医薬品の取込みを増強させるため、その表面が追加の機能性を与えるようなコアシェルナノ粒子を形成する（Ｊｉａｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．３３（３０）：７６２１－３０）。ナノ粒子は、追加的にターゲット分子と有利に結合され得、適切な細胞腫に対してナノ粒子を誘導かつ／または細胞への取込みといった可能性を増加させる。かかるターゲット分子の例は、細胞表面受容体に対して特異的な抗体および細胞表面受容体に対しての天然リガンド（または天然リガンドの一部）を含む。

【0220】

一部の実施形態では、メガヌクレアーゼタンパク質またはメガヌクレアーゼをコードしているＤＮＡ／ｍＲＮＡは、リポソーム内に被包されるか、またはカチオン性脂質を用いて組み合わせられている（例えば、リポフェクタミン（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；Ｚｕｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：７３－８０；Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２０１１：８６３７３４を参照されたい）。リポソーム製剤およびリポプレックス製剤は、低分子医薬品を分解から保護することができ、ターゲット細胞の細胞膜との融合および／またはその破壊を通し、細胞への取込みおよび輸送効率を促進することができる。

【0221】

一部の実施形態では、メガヌクレアーゼタンパク質、またはメガヌクレアーゼをコードしているＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ポリマー性スキャフォールド（例えばＰＬＧＡ）内に被包されているか、またはカチオン性ポリマー（例えばＰＥＩ、ＰＬＬ）を用いて組み合わせられている（Ｔａｍｂｏｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｔｈｅｒ Ｄｅｌｉｖ．２（４）：５２３－５３６）。ポリマー担体は、ポリマー浸食および薬物拡散の制御を通じて調節可能な薬物放出速度を提供するよう設計され得、高い薬物封入効率により、所望のターゲット細胞集団へと細胞内輸送されるまで、低分子医薬品の保護を提供することができる。

【0222】

一部の実施形態では、メガヌクレアーゼタンパク質、または組換えメガヌクレアーゼをコードしているＤＮＡ／ｍＲＮＡは、自己集合してミセルを構築する両親媒性分子と組み合わせられる（Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．９（１１）：９５６－６６）。ポリマー性ミセルは、凝集を防ぎ、電荷相互作用を遮蔽し、非特異的な相互作用を低下させることができる親水性ポリマー（例えばポリエチレングリコール）を用いて形成されたミセルシェルを含み得る。

【0223】

一部の実施形態では、メガヌクレアーゼタンパク質、または組換えメガヌクレアーゼをコードしているＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ターゲット細胞に対する投与および／または輸送のためのエマルションまたはナノエマルション（すなわち、１ｎｍ未満の平均粒子径を有す
る）に製剤化されている。「エマルション」という用語は、水不混和相が水相と混合されている場合、水から離れている無極性残基（例えば、長鎖炭化水素）および水に対する極性頭部群を駆動する疎水力の結果として形成され得る脂質構造物を含む、任意の油中水型、水中油型、水中油中水型または油中水中油型分散または液滴を指すが、これに限定されない。これらの他の脂質構造物は、単層状、小層（ｐａｕｃｉｌａｍｅｌｌａｒ）、または多層状の脂質小胞、ミセル、およびラメラ相を含むがこれに限定されない。エマルションは、水相および親油相（典型的には油と有機溶媒を含有している）で構成されている。エマルションはまた、１種以上の界面活性剤を含有することが多い。ナノエマルション製剤は、例えば米国特許出願番号第２００２／００４５６６７号、および第２００４／００４３０４１号、ならびに米国特許番号第６，０１５，８３２号、６，５０６，８０３号、６，６３５，６７６号、および６，５５９，１８９号に記載のものが周知であり、そのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

【0224】

一部の実施形態では、メガヌクレアーゼタンパク質、または組換えメガヌクレアーゼをコードしているＤＮＡ／ｍＲＮＡは、多機能性ポリマー抱合体、ＤＮＡデンドリマー、およびポリマー性デンドリマーに共有結合的に結合しているか、または非共有結合的に結合している（Ｍａｓｔｏｒａｋｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｎｏｓｃａｌｅ．７（９）：３８４５－５６；Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．９７（１）：１２３－４３）。デンドリマーの発生によって最大積載量とサイズを制御することができ、高い薬物最大積載量を提供し得る。加えて、複数の表面基の表示は、安定性を向上させ、非特異的相互作用を低下させ、かつ細胞特異的なターゲッティングおよび薬物放出を増強させるために活用され得る。

【0225】

一部の実施形態では、メガヌクレアーゼをコードしている遺伝子は、ウイルスベクターを用いて輸送されている。かかるベクターは当技術分野で公知であり、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む（Ｖａｎｎｕｃｃｉ，ｅｔ ａｌ．（２０１３ Ｎｅｗ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：１－２２）に概説されている）。本発明にて有用な組換えＡＡＶベクターは、細胞中へのウイルスの形質導入および細胞ゲノム中へのヌクレアーゼ遺伝子の挿入を可能とする、任意のセロタイプを有し得る。特定の実施形態では、組換えＡＡＶベクターはＡＡＶ２またはＡＡＶ６のセロタイプを有する。ＡＡＶベクターは、これらが宿主細胞内にて二本鎖ＤＮＡの合成を必要としないように自己相補的でもあり得る（ＭｃＣａｒｔｙ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１２４８－５４）。

【0226】

仮にメガヌクレアーゼ遺伝子がＤＮＡ形態（例えばプラスミド）でおよび／またはウイルスベクター（例えばＡＡＶ）を用いて輸送される場合、この遺伝子はプロモータと動作可能につながらなくてはならない。一部の実施形態では、ウイルスベクター由来の内因性プロモータ（例えば、レンチウイルスベクターのＬＴＲ）などのウイルスプロモータまたは周知のサイトメガロウイルスプロモータもしくはＳＶ４０初期プロモータであり得る。好ましい実施形態では、メガヌクレアーゼ遺伝子は、ターゲット細胞（例えばＴ細胞）において、好ましくは遺伝子の発現を駆動するプロモータと動作可能につながれている。

【0227】

本発明は、ＴＲＣ１－２認識配列にて、目的の外因性配列のＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子への導入を更に提供する。一部の実施形態では、目的の外因性配列は、５’相同アームと、挿入する配列に隣接する３’相同アームとを含む。かかる相同アームは、切断部位が作製される場所の配列の、５’上流および３’下流の対応するヌクレアーゼ認識配列に対する配列相同性を有する。一般に、相同アームは、少なくとも５０塩基対、好ましくは少なくとも１００塩基対、および最大２０００塩基対以上の長さを有することができ、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、またはそれ以上である、ゲノム内の対応する配列に対する配列相同性を有し得る。

【0228】

本発明の目的の外因性配列は、前述の方法のいずれかによって細胞内へと導入されてよい。特定の実施形態では、目的の外因性配列は、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、または好ましくは組換えＡＡＶベクターなどのウイルスベクターを用いて導入される。外因性核酸を導入するのに有用な組換えＡＡＶベクターは、細胞内へのウイルスの導入および細胞ゲノム中への外因性核酸配列を挿入することが可能である、任意のセロタイプを有し得る。特定の実施形態では、該組換えＡＡＶベクターはＡＡＶ２またはＡＡＶ６のセロタイプを有する。組換えＡＡＶベクターは、これらが宿主細胞内にて二本鎖ＤＮＡの合成を必要としないように自己相補的でもあり得る。

【0229】

別の特定の実施形態では、目的の外因性配列は、一本鎖ＤＮＡ鋳型を用いて細胞中へと導入され得る。一本鎖ＤＮＡは、目的の外因性配列を含み得、好ましい実施形態では、相同組換えによるメガヌクレアーゼ切断部位中への核酸配列の挿入を促進するための５’相同アームと３’相同アームを含み得る。一本鎖ＤＮＡは５’相同アームの５’上流である５’ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）と、３’相同アームの３’下流である３’ＡＡＶ ＩＴＲを更に含み得る。

【0230】

別の特定の実施形態では、本発明の操作されたヌクレアーゼをコードしている遺伝子および／または本発明の目的の外因性配列は、直線状ＤＮＡ鋳型を用いて遺伝子導入することで細胞内へと導入され得る。一部の例では、プラスミドＤＮＡは、細胞内へと遺伝子導入される前に環状プラスミドＤＮＡが直線化されるように、１つまたは複数の制限酵素によって消化され得る。

【0231】

本発明によって改変されたＴ細胞は、メガヌクレアーゼおよび／または目的の外因性配列を導入する前に活性化が必要となる。例えば、Ｔ細胞は、細胞を活性化させるのに十分な期間にわたり、可溶なまたは支持体（すなわちビーズ）に抱合されている抗－ＣＤ３および抗－ＣＤ２８抗体と接触することができる。

【0232】

本発明の遺伝子改変された細胞は、１つまたは複数の誘因可能な自殺遺伝子を発現させるために更に改変され得る。こうした細胞を誘発させることにより細胞死を引き起こし、インビトロまたはインビボでの細胞の選択的な破壊が可能となる。一部の例では、自殺遺伝子は細胞毒性ポリペプチド、非毒性のプロドラッグを細胞毒性薬物に変換することができる能力を有するポリペプチド、および／または細胞内の細胞毒性遺伝子経路を活性化するポリペプチドをコードすることができる。すなわち、自殺遺伝子は、それ自身によってまたは他の化合物の存在下にて細胞死を引き起こす産物をコードする核酸である。かかる自殺遺伝子の代表例は、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼをコードしているものである。追加の例としては、水痘帯状疱疹ウイルスのチミジンキナーゼおよび５－フルオロシトシンを、毒性が高い化合物である５－フルオロウラシルへと変換することができる細菌遺伝子シトシンデアミナーゼをコードしている遺伝子である。自殺遺伝子はまた、非限定的な例として、カスパーゼ－９、カスパーゼ－８、またはシトシンデアミナーゼをコードする遺伝子を含む。一部の例では、カスパーゼ－９は、特異的なタンパク質二量体誘導化合物（ＣＩＤ）を用いて活性化され得る。自殺遺伝子は、治療用抗体および／または細胞毒性モノクローナル抗体に対して細胞が感受できるようにする、細胞表面にて発現されるポリペプチドをコードすることも可能である。更なる例では、自殺遺伝子は、抗－ＣＤ２０ｍＡｂリツキシマブによって認識されている抗原モチーフおよび自殺遺伝子を発現している細胞をセレクション可能にするエピトープを含む、組換え抗原ポリペプチドをコードすることができる。例えば、２つのリツキシマブ結合エピトープおよびＱＢＥｎｄ１０－結合エピトープを含む、国際公開第２０１３１５３３９１号に記載されたＲＱＲ８ポリペプチドを参照されたい。かかる遺伝子について、リツキシマブは、必要時に細胞のディプリーションを誘発するため対象に投与され得る。更なる例では、自殺遺伝子は、切断
型ＥＧＦＲポリペプチドと組み合わせられて発現されている、ＱＢＥｎｄ１０－結合エピトープを含んでよい。

【0233】

本明細書に記載の、本方法で改変された真核細胞および組成物は、内因性Ｔ細胞受容体（すなわちアルファ／ベータＴ細胞受容体）の発現を低下させ得、目的のタンパク質（例えばＣＡＲ）を更に発現することができる。したがって、本発明は目的のタンパク質を発現する真核細胞の集団を更に提供し、内因性Ｔ細胞受容体（例えばアルファ／ベータＴ細胞受容体）を発現することはない。例えば、集団は、ＣＡＲ（すなわちＣＡＲ＋）、または外因性Ｔ細胞受容体（すなわち体外ＴＣＲ＋）を発現する、本発明の複数の遺伝子改変された真核細胞を含み得、内因性Ｔ細胞受容体（すなわちＴＣＲ－）の発現を低下させる。本発明の種々の実施形態では、該集団中の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または最大１００％の細胞は、本明細書に記載されているような遺伝子改変された真核細胞である。特定の実施形態では、集団は、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または最大１００％の、ＴＣＲ－およびＣＡＲ＋の両方である細胞を含むことができる。

【0234】

一部の実施形態では、細胞の集団に導入した場合、本開示の操作されたメガヌクレアーゼにより、第１世代のＴＣＲ１－２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼが細胞集団内へと導入される場合より更に高い比率で、その両方がＴＣＲ－およびＣＡＲ＋である、細胞集団が生じる。

【0235】

更に、本開示の操作されたメガヌクレアーゼで遺伝子改変された細胞は、向上した特徴を示す。この特徴は、オフターゲット切断およびその効果を低下させ、細胞中のメガヌクレアーゼの維持時間を減少させ、ＣＡＲ Ｔの増殖を増強（すなわち増加）させることを含む。更に、該細胞は、ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼで遺伝子改変された細胞と比較した場合、分化程度が低い。加えて、本開示のメガヌクレアーゼ（またはこれをコードする核酸）が中に導入された細胞集団は、ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼ（またはこれをコードする核酸）が中に導入された細胞集団と比較した場合、より多い比率にて改変された細胞を、およびより大きい比率にて分化程度の低い細胞を有する。特定の実施形態では、本開示の操作されたメガヌクレアーゼが導入される細胞の集団は、第１世代のＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼが導入される細胞の集団より更に高い比率の中央メモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌを発現するもの）を示す。

【0236】

２．４ 薬学的組成物
一部の実施形態では、本発明は本発明の遺伝子改変された真核細胞、本発明の遺伝子改変された真核細胞の集団、および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。かかる薬学的組成物は、公知の技術に従って調製され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔ ｅｄ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５）を参照されたい。本発明に従った薬学的製剤の製造において、細胞は典型的には薬学的に許容される担体と混合され、得られた組成物は対象へと投
与される。もちろん、担体は製剤中の任意の他の成分と適合しているという意味で許容されなければならず、対象に対して有害であってはならない。一部の実施形態では、本発明の薬学的組成物は、対象の疾患治療において有用である、１つまたは複数の追加の薬剤を更に含み得る。追加の実施形態では、本発明の薬学的組成物は、サイトカイン（例えばＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５および／またはＩＬ－２１）などの生物学的分子を更に含む。これは、インビボでの細胞増殖および遺伝子改変されたＴ細胞の移植を促進させる。本発明の遺伝子改変された真核細胞を含む薬学的組成物は、追加の薬剤もしくは生物学的分子として同じ組成物をもって投与され得る。代替的には、別々の組成物をもって同時投与され得る。

【0237】

本開示はまた、医薬品として使用されるための、本明細書に記載の遺伝子改変された細胞、またはその集団を提供する。本開示は、治療の必要がある対象において疾患を治療するための医薬品を製造する際、本明細書に記載の遺伝子改変された細胞、またはその集団を更に提供する。このような一態様では、医薬品は、必要のある対象においては、癌免疫療法に対して有用である。

【0238】

本開示のメガヌクレアーゼが中に導入された細胞は、オフターゲット切断を低下させ、細胞内のメガヌクレアーゼの維持時間を減少させ、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子をより高い効率で破壊し、ＣＡＲ Ｔ増殖を増強（すなわち増加）させる。更に、該細胞は、ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼによって事前に遺伝子改変されたＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼによって事前に遺伝子改変された細胞と比較した場合、分化程度が低くなる可能性がある。一部の実施形態では、遺伝子改変された細胞を含む、本発明にて開示された薬学的組成物はまた、ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼによって遺伝子改変された細胞を含む薬学的組成物の投与と比較した場合、治療の必要がある対象に投与された際に、疾患（例えば癌）の治療における有効性を向上させている。

【0239】

一部の実施形態では、細胞の集団に導入した場合、本開示の操作されたメガヌクレアーゼにより、第１世代のＴＣＲ１－２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼが細胞集団内へと導入される場合より更に高い比率で、その両方がＴＣＲ－およびＣＡＲ＋である、細胞集団が生じる。

【0240】

更に、本開示の操作されたメガヌクレアーゼで遺伝子改変された細胞は、向上した特徴を示す。この特徴は、オフターゲット切断およびその効果を低下させ、細胞中のメガヌクレアーゼの維持時間を減少させ、ＣＡＲ Ｔの増殖を増強（すなわち増加）させることを含む。更に、該細胞は、ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼで遺伝子改変された細胞と比較した場合、分化程度が低い。加えて、本開示のメガヌクレアーゼ（またはこれをコードする核酸）が中に導入された細胞集団は、ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼ（またはこれをコードする核酸）が中に導入された細胞集団と比較した場合、より多い比率にて改変された細胞を、およびより大きい比率にて分化程度の低い細胞を有する。特定の実施形態では、本開示の操作されたメガヌクレアーゼが導入される細胞の集団は、親のＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼに事前に導入される細胞の集団より更に高い比率の中央メモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌを発現するもの）を示す。

【0241】

本発明の薬学的組成物は、Ｔ細胞養子免疫療法によって標的とすることができる、任意の疾患状態を治療するのに有用であり得る。特定の実施形態では、本発明の薬学的組成物および医薬品は、癌の治療に有用である。本開示の薬学的組成物および医薬品を用いて治療することができる癌の非限定的な例には、Ｂ細胞起源の癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、前立腺癌、腎細胞癌、横紋筋肉腫、肝癌、胃癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頸部の癌、乳癌、肺癌、皮膚性または眼内悪性黒色腫卵巣癌、腎臓癌、子宮癌、卵巣癌、大腸癌
、結腸癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、ファロピウス管の細胞腫、子宮内膜の細胞腫、子宮頸部の細胞腫、膣の細胞腫、外陰部の細胞腫、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓または尿管癌、腎盂の細胞腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、ＣＮＳ原発リンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、アスベストにより誘発されるものを含む環境誘発癌、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、大細胞型免疫芽球性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、菌状息肉症、未分化大細胞型リンパ腫、およびＴ細胞リンパ腫、ならびに当該癌の任意の組合せを含むがこれに限定されない、細胞腫、リンパ腫、肉腫、黒色腫、芽腫、白血病、胚細胞性腫瘍である。ある特定の実施形態では、Ｂ細胞起源の癌は、Ｂ細胞系急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｐｒｅ－Ｂ ＡＬＬ（前駆Ｂ細胞リンパ性白血病、小児適応症）、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、およびＢ細胞非ホジキンリンパ腫を含むがこれに限定されない。

【0242】

癌が本開示の遺伝子改変された細胞またはその集団により治療される一部のこれらの実施形態では、遺伝子改変された細胞またはその集団を投与された対象は、放射線治療、外科治療などの追加の治療の薬剤、または化学療法剤を更に投与される。

【0243】

本発明は、本明細書に記載の複数の遺伝子改変された細胞を含む、遺伝子改変された細胞の集団を更に提供する。これは、目的の配列をコードしている外因性核酸分子をそのゲノム中に含み、該外因性核酸分子はＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子中へと挿入され、内因性ＴＣＲの細胞表面発現は低下する。したがって、本発明の種々の実施形態では、遺伝子改変された細胞の集団が提供されており、該集団中の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または最大１００％の細胞は、本明細書に記載の遺伝子改変された細胞である。本発明の更なる実施形態では、遺伝子改変された細胞の集団が提供されており、該集団中の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または最大１００％の細胞は、キメラ抗原受容体を更に発現する、本明細書に記載の遺伝子改変された細胞である。

【0244】

２．５．遺伝子改変された細胞の投与方法
本明細書に記載の別の態様は、治療の必要がある対象への、有効量の本開示の遺伝子改変された真核細胞またはその集団の投与である。特定の実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は治療の必要がある対象へと投与される。例えば、治療有効量の細胞の集団は、疾患を有する対象へと投与され得る。特定の実施形態では、該疾患は癌であり得、本発明の遺伝子改変された真核細胞の投与は免疫療法となる。投与された細胞は、増殖の減少、数の減少、またはレシピエント中のターゲット細胞を殺すことができる。抗体治療とは異なり、本開示の遺伝子改変された真核細胞は、インビボにて複製および増えることができ、持続的な疾患の制御をもたらし得るよう長期で持続する。

【0245】

可能な投与経路の例には、非経口（例えば静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮内、皮
下（ＳＣ）、または点滴）投与を含む。加えて、該投与は、持続点滴によるもの、または単一ボーラスもしくは複数のボーラスによるものであってよい。特異的な実施形態では、薬剤は約１２時間未満、６時間未満、４時間未満、３時間未満、２時間未満、または１時間未満の期間にわたって点滴される。更に他の実施形態では、点滴は、最初はゆっくりと行われ、その後経時的に増加してもよい。

【0246】

一部の実施形態では、本開示の遺伝子改変された真核細胞またはその集団は、癌を治療するという目的のための腫瘍抗原を標的とする。かかる癌は、細胞腫、リンパ腫、肉腫、芽腫、白血病、Ｂ細胞起源の癌、乳癌、胃癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、肺癌、黒色腫、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌、卵巣癌、横紋筋肉腫、白血病、およびホジキンリンパ腫を含むことができるが、これに限定されない。特異的な実施形態では、癌および障害は、ｐｒｅ－Ｂ ＡＬＬ（小児適応症）、成人ＡＬＬ、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、同種異系の骨髄移植後のサルベージなどが含まれるが、これに限定されない。これらの癌は、例えばＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、および／またはＲＯＲ１を標的にするＣＡＲの組合せを用いて治療され得る。一部の非限定的な例には、本開示の遺伝子改変された真核細胞またはその集団は、Ｂ細胞起源の癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、前立腺癌、腎細胞癌、横紋筋肉腫、肝癌、胃癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頸部の癌、乳癌、肺癌、皮膚性または眼内悪性黒色腫卵巣癌、腎臓癌、子宮癌、卵巣癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、ファロピウス管の細胞腫、子宮内膜の細胞腫、子宮頸部の細胞腫、膣の細胞腫、外陰部の細胞腫、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓または尿管癌、腎盂の細胞腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、ＣＮＳ原発リンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、アスベストにより誘発されるものを含む環境誘発癌、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、大細胞型免疫芽球性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、菌状息肉症、未分化大細胞型リンパ腫、およびＴ細胞リンパ腫、ならびに当該癌の任意の組合せを含むがこれに限定されない、細胞腫、リンパ腫、肉腫、黒色腫、芽腫、白血病、胚細胞性腫瘍を標的とする。ある特定の実施形態では、Ｂ細胞起源の癌は、Ｂ細胞系急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｐｒｅ－Ｂ ＡＬＬ（前駆Ｂ細胞リンパ性白血病、小児適応症）、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、およびＢ細胞非ホジキンリンパ腫を含むがこれに限定されない。

【0247】

「有効量」または「治療量」が示されている場合、年齢、体重、腫瘍サイズ（存在する場合）、感染または転移の程度、および患者（対象）の状態における個別の差異を考慮した上で、医師によって投与される正確な量が決定され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変された細胞またはその集団を含む薬学的組成物は、その範囲内での整数値全体を含む１０４～１０９細胞／ｋｇ体重の投薬量で投与される。更なる実施形態では、投薬量は、その範囲内での整数値全体を含む１０５～１０６細胞／ｋｇ体重である。一部の実施形態では、細胞組成物は、これらの投薬量で複数回投与される。該細胞は、免疫療法で周知である点滴技術を用いることによって投与され得る（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照されたい）。特定の患者に対する最適な投薬量および治療投与計画は、疾患の兆候に関して患者をモニタリングし、それに合うよう治療を調節することにより、医薬分野の当業者によって容易に決定され得る。

【0248】

一部の実施形態では、本開示の遺伝子改変された真核細胞またはその集団は、ターゲットの疾患または状態の少なくとも１つの症状を低減させる。例えば、本開示の遺伝子改変
されたＴ細胞またはその集団の投与は、癌の少なくとも１つの症状を低減させ得る。癌の症状は当技術分野で周知であり、公知の技術によって決定され得る。

【0249】

２．６ 組換えウイルスベクターを産生するための方法
一部の実施形態では、本発明は、本発明の方法で使用するためのウイルスベクター（例えば組換えＡＡＶベクター）を提供する。組換えＡＡＶベクターは、ＨＥＫ－２９３などの哺乳動物の細胞株において典型的に産生される。ウイルスｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子は、輸送される１つ以上の治療遺伝子（例えばメガヌクレアーゼ遺伝子）に対する空間を作製するよう、自己複製を防ぐためにベクターから除去されるので、パッケージング細胞株においてはトランス状態のこうした遺伝子を提供することが必要である。加えて、複製を支援するのに必要な「ヘルパー」（例えばアデノウイルス）成分を提供することが必要である（Ｃｏｔｓ ｅｔ ａｌ．（２０１３），Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３（５）：３７０－８１）。多くの場合、組換えＡＡＶベクターは「ヘルパー」成分をコードしている第１のプラスミド、ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子を含む第２のプラスミド、ならびにウイルスへとパッケージされる介在ＤＮＡ配列を含有するウイルス性ＩＴＲを含む第３のプラスミドで細胞株が遺伝子導入される、トリプルトランスフェクションを用いて作製されている。カプシド中に包まれているゲノム（目的のＩＴＲおよび１つ以上の介在遺伝子）を含むウイルス粒子は、その後に凍結融解サイクル、超音波処理、洗浄剤、または当技術分野で公知の他の手段によって細胞から単離される。次いで粒子は、塩化セシウムによる密度グラジエント遠心分離またはアフィニティークロマトグラフィを用いて精製され、その後に細胞、組織またはヒト患者などの生物に対する目的の１つ以上の遺伝子へと輸送される。

【0250】

組換えＡＡＶ粒子は典型的には細胞中に産生（製造）されるので、確実に操作されたメガヌクレアーゼがパッケージング細胞に発現されないように、本発明を実行する際には注意しなければならない。本発明のウイルスゲノムは、該メガヌクレアーゼのための認識配列を含み得るので、パッケージング細胞株に発現されている任意のメガヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼがウイルス粒子にパッケージされ得る前にウイルスゲノムを切断することが可能となり得る。これにより、パッケージング効率および／または断片となったゲノムのパッケージングの低下が発生する。パッケージング細胞におけるメガヌクレアーゼの発現を防ぐため、以下のアプローチを含む、いくつかのアプローチが使用され得る。

【0251】

メガヌクレアーゼは、パッケージング細胞で活性ではない組織特異プロモータを制御した状態で配置され得る。例えば、筋肉組織に（ａ）１つ以上のメガヌクレアーゼ遺伝子を輸送するためにウイルスベクターを発生させる場合、筋肉特異プロモータが使用され得る。筋肉特異プロモータの例は、Ｃ５－１２（Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：７８３－９２）、筋肉特異クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモータ（Ｙｕａｓａ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：１５７６－８８）、または平滑筋２２（ＳＭ２２）プロモータ（Ｈａａｓｅ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：４９－５４）を含む。ＣＮＳ（ニューロン）特異プロモータの例は、ＮＳＥ、シナプシン、およびＭｅＣＰ２プロモータ（Ｌｅｎｔｚ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ．４８：１７９－８８）を含む。肝臓特異プロモータの例は、アルブミンプロモータ（Ｐａｌｂなど）、ヒトα１－アンチトリプシン（Ｐａ１ＡＴなど）、およびヘモペキシン（Ｐｈｐｘなど）（Ｋｒａｍｅｒ
ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ７：３７５－８５）、ハイブリッド肝臓特異プロモータ（ＡｐｏＥ遺伝子由来の肝臓遺伝子座制御領域および肝臓特異アルファ１－アンチトリプシンプロモータ）、ヒトチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモータ、およびアポリポプロテインＡ－ＩＩプロモータを含む。眼特異プロモータの例は、オプシン、および角膜上皮特異Ｋ１２プロモータ（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｅｔｈｏｄｓ（２８）：２６７－７５）（Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００
７）Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ，９：９５６－６６）を含む。これらのプロモータ、または当技術分野で公知である他の組織特異プロモータは、ＨＥＫ－２９３中で高い活性を示さない。そのため、本発明のウイルスベクターに導入される場合、パッケージング細胞中では著しいレベルでのメガヌクレアーゼ遺伝子の発現をもたらすことは期待できない。同様に、本発明のウイルスベクターは、非適合性の組織特異プロモータの使用と一緒に他の細胞株を使用すること（すなわち、周知のＨｅＬａ細胞株（ヒト上皮細胞）と肝臓特異ヘモペキシンプロモータを使用すること）を企図している。組織特異プロモータの他の例は、滑膜肉腫ＰＤＺＤ４（小脳）、Ｃ６（肝臓）、ＡＳＢ５（筋肉）、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｂ（心臓）、ＳＬＣ５Ａ１２（腎臓）、コレステロール調節ＡＰＯＭ（肝臓）、ＡＤＰＲＨＬ１（心臓）および一遺伝子性奇形症候群ＴＰ７３Ｌ（筋肉）を含む。（Ｊａｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，（２０１０），ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ｖ．５（８）：ｅ１２２７４）。

【0252】

代替的には、ベクターは、メガヌクレアーゼが発現されない可能性のある異なる種由来の細胞内にパッケージされ得る。例えば、ウイルス粒子は、非哺乳動物のパッケージング細胞中では活性ではない、周知のサイトメガロウイルス初期プロモータ、またはＳＶ４０初期プロモータなど哺乳動物のプロモータを用いた微生物細胞、昆虫細胞、または植物細胞中に産生され得る。好ましい実施形態では、ウイルス粒子はＧａｏ，ｅｔ ａｌ．（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３１（２）：１３８－４３）により記載のバキュロウイルス系を用いて、昆虫細胞内に産生される。哺乳動物のプロモータの制御下にあるメガヌクレアーゼは、昆虫細胞内では発現される可能性がない（Ａｉｒｅｎｎｅ ｅｔ ａｌ．（２０１３），Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１（４）：７３９－４９）。加えて、昆虫細胞は、哺乳動物細胞以外の異なるｍＲＮＡスプライシングモチーフを使用する。したがって、メガヌクレアーゼのコード配列へと、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）イントロンまたはＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンなどの哺乳動物のイントロンを組み込むことができる。イントロンは、昆虫細胞内のプレｍＲＮＡ転写物から効率的にはスプライスされないため、昆虫細胞は機能的メガヌクレアーゼを発現することはなく、完全な長さのゲノムをパッケージすることになる。それとは対照的に、生じた組換えＡＡＶ粒子が輸送される哺乳動物細胞は、プレｍＲＮＡ転写物を確実にスプライスし、機能的メガヌクレアーゼタンパク質を発現する。Ｈａｉｆｅｎｇ Ｃｈｅｎは、昆虫のパッケージング細胞中の毒性タンパク質バルナーゼおよびジフテリア毒性フラグメントＡの発現を弱めるためのＨＧＨおよびＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンの使用を報告している。これにより、これらの毒性遺伝子を運搬する組換えＡＡＶベクターの製造が可能となる（Ｃｈｅｎ（２０１２），Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．１（１１）：ｅ５７）。

【0253】

メガヌクレアーゼ遺伝子は、メガヌクレアーゼの発現に小分子のインデューサが必要とされるように、動作可能に誘発性プロモータへと結合され得る。誘発性プロモータは、Ｔｅｔ－Ｏｎシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５），ＢＭＣ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（１）：４））およびＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈシステム（Ｉｎｔｒｅｘｏｎ；Ｓｏｗａ ｅｔ ａｌ．（２０１１），Ｓｐｉｎｅ，３６（１０）：Ｅ６２３－８）を含む。両方のシステムおよび当技術分野で公知である類似システムは、小分子活性化因子（それぞれドキシサイクリンまたはエクジソン）に応答する転写を活性化するリガンド誘発性転写因子（ＴｅｔリプレッサおよびＥｃｄｙｓｏｎｅ受容体それぞれのバリアント）に依存する。かかるリガンド誘発性転写活性化因子を用いた最新の発明を実施するものとしては、１）対応する転写因子に応答するプロモータの制御下でメガヌクレアーゼ遺伝子を配置し、該メガヌクレアーゼ因子は転写因子に対し、１つ以上の結合部位を有することと、２）パッケージされたウイルスゲノム中の転写因子をコードしている遺伝子を含むことと、を含む。後者の工程は、転写活性化因子が同じ細胞へと提供されない場合、メガヌクレアーゼが組換えＡＡＶの輸送後にターゲット細胞または組織で発現されないため必須である。転写活性化因子は次いで、同族の小分子活性化因子で治療されて
いる細胞または組織中でのみ、メガヌクレアーゼ遺伝子の発現を誘発する。このアプローチによって、小分子のインデューサがいつ、どの組織に輸送されるかを選択することで、時空間的な方法を用いてメガヌクレアーゼ遺伝子の発現の制御が可能となるため、これは有益である。ただし、インデューサは輸送能力が著しく制限されており、ウイルスゲノム中にこれを含むための要件はこのアプローチに欠陥を作り出している。

【0254】

別の好ましい実施形態では、組換えＡＡＶ粒子は、メガヌクレアーゼの発現を防ぐ転写リプレッサを発現する哺乳動物の細胞株にて産生される。転写リプレッサは当技術分野で公知であり、Ｔｅｔリプレッサ、Ｌａｃリプレッサ、Ｃｒｏリプレッサ、およびラムダリプレッサを含む。エクジソン受容体などの多くの核内ホルモン受容体はまた、同族のホルモンリガンドの不在下では転写リプレッサとして機能する。最新の発明を実施するため、パッケージング細胞は転写リプレッサをコードしているベクターを用いて遺伝子導入／形質導入される。ウイルスゲノム（パッケージングベクター）中の該メガヌクレアーゼ遺伝子は、リプレッサがプロモータの発現を停止させるように、リプレッサ用の結合部位を含むように改変されたプロモータと動作可能に結合される。転写リプレッサをコードしている遺伝子は、種々の位置に配置され得る。この遺伝子は、別々のベクターにコードされ得、ＩＴＲ配列外側のパッケージングベクターへと組み込まれ得、ｃａｐ／ｒｅｐベクターもしくはアデノウイルスヘルパーベクターへと組み込まれ得、または恒常的に該遺伝子が発現されるよう、パッケージング細胞のゲノムに安定的に組み込まれ得る。転写リプレッサ部位を組み込むための一般的な哺乳動物のプロモータを改変する方法は、当技術分野で公知である。例えば、ＣｈａｎｇとＲｏｎｉｎｓｏｎは、Ｌａｃリプレッサ用のオペレータを含む、強力で恒常的なＣＭＶプロモータおよびＲＳＶプロモータを改変した。そして、この改変されたプロモータからの遺伝子の発現は、リプレッサを発現している細胞内で大きく減弱したことを示した（Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｒｏｎｉｎｓｏｎ（１９９６），Ｇｅｎｅ １８３：１３７－４２）。非ヒト転写リプレッサの使用により、メガヌクレアーゼ遺伝子の転写はリプレッサを発現しているパッケージング細胞でのみ阻止され、得られた組換えＡＡＶベクターによって形質導入されたターゲット細胞または組織では阻止されないことが確実となる。

【0255】

２．７ 操作されたヌクレアーゼバリアント
本発明の実施形態は、本明細書に記載の操作されたヌクレアーゼ、およびそのバリアントを包含する。本発明の更なる実施形態は、本明細書に記載のヌクレアーゼをコードしている核酸配列を含むポリヌクレオチド、およびかかるポリヌクレオチドのバリアントを包含する。

【0256】

本明細書で使用される場合、「バリアント」は、実質的に同じ配列を意味すると意図されている。「バリアント」ポリペプチドは、天然タンパク質中の１つまたは複数の内部部位にて、１つまたは複数のアミノ酸の削除もしくは追加および／または天然ポリペプチド中の１つまたは複数のアミノ酸の置換によって「天然」ポリペプチドから誘導されたポリペプチドを意味すると意図されている。本明細書で使用される場合、「天然」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、バリアントが誘導されている親配列を含む。この実施形態により包含されているバリアントのポリペプチドは、生物学的に活性である。換言すると、該バリアントのポリペプチドは、天然タンパク質の所望の生物学的活性を有している。すなわち、これはヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域（配列番号３）中で見られるＴＲＣ１－２認識配列（配列番号５）を認識かつ切断する能力である。更に一部の実施形態では、これは向上（すなわち増加）した特異性およびオフターゲット切断、細胞内の減少した維持時間、ならびに増強（すなわち増加）した、ＴＣＲアルファ定常領域遺伝子の改変効率から成る群から選択される、第１世代のＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼについての少なくとも１つの向上した性質を示す。かかるバリアントは、例えば人間の操作によって生じ得る。該実施形態の天然ポリペプチドの生物学的に活性のあるバリアント（例えば、配列
番号７および配列番号８）、または本明細書に記載の認識ハーフサイト結合サブユニットの生物学的に活性のあるバリアントは、天然ポリペプチドまたは天然サブユニットのアミノ酸配列に対し、少なくとも約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列相同性を有し、これは本明細書の他の箇所に記載の配列アラインメントプログラムおよびパラメータによって決定される。該実施形態のポリペプチドまたはサブユニットの生物学的に活性のあるバリアントは、約１～４０のアミノ酸残基と同じくらい少ない、約１～２０のアミノ酸残基と同じくらい少ない、約１～１０のアミノ酸残基と同じくらい少ない、約５のアミノ酸残基と同じくらい少ない、４、３、２、または１ですらあるアミノ酸残基と同じくらい少ない分量のポリペプチドまたはサブユニットのバリアントとは異なっていてよい。

【0257】

該実施形態のポリペプチドは、アミノ酸の置換、削除、短縮化、挿入を含む、種々の方法で変化されてよい。かかる操作のための方法は、一般的には当技術分野で公知である。例えば、アミノ酸配列のバリアントは、ＤＮＡにおける変異によって調製され得る。変異誘発性およびポリヌクレオチドの変化のための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４８８－４９２、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７－３８２、米国特許番号第４，８７３，１９２号、Ｗａｌｋｅｒ
ａｎｄ Ｇａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、および本明細書に言及された参考文献を参照されたい。目的のタンパク質の生物学的活性に影響しない適切なアミノ酸置換に関する誘導は、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９７８）のＡｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルに見られることができ、これは参照として本明細書に組み入れられている。アミノ酸を、類似の特性を有する他のアミノ酸で交換するなどの保存的な置換が、最適であり得る。

【0258】

一部の実施形態では、本発明の操作されたメガヌクレアーゼは、本明細書に記載のＨＶＲ１領域およびＨＶＲ２領域のバリアントを含み得る。親ＨＶＲ領域は例えば、例証した操作されたメガヌクレアーゼの残基２４～７９または残基２１５～２７０を含み得る。したがって、バリアントＨＶＲは、本明細書に例証された操作されたメガヌクレアーゼの残基２４～７９または残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれ以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。これによってバリアントＨＶＲ領域は、操作されたメガヌクレアーゼの生物学的活性（すなわち、認識配列を結合および切断する）を維持している。更には、本発明の一部の実施形態では、バリアントＨＶＲ１領域またはバリアントＨＶＲ２領域は、親ＨＶＲ内部の特異的位置で見られるアミノ酸残基に対応する残基を含み得る。この文脈において、「対応している」は、バリアントＨＶＲにおけるアミノ酸残基が、同じ相対的位置の（すなわち、親配列中に維持しているアミノ酸に対する）親ＨＶＲ配列に存在している同じアミノ酸残基（すなわち別々の同一残基）であることを意味している。例を用いると、親ＨＶＲ配列は位置２６にセリン残基を含み、残基２６「に対応する残基を含む」バリアントＨＶＲはまた、親位置２６に相対的な（すなわち対応する）位置にセリンを含む。

【0259】

特定の実施形態では、本発明の操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７の残基２１
５～２７０に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれ以上の配列相同性を有するＨＶＲ１領域を含む。

【0260】

ある特定の実施形態では、本発明の操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれ以上の配列相同性を有するＨＶＲ２領域を含む。

【0261】

一部の実施形態では、本発明の操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号８の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれ以上の配列相同性を有するＨＶＲ２領域を含む。

【0262】

特定の実施形態では、本発明の操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７の２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも９７％の配列相同性を有するＨＶＲ１領域、および配列番号７の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも８１％の配列相同性を有するＨＶＲ２領域を含む。

【0263】

他の特定の実施形態では、本発明の操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号８の２１５～２７０に対応するアミノ酸配列を有するＨＶＲ１領域、および配列番号８の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも８６％の配列相同性を有するＨＶＲ２領域を含む。

【0264】

野生型Ｉ－ＣｒｅｌメガヌクレアーゼのＤＮＡ認識ドメインに対する、アミノ酸改変の実質的な数は既に特定されており（例えば、米国特許第８，０２１，８６７号）、単一にてまたは組み合わせでＤＮＡ認識配列ハーフサイト内の個々の塩基にて変化した特異性を有する、組換えメガヌクレアーゼを生じる。これにより得られる、合理的に設計されたメガヌクレアーゼは、野生型酵素とは異なるハーフサイト特異性を有する。表２は、認識ハーフサイトの各ハーフサイト位置（－１から－９）にて存在する塩基に基づく特異性を増強するための、操作されたメガヌクレアーゼ単量体またはサブユニット内にて作製され得る可能な置換を提供する。

【0265】

【表2】

【0266】

ＤＮＡ結合親和性および／または活性を調節するため、操作されたメガヌクレアーゼ単量体またはサブユニット中にある一定の改変が作製され得る。例えば、本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼ単量体またはサブユニットは、Ｉ－Ｃｒｅｌまたは配列番号７もしくは配列番号８（国際公開第２００９００１１５９号）の位置１９に対応する残基にてＧ、Ｓ、もしくはＡを含むことができ、Ｉ－Ｃｒｅｌまたは配列番号７もしくは配列番号８の位置６６に対応する残基にてＹ、Ｒ、Ｋ、もしくはＤを含むことができ、および／またはＩ－Ｃｒｅｌまたは配列番号７もしくは配列番号８（米国特許第８０２１８６７号）の位置８０に対応する残基にてＥ、Ｑ、もしくはＫを含むことができる。

【0267】

ポリヌクレオチドに対して、「バリアント」は、天然ポリヌクレオチド内の１つまたは複数の部位にて１つまたは複数のヌクレオチドを削除および／または追加することを含む。当業者は、オープンリーディングフレームが維持されるように、該実施形態の核酸のバリアントが構築されることを認識するだろう。ポリヌクレオチドに対して、保存バリアントは、遺伝子コードの縮重により、該実施形態のポリペプチドのうちの１つのアミノ酸配列をコードしているその配列を含む。バリアントのポリヌクレオチドは、例えば部位特異的変異誘発性を使用して生成されるものなどの合成的に誘導されたポリヌクレオチドを含むが、これは該実施形態の組換えヌクレアーゼを更にコードしている。一般的に、該実施形態の特定のポリヌクレオチドのバリアントは、その特定のポリヌクレオチドに対して少なくとも約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列相同性を有し、これは本明細書の他の箇所に記載の配列アラインメントプログラムおよびパラメータによって決定される。該実施形態の特定のポリヌクレオチドのバリアント（すなわち、参照ポリヌクレオチド）は、バリアントのポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドと、参照ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドの配列相同性の比率を比較することによっても評価され得る。

【0268】

本明細書に包含されたバリアントタンパク質配列の削除、挿入、および置換は、ポリペプチドの特徴に徹底的な変化を引き起こすことを期待されてはいない。ただし、前もって置換、削除または挿入を行う前にそれらの効果を予想することが難しい場合、ヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子（配列番号３）のエクソン１内で見られるＴＲＣ１－２認識配列（配列番号５）を優先的に認識かつ切断するその能力に関し、ポリペプチドをスクリーニングすることによって、この効果を評価するであろうことを当業者は理解するだろう。

【実施例0269】

本発明は、以下の実施例によって更に例示されるが、これは限定するものとして解釈さ
れるべきではない。当業者は、本明細書に記載の通常の実験、特異的物質に対する多数の等価物、および手順を十分に用いることなく認識または確認することができるだろう。かかる等価物は、以下の実施例に続く特許請求の範囲に包含されるよう意図されている。

【0270】

実施例１
ＴＲＣ１－２認識配列に対する特異性を有するメガヌクレアーゼの特徴
１．１．ＴＲＣ１－２認識配列を認識かつ切断するメガヌクレアーゼ

【0271】

ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２（配列番号７）およびＴＲＣ１－２Ｌ．１７７５（配列番号８）と呼ばれている第２世代のＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼは、ＴＲＣ１－２認識配列（配列番号５）を認識かつ切断するように操作された。この配列は、ヒトＴ細胞受容体アルファ定常領域中に存在している。これらの第２世代のメガヌクレアーゼは、ＳＶ４０、第１のメガヌクレアーゼのサブユニット、リンカー配列、および第２のメガヌクレアーゼのサブユニットから誘導されたＮ末端ヌクレアーゼ局在化シグナルを含む。各ＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼの第１のサブユニットは、配列番号５のＴＲＣ１認識ハーフサイトに結合している。一方、第２のサブユニットは、ＴＲＣ２認識ハーフサイトに結合している（図１を参照されたい）。ＴＲＣ１結合サブユニットおよびＴＲＣ２結合サブユニットはそれぞれ、５６塩基対超可変領域を含む。これはそれぞれＨＶＲ１およびＨＶＲ２と呼ばれている。

【0272】

各ＴＲＣ１結合サブユニットのＨＶＲ１領域は、配列番号７および配列番号８の残基２１５～２７０から成る。ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２およびＴＲＣ１－２Ｌ．１７７５のＴＲＣ１結合サブユニットは、ＨＶＲ１領域の外側で互いに同一である。各ＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼのＨＶＲ１領域は、位置２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６６および２６８にて野生型Ｉ－Ｃｒｅｌ配列（配列番号１）に対する改変を含む。野生型Ｉ－Ｃｒｅｌに対して改変されていない場合であっても、配列番号７および配列番号８の位置２６１のアルギニン残基は、改変ＨＶＲ１残基と共にヌクレアーゼの特異性の要因であると考えられている。ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２のＨＶＲ１領域は、ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼのＨＶＲ１領域に対し、９６．４３％の配列相同性を共有する。ＴＲＣ１－２Ｌ．１７７５のＨＶＲ１領域は、ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼのＨＶＲ１領域に対し、１００％の配列相同性を共有する。

【0273】

各ＴＲＣ２結合サブユニットのＨＶＲ２領域は、配列番号７および配列番号８の残基２４～７９から成る。ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２およびＴＲＣ１－２Ｌ．１７７５のＴＲＣ２結合サブユニットは、ＨＶＲ２領域の外側で互いに同一であるが、Ｅ（ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２）またはＱ（ＴＲＣ１－２Ｌ．１７７５）であり得る、配列番号７および配列番号８の位置８０である場合を除く。各ＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼのＨＶＲ２領域は、位置２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、６８、７０、７５、および７７にて野生型Ｉ－Ｃｒｅｌ配列（配列番号１）に対する改変を含む。ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２メガヌクレアーゼは、野生型Ｉ－Ｃｒｅｌに対して位置７１、７２、および７３での改変を更に含有する。配列番号７および配列番号８の位置１３９のアルギニン残基は、野生型Ｉ－Ｃｒｅｌ配列に対して改変されており、改変ＨＶＲ２残基と共にヌクレアーゼの特異性の要因であると考えられている点も注目すべき点である。ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２のＨＶＲ２領域は、第１世代のＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼのＨＶＲ２領域に対し、８０．３６％のみの配列相同性を共有する。ＴＲＣ１－２Ｌ．１７７５のＨＶＲ２領域は、ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼのＨＶＲ２領域に対し、８５．７１％のみの配列相同性を共有する。

【0274】

２．第１世代のＴＲＣ１－２ヌクレアーゼの最適化
これまでに報告されたＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼは、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５），Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３：１８７－１９７）と非常に類似しているが、メガヌクレアーゼに対して潜在的なオフターゲット部位を見いだすように調製された方法を用いて、認識部位特異性に関して評価された。一般的には、潜在的なオフターゲット部位は、二本鎖ＤＮＡ切断中でプローブであるオリゴヌクレオチドを捕獲することによって特定される。ＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼは、４塩基対の３’オーバーハングを生成する。そのため、プローブであるオリゴはまた、ヌクレアーゼ切断によってよりふさわしく作成された部位にてライゲーション効率を向上させる、無作為化された４塩基対のオーバーハングを含有する。

【0275】

ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥの特異性解析により、ヒトＴ細胞中に種々の潜在的なオフターゲット部位が発見された。これらのオフターゲットは、２つの関連カテゴリへと分類可能である。これは、高い頻度で的中する固有のターゲットおよび低い頻度で的中する繰り返しターゲットであった。これらのオフターゲットの配列中に関与している重要なアミノ酸は、再度無作為化された。その後、目的部位を切断するために同時セレクションを実施し、カウンターセレクションはオフターゲット部位を切断しないように実施された。オフターゲット部位は、両方のオフターゲットに対して判別する回答（すなわちヌクレアーゼ）を単離するセレクションの連続ラウンド間に交替された。使用された２つのオフターゲットは、５’－ＴＧＧＣＣＴＧＧＡＧａＡＡＣＡｇｔｇｔａａａ－３’（配列番号１６）であるオフ１であり、これは低頻度の切断であるがゲノム中で高度に繰り返された部位であった。オフ２は５’－ｃＧＧＣＣＴＧｔＡＧｔＡｃａｇｇＡｃＣＴＧＡ－３’（配列番号１７）であり、これは頻繁に的中した固有のオフターゲットであった（小文字は目的部位とのミスマッチを表している）。種々のヌクレアーゼライブラリーが使用された。

【0276】

セレクション後、それぞれの連続したライブラリーからの単離されたクローンの９６ウェルプレートは、プラスミドＤＮＡを単離するために調製された。各プラスミドＤＮＡは、ＧＦＰ遺伝子中の３箇所の直列反復配列の間の中断部にて、組み込まれたターゲット部位を含有するＣＨＯ細胞へと個別に遺伝子導入された。ターゲット部位の切断により、一本鎖アニーリングによるＧＦＰ遺伝子の修復が生じる。ターゲット部位の切断頻度は、フローサイトメータ上でＧＦＰポジティブ細胞の数を数えることにより計測され得る。発明者らは、目的部位およびオフ１ターゲット部位を用いて、細胞に対するヌクレアーゼプラスミドをアッセイした。こうした方法では、発明者らは、オフターゲットに対して最も区別するものを除いて、どのヌクレアーゼが目的部位を更に切断するかを評価することができた。発明者らは５つの候補を特定した。３つの候補は、ＴＲＣ１－２に対するオリジナルライブラリーから再度単離されたＬ．１４６２、Ｌ．１４６６およびＬ．１４６９であった。３つ全ての回答は、固有のものであったが、互いに関連していた。２つの候補はＴＲＣ－ライブラリー２から単離され、Ｌ．１１０８およびＬ．１１１８であった。これらの候補のそれぞれは、第２世代の本発明のヌクレアーゼの開発に関しては中間ヌクレアーゼを表す。

【0277】

ヌクレアーゼを更に向上させるため、認識配列特異性に関与する重要なアミノ酸を無作為化した。Ｌ．１４６２、Ｌ．１４６６およびＬ．１４６９はある特定のライブラリーへと収集され、Ｌ．１１０８およびＬ．１１１８は第２のライブラリーへと収集された。ＰＣＲによる新規無作為化は、両方へと導入された。類似のセレクション戦略は、新規ライブラリーによって実施された。これは、目的部位への選択およびオフ１またはオフ２に対する選択である。オフターゲットは、セレクションのラウンド間で交替された。個々の回答の９６ウェルプレートはセレクションから生成され、ＣＨＯ ｉＧＦＦＰアッセイで検査され、目的部位およびオフ１とオフ２の両方の切断を測定した。複数の新規ヌクレアーゼは、この追加の最適化ラウンドにより特定された。Ｌ．１４６２、Ｌ．１４６６およびＬ．１４６９に基づくライブラリーからの回答は、Ｌ．１７７５およびＬ．１８４３を含
んだ。Ｌ．１１０８およびＬ．１１１８に基づくライブラリーからの１つの回答は、Ｌ．１５９２である。新規ヌクレアーゼの全ては、目的ターゲットに対する強い活性および両方のオフターゲット（以下に更に記載される）に対する強い識別を示した。新規ヌクレアーゼは、潜在的なオフターゲット部位を決定するためにオリゴ捕獲アッセイ（以下に更に記載）を用いて実施され、一般的には潜在的なオフターゲットの数は減少し、特にＬ．１５９２はほとんど潜在性のない、合法的なオフターゲット部位を有する。Ｌ．１１０８、Ｌ．１４６９、Ｌ．１５９２、Ｌ．１７７５、およびＬ．１８４３は、７日間という期間にわたるｉＧＦＦＰアッセイで更に評価され、経時的なＧＦＰシグナルの安定性をアッセイした。これは、毒性に対する一般的な測定である。Ｌ．１４６９、Ｌ．１５９２、Ｌ．１７７５およびＬ．１８４３は、機能に関して一次Ｔ細胞において更に検査された。

【0278】

３．ＴＲＣ１－２認識配列切断およびオフターゲット切断の評価
どのＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼがＴＲＣ１－２認識配列（配列番号５）を認識かつ切断可能かを決定するため、各ＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼは、既に記載されたＣＨＯ細胞レポータアッセイ（国際公開第２０１２／１６７１９２号、図３を参照されたい）を用いて評価された。アッセイを実施するため、細胞のゲノムへと組み込まれた非機能的な緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子の発現カセットを運搬した、一対のＣＨＯ細胞レポータ株が産生された。各細胞株中のＧＦＰ遺伝子は、メガヌクレアーゼによるいずれかの認識配列の細胞内切断が機能的ＧＦＰ遺伝子を生じる相同組換え現象を刺激するように、一対の認識配列によって中断された。両方の細胞株において、認識配列のうち１つはＴＲＣ１－２遺伝子から誘導され、更に第２の認識配列は「ＣＨＯ２３／２４」と呼ばれる制御メガヌクレアーゼによって特異的に認識された。ＴＲＣ１－２認識配列（配列番号５）を含むＣＨＯレポータ細胞およびＣＨＯ２３／２４認識配列は、「ＴＲＣ１－２細胞」と本明細書にて呼ばれている。

【0279】

ＴＲＣ１－２細胞は、ＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼ（例えば、ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥ、ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２、ＴＲＣ１－２Ｌ．１７７５もしくはＴＲＣ１－２Ｌ．１８４３）のうち１つをコードしている、またはＣＨＯ２３／３４メガヌクレアーゼをコードしている、プラスミドＤＮＡで遺伝子導入された。４ｅ５ＣＨＯ細胞は、製造者の指示に従い、リポフェクタミン２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて９６ウェルプレート中に、５０ｎｇのプラスミドＤＮＡを用いて遺伝子導入された。遺伝子導入後４８時間時点にて、細胞をフローサイトメトリによって評価し、遺伝子導入されていないネガティブコントロール（１～２ｂｓ）と比較したＧＦＰ－ポジティブ細胞の比率を決定した。全てのＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼは、著しくネガティブコントロールを超え、かつＣＨＯ２３／２４ポジティブコントロールに相当するか、またはＣＨＯ２３／２４ポジティブコントロールを超える頻度でＴＲＣ１－２認識配列を含む細胞株中に、ＧＦＰ－ポジティブ細胞を産生することがわかっており、各ＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼは、細胞内の目的のＴＲＣ１－２認識配列を効率的に認識かつ切断することができることを示している（図４Ａ～図４Ｃ）。

【0280】

代替的には、このＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼはまた、対抗選択されたオフターゲット配列をＧＦＰ直列反復配列間に含有するＴＲＣオフ１およびＴＲＣオフ２細胞へと遺伝子導入される。目的ターゲット部位ＴＲＣ１－２ＣＨＯ細胞とは異なり、ＴＲＣオフ１およびオフ２ＣＨＯ細胞内の望ましいヌクレアーゼは基線レベルのＧＦＰポジティブ細胞しか有さない。これは、オフターゲット配列の切断に対する識別が可能であるためである。ＣＨＯ２３～２４ターゲット部位は、こうした実験においてポジティブコントロールとして作用し、ＣＨＯ２３～２４ヌクレアーゼによってターゲット部位が切断される場合、ＧＦＰは変わらずに産生され得ることを示す。新規ヌクレアーゼは、ＴＲＣ１－２ｂｓネガティブコントロールに相当するレベルの％ＧＦＰに関して、ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥと比べてオフ１およびオフ２ターゲット部位に対する識別が向上（すなわち増加）している
ことを示す（図５Ａ～図５Ｃ）。

【0281】

ＴＲＣ１－２．Ｌ１４６９、Ｌ．１５９２、Ｌ．１７７５およびＬ．１８４３といった操作されたメガヌクレアーゼの有効性は、メガヌクレアーゼのｍＲＮＡをＴＲＣ１－２細胞へと導入した２日後、５日後、および７日後に時間依存的様式でも測定された。この調査では、ＴＲＣ１－２細胞（１．０×１０^６）は、製造者の指示に従ってＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌを使用し、細胞ごとの１×１０^６コピーのメガヌクレアーゼｍＲＮＡによって電気穿孔された。遺伝子導入後４８時間時点にて、細胞はＧＦＰ－ポジティブ細胞の比率を決定するため、フローサイトメトリによって評価された。また、ポジティブコントロールとして各時点でＣＨＯ２３／２４メガヌクレアーゼを含めた。それぞれのメガヌクレアーゼは、ＣＨＯ２３～２４に対し、相当のＧＦＰ－ポジティブ比率を示した（図６および図７）。Ｌ．１４６９のみは経時的にＧＦＰポジティブ細胞が減少する傾向を示し、その後の最適化で向上される、分解されていない毒性がいくらかあるという課題を有していることを示す。残存ヌクレアーゼは、ＣＨＯ２３～２４コントロールと等価であるか、またはそれよりも高いレベルで、経時的に安定または増加しているＧＦＰ－ポジティブ細胞を呈した。

【0282】

拡張ｉＧＦＦＰアッセイはまた、７日間にわたるオフ１およびオフ２といった２つのオフターゲットに対する識別のため、同様の群のメガヌクレアーゼを評価するために使用された。この場合、オフ１またはオフ２のいずれかを含有する細胞およびＣＨＯ２３～２４は、製造者の指示に従ってＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌを使用し、細胞ごとの１×１０^６コピーのメガヌクレアーゼｍＲＮＡによって電気穿孔された。遺伝子導入後２日目、５日目、７日目時点で、細胞をフローサイトメトリによって評価し、ＧＦＰ－ポジティブ細胞の比率を決定した。ポジティブコントロールとして各時点で、ＣＨＯ２３～２４メガヌクレアーゼもまた含んだ。それぞれのヌクレアーゼは、ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥと比較すると、オフターゲットに対して識別を向上させたことを示した（図８Ａおよび図８Ｂ）。Ｌ．１５９２は、オフ１またはオフ２のいずれかを最小限切断することを示し、これは偽コントロール細胞と同等であった。Ｌ．１４６９は、ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥによって観察されたものよりも劇的に低かったにも関わらず、オフ１およびオフ２の切断をいくらか検出することができたことを示した。Ｌ．１７７５およびＬ．１８４３は、オフターゲットに対する識別に関し、その親であるＬ．１４６９以上に向上を示す。

【0283】

４．オリゴ捕獲アッセイおよびオフターゲット切断の解析
これらの調査において、オリゴ捕獲アッセイを用いてＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼによって誘発されたオフターゲット切断を識別した。ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑと類似する、オリゴ捕獲アッセイは細胞のゲノムＤＮＡ内の切断部位にてオリゴヌクレオチドを捕獲することでＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼにより作製された潜在的なオフターゲット部位を認識する。ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑは、ＤＮＡ切断を生成するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９のために開発された。この技術を本発明のヌクレアーゼに適用するために、化学および解析に対する重要な改変はほとんど行われない。ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ９とは異なり、本明細書の操作されたメガヌクレアーゼは４塩基対の３’オーバーハングを生成する。この違いに適応させるため、オリゴ捕獲に使用されたオリゴヌクレオチドは、ＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼで生成されたオーバーハングと適合し得る４塩基対オーバーハングを無作為化する。平滑末端よりも結合している付着末端の効率が大きいことを要因として、高頻度の挿入が観察される。細胞は、ヌクレアーゼおよび二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドをコードしているｍＲＮＡで遺伝子導入された。２日後、これらの細胞由来のゲノムＤＮＡを単離および超音波処理し、ＤＮＡを小さいサイズへとせん断した。オリゴヌクレオチドアダプタをせん断されたＤＮＡへとつなぎ、ＰＣＲを用いて、特定の末端ではアダプタを含有し、他方の末端では捕獲したオリゴヌクレオチドを含有する任意のＤＮＡ断片を増幅させた。増幅
されたＤＮＡを精製し、更に標準的な市販のキットを用いてシーケンシングライブラリーを調製した。

【0284】

シーケンシングライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑを用いるＶ２ ２×１５０キット上で行われた。オリゴヌクレオチドを捕獲する妥当な部位に対してこのデータを選別かつ解析し、潜在的なオフターゲット部位を予測した。ここで再び、プロトコールをＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ９を用いたＰＡＭサーチから、ＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼサーチへと調節する必要がある。開発されたソフトウェアは、各配列を調べ、アダプタの存在およびこの配列に隣接する捕獲オリゴが存在することを確認し、これが妥当なリードであると立証した。ソフトウェアはまた、ＰＣＲ重複についても調べ、ＰＣＲバイアスを低下させる一助となるように同一のリードを取り除く。配列リードは参照ゲノムに並べられ、１０００塩基対ウインドウ内の分類された配列は、潜在的なＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼ部位についてスキャニングされる。

【0285】

各ＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼは、結合二量体である。各単量体は、２つのハーフサイト間の中央に４塩基対スペーサを有する９塩基対ハーフサイトを認識する。ソフトウェアは、許容されないギャップを有する各ハーフサイトと、最も近い整合を示す配列を検索する。中央の４塩基対は、オフターゲットのセレクションには考えられていない。これは、ＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼがターゲット部位内のこれらの位置における大量の縮重を一般には許容可能であるという理由に依る。ソフトウェアは、結合ハーフサイト中の塩基ミスマッチの数を伴う潜在的なオフターゲット部位の一覧を出力する。ただし、この数には中央の４塩基対ミスマッチは含まれていない。ソフトウェアは、７塩基対以上がミスマッチ状態であると同定されている任意のオフターゲットを除くＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９とは異なり、任意のミスマッチフィルタに基づいて任意のオフターゲットを除くことはない。代わりに、ゲノム内の脆弱スポットまたはホットスポットにて、オリゴを無作為に捕獲することで生成されたバックグラウンドノイズは、２つの方法で取り除くことができる。最初に、オリゴ捕獲に未処置の偽サンプルを通し、存在するヌクレアーゼを欠いた組み込み部位のウインドウを、サンプルを含有するヌクレアーゼから引くことができる。発明者らは、３通りのアッセイの実施、および３回の繰り返しのうち少なくとも２回繰り返すことがない、任意の部位の除去は、無作為の組み込みノイズを経験的に取り除く上で良好な方法であるということも見いだした。

【0286】

リードカウントは特定部位での切断頻度と相関することはないものの、より頻繁に生じることから潜在的により関連するまたはより妥当なオフターゲットを、このデータによって一般的に強調することができる。潜在的に妥当なオフターゲット部位の数を基準として、オリゴ捕獲データを図表により可視化する１つの方法を図９に示す。特定のヌクレアーゼによって生成された各オフターゲットは、その部位で捕獲されているプローブオリゴのための固有の配列リードの数に基づきプロットされる。目的部位は最も高いリードカウントを有する必要がある。これは検査される全てのＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼの場合である。より良好なヌクレアーゼはより高い計測部位を取り除き、プロットの更に左の位置では、バックグラウンドノイズより高いドットをほとんど有さない。このプロットを使うことで、例えばＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２が、第１世代のＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥよりも高いリードカウント部位の多くを除外することが明白である。

【0287】

追加の可視化方法により、発明者らは特定の部位で回収されたリード数という観点だけではなく、推定オフターゲット部位と目的部位との間のミスマッチの数によってもオリゴ捕獲データを見ることができる。これにより、無作為組み込みノイズまたはシーケンシングノイズと比較した場合、実際のオリゴ組み込み部位をより正確に決定することができる。図１０においては、オフターゲット部位はＸ軸上に並べられたリード数に従ってプロットされ、目的部位と比較したミスマッチの塩基対の数は、色を用いて示されており、より
暗色の部分はオフターゲットと目的結合部位との間の全体的な一致度がより高いことを示している。ボックスは、最も高い信頼度領域を示している。こうしたボックス内のオフターゲットは、目的部位に対する並べられたリードカウントが高いか、または目的部位に対する類似性が非常に高いかのどちらかであり、このうちのいずれかは、バックグラウンドノイズとなっている部位の可能性を減少させる。信頼度領域における部位と比較すると、図１０は、特にＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥと比較したＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２といった、最適化されたメガヌクレアーゼの特異性の増加を示している。ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２は、より高いリードカウント部位の数における減少および目的部位とより類似している部位における減少を示す。

【0288】

実施例２
最適化されたＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼのインビトロ解析
遺伝子編集効率、編集後の増殖、および分化の評価

【0289】

第１の一連の実験においては、４つの最適化された第２世代のＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼを、その遺伝子編集効率、および編集後の増殖および分化ポテンシャルについてスクリーニングした。３人の異なるオペレータは、別の健常なヒトＴ細胞ドナーから得られたＴ細胞における全てのヌクレアーゼバリアントを評価した。アフェレーシス物質は、Ｋｅｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｍｅｍｐｈｉｓ，ＴＮ）からのドナーＫ７０８、Ｋ７９９、およびＫ６７８４から調達された。Ｋ７０８およびＫ６７８４Ｔ細胞は、以下のプロトコールに従って処理された。すなわち、ヒトＣＤ３ポジティブセレクション試薬（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＴ細胞を濃縮し、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ
抗－ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて刺激し、かつ４Ｄ ＮｕｃｌｅｏＦＥｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いてヌクレアーゼＲＮＡを輸送した。Ｋ７９９由来のＴ細胞は、以下のプロトコールに従って処理された。すなわち、ＣＤ４およびＣＤ８マイクロビーズおよびＣｌｉｎｉＭＡＣＳ細胞アイソレータ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＴ細胞を濃縮し、ＴｒａｎｓＡｃｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて刺激し、ＭａｘＣｙｔｅ－ＧＴを用いてヌクレアーゼＲＮＡを輸送した。

【0290】

４つの最適化されたヌクレアーゼバリアント（ＴＲＣ１－２Ｌ．１４９６、Ｌ．１５９２、Ｌ．１７７５およびＬ．１８４３）の編集効率、増殖、および分化を、前駆体ヌクレアーゼであるＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥおよび電気穿孔された偽Ｔ細胞に対して比較した。ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ／ＴｒａｎｓＡｃｔにより最初の刺激を行った３日後、Ｔ細胞を収集し、これを該ヌクレアーゼのうち１つをコードしているＲＮＡで電気穿孔し、かつＴＲＣ１－２切断部位へと挿入されるＣＡＲ遺伝子をコードしているＡＡＶ６ベクターで直ちに形質導入した。ＡＡＶを受け取っていないコントロール培養物は平行して組み立てられた。

【0291】

編集後４日目および８日目時点で、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２００（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ）を用いて培養物の全体の細胞充実度を測定した。編集効率は、ヒトＣＤ３－ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ｃｌｏｎｅ ＵＣＨＴ１）および抗－ＦＭＣ６３ｓｃＦｖ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（社内で作製および抱合された新規クローン）に対して目的とする抗体で培養物サンプルを着色することで測定した。分化は、ＣＤ４－ＢＶ７８６（クローンＯＫＴ４ ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８－ＢＶ７１１（クローンＲＰＡ－Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ６２Ｌ－ＢＢ５１５（クローンＳＫ１１ ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＣＤ４５ＲＯ－ＰＥ／Ｃｙ７（クローンＵＣＨＬ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて、ＣＤ４およびＣＤ８区画の両方について、中央メモリー細胞、移行期メモリー細胞、およびエフェクタメモリー細胞の頻度を比較することによって評価された。

【0292】

これらの実験結果は、図１１にまとめられている。内因性Ｔ細胞受容体（ＣＤ３－ネガティブ表現型に対し、ＣＤ３－ポジティブ形態を形質転換しているＴＲＣ細胞によって測定）のノックアウト頻度は、３人の別のドナー中の各ヌクレアーゼに対して決定された。検査された（および細胞調製方法の両方を使用した）３人のドナー全てについて、ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２およびＬ．１７７５の両方は、ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥと類似したまたはそれよりも高い効率でノックアウト細胞を生成した。比較すると、Ｌ．１４６９およびＬ．１８４３では、ノックアウト頻度は低くなった。これは検査された３人のドナー全てにあてはまった。Ｌ．１７７５は、Ｌ．１５９２よりもわずかに高い編集効率を示した。ＴＲＣ１－２認識配列の編集の増加は、ＣＡＲ遺伝子の挿入速度の増加と関連していた。３人のドナー全てにおいて、Ｌ．１５９２およびＬ．１７７５は、同等または優れた編集頻度および挿入頻度を立証した。

【0293】

編集後８日目時点で、細胞カウントデータを用いてＣＡＲ Ｔ細胞の増殖倍率を計算した。３人のドナー全てにわたって、Ｌ．１５９２、Ｌ．１７７５およびＬ．１８４３は、ｘ．８７ＥＥよりも電気穿孔後の高い増殖を促進した。対照的に、Ｌ．１４６９はｘ．８７ＥＥよりも低い増殖を促進した。３人のドナーのうち２人に関しては、Ｌ．１８４３は３つの最適化されたヌクレアーゼのうち最も広範に増殖することが可能であった。Ｌ．１７７５は、ドナーによって変化する増殖度を立証した。

【0294】

ＣＤ４：ＣＤ８の比率およびメモリーサブセットのデータはまた、編集後８日目に捕捉された。ｘ．８７ＥＥと比較すると、いずれの最適化されたヌクレアーゼからもＣＤ４：ＣＤ８の比率に対する主要な撹乱は観察されなかった。ただし、Ｌ．１５９２、Ｌ．１７７５、およびＬ．１８４３は、多くの場合、結果としてＣＤ４＋細胞の大きな頻度を生じた。ｘ．８７ＥＥと比較すると、中央メモリー細胞から離れたならびに移行期およびエフェクタメモリー細胞集団への分化は、Ｌ．１４６９で編集された細胞では大きな程度で観察された。対照的に、Ｌ．１５９２、Ｌ．１７７５、またはＬ．１８４３で編集された場合、同等の頻度、または大きな頻度の細胞は、中央メモリー表現型を維持した。

【0295】

これらの調査は、４つの最適化されたヌクレアーゼのうち３つが、編集効率、細胞増殖、および分化といった特徴といった点ではＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥよりも優れていた。発明者らによるヌクレアーゼであるＬ．１４６９は、ｘ．８７ＥＥと同様には機能しなかった。インビトロで向上した機能を有する３つのバリアントのうち、バリアントＬ．１７７５は、培養物中で編集された細胞が最大頻度であることを立証している。ただし、このバリアントは編集後の増殖量は最小であり、培養物中ではＴ細胞の分化を加速させる。バリアントＬ．１８４３は、編集後の増殖量を最大にすることができ、好ましい中央メモリー細胞の頻度を保持する。ただし、ノックアウト頻度という点では、Ｌ．１７７５またはＬ．１５９２のいずれかと比べるとそれらよりも効果は低かった。驚くべきことに、Ｌ．１５９２は、これらの基準の３つ全てを用いると、第１世代のｘ．８７ＥＥよりも向上していることを示している。

【0296】

２．オリゴ捕獲アッセイおよびオフターゲット切断の解析
オリゴ捕獲は、実施例１に既に記載の方法を用いて、３人のドナーのそれぞれから得られたＴ細胞の３つの複写物に対して実施された。オリゴ捕獲の結果は図１２に示している。ドットは、各推定オフターゲット部位および目的のターゲット部位にて回収されたシーケンシングリードの数を表す。従来の研究では、８箇所以上のミスマッチを有する部位がＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２により切断されることが示されなかったため、目的とするターゲットに対して８箇所以上のミスマッチを有する推定部位を除外した。各サンプルにとっての目的ターゲット部位は、円で強調されている。目的ターゲットと比較したミスマッチの数は各円の暗さによって示されており、ミスマッチがほとんどない場合にはより暗くな
っている。プロットは、取り除かれた偽バックグラウンドを有さず、サンプルごとの固有リードの数に標準化されたリードカウントを有するオリゴ捕獲データを表し、回収されたリードの総数についての差異を説明している。示されるように、ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２は、ＣＡＲ Ｔ細胞集団で編集および標的挿入のために使用される場合、高いリードカウントの数が少なく、更に目的部位とより類似する数が少ないことを示す。

【0297】

３．編集効率、増殖およびサイトカイン分泌のインビトロ調査
第２の一連のインビトロ調査では、Ｔ細胞を編集するという点、編集後増殖する編集Ｔ細胞の能力、および抗原関連ターゲット細胞と遭遇するよう応答するヌクレアーゼバリアントを用いて生成されたＣＡＲ Ｔ細胞の能力という点で、その効率について第２世代の最適化されたＴＲＣ１～２メガヌクレアーゼを評価した。

【0298】

アフェレーシス物質は、Ｋｅｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｍｅｍｐｈｉｓ，ＴＮ）からのドナーＫ７０８から調達し、Ｔ細胞は、ヒトＣＤ３ポジティブセレクション試薬（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて濃縮され、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ 抗－ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて刺激を受け、かつ４Ｄ ＮｕｃｌｅｏＦｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いてヌクレアーゼＲＮＡを輸送した。３通りのサンプルは、平行して実施された。

【0299】

３つの最適化されたメガヌクレアーゼ（ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２、Ｌ．１７７５およびＬ．１８４３）の編集効率、増殖、および分化を、前駆体ヌクレアーゼであるＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥおよび電気穿孔された偽Ｔ細胞に対して比較した。ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ／ＴｒａｎｓＡｃｔにより最初の刺激を行った３日後、Ｔ細胞を収集し、これを該ヌクレアーゼのうち１つをコードしているＲＮＡで電気穿孔し、かつＴＲＣ１－２切断部位へと挿入されるＣＡＲ遺伝子をコードしているＡＡＶ６ベクターで直ちに形質導入した。編集後４日目時点および８日目時点で、培養物を採取し、Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ
ＣｙｔｏＦＬＥＸ－ＬＸフローサイトメータを用いて編集効率および増殖を測定した。内因性Ｔ細胞受容体ノックアウト効率は、抗－ＣＤ３－ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ｃｌｏｎｅ ＵＣＨＴ１）を用いて、およびＣＡＲノックインは、抗－ＦＭＣ６２ｓｃＦｖ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（社内で作製および抱合された新規クローン）を用いて評価された。

【0300】

増殖、細胞毒性、およびサイトカイン産生は、ＣＤ１９＋腫瘍株であるＲａｊｉまたはＮａｌｍ６を１：１および１：２のＥ：Ｔ比率で有する共培養ＣＡＲ Ｔ細胞を用いて評価された。ＣＤ１９－ネガティブＫ５６２骨髄性白血病細胞をコントロールとして使用した。培養物の上澄みを収集し、Ｌｕｍｉｎｅｘ ＭＡＧＰＩＸ機器およびＭｉｌｌｉＰｌｅｘ ＭＡＰ１５－ｐｌｅｘビーズセット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、分泌されたサイトカインについて解析した。増殖およびターゲット死滅は、培養物細胞サンプルを、抗－ＣＤ４－ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ｃｌｏｎｅ ＯＫＴ４）、抗－ＣＤ８－ＦＩＴＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ｃｌｏｎｅ ＲＰＡ－Ｔ８）、および抗－ＣＤ１９－ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ｃｌｏｎｅ ＨＩＢ１９）を用いて着色し、ＣｙｔｏＦＬＥＸ－ＬＸを用いて細胞カウントと共に蛍光データを得ることで評価された。

【0301】

ＲＮＡなしで電気穿孔されたＴ細胞（偽コントロール）と比較すると、８日目時点での培養物の総細胞充実度は、ＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼであるｘ．８７ＥＥおよびＬ．１７７５で編集されたＴ細胞についておよそ５０％低下した（図１３Ａ）。Ｌ．１５９２またはＬ．１８４３で編集された培養物は、培養物の総細胞充実度において同じ程度までの低下を示されなかった。編集効率を考慮し、かつ該プロセスで生成された編集された細胞の総数を計測した場合、Ｌ．１５９２は最も多いＴＣＲノックアウト細胞を生成した（図１３Ｂ）。バリアントｘ．８７ＥＥおよびＬ．１７７５は、Ｌ．１８４３が最低量を生
成する一方で、ほとんど同数の編集された細胞を生成した。このパターンは、培養物中ＣＡＲ＋／ＴＣＲ－細胞の数を測定した場合にも測定された（図１３Ｃ）。

【0302】

ＣＡＲ Ｔ細胞が抗原関連ターゲット細胞で共培養された場合、ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥを用いて産生されたＣＡＲ Ｔ細胞は、導入数の約３倍以上増殖した（水平な点線によって図１４にて定義されている）。驚くべきことに、最適化されたヌクレアーゼを用いて産生されたＣＡＲ Ｔ細胞は、ｘ．８７ＥＥよりも更に急速に増殖し、５日後には増殖は１０倍に達した。Ｅ：Ｔ比率が１：２に増加した場合、ｘ．８７ＥＥおよびＬ．１８４３によって編集されたＣＡＲ Ｔ細胞の増殖は、１：１の比率に対し約１／２にまで低下した。これはＬ．１７７５またはＬ．１５９２を用いて産生されたＣＡＲ Ｔ細胞中に見られ、他のＴＲＣ１－２ヌクレアーゼよりも著しく良好に（ｐ＜０．０００１、図１５Ａ）働くことが見いだされた。ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ細胞の残存数を（１：２のＥ：Ｔ比率にて、図１５Ｂ）測定する場合、４つのＣＡＲ Ｔ産物全ては、ＣＡＲ Ｔ細胞を受け取っていないコントロール培養物と比較した場合、９０％または複数のＲａｊｉ数で減少を示した。最適化されたヌクレアーゼを用いて作製されたＣＡＲ Ｔ細胞は、ｘ．８７ＥＥを用いて生成された細胞よりも著しく良好にＲａｊｉ細胞を除去した。

【0303】

共培養上澄みの解析は、ＣＡＲ Ｔ細胞がｘ．８７ＥＥよりもむしろ最適化されたヌクレアーゼを用いて作製された場合に高レベルのエフェクタサイトカインが生成されたことを示した。Ｌ．１５９２で編集されたＣＡＲ Ｔ細胞は、最大レベルのＩＬ－２、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、およびグランザイムＢ（図１６Ａ～図１６Ｄ）、および次いで最大レベルのパーフォリン（図１６Ｅ）を分泌した。ＩＬ－２およびＴＮＦαの場合では、ｘ．８７ＥＥで編集されたＣＡＲ Ｔ細胞のサイトカイン産生とＬ．１５９２で編集されたＣＡＲ
Ｔ細胞の間の差異は、２～３倍であり、その一方でその他の差異全ては少数であった。

【0304】

全体的に見ると、最適化されたＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼであるＬ．１７７５、Ｌ．１５９２およびＬ．１８４３は、ｘ．８７ＥＥよりも機能的に優れていた。これは、ＣＡＲ Ｔ細胞の製造を立証するヌクレアーゼの相対的な能力（図１３）、およびこれらのターゲット抗原と遭遇するよう応答するＣＡＲ Ｔ細胞の能力（図１４～図１６）という点であてはまった。複数の実験より、Ｌ．１７７５は最大の編集効率（ノックアウト頻度）を一般的に支援し、Ｌ．１８４３は編集後Ｔ細胞の増殖を最大にできる一方で、Ｌ．１５９２は、２番目に大きい編集効率と、最大または次いで最大の増殖とを同時に可能とし、最大の全体数のＣＡＲ Ｔ細胞を産生することが明らかになった。重要な点としては、Ｌ．１５９２を用いて生成されたＣＡＲ Ｔ細胞は、他の最適化されたメガヌクレアーゼよりも機能的な利点（増殖、ターゲット細胞の死滅、およびサイトカイン産生）を示した。

【0305】

４．最適化されたＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼのインビトロでの維持時間
調査は、仮に最適化された第２世代のＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼが、第１世代のＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥよりもインビトロで短い維持時間を有するかどうかを決定するために更に実施された。より短い維持時間は、遺伝子の編集およびオフターゲット切断における低下といった可能性という文脈において有利であり得る。

【0306】

これらの調査では、Ｔ細胞は、ＣＤ４およびＣＤ８マイクロビーズおよびＬＤカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いてＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞を磁気濃縮することでアフェレーシス産物から得られた（Ｋｅｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）。細胞は、５％のＦＢＳ（ＧＥ
Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）、および１％の抗生物質／抗真菌溶液（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＸｕｒｉ培地（ＧＥ）中で、抗－ＣＤ３／抗－ＣＤ２８ＴｒａｎｓＡｃｔ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて３日間活性化させた。次いで細胞を、インビトロで転写され、ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥまたはＴＲＣ１－２
Ｌ．１５９２ヌクレアーゼ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）をコードしているｍＲＮＡを用いて、１ｅ６細胞ごとに１μｇのｍＲＮＡで、ＭａｘＣｙｔｅ電気穿孔システムを用いて電気穿孔した。細胞は、その後、３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２および１％の抗生物質／抗真菌溶液を含有する、血清を含まないＸｕｒｉ培地中、相同組換えによってＴＲＣ１－２部位に挿入されるために設計された抗－ＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＳＡＢ Ｔｅｃｈ）をコードしているドナー鋳型を運搬する組換えＡＡＶ６ベクターを用いて形質導入された。電気穿孔後６時間時点では、サンプルを定量し、５％のＦＢＳ、３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２および１％の抗生物質／抗真菌溶液を含有しているＸｕｒｉ培地中に再懸濁させた。９６時間時点では、残留した未編集ＣＤ３＋Ｔ細胞は、ＴＲＣの電気穿孔された群からＬＤカラム、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ緩衝液、およびＣＤ３マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて磁気ディプリーション（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）することで除去した。細胞はその後、３７℃で＋５％ＦＢＳ／１％抗－抗＋１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５およびＩＬ－２１を加えたＸｕｒｉ培地中で実験の残り時間にわたって培養された。

【0307】

電気穿孔後６時間時点、２４時間、４８時間、９６時間、および１６８時間時点にて、Ｔ細胞サンプルをクエンチし、同量の生存細胞をペレット状とし、ＲＩＰＡ緩衝液（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に再懸濁させ、そこにプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を添加し、十分混合させ、これをウェスタンブロットのため、以下に記載の通り更に処理する前に３０分間、凍結保存または氷上でインキュベートさせるかのいずれかを行った。

【0308】

同じドナーからの偽細胞は、ヌクレアーゼ治療群として活性化され、同じ培地にて培養された。また、この偽細胞は、ヌクレアーゼ治療群が事前に電気穿孔された後に２４時間時点にて収集された。

【0309】

ウェスタンブロット解析のため、可溶化液を遠心分離にかけ、上澄みを新しい試験管へと移し、氷上に設置した。タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって決定し、各サンプルに対して１５μｇの総タンパク質をサンプル緩衝液＋ＤＴＴ（ＮｕＰａｇｅ）とし、１０分間９０℃でインキュベートさせた。５μｇの各サンプルをゲルの各ウェルに充填した。電気穿孔後２４時間時点での単一の偽サンプルをコントロールとして使用した。電気穿孔後、サンプルをＰＶＤＦ膜（Ｎｏｖｅｘ）へと移した（ＮｕＰａｇｅ電気穿孔システムおよび試薬）。膜はＴＢＳ－Ｔ中５％の無脂肪粉乳を用いて遮断し、一次抗体で着色した。

【0310】

ブロット 一次抗体

【0311】

Ａ ウサギポリクローナル抗ヌクレアーゼ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ自社開発、１：６５００で使用）

【0312】

Ｂ マウス抗Ｂ―アクチン（Ｓｉｇｍａ、１：１５０００で使用）

【0313】

膜を６回洗浄し、次いで適切な二次抗体でインキュベートさせた。

【0314】

ブロット 二次抗体

【0315】

Ａ ヤギ抗ウサギＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：５００００で使用）

【0316】

Ｂ ヤギ抗マウスＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：７５０００で使用）

【0317】

洗浄工程後、膜をＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に曝され、サランラップ（登録商標）で包み、ＵＶＰ ＣｈｅｍｉＤｏｃ－Ｉｔ８１５Ｉｍａｇｅｒを用いて画像を
取得した。

【0318】

図１７に示されるように、ヌクレアーゼの未発現は、期待されるように偽サンプルで検出可能であった。ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥまたはＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２ヌクレアーゼをコードしているｍＲＮＡで電気穿孔されたサンプルでは、ヌクレアーゼタンパク質は、解析された中で最も早い時点である、電気穿孔後６時間時点で高く発現した。電気穿孔後２４時間時点では、タンパク質は検出可能なままであるが、発現はどちらのヌクレアーゼに対しても電気穿孔後６時間時点より実質的に低下し、かつこの時点でＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥよりもＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２に関しては顕著に低下すると観察された。ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２のｍＲＮＡ処理サンプルにおいて、ヌクレアーゼタンパク質は電気穿孔後４８時間時点、またはその後の時点では検出することができなかった。一方、ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥタンパク質の発現はこの時点でもまだ検出可能である。アクチン発現は全てのサンプルおよび時点にわたって安定しており、同量のタンパク質は各サンプルに対して添加されることを示した。

【0319】

これらの調査は、ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥおよびＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２ヌクレアーゼは、ｍＲＮＡを電気穿孔後６時間の時点では、高レベルで発現した。ただし、Ｔ細胞中でのＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２の発現は、ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥよりも速く低下する。図１１に示されるように、ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２はＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥに比べて遺伝子編集効率が低下していないことを示した。ただし、短時間の間でこれは発現された。遺伝子編集活性の高さを維持しつつ発現の継続時間を減少させることは、ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２の望ましい特徴であり、これらの特性が増強（すなわち増加）した許容性およびＴ細胞の高い増殖能力、およびＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥと比較してＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２におけるオフターゲット活性の低さと相関するため、これはＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥと比べると、予想されていなかった有利な向上を示した。

【0320】

実施例３
ＣＡＲ Ｔ産生における最適化されたＴＲＣ１－２メガヌクレアーゼの評価

【0321】

ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２メガヌクレアーゼは、大規模プロセス工程に関して更に評価され、スケールでのＣＡＲ Ｔ細胞の産生が第１世代のＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼに対して向上されるかどうかを決定した。

【0322】

ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥを有する同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞を生成するために使用される大規模プロセスは、健常で予め定性化されたドナーからのフレッシュなＬｅｕｋｏｐａｋを用いて開始した。Ｌｅｕｋｏｐａｋ産物を洗浄し、ターゲットＴ細胞の免疫磁気濃縮を行う前に血小板を取り除いた。濃縮されたＴ細胞は次いで、洗浄して増殖培養液に入れられ、活性化試薬を用いて活性化された。３日間の活性化期間の後、細胞を洗浄し、電気穿孔緩衝液中で濃縮させた。ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥをコードしているｍＲＮＡを添加し、細胞とｍＲＮＡの混合物を、電気穿孔装置を用いて処理した。電気穿孔された細胞は、ＣＡＲ挿入遺伝子をコードしているＡＡＶベクターを含有する増殖培養液を用いて希釈された。増殖期間の後、細胞を８日目に収集し、ＣＤ３－ポジティブ集団の免疫磁気ディプリーションを行った。ディプリーションの後、ターゲットＣＤ３－ネガティブ細胞を更なる期間、増殖培養液中で増殖させた。最後に、細胞を１３日目に収集し、洗浄して凍結保護溶液へと濃縮し、凍結した。ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２を有する同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞を生成するために使用される大規模プロセスを、ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥについて記載されたのと本質的には同じように実施した。ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２実施時の増殖培養液製剤を除いては、動物起源フリー（ＡＯＦ）であった。

【0323】

生存細胞の総数は、産生プロセス中の重要な時点で決定された（図１８）。細胞数は、
０日目から最大８日目のディプリーション工程まで同じである。ただし、ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２に関しては著しく高いＴ細胞受容体ノックアウト効率のため、ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２プロセス中のディプリーション工程は、ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥのプロセス工程時に回収された細胞数の２倍より多く細胞を回収した。８日目と１３日目の間の増殖速度は類似しており、これにより１３日目の総生存細胞はおよそ２倍以上多くなった。

【0324】

ＣＤ３ノックアウト効率（すなわち内因性Ｔ細胞受容体のノックアウトの指標）は、８日目の各産生工程にてフローサイトメトリによって決定された（図１９）。驚くべきことに、ＣＤ３－ネガティブであり、（総生存細胞の）遺伝子編集された細胞の比率は、ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥのプロセス工程時よりもＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２のプロセス工程時に２０％近く高いものであった。

【0325】

最後に、ＣＡＲノックイン効率は、各産生プロセス中の重要な３時点で、フローサイトメトリによって測定された（図２０）。予想しなかったことだが、ＣＡＲ－ポジティブである（ＣＤ３－ネガティブ細胞の）形質導入細胞の比率は、ＴＲＣ１－２ｘ．８７ＥＥのプロセス工程時よりもＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２工程時におよそ２５％高い。ＣＡＲノックイン比率は、８日目と１３日目のプロセスの最後との間の両方のプロセスに対して安定しており、ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２のプロセス工程の終局で類似して高い比率のＣＡＲ－ポジティブ細胞を生じる。

【0326】

最終的に、これらの調査は驚くべきことに、ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２ヌクレアーゼがその量および最終同種異系細胞治療産物の量を著しく向上させることを示した。ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２はより効果的に内因性Ｔ細胞受容体をノックアウトし、これによってより多くの遺伝子編集されたＣＤ３－ネガティブ細胞の集団を生じ、全体的な産生プロセスの収量をおよそ２倍に向上させた。加えて、ＴＲＣ１－２Ｌ．１５９２は、向上したＣＡＲノックイン効率によって証明されているように、標的となった二本鎖切断にＣＡＲ遺伝子挿入することで、相同組換えのための環境を潜在的に向上させる。ＣＡＲ－ポジティブ比率が増加することより、ほとんどＣＡＲ－ネガティブ細胞を有さない、著しく高い純度の薬物産物がもたらされる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13-1】

【図13-2】

【図14】

【図15】

【図16-1】

【図16-2】

【図16-3】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2023-07-24

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

ヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ定常領域遺伝子内の配列番号５を含む認識配列を認識かつ切断する、操作されたメガヌクレアーゼであって、
前記操作されたメガヌクレアーゼが、第１のサブユニットと第２のサブユニットを含み、前記第１のサブユニットは、前記認識配列の第１の認識ハーフサイトと結合し、かつ第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含み、前記第２のサブユニットは、前記認識配列の第２の認識ハーフサイトと結合し、かつ第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含み、
更に前記ＨＶＲ２は、
（ａ）配列番号７の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも８１％の配列相同性、または、
（ｂ）配列番号８の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対し、少なくとも８６％の配列相同性、を有する、操作されたメガヌクレアーゼ。

【外国語明細書】